Холинэстеразы рыб как биомаркеры загрязнения морской среды пестицидами

УДК 597.2/ 5:577.1

Татьяна Ковыршина,

ведущий инженер отдела ихтиологии, Ирина Руднева,

доктор наук, профессор,

ведущий научный сотрудник отдела ихтиологии,

Институт биологии южных морей имени А.О. Ковалевского, г. Севастополь

ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ РЫБ КАК БИОМАРКЕРЫ ЗАГРЯЗНЕНИЯ МОРСКОЙ СРЕДЫ ПЕСТИЦИДАМИ

Исследовали активность холинэстеразы в тканях печени и мышц бычка-кругляка Neogobius melanostomus, отловленного в прибрежных акваториях Азовского моря, в различной степени подверженных влиянию сельскохозяйственной деятельности. Снижение активности фермента установлено в печени рыб из района моря, куда в наибольшей степени поступают сточные воды с полей. Ферментативная активность в тканях рыб существенно ниже в летний период, чем в зимне-весенний. Обсуждается возможность применения активности холинэстеразы в качестве биомаркера для проведения мониторинговых исследований в районах интенсивной сельскохозяйственной деятельности с целью разработки экологических критериев для оценки состояния среды и нормирования использования пестицидов.

Summary

Cholinesterase activities in liver and muscle of the round goby Neogobius melanostomus caught in the coastal waters of Azov Sea with the different level of agricultural impact was studied. Decrease of enzymatic activity was indicated in the liver of fish collected in the site affected on the sewage from agricultural area. Enzymatic activity was significantly lower in summer period than in cold season which was associated by intensive application of pesticides. The possibilities of the use of Cholinesterase activity in fish as the bioindicator in monitoring programs in the locations of high agricultural activity with the purpose of development of ecological criteria of environmental status and pesticides application are discussed.

Ключевые слова: активность холинэстеразы, бычок-кругляк, Азовское море, пестициды.

Keywords: Cholinesterase activities, round goby, Azov Sea, pesticides.

Глобальное применение пестицидов в сельском хозяйстве приводит к загрязнению биосферы. Многие из них накапливаются в организме человека и животных, вызывают развитие интоксикации, па-

тологий, а иногда и гибель. Только 0,1% применяемых пестицидов достигает своей цели, тогда как остальные рассеиваются в окружающей среде [Hart, Pimentel, 2002]. При этом пестициды, смываемые с полей, попадают в водотоки, реки и другие водные объекты, включая морские прибрежные акватории, загрязнение которых приводит к острым и хроническим токсикозам гидробионтов, обитающих в них. Кроме того, прибрежная часть моря является местом нереста многих видов рыб и беспозвоночных, чувствительных даже к малым концентрациям агрохимикатов, что может вызвать их гибель и дальнейшее истощение морских ресурсов.

Среди пестицидов наиболее распространены фосфорорганические (ФОС), карбаматные (КБ) и синтетические пиретроидные соединения, которые относятся к наиболее важным классам инсектицидов и акарицидов. Мишенью их действия являются ферменты холинэстеразы (ХЭ), основная функция которых заключается в регуляции нервных связей (проведение нервного импульса) в результате гидролиза медиатора ацетилхолина в синап-тической щели [Assis et al., 2011]. Лабораторные и природные исследования, проведенные на рыбах, позволили заключить, что активность ХЭ в тканях может быть использована в качестве биомаркеров в ихтиомониторинге водной среды, загрязненной пестицидами. Экспериментальное тестирование пестицидов на гидробионтах показало, что инги-бирование активности ХЭ является удобным, быстрым и адаптивным тестом оценки токсичности различных химических соединений [Van der Oost et al., 2003]. Согласно FAO [FAO, 2007] 20% ингиби-рования активности АХЭ мозга характеризует начальные эффекты интоксикации, видимая интоксикация обусловлена 50%-ным ингибированием АХЭ, а смерть наступает при 90%-ном ингибиро-вании активности фермента.

Существует мнение, что использование ХЭ в качестве биомаркера присутствия в среде и в организме ФОС и КБ не ограничивается только этими пестицидами. Известно, что сельхозугодия нуждаются в систематическом удобрении, для чего применяется большое количество азот- и фосфор-

содержащих соединений, избыток которых также попадает в водотоки и в другие водные объекты, включая прибрежную часть моря. В теплый период года избыток биогенов вызывает эвтрофирова-ние, что связано с развитием цианобактерий, продуцирующих антихолинэстеразные метаболиты (анатоксина). Токсичность метаболитов цианобактерий может в тысячи раз превосходить токсичность пестицидов, и даже малые их концентрации могут необратимо блокировать активность ХЭ гид-робионтов. В этом случае активность холинэсте-раз рыб может применяться для определения наличия опасных концентраций данных метаболитов в воде. [Villatte et al., 2002].

Многими авторами показано ингибирование активности ХЭ в тканях рыб под действием различных пестицидов в экспериментальных и в природных условиях [Чуйко, Подгорная, 2007; Adedeji, 2011; Van der Oost et al., 2003]. Вместе с тем исследованиям сезонных вариаций активности фермента в тканях морских рыб и возможной связи их с интенсивностью сельскохозяйственной деятельности

уделено значительно меньше внимания. На этом основании целью настоящей работы явилось сравнительное исследование активности ХЭ в тканях бычка-кругляка, отловленного в прибрежных районах юго-западной части Азовского моря, в разной степени подверженных влиянию сельскохозяйственной деятельности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследований служил бычок-кругляк Л/еодоЬ/'ив me/aпosfomi^s - массовый вид и типичный представитель донной группы. Рыб отлавливали в двух районах прибрежной части Азовского моря - около села Семеновка, где ведется интенсивная сельскохозяйственная деятельность (выращиваются зерновые культуры, подсолнечник, рапс) и у села Мысового, основными источниками загрязнения которого являются Восточно-казантипская газовая буровая и небольшой порт (рис. 1).

Концентрация биогенных элементов в исследуемых акваториях представлена в таблице. Как можно видеть, уровень биогенов выше в морской воде у с. Семеновка [Руднева и др., 2007].

46°30

46°00

7 /,Л

Азовское море

45°30

\ч

\ \

Арабатский залив

Казан ти пеки й зал ив

с. Мыеовое

с. Семеновка

35°00

35°30

36°00

36°30

Рис. 1. Расположение районов отлова рыб в Арабатском заливе Азовского моря

Таблица

Содержание биогенных элементов в морской воде из двух исследуемых районов Азовского моря [Руднева и др., 2007]

Параметр с. Семеновка с. Мыеовое

Среднее значение, М min - max Среднее значение, М min - max

N02, мкг/л 15,8 1,6-19,2 4,06 1,2-9,6

N03, мкг/л 238,8 9,0-1215,9 108,9 4,5-451,0

Р04, мкг/л 81,9 6,3-175,6 46,15 9,4-106,0

Si, мкг/л 707,8 137-1512 627,8 418-797

Кроме того, активность фермента в тканях рыб, отловленных у села Семеновка, исследовали в разные сезоны года, которые различаются интенсивностью сельскохозяйственной деятельности.

Ткани рыб извлекали, гомогенизировали в 0,85%-ном холодном растворе хлорида натрия, центрифугировали при 5000 д 15 минут на холоду. Активность фермента определяли с использованием ацетилхолинхлорида в качестве субстрата. Под действием холинэстеразы происходит гидролиз ацетилхолина с образованием уксусной кислоты и холина. Уксусная кислота снижает рН раствора, который восстанавливается с помощью

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

0

индикатора. Изменение интенсивности окраски пропорционально активности фермента в анализируемой пробе. Концентрацию белка в образцах определяли биуретовым методом, используя стандартный набор реагентов фирмы «Филисит-диаг-ностика» (Украина). Полученные результаты рассчитывали в мкмоль /г белка/сек.

Статистический анализ проводили с использованием ^критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными в случае, если р с!» 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ На рисунке 2 приведены показатели активности холинэстеразы в различных тканях рыб.

*

с. Семеновка

район

мышцы

с. Мысовое

печень

Рис. 2. Активность холинэстеразы в тканях бычка-кругляка из двух исследуемых районов Азовского моря (М ±т); * - различия достоверны

Как можно видеть, активность фермента существенно выше в печени рыб из обоих районов по сравнению с соответствующими показателями в мышцах. В то же время активность ХЭ в мышцах рыб из двух районов не различается, тогда как в печени она достоверно ниже у бычка, отловленного в акватории села Семеновка (3,54 против 8,56 мкмоль/г белка/ сек соответственно, р<0,001). Таким образом, было установлено, что в печени рыб, отловленных в районе выпуска сельскохозяйственных стоков, активность ХЭ существенно ниже по сравнению с соответствующими значениями бычков из прибрежных вод с. Мысовое.

Учитывая тот факт, что интенсивность сельскохозяйственной деятельности, в том числе применение агрохимикатов зависит от сезона, интерес представляло изучить сезонную динамику активности ХЭ в тканях рыб, обитающих в акватории, подверженной влиянию стоков с сельхозугодий. На рисунке 3 представлены изменения ферментативной активности в тканях бычка-кругляка, отловленного в акватории с. Семеновка в разное время года.

Из представленных данных можно видеть, что в мышцах активность фермента варьирует в меньшей степени, проявляя тенденцию снижения летом и незначительного увеличения осенью. В печени активность ХЭ выше, чем в мышцах во все 40

исследуемые периоды, за исключением осеннего, когда показатели имеют сходство. Сезонная динамика та же, что и в мышцах, однако выражена в большей степени: весной ферментативная активность достоверно возрастает (р<0,05) по сравнению с зимними значениями, летом и осенью падает более, чем в 2 раза (р<0,001). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в период интенсивной сельскохозяйственной деятельности на побережье моря активность ХЭ в тканях рыб, обитающих в прилегающих акваториях, существенно снижается.

На основании полученных результатов исследований можно заключить, что активность ХЭ в тканях бычка-кругляка из двух районов Азовского моря имеет определенные различия. Если в мышцах величины активности одинаковы, то в печени они более, чем в 2 раза ниже у рыб, обитающих в акватории села Семеновка, на побережье которого ведется интенсивная сельскохозяйственная деятельность, сопряженная с применением удобрений и пестицидов (выращиваются зерновые культуры, подсолнечник, рапс). Полученные данные согласуются с результатами других авторов, которые показали ингибирование фермента в мышцах разных видов морских рыб, отловленных в районах с повышенным содержанием фосфороргани-ческих соединений в воде [Van derOost etal., 2003].

и

<L> о

CQ

(Я »

Ч ю

hQ

R О S ¡ai

2

4,5 -

4 3,5

3 J 2,5 2 1,5 1

0,5 0

* 9 I

d

зима

весна

лето

осень

сезон

мышцы

В печень

Рис. 3. Сезонная динамика активности холинэстеразы в тканях бычка-кругляка из акватории

с. Семеновка (Азовское море) (М ±т);

с зимним сезоном; % - с

При этом пестициды с водой и с пищей попадают в организм рыб и накапливаются в тканях и органах, приводят к ингибированию активности ХЭ и вызывают нейротоксические эффекты. Более того, даже если пестициды подвергаются биотрансформации в печени, образовавшиеся метаболиты также обладают высокой токсичностью. Ее механизм обусловлен повышением уровня ацетилхолина, который приводит к возрастанию содержания ка-техоламинов и нарушению углеводного и энергетического обмена, что, в свою очередь, вызывает хронический стресс у животных и нарушение поведенческих реакций, таких как плавательная активность, реакция на хищников, ориентация в пространстве и прочие [Adedeji, 2011].

Следует отметить, что исследуемый нами вид бычок-кругляк, обитающий в придонных слоях воды, которые являются более загрязненными различными токсикантами, включая пестициды, постоянно подвергается их негативному влиянию. Особую опасность представляет увеличение уровня пестицидов в морской воде в весенне-летний период, сопровождающийся возрастанием использования агрохимикатов (пестицидов и удобрений) для защиты растений от вредителей в период их вегетации. В этом случае смыв избыточных концентраций пестицидов и биогенов (азот- и фосфорсодержащих удобрений) может усилить негативное воздействие этих компонентов на рыб в условиях повышения температуры воды и вызвать сильное эвтровирование, сопровождающееся развитием микроводорослей, включая токсичных. Такие явления в последнее время часто наблюдают в акватории Азовского моря, особенно в прибрежной части, что приводит к массовой гибели рыб (в том числе бычков) и беспозвоночных. Помимо этого, в теплое время года в прибрежной части моря происходит нерест рыб и других гидробионтов, которые весьма чувствительны даже к небольшим концентрациям пестицидов в воде, вызывающих аномалии в развитии, задержку роста и гибель икры и личинок [Van der Oost et al., 2003]. Это подтверждается нашими исследованиями, которые показали значительное ингибирование активности ХЭ в

-достоверность различий (р d» 0,05 ) весенним; % - с летним

печени рыб, отловленных в районе с. Семеновка в летний период, характеризующийся интенсивной сельскохозяйственной деятельностью на побережье. Вероятно, смывы с полей и садов, попадающие в прибрежную часть моря, содержат значительные количества агрохимикатов, приводящих к ингибированию ХЭ в печени рыб и дальнейшим негативным последствиям для их жизнедеятельности.

Таким образом, полученные данные, свидетельствующие о снижении активности ХЭ в тканях бычка-кругляка, отловленного в прибрежье районов с интенсивной сельскохозяйственной деятельностью, могут быть применены для проведения мониторинговых исследований с целью разработки экологических критериев для оценки состояния среды и нормирования использования пестицидов.

Литература

1. Hart К.А. Environmental and economic costs of pesticide use / K.A. Hart, D. Pimental. - Encyclopedia of Pest Management. Pimental D. ed.; Marcel Dekker: New York, 2002. P. 237-239.

2. Assis C.R.D Fish cholinesterases as biomarkers of organophosphorus and carbamate pesticides / C.R.D. Assis, R.S. Bezerra, L B. Carvalho// Pesticides in the Modern World - Pests Control and pesticides Exposure and Toxicity Assessment. (Ed. M. Stoytcheva). In Tech. Publ. 2011. Vol. 13. P. 254278.

3. FAO. Pesticides in food report 2007. FAO plant production and protection. Food and Agricultural Organization. Rome, Italy, 2007. P. 191.

4. Villatte F. AdisposableAcetylcholinesterase-based electrode biosensor to detect anatoxin-a(s) in water / F. Villatte, H. Sculze, R.D. Schmid, T.T. Bachmann // Anal. Bioanal. Chem. 2002. Vol. 372. P. 322-326.

5. Чуйко Г.М. Холинэстеразы пресноводных костных рыб / Г.М. Чуйко, В.А. Подгорная // Физиология и токсикология пресных животных (Сб. биографических материалов и научных работ). Рыбинск. 2007. С. 100-139.

6. Adedeji О. В. Response of acetylcholinesterase activity in the brain of Ciarías gariepinus to sublethal

concentration of diazinon / O.B. Adedeji // J. Appl. Sei. Environ. Sanitation. 2011. Vol. 6 (2). P. 137-141.

7. Van der Oost R. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: a review/ R. Van der Oost, J. Beyer, N.P.E. Vermeulen // Environ. Toxicol, and Pharmacol. 2003. Vol.13. P. 57-149.

8. Руднева И И. Экологическое состояние вод

юго-западной части Азовского моря / И.И. Руднева, ТВ. Бахтина, Н.П. Ковригина, С.О. Омельченко, И.Н. Залевская, Г.В. Симчук // Современные проблемы экологии Азово-Черноморского региона: матер, конф. 10-11 октября 2007 г : тезисы докл. Керчь, 2007. С. 102-109.

svg-41@mail.ru

УДК 637.03 Лариса Колпакова,

доктор биологических наук, профессор,

Поволжский кооперативный институт (филиал Российского университета кооперации), г. Энгельс, Мария Саенко,

кандидат экономических наук, доцент,

Ямальский нефтегазовый институт (филиал Тюменского нефтегазового университета), г. Новый Уренгой

ИННОВАЦИОННЫЕ РАЗРАБОТКИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ФИТОМИНЕРАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ В ПРОФИЛАКТИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Рассматривается целесообразность и преимущества применения инновационных разработок для профилактики заболеваний организма человека и животных.

Ключевые слова: фитоминеральные компоненты, профилактика заболеваний организма человека и животных (птиц).

В условиях активного использования суперсовременных технологий, синтезированных продуктов питания и негативного состояния окружающей природной среды человеческий организм испытывает воздействие комплекса физических, химических и нервно-эмоциональных нагрузок, которые обусловливают снижение защитных реакций, а также появление предпосылок для различных заболеваний. При воздействии перечисленных факторов риск поражения (заболевания) такого организма резко возрастает. Для повышения защитных реакций организма и улучшения состояния здоровья современная медицина предлагает широкий ассортимент лечебно-профилактических препаратов и пищевых добавок, предназначенных в основном для приема внутрь. Прием таких препаратов и добавок не исключает возможности появления отрицательных побочных эффектов.

Одним из эффективных методов лечения и профилактики различных заболеваний является фитотерапия. Фитотерапия - это медицина, основанная на использовании растений или их экстрактов. Многие растения синтезируют вещества, которые полезны для поддержания здоровья людей и животных. К ним относятся ароматические вещества, большинство которых составляют фенолы и их кислород-замещающие производные, такие как таннины. Действие лекарств растительного происхождения определяется содержащимися в различных частях растения активными веществами: алкалоидами, гликозидами, дубильными веществами, эфирными маслами и другими.

Известно, что лекарственные вещества, содер-

жащиеся в необработанных лекарственных растениях, оказывают лучшее действие на организм человека. При правильном применении эти вещества обладают более мягким действием, менее токсичны, чем синтетические и не вызывают привыкания и аллергии. При этом растения не только не угнетают защитные силы организма, а наоборот, активны в отношении многих штаммов микроорганизмов и способны усиливать иммунитет человека. Наряду с этим лекарственные травы предупреждают и устраняют осложнения при приеме антибиотиков, гормонов и хими-опрепаратов; способствуют обратному развитию воспалений на любой стадии вплоть до стадии некроза. В цепом, лечение травами не наносит вреда организму и дает только выздоровление. Важными особенностями лекарственных растений являются:

- они быстрее и активнее включаются^ биохимические процессы человеческого организма, чем химические, чужие для организма синтетические средства;

- они, в отличие от синтетических лекарственных препаратов, редко вызывают осложнения, особенно аллергические реакции;

- нормализуя функции отдельных органов и систем, они положительно влияют на обмен веществ в организме (их можно использовать для длительного лечения);

- они обеспечивают постепенное, медленное развитие терапевтического эффекта, мягкое, умеренное действие;

- используются, как правило, только при перо-ральном введении или при наружном применении.

Эффективность фитотерапии, как метода лечения и профилактики различных заболеваний, объясняется тем, что действие лекарственных растений направлено на коррекцию внутриклеточных метаболитических процессов, в то время как синтетические препараты действуют на системы над-клеточной регуляции. Кроме того, фитопрепараты оказывают мягкое воздействие на организм, хорошо переносятся больными и почти не вызывают побочных реакций.