Действие рекомбинантного альфа-2 интерферона на вирус гриппа H1N1 (Москва 2009): активность генов врождённого и адаптивного иммунитета и воспалительных цитокинов

Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ

49

and abnormalities in young adult women at enrolment in the multinational PATRICIA trial // Gynecol. Oncol. - 2012. - Vol. 127 (3). - P. 440-450. PMID: 22940493.

6. Jensen, K.E., Thomsen, L.T., Schmiedel, S., Frederiksen, K. Chlamydia trachomatis and risk of cervical intraepithelial neoplasia grade 3 or worse in women with persistent human papillomavirus

infection: a cohort study // Sex. Transm. Infect. - 2014. -Vol. 90 (7). - P. 550-555. PMID: 24728044.

7. Roura, E., Castellsaque, X., Pawlita, M. Smoking as a major risk factor for cervical cancer and pre-cancer: results from the EPIC cohort // Int. J. Cancer. - 2014. -Vol. 135 (2). - P. 453-466. PMID: 24338632.

ДЕЙСТВИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АЛЬФА-2 ИНТЕРФЕРОНА НА ВИРУС ГРИППА H1N1 (МОСКВА 2009): АКТИВНОСТЬ ГЕНОВ ВРОЖДЁННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА И ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ

Соколова Татьяна Михайловна

Доктор биологических наук ведущий научный сотрудник Шувалов Александр Николаевич младший научный сотрудник Полосков Владислав Васильевич

Аспирант, Лаборатория Интерфероногенеза Федерального научно-исследовательского центра

им. Н. Ф. Гамалеи» МЗ РФ, г. Москва

АННОТАЦИЯ

Цель. Оценка антивирусного действия рекомбинантного альфа-2 ИФН («Фармапарк», Россия) в экспериментах с вирусом гриппа А H1N1 (Москва 2009) на клетках крови здоровых доноров.

Метод. Определение уровней экспрессии генов сделано методом ОТ-ПЦР в реальном времени (CFX-96, «Биорад»). Продукция цитокинов ИЛ1-бета и ФНО-альфа измерена с помощью ИФА-наборов фирмы «Вектор-бест» на Микропланшетном фотометре модель «Anthos 2010» в программе ADAP+ (Biochrom, Великобритания). Вирус гриппа А H1N1 (Москва 2009) был приготовлен к.м.н. И.А. Рудневой (Лаборатория физиологии подразделение «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского»).

РЕЗУЛЬТАТ

Вирус гриппа А H1N1 (Москва 2009) с инфекционным титром 104 ТЦД50/мл подавляет активность генов рецепторов TLR7 и RIG1 при добавлении к клеткам крови здоровых доноров на срок 24 ч при 37°С. Альфа-2 ИФН стимулирует транскрипцию генов рецепторов врождённого - TLR7 и адаптивного - B2M иммунитета. Антивирусное действие препарата альфа-2 ИФН в дозе 104 МЕ/мл проявляется при совместном внесении с вирусом: устраняется негативное действие вируса на ген рецептора TLR7 и достоверно снижается содержание вирусных РНК в клетках. Вирус гриппа А H1N1 (Москва 2009) вызывает слабую воспалительную реакцию в клетках крови, увеличивая продукцию сигнального воспалительного ИЛ1-бета и ФНО-альфа.

Выводы. Представленные данные показывают, что препарат рекомбинантного альфа-2 ИФН («Фармапарк», Россия) оказывает антивирусное действие на вирус гриппа А H1N1 (Москва 2009), активируя транскрипцию гена рецептора TLR7 и подавляя уровень вирусных РНК в клетках. Экспрессия генов TLRs, RLRs и B2M рецепторов и секреция ИЛ1-бета клетками крови могут быть использованы как информативные молекулярные маркёры эффективности ИФН-терапии при гриппозной инфекции.

ABSTRACT

Background. The antiviral action of recombinant alpha-2 IFN (“Pharmapark”,Russia) was studied in experiments with influenza virus A H1N1 (Moscow 2009) in culture blood cells of human donors.

Methods. The levels of gene expression was estimated by RT-PCR method in real time (CFX-96 ”Bio-Rad”). Production of IL1-beta and TNF-alpha cytokines was detected by Eliza-kits “ Vector-best” on Microplate reader «Anthos 2010» using ADAP+ program (Biochrom, Great Britain). Influenza virus A (Moscow 2009) was prepared by PhD I.A. Rudneva (deparment “D.I. Ivanovsky Institute of Virology”).

Result. Influenza virus A H1N1 (Moscow 2009) with infection titer 104 CPD50/ml decreases activity of TLR7 и RIG1 receptor genes in blood cells of human donors during 24 h 37°C. Alpha-2 IFN stimulates transcription levels of receptor genes: TLR7 innate and B2M adaptive immunity. Antiviral action of drug alpha-2 IFN in dose 104 ME/ml takes place together with virus: it was absent the negative viral effect on TLR7 gene transcription and it was lowed viral RNA levels (p<0,05). Influenza virus A H1N1 (Moscow 2009) results in weak inflammatory reaction in blood cells, increases the signaling IL1-beta and TNF-alpha production.

Conclusion. The data demonstrate the antiviral action of recombinant of alpha-2 IFN (“Pharmapark” Russia) influenza virus A H1N1 (Moscow 2009) by activating receptor gene TLR7 transcription and by inhibiting viral RNA levels in blood cells. The expression of immune receptor genes TLR, RLR and B2M may be used as informative molecular markers of IFN-effects in viral infection.

Ключевые слова: вирус гриппа А (H1N1)pdm09, рекомбинантный альфа2-ИФН, сигнальные рецепторы иммунитета TLRs, RIG1, B2M, клетки крови человека

Keywords: Influenza virus A (H1N1)pdm2009, recombinant alpha-2 IFN, signaling immune receptors TLRs, RIG1, B2M, human bood cells.

Текст статьи. Препараты рекомбинантных альфа2- торами при различных патологиях вирусного и бактери-ИФН известны как эффективные профилактические и ле- ального происхождения. Патогенез пандемического ви-карственные средства [1]. ИФН являются иммунокоррек- руса гриппа А (H1N1) pdm09 активно изучается, но его механизмы во многом неясны [2,9]. В исследованиях на

50

Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ

животных показано, что пандемический вирус размножается в клетках респираторного тракта активнее сезонного [12]. Пандемический вирус гриппа 2009 г. имеет реассор-тантную природу, происходит из свиного и распространился в человеческую популяцию [2-4,19]. Генетические отличия пандемического вируса от сезонного делают применение разработанных противогриппозных вакцин малоэффективным [9]. Значимость препаратов ИФН особенно возрастает в условиях отсутствия эффективных вакцин. Основное место репликации вирусов гриппа эпителиальные клетки, но клетки крови моноциты/макрофаги и другие лейкоциты также могут быть инфицированы вирусом [10,18]. В узнавании вирусов гриппа участвуют рецепторы врождённого иммунитета RIG1, TLR3, TLR4 и TLR7 [13,14, 16]. Идущие с этих рецепторов сигналы приводят к активации генов ИФН, антивирусных и апоптозных белков. Вирусы гриппа нарушают этот процесс с помощью различных механизмов, в первую очередь направленных на подавление сигнальных путей врождённого иммунитета [9, 20]. ИФН типа 1 интерферируют с вирусной репликацией, активируют иммунные клетки и делают окружающие клетки резистентными к вирусу [15,17]. Значимость препаратов ИФН особенно возрастает в условиях отсутствия эффективных вакцин. Исследования с вирусом Карельской лихорадки в клетках крови, проведенные нами ранее, показали высокую чувствительность альфавируса к препарату рекомбинантного альфа-2 ИФН (Реаферон «Вектор» Россия) [7]. Индуктор ИФН - препарат «Рибонуклеат натрия» усиливает действие инактивированных гриппозных вакцин, стимулируя гены сигнальных TLRs и RLRs рецепторов, ИФН и антивирусных ферментов [5,6].

В настоящей работе впервые исследовано влияние препарата альфа-2 ИФН («Фармапарк» Россия) на вирус гриппа A/Moscow/IIV01/2009 (H1N1) на уровне транскрипции генов рецепторов врожденного и адаптивного иммунитета. Полученная информация о действии вируса на уровне сигнальной трансдукции дополняет имеющиеся знания о молекулярных механизмах патогенеза. Действие пандемического вируса гриппа и рекомбинантного альфа-2 ИФН на сигнальные реакции иммунитета исследовано в клетках крови доноров. Сравнили регуляцию вирусом и ИФН группы генов TLRs и RIG1рецепторов, влияние на внутриклеточные уровни вирусных РНК и продукцию воспалительных цитокинов ИЛ1-бета и ФНО-альфа.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Вирус гриппа A/Moscow/IIV01/2009 (H1N1) получен из лаборатории физиологии вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, размножен в культуре клеток MDCK в присутствии трипсина TPCK 1 мкг/мл (титр 104 ТЦД50 ), хранили при -80°С в аликвотах по 0,5 мл.

Препарат Реаферон (рекомбинантный альфа2-ИФН) 108 МЕ/мл фирмы «Фармапарк», Россия. В настоящее время используется для приготовления препарата «Виферон».

Постановка опытов на клетках крови. Свежевзятую венозную кровь 2-х доноров исследовали параллельно. 10 мл крови каждого донора разводили в 3 раза питательной средой RPMI-1640 c 10% сыворотки эмбрионов коров и антибиотиком гентамицин и разливали по 3 мл в стерильные пробирки с крышками. Варианты анализа: 1) контроль (без обработки); 2) альфа-2 ИФН; 3) альфа-2 ИФН + вирус гриппа; 4) вирус гриппа. К пробам добавляли рекомбинантный препарат альфа2ИФН в 2-х дозах 104 и 103

МЕ/мл и затем сразу вносили вирус гриппа A/Moscow/IIV01/2009 (ШШ) в количестве 20 мкл с титром 104 ТЦД50. Инкубацию продолжали 24 ч при 37°С.

Образцы центрифугировали 5 мин при 3000 об\мин. К осадкам клеток добавляли 0,8 мл реагента Trizol («!^1й^еи»,США), пипетировали и замораживали при -80° С для выделения РНК. Супернатант собирали для определения цитокинов методом ИФА.

ПЦР-праймеры к консервативному 7 сегменту РНК вирусов гриппа описаны в литературе [8]. Праймеры взаимодействовали с РНК гена белка М1 вируса гриппа A/Moscow/IIV01/2009 (H1N1) (Генбанк NCBI accession GQ219584.1 L’vov D.K., Prilipov A.G., Sadykova G.K., Usachev E.V.). Праймеры к мРНК B2M опубликованы нами ранее [5]. Праймеры к мРНК TLR7 и мРНК RIG1 расcчитаны в программе Primer 3 Blast (NCBI GenBank) и приведены ниже: TLR7 прямой 5-AGATGC CTTC CAG TTGCGAT; обратный 5-AACCACACA GCA TCACA GGT.TLR8 прямой 5-CCTCGTCTCGA GTTGCTTGA; обратный 5-GAAAGCCAGAGGGTAGGTGG. RIG1 прямой 5-CCAGAGAACCAGTTG GGCTT; обратный 5-TCTCC ACCATCTCTGGACACC. Все праймеры синтезированы фирмой Синтол (Россия).

Процедуры выделения РНК и проведение ОТ-ПЦР в реальном времени подробно описаны в работах [5-7]. Количественную ПЦР в реальном времени ставили на приборе CFX-96 (“Bio-Rad”, США) с готовой 2х-кратной смесью SsoFast EvaGreen Supermix. К разведенной 1/3 или 1/9 кДНК добавляли пары специфических праймеров (прямого и обратного).

Полученные ПЦР-продукты, соответствовали расчётным по Т-плавления и подвижности в агарозном геле. Относительная оценка экспрессии генов (дельтаCq) сделана в программе CFX Manager «Gene expression analysis» в автоматическом режиме.

Определение цитокинов ИЛ1 -бета и ФНО-альфа в культуральной жидкости выполнено с помощью ИФА-наборов фирмы «Вектор-бест» согласно прилагаемой инструкции. Количественное измерение оптической плотности и расчёт средних концентраций 2-х повторных образцов в пг/мл выполнен на Микропланшетном фотометре модель «Anthos 2010» в программе ADAP+ (Biochrom, Великобритания).

Статистическая обработка результатов сделана в программе Medcalc с применением t-tests при р< 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гриппозная инфекция у человека характеризуется быстрым воспалительным ответом, который проявляется наиболее сильно в клетках дыхательных путей [11]. Взаимодействие вирусов гриппа с иммунокомпетентными клетками вызывает продукцию цитокинов и это способствует распространению вируса в организме человека. Наиболее восприимчивы к вирусу гриппа макрофаги и дендритные клетки и стимулированные моноциты, которые в основном формируют иммунный ответ [18]. Имеются данные о позитивном влиянии на чувствительность к вирусу факторов клеточной дифференцировки [10]. Пока нет однозначного мнения о возможности вирусов гриппа размножаться в клетках крови. Однако, даже инактивированный УФ-лучами, неинфекционный вирус гриппа сохраняет цитокин индуцирующие активности, взаимодействуя с рецепторами врождённого иммунитета.

На рисунке представлено действие пандемического вируса и альфа-2 ИФН при раздельном и совместном добавлении к клеткам крови 2-х доноров.

Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ

51

вирус ИФН вирус+ИФН вирус ИФН вирус+ИФН

Рисунок. Действие вируса A/Moscow/2009 (H1N1), альфа2-ИФН и комбинации альфа2-ИФН + вирус на экспрессию

генов сигнальных рецепторов иммунитета в клетках крови.

По оси ординат - кратность изменений генной активности (дельтаCq) относительно контроля, принятого равным 1.

Доза альфа-2 ИФН 104 МЕ/мл.

Сделана количественная оценка уровней экспрессию 3-х генов: эндосомального рецептора TLR7, цитоплазматического рецептора RIG1 и B2M - ко-рецептора главного комплекса гистосовместимости MHC, участвующего в адаптивном иммунном ответе. Видно подавление вирусом транскрипции генов TLR7 и RIG1 в клетках крови 2-х доноров. Ингибирование пандемическим вирусом H1N1 экспрессии гена RIG1 уже было описано ранее [20]. По нашим данным вирус дополнительно негативно

регулирует экспрессию гена TLR7. Рекомбинантный альфа-2 ИФН в дозе 104, напротив, стимулирует активность генов рецепторов TLR7, RIG^ B2M. Одновременное добавление к клеткам крови вируса и ИФН мало изменяет картину генной экспрессии, индуцированную одним ИФН. Поэтому ингибирующее действие вируса на ген TLR7 устраняется добавлением рекомбинантного альфа-2 ИФН.

В таблице суммированы результаты действия альфа-2 ИФН в дозе 104 МЕ на содержание вирионной РНК в клетках крови.

Таблица

Содержание РНК вируса H1N1 и продукция цитокинов в клетках крови

Показатели Способ воздействия

Вирус H1N1 Вирус H1N1+ альфа-2 ИФН*** альфа-2 ИФН Контроль клеток

*ОТ-ПЦР ген М1 РНК вируса 1±0,08 0,3±0,05 0 0

**ИФА ИЛ1-бета пг/мл 46 58 118 15

ФНО-альфа пг/мл 9 10 11 3

*Относительные изменения генной экспрессии дельтаСq±SD. **Средние арифметические 2-х повторных измерений. * * *Доза альфа-2 ИФН 104 МЕ/мл.

После 24 ч контакта с вирусом внутриклеточный уровень вирионной РНК достоверно снижается приблизительно в 3 раза. В ответ на вирус и ИФН возрастает продукция клетками крови ИЛ1-бета и незначительно ФНО-альфа.

Таким образом показано, что вирус гриппа А (H1N1)pdm09 вызывает подавление активности генов RIG1 и TLR7 в клетках крови людей. Рекомбинантный альфа-2 ИФН повышает экспрессию генов рецепторов врождённого иммунитета в клетках крови человека и снижает в них содержание вирионной РНК вируса гриппа А. Дополнительно, альфа-2 ИФН устраняет негативное влияние вируса гриппа H1N1 на экспрессию гена рецептора TLR7 - основного сигнального рецептора в дендритных клетках. Снижение содержания вирусных РНК в клетках крови может быть вызвано активацией ИФН-регулируе-мой РНК-азы и индуцированных процессов аутофагии в зараженных клетках.

Таким образом, наши результаты ex vivo на клетках крови, с вирусом гриппа А H1N1 (Москва, 2009) подтверждают выводы зарубежных исследователей на больных гриппом. Полученные данные характеризуют пандемический вирус гриппа 2009 как чувствительный к антивирусному действию ИФН и как слабый индуктор цитокинов в

макрофагах и дендритных клетках человека [15]. Нарушения транскрипционного ответа, вызываемые вирусами в генах сигнальных рецепторов клеток крови, и возможности их коррекции препаратами рекомбинантных ИФН являются важными показателями при выборе тактики лечения.

Список литературы

1. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты: справочник (2-е изд.). М.: Геотар Медиа. 2006. - 312 с.

2. Киселёв О.И. Геном пандемического вируса гриппа A/H1N1v-2009. С-П-М.: Компания «Димитрейд График групп» - 2011.

3. Львов, Д.К. Изоляция 24.05.2009. и депонирование в Государственную коллекцию вирусов (ГКВ № 2452 от 24.05.2009) первого штамма A/VII-Moscow/01/2009 больного в Москве / Д.К. Львов, Е.И. Бурцева, А.Г. Прилипов и др.// Вопросы вирусологии. - 2009. - Т. 54 - № 5. - С. 10-14.

4. Львов, Д.К. Распространение нового пандемического вируса гриппа A(H1N1)v в России / Д.К. Львов, Е.И. Бурцева, М.Ю. Щелканов и др.// Вопросы вирусологии. - 2010. - Т. 55. - № 3.- С. 4-9.

5. Соколова, Т.М. Стимуляция экспрессии генов сигнальных рецепторов и индукция синтеза цитокинов в клетках крови человека при действии препарата

52

Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ

«Рибонуклеат натрия» и его комбинаций с гриппозными вакцинами in vitro / Т.М Соколова, А.Н. Шувалов, В.В. Полосков, И.М. Шаповал, М.П. Кости-нов // Молекулярная медицина. - 2015. - № 1. -С.12-17.

6. Соколова, Т.М. Препарат «Ридостин» индуцирует транскрипцию широкого спектра генов системы интерферона в клетках человека / Т.М. Соколова, А.Н. Шувалов, М.В. Телков, Л.В. Колодяжная, Ф.И. Ершов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156. - № 8. - С. 179-182.

7. Соколова, Т.М. Подавление рекомбинантным альфа-2 интерфероном репродукции вируса Карельской лихорадки в клетках крови человека / Т.М. Соколова, А.Н. Шувалов // Вопросы вирусологии. - 2011. - Т. 57. - № 2. - С. 27-31.

8. Fouchier, R. A. M. Detection of influenza A viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene / R. A. M. Fouchier, T. M. Bestebroer, S. Herst, L. van der Kemp, G. F. Rimmerlzwaan et al. // J. of Clinical Microbiology. - 2000. - V. 38. - N 11. - P. 4096-4101.

9. Hale B.G. Innate immune evasion strategies of influenza viruses / B.G. Hale, R.A. Albrecht, A.Garcia-Sastre // Future Microbiol. - 2010. - N 5. - P. 23- 35.

10. Hoeve, M.A. Influenza virus A infection of human monocyte and macrophage subpopulations reveals increased susceptibility associated with cell differentiation / M.A. Hoeve, A.A. Nash, D. Jackson et al. // Plos One. - 2012. - V. 7. - N 1. - e29443.

11. Julkunen, I. Inflammatory responses in influenza A virus infection / I. Julkunen, K. Melen, Nyqvist et al. // Vaccine. - 2000. - V. 19. - S32-37.

12. Kwon, D. Replication and pathogenesis of the pandemic (H1N1) 2009 influenza virus in mammalian models / D. Kwon, K. Shin, S. Kim et al. // J. Microbiol. - 2010. - V. 48. - P. 657- 662.

13. Lee, N. Role of human Toll-like receptors in naturally occurring influenza infections / N. Lee, C.K. Wong, D.S. Hui et al. // Influenza other Respir. viruses. - 2013.

- V. 7. - N 5. - P. 666-675.

14. Liu, Y. Antiviral role of Toll-like receptors and cytokines against the new 2009 H1N1 virus infection / Y.Liu, H.Chen, Y. Sun, F.Chen // Mol. Biol. Rep. -2012. - V. 39. - N 2. - P. 1162-1172.

15. Osterlund, P. Pandemic H1N1 2009 influenza A virus induces weak cytokine responses in human macrophages and dendritic cells and is highly sensitive to the antiviral actions of interferons / P. Osterlund, J. Pirhonen, N. Ikonen et al. // J. Virol. - 2010. - V. 84. N 3.

16. Rehwinkel, J. RIG1 detects viral genomic RNA during negative-strand RNA virus infection / J. Rehwinkel, C. P. Tan, D.Goubau et al. // Cell. - 2010. - V. 140. P. 397- 408.

17. Ronni, T. Regulation of IFN-alpha/beta, MxA, 2',5'-oligoadenylate synthetase, and HLA gene expression in influenza A-infected human lung epithelial cells / T. Ronni, S. Matikainen, T. Sareneva, K. Melen, J. Pirhonen et al. // J. of Immunology - 1997. - V.158. -P. 2363-2374.

18. Short, K.R. The fate of influenza A virus infection of human macrophages and dendritic cells / K.R. Short, A.G. Brooks, P.C. Reading et al. // J. General Virology.

- 2012. - V. 93. - P. 2315-2325.

19. Smith, G.J. Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine origin H1N1 influenza A epidemic / G.J. Smith, D. Vijaykrishna, J. Bahl et al. // Nature. - 2009.

- V. 459. - P. 1122-1125.

20. Wu, W. Influenza A (H1N1)pdm09 virus suppresses RIG1 initiated innate antiviral responses in the human lung / W. Wu, W. Zhang, J.L. Booth, J.P. Metcalf J.P. et al. // PLOS ONE. - 2012. - V. 7. N11. e49856.

ХОЛОНИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ УПРАВЛЕНИЯ ГОРОДСКОЙ ПОЛИКЛИНИКОЙ

Суслин Сергей Александрович,

доктор медицинских наук, Самарский государственный медицинский университет, г. Самара

Федосеева Лидия Сергеевна,

кандидат медицинских наук, главный врач, Самарская городская клиническая поликлиника № 15, г. Самара,

Назаркина Ирина Михайловна,

кандидат медицинских наук, заместитель главного врача, Самарская городская клиническая поликлиника № 15,

г. Самара

HOLONIC MANA GEMENT MODEL CITY POL YCLINIC

Sergey Suslin, MD, Samara State Medical University, Samara, Lidia Fedoseyeva, PhD, chief medical officer, Samara city clinical clinic number 15, Samara, Nazarkina Irina, PhD, deputy chief medical officer, Samara city clinical clinic number 15, Samara

АННОТАЦИЯ

В статье рассматриваются вопросы управления качеством медицинской помощи с позиций холонического подхода в условиях городской клинической поликлиники № 15 г. Самары - одного из крупных амбулаторно-поликлинических учреждений Самарской области. Показана эффективность холонической модели управления, основанной на принципах самоорганизации, гибкости и иерархичности.

ABSTRACT

The article deals with the management of quality of care from the point of holonic approach in urban clinical clinic number 15 in Samara - one of the largest outpatient clinics of the Samara region. The efficiency of holonic management model based on the principles of self-organization, flexibility and hierarchy.

Ключевые слова. Амбулаторно-поликлиническая помощь, управление качеством медицинской помощи, холониче-ская модель управления

Keywords. Outpatient care management, quality of care, holonic management model.