БИОСОВМЕСТИМЫЙ КОМПОНЕНТ
BIOCOMPATIBLE COMPONENT

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к области биосовместимых компонентов, предназначенных для контакта с живыми клетками или тканью, в частности к имплантатам, предназначенным для имплантации в живую ткань.
Предпосылки изобретения
Зубные имплантаты представляют собой медицинские изделия, применяемые для восстановления функции, связанной с утратой одного или нескольких зубов. Для обеспечения успешного выполнения своих функций в течение длительного периода зубные имплантаты нужно достаточно прочно закрепить в кости, чтобы они выдерживали нагрузку, вызванную, например, жеванием. Двумя важными показателями для обеспечения высокой прочности крепления являются i) химический состав материала и ii) конструкция имплантата во всех диапазонах длин. Особенности рельефа при разных диапазонах длин индуцируют, например, центры зародышеобразования коллагена и минералов, прикрепление клеток и биомеханическую стимуляцию, необходимую для предотвращения резорбции кости, и в конечном итоге для усиления кости.
Зубные имплантаты, которые сейчас широко используются, выполнены из титана или сплавов титана с винтообразной конструкцией и шероховатой поверхностью.
На сегодняшний день существует несколько способов обработки металлических имплантатов, таких как зубные имплантаты на основе титана, для обеспечения лучшего прикрепления имплантата, и, следовательно, для улучшения остеоинтеграции. Некоторые из них связаны с изменением морфологии имплантата, например, путем создания неровностей на поверхности имплантата для увеличения шероховатости поверхности по сравнению с необработанной поверхностью. Считается, что увеличение шероховатости поверхности, которое обеспечивает больший контакт и большую площадь прикрепления между имплантатом и костной тканью, обеспечивает большую механическую прочность и фиксацию между имплантатом и костью. В данной области хорошо известно, что, например, плазменное напыление, обдувка или травление кислотой могут обеспечить шероховатость поверхности.
Кроме того, известно, что остеобласты, т.е. костеобразующие клетки, воспринимают и реагируют на множество физико-химических свойств подстилающей поверхности. Для образования кости на поверхности имплантата необходима дифференциация клеток-предшественников в секреторные остеобласты с целью получения неминерализованного внеклеточного матрикса (ЕСМ) и последующей кальцификации этого матрикса, как описано, например в Anselme K, Osteoblast adhesion on biomaterials, Biomaterials 21, 667-681 (2000).
Изменение химических свойств поверхности имплантата часто использовали для обеспечения лучшей фиксации имплантата к костной ткани. Некоторые способы включают нанесение слоя керамического материала, такого как гидроксиапатит, на поверхность имплантата с целью улучшения прикрепления имплантата к кости, поскольку гидроксиапатит близок к кости по химическим свойствам.
Общий недостаток в случае покрытий, содержащих гидроксиапатит, заключается, тем не менее, в том, что они могут быть хрупкими и могут шелушиться или откалываться от поверхности имплантата из-за более сильной связи, образующейся между костью и покрытием, чем между покрытием и имплантатом, что может привести к окончательному разрушению имплантата. Что касается применения белковых покрытий, которые также были предложены, то существуют дополнительные аспекты, которые необходимо учитывать. Вследствие химической природы белков для поверхности с белковым покрытием может понадобиться особая стерилизация и условия хранения с целью поддержания его биологической активности. Кроме того, реакция ткани-хозяина (например, иммунная реакция) на биомолекулы, такие как белки, может быть непредсказуемой.
Хотя различные физико-химические свойства поверхностей имплантата, как правило, считаются решающим фактором для биосовместимости материалов, механизм образования новой кости на молекулярном уровне до сих пор не изучен.
Одним словом, несмотря на то что существует множество ранее разработанных способов повышения остеоинтеграции имплантата, существует потребность в имплантатах с улучшенными характеристиками в отношении остеоинтеграции и обеспечения прочного прикрепления имплантата к кости.
Краткое описание изобретения
Цель настоящего изобретения заключается по меньшей мере в частичном решении проблем существующих имплантатов, связанных с образованием новой ткани, в частности, кости и/или остеоинтеграции, а также в обеспечении биосовместимого компонента, например, части зубного имплантата, который обеспечивает лучшее прикрепление имплантат-ткань.
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения эта и другие цели достигаются посредством биосовместимого компонента, имеющего поверхность, предназначенную для контакта с живой тканью, где поверхность содержит частицы оксида металла, при этом указанные частицы имеют средний размер частиц менее 100 нм. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения частицы имеют средний размер частиц менее 25 нм.
Автор настоящего изобретения обнаружил, что путем нанесения частиц оксида металла нанометрового размера на поверхность биосовместимого компонента биологическая активность биосовместимого компонента увеличилась в том плане, что она индуцировала раннее образование зародышей апатита in vitro по сравнению со стандартным образцом.
При имплантации имплантата в тело пациента поверхность имплантата вступает в контакт, например, с кровью. Ионы, находящиеся в крови, притягиваются к поверхности имплантата и начинают образовывать небольшие кристаллы гидроксиапатита, данный процесс называется образованием зародышей. Впоследствии кристаллы гидроксиапатита способствуют притяжению белков и клеток, таких как остеобласты, к поверхности имплантата и образованию структуры ткань-имплантат-кость. Полагают, что биосовместимый компонент в соответствии с настоящим, изобретением будет индуцировать раннее образование зародышей гидроксиапатита in vivo и тем самым способствовать остеоинтеграции путем повышения скорости регенерации ткани. Наблюдалось, что при погружении в жидкость, имитирующую жидкость организма, биосовместимые компоненты в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения в течение 12 ч индуцировали образование кристаллов апатита с отношением Ca/P, составляющим 1,7, которое аналогично таковому для природного гидроксиапатита, находящегося в кости.
Путем нанесения тонкого, относительно однородного, слоя наночастиц на поверхность биосовместимого компонента достигаются различные свойства поверхности по сравнению с нанесением слоя или покрытия, не содержащих частиц, с таким же химическим составом и кристалличностью, для которого свойства материала подложки являются преобладающими. Например, было показано, что небольшие наночастицы несут более высокий поверхностный заряд по сравнению с более крупными аналогами (Zareen Abbas, Christophe Labbez, Sture Nordholm, and Elisabet Ahlberg., J. Phys. Chem. С 2008, 112, 5715-5723). Считается, что это может влиять на образование апатита, а также на адсорбцию белков и клеток на поверхности, покрытой такими частицами.
Наноразмерные частицы оксида металла могут образовать нанопористый слой на поверхности биосовместимого компонента. Частицы могут располагаться на поверхности с высокой плотностью, образуя слой с присущей ему пористостью в диапазоне от 0,225*R для монослоев или от 0,732*R для мультислоев, соответственно, при этом R представляет собой радиус наночастиц. Мультислой, т.е. слой, содержащий несколько частиц в направлении, перпендикулярном поверхности, в котором находятся частицы, может иметь более высокую пористость из-за несоответствия в упаковке наночастиц, которые являются сферическими. Пористый характер слоев обуславливает более выраженную поверхность раздела по сравнению с поверхностью без наночастиц. Кроме того, наночастицы также обеспечивают большую площадь электрохимически активной поверхности, поскольку электролит может проникать в пористую структуру. Таким образом, структура из наночастиц, которая образует наружную поверхность компонента, является более реакционноспособной и может обладать различными электронными свойствами по сравнению с поверхностью без частиц или поверхностью с покрытием из частиц большего размера, чем частицы, применяемые в настоящем изобретении. Также было обнаружено, что электронные свойства оксидной пленки, покрывающей поверхность костного имплантата, оказывают сильное влияние на присоединение клеток и образование зародышей апатита, нежели небольшое изменение в рельефе, а также то, что менее изолирующая оксидная пленка может быть более предпочтительной для титановых имплантатов. Кроме того, слой частиц, применяемый в вариантах осуществления настоящего изобретения, может обладать настолько низкой пористостью, что он не позволяет бактериям проникать и/или накапливаться в этом слое.
Кроме того, полагают, что большое число энергетических состояний в запрещенной зоне, установленной для поверхности, содержащей наночастицы, может иметь большое значение для адсорбции редокс-активных белков, таких как фибриноген.
В вариантах осуществления настоящего изобретения частицы имеют распределение по размеру частиц, взятое как отношение полной ширины на половине максимума (FWHM), разделенной на среднее значение размера частиц, полученное с помощью сканирующего измерителя подвижности частиц с электрораспылением (ES-SMPS), до 45%, предпочтительно 40%, и еще более предпочтительно до 35%. Таким образом, например, для частиц со средним диаметром 10 нм индивидуальный размер частиц будет равным 10±4,5 нм, предпочтительно 10±4,0 нм, а еще более предпочтительно 10±3,5 нм. В результате узкого распределения частиц по размеру достигается гладкая структура поверхности частиц со складкой исходя из размеров отдельных частиц.
Обычно частицы имеют, как правило, сферическую форму.
В вариантах осуществления настоящего изобретения оксид металла является по меньшей мере частично кристаллическим. Указанный оксид металла обычно содержит диоксид титана. В предпочтительных вариантах осуществления преобладающей формой указанного диоксида титана является анатаз. Например, указанный оксид титана может состоять в основном из анатаза (по меньшей мере из 50% анатаза).
Однако можно применять и другие оксиды металлов, как правило, в сочетании с диоксидом титана. В вариантах осуществления настоящего изобретения частицы могут включать i) частицы, состоящие фактически из диоксида титана, а также необязательно ii) частицы, состоящие фактически из одного или нескольких оксидов циркония, гафния, ванадия, ниобия, тантала, кобальта и иридия, при этом оксиды циркония и/или иридия, являются особенно предпочтительными. В результате смешивания частиц титана с частицами одного или нескольких вышеуказанных оксидов можно достичь различных свойств полученного слоя, например, относительно цвета, прочности и/или электронных свойств. Например, для повышения электронных свойств слоя можно использовать частицы оксида иридия в сочетании с частицами диоксида титана.
В вариантах осуществления настоящего изобретения частицы оксида металла образуют слой по меньшей мере на части поверхности биосовместимого компонента. Таким образом, поскольку поверхность биосовместимого компонента предназначена для контакта с живой тканью, то частицы предназначены для контакта с живой тканью, в частности, с костью.
В вариантах осуществления настоящего изобретения указанный слой, образованный указанными частицами, может иметь толщину в диапазоне от 8 нм до приблизительно 1 мкм, обычно от 50 до 500 нм, например, от 100 нм до 400 нм. Тонкие слои являются предпочтительными из-за лучшей адгезии к поверхности подложки. К тому же, в случае спеченного слоя (см. ниже) частиц, такие тонкие слои могут обладать более высокой прочностью, нежели более толстые слои. Указанный слой может представлять собой монослой указанных частиц. Таким образом, нижний предел толщины слоя приблизительно такой же, что и размер частиц. Тонкий слой наноразмерных частиц снижает шероховатость поверхности на субмикронном уровне, преимущественно сохраняя при этом шероховатость поверхности (уровень обдувки). Это имеет большое значение для длительной остеоинтеграции имплантата.
Данный слой может представлять собой сплошной слой указанных частиц, причем этот слой может покрывать по меньшей мере часть указанной поверхности. Под сплошным слоем понимается связанный слой, образующий единую область. В отличие от сплошного слоя прерывистый слой образуется из нескольких отдельных участков слоя. В вариантах осуществления настоящего изобретения частицы могут образовывать слой, который полностью покрывает поверхность биосовместимого компонента.
В вариантах осуществления настоящего изобретения частицы равномерно распределены по всему указанному слою.
В вариантах осуществления настоящего изобретения частицы могут спекать. Тщательное спекание слоя наноразмерных частиц может повышать прикрепление частиц к подложке. Спекание частиц может привести к образованию керамического или керамоподобного слоя. Тем не менее, частицы могут также быть неспеченными.
aa
В вариантах осуществления настоящего изобретения указанная поверхность имеет относительную площадь активной поверхности A (площадь электрохимически активной поверхности) по меньшей мере 1,5, предпочтительно по меньшей мере 1,8, по сравнению с соответствующим биосовместимым компонентом, в котором отсутствуют частицы, и который имеет поверхность, покрытую природным оксидом металла. Увеличение активной площади поверхности приводит к образованию более реакционноспособной поверхности, и вследствие этого она может адсорбировать ионы в большей степени и/или увеличить скорость осаждения апатита.
a
В вариантах осуществления настоящего изобретения слой указанных частиц может иметь среднюю толщину поверхности (S) в диапазоне от 5 нм до 70 нм, например от 5 до 15 нм.
В вариантах осуществления настоящего изобретения биосовместимый компонент содержит подложку с указанной поверхностью, при этом подложка содержит материал на основе металла. Обычно подложка содержит металлический каркас, выполненный из указанного материала на основе металла. Материал на основе металла могут выбирать из титана, циркония, гафния, ванадия, ниобия, тантала, кобальта и иридия, а также их сплавов. Поверхность подложки, которая контактирует с указанными частицами, может содержать оксид титана, в частности, в вариантах осуществления, где подложка содержит титан или выполнена из титана. В таких вариантах осуществления оксид титана может представлять собой природный оксид титана, который естественно и мгновенно образуется на поверхности титана при контакте с кислородом, например, на воздухе. В вариантах осуществления, в которых подложка содержит или выполнена из другого вышеуказанного материала на основе металла, ее поверхность, которая контактирует с указанными частицами, обычно содержит природный оксид соответствующего металла, указанного выше.
В других вариантах осуществления изобретения подложка может содержать неметаллический материал, такой как биосовместимый керамический материал, например диоксид циркония, или биосовместимый полимерный материал. Подходящие материалы известны специалистам в данной области. В таких вариантах осуществления подложку можно выполнить из керамической композиции или композиции полимерного материала.
Биосовместимый компонент в соответствии с настоящим изобретением, как правило, предназначен для имплантации в живую ткань, в частности, в костную ткань. В качестве альтернативы, компонент может предназначаться для имплантации в мягкую ткань. Например, биосовместимый компонент может представлять собой зубной имплантат или его часть, такую как зубной винтообразный имплантат. С другой стороны, биосовместимый компонент может представлять собой ортопедический имплантат или его часть.
Преимущественно в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения биосовместимый компонент может индуцировать образование зародышей кристаллов гидроксиапатита в течение 12 часов при погружении в жидкость, имитирующую жидкость организма.
В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ получения биосовместимого компонента, включающий:
a) обеспечение подложки, имеющей поверхность;
b) обеспечение дисперсии частиц оксида металла, частицы которого имеют средний размер частиц менее 100 нм, частицы которого диспергированы в растворителе; и
c) нанесение указанной дисперсии частиц на поверхность указанной подложки.
При дисперсии на этапе b) частицы могут полностью диспергироваться. В таких вариантах осуществления на этапе c) каждую частицу в составе дисперсии наносят на поверхность по отдельности. Однако сразу после нанесения на поверхность подложки частицы плотно упаковываются вместе, образуя плотно упакованную структуру.
Как правило, указанные частицы имеют средний размер частиц менее 25 нм.
Растворитель может представлять собой водный растворитель, обычно деионизированную воду.
В вариантах осуществления настоящего изобретения указанную дисперсию частиц оксида металла можно получить путем:
4
b-i) осуществления контролируемого гидролиза TiCl в воде с получением коллоидной дисперсии и
b-ii) осуществления диализа указанной коллоидной дисперсии.
4
4
Этап b-i) обычно осуществляют путем медленного добавления TiCl, предпочтительно по каплям, в деионизированную воду. Температура соединения TiCl может быть ниже 0°C, обычно ниже -10°C, а температура указанной воды может находиться в диапазоне от 0°C до 5°C, предпочтительно 0°C при перемешивании.
Дисперсию можно наносить на подложку любым подходящим способом, включая нанесение покрытия центрифугированием, нанесение покрытия распылением, окунанием, погружением, нанесение покрытия золь-гель способом, электрофоретическим осаждением и т.д.
В вариантах осуществления настоящего изобретения данный способ дополнительно включает испарение указанного растворителя после нанесения указанной дисперсии.
Необязательно способ может дополнительно включать этап спекания указанных частиц. В вариантах осуществления настоящего изобретения также можно использовать процедуру, состоящую из двух этапов, при которой наносят и спекают первый слой указанных частиц с последующим нанесением дополнительных частиц оксида металла, как описано в данном документе, которые не спекают. Таким образом, можно получить преимущества как спеченных, так и неспеченных частиц.
Как правило, подложка может содержать металл, выбранный из титана, циркония, гафния, ванадия, ниобия, тантала, кобальта и иридия, а также их сплавов, но предпочтительно содержит титан или его сплав. Поверхность подложки может содержать природный оксид металла, такой как природный оксид титана в случае титановой подложки.
В вариантах осуществления настоящего изобретения поверхность подложки может подвергаться обработке для придания ей шероховатости перед этапом c). Примеры обработки для придания шероховатости включают абразивную обдувку и химическое травление. Кроме того, подложку можно обточить или подвергнуть обработке для устранения шероховатости, например полировке.
Следует отметить, что настоящее изобретение относится ко всем возможным комбинациям характеристик, перечисленных в формуле изобретения.
Краткое описание графических материалов
2
На фиг.1 показана дифракция рентгеновских лучей наночастиц TiO в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
2
2
На фиг.2a-c показаны изображения SEM с высоким разрешением поверхностей, содержащих частицы TiO диаметром 8 нм (фиг.2а) и 22 нм (фиг.2b, c), коммерческие частицы TiO (фиг.2d) и травленой дважды поверхности без частиц (фиг.2е).
2
На фиг.3 показаны вольтамперограммы, полученные в результате циклической вольтамперометрии, выполненной на поверхностях, содержащих наноразмерные частицы TiO, и контрольной поверхности (TS).
На фиг.4 показаны кривые Мотта-Шоттки для различных поверхностей на основе титана (Ti), исследуемых в данном документе.
2
На фиг.5 показаны кривые Мотта-Шоттки для поверхности на основе золота, содержащей наноразмерные частицы TiO.
2
На фиг.6 показана плотность состояний (DOS) поверхностей, содержащих наноразмерные частицы TiO, и контрольной поверхности как функции от потенциала в отношении потенциала плоских зон.
Фиг.7 представляет собой график, на котором показана площадь покрытия на основе апатита на пяти различных поверхностях через 12 часов, 72 часа и 1 неделю, соответственно, после погружения в жидкость, имитирующую жидкость организма.
2
2
На фиг.8a-d показаны изображения SEM с высоким разрешением поверхностей на основе титана, содержащих частицы TiO диаметром 8 нм (фиг.8а), 22 нм (фиг.8b), коммерческие частицы TiO (фиг.2с) и контрольной поверхности без частиц (фиг.8d), через 12 часов после погружения в жидкость, имитирующую жидкость организма. На фиг.8е-h показаны спектры EDX и зафиксированная атомная концентрация отобранных элементов поверхностей фиг.8a-d.
2
Фиг.9а-с представляет собой изображения SEM, на которых показана поверхность на основе титана, содержащая частицы TiO диаметром 22 нм, через 12 ч (фиг.9а), 72 ч (фиг.9b) и 1 неделю (фиг.9с) после погружения в жидкость, имитирующую жидкость организма.
Фиг.10a-b представляет собой изображения SEM, на которых показаны поверхности на основе титана, покрытые наночастицами в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
Фиг.11a-b представляет собой AFM изображения поверхностей, покрытых наночастицами, в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
Фиг.12 представляет собой изображение FEG-SEM при увеличении в 250000 раз винтообразного имплантата на основе титана, покрытого наночастицами в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
Фиг.13 представляет собой изображение FEG-SEM при увеличении в 100000 раз винтообразного имплантата из титана, покрытого наночастицами в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, после установки в малоберцовую кость и удаления из нее.
Фиг.14 представляет собой график, на котором показан уровень экспрессии гена cbfa, обнаруженного в остеобластах, выращенных на поверхностях в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
Фиг.15 представляет собой график, на котором показан уровень экспрессии гена ВМР-2, обнаруженного в остеобластах, выращенных на поверхностях в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
Фиг.16 представляет собой график, на котором показан уровень IL-6, секретируемого остеобластами, выращенными на поверхностях в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения.
Подробное описание изобретения
Пример 1: получение и характеристика поверхностей, содержащих частицы
1.1 Получение и характеристика образца
1.1.1 Получение образца
2
4
2
Наночастицы диоксида титана (TiO) синтезировали путем контролируемого гидролиза TiCl с получением чистых поверхностей частиц. Частицы TiO различных размеров получили путем синтеза при температуре 0°C, при этом диализ и хранение коллоидных дисперсий осуществляли при температуре 0°C для частиц диаметром 8 нм и 20°C для частиц диаметром 22 нм.
4
4
2
2
2
При обычном синтезе TiCl (99%) охлаждали при температуре -16°C и 5,2±0,05 мл этого раствора добавляли по каплям к 200 мл деионизированной (Milli-Q) воды при интенсивном перемешивании. В основном синтез осуществляли с применением объемного соотношения TiCl:HO 1:40 с получением концентрации TiO 18 г/л. Частицы TiO различных размеров получают путем регулирования температуры реакции, времени/температуры диализа и времени/температуры хранения. Этап диализа важен для предотвращения агломерации, а полученные суспензии состоят, в основном, из отдельных наночастиц. Подробную информацию о синтезе можно найти в Z. Abbas, J. Perez Holmberg, A.-K. Hellström, M. Hagström, J. Bergenholtz, M. Hassellöv and E. Ahlberg, Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Aspects, 2011, doi: 10.1016/j.colsurfa.2011.03.064. Синтез приводит к дисперсии, при которой частицы являются практически монодисперсными (Perez Holmberg, Z. Abbas, E. Ahlberg, M. Hassellöv and J. Bergenholtz, J. Phys. Chem. C, 2011, принята к публикации).
2
Коммерческие частицы TiO (Degussa P25) с индивидуальным размером частиц в диапазоне 30-80 нм и отношением анатаза к рутилу 4:1 тщательно промыли с удалением поверхностных органических соединений и поместили в ультразвуковую баню для получения дисперсного раствора. Однако динамическое рассеяние света показало наличие более крупных агрегатов, и было невозможно полностью диспергировать систему. Частицы наносили в несколько этапов путем центрифугирования на диски из Ti (диски 4 класса с обточенной поверхностью, диаметром 1,1 см) или Au (отполированные с помощью бумаги SiC (4000), диаметр 0,6 см). После нанесения центрифугированием образцы промыли деионизированной водой и оставили высыхать перед применением. В качестве дополнения к поверхностям, содержащим наночастицы, в настоящее исследование включили наноструктурную поверхность TS+AT1 (обточенную поверхность, последовательно обработанную щавелевой кислотой и плавиковой кислотой).
1.1.2 Определение распределения частиц по размерам
2
Распределение по размерам синтезированных наночастиц TiO можно получить способом, при котором применяют сканирующий анализатор подвижности частиц с электрораспылением (ES-SMPS) и который описан в Z. Abbas, J. Perez Holmberg, A.-K. Hellström, M. Hagström, J. Bergenholtz, M. Hassellöv and E. Ahlberg, Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Aspects, 2011, doi: 10.1016/j.colsurfa.2011.03.064.
1.1.3 Рельеф поверхности

Изображения SEM с высоким разрешением получали с помощью Leo Ultra 55 FEG SEM, работающего при 1 кВ. Анализ шероховатости поверхности проводили с помощью атомно-силовой микроскопии (АРМ) (Nanoscope Multimode IIIa, Digital Instruments). Измерения с помощью AFM в полуконтактном режиме осуществляли в трех точках для каждого образца и с тремя различными размерами сканирования, 10×10, 5×5 и 3×3 мкм (частота сканирования 0,8 Гц, 512 линий). Результаты AFM импортировали в программу MeX 19 (Alicona Imaging GmbH), в которой проводили анализ шероховатости и вычисляли параметры шероховатости 3D поверхности. С помощью различных размеров сканирования и различных размеров фильтра Гаусса в программе MeX получали информацию об особенностях рельефа в диапазоне от 10 мкм до 150 нм.
1.1.4 Анализ поверхностей
Для определения кристаллических фаз использовали порошковый дифрактометр Siemens D5000, в котором применяется излучение CuKα (λ=1,54056 Å). Дифракцию рентгеновского излучения измеряли при различных углах падения для того, чтобы получить информацию о различной толщине образцов. Для анализа XPS использовали квантовый сканирующий микроскоп 2000 ESCA (Physical Electronics, США) с применением источника рентгеновских лучей монохроматического AlKα.
1.1.5 Электрохимические измерения
2
4
2
-1
Циклическую вольтамперометрию и измерения импеданса осуществляли с помощью потенциостата/гальваностата/ZRA Gamry Reference 600™. Электрохимические измерения проводили в специально сконструированных трех электродных ячейках, применяемых для стационарных условий. Образец помещали на дно элемента с обточенной поверхностью в сторону электролита. Большой противоэлектрод из Pt размещали концентрически вокруг образца для обеспечения оптимального распределения тока, а контрольный электрод помещали в центр элемента. Данная конфигурация ячейки применима для всех типов плоских образцов и демонстрирует хорошие технические характеристики при измерении импеданса. Все потенциалы сравнивали с контрольным электродом из Ag/AgCl (насыщ. KCl, Е=0,197 В по сравнению с she). Измерения электрохимического импеданса (EIS) проводили в деаэрированной 0,5 М HSO и при проведении измерений импеданса поддерживали продувку газообразным N под низким давлением. Спектры импеданса записывали при постоянном потенциале в диапазоне частот от 1 кГц до 10 МГц, с 9 точек/декада и амплитудой 10 мВ rms. Потенциал усиливали на 50 мВ от +1 до -0,5 В со временем ожидания 300 с перед записью следующего спектра. Циклическую вольтамперометрию получали в 0,1 М KOH с частотой сканирования 50 мВс.
1.2. Результаты характеристики поверхностей
1.2.1 Распределение частиц по размерам
2
Распределения частиц по размерам, полученные через 1 и 3 недели хранения для дисперсий, которые хранили при температуре 0°C и при комнатной температуре, очень похожи. Предыдущие анализы (Z. Abbas, et al., Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Aspects, 2011, doi:10.1016/j.colsurfa.2011.03.064) показали, что можно получить коллоидные наночастицы TiO с узким распределением по размерам. Распределение измеряли как отношение полной ширины на половине максимума (FWHM), разделенное на среднее значение размера, и определили равным 35-40%.
1.2.2 XRD и XPS
На фигуре 1 показана дифракция рентгеновских лучей наночастиц в порошкообразной форме, полученной из суспензий, содержащих частицы диаметром 8 или 22 нм. Частицы сушили при 120°C в течение 16 часов до выполнения анализа. Основная фаза анатаз, но с небольшой долей брукита, как показало отражение при 2θ=30,8°. Широкие пики дифракции указывают на то, что частицы состоят из меньших кристаллитов (~4 нм) и исследования динамики роста показали, что частицы образуются путем медленной агрегации первоначально выпавших в осадок частиц данного размера. На вкладыше к фигуре 1 показана картина дифракции для частиц, прикрепленных к титану. Так как слой наночастиц тонкий, то сигнал очень слабый, но можно наблюдать основной пик анатаза. Это говорит о том, что фаза частиц сохраняется после осаждения и сушки. Частицы Р25, прикрепленные к титану, демонстрируют типичную картину дифракции при отношении анатаза к рутилу ~4/1. Для модификации TS+AT1 пики дифракции от оксида не наблюдаются, что указывает на то, что осажденный слой является аморфным или слишком тонким для обнаружения.
2
Анализ XPS, выполненный для слоев наночастиц, показывает чистый TiO со следами хлорида. Никакого сигнала для металла Ti не наблюдалось, что указывает на то, что пленки полностью покрывают поверхность. Ионы титана с меньшей валентностью не наблюдались. Сигнал углерода одинаковый для всех образцов и зависит от загрязнения поверхности.
1.2.3 Результаты рельефа поверхности
2
10z
На фигуре 2 показаны изображения SEM с высоким разрешением поверхностей, содержащих частицы TiO диаметром 8 нм (TS+8 нм, фиг.2а) или 22 нм (TS+22 нм, фиг.2b; Au+22 нм, фиг.2с), соответственно. Все три поверхности выглядят довольно гладкими. По изображениям SEM данных поверхностей создается впечатление, что подложка полностью покрыта. Для двух других модификаций, используемых в настоящей работе, это не так. Суспензия Р25 содержала агломераты частиц и их переносили на поверхность Ti в ходе выполнения процедуры нанесения центрифугированием. В результате получали поверхность с высокой шероховатостью, но посередине видна обточенная поверхность, фигура 2d. Для поверхности TS+АТ1, последовательно протравленной в щавелевой кислотой и плавиковой кислотой, образовывались довольно крупные, выпадающие в осадок частицы с очень тонким слоем оксида между ними. В отличие от сферических наночастиц, выпавшие в осадок частицы на поверхности TS+AT1 можно рассматривать как стержни с высотой 0,45 мкм (определено из среднего значения максимальной высоты 5 пиков и впадин, S), см. фиг.2е.

Анализ рельефа поверхностей осуществляли путем анализа AFM с помощью перекрывающихся размеров сканирования и различных размеров фильтра Гаусса с получением информации об особенностях поверхности в диапазоне от 10 до 0,150 мкм. Параметры шероховатости 3D поверхности вычисляли с помощью программного обеспечения MeX и значения для трех различных параметров приведены в таблице 1.
a
a
a
dq
dq
dr
a
dq
Значение S (средняя высота) значительно больше для поверхностей TS+P25 и TS+AT1, чем для поверхностей, содержащих наночастицы, и обточенной поверхности. Оба эти способа обработки поверхности индуцировали появление дополнительных поверхностных структур на верхней части обточенной поверхности, не покрывая ее полностью, фигура 2d-e. Слои частиц диаметром 8 и 22 нм, соответственно, полностью покрывали частицами обточенную поверхность, что, в свою очередь, вызвало снижение шероховатости поверхности непосредственно после покрытия обтачиваемых канавок, см. фиг.2а-b и таблицу 1. Та же тенденция наблюдается и для подложки из золота (фиг.2с), где значение S уменьшается после нанесения слоя частиц диаметром 22 нм. Существует лишь небольшая разница между значениями S для поверхностей TS+8 нм и TS+22 нм, но нижнее значение, полученное для более мелких частиц, означает, что кривизна частиц отражается на шероховатости поверхности. Было показано, что среднеквадратическое значение уклона (S) соотносится с прочностью на срез поверхности раздела и, таким образом, является важным параметром для изучения областей применения зубных имплантатов. С биомеханической точки зрения может потребоваться большое значение S. Тенденция в случае значений S (развернутая площадь поверхности раздела) соответствует той же тенденции, что и значения S и S с наименьшими значениями, полученными для поверхностей, содержащих наночастицы.
1.3. Электрохимическая характеристика
1.3.1 Циклическая вольтамперометрия (CV)
На фигуре 3 приведены примеры вольтамперограмм для иллюстрации влияния диапазона сканирования и числа сканирований для одного типа электродов (фигура 3а), частиц различных размеров (фигура 3b), частично покрытых электродов (фигура 3c) и различных подложек (фигура 3d). Общие особенности вольтамперограмм, полученные с Ti в качестве подложки, аналогичны таким в случае с симметричным процессом при наиболее отрицательных потенциалах и пиком при менее отрицательных потенциалах. Процесс, наблюдаемый при наиболее отрицательных потенциалах, отнесли к накоплению заряда в зоне проводимости, реакция (1), или заполнению ловушек чуть ниже зоны проводимости, реакция (2). В обоих случаях происходила адсорбция протонов с получением баланса зарядов в растворе кислоты.
2
2
В щелочных растворах катион электролита, вероятно, представляет собой частицу, уравновешивающую заряд, т.е. в данном случае адсорбцию K+. Пик при менее отрицательных потенциалах был объяснен заполнением состояний поверхности ниже зоны проводимости, т.е. восстановлением Ti(IV) до Ti(III) в соответствии с (2). Для реакции (2) образование TiO(OH) также возможно в щелочном растворе. С другой стороны, пик при менее отрицательных потенциалах объясняется состояниями ловушек на границах зерен на пленке. Как правило, ток при наиболее отрицательных потенциалах возрастает экспоненциально и в конечном итоге в результате восстановления воды происходит выделение водорода. Для электродов, покрытых наночастицами, наблюдается симметрия между катодным и анодным зарядом, TS+8 нм и TS+22 нм, которая указывает на то, что фарадеевские процессы не вовлечены, если потенциал ограничен -1,8 В. Поляризация к более отрицательным потенциалам приводит к дополнительному усилению тока вследствие выделения водорода (не показано). В отличие от других исследований электродов, покрытых наночастицами, ток проходит через максимум на убывающем сканировании, до начала выделения водорода. Причина этого не известна, но это может быть связано с полным заполнением энергетических уровней чуть ниже зоны проводимости. Наличие пика при менее отрицательных потенциалах объяснили заполнением состояний поверхности или состояний ловушки на границах зерен на пленке, как уже упоминалось выше. В настоящем исследовании пленки не спекали, а количество границ зерен должно быть низким, и поэтому, скорее всего, из-за состояний поверхности появляется пик. Предельное значение положительного потенциала составило 0 В, но этого было не достаточно для полного освобождения поверхностных зон, заполняемых при убывающем сканировании. Это видно по гораздо меньшему пику, наблюдаемому при последующих сканированиях, фигура 3а. Потенциал пика смещается в зависимости от покрытия с самым отрицательным потенциалом пика для электрода TS+8 нм, затем для поверхностей TS+22 нм и TS+P25, фигура 3b и таблица 2. Также ток для процесса при более отрицательных потенциалах зависит от типа частиц, фигура 3b, а также зависит от активной площади поверхности пленок из наночастиц, указывая на то, что площадь активной поверхности возрастает с уменьшением размера частиц. Так как природный оксид всегда находится на металлическом титане, пик восстановления появляется при менее отрицательных потенциалах (-0,89 В) по сравнению с электродами, покрытыми частицами, а окислительно-восстановительный процесс демонстрирует некоторую обратимость с пиком окисления при -0,81 В. Некоторая обратимость окислительно-восстановительного процесса при этих потенциалах наблюдается также для электрода TS+P25, фигура 3c. Общий заряд для образованного естественным образом оксида ниже, чем для TS+P25, что вполне ожидаемо, так как имеющаяся площадь поверхности будет больше для пленки из наночастиц Р25. Внимательное изучение вольтамперограммы для TS+P25 указывает на то, что непокрытая поверхность дает образованный естественным образом оксид (показан как плечо пика). Это соответствует изображению SEM на фигуре 2d, на котором видна непокрытая поверхность в пористой структуре. При более отрицательном потенциале процесс, тем не менее, аналогичный и отличается лишь обратимостью с более высоким анодным зарядом для электрода TS+P25. Обратимость этого процесса - выше для электродов TS+8 нм и TS+22 нм по сравнению с TS+P25 и обточенными поверхностями и, вероятно, связана с меньшими размерами частиц и четко определенными поверхностями. Отсутствие обратимости может быть связано с фарадеевскими процессами и это, вероятно, имеет место в случае электрода из золота, покрытого частицами TiO диаметром 22 нм, Au+22 нм. Пик восстановления находится ближе к зоне проводимости, и выделение водорода, вероятно, происходит при более отрицательных потенциалах, поскольку не наблюдается пик окисления, фигура 3d. Тем не менее, небольшой пик окисления наблюдается при -0,82 В, при близком совпадении с пиком, наблюдаемым для электродов, покрытых Ti. Этот пик связан с освобождением энергетических состояний на поверхности частиц TiO.
В зависимости от вольтамперометрического отклика и предположив, что фарадеевские процессы не протекают, плотность состояний (DOS) в запрещенной зоне и электронную плотность можно определить с помощью уравнения 3.
,
0
tail
gauss
где g(-eE) - первая оценка DOS в запрещенной зоне, справедливая при нуле градусов Кельвина, E - потенциал электрода, L - толщина слоя, e - элементарный заряд, A - площадь поверхности и v - частота сканирования. Экспериментальные данные показывают два типа состояний, одно связано с экспоненциальным хвостом зоны проводимости, g(-eE), при наиболее отрицательных потенциалах, и состояниями в запрещенной зоне с распределением, подобным гауссовскому, g(-eE), см. уравнения 4 и 5.
,
tail,BE
где q является DOS на краю зоны проводимости, а α относится к расширению хвоста в запрещенную зону. Распределение Гаусса приведено в уравнении 5.
,
tail,BE
p
dr
dr
dr
где q соответствует полному заполнению состояний в запрещенной зоне, E - потенциал пика и σ - стандартное отклонение от потенциала пика. Была предпринята попытка описать экспериментальные данные этими уравнениями, но состояния в запрещенной зоне отклоняются от распределения Гаусса, и получить надежные значения было невозможно. Выше было показано, что для пористых наноструктурных пленок заряд, связанный с экспоненциальным ростом, пропорционален площади поверхности раздела. Так как точная толщина слоев частиц не известна, то значения, полученные из экспоненциального члена, можно использовать только для расчета площади поверхности раздела, нормализованной к площади контрольной поверхности (на которой отсутствуют частицы), таблица 2. Сравнение этих значений с развернутой площадью поверхности раздела, S, показывает, что даже если Р25 будет иметь самое большое значение S, активная площадь будет лишь немного выше, чем для обточенной поверхности. Напротив, гладкий внешний вид поверхностей TS+8 нм и TS+22 нм дает более высокую площадь поверхности раздела, причем наибольшую площадь поверхности раздела получают для самых маленьких наночастиц. Несоответствие получается в результате того, что S представляет собой физическую (пассивную) площадь, в то время как площадь (активная) поверхности раздела создается при контакте с электролитом.
1.3.2 Спектроскопия электрохимического импеданса (EIS)
sol
Измерение значений импеданса проводили в зависимости от потенциала в диапазоне частот от 100 кГц до 10 МГц с амплитудой 10 мВ ср. квадр. Значения импеданса подогнали с помощью схем замещений, состоящих из одной или двух констант времени последовательно с сопротивлением раствора (R). Каждый раз константа состоит из элемента постоянной фазы (СРЕ) параллельно с сопротивлением, связанным с оксидом. Было показано, что для поперечного распределения констант времени сопротивление раствора включено в расчеты, в то время как его можно опустить для распределения константы времени, перпендикулярной поверхности. Для системы, рассматриваемой в данном документе, где образуется пористый оксид, а электролит может проникать в большую часть пористого слоя, распределение констант времени происходит поперечно вследствие пористости поверхности, а поэтому эффективную емкость вычислили по уравнению 6,
,
sol
film
где R - сопротивление раствора, R относится к сопротивлению оксидной пленки, и α - коэффициент дисперсии для элемента СРЕ. Эффективную емкость использовали для оценки электрических свойств полупроводникового слоя диоксида титана с помощью хорошо известной зависимости Мотта-Шоттки, уравнение 7:
,
sc
r
2
0
d
fb
где C - емкость пространственного заряда, ε - диэлектрическая проницаемость TiO, ε - диэлектрическая проницаемость вакуума, N - число носителей заряда, e - заряд электрона, E - приложенный потенциал, и E - потенциал плоских зон. При этом считается, что емкость двойного слоя гораздо выше емкости пространственного заряда. Согласно уравнению 7 должна получиться линейная зависимость, по наклону которой можно определить число носителей заряда, а потенциал плоских зон - по отрезку, отсекаемому на координатной оси.
На фигуре 4 показаны кривые Мотта-Шоттки для различных поверхностей. Для поверхностей на основе Ti, содержащих частицы диаметром 8 и 22 нм, характер изменения кривых Мотта-Шоттки аналогичный, а на графике показана только одна кривая. Для этих поверхностей установлена линейная зависимость Мотта-Шоттки, кроме расположенных рядом с потенциалом плоских зон, где для всех поверхностей наблюдается нелинейная зависимость. Для поверхностей TS+P25 и TS+AT1 изменение наклона наблюдается при наиболее положительных потенциалах. Число носителей заряда вычислили при каждом потенциале по наклону кривой Мотта-Шоттки и оно приведено на вкладыше к фигуре 4. Несмотря на изменения наклона кривых Мотта-Шоттки число носителей заряда достаточно постоянное и значение для наиболее линейной области приведено в таблице 2 ниже, наряду с потенциалом плоских зон. Потенциалы плоских зон были одинаковыми для различных поверхностей.
Для поверхности, покрытой Р25, наклон значительно возрастает при потенциалах выше 0,4 В, что дает более низкую плотность донорной примеси при коэффициенте 1,6. Эту линию можно экстраполировать для получения явного потенциала плоских зон близкого к 0 В. Это значение такое же, как и то, что было получено для анодированных слоев на том же материале подложки. Поскольку потенциал плоских зон должен быть близким к -0,35 В при значении pH, применяемым в настоящей работе, состояния поверхности, видимо, оказывают влияние на явный потенциал плоских зон. Кроме того, в случае анодированных пленок наблюдается уменьшение пика, представляющего собой состояния поверхности с энергетическими зонами в запрещенной зоне.
Кривая Мотта-Шоттки для электрода Au+22 нм имеет иной вид по сравнению с другими электродами, фигура 5. В этом случае емкость вычисляли по значениям импеданса, полученным при постоянной частоте 100 Гц. Для сравнения также показана кривая Мотта-Шоттки для электрода TS+22 нм, при этом значения емкости вычисляли таким же образом. Начиная с положительных потенциалов, емкость является постоянной для поверхности Au+22 нм, т.е. независимо от потенциала. Следовательно, эта емкость связана с емкостью изолирующей оксидной пленки. Рядом с потенциалом плоских зон кривая меняется очень быстро. Сделав поправку на емкость оксида, можно определить плотность донорной примеси и потенциал плоских зон, см. таблицу 2 ниже. По значению емкости оксида можно вычислить среднюю толщину оксида с помощью уравнения 8. Получили значение 28 нм, которое указывает на то, что только монослой частиц соединяется с поверхностью в случае золота.
,
0
r
2
где ε - диэлектрическая проницаемость вакуума ε - диэлектрическая проницаемость TiO (60), A - площадь электрода и C - емкость.
2
Число носителей заряда значительно ниже для пленки из наночастиц на золоте, чем для той же пленки на титане. Это означает, что наночастицы TiO взаимодействуют более тесно с тонкой оксидной пленкой на титане, чем с золотом. Вследствие этого можно сделать вывод, что состояния поверхности, наблюдаемые при циклической вольтамперометрии, происходят не только от частиц, но и от поверхности раздела между частицами и природной оксидной пленкой на Ti. Для поверхности TS+AT1 число носителей заряда выше, чем для пленок из наночастиц, а также выше, чем для природного оксида (TS), таблица 2. Одной из причин слегка более высокой проводимости может быть присутствие гидрида титана в металлической фазе. Однако для обдутых образцов проводимость поверхности, обработанной АТ1, оказалась ниже, чем для обдутого образца (I. Mattisson and E. Ahlberg, Appl. Surf. Sei., 2011, принята к публикации).
Вольтамперометрические измерения проводили в щелочном растворе и с помощью экспериментально установленных потенциалов плоских зон, полученных в растворе кислоты, и, учитывая сдвиг pH Нернста, для pH, равного 13, вычислили потенциал плоских зон, Efb=-1,1±0,1 В. На фигуре 6 плотность состояний (DOS) представлена зависимостью от потенциала в отношении потенциала плоских зон.
fb
fb
Для поверхности с частицами диаметром 8 нм максимум в DOS наблюдается при более высоких значениях энергии, чем потенциал плоских зон, в то время как для других поверхностей максимум близок к E (TS+22 нм), и при положительных потенциалах для E (TS+Р25 и TS). Расположение энергетических зон может быть важным для адсорбции биологически активных соединений, и, в свою очередь, для способности поверхности функционировать in-vivo. Это будет рассматриваться далее ниже в связи с результатом, полученным после погружения в жидкость, имитирующую жидкость организма.
Пример 2: Оценка биологической активности поверхности
2.1. Получение образцов
2.1.1 Погружение в жидкость, имитирующую жидкость организма (SBF)
Раствор SBF получали при температуре 37°C по пересмотренному рецепту получения SBF, описанному в A. Oyane, Н.М. Kim, Т. Furuya, Т. Kokubo, Т. Miyazaki and Т. Nakamura, J. Biomech. Mater. Res. A, 2003, 65, 188-195. pH раствора довели до 7,00±0,05 с применением 1 М NaOH и использовали свежеполученный раствор SBF.
Образцы, полученные в соответствии с примером 1.1, изложенным выше, погрузили по отдельности в 40 мл раствора SBF и зафиксировали обработанной поверхностью в перевернутом положении. 9 образцов из каждой категории погружали при температуре 37,0°C, а 3 образца из каждой категории оценивали через 12 ч, 72 ч и 1 неделю после погружения, соответственно. Анализ дифракции рентгеновских лучей (XRD) проводили для одного образца из каждой категории и времени погружения для исследования химического состава образца. Анализ SEM (ESEM XL30, FEI Company) и анализ с помощью энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDX) (Apollo 14, EDAX) проводили в 3 точках на образец для всех типов образцов с целью определения количества и морфологии образующегося апатита. Применяемыми настройками SEM были 10 кВ, рабочее расстояние 10 мм и область анализа 126×102 мкм.
2.2 Результаты
Способность поверхностей индуцировать образование зародышей апатита определяли путем погружения образцов в раствор SBF на 12 ч, 72 ч и 1 неделю. Раствор SBF содержал ионы с такой же концентрацией, что и плазма крови человека, и рецепт для получения растворов SBF может отличаться. В настоящей работе применяли пересмотренный рецепт получения SBF, предоставленный Oyano и соавт. Образцы фиксировали с помощью обработанной поверхности в подвешенном перевернутом состоянии для предотвращения гравитационного осаждения.
Количество образующегося апатита определяли с помощью EDX. Площадь покрытия апатитом  вычисляли по отношению сигнала титана до и после погружения в раствор SBF с помощью уравнения 9. Допускается, что апатит является единственным осадком, образующимся во время погружения.
2
Результаты показаны на фигуре 7 и интересно отметить, что раннее образование зародышей апатита значительно выше для поверхностей, содержащих наночастицы TiO, по сравнению с контролем (TS) и поверхностью TS+AT1. Через 72 ч после погружения в SBF разница между поверхностью, содержащей частицы, и контролем уменьшилась и, наоборот, поверхность TS+AT1 демонстрирует самую большую площадь покрытия апатитом. Эта тенденция сохраняется через 1 неделю, фигура 7. С помощью SEM изучили морфологию различных поверхностей и получили четкие отличия.
На фигурах 8a-d показаны изображения SEM с высоким разрешением поверхностей титана TS+8 нм (фиг.8а), TS+22 нм (фиг.8b), TS+P25 (фиг.8с) и контрольной поверхности TS (фиг.8d). Видны центры зародышеобразования кристаллов апатита, которые отметили кружками. Кроме того, анализ EDX (измерение энергии, выделяющейся из электронов, находящихся на электронной оболочке K) подтверждает, что на испытуемых поверхностях (фиг.8e-g) находятся большие количества кальция (Ca) и фосфора (P) по сравнению с контрольной поверхностью (TS, фиг.8h). Анализ EDX выполняли только в одной точке для каждой поверхности.
a
До этого исследовали влияние шероховатости поверхности на образование апатита, а также показали, что сплошной и адгезивный слой апатита образуется на различных материалах с шероховатостью поверхности, соответствующей значению R от 0,2 до 0,6 мкм. Абсолютные значения параметров шероховатости трудно сравнивать из-за различий в методике измерений и анализе. Тем не менее, можно использовать относительные значения и результаты, полученные через 1 неделю после погружения, подтверждают предыдущие результаты, что более шероховатые поверхности способствуют образованию толстых и адгезивных слоев апатита по сравнению с более гладкими поверхностями, таблица 2.
Слои апатита с трещинами, обладающие различными характеристиками, наблюдали для всех поверхностей, за исключением поверхности TS+P25.
5
4
2
На слое апатита, образовавшемся на поверхностях TS+8 нм и TS+22 нм, наблюдались трещины другого типа, похожие на трещины на слоях апатита, образовавшихся на титане, сначала выдержанном в растворе фибронектина, а после этого в буферном солевом растворе Хэнкса (HBSS) в течение одной недели (А.Р. Do Serro, А.С Femandes and V.S. В. de Jesus, J. Biomed. Mater. Res., 2000, 49, 345-352). Предположили, что появление трещин и изломов было вызвано усадкой при высыхании, и было отмечено, что они становились более крупными и более глубокими с увеличением времени погружения. Альтернативное объяснение относится к 3D механизмам роста для толстых слоев апатита, при которых зародыш кристалла растет на поверхности и, в конечном счете, образует полностью покрывающую пленку. Когда различные зародыши кристаллов начинают взаимодействовать, прикладываются напряжения, и слой апатита дает трещины. Этот механизм, видимо, применим для поверхности TS+AT1 без частиц, осажденных через 12 ч., но полностью покрывающая пленка образуется через 72 часа. Механизм образования зародышей, видимо, отличается для поверхностей с наночастицами. Быстрое осаждение гидроксиапатита в некоторых центрах на поверхности сопровождается 2D ростом, при котором слой слабо взаимодействует с подложкой. Образование 2D слоя, видимо, препятствует образованию больших агломератов, которые обычно наблюдаются, и в результате слой остается тонким. Раннее образование центров зародышей, наблюдаемое на поверхностях, покрытых наночастицами, показано для поверхности TS+22 нм на фигуре 9. Через 12 ч наблюдаются четко выраженные осаждающиеся частицы (отмечены стрелками на фигуре 9а), но поверхность не полностью покрыта осаждающимися частицами. Отношение Ca/P осажденных частиц на этой стадии близко к 1,7 (среднее значение многих контрольных точек), а среди осажденных частиц сигналы Ca и P не получали. Это указывает на образование гидроксиапатита (Ca(PO)(OH)), который является наиболее термодинамически стабильной фазой. Гидроксиапатит является основным неорганическим веществом в кости и имеет решающее значение для достижения высокой механической прочности. Через 72 ч после погружения поверхность покрывается тонким слоем апатита и на ней начинают появляться трещины, фигура 9b. По-видимому, трещина увеличивается из-за первых осаждающихся частиц в результате напряжений, индуцированных дисбалансом между осаждающимися частицами и слоем. Через одну неделю после погружения полностью образуется слой апатита, но он все еще тонкий, фигура 9с.
3
4
2
В настоящем исследовании все поверхности (кроме TS+P25) имели трещины, независимо от шероховатости поверхности, таблица 2. Апатитовые слои поверхностей TS+8 нм и TS+22 нм, видимо, отслаиваются от подстилающей поверхности. Тем не менее, в данном контексте следует отметить, что в случае in vivo, после имплантации биосовместимых компонентов, которые описаны в данном документе, в живую ткань, макромолекулы, такие как белки и протеогликаны, и клетки будут притягиваться к поверхности компонента в течение нескольких часов после имплантации, и полагают, что их присутствие и/или активность будет эффективно препятствовать образованию любого 2-D или 3-D слоя апатита. Следовательно, свойства апатитового слоя, образующегося in vitro через одну неделю, может мало относится к результату имплантации in vivo. Отношение Ca/P образовавшихся пленок апатита вычисляли по результатам измерения EDX и определили в диапазоне от 1,42 до 1,56 для всех поверхностей через 72 ч и 1 неделю после погружения. Это может указывать на образование трикальцийфосфата (Ca(PO)) с отношением Ca/P=1,5.
Химический состав образовавшихся слоев апатита проанализировали с помощью дифракции рентгеновских лучей при скользящих углах падения (GI-XRD). Несмотря на то что результаты измерения EDX показывают достаточно высокую степень покрытия апатитом для поверхностей TS, TS+8 нм, TS+22 нм и TS+P25 через 1 неделю, получали лишь слабые и широкие сигналы дифракции. Это означает, что образовавшиеся слои являются аморфными. Равномерный рост из раствора SBF начинается с образования аморфной фазы и последующего образования небольших кристаллов апатита (Z.Z. Zyman, D.V. Rokhmistrov and V.I. Glushko, J. Mater. Sci., Mater. Med., 2010, 21, 123-130).
Для поверхности TS+АТ1, для которой получили более толстые слои апатита, через 72 ч и 1 неделю после погружения в SBF наблюдаются четкие дифракционные пики для гидроксиапатита.
Долгосрочные результаты показывают, что на более шероховатой поверхности легче образуются толстые слои апатита. Тем не менее, на более гладких поверхностях, содержащих наночастицы, показывается, что зародыши образуются быстрее, а также на них быстрее образуются тонкие 20-слои аморфного апатита. В работе Т. Kokubo and H. Takadama, Biomaterials, 2006, 27, 2907-2915 была изучена зависимость между способностью поверхности индуцировать образование зародышей гидроксиапатита и реакцию in-vivo.
Таким образом, погружение в раствор SBF может быть показателем биологической активности различных поверхностей. В настоящем исследовании наблюдали два типа образования зародышей и динамики роста. Для более шероховатых поверхностей образование зародышей вначале задерживается, но как только оно начинается, образуются толстые слои. Эти слои имеют трещины, индуцированные напряжениями в пленке. Для более гладких поверхностей с небольшими наночастицами анатаза начальное осаждение происходит быстро, но образуется лишь несколько небольших зародышей гидроксиапатита, оставляя при этом остальную часть поверхности непокрытой.
Для поверхностных пленок, образующихся из небольших, хорошо диспергированных наночастиц, на поверхности образуется пористый слой. Это приводит к получению как большей плотности доноров в соответствии с результатами измерения импеданса, так и большей активной площади по сравнению с обточенной поверхностью и поверхностью, содержащей агломераты Р25. Кроме того, шероховатость физической поверхности, по-видимому, играет важную роль в образовании апатита, поскольку для контрольной поверхности (TS) с достаточно высокой проводимостью, образование апатита ограничено. Для раннего образования зародышей, видимо, предпочтительными являются поверхности, покрытые наночастицами.
Пример 3: получение и характеристика поверхностей, покрытых наночастицами
3.1 Получение образца
2
4
2
Наночастицы TiO синтезировали путем контролируемого гидролиза TiCl, как описано выше. Регулируя температуру реакции, время/температуру диализа и время хранения и/или температуру, получали наночастицы TiO диаметром ~20 нм. Частицы состояли преимущественно из анатаза с небольшими следами брукита. Частицы наносили центрифугированием на вращающиеся обезжиренные диски на основе титана по следующей схеме: для группы образцов А1 выполняли только один этап нанесения центрифугированием, в то время как для группы образцов А5 нанесение центрифугированием выполнили пять раз. После нанесения частиц центрифугированием образцы промыли в воде и оставили сушиться при температуре 50°C в течение 5 минут перед упаковкой и β-стерилизацией при 21 кГр.
3.2 Характеристика образца
Параметры двух поверхностей образцов А1 и А5 определили с применением следующих техник:
- сканирующей электронной микроскопии (SEM) (XL30, FEI Company, GG 5651 Эйндховен, Нидерланды)
- сканирующей электронной микроскопии с автоэмиссионной пушкой (FEG-SEM) (Leo Ultra 55 FEG SEM)
- энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDX или EDS) (XL30, FEI Company, GG 5651 Эйндховен, Нидерланды)
- рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) (сканирующий микроскоп Quantum 2000 ESCA, Physical Electronics, Chanhassen, Миннесота, США и программное обеспечение CasaXPS)
- дифракции рентгеновских лучей (XRD) (порошковый дифрактометр Siemens D5000 с применением излучения CuKα; λ=1,54056 Å)

- атомно-силовой микроскопии (AFM) (Nanoscope Multimode IIIa, Digital Instruments)
- измерения контактных углов (EQ-Q-2857, SY-0302).
3.2.1 Сканирующая электронная микроскопия
С помощью SEM и FEG-SEM изучили морфологию трех различных поверхностей образца. FEG-SEM в основном применяли для определения наноструктурированных поверхностей, А1 и А5, так как дискретные наночастицы невозможно обнаружить с помощью обычной внешней SEM. Для получения изображений при более высоком увеличении использовали детектор inLense в комбинации с пониженным потенциалом и соответственно меньшим рабочим расстоянием. Изображение поверхности образца А1 показано на фиг.10а, а изображение поверхности образца А5 - на фиг.10b, оба при увеличении в 100000 раз. На изображениях не видна толщина слоя покрытия из наночастиц, но дискретные наночастицы видны в виде небольших белых точек на поверхности.
На изображениях SEM, показанных на фиг.10a-b, поверхности А1 и А5 выглядят одинаковыми. Тем не менее, существуют различия в шероховатости поверхности. Шероховатость поверхности определяли с помощью АРМ, и ее будут рассматривать далее ниже.
3.2.2 Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (EDX)
Качественный и количественный элементный анализ общего элементного состава двух образцов подложки А1 и А5 определили с помощью EDX. EDX позволяет получить информацию с глубины приблизительно 1-2 мкм, а значит с помощью данного способа можно получить лишь неполную информацию о внешнем слое. Анализ проводили в трех различных положениях для каждого образца (два положения при разных краях и одно положение посередине образца) и при трех различных ускоряющих напряжениях (5, 15 и 30 кВ) для того, чтобы изучить, изменяется ли химический состав в зависимости от положения и/или глубины проникновения.
В результате элементного количественного анализа было обнаружено, что образцы А1 и А5 имеют похожий состав. Так как значения, полученные в результате анализа EDX, являются относительными, то соотношения кислород/титан, азот/титан и углерод/титан вычисляли, соответственно, для различных образцов и потенциалов ускорения, см. таблицу 3. Видно, что образцы А1 и А5 имеют похожий элементный состав. Кроме того, можно также сделать вывод, что соотношения между кислородом, азотом или углеродом, соответственно, в отличие от титана, уменьшаются в зависимости от ускоряющего напряжения (т.е. глубины анализа) для обеих групп образцов.
Таблица 3
Количественное элементное соотношение (в %) между углеродом (C), азотом (N), кислородом (O), соответственно, и титаном (Ti), в зависимости от ускоряющего напряжения (15 и 30 кВ, соответственно), как определено с помощью EDX (Средние значения 9 положений/группа образцов)
Образец
C/Ti
N/Ti
O/Ti
А1, 15 кВ
0,046
0,072
0,033
А1, 30 кВ
0,035
0,041
0,023
А5, 15 кВ
0,051
0,074
0,041
А5, 30 кВ
0,035
0,051
0,033
3.3.3 Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS)
Химический состав поверхностей, покрытых наночастицами, определили с помощью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS), результаты представлены в таблице 4. Две поверхности образцов А1 и А5 имеют похожий химический состав и большей частью демонстрируют присутствие титана, кислорода и углерода. Для обоих образцов обнаружили высокое содержание углерода в результате процедуры получения образцов вручную. В результате синтеза наночастиц ни на одной поверхности образцов следов хлорида не обнаружили.
2
2
Также провели развернутый анализ обнаруженных элементов с помощью программного обеспечения Casa XPS. Энергии связи Ti2p 1/2 и Ti2p 3/2 зафиксировали при 465 и 459 эВ для всех образцов. Дублет объясняется Ti(IV), и свидетельствует о том, что TiO является основной составляющей на поверхности образцов. На обеих поверхностях А1 и А5 также обнаружили дублет металла Ti при 454,6 эВ и 461,4 эВ, соответственно. Пик металла Ti возникает от подложки титана и его можно обнаружить на поверхности А1 и А5, поскольку покрытия из наночастиц TiO являются тонкими.
Обе поверхности образцов показали четкий пик O1s при 531 эВ, возникающий в результате образования связей Ti-O. Кроме того, наблюдали появление плеча при более высоких энергиях связи. Деконволюция спектров O1s дала пик при 533 эВ, который возникает от кислорода, связанного с углеродом. Что касается спектров O1s, то спектры C1s продемонстрировали доминантные соединения с плечом при более высоких энергиях связи. Доминирующий пик при 285,5 эВ объясняли наличием углеводородов (C-C и C-H) и его часто наблюдают на оксидных слоях в атмосферных условиях. Плечо при более высоких энергиях связи (289 эВ) объясняли соединениями C-O и C=O, соответственно.
Таблица 4
Количественный состав поверхности (в %) образцов А1 и А5, как определено с помощью XPS (проанализировали три пробы из каждой группы)
Образец
Положение
C1s
N1s
O1s
NaKL
Si2p
Ti2p
А1-1
Середина
24,4
1,2
51,4
-
-
23,0
А1-1
Край 1
31,6
0,4
48,7
-
-
19,3
А1-1
Край 2
26,1
0,8
50,4
-
-
22,6
А1-2
Середина
26,6
0,6
50,7
-
-
22,1
А1-2
Край 1
30,6
1,1
48,6
-
-
19,7
А1-2
Край 2
28,4
1,2
49,2
-
-
21,2
А1-3
Середина
39,1
0,9
41,8
-
-
18,2
А1-3
Край 1
33,6
0,6
48,0
-
-
17,8
А1-3
Край 2
25,8
1,0
50,4
-
-
22,8
А5-1
Середина
38,5
0,8
41,2
-
0,3
19,1
А5-1
Край 1
32,6
0,6
48,1
-
-
18,7
А5-1
Край 2
38,2
0,9
42,4
-
-
18,6
А5-2
Середина
22,1
0,8
53,3
-
-
23,8
А5-2
Край 1
27,1
0,7
51,4
-
-
20,9
А5-2
Край 2
22,0
0,9
52,9
0,4
23,8
А5-3
Середина
22,6
0,3
52,8
-
0,3
24,0
А5-3
Край 1
32,3
0,2
49,3
-
-
18,2
А5-3
Край 2
22,1
1,0
53,5
-
-
23,5
3.3.4 Дифракция рентгеновских лучей (XRD)
Измерения дифракции рентгеновских лучей проводили на поверхностях А1 и А5, соответственно. Для обоих образцов поверхностей были показаны все семь сигналов титана. Сигналы металла не были направлены случайным образом, как для одной поверхности кристалла, вероятно, из-за холодной обработки материала подложки. От диоксида титана (рутила) не было сигналов на поверхности, вероятно, из-за тонкости оксидного слоя. Отсутствие пиков оксида может также свидетельствовать о том, что оксид является рентгеноаморфным, т.е. размер зерна превышает пределы Брэгга, так что нельзя получить четкий рисунок отражений.
3.3.5 Атомно-силовая микроскопия (AFM)

С целью дальнейшего исследования шероховатости поверхности также получили AFM изображения. На фиг.11а показана поверхность А1, а на фиг.11b показана поверхность А5. Параметры шероховатости 3D-поверхности вычисляли с помощью программного обеспечения MeX, и значения для трех различных параметров приведены в таблице 5.
На изображениях AFM можно заметить, что поверхности А1 и А5 имеют дополнительную поверхностную структуру на верхней части обточенной поверхности.
a
dq
dq
dr
a
dq
На изображениях SEM образца А1 (фиг.10а) и А5 (фиг.10b) эти две поверхности кажутся очень похожими с подложкой, покрытой в такой же степени. Тем не менее, при изучении изображений AFM, фиг.12a-b, становится ясно, что это не так. В случае образца А5 (фиг.11b) подложка полностью покрыта несколькими слоями наночастиц, образуя толстую, сглаженную оксидную пленку. Образец А1 (фиг.11а) также имеет покрывающий слой наночастиц, хотя его структура не такая гладкая, как у А5. Это также подтверждается параметрами шероховатости поверхности в таблице 5, из которой видно, что значение S у А1 несколько выше по сравнению с таковым у А5. Было показано, что среднеквадратическое наклона (S) коррелирует с прочностью на срез поверхности раздела и, таким образом, является важным параметром для изучения областей применения зубных имплантатов. С биомеханической точки зрения большое значение S может быть желательным, придавая поверхности А1 небольшое преимущество по сравнению с А5. Тенденция в случае значений S (развернутая площадь поверхности раздела) такая же, что и тенденция в случае значений S и S с наименьшим значением, полученным для поверхности с самым толстым слоем наночастиц, т.е. А5.
Таблица 5
Параметры шероховатости поверхности, как определено с помощью AFM. Данные для размера сканирования 5×5 мкм и фильтра Гаусса 20% горизонтальной ширины
Образец
S<sub>a</sub> (HM)
S<sub>dq</sub>
S<sub>dr</sub> (%)
А1
10,91 (2,11)
0,42 (0,08)
8,45 (3,01)
А5
6,88 (1,78)
0,31 (0,05)
5,06 (1,18)
3.3.6 Угол контакта
Гидрофильность поверхностей А1 и А5 определили с помощью результатов измерения угла контакта. Обе поверхности образцов были гидрофильными согласно обычному определению, т.е. углы контакта <90°, см. таблицу 6.
Таблица 6
Углы контакта образцов А1 и А5
Образец
Угол контакта (°)
А1
76,6 (3,1)
А5
84,6 (6,6)
3.3 Обсуждение
a
Образцы А1 и А5 получали из подложки одного и того же типа, т.е. обточенных дисков на основе титана (4 класс). В обоих случаях слой наночастиц, нанесенный центрифугированием, покрывал подложку. Наноструктуры были слишком малы, чтобы их можно было определить с помощью обычной внешней SEM, поэтому образцы анализировали с помощью FEG-SEM с высоким разрешением. На этих изображениях поверхности А1 и А5 выглядят совершенно одинаково с дискретными наночастицами или группами наночастиц, отложившимися поверх структуры металла. Тем не менее, при сравнении SEM изображений с AFM изображениями хорошо видно, что внутренняя структура поверхности полностью покрыта пленкой из наночастиц, образуя сплошное покрытие. На группу образцов А1 нанесение покрытия центрифугированием проводили только один раз, в то время как для группы образцов А5 процедуру нанесения покрытия центрифугированием повторяли пять раз, в результате чего получили значительно более толстое покрытие. Это также подтвердили результаты измерения шероховатости поверхности, которые показывают более низкое значение S для поверхности А5 по сравнению с А1.
2
Результаты измерения угла контакта показали, что оба образца были гидрофильными. Анализ XPS показал, что образцы были чистыми и поверхность, в основном, была образована титаном, кислородом и углеродом, а также он указал на то, что TiO является основным компонентом, находящимся на поверхности образцов. Кроме того, для обоих образцов А1 и А5 можно наблюдать сигнал металла Ti, что свидетельствует о том, что покрытия из наночастиц являются тонкими, хотя покрытие А5 толще, чем покрытие А1.
2
Несмотря на то что анализ XPS показал, что обе поверхности образцов были покрыты TiO, анализ XRD не показал каких-либо отражений от оксида. Оксид нельзя проверить с помощью XRD, так как слои являются слишком тонкими.
Пример 4: адгезия покрытия из наночастиц
4.1 Получение образцов
2
Раствор наночастиц TiO диаметром 19,5 нм получали в соответствии c Abbas et al, Nanoparticles Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 384 (2011) 254-261. Раствор наночастиц наносили центрифугированием на коммерчески чистые и очищенные винтообразные имплантаты на основе титана (обточенные, без обдувки или травления кислотой) следующим образом: винтообразный имплантат устанавливали в держатель образца и погружали в раствор наночастиц при вращении со скоростью 1400 об./мин. После погружения в раствор наночастиц винтообразный имплантат опускали в промывочную воду. Затем винтообразный имплантат вращали при 4500 об./мин. в течение приблизительно 30 секунд для удаления оставшейся воды. Винтообразный имплантат сушили в сушильном шкафу при 50°C в течение нескольких минут.
Винтообразные имплантаты оценивали с помощью FEG-SEM при увеличении в 250000 раз, показано на фиг.12. Анализ показал, что на поверхности находились наночастицы.
4.2 Оценка после установки в кость
Проводили испытания для исследования того, остается ли покрытие из наночастиц на поверхности после установки винтообразного имплантата в омертвевшую малоберцовую кость, после удаления из кости и последующей процедуры промывки. Результаты показали, что установка винтообразного имплантата в омертвевшую малоберцовую кость, по-видимому, не влияет на покрытие из наночастиц, а также оно остается в неизменном состоянии после последующей процедуры промывки. Фиг.13 представляет собой изображение FEG-SEM при увеличении в 100000 раз, на котором показан винтообразный имплантат из титана, покрытый наночастицами, после удаления из малоберцовой кости и очистки. Некоторые осколки кости остались на поверхности. Наночастицы также все оставались на верхней части резьбы.
Пример 5: Оценка клеточной реакции in vitro
Влияние поверхностей образцов, полученных в соответствии с примером 3.1, приведенном выше, оценивали с помощью базовых лабораторных анализов в отношении пролиферации клеток и остеогенных маркеров дифференциации с помощью модели мезенхимных стволовых клеток, полученных из организма человека.
5.1 Образцы
Кроме образцов А1 и А5, описанных выше, в качестве контроля использовали обточенные коммерчески чистые диски на основе титана (ʺTiʺ).
5.2 Клеточная культура
2
Мезенхимные клетки неба человека (НЕРМ 1486; АТСС) культивировали на минимальных питательных средах Игла (ЕМЕМ) с солями Эрла и с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) с антибиотиками пенициллина/стрептомицина [25 мг/мл] и аскорбиновой кислотой [50 мг/мл], пируватом Na [1 ммоль], заменимыми аминокислотами [0,1 ммоль], L-глутамином [2 ммоль], при культивировании с 5% CO. После культивирования клеток осуществляли выделение клеток НЕРМ посредством трипсина, подсчет (с помощью гемоцитометра), гранулирование и получали суспензию из 50000 клеток/10 мкл. 10 мкл суспензии клеток (методика Micromass) высеивали на каждую исследуемую и контрольную поверхность, культуре давали возможность прирасти к поверхности в течение 1 часа, после чего аккуратно заливали 1 мл ЕМЕМ+10% FBS (Stanford, Jacobson et al, 1995, Journal of Biological Chemistry 270 (16): 9420-9428).
Для проведения анализов использовали 3 диска/группа/момент времени. Анализы проводили по 14-й день с анализом в конечных точках на день 0, 1, 4, 8 и 14. Нулевой момент времени был аликвотой суспензии клеток, полученной до посева. Питательные среды меняли каждые четыре дня. 100 мкл питательных сред собирали из каждой лунки планшета, состоящего из двадцати четырех луночного планшета, в котором инкубируют диски.
Собранные питательные среды хранили для выполнения протеомного анализа в отношении экспрессии белков, относящихся к кости. Сбор питательных сред для протеомного анализа питательных сред осуществляли на день 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12.
5.3 Пролиферация клеток и активность клеток
5.3.1 Анализ пролиферации клеток
Пролиферацию клеток измеряли в течение 14-дневного периода с помощью стандартного МТТ анализа. Анализ пролиферации клеток Vybrant МТТ (комплект молекулярных зондов V-13154) представляет собой анализ поглощения в микропланшетах, в котором используется превращение водорастворимого МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида) в нерастворимый формазан. Формазан затем растворяют и считывают его показания на микротитрационных планшетах при 570 нм.
Микрофотоснимки (50000 клеток/10 мкл среды) клеток НЕРМ поместили на диски в 24-луночный планшет. Через 1 час (для обеспечения прикрепления клеток) диски заливали 1 мл ЕМЕМ с добавлением аскорбиновой кислоты [50 мг/мл]. Питательные среды также содержали 10% FBS и пенициллина/стрептомицина. Через 24 часа выполняли анализ пролиферации клеток Invitrogen Vybrant МТТ для сбора образцов на 1 день. Образцы выдерживали в течение ночи при температуре 37°C в растворе SDS-HCI, затем перемешивали и считывали поглощение при 570 нм. Эту процедуру повторили для образцов на 2-й день, 4-й день, 6-й день, 8-й день и 14-й день.
Пролиферацию клеток сравнили со стандартной кривой. Отметили следующее:
День 1: для всех поверхностей отмечали, что клетки прикрепились к ним и были жизнеспособными на поверхностях А1 и А5 по сравнению с Ti на 1-й день. На поверхности А1 отмечали увеличение числа клеток по сравнению c Ti.
День 4: на поверхностях А1 и А5 отмечали уменьшение числа клеток по сравнению с Ti.
День 8: через 8 дней как на поверхности А1, так и на поверхности А5 отмечали уменьшение числа клеток по сравнению с поверхностью Ti.
День 14: клетки на поверхностях А1 и А5 восстановились, демонстрируя такое же число клеток, что и на Ti через 14 дней.
5.3.2 Уровни экспрессии генных маркеров, относящихся к кости
Изменения в экспрессии генов остеобластов для щелочной фосфатазы, cbfa1, остеокальцина и ВМР-2 анализировали с помощью мультиплексирования и методик ПЦР в реальном времени на день 0, 1, 4, 8 и 14. Культуры Micromass (50000 клеток/10 мкл питательных сред) высеивали в трех повторностях на пластик, используемый в качестве контроля, как описывалось выше (Schneider, Zaharias et al., 2004. Journal of Biomedical Materials research. 69A 3:462-468). Через 1 час после прикрепления лунки заполняли ЕМЕМ/10% FBS и 50 мг/мл аскорбиновой кислоты. На день 0, 1, 4, 8 и 14 извлекали всю РНК клетки с помощью мини-набора RNeasy (Qiagen) в соответствии с указаниями производителя. Затем клетки гомогенизировали (колонка QIAshredder, Qiagen) и применяли в колонке RNeasy, промывали и элюировали. Концентрацию РНК вычисляли по поглощению при 260 нм, а чистоту РНК определяли из отношения оптической плотности при 260 и 280 нм. С помощью извлеченной РНК в качестве матрицы проводили реакции обратной транскрипции с использованием TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems), a RT реакции проводили в термоциклере Пельтье РТС-200 (MJ Research). После первых 10 мин. при 25°C реакционную смесь выдерживали при температуре 48°C в течение 30 мин, нагревали при температуре 95°C в течение 5 мин, а затем охлаждали до 4°C. Для обнаружения 18s рибосомальной РНК в качестве эндогенного контроля использовали набор РНК TaqMan Ribosomal RNA Control Reagents (Applied Biosystems).
VIC
(-ΔΔCt)
Затем щелочную фосфатазу, cbfa1, остеокальцин и мишень BMP-2, a также эндогенный контроль рРНК амплифицировали с помощью множественной ПЦР с помощью параметров термоциклирования 50°C в течение 2 мин, 95°C в течение 10 мин, 40 циклов при 95°C в течение 15 сек и 60°C в течение 1 мин с помощью TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Реакции ПЦР в реальном времени проводили на 96-луночных оптических реакционных планшетах (Applied Biosystems) в системе детектирования ПЦР в реальном времени ABI Prism 7300. Извлечение РНК и RT-ПЦР протоколы для остеогенных генов (в данном документе приведены только ВМР-2 и cbfa1) осуществляли в соответствии со способами, описанными Perinpanayagam, H. (2002). Кратко, культуры собирали, промывали в PBS и извлекали общую РНК клетки. Праймеры ПЦР в реальном времени и зонды для RUNX-2/Cbfa1 конструировали с помощью программного обеспечения Primer Express (Perkin Elmer) из 294 п.о. известной последовательности крысы, которая соответствует 1 и 2 экзонам гена (Xiao et al. (1998) Journal of Biological Chemistry, 273 (49): 32988-32994) с образованием продукта 80 п.о., который перекрыл сочленение экзона. ДНК зонд модифицировали 5'-репортерным красителем FAM (6-карбоксифлуоресцеин) и 3'-гасящим красителем TAMRA (6-карбокси-N,N,N',N'-тетраметилродамин). В каждой реакционной пробирке нормализовали уровни Cbfa1 на 18S рРНК в результате вычисления ΔCt, где ΔCt=(FAM)Ct-()Ct. Константу вычитали для получения ΔΔCt, где ΔΔCt=ΔCt-k (k приводили к приблизительно самому низкому значению ΔCt). Относительные уровни cbfa1 вычисляли как 2.
В различные моменты времени получили следующие результаты:
День 1: отсутствие различий в экспрессии генов BMP-2, cbfa1, щелочной фосфатазы и остеокальцина на испытуемых поверхностях по сравнению с Ti.
День 4: повышение экспрессии BMP-2 и cbfa1 на поверхности А1 и небольшое повышение экспрессии щелочной фосфатазы на А5, но снижение экспрессии остеокальцина на всех испытуемых поверхностях.
День 8: повышение экспрессии BMP-2 на всех испытуемых поверхностях показывает значительно более высокие значения на поверхности А1 по сравнению с Ti. Экспрессия cbfa1 показала более высокий уровень на поверхности А5 и сопоставимый уровень на А1 по сравнению с контрольной поверхностью Ti. В целом наблюдались низкие уровни экспрессии щелочной фосфатазы на всех поверхностях.
День 14: значительное повышение экспрессии ВМР-2 на поверхности А1. Контроль Ti и А1 показали похожие уровни экспрессии cbfa1, но поверхность А5 показала больший уровень по сравнению с контролем (Ti). По сравнению с контролем уровни экспрессии щелочной фосфатазы или остеокальцина не увеличились. Низкие уровни щелочной фосфатазы.
Экспрессия cbfa проиллюстрирована на фиг.14, а экспрессия BMP-2 проиллюстрирована на фиг.15.
5.3.3 Результаты измерений уровней белка
Выбирали множественный набор, который обеспечивал получение наиболее объективных показателей остеогенных белковых маркеров (остеокальцина, остеопонтина и остеопротегерина), экспрессированных in vitro. Кратко, 50 мкл супернатантов клеточной культуры инкубировали с гранулами антитела к маркеру нескольких белков человека при температуре 4°C в течение 18 часов с несвязанным материалом, удаляемым фильтрованием (Assay Millipore, Billerica, Массачусетс, США). Добавляли 25 мкл биотинилированного репортерного антитела к нескольким пептидам человека и реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 1,5 часов в темноте. Добавляли 25 мкл стрептавидин-фикоэритрина и выдерживали планшеты при комнатной температуре в течение еще 30 минут. Добавляли 25 мкл стоп-реагента и считывали планшеты в планшете-ридере (модель 100 IS, Luminex, Austin, Техас, США). Значения концентрации цитокинов IL-6 и TNF-a в каждом образце экстраполировали из стандартов (от 2,3 до 10000 пг/мл) с помощью программного обеспечения Beadview (Millipore, Billerica, Массачусетс, США).
Все поверхности после обычного процесса заживления не показали сверх высоких уровней белка на любой из поверхностей. Провоспалительные цитокины TNF-α и IL-6 продемонстрировали повышенные уровни IL-6 через 8 дней, а через 14 дней отмечали наибольшие значения на поверхности А1. Реакция IL-6 показана на фиг.16.
5.3.4 Выводы и заключения
В целом испытуемые поверхности продемонстрировали пролиферацию, которая сопоставима с контрольной поверхностью Ti. В целом в большей степени отмечали пролиферацию, чем дифференциацию. Это показала низкая активность экспрессии щелочной фосфатазы, достигая максимума на день 4, но снижаясь в более поздние моменты времени. Остеоиндуктивную ВМР-2 отмечали лишь для поверхности А1 с дня 4 по день 14. Маркер дифференциации остеобластов cbfa1 увеличивался на А5 с дня 4 по день 14.
Незначительное повышение уровней IL-6 на испытуемых поверхностях может отражать позднюю реакцию BMP-2.
Поверхности А1 и А5, покрытые наночастицами, оказывают небольшое влияние на дифференциацию, но общая тенденция такова, что эти поверхности способствуют пролиферации остеобластов в настоящем исследовании in vitro.