Исследование гомозиготности двух сублиний BALB/cY и BALB/cP высоко инбредной линии BALB/c

БИОМЕДИЦИНА • №1 2009, с. 49-54

ГЕНЕТИКА

Исследование гомозиготности двух сублиний BALB/cY и BALB/cP высоко инбредной линии BALB/c

Х.Х.Семенов, Н.Н.Каркищенко, Т.Б.Бескова, Е.Л.Матвеенко

Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва

Настоящая работа посвящена исследованию гомозиготности мышей двух сублиний: BALB/cY - поддерживаемой в ГУ НЦБМТ РАМН лабораторией генетики, и BALB/cP - находящейся на размножении в питомнике лабораторных животных филиала ФИБХ РАН. Исследование проводилось методом изотрансплантации кожи. Установлено, что у мышей BALB/cY трансплантаты прижились стопроцентно. Это означает, что мыши линии BALB/cY - гомозиготны, генетически стандартны. Согласно результатам исследования между мышами линии BALB/cY и BALB/cP проявилась сублинейная гистонесовместимость. вместе с тем, генетически неоднородными оказались мыши внутри самой сублинии BALB/cP.

Ключевые слова: трансплантация, гомозиготность, инбредные мыши, сублиния.

Иммуногенетика - наука, включающая в себя методы и принципы как генетики, так и иммунологии. Одно из главных направлений в иммуногенетике составляет генетика совместимости тканей. Основные данные, которые определяют современный уровень в этой области знаний были получены в результате изучения одного объекта - лабораторной мыши [6]. Причина выбора мышей в качестве объекта исследований заключается в том, что уже в первой половине прошлого столетия было выведено большое количество инбредных линий мышей [8], а также в исключительных успехах генетики мыши [5]. Использование генетически контролируемых животных составляет необходимое условие успешного развития генетики совместимости тканей.

Гомозиготность, генетическая стандартность линейных животных поддерживается строгим соблюдением правил

разведения инбредной линии - постоянным, тесным инбридингом, методом братско-сестринского скрещивания. Однако даже при тщательном соблюдении всех правил существует опасность возникновения гетерозиготности в высоко инбредных линиях животных. Причиной тому могут явиться как спонтанные мутации, вызванные естественным фоном радиации и другими вредными факторами окружающей среды, так и случайные скрещивания [7]. Поэтому необходимым условием для производства качественных лабораторных животных является обеспечение постоянного контроля генетической чистоты инбредных линий по генам гистосовместимости.

Материалы и методы

Для исследования были использованы мыши двух сублиний высоко инбред-

ной линии BALB/c - BALB/cY, которая поддерживается в коллекционном фонде мышей инбредных линий НЦБМТ РАМН. Мыши BALB/c поступили из Джексоновской лаборатории США в 1958 г. на 70-м поколении инбридинга (F70) в филиал «Столбовая». В Научный центр (ранее НИЛЭБМ РАМН) линия была передана из филиала «Столбовая» на 105-м поколении инбридинга (F105). В настоящее время инбредный возраст линии BALB/cY достиг 188 поколения (F188). Племенное ядро мышей линии BALB/cY поддерживается в лаборатории генетики Центра в конвенциональных условиях на гранулированном комбикорме ПК-120, в клетках фирмы Велаз Т-2, имеют сублинейный символ Y (Юрлово). Контроль гомозиготности, осуществленный в 2005 г., подтвердил идентичность мышей BALB/cY по генам гистосовме-стимости (Н-генам) как в племенном ядре Центра, так и у животных, разводимых в филиале «Столбовая».

Вторая сублиния BALB/c - мыши, которых разводят в питомнике лабораторных животных филиала института Биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова (ФИБХ РАН, Пущино), куда они поступили в 2006 г. из питомника Charles River Laboratory (США). Пущинскую сублинию мы условно обозначили символом Р - BALB/cP. Чтобы избежать влияния Н-Y-антигенов, трансплантанты от самцов на самок не пересаживают: в выборку включают либо самок, либо самцов [4, 9]. В опыт для длительного наблюдения удобнее брать самок, так как половозрелые самцы агрессивны. Поэтому для исследования были отобраны 9 самок из племенного ядра инбредной линии BALB/cY так, чтобы в опыты включить мышей от

максимального количества размножающихся пар. Из питомника лабораторных животных филиала ФИБХ РАН было получено 4 самки линии BALB/cP.

Таким образом, обмен кожными трансплантантами с хвоста на бок выполняли на мышах одного пола.

Для контроля гомозиготности генетической однородности мышей инбредных линий был использован метод изотран-сплантации кожи. Ценность этого метода заключается в том, что он: 1) позволяет контролировать гомозиготность по большому числу генов, так как совместимость тканей - полигенный признак; 2) дает возможность выявить очень слабые генетические различия между животными одной линии, обусловленные остаточной гетерозиготностью или спонтанными мутациями; 3) технически достаточно прост и не требует больших материальных затрат; 4) чтение результатов однозначно - приживление или отторжение пересаженной кожи; 5) генетическое засорение выявляется в короткие сроки.

Критерием гомозиготности инбред-ных животных при контроле методом трансплантации кожи служит 100%-при-живление трансплантатов в пределах линии [3]. Для контроля на гомозиготность племядра были отобраны 2-3-х месячные мыши. Трансплантация кожи с хвоста на бок с правой стороны в области грудной клетки осуществлялась по общепринятой методике [2] в современной модификации [1]. Наблюдение за состоянием трансплантатов проводилось ежедневно в течение 30 дней, начиная с момента снятия повязки, затем 1 раз в неделю, после 200 дней 1 раз в месяц. Общий срок наблюдения при проверке на гомозиготность племенного ядра инбредной линии составляет 250-300 дней.

Как правило, в инбредной линии у мышей неприживление трансплантантов на 7-9-й день после операции происходит по техническим причинам, таким как слабое наложение повязки, случайное приклеивание коллодием трансплантата к повязке, кровоточащее ложе, сдвиг трансплантата при наложении повязки. Иногда отрицательный результат бывает из-за того, что после снятия повязки животные чешутся и срывают трансплантаты. В наших опытах отторжений по техническим причинам не наблюдалось. На пересаженной коже шерсть начинает расти на 14-20-й день после операции.

Если животные инбредной линии действительно гомозиготны, то все трансплантаты будут в хорошем состоянии в течение всего срока наблюдения, покрытые волосками, характерными для хвоста. Если наблюдается отторжение трансплантатов в ранние сроки наблюдения, то оно протекает по типу острой реакции: трансплантат воспален, образуется струп, реакция кончается полным некрозом трансплантата. Такой тип отторжения может быть в ранние сроки наблюдения (8-14-й день) и поздние (35-40-й день). Если все или большинство трансплантатов отторгается по типу острой реакции, следует делать вывод о гистонесовместимости по причине генетического засорения линии и животных такой линии считать генетически нестандартными. Иногда наблюдаются единичные случаи отторжения, как правило, от одного или двух родственных доноров. В этом случае можно полагать, что в линии возникла мутация сильного гена гистосовместимости. Животных сублинии, несущей эту мутацию, выводят из размножения, тем самым гомозигот-ность племенного ядра инбредной линии

восстанавливается.

Иногда наблюдают хроническое отторжение трансплантата: медленное облысение, шелушение эпидермиса, в конце концов трансплантат превращается в лысый блестящий рубец. Такую картину можно наблюдать, начиная с 40-го дня по 100-й и после 200-го дня наблюдения. Причиной является слабая гистонесовме-стимость, как результат мутирования слабых Н-генов. Такие сублинии также выводятся из размножения в племенном ядре.

Во всех случаях отторжения трансплантатов по техническим или иммуно-генетическим причинам делают повторную трансплантацию кожи от того же донора, но не раньше, чем через 14 дней после регистрации отторжения.

Результаты исследований

Результаты проверки гомозиготности мышей двух сублиний BALB/cY и BALB/cP приведены в таблице. В первом опыте, в который были включены только мыши внутри самой сублинии BALB/cY, изотрансплантация кожи показала высокую степень гомозиготности - прижились стопроцентно все 14 трансплантатов, что свидетельствует об отсутствии каких-либо изменений в локусе Н-генов.

Во втором опыте был осуществлен контроль гомозиготности мышей сублиний BALB/cY и BALB/cP, у которых провели пересадку кожных локусов как в прямой, так и в обратной комбинации. В итоге более 80% трансплантатов были отторгнуты мышами как одной, так и второй сублинии. Наблюдаемое отторжение трансплантатов происходило, начиная с 37-40-го дня и шло по хроническому типу: облысение, шелешение эпидермиса, медленное превращение

Таблица

Результаты контроля гомозиготности у мышей сублиний BALB/cY и BALB/cP

№ опыта Вариант Число трансплантатов

пересадки всего прижилось отторглось % отторжения

1 У^У 14 14 - -

2 У^Р 12 3 9 81,8

Р^У 10 1 9

3 Р^Р 4 2 2 50

трансплантата в лысый блестящий рубец. Возможной причиной является ги-стонесовместимость, как результат мутирования слабых Н-генов.

Аналогичную картину можно было наблюдать и в третьем опыте, где исследовались на гистосовместимость мыши внутри самой сублинии - BALB/cP. Отторжение трансплантатов у самок шло по тому же типу, что и между сублиниями BALB/cY и BALB/cP, т.е. имело место хроническое отторжение транплантатов. Результаты этого опыта лишь подтверждают наше предположение о том, что у мышей сублинии BALB/cP произошла мутация в локусе слабых Н-генов, которая и явилась причиной слабой ги-стонесовместимости их как с мышами сублинии BALB/cY, так и внутри самой сублинии BALB/cP.

Повторная трансплантация кожи от того же донора через 14 дней не повлияла на результаты опыта. Отторжение трансплантатов происходило, как и в первом варианте исследования. Животные таких сублиний выводятся из размножения в племенном ядре.

Обсуждение

Проведенный контроль гомозигот-ности двух сублиний высоко инбредной линии BALB/c подтвердил методически верное ведение генетико-селекционной

работы с племенными ядрами инбред-ных линий мышей коллекционного фонда НЦБМТ РАМН сотрудниками лаборатории генетики. Свидетельством тому может служить гомозиготность инбред-ной линии мышей BALB/cY, у которой прижились все трансплантаты. Что касается мышей сублинии BALB/cP из питомника лабораторных животных ФИБХ РАН, то необходимо отметить, что они оказались гистонесовместимыми не только с мышами BALB/cY, но и внутри самой сублинии BALB/cP. Приведенные факты позволяют дать объяснение полученным в настоящей работе результатам. Известно, что у животных долгое время разводимых в разных источниках, возможно проявление сублинейных различий, вызванных, как ранее было указано, мутацией слабых Н-генов, возникающих под воздействием естественного фона радиации, и других вредных факторов окружающей среды.

Поскольку генетическая несовместимость мышей сублинии BALB/cP проявилась не только с мышами сублинии BALB/cY, т.е. взятой из другого источника (Юрлово), но и внутри самой сублинии BALB/cP, то животные такой сублинии не могут считаться генетически стандартными и, следовательно, подлежат выведению из размножения в племенном ядре.

Сотрудникам питомника лаборатор-

ных животных ФИБХ РАН следует регулярно (через 4 поколения) проводить генетический мониторинг, что позволит уберечь племенное ядро линии от всех форм генетических изменений.

Выводы

1. Результаты проведенного исследования выявили наличие сублинейного различия между мышами сублиний BALB/cY и BALB/cP, что было доказано отторжением трансплантатов при проведении изотрансплантации кожи между ними.

2. Выявлена гистонесовместимость мышей внутри сублинии BALB/cP из питомника лабораторных животных ФИБХ РАН, что является следствием произошедшей мутации в локусе слабых Н-генов. Такие генетически нестандартные сублинии, как правило, выводятся из размножения племенного ядра.

3. Все трансплантаты, проведенной пересадки кожи, прижились стопроцентно; сублиния BALB/cY - гомозиготна, генетически стандартна - об этом свидетельствуют результаты контроля гомо-зиготности мышей из племенного ядра коллекционного фонда НЦБМТ РАМН, где поддерживается данная сублиния.

Литература

1. Бескова Т.Б. Модификация метода реципрокной трансплантации кожи у лабораторных мышей // Биомедицина, № 6, с.161-163, 2007.

2. Бландова З.А".Контроль гомо-зиготности инбредных линий мышей и крыс методом трансплантации кожи. Методические указания. - М., 1982.

3. Billingham R.E., Silvers W.K. Inbred animals and tissue transplantation

immunity // Plast. and reconstr. surg. and transpl. bill., vol. 28, pp. 199-406, 1959.

4. Billingham R.E., Hodge B.A., Silvers W.K. An estimate of the number of histocompatibility loci in the rat // Proc. nat. acad. sci. US, vol. 48, pp. 138-147, 1962.

5. Green M.C. Mutant genes and linkages // In Biology of the laboratory mouse / ed. E.L.Green - N.Y.: McGraw-Hill, pp.87-151, 1966.

6. Snell G.D. The H-2 locus the mouse: Observations and speculations concerning its comparative genetics and its polymorphism. - Folia boil. (CSSR), v. 4, pp. 335-358, 1968.

7. Snell G.D. Note on results of Linder and Klein with coisogenic resistant of mice // J. Nat. cancer inst., vol. 25, pp.1191-1193, 1960.

8. Staats J. Standardized nomenclature for inbred strains of mice: third listing // Cancer res., vol. 24, pp. 147-168, 1964.

9. Ziess I.M. Demonstration of isohistogenicity in groups of rats from partionally inbred strains // Transplantation, vol. 4, pp. 506-509, 1966.

X.X.CeMeHOB, H.H.KapKH^eHio. TE.EecKOBa, EJ.MaTBeeHKO

THE STUDY OF HOMOZYGOSIS IN TWO SUBSTRAINS BALB/cY AND BALB/cP OF HIGH INBREAD BALB/c STRAIN

H.H.Semenov, N.N.Karkischenko, T.B.Beskova, E.L.Matveenko

Scientific center of biomedical technologies RAMS, Moscow

Homozygosis of two mice substrains (BALB/cY and BALB/cP) has been studied. The BALB/cY substrains is kept in the Scientific center of biomedical technologies RAMS. The BALB/cP substrain mice are breed in Branch of Institute of Bioorganic Chemistry RAS. Method of skin isotransplantation used in these experiments. Transplants in the BALB/cP substrain mice survived in 100%. It means that BALB/cP substrain mice are homozygous and standard genetically. According to the study results between BALB/cY and BALB/cP revealed substrainical tissue incapability. Additionally, BALB/c substrain mice were heterogeneous genetically by themselves.

Key words: transplantation, homozygosis, substrain, inbred mice substrain.