ХЛАДОТЕРМОСТАТ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ БАКТЕРИЙ

Полезная модель относится к области медицины и ветеринарии и может быть использована для выделения некультивируемых бактерий в лабораторных условиях являющихся возбудителями инфекционных заболеваний.
Известно, что при диагностике инфекционных заболеваний имеют место ложноотрицательные результаты лабораторных исследований. Одной из причин низкой чувствительности применяемых методов лабораторной диагностики является наличие в популяциях бактерий значительного количества некультивируемых бактерий, находящихся в стадии анабиоза. Бактерии, обладающие некультурабельными свойствами, не растут на питательных средах, применяемых для микробиологических исследований, но обладают патогенными свойствами.
О наличии в популяциях возбудителей инфекционных заболеваний некультивируемых бактерий свидетельствуют литературные данные. Меняющиеся условия окружающей среды вызывают у бактерий состояние стресса, в результате которого меняется способность бактерий размножаться на питательных средах [Rollins D., Colwell R. Viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural aquatic environment // Appl. Environ. Microbiol. - 1986. - Vol.52. - P.531-538]. Под воздействием стрессовых факторов окружающей среды, влияющих на культуральные свойства бактерий, иногда даже значительное количество бактерий может переходить в жизнеспособное некультурабельное состояние [Волянский. Ю.Л. Некультурабельний стан аспорогенних бактерiй: теоретичнi аспекти проблеми та ïï практична значущiсть // Iнфекцiйнi хвороби. - 2004. - №1. - С.5-9; Головлев Е.Л. Другое состояние неспорулирующих бактерий // Микробиология. - 1998. - №6. - С.725-735; Colwell R. R. Bacterial death revisited // Nonculturable microorganisms in the environment / - Ed. D.J.Grimes. - Washington, D.C.. ASM Press, 2000. - p.325-342]. Установлено, что значительное количество бактериальных клеток, обладающих жизнеспособными патогенными свойствами, не размножаются в лабораторных условиях [Staley J., Konopka A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats // Annu. Rev. Microbiol. - 1985. - Vol.39 - P.321-346].
Задачей настоящего изобретения является разработка устройства для выделения некультивируемых в лабораторных условиях бактерий, вызывающих патологический процесс в восприимчивом организме.
Технический результат предложенного устройства достигается тем, что на возбудителей инфекционных заболеваний, находящихся в стадии анабиоза, оказывают стрессовое воздействие низкой температурой, в результате которого бактерии из стадии анабиоза переходят в активное репродуктивное состояние, позволяющее микробам размножаться в лабораторных условиях, поэтому необходимо создать оптимальный температурный режим для размножения этих бактерий.
В патентной литературе описано значительное количество термостатов и холодильников различных конструкций и различного назначения [Патент RU №2328709 от 10.07.2008; Патент RU №2317495 от 20.02.2008: и др.]. Все устройства обеспечивают сохранение в пределах ошибки определенной высокой или низкой температуры и не предназначены для вывода бактерий из стадии анабиоза в активное репродуктивное состояние. Устройства не обеспечивают запланированного изменения температурного режима необходимого для выхода бактерий из состояния анабиоза и последующего их накопления. Технически это достигается в результате запрограммированного изменения температурного режима внутри рабочей камеры хладотермостата.
С наиболее близким техническим решением известны хладотермостаты. В качестве прототипа выбран хладотермостат воздушный ТВЛК-50 с полезным объемом рабочей камеры не менее. 100, л, предназначенный для обеспечения заданной постоянной температуры исследуемого объекта (производитель: ЗАО Научно-производительное объединение «ТЕХНОКОМ»). Хладотермостат служит для выращивания микроорганизмов при определенной, оптимальной для их роста температуре, но не предназначен для программированного измегнения температурного режима внутри рабочей камеры, а обеспечивает стабильное поддержание одного температурного режима.
Технический результат достигается тем, что хладотермостат согласно изобретения состоит из рабочей камеры, нагревательного элемента, охлаждающего змеевика, фильтра, испарителя, компрессора, приводного двигателя, пускового защитного реле двигателя, цифрового программирующего устройства и датчика температуры.
Отличительным признаком формулы полезной модели является цифровое программирующее устройство обеспечивающее работу хладотермостата в течение 24 часов при 37°С для репродукции культивируемых бактерий, затем в течение 48 часов при +4°С имеющиеся в популяции бактерии в стадии анабиоза переходят в активное репродуктивное состояние и последующее повышение температуры до 37°С, обеспечивает размножение некультивируемых бактерий на питательных средах в лабораторных условиях.
Предложенная полезная модель поясняется графическим материалом. На фигуре 1 представлен чертеж предлагаемого устройства, где 1 - рабочая камера хладотермостата, 2 - нагревательный элемент, 3 - охлаждающий змеевик, 4 - фильтр, 5 - испаритель, 6 - компрессор, 7 - приводной двигатель, 8 - пусковое защитное реле двигателя, 9 - цифровое программирующее устройство, 10 - датчик температуры.
Практическое использование предложенного изобретения.
7
9
7
9
7
9
Проводят посев выделенной культуры возбудителя инфекционного заболевания на питательную среду для роста бактерий. В течение 18-24 часов при температуре 37°С происходит размножение бактерий. Затем по стандарту мутности в 5 единиц, соответствующей 500000 мк в 1 мл, получают взвесь бактерий, из которой готовят серийные разведения до 10-10. В качестве контроля количества бактерий в этих разведениях проводят посев из этих разведении на плотную питательную среду для получения изолированных колоний. До разведения 10 степени будут определяться колонии бактерий культивируемых в лабораторных условиях, а в разведениях 10-10 роста бактерий не будет наблюдаться. Эти разведения поместили в условия холодильника при температуре +4°С в течение 48 часов (на бактерий оказывают стрессовое воздействие низкой температурой и в результате этого из стадии анабиоза бактерии переходят в активное репродуктивное состояние). Затем из разведении 10-10 степени делают пересев «некультивируемых» бактерий на элективную питательную среду для накопления бактерий и через 24 часа при 37°С происходит размножение бактерий, вышедших из стадии анабиоза, которые находились в популяции данного возбудителя инфекционного заболевания.
На данный способ подана заявка на изобретение в ФГБУ ФИПС за №2011146052/10(068935) от 14.11.2011 «Способ выделения некультивируемых бактерий стафилококка». В настоящее время получено уведомление о проведении экспертизы заявки на изобретение по существу от 05.12.2011 г.
Примеры практического использования:
Пример 1
5
7
6
7
6
7
В декабре 2010 - январе 2011 гг. возникла вспышка, вызванная госпитальным штаммом стафилококка в 3-м роддоме г.Тюмени. От больных выделен возбудитель инфекции и проведен посев бактерий на скошенный мясопептонный агар (МПА). Культивировали бактерии при температуре 37°С в течение 24 часов. В качестве контроля количества бактерий накопленных на МПА провели посев серийных 10-кратных разведении бактерий на чашки Петри с желточно-солевым агаром. Через 24 часа титр микробной взвеси составил 9,0.10, т.е. произошло накопление культивируемых в лабораторных условиях стафилококков. Из культуры бактерий, выросших на МПА, по стандарту мутности в 5 единиц, соответствующей 500000 мк в 1 мл, приготовили серийные разведения до 10. Серийные разведения бактерий выдержали в условиях холодильника 48 часов при температуре +4°С и определили концентрацию бактерий в разведениях, в которых не определялись бактерии после первичного накопления на питательной среде. Контроль наличия бактерий в серийных разведениях 10-10 степени определяли по результатам посева бактерий на чашки Петри с желточно-солевым агаром. Бактерии определялись в разведениях - 10 и 10 степени. Выделенные бактерии накапливали на МПА в течение 24 часов при температуре 37°С. После накопления бактерий провели их идентификацию. Установлено, что произошло накопление бактерий S. aureus.
Пример 2
5
7
6
7
6
7
От больного с гнойно-воспалительным процессом выделен спорадический штамм стафилококка. От больных выделен возбудитель инфекции и проведен посев бактерий на МПА. Культивировали бактерии при температуре 37°С в течение 24 часов. В качестве контроля количества бактерий накопленных на МПА провели посев серийных 10-кратных разведении бактерий на чашки Петри с желточно-солевым агаром. Через 24 часа титр микробной взвеси составил 10,4.10, т.е. произошло накопление культивируемых в лабораторных условиях стафилококков. Из культуры бактерий, выросших на МПА, по стандарту мутности в 5 единиц, соответствующей 500000 мк в 1 мл, приготовили серийные разведения до 10. Серийные разведения бактерий выдержали в условиях холодильника 48 часов при температуре +4°С и определили концентрацию бактерий в разведениях, в которых не определялись бактерии после первичного накопления на питательной среде. Контроль наличия бактерий в серийных разведениях 10-10 степени определяли по результатам посева бактерий на чашки Петри с желточно-солевым агаром. Бактерии определялись в разведениях - 10 и 10 степени. Выделенные бактерии накапливали на МПА в течение 24 часов при температуре 37°С. После накопления бактерий провели их идентификацию. Установлено, что произошло накопление бактерий S. aureus.
Предложенное устройство апробировано на базе бактериологической лаборатории Тюменского филиала ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии по железнодорожному транспорту». Всего проведено 26 исследований со штаммами бактерий, вызвавших инфекционный процесс в организме восприимчивых организмов. Результаты выделения некультурабельных бактерий представлены в таблице.
Предложенное устройство позволяет из популяций возбудителей инфекционных заболеваний выделять и накопить бактерии, находящихся в стадии анабиоза, что повышает эффективность лабораторной диагностики, а именно, уменьшает количество ложноотрицательных результатов лабораторных исследований и позволяет в более полном объеме проводить противоэпидемические расследования при возникновении вспышек инфекционных заболеваний, а также осуществлять эффективные противоэпидемические мероприятия, направленные на источник инфекционного заболевания.