СПОСОБ НЕИНВАЗИВНОЙ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА
METHOD FOR NONINVASIVE EXPRESS DIAGNOSTICS OF TYPE 2 DIABETES MELLITUS

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для выявления сахарного диабета (СД) 2 типа.
В основе предлагаемого способа лежит безопасное, доступное и легковоспроизводимое кристаллографическое исследование секретов больших слюнных желез (БСЖ), проведенное у жителей города Воронежа.
Исследование секретов больших слюнных желез (БСЖ) привлекает простотой их сбора и удобством для случаев неклинических окружающих условий, безболезненностью, риск заражения медперсонала значительно меньше, чем при работе с кровью. Содержание некоторых гормонов, антител, лекарств в слюне отражает их концентрацию в крови [Biochemical modifications of human whole saliva induced by pregnancy / E. Salvolini [et al.] // Br. J. Obstel. Gynaecol. – 1998. – Vol.105, №6. – P. 656 - 660]. Слюна человека представляет собой уникальную субстанцию, имеющую большие потенциальные возможности для использования в фундаментальных исследованиях и в медицинской диагностике [Григорьев И.В. Белковый состав смешанной слюны человека: механизмы психофизиологической регуляции / И.В. Григорьев, Е.А. Уланова, И.Д. Артамонов // Вестник РАМН. – 2004. – №7. – С. 36-47].
Известен метод клиновидной дегидратации  для оценки состояния организма человека в норме и при различных патологиях путем анализа кристаллических структур биологических жидкостей: сыворотки крови, ликвора, смешанной слюны, мочи и других биожидкостей [Шабалин В.Н. Морфология биологических жидкостей человека / В.Н. Шабалин, С.Н. Шатохина. – Москва: Хризопраз, 2001. – 304 с.].
На обезжиренное предметное стекло, расположенное строго горизонтально, наносят дозатором каплю биологической жидкости объемом 10-20 мл. Диаметр капли на предметном стекле 5-7 мм. Средняя толщина около 1 мм. Угол наклона поверхности капли 25-300. При температуре 20-250 и относительной влажности воздуха 65-70% образец высушивается. Процесс сушки занимает 18-24 часа. Высушенная капля биологической жидкости называется фацией, ее анализируют, что позволяет диагностировать некоторые заболевания.
Известен тезиокристаллоскопический метод исследования биологических жидкостей, в частности плазмы крови человека, основанный на добавлении к ней стандартного кристаллообразующего раствора [Использование тезиокристаллоскопического метода в диагностике аутоиммунного тиреоидита / И.В. Бейникова, А.В. Синтюрина, А.С. Нургалиева, С.В. Василечко // На стыке наук. Физико-химическая серия. Сборник трудов I Международной Интернет-конференции. Казань, 24-25 января 2013 года. – Казань : Изд-во «Казанский университет», 2013. – С. 23-26].
Тезиокристаллоскопическое исследование проводят методом клиновидной дегидратации плазмы крови с добавлением 50 мкл 0,9% раствора хлорида натрия. Полученные фасции сканируют на сканере CanoScanLine20 при разрешении 1200dpi и изучают в программе ACDSeePro5.
Известен способ структурообразования сыворотки крови в условиях вакуума [Савина Л.В. Структурообразования сыворотки крови в условиях вакуума / Л.В. Савина // Клиническая лабораторная диагностика – 1999. – № 11. – С.48].
Для высушивания используют вакуумную камеру при создании в ней давления 0,1-0,5 мм рт. ст. и начальной температуре 18-220. Сыворотку крови в виде капель помещают в изотропный контейнер и сушат в вакууме 1,5-2 часа. Полученный препарат декорируют слоем углерода в электронно-вакуумном посту, а затем микроскопируют.
Известен метод исследования кристаллических агрегатов ротовой жидкости [Барер Г.М.Вариабельность кристаллических агрегатов ротовой жидкости в норме / Г.М. Барер, А.Б. Денисов, Т.М. Стурова // Рос. стоматол. журн. – 2003. – № 1. – С. 33-35].
Ротовую жидкость получают при свободном вытекании ее из полости рта, затем каплю ротовой жидкости объемом 0,1 мл помещают на поверхность чашки Петри с крышкой и высушивают. Исследование структуры образцов слюны выполняют при помощи оптического микроскопа LeicaDM-LS с видеокамерой SonySSC-DC30P. Полученное изображение передают на экран монитора. Сканирование проводят сначала при малом увеличении по всей поверхности высушенной капли, а затем при большом увеличении исследуют отдельные поверхности с различной морфологией. Выбранные участки кристаллограммы записывают в виде графического файла на компьютере со следующими параметрами : 262×280 пикс.
Вышеперечисленные методы имеют следующие недостатки:
- длительное время сушки препаратов, необходимость поддержания оптимальной температуры и влажности воздуха;
- наличие специальных реактивов;
- забор крови является инвазивной манипуляцией, следовательно, несет риск инфицирования для медицинского персонала и болезненные ощущения для обследуемого; забор ликвора помимо этого должен осуществляться квалифицированным врачом в стационарных условиях;
- использование смешанной слюны малоинформативно, поскольку на ее физико-химические свойства может оказывать влияние состояние полости рта обследуемого.
Техническим результатом нашего изобретения является повышение точности и сокращение времени диагностики сахарного диабета 2 типа без использования специальных реактивов и дорогостоящего оборудования.
Технический результат изобретения достигают тем, что забор биологического материала проводят в утренние часы до приема лекарственных препаратов [Мячина О.В. Хронобиологический анализ содержания оксида азота в секрете слюнных желез при соматической патологии в комплексной оценке цифрового анализа биоритмов: дис… канд. мед. наук; Воронеж. гос. мед. ак.  – Воронеж, 2006. –  С. 68-69]. Обследуемые тщательно прополаскивают рот дистиллированной водой. Секрет больших слюнных желез собирают при помощи слюносборника SarstedtD – 51588 Numbrecht, представляющего собой центрифужную пробирку, содержащую контейнер с гигроскопичным тампоном и крышку. Тампоны закладывают в места выводных протоков больших слюнных желез: в преддверии полости рта на уровне верхнего второго моляра справа и слева, что соответствует выводным протокам околоушных слюнных желез, и в области дна полости рта у переднего края уздечки языка, где находятся выводные протоки подчелюстных и подъязычных желез, на 10 минут. Необходимость исследования левой околоушной железы (ЛОУЖ), правой околоушной железы (ПОУЖ) и подчелюстных и подъязычных слюнных желез (ПЧПЯЖ) обусловлена  асинхронным характером работы БСЖ и различным химическим составом, поскольку околоушные слюнные железы выделяют преимущественно белковый секрет, а подчелюстные и подъязычные железы – слизистый. Для предотвращения факторов, способных повлиять на состав и количество выделяемого секрета, обследуемые дышат через нос, не разговаривают. Сразу после забора проб тампоны со слюной помещают в пробирки-слюносборники и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут.
Для проведения кристаллографии 5 мкл секретов левой и правой околоушных, подчелюстных и подъязычных слюнных желез наносят в виде капли на поверхность обезжиренного предметного стекла, расположенного строго горизонтально, как при проведении метода клиновидной дегидратации [Шабалин В.Н. Морфология биологических жидкостей человека / В.Н. Шабалин,  С.Н. Шатохина. – Москва: Хризопраз, 2001. – 304 с.]. Диаметр капли на предметном стекле 3-5 мм. Средняя толщина около 0,5 мм. Сразу после этого мы предлагаем исследуемые образцы помещать в вакуумную камеру над гранулированным гидроксидом калия, который поглощает влагу и повышает вакуум, где происходит лиофильная сушка в течение 15 минут. Это позволяет нам создать более стандартизированные условия приготовления препаратов по сравнению с высушиванием на воздухе, время их приготовления значительно сокращается, соответственно, процесс формирования кристаллов из жидкокристаллического состояния секретов БСЖ происходит быстрее. Полученные таким образом структуры анализируют с помощью цифрового микроскопа Levenhuk с мультимедийным комплексом, включающим ноутбук, видеокамеру и монитор. Для морфометрического анализа кристаллограмм, а именно определения количественных показателей ширины и оптической плотности основных слоев кристаллограмм, микропрепараты также сканируют и обрабатывают при помощи программы Видео-Тест при увеличении х10 .
Новым при применении кристаллографии является использование вакуумной сушки микропрепаратов без применения специальных реактивов, что позволяет стандартизировать условия и сократить время приготовления препаратов.  Новым также является использование не ротовой жидкости, а секретов, полученных из протоков больших слюнных желез, что более информативно и определяет вклад каждой железы, поскольку не зависит от состояния полости рта обследуемого. Предлагаемый способ позволяет выделить слои в периферической части препарата, провести их морфометрический анализ и выявить новые неинвазивные кристаллографические критерии сахарного диабета 2 типа.
Предлагаемый способ был разработан в результате наблюдения за 15 практически здоровыми лицами и 17 больными сахарным диабетом 2 типа. Морфологическая картина секретов больших слюнных желез у всех обследуемых имеет периферическую концентрическую и центральную части (фигура 1). В ходе исследования было выделено в периферической части препарата 5 слоев сформированных кристаллических структур: наружный, промежуточный, внутренний, пограничный и переходный. Наружный слой (1) имеет ширину в пределах  9-13 мкм, он представлен тонкой полосой, покрывающей всю краевую зону. Внутрь от него располагается более светлый промежуточный слой (2) шириной 22-88 мкм. Следующий внутренний слой (3) представлен рыхлыми глыбчатыми структурами, его ширина составляет 11-30 мкм. Пограничный слой (4) представлен в виде прозрачной полосы шириной 27-100 мкм. В переходном слое (5) шириной 346-743 мкм прослеживаются сформированные кристаллические структуры. Он имеет более темную пигментацию и обрамляет по периферии центральную часть микропрепарата.
В центральной части типичных нативных препаратов секретов левой и правой околоушных, подчелюстных и подъязычных слюнных желез, приготовленных в вакуумной камере, наблюдаются единичные мелкие микрокристаллы, либо зернистые структуры,  придающие этой части препарата крапчатый рисунок.
Диагностически значимые отличия у больных СД 2 типа по сравнению с практически здоровыми лицами обнаружены в ширине наружного и промежуточного слоя в секретах ЛОУЖ, ПОУЖ и ПЧПЯЖ (таблица 1).
Таблица 1
Ширина основных слоев кристаллограмм секретов больших слюнных желез, мкм (микрометры)
Железа
Слои периферической части
Практически здоровые
СД 2 типа
Среднее
Стандартное отклонение
Среднее
Стандартное отклонение
ЛОУЖ
наружный
11,50
1,21
14,86<sup>*</sup>
1,20
промежуточный
60,56
20,97
104,38<sup>*</sup>
21,50
ПОУЖ
наружный
10,88
2,18
16,05<sup>*</sup>
2,07
промежуточный
62,10
25,40
113,84<sup>*</sup>
24,56
ПЧПЯЖ
наружный
10,86
1,91
15,32<sup>*</sup>
2,20
промежуточный
31,73
9,78
60,84<sup>*</sup>
16,02
Примечание: здесь и далее* – статистически значимые различия между больными и практически здоровыми лицами; ЛОУЖ – левая околоушная железа; ПОУЖ – правая околоушная железа; ПЧПЯЖ – подчелюстные и подъязычные слюнные железы.
Предлагаемый способ поясняется следующими клиническими примерами.
Пример 1
Обследуемый А. отмечает хорошее самочувствие и отсутствие каких-либо жалоб.
Общее состояние удовлетворительное. Сознание ясное. Покровы тела: кожа сухая, чистая, телесной окраски. Видимые слизистые оболочки розового цвета. Лимфатические узлы не увеличены, безболезненны при пальпации. Периферических отеков нет. В легких перкуторно – ясный легочной звук по всем полям. Аускультативно дыхание везикулярное, хрипов нет. Частота дыхания 19 в минуту. Верхушечный толчок пальпируется в V межреберье по среднеключичной линии слева. ЧСС 72 в минуту. Тоны сердца ритмичные, приглушены. Границы относительной сердечной тупости в норме. Артериальное давление - 110×80 мм рт.ст. Язык сухой, чистый. Живот при пальпации мягкий, безболезненный. Стул регулярный, оформленный. Печень не увеличена, безболезненна при пальпации. Поколачивание поясничной области безболезненно с обеих сторон.  Мочеиспускание учащенное, безболезненное.
Анализ результатов с применением заявленного способа у обследуемого А. выявил следующие особенности:
Ширина наружного слоя кристаллограмм составила 10,3 мкм в секретах ЛОУЖ, 9,81 мкм в секретах ПОУЖ и 10,3 мкм в секретах ПЧПЯЖ; промежуточного слоя 40,3 мкм в секретах ЛОУЖ, 41,9 мкм в секретах ПОУЖ и 27,2 мкм в секретах ПЧПЯЖ.
Эти параметры соответствуют нормальным значениям, свойственным практически здоровому человеку.
Пример 2
Обследуемый Ч. предъявляет жалобы на жажду, сухость во рту, головную боль, головокружение, быструю утомляемость.
Общее состояние удовлетворительное. Сознание ясное. Покровы тела: кожа сухая, чистая, телесной окраски, тургор снижен. Видимые слизистые оболочки розового цвета. Лимфатические узлы не увеличены, безболезненны при пальпации. Периферических отеков нет. В легких перкуторно - ясный легочной звук по всем полям. Аускультативно дыхание везикулярное, хрипов нет. Частота дыхания 19 в минуту. Верхушечный толчок пальпируется в V межреберье по среднеключичной линии слева. ЧСС 78 в минуту. Тоны сердца ритмичные, приглушены. Границы относительной сердечной тупости в норме. Артериальное давление - 160×90 мм рт.ст. Язык сухой, чистый. Живот при пальпации мягкий, безболезненный. Стул регулярный, оформленный. Печень не увеличена, безболезненна при пальпации. Поколачивание поясничной области безболезненно с обеих сторон. Мочеиспускание учащенное, безболезненное.
Анализ результатов с применением заявленного способа у обследуемого Ч. выявил следующие особенности:
Ширина наружного слоя кристаллограмм составила 13,7 мкм в секретах ЛОУЖ, 14,8 мкм в секретах ПОУЖ и 14,7 мкм в секретах ПЧПЯЖ; промежуточного слоя 95 мкм в секретах ЛОУЖ, 94,4 мкм в секретах ПОУЖ и 68,1 мкм в секретах ПЧПЯЖ.
Эти параметры соответствуют течению сахарного диабета 2 типа.
Диагноз клинический: Сахарный диабет, тип 2, средней степени тяжести, стадия декомпенсации без кетоза. Гипертоническая болезнь II, риск IV.
Таким образом, мы разработали способ неинвазивной экспресс-диагностики сахарного диабета 2 типа, включающий новые шаги: сбор секретов больших слюнных желез, лиофильная сушка микропрепаратов в вакуумной камере, выделение слоев в периферической части препарата, их морфометрический анализ и получение диагностических критериев. Способ достигается тем, что 5 мкл секретов  левой и правой околоушных, подчелюстных и подъязычных слюнных желез наносят в виде капли на поверхность обезжиренного предметного стекла, расположенного строго горизонтально, как при проведении метода клиновидной дегидратации. Затем исследуемые образцы помещают в вакуумную камеру, где происходит лиофильная сушка в течение 15 минут, что стандартизирует условия и сокращает время приготовления препаратов. Морфометрический анализ полученных структур проводят при помощи программы Видео-Тест при увеличении х10.
При этом ширину наружного слоя до 13 мкм в секретах левой и правой околоушных, подчелюстных и подъязычных слюнных желез; ширину промежуточного слоя до 88 мкм в секретах левой и правой околоушных желез и до 42 мкм в секретах подчелюстных и подъязычных слюнных желез считают нормой. При увеличении ширины наружного и промежуточного слоя в секретах левой и правой околоушных, подчелюстных и подъязычных слюнных желез диагностируют сахарный диабет 2 типа.