Исследование информативности мультиплексных тест-систем анализа микросателлитов кур с различным числом локусов

33. Стрекозов Н.И., Зиновьева Н.А., Горелов П.В., Листратенкова В.И., Коновалова Е.Н., Чернушенко В.К., Эрнст Л.К. Генетическая характеристика созданных типов скота бурой швицкой и сычевской пород с использованием полиморфизма микросателлитных локусов // Сельскохозяйственная биология. Серия: Биология животных. - 2009. - № 2. - С. 10-15.

34. Траспов А.А., Зиновьева Н.А., Долматова И.Ю., Гладырь Е.А. Аллелофонд башкирской популяции черно-пестрого скота по микросателлитам в связи с показателями молочной продуктивности коров // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - Т. 1. - С. 65-68.

35. Paetkau D, Slade R, Burden M, Estoup A. Direct, real-time estimation of migration rate using assignment methods: a simulation-based exploration of accuracy and power.// Molecular Ecology. - 2004. - 13. - 55-65.

36. Горелов П.В. Генетическая характеристика новых типов скота бурой швицкой и сычевской пород Смоленской области по микросателлитам: Автореф. дис. канд. биол. наук. - Дубровицы, 2010. - 18 с.

37. Nei M., Tajima F., Tateno, Y. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data //J. Mol. Evol. - 1983. - 19. - 153-170.

USING OF MICROSATELLITES FOR CHARACTERISTICS OF ALLELE POOL OF TADZHIKISTAN CATTLE POPULATIONS

E.A. Gladyr, N.A. Zinovieva, V.A. Bagirov, F.S. Amirshoev, V.V. Volkova, P.M. Klenovitskij, A.P. Karpov, I L.K. Ernst]

Summary. The molecular genetic characteristics of allele pool of cattle of Hatlonregion of Tadzhikistan: Tajik types of Black and White and Brown Swiss cattle, local zebu type cattle and two local crossbred population of Brown Swiss and Zebu cattle (F1 and F2). The microsatellites (11 loci) were used as the DNA markers. The number of alleles in different loci is varied of 2 in TGLA122 to 14 in TGLA227 and was in sum 108 alleles. The number of allelesper loci is varied of 8.27±0.84 in F1 population to 5.64±0.47 in Black and White cattle and was in average 6.96+0.31. Fifteen privet alleles were identified in cattle populations analyzed. The average heterozygote degree was

0.652+0.032. The heterozygote defficiency was detected in all population that is varied of4.63 to 12.26 per cent. The probability of genotypeidentity (PI) for all microsatelliteloci was lowerthen 1*10-10, the probability of exclusion for both parents known (PX1) and for only one parent known (PX2) was higher than 97.7 per cent, the probability of excluding of both parents was higher than 99,999 per cent. The construction and analysis of phylogenetic tree was performed.

Key words:microsatellites, genetic diversity, allele pool, Tajik cattle.

УДК 575.174.015.3

ИССЛЕДОВАНИЕ ИНФОРМАТИВНОСТИ МУЛЬТИПЛЕКСНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ АНАЛИЗА МИКРОСАТЕЛЛИТОВ КУР С РАЗЛИЧНЫМ ЧИСЛОМ ЛОКУСОВ*

И.П. НОВГОРОДОВА, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник ВИЖ Россельхозакадемии В.И. ФИСИНИН, академик РАСХН, директор ВНИТИП Россельхозакадемии

Н.А. ЗИНОВЬЕВА, академик РАСХН, директор Е.А. ГЛАДЫРЬ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией

ВИЖ Россельхозакадемии

М.В. МИХАЙЛОВ, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Ставропольский НИИЖК

Я.С. РОЙТЕР, доктор сельскохозяйственных наук, зам. директора

ВНИТИП Россельхозакадемии Г. БРЕМ, доктор ветеринарных наук, ординариус Институт животноводства и генетики ветеринарно медицинского университета

E-mail: n_zinovieva@mail.ru

Резюме. Выполнено сравнительное исследование двух мультиплексных тест-систем анализа микросателлитов кур, включающих 8 («короткий» тип) и 11 («длинный» тип) локусов. Изучение 100 образцов ДНК пяти пород кур показало высокую специфичность разработанных тест-систем: доля амплифицированныхлокусов для тест-систем «короткого» и «длинного» типов составила 99,88 и 99,91 % соответственно. Сравниваемые типы тест-систем достоверно не различались по среднему числу аллелей, числу информативных аллелей и числу эффективныхаллелей в расчете на один локус. При увеличении числа анализируемых локусов вероятность совпадения генотипов снижается. Отнесение осо-

би к собственной популяции на основании результатов анализа микросателлитов достигалось в100 % случаев при использовании тест-систем обоих типов. Установлена высокая корреляция значений популяционно-генетических показателей, рассчитанных на основании результатов анализа 8 и 11 локусов микросателлитов: r=+0,98 (p>0,999) - для среднего числа аллелей в расчете на локус, r=+0,99 (p>0,999) - для наблюдаемой степени гетерози-готности, r=+0,98 (p>0,999) - для индекса Fis. Доля межпопуля-ционной изменчивости, оцененная с использованием индекса Rst (AMOVA), для системы «короткого» типа составила 13,1 %, «длинного» -11,9 %. Анализ генетических дистанций, рассчитанных на основании ДНК-профилей кур пяти пород по 8 и11 локусам микросателлитов, показал сходную картину филогенетических связей исследуемых пород (r=+0,97, p>0,999).

Ключевые слова: тест-системы, микросателлиты, породы кур

Развитие методов инструментального обеспечения молекулярно-генетических исследований обусловило разработку мультиплексных тест-систем, которые дают возможность проводить анализ нескольких локусов в одной реакции [1]. Особую актуальность это приобретает для тест-систем анализа микросателлитов - высоко полиморфных последовательностей ДНК, равномерно распределенных по всему геному [2], которые находят широкое применение в решении вопросов популяционной

* Исследования выполнены при финансовой поддержке Минобрнауки РФ, государственный контракт № 11.519.11.2024 и шифр 2012-1.4-12-000-1001-010. В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Табл. 1. Функциональные характеристики и потребительские свойства мультиплексных тест-систем анализа микросателлитов кур

Показатель Тип тест-системы

«короткая» «длинная»

Число пород 5 5

Мультиплексность 8 11

Специфичность, % 99,88 99,91

Na 6,38±0,32 6,07±0,30

Na>5% 4,88±0,45 4,67±0,50

Ne 3,63±0,17 3,55±0,19

PI 7,6*10-8 4,1*10-10

PI для полусибсов 1,3*10-3 1,7*10-4

PX1,% 99,51±0,09 99,91±0,01

PX2, % 95,09±0,60 98,16±0,20

PX3, % 99,99±0,01 >99,99±0,01

ASS, % 100,0 100,0

-30

-20

-10

Рис. 1. Схемы двух типов тест-систем анализа микросателлитов кур: А) «короткого» типа (8 локусов); Б) «длинного» типа (11 локсов); локусы, амплифицируемые с использованием праймеров, меченных FAM и Ябв, показаны, соответственно, белыми и черными прямоугольниками; длины амплифици-руемых фрагментов указаны в парах оснований (п.о.).

и эволюционной генетики, в генетической экспертизе происхождения животных [3...5]. Достижение высокой точности подтверждения и (или) исключения отцовства при проведении генетической экспертизы происхождения племенных животных требует исследования, как правило, не менее 7.9 локусов [6,

7]. С другой стороны, для определения популяционной принадлежности особей на основании ДНК-профилей необходимо использование, по возможности, большего числа локусов. Следует отметить, что их увеличение - один из способов повышения функциональных и потребительских свойств тест-систем. Однако это приводит к удорожанию исследований. В сложившейся ситуации ряд производителей тест-систем предлагают несколько вариантов технических решений с различным

числом локусов («короткие» и «длинные»), применение которых зависит от задач исследований [8].

Цель нашей работы - разработка и сравнительная оценка информативности двух типов мультиплексных тест-систем анализа микросателлитов кур с различным числом локусов, амплифицируемых в одной реакции.

Условия, материалы и методы. Работу проводили на базе Центра коллективного пользования научным оборудованием «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ Россельхозакадемии. Материалом для исследований послужили образцы ДНК кур генофондного стада ВНИТИ птицеводства Россельхозакадемии пород юрловская голосистая (п=20), орловская ситцевая (п=20), русская хохлатая (п=20), вельзумер (п=20) и суссекс (п=20). Сравнение тест-системы «длинного» типа (рис. 1), включающей 11 локусов МС (МСЖ)111, МСЖЮ78, МСШ0067, І_ЕІ0094, І_ЕІ0074, МСШ0123, МСШ0081, МСШ0216, МСШ0069, МСШ0104, МСШ0183) проводили с ранее разработанной тест-системой «короткого» типа, включающей 8 локусов (МСШ0111, МСШ0067, _Е10094, МСШ0123, МСШ0081, МСШ0069, МСШ0104, МСШ183). Определяли следующие функциональные характеристики: мультиплексность (способность одновременного анализа нескольких локусов в одной реакции), специфичность (доля генотипированных локусов, %), среднее число аллелей на локус (Ыа), среднее число информативных аллелей, встречающихся с частотой 5 % и более, на локус (Ыа>5%),

о

-30

-20

-10

0

А О

о

- -5

- -10

-15

-20

Измерение 1

-25

О

-10

-15

-20

-25

Измерение 1

-30

Рис. 2. Распределение особей кур пяти пород в пространстве двух измерений на основании анализа локусов микросателлитов по методу Paetkau й. [10]: А) тест-система «короткого» типа (8 локусов); Б) тест-система «длинного» типа (11 локусов); породы кур: О - юрловская голосистая,  - орловская ситцевая, Д - русская хохлатая,О - вельзумер, •- суссекс.

Табл. 2. Популяционно-генетические параметры изучаемых пород кур, рассчитанные по микросателлитам

Показатель Горо- да Число исследованных локусов микросателлитов

8* 11**

Среднее число Ю Г 6,75±1,07 6,36±0,88

аллелей на локус О С 6,63±0,46 6,36±0,59

микросателлитов Р Х 7,13±0,64 6,64±0,68

ВЗ 5,50±0,50 5,18±0,48

СУС 5,88±0,81 5,82±0,72

Наблюдаемая сте- Ю Г 0,538±0,091 0,532±0,085

пень гетерозигот- О С 0,581±0,072 0,568±0,078

ности Р Х 0,713±0,032 0,673±0,063

ВЗ 0,800±0,053 0,750±0,077

СУС 0,538±0,062 0,559±0,053

Индекс фиксации, Ю Г 0,243±0,084 0,244±0,086

(Fis) О С 0,176±0,094 0,124±0,073

Р Х 0,011±0,043 -0,033±0,054

ВЗ -0,155±0,070 -0,155±0,060

СУС 0,196±0,089 0,125±0,080

среднее число эффективных аллелей на локус (Ne). Оценку потребительских свойств тест-систем проводили по таким показателям [9, 10], как вероятность совпадения генотипов животных (PI), точность подтверждения происхождения по обоим (PX1) и по одному (PX2) родителю, точность исключения родителей (PX3), доля особей, отнесенных к собственной популяции (ASS). Для оценки доли межпопуляционной изменчивости рассчитывали индекс Rst с использованием функции молекулярной вариансы (AMOVA). Генетические дистанции определяли по [11].

Построение филогенетического дерева осуществляли методом попарного внутригруппового невзвешенного среднего (UPGMA). В работе использовали программное обеспечение GenAlEx (версия 6.4) и Past (ver. 2.15).

Результаты и обсуждение. Анализ функциональных характеристики и потребительских свойств разработанных тест-систем показал, что они обладают высокой специфичностью: доля амлифицированных локусов для тест-систем «короткого» и «длинного» типов составила соответственно 99,88 и 99,91 %. По среднему числу аллелей, числу информативных и эффективных аллелей в расчете на один локус достоверных различий между ними не обнаружено. Увеличение числа локусов приводило к снижению вероятности совпадения генотипов (p>0,95). В то же время при использовании тест-системы «короткого» типа вероятность совпадения генотипов животных при проведении ДНК-паспортизации кур внутри отдельных стад практически отсутствует. Оба изучаемых типа тест-систем обеспечивали высокую точность подтверждения происхождения по обоим родителям (99,51 и 99,91 %) и исключения родителей (99,99 % и более). В случае проведения анализа на достоверность происхождения по одному из родителей преимущество принадлежит тест-системе «длинного» типа, характеризующейся более высокой точностью, чем система «короткого» типа (95,09±0,60 против 98,16±0,20 %, p>0,999).

Обработка ДНК-профилей кур по 8 и 11 локусам микросателлитов по Paetkau D. [10] позволила в 100 % случаев корректно отнести каждую особь к собственной популяции, при этом использование тест-системы «длинного» типа приводило к формированию более удаленных массивов (рис. 2).

Достоверныхразличий междузначениями популяционногенетических показателей (среднее число аллелей на локус микросателлитов, наблюдаемая степень гетерозиготности, индекс фиксации, Fis), рассчитанных на основании профилей кур изучаемых пород по 8 и 11 локусам микросателлитов не выявлено (табл. 2).

Наибольшее генетическое разнообразие, оцененное по среднему числу аллелей микросателлитов на локус, наблюдалось у кур русской хохлатой породы, наименьшее - у птиц породы вельзу-мер (табл. 2). Коэффициент корреляции по величине этого показателя между результатами, полученными с использованием разных тест-систем, составил +0,98 (p>0,999).

Наибольшая степень гетеро- _ „ „ ,

г Рис. 3. Дендограмма филогенетического родства изучаемых пород кур, построенная

^готнюст1, рассчитанная по по Nei m. (11) методом попарного внутригруппового невзвешенного среднего, UPGMA: А. данным ДНК-профилей по 8 тест-система «короткого» типа (8 локусов); Б. тест-система «длинного» типа (11 локусов); ось и 11 локусам, отмечена у кур Х - генетические дистанции, рассчитанные по Nei M. (10); породы кур: Ю_Г - юрловская голопороды вельзумер, наимень- систая, О_С - орловская ситцевая, Р_Х - русская хохлатая, ВЗ - вельзумер, СУС - суссекс.

* - тест-система «короткого» типа; ** тест-система «длинного» типа; породы кур: Ю_Г- юрловская голосистая, О_С - орловская ситцевая, Р_Х - русская хохлатая, ВЗ - вельзумер, СУС - суссекс.

шая - у птиц юрловской голосистой породы (г=+0,99, р>0,999). Использование обеих тест-систем показало существенный дефицит гетерозигот у кур пород юрловская голосистая, орловская ситцевая и суссекс, 15,5 %-ный избыток гетерозигот отмечен у птиц породы вельзумер (г=+0,98, р>0,999).

В результате расчета значений индекса 1^ (ДМОУД) установлено, что доля межпопуляционной изменчивости в общей изменчивости микросателлитов при использовании тест-системы «короткого» типа составила 13,1 %, в варианте с тест-системой «длинного» типа - 11,9 %. Внутрипопуляционная изменчивость внутри и между индивидуумами составила соответственно 75,9 и 10,2 % для тест-системы «короткого» типа и 5,4 и 82,6 % - для тест-системы «длинного» типа.

Анализ генетических дистанций, рассчитанных по [11], в целом показал сходную картину филогенетических связей изучаемых пород (г=+0,97, р>0,999). Они формируют на дендограмме два кластера (рис. 3). Первый объединяет породы юрловская голосистая, русская хохлатая и суссекс, в селекции которых использовали кур породы брама. Второй кластер образуют породы орловская ситцевая и

вельзумер, в создании которых участвовали бойцовые Выводы. В целом результаты проведенных исследо-куры малайского типа. Следует отметить, что величины ваний показали, что использование двух типов тест-систем

генетических дистанций, рассчитанных с использованием анализа микросателлитов кур, различающихся числом

тест-системы «короткого» типа в абсолютном выражении анализируемых локусов, дают сходную картину оценки со-

были выше, чем аналогичные для тест-системы «длинного» стояния популяций. Для определения спектра прикладного

типа, что, на наш взгляд, связанного со снижением доли применения разработанных тест-систем требуется прове-

межпопуляционной изменчивости вследствие введения дение дополнительных исследований с увеличением числа

дополнительного числа локусов. пород кур и размера выборок.

Литература.

1. Зиновьева Н.А., Гладырь Е.А. Генетическая экспертиза сельскохозяйственных животных: применение тест-систем на основе микросателлитов //Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 9. - с. 19-20.

2. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers // Nucleic Acids Research. -1989. - 17. - 6463-6471

3. Зиновьева Н.А., Сизарева Е.И., Гладырь Е.А., Проскурина Н.В., Шавырина К.М. Некоторые аспекты использования микросателлитов в свиноводстве //Достижения науки и техники АПК. - 2009. - № 8. - с. 38-41.

4. Зиновьева Н.А., Стрекозов Н.И., Молофеева Л.А. Оценка роли ДНК-микросателлитов в генетической характеристике популяции черно-пестрого скота //Зоотехния. - 2009. - № 1. - с. 2-4.

5. Фисинин В.И., Гладырь Е.А., Волкова В.В., Севастьянова А.А., Зиновьева Н.А. Анализ генетической структуры породдомашних кур с использованием микросателлитных маркеров // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - № 1. - с. 68-72.

6. Measurement of Domestic Animal Diversity (MoDAD): Recommended Microsatellite Markers // Secondary Guidelines for Development of National Farm Animal Genetics Resources Management Plants. - Rome: FAO Swines, 1998. - p. 19-24.

7. Measurement of Domestic Animal Diversity (MoDAD): New Recommended Microsatellite Markers // FAO/ISAG, 2004, режим доступа: http://dad.fao.org/.

8. Гладырь Е.А., Горелов П.В., Маурчева В.Н., Шахин А.В., Чинаров Ю.И., Зиновьева Н.А. Оценка результативности тест-системы на основе микросателлитов в проведении ДНК-экспертизы крупного рогатого скота //Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 8. - с. 51-54.

9. Peakall R., Ebert D., Cunningham R., Lindenmayer D.B. Mark-recapture by genetic tagging reveals restricted movements by bush rats, Rattus fuscipes, in a fragmented landscape // Journal of Zoology. - 2006. - 268. - 207-216.2006.

10. Paetkau D., Slade R., Burdens M., Estoup A. Genetic assignment methods for the direct, real-time estimation of migration rate: a simulationbased exploration of accuracy and power// Molecular Ecology. - 2004. - 13. - 55-65.

11. Nei M., Tajima F., Tateno, Y. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data // J. Mol. Evol., 1983, 19, 153-170.

THE STUDY OF INFORMATIVITY OF THE MULTIPLEX TEST SYSTEMS FOR ANALYSIS OF CHICKEN MICROSATELLITES WITH THE DIFFERENT NUMBER OF LOCI

I.P. Novgorodova, V.I. Fisinin, N.A. Zinovieva, E.A. Gladyr, M.V. Mikhaylov, J.S. Royter, G. Brem

Summary. The comparative study of two multiplex test systems for analysis of chicken microsatellites including eight (“short’ type) and eleven (“long” type) loci was performed. The analysis of 100 samples derived from five chicken breeds showed the high specificity of developed systems: the number of amplified loci was 99.88 and 99.91 per cent for “short” and “long” types of test systems, respectively. The compared test systems significantly not differed for the average number of alleles, the number of informative alleles and the number of effective alleles calculated per loci. The decrease of probability of genotype identity with increase of number of analyzed loci was shown. The correct assignment of individuals to own populations was achieved in 100 per cent cases using the test systems of both types. The high degree of correlation of population genetic parameters calculated using eight and eleven microsatellite loci was observed: r=+0.98 (p>0,999) for the average number of alleles per loci, r=+0.99 (p>0,999) for the degree of observed heterozygoty, r=+0.98 (p>0,999) for Fis index. The degree of intra population diversity evaluated using Rst (AMOVA) index was 13.1 and 11.9 per cent for “short” and “long” types of test systems, respectively. The analysis of genetic distances calculated on the base of DNA profiles of five chicken breeds using eight and eleven microsatellite loci showed the similar pattern of the phylogenetic relationships between investigated breeds (r=+0.97, p>0,999).

Key words: test systems, microsatellites, chicken breeds.

УДК 636.082

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ МУЖСКИХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК КАК МЕТОД СОХРАНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ*

В.И. ФИСИНИН, академик РАСХН, директор ВНИТИП Россельхозакадемии В.А. БАГИРОВ, член-корреспондент РАСХН, зам. директора

Н.А. ВОЛКОВА, доктор биологических наук, зав. лабораторией

Н.А. ЗИНОВЬЕВА, академик РАСХН, директор ВИЖ Россельхозакадемии

Я.С. РОЙТЕР, доктор сельскохозяйственных наук, зам. директора

ВНИТИП Россельхозакадемии М.А. ЖИЛИНСКИЙ, аспирант ВИЖ Россельхозакадемии E-mail: vugarbagirov@mail.ru

Резюме. Рассмотрены перспективы использования половых клеток самцов для разработки эффективных криотехнологий сохранения генетических ресурсов сельскохозяйственной птицы. На основании анализа литературных данных показано, что сегодня для криоконсервации генетических ресурсов сельско-

*Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ, государственный контракт № 11.519.11.2024. Достижения науки и техники АПК, №8-2012 ______________________________________________________ 65