Особенности биохимических механизмов адаптации к гипобарической гипоксии растений, различающихся по устойчивости

С. А. Войцековская', Т.П. Астафурова“ Б.Г. Агеев“', В.А. Сапожпикова"*

ОСОБЕННОСТИ БИОХИМИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ АДАПТАЦИИ К ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ РАСТЕНИЙ,

РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО УСТОЙЧИВОСТИ

"Томский государственный педагогический университет "Научно-исследовательский институт биологии к биофизики Томского государственного университета

'"Институт оптики атмосферы СО РАН

Адаптация растений к условиям гипоксии осуществляется на морфологическом, клеточном, биохимическом, генетическом уровнях. У одних растений, постоянно находящихся в условиях дефицита кислорода, в процессе эволюции выработались разнообразные приспособления (устойчивые объекты), у других они возникают во время воздействия неблагоприятного фактора или не появляются совсем (неустойчивые объекты). Исследование механизмов адаптации растений к условиям анаэробиоза представляет интерес в связи с изучением основ устойчивости. Это имеет большое практическое значение для разработки способов выращивания растений на затопляемых территориях, создания тестовых систем для селекционною отбора устойчивых к дефициту кислорода сельскохозяйственных культур. Актуальность исследований в этой области возрастает в связи с освоением высокогорных районов, Космоса, морских глубин и решением различных экологических задач. Экспериментально гипоксические условия создают затоплением, вы-

теснением воздуха инертными газами, разряжением атмосферы (гипобарическая гипоксия), причем последний способ менее изучен.

Целью настоящей работы являлось изучение биохимических механизмов адаптации к гипобаричес-кой гипоксии растений, контрастных по устойчивости к этому фактору. В задачи работы входило: 1) определение активности ключевого фермента анаэробного обмена - алкогольдегидрогеназы (АДГ) в различных условиях аэрации; 2) исследование влияния гипобарической гипоксии на активность малатде-гидрогеназ: НАД-зависимой малатдегидрогеназы (НАД-МДГ) и НАДН-зависимой малатдегидрогеназы (НАДН-МДГ).

Объектами служили 7-суточные проростки пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Тулунская и 10-суточные проростки риса (Oryza sativa L.) сорта ВНИИР-17, различающиеся по устойчивости к дефициту кислорода. Растения выращивали на специальных подставках на дистиллированной воде при температуре воз-

С.А. Войцековская, Т.П. Астафурова, Б.Г. Агеев, В. А. Сапожникова: Особенности биохимических..

духа 22-24 °С под люминесцентными лампами интенсивностью 40 Вт/м2 с 12-часовым фотопериодом. Гипоксические условия достигались помещением растений в барокамеры с пониженным парциальным давлением кислорода (2 кПа) на 1 и 3 сут. Для исключения фотосинтеза растения находились в темноте. Контрольные проростки выдерживали такое же количество времени при нормальной аэрации и атмосферном давлении в темноте. После завершения эксперимента растительный материал сразу же использовался для анализа. Количественное определение белка осуществляли по методу Бредфорда, активность ферментов дегидрогеназ определяли спектрофотометрически [1]. Результаты обрабатывали статистически, рассчитывали среднее арифметическое и среднее квадратичное отклонение. Достоверность различий между контролем и опытом оценивали, используя критерий Стьюдента, при 5 %-ном уровне значимости [2] .

Перестройка окислительного метаболизма в растениях на анаэробный путь обмена, определяющий адаптацию организма, связана с активацией ключевых ферментов гликолиза и брожения, а также снижением энзиматической активности цикла Кребса и включением альтернативных путей (3, 4]. Особый интерес представляет фермент заключительного этапа спиртового брожения, которое активируется при недостатке кислорода в растениях - АДГ. Исследования, проведенные с проростками пшеницы и риса, выращенными в нормальных условиях аэрации, показали, что активность АДГ по окислению этанола в корнях пшеницы от 1 к трем суткам пребывания в темноте увеличилась, в то время как в листьях уменьшилась (табл. 1), В отличие от пшеницы, для риса отмечена тенденция

Таблица 1

Влияние гипобартеской гипоксии на активность ключевого фермента анаэробного обмена -АДГ в проростках пшеницы и риса

Исследуемый материал Условие опыта/сут Активность фермента

мЕ х мг белка'1 %

Пшеница корни Аэрация/1 Гипоксия/1 Аэрация/3 Г ипоксия/3 0.24 ± 0.02 0.20 ±0.02 1.03 ±0.01 0.61 ±0.05 100 83 100 59

листья Аэрация/1 Г ипоксия/1 Аэрация/3 Г ипоксия/3 0.83 ± 0.07 0.12 ±0.01 0.33 ± 0.02 0.10 ±0.01 100 14 100 30

Рис корни Аэрация/1 Гипоксия/1 Аэрация/3 Гипоксия/3 0.14 ±0.01 0.20 ±0.01 0.24 ± 0.02 0.83 ± 0.07 100 143 100 344

листья Аэрация/1 Гипоксия/1 Аэрация/3 Г ипоксия/3 0.07 ±0.01 0.09 ± 0.09 0.40 ± 0.06 1.71 ±0.20 100 130 100 426

к постепенному увеличению активности фермента с течением времени как в корнях, так и в листьях. В ги-поксических условиях активность АДГ в проростках пшеницы снижалась по сравнению с аэрируемым контролем. Так, после суточной гипоксии в корнях она составила 83 % от контроля, а при увеличении срока экспозиции до трех суток - лишь 59 %. Влияние ги-побарической гипоксии на активность АДГ в зеленой части проростков было более значительным. После суточного воздействия этот показатель снизился до 14 % по сравнению с контрольным вариантом, а при увеличении срока неблагоприятного действия фактора до трех суток составил 30 % от контроля. При анаэробиозе в проростках риса, более приспособленного растения, наблюдалось резкое увеличение активности заключительного энзима спиртового брожения. В корнях уже после суточной гипоксии она была выше, чем в соответствующем контроле, в 1.4 раза. А при увеличении срока до трех суток активность АДГ составила 344 % от аэрируемого контроля. Подобная активизация работы фермента при анаэробиозе наблюдалась и в листьях устойчивого растения. Если после суточного пребывания в барокамере в листьях риса активность АДГ составила 130 % от контроля, то после трех суток - 429 %.

Таким образом, в анаэробных условиях , времени в проростках неустойчивого расте далось снижение активности основного фе эробного обмена, В то Время ЗЛЯ О -

та характерно постепенно ггенсивнос-

ти его работы. Это связано :оким уров-

нем протекания процессов ГлИКОлпЗа и ирОЖбНИЯ при гипоксии у приспособленных растений, которые обеспечивают при невозможности окислительного фосфо-ридировавня высокий энергетический потенциал. Считают, что избыточно высокая ферментативная активность, наблюдаемая у устойчивых к гипоксии объектов, необходима при переходе от низкой интенсивности гликолиза к высокой, когда этот переход должен происходить быстро и без изменения концентрации метаболитов [5]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что у риса, в отличие от пшеницы, анаэробиоз индуцирует обращение конечных этапов брожения, как это было показано ранее [3]. У неустойчивых объектов было обнаружено более интенсивное накопление этанола в бескислородной среде по сравнению с устойчивыми. Сдвиг алкогодьдегидрогеназ-ной реакции в сторону окисления этанола после анаэробного воздействия у приспособленных растений препятствует накоплению конечных продуктов брожения, что способствует длительному поддержанию нормального уровня кислотности в клетке.

Для поддержания высокой скорости анаэробного гликолиза при недостатке кислорода необходимо непрерывное реокисление восстанавливающихся в ходе его коферментов. Если у многих устойчивых растений действительно возможно обращение конечных

Вестник ТГПУ. 2003. Выпуск 4 (36). Серия: ЕСТЕСТВЕННЫЕ И ТОЧНЫЕ НАУКИ

Таблица 2

Активность малатдегидрогеназ в проростках пшеницы и риса в различных условиях аэрации

Исследуемый материал Условие опыта/сут НАД-МДГ НАДН-МДГ

мЕ х мг белка'1 % МЕ х мг белка'1 %

Аэрация/1 10.0 ±0.80 100 5.0 ± 0.4 100

Гипоксия/1 8.0 ±0.5 80 3.0 ±0.1 60

корни Аэрация/3 23.0 ± 1.0 100 3.0 ±0.2 100

Пшеница Г ипоксия/3 11.5 ±0.9 50 5.0 ±0.3 167

Аэрация/1 18.0 ±0.7 100 3.7 ±0.3 О О

Гипоксия/1 12.5 + 0.5 69 1.7+ 0.2 46

листья Аэрация/3 29.0 ± 0.9 100 О +1 о СП 100

Г ипоксия/3 9.5 ±0.7 33 1.8 ± 0.1 60

Аэрация/1 16.5 + 1.2 100 5.0 + 0.3 100

Гипоксия,'11 9.5 ±0.8 58 8.0 ±0.5 160

корни Аэрация/3 23.0 ±2.0 100 8.0 ±0.5 100

Рис Гипоксия/3 7.0 ± 0.5 30 20.0 ±0.7 250

Аэрация/1 13.5 ±1.0 100 9.0 ±0.8 100

Гипоксия/1 11.0 + 1.1 81 18.5 + 0.9 205

листья Аэрация/3 26.5 ±2.1 100 7.0 ± 0.5 100

Г ипоксия/3 10.2 ±0.8 38 28.5 ± 1.2 407

реакций спиртового брожения без торможения гликолиза, то должны существовать дополнительные пути, выполняющие задачу реокисления восстановленных коферментов. Одним из способов трансформации дыхания при анаэробиозе у устойчивых объектов является обращение дикарбоновой части цикла Кребса, Исследовали влияние гипобарической гипоксии на активность дегидрогеназ, регулирующих протекание заключительной реакции цикла трикарбоно-вых кислот: НАД-МДГ и НАДН-МДГ. Первый энзим катализирует окисление яблочной кислоты в щавелево-уксусную, второй ускоряет обратную реакцию восстановления оксалоацетата в малат.

В условиях нормальной аэрации активность НАД-МДГ возрастала от одних к трем суткам в проростках пшеницы и риса (табл. 2). В темноте активно функционирует цикл Кребса для обеспечения растительного организма энергией и необходимыми метаболитами. По мере увеличения срока гипобаричес-кого воздействия активность НАД-МДГ снижалась и в листьях, и в корнях обоих растений. НАДН-МДГ в контрольных вариантах при нормальной аэрации в темноте работала слабо и в корнях, и в листьях пшеницы и риса. Различия между устойчивым и неустойчивым объектом обнаружились в анаэробных ус-

ловиях. В листьях пшеницы уровень активности этого энзима и при суточном, и при 3-суточном анаэробиозе был ниже, чем в соответствующем контроле. Длительное пребывание в условиях кислородной недостаточности приводило к усилению работы НАДН-МДГ в корнях пшеницы. В проростках более приспособленного к недостатку кислорода риса отмечалось увеличение активности этого энзима и в корнях, и в листьях уже после кратковременной гипоксии (1 еут). Трехсуточное пребывание растений в барокамере вызывало повышение активности дегидрогеназы более чем в 2 раза по сравнению с аэрируемым контролем. Вероятно, это свидетельствует о смещении равновесия в реакции малат-оксалоа-цетат в сторону образования яблочной кислоты в анаэробных условиях у риса, что не исключает возможности обращения дикарбоновой части цикла ди- и трикарбоновых кислот у устойчивого к гипоксии объекта. Этот путь дополняет гликолиз, переходящий в брожение, осуществляя окисление НАДН и образование нетоксичных интермедиатов. Таким образом, изменение активности ряда ферментов в условиях анаэробиоза у устойчивых растений обеспечивает необходимые перестройки обмена веществ с целью адаптации к изменившимся условиям среды.

Литература

1. Астафурова Т.П., Войцековская С,А., Верхотурова Г.С. и др. Специальный практикум по физиологии и биохимии растений. Томск, 2001, Вып. 4.

2. Кузнецов В.К, Методика ускоренного исчисления стандартного отклонения и ошибки средней // Социально-гигиенические исследования. М., 1970.

3. Чиркова ТВ. Пути адаптации растений к гипоксии и аноксии. Л,,1988.

4. Астафурова Т.П., Верхотурова Г.С.. Зайцева Т.А., Войцековская С.А. Особенности метаболизма в листьях растений на свету в условиях гипобарической гипоксии // Физиология организмов в нормальном и экстремальном состояниях, Томск, 2001.

5. Betts G.F.. Srivastava D.K. The rationalization of high enzyme concentration in metabolic pathways such as glycolysis // J, Theor. Biol. 1991. V. 151.