ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫЕ ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕМЕНЦИИ И СОСТОЯНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ПРЕДДЕМЕНЦИЕЙ
POLYUNSATURATED FATTY ACIDS FOR TREATING DEMENTIA, AND PRE-DEMENTIA RELATED CONDITIONS

Область изобретения
Изобретение относится к композициям и способам для лечения или профилактики деменции и состояний, связанных с преддеменцией, и/или симптомов или признаков таких состояний.
Предшествующий уровень техники
Ухудшение памяти и когнитивной функции рассматривается как нормальный процесс, являющийся результатом старения человека. Возрастное расстройство познавательных способностей является термином, используемым для описания действительного ослабления памяти у пожилых людей, у которых когнитивная функция является нормальной относительно их ровесников. Возрастное когнитивное расстройство отличается от умеренного когнитивного нарушения (MCI), которое является более тяжелым или стойким, и может указывать на ранние стадии состояния, такого как деменция (АРА президентская специальная комиссия по оценке возрастного снижения памяти и деменции, февраль 1998 года). Учитывая широкое распространение возрастного снижения познавательных способностей, потеря памяти является главной проблемой здоровья для многих индивидуумов в возрасте 55 лет и старше.
Деменция характеризуется потерей комплекса функций центральной нервной системы, приводящей к неспособности постигать простые понятия или команды, запоминать и отыскивать информацию в памяти, и к изменениям в поведении и личности. Наиболее широко применяемыми критериями для обнаружения деменции являются DSM-IV (Руководства по диагностике и статистике психических расстройств, Американская ассоциация психиатров). Диагностические признаки деменции согласно DSM-IV включают ухудшение памяти и, по меньшей мере, один из следующих признаков: ухудшение речи (афазия), потерю способности выполнять благоприобретенные двигательные функции (апраксия), неспособность распознавать знакомые предметы (агнозия) или нарушения в организационной деятельности или принятии решения.
Наиболее широко распространенными формами деменции в Соединенных Штатах Америки являются болезнь Альцгеймера (от 40 до 60% диагнозов); сосудистая деменция (от 10 до 20% всех диагнозов); смешанная деменция (10% всех диагнозов); деменция с тельцами Леви (10% всех диагнозов). Вторичные деменции, вызванные лекарственными средствами, делирием или депрессией, представлены 5% или менее всех диагнозов деменции в Соединенных Штатах.
Болезнь Альцгеймера (AD) классифицируется как деменция с нейродегенеративными расстройствами и является преобладающей формой деменции во всем мире. Диагноз AD подтверждается после смерти по накоплению амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков, гибели синапсов и дегенерации нервной ткани в некоторых областях головного мозга и расширении желудочков мозга. Сенильная деменция сама по себе относится ко всем типам деменции в популяции лиц возраста 65 лет и выше и включает в себя AD. Однако механизмы патогенеза, ответственные за развитие AD, недостаточно изучены.
Гистологические исследования показывают, что основные нейропатологические показатели при AD включают повышенное содержание в нервной ткани амилоидного пептида, амилоидных бляшек, нейрофибриллярных клубков, потерю синапсов и гибель нервных клеток. Большое количество амилоидных бляшек является признаком тяжести AD, хотя повышенное количество бляшек не коррелирует строго с ухудшением когнитивной функции. Morris и Price (2001) предположили, что широкое распространение амилоидных бляшек в новой коре головного мозга служит отличительным признаком самой ранней стадии AD. Другие поражения при AD, включающие повышенное образование нейрофибриллярных клубков и дегенерацию нервной ткани, являются, по-видимому, результатом инициированного амилоидом патологического процесса, хотя они могут иметь более непосредственное воздействие на выраженность и тяжесть деменции.
Потребление рыбы индивидуумами и особенно пожилыми приводит к улучшению познавательной способности, уменьшению проявлений агрессии и снижению риска возникновения болезни Альцгеймера и деменции. Было показано, что добавление к пище комбинации докозагексаеновой кислоты (DHA) и эйкозапентаеновой кислоты (EPA) улучшает познавательную способность и остроту зрения у субъектов с деменцией или без нее (Suzuki et al. (2001)). Кроме того, изучения на модели болезни Альцгеймера у трансгенных мышей, где мыши имели мутацию в гене, кодирующем предшественник амилоидного белка (АРР), указывают, что DHA снижает уровни амилоида и количество бляшек. Однако механизм влияния потребления рыбы или употребления DHA или EPA не определяли до настоящего изобретения, особенно относительно патофизиологии болезни Альцгеймера.
Лечение или предотвращение неврологических заболеваний или повреждений традиционно сфокусировано на фармацевтическом подходе. Например, непрерывно развиваются лекарственные средства для психоневрологических или нейродегенеративных заболеваний, которые ослабляют симптомы, но не способны ослаблять внутреннюю причину неврологической проблемы. Таким образом, существует потребность в данной области техники в новых терапевтических стратегиях лечения неврологических расстройств, которые обнаруживаются при деменции, такой как AD. Кроме того, хотя и существует доказательство в пользу того, что потребление рыбы и/или добавление к пище DHA и ЕРА может уменьшить симптомы, связанные с AD, все же в данной области имеется необходимость в идентификации механизма действия такой терапии для разработки улучшенных препаратов и протоколов и для легкости выявления индивидуумов с риском развития AD и лечения в момент времени, когда лечение должно быть самым эффективным, особенно до начала клинических симптомов.
Сущность изобретения
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу снижения уровня β-амилоидного (Аβ) пептида у индивидуума. Способ включает введение индивидууму, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) или ее предшественника или источника для снижения уровня Аβ-пептида у индивидуума, где PUFA выбирают из докозагексаеновой кислоты (DHA); докозапентаеновой кислоты (DPAn-6); комбинации DHA и DPAn-6; комбинации DHA и арахидоновой кислоты (ARA) и комбинации DHA, DPAn-6 и ARA. В одном аспекте Аβ-пептид является растворимым Аβ-пептидом.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу снижения уровня тау-белка у индивидуума. Способ включает введение индивидууму, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) или ее предшественника или источника для снижения уровня тау-белка у индивидуума, где PUFA выбирают из докозагексаеновой кислоты (DHA); докозапентаеновой кислоты (DPAn-6); комбинации DHA и DPAn-6; комбинации DHA и арахидоновой кислоты (ARA), и комбинации DHA, DPAn-6 и ARA. В одном аспекте тау-белок является фосфорилированным тау-белком.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу снижения уровня белка пресенилина-1 (PS1) у индивидуума. Способ включает введение индивидууму, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) или ее предшественника или источника для снижения уровня белка PS1 у индивидуума, где PUFA выбирают из докозагексаеновой кислоты (DHA); докозапентаеновой кислоты (DPAn-6); комбинации DHA и DPAn-6; комбинации DHA и арахидоновой кислоты (ARA) и комбинации DHA, DPAn-6 и ARA.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу задержки начала синаптической дисфункции или уменьшения тяжести синаптической дисфункции у индивидуума. Способ включает введение индивидууму DHA, DPAn-6 или, в предпочтительных вариантах, введение комбинации полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) или их предшественников или источников для задержки начала синаптической дисфункции или уменьшения тяжести синаптической дисфункции у индивидуума, где комбинацию PUFA выбирают из комбинации DPAn-6 и DHA, комбинации ARA и DHA и комбинации DPAn-6, ARA и DHA.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу задержки начала деменции или уменьшения тяжести деменции у индивидуума. Способ включает введение индивидууму DHA, DPAn-6 или, в предпочтительных вариантах, введение комбинации полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) или их предшественников или источников для задержки начала деменции или уменьшения тяжести деменции у индивидуума, где комбинацию PUFA выбирают из комбинации DPAn-6 и DHA, комбинации ARA и DHA и комбинации DPAn-6, ARA и DHA.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения или предотвращения расстройства, ассоциированного с повышенными количествами или экспрессией или дисфункцией β-амилоидного пептида (Аβ), белка пресенилина-1 (PS1), фосфорилированного тау-белка или тау-белка. Способ включает стадии: (а) идентификацию индивидуума, имеющего повышенное количество биомаркера, экспрессию или биологическую активность этого биомаркера, выбранного из Аβ-пептида, белка PS1, фосфорилированного тау-белка, тау-белка и их комбинаций, по сравнению с количеством, экспрессией или биологической активностью биомаркера у отрицательного контрольного индивидуума; и (b) введение индивидууму, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) или ее предшественника или источника для снижения количества, экспрессии или биологической активности Аβ-пептида, белка PS1, фосфорилированного тау-белка или тау-белка, где PUFA выбирают из докозагексаеновой кислоты (DHA); докозапентаеновой кислоты (DPAn-6); комбинации DHA и DPAn-6; комбинации DHA и арахидоновой кислоты (ARA) и комбинации DHA, DPAn-6 и ARA.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения или предотвращения расстройства, ассоциированного со снижением количества полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 или омега-6 или ее предшественника или источника. Способ включает стадии (а) идентификации индивидуума со сниженными количествами полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 или омега-6 или ее предшественника или источника и (b) введения индивидууму комбинации полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) или их предшественников или источников для компенсации эффектов снижения количеств полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 или омега-6 или ее предшественника или источника, где комбинацию PUFA выбирают из комбинации DPAn-6 и DHA, комбинации ARA и DHA и комбинации DPAn-6, ARA и DHA.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу задержки начала снижения функции головного мозга или ослабления тяжести снижения функции головного мозга у индивидуума. Способ включает введение индивидууму DHA, DPAn-6 или, в предпочтительных вариантах, введение комбинации полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) или их предшественников или источников для задержки начала снижения функции головного мозга или ослабления тяжести снижения функции головного мозга у индивидуума, где комбинацию PUFA выбирают из комбинации DPAn-6 и DHA, комбинации ARA и DHA и комбинации DPAn-6, ARA и DHA. В одном аспекте состояние функции мозга оценивают способом, выбранным из нейропсихологических или познавательных тестов, способа визуализации мозга (PET, SPECT, CT, MRI, fMRI) и электроэнцефалографии (EEG).
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу задержки демиелинизации или уменьшения тяжести демиелинизации у индивидуума. Способ включает введение индивидууму комбинации полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) или их предшественников или источников для задержки демиелинизации или уменьшения тяжести демиелинизации у индивидуума, где комбинацию PUFA выбирают из комбинации DPAn-6 и DHA, комбинации ARA и DHA и комбинации DPAn-6, ARA и DHA.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу задержки начала формирования нейрофибриллярных клубков или уменьшения опасности формирования нейрофибриллярных клубков, ассоциированных с болезнью Альцгеймера у индивидуума. Способ включает введение индивидууму DHA, DPAn-6 или, в предпочтительных вариантах, введение комбинации полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) или их предшественников или источников для задержки начала формирования нейрофибриллярных клубков или уменьшения опасности формирования нейрофибриллярных клубков у индивидуума, где комбинацию PUFA выбирают из комбинации DPAn-6 и DHA, комбинации ARA и DHA и комбинации DPAn-6, ARA и DHA.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу стабилизации или нормализации активности тета-волн, или к способу уменьшения или предотвращения развития аномальной активности тета-волн у индивидуума. Способ включает стадии (а) идентификации индивидуума, у которого наблюдается аномальная активность тета-волн или у которого прогнозируют развитие такой активности; и (b) введения индивидууму, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) или ее предшественника или источника для стабилизации или нормализации активности тета-волн или для предотвращения или уменьшения развития аномальной активности тета-волн у индивидуума, где PUFA выбирают из докозагексаеновой кислоты (DHA); докозапентаеновой кислоты (DPAn-6); комбинации DHA и DPAn-6; комбинации DHA и арахидоновой кислоты (ARA), и комбинации DHA, DPAn-6 и ARA.
В любом из вышеуказанных вариантов осуществления настоящего изобретения, в одном аспекте, индивидуума идентифицируют как восприимчивого к деменции или преддеменции или страдающего от деменции или преддеменции. В одном аспекте деменцией является болезнь Альцгеймера. Например, в одном аспекте индивидуума идентифицируют как страдающего от деменции или преддеменции или как восприимчивого к деменции или преддеменции путем оценки биологического маркера, семейного анамнеза, указывающего на деменцию, умеренного когнитивного нарушения или связанного с возрастом когнитивного расстройства. Биологический маркер может включать, но не ограничивается ими, АРР, Аβ-пептид, тау-белок, фосфорилированный тау-белок, PS1 и полиненасыщенную жирную кислоту (PUFA) омега-3 или омега-6 или ее предшественник или источник. В одном аспекте количество, уровень экспрессии или биологической активности биологического маркера определяют в биологическом образце, взятом от индивидуума. Биологический образец может включать, но не ограничивается ими, клеточный образец, тканевый образец и образец, взятый из жидкости организма, и особенно предпочтительные образцы включают образец спинномозговой жидкости или образец крови.
В одном аспекте любого из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения, перед стадией введения, способ может включать измерение количества, экспрессии или биологической активности биомаркера, выбранного из АРР, Аβ-пептида, тау-белка, фосфорилированного тау-белка и белка PS1 в биологическом образце, взятом от индивидуума. В одном аспекте способ также может включать сравнение количества, экспрессии или биологической активности биомаркера в образце индивидуума с исходными данными количества, экспрессии или биологической активности биомаркера в образце такого же типа, где увеличение количества, экспрессии или биологической активности биомаркера в образце от индивидуума по сравнению с исходными данными количества, экспрессии или биологической активности указывает на то, что индивидуум находится в группе риска развития деменции или страдает от деменции.
В одном аспекте любого из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения перед стадией введения способ может включать измерение количества или биологической активности полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 или омега-6 или ее предшественника или источника в биологическом образце от индивидуума. В одном аспекте способ также может включать сравнение количества или биологической активности полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 или омега-6 или ее предшественника или источника в образце от индивидуума с исходными данными количества или биологической активности полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 или омега-6 или ее предшественника или источника в образце такого же типа, где изменение количества полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 или омега-6 или ее предшественника или источника в образце от индивидуума по сравнению с исходными данными количества указывает на то, что индивидууму угрожает развитие деменции или он страдает от деменции.
Стадия измерения количества или активности биомаркера PUFA омега-3 или омега-6 может включать методы, но не ограничивается ими: вестерн-блоттинг, иммуноблоттинг, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA), иммунопреципитация, поверхностный плазмон-резонанс, хемилюминесценция, флуоресцентный поляризационный иммуноанализ, фосфоресценция, иммуногистохимический анализ, времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), микроцитометрия, метод биочипов, микроскопия, сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS), проточная цитометрия, капиллярный электрофорез, метод белкового микрочипа или биочипа, этерификация жирной кислоты метиловым спиртом/газовая хроматография, тонкослойная хроматография, газовая хроматография/масс-спектроскопия и жидкостная хроматография/масс-спектроскопия.
Любой из вышеописанных вариантов осуществления изобретения также может включать контролирование влияния введения PUFA на уровни Аβ-пептида, тау-белка, фосфорилированного тау-белка или белка PS1 у индивидуума, по меньшей мере, один раз после стадии введения. Аналогично, любой из вышеописанных вариантов осуществления изобретения также может включать контролирование влияния введения PUFA на уровни полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 или омега-6 у индивидуума, по меньшей мере, один раз после стадии введения. На основании полученных результатов мониторинга способ также может включать регулирование введения PUFA индивидууму при последующих курсах лечения.
В любом из вышеописанных вариантов осуществления изобретения PUFA может включать масло, содержащее 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более PUFA, где PUFA является химическим веществом, находящимся в виде, выбранном из триглицеридов, триглицеридного масла, содержащего PUFA, фосфолипидов, содержащих PUFA, комбинации белка и фосфолипидов, содержащих PUFA, высушенных морских водорослей, сфинголипидов, содержащих PUFA, сложных эфиров, свободной жирной кислоты, конъюгата PUFA с другой биоактивной молекулой, и их комбинаций.
В любом из вышеописанных вариантов осуществления изобретения, где PUFA включает DPAn-6 и DHA, отношение DPAn-6 к DHA может составлять отношения от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:10. В любом из вышеописанных вариантов осуществления изобретения, где PUFA включает ARA и DHA, отношение ARA к DHA может составлять отношения от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:10. В любом из вышеописанных вариантов осуществления изобретения, где PUFA включает DPAn-6, ARA и DHA, отношение DPAn-6 к ARA к DHA может составлять отношения от приблизительно 1:1:1 до приблизительно 1:1:10.
В любом из вышеописанных вариантов осуществления изобретения PUFA может быть введена, в одном аспекте, в количестве от приблизительно 50 мг до 20000 мг в день. В другом аспекте PUFA может быть введена в количестве от приблизительно 0,025 мг в день до приблизительно 15 г в день. В другом аспекте PUFA может быть введена в количестве от приблизительно 0,05 мг/кг массы тела в день до приблизительно 275 мг/кг массы тела в день.
В любом из вышеописанных вариантов осуществления изобретения источник PUFA может включать, но не ограничивается ими, рыбий жир, морские водоросли, растительное масло и их комбинации.
В одном аспекте любого из вышеописанных вариантов осуществления изобретения PUFA включает DHA, и где предшественник DHA выбирают из α-линоленовой кислоты (LNA); эйкозапентаеновой кислоты (EPA); докозапентаеновой кислоты (DPA); смесей LNA, EPA и DPA.
В любом из вышеописанных вариантов осуществления изобретения PUFA может быть введена индивидууму перорально. В одном аспекте PUFA может быть введена индивидууму в виде препарата, содержащего PUFA или ее предшественник или источник, выбранного из жевательных таблеток, быстрорастворимых таблеток, шипучих таблеток, восстанавливаемых порошков, эликсиров, жидкостей, растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, многослойных таблеток, двухслойных таблеток, капсул, мягких желатиновых капсул, твердых желатиновых капсул, каплет, пастилок, жевательных пастилок, шариков, порошков, гранул, частиц, микрочастиц, диспергируемых гранул, крахмальных облаток, промываний, суппозиториев, кремов, местных средств, ингаляционных средств, аэрозольных ингаляций, пластырей, ингаляций частицами, имплантов, депо-имплантов, проглатываемых средств, инъецируемых средств, инфузионных средств, питательных батончиков, фармацевтического препарата, состоящего из лекарственного средства, смешанного со сладким наполнителем, изделий из дробленого зерна, зерновых изделий с покрытиями, пищевых продуктов, пищевых продуктов, богатых питательными веществами, функциональных продуктов питания и их комбинаций. В другом аспекте PUFA, входящую в состав препарата, получают в виде, выбранном из высокоочищенного масла водорослей, содержащего PUFA, триглицеридного масла, содержащего PUFA, фосфолипидов, содержащих PUFA, комбинации белка и фосфолипидов, содержащих PUFA, высушенных морских микроводорослей, содержащих PUFA, сфинголипидов, содержащих PUFA, сложных эфиров PUFA, свободной жирной кислоты, конъюгата PUFA с другой биоактивной молекулой и их комбинаций. Другой вариант осуществления изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей DHA, DPAn-6 или комбинацию полиненасыщенных жирных кислот (PUFA) или их предшественников или источников и, по меньшей мере, одно терапевтическое соединение для лечения или профилактики деменции у индивидуума, который страдает от деменции или которому угрожает развитие деменции. Комбинацию PUFA выбирают из DPAn-6 и DHA, ARA и DHA и DPAn-6, ARA и DHA. В одном аспекте комбинация PUFA включает масло, содержащее 30% или более или вплоть до 80% или более указанных PUFA, где PUFA является химическим веществом, находящимся в виде, выбранном из триглицеридов, триглицеридного масла, содержащего PUFA, содержащих PUFA фосфолипидов, комбинации белка и содержащих PUFA фосфолипидов, высушенных морских микроводорослей, содержащих PUFA сфинголипидов, сложных эфиров, в виде свободной жирной кислоты, в виде конъюгата PUFA с другой биоактивной молекулой, и их комбинаций. В одном аспекте источник PUFA выбирают из рыбьего жира, морских водорослей, растительного масла и их комбинаций. В одном аспекте предшественник DHA выбирают из α-линоленовой кислоты (LNA); эйкозапентаеновой кислоты (EPA); докозапентаеновой кислоты (DPA); смесей LNA, EPA или DPA. В одном аспекте PUFA входит в состав препарата, выбранного из жевательных таблеток, быстрорастворимых таблеток, шипучих таблеток, восстанавливаемых порошков, эликсиров, жидкостей, растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, многослойных таблеток, двухслойных таблеток, капсул, мягких желатиновых капсул, твердых желатиновых капсул, каплет, пастилок, жевательных пастилок, шариков, порошков, гранул, частиц, микрочастиц, диспергируемых гранул, крахмальных облаток, средств для полосканий, суппозиториев, кремов, местных средств, ингаляционных средств, аэрозольных ингаляций, пластырей, ингаляций частицами, имплантов, депо-имплантов, проглатываемых средств, инъецируемых средств, инфузионных средств, питательных батончиков, фармацевтического препарата, состоящего из лекарственного средства, смешанного со сладким наполнителем, изделий из дробленого зерна, зерновых изделий с покрытиями, пищевых продуктов, пищевых продуктов, богатых питательными веществами, функциональных продуктов питания и их комбинаций. В одном аспекте PUFA входит в состав препарата в виде, выбранном из высокоочищенного масла водорослей, содержащего PUFA, триглицеридного масла, содержащего PUFA, фосфолипидов, содержащих PUFA, комбинации белка и фосфолипидов, содержащих PUFA, высушенных морских микроводорослей, содержащих PUFA, сфинголипидов, содержащих PUFA, сложных эфиров PUFA, свободной жирной кислоты, конъюгата PUFA с другой биоактивной молекулой и их комбинаций.
Терапевтическое соединение, которое может быть включено в композицию согласно изобретению, может включать, но не ограничиваться ими, белок, аминокислоту, лекарственное средство и углевод. В одном аспекте терапевтическое соединение выбирают из такрина; донепезила; ривастигмина; галантамина; мемантина; неотропина; ноотропов; альфа-токоферола (витамин Е); селегелина; нестероидных противовоспалительных средств (NSAID); гингко билоба; эстрогена; ингибиторов β-секретазы; вакцин; витаминов группы В; блокаторов кальциевых каналов; ингибиторов HMG CоA редуктазы; статинов; поликозанолов; фибратов; клиохинола; куркумина; лигнанов; фитоэстрогенов; фитостеринов; ниацина и витаминных добавок.
Другим вариантом осуществления изобретения является использование, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) или ее предшественника или источника для приготовления композиции, где PUFA выбирают из докозагексаеновой кислоты (DHA); докозапентаеновой кислоты (DPAn-6); комбинации DHA и DPAn-6; комбинации DHA и арахидоновой кислоты (ARA) и комбинации DHA, DPAn-6 и ARA. Такие композиции используют для снижения уровня β-амилоидного (Аβ) пептида у индивидуума; снижения уровня тау-белка у индивидуума; снижения уровня белка пресенилина-1 (PS1) у индивидуума; лечения или предотвращения расстройства, ассоциированного с повышенными количествами или экспрессией или дисфункцией β-амилоидного (Аβ) пептида, белка пресенилина-1 (PS1), фосфорилированного тау-белка или тау-белка; и/или стабилизации или нормализации активности тета-волн, или снижения или предотвращения развития аномальной активности тета-волн у индивидуума.
Другой вариант осуществления изобретения относится к использованию, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) или ее предшественника или источника для приготовления композиции, где PUFA выбирают из докозапентаеновой кислоты (DPAn-6); комбинации DHA и DPAn-6; комбинации DHA и арахидоновой кислоты (ARA), и комбинации DHA, DPAn-6 и ARA. Такую композицию используют для того, чтобы задержать начало развития синаптической дисфункции или уменьшить степень тяжести синаптической дисфункции у индивидуума; задержать начало развития деменции или уменьшить степень тяжести деменции у индивидуума; лечить или предотвратить расстройство, ассоциированное с уменьшением количества полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 или омега-6; задержать начало снижения функции головного мозга или уменьшить степень тяжести снижения функции головного мозга у индивидуума; задержать демиелинизацию или уменьшить степень тяжести демиелинизации у индивидуума; и/или задержать формирование нейрофибриллярных клубков или уменьшить степень формирования нейрофибриллярных клубков, ассоциированных с болезнью Альцгеймера у индивидуума.
Краткое описание рисунков
На фиг.1А-1С представлены профили жирных кислот целого мозга у мышей 3хTG-AD после лечебного питания в течение 3 месяцев (фиг.1А; n=6), 6 месяцев (фиг.1В; n=6) или 9 месяцев (фиг.1С; n=6).
На фиг.2А-2С представлены профили жирных кислот эритроцитов у мышей 3хTG-AD после лечебного питания в течение 3 месяцев (фиг.2А; n=6), 6 месяцев (фиг.2В; n=6) или 9 месяцев (фиг.2С; n=6).
На фиг.3А-3С представлены профили фосфатидилхолина (РС) мозга у мышей 3хTG-AD после лечебного питания в течение 3 месяцев (фиг.3А), 6 месяцев (фиг.3В) или 9 месяцев (фиг.3С).
На фиг.4А-4С представлены профили фосфатидилэтаноламина (РЕ) мозга у мышей 3хTG-AD после лечебного питания в течение 3 месяцев (фиг.4А), 6 месяцев (фиг.4В) или 9 месяцев (фиг.4С).
На фиг.5А-5С представлены профили фосфатидилсерина (РS) мозга у мышей 3хTG-AD после лечебного питания в течение 3 месяцев (фиг.5А), 6 месяцев (фиг.5В) или 9 месяцев (фиг.5С).
На фиг.6А-6F представлены уровни растворимого (фиг. 6А, 6С, 6Е) и нерастворимого (фиг.6В, 6D, 6F) Аβ у мышей 3хTG-AD после лечебного питания с DHA в течение 3 месяцев (фиг.6А и 6В; n=6), 6 месяцев (фиг.6C и 6D; n=6) или 9 месяцев (фиг.6E и 6F; n=6).
Фиг.6G-6J являются цифровыми изображениями, показывающими, что окрашивание DAB с помощью 6Е10 демонстрирует Аβ-подобную иммунореактивность в 40 мкМ срезах, сделанных у мышей, которых держали в течение 3 месяцев на контрольной диете (фиг.6G), диете с DHA/DPA (фиг.6H), диете с DHA (фиг.6I) и диете с DHA/ARA (фиг.6J).
На фиг.7А-7D показаны устойчивые уровни APP и IDE (фиг.7А и 7С) и представлена количественная оценка белковых пятен, нормализованных до уровней β-актина, как нагрузочного контроля (фиг.7В и 7D), фрагментов APP (фиг.7А и 7В) и IDE (фиг.7C и 7D) у мышей 3хTG-AD после лечебного питания с DHA.
На фиг.8А-8В показаны устойчивые уровни ADAM10 и BACE (фиг.8А) и количественная оценка белковых пятен, нормализованных до уровней β-актина, как нагрузочного контроля (фиг.8В), у мышей 3хTG-AD после лечебного питания с DHA.
На фиг.8С-8D показаны устойчивые уровни пресенилина-1 и никастрина (фиг.8С) и представлена количественная оценка белковых пятен, нормализованных до уровней β-актина, как нагрузочного контроля (фиг.8D) у мышей 3хTG-AD после лечебного питания с DHA.
∗
На фиг.8Е показано, что DHA значительно снижает mRNA пресенилина-1 (, р<0,05) в клетках SHSY5Y, обработанных в течение 48 часов либо 0,3 мкг/мл DHA в комплексе с BSA 3:1 (n=3), либо эквивалентным количеством BSA только (n=3).
На фиг.9А-9F показаны устойчивые уровни тау-белка (фиг.9А, 9С и 9Е) и представлена количественная оценка белковых пятен, нормализованных до уровней β-актина, как нагрузочного контроля (фиг.9В, 9D, и 9F) у мышей 3хTG-AD после лечебного питания с DHA в течение 3 месяцев (фиг.9А и 9В), 6 месяцев (фиг.9С и 9D) и 9 месяцев (фиг.9E и 9F).
Фиг.10А-10D являются цифровыми изображениями, показывающими иммунореактивность конформационно измененного тау-белка у мышей 3хTG-AD после лечебного питания в течение 3 месяцев (фиг.10А = контрольная диета, фиг.10В = DHA/DPA диета, фиг.10С = диета с DHA и фиг.10D = DHA/арахидоновая кислота).
Фиг.10Е является цифровым изображением иммуноблотта, показывающего фосфорилированный тау-белок после 9 месяцев лечебного питания.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу использования добавок жирных кислот и, предпочтительно, добавок полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 (например, DHA и DPAn-6) для того, чтобы задержать начало деменции и/или уменьшить тяжесть деменции и/или ослабить симптомы деменции, и/или снизить уровень биологических соединений (например, белков), которые ассоциированы с развитием и/или прогрессированием деменции, включающей болезнь Альцгеймера (AD). Особенно, настоящее изобретение направлено на способы снижения уровня β-амилоида (растворимого или нерастворимого), тау-белка, фосфорилированного тау-белка и/или белка пресенилина-1 (PS1) в нервной ткани индивидуума; на способы задержки синаптической дисфункции или уменьшения тяжести синаптической дисфункции, снижения функции головного мозга, демиелинизации, формирования нейрофибриллярных клубков и/или деменции у индивидуума; и на способы лечения или предотвращения расстройства, ассоциированного с повышенными количествами β-амилоида, тау-белка (растворимого или нерастворимого), фосфорилированного тау-белка и/или белка пресенилина-1 (PS1), или с пониженными количествами PUFA омега-3 и/или омега-6. Изобретение также направлено на способ стабилизации или нормализации активности тета-волн или снижения или предотвращения развития аномальной активности тета-волн у индивидуума. Способы согласно настоящему изобретению, в основном, включают введение индивидууму количества, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника. В некоторых вариантах осуществления изобретения PUFA представляет собой комбинацию DPAn-6 и DHA, комбинацию DHA и ARA, или комбинацию DPAn-6, ARA и DHA. В некоторых вариантах осуществления изобретения PUFA представляет собой DHA и/или DPAn-6 и/или ARA, только, в комбинации друг с другом и/или в комбинации с другими PUFA.
Согласно настоящему изобретению деменция характеризуется потерей комплекса функций центральной нервной системы, приводящей к неспособности постигать простые понятия или команды, запоминать и отыскивать информацию в памяти, и к изменениям в поведении и личности. Наиболее широко применяемыми критериями для обнаружения деменции являются DSM-IV (Руководства по диагностике и статистике психических расстройств, Американская ассоциация психиатров). Диагностические характеристики деменции согласно DSM-IV включают ухудшение памяти и, по меньшей мере, одну из следующих характеристик: ухудшение речи (афазия), потерю способности выполнять благоприобретенные двигательные функции (апраксия), неспособность распознавать знакомые предметы (агнозия) или нарушения в организующей функции или принятии решения. Болезнь Альцгеймера (AD) является самой распространенной формой деменции.
M146V,
Swe
P301L
42
Недавно была разработана модель болезни Альцгеймера на трижды трансгенных мышах и результаты описаны группой при Университете Калифорнии в Ирвине (Oddo et al., 2003). Данные мыши содержат трансгены PS1APP и тау. Пресенилин-1 (PS1) является белком, продуцируемым в клетках мозга, и он связан с повышенными количествами Аβ-пептидов. Наследственные мутации гена PS1 на хромосоме 14 являются причиной семейной болезни Альцгеймера. Белок-предшественник амилоида (АРР) является белком с неопределенной функцией, который в норме обнаруживают в мозге. При болезни Альцгеймера АРР аномально деградирует, что приводит к образованию амилоида. Тау, высоко асимметричный и термостабильный белок, экспрессируется, главным образом, в мозге, где он регулирует ориентацию и стабильность микротрубочек в нейронах, астроцитах и олигодендроцитах. Было показано, что у трижды трансгенных мышей наблюдаются патологические изменения в виде бляшек и клубочков в соответствующих для болезни Альцгеймера областях головного мозга (гиппокампе, миндалине и коре головного мозга). У мышей наблюдались внеклеточные отложения Аβ до формирования клубочков, соответственно гипотезе каскада амилоида. У мышей проявляется синаптическая дисфункция в раннем периоде в возрасте шести месяцев. Хотя внеклеточные отложения Аβ не были локализованы в области гиппокампа в этом возрасте, внутриклеточные накопления Аβ-пептида, включая самый патогенный пептид Аβ, были продемонстрированы в этом возрасте. Полученные на указанной модели результаты дают основания предположить, что отложения Аβ внутри нейронов лежат в основе наблюдаемой синаптической дисфункции. Формирование клубочков обычно инициирует в лимбической системе головного мозга структуры и прогрессирует до областей коры головного мозга у человеческих индивидуумов, что являет собой картину, наблюдаемую на данной модели мыши.
Автор настоящего изобретения использовал данную мышиную модель, которая близко воспроизводит AD у человека, чтобы определить механизм действия PUFA на развитие и прогрессирование AD и чтобы разработать новые стратегии терапии и композиции для предотвращения и лечения AD. Автор изобретения создал группы из этих мышей с рационом, который включал значительное количество диетического источника одной или более PUFA. Рационы включали пищу, обогащенную DHA, пищу, обогащенную DHA и DPAn-6, и обогащенную DHA и ARA пищу. Автор изобретения с удивлением обнаружил, что введение PUFA действительно уменьшает количество растворимого Аβ, снижает количество общего тау-белка и снижает количество пресенилина-1 на этой модели животных. В частности, автор изобретения обнаружил, что DHA-содержащая пища снижает уровни растворимого Аβ, хотя эффект DHA уменьшается со временем, особенно у индивидуума, у которого повышены уровни адреновой кислоты или арахидоновой кислоты, или у индивидуума, у которого уровни DPAn-6 снижены. Диеты, включающие только DHA, были самыми эффективными в течение длительного времени, но комбинация DHA и DPAn-6 также оказалась эффективной на ранних этапах времени, и комбинация DHA и ARA также была эффективной на ранних этапах времени. Кроме того, автор изобретения обнаружил, что комбинация DHA и DPAn-6 оказывает удивительную, неожиданную пользу, поскольку животные, которых кормили достаточным количеством DHA в комбинации с DPAn-6, имели значительно повышенные уровни DPAn-6 в ткани по сравнению с животными, которых кормили только DHA. У животных с более высокими уровнями DHA и ARA в крови наблюдали тенденцию к более значительному снижению количества пресенилина-1, белка, ассоциированного с расщеплением АРР до токсичных амилоидных пептидов, хотя диеты, включающие DHA только или комбинации DHA и DPAn-6, также снижали уровни пресенилина-1. Автор изобретения также обнаружил, что DHA-содержащая диета снижала уровни общего тау-белка, включая диету, содержащую только DHA, DHA и DPAn-6 или DHA и ARA, хотя эффекты комбинации диет ослаблялись со временем, так что только диеты, включающие DHA в качестве преобладающей PUFA, способствуют снижению уровня общего тау-белка. Однако что касается фосфорилированного тау-белка, диеты, включающие DHA или DHA и DPAn-6, значительно снижали уровни фосфорилированного тау-белка, даже на более поздних периодах времени, причем комбинация DHA и DPAn-6 является эффективной и имеющей тенденцию к большей эффективности, чем диета, обогащенная только DHA. Результаты, полученные автором изобретения, указывают на то, что диеты, включающие DHA или DHA и DPAn-6, проявляют эффективность при уменьшении патологий AD и что самых успешных результатов достигает диета, включающая только DHA в качестве преобладающей PUFA, хотя диеты с DHA и DPAn-6 также являются эффективными относительно снижения, по меньшей мере, уровня фосфорилированного тау-белка. Точнее, автор настоящего изобретения обнаружил, что PUFA оказывают различное воздействие на когнитивные нарушения, такие как AD, так что на больных может быть оказано соответствующее направленное действие и/или так, что PUFA можно вводить в предпочтительных дозах или моментах времени, чтобы более эффективно лечить заболевание. Точнее, автор настоящего изобретения обнаружил, что DHA уменьшает амилоид, который, как полагают, является признаком ранней стадии патологических процессов, в то время как DPAn-6 является дополнительным эффективным средством, уменьшающим патологию, связанную с тау-белком и фосфорилированным тау-белком, которые, как полагают, являются биомаркерами более поздней стадии патологических процессов. Кроме того, благоприятные эффекты, наблюдаемые от диет, включающих DPAn-6, оказались также удивительными, так как до настоящего изобретения роль DPAn-6 в улучшении симптома или лечении AD не описана. Полученные автором изобретения результаты также способствуют представлению новых маркеров для идентификации субъектов, которые, весьма вероятно, реагируют положительно на добавку PUFA или лечение при различных периодах времени заболевания.
Таким образом, один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу снижения уровня Аβ-пептида в нервной ткани индивидуума, включающий введение индивидууму количества, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6, и/или ее предшественника или источника, для снижения уровня Аβ-пептида у индивидуума. В предпочтительном варианте осуществления изобретения Аβ-пептид, уровень которого уменьшается, является растворимым Аβ-пептидом. В некоторых вариантах осуществления изобретения PUFA включает DHA, DPAn-6, комбинацию DPAn-6 и DHA, комбинацию DHA и ARA или комбинацию DPAn-6, ARA и DHA. В одном варианте осуществления изобретения PUFA представляет собой DHA. В одном варианте осуществления изобретения PUFA представляет собой DPAn-6. В другом варианте осуществления изобретения PUFA представляет собой комбинацию DHA и DPAn-6.
В другом варианте осуществления изобретения изобретение относится к способу поддержания уровня АРР в нервной ткани индивидуума или, более предпочтительно, предотвращения или ингибирования расщепления АРР (независимо от уровня) с образованием Аβ-пептида пресенилином-1, и особенно с образованием более токсичных форм Аβ-пептида. Способ включает введение индивидууму количества, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6, и/или ее предшественника или источника для поддержания уровня АРР у индивидуума, или для предотвращения или ингибирования расщепления АРР пресенилином-1 с образованием Аβ-пептида и более токсичных форм Аβ-пептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения PUFA включает DHA, DPAn-6, комбинацию DPAn-6 и DHA или комбинацию DPAn-6, ARA и DHA. В одном варианте осуществления изобретения PUFA представляет собой комбинацию DHA и DPAn-6.
Основным компонентом внутриклеточных амилоидных бляшек является амилоидный белок (Аβ), который представляет собой пептид, состоящий из 42-43 аминокислот, являющийся продуктом протеолитического расщепления белка-предшественника амилоида (АРР), трансмембранного гликопротеина типа I с неизвестной функцией. Три различные фермента расщепляют АРР с образованием бета-амилоидных пептидов, которые отличаются по размеру. Альфа-секретаза расщепляет связи на С-конце АРР на участке, расположенном в последовательности Аβ-пептида (Аβ 16), производя С-концевой фрагмент из 83 аминокислот и форму Аβ из 26 аминокислот. Гамма-секретаза последовательно расщепляет пептид, состоящий из 83 аминокислот, у С-конца Аβ-пептида, высвобождая короткий пептид из 15 аминокислот (р3), чья роль в амилоидогенезе четко не установлена. Бета-секретаза, или BACE1, расщепляет связи на N-конце Аβ-пептида, в то время как гамма-секретаза, которая может, фактически, являться пресенилином, расщепляет связи на С-конце Аβ-пептида. В зависимости от того, где именно гамма-секретаза расщепляет АРР в соединении с бета-секретазой, образуется пептид, содержащий 40 или 42 аминокислоты. Более длинный пептид, состоящий из 42-43 аминокислот, полагают, является более патогенной формой Аβ по сравнению с формами, состоящими из 15 или 40 аминокислот. Диффундирующие лиганды, являющиеся производными Аβ (или ADDL), являются нефибриллярными, вызывающими агрегацию производными Аβ 1-42, как сообщают, с большей нейротоксичностью по сравнению с большими Аβ-фибриллами, обнаруженными в бляшках при болезни Альцгеймера. Агрегация Аβ 1-42 в олигомерные ADDL увеличивается в присутствии кластерина (Apo J), белкового компонента сенильных бляшек. Комплекс Аβ 1-42 + кластерин является высоко токсичным в культивируемых нейронах РС12.
Нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-предшественник амилоида человека (АРР), определяли, и нуклеотидные и кодированные аминокислотные последовательности для АРР-пептида можно обнаружить в общедоступных базах данных последовательностей, таких как база данных Национального центра информации по биотехнологии (NCBI). Например, нуклеотидная и аминокислотная последовательности АРР-пептида человека могут быть найдены в базе данных NCBI под инвентарными номерами NM_000484 (вариант 1), NM_201413 (вариант 2) и NM_201414 (вариант 3). Вся информация о последовательностях, представленных из базы данных под указанными инвентарными номерами, включена в описание посредством ссылки во всей полноте. Определение и/или количественная оценка Аβ-пептида может осуществляться способами, известными в данной области, и подробно обсуждается ниже.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение относится к способу снижения уровня тау-белка в нервной ткани индивидуума, включающему введение индивидууму количества, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника для снижения уровня тау-белка у индивидуума. В предпочтительном варианте осуществления изобретения тау-белок, уровень которого необходимо снизить, является фосфорилированным тау-белком или конформационно измененным тау-белком. В некоторых вариантах осуществления изобретения PUFA включает DHA, DPAn-6, комбинацию DPAn-6 и DHA, комбинацию DHA и ARA или комбинацию DPAn-6, ARA и DHA. В одном варианте осуществления изобретения PUFA включает DHA. В одном варианте осуществления изобретения PUFA включает DPAn-6. В другом варианте осуществления изобретения PUFA является комбинацией DHA и DPAn-6.
Тау-белок, и особенно фосфорилированный тау-белок, является преобладающим белком, обнаруженным в нейрофибриллярных клубках, присутствующих на более поздних стадиях болезни Альцгеймера. Нейрофибриллярные клубки состоят, главным образом, из аномально фосфорилированного тау-белка, нейронспецифического фосфопротеина, который является основным составляющим компонентом нейронных микротрубочек. При болезни Альцгеймера, нейрофибриллярные клубки найдены в нейронах коры головного мозга, но наиболее распространены в височной зоне головного мозга, особенно в гиппокампе и миндалине. Плотность и картина распределения нейрофибриллярных клубков коррелирует со степенью тяжести AD. Определение и/или количественная оценка тау-белка и/или фосфорилированного тау-белка может осуществляться способами, известными в данной области, и подробно обсуждается ниже.
Таким образом, один вариант осуществления изобретения включает способ задержки процесса формирования нейрофибриллярных клубков или уменьшения опасности такого формирования нейрофибриллярных клубков у индивидуума, включающий введение индивидууму количества, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника для задержки процесса формирования нейрофибриллярных клубков или уменьшения опасности такого формирования нейрофибриллярных клубков у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения PUFA включает DHA, DPAn-6, комбинацию DPAn-6 и DHA, комбинацию DHA и ARA или комбинацию DPAn-6, ARA и DHA. В одном варианте осуществления изобретения PUFA включает DHA. В одном варианте осуществления изобретения PUFA включает DPAn-6. В другом варианте осуществления изобретения PUFA является комбинацией DHA и DPAn-6.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение включает способ снижения уровня белка пресенилина-1 (PS1) в нервной ткани индивидуума, заключающийся во введении индивидууму количества, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника для снижения уровня PS1-белка у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения PUFA включает DHA, DPAn-6, комбинацию DPAn-6 и DHA, комбинацию DHA и ARA или комбинацию DPAn-6, ARA и DHA. В одном варианте осуществления изобретения PUFA включает DHA. В одном варианте осуществления изобретения PUFA включает DPAn-6. В другом варианте осуществления изобретения PUFA является комбинацией DHA и DPAn-6.
mАРР)
пресенилине-1
Исследователи в данной области полагают, что пресенилин-1 является либо ответственным за активность гамма-секретазы, которая расщепляет АРР на бета-амилоид и на патогенные пептиды, либо он является важной детерминантой активности “гамма-секретазы”, необходимой для получения бета-амилоида. Мутации в белке-предшественнике амилоида ( и в  (mPS1) связывают с повышенной продукцией бета-амилоидного пептида (Аβ). Определение и/или количественную оценку экспрессии или активности пресенилина-1 можно осуществлять способами, известными в данной области, которые более полно обсуждаются ниже.
В другом варианте осуществления изобретения настоящее изобретение включает способ задержки начала синаптической дисфункции и/или уменьшения тяжести синаптической дисфункции у индивидуума, заключающийся во введении индивидууму количества, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника для задержки начала синаптической дисфункции и/или уменьшения тяжести синаптической дисфункции у индивидуума. В данном варианте осуществления изобретения PUFA предпочтительно представляет собой DHA, DPAn-6, комбинацию DPAn-6 и DHA, комбинацию DHA и ARA или комбинацию DHA, DPAn-6 и ARA. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения PUFA представляет собой DPAn-6 или комбинацию DPAn-6 и DHA. Синаптическая дисфункция является главным фенотипическим проявлением нейропатии при болезни Альцгеймера и лучше всего ассоциируется с изменениями памяти и познавательных способностей, которые характеризуют болезнь Альцгеймера.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу задержки начала деменции и/или уменьшения тяжести деменции, включающему введение индивидууму количества, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника для задержки начала деменции и/или уменьшения степени тяжести деменции у индивидуума. В данном варианте осуществления изобретения PUFA предпочтительно представляет собой DHA или DPAn-6, комбинацию DPAn-6 и DHA, комбинацию DHA и ARA или комбинацию DHA, DPAn-6 и ARA. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения PUFA представляет собой DPAn-6 или комбинацию DPAn-6 и DHA.
В другом варианте осуществления изобретения настоящее изобретение относится к способу задержки начала снижения функции головного мозга и/или уменьшения тяжести снижения функции головного мозга у индивидуума, включающему введение индивидууму количества, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника для задержки начала снижения функции головного мозга и/или уменьшения тяжести снижения функции головного мозга у индивидуума. В данном варианте осуществления изобретения PUFA предпочтительно представляет собой DHA или DPAn-6, комбинацию DPAn-6 и DHA, комбинацию DHA и ARA или комбинацию DHA, DPAn-6 и ARA. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения PUFA представляет собой DPAn-6 или комбинацию DPAn-6 и DHA.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу задержки демиелинизации или уменьшения тяжести демиелинизации у индивидуума, включающему введение индивидууму количества, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника для задержки демиелинизации или уменьшения тяжести демиелинизации у индивидуума. В данном варианте осуществления изобретения PUFA предпочтительно представляет собой DHA или DPAn-6, комбинацию DPAn-6 и DHA, комбинацию DHA и ARA или комбинацию DHA, DPAn-6 и ARA. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения PUFA представляет собой DPAn-6 или комбинацию DPAn-6 и DHA. Миелин является белым веществом мозга, покрывающим аксоны нейронов, и способствует эффективной проводимости нервных импульсов между головным мозгом и другими частями тела. Потеря миелина (т.е. демиелинизация) или аномальный состав миелина может быть связан со снижением скорости или активности процессов в нервной системе и последующим ухудшением когнитивной функции.
В другом варианте осуществления изобретения настоящее изобретение относится к способу лечения или предотвращения расстройства, ассоциированного с повышенными количествами и/или дисфункцией АРР, Аβ-пептида, белка PS1, фосфорилированного тау-белка и/или тау-белка. Способ включает стадии (а) идентификации индивидуумов с повышенными количествами и/или дисфункцией белка или пептида, выбранного из АРР, Аβ-пептида, белка PS1, фосфорилированного тау-белка, тау-белка или их комбинаций; и (b) введения индивидууму, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника. В одном варианте осуществления изобретения PUFA вводят в количестве, которое определено как достаточное количество для уменьшения повышенных количеств или для снижения дисфункции Аβ-пептида, белка PS1, фосфорилированного тау-белка или тау-белка. В данном варианте осуществления изобретения PUFA предпочтительно представляет собой DHA, DPAn-6 и комбинацию DPAn-6 и DHA, комбинацию DHA и ARA или комбинацию DHA, DPAn-6 и ARA. Предпочтительные PUFA включают DHA, DPAn-6 или комбинацию DPAn-6 и DHA.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения или предотвращения расстройства, ассоциированного с пониженными количествами полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника. Способ включает стадии (а) идентификации индивидуумов с пониженными количествами полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника (например, в тканях или крови); и (b) введения индивидууму, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника в количестве, которое определено как достаточное для компенсации эффектов, связанных с пониженными количествами полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника. В данном варианте осуществления изобретения, PUFA предпочтительно представляет собой DHA, DPAn-6 и комбинацию DPAn-6 и DHA, комбинацию DHA и ARA или комбинацию DHA, DPAn-6 и ARA. Предпочтительные PUFA включают DPAn-6 или комбинацию DPAn-6 и DHA.
В другом варианте осуществления изобретения настоящее изобретение относится к способу задержки синаптической дисфункции или уменьшения тяжести синаптической дисфункции, снижения функции головного мозга, демиелинизации и/или деменции или родственного расстройства у индивидуума. Способ включает стадии (а) идентификации индивидуумов, имеющих, по меньшей мере, один симптом или биологический маркер, указывающий на синаптическую дисфункцию, снижение функции головного мозга, демиелинизацию и/или деменцию или родственное расстройство; и (b) введения индивидууму, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника в количестве, которое определено как достаточное для задержки или ослабления тяжести синаптической дисфункции, снижения функции головного мозга, демиелинизации и/или деменции или родственного расстройства. В данном варианте осуществления изобретения PUFA предпочтительно представляет собой DHA, DPAn-6, комбинацию DPAn-6 и DHA, комбинацию DHA и ARA или комбинацию DHA, DPAn-6 и ARA. Предпочтительные PUFA включают DHA, DPAn-6 или комбинацию DPAn-6 и DHA.
В другом варианте осуществления изобретения настоящее изобретение относится к способу стабилизации и нормализации тета-волн на электроэнцефалограмме (EEG) у индивидуума, страдающего потерей памяти, ранней болезнью Альцгеймера, и который является потенциальным больным, страдающим деменцией любого вида, и у которого зарегистрированы глубоко расположенные, медленные аномальные тета-волны на EEG, особенно в области лобных долей. Данный способ может быть использован для предотвращения развития аномальной активности тета-волн у тех индивидуумов, у которых по семейному анамнезу или генетическому маркеру можно предположить развитие аномальной активности тета-волн. Способ включает стадии (а) идентификации индивидуумов, у которых наблюдается аномальная активность тета-волн или которые предрасположены к развитию аномальной активности тета-волн; (b) введения индивидууму, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника в количестве, которое определено как достаточное для стабилизации или нормализации активности тета-волн или для предотвращения или снижения возможности развития аномальной активности тета-волн у индивидуума. В данном варианте осуществления изобретения PUFA предпочтительно представляет собой DHA, DPAn-6, комбинацию DPAn-6 и DHA, комбинацию DHA и ARA или комбинацию DHA, DPAn-6 и ARA. Предпочтительные PUFA включают DHA, DPAn-6 или комбинацию DPAn-6 и DHA.
В одном аспекте из вышеописанных вариантов осуществления изобретения индивидуума идентифицируют как восприимчивого к деменции или преддеменции. В другом аспекте индивидуума положительно диагностируют с деменцией или преддеменцией. В другом аспекте индивидуума положительно диагностируют с болезнью Альцгеймера. Способы диагностирования индивидуума на предмет того, страдает ли он от деменции или преддеменции, или восприимчив к развитию деменции или преддеменции, включая болезнь Альцгеймера, включают количественное определение биологического маркера (например, АРР, Аβ-пептида, белка PS1, фосфорилированного тау-белка или тау-белка, как указано в описании), или изучение семейного анамнеза, указывающего на деменцию, или выявление текущего умеренного когнитивного нарушения, или выявление возрастного нарушения познавательной способности.
Умеренное когнитивное нарушение (MCI) является формой потери памяти, которое может воздействовать на способность персоны проходить нейропсихологические тесты. Обычно индивидуумы с MCI имеют ослабленную память, исходя из показателей нормативных стандартных тестов, но у них не наблюдается ухудшение других типов функции головного мозга, таких как составление планов или внимание. Указанные индивидуумы не имеют серьезных проблем в навыках управления, которые требуются ежедневно. Индивидуумы с MCI имеют значительно повышенный риск развития болезни Альцгеймера или других форм деменции.
Возрастное когнитивное расстройство (ACRD), также названное как ассоциированное с возрастом ухудшение памяти (AAMI), совместимое с возрастом ухудшение памяти, беспамятство пожилых людей в легкой форме (BSF), ухудшение познавательной способности (обусловленное возрастом), беспамятство (у пожилых людей в легкой форме) или ухудшение памяти (совместимое с возрастом), не рассматривается как заболевание, хотя специалисты различают, связано ли, отчасти, возрастное когнитивное расстройство с болезнью Альцгеймера и другими формами деменции, или указанное расстройство имеет отличающуюся сущность. Индивидуумы с ARCD испытывают ухудшение памяти и обучения, внимания и концентрации, мышления, затрудняются говорить и испытывают другие психические отклонения.
Умеренное когнитивное расстройство (MCI) и возрастное когнитивное нарушение (ARCD) можно идентифицировать с помощью различных неврологических и когнитивных тестов, включая, но не ограничиваясь ими, краткую шкалу оценки психического статуса (MMSE), кэмбриджскую нейропсихологическую автоматизированную систему тестов (CANTAB), шкалу оценки болезни Альцгеймера по когнитивному тесту (ADAScog), присутствие амилоидных бета-пептидов или фосфорилированного тау-белка в спинномозговой жидкости, расширенные желудочки головного мозга, определенные методом эмиссионной позитронной томографии (РЕТ) или однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT), определение присутствия амилоидных бляшек или нейрофибриллярных клубков в мозге с помощью методов PET или SPECT, электроэнцефалографию (EEG) и, в некоторых случаях, генетическое тестирование. МCI можно определять посредством комбинации клинических проверок, нейропсихологического тестирования, которые показывают расстройства памяти, аномальную для возраста память, возможность выполнять нормальные работы ежедневно, нормальную общую когнитивную функцию, отсутствие деменции. Кроме того, уровни тау-белка и амилоидного бета-пептида в спинномозговой жидкости (CSF) и изображение мозга (PET, SPECT, визуализация методом ядерно-магнитного резонанса (MRI)) могут быть использованы для установления показателей болезни Альцгеймера или в качестве вторичных факторов риска.
Синаптическую дисфункцию можно количественно определять рядом способов, включая, но не ограничиваясь ими, потребление кислорода и глюкозы (РЕТ - эмиссионная позитронная томография, однофотонная эмиссионная компьютерная томография (SPECT)) и функциональную магнитно-резонансную томографию (fMRI), электроэнцефалографию и длительную потенциацию.
Функцию мозга можно количественно определять рядом методов, известных в данной области, включающих различные тесты познавательных способностей для оценки скорости обработки информации, организующей функции и памяти. Примеры включают, но не ограничиваются ими, краткую шкалу оценки психического статуса (MMSE), кэмбриджскую нейропсихологическую автоматизированную систему тестов (CANTAB), шкалу оценки болезни Альцгеймера по когнитивному тесту (ADAScog), висконсинский тест сортировки карточек, тест беглости речевых ответов и тест слежения, электроэнцефалографию (EEG), магнитоэнцефалографию (MEG), эмиссионную позитронную томографию (РЕТ), однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (SPECT), визуализацию методом магнито-резонансной томографии (MRI), функциональную магнито-резонансную томографию (fMRI), компьютерную томографию и длительную потенциацию.
EEG, измерение электрической активности головного мозга, сопровождается размещением электродов на коже головы при различных ориентировочных точках и записью значительно усиленных сигналов мозга.
MEG является родственным методом EEG, при котором происходит измерение магнитных полей, которые связаны с электрическими полями. MEG используют для измерения спонтанной активности мозга, включающей синхронные волны в нервной системе (Joliot et al., 1994; Deutsch, 1998).
С помощью РЕТ измеряют потребление кислорода и метаболизм глюкозы. При данном методе позитронно-радиоактивный индикатор вводят, и поглощение индикатора мозгом коррелирует с активностью мозга. Указанные индикаторы излучают гамма-лучи, которые регистрируются датчиками, окружающими голову, что приводит к трехмерному изображению активации мозга. Как только индикатор поглощается мозгом, обнаруженная радиоактивность проявляется как функция регионального мозгового кровотока (Frackowiak, 1989), и в течение активации, увеличение в CBF и метаболизма глюкозы в нервной клетке можно детектировать в пределах секунд.
Методы MRI и fMRI опираются на тот факт, что одним свойством атомных ядер, их спинами, можно управлять путем воздействия на них большой магнитной силы. В то время как голова субъекта расположена в мощном магните (от 1,5 до 5 тесла в силе), коротковолновая радиоантенна изменяет магнитное поле таким образом, что оно становится намного слабее, чем основной магнит. Меняющиеся импульсы производят резонансный сигнал от ядер, который может быть измерен в 3D и преобразован в цифровую форму.
Индивидуумов, которых предполагается лечить способами согласно изобретению, также можно идентифицировать посредством нейропсихиатрического тестирования, клинических испытаний и на основании индивидуальных жалоб на потерю когнитивной функции (например, субъективная потеря памяти).
Предпочтительные биологические маркеры, используемые для оценки идентификации индивидуумов, подвергаемых лечению или контролированию лечения способами согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются следующими маркерами: АРР, Аβ-пептид, тау-белок, фосфорилированный тау-белок, PS1 и/или полиненасыщенную жирную кислоту (PUFA) омега-3 или омега-6 (и предпочтительно DHA, ARA и/или DPAn-6), и/или ее предшественник или источник (например, содержание указанных биомаркеров в биологическом образце). Предпочтительно, экспрессию (например, обнаружение РНК или белка) или биологическую активность любого из указанных биомаркеров оценивают количественно в биологическом образце от индивидуума до стадии введения PUFA согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество, экспрессию или биологическую активность приведенных биомаркеров можно количественно определять после стадии введения PUFA согласно изобретению, например, чтобы контролировать воздействие данного способа на лечение симптома или состояния.
Определение значимости количества, уровня экспрессии или биологической активности биологического маркера (например, определение того, страдает ли индивидуум от деменции или преддеменции или восприимчив к деменции или преддеменции, или определение эффективности данного протокола введения PUFA) включает сравнение уровня экспрессии и/или биологической активности биологического маркера (также названного биомаркером) в образце индивидуума с начальным уровнем количества, экспрессии и/или биологической активности биомаркера в контрольном или исходном образце. Повышение количества биомаркера в образце от индивидуума (для биомаркеров АРР, Аβ, АРР, Аβ-пептида, тау-белка, фосфорилированного тау-белка и PS1) по сравнению с начальным количеством, или уменьшение количества полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 по сравнению с исходным количеством, указывает на то, что индивидуум находится в состоянии риска развития, синаптической дисфункции, снижения функции головного мозга, демиелинизации и/или преддеменции или деменции или родственного расстройства (например, болезнь Альцгеймера) или имеет данные заболевания.
in vivo
Обычно биомаркеры оценивают количественно в настоящем изобретении путем определения количества, экспрессии и/или биологической активности биомаркера в биологическом образце, полученном от индивидуума. Биологический образец может представлять собой клеточный образец, тканевый образец и/или образец жидкости организма. Согласно настоящему изобретению, термин “клеточный образец” может быть употреблен, в основном, чтобы сослаться на образец любого типа, содержащий клетки, количество которых необходимо определить настоящим способом, включая, но не ограничиваясь ими, образец изолированных клеток, тканевый образец и/или образец жидкости организма. Согласно настоящему изобретению, образец изолированных клеток является образцом клеток, обычно в суспензии или отделенных от соединительной ткани, которая может иметь связанные клетки в ткани , которые собирают из органа, ткани или жидкости любым подходящим методом, приводящим к сбору соответствующего количества клеток для их количественной оценки способом согласно настоящему изобретению. Клетки в клеточном образце не обязательно являются одинакового типа клетками, хотя методы очистки могут быть использованы для выделения клеток, которые предпочтительно оценивают. Клетки могут быть получены, например, путем соскабливания ткани, обработки образца ткани для высвобождения индивидуальных клеток или выделения клеток из жидкости организма.
Тканевый образец, хотя и подобен образцу изолированных клеток, определяют в описании как часть органа или ткани организма, которая обычно включает несколько типов клеток и/или цитоскелетную структуру, которая держит клетки вместе. Специалист в данной области должен признать, что термин “тканевый образец” может быть употреблен в некоторых случаях взаимозаменяемо с термином “клеточный образец”, хотя его предпочтительно используют для обозначения более сложной структуры, чем клеточный образец. Тканевый образец может быть получен посредством биопсии, например, посредством срезов, нарезаний на части или использования щипцов.
Образец жидкости организма, подобный тканевому образцу, также может содержать клетки и может быть получен любым способом, подходящим для отдельной жидкости организма, выбранной в качестве образца. Жидкости организма, подходящие для взятия пробы, включают, но не ограничиваются ими, кровь, спинномозговую жидкость, слизь, семенную жидкость, слюну, материнское молоко, желчь и мочу. В предпочтительном варианте осуществления изобретения биологическим образцом является образец крови, включающий любую фракцию крови (например, цельную кровь, плазму, сыворотку), или образец спинномозговой жидкости.
В общем, тип образца (т.е. клетка, ткань или жидкость организма) выбирают на основании доступности образца и получаемых результатов способа. Обычно биологические образцы, которые могут быть получены наименее инвазивным методом, являются предпочтительными (например, кровь), хотя в некоторых вариантах осуществления изобретения может быть использован клеточный или тканевый образец или его необходимо получить для количественной оценки. Отдельные ткани также могут быть оценены неинвазивными методами, такими как методы визуализации.
После того как образец получают от индивидуума, образец исследуют на предмет выявления в нем наличия, экспрессии или биологической активности любого биомаркера, приведенного в описании, включая АРР, Аβ-пептид, тау-белок, фосфорилированный тау-белок и/или PS1 и/или полиненасыщенную жирную кислоту (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественник или источник. Ссылка на выявление “экспрессии” биомаркера обычно относится к установлению или транскрипции мРНК или трансляции белка, включая установление посттрансляционного процессинга белков или пептидов (например, выявление белка в образце). Выявление “наличия” биомаркера относится к любому методу установления, имеется ли биомаркер в образце или не имеется, и может в большинстве случаев быть использовано взаимозаменяемо с выявлением экспрессии или выявлением количества белка. Предпочтительно, метод установления наличия, количества, экспрессии или биологической активности у индивидуума является одним и тем же или количественно эквивалентным методу, используемому для установления наличия, количества, экспрессии или биологической активности в образце, который используют, чтобы определить исходный или контрольный уровень биомаркера.
in situ
Методы, подходящие для определения транскрипции биомаркера, включают любой подходящий метод определения и/или измерения уровней мРНК жидкости, клетки или клеточного экстракта. Такие методы включают, но не ограничиваются ими, полимеразную цепную реакцию (PCR), PCR с использованием обратной транскриптазы (RT-PCR), гибридизацию , нозерн-блоттинг, анализ последовательностей, анализ с использованием микрочипов и регистрацию репортерного гена. Такие методы определения уровней транскрипции хорошо известны в данной области, и многие из таких методов описаны, например, в публикации Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989, и/или в публикации Glick et al., Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, 1998; Sambrook et al., ibid., и Glick et al., ibid. и включены в описание посредством ссылки во всей полноте. Определение транскрипции биомаркера подходит, главным образом, в тех случаях, когда образец является клеточным или тканевым образцом; поэтому когда образец является образцом жидкости организма, содержащим клетки или клеточные экстракты, то клетки обычно выделяют из жидкости организма для возможности осуществления анализа экспрессии.
Экспрессию биомаркера также можно идентифицировать путем определения трансляции (т.е. выявление белка в образце). Методы, подходящие для выявления белка, включают любой подходящий метод определения и/или измерения белков жидкости, клетки или клеточного образца. Такие методы включают, но не ограничиваются ими, вестерн-блоттинг, иммуноблоттинг, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA), иммунопреципитацию, поверхностный плазмон-резонанс, хемилюминесценцию, флуоресцентный поляризационный иммуноанализ, фосфоресценцию, иммуногистохимический анализ, времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), микроцитометрию, метод микрочипов, микроскопию, сортировку клеток с активацией флуоресценции (FACS), проточную цитометрию и метод белкового микрочипа или биочипа, высокоэффективную жидкостную хроматографию или гель-проникающую хроматографию. Такие методы хорошо известны в данной области. Антитела против биомаркеров, приведенных в описании, получены и описаны в данной области и могут быть использованы во многих анализах, предназначенных для выявления биомаркеров.
2
Альтернативно, можно легко получать антитела, которые избирательно связываются с биомаркерами, используя методики, хорошо известные в данной области. Фраза “избирательно связывает” относится к специфическому связыванию одного белка с другим (например, антитело, его фрагмент или связывающий партнер с антигеном), где уровень связывания, измеренный любым стандартным анализом (например, иммуноанализ), является статистически значительно выше, чем фоновый контроль для анализа. Например, при выполнении иммуноанализа, контроли обычно представляют собой реакционную смесь в лунке/пробирке, которая содержит антитело или антигенсвязывающий фрагмент только (т.е. в отсутствие антигена), где иммунореактивность (например, неспецифическое связывание с лункой), проявляемая антителом или его антигенсвязывающим фрагментом в отсутствие антигена, рассматривается как фоновая. Связывание может быть измерено посредством ряда методов, являющихся стандартными в данной области, включающих иммуноферментные анализы с аффинной хроматографией (например, ELISA), методы иммуноблоттинга и т.д. Антитела, используемые в наборе для анализа, и способы согласно настоящему изобретению могут включать поликлональные и моноклональные антитела, двухвалентные и моновалентные антитела, би- или мультиспецифические антитела, сыворотку, содержащие такие антитела, антитела, которые очищены до различной степени, и любые функциональные эквиваленты целых антител (например, фрагменты Fv, Fab, Fab′′ или F(ab)).
Как описано выше, Аβ-пептиды обнаруживают у индивидуумов в виде одной или более различных “по размеру форм”. Эти “отличающиеся по размеру формы” также могут быть определены и сравнены одна с другой, или отдельная форма этих белков может быть сравнена с таким же фрагментом в исходном или контрольном образце. Кроме того, можно определять соотношение, или профиль, различных Аβ-пептидов или любой из отличающихся по размеру форм вышеописанных пептидов в биологическом образце от индивидуума, и сравнивать профиль с таковым в исходном образце. В частности, используемые формы Аβ-пептидов (фрагменты) различного размера для их определения включают продукты расщепления АРР, представляющие собой олигопептиды из 15 аминокислот, 40 аминокислот, 42 аминокислот или 43 аминокислот. Формы различного размера могут быть определены, и их можно различить одну от другой, используя многие из приведенных выше методов определения белка.
Биомаркеры также можно подвергнуть количественной оценке в образце путем выявления биологической активности биомаркера (например, биологическая активность белка). Согласно настоящему изобретению “биологическая активность” относится к любому биологическому действию, приведенному в описании, включающему, но не ограниченному ими, ферментативную активность; связывание белка с другим белком (например, рецептор, сигнальный белок, субстрат и т.д.); активацию белка; активацию пути передачи сигнала в клетке; и нисходящие [в каскаде реакций] биологические процессы, которые протекают в результате экспрессии, присутствия или активации биомаркера. Методы определения биологической активности биомаркеров, приведенных в описании, хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваются ими, анализы связывания, ферментативные реакции и анализы фосфорилирования.
Таким образом, некоторые из способов согласно настоящему изобретению, которые включают стадию идентификации индивидуума, диагностики индивидуума с целью его лечения и/или контролирования эффективности лечения или протокола, включают стадию сравнения уровня экспрессии или активности биомаркера, определенного у индивидуума (например, АРР, Аβ-пептида, тау-белка, фосфорилированного тау-белка, PS1 или PUFA омега-3 и/или PUFA омега-6), или результата отдельного тестирования, связанного с синаптической дисфункцией, функцией мозга, демиелинизацией и/или деменцией или родственным расстройством, с исходным или контрольным уровнем экспрессии или активности биомаркера или результатом тестирования. Согласно настоящему изобретению, “исходный уровень” является контрольным уровнем и, в некоторых вариантах осуществления изобретения, нормальным уровнем (например, уровень биомаркера, выявляемого у индивидуума или прогнозируемого у индивидуума, который не страдает от деменции или преддеменции или состояния, родственного деменции) экспрессии или активности биомаркера или результатом испытания, против которых определяемый уровень экспрессии или активности биомаркера (т.е. в образце индивидуума) или результат тестирования можно сравнивать. Поэтому, на основании контрольного или исходного уровня биомаркера или результата тестирования можно определить, имеет ли оцениваемый биомаркер измеряемое увеличение, уменьшение уровня экспрессии или активности биомаркера или, в основном, не имеет изменений указанного уровня или результата тестирования по сравнению с исходным или контрольным уровнем. Термин “отрицательный контроль”, используемый при ссылке на исходный уровень, относится к исходному уровню, определенному в образце от индивидуума или от популяции индивидуумов, который, как полагают, является нормальным относительно экспрессии или активности биомаркера или относительно результата отдельного тестирования функции. В другом варианте осуществления изобретения исходный уровень может быть показателем положительного диагноза деменции или другого состояния и/или заболевания, как указано в описании. Такой исходный уровень, также названный в описании как “положительный контрольный” исходный уровень, относится к уровню экспрессии или активности биомаркера, или результату тестирования, определенному в образце от индивидуума, другого индивидуума или популяции индивидуумов, где уровень экспрессии или активности в образце или результат тестирования контроля, как полагают, соответствует уровню биомаркера или результату тестирования, который указывает на дисфункцию, преддеменцию или деменцию у индивидуума. В другом варианте осуществления изобретения исходный уровень может быть определен, исходя из предварительного образца от индивидуума, который подвергают тестированию, так что статус биомаркера или результата тестирования можно контролировать со временем.
Способ установления исходного уровня биомаркера или результата тестирования выбирают на основании типа образца, ткани или органа, из которого образец получают, статуса индивидуума, которого оценивают, и, как описано выше, цели анализа (например, первоначальный диагноз, мониторинг). Предпочтительно, способ является приведенным выше способом, который будет использован для оценки образца или индивидуума.
В одном варианте осуществления изобретения исходный уровень количества, экспрессии или биологической активности биомаркера устанавливают в аутологичном контрольном образце, полученном от индивидуума. Аутологичный контрольный образец может быть образцом выделенных клеток, тканевым образцом или образцом жидкости организма, и предпочтительно образцом жидкости организма (например, CSF или кровь). Согласно настоящему изобретению, и как используют в данной области, термин “аутологичный” означает, что образец получают от того же индивидуума, от которого образец получают для оценки. Предпочтительно, контрольный образец получают из такой же жидкости, органа или ткани, как и образец, который оценивают, так что контрольный образец служит в виде наилучшей возможной отправной точки для образца, который оценивают. Указанный вариант осуществления изобретения чаще используют, когда предварительные показания для индивидуума указывают на распознавание биомаркера либо как положительное, либо как отрицательное. Указанный исходный уровень может быть использован для контролирования непрекращающегося прогрессирования у индивидуума заболевания или состояния или продолжающегося отступления заболевания или состояния, или для контролирования успешных результатов терапии (например, добавка PUFA). В данном варианте осуществления изобретения новый образец оценивают периодически (например, при ежегодных медосмотрах, которые являются особенно полезными для здоровых индивидуумов, у кого не обнаруживается деменция или преддеменция, но кто желает следить за признаками заболевания, или по графику, определенному клиницистом, лечащим индивидуума), и профилактическое лечение или терапию устанавливают посредством добавления к рациону жирной кислоты при любой временной точке. Относительно первой оценки, дополнительный контроль может быть использован, как описано ниже, или дополнительное испытание может быть проведено для подтверждения первоначального отрицательного или положительного распознавания биомаркера или результата тестирования и признака преддеменции или деменции, если желательно, и установленный уровень биомаркера или результат тестирования можно использовать с этого времени в качестве исходного уровня. Указанный тип начального контроля часто используют в других клинических диагностических методиках, где “нормальный” уровень может различаться от индивидуума к индивидууму, и/или где получение аутологичного контрольного образца во время оценки является невозможным, нецелесообразным или неблагоприятным.
Другой способ установления исходного уровня биомаркера или результата тестирования заключается в установлении начального уровня количества, экспрессии или биологической активности биомаркера в контрольных образцах или результата тестирования контрольных субъектов, где контрольные субъекты предпочтительно представляют собой популяцию подобранных индивидуумов. Предпочтительно, что контрольные образцы представляют собой такой же тип образца, как тип образца, подвергаемого оценке относительно количества, экспрессии или биологической активности биомаркера. Согласно настоящему изобретению, фраза “подобранные индивидуумы” относится к подбору контрольных индивидуумов на основании одной или более характеристик, которые являются подходящими для параметра, типа клетки, тканевого образца или образца жидкости организма, который подвергают оценке. Например, контрольные индивидуумы могут соответствовать индивидууму, которого подвергают оценке, исходя из пола, возраста, расы или любого значимого биологического или социологического фактора, который может влиять на исходные данные для контрольных индивидуумов и индивидуума (например, предсуществующие состояния, потребление отдельных веществ, уровни других биологических или физиологических факторов). Например, уровни приведенных в описании биомаркеров в крови нормального индивидуума могут быть выше у индивидуумов данной классификации (например, пожилой против персоны в возрасте от 13 до 19 лет, женщина против мужчины). Для того, чтобы установить контрольный или исходный уровень количества, экспрессии или биологической активности биомаркера, образцы от числа подобранных индивидуумов получают и оценивают относительно количества, экспрессии или биологической активности биомаркера. Число подобранных индивидуумов, от которых должны быть получены контрольные образцы для установления соответствующего контрольного уровня (например, популяция), могут определить специалисты в данной области, но они должны быть статистически подходящими для установления соответствующего исходного уровня для сравнения с индивидуумом, которого подвергают оценке (т.е. испытуемого индивидуума). Величины, полученные для контрольных образцов, статистически обрабатывают, чтобы установить соответствующий исходный уровень способами, стандартными в данной области для установления таких величин.
Исходный уровень, такой как описанный выше, может быть отрицательным контрольным исходным уровнем, таким как исходный уровень, установленный для популяции, вероятно, нормальных контрольных индивидуумов. Альтернативно, как обсуждалось выше, такой исходный уровень может быть установлен для популяции индивидуумов, которые положительно диагностированы как имеющие аномальные уровни биомаркеров, дисфункцию биомаркера, синаптическую дисфункцию, ухудшение функции мозга, демиелинизацию и/или деменцию или преддеменцию, так что один или более исходных уровней может быть установлено для оценки индивидуума. Уровень количества, экспрессии или биологической активности биомаркера в образце индивидуума или результат тестирования индивидуума затем сравнивают с каждым из исходных уровней, чтобы определить, к какому типу исходного (положительного или отрицательного) уровня уровень биомаркера или результат тестирования индивидуума статистически приближается. Следует признать, что данный образец индивидуума может попадать между исходными уровнями, так что наилучшим диагнозом является выявление у индивидуума возможного начала дисфункции, указывающей на необходимость добавки, по меньшей мере, какой-нибудь жирной кислоты, и у индивидуума, возможно, заболевание перерастает в более высокую стадию. Целью изобретения является реверсирование, коррекция или компенсация такого прогрессирующего заболевания.
Специалисту в данной области следует иметь в виду, что исходный уровень не нужно устанавливать для каждого анализа или определения, поскольку анализ или определение осуществляют недостаточно, исходный уровень может быть установлен путем обращения к форме хранимой информации относительно предварительно определенного исходного уровня для данного контрольного образца, как например, исходный уровень, установленный любым из описанных выше способов. Такая форма хранимой информации может включать, например, но не ограничивается ими, ссылку на карту, распечатку файла или электронную картотеку данных популяции или индивидуума относительно “нормальных” (отрицательный контроль) или положительных контролей; медицинскую карту индивидуума с записью данных предварительных оценок; или любой другой источник данных относительно исходного уровня экспрессии или активности биомаркера или результата тестирования, который используют для индивидуума, которого диагностируют или характеризуют.
При сравнении результатов тестирования индивидуума или исследования образца от индивидуума с начальным контролем(ями), можно определить, наблюдается ли в испытуемом образце измеряемое уменьшение или увеличение количества, экспрессии или биологической активности биомаркера над исходным уровнем, или имеется ли статистически значимое различие между тестируемым или исходным уровнем. После данной стадии может быть выполнена конечная стадия постановки диагноза, лечения индивидуума, контролирования индивидуума или определения дальнейшего лечения индивидуума.
Обнаружение повышенного уровня количества, экспрессии или биологической активности АРР, Аβ-пептида, тау-белка, фосфорилированного тау-белка и/или PS1, или обнаружение усиленного превращения АРР в более токсичные, различные по размеру формы Аβ в образце, который подвергают оценке (т.е. испытуемый образец), или выявление усиления нарушения или отсутствия нарушения синаптической дисфункции, обнаружение расстройства функции мозга, демиелинизации и/или симптома деменции, или обнаружение снижения количества PUFA омега-3 или омега-6, по сравнению с исходным уровнем, обычно указывает на то, что, как сравнивают с исходным уровнем образца или с начальным результатом, индивидуум может иметь повышенную восприимчивость к заболеваниям или состояниям, приведенным в описании (например, деменция), или индивидуум страдает от таких заболеваний или состояний. Если исходный образец является предварительным образцом от индивидуума или характеристикой индивидуума (или контроль популяции) и является показателем положительного диагноза деменции или преддеменции у индивидуума, обнаружение повышенного количества, экспрессии или биологической активности биомаркера в образце или выявление усиления нарушения или отсутствия нарушения синаптической дисфункции, обнаружение расстройства функции мозга, демиелинизации и/или деменции, или выявление снижения PUFA омега-3 или омега-6, как сравнивают с исходным уровнем, указывает на то, что состояние индивидуума ухудшается, а не улучшается, и что лечение должно быть подвергнуто повторной оценке или скорректировано.
Обнаружение нормального или благоприятного количества, экспрессии или биологической активности АРР, Аβ-пептида, тау-белка, фосфорилированного тау-белка и/или PS1, определение превращения АРР в менее токсичную форму Аβ в образце, который подвергают оценке (т.е. испытуемый образец), или обнаружение снижения синаптической дисфункции или отсутствия синаптической дисфункции, снижения нарушения функции головного мозга или отсутствия нарушения функции головного мозга, снижения демиелинизации и/или ослабления симптомов деменции или отсутствия симптомов деменции, или обнаружение нормальных или повышенных уровней PUFA омега-3 или омега-6, по сравнению с исходным уровнем, указывает на то, что по сравнению с исходным образцом индивидуум испытывает пониженную восприимчивость к любому из заболеваний или состояний, приведенных в описании, или не имеет таких заболеваний или состояний. Если исходный образец является предварительным образцом от индивидуума (или от контроля популяции) и свидетельствует в пользу положительного диагноза деменции или преддеменции у индивидуума (т.е. положительный контроль), получение такого результата в образце или от индивидуума, по сравнению с исходным уровнем, указывает на то, что у индивидуума наблюдается положительная динамика заболеваний или состояний, обсуждаемых в описании.
И, наконец, выявление экспрессии или активности биомаркера, или установление результата тестирования, которые статистически значимо не отличаются от количества, экспрессии или биологической активности биомаркера или результата тестирования исходного образца, указывает на то, что в сравнении с исходным образцом никакой разницы в заболеваниях или состояниях, приведенных в описании, не показано у индивидуума. Если исходный образец является предварительным образцом от индивидуума (или от контроля популяции) и свидетельствует в пользу положительного диагноза деменции или преддеменции у индивидуума (т.е. положительный контроль), обнаружение экспрессии или активности биомаркера или установление результата тестирования, которые статистически значимо не отличаются от исходного уровня, указывает на то, что у индивидуума не изменяется состояние, которое мог бы предположить клиницист, что предписанное в настоящее время лечение, например, оказывается неэффективным при контролировании состояния.
Для того, чтобы выявить изменения по сравнению с исходным уровнем экспрессии или активности биомаркера или результата тестирования, уровень экспрессии или активности биомаркера или величину результата тестирования изменяют по сравнению с установленным исходным уровнем на количество, которое является статистически значимым (т.е. по меньшей мере, с 95% доверительным уровнем, или р<0,05). Предпочтительно, обнаружение, по меньшей мере, приблизительно 5% изменения и более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 10% изменения, и более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 20% изменения, и более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 30% изменения, и более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 40% изменения, и более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 50% изменения количества, экспрессии или биологической активности биомаркера в образце или в величине результата тестирования, в сравнении с исходным уровнем, приводит к выявлению разницы между испытуемым образцом и исходным образцом. В одном варианте осуществления изобретения 1,5-кратное изменение количества, экспрессии или биологической активности биомаркера в образце или в величине результата тестирования по сравнению с исходным образцом, и более предпочтительно, обнаружение, по меньшей мере, приблизительно 3-кратного изменения, и более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 6-кратного изменения, и даже более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 12-кратного изменения, и даже более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 24-кратного изменения, свидетельствует о значительном изменении экспрессии или активности биомаркера или величины результата тестирования, по сравнению с исходным образцом.
Способы согласно настоящему изобретению включают контролирование влияния введения PUFA на уровни АРР, Аβ-пептида, тау-белка, фосфорилированного тау-белка, белка PS1 и, в некоторых вариантах осуществления изобретения, на уровни PUFA омега-3 и/или PUFA омега-6 у индивидуума, по меньшей мере, один раз после стадии введения. Влияние может быть оценено, исходя из изменения в количестве и/или биологической активности одного или более биомаркеров, по положительной динамике умеренного когнитивного расстройства, положительной динамике возрастного когнитивного расстройства, и/или любыми другими способами, известными в данной области и обсуждаемыми более подробно выше. Способ может также, необязательно, включать регулирование введения PUFA индивидууму при последующем лечении, основанном на результатах контролирования эффективности лечения.
Способы диагностики и текущего контроля согласно настоящему изобретению имеют несколько различных использований. Во-первых, способ может быть использован для диагностики и контроля подгруппы индивидуумов, у которых обнаруживается чрезмерная экспрессия или дисфункция АРР, Аβ-пептида, тау-белка, фосфорилированного тау-белка и/или PS1 в большем объединении индивидуумов, имеющих данное состояние (например, неврологическое заболевание), для того, чтобы идентифицировать тех индивидуумов, кому способы согласно настоящему изобретению, наиболее вероятно, приносят пользу. Действительно, полагают, что способ согласно настоящему изобретению является эффективным на ранних стадиях развития деменции и преддеменции, до того, как явные симптомы снижения познавательной способности могут проявиться. Также, способ может быть использован для диагностики и контроля индивидуумов путем идентификации индивидуумов, имеющих недостаток PUFA (например, недостаток DHA, DPAn-6 и/или ARA), или индивидуумов с вероятностью недостатка PUFA. Индивидуум может быть индивидуумом, который, как подозревают, имеет недостаток PUFA, или индивидуумом, который является, предположительно, здоровым, но который подвергают стандартной проверке на недостаток PUFA. Также, индивидуум может быть индивидуумом, который предварительно был диагностирован как имеющий недостаток PUFA и подвергался лечению и который теперь находится под обычным наблюдением за возможно повторяющимся недостатком PUFA.
Термины “ставить диагноз”, “диагноз”, “диагностирование” и их варианты относятся к распознаванию заболевания или состояния на основании его признаков и симптомов. Употребляемый в описании термин “положительный диагноз” указывает на то, что заболевание или состояние, или вероятность развития заболевания или состояния были обнаружены. В противоположность, “отрицательный диагноз” указывает на то, что заболевание или состояние, или вероятность развития заболевания или состояния не были обнаружены. В случае положительно диагноза, индивидууму может быть предписано лечение для полного изменения или элиминирования признаков деменции или преддеменции, недостатка PUFA и/или аномального количества, экспрессии и/или активности АРР, Аβ-пептида, тау-белка, фосфорилированного тау-белка и/или PS1. В случае отрицательного диагноза (т.е. отрицательная оценка) индивидууму обычно не предписывают никакого лечения или могут назначить небольшое количество добавки PUFA, но могут провести повторную оценку при одной или более временных точках в будущем, чтобы вновь установить уровень биомаркеров или признаки синаптической дисфункции, снижения функции головного мозга, демиелинизации и/или симптома деменции. Исходные уровни для этого отдельного варианта способа оценки согласно настоящему изобретению обычно основаны на уровнях в “нормальном” или “здоровом” образце, взятом из такого же источника организма, как и испытуемый образец (т.е. такая же ткань, клетки или жидкость организма), как обсуждается подробно ниже.
Способ согласно изобретению также может быть использован для контролирования успешного лечения или отсутствия успешного лечения, деменции или преддеменции или ее симптома или признака (например, уровень биомаркера, как указано в описании) у индивидуума, которому был поставлен отрицательный диагноз относительно описанных состояний. Указанный вариант осуществления изобретения позволяет врачу или медицинскому работнику контролировать успешность или отсутствие успешности лечения (например, добавка PUFA), которое индивидуум получает для данного состояния, и может помочь врачу определить, следует ли изменить лечение (например, следует ли добавку PUFA увеличить, уменьшить или, в основном, оставить такой же). В одном варианте осуществления изобретения способ включает дополнительные стадии осуществления другого лечения индивидуума, которое применяют для лечения и/или предотвращения деменции или преддеменции или ее симптомов.
Введение PUFA согласно настоящему изобретению для регуляции уровня биомаркера или уровня PUFA в ткани, или для задержки начала/развития или для ослабления тяжести деменции или преддеменции или симптома или состояния, связанного с деменцией, должно принести некоторую пользу (например, пользу в терапии или пользу общему здоровью) здоровым, нормальным индивидуумам, а также индивидуумам, у которых может развиваться деменция или преддеменция, или тем, кто страдает от деменции или преддеменции. Как таковая, терапевтическая полезность необязательно приводит к излечиванию от отдельной болезни или состояния, но скорее, предпочтительно достигает результата, который обычно включает облегчение заболевания или состояния, устранение заболевания или состояния, ослабление симптома, связанного с заболеванием или состоянием, задержку начала или развития симптома заболевания, состояния или симптома, предотвращение или облегчение вторичного заболевания или состояния, являющегося результатом распространенности первичного заболевания или состояния, и/или предотвращение заболевания или состояния. Употребляемая в описании фраза “защита от заболевания” относится к уменьшению симптомов заболевания или состояния, снижению распространенности заболевания или состояния, задержке начала или развития заболевания или состояний и/или снижению тяжести заболевания или состояния. Как таковая, защита индивидуума от заболевания включает как предотвращение или замедление или снижение распространенности заболевания (профилактическое лечение), так и лечение индивидуума, который страдает от заболевания (терапевтическое лечение). Благоприятный эффект может легко оценить специалист в данной области и/или опытный клиницист, который лечит индивидуума. Термин “заболевание” относится к любому отклонению от нормального состояния здоровья млекопитающего и включает состояние, когда присутствуют симптомы заболевания, а также состояния, когда отклонение существует, но симптомы еще не проявляются.
Многие варианты осуществления настоящего изобретения включают стадию введения индивидууму количества одной или более полиненасыщенных жирных кислот (PUFA). Полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA) являются важными компонентами мембранных липидов в большинстве эукариот (Lauritzen et al., Prog. Lipid Res. 40 1 (2001); McConn et al., Plant J. 15, 521 (1998)) и являются предшественниками определенных гормонов и сигнальных молекул (Heller et al., Drugs 55, 487 (1998); Creelman et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 355 (1997)).
цис
Согласно настоящему изобретению, PUFA представляют собой жирные кислоты с длиной углеродной цепи, состоящей, по меньшей мере, из 16 углеродов, и более предпочтительно, по меньшей мере, из 18 углеродов, и более предпочтительно, по меньшей мере, из 20 углеродов, и более предпочтительно из 22 и более углеродов, по меньшей мере, с 3 или более двойными связями, и предпочтительно с 4 или более, и более предпочтительно с 5 или более, и даже более предпочтительно с 6 или более двойными связями, где все двойные связи находятся в -конфигурации. Ссылка в описании на длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты (LCPUFA) особенно относится к жирным кислотам из 18 и более углеродов в цепи, и особенно из 20 и более углеродов в цепи, содержащей 3 или более двойных связей. LCPUFA серии омега-6 включают гамма-линоленовую кислоту (С18:3), дигомо-гаммалиноленовую кислоту (С20:3n-6), арахидоновую кислоту (С20:4n-6), адреновую кислоту (также названную докозатетраеновой кислотой или DTA) (C22:4n-6) и докозапентаеновую кислоту (С22:5n-6). LCPUFA серии омега-3 включают альфа-линоленовую кислоту (С18:3), эйкозатриеновую кислоту (С20:3n-3), эйкозатетраеновую кислоту (C20:4n-3), эйкозапентаеновую кислоту (C20:5n-3), докозапентаеновую кислоту (C22:5n-3) и докозагексаеновую кислоту (C22:6n-3). LCPUFA также включают жирные кислоты с более чем 22 углеродами и 4 или более двойными связями, включая, но не ограничиваясь, C28:8(n-3).
Употребляемый в описании термин “липид” включает фосфолипиды (PL); свободные жирные кислоты; сложные эфиры жирных кислот; триацилглицерины (TAG); диацилглицериды; моноацилглицериды; фосфатиды; воски (сложные эфиры спиртов и жирных кислот); стерины и сложные эфиры стеринов; каротиноиды; ксантофиллы (например, оксикаротиноиды); углеводороды; и другие липиды, известные специалистам в данной области. Термины “полиненасыщенная жирная кислота” и “PUFA” включают не только свободную форму жирной кислоты, но другие формы также, такие как TAG-форма и PL-форма.
В одном варианте осуществления изобретения смеси жирных кислот и, особенно, жирных кислот омега-3 и жирных кислот омега-6, могут быть использованы в способах согласно изобретению. Предпочтительные PUFA включают полиненасыщенные жирные кислоты омега-3 и омега-6 с тремя или более двойными связями. PUFA омега-3 являются полиэтиленовыми жирными кислотами, в которых последняя этиленовая связь отделена от конечной метильной группы жирной кислоты тремя углеродами, и они включают, например, докозагексаеновую кислоту С22:6(n-3) (DHA) и омега-3 докозапентаеновую кислоту С22:5(n-3) (DPAn-3). PUFA омега-6 являются полиэтиленовыми жирными кислотами, в которых последняя этиленовая связь отделена от конечной метильной группы жирной кислоты шестью углеродами, и включают, например, арахидоновую кислоту C20:4(n-6) (ARA); C22:4(n-6), омега-6 докозапентаеновую кислоту C22:5(n-6) (DPAn-6); и дигомогаммалиноленовую кислоту C20:3(n-6) (дигомо-GLA).
Любой источник PUFA может быть использован в композициях и способах согласно настоящему изобретению, включая, например, животные, растительные и микробные источники. Предпочтительными источниками полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) могут быть любые источники PUFA, которые являются подходящими для их использования в настоящем изобретении. Предпочтительные источники полиненасыщенных жирных кислот включают источники биомассы, такие как животные, растительные и/или микробные источники.
Примеры животных источников включают водяных животных (например, рыба, морские млекопитающие, ракообразные, коловратки и т.д.) и липиды, экстрагируемые из животных тканей (например, головной мозг, печень, глаза и т.д.). Примеры растительных источников включают макроводоросли, семена льна, семена рапса, кукурузу, энотеру, сою и бурачник. Примеры микроорганизмов включают микроводоросли, протисты, бактерии и грибы (включая дрожжи). Использование источника микроорганизмов, такого как микроводоросли, может дать органолептические преимущества, т.е. жирные кислоты из источника микроорганизмов могут не иметь рыбного привкуса и запаха, которые имеют жирные кислоты из рыбного источника. Точнее, источник длинноцепочечных жирных кислот включает микроводоросли или масла из микроводорослей.
Mortierella
Stramenopiles
Crypthecodinium
Thraustochytriales
Mortierella
Thraustochytrium
Schizochytrium
Ulkenia
Mortierella schmuckeri
Mortierella alpina
Crypthecodinium cohnii
Предпочтительно, когда микроорганизмы являются источником длинноцепочечных жирных кислот, тогда микроорганизмы культивируют в сбраживаемой среде в ферментере. Альтернативно, микроорганизмы можно культивировать фотосинтетическим путем в фотобиореакторе или искусственном водоеме. Предпочтительно, микроорганизмы являются богатыми липидами микроорганизмами, более предпочтительно, микроорганизмы выбирают из группы, состоящей из микроводорослей, бактерий, грибов и протист, более предпочтительно, микроорганизмы выбирают из группы, состоящей из золотистых водорослей, зеленых водорослей, динофлагеллятов, дрожжей, грибов рода  и . Предпочтительно, микроорганизмы включают микроорганизмы рода  и отряд  и мицелиальные грибы рода , и более предпочтительно, микроорганизмы выбирают из рода , ,  или их смеси, более предпочтительно, микроорганизмы выбирают из группы, состоящей из микроорганизмов с известными характеристиками, входящих в коллекцию под номерами АТСС номер 20888, АТСС номер 20889, АТСС номер 20890, АТСС номер 20891 и АТСС номер 20892, штаммов  и , штаммов , мутантных штаммов, произведенных из любых перечисленных выше организмов, или их смесей. Информацию относительно таких водорослей можно найти в патентах США № 5407957, 5130242 и 5340594, которые включены в описании посредством ссылки во всей полноте.
Thraustochytriales
Thraustochytrids
Labyrinthulales
Labyrinthulids
Thraustochytrids
Labyrinthulids
Labyrinthulaceae
Thraustochytriасеае
Labyrinthulaceae
Stramenopile
Labyrinthulaceae
labyrinthulids
labyrinthula
labyrinthuloides
Thraustochytriaceae
thraustochytrids
Labyrinthulaceae
Thraustochytriales
Labyrinthulales
Labyrinthulales
Thraustochytriales
Labyrinthulomycota
Thraustochytriales
Thraustochytriaceae
Labyrinthulales
Labyrinthulaceae
Согласно изобретению, термин “морские микроводоросли” включает микроводоросли, которые в природе могут обитать в морской среде или среде, содержащей соль. Морские микроводоросли, как упоминают в описании, включают микроорганизмы отряда  (также названные в описании как ) и микроорганизмы отряда  (также названные как ). Следует признать, что на период данного изобретения, проверка таксономии  привела к размещению рода  в семейство  и подтвердила размещение двух семейств  и  в линию . Следует заметить, что  иногда называют  или , или , и  в большинстве случаев называют . Члены семейства  ранее рассматривали как члены отряда , а теперь семейство рассматривают как член отряда , и оба организма  и рассматривают как члены типа . Таким образом, как употребляют в описании, термин “Thraustochytrid” относится к любым членам отряда , который включает семейство , и термин “Labyrinthulid” относится к любому члену отряда , который включает семейство .
Thraustochytrids (thraustochytrids)
Thraustochytrids
Thraustochytrids
Thraustochytriales
Thraustochytriaceae
Thraustochytrium
arudimentale, aureum, benthicola, globosum, kinnei, motivum, multirudimentale, pachydermum, proliferum, roseum, striatum
Ulkenia
Thraustochytrium
amoeboidea, kerguelensis, minuta, profunda, radiata, sailens, sarkariana, schizochytrops, visurgensis, yorkensis), Schizochytrium
aggregatum, limnaceum, mangrovei, minutum, octosporum), Japonochytrium
marinum
Aplanochytrium
haliotidis, kerguelensis, profunda, stocchinoi), Althornia
crouchii
Elina
marisalba, sinorifica
Разработки в данной области привели к часто повторяющимся пересмотрам систематики микроорганизмов . Теоретики систематики микроорганизмов обычно помещают  с водорослями или подобными водорослям протистами. Однако вследствие изменчивости таксономии, в описании настоящего изобретения лучше рассматривать описанные в нем штаммы как , чтобы включить следующие организмы: отряд: ; семейство: ; род:  (вид: sp., ),  (ранее рассматриваемый некоторыми как член ) (вид: sp.,  (вид: sp.,  (вид: sp., ),  (вид: sp.,  (вид: sp., ), или  (вид: sp., ).
Labyrinthulales
Labyrinthulaceae
Labyrinthula
algeriensis, coenocystis, chattonii, macrocystis, macrocystis atlantica, macrocystis macrocystis, marina, minuta, roscoffensis, valkanovii, vitallina, vitеllina pacifica, vitellina vitellina, zopfii), Labyrinthuloides
haliotidis, yorkensis
Labyrinthomyxa
marina
Diplophrys
archeri
Pyrrhosorus
marinus
Sorodiplophrys
stercorea
Chlamydomyxa
Labyrinthuloides, montana
Pyrrhosorus
Sorodiplophrys
Chlamydomyxa
Штаммы, описанные в настоящем изобретении, как Labyrinthulids, включают следующие организмы: отряд: , семейство: , род:  (вид: sp.,  (вид: sp., ),  (вид: sp., ),  (вид: sp., ),  (вид: sp., ), (вид: sp., ) или  (вид: sp., ) (хотя в настоящее время не существует единодушия относительно таксономического размещения ,  или ).
Точнее, PUFA, используемая в настоящем изобретении, может включать докозагексаеновую кислоту (DHA; по меньшей мере, приблизительно 10, приблизительно 20, приблизительно 30 или приблизительно 35% масс.), докозапентаеновую кислоту (DPA, и предпочтительно DPAn-6; по меньшей мере, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15 или приблизительно 20% масс.) и/или арахидоновую кислоту (ARA; по меньшей мере, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 40 или приблизительно 50% масс.). Другие PUFA могут включать эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА). PUFA включают свободные жирные кислоты и соединения, содержащие остатки PUFA, включая фосфолипиды; сложные эфиры жирных кислот; триацилглицерины; диацилглицериды; моноацилглицериды; лизофосфолипиды; фосфатиды, и т.д.
Источники фосфолипидов включают яйца домашних птиц, обогащенные яйца домашних птиц, водоросли, рыбу, икру рыбы и генетически модифицированные (GE) семена растений или микроводоросли. Особенно предпочтительные источники PUFA, включающие DHA, включают, но не ограничиваются перечисленными источниками, рыбий жир, морские микроводоросли и растительные масла, включая масла из генетически модифицированных микроводорослей и растений. Предпочтительные предшественники PUFA, DHA, включают, но не ограничиваются ими, α-линоленовую кислоту (LNA); эйкозапентаеновую кислоту (EPA); докозапентаеновую кислоту (DPA); смеси LNA, EPA и/или DPA.
Согласно настоящему изобретению, длинноцепочечные жирные кислоты, которые используют в добавках и терапевтических композициях, описанных в настоящем изобретении, находятся в разных видах. Например, такие виды включают, но не ограничиваются перечисленными видами, высокоочищенное масло водорослей, содержащее PUFA, растительное масло, содержащее PUFA, содержащее PUFA триглицеридное масло, содержащие PUFA фосфолипиды, комбинацию белка и фосфолипидов, содержащих PUFA, содержащие PUFA высушенные морские водоросли, содержащие PUFA сфинголипиды, сложные эфиры PUFA, свободную жирную кислоту, конъюгат PUFA с другой биоактивной молекулой и их комбинацию. Длинноцепочечные жирные кислоты могут быть получены в количествах и/или отношениях, которые отличаются от количеств или отношений, имеющихся в природном источнике жирных кислот, путем смешивания, очистки, обогащения и генетической модификации источника. Биоактивные молекулы могут включать любую подходящую молекулу, включающую, но не ограниченную ими, белок, аминокислоту (например, природные аминокислоты, такие как DHA-глицин, DHA-лизин, или аналоги аминокислот), лекарственное средство и углевод. Перечисленные в описании виды привносят пластичность при приготовлении пищевых продуктов с высоким сенсорным качеством, биологически активных добавок и фармацевтических средств. Например, доступные в настоящее время масла из микроводорослей содержат около 40% DHA. Указанные масла можно превращать в сложные эфиры и очищать способами, такими как молекулярная перегонка, чтобы повысить содержание DHA до 70% и выше, получая концентрированный продукт, который может быть использован в продуктах с ограниченным размером, т.е. продуктах в виде маленьких порций, таких как продукты для детского питания или биологически активные добавки с ограниченным подходящим размером шариков. Использование комбинаций масла и фосфолипидов позволяет повысить устойчивость к окислению и, следовательно, сенсорное и питательное качество масла из микроводорослей. Разрушение при окислении ухудшает питательное и сенсорное качество PUFA, содержащихся в триглицеридах. При использовании фосфолипидов желаемые PUFA оказываются более стабильными и жирные кислоты являются более биодоступными, чем при использовании триглицеридов. Хотя масла из микроорганизмов являются более устойчивыми, чем обычный рыбий жир, оба подвергаются окислительной деградации. Окислительная деградация снижает питательную ценность этих жирных кислот. Кроме того, окисленные жирные кислоты, полагают, являются вредными для здоровья. Использование фосфолипид DHA/DPA/ARA/дигомо-GLA, более устойчивой системы жирных кислот, способствует повышению здоровья и питательной ценности указанных добавок. Также, фосфолипиды легче смешивать в водных системах, чем триглицеридные масла. Использование комбинаций белка и фосфолипидов способствует приготовлению более питательных комбинированных пищевых продуктов, поскольку в них присутствует как белок, так и жирные кислоты. Использование высушенных морских микроводорослей способствует устойчивости содержащегося в них масла к высокой температуре и является благоприятным обстоятельством для приготовления пищевых продуктов, выпекаемых при высокой температуре.
В одном варианте осуществления изобретения источник желаемых фосфолипидов включает очищенные фосфолипиды из яиц, растительных масел и органов животных, получаемые способом Friolex и способом экстракции фосфолипидов (РЕР) (или сходными способами) для приготовления пищевых добавок, богатых DHA, DPA, ARA и/или дигомо-GLA. Способы Friolex и PEP и сходные способы более детально описаны в РСТ патенте № РСТ/IB01/00841, озаглавленном “Способ фракционирования нефти и природных сырых материалов, содержащих полярные липиды”, зарегистрированном 12 апреля 2001 года, опубликованном как международная заявка WO 01/76715 18 октября 2001 года; патенте № РСТ/IB01/00963, озаглавленном “Способ фракционирования нефти и природных сырых материалов, содержащих полярные липиды, с использованием спирта и центрифугирования”, зарегистрированном 12 апреля 2001 года, опубликованном как международная заявка WO 01/76385 18 октября 2001 года; и патенте № РСТ/DE95/01065, озаглавленном “Способ экстрагирования природных продуктов, которые не являются водорастворимыми, из смесей природных веществ посредством центробежной силы”, зарегистрированном 12 августа 1995 года, опубликованном как международная заявка WO 96/05278 22 февраля 1996 года, каждая из которых включена в описание посредством ссылки во всей полноте.
Предпочтительно, высокоочищенное масло из водорослей, содержащее желаемую PUFA в триглицеридах, триглицеридное масло, комбинированное с фосфолипидом, фосфолипид только, комбинация белка и фосфолипида или высушенные морские микроводоросли содержат остатки жирных кислот, выбранные из группы, составленной из DHA, и/или DPAn-3, и/или DPAn-6, и/или ARA, и/или дигомо-GLA. Более предпочтительно, высокоочищенное масло из водорослей, содержащее желаемую PUFA в триглицеридах, триглицеридное масло, комбинированное с фосфолипидом, фосфолипид только, комбинация белка и фосфолипида или высушенные морские микроводоросли содержат остатки жирных кислот, выбранные из группы, составленной из DHA, ARA и/или DPAn-6. Более предпочтительно, высокоочищенное масло из водорослей, содержащее желаемую PUFA в триглицеридах, триглицеридное масло, комбинированное с фосфолипидом, фосфолипид только, комбинация белка и фосфолипида или высушенные морские микроводоросли содержат остатки жирных кислот, выбранные из группы, составленной из DHA и DPAn-6. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения высокоочищенное масло из водорослей, содержащее желаемую PUFA в триглицеридах, триглицеридное масло, комбинированное с фосфолипидом, фосфолипид только, комбинация белка и фосфолипида или высушенные морские микроводоросли содержат остатки жирной кислоты DHA. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения высокоочищенное масло из водорослей, содержащее желаемую PUFA в триглицеридах, триглицеридное масло, комбинированное с фосфолипидом, фосфолипид только, комбинация белка и фосфолипида или высушенные морские микроводоросли содержат остатки жирной кислоты DPAn-6.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения PUFA включает комбинацию DPAn-6 и DHA. Автор изобретения обнаружил, что данная комбинация PUFA оказывает удивительное, неожиданное благоприятное воздействие по сравнению с введением только DHA. Неожиданным является то, что комбинация DPAn-6 и DHA, в частности, может оказать какое-либо благоприятное воздействие по сравнению с введением только DHA или DHA в комбинации с другими омега-6 PUFA. Поразительный результат возникает вследствие того, что роль DPAn-6 в тканях возрастает при потреблении пищи с недостаточным содержанием DHA. Повышение DPAn-6 в тканях DHA-дефицитных животных часто связано с субоптимальной тканевой функцией. В примерах настоящего изобретения у животных с достаточным, определенным заранее количеством DHA в пище в комбинации с DPAn-6 наблюдали значительно повышенные уровни DPAn-6 в ткани и превосходящие уровни ARA в сравнении с животными, которым давали только DHA. У животных с более высокими уровнями DHA и ARA в крови наблюдалась тенденция к значительному снижению PS-1, белка, ассоциированного с расщеплением АРР с образованием токсичных амилоидных пептидов. Кроме того, у животных с достаточным, определенным заранее количеством DHA в пище в комбинации с DPAn-6 наблюдали сниженные уровни фосфорилированного тау-белка, который ассоциирован с развитием нейрофибриллярных клубков у пациентов с деменцией.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения PUFA представляет собой масло или препарат, содержащий приблизительно 30% или более, приблизительно 35% или более, приблизительно 40% или более, приблизительно 45% или более, приблизительно 50% или более, приблизительно 55% или более, приблизительно 60% или более, приблизительно 65% или более, приблизительно 70% или более, приблизительно 75% или более или приблизительно 80% или более комбинации DPAn-6 и DHA. Предпочтительно, отношение DHA к DPAn-6 в масле или препарате составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 10:1, или любое отношение между 1:1 и 10:1.
В другом варианте осуществления изобретения PUFA включает комбинацию ARA и DHA. Кроме того, автор изобретения обнаружил, что комбинация DHA и ARA оказывает удивительное, неожиданное благоприятное воздействие по сравнению с введением только DHA. Неожиданным является то, что комбинация ARA и DHA, в частности, может оказать какое-либо благоприятное воздействие по сравнению с введением только DHA или DHA в комбинации с другими омега-6 PUFA, которые не включают ARA. Полученный результат является поразительным, так как в примерах настоящего изобретения у животных с более высокими уровнями DHA и ARA в крови наблюдали тенденцию к более значительному снижению PS-1, белка, ассоциированного с расщеплением АРР с образованием токсичных амилоидных пептидов.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения PUFA представляет собой масло или препарат, содержащий приблизительно 30% или более, приблизительно 35% или более, приблизительно 40% или более, приблизительно 45% или более, приблизительно 50% или более, приблизительно 55% или более, приблизительно 60% или более, приблизительно 65% или более, приблизительно 70% или более, приблизительно 75% или более или приблизительно 80% или более комбинации ARA и DHA. Предпочтительно, отношение DHA к ARA составляет от приблизительно 1:1 до 10:1 или любое отношение между 1:1 и 10:1.
В другом варианте осуществления изобретения PUFA включает комбинацию DHA, ARA и DPAn-6, которая будет оказывать поразительный, неожиданный благоприятный эффект по сравнению с введением только DHA по причинам, описанным выше. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения PUFA представляет собой масло или препарат, содержащий приблизительно 30% или более, приблизительно 35% или более, приблизительно 40% или более, приблизительно 45% или более, приблизительно 50% или более, приблизительно 55% или более, приблизительно 60% или более, приблизительно 65% или более, приблизительно 70% или более, приблизительно 75% или более или приблизительно 80% или более комбинации DPAn-6, ARA и DHA. Предпочтительно, отношение DHA к ARA к DPAn-6 составляет от приблизительно 1:1:1 до 10:1:1 или любое отношение между 1:1:1 и 10:1:1.
Предпочтительно, суточное потребление PUFA колеблется от приблизительно 0,025 мг до 15 граммов ежедневно, включая любую прибавку между ними, прибавки по 0,005 (например, 0,025, 0,030, 0,035 и т.д.). В одном варианте осуществления изобретения PUFA вводят в дозировке от приблизительно 0,05 мг PUFA на кг массы тела индивидуума до приблизительно 200 мг PUFA на кг массы тела индивидуума или выше, включая любую прибавку между ними, по 0,01 мг прибавки (например, 0,06 мг, 0,07 мг и т.д.), или в количествах, варьирующих приблизительно между 50 мг и 20000 мг на субъекта в день (например, пероральным путем, в виде инъекции, эмульсии или полного парентерального питания, местным, внутрибрюшинным, плацентарным, трансдермальным или внутричерепным способами доставки). В другом варианте осуществления изобретения PUFA вводят в дозировке от приблизительно 0,45 мг PUFA на кг массы тела в день до приблизительно 275 мг PUFA на кг массы тела в день. В другом варианте осуществления изобретения PUFA вводят в дозировке от приблизительно 0,025 мг PUFA на кг массы тела в день до приблизительно 275 мг PUFA на кг массы тела в день, включая любую прибавку между ними, по 0,005 прибавки (например, 0,025, 0,030, 0,035 и т.д.). В другом варианте осуществления изобретения PUFA вводят в дозировке от приблизительно 0,05 мг PUFA на кг массы тела в день до приблизительно 275 мг PUFA на кг массы тела в день. Обычная капсула пищевой добавки DHA, например, может быть приготовлена с дозой от 100 мг до 200 мг на капсулу, хотя изобретение не ограничивается формой капсулы или капсулами, содержащими указанные количества DHA или другой PUFA.
Хотя жирные кислоты, такие как DHA, могут быть введены местно или в виде инъекции, самым предпочтительным путем введения является пероральное введение. Предпочтительно, жирные кислоты (например, PUFA) вводят индивидууму в виде биологически активных добавок, и/или пищевых продуктов, и/или фармацевтических препаратов, и/или напитков, более предпочтительно в виде пищевых продуктов, напитков и/или биологически активных добавок, более предпочтительно, пищевых продуктов и напитков, более предпочтительно пищевых продуктов. Предпочтительным типом пищевого продукта является лечебный пищевой продукт (например, продукт, который находится в препарате, который должен быть потреблен или введен извне под наблюдением врача и который предназначен для специфической диетотерапии заболевания или состояния, для которого особые требования к питанию, основанные на общепризнанных научных принципах, устанавливают посредством медицинской экспертизы). Что касается младенцев, жирные кислоты вводят младенцам в виде детского питания, продуктов, которые используют при отлучении ребенка от груди, упакованного в банки детского питания и круп для младенцев.
Любые биологически приемлемые дозированные формы и их комбинации предназначены быть объектами изобретения. Примеры таких дозированных форм включают, без ограничения, жевательные таблетки, быстрорастворимые таблетки, шипучие таблетки, восстанавливаемые порошки, эликсиры, жидкости, растворы, суспензии, эмульсии, таблетки, многослойные таблетки, двухслойные таблетки, капсулы, мягкие желатиновые капсулы, твердые желатиновые капсулы, каплеты, пастилки, жевательные пастилки, шарики, порошки, гранулы, частицы, микрочастицы, диспергируемые гранулы, крахмальные облатки, средства для промываний, суппозитории, кремы, местные средства, ингаляции, аэрозольные ингаляции, пластыри, ингаляции частицами, импланты, депо-импланты, проглатываемые средства, инъецируемые средства, инфузионные средства, питательные батончики, фармацевтический препарат, состоящий из лекарственного средства, смешанного со сладким наполнителем, изделия из дробленого зерна, изделия из зерновых с покрытиями, пищевые продукты, пищевые продукты, богатые питательными веществами, функциональные продукты питания и их комбинации. Технологии приготовления указанных выше дозированных форм хорошо известны специалистам в данной области. Предпочтительно, пищу, обогащенную желаемой PUFA, выбирают из группы, включающей, но не ограниченной ими, хлебобулочные изделия и смеси; жевательную резинку; сухие завтраки; продукты из сыра; орехи и основанные на орехах продукты; желатин; пудинг и начинки; замороженные молочные продукты; молочные продукты; аналоги молочных продуктов; мягкую конфету; супы и смеси супов; закуски; обработанный фруктовый сок; обработанный овощной сок; жиры и масла; рыбные продукты; продукты из растительных белков; продукты из домашней птицы и мясные продукты.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает фармацевтическую композицию, содержащую количество, по меньшей мере, одной полиненасыщенной жирной кислоты (PUFA) омега-3 и/или омега-6 и/или ее предшественника или источника, по меньшей мере, с одним дополнительным терапевтическим соединением, для лечения или предотвращения деменции у индивидуума, который страдает от деменции или находится в группе риска развития деменции. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения PUFA включает DHA, DPAn-6 или комбинацию DPAn-6 и DHA, которая имеет, по меньшей мере, 30% или более комбинации DPAn-6 и DHA. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения PUFA включает комбинацию DPAn-6, ARA и DHA, которая имеет, по меньшей мере, 30% или более комбинации DPAn-6, ARA и DHA, где DPAn-6, ARA и DHA. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения PUFA включает комбинацию ARA и DHA, которая имеет, по меньшей мере, 30% или более комбинации ARA и DHA.
Терапевтические соединения, подходящие для использования согласно настоящему изобретению, включают любые терапевтические средства, которые могут быть использованы для защиты индивидуума от любого из состояний или заболеваний, обсуждаемых в описании, и могут включать белок, аминокислоту, лекарственное средство, другие натуральные продукты и углевод. Такие терапевтические соединения хорошо известны специалистам в данной области для лечения отдельного заболевания или состояния. Некоторые предпочтительные терапевтические соединения, охватывающие композицию или препарат согласно изобретению, включают, но не ограничиваются перечисленными соединениями, такрин (COGNEX); донепезил (ARICEPT); ривастигмин (EXELON); галантамин (REMINYL); мемантин (AKATINOL); неотропин; ноотропы; альфа-токоферол (витамин Е); селегелин (ELDEPRYL); нестероидные противовоспалительные средства (NSAID); гингко билоба; эстроген; ингибиторы β-секретазы; вакцины, включая липидные и основанные на липосомах вакцины, которые растворяют бляшки в головном мозге; комплекс витаминов группы В; блокаторы кальциевых каналов; ингибиторы HMG CoA-редуктазы; статины; поликозанолы; фибраты; клиохинол и другие природные продукты (например, куркумин, лигнаны, фитоэстрогены, фитостерины; ниацин и витаминные пищевые добавки).
Дозировки и способы введения хорошо известны в данной области и могут быть определены специалистом в данной области.
Настоящее изобретение также включает способ получения любой из приведенных выше композиций согласно изобретению, такой как комбинирование компонентов композиции в любом подходящем для доставки виде, используя любой подходящий способ, известный в данной области.
Согласно настоящему изобретению, способы настоящего изобретения являются подходящими для использования индивидуумом, который является членом класса позвоночных, млекопитающим, включая, без ограничения, приматов, крупный рогатый скот и домашних животных (например, комнатное животное). Обычно, индивидуумом должен быть человеческий индивидуум. Термин “индивидуум” может быть заменен термином “субъект” или “пациент” и относится к предмету протокола или способа согласно изобретению. Таким образом, индивидуум может включать здорового, нормального (не больного) индивидуума, а также индивидуума, который страдает от преддеменции или деменции или имеет симптом или признак преддеменции или деменции, или который находится в группе риска развития преддеменции или деменции или симптома или признака преддеменции или деменции, как указано в описании.
Следующие примеры приведены для иллюстрации изобретения, но они не предназначены ограничить объем настоящего изобретения.
Примеры
Следующие материалы и методы использовали в примерах, описанных ниже.
Создание мышей 3ХТg-AD
Создание мышей 3XTg-AD было описано в публикации Oddo, “Triple-transgenic Model of Alzheimer′s Disease with Plaques and Tangles: Intracellular Aβ and Synaptic Dysfunction”, Neuron, Vol. 39, 409-21 (2003). Кратко, cDNA человека, кодирующую АРР (изоформа 695), со шведской двойной мутацией (КМ670/671NL), субклонировали в экзоне 3 полигенного экспрессирующего кластера Thy1.2. cDNA человека, кодирующую тау-изоформу, содержащую четыре повтора без аминокислотных вставок (4R0N), с мутацией P30IL также субклонировали в полигенном экспрессирующем кластере Thy1.2. После переваривания рестриктазами для высвобождения трансгена каждый фрагмент очищали фракционированием в градиенте сахарозы с последующим диализом в течение ночи в инъекционном буфере (10 мМ трис [рН 7,5], 0,25 мМ EDTA). Равные молярные количества каждой конструкции вводили совместно в виде микроинъекций в пронуклеусы единственной клетки зародышей, взятых от гомозиготных мышей с мутацией PS1M146V (Guo et al., Arch. Pathol. Lab. Med. 125, 489-492 (2001). Мышей с мутацией гена белка PS1 первоначально создавали в качестве генетического фона гибрида 129/С57BL6. Трансгенных мышей идентифицировали посредством анализа саузерн-блоттинга хвостовой части DNA, как описано ранее (Sugarman et al. Natl. Acad. Sci. 99, 6334-6339 (2002)). Созданных мышей подвергали возвратному скрещиванию с родительскими мышами с введенным геном PS1.
Питание

TM

TM

Всем мышам, описанным в данных примерах, устанавливали экспериментальные диеты, начиная с 3-месячного возраста, чтобы завершить эксперимент к возрасту 6, 9 или 12 месяцев. Пищей служил корм для грызунов AIN-76, содержащий всего 5% жира. Заданная композиция жирной кислоты для каждой диеты описана в таблице 1 и получена путем смешивания комбинации растительных масел и масел из микроводорослей, как указано в таблице 2. Так как исследование вначале было выполнено “вслепую”, диета была с цветной маркировкой, как следующая, которая указана в некоторых таблицах и фигурах: голубая диета (кукуруза/соя); желтая диета (DHASCO; также известная как DHA-дополненная диета, или DHA-обогащенная диета); зеленая диета (DHA-S; также названная как DHA- и DPAn-6-дополненная диета или DHA- и DPAn-6-обогащенная диета), и красная диета (DHASCO/ARASCO; также названная как DHA- и ARA-дополненная диета или DHA- и ARA-обогащенная диета). Вместе диеты, содержащие DHASCO, DHA-S или DHASCO/ARASCO, могут быть рассмотрены как диеты, включающие масла из микроводоролей.

Crypthecodinium cohnii
докозагексаеновая кислота (22:6) (DHA) 40-45%
DHASCO представляет собой масло, полученное из , содержащее большие количества докозагексаеновой кислоты (DHA), и точнее, содержит приблизительные количества этих жирных кислот, как % от общего количества жирных кислот: миристиновая кислота (14:0) 10-20%; пальмитиновая кислота (16:0) 10-20%; пальмитолеиновая кислота (16:1) 0-2%; стеариновая кислота (18:0) 0-2%; олеиновая кислота (18:1) 10-30%; линолевая кислота (18:2) 0-5%; арахидоновая кислота (20:0) 0-1%; бегеновая кислота (22:0) 0-1%; докозапентаеновая кислота (22:5) 0-1%; ; ацетэруковая кислота (24:1) 0-2% и другие 0-3%.
TM

Schizochytrium
докозапентаеновая кислота (22:5, n-6) (DPAn-6) 16,28%; докозагексаеновая кислота (DHA) (22:6, n-3) 41,14%,
DHA-S (также раньше названная как DHASCO-S) является маслом, произведенным из Thraustochytrid,  sp., которое содержит большое количество DHA и также содержит докозапентаеновую кислоту (n-6) (DPAn-6) и, точнее, содержит следующие приблизительные количества этих жирных кислот как % от общего количества жирных кислот: миристиновая кислота (14:0) 8,71%; пальмитиновая кислота (16:0) 22,15%; стеариновая кислота (18:0) 0,66%; линолевая кислота (18:2) 0,46%; арахидоновая кислота (20:4) 0,52%; эйкозапентеновая кислота (20:5, n-3) 1,36%;  и другие 8%.

Mortierella alpine
арахидоновая кислота (20:4)
(ARA) 38-44%
ARASCOпредставляет собой масло, полученное из , которое содержит большое количество арахидоновой кислоты (ARA) и, точнее, содержит следующие приблизительные количества этих жирных кислот: миристиновая кислота (14:0) 0-2%; пальмитиновая кислота (16:0) 3-15%; пальмитолеиновая кислота (16:1) 0-2%; стеариновая кислота (18:0) 5-20%; олеиновая кислота (18:1) 5-38%; линолевая кислота (18:2) 4-15%; линоленовая кислота (18:3) 1-5%; арахиновая кислота (20:0) 0-1%; эйкозатриеновая кислота (20:3) 1-5%; ; бегеновая кислота (22:0) 0-3%; докозапентаеновая кислота (22:5) 0-3%, и лигноцериновая кислота (24:0) 0-3%.
Таблица 1
Содержание жирных кислот с n-3 и n-6 в диетах крыс
Жирная кислота
Испытуемое пищевое масло, граммы жирной кислоты/100 граммов корма
Кукуруза/соя (голубая диета)
DHASCO (желтая диета)
DHA™-S (зеленая диета)
DHASCO/ARASCO (красная диета)
<b>n-6 серий</b>
18:2 линолевая кислота
2,34
1,28
0,68
0,84
20:4 ARA
0
0
0,03
0,48
22:5 DPA
0
0,01
0,51
0,01
<b>n-3 серий</b>
18:3 линоленовая кислота
0,23
0,01
0,01
0,05
20:5 EPA
0
0
0,08
0
22:6 DHA
0
1,27
1,25
1,27
% SAT
27,4%
27,3%
26,4%
26,7%
% МОНО
21,0%
20,8%
20,1%
19,9%
% ПОЛИ
51,6%
51,9%
53,5%
53,3%
Отношение n-6 к n-3
10,10
1,00
0,91
1,01
Таблица 2
Состав смеси масел, используемой для экспериментальных диет
Контрольная диета
DHASCO<sup></sup>
DHA™-S
ARASCO<sup></sup>/DHASCO<sup></sup>
Кукуруза/соя
DHA
DHA+DPA
ARA+DHA
Тип масла
г/100 г корма
г/100 г корма
г/100 г корма
г/100 г корма
DHASCO
0
30
0
30
Кукурузное
15
9
0
0
Соевое
27
0
0
2
Сафлоровое
0
9
8
8
Кокосовое
8
2
1
0
DHA™-S
0
0
31
0
ARASCO
0
0
0
11
Подсолнечное
0
0
10
0
Итог
50
50
50
51
Все диеты включали 50 г жира/100 г корма. Каждая из DHA-содержащих диет включала 1,3 г DHA/100 г корма и имела приблизительно 1:1 отношение жирных кислот n-6 к n-3, в сравнении с контрольной диетой, которая имела приблизительно 10:1 отношение жирных кислот n-6 к n-3. % насыщенных, мононенасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот был эквивалентен во всех диетах. Количество общего белка (20%) и углевода (66%), а также общая энергия (3,9 ккал/г) также были эквивалентны во всех диетах.
ELISA и иммуноблоттинг
2
Анализ Аβ методом ELISA осуществляли, в основном, как описано ранее (Suzuki et al., Science 264, 1336-1340 (1994). Относительно иммуноблоттинга, мозг трансгенных и контрольных мышей гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса в растворе 2% SDS в НО, содержащем 0,7 мг/мл пепстатина А, снабженном минитаблеткой, содержащей полный набор протеазных ингибиторов (Roche 1836153). Гомогенизированные смеси подвергали действию ультразвука в течение короткого времени для фрагментирования DNA и центрифугировали при 4°С в течение 1 часа при 100000×g. Супернатант использовали для иммуноблоттинга. Белки разделяли с помощью SDS/PAGE (10% бис-трис из Invitrogen) при восстанавливающих условиях и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану инкубировали в 5% растворе обезжиренного молока в течение 1 часа при 20°С. После инкубации в течение ночи при 4°С с первым антителом “блоты” промывали в растворе Твин-TBS в течение 20 минут и инкубировали при 20°С со вторым антителом. “Блоты” промывали в T-TBS в течение 20 минут и инкубировали при 20°С со вторым антителом. “Блоты” промывали в T-TBS в течение 20 минут и инкубировали в течение 5 минут с Super Signal (Pierce).
Биохимические маркеры
Количественное определение Аβ: проводили количественную оценку влияния DHA на различные виды Аβ (например, Аβ40 в сравнении с Аβ42; растворимый Аβ в сравнении с нерастворимым Аβ) (Oddo et al., 2003). Белок, экстрагированный из ткани мозга мышей, обработанных DHA, использовали для получения растворимых и нерастворимых белковых экстрактов и анализировали методом сэндвич-ELISA. Вестерн-блоттинг применяли для оценки уровней устойчивого состояния холопротеина АРР, фрагментов С99/С83 и sAPPα с целью определения влияния DHA на указанные биомаркеры.
Гиперфосфорилирование тау-белка: Поскольку в коре головного мозга и гиппокампе трансгенных мышей 3хTg-AD с возрастом аккумулируются аргирофильные и нитевидные тау-иммунореактивные нейрональные включения (Oddo et al., 2003), влияние DHA на гиперфосфорилирование тау-белка, как функционального биомаркера, оценивали количественно. Для данного исследования использовали количественный вестерн-блоттинг с антителами (такими как АТ8, АТ100 или PHF1), которые специфически распознают гиперфосфорилированный тау-белок.
Головной мозг разделяли на кору, гиппокамп и мозжечок.
Иммуногистохимический анализ
Для того чтобы оценить общие бляшки и клубочки и также активацию микроглий, фиксированные формалином, залитые парафином фракции мозга рассекали на кусочки 5 мкм, закрепляли на покрытых силаном предметных стеклах и обрабатывали, как описано. Используя различные антитела против разных форм Аβ (1-40, 1-42 и олигомеры) и фосфорилированные формы тау-белка, бляшки и клубочки обнаруживали визуально для установления локализации и степени поражения в мозге. Кроме того, антитела, такие как CD45, использовали, чтобы с помощью окрашивания выявить активацию микроглий с целью определения, инициируют ли все еще бляшки и клубочки иммунный ответ. Следующие антитела были использованы: анти-Аβ 6Е10 и 4G8 (Signet Laboratories, Dedham, MA), анти-Аβ 1560 (Chemicon), A11 (Kayed et al., 2003), анти-АРР 22С11 (Chemicon), анти-тау НТ7, АТ8, АТ180 (Innogenetics), тау С17 (Santa Cruz), тау 5 (Calbiochem), анти-GFAP (Dako) и анти-актин (Sigma). Первые антитела применяли при разведениях 1:3000 для GFAP; 1:1000 для 6Е10; 1:500 для 1560, АТ8, АТ180 и таu5; и 1:200 для НТ7.
Экстракция общих липидов мозга
Мозг хранили при -80°С до анализа. Мозг лиофилизировали и липиды экстрагировали в 4 мл смеси 2:1 (об./об.) хлороформ:метанол с 0,5% ВНТ в качестве антиоксиданта. Смесь подвергали действию ультразвука в течение 10 минут и центрифугировали для осаждения твердых частиц.
Анализ жирных кислот
Анализ общих липидов мозга
3
2
Экстракт липидов мозга в количестве 1,2 мг анализировали на содержание общих жирных кислот мозга. Общие липиды мозга превращали в метиловые эфиры жирных кислот (FAME) с помощью 14% BF/метанола при 100°С в течение 30 минут (Morrison, W.R. and Smith, L.M. (1964) J. Lipid Res. 5:600-8). Бутилированный гидрокситолуол добавляли до омыления и все образцы обрабатывали в атмосфере N на протяжении всего способа, чтобы уменьшить до минимума степень окисления. Трикозановую свободную жирную кислоту (23:0) добавляли к каждому образцу в качестве внутреннего стандарта до анализа FAME.
Анализ фосфолипидов мозга
3
2
Фосфатидилхолин (РС), фосфатидилсерин (PS) и фосфатидилэтаноламин (РЕ) мозга разделяли способами согласно Gilfillan et al. (Gilfillan et al. (1983), J. Lipid Res. 24:1651-1656). Пластины 20×20 см с силикагелем К толщиной 0,25 мм (Whatman, Clifton, NJ) активировали в течение 60 минут в печи при 100°С. Образец (0,6 мг) общего экстракта мозга наносили на пластину и подвергали ТСХ в камере, используя смесь хлороформ:метанол:петролейный эфир:уксусная кислота:борная кислота 40:20:30:10:1,8 (об./об./об./об./масс.). Смесь растворителей перемещалась по пластине до 1 см сверху пластины. Пластину опрыскивали ацетатом меди для выявления полос. Полосы PC, PS PE соскабливали в пробирки и липиды превращали в метиловые эфиры жирных кислот (FAME) с помощью 14% BF/метанола при 100°С в течение 30 минут (Morrison and Smith, 1964, выше). Бутилированный гидрокситолуол добавляли до омыления и все образцы обрабатывали в атмосфере N на протяжении всего способа, чтобы уменьшить до минимума степень окисления. Трикозановую свободную жирную кислоту (23:0) добавляли к каждому образцу в качестве внутреннего стандарта до анализа FAME.
Анализ эритроцитов
3
2
Общие липиды экстрагировали из 400 мкл эритроцитной массы (RBC) способами, описанными Bligh и Dyer (Bligh, E.G. and Dyer, W.J. (1959), Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911). Трикозановую свободную жирную кислоту (23:0) добавляли к каждому образцу в качестве внутреннего стандарта до экстракции. Липиды RBC подвергали омылению 0,5 н метанольным раствором гидроксида натрия, и жирные кислоты превращали в метиловые эфиры с помощью 14% BF/метанола при 100°С в течение 30 минут (Morrison and Smith, 1964, выше). Бутилированный гидрокситолуол добавляли до омыления и все образцы обрабатывали в атмосфере N на протяжении всего способа, чтобы уменьшить до минимума степень окисления.
Анализ с помощью газовой хроматографии
Метиловые эфиры жирных кислот (FAME) анализировали с помощью ГЖХ (GLC), используя хроматограф Hewlett Packard 6890, снабженный пламенно-ионизационным детектором. Метиловые эфиры жирных кислот разделяли на 30-метровой капиллярной колонке FAMEWAX (Restek, Bellefonte, PA; диаметр 0,25 мм, толщина покрытия 0,25 мм), используя гелий при скорости потока 2,1 мл/мин с отношениями щелей 48:1 и 20:1. Параметры хроматографического разделения включали начальную температуру печи 130°С, которая увеличивалась на 6°С/мин до 225°С, где она поддерживалась в течение 20 минут до повышения ее до 250°С при скорости 15°С/мин, эта конечная температура поддерживалась в течение 5 минут. Температуры инжектора и детектора были постоянными при 220°С и 230°С соответственно. Пики идентифицировали путем сравнения времени удерживания образцов со временем удерживания внешних стандартных смесей метиловых эфиров жирных кислот от NuCheck Prep (Elysian, MN, U.S.A.). Профили жирных кислот выражали как % от общего количества мг жирных кислот (% масс.).
Пример 1
В следующем примере описывают определение способности пищевых полиненасыщенных жирных кислот (PUFA), докозагексаеновой кислоты (DHA; 22:6 n-3), докозапентаеновой кислоты (DPAn-6; 22:5 n-6) или арахидоновой кислоты (ARA; 20:4 n-6) корректировать начало или тяжесть патофизиологических симптомов заболевания, изученных на новой модели болезни Альцгеймера у мышей с тремя трансгенами (3xTg-AD).
Группы гомозиготных мышей 3xTg-AD держали на одной из четырех диет, включающих DHA, DHA и DPAn-6, DHA и ARA или на диете, лишенной указанных PUFA (контроль), как описано выше в материалах и методах (см. таблицы 1 и 2). Три экспериментальные диеты включали подобные количества DHA, и линолевую кислоту, DPAn-6 или ARA, в качестве источника с n-6, как описано выше (см. обсуждение диет в материалах и методах). Терапевтический эффект контроля и PUFA-снабженных диет оценивали после нескольких временных точек обработки путем наблюдения за развитием патологии у данных мышей.
Конкретнее, начиная с 3-месячного возраста, мышей 3xTg-AD держали на установленных диетах, как показано в таблицах 1 и 2, вплоть до 12-месячного возраста. Каждая диета имела ссылочные номера и была с цветовым кодом без информации об уровне экспериментального соединения, включенного в диету. Запасенная пища хранилась при 0°С на протяжении всего исследования. Начало эксперимента в 3-месячном возрасте животных было выбрано, чтобы не навредить нормальному росту и развитию мышей во время содержания на экспериментальных диетах до появления Аβ и тау-нейропатологии. Обработки были остановлены в возрасте животных 6, 9 или 12 месяцев жизни, и ряд нейропатологических оценок мозга и крови был сделан, включая уровни общего АРР, бета-амилоидных пептидов, количество бляшек, размер бляшек и уровни АРР-расщепляющих ферментов (альфа- и бета-секретазы, пресенилин-1). Общие жирные кислоты мозга и крови и фосфолипиды мозга также количественно определяли.
При каждой временной точке полный нейропатологический и иммуногистохимический анализ мозга и спинномозговой жидкости (CSF) был совершен, по меньшей мере, для 6 мышей для получения надежного статистического анализа. Кровь собирали и обрабатывали с получением осадков эритроцитов и сыворотки и хранили при -80°С. Дополнительные шесть мышей из каждой группы диет убивали, и кровь и срезы мозга отправляли замороженными для дополнительных анализов. Нейропатологические и иммуногистохимические показатели оценивали при 3 временных точках, когда мыши были в возрасте 6, 9 и 12 месяцев.
В таблице 3 представлены средние массы тела после 3 месяцев, 6 месяцев и 9 месяцев от начала содержания на диетах, включающих PUFA, как описано выше.
Таблица 3
Средний вес тела после 3 месяцев диеты
Самцы
+/-
Самки
+/-
Голубой
38,50
1,88
29,00
2,32
Желтый
32,08
0,68
28,43
0,33
Зеленый
40,54
2,31
32,10
1,42
Красный
31,23
1,23
27,43
0,73
Средний вес тела после 6 месяцев диеты
Самцы
+/-
Самки
+/-
Голубой
39,60
5,42
26,48
0,81
Желтый
47,10
5,27
32,50
1,79
Зеленый
50,13
1,74
34,53
4,22
Красный
39,26
3,77
32,83
2,82
Средний вес тела после 9 месяцев диеты
Самцы
+/-
Самки
+/-
Голубой
39,68
1,688
35,40
3,15
Желтый
45,81
6,16
46,44
3,95
Зеленый
46,56
1,69
37,53
6,08
Красный
47,51
2,89
32,45
0
Как видно из таблицы 3, средние массы тела самцов и самок не различались для всех диет при 3, 6 и 9 месяцах обработки. Мыши, содержащиеся на всех диетах, продолжали расти и оставаться здоровыми в течение хода исследования.
Результаты анализа жирных кислот
На фиг.1А-С представлены профили жирных кислот из гомогенатов целого мозга четырех групп животных, содержащихся на диете, после 3 месяцев (фиг.1А; n=6), 6 месяцев (фиг.1В; n=6) или 9 месяцев (фиг.1С; n=6) лечебного питания (величины выражены как % общих жирных кислот мозга). На фиг.2А-2С представлены профили жирных кислот из гомогената эритроцитов четырех групп животных, содержащихся на диете, после 3 месяцев (фиг.2А), 6 месяцев (фиг.2В) или 9 месяцев (фиг.2С) лечебного питания (величины выражены как % общих жирных кислот эритроцитов). На фиг.3А-3С представлены профили фосфатидилхолина (РС) мозга четырех групп животных, содержащихся на диете, после 3 месяцев (фиг.3А), 6 месяцев (фиг.3В) или 9 месяцев (фиг.3С) лечебного питания (величины выражены как % РС от общих жирных кислот мозга). На фиг.4А-4С представлены профили фосфатидилэтаноламина (РЕ) мозга четырех групп животных, содержащихся на диете, после 3 месяцев (фиг.4А), 6 месяцев (фиг.4В) или 9 месяцев (фиг.4С) лечебного питания (величины выражены как % РЕ от общих жирных кислот мозга). На фиг.5А-5С представлены профили фосфатидилсерина (РS) мозга четырех групп животных, содержащихся на диете, после 3 месяцев (фиг.5А), 6 месяцев (фиг.5В) или 9 месяцев (фиг.5С) лечебного питания (величины выражены как % РS от общих жирных кислот мозга). В каждой из фиг.1-5, четыре диеты, на которых содержались животные, представлены как контрольная (голубая), DHA (желтая), DHA/DPA (зеленая) и DHA/ARA (красная). В каждой из фиг.1-5, DMA = диметилацетали; ARA = арахидоновая кислота (n-6); DHA = докозагексаеновая кислота (n-3); EPA = эйкозапентаеновая кислота (n-3); LA = линолевая кислота (n-6); ALA = альфа-линоленовая кислота (n-3); DPAn-6 = докозапентаеновая кислота (n-6); DPA n-3 = докозапентаеновая кислота (n-3); и adrenic = адреновая кислота (n-6).
Результаты показывают, что жирные кислоты эритроцитов (RBC) и мозга изменились в возрасте 6 месяцев (3 месяца лечебного питания), 9 месяцев (6 месяцев лечебного питания) и 12 месяцев (9 месяцев лечебного питания) мышей в результате содержания на PUFA-обогащенных диетах (фиг.1А-С и 2А-С). Уровни жирной кислоты 22:6 n-3 (DHA) в RBC, выраженные в % масс., были в два раза выше контрольных уровней для всех PUFA-добавленных диет при всех временных точках. Уровни жирной кислоты 22:6 n-3 (DHA) всего мозга были также повышены от 1 до 3% масс. для всех PUFA-добавленных диет, но не так сильно, как в RBC. У мышей, содержащихся на DHA-диете (желтая), наблюдали самые большие изменения в % масс. 22:6 n-3 (DHA) как в RBC, так и в общих липидах мозга. Исходя из % масс. жирных кислот, 22:6 n-3 (DHA) и 20:4 n-6 (ARA) являются самыми изобилующими длинноцепочечными PUFA в общих липидах как мозга, так и RBC. Уровни 20:5 n-3 (EPA) в мозге и RBC являются низкими, и обычно уровни 22:6 n-3 (DHA) в % масс. в мозге приблизительно в пятнадцать раз выше, чем 20:5 n-3 (EPA) и приблизительно в пять раз выше, чем в RBC.
Хотя уровни DHA повышались, было последующее уменьшение 20:4 n-6 (ARA) для всех PUFA-обогащенных диет по сравнению с контрольной диетой (которая имела отношение n-6 к n-3, равное 10:1). Уровни жирных кислот DHA и ARA мозга сохранялись в течение всего периода содержания на диете с добавками. В RBC, DHA-содержащая диета (желтая) в значительной степени снижала уровни 20:4 n-6 (ARA) в RBC на 11,75% масс. по сравнению с контрольной группой по всем временным точкам. Как и ожидалось, уровни 20:4 n-6 (ARA) в RBC мышей, которые содержались на красной диете (DHA- и ARA-добавленные), были близки уровням контрольных мышей.
Уровни 22:5 n-6 (DPAn-6) в RBC и общих липидов мозга были более чем в два раза выше контрольных уровней у мышей, содержащихся на DHA- и DPAn-6-включающих диетах (зеленая), во всех временных точках. Уровни 22:5 n-6 (DPA) в мозге и RBC были очень низкими или не определялись у мышей, содержащихся на DHA-диете (желтая) или DHA- и ARA-диете (красная). Минимальное количество 18:3 (n-3) (ALA) наблюдали в липидах мозга и RBC, и незначительные изменения жирных кислот отмечали в любом типе ткани относительно данного предшественника длинноцепочечных PUFA. Уровни 18:2 n-6 (LA) оказались в пятнадцать раз выше в RBC по сравнению с мозгом. Уровни 18:2 n-6 (LA) в % масс. были ниже для всех PUFA-содержащих диет по сравнению с контрольными уровнями, во всех временных точках. Эти изменения являются показательными для композиций жирных кислот. Уровни 20:5 n-3 (EPA) в RBC были выше для PUFA-содержащих диет по сравнению с контрольными уровнями, хотя указанные диеты не содержали существенные количества 20:5 n-3 (EPA). Это может означать обратное превращение 22:6 n-3 (DHA) в 20:5 n-3 (EPA) в клетках крови. Никаких заметных количеств 20:5 n-3 (EPA) в липидах мозга не было отмечено для различных PUFA-содержащих диет и периодов времени.
Жирные кислоты, содержащиеся во фракциях фосфолипидов мозга PS, PE и PC, также изменялись к 6 месяцам (3 месяца лечебного питания), 9 месяцам (6 месяцев лечебного питания) и 12 месяцам (9 месяцев лечебного питания) мышей, содержащихся на PUFA-обогащенных диетах (см. фиг.3А-3С, 4А-4С и 5А-5С). Исходя из % масс., уровень 22:6 n-3 (DHA) был в пять раз выше во фракциях PS (фиг.5) и PE (фиг.4) по сравнению с фракцией PC (фиг.3), и уровни 20:4 n-6 (ARA) были самыми значимыми во фракции РЕ. Уровни 20:5 n-3 (EPA), 18:2 n-6 (LA) и 18:3 n-3 (ALA) во фракциях фосфолипидов мозга были очень низкими. Диета, содержащая DHA (желтая), привела к самому большому увеличению количества в % масс. 22:6 n-3 (DHA) по сравнению с контролем во фракции фосфолипидов мозга для всех трех фосфолипидов. Также было соответствующее снижение уровней 20:4 n-6 (ARA) с DHA (желтая) диетой по сравнению с контролем для всех трех фосфолипидов мозга. Исходя из данных общих фосфолипидов мозга и RBC, уровни 22:5 n-6 (DPA) в % масс. во всех фосфолипидных фракциях мозга увеличивались больше всего у мышей, содержащихся на DHA- и DPAn-6-обогащенной (зеленая) диете.
Таким образом, отношения n-6 к n-3 жирных кислот в составе диет отразились на уровнях жирных кислот в мозге и RBC. Увеличение содержания 22:6 n-3 (DHA) в диетах привело к значительным повышениям уровней DHA как в RBC, так и в мозге. С увеличением уровней 22:6 n-3 (DHA) в диетах отмечали последующее снижение уровней n-6 жирных кислот. Когда другие жирные кислоты (т.е. DPA и ARA) были добавлены к диетам, то уровни соответствующих жирных кислот также увеличивались в тканях. В целом, уровни жирных кислот в мозге хорошо сохранялись в течение всего периода содержания на диете для каждой диеты.
Анализ биохимических маркеров

TM

TM
На фиг.6А-6J представлены результаты влияния диет на уровни β-амилоида (Аβ) у 6-месячных мышей 3X-TG-AD после 3 месяцев, 6 месяцев и 9 месяцев лечебного питания. Как описано выше, животных содержали на одной из четырех диет, представленных в таблице 1 выше. Общий растворимый (фиг.6А, 6С и 6Е) и нерастворимый (фиг.6В, 6D и 6F) Аβ-пептид определяли количественно в белковом экстракте мозга с антителами, специфическими к Аβ 1-40 и Аβ 1-42 и общему амилоиду. Как показано на фиг.6А, после 3 месяцев кормления у животных, содержащихся на диетах с DHA из микроводорослей (желтая, зеленая и красная диеты), наблюдали значительно ниже уровни растворимых β-амилоидных пептидов по сравнению с животными, получавшими кукурузно-соевое масло. После 6 месяцев кормления пищевыми добавками (фиг.6С) у животных, содержащихся на диетах, включающих DHA (желтая) или DHA и DPAn-6 (зеленая), уровни β-амилоидных пептидов были все еще значительно ниже уровней контрольных животных, но уровень β-амилоидного пептида у животных, содержащихся на диете с DHA и ARA (красная), не отличался значительно от контрольных уровней. После 9 месяцев кормления (фиг.6Е) только животные, содержащиеся на диете с включенной DHA (желтая), имели значительно сниженные уровни Аβ по сравнению с контролем. Никаких различий в общих уровнях нерастворимого амилоида не наблюдали между диетами, включающими масло кукуруза/соя и масло из микроводорослей. На фиг.6G-6J представлены данные относительной плотности внутриклеточного общего амилоида, присутствующего в коронарных срезах, полученных от животных, которых содержали на диетах, включающих масло кукуруза/соя (голубая группа), DHASCO (желтая группа), DHA-S (зеленая группа) и DHASCO/ARASCO (красная группа). У животных, содержащихся на диетах, включающих масло кукуруза/соя и DHASCO/ARASCO, наблюдали относительно большее содержание общего внутриклеточного амилоида, чем у животных, которых содержали на диетах, включающих DHASCO или DHA-S, после 3 месяцев лечебного питания.
На фиг.7А и 7В представлены данные, показывающие влияние диет на процессинг АРР у 6-месячных мышей 3x-TG-AD после 3 месяцев обработки. Общие уровни АРР, С83 и С99 не различались значительно между животными, содержащимися на диетах, включающих кукурузно-соевое масло или масла из микроводорослей.
На фиг.7С и 7D представлены данные, показывающие влияние диет на фермент, “очищающий” от Аβ-пептида (инсулиндеградирующий фермент, IDE), после 3 месяцев обработки. Никаких значимых различий в уровнях IDE не наблюдали у животных, содержащихся на диетах, включающих масло кукуруза/соя или различные масла из микроводорослей.
На фиг.8А и 8В представлены данные, показывающие влияние диет на АРР-секретазы у 6-месячных мышей 3X-TG-AD после 3 месяцев экспериментального лечебного питания. Никаких значительных различий в уровнях β-секретазы (ВАСЕ) или ADAM 10 не наблюдали у животных, содержащихся на диетах, включающих кукурузно-соевое масло или масла из микроводорослей.
На фиг.8С и 8D представлены данные, показывающие, что по сравнению с животными, получающими кукурузно-соевое масло, у животных, содержащихся на диетах, включающих масла из микроводорослей, наблюдали сниженные уровни фермента, пресенилина 1, но не никастрина.
∗
На фиг.8Е представлены данные, показывающие, что DHA значительно снижает уровень mRNA пресенилина 1 (, р<0,05) в клетках SHSY5Y.
На фиг.9A-9F представлены данные, показывающие влияние диет на уровни общего тау-белка после 3 месяцев, 6 месяцев и 9 месяцев лечебного питания. Как показано на фиг.9А и 9В, диеты, включающие DHA-содержащие масла из микроводорослей (желтая, зеленая и красная диеты), значительно снижали уровни общего тау-белка по сравнению с диетами, включающими кукурузно-соевое масло. После 6 месяцев кормления у животных, содержащихся на диетах, включающих DHA в качестве преобладающей PUFA (желтые) или DHA и DPAn-6 (зеленые), уровни общего тау-белка сохранялись низкими по сравнению с диетами, включающими кукурузно-соевое масло, но у животных, содержащихся на диетах, включающих комбинацию DHA и ARA (красные), не наблюдали значительных различий в уровнях общего тау-белка по сравнению с контролями. После 9 месяцев кормления только животные, содержащиеся на диетах, включающих DHA в качестве преобладающей PUFA (желтые), имели значительно сниженные уровни общего тау-белка по сравнению с контролями.
На фиг.10A-10D представлены данные, показывающие, что диета с DHA и DPAn-6 (зеленая) значительно снижала экспрессию конформационно измененного тау-белка по сравнению с другими тремя диетами после 3 месяцев кормления.
Как показано на фиг.10Е и 10F, после 9 месяцев лечебного питания уровни фосфорилированного тау-белка значительно снижались у животных, диеты которых включали DHA в качестве преобладающей PUFA (желтые) или DHA и DPAn-6 (зеленые), по сравнению с животными, содержащимися на диетах, включающих кукурузно-соевое масло. Животные, диеты которых включали комбинацию DHA и ARA (красные), не имели значительных отличий в уровнях фосфорилированного тау-белка от контрольных уровней.
Каждая ссылка и публикация, цитированная в описании, включена посредством ссылки во всей полноте. Полное раскрытие каждой предварительной заявки США № 60/697911 и предварительной заявки США № 60/779145 включено в описание посредством ссылки.
Хотя различные варианты осуществления настоящего изобретения описаны подробно, очевидно, что изменения и приспособления данных вариантов осуществления изобретения очевидны специалистам в данной области. Однако, следует признать, что такие изменения и приспособления входят в объем настоящего изобретения, как изложено в следующей формуле изобретения.