СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ПРОЛАПСА ГЕНИТАЛИЙ У ЖЕНЩИН
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF DEVELOPING GENITAL PROLAPSE IN FEMALES

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования повышенного риска развития пролапса гениталий.
Известно, что частота пролапса гениталий (ПГ) составляет 15-30%, увеличиваясь с возрастом до 50-60%. Существуют расовые отличия частоты заболевания, свидетельствующие о том, что ПГ более характерен для женщин европеоидного и латино-американского происхождения по сравнению с афроамериканками (Whitcomb EL, Rortveit G, Brown JS, Creasman JM, Thom DH, Van Den Eeden SK, Subak LL. Racial differences in pelvic organ prolapse. Obstet Gynecol. 2009 Dec; 114(6): 1271-7). Значимым фактором риска развития ПГ является наследственность, которая может обусловливать до 40% случаев формирования ПГ (Altman, D., Forsman, М., Falconer, С., and Lichtenstein, P. (2008). Genetic influence on stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse. Eur. Urol. 54, 918-922).
В связи с этим чрезвычайно важно прогнозирование повышенного риска развития ПГ у женщин любого возраста.
Описан ряд способов решения этой задачи. Так, из патента RU 2341181 С1, Ящук А.Г. и др., от 20.12.2008 известен способ оценки риска формирования постгистерэктомического пролапса (ПГП) У женщины до операции гистерэктомии определяют возраст впервые возникшего ПГП; возраст менопаузы; длительность постменопаузального периода; паритет; наличие в анамнезе хронических бронхо-легочных заболеваний, связанных с хроническим кашлем; наличие в анамнезе ПГП у родственников первой степени родства; возраст на момент гистерэктомии; определяют наличие признаков дисплазии соединительной ткани, оценивая степени ее выраженности по шкале Смольновой Т.Ю.; наличие ПГП до гистерэктомии; уровень суточной экскреции оксипролина. Полученные анамнестические данные и результаты обследования подставляют в математические прогностические модели, по большему из полученных коэффициентов прогнозируют вероятность развития ПГП гениталий.
Недостатком данного способа является прогнозирование лишь предрасположенности к ПГП после гистерэктомии при наличии такового до операции, что не дает возможности прогнозировать риск развития заболевания в любом возрасте при отсутствии каких-либо симптомов патологии.
Близким аналогом является изобретение по патенту RU 2310849 С1, А.Г. Ящук и др., от 20.11.2007. Способ прогнозирования десценции тазового дна основан на выявлении полиморфизма гена интерстициального коллагена Со13АI. Выделяют геномную ДНК из лейкоцитов свежей или замороженной консервированной периферической венозной крови методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции. С помощью полимеразной цепной реакции синтеза ДНК амплифицируют фрагменты локусов Alu и VNTR гена коллагена 3 типа. При выявлении генотипов Alu -/- с отсутствием инсерции и VNTR*2*2 аллеля, прогнозируют риск развития тазовой десценции у обследуемых.
Однако в данной работе не показана корреляция между генотипом и экспрессией белка; в качестве негенетических факторов риска, учтенных в логистическом регрессионном анализе, указаны следующие ковариаты: гипермобильность суставов, варикозное расширение вен нижних конечностей, костные нарушения, наследственная отягощенность. Между тем, хорошо известно, что наибольшей специфичностью относительно риска развития ПГ являются такие факторы, как возраст и повреждения мягких родовых путей во время родов. Кроме того, предложенный способ основан на выявлении полиморфных вариантов в генах, контролирующих процессы формирования коллагенового, но не эластического волокна в структурах соединительной ткани.
Задача изобретения - разработка способа выявления высокого риска развития ПГ путем поиска новых критериев патологии.
Способ прогнозирования степени риска развития ПГ у женщин, заключающийся в отборе биоматериала для выделения ДНК, проведении генотипирования ДНК методом тетра-праймерной аллель-специфической ПЦР реакции, характеризуется выявлением полиморфизма гена FBLN5 по сайтам rs12586948 и rs2018736, при этом высокую степень риска развития ПГ прогнозируют при наличии аллелей однонуклеотидных вариантов rs12586948-A и/или rs2018736-C, а пониженную степень риска - при наличии аллелей однонуклеотидных вариантов rs12586948-G и/или rs2018736-A.
Технический результат - выявление объективных и информативных критериев прогнозирования высокого риска развития ПГ у женщин любого возраста.
В основе патентуемого способа лежат следующие предпосылки.
Процессы, развитие которых вызывает ослабление поддерживающих структур тазового дна, до сих пор окончательно неизвестны, однако предполагается, что генетически обусловленные различия в строении соединительной ткани могут вносить свой вклад в развитие этого патологического процесса. Например, в полногеномном исследовании близких родственников с ПГ (124 пробанда, всего 209 женщин) показана ассоциация участка хромосомы 9q21 с наследственным пролапсом гениталий (Allen-Brady К. Norton PA, Famham JM, Teerlink С, Cannon-Albright LA. Significant linkage evidence for a predisposition gene for pelvic floor disorders on chromosome 9q21. Am J Hum Genet. 2009 May; 84(5):678-82). Наиболее выраженная ассоциация получена для находящегося в межгенном участке однонуклеотидного варианта rs 11139451, что не позволяет установить возможные механизмы и метаболические пути, на которые может влиять данный полиморфизм.
Известно, что одним из ключевых белков соединительной ткани является матриксный белок фибулин-5 (FBLN5). Мутации в гене FBLN5 обусловливают развитие синдрома вялой кожи и возрастную дегенерацию макулы (http://omim.org/entry/604580; Jones RP, Ridlev С, Jowitt ТА, Wang MC, Howard M, Bobola N, Wane Т, Bishop PN, Kieltv CM, Baldock C, Loterv AJ, Trumn D. Structural effects of fibulin 5 missense mutations associated with age-related macular degeneration and cutis laxa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010 May; 51(5):2356-62). В экспериментальных исследованиях показана роль FBLN5 в аномальном эластогенезе, увеличении протеазной активности и ослаблении «поддержки» тазовых органов с возрастом (Drewes PG, Yanagisawa H, Starcher В, Hornstra IK, Csiszar K, Marinis SI, Keller P, Word RA. Pelvic organ prolapse in Fibulin-5 knockout mice: pregnancy changes in elastic fiber homeostasis in mouse vagina. Am J Pathol 2007; 170: 578-589). Таким образом, ген FBLN5 может рассматриваться как один из наиболее перспективных для изучения в качестве гена предрасположенности к ПГ.
Ген FBLN5 не имеет известных функциональных полиморфных вариантов, для которых была бы показана устойчивая ассоциация с экспрессией гена и заболеваниями соединительной ткани (Badger SA, Soong CV. O′Donnell ME, Sharif MA, Makar RR, Hughes AE. Common polymorphisms of Fibulin-5 and the risk of abdominal aortic aneurysm development. Vase Med. 2010 Apr; 15(2): 113-7; Brión M, Sanchez-Salorio M, Cortón M, de la Fuente M, Pazos B, Othman M, Swaroop A, Abecasis G, Sobrino B, Carracedo A: Spanish multi-centre group of AMD. Genetic association study of age-related macular degeneration in the Spanish population. Acta Ophthalmol. 2011 Feb; 89(1):e12-22. doi: 10.1111/j.1755-3768.2010.02040.X. Epub 2010 Nov 25).
В связи поставленной задачей была сопоставлена частота встречаемости минорных аллелей rs12586948-A и rs2018736-C у пациенток с ПГ и у здоровых женщин. Для ассоциативного исследования ПГ выбор сайтов для генотипирования был основан на использовании ресурса HaploView (version 4.2) для подбора таргетных SNP с целью покрытия всего гена. На фигуре 1 показана гаплотипическая структура гена FBLN5. Ген включает девять блоков сцепления, в каждом из которых было прогенотипировано по одному из таргетных SNP.
Методом тетра-праймерной аллель-специфической ПЦР реакции нами было определено распределение частот аллелей таргетных однонуклеотидных вариантов FBLN5 у пациенток с ПГ и у здоровых женщин. Группа с ПГ и здоровые женщины аналогичны по факторам риска (возраст, репродуктивный период или менопауза/постменопауза, количество родов естественным путем, повреждение родовых путей в процессе родов). Статистическая обработка данных основывалась на множественном регрессионном анализе с учетом в качестве ковариат факторов риска.
Все изученные варианты находились в состоянии равновесия по Харди-Вайнбергу. Минорные аллели rs12586948-A и rs2018736-C чаще встречались у женщин с ПГ по сравнению с контрольной группой (множественный регрессионный анализ - аддитивная модель: Р=0.01, OR=1.59, 95% ДИ: 1.11-2.28 и Р=0.03, OR=1.38, 95% ДИ: 1.03-87, соответственно (Таблица 2). Гаплотип АС при частоте встречаемости 18.46% характеризовался значимостью эффекта: Р=0.0071, OR=1.73, 95% ДИ: 1.16-2.58.
В протокол обследования включается генотипирование на предмет выявления полиморфных вариантов гена FNLN5 (rs12586948 и rs2018736), которое проводится в один этап на стандартном оборудовании для ПЦР-лаборатории. Для генотипирования образцы крови собирают в вакутейнеры, содержащие ЭДТА, и хранят при ~(20-80)°С до выделения ДНК. Для генотипирования ДНК выделяют из цельной крови с помощью наборов Diatom DNA Prep 200, основанных на использовании гуанидинтиоционата и Nucleus-сорбента (Isogene Lab.Ltd, Россия). Для проведения ПЦР реакции используют лиофилизированные готовые наборы Master Mix (Фирма Изоген), в которые добавляют 10 мкл ПЦР-растворителя (Фирма Изоген), 3 мкл праймеров (оптическая плотность 3-4 о.е.), 2 мкл деионизованной воды, 5 мкл исследуемой ДНК. Праймеры и условия ПЦР реакции описаны в таблице 3. Амплификацию проводят в амплификаторе Applied Biosystems 9700 (GeneAmp PCR System 9700). Визуализацию результатов осуществляют в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.
В нижеследующих примерах приведены доказательства возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата.
Пример 1. Пациентка из основной группы (образец №181).
Негенетические факторы риска (в основном отсутствуют):
- пременопаузальный период (49 лет),
- не занимается тяжелым физическим трудом,
- без вредных привычек,
- одни роды, вес ребенка менее 4 кг, без повреждения родовых путей.
В норме экспрессия фибулина 5 в тканях эпителия, эндотелия, фибробластах и экстрацеллюлярном матриксе составляет 6 баллов. Иммуногистохимическое исследование тканей влагалища пациентки показало сниженную экспрессию фибулина 5: эпителий - 4 балла, эндотелий - 4 балла, фибробласты - 4 балла, экстрацеллюлярный матрикс - 3 балла.
Данные иммуногистохимического исследования коррелируют с генотипическими данными: пациентка является носительницей гомозиготных минорных вариантов по обоим сайтам гена FBLN5 (rs12586948-A/A и rs2018736-C/C), ассоциированных по результатам исследования с наследственной предрасположенностью к ПГ.
Пример 2. Пациентка из основной группы (образец №95).
Негенетические факторы риска присутствуют частично:
- пременопаузальный период (51 год),
- не занимается тяжелым физическим трудом,
- без вредных привычек,
- трое родов, ребенок (дети) более 4 кг, без повреждения родовых путей.
Иммуногистохимическое исследование тканей влагалища показало сниженную экспрессию фибулина 5: эпителий - 4 балла, эндотелий - 6 балла, фибробласты - 4 балла, экстрацеллюлярный матрикс - 2 балла.
Пациентка является гетерозиготной носительницей минорных аллелей по обоим сайтам гена FBLN5 (rs12586948-G/A и rs2018736-A/C), ассоциированных по результатам исследования с наследственной предрасположенностью к ПГ.
Пример 3. Пациентка из контрольной группы (образец №267).
Негенетические факторы риска присутствуют:
- постменопаузальный период (71 год; более 10 лет постменопауза),
- не занимается тяжелым физическим трудом,
- без вредных привычек,
- двое родов с повреждением родовых путей. Повреждение родовых путей рассматривается как основной фактор риска развития ПГ (Dietz HP. Genetics of pelvic organ prolapse: comment. Int Urogynecol J. 2012 Apr; 23(4):509-10).
Пациентка является гомозиготной носительницей мажорных (протективных) аллелей по обоим сайтам гена FBLN5 (rs12586948-G/G и rs2018736-A/A), ассоциированных по результатам исследования со снижением риска формирования ПГ.
Таким образом, высокую степень риска развития ПГ возможно прогнозировать при выявлении минорных аллелей однонуклеотидных вариантов rs12586948-A и/или rs2018736-C.
Патентуемый способ позволяет выявить пациенток с высокой степенью риска развития ПГ для проведения своевременных и целенаправленных мероприятий по профилактике развития данной патологии.
Таблица 1
Список таргетных SNP
Блок сцепления
№ SNP на фигуре
Идентификационный номер в db SNP (rs)
1
1
rs2430339
2
5
rs12586948
3
7
rs2284337
4
22
rs2498841
5
41
rs2018736
6
46
rs12589592
7
51
rs2284340
8
58
rs2245701
9
64
rs2474028
Таблица 2
Частоты генотипов и аллелей, ассоциированных с ПГ
Сайт
Аллели и генотипы
Контроль, n (%)
ПГ, n (%)
rs12586948
G
428 (79.9)
298 (73.4)
А
108 (20.1)
108 (26.6)
GG
170 (63.4)
110 (54.2)
GA
88 (32.8)
78 (38.4)
АА
10 (3.7)
15 (7.4)
rs2018736
А
330 (61.8)
226 (53.8)
С
204 (38.2)
194 (46.2)
АА
103 (38.6)
62 (29.5)
АС
124 (46.4)
102 (48.6)
СС
40 (15.0)
46 (21.9)
Таблица 3
Праймеры и условия ПЦР реакции
Праймеры 5′-3′
Условия амплификации
SNP
F (внешний прямой),
Соотношение праймеров в реакционной смеси (в частях)
Режимы
Длины фрагментов (п.н.)
R (внешний обратный),
F (внутренний, в скобках указан аллельный вариант),
R (внутренний, в скобках указан аллельный вариант)
rs12586948
F atactccaccctggacaacg
0.8
94° - 1 мин, (94° - 30 сек, 63.8° - 25 сек, 72° - 25 сек) × 32 цикла, 72° - 5 мин
395
R tggttctgcccaagactagc
1.0
F(a) tactgagccagaatctgta
1.0
235
R(g) cctgtggattgtgttaagcc
0.8
198
rs2018736
F acgaccccagagtagcagaa
1.0
94° - 1 мин, (94° - 30 сек, 61° - 30 сек, 72° - 30 сек) × 32 цикла, 72° - 5 мин
542
R gactcctgagcagaggcatt
1.0
F(c) tgccctttctcagccac
1.0
193
R(a) gctggtgctcatagagggt
1.0
384