Использование различных дериватизирующих агентов при определении гомоцистеина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

ФАРМАКОЛОГИЯ, ТОКСИКОЛОГИЯ

А. Ф. Рябуха, Л. А. Смирнова, К. А. Кузнецов, Е. А. Сучков, В. Н. Перфилова

Волгоградский государственный медицинский университет, лаборатория фармакокинетики НИИ фармакологии, кафедра фармакологии и биофармации ФУВ, ГУ ВМНЦ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ДЕРИВАТИЗИРУЮЩИХ АГЕНТОВ

ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ГОМОЦИСТЕИНА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ

ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

УДК 615:547.466

Проведен сравнительный анализ методик определения гомоцистеина в плазме крови. Воспроизведены две методики определения - количественное определение методом ВЭЖХ после дериватизации с SBD-F и ортофталевым альдегидом.

Ключевые слова: гомоцистеин, ВЭЖХ, дериватизация, ОРА/2МЕ, SBD-F.

A. F. Riabuha, L. A. Smirnova, K. A. Kuznetsov, E. A. Suchkov, V. N. Perfilova

DERIVATIZATION AGENTS USED IN HPLC METHOD OF HOMOCYSTEIN DETERMINATION

Analysis of different methods of homocystein determination in the plasma was performed. Two methods of determination were reproduced - HPLC methods of quantitative determination after derivatization with SBD-F and orthophtalic aldehyde.

Key words: homocystein, HPLC, derivatization, OPA/2ME, SBD-F.

Гомоцистеин - серосодержащая аминокислота, которая может катаболизироваться в ци-стеин или реметилироваться в метионин. Избыток гомоцистеина (гипергомоцистеинемия) повышает риск раннего развития атеросклероза и тромбоза артерий и является прогностическим маркером летального исхода. В плазме крови гомоцистеин (ГЦ) присутствует в трех молекулярных формах: свободный ГЦ, дисульфид ГЦ (гомоцистин) и дисульфид ГЦ с цистеином. Большая часть (около 70 %) ГЦ связана с белками. Свободный и связанный с белком ГЦ составляют общий ГЦ [1].

Перед определением ГЦ и цистеина в плазме/сыворотке крови их необходимо высвободить из дисульфидов и связи с белками. В качестве восстанавливающих веществ из различных дисульфидных связей используют соединения дитиоэритритол, дитиотрейтол, меркаптоэтанол, а также борогидриды натрия или калия.

Для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) анализа тиолов чаще всего их превращают во флуоресцирующие производные путем реакции с биманами или галоген-

сульфонилбензофуранами [аммоний-7-фтор-бензо-2-окса-1,3-диазол-4-сульфонат (SBD-F), 4-амино-сульфонил-7-фторбензо-2-окса-1,3-диа-зол (ABD-F)]. Эти методы имеют высокую чувствительность определения, но ряд недостатков - продолжительность реакции варьирует от 10 до 60 мин, а для анализа необходим флуориметрический детектор. Недостатком последних двух методов является также использование в ряде методик токсичного восстанавливающего реагента (три-п-бутил-фосфин) [4].

ГЦ и другие тиолы можно дериватизиро-вать с помощью ортофталевого альдегида/ 2-меркаптоэтанола (ОФА-2МЕ). Реакция не является тиолспецифичной и помимо цистеина и ГЦ позволяет определять другие аминокислоты [2 ].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Выбрать наиболее чувствительную, селективную и воспроизводимую методику для определения содержания гомоцистеина в плазме крови крыс.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Содержание вещества определяли методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Shi-madzu (Япония) с флуоресцентным детектором RF-10Axl, колонка SUPELCOSIL LC-18 (5 мкм; 150 мм х 4,6 мм). В работе использовали де-риватизирующие агенты: ОФА-2МЭ (метод 1) и SBD-F (метод 2).

Метод 1

Подвижная фаза состояла из ацетонитри-ла (16 %), №2НРО4 (0,01 М), №Н2РО4 (0,01 М), №2-ЭДТА (0,002 М), рН 7,0. Скорость потока элюента 1 мл/мин, t = 26 °С. Детектирование проводили при длине волны возбуждения 340 нм, испускания - 450 нм.

Для восстановления дисульфидных связей в плазме крови использовали 2-меркаптоэтанол (2-МЭ). Образующиеся сульфгидрильные группы алкилировали при помощи йодуксусной кислоты (0,8 М).

Ортофталевый/2-МЭ (ОФА/2-МЭ) реагент получали следующим образом: 27 мг ОФА растворяли в 0,5 мл метанола [раствор (1)]. Раствор (1) хранился при -20 °С. Раствор (2), используемый для получения деривата гомоци-стеина, готовили непосредственно перед использованием, смешивая 20 мкл раствора (1) с 40 мкл 2-МЭ и 140 мкл 0,1 М раствора №2В4О7 (рН = 12,5).

Перед реакцией модификации проводили депротеинизацию образцов плазмы метанолом.

Для перевода гомоцистеина в производное к 20 мкл супернатанта добавляли 20 мкл 0,8 М йодуксусной кислоты (для защиты сульф-гидрильных групп), 20 мкл реагента (2) и 140 мкл 0,1 М №2В4О7, перемешивали в течение 5 мин, после чего 10 мкл смеси вводили в хроматогра-фическую систему.

М етод 2

Для дериватизации гомоцистеина этим методом использовали аммоний-7-фторбензо-2-окса-1,3-диазол-4-сульфонат (SBD-F). Подвижная фаза включала ацетонитрил (10 %), 0,1 М КН2Р04 (90 %), рН 2,1. Скорость потока элюента 1 мл/мин, t = 30 °С. Детектирование проводили при длине волны возбуждения 385 нм, испускания - 515 нм [3].

В качестве восстанавливающего агента мы использовали ТСЕР [трис-(2-карбоксиэтил)-фосфин], менее токсичный и более стабильный по сравнению с другими восстановителями.

Кровь откручивали, получали плазму. К 90 мкл супернатанта добавляли 10 мкл внутреннего стандарта (монопропионилглицин, в концентрации 10 мкг/мл) затем добавляли 10 мкл 10%-го ТСЕР, 30 минут инкубировали при температуре 4 °С, добавляли 100 мкл холодной 10%-й ТХУ с 1 тМ ЭДТА, центрифугировали 5 мин при 21000 д. Супернатант (100 мкл) переносили в эппендорф, к нему добавляли 20 мкл 1,55 М №ОН, 250 мкл 0,125 М боратного буфера (рН 9,5) с 4 тМ ЭДТА и 50 мкл SBD-F (1 г/л) в 0,125 М боратном буфере, рН 9,5, инкубировали при 60 °С 60 мин и охлаждали во льду для последующего хроматографического анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Чувствительность методики ОФА/2-МЕ составила 1 мкг/мл, но средняя ошибка измерения была выше 20 % по всем концентрациям (табл. 1, рис. 1).

с, мкг/мл

Рис. 1. График зависимости площади пика от концентрации гомоцистеина при дериватизации ОФА-2МЭ

Таблица 1

Статистические параметры определения гомоцистеина после дериватизации с OФA-2MЭ

С добавл., мкг\мл С получ., мкг/мл С ср. Ст. откл. Ошибка, %

0,379902

0,5 0,301498 0,402544 0,114064 28,3359

0,526231

1,042562

1 1,041574 0,970951 0,12318 12,68648

0,828717

5,262598

5 6,107814 4,76279 1,652619 34,69854

2,917959

14,36897

10 9,144474 10,41362 3,497936 33,59

7,72743

67,37311

50 29,92634 49,94609 18,85754 37,75579

52,53883

Полученные дериваты были крайне нестабильны и для получения воспроизводимых результатов необходимо было каждую пробу деривати-зировать отдельно.

Это существенно увеличивает время анализа и делает невозможным использование дан-

ной методики в рутинной клинической практике. Чувствительность методики дериватизации SBD-F составила 500 нг/мл. Средняя ошибка измерения была ниже 10 % в диапазоне изученных концентраций, дериваты стабильны в течение суток (рис. 2, табл. 2).

1,4

1,2

ет 1 а

Е 0,8 § 0,6 Й 0,4 0,2 0

у = 0,0001х I 0,0163 Р = 0,997

0 2000 4000 6000 8000

С гц, нг/мл

10000 12000

Рис. 2. График зависимости площади пика от концентрации гомоцистеина при дериватизации SBD-F

Таблица 2

Статистические параметры определения гомоцистеина после дериватизации с SBD-F

С добавл. нг/мл C получ., нг/мл С ср. Ст. откл. Ошибка, %

100 33,5807 125,5013 79,98326 63,731

179,225

163,6983

500 617,5297 664,2774 40,4864 6,094803

687,2823

688,0203

1000 1191,229 1333,91 126,6325 9,493326

1377,553

1432,95

5000 5426,054 5348,75 209,0908 3,909152

5508,181

5112,014

10000 11199,24 11830,22 618,2811 5,226287

12434,97

11856,44

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, методика дериватизации гомоцистеина с SBD-F имеет высокую воспроизводимость, чувствительность и селективность, что позволяет использовать ее в клинической и лабораторной диагностике.

ЛИТЕРАТУРА

1. Дутов А. А, Никитин Д. А, Федотова А. А. // Биомедицинская химия. - 2010. - Т. 56, вып. 5. - С. 609-615.

2. Черкас Ю. В., Денисенко А. Д. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2001. - № 5. -С. 35-37.

3. Pfeiffer C. M, Huff D. L., Gunter E. W. / Clinical Chemistry. - 1999. - Vol. 45. - P. 290-292.

4. Ueland M., Refsum H., Stabler S. P., et. al. // Clinical chemistry. - 1993. - Vol. 39. - № 9. -P.1464-1779.

5. Tyurenkov I. N., Perfilova V. N., Smirnova L. A, et al. / Pharmaceutical Chemistry Journal. - 2010. -№ 44 (12). - Р. 702-704.