Предпосевная обработка семян сельскохозяйственных культур диазотрофными и фосфатмобилизующими микроорганизмами

И. А. Дегтярева, А. Х. Яппаров, Д. С. Дмитричева,

С. К. Зарипова

ПРЕДПОСЕВНАЯ ОБРАБОТКА СЕМЯН СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР ДИАЗОТРОФНЫМИ И ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ

Ключевые слова: инокуляция, семена, диазотрофы, фосфатмобилизующие микроорганизмы, консорциум, плодородие почвы.

Эффективные аборигенные штаммы азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов использованы в качестве биоудобрений. Установлено более эффективное влияние на биологическую активность серой лесной почвы сформированного на их основе консорциума по сравнению с чистыми культурами бактерий.

Keywords: seeds inoculation, diazotrophes, phosphate-mobilizing microorganisms, consortium, soil fertility

An efficient aboriginal culture of nitrogen-fixing and phosphate-mobilizing microorganism were used as biofertilizers.

More efficient influence on the timber soil biological activity was shown by microbial consortium formed on their base.

Введение

Интенсификация агропромышленного

производства связана прежде всего с применением разнообразных химических веществ,

предназначенных для усиления минерального питания растений или для подавления развития фитопатогенных организмов. Длительное,

несбалансированное применение химических средств приводит со временем к изменению в той или иной степени физико-химических и биологических свойств почв, снижению способности к самовосстановлению и, как следствие, потере ими плодородия. Восстановление плодородия почв и разработка приемов по его сохранению становится первоочередной задачей земледелия.

При решении этой проблемы, прежде всего, следует рассматривать почву как многофакторную экосистему, в которой ведущую роль играют ее естественные обитатели - микроорганизмы. Одно из направлений развития земледелия - сохранение плодородия почв при одновременном снижении норм используемых удобрений. Такую возможность дает применение биопрепаратов - совокупности микроорганизмов, способных к мобилизации недоступных для растений форм минерального питания.

Наиболее часто в качестве биоудобрений используют микроорганизмы, фиксирующие атмосферный азот. Ассоциативные диазотрофные и фосфатмобилизующие микроорганизмы

распространены повсеместно и включают представителей разных таксономических групп. Однако практика показывает, что применение таких биопрепаратов не всегда может сравниться по эффективности с химическими средствами. Одна из причин - неспособность микроорганизмов осуществить успешную интервенцию в устойчивый микробоценоз почв. Для увеличения приживаемости в почве микроорганизмов, входящих в состав бактериальных препаратов, целесообразно

использовать активные аборигенные

микроорганизмы. Для эффективного применения

биопрепараты лучше вносить не в почву, а обрабатывать семенной материал, обеспечивая тем самым повышенную концентрацию

микроорганизмов в прикорневой зоне развивающегося растения и более тесное взаимодействие бактерий и растений.

Цель данного исследования - изучение влияния инокуляции семян яровой пшеницы азотфиксирующими, фосфатмобилизующими

микроорганизмами, а также созданным на их основе консорциумом на микробоценоз серой лесной почвы.

1. Экспериментальная часть

Опыты проводили в теплице с естественным освещением в летний период в 6 кг сосудах на серой лесной почве по следующей схеме: 1 - контроль (без растений), 2 - контроль (без удобрений), 3 - аммиачная селитра (40 кг/га д.в. азота), 4 - мизорин, 5 - ассоциация диазотрофов, 6 -ассоциация фосфатмобилизующих

микроорганизмов, 7 - консорциум штаммов.

Возделываемая культура - яровая пшеница (Triticum aestivum L.).

Ранее из различных почв Татарстана нами были выделены аборигенные диазотрофные и фосфатмобилизующие микроорганизмы [1, 2]. По комплексу положительных признаков (высокая нитрогеназная и антагонистическая активность, способность давать высокие титры на недорогих питательных средах и др.) наиболее эффективные из выделенных штаммов были идентифицированы методом установления нуклеотидной

последовательности 16S рРНК и задепонированы в коллекции ФГУП ГосНИИгенетика

Для инокуляции семян использовали выращенные на среде Бэрка 4-суточные культуры. Изучение влияния инокуляции на семена проводили азотфиксирующими (Azotobacter chroococcum, Pseudomonas brassicacearum) и

фосфатмобилизующими (Sphingobacterium

multivorum, Achromobacter xylosoxidans) микроорганизмами, а также созданным на их основе

консорциумом (соотношение 1:1). Плотность бактериальной суспензии 2,0-109 - 8,0-109 кл./мл, время экспозиции 1 ч.

В качестве сравнения использовали промышленный биопрепарат мизорин, созданный на основе штамма Arthrobacter mysorens и обладающий широким спектром действия практически на все группы сельскохозяйственных культур.

В ходе вегетационного опыта растения поливали деминерализованной водой, поддерживая влажность почвы на уровне 60% предельной полевой влагоемкости. После прореживания в каждом сосуде оставляли по 15 растений, которые выращивали в течение 90 суток до фазы полной спелости. Повторность опыта трехкратная.

Почвенные образцы из ризосферы яровой пшеницы отбирали в фазах всходов, выхода в трубку и полной спелости. Комплексное исследование микробоценоза включало определение численности жизнеспособных микроорганизмов различных эколого-трофических групп методом посева соответствующих разведений на элективные среды [3, 4]: аммонифицирующих бактерий - на мясо-

пептонном агаре, азотфиксирующих - на среде Эшби, денитрифицирующих - на среде Гильтая, фосфатмобилизующих - на среде Муромцева, микромицетов - на среде Чапека, актиномицетов - на крахмало-аммиачном агаре. Численность

микроорганизмов определяли в 1 г почвы после ее высушивания при температуре 105°С [5]. Суммарную микробную биомассу (Сш1с) вычисляли на основе субстрат-индуцированной респираторной активности [6]. Респираторную активность почвенного микробного сообщества оценивали путем титрометрического определения количества СО2, выделившегося после поглощения щелочью [6].

Измерение всех параметров проводили не менее чем в трехкратной повторности. Статистическую обработку результатов проводили с помощью электронных таблиц Excel и программы Origin 4.1. Достоверность различий полученных результатов оценивали с использованием коэффициента Стьюдента [7].

2. Результаты и их обсуждение

Изучение биологической активности серой лесной почвы проводили в онтогенезе в вегетационном опыте. Превращение азота и содержащих этот элемент соединений в почве довольно сложны, но в них можно выделить основные направления, определяющие круговорот азота в природе: аммонификация, азотфиксация,

денитрификация и др.

Аммонификаторы - микроорганизмы, использующие в качестве источника углерода органические соединения. В контрольных вариантах (без растений и без удобрений) количество этих микроорганизмов во все изучаемые фазы онтогенеза было минимальным (8,1 и 8,3; 23,5 и 22,1; 8,5 и 10,5 млн/г в фазы всходов, выхода в трубку и полной спелости, соответственно). Внесение аммиачной селитры и мизорина незначительно увеличивало

количество аммонификаторов по сравнению с контрольными вариантами.

При бактеризации семян пшеницы аборигенными диазотрофами количество аммонификаторов возрастало по сравнению с контролем без растений только в фазе полной спелости (39,5 млн/г).

Необходимо выделить варианты, где инокуляция семян осуществлялась ассоциацией фосфатмобилизующих микроорганизмов и консорциумом. Именно здесь наблюдалась максимальная численность аммонифицирующих микроорганизмов во все изучаемые фазы онтогенеза (11,1 и 13,5; 121,1 и 120,1; 49,1 и 50,5 млн/г в фазы всходов, выхода в трубку и полной спелости, соответственно).

Изучение динамики численности диазотрофных микроорганизмов, играющих существенную роль в пополнении в почве запасов азота, показало, что во всех исследованных вариантах их максимальное количество было отмечено в фазе выхода в трубку.

В контрольных вариантах, а также при внесении азотного удобрения количество почвенных азотфиксаторов во все изучаемые фазы онтогенеза было минимальным (6,2; 6,5; 6,2 - в фазе всходов, 11,6; 16,4; 17,4 - в фазе выхода в трубку, 5,2; 4,7; 6,7 млн/г - в фазе полной спелости, соответственно). Внесение мизорина не оказало влияния на численность этой группы микроорганизмов.

Максимальные показатели численности азотфиксаторов на протяжении всего вегетационного периода были получены при бактеризации семян коллекционными

аборигенными диазотрофными и фосфат-мобилизующими микроорганизмами, а также созданным на их основе консорциумом (6,8; 6,5; 6,7

- в фазе всходов, 28,6; 23,5; 32,1 - в фазе выхода в трубку, 11,1; 7,3; 12,6 млн/г - в фазе полной спелости, соответственно).

Изучение денитрификаторов -

микроорганизмов, осуществляющих восстановление нитратов до газообразного азота, показало, что на протяжении всего эксперимента их численность была практически одинакова во всех исследованных вариантах (13,0-25,0 млн/г). Это обстоятельство можно объяснить тем, что бактеризация семян изучаемыми микроорганизмами и их последующая интродукция в почву не повлияла на баланс форм азота в почве, в частности, на содержание нитратов.

Наличие в почве микроорганизмов, способных мобилизовать фосфор из водонерастворимых соединений, увеличивая тем самым его доступность для растений, является существенным фактором плодородия почвы. В проведенном исследовании в контрольных вариантах (без растений и без удобрений) количество этих микроорганизмов составило 5,1 и 4,6; 15,1 и 16,3; 14,5 и 9,8 млн/г в фазах всходов, выхода в трубку, полной спелости, соответственно.

При внесении азотного удобрения численность фосфатмобилизующих

микроорганизмов в фазе выхода в трубку увеличилась в 2,2 раза, в остальные периоды количество этих микроорганизмов было сопоставимо с контрольными вариантами.

Применение мизорина оказало сопоставимый с удобрениями эффект на увеличение численности фосфатмобилизующих микроорганизмов (16,1; 31,1; 25,1 млн/г - в фазах всходов, выхода в трубку и полной спелости, соответственно).

Бактеризация семян сообществом диазотрофов также не оказала существенного влияния на рост численности фосфатмобилизующих микроорганизмов - увеличение отмечено только в фазе полной спелости (28,5 млн/г, или в 2,0 раза выше контроля без растений).

Максимальная численность во все изучаемые фазы онтогенеза выявлена при инокуляции семян ассоциацией фосфатмобилизующих штаммов и консорциумом (30,1 и 19,1; 65,1 и 46,1; 126,1 и 43,5 млн/г - в фазах всходов, выхода в трубку и полной спелости, соответственно).

Универсальную по своему значению для формирования плодородия почвы группу представляют почвенные микромицеты. В контрольных вариантах их количество было максимальным в процессе всего периода вегетации (140,0-120,0 тыс./г).

При внесении азотного удобрения численность в фазе всходов была минимальной (45,0 тыс./г), затем количество грибов увеличилось в 2,7 раза и сохранилось на этом до конца эксперимента.

Применение мизорина способствовало тому, что количество микромицетов было ниже, чем в контрольных вариантах в 1,5-2,0 раза.

В почве, засеянной бактеризованными семенами пшеницы, наблюдали постепенное подавление численности почвенных грибов. Так, при использовании диазотрофных бактерий численность микромицетов составила 115,0; 100,0; 70,0 - в фазах всходов, выхода в трубку, полной спелости, соответственно, а в вариантах с инокуляцией фосфатмобилизующими микроорганизмами и внесением консорциума - 90,0 и 115,0; 25,0 и 60,0; 10,5 и 50,0 тыс./г - в указанных выше фазах, соответственно.

Необходимо отметить, что предлагаемые в качестве биоудобрений аборигенные штаммы азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов способствовали снижению численности фитопатогенных грибов почве. Так, в контрольных вариантах и при внесении аммиачной селитры обнаружены не только микромицеты из родов Penicillium, Aspergillus, Mucor, но и фитопатогенные грибы из родов Alternaría, Fusarium. Во всех вариантах с биоудобрениями доминировали микромицеты рода Trichoderma. Активнее всего представители этого рода развивались при внесении консорциума аборигенных штаммов. Это является позитивным фактом, так как триходерма обладает высокой антагонистической активностью к фитопатогенным грибам [8].

Высокое количество актиномицетов, которым принадлежит важная роль в процессе распада трудноразлагаемых остатков органической природы, было отмечено в контрольном варианте (без удобрений) и при инокуляции

азотфиксирующими бактериями. Максимальные показатели численности актиномицетов были получены в фазе выхода пшеницы в трубку при бактеризации сообществом фосфатмобилизующих микроорганизмов (15,1 млн/г).

Необходимо выделить вариант с инокуляцией семян консорциумом штаммов, в котором количество актиномицетов было на высоком уровне в течение всего эксперимента.

Интегральным показателем состояния почвенного биоценоза, в который вносят вклад отдельные группы микроорганизмов, как проявляющие активность в настоящее время, так и находящиеся в покое, но способные осуществлять различные процессы при изменяющихся условиях, является суммарная биомасса.

В контрольной почве без растений микробная биомасса в течение вегетационного периода изменялась от 37,5 до 60,7 мг Ст1с/г. Близким по показателям был и контрольный вариант без удобрений (49,2-57,2 мг Ст1с/г). Внесение азотного удобрения и мизорина способствовало увеличению микробной биомассы только в фазе выхода в трубку (в 1,5 и 1,3 раза, соответственно).

Необходимо отметить, что при бактеризации азотфиксирующими,

фосфатмобилизующими микроорганизмами, а также созданным на их основе консорциумом были получены максимальные показатели микробной биомассы на протяжении всего периода вегетации (до 1,8-2,0 раз).

Базальное дыхание является одной из важнейших биохимических характеристик почвы, так как характеризует способность микробного сообщества минерализовывать органическое вещество в почве [9].

На протяжении всего вегетационного периода интенсивность дыхания почвы во всех опытных вариантах была выше уровня контрольной почвы без растений. Максимальные показатели респираторной активности были получены при инокуляции аборигенными азотфиксирующими, фосфатмобилизующими микроорганизмами, а также созданным на их основе консорциумом (в 1,9-9,8 раз).

Заключение

Ранее было установлено, что предпосевная обработка семян пшеницы консорциумом микроорганизмов, сформированным из

диазотрофных и фосфатмобилизующих

микроорганизмов, выделенных из почв Республики Татарстан, способствовала улучшению показателей развития растений на начальном этапе.

Проведенные исследования показали, что использование консорциума значительно повышает

такие показатели биологической активности серой лесной почвы как микробная биомасса и респираторная активность. Эффективность

положительного влияния предлагаемого сообщества значительно выше, чем азотного удобрения и мизорина, что может быть связано как с увеличением активности почвенных микроорганизмов, так и с ростом их численности. Интересен тот факт, что помимо ожидаемого и объяснимого увеличения количества диазотрофных и фосфатмобилизующих бактерий, внесенных в почву с семенами пшеницы, также возросло количество аммонификаторов и актиномицетов, участвующих в биологическом

круговороте органического углерода, в том числе трудно минерализуемого.

К несомненным достоинствам

использованных в данном исследовании микроорганизмов можно отнести и

антогонистическую активность к микромицетам-фитопатогенам серой лесной почвы.

Современные тенденции создания, развития и продвижения «органических» технологий земледелия предполагают замену химических средств,

используемых в интенсивном сельскохозяйственном производстве, на биологические. В связи с этим создание биопрепаратов на основе эффективных аборигенных микроорганизмов является актуальной задачей современного сельского хозяйства.

Литература

1. Дегтярева, И.А. Выделение высокоэффективных микроорганизмов и их использование в земледелии / И.А.

Дегтярева, А.Х. Яппаров, Д.С. Дмитричева // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2010. - Том 202. - С.73-77.

2. Дмитричева, Д.С. Ризосферные аборигенные микроорганизмы, способствующие росту и развитию растений / Д.С. Дмитричева, А.Х. Яппаров, И.А. Дегтярева // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2011. - Том 207. - С. 186-190.

3. Колешко, О.И. Экология микроорганизмов почвы. Лабораторный практикум / О.И. Колешко // Минск: Высшая школа, 1981. - 175 с.

4. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1991. -304 с.

5. Зенова, Г.М. Практикум по микробиологии почв / Г.М. Зенова, А.Л. Степанов, Н.А. Лихачева // М.: Изд-во Моск. ун-та, 2002. - 120 с.

6. Microbiological methods for assessing soil quality / ed. By J. Dloem, D.W. Hopkins, A. Benedetti // CABI Publishing.

- 2006. - 307 p.

7. Шайдарова, Л.Г. Математическая обработка результатов химического анализа / Л.Г Шайдарова, Н.А. Улахович // Казань: Изд-во КГУ, 2000. - 44 с.

8. Мирчинк, Т.Г. Почвенная микология / Т.Г. Мирчинк // М.: Изд-во Моск. ун-та, 1988. - 206 с.

9. Lee, S.-H. Effects of various amendments on heavy mineral oil bioremediation and soil microbial activity / S.-H. Lee, B.-I. Oh, J.-G. Kim // Bioresource Technology. - 2008. -Vol.99. - Is.7. - P.2578-2587.

© И. А. Дегтярева - д-р биол. наук, зав. лаб. агроэкологии и микробиологии ГНУ Татарский НИИАХП Россельхозакадемии, peace-1963@mail.ru; А. Х. Яппаров - д-р с/х наук, проф., дир. ГНУ Татарский НИИАХП Россельхозакадемии, niiaxp2@mail.ru; Д. С. Дмитричева - науч. сотр. той же лаборатории, kindness2006@yandex.ru; С. К. Зарипова - канд. биол. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, zsania@mail.ru.