СПОСОБ СТАНДАРТИЗАЦИИ ДАННЫХ КОНВЕКЦИОННОЙ ПОЛИМЕРНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С РЕГИСТРАЦИЕЙ НАКОПЛЕНИЯ ПРОДУКТОВ РЕАКЦИЙ ПО ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ НЕПОСРЕДСТВЕННО ВО ВРЕМЯ РЕАКЦИИ
METHOD OF STANDARDISATION OF CONVECTION POLYMERASE CHAIN REACTION VALUES WITH DIRECT FLUORESCENCE REGISTRATION OF REACTION PRODUCT ACCUMULATION

Изобретение относится к медицине, молекулярной биологии и биотехнологии и может применяться при детекции и количественном анализе нуклеиновых кислот в конвекционной полимеразной цепной реакции с непосредственной регистрацией накопления продуктов реакции.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) заключается в циклической смене температур, где в каждом цикле должна пройти денатурация белков при температурах порядка 92-95°С, отжиг праймеров при около 50-65°С, а также их удлинение при температурах 72-75°С. Наиболее быстро амплификация протекает в так называемой конвекционной ПЦР, в основе которой лежит эффект термоконвекции. При этом может использоваться принцип смены температур реакционной смеси за счет градиента силы поверхностного натяжения (ячейка Марангони) [US патент №2006/0216725, МПК C12Q 1/68, С12Р 19/34, С12М 1/34, 28.09.2006] либо приводиться в действие силой плавучести, представляющей собой разницу между архимедовой силой и силой тяжести (ячейка Бенара-Рэлея), на основе которой разными авторами было предложено несколько вариантов ПЦР систем [Krishnan М., Ugaz V.M., Burns M.A. PCR in a Rayleigh-Benard convection cell // Science. 2002. V.298. P.793; Braun D., Goddard N.L., Libchaber A. Exponential DNA replication by laminar convection // Phys. Rev. Lett. 2003. V.91. 158103; US патент №2004/0152122 A1, МПК C12Q 1/64, 05.08.2004].
Регистрация продуктов реакции может быть либо отложенной (электрофоретические методы анализа или гибридизация с меченными олигонуклеотидными пробами), либо проводимой в реальном времени. Для ПЦР «в реальном времени» наиболее широкое распространение получили методы флуоресцентного анализа ампликонов, меченых флуоресцентными олигонуклеотидными последовательностями либо в присутствии флуоресцентных интеркалирующих красителей. При этом наработка целевого продукта ПЦР в реакционной смеси приводит к увеличению интенсивности флуоресценции в детектирующем амплификаторе [US патент №2002123062, МПК G01N 21/64 H, C12Q 1/68 D4, 05.09.2002]. Серьезной проблемой может стать тот факт, что многие из используемых флуоресцирующих веществ имеют довольно ярко выраженную зависимость интенсивности флуоресценции от температуры, что осложняет процесс регистрации наработанного продукта в конвекционной ПЦР. Кроме того, возможны неоднородности величины регистрируемой интенсивности флуоресценции, связанные с наличием градиента температур внутри реакционного блока, неоднородности оптического тракта измерительного узла прибора, неточности в приготовлении реакционных смесей и т.д.
Известен способ стандартизации данных [JP патент №2001286300, МПК С12М 1/00, C12N 15/09, C12Q 1/68, 16.10.2001], получаемых в ходе ПЦР «в реальном времени». Он включает операцию коррекции уровня интенсивности флуоресценции в реакции гибридизации.
Недостатком такого способа является проведение дополнительных экспериментов и он может быть осуществлен только по окончании ПЦР.
Известен способ стандартизации данных [Larionov A., Krause A., Miller W. А standard curve based method for relative real time PCR data processing, BMC Bioinformatics. 2005 Mar 21; 6 (1): 62], получаемых в ходе ПЦР «в реальном времени», предусматривающий устранение «шума» путем сглаживания кривых, отражающих зависимость интенсивности флуоресцентного излучения от количества циклов ПЦР, вычитания интенсивности базовой флуоресценции и нормализации амплитуды с последующим определением оптимального порогового уровня интенсивности флуоресценции и точек пересечения его линии с полученными кривыми.
Недостатком такого способа является невозможность его применения непосредственно в ходе ПЦР «в реальном времени», а используемая амплитудная нормализация существенно искажает результаты измерений.
Наиболее близким к предложенному способу является изобретение [RU патент №2294532 С1, МПК G01N 21/64, Бюл. №6, 14.02.2006], в котором до проведения ПЦР «в реальном времени» в реакционную смесь добавляется калибровочное вещество, содержащее флуорофор, измеряются интенсивности флуоресцентного излучения на первых циклах ПЦР, а результат корректируется путем вычитания из интенсивности флуоресцентного излучения на каждом цикле ПЦР интенсивности фонового излучения и умножения на калибровочный коэффициент, учитывающий зависимость интенсивности флуоресцентного излучения, испускаемого калибровочных веществом, с последующим построением стандартизованной кривой для каждой реакционной смеси.
Недостатком такого способа является невозможность его применения для стандартизации данных в конвекционной ПЦР «в реальном времени» из-за наличия температурных неоднородностей внутри смеси во время конвекции.
Задачей изобретения является обеспечение надежной стандартизации данных в конвекционной ПЦР «в реальном времени» за счет учета температурных неоднородностей внутри смеси во время конвекции с возможностью проведения не только качественных, но и количественных анализов нуклеиновых кислот.
Согласно заявляемому способу стандартизации данных конвекционной полимеразной цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции по флуоресценции непосредственно во время реакции, заключающемуся в том, что до проведения конвекционной полимеразной цепной реакции с непосредственной регистрацией продуктов реакции в каждую реакционную смесь добавляют калибровочное вещество, содержащее флуорофор и обладающее зависимостью интенсивности испускаемого флуоресцентного излучения от температуры, в равных конечных концентрациях, определяют разницу между интенсивностью фонового излучения и интенсивностями флуоресцентного излучения, измеренными на каждом цикле полимеразной цепной реакции, полученные значения умножают на калибровочный коэффициент, учитывающий зависимость интенсивности флуоресцентного излучения, испускаемого калибровочных веществом в каждой реакционной смеси, для двух различных температур, с последующим построением для каждой реакционной смеси стандартизованной кривой непосредственно в ходе полимеразной цепной реакции, отражающей зависимость интенсивности флоресцентного излучения от номера цикла полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что до начала проведения конвекционной полимеразной цепной реакции после добавления калибровочного вещества производят несколько циклов равномерных нагревов и охлаждений реакционной смеси до граничных температур полимеразной цепной реакции с одновременной регистрацией и попарным запоминанием значений интенсивности флуоресценции и температуры в каждой реакционной смеси, измерения флуоресценции и температуры во время конвекции проводят одновременно и непрерывно в режиме реального времени в заданных точках внутри каждой реакционной смеси, величину фоновой флуоресценции определяют как выборку по текущей измеренной температуре в данной точке во время полимеразной цепной реакции из массива данных флуоресценции, полученных до начала проведения конвекционной полимеразной цепной реакции, а калибровочный коэффициент вычисляют как обратную величину разности по модулю между выборками интенсивностей флуоресценции по граничным значениям температур конвекции, полученными до начала проведения конвекционной полимеразной цепной реакции для каждой реакционной смеси.
Таким образом, благодаря одновременному измерению интенсивности флуоресценции и температуры в заданных точках реакционной смеси учитывается температурная неоднородность внутри смеси при стандартизации данных конвекционной ПЦР «в реальном времени» предлагаемым способом.
При этом необходимо, чтобы концентрации калибровочного флуоресцирующего вещества в каждой реакционной смеси были известны, а само калибровочное вещество не мешало протеканию ПЦР.
Технический результат - надежная стандартизация данных конвекционной ПЦР «в реальном времени» непосредственно в ходе ПЦР, позволяющая проводить не только качественный, но и количественный анализы нуклеиновых кислот.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлены зависимости интенсивности флуоресценции от температуры для двух экспериментов в каждой из реакционных смесей, зависимости получены путем равномерного нагрева и охлаждения реакционного блока до начала конвекционной ПЦР, проводимой в 8 пробирках.
На фиг.2 приведен график зависимости интенсивности флуоресценции от температуры для двух экспериментов в каждой из реакционных смесей, зависимости получены во время проведения конвекционной ПЦР в 8 пробирках.
На фиг.3 представлены зависимости интенсивности флуоресцентного излучения от номера цикла конвекционной ПЦР, не стандартизованные согласно предлагаемому способу.
На фиг.4 представлены зависимости интенсивности флуоресцентного излучения от номера цикла конвекционной ПЦР, стандартизованные согласно предлагаемому способу.
Пример осуществления изобретения
2
Конвекционная ПЦР проводилась в 30 мкл реакционной смеси, содержащей буфер (40 мМ Трис-HCl рН 8.0, 2.5 мМ MgCl, 25 мМ KCl); 1 ед. акт. Taq ДНК полимеразы; 10 пмоль детектирующей и 10 пмоль калибровочной проб; по 20 пмоль каждого из 2 праймеров и соответствующее количество дистиллированной воды.
Для создания конвекции использовался реакционный блок, в котором пробирки снизу нагревались до температуры 95°С, сверху до 62°С. Они помещались в амплификатор iCycler IQ5 (производства Bio-Rad Laboratories, Inc.) с установленными на него цифровыми температурными датчиками MLX90614 (производства Melexis NV), соединенными друг с другом по последовательному каналу I2C для слежения за температурой каждой реакционной смеси. Перед проведением ПЦР значения температурных датчиков корректировались для выравнивания показаний во время равномерного нагрева/охлаждении реакционного блока.
До начала реакции проводилось 2 цикла равномерного нагрева/охлаждения до граничных температур конвекции с непрерывной регистрацией интенсивностей флуоресценции I0 и температуры Т0, значения записывались в виде массивов I0(Т0) для каждой реакционной смеси (фиг.1).
Во время конвекционной ПЦР «в реальном времени» измерялись интенсивности флуоресценции I1 и температуры Т1 в одной точке внутри каждой реакционной смеси и фиксировались в виде массивов I1(n) (фиг.2) с одновременным запоминанием температуры Т1 (где n - номер цикла конвекционной ПЦР).
Интенсивность фонового излучения Iф для каждой реакционной смеси на каждом цикле определялась как Iф=I0(Т1(n)), а калибровочный коэффициент D вычислялся по формуле:
D=1/|I0(Tmax)-I0(Tmin)|,
где Tmax и Tmin - граничные температуры конвекции.
Для построения стандартизованных кривых зависимости интенсивности флуоресцентного излучения от номера цикла для каждой реакционной смеси в ходе процесса конвекцонной ПЦР «в реальном вермени» применялась следующая формула:
Ic(n)=D·(I1(Т1)-Iф).
На фиг.4 представлены кривые зависимости интенсивности флуоресценции от номера цикла конвекционной ПЦР для двух экспериментов со стандартизацией данных, а на фиг.3 - без нее. Коэффициенты вариации количества исходных копий без стандартизации предложенным способом составили 33,7% и 21,5%, а с его применением уменьшились до 16,1% и 11,8% соответственно. Это говорит об эффективности стандартизации данных предлагаемым способом и возможности проведения количественных анализов нуклеиновых кислот за счет улучшения статистических показателей.
Итак, заявляемое изобретение позволяет проводить надежную стандартизацию данных конвекционной ПЦР «в реальном времени» и осуществлять не только качественный, но и количественный анализы нуклеиновых кислот, благодаря одновременному измерению интенсивности флуоресценции и температуры в заданных точках реакционной смеси.