Оценка окислительного статуса крови при воздействии активных форм кислорода в эксперименте in vitro

Н.В. Диденко, А.Г. Соловьева, С.П. Перетягин, К.Л. Беляева

ОЦЕНКА ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТАТУСА КРОВИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ IN VITRO

ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России, Нижний Новгород, Россия

В статье рассмотрено воздействие на консервированную кровь таких активных форм кислорода (АФК) как озон (О3) в дозе 500 мкг и синглетный кислород (О2') с мощностью газового потока-100%, а также бирадикал оксид азота (NO) c концентрацией 100 ррm. Показано, что под влиянием АФК и оксида азота в крови изменяется окислительно-восстановительный потенциал среды, развивается состояние окислительного стресса, сопровождающееся сдвигами про- и антиоксидантного баланса, активацией процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Воздействие на донорскую кровь NO и О2' способствовало преобладанию восстановительных процессов. Кроме того, выявлено увеличение показателя рН крови под действием всех АФК.

Ключевые слова: озон, синглетный кислород, оксид азота.

In this paper we considered the impact of active oxygen species (ROS) such as ozone (O3 in a doses of 500 mcg), nitric oxide (NO, at a concentration of 100 ppm), singlet oxygen (O2') with an output gas stream 100% on canned blood. It was shown that under the influence of ROS and NO in a blood the redox potential of the medium changes, oxidative stress develops, pro- and antioxidant balance violates, the processes of lipid peroxidation activates. Effects of NO and O2' on donor blood contributed to the dominance of recovery processes. Also an increase in the pH level of the blood was revealed under the influence of all ROS.

Key words: ozon, singlet oxygen, nitric oxide

В последние годы опубликован огромный массив данных, свидетельствующий о том, что генерация умеренных количеств АФК и свободных радикалов является совершенно необходимым элементом физиологического состояния клеток всех типов. Так, при пониженном содержании в атмосфере супероксидных радикалов животные и человек заболевают, а при длительном их отсутствии гибнут. Одними из наиболее известных АФК являются О3 и О2'. Первый - результат химической, а второй - физической активации кислородных молекул.

К числу важных для организма свободных радикалов кислорода относится NO. Как межклеточный и внутриклеточный мессенджер NO участвует в регуляции разнообразных метаболических реакций, обеспечивающих жизнеспособность и функциональную активность клеток и всего организма в целом [1,4].

Целью работы явилось изучение воздействия различных концентраций активных форм кислорода (О3, О2') и оксида азота на изменение ОВП, уровня рН, показателей про- и антиоксидантной защиты донорской крови в условиях in vitro.

Материал и методы. Эксперименты были проведены на консервированной крови от пациентов-доноров. Генерацию NO производили на специализированном аппарате, разработанном в РФЯЦ (Саров), О3 - на озонаторе «Медозонс-Систем» (г.Нижний Новгород), О2' - на аппарате «Airnergy» (Германия) .

Обработка крови (5 мл) выполнялась пктем прямого барботажа газовой смесью (100 см ) в течение 2 минут в условиях термостатирования (37 С0). В качестве действующей концентрации NO использовано 100 ppm, доза О3 выбрана - 500 мкг, мощность газового потока О2' составила 100%. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по ингибированию образования продукта аутокисления адреналина [5]. Показатель рН и

окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) крови определяли с помощью анализатора жидкости InoLab 7110 (Германия). Показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ), общей антиоксидантной активности (АОА) плазмы крови и перекисная резистентность эритроцитов (ПРЭ) оценивались методом индуцированной хемилюминесценции[2].

Уровень малонового диальдегида (МДА) определяли в плазме и эритроцитах с помощью диагностическиго набора для количественного определения содержания ТБК-активных продуктов - ТБК-АГАТ (Москва).

Результаты исследований подвергали статистической обработке с использованием ^ критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение. Показано, что при воздействии таких активных форм кислорода, как О3, O2', а также NO на консервированную кровь происходили статистически значимые изменения ОВП с одновременным сдвигом уровня рН в щелочную сторону (табл.1).

Таблица 1. Изменение некоторых параметров донорской крови при воздействии на нее активных форм кислорода в условиях in vitro

АФК рН ОВП ПОЛ АОА ПРЭ МДА МДА СОД

(мВ) (усл. (усл. (усл. Плазма эритро- (усл.

ед.) ед.) ед.)

ед.) (усл.

ед.)

Контроль 6,72±0,06 -35,1± 10,1± 0,74± 10,3± 0,439± 2,444± 70,5±

3,2 0,9 0,05 0,5 0,041 0,187 3,4

О3 7,01±0,09* -9,4 ± 15,2± 0,82± 8,4± 1,819± 3,246± 64,3±

500 мкг 0,7* 1,4* 0,07 0,3* 0,161* 0,245* 2,3*

NO 7,00±0,08* -42,4± 12,3± 0,70± 8,6± 1,561± 4,536± 72,6±

100 ppm 3,7* 1,1* 0,04 0,3* 0,143* 0,324* 3,9

O2' 7,02±0,09* -44,0± 12,7± 0,75± 9,8± 0,653± 3,483± 79,7±

100% 4,1* 1,2* 0,05 0,4 0,059* 0,259* 4,5*

Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем

На фоне воздействия O3 изменения ОВП заключалось в снижении восстановительной его составляющей в 2,48 (р=0,034) и увеличении соответственно окислительного потенциала среды. Резкое увеличение показателя ОВП (под влиянием сильного окислителя) свидетельствует о возрастании в крови большого числа свободных радикалов, обуславливающих развитие окислительного стресса[6]. После контакта крови с O2' и NO величина ОВП статистически значимо снизилась в 1,21 и 1,25 раза соответственно, сопровождаясь защелачиванием среды. В последнем случае более активно восстанавливались буферные свойства крови. Такое защелачивание крови можно объяснить тем, что под воздействием АФК происходит резкое возрастание числа ОН' радикалов [3].

При воздействии O3 в донорской крови наблюдается статистически значимое возрастание интенсивности ПОЛ в плазме крови в 1,51 раза. При этом наблюдалось достоверное снижение активности СОД в 1,1 раза (р=0,029). Сдвиги про- и антиоксидантного баланса сопровождались увеличением МДА в плазме крови в 4,14 раза (р=0,033) и в эритроцитах в 1,33 раза (р=0,031). Устойчивость эритроцитарных мембран к окислению была увеличенной - ПРЭ уменьшалась при воздействии на донорскую кровь O3 в 1,23 раза (р=0,022).

Обработка донорской крови NO и O2' интенсифицировала в ней процессы ПОЛ, хотя и в меньшей степени, чем озон. На фоне воздействия NO и O2' происходит увеличение интенсивности ПОЛ в 1,22 (р=0,021) и 1,26 (р=0,022) раза соответственно с накоплением его промежуточных продуктов. Под влиянием NO уровень МДА в плазме возрос в 3,56 раза (р=0,031), в эритроцитах в 1,86 раза (р=0,023.

При воздействии O2' концентрация МДА статистически значимо увеличилась лишь в 1,49 раза в плазме и в 1,43 раза в эритроцитах. В отличии от воздействий озона в крови сохранилась

и даже была повышенной ферментативная антиоксидантная активность СОД в 1,13 раза (р=0,031). При этом, как и на фоне действия О3, судя по показателю ПРЭ, отмечено увеличение перекисной устойчивости мембран эритроцитов.

Заключение. Результаты эксперимента показали, что при воздействии всех изучаемых АФК и NO в консервированной крови in vitro интенсифицируются про- и антиоксидантные системы с четким развитием явлений окислительного стресса (при использовании озона). Степень выраженности возникающих изменений, по всей видимости, определяется количеством применявшихся биорадикалов, имеет свои сходства и отличия в зависимости от их вида.

Список литературы:

1. Ванин А.Ф., Островская Л.А., Корман Д.Б. и др. Антинитрозативная система как фактор резистентности злокачественных опухолей к цитотоксическому действию монооксида азота // Биофизика. 2015. Т.60. №1. С.152-157.

2. Кузьмина Е.И., Ермолин С.В., Учугина А.Ф. Метод хемилюминесценции в изучении нарушений свободно-радикального процесса, его регуляции при ряде заболеваний мочеполовой системы // Нижегородский медицинский журнал. 1993. №1. С.8.

3. Нго Куен Куи., Кияненко Е.А., Зайнуллина Л.Р. и др. Изменение рН воды в процессе озонирования // Вестник Казанского технологического университета.2013.Т. 16, № 10. С.232-234.

4.Новиков А.К., Кукес В.Г., Бердникова Н.Г. и др. Исследование в динамике процесса образования активных форм кислорода в крови пациентов с обструктивными заболеваниями легких и его значение в оценке эффективности проводимой фармакотерапии // Клиническая фармакология и терапия. 2008. Т.5, № 17. С.24-28.

5. Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. 1999. Т 45,№ 3. С.109-116.

6. Соловьева А.Г., Перетягин С.П., Диденко Н.В. Влияние озона на активность оксидредуктаз печени при экспериментальной термической травме // Биорадикалы и антиоксиданты.2015. Т. 2., № 3, С. 56-60.