Метод экспресс-оценки алюмотолерантности у гороха посевного ( p Isum sativum L. )

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 50, № 3, с. 353-360

УДК 635.655:581.1:631.453 doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.353rus

МЕТОД ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКИ АЛЮМОТОЛЕРАНТНОСТИ У ГОРОХА ПОСЕВНОГО (Pisum sativum L.)*

М.А. ВИШНЯКОВА1, Е.В. СЕМЕНОВА1, И.А. КОСАРЕВА1, Н.Д. КРАВЧУК1,

С.И. ЛОСКУТОВ2, Я.В. ПУХАЛЬСКИЙ2, А.И. ШАПОШНИКОВ2,

А.Л. САЗАНОВА2, А.А. БЕЛИМОВ2

Сельскохозяйственные культуры существенно различаются по устойчивости к кислым почвам, при этом многие зернобобовые, включая горох посевной (Pisum sativum L.), относят к чувствительным или среднечувствительным культурам по сравнению с зерновыми. Основным фактором, определяющим фитотоксичность кислых почв, служит повышенная концентрация подвижных ионов алюминия в почвенном растворе. Аккумуляция алюминия в тканях корня нарушает процессы деления клеток, инициации и роста боковых корней, снабжения растения минеральными веществами и водой. В лабораторных условиях устойчивость растений к алюминию оценивается по степени повреждения корней алюминием с помощью красителей (гематоксилин, эриохромцианин R) и способности корней восстанавливать рост после токсического действия этого металла. Представляемое исследование посвящено разработке экспресс-оценки алюмотолерантности специально для гороха. Предложенный метод заключается в следующем: семена проращивали в фитотроне в питательном растворе в течение 3 сут (освещенность 7000 лк, температура 19 °С ночью и 21 °С днем, фотопериод 16 ч); обрабатывали токсичной концентрацией хлорида алюминия (3 мг Al/л) в течение 24 ч; инкубировали проростки в питательном растворе без алюминия в течение 2 сут и окрашивали корни 0,1 % раствором эриохромцианина R в течение 10 мин. Зона повреждения тканей корней алюминием окрашивалась в фиолетовый цвет. Устойчивость растений к алюминию определяли по длине отрастания кончика корня после воздействия токсиканта. С использованием 19 образцов гороха разного происхождения и хозяйственного направления из коллекции Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.В. Вавилова (коллекция ВИР) показано, что горох имеет высокую вариабельность по алюмотолерантности. Образцы с минимальной (1,0*1,5 мм) длиной отрастания корня (к-2759, к-3654 и к-3283) характеризовались интенсивной фиолетовой окраской обработанного алюминием участка корня, а образцы с максимальной (14,0*14,5 мм) длиной отрастания корня (к-4376, к-9504 и к-7307) имели слабое, но детектируемое окрашивание. Предлагаемый метод позволяет идентифицировать контрастные по устойчивости к алюминию генотипы, обладает высокой воспроизводимостью и может быть применен для скрининга и изучения внутривидовой изменчивости растений гороха по указанному признаку на самых ранних этапах вегетации.

Ключевые слова: алюминий, гематоксилин, горох, закисленность почв, кислотоустойчивость, эриохромцианин.

Горох посевной (Pisum sativum L.) — основная зернобобовая культура в Российской Федерации, и его производственные площади в последние годы составляли около 1 млн га. Такой обширный производственный ареал предполагает разнообразие почвенно-климатических условий, в которых действуют неблагоприятные факторы среды, в том числе высокая закисленность почв. По данным Минсельхоза РФ, на 1 января 2011 года из обследованных 84,6 млн га пашни кислые почвы составляют 30,2 млн га, или 35,6 % (1). Сельскохозяйственные культуры существенно различаются по устойчивости к кислым почвам, при этом целый ряд зернобобовых (горох посевной, чечевица, нут) относят к чувствительным или среднечувствительным культурам по сравнению с зерновыми (рожь, овес, тритикале, рис, пшеница, ячмень) и кукурузой (2-5). Горох, несмотря на чувствительность к токсичным ионам алюминия, способен переносить некоторую степень закисленности почвы (3, 6).

Известно, что основной фактор, определяющий фитотоксичность

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 14-16-00137).

353

кислых почв, — повышенная концентрация подвижных ионов алюминия в почвенном растворе (6-8). Токсичные концентрации ионов алюминия сильно варьируют для разных видов растений, что во многом определяет их устойчивость к кислым почвам (9). В результате токсичного действия ионов алюминия происходит повреждение и прекращение деления и удлинения клеток кончика корня (10-12). Чувствительность корней растений к алюминию коррелирует положительно с интенсивностью его проникновения внутрь клеток и отрицательно — с интенсивностью его вывода из клеток (13). Аккумуляция алюминия в клеточной мембране и симпласте корня чувствительных растений негативно воздействует на целый ряд процессов, определяющих его рост. В частности, происходит нарушение процессов деления (14), ферментации пектинов оболочки клеток (15) и синтеза актинов для формирования цитоскелета клеток корня (16). В дальнейшем наблюдается ингибирование инициации и роста боковых корней и корневых волосков и нарушение снабжения растения минеральными веществами и водой (12, 17).

Проблема кислых почв решается на основе двух подходов: посредством известкования почвы (дорогостоящий и не всегда эффективный прием) и созданием кислотоустойчивых сортов растений, чему способствуют значительная внутривидовая вариабельность признака алюмотоле-рантости у сельскохозяйственных культур и сравнительно несложные схемы скрининга и селекции (5, 18). Чаще всего используют лабораторные методики скрининга генофонда по алюмотолерантности, в основе которых лежат различные модификации методов проращивания семян в водной культуре в присутствии токсичных концентраций алюминия. Такие методики просты в исполнении, не требуют значительного времени, обладают большой пропускной способностью и позволяют диагностировать генотипы и индивидуальные растения на ранних этапах онтогенеза. Это дает им преимущества перед вегетационными и полевыми методами, где возможна сильная вариабельность рН и содержания алюминия в почвенном растворе и влияние других неконтролируемых факторов.

В лабораторных тестах устойчивость растений оценивается с помощью красителей гематоксилина (19-20) и эриохромцианина R (21) по степени повреждения корней проростков алюминием. Гематоксилин образует с алюминием окрашенные в черно-синий цвет комплексы. Интенсивность окрашивания зависит от содержания алюминия в тканях растений. Чувствительные к алюминию растения не способны эффективно выводить его из клеток и накапливают токсикант в симпласте и клеточных оболочках, где он связывается с красителем. У устойчивых образцов ионы алюминия либо активно выводятся из тканей, либо связываются в комплексы, не реагирующие с красителем и, вероятно, не обладающие биологической активностью (20). Указанный подход был успешно применен для оценки внутривидовой изменчивости алюмотолерантости у сои (4), кукурузы (4, 19), пшеницы (21) и сорго (4, 22). Однако отмечено (5, 23, 24), что этот метод имеет существенные недостатки, к которым следует отнести субъективность оценки устойчивости по балльной системе; неравномерность отмывания красителя гематоксилина от корней; необходимость включения в каждый эксперимент генотипов, служащих стандартами степени окрашивания корней; отсутствие окрашивания у наиболее алюмотолерантных генотипов.

Эриохромцианин R образует с алюминием комплекс фиолетового цвета и используется для обнаружения и определения концентраций алю-

354

миния в химии (25), хроматографии (26), медицине (27), цитологии (28) и экологии (29). Для изучения воздействия алюминия на растения, в том числе для оценки внутривидовой изменчивости растений по признаку алю-мотолерантости, этот краситель впервые был использован при сравнении содержания алюминия в разных сортах пшеницы (21), а затем ржи и тритикале (2). Результаты наших предыдущих исследований показали, что эриохромцианин R может быть успешно применен для внутривидового скрининга по признаку алюмотолерантости и других злаковых культур, а именно эгилопса (30), тритикале (31), овса (31) и кукурузы (32). Поэтому представляется целесообразным использовать эриохромцианин R для изучения внутривидовой изменчивости по алюмоустойчивости у гороха.

Средняя урожайность гороха в Российской Федерации сравнительно невысока и составляет 14-18 ц/га (33, 34). Поскольку большая часть посевов гороха находится на территории, занятой кислыми почвами, алюмотоксичность, безусловно, вносит негативный вклад в снижение продуктивности этой культуры. Поэтому современным сортам, наряду с признаками высокой урожайности, устойчивости к патогенам, технологичности и т.п., необходимо придать алюмотолерантность (35). Первым этапом в таких исследованиях должен быть поиск в генофонде гороха форм, устойчивых к алюминию в условиях кислой среды.

Наша цель заключалась в разработке методики экспресс-оценки алюмотолерантности у коллекционных образцов гороха с использованием красителя эриохромцианина R.

Методика. Объектом исследований были 19 образцов гороха посевного (Pisum sativum L.) из коллекции Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР). Эксперименты проводили в климатической камере с освещенностью 7000 лк, температурой 19 °С (ночь) и 21 °С (день) и фотопериодом 16 ч. Семена (по 25 шт. каждого образца) раскладывали в специальные кюветы с ячейками для семян и сетчатым дном, которые помещали в 6-литровые контейнеры, располагая их на поверхности питательного раствора и прикрывая сверху прозрачной полиэтиленовой пленкой. Питательный раствор содержал (мМ): CaCl2 — 0,4; KNO3 — 0,65; MgCl2 — 0,25; (NH4)2SO4 — 0,01; NH4NO3 — 0,04; рН 4,2 (2). После проращивания семян в течение 3 сут выбраковывали невсхожие и промывали проростки проточной водой. Затем кюветы с проростками помещали в свежеприготовленный питательный раствор с добавлением 6-водного хлорида алюминия (AICI3 • 6Н2О) и инкубировали 24 ч. На основании предварительных экспериментов с горохом и приведенных в специальной литературе описаний алюмоустойчивости зернобобовых культур (23, 24) использовали концентрации 2, 3 и 5 мг Al/л, которые оказывали токсичное действие на растения и существенно ингибировали рост корней в используемых условиях. После этого кюветы помещали в свежий питательный раствор без алюминия и инкубировали 48 ч. В течение указанного времени в корнях происходили репарационные процессы (восстановление митотической активности клеток) и корни отрастали. Проростки промывали проточной водой и производили окрашивание корней, погружая кюветы в 0,2 % раствор гематоксилина на 15 мин (2) или в 0,1 % раствор эриохромцианина R на 10 мин (5). Излишки красителя смывали проточной водой, и корни осушали фильтровальной бумагой. Зона повреждения тканей корней алюминием окрашивалась в черно-синий цвет после окраски гематоксилином или в фиолетовый — после окраски эрио-хромцианином R. Устойчивость растений к алюминию определяли по

355

длине отрастания кончика корня. Для каждого образца были проведены два независимых эксперимента.

Статистическую обработку данных выполняли методом дисперсионного анализа с помощью программы STATISTICA v. 7.0 (StatSoft Inc., США).

Результаты. Изученные образцы различались по происхождению и направлению использования (табл.).

Образцы гороха посевного

Номер в каталоге ВИР Название Происхождение Направление использования

к-1776 Местный Казахстан Зерновой

к-2008 Местный Египет Кормовой

к-2759 Без названия Эфиопия Кормовой

к-3283 Местный Архангельская область Кормовой

к-3654 Без названия Китай Кормовой

к-4376 Г-11 Киргизия Зерновой

к-4379 Горох местный Киргизия Кормовой

к-5054 Белый горох Китай Зерновой

к-5749 Пинский местный Беларусь Кормовой

к-7044 Местный №26 Ливия Зерновой

к-7157 Местный Кения Зерновой

к-7307 Кийр Эстония Зерновой

к-8858 Фламинго Кировская область Зерновой

к-9075 Лд 203-94 Орловская область Зерновой

к-9110 Харвус-2 Украина Зерноукосный

к-9252 Аз-93-1955 Орловская область Зерновой

к-9254 Аз-95-614 Орловская область Зерновой

к-9281 Триумф Орловская область Зерновой

к-9504 Кореличский Беларусь Кормовой

2 3 5

Концентрация алюминия, мг/л

На первом этапе было исследовано воздействие на горох разных концентраций алюминия и осуществлен выбор красителя. При всех испытанных концентрациях алюминия наблюдались существенные различия между образцами гороха по длине отрастания

корня при окрашивании эри-Рис. 1. Влияние различных концентраций алюминия на охромцианином R (рис 1) прирост корня у образцов гороха посевного (Pisum sat- Л/г

vum L.) к-9075, к-9110, к-9281, к-9254 и к-9252 (кол- Магаимальное ра^шчж ме-лекция ВИР) по результатам окрашивания эриохром- жду образцами (к-9075 и к-цианином R. Вертикальными отрезками обозначены 9252) при концентрации 2 ошибки средних. Разные латинские буквы означают и 3 мг Al/л было соответст-существенные различия между вариантами (критерий г ^

НСР Фишера, Р < 0,05). венно 5- и 6-кратным. При

концентрации 5 мг Al/л максимальное различие между образцами (к-9010 и к-9252) было 8-кратным, но различия между четырьмя образцами оказались недостоверны (вероятно, из-за высокой степени ингибирования роста корней алюминием). Однако различия между образцами к-9252 и к-9254 при этой концентрации стали статистически значимы. На основании полученных результатов в качестве рабочей (дифференцирующей) концентрации для дальнейших экспериментов была выбрана концентрация 3 мг Al/л, при которой различия между образцами проявились наиболее четко.

Окрашивание корней проростков гематоксилином после воздейст-

356

вия разными концентрациями хлорида алюминия в питательном растворе не имело ярко выраженных различий в зависимости от образца гороха. Ранжирование по степени интенсивности окраски поврежденных тканей у некоторых образцов было затруднительно, несмотря на то, что длина зоны отрастания кончика корня, как правило, оказывалась больше у образцов с меньшей интенсивностью окраски корней гематоксилином (данные не представлены). Вероятно, это связано с видовыми особенностями гороха, поскольку у других видов растений гематоксилин успешно использовался для дифференциации сортов по алюмоустойчивости с помощью оценки интенсивности окраски корней, и этот показатель коррелировал с ростовыми показателями алюмоустойчивости (4, 19, 20, 22, 36). Обработка корней эриохромцианином R выявила широкую вариабельность образцов гороха по интенсивности окрашивания, при этом зона отрастания корня была визуально достаточно различима. Описанные факты подтвердили эффективность использования этого красителя для изучения внутривидовой изменчивости по алюмотолерантости, которая ранее была продемонстрирована на злаковых культурах (2, 18, 30-32).

Рис. 2. Сравнение образцов гороха посевного (Pisum sativum L.) по влиянию алюминия (3 мг/л) на прирост корня при экспресс-оценке на основании окрашивания эриохромцианином R: 1 — к-2759, 2 — к-3654, 3 — к-3283, 4 — к-5054, 5 — к-4379, 6 — к-5749, 7 — к-7157, 8 — к-2008, 9 — к-7044, 10 — к-8858, 11 — к-1776, 12 — к-4376, 13 — к-9504, 14 — к-7307 (коллекция ВИР). Вертикальными отрезками обозначены ошибки средних. Разные латинские буквы означают существенные различия между вариантами (критерий НСР Фишера, Р < 0,05).

На втором этапе исследований мы провели скрининг 14 образцов гороха при обработке алюминием в концентрации 3 мг/л и окрашивании корней эриохромцианином R. Результаты показали, что горох имеет высокую степень вариабельности по приросту корня после токсичного воздействия алюминия, поскольку длина отрастающих корней проростков максимально различалась в 14 раз (образцы к-2759 и к-7307) (рис. 2). К наименее устойчивым отнесли также образцы к-3654 и к-3283, а наиболее устойчивыми были образцы к-4376 и к-9504. В изучаемую выборку входил алюмотолерантный сорт гороха Фламинго (к-8858), созданный в Кировской области в зоне кислых почв с высоким содержанием подвижного алюминия (24) и использованный нами в качестве стандарта алюмотолерантности. Полученные данные свидетельствовали, что этот сорт обладает высокой алюмотолерантностью, но уступает по указанному признаку образцам к-4376, к-9504 и к-7307. Поскольку изучаемая выборка образцов гороха невелика, мы не можем пока определить какие-либо взаимосвязи между характеристиками образцов (происхождение, направление использования, фенотип) и степенью алюмотолерантности. Но уже очевидно, что образцы сходного географического происхождения могут оказаться как алюмотолерантными, так и чувствительными к воздействию алюминия, например образцы к-4376 и к-4379 из Киргизии.

Значительные различия наблюдались между образцами по интенсивности окрашивания корней эриохромцианином R. Образцы с минимальной длиной отрастания корня (к-2759, к-3654 и к-3283) характеризовались интенсивной фиолетовой окраской обработанного алюминием уча-

357

стка корня, а образцы с максимальной длиной отрастания корня (к-4376, к-9504 и к-7307) имели слабое, но детектируемое окрашивание (вклейка, рис. 3). Интенсивность окрашивания эриохромцианином R характеризует в первую очередь концентрацию подвижных (токсичных) форм алюминия, и этот показатель коррелирует с алюмотолерантостью. Если после обработки алюминием концентрация его активных форм невысока, то в корне восстанавливается митотическая активность клеток, корень отрастает, и после зоны окрашивания появляется неокрашенный прирост (5). Интенсивность окрашивания эриохромцианином R может служить дополнительным показателем степени алюмотолерантности, связанным с концентрацией токсиканта в тканях корня. В изучаемых условиях длина прироста корня характеризует интенсивность регенерации тканей корня после воздействия токсиканта. Скрининг по этому показателю может быть полезен для идентификации генотипов растений, которые способны образовать активно функционирующую корневую систему при попадании семян в почву с высокой концентрацией алюминия.

Таким образом, предлагаемый метод обладает высокой пропускной способностью и воспроизводимостью, что позволяет считать его надежным способом оценки потенциальной алюмотолерантности у гороха на самых ранних этапах вегетации. Однако в природных почвенных условиях концентрация ионов алюминия, как правило, ниже используемых в гидропонных культурах при скрининге, а действие алюминия на корни длительное и постоянное. Поэтому мы предлагаем разработанный метод в качестве экспресс-оценки алюмотолерантности для быстрого скрининга широкого спектра генотипов и последующего изучения контрастных форм при более длительном выращивании растений в гидропонной культуре (включая анализ содержания алюминия в корнях и побегах) и в почвенных условиях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Доклад о состоянии и использовании земель сельскохозяйственного назначения. М., 2011 (http://agro.tmbreg.ru/fiIes/zem-Doklad_2011.pdf).

2. Aniol A., Gustafson P. Chromosome location of genes controlling aluminum tolerance in wheat, rye and triticale. Can. J. Genet. Cytol., 1984, 26: 701-705 (doi: 10.1139/g84-111).

3. Lazof D.B., Holland M.J. Evaluation of the aluminium-induced root growth inhibition in isolation from low pH effects in Glycine max, Pisum sativum and Phaseolus vulgaris. Aust. J. Plant Physiol., 1999, 26: 147-157.

4. Akhter A., Wagatsuma T., Khan M.S.H., Tawaraya K. Comparative studies on aluminum tolerance screening techniques for sorghum, soybean and maize in simple solution culture. Am. J. Plant Physiol., 2009, 4: 1-8 (doi: 10.3923/ajpp.2009.1.8).

5. Косарева И.А. Изучение коллекций сельскохозяйственных культур и диких родичей по признакам устойчивости к токсическим элементам кислых почв. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции, 2012, 170: 35-45.

6. Авдонин Н.С. Известкование кислых почв. М., 1976.

7. Eswaran H., Reich P., Beinroth F. Global distribution of soils with acidity. In: Plant-soil interactions at low pH /A.C. Moniz et al. (eds.). Brazilian Soil Science Society, Campinas, 1997.

8. Соколова Т.А., Толпешта И.И., Трофимов С.Я. Почвенная кислотность. Кислотно-основная буферность почв. Соединения алюминия в твердой фазе почвы и в почвенном растворе. Тула, 2012.

9. Климашевский Э.Л. Генетический аспект минерального питания растений. М., 1991.

10. Ryan P.R., Ditomaso J.M., Kochian L.V. Aluminum toxicity in roots: an investigation of spatial sensitivity and the role of the root cap. J. Exp. Bot., 1993, 44: 437-446 (doi: 10.1093/jxb/44.2.437).

11. Ciamporova M. Morphological and structural responses of plant roots to aluminium at organ, tissue, and cellular levels. Biologia Plantarum, 2002, 45: 161-171 (doi: 10.1023/A:1015159601881).

12. Kochian L.V., Hoekenga O.A., Pineros M.A. How do crop plants tolerate acid

358

soils? Mechanisms of aluminum tolerance and phosphorous efficiency. Annu. Rev. Plant Biol., 2004, 55: 459-493 (doi: 10.1146/annurev.arplant.55.031903.141655).

13. Kobayashi Y., Yamamoto Y., Matsumoto H. Studies on the mechanism of aluminum tolerance in pea (Pisum sativum L.) using aluminum-tolerant cultivar «Alaska» and aluminum-sensitive cultivar «Hyogo». Soil Science and Plant Nutrition, 2004, 50(2): 197-204 (doi: 10.1080/00380768.2004.10408468).

14. Kikui S., Sasaki T., Maekawa M., Miyao A., Hirochika H., Matsumoto H., Yamamoto Y. Physiological and genetic analyses of aluminium tolerance in rice, focusing on root growth during germination. Journal of Inorganic Biochemistry, 2005, 99: 1837-1844 (doi: 10.1016/j.jinorgbio.2005.06.031).

15. Schmohl N., Pilling J., Fisahn J., Horst W.J. Pectin methylesterase modulates aluminium sensitivity in Zea mays and Solanum tuberosum. Physiologia Plantarum, 2000, 109: 419-427 (doi: 10.1034/j.1399-3054.2000.100408.x).

16. Amenos M., Corrales I., Poschenrieder C., Illes P., Baluska F., Barcelo J. Different effects of aluminum on the actin cytoskeleton and brefeldin A-sensitive vesicle recycling in root apex cells of two maize varieties differing in root elongation rate and aluminum tolerance. Plant Cell Physiol., 2009, 50(3): 528-540 (doi: 10.1093/pcp/pcp013).

17. Choudhary A.K., Singh D. Screening of pigeonpea genotypes for nutrient uptake efficiency under aluminium toxicity. Physiology and Molecular Biology of Plants, 2011, 17(2): 145152 (doi: 10.1007/s12298-011-0057-7).

18. Косарева И.А., Семенова Е.В. Лабораторный скрининг видов пшеницы на алюмотолерантность. Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук, 2005, 5: 5-7.

19. Polle E.C., Konzak C.E., Kittrick J.A. Visual detection of aluminum tolerance levels of wheat by hematoxilin staining of seedlings roots. Crop Science, 1978, 18: 823-827 (doi: 10.2135/cropsci1978.0011183X001800050035x).

20. Canoado G.M.A., Loguercio L.L., Martins P.R. Parentoni S.N., Paiva E., B o r e m A., L o p e s M.A. Hematoxylin staining as a phenotypic index for aluminum tolerance selection in tropical maize (Zea mays L.). Theor. Appl. Genet., 1999, 99: 747-754 (doi: 10.1007/s001220051293).

21. Aniol A. Metody okrea lania tolerancyjno ci zby na toksyczne dzialanie jonyw glinu. Biul. Inst. Hodowli Aklim. Roslin., 1991, 243: 3-14.

22. Anas A., Yoshida T. Heritability and genetic correlation of Al-tolerance with several agronomic characters in sorghum assessed by hematoxylin staining. Plant Production Science, 2004, 7: 280-282 (doi: 10.1626/pps.7.280).

23. Singh D., Rai A.K., Panyang O. Hematoxilin staining as a potential screening technique for aluminum tolerance in pea. Curr. Sci., 2009, 96(8): 1029-1030.

24. Кропотов А.В. Комплексная оценка сортов овса и гороха на кислотоустойчивость. Канд. дис. Киров, 2000.

25. Zanjanchi M.A., Noei H., Moghimi M. Rapid determination of aluminum by UV-vis diffuse reflectance spectroscopy with application of suitable adsorbents. Talanta, 2006, 70: 933939 (doi: 10.1016/j.talanta.2006.05.056).

26. Tria J., Haddad P.R., Nesterenko P.N. Determination of aluminium using high performance chelation ion chromatography. Journal of Separation Science, 2008, 31(12): 22312238 (doi: 10.1002/jssc.200800046).

27. Sato T., Saito Y., Chikuma M., Saito Y., Nagai S. Fluorimetric determination of trace amounts of albumin in bronchoalveolar lavage fluid with eriochrome cyanine R. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2007, 30(7): 1187-1190.

28. Dapson R., Horobin R.W., Kiernan J. Hematoxylin shortages: their causes and duration, and other dyes that can replace hemalum in routine hematoxylin and eosin staining. Bio-technic and Histochemistry, 2010, 85(1): 55-63 (doi: 10.3109/10520290903048400).

29. Shokrollahi A., Ghaedi M., Niband M.S, Rajabi H.R. Selective and sensitive spec-trophotometric method for determination of sub-micro-molar amounts of aluminium ion. Journal of Hazardous Materials, 2008, 151(2-3): 642-648 (doi: 10.1016/j.jhazmat.2007.06.037).

30. Niedziela G., Aniol A. Subcellular distribution of aluminium in wheat roots. Acta Bio-chimica Polonica, 1983, 30: 99-105.

31. Косарева И.А. Семенова Е.В. Алюмотолерантность видов эгилопса. Тез. Межд. конф. «Проблемы физиологии растений Севера». Петрозаводск, 2004.

32. Косарева И.А., Давыдова Г.В., Семенова Е.В. Диагностика устойчивости растений овса посевного к повышенному содержанию ионов алюминия в почвенном растворе. Сельскохозяйственная биология, 1998, 5: 73-76.

33. Косарева И.А., Олинга Т.Ж. Алюмоустойчивость кукурузы на ранних этапах роста и развития. Известия СПбГАУ, 2007, 6: 47-49.

34. Зотиков В.И., Наумкина Т.С., Сидоренко В.С. Современное состояние отрасли зернобобовых и крупяных культур в России. Вестник ОрелГАУ, 2006, 1: 14-17.

35. Дебелый Г.А. Зернобобовые культуры в мире и Российской Федерации. Зернобобовые и крупяные культуры, 2012, 2: 31-35.

359

36. Poschenrieder C., Gunse B., Corrales I., Barcely J. A glance into aluminum toxicity and resistance in plants. Science of the Total Environment, 2008, 400(1-3): 356-368 (doi: 10.1016/j.scitotenv.2008.06.003).

37. Anas A., Yoshida T. Screening of Al-tolerant sorghum by hematoxylin staining and growth response. Plant Production Science, 2000, 3: 246-253.

1ФГБНУ Всероссийский НИИ растениеводства Поступила в редакцию

им. НИ Вавилова, 10 марта 2015 года

190000 Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 42-44;

2ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии,

196608 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3, e-mail: belimov@rambler.ru

Sel’skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2015, V. 50, № 3, pp. 353-360

METHOD FOR RAPID ASSESSMENT OF ALUMINUM TOLERANCE

OF PEA

M.A. Vishnyakova1, E.V. Semenova1, I.A. Kosareva1, N.D. Kravchuk1, C.I. Loskutov2,

I. V Pukhalskii2, A.I Shaposhnikov2, A.L. Sazanova2, A.A. Belimov2

1N.I. Vavilov Research Institute of Plant Industry, Federal Agency of Scientific Organizations, 42-44, ul. Bol’shaya Morskaya, St. Petersburg, 190000 Russia;

2All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology, Federal Agency of Scientific Organizations, 3, sh. Podbel’skogo, St. Petersburg, 196608 Russia, e-mail belimov@rambler.ru Supported by Russian Science Foundation

Received March 10, 2015 doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.353eng

Abstract

Crops vary considerably in their resistance to acidic soils, and many legumes, including pea (Pisum sativum L.), considered to be sensitive or moderately sensitive crops compared to cereals. The main factor determining the phytotoxicity of acidic soils is the increased concentration of mobile aluminum ions in the soil solution. Accumulation of aluminum in root tissues interferes with cell division, initiation of growth of lateral roots and uptake of minerals and water by plants. Under laboratory conditions the resistance of plants to aluminum is estimated by the degree of damage to the roots by aluminum using dyes (hematoxylin, eriochrome cyanine R) and the ability of roots to restore growth after toxic effect of this metal. This work dedicated to the development of rapid assessment of aluminum tolerance especially for peas, which is as follows: the seeds were germinated in the growth chamber in the nutrient solution for 3 days (7000 lx illumination, temperature of 19 °C at night and 21 °C during the day, photoperiod 16 h), treated with a toxic concentration of aluminum chloride (3 mg Al/l) for 24 hours, incubated in fresh nutrient solution without aluminum for 2 days and stained with 0.1 % eriochrome cyanine R for 10 min. Zone of root tissue damage by aluminum painted in the color purple. Plant resistance to aluminum was determined by the length of the root re-growth area after exposure to the toxicant. Using 19 varieties of pea from the N.I. Vavilov Research Institute of Plant Industry collection (VIR collection) it was shown that pea has high variability in tolerance to aluminum. Varieties with a minimum (1.0+1.5 mm) length of the root re-growth (k-2759, k-3654 and k-3283) were characterized by intense purple color of the root, but varieties with a maximum (14.0^14.5 mm) length of the root re-growth (k-4376, k-9504 and k-7307) had a faint but detectable staining. The proposed method makes it possible to identify genotypes contrasting in aluminum tolerance, is highly reproducible and can be used for screening and study of intraspecific variability in this trait of pea plants at very early developing stage.

Keywords: aluminum, hematoxylin, peas, soil acidification, acid tolerance, eriochrome cyanine R.

Научные собрания

3-я МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ «ГЕНЕТИКА, ГЕНОМИКА, БИОИНФОРМАТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ»

Основные тематические направления: организация и эволюция генома растений, системная биология; генетика и селекция в изменяющихся условиях окружающей среды; физиологическая и экологическая генетика растений; генетическая инженерия и клеточная биотехнология

360