БИОФУНГИЦИД ДЛЯ ЗАЩИТЫ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР ОТ БОЛЕЗНЕЙ И ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ
BIOPHUNGICIDE FOR PROTECTING AGRICULTURAL CROPS AGAINST DISEASES AND FOR YIELD INCREASE

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и сельскому хозяйству, в частности к биопрепаратам (биофунгицидам), используемым для защиты растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами родов Fusarium, Microdochium, Pyrenophora, Puccinia, Botrytis, Alternaria и Rhizoctonia, и может применяться при предпосевной обработке семян сельскохозяйственных культур, а также опрыскивании растений по вегетации.
Известны биопрепараты на основе бактерий рода Bacillus, предназначенные для защиты и стимуляции роста сельскохозяйственных культур. Например, биопрепарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней, повышения урожайности и почвенного плодородия на основе Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 (Патент РФ №2478290, кл. A01N, А01С, C12R, опубл. 10.04.2013), биопрепарат Бактофит на основе штамма Bacillus subtilis ИПМ-215 (Патент РФ №2019966, кл. A01N 63/00, опубл. 1994). Однако нет данных об антифунгальной активности указанных биопрепаратов в отношении таких экономически значимых болезней, как желтая пятнистость листьев (Pyrenophora tritici-repentis), снежная плесень (Microdochiumnivale (F. nivale)) и бурая ржавчина (Puccinia recondita f. sp. tritici). Кроме того, отсутствуют сведения о совместимости (устойчивости) биопрепарата Бактофит с химическими препаратами, используемыми в системе интегрированной защиты сельскохозяйственных культур.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является биопрепарат Фитоспорин жидкий для защиты растений от болезней на основе штамма Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 (Патент РФ №2129375, кл. A01N, C12N, C12R, опубл. 27.04.1999). Биопрепарат характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов.
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового биофунгицида для защиты сельскохозяйственных культур от болезней и повышения урожайности, позволяющего расширить арсенал биопрепаратов для растениеводства.
9
10
Указанный технический результат достигается тем, что в качестве биомассы из живых клеток и спор бактерий из рода Bacillus он содержит живую биомассу Bacillus subtilis BZR 517 с титром от 1,0х10 до 1,0х10 КОЕ в 1 мл и антифунгальные вещества с активностью от 18,7 до 20,5%.
В настоящее время отобран и изучен новый штамм Bacillus subtilis BZR 517, пригодный для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов (Патент РФ №2552146 кл. C12N, A01N, C12R, опубл. 10.06.2015). Штамм бактерии Bacillus subtilis BZR 517, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии под номером RCAM01728. Штамм не вирулентен для теплокровных животных, не способен к диссеминации и не вызывает бактериального поражения органов, не является токсичным и токсиногенным.
Поставленная задача решается получением биомассы штамма Bacillus subtilis BZR 517 путем периодического культивирования в жидкой оригинальной питательной среде, содержащей минеральные соли, органические источники азота и углерода (меласса и кукурузный экстракт) и антифунгальные вещества, продуцируемые штаммом.
Глубинное культивирование осуществляют при 35°С, pH 10 и перемешивании со скоростью вращения 180-200 об/мин. Контроль за ростом культуры проводят путем отбора проб через 8, 16, 24, 36 часов от начала культивирования и определения концентрации микробных клеток микробиологическим методом.
9
10
Культивирование проводят в течение 36 часов. Полученная культуральная жидкость содержит от 1,0х10 до 1,0х10 КОЕ в 1 мл и антифунгальные вещества с активностью от 18,7 до 20,5%.
Культуральная жидкость, содержащая живые клетки и споровую биомассу штамма В. subtilis BZR 517, а также антифунгальные вещества, используется в качестве бактериального фунгицида в жидкой форме.
Установлено, что штамм-продуцент биофунгицида Bacillus subtilis BZR 517 обладает активностью в отношении фитопатогенных грибов из родов Fusarium, Microdochium, Pyrenophora, Botrytis, Alternaria и Rhizoctonia (таблица 1).
Определение антагонистической активности бактериальных штаммов проводили методом двойных (встречных) культур на картофельно-глюкозном агаре. В чашки Петри высевали агаровый блок с мицелием патогена, бактериальный штамм при этом наносили методом штриха на расстоянии 6 см от блока патогена. Культуры инкубировали в течение 20 дней при температуре +28°С. Контрольные варианты - чистые культуры гриба патогена и бактерии, посеянные отдельно. Учеты проводили на 5-е и 10-е сутки. Отмечали характер взаимоотношений гриба и бактерии: наличие или отсутствие зон, их размер, изменение цвета, плотности, толщины и направления роста мицелия патогена. Степень ингибирования роста мицелия патогена определяли по формуле:
И=(1-(А/В))Х100,
где И - % ингибирования;
А - рост гриба в варианте;
В - рост гриба в контроле.
Штамм-продуцент биофунгицида Bacillus subtilis BZR 517 активно ингибировал рост следующих фитопатогенных грибов: Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, F. oxysporum var. orthoceras, Microdochium nivale (F. nivale), Pyrenophora tritici-repentis, Botrytis cinerea, Alternaria alternata, Rhizoctonia solani, распространенных на таких сельскохозяйственных культурах, как озимая и яровая пшеница, подсолнечник, томаты, малина, черная смородина, картофель (таблица 1).
Отмечены существенные морфологические изменения патогенных грибов под воздействием вторичных метаболитов бактериального штамма Bacillus subtilis BZR 517: отсутствие воздушного мицелия, лизис и израстание уже сформировавшегося мицелия, ингибирование роста и потемнение мицелия патогена.
Синтез антифунгальные веществ - один из наиболее распространенных эффектов микробного антагонизма. Результаты исследования антифунгальной активности биофунгицида на основе штамма Bacillus subtilis BZR 517 при периодическом способе выращивания представлены в таблице 2.
Исследование активности биофунгицида на основе штамма-продуцента В. subtilis BZR 517 показало, что начальный синтез антифунгальных веществ отмечен после восьми часов культивирования. Максимальная антифунгальная активность препарата приходится на 36 ч культивирования, что обеспечивает ингибирование патогена от 18,7 до 20,5% соответственно по сравнению с контролем.
Для оценки ростостимулирующей активности биофунгицида на основе штамма Bacillus subtilis BZR 517 проводили обработку тестовых семян озимой пшеницы сорта Калым жидкой формой препарата. Через 24 ч обработанные семена высевали в почву в условиях открытого грунта. Повторность опыта трехкратная. Производили учет длины и массы корня и побега проростков на различных этапах вегетации. Корни проростков предварительно тщательно отмывали от почвы.
В результате предпосевной обработки семян озимой пшеницы биофунгицидом на основе штамма бактерии Bacillus subtilis BZR 517 на ранних этапах вегетации наблюдалось статистически достоверное увеличение массы корня на 38,0% по сравнению с проростками в контрольном варианте. На более поздних этапах вегетации было отмечено стимулирующее действие на развитие побегов: увеличение длины и массы побега на 20,1 и 56,5% соответственно.
Для оценки биологической эффективности семена озимой пшеницы обрабатывали жидкой формой биофунгицида на основе штамма Bacillus subtilis BZR 517.
Установлена биологическая эффективность жидкой формы биофунгицида на основе штамма Bacillus subtilis BZR 517 против различных болезней на растениях озимой пшеницы и подсолнечника в полевых условиях, представлены средние значения (таблица 3).
Данные, приведенные в таблице 3, позволяют сделать заключение, что биофунгицид на основе штамма Bacillus subtilis BZR 517, обеспечивает более высокое защитное действие против возбудителей бурой ржавчины, фузариозной корневой гнили и желтой пятнистости листьев пшеницы по сравнению с биопрепаратом Фитоспорин на основе штамма Bacillus subtilis 128 ВНИИСХМ.
Биологическая эффективность жидкой формы биофунгицида против ризоктониоза картофеля представлена в таблице 4.
Данные, приведенные в таблице 4, показывают, что биофунгицид на основе штамма Bacillus subtilis BZR 517 обеспечивает более высокое защитное действие против возбудителя ризоктониоза картофеля по сравнению с биопрепаратом Алирин-Б на основе штамма Bacillus subtilis В-10 ВИЗР.
Доказано положительное влияние обработки семян и вегетирующих растений биофунгицидом на основе штамма Bacillus subtilis BZR 517 в полевых условиях на урожайность озимой пшеницы сорта Калым (таблица 5).
Данные опыта свидетельствуют о высокой эффективности биофунгицида на основе штамма Bacillus subtilis BZR 517 для предпосевной обработки семян вегетирующих сельскохозяйственных культур, в том числе озимой пшеницы.
Определение совместимости штамма Bacillus subtilis BZR 517 с перспективными пестицидами (инсектицидами и гербицидами) проводили, используя модифицированный метод диффузии в агар, разработанный для определения антибиотической активности микроорганизмов. Для этого в чашки Петри с картофельно-глюкозным агаром специальным стерильным сверлом вырезали в центре лунку, диаметром 0,8 см, в которую закапывали 0,1 мл химического препарата в рабочей концентрации, контроль - стерильная вода. Норма расхода рабочей жидкости из расчета 300 л/га.
Бактериальную культуру высевали радиальными штрихами вокруг лунки с химическим препаратом. В контрольном варианте штамм-продуцент биофунгицида высевали штрихом вокруг лунки со стерильной водой. По ингибированию роста, изменению степени пигментирования, образованию зон задержки роста вокруг лунок судили о совместимости штамма Bacillus subtilis BZR 517 с пестицидами. Опыт проводили в трехкратной повторности. Учеты осуществляли на вторые и седьмые сутки от начала инкубации (таблицы 6, 7).
Представленные данные позволяют заключить, что биофунгицид на основе штамма Bacillus subtilis BZR 517 может применяться в системе интегрированной защиты растений в сочетании с другими химическими препаратами, что будет способствовать снижению пестицидной нагрузки на агроценозы.
Приведенные примеры подтверждают достижение технического результата изобретения.
Таким образом, биофунгицид на основе штамма Bacillus subtilis BZR 517 является новым и пригоден для включения в современный ассортимент средств защиты растений от экономически значимых болезней в системе интегрированной защиты и повышения урожайности.