Роль оксида азота в иммуносупрессорной и противоопухолевой активностях клеток эмбриональной печени

ОНКОЛОГИЯ

УДК 612.017.1:57.052

Ю.П. Бельский, М.Г. Данилец, Н.В. Бельская, В.К. Патрушев, Е.С. Трофимова, В.И. Агафонов

РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В ИММУНОСУПРЕССОРНОЙ И ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЯХ КЛЕТОК ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ПЕЧЕНИ

ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН, Томск

Работа посвящена сравнительному исследованию роли оксида азота в иммуносупрессорной и противоопухолевой активностях клеток печени эмбрионов мышей, полученных на 14-е и 19-е сутки внутриутробного развития. Показано, что неприлипающие к пластику клетки печени эмбрионов подавляли пролиферацию как сингенных Т-лимфоцитов, активированных митогеном, так и опухолевых клеток мастоцитомы Р-815. В присутствии блокатора N0-^^ тазы L-NMMA иммуносупрессорная активность отменялась полностью, противоопухолевая не изменялась. Клетки с иммуносупрессорными свойствами, так же, как и клетки-продуценты оксида азота, обладали низкой плавучей плотностью. Таким образом, клетки эмбриональной печени обладают N0-зависимой иммуносупрессорной и N0-независимой противоопухолевой активностями. Суммируя вышесказанное и учитывая данные других авторов, можно заключить, что естественная супрессорная активность является общим свойством гемопоэ-тических тканей.

Ключевые слова: иммунорегуляция,

Иммунорегуляторные свойства гемопоэтичес-ких клеток разной степени зрелости и принадлежащих к разным росткам изучаются последние 20 лет [3, 4, 6, 8, 9, 12, 13]. Способность таких клеток подавлять реакции Т- и В-лимфоцитов в ответ на антигены и митогены in vitro и in vivo без предварительного контакта с мишенями и рестрикции по антигенам комплекса гистосовместимости путем выделения супрессорных факторов обозначена в литературе термином «естественная супрессорная активность». Позже была описана и противоопухолевая активность естественных супрессорных клеток как способность подавлять пролиферацию опухолевых клеток in vitro [11, 13]. Показано, что в качестве факторов иммуносупрессорной активности могут выступать трансформирующий фактор роста бета, оксид азота (NO), простагландины, эритроидный супрессорный фактор небелковой природы и др. [5, 9, 10, 14]. Противоопухолевая активность и ее факторы изучены мало, только в работах [2, 11] показано, что NO в ней не играет роли.

В качестве источника естественных супрессорных клеток в приведенных работах были использованы костный мозг и селезенки взрослых мышей, а также селезенки новорожденных [8]. Печень эмбриона как источник иммуносупрессорных клеток исследовали мало. Показано, что ее клетки обладают противоопухолевой активностью [1], а выделенные из печени эритроидные незрелые клетки

оксид азота, эмбриональная печень

подавляют функции В-лимфоцитов и не влияют на Т-клетки [4]. Целью настоящей работы явилось изучение влияния клеток эмбриональной печени на пролиферацию Т-лимфоцитов, а также роли оксида азота в механизме их иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей.

Методика. В работе использовано 24 мыши линии С57В1/6 и DBA/2 в возрасте 10-16 недель, полученных из коллекционного фонда НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. Животные соответствовали 1 категории (согласно сертификату), содержались в неполной барьерной системе, имели постоянный доступ к воде и пище, получали стерилизованный гранулированный корм и кипяченую питьевую воду, подкисленную соляной кислотой (рН=4-4,5). Клеточную линию Р-815 (мастоци-тома) поддерживали в асцитной форме на мышах линии DBA/2. Клетки печени получали от эмбрионов известного возраста, для чего беременных самок (14-е и 19-е сутки гестации) забивали под легким ингаляционным наркозом декапитаци-ей, вскрывали брюшную полость, переносили из матки эмбрионы в чашки Петри с изотоническим раствором хлорида натрия (ФР), декапитировали, гомогенизировали их печень, фильтровали через 4-слойный капрон. Опухолевые клетки выделяли из асцитной жидкости. Спленоциты получали из селезенок не беременных самок. Клетки трижды промывали ФР и ресуспендировали в культураль-

ной среде. Жизнеспособность клеток оценивали в тесте с 0,1% трипановым синим. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток. Клетки культивировали в атмосфере с 5% СО2 и абсолютной влажности в среде следующего состава: RPMI 1640 (Sigma) с добавлением 10% ЭТС (ICN, Serva), 20 мМ HEPES, 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола (оба Sigma), 50 мкг/мл гентамицина и 2 мМ L-глютамина (оба Flow Lab). Из суспензии клеток эмбриональной печени удаляли прилипающие к пластику клетки культивированием 1 ч в пластиковых чашках Петри («Costar») в концентрации 3-5*106/мл. Затем неприлипшие клетки собирали, отмывали и ресус-пендировали в среде.

Фракционирование клеток по плавучей плотности проводили с использованием коммерческого раствора для сепарации клеток (Flow Lab, р=1,077 г/мл). Суспензию клеток осторожно наслаивали на жидкость для сепарации, после 15-минутного центрифугирования при 400 g клетки, сформировавшие кольцо в растворе, собирали, трижды отмывали холодным ФР, ресуспендировали в культуральной среде и оценивали их жизнеспособность.

Оценку иммуносупрессорной и противоопухолевой активностей проводили по способности подавлять пролиферацию клеток-мишеней (син-генных лимфоцитов селезенки, активированных митогеном) или опухолевых клеток Р-815 [5, 13]. Для этого неприлипающие клетки-эффекторы культивировали в 96-луночных планшетах совмес-

тно со спленоцитами (2*105 на лунку 60-64 ч в присутствии конканавалина А (Sigma), 4 мкг/мл) или клетками мастоцитомы (2*104 на лунку 36-40 ч). За 16 ч до окончания культивирования вносили по

0,5 мкКю/лунку 3Н-тимидина. Затем содержимое лунок переносили на стекловолокнистые фильтры и оценивали включение изотопа. Пролиферативную активность клеток выражали в количестве импульсов в минуту либо в виде индекса супресии (%), который вычисляли по следующей формуле: ИС=(1-О/К)*100, где О — количество имп./мин в лунках (эффекторы + мишени), К — количество имп./мин в лунках с клетками-мишенями.

Продукцию оксида азота (NO) оценивали по содержанию нитритов в супернатантах при помощи реактива Грейса [7]. Реактив (0,1 мл) смешивали с эквивалентным объемом супернатанта и измеряли абсорбцию при длине волны 550 нм. Концентрацию нитритов определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов нитрита натрия. В части экспериментов в лунки вносили 2 mM блокатора NO-синтазы — NG-монометил-L-аргинина (NMMA, Sigma).

Статистическую обработку проводили при помощи t-критерия Стьюдента. Различия показателей считали достоверными при p<0,05.

Результаты. Было обнаружено, что клетки печени эмбрионов мыши на 14-й день внутриутробного развития обладали иммуносупрессорной активностью и способностью продуцировать оксид азота (таблица 1). Для определения участия NO в

Таблица 1

Роль оксида азота в иммуносупрессорной и противоопухолевой активностях клеток печени 14-дневных эмбрионов мышей линии C57Bl/6

Количество клеток в лунке (тыс.) Без NMMA + NMMA

Эффекторы Mишени Пролиферация клеток

Иммуносупрессорная активность

0 200 25416±1239 <2 24377±2118 <2

200 0 2256±1165 <2 2593±233 <2

400 0 3473±566 <2 3661±985 <2

200 200 16774±1576* (34,0) 26,7±3,1 23840±1915# (2,2) 3,0±1,6#

400 200 11615±1330* (54,3) 37,0±5,3 22722±1169# (6,8) 6,5±0,8#

Противоопухолевая активность

0 20 22640±1080 <2 24377±2105 <2

200 20 2752±863 <2 2936±1546 <2

400 20 4135±898 <2 4262±975 <2

200 20 9765±2196* (56,9) <2 9457±1453* (61,2) <2

400 20 3269±1391* (85,6) <2 3948±1533* (83,8) <2

Примечание: в скобках указан индекс супрессии; * — различие достоверно (р<0,05) при сравнении с соответствующим показателем мишеней в отсутствие эффекторов; # — различие достоверно (р<0,05) при сравнении с аналогичным показателем в отсутствие ЫММА.

качестве фактора иммуносупрессорной активности клеток эмбриональной печени сравнили уровень этой активности в присутствии и в отсутствие бло-катора МО-синтазы (КММА). Иммуносупрессор-ная активность в присутствии МММА снижалась: при соотношении эффектор/мишень 1/1 с 34,0% до 2,2%, при соотношении 2/1 с 54,3% до 6,8%. При этом уменьшалась и концентрация нитритов с 26,7 мкМ до 3,0 мкМ и с 37,0 мкМ до 6,5 мкМ (соответственно в меньшем и большем соотношениях). Следует отметить, что в присутствии МММА пролиферация клеток-мишеней, культивировавшихся отдельно от эффекторов, не изменялась. Клетки печени тех же эмбрионов проявляли противоопухолевую активность. Ее уровень не зависел от присутствия МММА и составлял в соотношении эффектор/мишень 10/1 56,9 и 61,2% в отсутствие или при добавлении блокатора; в соотношении 20/1 — 85,6 и 83,8% соответственно. При этом оксид азота ни в одном из вариантов культур не выявлялся.

В более поздние сроки внутриутробного развития (19-й день) клетки эмбриональной печени сохраняли иммуносупрессорную и противоопухолевую активности (таблица 2). Подавление синтеза оксида азота привело к значительному снижению иммуносупрессорной активности клеток эмбриональной печени: в соотношении эффектор/мишень 1/1 с 61,5 до 18,9%, в большем соотношении (2/1) с 78,1 до 22,2%. Одновременно со снижением иммуносупрессорной активности наблюдали и уменьшение концентрации нитритов — с 33,0 мкМ

до 6,1 мкМ в соотношении 1/1 и с 58,8 мкМ до 10,1 мкМ в соотношении 2/1. Исследование роли N0 в противоопухолевой активности клеток печени 19дневного эмбриона мыши показало, что блокирование МО-синтазы не оказывало никакого влияния на ее уровень. Эмбриональные клетки подавляли пролиферацию опухолевых клеток-мишеней как в присутствии МММА (на 50,7 и 72,1% в меньшем и большем соотношениях соответственно), так и в культуре, не содержащей блокатор (на 45,3 и 68,3% в меньшем и большем соотношениях соответственно). При этом нитриты не были обнаружены.

Клетки костного мозга, проявляющие имму-носупрессорную активность, при разделении по плавучей плотности обнаруживаются во фракции с плотностью менее 1,075 г/мл [5, 13]. При фракционировании клеток эмбриональной печени было получено (таблица 3), что клетки с плавучей плотностью более 1,077 г/мл (высокоплотностная фракция) не проявляли иммуносупрессорной активности и не продуцировали оксид азота при соотношении эффектор/мишень 1/1, 2/1 и даже 4/1. Неприлипающие клетки печени подавляли пролиферацию лимфоцитов-мишеней на 32,5% и проявляли МО-синтезирующую активность только в соотношении 2/1, концентрация нитритов при этом составила 7,2 мкМ, в то время как клетки низкоплотностной фракции — в обоих соотношениях (на 23,2 и на 46,2% в меньшем и большем соответственно). Концентрация нитритов повышалась параллельно с увеличением иммуносуп-

Таблица 2

Роль оксида азота в иммуносупрессорной и противоопухолевой активностях клеток печени 19-дневных эмбрионов мышей линии C57Bl/6

Количество клеток в лунке (тыс.) Без NMMA + NMMA

Эффекторы Мишени Пролиферация клеток

Иммуносупрессорная активность

0 200 29040±3247 <2 32331±1969 <2

200 0 1863±286 <2 1742±522 <2

400 0 2976±971 <2 3162±1285 <2

200 200 11180±2348* (61,5) 33,0±5,1 26223±2307# (18,9) 6,1±1,8#

400 200 6360±1581* (78,1) 58,8±4,5 25149±3655# (22,2) 10,1 ±2,1

Противоопухолевая активность

0 20 31455±1380 <2 33450±2748 <2

200 0 2180±1180 <2 1860±966 <2

400 0 2974±264 <2 2586±690 <2

200 20 17193±1400* (45,3) <2 16498±1817* (50,7) <2

400 20 9962±876* (68,3) <2 9348±1012* (72,1) <2

Примечание: в скобках указан индекс супрессии; * — различие достоверно (р<0,05) при сравнении с соответствующим показателем мишеней в отсутствие эффекторов; # — различие достоверно (р<0,05) при сравнении с аналогичным показателем в отсутствие ЫММА.

Таблица 3

Иммуносупрессорная активность и продукция оксида азота фракциями неприлипающих клеток печени 14-дневных эмбрионов мышей линии C57Bl/6, различающихся по плавучей плотности

Количество клеток в лунке (тыс.) Неприлипающие (контроль) Низкоплотностные Высокоплотностные

Эффекторы Mишени пролиферация клеток

0 200 47728±3432 <2 47728±3432 <2 47728±3432 <2

200 0 1730±527 <2 2230±290 <2 1767±256 <2

400 0 2510±580 <2 3503±144 <2 2317±196 <2

800 0 — — — — 3180±387 <2

200 200 47197±1829 (1,1) <2 36673±1924*# (23,2) 10,9±1,0 46853±1936 (1,8) <2

400 200 32237±1996* (32,5) 7,2±0,8 25667±871*# (46,2) 23,1±0,8# 47210±2053# (1,1) <2

800 200 — — — — 48283±1571 (-1,2) <2

Примечания: в скобках указан индекс супрессии; * — различие достоверно (р<0,05) при сравнении с соответствующим показателем мишеней в отсутствие эффекторов; # — различие достоверно (р<0,05) при сравнении с аналогичным показателем в присутствии контрольных эффекторов.

рессии с 10,9 мкМ (в соотношении 1/1) до 23,1 мкМ (в соотношении 2/1).

Заключение

Как показали проведенные исследования, клетки печени эмбрионов, полученные на 14-е и 19-е сутки внутриутробного развития, проявляли способность подавлять пролиферацию Т-лимфоцитов и опухолевых клеток. Оксид азота выступал в роли главного супрессорного фактора только против лимфоцитов и не участвовал в подавлении пролиферации опухолевых клеток. Клетки эмбриональной печени с иммуносупрессорными свойствами, так же, как и клетки-продуценты оксида азота, обладали низкой плавучей плотностью.

Таким образом, клетки эмбриональной печени, как и костного мозга, обладают NO-зависимой иммуносупрессорной и NO-независимой противоопухолевой активностями. Суммируя вышесказанное и учитывая данные других авторов, можно заключить, что естественная супрессорная активность является общим свойством гемопоэтических тканей.

The role of nitric oxide

in immunosuppressor and anti-tumor activities of embryonic hepar-derived cells

Y.P. Belsky, M.G. Danilets, N.V. Belskaya,

V.K. Patrushev, E.S. Trofimova, V.I. Agaphonov

The article is devoted to comparative study a role of nitric oxide in immunosuppressor and anti-tumor activities of hepar-derived cells taken from murine embryos after 14- and 19-days of it embryonic growth. It has been shown here, non-adherent hepar-derived cells have suppressed a proliferation of syngenic mitogen-activated T lymphocytes and mastocytoma P-815 cells. The addition of a competitive iNOS inhibitor L-NMMA completely abrogated the immunosuppres-

sor activity, but not effect on the anti-tumor ones. Thus, embryonic hepar-derived cells are possessed of the NO-dependent immunosuppressor and NO-independent anti-tumor activities. Taken together our findings and others, it may be concluded that natural suppressor activity is a general property of all haemopoietic tissues.

Литература

1. Бельский Ю.П., Кусмарцев С.А. //Экспериментальная и клиническая иммунология. — Томск, 1995.

— С. 25-31.

2. Бельский Ю.П., Бельская Н.В., Данилец М.Г. и др. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 1999. — Т. 127.

— № 4. — С. 452-454.

3. Кусмарцев С.А., Бельский Ю.П., Агранович И.М., Землянская Н.В. // Успехи соврем. биологии. — 1994.

— Т. 114. — № 6. — С. 705-714.

4. Цырлова И.Г., Чеглякова В.В., Козлов В.А. // Онтогенез. — 1985. — № 2. — С. 143-148.

5. Angulo I., Rodriguez R., Garcia B. et al. // J. Immunol. — 1995. — Vol. 155. — P. 15-26.

6. Brooks-Kaiser J.C., Hoskin D.W. // J. Reproductive Immunol. — 1993. — Vol. 25. — Is. 1. — P. 31-49.

7. Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J. et al. // Anal. Biochem. — 1982. — Vol. 126. — P. 131-143.

8. Maier T., Holda J.H., Claman H.N. // J. Immunol.-1989. — Vol. 143. — № 2. — P. 491-498.

9. McGarry R.C., Singhal S.K. // Immunol. — 1982.

— Vol. 46. — № 2. — P. 387-394.

10. Moore S.C., Shaw M.A., Soderberg L.S.F. // J. Leuk. Biol. — 1992. — Vol. 52. — P. 596-601.

11. Seledtsov V.I., Avdeev I.V., Morenkov A.V. // Immunobiol. — 1995. — Vol. 192. — P. 205-217.

12. Strober S. // Annu. Rev. Immunol. — 1984. — Vol. 2. — P. 219-237.

13. Sugiura K., Inaba M., Ogata H. et al. // Cancer Res.

— 1990. — Vol. 50. — P. 2582-2586.

14. Young M.R., Wright M.A., Coogan M. et al. // Cancer Immunol. Immunother. — 1992. — Vol. 35. — P. 14-18.