ИММУНОГЕНЫ ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ ВИЧ
IMMUNOGENS FOR VACCINATION AGAINST HIV

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к новым иммуногенам на основе перекрывающихся пептидов (OLP) и происходящих из них пептидов. Оно также относится к выделенным нуклеиновым кислотам, экспрессирующим эти иммуногены, а также векторам и клеткам, включающим такие нуклеиновые кислоты. Соединения настоящего изобретения применимы в качестве вакцин, особенно для предупреждения и лечения СПИД и заболеваний, вызываемых условно-патогенными организмами.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ВИЧ инфекция индуцирует сильные и широко направленные, с ограничением по HLA (МНС) класса I T-клеточные реакции, специфические эпитопы и ограничивающие аллели HLA для которых, как было установлено, вовлечены в относительный in vivo контроль. Смотрите Brander C, et al., Current Opinion Immunol. 2006; 18: 1-8. Хотя большая часть противовирусной CTL (ЦТЛ) реакции, по-видимому, с ограничением по HLA-B, относительный вклад вирусных участков-мишеней и ограничивающих молекул HLA в эффективность этих реакций остается неясным. Смотрите Kiepiela P, et al., Nature 2004; 432: 769-775 и Ngumbela K, et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 2008; 24: 72-82.
Кроме того, неясна роль, которую играет многообразие последовательностей ВИЧ в значимости in vivo вирус-специфического T-клеточного иммунитета, поскольку функциональные ограничения вариантов ускользания, частота использования кодона в отдельных положениях белков, гибкость T-клеточного рецептора (TCR) и возможность функциональной авидности и перекрестной реактивности могут все вносить вклад в общую эффективность специфической T-клеточной реакции. Смотрите Brockman M, et al., J. Virol. 2007; 81: 12608-12618 и Yerly D, et al., J. Virol. 2008; 82: 3147-3153. Следует отметить, что T-клеточные реакции на Gag ВИЧ наиболее последовательно сопровождались уменьшением вирусных нагрузок в группах, инфицированных ВИЧ и клада B, и клада C. Смотрите Zuniga R, et al., J. Virol. 2006; 80:3122-3125 и Kiepiela P, et al., Nat. Med. 2007; 13: 46-53.
Однако ни один из этих анализов не оценил роль реакций на более короткие участки белка(ов)-мишеней, которые могут индуцировать особенно эффективные реакции. Кроме того, неясно, обусловлена ли относительная полезность Gag каким-либо другим специфическим свойством этого белка, таким как уровень экспрессии, аминокислотный состав и внутренне большая иммуногенность. Таким образом, вероятно, что могут быть идентифицированы белковые субъединицы вне Gag и внутри этих специфических, коротких, богатых эпитопами участков, которые: i) индуцируют реакции, отмечаемые преимущественно у индивидуумов, контролирующих ВИЧ, и ii) которые могли бы быть выявлены у индивидуумов с различными типами HLA, без ограничения индивидуумами, экпрессирующими аллели, ранее связанные с эффективным вирусным контролем.
Хотя некоторые из предшествующих исследований действительно сдерживали возможную сверхпрезентацию происходящих из Gag эпитопов на «хороших» аллелях HLA класса I, остается опасение, что вакцина против ВИЧ на основе только Gag может в основном приносить пользу тем людям, которые имеют выгодный генотип HLA, и в ней не будет использоваться преимущество потенциально полезных мишеней вне Gag. Смотрите Kiepiela, 2007, выше, и Honeyborne I, et al., J. Virol. 2007; 81: 3667-3672. Кроме того, исследования ускользания от CTL и вирусной приспособленности были почти совершенно ограничены происходящими из Gag эпитопами, презентируемыми в связи с относительно защитными аллелями HLA, такими как HLA-B57 и -B27. Смотрите Schneidewind A, et al., J. Virol. 2007; 81: 12382-12393 и Leslie A, et al., Nat. Med. 2004; 10: 282-289. Таким образом, имеющиеся сведения не могут обеспечить соответствующую информацию о последовательностях иммуногенов, предназначенных для защиты генетически многообразного большинства популяции людей-хозяев.
Кроме того, многие исследования были сосредоточены только на иммунодоминантных мишенях, несмотря на то, что некоторые недавние исследования ВИЧ и ВИО инфекции показывают решающий вклад соподчиненных реакций в in vivo вирусный контроль, среди них мишени, находящиеся вне Gag. Смотрите Frahm N, et al., Nat. Immunol. 2006; 7: 173-178 и Friedrich T, et al., J. Virol. 2007; 81: 3465-3476. В совокупности, современная точка зрения по вопросу, что может создавать протективный клеточный иммунный ответ на ВИЧ, совершенно возможно, является, таким образом, необъективной, смещенной в сторону сосредоточения на иммунодоминантных ответах и на ответах, ограниченных частыми аллелями HLA класса I и аллелями HLA, связанными с лучшим исходом заболевания. По этой причине разработка вакцин против ВИЧ ограничена, отчасти, отсутствуем иммуногенов, способных к индукции широкого иммунного ответа. Настоящее изобретение берется за разработку таких иммуногенов.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, включающую последовательности SEQ ID NO: 1-16 или варианты указанных SEQ ID NO: 1-16, причем каждый из указанных вариантов имеет длину, составляющую по меньшей мере 8 аминокислот, с условиями, что указанная аминокислотная последовательность не включает какие-либо участки последовательностей, происходящие из генома ВИЧ, длиной, составляющей 8 или более аминокислот, отличные от аминокислотной последовательности в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1-16 или их вариантами.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16 или их вариантов, причем указанный вариант имеет длину, составляющую по меньшей мере 8 аминокислот, с условиями, что:
i) аминокислотная последовательность указанного иммуногена не включает какие-либо участки последовательностей, происходящие из генома ВИЧ, длиной, составляющей 8 или более аминокислот, отличные от аминокислотной последовательности в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1-16 или ее вариантом или фрагментом, и
ii) когда иммуноген включает только одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16, то эту последовательность не выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 5, 6 и 16.
В дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим иммуногены первого аспекта и второго аспекта, и к экспрессионным кассетам, векторам, вирусам и клеткам, включающим указанные нуклеиновые кислоты.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к вакцине, включающей иммуногенный полипептид в соответствии с любым из пунктов 1-11 формулы изобретения и один или более адъювантов.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенному полипептиду, нуклеиновой кислоте, экспрессионной кассете, экспрессионному вектору, вирусу или клетке третьего аспекта, или вакцине на основе композиции для применения в медицине.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенному полипептиду, нуклеиновой кислоте, экспрессионной кассете, экспрессионному вектору, вирусу или клетке третьего аспекта, или вакцине на основе композиции для применения для предупреждения или лечения ВИЧ инфекции или заболевания, связанного с ВИЧ инфекцией.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору, включающему иммуноген первого и/или второго аспектов, нуклеиновую кислоту, экспрессионную кассету, экспрессионный вектор, вирус или клетку третьего аспекта, или композицию четвертого аспекта.
ДЕПОНИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Плазмидая ДНК 298H GMCSF-HIVACAT была депонирована 13 января 2012, под идентификационным номером DSM 25555 в DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstrabe 7 B, D-38124 Braunschweig, Федеративная Республика Германии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1. Схематическое представление гена, включенного в экспрессионную плазмиду. Точки определяют инициирующий кодон и стоп-кодон.
Фиг.2. Клеточные иммунные реакции, исследованные в объединенных спленоцитах с помощью проточного цитометрического анализа. Представлены частота всех специфических в отношении Gag, Pol и Nef-Tat-Vif ответов в виде продукции интерферона-γ среди групп в (a) и распределение CD4 и CD8 реакций в (b).
Фиг.3. Ответы на Gag, Pol, NTV и последовательность Т-клеточного иммуногена HIVACAT, измеренные с помощью анализа ELISpot для интерферона-γ в мышиных спленоцитах. Отдельных мышей иммунизировали плазмидами, кодирующими полноразмерные полипептиды Gag, Pol и Nef-Tat-Vif. Представлен вклад ответов, специфических в отношении участков, включенных в Т-клеточный иммуноген HIVACAT, в общий Gag-Pol-NTV-специфический ответ в виде продукции интерферона-γ.
Фиг.4. Сравнение широты в (a) и величины в (b) ответов в виде продукции интерферона-γ, специфических в отношении Т-клеточного иммуногена HIVACAT, у иммунизированных мышей. Субъектов подвергали воздействию плазмид, кодирующих или полноразмерные белки, или минимальную Т-клеточную последовательность.
Фиг.5. Равновесие ответов в виде продукции интерферона против Gag, Pol, Vif или Nef в случае мышей, иммунизированных 20 мкг плазмид, кодирующих весь Gag, Pol плюс полипептид Nef-Tat-Vif и Т-клеточный иммуноген HIVACAT. Доминирование Gag-специфических ответов представлено на панели (a) в случае мышей, иммунизированных полноразмерными белками, тогда как более сбалансированный спектр, наблюдается на панели (b) в случае мышей, иммунизированных Т-клеточным иммуногеном HIVACAT.
Фиг.6. Антитела, связывающиеся с p24, p37 и p55, детектированные с помощью Вестерн-блоттинга, используя экстракты клеток HEK 293, трансфецированных 1 мг векторов для экспрессии gag и gag-pol, (демонстрирующие p55 gag и процессированные субъединицы p24, p37 и p55 gag), разделенные в 12% ПААГ с SDS, и исследуя мембраны с использованием a) сывороток ВИЧ-инфицированного пациента, b) объединенных сывороток мышей, иммунизированных высокими дозами иммуногена, и c) объединенных сывороток мышей, иммунизированных низкими дозами иммуногена (все в разведении 1:100).
Фиг.7. a) Титры в конечной точке специфических в отношении gag-p24 связывающих антител от мышей, подвергнутых воздействию. Определение было выполнено с помощью ELISA, исходя из индивидуальных последовательно 4-кратно разводимых образцов объединенных сывороток. b) ELISA для р55 gag собственной разработки, используя рекомбинантный белок pr55 gag ВИЧ-1IIIB (каталожный № 3276, NIH Reagent Program, Bethesda, MD, США). Определение было выполнено в сыворотках отдельных мышей в разведении 1:100.
6
Фиг.8. a) Схематическое представление иммунизаций мышей. Группы из шести мышей C57BL/6 использовались для сравнения иммуногенности различных гетерологичных комбинаций (2хДНК примирований в сравнение с 3хДНК примированиями с последующим 1xMVA бустингом), используя или 100 мкг пДНК-HIVACAT, или 10 pfu MVA-HIVACAT, вводимых с помощью внутримышечной инъекции, b) Сравнение широты и величины ответов в виде продукции IFNγ, специфических в отношении Т-клеточного иммуногена HIVACAT, у отдельных иммунизированных мышей, c) Распределение специфических в отношении Gag, Pol, Vif и Nef ответов у отдельных иммунизированных мышей, d) Распределение между 8 белковыми субъединицами, включенными в Т-клеточный иммуноген HIVACAT (р17 Gag, р24 Gag, p2p7p1p6 Gag, Pol-протеаза, Pol-RT, Pol-интеграза, Vif и Nef) в различных группах иммунизации представлено.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
+
+
Настоящее изобретение раскрывает несколько иммуногенных соединений, эффективных в индукции сильного иммунного ответа против ВИЧ у широкого ряда субъектов. В частности, ВИЧ-специфические CD4 и CD8 T-клеточные реакции на ключевые, кодируемые ВИЧ эпитопы были получены с помощью этих соединений.
1. Определения общих терминов и выражений
4
2
4
2
4
2
3
3
4
2
Mycobacterium tuberculosis
Corynebacterium parvum
Bordetella pertussis
Используемый в настоящем изобретении термин «адъювант» относится к иммунологическому средству, которое модифицирует эффект иммуногена, при обладании, если вообще обладает, малочисленными непосредственными эффектами при введении самого по себе. Его часто включают в вакцины для усиления иммунного ответа у реципиента на привносимый антиген, при ограничении до минимума вводимого чужеродного материала. Адъюванты добавляют к вакцинам для стимуляции ответа иммунной системы на антиген-мишень, но они сами не придают иммунитет. Неограничивающие примеры применимых адъювантов включают минеральные соли, полинуклеотиды, полиаргинины, ISCOM, сапонины, монофосфорил липид A, имиквимод, ингибиторы CCR-5, токсины, полифосфазены, цитокины, белки-иммунорегуляторы, иммуностимулирующие слитые белки, костимулирующие молекулы и их комбинации. Минеральные соли включают, но без ограничения, AIK(SO), AlNa(SO), AlNH(SO), диоксид кремния, квасцы, Al(OH), Ca(PO), каолин или уголь. Применимые иммуностимулирующие полинуклеотиды включают, но без ограничения, содержащие CpG олигонуклеотиды с иммуностимулирующими комплексами (ISCOM) или без них, содержащие CpG олигонуклеотиды с полиарнинином или без него, поли-IC или поли-AU кислоты. Токсины включают холерный токсин. Сапонины включают, но без ограничения, QS21, QS17 или QS7. Примером применимого иммуностимулирующего слитого белка является белок IL-2, слитый с Fc-фрагментом иммуноглобулина. Применимые иммунорегулирующие молекулы включают, но без ограничения, CD40L и лиганд CD1a. Цитокины, применимые в качестве адъювантов, включают, но без ограничения, IL-1, IL-2, IL-4, GMCSF, IL-12, IL-15, IGF-1, IFN-α, IFN-β и интерферон гамма. Также их примерами являются мурамилдипептиды, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглютамин (thr-DMP), N-ацетилнорнурамил-L-аланил-D-изоглютамин (CGP 11687, также называемый nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютаминил-L-аланин-2-(1'2'-дипалмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (CGP 19835A, также называемый MTP-PE), RIBI (MPL+TDM+CWS) в 2% эмульсии сквален/TWEEN 80, липополисахариды и их различные производные, в том числе липид A, полный адъювант Фрейнда (FCA), неполный адъювант Фрейнда, адъювант 65 Merck, полинуклеотиды (например, поли-IC и поли-AU кислоты), парафин D из , вещества, обнаруживаемые в ,  и членах рода Brucella, Titermax, Quil A, ALUN, производные липида A, производные холерного токсина, производные HSP, производные LPS, синтетические матрицы для пептидов или GMDP, Монтанид ISA-51 и QS-21, содержащие CpG олигонуклеотиды, поли-I:C, и GMCSF. Смотрите Osol A., Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA, US, 1980, pp. 1324-1341), Hunter R, патент США с № 5554372 и Jager E, Knuth A, WO1997028816. Также могут использоваться комбинации адъювантов.
Используемый в настоящем изобретении термин «СПИД» относится к симптоматической фазе ВИЧ инфекции и включает как синдром приобретенного иммунного дефицита (общеизвестный как СПИД), так и «ARC» или связанный со СПИД комплекс. Смотрите Adler M, et al., Brit. Med. J. 1987; 294: 1145-1147. Иммунологические и клинические проявления СПИД хорошо известны в данной области техники и включают, например, оппортунистические инфекции и раки, являющиеся следствием иммунного дефицита.
Используемый в настоящем изобретении термин «аминокислотный линкер» относится к аминокислотной последовательности, отличной от таковой, обнаруживаемой в конкретном положении во встречающемся в природе белке, и его, как правило, разрабатывают так, чтобы он был гибким или включался в структуру, такую как α-спираль, между двумя белковыми фрагментами. Линкер также называют спейсером. Линкер типично является неантигенным и может быть по существу любой длины (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более аминокислот). Линкером может также быть положение или последовательность, в котором клеточная система процессирования антигена может инициировать деградацию иммуногенного полипептида без разрушения сильных T-клеточных эпитопов).
Используемый в настоящем изобретении термин «сайт мутации резистентности к антиретровирусному агенту» относится к сайту, который после мутирования, придает резистентность к антиретровирусному агенту. Такие сайты можно идентифицировать посредством добычи известных баз данных, таких как Stanford University HIV Drug Resistance Database, в которых можно отыскать, например, последовательности и лечения против вирусов с конкретными мутациями или данные, касающиеся лекарственной чувствительности для изолятов с выбранными мутациями. Анализы для проверки лекарственной чувствительности ВИЧ хорошо известны в данной области техники. Смотрите Dong J, US 20040106136 и Shafer R, Assay for Antiretroviral Resistance, HIV InSite Knowledge Base Chapter (http://hivinsite.ucsf.edu/InSite?page=kb-02-02-03, January 2012). Уже известные сайты мутаций резистентности к антиретровирусным агентам в ВИЧ регулярно публикуются Всемирной организацией здравоохранения или Международным обществом по противовирусному исследованию - США (например, Johnson V, et al., ISA-USA Topics Antiviral Med. 2011; 19(4): 153-164.
Используемое в настоящем изобретении выражение «клеточный иммунный ответ» описывает иммунный ответ против чужеродного антигена(ов), который опосредуется T-клетками и их продуктами секреции.
Используемый в настоящем изобретении термин «последовательность центра древа» или «COT» относится к последовательности, от которой среднее эволюционное расстояние до каждого верхнего конца диаграммы филогенетического древа родственных вариантных последовательностей было минимизировано. Смотрите Nickle D, et al., Science 2003; 299, 1515-1517.
Используемый в настоящем изобретении термин «с оптимизацией кодонов» относится к изменению кодонов в молекулах нуклеиновых кислот для воспроизведения использования типичных кодонов организма-хозяина без изменения кодируемого ДНК полипептида, для увеличения экспрессии. Ранее сообщалось о множестве способов и программных средств для оптимизации кодонов. Смотрите Narum D, et al., Infect. Immun. 2001; 69(12): 7250-7253, Outchkourov N, et al., Protein Expr. Purif. 2002; 24(l): 18-24, Feng L, et al., Biochemistry 2000; 39(50): 15399-15409, и Humphreys D, et al., Protein Expr. Purif. 2000; 20(2): 252-2.
Используемый в настоящем изобретении термин «включающий» или «включает» отражает также «состоящий из» в соответствии с общепринятой патентной практикой.
Mycobacteria spp
Pneumocystis carinii
Pneumocystis cryptococcus
Используемое в настоящем изобретении выражение «заболевание, связанное с ВИЧ инфекцией», включает состояние, когда у субъекта уже развился СПИД, но также включает состояние, когда субъект, инфицированный ВИЧ, еще не продемонстрировал какой-либо признак или симптом заболевания. Таким образом, вакцина настоящего изобретения, при введении субъекту, у которого нет клинических признаков инфекции, может обладать превентивной активностью, поскольку она может предотвратить возникновение заболевания. Иммуногенные композиции способны к предотвращению или замедлению инфекции и уничтожению здоровых CD4+ T-клеток у такого субъекта. Она также относится к предотвращению и замедлению возникновения симптомов синдрома приобретенного иммунного дефицита, таких как крайне низкое количество CD4+ T-клеток и повторяющиеся инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, такими как .,  и . Благотворные или желаемые клинические результаты включают, но без ограничения, увеличение абсолютного числа необученных CD4+ T-клеток (диапазон 10-3520), увеличение процента CD4+ T-клеток к общему количеству циркулирующих иммуноцитов (диапазон 1-50%) и/или увеличение количества CD4+ T-клеток в виде процента от нормального количества CD4+ T-клеток у неинфицированного субъекта (диапазон 1-161%).
Используемые в настоящем изобретении термины «вариант» или «фрагмент» относится к полипептиду, происходящему из любой из SEQ ID NO: 1-16 в результате делеции одной или более концевых аминокислот на N-конце или на C-конце отдельной SEQ ID NO. Варианты или фрагменты предпочтительно имеют длину, составляющую по меньшей мере 8 аминокислот или вплоть до 10%, вплоть до 20%, вплоть до 30%, вплоть до 40%, вплоть до 50%, вплоть до 60%, вплоть до 70%, вплоть до 80%, вплоть до 90% или вплоть до 99% от соответствующей им SEQ ID NO.
Используемый в настоящем изобретении термин «геном ВИЧ» относится к последовательности РНК длиной, составляющей приблизительно 8749 нуклеотидов, защищенной капсидом ВИЧ и кодирующей гены gag, pol, env, tat, rev, vif, nef, vpr, vpu, vpx и необязательно tev. Геномная последовательность ВИЧ лежит в основе высокой вариабельности, по этой причине геном ВИЧ, на который ссылаются в настоящем изобретении, не ограничивается какой-либо конкретной последовательностью. Предпочтительными последовательностями являются последовательности типов и подтипов ВИЧ, перечисленных в настоящем описании.
Используемый в настоящем изобретении термин «вирус иммунодефицита человека» или «ВИЧ» относится, в общем, к вирусам иммунодефицита человека и включают ВИЧ типа 1 («HIV-1»), ВИЧ типа 2 («ВИЧ-2») и другие вирусы ВИЧ, включающие, например, ВИЧ-l, ВИЧ-2, возникающие и другие подтипы ВИЧ и варианты ВИЧ, такие как широко распространенные или географически изолированные варианты и вирус иммунодефицита обезьян («ВИО»). Например, анцестральная вирусная последовательность гена может быть определена для генов env и gag ВИЧ-1, такого как ВИЧ-1 подтипов A, B, C, D, E, F, G, H, J и K, и межподтиповых рекомбинантов, таких как AG, AGI, и для групп M, N, O или для вирусов ВИЧ-2 или ВИЧ-2 подтипов A или B. ВИЧ-1, ВИЧ-2 и ВИО включают, но без ограничения, экстраклеточные вирусные частицы и формы вирусов, связанные с соответствующими им инфицированными клетками.
Используемый в настоящем изобретении термин «гуморальный иммунный ответ» описывает иммунный ответ против чужеродного антигена(ов), который опосредуется антителами, продуцируемыми B-клетками.
Используемый в настоящем изобретении термин «иммуногенная композиция» относится к композиции, которая вызывает иммунную реакцию, которая продуцирует антитела или клеточно-опосредованные иммунные ответы против конкретного иммуногена.
Используемый в настоящем изобретении термин «иммуногенный полипептид» или «иммуноген» относится к полипептидному антигену, который способен к индукции адаптивного иммунного ответа (т.е. гуморального или клеточно-опосредованного иммунного ответа), в случае его введения самого по себе или вместе с адъювантом.
Используемый в настоящем изобретении термин «набор» относится к комбинации изделий, которые облегчают процесс, способ или применение. Эти наборы предоставляют материалы, необходимые для осуществления применения, описанного в настоящем изобретении.
Используемый в настоящем изобретении термин «функционально связанная», как предполагается, означает, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью(ями) таким образом, который создает возможность для экспрессии нуклеотидной последовательности (например, в системе in vitro транскрипции/трансляции или в клетке-хозяине, когда вектор введен в клетку-хозяина). Смотрите Auer H, Nature Biotechnol. 2006; 24: 41-43.
Используемый в настоящем изобретении термин «пептидная метка» или «метка» относится к пептиду или аминокислотной последовательности, который может использоваться для выделения или очистки указанного иммуногена. Таким образом, указанная метка способна к связыванию с одним или более лигандов, например, одним или более лигандов аффинной матрицы, такой как хроматографический носитель или гранула с высоким сродством. Иллюстративные, неограничивающие, примеры меток, применимых для выделения или очистки белка, включают Arg-метку, FLAG-метку, His-метку или Strep-метку; эпитоп, который может распознаваться антителом, такой как c-myc-метка (распознаваемая антителом против c-myc), SBP-метку, S-метку, кальмодулин-связывающий пептид, связывающийся с целлюлозой пептид, хитин-связывающий пептид, глютатион-S-трансферазу-метку, связывающийся с мальтозой белок, NusA, TrxA, DsbA или Avi-метку; аминокислотную последовательность, такую как AHGHRP (SEQ ID NO: 96), PIHDHDHPHLVIHS (SEQ ID NO: 97) или GMTCXXC (SEQ ID NO: 98); или β-галактозидазу. Смотрите Terpe K, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003; 60: 523-525.
Используемые в настоящем изобретении термины «фармацевтически приемлемый носитель», «фармацевтически приемлемый разбавитель», или «фармацевтически приемлемый наполнитель», или «фармацевтически приемлемая среда» относятся к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, герметизирующему материалу или вспомогательному средству в препарате любого стандартного типа. Фармацевтически приемлемый носитель, по существу, нетоксичен для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и совместим с другими ингредиентами препарата. Например, носитель для препарата, содержащего полипептиды, не будет обычно включать окислительные средства и другие соединения, которые, как известно, являются разрушительными для полипептидов. Подходящие носители включают, но без ограничения, воду, декстрозу, глицерин, солевой раствор, этанол и их комбинации. Носитель может содержать дополнительные агенты, такие как смачивающие реагенты или эмульгаторы, pH-буферные агенты или адъюванты, которые увеличивают эффективность препарата.
Используемые в настоящем изобретении термины «предупреждать» и «предупреждение» относятся к ингибированию начала или уменьшению частоты заболевания у животного. Предупреждение может быть полным (например, абсолютное отсутствие патологических клеток у субъекта). Предупреждение может также быть частичным, так что, например, возникновений патологических клеток у субъекта меньше, чем могло бы происходить без настоящего изобретения. Предупреждение также относится к уменьшенной подверженности клиническому состоянию.
Термин «сигнальный пептид для секреции» относится к очень гидрофобной аминокислотной последовательности (например, предпочтительно длиной 15-60 аминокислот) белков, которые должны пересечь мембрану, чтобы достичь расположения в клетке, где они функционируют. При связывании с распознающими сигнальный пептид частицами, эти последовательности направляют комплексы белок в стадии возникновения-рибосомы к мембране, в которую белок вставляется во время трансляции. Сигнальные пептиды предписывают поступательное внедрение белка в различные мембраны (например, эндоплазматический ретикулум, митохондрии, хлоропласт, пероксисому). Лидерные сигнальные последовательности в немембранных белках в конечном счете удаляются с помощью специфических пептидаз. Некоторые используемые сигнальные пептиды включают хемокин MCP-3, для стимуляции секреции и притяжения антигенпрезентирующих клеток; происходящий из катенина (CATE) пептид для увеличения протеасомной деградации; и лизосомальный связанный белок, LAMP1 для направленной доставки к компартменту MHC II. Смотрите Rosati M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009; 106: 15831-15836.
Используемое в настоящем изобретении выражение «последовательное введение» означает, что введение не является одновременным, а выполняют первое введение, за которым следует одно или более последующих введений.
Используемое в настоящем изобретении выражение «по существу сохраняются иммунологические способности иммуногенного полипептида» означает, что вариант проявляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%), по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% от способности иммуногенного полипептида к индукции адаптивного иммунного ответа (т.е. гуморального или клеточно-опосредованного иммунного ответа), в случае его введения самого по себе или с адъювантами.
Используемый в настоящем изобретении термин «лечить» или «лечение» относится к введению иммуногенной композиции настоящего изобретения или лекарственного средства, содержащего ее, для контролирования прогрессирования заболевания до или после появления клинических признаков. Контролирование прогрессирования заболевания, как подразумевается, означает благотворные или желательные клинические результаты, которые включают, но без ограничения, уменьшение симптомов, уменьшение продолжительности заболевания, стабилизацию патологических состояний (в особенности во избежание дополнительного ухудшения), отсрочку прогрессирования заболевания, улучшение патологического состояния и ремиссию (как частичную, так и полную). Контролирование прогрессирования заболевания также включает удлинение продолжительности существования, по сравнению с ожидаемой продолжительностью существования, если лечение не применялось.
Используемый в настоящем изобретении термин «вакцина» относится к веществу или композиции, которое устанавливает или увеличивает иммунитет к конкретному заболеванию посредством индукции адаптивного иммунного ответа, в том числе иммунологической памяти. Вакцина типично содержит агент, который имеет сходство с вызывающим заболевание микроорганизмом или его частью (например, полипептидом). Вакцины могут быть профилактическими или терапевтическими.
Используемый в настоящем изобретении термин «вариант» относится ко всем тем аминокислотным последовательностям, которые происходят из любой из SEQ ID NO: 1-16 при помощи модификаций или мутаций, в том числе замен, предпочтительно консервативных замен, вставок или неконцевых делеций, затрагивающих одну или более аминокислот, и в которых, по существу, сохраняются иммуногенные способности иммуногенного полипептида.
Используемый в настоящем изобретении термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, линейной или замкнутой в круг, которая включает сегмент в соответствии с представляющей интерес нуклеиновой кислотой, функционально связанный с дополнительными сегментами, которые обеспечивают ее автономную репликацию в клетке-хозяине, представляющей интерес, или в соответствии с представляющей интерес экспрессионной кассетой.
2. Иммуногенные полипептиды настоящего изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, включающую последовательности SEQ ID NO: 1-16 или варианты указанных SEQ ID NO: 1-16, причем каждый из указанных вариантов имеет длину, составляющую по меньшей мере 8 аминокислот, с условиями, что указанная аминокислотная последовательность не включает какие-либо участки последовательностей, происходящие из генома ВИЧ, длиной, составляющей 8 или более аминокислот, отличные от аминокислотной последовательности в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1-16 или их вариантами.
В конкретном варианте осуществления иммуногенный полипептид первого аспекта имеет аминокислотную последовательность, включающую SEQ ID NO: 49.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16 или их вариантов, причем указанный вариант имеет длину, составляющую по меньшей мере 8 аминокислот, с условиями, что:
i) указанная аминокислотная последовательность не включает какие-либо участки последовательностей, происходящие из генома ВИЧ, длиной, составляющей 8 или более аминокислот, отличные от аминокислотной последовательности в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1-16 или ее варианта или фрагмента, и
ii) когда иммуноген включает только одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16, то эту последовательность не выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 5, 6 и 16.
Предпочтительно вариант в соответствии с первым и вторым аспектами является эквивалентным родственной ему последовательности и происходит из отличного штамма ВИЧ или представляет собой искусственную последовательность ВИЧ. Эквивалентный в этой связи означает несходный по одному или более аминокислотных остатков, но соответствующий той же последовательности (например, определяемой положением в геноме или схожестью последовательности). Другими словами, в предпочтительном варианте осуществления вариантом является «встречающийся в природе вариант», который относится к последовательностям нуклеиновых кислот, происходящим из генома циркулирующего в настоящее время или когда-то вируса ВИЧ, и можно идентифицировать, исходя из имеющихся баз данных (например, баз данных, касающихся последовательностей, GenBank и Los Alamos). Последовательность циркулирующих вирусов можно также определить с помощью методик молекулой биологии. Смотрите Brown T, "Gene Cloning" (Chapman & Hall, London, GB, 1995); Watson R, et al., "Recombinant DNA", 2nd Ed. (Scientific American Books, New York, NY, US, 1992); Sambrook J, et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, US, 1989). Предпочтительно, вариант любой из SEQ ID NO: 1-16 идентичен по аминокислотной последовательности на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% соответствующей ему последовательности (т.е. SEQ ID NO: 1-16). Примерами алгоритмов, подходящих для определения процента идентичности последовательностей и схожести последовательностей являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0. Смотрите Altschul S, et al., Nuc. Acids Res. 1977; 25: 3389-3402 и Altschul S, et al., J. Mol. Biol. 1990; 215: 403-410. Программы BLAST и BLAST 2.0 могут использоваться для определения процента идентичности последовательностей нуклеиновых кислот и белков настоящего изобретения. Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации. Смотрите http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi, January 2012.
Варианты могут также содержать один или более модифицированных аминокислотных остатков (например, остатков, которые модифицированы посредством присоединения групп заместителей), или одну или более неприродных аминокислот, таких как бета-аминокислоты.
Способы определения силы клеточной реакции известны в данной области техники. Может использоваться любой способ, подходящий для оценки стимуляции T-клеток в ответ на Аг. Описанные ниже процедуры являются несколькими примерами подходящих способов:
6
1) Иммуноферментный спот-анализ (ELISpot): неадгезивные клетки из лунок для предварительного культивирования переносят в планшет, который покрыт желаемыми иммобилизованными антителами против цитокинов (Ат, например, против IFN, IL-10, IL-2, IL-4). Обнаружение осуществляют с помощью биотинилированных вторых Ат и стандартных колометрических или люминесцентных способов детектирования, таких как стрептавидин-щелочная фосфатаза и NBT-BCIP, и подчитывают споты. Считывания ELISpot затем представляют как спот-образующие клетки (SFC)/10 введенных клеток.
2) Анализ цитокинов в супернатанте: цитокины, выброшенные в супернатант культуры, измеряют с помощью различных методов, таких как иммуноферментные твердофазные анализы (ELISA), мультиплексный иммуноанализ на основе микросфер BD Cytometric Bead Array, анализ Biorad Bio-Plex и другие.
3) Тетрамеры HLA класса I: с помощью этой процедуры детектируют Аг-реагирующие T-клетки, распознающие специфические пептидные эпитопы, используя любые имеющиеся в продаже реагенты (например, MHC Class I Dexamers, Immudex, Copenhagen, DK) или созданные своими силами реагенты (например, Novak E, et al., J. Clin. Invest. 1999; 104: R63-R67).
4) Тетрамеры HLA класса II: с помощью этой процедуры детектируют Аг-реагирующие T-клетки, распознающие специфические пептидные эпитопы, используя или имеющиеся в продаже реагенты (например, MHC Class II Ultimers™, Prolmmune Ltd, Oxford, GB) созданные своими силами реагенты (например, Novak, 1991, выше).
5) Увеличение экспрессии маркеров активации (например, CD69, CD25, CD137): с помощью этой процедуры Аг-специфические T-клеточные реакции детектируют в соответствии с дифференциальной экспрессией в них маркеров активации, выставляемых на мембране после распознавания Аг.
6) Анализы иммобилизации цитокинов: эта система является эффективной альтернативой ELISpot для визуализации Аг-специфических T-клеток в соответствии с продукцией цитокинов (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, DE). Кроме того, они делают возможной непосредственную сортировку и клонирование представляющих интерес T-клеток.
7) Анализ CD154: эта процедура ограничивается детектированием Аг-специфических CD4+ T-клеток. Смотрите Chattopadhyay P, et al., Nat. Med. 2005; 11: 1113-11117 и Frentsch M, et al., Nat. Med. 2005; 11: 1118-1124.
8) Анализ CD107: эта процедура позволяет визуализировать Аг-специфические CD8+ T-клетки с цитотоксическим потенциалом. Смотрите Betts M, et al., J. Immunol. Methods 2003; 281: 65-78.
9) Анализ распределения красителя CFSE: с помощью этой процедуры детектируются Аг-специфические T-клетки (CD4+ и CD8+) в соответствии с их пролиферацией после распознавания Аг. Смотрите Mannering S, et al., J. Immunol. Methods 2003; 283: 173-183.
Способы определения силы гуморальной реакции на вариант известны в данной области техники. Может использоваться любой способ, подходящий для оценки стимуляции T-клеток в ответ на Аг. Примеры подходящих способов включают, но без ограничения, детектирование или определение относительного количества антитела, которое специфически распознает антигенный или иммуногенный агент, в сыворотке субъекта, который был подвергнут лечению иммуногенным полипептидом или вариантом, относительно количества антитела у не подвергнутого лечению субъекта. Титры антител можно определить, используя стандартные анализы, такие как иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA), простая одномерная радиальная иммунодиффузия (SRID) или ферментативный иммуноанализ (ETA).
В предпочтительном варианте осуществления вариантом любой из SEQ ID NO: 1-16 является фрагмент указанной последовательности(ей).
В конкретных вариантах осуществления определяют анцестральные вирусные последовательности для генов env ВИЧ-1 подтипов B или C, или для генов gag подтипов B или C. В других вариантах осуществления определяют анцестральную вирусную последовательность для других генов или полипептидов ВИЧ, таких как pol или вспомогательные гены или полипептиды. Тем не менее, в другом варианте осуществления определяют вирусную последовательность с помощью методов с использованием консенсусной последовательности или центра древа.
В предпочтительном варианте осуществления ВИЧ является ВИЧ группы M. Группа M является группой численно преобладающих, циркулирующих ВИЧ-1. Она была разделена на подтипы, обозначаемые буквами, и подтипы, обозначаемые цифрами. В настоящее время идентифицированы подтипы A1, A2, A3, A4, B, C, D, E, F1, F2, G, H, J и K. Подтипы ВИЧ-1, также называемые кладами, являются филогенетически связанными штаммами ВИЧ-1, которые имеют приблизительно равное генетическое расстояние друг от друга; в некоторых случаях подтипы также связаны географически или эпидемиологически. Генетическая вариация в пределах подтипа может составлять 15-20% или больше, тогда как вариация между подтипами или дивергентными членами одного и того же подтипа обычно составляет 25-35%. Успехи секвенирования всего генома ВИЧ привели к идентификации циркулирующих и уникальных рекомбинантных форм (CRF и URF, соответственно). Они являются результатом рекомбинации между подтипами у двойственно инфицированного человека, от которого рекомбинантные формы затем переходят к другим людям. Рекомбинантное потомство относят к циркулирующим рекомбинантным формам, если они идентичны у трех или более людей без прямой эпидемиологической связи; в противном случае их описывают как уникальные рекомбинантные формы.
В одном варианте осуществления указанный иммуноген имеет аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16 или их вариантов, причем указанным условием ii) является: когда иммуноген включает только одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16, то эту последовательность не выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16.
В предпочтительном варианте осуществления указанный иммуноген включает по меньшей мере две, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре последовательности, выбираемые из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16 или их вариантов, причем указанным условием ii) является: когда иммуноген включает только две, три или четыре последовательности, выбираемые из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16, то не все из этих последовательностей выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 5, 6 и 16. В другом варианте осуществления указанный иммуноген имеет аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять или по меньшей мере десять последовательностей, выбираемых из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16 или их вариантов, причем указанным условием ii) является: когда иммуноген включает только две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять последовательностей, выбираемых из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16, то не все из этих последовательностей выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16.
В предпочтительном варианте осуществления иммуноген в соответствии с первым аспектом включает последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1-16 или их вариантами в следующем порядке 1-16.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к иммуногену первого аспекта, причем по меньшей мере две последовательности присоединены с помощью аминокислотного линкера.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к иммуногену второго аспекта, причем если иммуноген включает по меньшей мере две последовательности, выбираемые из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16 или их вариантов, указанные последовательности присоединены с помощью аминокислотного линкера.
В предпочтительном варианте осуществления иммуногенов и первого и второго аспектов, линкер имеет аминокислотную последовательность A, AA или AAA. В другом варианте осуществления, когда C-концевым остатком последовательности, имеющей N-концевое расположение относительно линкера, или N-концевым остатком последовательности, имеющей C-концевое расположение, является остаток аланина, линкер может быть укороченным, так чтобы последовательность AAA образовывалась в участке соединения между присоединяемыми последовательностями. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления, если C-концевым остатком последовательности, имеющей N-концевое расположение относительно линкера, является аланин, или, если N-концевым остатком последовательности, имеющей C-концевое расположение, является аланин, линкер имеет последовательность AA. В другом варианте осуществления, если и C-концевым остатком последовательности, имеющей N-концевое расположение относительно линкера, и N-концевым остатком последовательности, имеющей C-концевое расположение, является аланин, то линкер имеет последовательность A.
В другом варианте осуществления указанные иммуногены, кроме того, включают сигнальный пептид для секреции на N-конце, причем указанный сигнальный пептид предпочтительно усиливает секрецию иммуногена из клеток, экспрессирующих указанный иммуноген. Предпочтительный сигнальный пептид для секреции происходит из GMCSF (гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора), за которым предпочтительно следует валин для увеличения стабильности. Предпочтительно последовательностью сигнального пептида GMCSF является: MWLQSLLLLGTVACSIS (SEQ ID NO: 46) или MWLQSLLLLGTVACSISV (SEQ ID NO: 47).
В другом варианте осуществления указанные иммуногены, кроме того, необязательно включают пептидную метку. Пептидная метка может находиться на N-конце между сигнальным пептидом и иммуногенным полипептидом или предпочтительно может находиться на C-конце перед стоп-кодоном.
Предпочтительно указанной меткой является FLAG-пептид. В FLAG-системе используется короткий, гидрофильный 8-аминокислотный пептид, который слит с представляющим интерес рекомбинантным белком. FLAG-пептид включает сайт связывания нескольких очень специфических моноклональных антител против FLAG (M1, M2, M5; Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, США), которые могут использоваться для оценки экспрессии представляющего интерес белка в материале из трансфецированных клеток. Из-за небольших размеров метки в виде FLAG-пептида, она не экранирует другие эпитопы, домены или не изменяет функцию, секрецию или перенос слитого белка, как правило. Предпочтительно указанный FLAG-пептид имеет последовательность DYKDDDDKL (SEQ ID NO: 48).
В предпочтительном варианте осуществления указанная метка предназначена лишь для анализа экспрессии и очистки иммуногена, и ее удаляют до его использования для вызова иммунного ответа.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к указанным иммуногенам, причем указанная аминокислотная последовательность включает по меньшей мере один сайт мутации резистентности к антиретровирусному агенту.
Мутация может произойти в любом сайте в вирусном геноме. Предпочтительно, когда мутация происходит в области, кодирующей интегразу, протеазу или обратную транскриптазу.
Мутации в интегразе, которые придают резистентность к ингибиторам интегразы, включают, без ограничения, T66, E92, F121, E138, G140, Y143, S147, Q148, S153, N155, E157 и R263 в SEQ ID NO: 1 и их комбинацию. В предпочтительном варианте осуществления мутацию выбирают из группы, состоящей из мутаций E92Q, G140S, G140A и Y143R в белке интегразе и их комбинаций.
Мутации в протеазе, связанные с резистентностью к ингибиторам протеазы (PI), включают основные мутации в протеазе, дополнительные мутации в протеазе и мутации в сайте расщепления протеазы. Смотрите Shafer R, et al., AIDS Rev. 2008; 10(2): 67-84. Наибольшую клиническую значимость имеют семнадцать почти совершенно неполиморфных положений, включающих L231, L241, D30N, V321, L33F, M461/L, 147/V/A, G48V/M, 150L/V, F53L, 154V/T/A/L/M, G73S/T, L76V, V82A/T/F/S, 184V/A/C, N88D/S, L90M. Дополнительные мутации в протеазе включают мутации в полиморфных положениях L101/V, 113V, K20R/M/I, M36I, D60E, I62V, L63P, A71V/T, V77I и 193L, и мутации в неполиморфных положениях L10F/R, V111, E34Q, E35G, K43T, K45I, K55R, Q58E, A71I/L, T74P/A/S, V751, N83D, P79A/S, 185V, L89V, T91S, Q92K и C95F.
В другом варианте осуществления сайт мутации резистентности к антиретровирусному агенту находится в обратной транскриптазе, приводя к резистентности к нуклеозидному ингибитору обратной транскриптазы (NRTI) или ненуклеозидному ингибитору обратной транскриптазы (NNRTI). Мутации резистентности к NRTI включают M184V, мутации резистентности к аналогам тимидина (TAM), мутации, отбираемые с использованием систем, в которых отсутствуют аналоги тимидина, (не-TAM) и мутации резистентности к множеству нуклеозидов (мульти-NRTI мутации), и множество недавно описанных дополнительных мутаций в неполиморфных положениях. В общем, M184V, связанные не с аналогами тимидина мутации, такие как K65R и L74V, и мутация резистентности к множеству нуклеозидов Q151M действуют посредством уменьшения включения NRTI. Мутации резистентности к аналогам тимидина, вставки T69, связанные с резистентностью к множеству нуклеозидов, и многие из дополнительных мутаций способствуют деблокировке праймера. Смотрите Shafer, 20008, выше. M184V является чаще всего встречающейся мутацией резистентности к NRTI. Самыми распространенными аминокислотными мутациями лекарственной устойчивости являются M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F и K219QE. Самые распространенные мутации у пациентов, у которых обнаруживается вирусологическая неэффективность при получении нетимидинового аналога, содержащего остов NRTI, (не-TAM), включают M184V отдельно или M184V в комбинации с K65R или L74V. Другие мутации не-TAM включают K65N, K70E/G, L741, V75T/M, Y115F. Вставки аминокислот в кодон 69, как правило, происходят в присутствии множества TAM, и в этой установке связаны с промежуточной резистентностью к 3TC и FTC и сильной резистентностью к каждому из остальных NRTI. Q151M является мутаций 2 п.о. (CAG.fwdarw.ATG), которая обычно сопровождается двумя или более следующих мутаций: A62V, V751, F77L и F116Y. Комплекс с Q151M является причиной сильной резистентности к ZDV, d4T, ddI и ABC, и промежуточной резистентности к TDF, 3TC и FTC. Смотрите Shafer R, et al., AIDS Rev. 2008; 10(2): 67-84.
Мутации резистентности к NNTRI включают, без ограничения, основные мутации резистентности к NNRTI (K103N/S, V106A/M, Y181C/I/V, Y188L/C/H и G190A/S/E), дополнительные мутации резистентности к NNRTI (L1001, K101P, P225H, F227L, M230L и K238T) и редкие мутации (V179F, F227C и L2341).
Минорные мутации в неполиморфных положениях: A98G, K101E, V1081 и V179D/E - являются типичными мутациями резистентности к NNRTI, которые уменьшают чувствительность к невирапину и эфавирензу в приблизительно 2-5 раз.
Разнообразные мутации резистентности к ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы, такие как K101Q, 1135T/M, V1791 и L2831, уменьшают чувствительность к невирапину и эфавирензу в приблизительно 2 раза, и могут действовать синергетически с основными мутациями резистентности к NNRTI. Другие мутации, такие как L74V, H221Y, K223E/Q, L228H/R и N3481, отбираются первоначально с помощью NRTI, тем не менее, также вызывают едва уловимое уменьшение чувствительности к NNRTI.
Предпочтительно, когда указанный сайт мутации резистентности к антиретровирусному агенту находится в любой из SEQ ID NO: 9-11. Более предпочтительно, когда указанным сайтом мутации резистентности к антиретровирусному агенту является аминокислотный остаток 8 SEQ ID NO: 9, причем аминокислота Leu замещается на аминокислоту Met.
В другом варианте осуществления вариант или фрагмент имеет длину, составляющую 8-40 аминокислот, более предпочтительно длину, составляющую 11-27 аминокислот. Предпочтительно указанный вариант или фрагмент не включает аминокислотный линкер, присоединяющий любую из SEQ ID NO: 1-16. Кроме того, предпочтительно, когда C-концевой аминокислотой указанного варианта или фрагмента не является ни G, P, E, D, Q, N, T, S, ни C, поскольку эти остатки не образуют C-концевой «якорь» для Т-клеточных эпитопов с ограничением по HLA класса I, как правило.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления указанный вариант или фрагмент выбирают из группы, состоящей из пептидов в соответствии с SEQ ID NO: 17-45.
Кроме того, предусматривается объединение или слияние указанного варианта или фрагмента с белком теплового шока. Настоящее изобретение также относится к слитому белку, включающему указанный вариант или фрагмент и белок теплового шока. Предпочтительными белками теплового шока являются Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96 или Hsp100.
В другом варианте осуществления вариантом или фрагментом является вариант или фрагмент в соответствии с первым и вторым аспектами. Предпочтительно, указанный вариант или фрагмент не включает аминокислотный линкер, присоединяющий любую из SEQ ID NO: 1-16. Кроме того, предпочтительно, когда C-концевой аминокислотой указанного варианта или фрагмента не является ни G, P, E, D, Q, N, T, S, ни C, поскольку эти остатки не образуют C-концевой «якорь» для Т-клеточных эпитопов с ограничением по HLA класса I, как правило.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления указанный вариант или фрагмент выбирают из группы, состоящей из пептидов в соответствии с SEQ ID NO: 17-45.
Кроме того, предусматривается объединение или слияние указанного варианта или фрагмента с белком теплового шока. Настоящее изобретение также относится к слитому белку, включающему указанный вариант или фрагмент и белок теплового шока. Предпочтительными белками теплового шока являются Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96 или Hsp100.
3. Нуклеиновые кислоты, векторы, вирусы и клетки настоящего изобретения
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей иммуноген первого аспекта, и к экспрессионной кассете, вектору, вирусу и клетке, включающей указанную нуклеиновую кислоту.
Предпочтительно, указанной нуклеиновой кислотой является полинуклеотид, относящийся к одноцепочечным или двухцепочечным полимерам нуклеотидных мономеров (нуклеиновым кислотам), включающих, но без ограничения, 2'-дезоксирибонуклеотиды (ДНК) и рибонуклеотиды (РНК), связанные межнуклеотидными фосфодиэфирными связями. Полинуклеотиды настоящего изобретения кодируют иммуноген настоящего изобретения без, по существу, включения дополнительных участков генома ВИЧ.
В одном варианте осуществления указанная нуклеиновая кислота подвергнута оптимизации кодонов. В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота подвергнута оптимизации кодонов для экспрессии у людей. Нуклеиновые кислоты с оптимизацией кодонов для применения в соответствии с настоящим изобретением можно приготовить посредством замены кодонов нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноген, на «гуманизированные» кодоны (т.е. кодоны являются кодонами, которые часто обнаруживаются в высокой степени экспрессируемых генах человека). Смотрите Andre S, et al., J. Virol. 1998; 72: 1497-1503. В предпочтительном варианте осуществления указанная нуклеиновая кислота с оптимизацией кодонов имеет последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 50.
В случае нуклеиновой кислоты третьего аспекта может потребоваться разрезание рестриктазами для ее лигирования в вектор. Эта процедура могла бы повлечь за собой удаление различных концевых нуклеотидов (например, 1, 2 или 3). Как таковое, в одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к указанной нуклеиновой кислоте, которая была разрезана на каждом конце рестриктазой.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к экспрессионной кассете, включающей нуклеиновую кислоту третьего аспекта, промоторную последовательность и 3'-UTR и необязательно селектируемый маркер. Предпочтительно промоторной последовательностью является промотор цитомегаловируса человека (CMV) или последовательность промотора раннего-позднего гена p7.5. Предпочтительно, 3'-UTR является поли-А бычьего гормона роста (BGH). Предпочтительно, необязательным селектируемым маркером является ген устойчивости к антибиотику (например, канамицину, ампицилину, тетрациклину, спектиномицину).
Тем не менее, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, включающему нуклеиновую кислоту или экспрессионную кассету третьего аспекта.
В одном варианте осуществления вектором является экспрессионный вектор. Таким образом, подходящие векторы в соответствии с настоящим изобретением включают прокариотические векторы, такие как pUC18, pUC19, и плазмиды Bluescript и их производные, вроде плазмид mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColEl, pCRl и RP4; фаги и «челночные» векторы, такие как векторы pSA3 и pAT28; векторы для экспрессии в дрожжах, такие как векторы типа 2-микронной пдазмиды; интеграционные плазмиды; векторы YEP; центромерные плазмиды и аналоги; векторы для экспрессии в клетках насекомых, такие как векторы серии pAC и серии pVL; векторы для экспрессии в растениях, такие как векторы серий pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE и аналоги; и векторы для экспрессии в клетках высших эукариот на основе вирусных векторов (например, MVA, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, ретровирусов и лентивирусов), а также невирусных векторов, таких как векторы pSilencer 4.1-CMV (Ambion, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, США), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL и pKSV-10, pBPV-1, pML2d и pTDT1.
В конкретном варианте осуществления экспрессионным вектором является вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, включающий промотор млекопитающего и сайт полиаденилирования. Предпочтительно промотором является промотор цитомегаловируса человека (CMV). Предпочтительно, сайтом полиаденидирования является сайт полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH). Вектор для экспрессии в клетках млекопитающих может быть модифицированным для оптимизации репликации вектора в бактериях. Вектор для экспрессии в клетках млекопитающих может, кроме того, включать ген селектируемого маркера, например, ген, кодирующий белок, придающий устойчивость к антибиотику. В конкретном варианте осуществления вектор для экспрессии в клетках млекопитающих включает ген устойчивости к канамицину.
В другом конкретном варианте осуществления экспрессионным вектором является вирусный вектор, предпочтительно модифицированный вирусный вектор коровьей оспы Анкара (MVA).
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к вирусу, содержащему нуклеиновую кислоту третьего аспекта. Подходящие вирусы являются безопасными, обладают низкой токсичностью и являются генетически стабильными. Неограничивающими примерами являются ретровирусы, в частности, поксвирусы, такие как MVA, лентивирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы (AAV).
В дальнейшем конкретном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к модифицированному вирусу коровьей оспы Анкара (MVA), включающему полинуклеотид или генную конструкцию, кодирующий иммуногенные полипептиды настоящего изобретения. Модифицированный вирус коровьей оспы Анкара (MVA) относится к вирусу коровьей оспы, члену рода Orthopoxvirus в семействе Poxviridae. MVA был создан в результате 516 последовательных пассажей на фибробластах куриных эмбрионов штамма Анкара вируса коровьей оспы (CVA). Смотрите Mayr A, et al., Infection 1975; 3: 6-14 и Sutter G, et al., патент США с № 6440422 и CH 568392. Вирусы MVA общедоступны (например, идентификационный номер в ATCC - VR-1508). Отличительным признаком MVA является его аттенуация (например, уменьшенная вирулентность и ограниченная способность к репродукции инфекционных вирионов в некоторых клетках млекопитающих), при сохранении достаточной иммуногенности и полной способности к репликации и продукции инфекционных вирионов в клетках птиц. Подходящие штаммы MVA включают штаммы с повышенной безопасностью благодаря i) способности к репликации - репродукции in vitro в фибробластах куриных эмбрионов (CEF), но отсутствию способности к репликации - репродукции в линии клеток человека, такой как линия кератиноцитов человека HaCaT, линия клеток почки эмбриона человека 293, линия клеток остеосаркомы человека 143B и линия клеток аденокарциномы шейки матки человека HeLa; ii) неспособности к репликации в модели на мыши, которая неспособна к продукции зрелых B- и T-клеток, и как таковая характеризуется весьма ослабленным иммунитетом и является очень чувствительной к реплицирующему вирусу; и iii) индукции уровня специфического иммунного ответа в схемах примирование с использованием вируса коровьей оспы/бустинги с использованием вируса коровьей оспы, по меньшей мере одинакового с таковым в схемах примирование с использованием ДНК/бустинги с использованием вируса коровьей оспы. Подходящим аттенуированным штаммом MVA является штамм, называемый MVA-BN. Смотрите Chaplin P, et al., WO2002042480, идентификационный номер в ECACC - V00083008.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к клетке, включающей нуклеиновую кислоту, экспрессионную кассету, экспрессионный вектор или вирус третьего аспекта. Используемые клетки могут быть клетками любого типа, включая и эукариотические клетки, и прокариотические клетки. Предпочтительно клетки включают прокариотические клетки, дрожжевые клетки или клетки млекопитающих. Предпочтительными примерами клеток млекопитающих являются клетки COS, клетки HeLa, клетки HEK 293T или клетки, выделенные от пациента (например, пациента с ВИЧ).
4. Композиции настоящего изобретения
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, включающей вариант или фрагмент в соответствии с первым и вторым аспектами и белок теплового шока. Иммуногенные композиции можно приготовить, например, в виде инъецируемых препаратов, таких как жидкие растворы, суспензии и эмульсии. Предпочтительными белками теплового шока являются Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96 или Hspl00.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей иммуноген, нуклеиновую кислоту, экспрессионную кассету, вектор или клетку в соответствии с настоящим изобретением или композицию в соответствии с четвертым аспектом и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте осуществления указанные фармацевтические композиции и композиция четвертого аспекта могут использоваться в качестве вакцины, как изложено ниже.
5. Вакцина настоящего изобретения
В другом аспекте настоящее изобретение относится к вакцине, включающей иммуноген первого и второго аспектов, нуклеиновую кислоту, экспрессионную кассету, экспрессионный вектор, вирус или клетку третьего аспекта, или композицию четвертого аспекта.
51
В предпочтительном варианте осуществления указанная вакцина способна к вызову клеточного и гуморального ответов. Более предпочтительно, вакцина вызывает цитотоксическую T-клеточную реакцию. Анализ цитотоксических T-клеток или цитоксических T-лимфоцитов (CTL) может использоваться для слежения за клеточной иммунной реакцией после иммунизации с использованием субгеномной вирусной последовательности против гомологичных и гетерологичных штаммов ВИЧ. Смотрите Burke S, et al., J. Inf. Dis. 1994; 170: 1110-1119 и Tigges M, et al., J. Immunol, 1996; 156: 3901-3910. Традиционные анализы, применяемые для детектирования T-клеточных реакций, включают, например, анализы пролиферации, анализы секреции лимфокинов, прямые анализы цитотоксичности и анализы методом серийных разведений. Например, антигенпрезентирующие клетки, которые были подвергнуты инкубации с пептидом, можно проанализировать в отношении их способности к индукции CTL реакций в популяциях клеток-респондеров (отвечающих клеток). Антигенпрезентирующими клетками могут быть такие клетки, как мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) или дендритные клетки (DC). Альтернативно, линии мутантных клеток млекопитающих, не человека, которые лишены способности к нагрузке молекул MHC класса I внутренне процессированными пептидами и которые были трансфецированы соответствующим геном MHC класса I человека, могут использоваться для проверки способности представляющего интерес пептида к индукции in vitro первичных CTL реакций. PBMC могут использоваться в качестве источника клеток-респондеров - CTL-предшественников. Соответствующие антигенпрезентирующие клетки инкубируют с пептидом, после чего антигенпрезентирующие клетки с нагруженным белком инкубируют с популяцией клеток-респондеров в оптимизированных условиях культивирования. Позитивную активацию CTL можно определить с помощью исследования культуры на присутствие CTL, которые уничтожают меченные радиоактивным изотопом клетки-мишени, как специфические, подвергнутые импульсному мечению пептидом мишени, так и клетки-мишени, экспрессирующие эндогенно процессированные формы антигена, от которого произошла последовательность пептида. Например, клетки-мишени можно пометить радиоактивным изотопом - Cr, и цитотоксическую активность можно рассчитать, исходя из радиоактивности, высвободившейся из клеток-мишеней. Другой подходящий способ делает возможным прямой количественный анализ антигенспецифических T-клеток посредством окрашивания флуоресцеин-меченными тетрамерными комплексами HLA. Смотрите Al™an J, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: 10330-10334 и Al™an J, et al., Science 1996; 274: 94-96. Другие относительно недавние технические разработки включают окрашивание на предмет выявления внутриклеточных лимфокинов и анализы выброса интерферонов или анализы ELISpot.
В одном варианте осуществления вакцина четвертого аспекта, кроме того, включает один или более адъювантов или белков теплового шока.
Адъюванты определяют, как указано выше. Предпочтительными белками теплового шока являются Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96 или Hsp100.
6. Терапевтические методы
В предпочтительном варианте осуществления иммуногенный полипептид в соответствии с настоящим изобретением, нуклеиновую кислоту настоящего изобретения, экспрессионную кассету настоящего изобретения, экспрессионный вектор настоящего изобретения, вирус настоящего изобретения, клетку настоящего изобретения или вакцину в соответствии с настоящим изобретением можно использовать для предупреждения или лечения ВИЧ инфекции или заболевания, связанного с ВИЧ инфекцией.
Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенному полипептиду в соответствии с настоящим изобретением, нуклеиновой кислоте настоящего изобретения, экспрессионной кассете настоящего изобретения, экспрессионному вектору настоящего изобретения, вирусу настоящего изобретения, клетке настоящего изобретения или вакцине в соответствии с настоящим изобретением для применения для предупреждения или лечения ВИЧ инфекции или заболевания, связанного с ВИЧ инфекцией.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению иммуногенного полипептида в соответствии с настоящим изобретением, нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, экспрессионной кассеты настоящего изобретения, экспрессионного вектора настоящего изобретения, вируса настоящего изобретения, клетки настоящего изобретения или вакцины в соответствии с настоящим изобретением для производства лекарственного средства для предупреждения или лечения ВИЧ инфекции или заболевания, связанного с ВИЧ инфекцией.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу предупреждения или лечения ВИЧ инфекции или заболевания, связанного с ВИЧ, у нуждающегося в этом субъекта, включающему введение указанному субъекту иммуногенного полипептида в соответствии с настоящим изобретением, нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, экспрессионной кассеты настоящего изобретения, экспрессионного вектора настоящего изобретения, вируса настоящего изобретения, клетки настоящего изобретения или вакцины в соответствии с настоящим изобретением для производства лекарственного средства для предупреждения или лечения ВИЧ инфекции или заболевания, связанного с ВИЧ инфекцией.
В конкретном варианте осуществления иммуногенный пептид, нуклеиновая кислота, экспрессионная кассета, экспрессионный вектор, вирус, клетка или вакцина для применения в соответствии с настоящим изобретением включает последовательное введение:
i) первого иммуногенного пептида любого из пунктов 1-11 формулы изобретения, нуклеиновой кислоты любого из пунктов 12-14 формулы изобретения, экспрессионной кассеты пункта 15 формулы изобретения, экспрессионного вектора пункта 16 формулы изобретения, вируса любого из пунктов 17-18 формулы изобретения, клетки пункта 19 формулы изобретения или вакцины пункта 20 формулы изобретения и
ii) второго иммуногенного пептида любого из пунктов 1-11 формулы изобретения, нуклеиновой кислоты любого из пунктов 12-14 формулы изобретения, экспрессионной кассеты пункта 15 формулы изобретения, экспрессионного вектора пункта 16 формулы изобретения, вируса любого из пунктов 17-18 формулы изобретения, клетки пункта 19 формулы изобретения или вакцины пункта 20 формулы изобретения.
В конкретном варианте осуществления первый иммуногенный пептид, нуклеиновая кислота, экспрессионная кассета, экспрессионный вектор, вирус, клетка или вакцина отличны от второго иммуногенного пептида, нуклеиновой кислоты, экспрессионной кассеты, экспрессионного вектора, вируса, клетки или вакцины. Предпочтительно сначала вводят экспрессионный вектор в соответствии с настоящим изобретением, с последующим введением модифицированного вируса коровьей оспы Анкара в соответствии с настоящим изобретением.
В конкретном варианте осуществления первый экспрессионный вектор в соответствии с настоящим изобретением вводят по меньшей мере два раза, предпочтительно по меньшей мере три раза.
Полезный профилактический или терапевтический эффект вакцины по отношению к ВИЧ инфекции или симптомам СПИД включает, например, предотвращение или отсрочку первоначального инфицирования индивидуума, подвергнутого воздействию ВИЧ; уменьшение вирусной нагрузки у индивидуума, инфицированного ВИЧ; продление бессимптомной фазы ВИЧ инфекции; сохранение низких вирусных нагрузок у ВИЧ-инфицированных пациентов, уровни вируса у которых были снижены, благодаря антиретровирусной терапии (ART); увеличение уровней CD4 T-клеток или уменьшение снижения CD4 T-клеток, и ВИЧ-1-специфических, и неспецифических, у пациентов, не подвергнутых воздействию лекарственного средства, и у пациентов, подвергнутых лечению ART, увеличение широты, абсолютного значения, авидности и функциональности ВИЧ-специфических CTL, улучшение общего состояния здоровья или качества жизни у индивидуума со СПИД; и увеличение средней вероятной продолжительности жизни индивидуума со СПИД. Клиницист может сравнить эффект иммунизации с состоянием пациента до лечения, или с ожидаемым состоянием пациента, не подвергнутого лечению, для определения того, является ли лечение эффективным в ингибировании СПИД.
Mycobacterium avium
Mycobacterium kansasii
Mycobacterium tuberculosis
Pneumocystis carinii
Предпочтительно указанным заболеванием является СПИД, ARC или заболевание, вызванное условно-патогенными организмами при ВИЧ. Неограничивающими примерами заболеваний, вызванных условно-патогенными организмами, при ВИЧ являются лимфома Беркитта, кандидоз в бронхах, трахеи, легких или пищеводе, рак шейки матки, кокцидиоидоз (диссеминированный или внелегочный), криптококкоз (внелегочный), криптоспоридиоз (в кишечники, длящийся в течение более 1 месяца), цитомегаловирусная инфекция (вне печени, селезенки или лимфатических узлов), цитомегаловирусный ретинит (с потерей зрения), энцефалопатия при ВИЧ, герпетические поражения, длящиеся более одного месяца, простой герпес в бронхах, легком или пищеводе, гистоплазмоз (диссеминированный или внелегочный), иммунобластная лимфома, инвазивная карцинома (рак) шейки матки, изоспороз в кишечнике, длящийся в течение более одного месяца, саркома Капоши, лимфома (первичная в головном мозге), комплекс  (диссеминированный или внелегочный),  (диссеминированный или внелегочный),  (диссеминированный или внелегочный), вызванная  пневмония, пневмония (рецидивирующая в 12-месячный период), прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия (PML), сальмонеллезная септицемия (рецидивирующая), токсоплазмоз (в головном мозге), кахексия и любое другое заболевание, являющееся следствием инфицирования, которому способствует ослабленная иммунная система у ВИЧ-инфицированного пациента.
Вакцина настоящего изобретения может быть применима для терапии ВИЧ-1 инфекции. Хотя подвергнуты лечению таким образом могут быть все животные, которые могут быть поражены ВИЧ-1 или их эквивалентами, (например, шимпанзе, макаки, павианы или люди), иммуногенные композиции настоящего изобретения направлены в особенности на их терапевтические применения для людей. Часто может потребоваться более чем одно введение для вызова желаемого терапевтического эффекта; точный протокол (дозу и частоту) можно установить с помощью стандартных клинических процедур.
Pneumocystis carinii
Настоящее изобретение, кроме того, относится к предотвращению и уменьшению симптомов, связанных с ВИЧ инфекцией. Они включают симптомы, связанные с неосновной симптоматической фазой ВИЧ инфекции, включающие, например, опоясывающий лишай, кожную сыпь и инфекции ногтей, язвы во рту, рецидивирующую инфекцию носа и гортани и потерю веса. Кроме того, дополнительные симптомы, связанные с основной симптоматической фазой ВИЧ инфекции, включают, например, кандидозный стоматит и вагинальный кандидоз (кандидоз), упорный понос, потерю веса, непрекращающийся кашель и реактивированный туберкулез или рецидивирующие герпесные инфекции, такие как герпес губ (герпетическую лихорадку). Другие симптомы СПИД с развернутой клинической картиной, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают, например, диарею, тошноту и рвоту, кандидозный стоматит и язвы во рту, персистирующие, рецидивирующие инфекции влагалища и рак шейки матки, персистирующую генерализованную лимфаденопатию (PGL), тяжелые инфекции кожи, бородавки и дерматомикоз, респираторные инфекции, пневмонию, в особенности вызванную  пневмонию (PCP), опоясывающий лишай (или опоясывающий герпес), связанные с нервной системой проблемы, такие как боли, онемение или ощущения покалывания в руках и ногах, неврологические расстройства, саркому Капоши, лимфому, туберкулез или другие схожие оппортунистические инфекции.
Полезные эффекты настоящего изобретения включают, например, предотвращение или отсрочку первоначального инфицирования индивидуума, подвергнутого воздействию ВИЧ; уменьшение вирусной нагрузки у индивидуума, инфицированного ВИЧ; продление бессимптомной фазы ВИЧ инфекции; сохранение низких вирусных нагрузок у ВИЧ-инфицированных пациентов, уровни вируса у которых были снижены, благодаря антиретровирусной терапии (ART); увеличение уровней CD4 T-клеток или уменьшение снижения CD4 T-клеток, и ВИЧ-1-специфических, и неспецифических, у пациентов, не подвергнутых воздействию лекарственного средства, и у пациентов, подвергнутых лечению ART, увеличение широты, абсолютного значения, авидности и функциональности ВИЧ-специфических CTL, улучшение общего состояния здоровья или качества жизни у индивидуума со СПИД; и увеличение средней вероятной продолжительности жизни индивидуума со СПИД. Клиницист может сравнить эффект иммунизации с состоянием пациента до лечения, или с ожидаемым состоянием пациента, не подвергнутого лечению, или в клиническом испытании индивидуумов, подвергнутых лечению и не подвергнутых лечению вакциной, для определения того, является ли лечение эффективным в ингибировании СПИД.
Иммуногенные композиции могут быть разработаны для введения нуклеиновых кислот или экспрессионных векторов в желаемое место действия и высвобождения их с подходящей и контролируемой скоростью. Способы приготовления препаратов с контролируемым высвобождением известны в данной области техники. Например, препараты с контролируемым высвобождением можно создать посредством использования полимеров, которые образуют комплекс с иммуногеном или иммуногенной композицией или абсорбируют его. Препарат с контролируемым высвобождением можно приготовить, используя соответствующие макромолекулы (например, полиэфиры, полиаминокислоты, поливинил, пирролидон, этиленвинилацетат, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу или протамина сульфат), которые, как известно, обеспечивают желаемые параметры контролируемого высвобождения или профиль высвобождения. Другим возможным способом контролирования продолжительности действия с помощью препарата с контролируемым высвобождением является включение активных ингредиентов в частицы полимерного материала (например, полиэфиров, полиаминокислот, гидрогелей, полимолочной кислоты, полигликолевой кислоты, сополимеров этих кислот или сополимеров этилена с винилацетатом). Альтернативно, вместо включения этих активных ингредиентов в полимерные частицы, можно захватить эти материалы в микрокапсулы, приготовленные, например, с использованием методов коацервации или с помощью межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозную или желатиновую микрокапсулу и поли(метилметакрилатную) микрокапсулу, соответственно, в коллоидные системы для доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы, нанокапсулы) или в макроэмульсии. Смотрите в Voller A, et ah, Eds., "New Trends and Developments in Vaccines (University Park Press, Baltimore, MD, US, 1978) и Gennaro A, Ed., "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, PA, US, 1990).
Квалифицированные в данной области техники специалисты могут без труда определить соответствующие дозы нуклеиновых кислот и экспрессионных векторов настоящего изобретения (в собирательном значении, иммуногенов) в иммуногенной композиции настоящего изобретения. Например, доза иммуногенов может варьировать в зависимости от пути введения и размера пациента. Квалифицированные в данной области техники специалисты могут определить соответствующие дозы, например, посредством измерения иммунного ответа у субъекта, такого как лабораторное животное, используя традиционные иммунологические методы и регулируя дозы соответствующим образом. Такие методы измерения иммунного ответа у субъекта включают, но без ограничения, анализы высвобождения хрома, анализы связывания тетрамеров, анализы ELISPOT для IFN, анализы ELISPOT для IL-2, анализы внутриклеточных цитокинов и другие иммунологические анализы на обнаружение. Смотрите Harlow E, Lane D, "Antibodies: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, US, 1988).
Иммуногенные композиции можно вводить, используя любой подходящий способ доставки, в том числе, но без ограничения, внутримышечную, внутривенную, интрадермальную, чрескожную, интраназальную доставку, доставку через поверхность слизистой оболочки (например, интраректальную, интравагинальную, пероральную) и местную доставку. Такие методы хорошо известны в данной области техники. Более конкретными примерами способов доставки являются внутримышечная инъекция, интрадермальная инъекция и подкожная инъекция. Однако доставка не должна ограничиваться способами инъекции. Кроме того, доставка ДНК в ткань животного была достигнута с использованием катионных липосом, с помощью непосредственной инъекции «голой» ДНК в мышечную ткань животного или интрадермальной инъекции ДНК, используя «генную пушку» или технологию электропорации. Смотрите Watanabe M, et al., Mol. Reprod. Dev. 1994; 38: 268-274, Charnock-Jones D, et al., WO 1996020013, Robinson H, et al., Vaccine 1993: 11: 957-960, Hoffman S, et al., Vaccine 1994; 12(16): 1529-1533; Xiang Z, et al., Virology 1994; 199: 132-140, Webster R, et al., Vaccine 1994; 12: 1495-1498, Davis H, et al., Vaccine 1994; 12: 1503-1509, Davis H, et al., Hum. Mol. Gen. 1993; 2: 1847-1851, и Johnston S, et al., Meth. Cell Biol. 1994; 43: 353-365. Доставку можно также осуществить через поверхность слизистой оболочки, такой как слизистые оболочки анального канала, влагалища или ротовой полости.
7. Набор настоящего изобретения
В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору, включающему иммуноген первого аспекта, пептид или его вариант второго аспекта, нуклеиновую кислоту, экспрессионную кассету, экспрессионный вектор, вирус или клетку четвертого аспекта, или вакцину четвертого аспекта. Эти наборы предоставляют материалы, необходимые для осуществления применения, описанного в настоящем изобретении. Набор мог бы также быть в форме пластыря.
Кроме того, набор может включать упаковку, которая позволяет сохранить реагенты в определенных пределах. Подходящие материалы для приготовления таких упаковок включают стекло, пластик (например, полиэтилен, полипропилен, поликарбонат), флаконы, ампулы, бумагу или саше. Набор настоящего изобретения может, кроме того, содержать инструкции в отношении применения компонентов, содержащихся в нем, в частности, тех, которые являются гемостатическим пластырем настоящего изобретения. Указанные инструкции можно встретить в форме отпечатанного материала или в форме радиотехнического обеспечения, которое может хранить инструкции, так что их может прочитать субъект, такого как электронные носители информации (например, магнитные диски, ленты) или оптические среды (например, CD-ROM, DVD). Среды могут дополнительно или альтернативно содержать интернет-сайты, обеспечивающие указанные инструкции.
ОБЩИЕ ПРОЦЕДУРЫ
1. Разработка T-клеточного иммуногена
Для разработки OLP ВИЧ настоящего изобретения придерживались следующего подхода.
Экспериментальный скрининг (с использованием ELISpot для интерферона-γ) 232 ВИЧ-инфицированных, не подвергнутых лечению индивидуумов, используя совокупность консенсусных для клада В последовательностей пептидов, позволил обнаруживать участки вирусного генома, на которые преимущественно реагировали субъекты с превосходным контролем ВИЧ. Смотрите Frahm N, et al., J. Virol. 2004; 78: 2187-2200; Mothe B, et al., J. Transl. Med. 2011; 9(1): 208. Общая совокупность исследуемых пептидов состояла из 410 18-аминокислотных перекрывающихся пептидов, охватывающих всю вирусную протеому. Из них было идентифицировано 26 OLP, группа индивидуумов, реагирующих на которые, имела значительно (p<0,05 без учета поправки на множественное сравнение) уменьшенную вирусную нагрузку по сравнению с группой индивидуумов, не реагирующих на OLP, (т.е. индивидуумов, которые не реагировали на эти OLP в анализе ELISpot для интерферона-γ). Эти полезные OLP характеризовались коэффициентом защиты (PR) >1 и находились в белке Gag ВИЧ (n=10), в Pol (n=12), и в белках Vif (n=3) и Nef (n=1) вируса. Из 26 OLP 15 были частично перекрывающимися. Смотрите таблицу 1.
Таблица 1
OLPNo.
Белок
Белковая субъединица
Консенсусная для клада В последовательность OLP
Средняя вирусная нагрузка у индивидуумов, реагирующих на OLP
Средняя вирусная нагрузка у индивидуумов, не реагирующих на OLP
Коэффициент защиты (PR)*
р-значение
3
Gag
p17
EKIRLRPGGKKKYKLKHI
22947
39014
1,053
0,037
6
Gag
p17
ASRELERFAVNPGLL
15380
43189
1,107
0,001
7
Gag
p17
ERFAVNPGLLETSEGCR
25939
38974
1,040
0,049
10
Gag
p17
QLQPSLQTGSEELRSLY
16285
37237
1,085
0,031
12
Gag
p17
SLYNTVATLYCVHQRIEV
23855
37113
1,044
0,037
23
Gag
p24
AFSPEVIPMFSALSEGA
22947
37113
1,048
0,036
31
Gag
p24
IAPGQMREPRGSDIA
3563
35483
1,281
0,028
34
Gag
p24
STLQEQIGWMTNNPPIPV
6127
37360
1,207
0,002
48
Gag
p24
ACQGVGGPGHKARVLAEA
12975
35755
1,107
0,041
60
Gag
p15
GKIWPSHKGRPGNFLQSR
16266
36434
1,083
0,044
75
Nef
-
WLEAQEEEEVGFPVRPQV
13407
37360
1,108
0,026
76
Nef
-
EVGFPVRPQVPLRPMTYK
59618
29855
0,937
0,001
84
Nef
-
NYTPGPGIRYPLTFGWCF
55402
30538
0,945
0,006
85
Nef
-
RYPLTFGWCFKLVPV
69890
29903
0,924
0,002
90
Nef
-
SLHGMDDPEKEVLVWKF
89687
32650
0,911
0,042
159
Pol
протеаза
KMIGGIGGFIKVRQYDQI
14736
36434
1,094
0,020
160
Pol
Протеаза
FIKVRQYDQILIEICGHK
3682
35755
1,277
0,031
161
Pol
Протеаза
QILIEICGHKAIGTVLV
9117
35483
1,149
0,050
163
Pol
Протеаза
LVGPTPVNIIGRNLLTQI
25965
45637
1,055
0,007
171
Pol
RT
LVEICTEMEKEGKISKI
1865
35483
1,391
0,014
181
Pol
RT
LDVGDAYFSVPLDKDFRK
65858
32871
0,937
0,041
195
Pol
RT
LRWGFTTPDKKHQKEPPF
5624
37113
1,219
0,006
196
Pol
RT
DKKHQKEPPFLWMGYELH
10103
35483
1,136
0,044
210
Pol
RT
EIQKQGQGQWTYQIY
18155
35483
1,068
0,045
222
Pol
RT
PPLVKLWYQLEKEPIVGA
412599
34640
0,808
0,030
230
Pol
RT
IHLALQDSGLEVNIV
85102
34117
0,919
0,030
237
Pol
RT
VYLAWVPAHKGIGGNEQV
85102
34117
0,919
0,029
240
Pol
RT
SAGIRKVLFLDGIDKA
116902
32761
0,891
0,019
269
Pol
Интеграза
TKELQKQITKIQNFRVYY
6629
35755
1,192
0,030
270
Pol
Интеграза
TKIQNFRVYYRDSRDPLW
18171
37360
1,073
0,019
271
Pol
Интеграза
YYRDSRDPLWKGPAKLLW
25939
35755
1,032
0,043
276
Pol
Интеграза
KIIRDYGKQMAGDDCVA
6629
35755
1,192
0,021
279
Vpr
-
GPQREPYNEWTLELLEEL
60222
32650
0,944
0,042
307
Env
gp120
DLNNNTNTTSSSGEKMEK
179419
34117
0,863
0,044
311
Env
gp120
IRDKVQKEYALFYKLDVV
179419
32871
0,860
0,008
314
Env
gp120
YRLISCNTSVITQACPKV
58206
31273
0,943
0,008
315
Env
gp120
SVITQACPKVSFEPIPIH
61011
32871
0,944
0,034
320
Env
gp120
TNVSTVQCTHGIRPVV
341587
34640
0,820
0,034
355
Env
gp120
VAPTKAKRRVVQREKRAV
161602
34117
0,870
0,042
399
Env
gp41
VIEVVQRACRAILHIPRR
388089
34640
0,812
0,026
405
Vif
-
VKHHMYISGKAKGWFYRH
16458
37237
1,084
0,021
406
Vif
-
GKAKGWFYRHHYESTHPR
16458
37237
1,084
0,022
424
Vif
-
TKLTEDRWNKPQKTKGHR
10319
36434
1,137
0,014
*Значения PR, выделенные жирным шрифтом, указывают на PR>1, т.е. индивидуумы, реагирующие на OLP, отмечались чаще среди индивидуумов с уменьшенными вирусными нагрузками.
Для построения непрерывной последовательности иммуногена, 26 OLP были совмещены и собраны во всего 16 сегментов длиной в диапазоне от 11 до 78 аминокислот. Точные положения начала и конца этих сегментов основывались на анализе остатков вверху и внизу от идентифицированных 26 OLP и основывались на числе учитываемых факторов, которые применялись к различным фланкирующим сайтам. Эти учитываемые факторы включали:
1) Данные, касающиеся иммуногенности OLP;
2) Данные, касающиеся реактивности консервативного района;
3) Удлинение или подрезание сегментов для включения/исключения хороших или плохих известных эпитопов;
4) Охват CD4 эпитопа;
5) Охват HLA;
6) Вариабельность последовательности (2010 консенсусные и HBX2-определяемые эпитопы);
7) Многофакторные анализы OLP;
8) Создание нового эпитопа/аутоэпитопа;
9) Сохранение природной последовательности, хотя бы без включенных полезных OLP;
10) Внесение изменений во избежание узнавания эпитопа и
11) Избегание запрещенных остатков (G,P,E,D,Q,N,T,S или C)
Этот протокол привел к разработке SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 16 в качестве потенциальных иммуногенов.
2. Векторы
Последовательности SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 16 связывали с помощью одной, двух или трех аминокислот - аланинов между сегментами для обеспечения оптимального процессирования и во избежание преждевременного расщепления эпитопов.
Затем связанные сегменты использовали в виде ВИЧ последовательностей T-клеточных иммуногенов для включения в ДНК- и MVA векторы. Для доставки иммуногенов, используя или только растворимые пептиды, или растворимые пептиды в комбинации с белками теплового шока, были разработаны более короткие перекрывающиеся пептиды (средняя длина - 23 остатка), которые охватывают 16 сегментов, не включая трех-аминокислотные линкеры AAA. Эти OLP были созданы таким способом, который помог избежать нежелательных остатков на C-конце (важном для оптимальной презентации эпитопа на молекулах HLA класса I. Смотрите SEQ ID NO: 17 - SEQ ID NO: 45, январь 2012). Длина этих перекрывающихся пептидов находится в диапазоне от 11 до 27 аминокислот.
3. T-клеточный иммуноген
T-клеточный иммуноген был разработан в виде полипептида и собран из 16 сегментов генома ВИЧ-1 варьирующего размера (между 11 и 78 аминокислотами), слитых с помощью линкеров в виде трех аланинов. Описание районов содержало:
Сегменты Т-клеточного иммуногена
Длина
Белок ВИЧ-1
Положение (HXB2)
SEQ ID NO:
Seg-1
78
p17
17-94
1
Seg-2
14
p24
30-43
2
Seg-3
11
p24
61-71
3
Seg-4
60
p24
91-150
4
Seg-5
14
p24
164-177
5
Seg-6
15
p24
217-231
6
Seg-7
27
p2p7p1p6
63-89
7
Seg-8
55
Протеаза
45-99
8
Seg-9
17
RT
34-50
9
Seg-10
55
RT
210-264
10
Seg-11
34
RT
309-342
11
Seg-12
34
Интеграза
210-243
12
Seg-13
17
Интеграза
266-282
13
Seg-14
23
Vif
25-50
14
Seg-15
19
Vif
166-184
15
Seg-16
13
Nef
56-68
16
Общая длина: 529 (включая линкеры A, AA или AAA)
4. Включение лидерной последовательности
Сигнальные пептиды являются, как правило, очень гидрофобными аминокислотными последовательностями (длиной 15-60 аминокислот), белков, которые должны пересечь мембраны, чтобы достичь расположения в клетке, где они функционируют. При связывании с распознающими сигнальный пептид частицами, эти последовательности направляют комплексы белок в стадии возникновения-рибосомы к мембране, в которую белок вставляется во время трансляции. Сигнальные пептиды предписывают поступательное внедрение белка в различные мембраны (например, эндоплазматический ретикулум, митохондрии, хлоропласт, пероксисому). Лидерные сигнальные последовательности в немембранных белках, в конечном счете, удаляются с помощью специфических пептидаз.
Некоторые используемые сигнальные пептиды включают хемокин MCP-3, для стимуляции секреции и притяжения антигенпрезентирующих клеток; происходящий из катенина (CATE) пептид для увеличения протеасомной деградации; и лизосомальный связанный белок, LAMP1 для направленной доставки к компартменту MHC II. Смотрите Rosati M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009; 106: 15831-15836.
При текущей разработке, сигнальный пептид из GMCSF (гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора) был присоединен к N-концу иммуногена для увеличения секреции иммуногена из экспрессирующих клеток, за которым следовал валин для увеличения стабильности. Последовательностью сигнального пептида GMCSF является:
MWLQSLLLLGTVACSIS (SEQ ID NO: 46)
5. Включение метки для экспериментов, относящихся к in-vitro экспрессии.
С целью оценки экспрессии в трансфецированных клетках, последовательность иммуногена сначала включала FLAG-пептид на C-конце, до стоп-кодона, имеющий последовательность:
DYKDDDDKL (SEQ ID NO: 48)
В FLAG-системе используется короткий, гидрофильный 8-аминокислотный пептид, который слит с представляющим интерес рекомбинантным белком. FLAG-пептид включает сайт связывания нескольких очень специфических моноклональных антител против FLAG (M1, M2, M5; Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, США), которые могут использоваться для оценки экспрессии представляющего интерес белка в материале из трансфецированных клеток.
Из-за небольших размеров метки в виде FLAG-пептида, она не экранирует другие эпитопы, домены или не изменяет функцию, секрецию или перенос слитого белка, как правило. Эту последовательность удаляли впоследствии для анализа иммуногенности у мышей. FLAG-метку удаляют из конечного иммуногена (298H) до иммунизации.
6. Описание T-клеточного иммуногена
T-клеточный иммуноген имеет следующую последовательность (SEQ ID NO: 49):
где
сигнальный пептид GMCSF подчеркнут, валин, который следует сразу же за сигнальной последовательностью, выделен, линкеры в виде одного, двух или трех A (AAA) представлены с использованием жирного шрифта, эпитоп FLAG (удаленный в конечной конструкции для in-vivo исследований) представлены с использованием курсивного шрифта, а различные сегменты представлены в скобках, как указано ниже:
Номер сегмента
Полипептид ВИЧ
Ген ВИЧ
(…)<sub> S1</sub>
p17 (Seg-1)
<img file="00000002.jpg" he="15" wi="19" img-content="undefined" img-format="jpg" />
(…)<sub> S2-6</sub>
p24 (Seg-2 или Seg-6)
(…)<sub> S7</sub>
p2p7p1p6 (Seg-7)
(…)<sub> S8</sub>
Prot (seg-8)
<img file="00000003.jpg" he="15" wi="18" img-content="undefined" img-format="jpg" />
(…)<sub> S9-11</sub>
RT (Seg-9 или Seg-11)
(…)<sub> S12-13</sub>
Int (Seg-12 и Seg-13
(…)<sub> S14-15</sub>
Vif (Seg-14 и Seg-15)
Vif
(…)<sub> S16</sub>
Nef (Seg-16)
Nef
7. Оптимизация кодонов нуклеотидной последовательности
Последовательность T-клеточного иммуногена преобразовывали в нуклеотидную последовательность с оптимизацией кодонов/РНК для увеличения экспрессии и секреции (Mr. Gene GmbH, Regensburg, DE). Оптимизация кодонов основывалась на введении множества замен нуклеотидов для нарушения ранее определяемого РНК-процессинга, ингибиторных последовательностей и последовательностей нестабильности в мРНК без оказания влияния на кодируемый белок. Смотрите Schwartz S, et al., J. Virol. 1992; 66(12): 7176-7182. Этот процесс может также включать исключение предсказанных сайтов сплайсинга (с оценкой >0,4) из кодирующих последовательностей с помощью соответствующего изменения кодонов, для минимизации возможности сплайсинга.
В результате замен нуклеотидов, указанных выше, конечное содержание GC в T-клеточном иммуногене составляло 63%. Полной нуклеотидной последовательностью с оптимизацией кодонов является (SEQ ID NO: 50):
где последовательность, кодирующая сигнальный пептид GMCSF, подчеркнута, кодон для валина, сразу же 3' от последовательности, кодирующей сигнальную последовательность, выделен, последовательность, кодирующая иммуногенный полипептид, представлена с использованием стандартных букв, последовательность, кодирующая Flag-метку, представлена с использованием курсивного шрифта, а стоп-кодоны tga и taa представлены с использованием прописных букв.
8. Стратегия клонирования
T-клеточный иммуноген с оптимизацией кодонов был клонирован в плазмиду для экспрессии в клетках млекопитающих BV5, которая состоит из модифицированного остова плазмиды на основе CMV, оптимизированного для роста в бактериях, который содержит промотор цитомегаловируса человека (CMV), сайт полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) и ген устойчивости к канамицину, в котором отсутствует сайт для Xho. Стадиями клонирования были следующие стадии:
1) На первой стадии, в синтезированный T-клеточный иммуноген, включающий эпитоп FLAG, была введена замена аминокислоты Leu на Meth в положении 41 RT (сегменте 9), которое относится к одному из основных сайтов мутаций резистентности к антиретровирусному агенту. Ген T-клеточного иммуногена (исходный вектор) был клонирован в плазмиду с кассетой устойчивости к спектомицину. Созданный с помощью ПЦР сегмент, охватывающий замену М41 RT, был вставлен в T-клеточный иммуноген как SpeI/HindIII-фрагмент. Компетентные клетки DH108B использовали для трансформации и выращивали в среде LB-спектомицин. Результирующую плазмиду назвали HIVACAT RT M41. Введение точечной мутации подтверждали с помощью ПЦР, используя смысловой и антисмысловой праймеры, охватывающие последовательность сегмента 9.
2) На второй стадии ген HIVACAT RT M41 встраивали в плазмиду BV5, в которой отсутствует сайт для Xho в гене устойчивости к канамицину, как SalI/EcoRI-фрагмент, посредством лигирования вектора и очищенного из геля, расщепленного фрагмента HIVACAT RT M41. Компетентные клетки DH108B использовали для трансформации и выращивали в среде LB-Kan. Результирующую плазмиду назвали 297H (GMCSF-HIVACAT-FLAG). Встраивание гена подтверждали с помощью расщепления рестриктазами и секвенирования с использованием ПЦР, используя смысловой (из промотора CMV) и антисмысловой праймеры (из района полиА BGH).
3) На третьей стадии эпитоп для FLAG-метки удаляли из плазмиды 297H посредством расщепления BstEII-EcoRI и вставки подвергнутых отжигу праймеров 298H Plus и 298H Minus:
Результирующую плазмиду назвали 298H GMCSF-HIVACAT, идентификационный номер DSM 25555). Смотрите фиг.1. Удаление FLAG-метки подтверждали с помощью секвенирования с использованием ПЦР, используя антисмысловые праймеры (из района полиА BGH).
Пример 1
Исследования in-vitro экспрессии
Было выполнено несколько транзиторных трансфекций для оценки экспрессии, локализации и стабильности Т-клеточного иммуногена HIVACAT.
6
Вкратце, 1×10 клеток человека 293 в полной среде DMEM плюс 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) высевали в 60-мм чашки для культивирования тканей и допускали их адгезию в течение ночи. Клетки HEK 293 трансфецировали с помощью копреципитации ДНК с использованием фосфата Ca всего 7 мкг ДНК (100 нг или 250 нг плазмидной ДНК 297H GMCSF-HIVACAT-FLAG, 50 нг GFP-экспрессирующей плазмиды pFRED143, дополненных до 7 мкг с помощью ДНК Bluescript).
Через 6 часов после трансфекции среду замещали на 3 мл DMEM, дополненной 2% FCS. Через 24 и 48 ч клетки и супернатанты собирали в 0,5X RIPA.
Экспрессию белка анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Вносили 1/250 от всего количества клеточных экстрактов и супернатантов. Белки разделяли с помощью электрофореза в 10% полиакриламидных гелях с натрия додецилсульфатом (Nu-Page Bis-Tris, NuPAGE, Invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, США) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны.
Плазмиду 297H детектировали после исследования мембран с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена моноклонального антитела против FLAG (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, США) в разведении 1:3000.
Полосы визуализировали, используя ECL. Изображения мембран получали на ChemiDoc XRS+.
Положительные контроли были использованы и включали плазмидную ДНК, кодирующую р55 Gag клада В, которая также содержала FLAG-метку.
Экстракты клеток, транзиторно трансфицированных плазмидой 298H (кодирующей Т-клеточный иммуноген HIVACAT без FLAG-метки) исследовали с использованием сыворотки от ВИЧ-1-инфицированного человека в разведении 1:3000, а затем конъюгированного с пероксидазой хрена антитела человека против IgG, в разведении 1:10000.
Плазмиды 297H и 298H стабильно (одинаковое оцененное количество через 24 ч и 48 ч) экспрессировали конструкцию Т-клеточного иммуногена HIVACAT, которую визуализировали в компартменте клеточного экстракта. Не было признака секреции конструкции.
Пример 2
Клеточная реакция у мышей
Маточный раствор 1 мл (2 мг/мл) ДНК 298H GMCSF-HIVACAT создавали без эндотоксина для in vivo исследований на мышах.
Иммуногенность Т-клеточного иммуногена HIVACAT оценивали на самках мышей C57BL/6 возрастом 6-8 недель (Charles River Labs, Inc., Frederick, MD, США).
20 мкг и 5 мкг ДНК доставляли внутримышечно с помощью электропорации, используя систему Inovio (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA, США) в левую и правую четырехглавые мышцы (20 мкг/50 мкл на дозу, 25 мкл в каждое место) на неделе 0 и 4. Мышей умерщвляли через 2 недели после последней иммунизации. Спленоциты и сыворотку мышей собирали для исследований иммуногенности. Использованными контрольными ДНК были:
1) 114H p55 gag clade B: экспрессирует полноразмерный белок gag;
2) 132H NTV: экспрессирует химерный белок nef, tat и vif;
3) 133H pol: экспрессирует полноразмерный белок pol; и
4) BV4 CMV-kan-Basic: симулянт-контроль, схожий остов ДНК-плазмиды без какого-либо экспрессируемого трансгена.
В эксперименте использовали 35 мышей, объединяя 5 мышей в каждую группу. Распределение иммунизаций по группам было следующим:
Группы
Количество инокулятов
Доставка
Доза
ДНК/место(четырехглавые мышцы)
n
1
114 p55 gag clade B
внутримышечно Inovio
20 мкг
25 мкл в каждое место
5
2
114 p55 gag clade B+132H NTV+133 pol
внутримышечно Inovio
20 мкг каждого
25 мкл в каждое место
5
3
298H GMCSF-HIVACAT
внутримышечно Inovio
20 мкг
25 мкл в каждое место
5
4
114 p55 gag clade B
внутримышечно Inovio
5 мкг
25 мкл в каждое место
5
5
114 p55 gag clade B+132H NTV+133 pol
внутримышечно Inovio
5 мкг каждого
25 мкл в каждое место
5
6
298H GMCSF-HIVACAT
внутримышечно Inovio
5 мкг
25 мкл в каждое место
5
7 (Симулянт)
BV4 CMVKan-Basic
внутримышечно Inovio
20 мкг
25 мкл в каждое место
5
На первой стадии клеточные иммунные реакции были охарактеризованы, используя окрашивание внутриклеточных цитокинов (ICS) в объединенных спленоцитах (клетках от 5 мышей, относящихся к группе) и используя пул перекрывающихся пептидов, охватывающих все белки gag, pol, nef, tat и vif.
6
Вкратце, объединенные выделенные спленоциты из каждой группы мышей инкубировали в плотности 2×10 клеток/мл, в 1 мл сокультуры в течение ночи, в присутствии пулов пептидов (15-аминокислотных, перекрывающихся на 11 аминокислот, охватывающих gag клада В, консенсусные последовательности pol B и nef, tat и vif NL43, 1 мкг/мл каждого пептида, всего в течение приблизительно 12 часов, 1 час без ингибитора переноса белков GolgiStop для предотвращения секреции цитокинов). Иммуноокрашивание поверхности выполняли с использованием CD3-аллофикоцианин-Cy7, CD4-PerCP, CD8-Pacific Blue (BD Biosciences, Inc., Franklin Lakes, NJ, США). Окрашивание внутриклеточных цитокинов выполняли, используя антитело против интерферона-γ с FITC (BD Biosciences, Inc., Franklin Lakes, NJ, США) после пермеабилизации.
Исходя из первого анализа иммуногенности, и 20 мкг, и 5 мкг ДНК действительно вызывали у мышей C57BL/6 выявляемые ответы в виде продукции интерферона-γ на целые пулы пептидов gag, pol и nef-tat-vif. Смотрите фиг.2a. Представлено распределение CD4+ и CD8+ реакций. Смотрите фиг.2b.
На уровне отдельной мыши, ответы были подвергнуты деконволюции, используя замороженные спленоциты, подвергнутые стимуляции с использованием 8 пулов пептидов, которые охватывали белковые субъединицы, включенные в иммуноген, в анализе ELISpot для интерферона-γ.
5
2
Анализ ELISpot выполняли, используя набор для ELISpot для интерферона-γ (ALP) (Mabtech AB, Stockholm, SE), следуя инструкциям производителя с незначительными модификациями. В случае всех анализов, мышиные спленоциты добавляли во вводимом количестве клеток равном 4×10 клеток/лунку в 140 мкл среды 1640 Rosewell Park Memorial Institute с 10% фетальной телячьей сывороткой в 96-луночные планшеты из поливинилидена (Millipore Corp., Bedford, MA, США) отдельно или вместе с пулом ВИЧ-1-специфических пептидов (конечная концентрация каждого пептида равна 14 мкг/мл) на 16 часов при 37°C в 5% СО. Восемь пулов пептидов, при этом каждый пул содержал 2-12 пептидов из 18 аминокислот на основе консенсусной для клада В последовательности 2001, были объединены в различные белковые субъединицы (gag-p17, gag-p24, gag-p2p7p1p6, pol-RT, pol-протеаза, pol-интеграза, vif и nef), охватывающие сегменты, включенные в Т-клеточный иммуноген HIVACAT. Смотрите http://hiv-web.lanl.gov/content/hiv-db/CONSENSUS/M_GROUP/Consensus.h™l, January 2012. Пулы пептидов ВИЧ, использованные в случае мышей, иммунизированных ДНК, экспрессирующими полноразмерные белки gag, pol, nef, tat и vif, состояли из 18-аминокислотных пептидов с перекрытием, составляющим 11 остатков, охватывающих полные белки gag (6 пулов, 11 пептидов/каждый), pol (8 пулов, 16 или 17 пептидов/каждый), nef (2 пулов, 13 или 14 пептидов/каждый), tat (1 пул, 12 пептидов) и vif (2 пула, 12 пептидов/каждый).
Конкавалин A (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, США), в концентрации 5 мг/мл, использовали в качестве положительного контроля. Планшеты проявляли одностадийно с использованием смеси 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросиний тетразолий (BCIP/NBT, Bio-Rad Laboratories, Inc., Irvine, CA, США). Споты в планшетах подсчитывали, используя автоматическую считывающую систему для ELISPOT (CTL Analyzers LLC, Cleveland, OH, США), используя программное обеспечение ImmunoSpot software, и величину ответов представляли в виде количества спот-образующих клеток (SFC) на миллион введенных спленоцитов. Пороговое значение для положительных ответов определяли как по меньшей мере 5 спотов на лунку и ответы, превышающие «среднее число спотов в лунках отрицательных контролей плюс 3 среднеквадратических отклонения для лунок отрицательных контролей» и «3Х среднее значение в лунках отрицательных контролей», тот, который больше.
1) Доминирование ответов в виде продукции интерферона-γ, развивающихся у мышей, иммунизированных плазмидами, кодирующими полные белки gag, pol, nef, tat и vif, было в сторону участков вне сегментов, охватываемых Т-клеточным иммуногеном HIVACAT, (среднее отношение ответов, специфических в отношении участков иммуногена HIVACAT/всю сумму gag+pol+nef+tat+vif, равнялось 0,26 (диапазон 0,17-0,42) и не отличалось между группами, иммунизированными высокой дозой (20 мкг) или низкой дозой (5 мкг) ДНК. Смотрите фиг.3.
2) Средняя широта ответов на белковые субъединицы, включенные в последовательность Т-клеточного иммуногена HIVACAT, составляла 4 (диапазон 2-5) у мышей, иммунизированных 20 мкг HIVACAT, в сравнение с 2 ответами (диапазон 1-3) у мышей, иммунизированных 20 мкл плазмид, кодирующих полные белки (ns), без значимых различий в величине ответа. Шесть из восьми белковых субъединиц были мишенями по меньшей мере один раз у мышей, иммунизированных Т-клеточным иммуногеном HIVACAT. Смотрите фиг.4.
Сегменты Т-клеточного иммуногена HIVACAT
Белок ВИЧ-1
Номер пула
Пептиды/пул
Мыши, вырабатывающие ответ (группы Gag-Pol-NTV)
Мыши, вырабатывающие ответ (группы HIVACAT)
Seg-1
gag-p17
HTI-пул l1
10
0/10
3/10
Seg-2
gag-p24
HTI-пул l2
12
10/10
10/10
Seg-3
gag-p24
Seg-4
gag-p24
Seg-5
gag-p24
Seg-6
gag-p24
Seg-7
gag-p2p7p1p6
HTI-пул l3
3
0/10
0/10
Seg-8
pol-протеаза
HTI-пул l4
6
4/10
7/10
Seg-9
pol-RT
HTI-пул l5
11
5/10
9/10
Seg-10
pol-RT
Seg-11
pol-RT
Seg-12
pol--интеграза
HTI-пул l6
4
0/10
0/10
Seg-13
pol-интеграза
Seg-14
vif
HTI-пул l7
4
3/10
2/10
Seg-15
vif
Seg-16
nef
HTI-пул 8
2
0/10
1/10
4) Доминирование ответов у мышей, иммунизированных плазмидами, кодирующими полноразмерные белки gag, pol, nef, tat и vif, было в основном 89% направляемым в сторону gag, в то время как у мышей, иммунизированных Т-клеточным иммуногеном HIVACAT в высоких дозах, было более сбалансированным в отношении всех белковых компонентов (gag, pol, vif и nef), содержащихся в иммуногене. Смотрите фиг.5.
Пример 3
Гуморальный ответ у мыши
Гуморальные ответы сначала анализировали в объединенных сыворотках мышей. Антитела, связывающиеся с p24, p37 и p55, детектировали с помощью Вестерн-блоттинга, используя экстракты клеток HEK 293, трансфецированных 1 мг векторов для экспрессии gag, разделенные в 12% ПААГ с SDS, и исследуя мембраны с использованием объединенных сывороток мышей (в разведении 1:100). Титры антител против р24 gag определяли с помощью ELISA. Последовательные 4-кратные разведения образцов объединенных сывороток оценивали, и определяли оптическую плотность при 450 нм (Advanced Bioscience Lab, Inc., Kensington, MD, США). Данные о титрах связывающих антител представляли как положительная величина - оценка наибольшего разведения, имеющая значение, превышающее среднее значение плюс 3 среднеквадратических отклонения, полученное с использованием контрольной сыворотки от мышей, иммунизированных ДНК-симулянтом.
a) Исходя из первого гуморального анализа иммуногенности, Т-клеточный иммуноген HIVACAT индуцировал продукции антител, связывающихся с p55, p37 и p24 gag, выявляемых с помощью Вестерн-блоттинга в группе мышей, иммунизированных 20 мкг. Смотрите фиг.6.
b) Количество антител, связывающихся с p24, определяли с помощью ELISA. Титры в конечной точке специфических в отношении gag-p24 связывающих антител от мышей, которые получили описанные плазмиды, определяли с помощью ELISA, исходя из индивидуальных последовательно 4-кратно разводимых образцов объединенных сывороток. В группе мышей, иммунизированных высокой дозой Т-клеточного иммуногена HIVACAT, титры, составляющие 1:4000, были ниже титров, выявляемых у мышей, иммунизированных конструкцией полноразмерного gag. Антитела, связывающие с p24, невозможно было определить в группу мышей, иммунизированных низкой дозой. Смотрите фиг.7a. На уровне отдельных мышей, ELISA для р55 gag собственной разработки, используя рекомбинантный белок pr55 gag ВИЧ-1IIIB (каталожный № 3276, NIH Reagent Program, Bethesda, MD, США), был выполнен с использованием сывороток мышей в разведении 1:100. Низкие уровни антитела можно было выявить у 2 из 3 мышей, иммунизированных высокой дозой иммуногена. Смотрите фиг.7b.
Пример 4
In-vivo иммуногенность у мышей, подвергнутых гетерологичным схемам примирования/бустинга.
МАТЕРИАЛЫ и МЕТОДЫ
Приготовление вакцин на основе пДНК-HIVACAT и MVA-HIVACAT
T-клеточный иммуноген с оптимизацией кодонов был клонирован в плазмиду для экспрессии в клетках млекопитающих BV5, которая состоит из модифицированного остова плазмиды на основе CMV, оптимизированного для роста в бактериях, который содержит промотор цитомегаловируса человека (CMV), сайт полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) и ген устойчивости к канамицину, в котором отсутствует сайт для Xho. Плазмидную ДНК для иммунизаций мышей готовили, используя Endo-Free Megaprep (Qiagen), и хранили при -80°C до использования.
Рекомбинантный MVA, экспрессирующий ген HIVACAT, был создан, как описывалось ранее {Letourneau, 2007 #235; Nkolola, 2004 #321}. Вкратце, фибробласты куриных эмбрионов (CEF), выращенные в модифицированной Дульбеко среде Игла, дополненной 10% FBS, пенициллином/стрептомицином и глютамином (DMEM 10), инфицировали исходным MVA с MOI (множественностью заражения)=1 и трансфецировали, используя Superfectin (Quiagen), 3 мкг пДНК-HIVACAT, содержащей ген β-галактозидазы в качестве маркера. Спустя два дня все количество вируса собирали и использовали для повторного инфицирования клеток CEF. MVA подвергали пяти циклам очистки из бляшек, после чего основной запас вируса выращивали, очищали через 36% сахарозную «подушку», титровали и хранили при -80°C до использования.
In-vivo иммуногенность у мышей C57BL/6
.
6
В случае экспериментов для исследования in-vivo иммуногенности у мышей,подвергнутых гетерологичным схемам примирования/бустинга, использовали группы из пяти самок мышей C57BL/6 возрастом 6-8 недель (Harlan Laboratories Ltd., Barcelona, Испания). Мышей примировали внутримышечно с использованием 100 мкг пДНК-HIVACAT (2 или 3 вакцинации) с последующим бустингом с использованием 10 pfu (бляшкообразующих единиц) MVA-HIVACAT (группы: 2хДНК, 3хДНК, 2хДНК+1 MVA и 3хДНК+1 MVA, соответственно). Все вакцинации осуществили с интервалом в три недели.
Всех мышей умерщвляли через две недели после последней вакцинации в каждом эксперименте. Спленоциты и сыворотку мышей собирали для исследований иммуногенности. Селезенки извлекали и прессовали через клеточный фильтр (Falcon), используя резиновый поршень 5-мл шприца. После лизиса эритроцитов, спленоциты промывали и ресуспендировали в RPMI 1640, дополненной 10% FCS, пенициллином/стрептомицином (R10), и хранили до использования.
Все процедуры с животными и уход за ними были санкционированы местным Комитетом по этике.
Перекрывающиеся пептиды и распределение пулов пептидов
Для оценки иммуногенности гетерологичных схем были использованы пДНК или MVA, экспрессирующая(ий) только Т-клеточный иммуноген HIVACAT, а для исключения иммуногенности потенциальных соединительных эпитопов была вновь синтезирована совокупность 147 перекрывающихся пептидов длиной 15 аминокислот (перекрывающихся по 11 остаткам), охватывающая весь Т-клеточный иммуноген HIVACAT (включая лидерную последовательность и линкерные участки), используя химическую структуру 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc). Пептиды были распределены по 18 отличным пулам, в соответствии с белковыми субъединицами и сегментами иммуногена (1 пул для последовательности сигнального пептида, n=4 пептида; 7 пулов для Gag, n=8-11 пептидов/каждый пул; 7 пулов для Pol, n=5-11 пептидов/каждый пул; 2 пула для Vif, n=6-8 пептидов/каждый пул и 1 пул для Nef, n=2 пептида). Результаты представляли в соответствии с ответами в виде продукции IFNγ, специфическими для восьми белковых субъединиц (р17 Gag, р24 Gag, р2р7р1р6 Gag, Pol-протеазы, Pol-RT, Pol-интегразы, Vif и Nef)
Анализ ELISPOT для IFN
мыши
γ
5
2
Анализ ELISpot выполняли, используя набор для ELISpot для IFNγ мыши (ALP) (Mabtech AB, Stockholm, SE), следуя инструкциям производителя с незначительными модификациями. В случае всех анализов, замороженные спленоциты мыши сначала оттаивали и выдерживали в течение 5 ч при 37°C в RIO до использования. Клетки добавляли во вводимом количестве клеток равным 4×10 клеток/лунку в 140 мкл RIO в 96-луночные планшеты из поливинилидена (Millipore Corp., Bedford, MA, США) отдельно или вместе с пулами ВИЧ-1-специфических пептидов (конечная концентрация каждого пептида равна 14 мкг/мл) на 16 часов при 37°C в 5% СО. Конкавалин A (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, США), в концентрации 5 мг/мл, использовали в качестве положительного контроля. Планшеты проявляли одностадийно с использованием смеси 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросиний тетразолий (BCIP/NBT, Bio-Rad Laboratories, Inc., Irvine, CA, США). Споты в планшетах подсчитывали, используя автоматическую считывающую систему для ELISPOT (CTL Analyzers LLC, Cleveland, OH, США), используя программное обеспечение ImmunoSpot software, и величину ответов представляли в виде количества спот-образующих клеток (SFC) на миллион введенных спленоцитов. Пороговое значение для положительных ответов определяли как по меньшей мере 5 спотов на лунку и ответы, превышающие «среднее число спотов в лунках отрицательных контролей плюс 3 среднеквадратических отклонения для лунок отрицательных контролей» и «3Х среднее значение в лунках отрицательных контролей», тот, который больше.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В этих экспериментах, поскольку мышей не подвергали иммунизации, используя плазмиды, кодирующие полноразмерные белки, вторую совокупность перекрывающихся пептидов, соответствующую точной последовательности иммуногена, синтезировали и использовали для сравнений иммуногенности. Эти внутримышечные (i.m.) иммунизации с использованием 100 мкг пДНК-HIVACAT были способны индуцировать частоты ответов в виде продукции IFNγ у всех мышей, которые были сравнимы с частотами ответов в виде продукции IFNγ, индуцируемых в результате иммунизаций с использованием системы для электропорации Inovio. Однако было установлено, что две внутримышечные иммунизации с использованием пДНК являются иммуногенными лишь у трех животных (60%) по сравнению с индукцией ответов у 100% животных после трех внутримышечных иммунизаций с использованием пДНК. Примечательно, что вакцина на основе MVA-HIVACAT была способна усилить ответы и по широте, и по величине (фиг.8B) в двух исследуемых группах, но действительно просто значительно увеличивала величину ответов, когда мыши были предварительно примированы с использованием трех доз пДНК-HIVACAT (фиг.8B и 8C). Как видно в предшествующих EP экспериментах, сбалансированный и широкий ответ на большую часть из всех белковых субъединиц, включенных в иммуноген, отмечался у всех животных, без отчетливого характера доминирования среди них. Специфические в отношении nef или gag-pl5 ответы не выявлялись у исследованных мышей (фиг.8D).
Хотя настоящее изобретение описано довольно подробно с целью ясности и понимания, квалифицированному в данной области техники специалисту будет понятно путем прочтения этого описания, что различные изменения формы и детали могут быть осуществлены, не выходя за пределы истинного объема настоящего изобретения и прилагаемой формулы изобретения.
Все публикации, упомянутые выше, таким образом, включены в их полном объеме посредством ссылки.
--->
Список последовательностей
<110>  Laboratorios del Dr. Esteve, S.A.
Fundació Privada Institut de Recerca de la SIDA-Caixa
Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats
<120>  ИММУНОГЕНЫ ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ ВИЧ
<130>  P7568PC00
<150>  EP12382031.8
<151>  2012-01-27
<160>  98
<170>  Патент в версии 3.5
<210>  1
<211>  78
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  1
Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys
1               5                   10                  15
His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro
20                  25                  30
Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu
35                  40                  45
Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Lys Ser Leu Tyr Asn
50                  55                  60
Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Lys Ile Glu Val
65                  70                  75
<210>  2
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  2
Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu
1               5                   10
<210>  3
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  3
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu
1               5                   10
<210>  4
<211>  60
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  4
Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly
1               5                   10                  15
Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro
20                  25                  30
Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu
35                  40                  45
Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile
50                  55                  60
<210>  5
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  5
Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala
1               5                   10
<210>  6
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  6
Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu
1               5                   10                  15
<210>  7
<211>  27
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  7
Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His
1               5                   10                  15
Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Ser Arg
20                  25
<210>  8
<211>  55
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  8
Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp
1               5                   10                  15
Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu
20                  25                  30
Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln
35                  40                  45
Ile Gly Cys Thr Leu Asn Phe
50                  55
<210>  9
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  9
Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu Leu Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys
1               5                   10                  15
Ile
<210>  10
<211>  55
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  10
Leu Arg Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro
1               5                   10                  15
Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp Thr Val
20                  25                  30
Gln Pro Ile Val Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Thr Val Asn Asp Ile
35                  40                  45
Gln Lys Leu Val Gly Lys Leu
50                  55
<210>  11
<211>  34
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  11
Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys Asp
1               5                   10                  15
Leu Ile Ala Glu Ile Gln Lys Gln Gly Gln Gly Gln Trp Thr Tyr Gln
20                  25                  30
Ile Tyr
<210>  12
<211>  34
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  12
Thr Lys Glu Leu Gln Lys Gln Ile Thr Lys Ile Gln Asn Phe Arg Val
1               5                   10                  15
Tyr Tyr Arg Asp Ser Arg Asp Pro Leu Trp Lys Gly Pro Ala Lys Leu
20                  25                  30
Leu Trp
<210>  13
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  13
Lys Ile Ile Arg Asp Tyr Gly Lys Gln Met Ala Gly Asp Asp Cys Val
1               5                   10                  15
Ala
<210>  14
<211>  26
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  14
Val Lys His His Met Tyr Ile Ser Lys Lys Ala Lys Gly Trp Phe Tyr
1               5                   10                  15
Arg His His Tyr Glu Ser Thr His Pro Arg
20                  25
<210>  15
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  15
Val Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys Pro Gln Lys Thr Lys
1               5                   10                  15
Gly His Arg
<210>  16
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  16
Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe
1               5                   10
<210>  17
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  17
Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys
1               5                   10                  15
His Ile Val Trp Ala Ser Arg
20
<210>  18
<211>  22
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  18
Lys Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala
1               5                   10                  15
Val Asn Pro Gly Leu Leu
20
<210>  19
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  19
Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu
20
<210>  20
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  20
Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr
1               5                   10                  15
Gly Ser Glu Glu Leu Lys Ser Leu
20
<210>  21
<211>  26
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  21
Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Lys Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr
1               5                   10                  15
Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Val
20                  25
<210>  22
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  22
Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu
1               5                   10
<210>  23
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  23
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu
1               5                   10
<210>  24
<211>  21
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  24
Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly
1               5                   10                  15
Thr Thr Ser Thr Leu
20
<210>  25
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  25
Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp
1               5                   10                  15
Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
20
<210>  26
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  26
Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr
1               5                   10                  15
Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu
20
<210>  27
<211>  22
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  27
Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met
1               5                   10                  15
Tyr Ser Pro Thr Ser Ile
20
<210>  28
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  28
Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala
1               5                   10
<210>  29
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  29
Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu
1               5                   10                  15
<210>  30
<211>  27
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  30
Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His
1               5                   10                  15
Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Ser Arg
20                  25
<210>  31
<211>  26
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  31
Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp
1               5                   10                  15
Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys Gly His Lys
20                  25
<210>  32
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  32
Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu
1               5                   10                  15
Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile
20
<210>  33
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  33
Val Leu Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu
1               5                   10                  15
Thr Gln Ile Gly Cys Thr Leu Asn Phe
20                  25
<210>  34
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  34
Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys
1               5                   10                  15
Ile
<210>  35
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  35
Leu Arg Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro
1               5                   10                  15
Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr Glu Leu
20                  25
<210>  36
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  36
Pro Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp Thr
1               5                   10                  15
Val Gln Pro Ile Val Leu Pro Glu Lys
20                  25
<210>  37
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  37
Thr Val Gln Pro Ile Val Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Thr Val Asn
1               5                   10                  15
Asp Ile Gln Lys Leu Val Gly Lys Leu
20                  25
<210>  38
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  38
Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys Asp
1               5                   10                  15
Leu Ile Ala Glu Ile Gln Lys
20
<210>  39
<211>  21
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  39
Ser Lys Asp Leu Ile Ala Glu Ile Gln Lys Gln Gly Gln Gly Gln Trp
1               5                   10                  15
Thr Tyr Gln Ile Tyr
20
<210>  40
<211>  22
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  40
Thr Lys Glu Leu Gln Lys Gln Ile Thr Lys Ile Gln Asn Phe Arg Val
1               5                   10                  15
Tyr Tyr Arg Asp Ser Arg
20
<210>  41
<211>  22
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  41
Asn Phe Arg Val Tyr Tyr Arg Asp Ser Arg Asp Pro Leu Trp Lys Gly
1               5                   10                  15
Pro Ala Lys Leu Leu Trp
20
<210>  42
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  42
Lys Ile Ile Arg Asp Tyr Gly Lys Gln Met Ala Gly Asp Asp Cys Val
1               5                   10                  15
Ala
<210>  43
<211>  26
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  43
Val Lys His His Met Tyr Ile Ser Lys Lys Ala Lys Gly Trp Phe Tyr
1               5                   10                  15
Arg His His Tyr Glu Ser Thr His Pro Arg
20                  25
<210>  44
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  44
Val Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys Pro Gln Lys Thr Lys
1               5                   10                  15
Gly His Arg
<210>  45
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная для ВИЧ клада В последовательность OLP
<400>  45
Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe
1               5                   10
<210>  46
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  46
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1               5                   10                  15
Ser
<210>  47
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Сигнальный пептид GM-CSF человека + V
<400>  47
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1               5                   10                  15
Ser Val
<210>  48
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Flag-метка
<400>  48
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu
1               5
<210>  49
<211>  556
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ВИЧ иммуноген, включающий OLP
<400>  49
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1               5                   10                  15
Ser Val Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys
20                  25                  30
Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val
35                  40                  45
Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly
50                  55                  60
Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Lys Ser Leu
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Lys Ile Glu Val
85                  90                  95
Ala Ala Ala Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala
100                 105                 110
Leu Ala Ala Ala Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Ala
115                 120                 125
Ala Ala Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile
130                 135                 140
Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn
145                 150                 155                 160
Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu
165                 170                 175
Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Ala Ala
180                 185                 190
Ala Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Ala
195                 200                 205
Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala
210                 215                 220
Ala Ala Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro
225                 230                 235                 240
Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Ser Arg Ala Ala Ala
245                 250                 255
Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp
260                 265                 270
Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu
275                 280                 285
Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gln
290                 295                 300
Ile Gly Cys Thr Leu Asn Phe Ala Ala Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu
305                 310                 315                 320
Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys Ile Ala Ala Ala Leu Arg Trp
325                 330                 335
Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro Pro Phe Leu
340                 345                 350
Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp Thr Val Gln Pro Ile
355                 360                 365
Val Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Thr Val Asn Asp Ile Gln Lys Leu
370                 375                 380
Val Gly Lys Leu Ala Ala Ala Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val
385                 390                 395                 400
Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys Asp Leu Ile Ala Glu Ile Gln Lys Gln Gly
405                 410                 415
Gln Gly Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Ala Ala Ala Thr Lys Glu Leu
420                 425                 430
Gln Lys Gln Ile Thr Lys Ile Gln Asn Phe Arg Val Tyr Tyr Arg Asp
435                 440                 445
Ser Arg Asp Pro Leu Trp Lys Gly Pro Ala Lys Leu Leu Trp Ala Ala
450                 455                 460
Ala Lys Ile Ile Arg Asp Tyr Gly Lys Gln Met Ala Gly Asp Asp Cys
465                 470                 475                 480
Val Ala Ala Ala Val Lys His His Met Tyr Ile Ser Lys Lys Ala Lys
485                 490                 495
Gly Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Glu Ser Thr His Pro Arg Ala Ala
500                 505                 510
Ala Val Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys Pro Gln Lys Thr
515                 520                 525
Lys Gly His Arg Ala Ala Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu
530                 535                 540
Val Gly Phe Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu
545                 550                 555
<210>  50
<211>  1674
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полинуклеотид, кодирующий иммуноген, включающий ВИЧ OLP
<400>  50
atgtggctcc agagcctgct actcctgggg acggtggcct gcagcatctc ggtcgagaag       60
atccggctgc ggccaggcgg aaagaagaag tacaagctga agcacatcgt ctgggcctcg      120
agggagctgg agcggttcgc ggtgaacccg ggacttctgg agacgtcgga ggggtgcagg      180
cagatcctcg gccagctgca gccctctctg caaacggggt ctgaggagct gaagagcctg      240
tacaacacgg tggcgaccct ctactgcgtc caccagaaga tcgaggtggc agcggccaag      300
gcgttctcgc cggaggtcat ccccatgttc tcggcgctgg cagctgccgg acaccaggcc      360
gcgatgcaga tgctgaagga ggccgctgcg atcgcaccgg gccagatgag ggagccacgc      420
ggttccgaca tcgcgggaac cacctcgacg ctccaggagc agatcggatg gatgacgaac      480
aacccgccaa tcccggtcgg ggagatctac aagcggtgga tcatcctcgg gctgaacaag      540
atcgtccgga tgtacagccc gacgtcgatc gctgcggcat acgttgaccg gttctacaag      600
accctgaggg ccgagcaggc agcggcctgc cagggggtcg gtggaccagg gcacaaggcc      660
cgagtgctcg cggccgcatg cacggagcgg caggcgaact tcctggggaa gatctggccg      720
tcgcacaagg gccgaccggg aaacttcctc cagtctcgcg cagcggctaa gatgatcgga      780
ggcatcggag gcttcatcaa agtccgtcag tacgaccaga tcctcatcga gatctgcggg      840
cacaaggcga tcggaaccgt gctcgtcggc ccaacgcccg tgaacatcat cggccgcaac      900
ctgttaacgc agatcggctg caccctcaac ttcgccgcac tagtggagat ctgcacggag      960
atggagaagg agggcaagat atcgaagatc gcggcagctc tgaggtgggg cttcaccacg     1020
ccggacaaga agcaccagaa ggagccgcca ttcctgtgga tgggatacga gctgcacccg     1080
gacaagtgga ccgtgcagcc catcgtcctg ccggagaagg actcgtggac ggtgaacgac     1140
atccagaagc tcgtggggaa gctggcggca gccatcctca aggagcccgt ccacggggtg     1200
tactacgacc cctctaagga cctgatcgcg gagatccaga agcaggggca gggtcagtgg     1260
acctaccaga tctacgcagc agcaaccaag gagctgcaga agcagatcac gaagatccag     1320
aacttccgcg tatactaccg cgactcgcgg gaccccctgt ggaagggccc tgcgaagctt     1380
ctctgggcag ccgcgaagat catccgggac tacggcaagc agatggcggg cgacgactgc     1440
gtggccgcag cggtgaagca ccatatgtac atctcgaaga aggcgaaggg ctggttctac     1500
agacaccact acgagtccac ccaccccagg gcagctgcgg tgacgaagct gacggaggac     1560
cggtggaaca agccccagaa gacgaagggt caccgggcgg ctgcatggct ggaggctcag     1620
gaggaggagg aggtgggctt cgattacaag gacgatgacg acaagctgtg ataa           1674
<210>  51
<211>  60
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  198HPlus праймер
<400>  51
gtcaccgggc ggctgcatgg ctggaggctc aggaggagga ggaggtgggc ttctgataag       60
<210>  52
<211>  59
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  298HMinus праймер
<400>  52
aattcttatc agaagcccac ctcctcctcc tcctgagcct ccagccatgc agccgcccg        59
<210>  53
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223   Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  53
Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys
1               5                   10                  15
His Ile
<210>  54
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  54
Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
<210>  55
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  55
Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg
<210>  56
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  56
Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu
1               5                   10                  15
Tyr
<210>  57
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  57
Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile
1               5                   10                  15
Glu Val
<210>  58
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  58
Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly
1               5                   10                  15
Ala
<210>  59
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  59
Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala
1               5                   10                  15
<210>  60
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  60
Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
1               5                   10                  15
Pro Val
<210>  61
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  61
Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala
1               5                   10                  15
Glu Ala
<210>  62
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  62
Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln
1               5                   10                  15
Ser Arg
<210>  63
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  63
Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro
1               5                   10                  15
Gln Val
<210>  64
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  64
Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr
1               5                   10                  15
Tyr Lys
<210>  65
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  65
Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp
1               5                   10                  15
Cys Phe
<210>  66
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  66
Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val
1               5                   10                  15
<210>  67
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  67
Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro Glu Lys Glu Val Leu Val Trp Lys
1               5                   10                  15
Phe
<210>  68
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  68
Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp
1               5                   10                  15
Gln Ile
<210>  69
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  69
Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys Gly
1               5                   10                  15
His Lys
<210>  70
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  70
Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu
1               5                   10                  15
Val
<210>  71
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  71
Leu Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr
1               5                   10                  15
Gln Ile
<210>  72
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  72
Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys
1               5                   10                  15
Ile
<210>  73
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  73
Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val Pro Leu Asp Lys Asp Phe
1               5                   10                  15
Arg Lys
<210>  74
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  74
Leu Arg Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro
1               5                   10                  15
Pro Phe
<210>  75
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  75
Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr Glu
1               5                   10                  15
Leu His
<210>  76
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  76
Glu Ile Gln Lys Gln Gly Gln Gly Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  77
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  77
Pro Pro Leu Val Lys Leu Trp Tyr Gln Leu Glu Lys Glu Pro Ile Val
1               5                   10                  15
Gly Ala
<210>  78
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  78
Ile His Leu Ala Leu Gln Asp Ser Gly Leu Glu Val Asn Ile Val
1               5                   10                  15
<210>  79
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  79
Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala His Lys Gly Ile Gly Gly Asn Glu
1               5                   10                  15
Gln Val
<210>  80
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  80
Ser Ala Gly Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Asp Gly Ile Asp Lys Ala
1               5                   10                  15
<210>  81
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  81
Thr Lys Glu Leu Gln Lys Gln Ile Thr Lys Ile Gln Asn Phe Arg Val
1               5                   10                  15
Tyr Tyr
<210>  82
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  82
Thr Lys Ile Gln Asn Phe Arg Val Tyr Tyr Arg Asp Ser Arg Asp Pro
1               5                   10                  15
Leu Trp
<210>  83
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  83
Tyr Tyr Arg Asp Ser Arg Asp Pro Leu Trp Lys Gly Pro Ala Lys Leu
1               5                   10                  15
Leu Trp
<210>  84
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  84
Lys Ile Ile Arg Asp Tyr Gly Lys Gln Met Ala Gly Asp Asp Cys Val
1               5                   10                  15
Ala
<210>  85
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  К Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  85
Gly Pro Gln Arg Glu Pro Tyr Asn Glu Trp Thr Leu Glu Leu Leu Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu
<210>  86
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  86
Asp Leu Asn Asn Asn Thr Asn Thr Thr Ser Ser Ser Gly Glu Lys Met
1               5                   10                  15
Glu Lys
<210>  87
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  87
Ile Arg Asp Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Leu Phe Tyr Lys Leu Asp
1               5                   10                  15
Val Val
<210>  88
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  88
Tyr Arg Leu Ile Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro
1               5                   10                  15
Lys Val
<210>  89
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  89
Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro
1               5                   10                  15
Ile His
<210>  90
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  90
Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val
1               5                   10                  15
<210>  91
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  91
Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg
1               5                   10                  15
Ala Val
<210>  92
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  92
Val Ile Glu Val Val Gln Arg Ala Cys Arg Ala Ile Leu His Ile Pro
1               5                   10                  15
Arg Arg
<210>  93
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  93
Val Lys His His Met Tyr Ile Ser Gly Lys Ala Lys Gly Trp Phe Tyr
1               5                   10                  15
Arg His
<210>  94
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  94
Gly Lys Ala Lys Gly Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Glu Ser Thr His
1               5                   10                  15
Pro Arg
<210>  95
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность OLP клада В
<400>  95
Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys Pro Gln Lys Thr Lys Gly
1               5                   10                  15
His Arg
<210>  96
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность метки
<400>  96
Ala His Gly His Arg Pro
1               5
<210>  97
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность метки
<400>  97
Pro Ile His Asp His Asp His Pro His Leu Val Ile His Ser
1               5                   10
<210>  98
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность метки
<220>
<221>  различный признак
<222>  (5)..(6)
<223>  Хаа может быть любой встречающейся в природе аминокислотой
<400>  98
Gly Met Thr Cys Xaa Xaa Cys
1               5
<---