Способ экстракции нуклеиновых кислот из ногтевых пластин
METHOD FOR EXTRACTION OF NUCLEIC ACIDS FROM NAIL PLATES

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, микробиологии и медицине и предназначено для экстракции нуклеиновых кислот (НК) из биологического материала - ногтевых пластин, для последующего анализа методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) или обратной транскрипции (ОТ) и ПЦР (ОТ-ПЦР).
Получившие широкое распространение лабораторные методы выделения НК описаны, например, в J. Sambrook, D.W. Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, NY, v. 1; Short protocols in molecular biology, Wiley, 1995, или в Wilcockson J. The Use of Sodium Perchlorate in Deproteinization During the Preparation of Nucleic Acids // Biochem. J. 1973. V. 135. P. 559-561. Классические методы экстракции НК из «сложных» исходных образцов, таких как кровь или ткани, включают в себя лизис биологического материала детергентами или хаотропными агентами иногда в присутствии разрушающих белки ферментов. После этого этапа следуют несколько стадий, в которых используются органические растворители, такие как фенол и/или хлороформ или этанол.
На современном этапе наиболее эффективными методами выделения и очистки НК при работе со «сложным» биологическим материалом, таким как ногтевые пластины, признаются сорбционный или преципитационный.
Сорбционные методики экстракции НК обеспечивают довольно высокую степень очистки из различных типов биологического материала. Наиболее известным из уровня техники является способ выделения НК, предложенный Boom с соавторами [US 5234809, дата приоритета 01.07.1991]. Этот способ включает в себя стадию лизиса клеток сильным хаотропным агентом, который разрушает клеточные мембраны и инактивирует внутриклеточные РНКазы, и последующую сорбцию НК на носителе. НК обратимо связывается со стеклом в присутствии высокой концентрации хаотропных солей (например, гуанидин хлорида, гуанидин тиоцианата). В таких условиях связывания белков с матрицей не происходит. Хаотропные соединения представляют собой вещества, нарушающие упорядоченную структуру воды и тем самым приводящие мембраны в состояние хаоса (например, мочевина, йодид натрия). Таким образом, помимо связывания, хаотропные агенты обеспечивают разрушение клеточных мембран и лизис клеток с последующим выходом НК. Примеси отмываются хаотропной солью, а хаотропная соль - 80% этанолом. Очищенная НК снимается со стекла буфером с низкой ионной силой.
Несмотря на высокую степень популярности сорбционных методик, их применение может быть сопряжено с потерями НК вследствие необратимой сорбции на носителе или в процессе нескольких промываний. Кроме того, остаточное количество носителя (например, диоксида кремния) в конечном растворе НК может ингибировать ферментативные реакции ОТ и/или ПЦР.
Преципитация (спиртовое осаждение) предполагает агрегацию НК (как ДНК, так и РНК) в присутствии соли и спирта. После осаждения спиртом НК отделяется от раствора центрифугированием. Осадок, содержащий целевую НК, неоднократно промывается спиртами и концентрируется центрифугированием. На завершающем этапе процедуры происходит растворение НК в водном буфере, часто в процессе инкубирования при нагревании до 55-65°С для лучшего растворения осадка.
Преимуществом данной технологии является возможность работы со «сложными» образцами, выделяя в равной степени, как ДНК, так и РНК, однако спиртовое осаждение приводит к преципитации не только НК, но и белков, что в свою очередь затрудняет получение чистого препарата. Наиболее простым путем решения проблемы с нежелательными примесями является уменьшение исходного объема анализируемого образца, однако такой подход неприменим, если необходимо получить в результате препарат НК с высокой степенью химической чистоты и высокой концентрацией.
Из уровня техники известен способ экстракции НК методом преципитации из таких биологических образцов, как кровь, сыворотка, плазма, иные жидкости (спинномозговая жидкость, слюна, сперма и моча и др.), продукты крови, полученные из плазмы или сыворотки. Данный способ раскрывается в патенте EP1306446, дата приоритета 02.08.2000, и включает следующие стадии: i) инкубирование биологического образца с восстанавливающим агентом, соосаждением и денатурирующим белком для разложения и денатурирования белков и других загрязняющих веществ в биологическом образце без использования протеазы; ii) прямое осаждение спиртом. Способ реализуется посредством применения набора для извлечения НК, включающего восстановитель, сореципитент и денатурирующий белок, при этом упомянутый набор не содержит протеазу. На стадии i) инкубация происходит при 55-65°C, предпочтительно около 60°C, в течение от 5 минут до 15 минут, предпочтительно, около 10 минут. Наиболее предпочтительно инкубация проводится при температуре около 60°C в течение около 10 минут. На стадии ii) реакционную смесь, полученную на стадии i) объединяют с низшим спиртом для осаждения НК. Подходящие спирты включают изопропанол и этанол или тому подобное. Предпочтительно изопропанол добавляют при конечной концентрации 40% или более или этанол добавляют при конечной концентрации 70% или более. Затем полученную смесь можно охладить до температуры от минус 70°C до 40C после добавления низшего спирта для повышения эффективности высаливания.
Несмотря на то, что указанный способ является наиболее распространенным при проведении экстракции НК методом преципитации, он не позволяет обеспечить достаточно высокий процент выхода высокоочищенной тотальной ДНК/РНК из образцов ногтевых пластин.
3
2
з уровня техники известен способ экстракции ДНК из биологического материала ногтей методом преципитации, где в 1,5 мл пробирку с 100 мкл лизирующего буфера (50 мМ ТрисНСl рН 9,5, 250 мМ KCl, 60 мМ NaHCO) вносят ногтевые чешуйки и инкубируют при температуре 90-95°С 5-10 минут. К лизату добавляют равный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта (в соотношении 24:1), после чего всю смесь перемешивают и центрифугируют 10 минут при 9 000 g. Верхнюю фазу отбирают и добавляют 0,1 объема 3М ацетата натрия и 2 объема этилового спирта. После этого пробирку инкубируют в течение 2 часов при температуре минус 20°С. Далее центрифугируют 10 минут при 20 000 g на холоде, осадок ДНК отмывают от солей 0,5 мл 70% этилового спирта при комнатной температуре в течение 10 минут. Осажденную ДНК растворяют в 30 мкл ddHO [Патент RU 2584035, дата приоритета 12.02.2015].
Данный способ разработан для выделения только ДНК и предназначен для проведения экстракции из образцов ногтевых чешуек, при этом в качестве биологического материала не могут быть использованы фрагменты ногтевых пластин. Кроме того, при реализации упомянутого способа применяется хлороформ - высокотоксичное вещество.
Human betaherpesvirus
Также известно, что для выделения ДНК из образцов ногтевых пластин использовался комплект реагентов «РИБО-преп» (РУ № ФСР 2008/03147, ЦНИИЭ, Россия) [Первые данные о распространенности в России хромосомно-интегрированного  6А/В, передаваемого по наследству. Домонова Э.А., Сильвейстрова О.Ю., Гоптарь И.А., Кулешов К.В., Никифорова А.В., Матосова С.В., Шипулина О.Ю. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы № 4/2019, стр. 43-50]. Экстракцию ДНК проводили согласно инструкции по применению комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» [https://interlabservice.ru/upload/iblock/428/%D0%98%D0%BD%D1%81%D1%82%D1%80%D1%83%D0%BA%D1%86%D0%B8%D1%8F%20%D0%BA%20%C2%AB%D0%A0%D0%98%D0%91%D0%9E-%D0%BF%D1%80%D0%B5%D0%BF%C2%BB%20(%D0%BE%D0%B1%D0%BD%D0%BE%D0%B2%D0%BB%D0%B5%D0%BD%D0%BE%2020.05.2020).pdf]. Инструкция предполагает проведение следующих манипуляций:
Раствор для лизиса прогревают при температуре 65°С до полного растворения кристаллов, отбирают необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл с плотно закрывающимися крышками (включая отрицательный и положительный контроли выделения) и вносят в каждую пробирку по 10 мкл ВКО. Затем в пробирки добавляют по 300 мкл раствора для лизиса, пробирки маркируют. В пробирки с раствором для лизиса и ВКО, вносят по 100 мкл подготовленных проб, используя наконечники с фильтром. В пробирку отрицательного контроля (ОК) выделения вносят 100 мкл отрицательного контрольного образца (ОКО), в пробирку положительного контроля (ПК) выделения вносят 90 мкл ОКО и 10 мкл положительного контрольного образца (ПКО). Содержимое пробирок тщательно перемешивают на вортексе, далее центрифугируют в течение 5 секунд на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней поверхности крышки и прогревают 5 минут при 65°С в термостате. Добавляют в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, перемешивают на вортексе, затем центрифугируют их на микроцентрифуге в течение 5 минут при 13 000 об/мин. Аккуратно отбирают надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 200 мкл для каждой пробы. В пробирки добавляют по 500 мкл раствора для отмывки, плотно закрывают крышки, осторожно промывают осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз, затем центрифугируют при 13 000 об/мин в течение 1-2 минуты на микроцентрифуге. Осторожно, не захватывая осадок, отбирают надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы. Добавляют в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки, плотно закрывают крышки и осторожно промывают осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз, после чего центрифугируют при 13 000 об/мин в течение 1-2 минут на микроцентрифуге. Осторожно, не захватывая осадок, отбирают надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы. Помещают пробирки в термостат при температуре 65°С на 5 минут для подсушивания осадка, добавляют в пробирки по 50 мкл РНК-буфера, перемешивают на вортексе, помещают в термостат при температуре 65°С на 5 минут, периодически встряхивая на вортексе. В заключение пробирки центрифугируют при 13 000 об/мин в течение 1 минуты на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенные РНК и ДНК, пробы готовы к постановке реакции ОТ и ПЦР.
Дальнейшие расширенные лабораторные исследования показали, что НК, выделенные из образцов ногтевых пластин, описанным способом экстракции, не обладают достаточной степенью химической чистоты и в ряде случаев имеют недостаточную концентрацию для последующего анализа методом ПЦР или ОТ-ПЦР.
Общим недостатком перечисленных выше способов экстракции НК является недостаточный процент выхода ДНК/РНК, степень их очистки, что, в свою очередь, снижает качество дальнейших молекулярно-биологических исследований вплоть до невозможности их проведения. Кроме того, в подавляющем большинстве случаев при выполнении процедуры выделения НК из ногтевых пластин необходимы предварительные механические способы гомогенизации исследуемых образцов.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение из образцов биологического материала - ногтевых пластин, высокоочищенного препарата НК, свободного от ингибиторов, с высокой концентрацией, что обеспечивает высокую аналитическую чувствительность последующих молекулярно-биологических исследований (например, включающих ПЦР, ОТ-ПЦР).
Технический результат достигается за счет того, что при проведении экстракции НК применяется метод преципитации, включающей стадии: (i) лизиса биологического материала; (ii) преципитации; (iii) удаления супернатанта и отмывки осадка; (iiii) растворение осадка, содержащего НК, в буфере для элюции, где на стадии лизиса к ногтевым пластинам добавляют 600 мкл лизирующего буфера, затем содержимое пробирки инкубируют при температуре 65°С в течение 20 минут, после чего перемешивают и центрифугируют при 13 000 об/мин в течение 2 минут, на стадии преципитации полученную надосадочную жидкость в объеме 400 мкл вносят в отдельные пробирки и добавляют раствор для преципитации в равном объеме.
При этом для проведения одного исследования используется 2 образца ногтевых пластин размером, приближенном к 2х10 мм.
Эффективность всех этапов экстракции может быть проконтролирована за счет использования:
- внутреннего экзогенного контрольного образца (ВКО), представляющего собой искусственно сконструированную последовательность НК,
а так же:
- отрицательного контрольного образца (ОКО), представляющего собой стерильный раствор, не содержащий ДНК и РНК,
- положительного контрольного образца (ПКО), представляющего собой искусственно сконструированную последовательность НК искомой мишени (например, фрагмент уникальной последовательности ДНК микроорганизма).
При этом ВКО вносят в каждую пробирку в объеме на 50% больше стандартного (например, рекомендуемого инструкцией к используемому набору реагентов) до момента внесения лизирующего буфера.
ОКО вносят в пробирку, предназначенную для отрицательного контроля экстракции, в объеме 100 мкл. ПКО вносят в пробирку, предназначенную для положительного контроля экстракции, в объеме 100 мкл в концентрации, увеличенной в 1,5 раза. После добавления лизирующего буферапробирки с ОКО и ПКО тщательно перемешивают на вортексе, осаждают капли с внутренней поверхности крышки центрифугированием в течение 5 секунд на микроцентрифуге и только после этого инкубируют при температуре 65°С в течение 20 минут.
Предлагаемый способ экстракции НК позволяет быстро и с высоким показателем выхода (не менее чем в 2,08 и 1,92 раза больше для ДНК и РНК, соответственно, по сравнению с прототипом) осуществлять одновременно процедуру выделения и очистки НК из таких «сложных» типов биологического материала как ногтевые пластины. Полученный препарат НК можно использовать для проведения молекулярно-биологических исследований, в том числе для ПЦР-диагностики.
Заявляемое решение реализуется следующим образом:
Сбор образцов ногтевых пластин обследуемых производят после удаления декоративного лака или гель-лака (при наличии покрытия ногтевой пластины), тщательного мытья рук, включая подногтевые пространства, и обсушивания одноразовыми салфетками. Ножницами обрезают свободный край ногтевой пластины (3-4 образца) из расчета на одно исследование - 2 образца размером, приближенным к 2х10 мм.
Предназначенные для ПЦР-исследования образцы ногтевых пластин помещают в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры с крышкой или пробирки типа «Эппендорф». При сборе образцов биологического материала используют только одноразовый стерильный инструментарий.
Экстракция тотальной ДНК/РНК осуществляется методом преципитации, например с применением коммерческого набора реагентов. Экстракция включает следующие стадии:
(i) лизис биологического материала, при котором:
(i) (a) отбирают необходимое количество одноразовых полипропиленовых микропробирок с плотно закрывающимися крышками.
Если протоколом исследования предусмотрено использование внутреннего контрольного образца, то в каждую пробирку вносят ВКО в объеме на 50% больше стандартного (например, рекомендуемого инструкцией к используемому коммерческому набору реагентов). Пробирки маркируют.
(i) (b) в каждую пробирку вносят исследуемый биологический материал - 2 образца ногтевых пластин размером, приближенным к 2х10 мм.
Если протоколом исследования предусмотрено использование отрицательного и положительного контролей прохождения этапа выделения НК, то в пробирку, предназначенную для отрицательного контроля экстракции, вносят 100 мкл ОКО, а в пробирку, предназначенную для положительного контроля экстракции, вносят 100 мкл ПКО в концентрации увеличенной в 1,5 раза.
(i) (c) в пробирки добавляют по 600 мкл предварительно прогретого до 65°С (до полного растворения кристаллов) лизирующего буфера, включающего в свой состав хаотропный агент, например гуанидин тиоционат. Биологический материал должен быть полностью погружен в раствор.
Проведение манипуляций в указанном порядке исключает возможность недостаточного погружения исследуемых образцов биологического материала в лизирующий буфер, сводя к минимуму ошибки на данной стадии преаналитического этапа.
Если протоколом экстракции предусмотрено использование отрицательного и положительного контролей прохождения этапа выделения НК, то пробирки с ОКО и ПКО тщательно перемешивают на вортексе, центрифугируют в течение 5 секунд на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней поверхности крышки.
(i) (d) содержимое пробирок, полученное по стадии (i) (c), инкубируют в течение 20 минут при температуре 65°С.
(i) (e) содержимое пробирок, полученное на стадии (i) (d), перемешивают и центрифугируют в течение 2 минут при скорости 13 000 об/мин для отделения от еще неполностью лизированных составных частей исследуемого биологического материала.
В результате получают надосадочную жидкость, пригодную для проведения преципитации.
(ii) преципитация, где:
(ii) (a) отбирают необходимое количество одноразовых полипропиленовых микропробирок с плотно закрывающимися крышками. Пробирки маркируют.
(ii) (b) в каждую пробирку вносят по 400 мкл аккуратно отобранной надосадочной жидкости, полученной в результате реализации стадии (i).
(ii) (c) в каждую пробирку к надосадочной жидкости добавляют по 400 мкл раствора для преципитации, содержащий изопрапонол - изопропиловый спирт.
(ii) (d) содержимое пробирок, полученное по стадии (ii) (c) перемешивают на вортексе и центрифугируют на микроцентрифуге в течение 5 минут при 13 000 об/мин.
Полученная в результате реализации стадии (ii) суспензия пригодна для удаления супернатанта и отмывки осадка.
(iii) удаление супернатанта и отмывка осадка, при которой:
(iii) (a) из пробирки отбирают надосадочную жидкость, не задевая осадок и используя отдельный наконечник для каждой пробы.
(iii) (b) к осадку в пробирки добавляют 500 мкл раствора для отмывки, который содержит 70% этиловый спирт, укупоривают пробирку и промывают осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз.
(iii) (c) центрифугируют при 13 000 об/мин в течение 1-2 минут и, не захватывая осадок, отбирают надосадочную жидкость, используя отдельный наконечник для каждой пробы.
(iii) (d) к осадку в пробирку добавляют 200 мкл раствора для отмывки, содержащий 95% этиловый спирт или смесь 70% ацетона и 70% этилового спирта в равных пропорциях, укупоривают пробирку и промывают осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз;
(iii) (e) центрифугируют при 13 000 об/мин в течение 1-2 минут и, не захватывая осадок, отбирают надосадочную жидкость, используя отдельный наконечник для каждой пробы;
(iii) (f) пробирки с открытыми крышками помещают в термостат, прогретый до температуры 65°С на 5 минут для подсушивания осадка.
В результате получают подсушенный осадок, пригодный для последующего элюирования в целях получения препарата тотальной ДНК/РНК.
(iiii) растворение осадка, содержащего НК, в буфере для элюции, при которой:
- в пробирку с подсушенным осадком добавляют 50 мкл буфера для элюции, состоящего из стерильного раствора с низким содержанием соли, перемешивают и нагревают в течение 5 минут при температуре 65°С периодически встряхивая.
- пробирки центрифугируют при 13 000 об/мин в течение 1 минуты.
На выходе получают надосадочную жидкость, которая содержит высокоочищенную тотальную ДНК/РНК, готовую для непосредственного использования в постановке ПЦР или ОТ-ПЦР, и проведения дальнейших молекулярно-биологических исследований.
Заявляемый способ экстракции нуклеиновых кислот из образцов ногтевых пластин позволяет повысить качество и количество (процент выхода НК) получаемого препарата тотальной ДНК/РНК без значительного увеличения продолжительности процедуры и удорожания процесса. В заявляемом способе экстракции, основанном на принципе преципитации, для того, чтобы свести к минимуму потери тотальной ДНК/РНК и достигнуть максимально возможного удаления ингибиторов ферментативных процессов ПЦР и ОТ-ПЦР, оптимально подобраны объемы используемых реагентов, а так же продолжительность этапов инкубирования и центрифугирования.
В основе создания заявляемого изобретения лежит исследование, выполненное в ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Материалом для исследования послужили 440 образцов ногтевых пластин 100 человек в возрасте от 5 дней до 80 лет (медиана возраста 29 лет), среди которых: 44,0% мужчин (44/100) и 56% женщин (56/100). Исследование проведено в соответствии с законодательством РФ, международными этическими нормами и нормативными документами ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора при наличии письменного согласия пациентов.
Сравнение эффективности экстракции НК согласно заявляемому способу проводили с коммерчески доступными комплектами реагентов на основе аналогичного метода выделения тотальной ДНК/РНК, в рамках которого экстракцию НК из анализируемых образцов биологического материала осуществляли одновременно при помощи 4 методик, основанных на преципитационном методе, а именно: с использованием комплекта реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, РФ) (далее комплект реагентов №1) в соответствии с инструкцией производителя (стандартный протокол) и его модифицированного протокола, согласно заявляемому способу, а также комплекта реагентов «ПРОБА-НК» (ООО «НПО ДНК-Технология, РФ) (далее - комплект реагентов №2) в соответствии с инструкцией производителя (стандартный протокол) и его модифицированного протокола, согласно заявляемому способу. При этом комплект реагентов №1 (стандартный протокол) был принят за прототип заявляемого способа, а комплект реагентов №2 (стандартный протокол) - способ сравнения.

Определение концентрации НК проводили флуориметрическим методом с использованием флуориметра «Qubit 3» («Thermo Fisher Scientific», США). Концентрацию НК измеряли с применением высокочувствительных флуоресцентных зондов, способных селективно связываться с целевыми молекулами ДНК или РНК с образованием флуоресцентного комплекса. Интенсивность флуоресценции комплекса являлась пропорциональной концентрации аналита в диапазоне 0,2-100 нг/мкл и 5-100 нг/мкл, для исходного образца ДНК и РНК, соответственно.

Параллельно концентрацию ДНК в образцах биологического материала и отсутствие влияния ингибиторов на прохождение ферментативной реакции определяли методом ПЦР-РВ с анализом полученных результатов в количественном формате («АмплиСенс HHV6-скрин-титр-FL», ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, РФ). Расчет концентрации ДНК, оцененное по β-глобиновому гену человека, выполняли в lg копий/мл.
5
6

Дополнительно проведено изучение влияния ингибиторов на прохождение ОТ-ПЦР. Оценку проводили относительно эффективности количественного определения экзогенного ВКО, представляющего собой искусственно сконструированную последовательность РНК, встроенную в фаг ms2, в концентрации 5х10-2х10 копий/мл («АмплиСенс HCV-Монитор-FL», ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, РФ). Расчет концентрации РНК выполняли в lg копий/мл.
Постановку и анализ результатов амплификации выполняли на приборе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» «Rotor-Gene Q» («Qiagen», ФРГ).
В результате проведенного исследования определены количественные характеристики НК, экстрагированных из образцов ногтевых пластин (n=50) при использовании четырех различных способов. Результаты сравнения количественных характеристик НК, выделенных из образцов ногтевых пластин при использовании различных способов экстракции приведены в Таблице 1. Для сравнительного анализа использовались пробы НК, полученные согласно способам, взятым в качестве прототипа и сравнения в стандартном и модифицированном вариантах методик.
Таблица 1. Сравнение количественных характеристик НК, выделенных из образцов ногтевых пластин при использовании различных способов экстракции
№№
Количественные характеристики
Тип исследуемого биологического материала
Ногтевые пластины (n=50)
комплект реагентов №1
комплект реагентов №2
стандартный протокол
модифицированный протокол согласно заявляемому способу
стандартный протокол
модифицированный протокол согласно заявляемому способу
1
Объем элюции, мкл
50,0
50,0
50,0
50,0
2
Концентрация ДНК, нг/мл
2,5-41,6(Ме 10,6)
5,2-89,1(Ме 22,2)
ниже предела детекции
1,9-35,1(Ме 14,0)
3
Концентрация РНК, нг/мл
40,2-195,0(Ме 63,8)
77,1-454,0(Ме 131,0)
ниже предела детекции
25,9-193,0(Ме 103,0)
Количественные характеристики НК, экстрагированных модифицированным способом из образцов ногтевых пластин, удовлетворяют требованиям к образцам, предназначенным для выполнения ПЦР и ОТ-ПЦР. Это позволяет считать заявляемый способ экстрации пригодным для использования в медико-биологических исследованиях, связанных с получением НК.
При определении возможности применения способа экстракции согласно заявляемому изобретению при практической работе с образцами ногтевых пластин, проведена сравнительная оценка эффективности экстракции НК методом ПЦР (n=30) и ОТ-ПЦР (n=30). Для сравнительного анализа использовались пробы НК, полученные согласно способам, взятым в качестве прототипа и сравнения в стандартном протоколе и модифицированном протоколе согласно заявленному способу.
Заявляемое изобретение поясняется графиками - Фиг. 1 и Фиг. 2, где:
На Фиг. 1 «Сравнение концентрации ДНК, выделенной из образцов ногтевых пластин при использовании различных способов экстракции» изображены результаты распределений концентраций ДНК, оцениваемой по β-глобиновому гену человека, в образцах биологического материала при использовании четырех различных способов, при этом столбец с косой штриховкой визуализирует результаты исследования, полученные путем проведения экстракции при использовании стандартного протокола, а столбец с горизонтальной штриховкой - результаты исследования, полученные путем проведения экстракции при использовании модифицированного протокола согласно заявляемому способу.
На Фиг. 2 «Сравнение концентрации РНК ВКО при экстракции образцов ногтевых пластин различными способами» изображены результаты распределений концентраций ВКО, представляющего собой искусственно сконструированную последовательность РНК, встроенную в фаг ms2, в образцах биологического материала при использовании четырех различных способов экстракции, при этом столбец с косой штриховкой визуализирует результаты исследования, полученные путем проведения экстракции при использовании стандартного протокола, а столбец с горизонтальной штриховкой - результаты исследования, полученные путем проведения экстракции при использовании модифицированного протокола согласно заявляемому способу.
В результате проведенных исследований установлено, что эффективность экстракции ДНК, оцениваемой по β-глобиновому гену человека, при применении заявляемого способа выше (р<0,05), чем при применении стандартных протоколов исследований как для комплекта реагентов №1, так и для комплекта реагентов №2. Наименьшая концентрация ДНК определена в пробах НК, экстрагированных из образцов ногтевых пластин согласно методике способа сравнения (в среднем 2,7 lg копий ДНК/мл). А наибольшая концентрация ДНК - при помощи заявляемого решения, составлявшая в среднем 5,2 и 5,3 lg копий ДНК/мл, соответственно для модифицированных протоколов согласно заявляемому способу исследований прототипа (комплект реагентов №1) и сравнения (комплект реагентов 2). Результаты распределений концентраций ДНК, оцениваемой по β-глобиновому гену человека, в образцах биологического материала при использовании четырех различных способов представлены на Фиг.1.
При изучении эффективности экстракции РНК исключено ингибирование прохождения ОТ-ПЦР, оцененное по эффективности амплификации экзогенного внутреннего контрольного образца, при использовании четырех различных способов. Результаты распределений концентраций ВКО, представляющего собой искусственно сконструированную последовательность РНК, встроенную в фаг ms2, в образцах биологического материала при использовании четырех различных способов экстракции представлены на Фиг.2. Наименьшая концентрация РНК определена в пробах НК, экстрагированных из образцов ногтевых пластин согласно методике способа сравнения (в среднем 4,33 lg копий РНК/мл). А наибольшая концентрация РНК - при помощи заявляемого решения, составлявшая в среднем 5,01 и 5,28 lg копий РНК/мл, соответственно для модифицированных протоколов согласно заявляемому способу исследований прототипа (комплект реагентов №1) и сравнения (комплект реагентов 2).
Таким образом, заявляемое изобретение позволяет провести экстракцию тотальной ДНК/РНК из образцов биологического материала - ногтевых пластин, с высокой концентрацией. Концентрация тотальной ДНК по заявляемому способу составляет до 89,1 нг/мл, а тотальной РНК - до 454,0 нг/мл, то есть заявляемый способ позволяет увеличить выход препарата тотальной ДНК/РНК не менее чем в 1,92 раза. Отсутствие данных по ингибированию ферментативных реакций прохождения ПЦР и ОТ-ПЦР позволяет использовать как ДНК, так и РНК для дальнейших исследований.
Решение, предлагаемое в заявляемом изобретении, является необходимым и достаточным для достижения поставленной задачи - экстракции ДНК/РНК, имеющих высокую степень химической очистки, свободных от ингибиторов, с высокой концентрацией, пригодных для постановки ПЦР (ОТ-ПЦР) и проведения дальнейших молекулярно-биологических исследований.
Следующие ниже примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение, но не предназначены для ограничения его применения.
Пример 1.
Данный пример демонстрирует возможность использования РНК, экстрагированной из образцов ногтевых пластин, при проведении молекулярно-биологических исследований.
Для проведения молекулярно-биологических исследований в Отдел молекулярной диагностики и эпидемиологии ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора направлен мужчина (23 года).
Сбор образцов ногтевых пластин производили после тщательного мытья рук обследуемым, включая подногтевые пространства, и обсушивания одноразовыми салфетками. Свободный край ногтевой пластины (n=4) обрезали одноразовыми стерильными ножницами. Предназначенные для анализа образцы биологического материала помещали в одноразовые стерильные пластиковые пробирки типа «Эппендорф» и маркировали.

Перед проведением процедуры экстракции исследуемые биологические образцы разделяли из расчета на одно исследование - 2 образца ногтевых пластин размером, приближенным к 2х10 мм. Экстракцию РНК из образцов ногтевых пластин проводили согласно способу заявляемого изобретения. Для всех проб, экстрагированных из образцов биологического материала, определяли концентрацию РНК с использованием флуориметра «Qubit 3» («Thermo Fisher Scientific», США) согласно инструкции производителя. Результаты тестирования представлены в Таблице 2. Количественные характеристики РНК, экстрагированной из образцов ногтевых пластин мужчины (23 года). Далее пробы РНК хранили при температуре не выше минус 70°С до проведения тестирования в рамках дальнейшего молекулярно-биологического исследования, избегая повторного оттаивания-замораживания, но не более одного года.
Таблица 2. Количественные характеристики РНК, экстрагированной из образцов ногтевых пластин мужчины (23 года)
№№
Название образца
Тип исследуемого биологического материала
Количественные характеристики
Объем элюции, мкл
Концентрация РНК, нг/мл
1
Образец №532/1
ногтевые пластины
50,0
454,0
2
Образец №532/2
ногтевые пластины
50,0
420,0
Таким образом, количественные характеристики РНК, экстрагированной из образцов ногтевых пластин согласно заявляемому способу изобретения, удовлетворяют требованиям к образцам, предназначенным для молекулярно-биологических исследований. Образцы РНК готовы к дальнейшему использованию.
Пример 2.
Данный пример демонстрирует возможность использования ДНК, экстрагированной из образцов ногтевых пластин, при изучении наследственной предрасположенности к различным мультифакторным заболеваниям, например нарушения свертываемости крови, методом ПЦР-РВ.
9
9
9
9
9
9
Пациентка (женщина, 33 года) в рамках проведения предгравидарной подготовки направлена на лабораторное обследование для исключения наследственной предрасположенности к нарушениям свертываемости крови. Из анамнеза известно: женщина (1987 г.р.) правильного телосложения с ожирением (ИМТ 39,9), АД 125/70 мм рт ст., 1-ая беременность закончилась спонтанным абортом на сроке 8 недель в 2013 г., у родственника первой линии (матери) отмечались нарушения свертываемости крови -тромбозы глубоких вен голеней, группа крови A(II) Rh положит., kell отриц., фенотип С+с+Е+е+, жалоб не предъявляла. При обращении за амбулаторной помощью к врачу акушеру-гинекологу пациенткой представлены результаты общего клинического анализа крови (гемоглобин, г/л - 124,00; гематокрит, % - 39,40; тромбоциты, 10/л - 264,00; абсолютное содержание: нейтрофилов, 10/л - 2,96; эозинофилов, 10/л - 0,13; базофилов, 10/л - 0,04; моноцитов, 10/л - 0,40; лимфоцитов, 10/л - 2,24; скорость оседания эритроцитов, мм/ч - 8,00), исследования коагуляционного гемостаза (МНО - 1,154), общего анализа мочи - без патологии.
Для исключения генетической склонности к развитию тромбозов, проведено ПЦР-исследование ДНК, выделенной из образцов ногтевых пластин, включающее качественное определение генотипов по полиморфизмам 20210 G>A (rs1799963) в гене протромбина (F2) и R534Q G>A (rs6025, мутация Лейдена) в гене проакцелерина (F5). Валидность результата анализа оценивалась относительно данных полученных при исследовании ДНК, экстрагированной из образца цельной венозной крови обследуемой, по аналогичным параметрам.
Сбор образцов ногтевых пластин производили после тщательного мытья рук обследуемой, включая подногтевые пространства, и обсушивания одноразовыми салфетками. Свободный край ногтевой пластины (n=2) обрезали одноразовыми стерильными ножницами. Образцы биологического материала размером, приближенным к 2х10 мм, помещали в одноразовую стерильную пластиковую пробирку типа «Эппендорф». Взятие крови производили натощак одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в одноразовую стерильную пробирку объемом 4,0 мл с 6% ЭДТА путем пункции периферической вены после обработки места пункции кожным антисептиком. Предназначенные для ПЦР-исследования образцы биологического материала маркировали. Допускалось хранение образцов ногтевых пластин и ценой венозной крови при температуре 18-25°С и 2-8°С, соответственно, в течение 72 ч. с момента взятия биологического материала.

Выделение ДНК из ногтевых пластин проводили согласно заявленному способу экстракции, цельной венозной крови - при помощи комплекта реагентов «РИБО-преп» (РУ № ФСР 2008/03147, ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, РФ). Для всех проб, экстрагированных из образцов биологического материала, предварительно определяли концентрацию ДНК с использованием флуориметра «Qubit 3» («Thermo Fisher Scientific», США) согласно инструкции производителя. Результаты тестирования представлены в Таблице 3. Количественные характеристики ДНК, экстрагированной из образцов ногтевых пластин и цельной венозной крови женщины (33 года).
Таблица 3. Количественные характеристики ДНК, экстрагированной из образцов ногтевых пластин и цельной венозной крови женщины (33 года)
№№
Тип исследуемого биологического материала
Объем элюции,мкл
Концентрация ДНК, нг/мл
1
Ногтевые пластины
50,0
69,5
2
Цельная венозная кровь
50,0
316,3

Затем пробы ДНК анализировали методом ПЦР-РВ с использованием набора реагентов «АмплиСенс F2/F5-SNP-FL» (РУ № РЗН 2019/8325, ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, РФ) согласно инструкции производителя. Постановку и анализ результатов амплификации проводили на приборе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» «Rotor-Gene Q» («Qiagen», ФРГ). Результаты лабораторного обследования пациентки представлены в Таблице 4. Результаты определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития тромбозов методом ПЦР-РВ.
Таблица 4. Результаты определения генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития тромбозов методом ПЦР-РВ
№№
НК
Тип исследуемого биологического материала
Определяемый параметр
полиморфизм в гене F2(протромбин, 20210 G>A), rs1799963
полиморфизм в гене F5(коагуляционный фактор V, мутация Лейдена, R534Q G>A), rs6025
1
ДНК
ногтевые пластины
GG
GG
2
ДНК
цельная венозная кровь
GG
GG
Как следует из таблицы у обследуемой женщины детектирован частый («дикий тип») вариант генотипа (генотип GG) для каждого из анализируемых полиморфизмов: rs1799963 в гене протромбина (F2) и rs6025 в гене проакцелерина (F5). Установлено 100% совпадение полученных результатов по сравниваемым типам биологического материала (образцы ногтевых пластин и цельной венозной крови) пациентки при изучении наследственной предрасположенности к нарушению свертываемости крови (развитию тромбозов) методом ПЦР-РВ, аллели риска не выявлены.
Таким образом, количественные и качественные характеристики ДНК, экстрагированной из образцов ногтевых пластин, позволяют рекомендовать данный тип биологического материала для использования при изучении наследственной предрасположенности пациентов к различным мультифакторным заболеваниям методом ПЦР-РВ.
Пример 3.
Данный пример демонстрирует возможность использования ДНК, экстрагированной из образцов ногтевых пластин, при лабораторном подтверждении хиВГЧ-6А-статуса и расшифровке случая наследственной передачи хромосомно-интегрированного вируса герпеса человека 6А (хиВГЧ-6А) у членов одной семьи.
5
5
5
5
5
5
5
Из анамнеза известно: мальчик (2016 г.р.) от матери (1986 г.р., соматически здорова), от I беременности, протекавшей: I триместр - ретрохориальная гематома, повышение Д-димера, II триместр - без особенностей, III триместр - анемия беременных. Роды I самопроизвольные в срок. Ребенок родился с весом 3570 г, длиной тела 54 см, окружностью головы - 36 см, окружностью груди - 36 см. Оценка по шкале Апгар - 8/9 баллов. Неонатальный период - без особенностей. При лабораторном обследовании ребенка на фоне клинического здоровья в возрасте 1,5 месяцев выявлены изменения: в гемограмме: анемия (гемоглобин - 85 г/л), относительная нейтропения (12,6%), тромбоцитоз (506 тыс.); в крови ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации 5,14 lg копий/10 клеток (ПЦР-РВ) при отсутствии вирусоспецифических антител класса IgG (ИФА) в сыворотке крови. По данным УЗИ - тимомегалия III степени. На основании результатов клинико-лабораторного обследования мальчику выставлен диагноз: «Острая инфекция, вызванная вирусом герпеса человека 6?». Рекомендовано провести клинико-лабораторное обследование матери ребенка. Рассматривался вопрос о назначении пациенту специфической противовирусной терапии. Дальнейшее обследование ребенка, матери включало лабораторное подтверждение или исключение активной ВГЧ-6А/В-инфекции. В результате которого, ДНК ВГЧ-6А/В методом ПЦР-РВ выявлена в концентрации ≥5 lg копий/10 клеток во всех типах исследованного биологического материала как ребенка, так и его матери (цельная кровь, плазма крови, мазок из ротоглотки; моча ребенка) без увеличения полученных значений в динамике. При этом определяемая концентрация ДНК вируса коррелировала с количеством клеток в исследуемом образце, оцениваемым по β-глобиновому гену человека. В крови концентрация вирусной ДНК составляла у матери - 5,23 lg копий/10 клеток, ребенка - 5,24 lg копий/10 клеток, плазме крови - 5,10 lg копий/10 клеток (для обоих); мазок из ротоглотки - 5,27 и 5,29 lg копий/10 клеток у матери и ребенка, соответственно; моча - 5,35 lg копий/10 клеток (ребенок). В образцах сыворотки крови пациентов вирусоспецифические антитела класса IgG методом ИФА не обнаружили. Последующее динамическое ИФА-исследование парных сывороток крови матери и мальчика, взятых с интервалом 14 дней, сероконверсию вирусоспецифических АТ-IgG не выявило, что указывало на отсутствие данных, свидетельствующих об инфицировании пациентов экзогенным ВГЧ-6А/В. Следует отметить, что мать мальчика на момент клинико-лабораторного обследования жалоб не предъявляла, клинических симптомов активной инфекции у нее не выявлено, показатели общего клинического и биохимического анализов крови, общего анализа мочи находились в пределах диапазона референсных значений.
Полученные данные лабораторного обследования и отсутствие у пациентов клинических признаков активной инфекции явились основанием для подозрения у них хиВГЧ-6А/В-статуса.
Для подтверждения или опровержения данного предположения проведено дополнительное исследование образцов ногтевых пластин матери, ребенка методом ПЦР-РВ. Сбор образцов ногтевых пластин производили после тщательного мытья рук, включая подногтевые пространства, и обсушивания одноразовыми салфетками. Свободный край ногтевой пластины (n=4) обследуемых обрезали одноразовыми стерильными ножницами, помещали в одноразовые стерильные пластиковые пробирки типа «Эппендорф» и маркировали. Допускалось хранение образцов ногтевых пластин при температуре 18-25°С в течение 72 ч. с момента взятия биологического материала.

Перед проведением процедуры экстракции исследуемые биологические образцы разделяли из расчета на одно исследование для каждого пациента отдельно - 2 образца ногтевых пластин размером, приближенным к 2х10 мм. Экстракцию ДНК из образцов ногтевых пластин проводили согласно заявленному способу настоящего изобретения. Концентрацию тотальной ДНК, экстрагированой из образцов ногтевых пластин, определяли с использованием флуориметра «Qubit 3» («Thermo Fisher Scientific», США) согласно инструкции производителя. Результаты исследования представлены в Таблице 5. Количественные характеристики ДНК, экстрагированной из образцов ногтевых пластин мальчика (2 месяца) и его матери (31 год).
Таблица 5. Количественные характеристики ДНК, экстрагированной из образцов ногтевых пластин мальчика (2 месяца) и его матери (31 год)
№№
Пациент
Тип биологического материала
Объем элюции,мкл
Концентрация ДНК, нг/мл
1
Ребенок
ногтевые пластины
50,0
42,6
2
Мать
ногтевые пластины
50,0
78,0

5
Концентрацию ДНК ВГЧ-6А/В в исследуемых образцах ногтевых пластин определяли методом ПЦР-РВ с учетом результатов анализа в количественном формате («АмплиСенс HHV6-скрин-титр-FL», ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, РФ) согласно инструкции производителя. Постановку и анализ результатов амплификации проводили на приборе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» «Rotor-Gene Q» («Qiagen», ФРГ). Расчет концентрации выполняли в логарифмах копий специфической ДНК ВГЧ-6А/В на стандартное количество (10) клеток человека, оцененное по β-глобиновому гену.
5
В результате проведенного исследования хиВГЧ-6А, передаваемый по наследству, верифицирован на основании определения ДНК вируса методом ПЦР-РВ в образцах цельной венозной крови и ногтевых пластин ребенка и матери в концентрации 5,24, 5,37 и 5,23, 5,63 lg копий ДНК ВГЧ-6А/В/10 клеток, соответственно. Видовую идентификацию вируса проводили на основании данных, полученных с помощью метода массового параллельного секвенирования («MiSeq», Illumina). ХиВГЧ-6А-статус ребенка и матери констатировали при проведении исследования тотальной ДНК пациентов методом ПЦР со специфическими праймерами, комплементарными участку вирусной ДНК и хромосом человека, с последующим проведением реакции секвенирования по Сэнгеру. В результате которого получены два идентичных ампликона, включающих с одной стороны участок генома ВГЧ-6А, с другой - часть 17р хромосомы человека, между которыми располагался участок с теломерными повторами длиной около 300 нуклеотидов.
Для расшифровки случая наследственной передачи хиВГЧ-6А проведено обследование четверых условно-здоровых ближайших родственников пары «мать-ребенок» с хиВГЧ-6А-статусом: отца ребенка, родной сестры матери, бабушки по материнской линии, дедушки по материнской линии. На момент клинико-лабораторного обследования пациенты жалоб не предъявляли, клинических симптомов активной инфекции у них не выявлено. Показатели общего и биохимического анализов крови - в пределах диапазона референсных значений, общий анализ мочи - без патологии. Дальнейшие молекулярно-биологические исследования, проведенные в формате аналогично описанному выше, позволили выявить и лабораторно подтвердить хиВГЧ-6А-статус у дедушки по материнской линии. У остальных членов семьи хиВГЧ-6А-статус не подтвержден.
Таким образом, количественные и качественные характеристики ДНК, выделенной из образца ногтевых пластин согласно заявленному способу экстракции, позволяют провести лабораторное подтверждение хиВГЧ-6А/В-статуса обследуемых. Данный пример демонстрирует случай выявления и лабораторного подтверждения хиВГЧ-6А-статуса у членов одной семьи в трех поколениях (от отца дочери и внуку). Лабораторное подтверждение хиВГЧ-6А-статуса явилось обоснованием для исключения активной инфекции, вызванной ВГЧ-6А и проведения излишней противовирусной терапии.
Заявляемый способ экстракции нуклеиновых кислот из образцов ногтевых пластин осуществим с применением стандартных технических устройств и оборудования, и необходим в различных областях, например практической медицине (клинико-лабораторная диагностика, медицинская генетика), криминалистической, судебно-медицинской практике (например, в рамках проведения ДНК-идентификации личности), генной дактилоскопии и др.