СУММАРНЫЕ ЭКСТРАКТЫ ИЗ ANDROGRAPHIS PANICULATA
COMBINED EXTRACTS FROM ANDROGRAPHIS PANICULATA

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
В соответствии с 35 USC §119(e) по настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США №60/566477, поданной 28 апреля 2004 года, содержание которой включено сюда в качестве ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Фактор некроза опухолей альфа (TNFα), мононуклеарный цитокин, преимущественно продуцируют моноциты и макрофаги. Он обладает различными биологическими активностями: (1) уничтожение раковых клеток или ингибирование роста раковых клеток, (2) усиление фагоцитоза нейтрофильных гранулоцитов, (3) уничтожение инфекционных патогенов и (4) повышение экспрессии молекул адгезии сосудистыми эндотелиальными клетками в ходе воспалительных реакций.
Расстройства, связанные с экспрессией TNFα, включают в себя в качестве неограничивающих примеров ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартрит, спондилоартропатии, воспалительное заболевание кишечника (включающее в себя болезнь Крона и язвенный колит), хроническую сердечную недостаточность, системную красную волчанку, склеродерму, саркоидоз, полимиозит/дерматомиозит, псориаз, множественную миелому, миелодиспластический синдром, острый миелоидный лейкоз, болезнь Паркинсона, комплекс умственного расстройства при СПИДе, болезнь Альцгеймера, депрессию, сепсис, гангренозную пиодерму, гематосепсис, септический шок, синдром Бехчета, реакцию «трансплантат против хозяина», увеит, гранулематоз Вегенера, синдром Шегрена, хроническое обструктивное заболевание легких, астму, острый панкреатит, заболевание периодонта, кахексию, поражение центральной нервной системы, рак (например, карциномы легкого, карциному пищевода, аденокарциному желудка и карциному простаты), вирусное респираторное заболевание и ожирение. Смотри, например, Ogata H. et al Curr Pharm Des. 2003; 9(14): 1107-13; Moller D.R. et al J Intern Med. 2003; 253(1): 31-40; Taylor P.C. et al Curr Pharm Des. 2003; 9(14): 1095-106; Wilkinson N. et al Arch Dis Child. 2003; 88(3): 186-91; Nishimura F. et al J Periodontol. 2003; 74(1): 97-102; Weinberg J.M. et al Cutis. 2003; 71(1): 41-5; Burnham E. et al Crit Care Med. 2001; 29(3): 690-1; Sack M. et al Pharmacol Ther. 2002; 94(1-2): 123-35; Barnes P.J. et al Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2002; 42:81-98; Mageed R.A. et al Lupus 2002; 11(12): 850-5; Tsimberidou A.M. et al Expert Rev Anticancer Ther. 2002; 2(3): 277-86; Muller Т. et al Curr Opin Investig Drugs. 2002; 3(12): 1763-7; Calandra T. et al Curr Clin Top Infect Dis. 2002; 22:1-23; Girolomoni G et al Curr Opin Investig Drugs. 2002; 3(11): 1590-5; Tutuncu Z. et al Clin Exp Rheumatol. 2002; 20(6 Suppl 28): S146-51; Braun J. et al Best Pract Res Clin Rheumatol. 2002; 16(4): 631-51; Barnes P. J. et al Novartis Found Symp. 2001; 234:255-67; discussion 267-72; Brady M. et al Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol. 1999; 13(2): 265-89; Goldring M.B. et al Expert Opin Biol Ther. 2001; 1(5): 817-29; Mariette X.Rev Prat. 2003; 53(5): 507-11; Sharma R. et al Int J Cardiol. 2002; 85(1): 161-71; Wang C.X. et al Prog Neurobiol. 2002; 67(2): 161-72; Van Reeth K. et al Vet Immunol Immunopathol. 2002; 87(3-4): 161-8; Leonard B.E. et al Int J Dev Neurosci. 2001; 19(3): 305-12; и Hays S.J. et al Curr Pharm Des. 1998; 4(4): 335-48.
Интерлейкин-1 бета (IL-1β), цитокин, секретируемый клетками, такими как моноциты, макрофаги и дендритные клетки, опосредует широкий ряд иммунных и воспалительных реакций. Можно модулировать выработку IL-1β для лечения множества заболеваний, таких как ревматоидный артрит, гематосепсис, заболевание периодонта, хроническая сердечная недостаточность, полимиозит/дерматомиозит, острый панкреатит, хроническое обструктивное заболевание легких, болезнь Альцгеймера, остеоартрит, бактериальные инфекции, множественная миелома, миелодиспластический синдром, увеит, поражение центральной нервной системы, вирусное респираторное заболевание, астма, депрессия и склеродерма. Смотри, например, Taylor P.C. et al Curr Pharm Des. 2003; 9(14): 1095-106; Dellinger R.P. et al Clin Infect Dis. 2003; 36(10): 1259-65; Takashiba S. et al J Periodontol. 2003; 74(1): 103-10; Diwan A. et al Curr Mol Med. 2003; 3(2): 161-82; Lundberg I.E. et al Rheum Dis Clin North Am. 2002; 28(4): 799-822; Makhija R. et al J Hepatobiliary Pancreat Surg. 2002; 9(4): 401-10; Chung K.F. et al Eur Respir J Suppl. 2001; 34:50s-59s; Hallegua D.S. et al Ann Rheum Dis. 2002; 61(11): 960-7; Goldring M.B. et al Expert Opin Biol Ther. 2001; 1(5): 817-29; Mrak R.E. et al Neurobiol Aging. 2001; 22(6): 903-8; Brady M. et al Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol. 1999; 13(2): 265-89; Van der Meer J.W. et al Ann NY Acad Sci. 1998; 856:243-51; Rameshwar P. et al Acta Haematol. 2003; 109(1): 1-10; de Kozak Y et al Int Rev Immunol. 2002; 21(2-3): 231-53; Wang C.X. et al Prog Neurobiol. 2002; 67(2): 161-72; Van Reeth K. et al Vet Immunol Immunopathol. 2002; 87(3-4): 161-8; Stirling R.G. et al Br Med Bull. 2000; 56(4): 1037-53; Leonard B.E. et al Int J Dev Neurosci. 2001; 19(3): 305-12; Allan S.M. et al Ann NY Acad Sci 2000; 917:84-93; и Cafagna D. et al Minerva Med. 1998; 89(5): 153-61.
Andrographis paniculata
Andrographis paniculata
Данное изобретение основано на неожиданном открытии, что экстракт из  ингибирует экспрессию как TNFα, так и IL-1β. Экстракт, полученный из надземной части , содержит андрографолид, 14-дезоксиандрографолид, 14-дезокси-11,12-дегидроандрографолид и неоандрографолид. Предпочтительно, экстракт содержит 2-20 мас.% андрографолида, 1-6 мас.% 14-дезоксиандрографолида, 1-12 мас.% 14-дезокси-11,12-дегидроандрографолида и 1-5 мас.% неоандрографолида. Более предпочтительно, когда экстракт содержит 3-8 мас.% андрографолида, 3-5 мас.% 14-дезоксиандрографолида, 7-9 мас.% 14-дезокси-11,12-дегидроандрографолида и 2-4 мас.% неоандрографолида. Особенно предпочтительно, когда экстракт содержит 4,2 мас.% андрографолида, 4,4 мас.% 14-дезоксиандрографолида, 8 мас.% 14-дезокси-11,12-дегидроандрографолида и 2,1 мас.% неоандрографолида.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования экспрессии TNFα или IL-1β у субъекта. Способ предусматривает введение субъекту эффективного количества вышеописанного экстракта.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения расстройства, связанного с TNFα или IL-1β, то есть воспалительного заболевания кишечника (включающего в себя болезнь Крона и язвенный колит), хронической сердечной недостаточности, сахарного диабета, системной красной волчанки, полимиозита/дерматомиозита, псориаза, острого миелоидного лейкоза, комплекса умственного расстройства при СПИДе, гематосепсиса, септического шока, реакции «трансплантат против хозяина», увеита, астмы, острого панкреатита или заболевания периодонта. Способ предусматривает введение субъекту, при необходимости, лечения эффективного количества вышеописанного экстракта.
Также в объем данного изобретения входит композиция, содержащая экстракт по данному изобретению, описанный выше, для применения при лечении расстройств, связанных с TNFα, и расстройств, связанных с IL-1β, а также применение такой композиции для производства лекарственного средства для лечения данных расстройств.
Подробности нескольких вариантов осуществления изобретения изложены в описании ниже. Другие характеристики, цели и преимущества данного изобретения станут очевидными из описания и также из формулы изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Данное изобретение относится к способам ингибирования экспрессии TNFα или IL-1β, лечения расстройства, связанного с TNFα, и лечения расстройства, связанного с IL-1β, путем введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества вышеописанного экстракта. Термин «эффективное количество» относится к количеству экстракта, необходимому для получения одного из вышеописанных эффектов у субъекта. Эффективные количества можно варьировать, как признано специалистами в данной области, в зависимости от способа введения, применения наполнителя и возможности совместного применения с другими средствами. Термин «лечение» относится к введению экстракта субъекту, имеющему расстройство, связанное с TNFα, или расстройство, связанное с IL-1β, или обладающему симптомом данного расстройства, или обладающему предрасположенностью к данному расстройству, с целью излечения, исцеления, облегчения, смягчения, изменения, лечения, улучшения, оздоровления или влияния на расстройство, симптомы расстройства или предрасположенность к расстройству.
Andrographis paniculata
Для того чтобы получить экстракт для применения по данному изобретению, можно поместить надземную часть  в один или более подходящих растворителей, например, этанол, метанол или ацетон; отделить жидкость от твердого остатка; и сконцентрировать жидкость. Экстракт, полученный таким образом, можно подвергать дальнейшей обработке. Например, можно удалить примеси или изменить соотношение компонентов хроматографией.
Для осуществления вышеописанных способов субъекту при необходимости вводят перорально, ректально, парентерально, посредством ингаляционного аэрозоля или через вживленный резервуар композицию, которая представляет собой либо только вышеупомянутый экстракт, либо смесь экстракта и фармацевтически приемлемого носителя. Термин «парентеральный» при применении здесь включает в себя способы подкожной, внутрикожной, внутривенной, внутримышечной, внутрисуставной, внутриартериальной, внутрисиновиальной, внутригрудинной, интратекальной, внутриочаговой и внутричерепной инъекции или инфузии.
Пероральная композиция может являться любой перорально приемлемой дозированной формой, включающей в себя в качестве неограниченных примеров таблетки, капсулы, эмульсии и водные суспензии, коллоидные растворы и растворы. Обычно применяемые носители для таблеток включают в себя лактозу и кукурузный крахмал. Лубриканты, такие как стеарат магния, также обычно добавляют в таблетки. Для перорального введения в форме капсул применяемые разбавители включают в себя лактозу и сухой кукурузный крахмал. При пероральном введении водных суспензий или эмульсий активный компонент можно суспендировать или растворить в масляной фазе, объединенной с эмульгирующими или суспендирующими веществами. По желанию можно добавить определенные подсластители, флаворанты или подкрашивающие вещества.
Стерильную композицию для инъекций (например, водную или масляную суспензию) можно готовить согласно способам, известным в данной области, применяя подходящие диспергирующие или увлажняющие вещества (такие как, например, твин 80) и суспендирующие вещества. Стерильным инъекционным препаратом может также являться стерильный инъекционный раствор или суспензия в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, раствор в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей или растворителей, которые можно применять, присутствуют маннит, вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла обычно применяют в качестве растворителя или суспендирующей среды (например, синтетические моно- или диглицериды). Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, применимы для получения препаратов для инъекций как и натуральные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно их полиоксиэтилированные варианты. Данные масляные растворы или суспензии могут также содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или диспергатор, или карбоксиметилцеллюлозу, или сходные диспергирующие вещества.
Ингаляционную композицию можно получить согласно способам, хорошо известным в области получения лекарственных средств, и можно получить в виде растворов в физиологическом растворе, применяя бензиловый спирт или другие подходящие консерванты, стимуляторы всасывания для усиления биодоступности, фторуглероды и/или другие растворяющие или диспергирующие вещества, известные в данной области.
Композицию для местного применения можно готовить в форме масла, крема, примочки, мази и т.п. Стабильные носители для композиции включают в себя растительные или минеральные масла, белый вазелин (мягкий белый парафин), жиры или масла с разветвленной цепью, животные жиры и высокомолекулярные спирты (выше, чем C12). Предпочтительными носителями являются те, в которых активный компонент растворим. По желанию можно также включать эмульгаторы, стабилизаторы, увлажнители и антиоксиданты, а также вещества, придающие цвет или запах. Кроме того, в данных местных композициях можно применять усилители проникновения через кожу. Примеры таких усилителей можно найти в патентах США 3989816 и 4444762. Кремы можно предпочтительно готовить из смеси минерального масла, самоэмульгирующегося пчелиного воска и воды; к данной смеси примешан активный компонент, растворенный в небольшом количестве масла, таком как миндальное масло. Примером такого крема является крем, содержащий приблизительно 40 частей воды, приблизительно 20 частей пчелиного воска, приблизительно 40 частей минерального масла и 1 часть миндального масла. Мази готовят смешиванием раствора активного компонента в растительном масле, таком как миндальное масло, с теплым мягким парафином и дают смеси остыть. Примером такой мази является мазь, содержащая приблизительно 30 мас.% миндаля и приблизительно 70 мас.% мягкого белого парафина.
Носитель в фармацевтической композиции должен быть «приемлемым» в смысле совместимости с активным компонентом состава (и, предпочтительно, способным его стабилизировать) и не являться вредным для субъекта, подлежащего лечению. Например, вещества, повышающие растворимость, такие как циклодекстрины (которые формируют специфические, более растворимые комплексы с одним или более активными соединениями экстракта), можно применять как фармацевтические эксципиенты для доставки активных соединений. Примеры других носителей включают в себя коллоидный диоксид кремния, стеарат магния, целлюлозу, лаурилсульфат натрия и D&C Yellow#10.
in vitro
in vivo
Подходящий анализ  можно применять для предварительной оценки эффективности вышеописанного экстракта при ингибировании экспрессии TNFα или экспрессии IL-1β. Экстракт можно далее исследовать на его эффективность в лечении расстройства, связанного с TNFα, или расстройства, связанного с IL-1β, посредством анализов . Например, экстракт можно ввести животному (например, мышиная модель), обладающему расстройством, связанным с TNFα или IL-1β, и затем получить терапевтический эффект. Основываясь на данных результатах, можно также определить подходящий диапазон доз и способ введения.
Предполагается, что без дальнейшего уточнения по вышеизложенному описанию можно адекватно осуществить настоящее изобретение. Последующие конкретные примеры, таким образом, следует толковать как исключительно иллюстративные и совсем не ограничивающие описание любым образом. Все публикации, включая патенты, цитированные здесь, таким образом, приведены в качестве ссылки в их полном объеме.
Andrographis paniculata
Приготовление экстракта из
Andrographis paniculata
Высушенный порошок надземной части  (1 кг) суспендировали в 85% этаноле. Суспензию кипятили с обратным холодильником два часа и фильтровали. Осадок снова экстрагировали 85% этанолом. Объединенные этанольные растворы охлаждали и концентрировали, с получением 105 г желаемого экстракта. Анализ посредством HPLC показывает, что экстракт содержал 4,0% андрографолида.
in vitro
Анализ
in vitro
Andrographis paniculata
Анализ  проводили для оценки эффективности экстракта из  при ингибировании экспрессии TNFα и экспрессии IL-1β.
5
4
Клетки моноцитов периферической крови (PBMC) выделяли из свежей крови, применяя Ficoll-Paque Plus (Amersham Bioscience) согласно протоколу, рекомендованному производителем. Клетки суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS, в концентрации 1×10 клеток/мл и высевали на 96-луночный планшет (всего 1×10 клеток в каждой лунке). Каждую реакцию осуществляли в трех лунках.
Andrographis paniculata
2
2
10 мкл экстракта из  в DMSO добавляли в каждую лунку (конечные концентрации: 0,1, 0,3, 1, 3, 10 и 30 мкг/мл). Лунки, содержащие дексаметазон (CalBiochem.) в конечной концентрации 10 мкМ, применяли в качестве положительного контроля. Лунки, содержащие 10 мкл среды, применяли в качестве отрицательного контроля. Планшет инкубировали при 37°C в 5% CO в течение 15 минут. После добавления 10 мкл аликвот 100 мкг/мл липополисахарида ко всем лункам, за исключением отрицательного контроля, планшет инкубировали при 37°C в 5% CO в течение ночи.
Планшет центрифугировали при 1000 об/мин 15 минут и собирали супернатанты. Концентрации TNFα и IL-1β измеряли, применяя набор TNFα ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) и набор IL-1β ELISA (Jingmei Bioengineer Technology).
Коэффициент ингибирования подсчитывали следующим образом:
экстракт
LPS
контроль
где C представляет собой концентрацию TNFα или IL-1β в клетках PBMC, обработанных экстрактом и LPS, C представляет собой концентрацию TNFα или IL-1β в клетках PBMC, обработанных LPS и дексаметазоном, и C представляет собой концентрацию TNFα или IL-1β в клетках PBMC без обработки LPS или экстрактом.
Результаты показывают, что экстракт значительно ингибировал экспрессию как TNFα, так и IL-1β.
in vivo
Анализы
in vivo
Andrographis paniculata
Анализы  проводили для оценки эффективности экстракта из  в лечении воспалительного заболевания кишечника (IBD).
Andrographis paniculata
Самцов мышей Balb/c (18-24 г) анестезировали 1% пентобарбитала натрия из расчета 0,05 мг/10 г. Для индукции IBD медленно вводили 1,5 мг 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS; Sigma) в 50% этаноле каждой мыши (за исключением необработанных контрольных мышей) через катетер. Необработанные контрольные мыши получали только 0,1 мл 50% этанола. Мышей обрабатывали экстрактом из  за 24 часа и 2 часа перед введением TNBS и ежесуточно в течение 5 суток после введения.
Массу тела каждой мыши отслеживали каждые сутки до и после введения TNBS. Мышей забивали через 24 часа после последнего введения экстракта. Толстые кишки извлекали и взвешивали. Далее вычисляли отношение массы толстой кишки к массе тела и также отслеживали спайки между толстой кишкой и другими органами.
Получали образцы тканей толстой кишки, расположенные точно на 2 см выше анального канала, фиксировали в 10% фосфатном буфере, заключали в парафин, делали срезы и окрашивали гематоксилином/эозином. Степень воспаления на микроскопических поперечных срезах ранжировали от 0 до 4 (0: нет признаков воспаления; 1: очень низкая степень воспаления; 2: низкая степень лейкоцитарной инфильтрации; 3: высокая степень лейкоцитарной инфильтрации, высокая плотность сосудов и утолщенная стенка толстой кишки; и 4: трансмуральные инфильтрации, утрата бокаловидных клеток, высокая плотность сосудов и утолщенная стенка толстой кишки).
Andrographis paniculata
Результаты показывают, что, когда мышей обрабатывали только 150 мг/кг TNBS, они обладали тяжелым заболеванием, характеризующимся диареей, глубокими и устойчивыми потерями массы, значительным увеличением отношения массы толстой кишки к массе тела и показателем смертности 50%. Макроскопическое обследование указывает, что толстая кишка каждой из мышей обладала трансмуральным воспалением во всех слоях кишечной стенки. В отличие от этого, когда мышей обрабатывали экстрактом из  (500 мг/кг/сутки) перед индукцией IBD, они обладали сниженным показателем общей смертности, менее тяжелым синдромом атрофии, более низким отношением массы толстой кишки к массе тела и более низким показателем IBD. Кишечная стенка была гладкой и не образовывала спаек с окружающими тканями.
Andrographis paniculata
В отдельном анализе применяли самцов крыс Wistar для оценки эффективности экстракта из  при лечении IBD, следуя процедуре, сходной с описанной выше. Для индукции IBD крысам вводили 2,4-динитробензолсульфоновую кислоту вместо TNBS.
Andrographis paniculata
Получили сходные результаты. А именно, крысы, обработанные экстрактом из , обладали сниженным показателем общей смертности, менее тяжелым синдромом атрофии, более низким отношением массы толстой кишки к массе тела и более низким показателем IBD в сравнении с крысами, не обработанными экстрактом.
Другие варианты осуществления
Описан ряд вариантов осуществления изобретения. Тем не менее, будет понятно, что можно осуществить разнообразные модификации, не отступая от сущности и объема изобретения. Таким образом, другие варианты осуществления также входят в объем следующей формулы изобретения.