СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДОВ

1. Трансгенное растение для получения неполярных липидов, содержащее один или более экзогенных полинуклеотидов и имеющее повышенный уровень одного или более неполярных липидов по сравнению с соответствующим растением, не имеющим одного или более экзогенных полинуклеотидов, где один или более экзогенных полинуклеотидов содержат первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует первый полипептид ацилтрансферазы жирной кислоты и один или более дополнительных экзогенных полинуклеотидов, кодирующих одно или более из следующего:
молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего полипептид, который участвует в разложении липидов и/или который снижает содержание липидов, такого как липаза,
второй полипептид ацилтрансферазы жирных кислот, или
полипептид, который стабилизирует один или более неполярных липидов, таких как олеозин,
где каждый из одного или более экзогенных полинуклеотидов функционально связан с промотором, который способен направлять экспрессию полинуклеотида в растении.
2. Растение по п.1, которое представляет собой растение канолы, содержащее семена канолы, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 45% по массе.
3. Растение по п.1, которое представляет собой растение кукурузы, содержащее семена кукурузы, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 5% по массе.
4. Растение по п.1, которое представляет собой растение сои, содержащее семена сои, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 20% по массе.
5. Растение по п.1, которое представляет собой растение люпина, содержащее семена люпина, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 10% по массе.
6. Растение по п.1, которое представляет собой растение арахиса, содержащее орехи арахиса, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 50% по массе.
7. Растение по п.1, которое представляет собой растение подсолнечника, содержащее семена подсолнечника, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 50% по массе.
8. Растение по п.1, которое представляет собой растение хлопчатника, содержащее семена хлопчатника, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 41% по массе.
9. Растение по п.1, которое представляет собой сафлоровое растение, содержащее семена сафлора, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 35% по массе.
10. Растение по п.1, которое представляет собой растение льна, содержащее семена льна, содержание масла в которых составляет по меньшей мере 36% по массе.
Camelina sativa
Camelina sativa
11. Растение по п.1, которое представляет собой растение , содержащее семена , содержание масла в которых составляет по меньшей мере 36% по весу.
12. Часть трансгенного растения для получения неполярного липида, содержащая один или более экзогенных полинуклеотидов и имеющая повышенный уровень одного или более неполярных липидов, по сравнению с частью соответствующего растения, не имеющим одного или более экзогенных полинуклеотидов, где один или более экзогенных полинуклеотидов содержат первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует первый полипептид ацилтрансферазы жирной кислоты и один или более дополнительных экзогенных полинуклеотидов, кодирующих одно или более из следующего:
молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего полипептид, который участвует в разложении липидов и/или который снижает содержание липидов, такого как липаза,
второй полипептид ацилтрансферазы жирных кислот, или
полипептид, который стабилизирует один или более неполярных липидов, таких как олеозин,
где каждый из одного или более экзогенных полинуклеотидов функционально связан с промотором, который способен направлять экспрессию полинуклеотида в части растении.
13. Растение по п.1 или часть растения по п.12, которое обладает одной или более, или всеми из следующих характеристик:
олеиновая кислота в растении или части растения находится в эстерифицированной или неэстерифицированной форме, при этом по меньшей мере 20% (мол.%), по меньшей мере 22% (мол.%), по меньшей мере 30% (мол.%), по меньшей мере 40% (мол.%), по меньшей мере 50% (мол.%) или по меньшей мере 60% (мол.%), предпочтительно по меньшей мере 65% (мол.%) или по меньшей мере 66% (мол.%) от общих жирных в содержании липидов в растении или части растения составляет олеиновая кислота,
олеиновая кислота в растении или части растения находится в эстерифицированной форме в неполярном липиде, при этом по меньшей мере 20% (мол.%), по меньшей мере 22% (мол.%), по меньшей мере 30% (мол.%), по меньшей мере 40% (мол.%), по меньшей мере 50% (мол.%) или по меньшей мере 60% (мол.%), предпочтительно по меньшей мере 65% (мол.%) или по меньшей мере 66% (мол.%) от общих жирных кислот в содержании неполярных липидов в растении или части растения составляет олеиновая кислота,
модифицированная жирная кислота в растении или части растения находится в эстерифицированной или неэстерифицированной форме, предпочтительно в эстерифицированной форме в неполярных липидах растительной части, если эта часть является вегетативной частью, при этом модифицированная жирная кислота содержит гидроксильную группу, эпокси-группу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, сопряженные двойные связи, разветвленную цепь, такую как метилированная или гидроксилированная разветвленная цепь, или комбинацию двух или более из них, или любые две, три, четыре, пять или шесть из вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей, и
воски и/или восковые эфиры в неполярном липиде растения или части растения.
14. Растение по п.1 или часть растения по п.12, которая является членом популяции или группы по меньшей мере из около 1000 таких растений или частей.
15. Растение по п.1, которое является частью популяции по меньшей мере из около 1000 растений, каждое из которых является растением по п.1, растущим в поле.
16. Часть растения по п.12, которая находится в группе по меньшей мере из около 1000 частей растений, каждая из которых является частью растения по п.12, где части растений собраны из растений, растущих в поле.
17. Растение по п.1 или часть растения по п.12, в котором:
вегетативная часть растения имеет общее содержание неполярных липидов по меньшей мере 7% (масс./масс.),
вегетативная часть растения имеет общее содержание неполярных липидов от 5 до 25% (масс./масс.),
неполярный липид (липиды) содержит жирную кислоту, которая содержит гидроксильную группу, эпокси-группу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, сопряженные двойные связи, разветвленную цепь, такую как метилированная или гидроксилированная разветвленная цепь, или комбинацию двух или более из них, или любую из двух, трех, четырех, пяти или шести из вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей,
общее содержание жирных кислот в липиде (липидах) составляет по меньшей мере на 2% больше олеиновой кислоты и/или по меньшей мере на 2% меньше пальмитиновой кислоты, чем в липиде (липидах) в соответствующем растении или части растения, не содержащей одного или более экзогенных полинуклеотидов,
общее содержание жирных кислот в неполярном липиде (липидах) составляет по меньшей мере на 2% больше олеиновой кислоты и/или по меньшей мере на 2% меньше пальмитиновой кислоты, чем в неполярном липиде (липидах) в соответствующем растении или части растения, не содержащей одного или более экзогенных полинуклеотидов,
неполярный липид (липиды) содержит измененную концентрацию общих стеролов, предпочтительно свободных стеролов, стероиловых эфиров и/или стероил-гликозидов, и
неполярный липид содержит по меньшей мере 90% триацилглицеринов (TAG).
18. Растение по п.1 или часть растения по п.12, где часть растения представляет собой семя, плод или вегетирующую часть растения, такую как наземная часть растения или зеленая часть, такая как лист или стебель.
Acrocomia aculeate
Arabidopsis thaliana
Aracinis hypogaea
Astrocaryum murumuru
Astrocaryum vulgare
Attalea geraensis
Attalea humilis
Attalea oleifera
Attalea phalerata
Attalea speciosa
Avena sativa
Beta vulgaris
Brassica
Brassica carinata
Brassica juncea
Brassica napobrassica
Brassica napus
Camelina sativa
Cannabis sativa
Carthamus tinctorius
Caryocar brasiliense
Cocos nucifera
Crambe abyssinica
Cucumis melo
Elaeis guineensis
Glycine max
Gossypium hirsutum
Helianthus
Helianthus annuus
Hordeum vulgare
Jatropha curcas
Joannesia princeps
Lemna
Lemna aequinoctialis
Lemna disperma
Lemna ecuadoriensis
Lemna gibba
Lemna japonica
Lemna minor
Lemna minuta
Lemna obscura
Lemna paucicostata
Lemna perpusilla
Lemna tenera
Lemna trisulca
Lemna turionifera
Lemna valdiviana
Lemna yungensis
Licania rigida
Linum usitatissimum
Lupinus angustifolius
Mauritia flexuosa
Maximiliana maripa
Miscanthus
Miscanthus x giganteus
Miscanthus sinensis
Nicotiana
Nicotiana tabacum
Nicotiana benthamiana
Oenocarpus bacaba
Oenocarpus bataua
Oenocarpus distichus
Oryza
Oryza sativa
Oryza glaberrima
Panicum virgatum
Paraqueiba paraensis
Persea amencana
Pongamia pinnata
Populus trichocarpa
Ricinus communis
Saccharum
Sesamum indicum
Solanum tuberosum
Sorghum
Sorghum bicolor
Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum
Trifolium
Trithrinax brasiliensis
Triticum
Triticum aestivum
Zea mays
19. Растение по п.1 или часть растения по п.12, где растение представляет собой (пальма макауба), , (арахис), (мурумуру), (тукума), (Indaiá-rateiro), (американская масличная пальма), (andaiá), (урикури), (бабассу), (овес), (сахарная свекла), виды , такие как , , , (канола), (ложный лен), (конопля), (сафлор), (кариокар), (кокосовый орех), (абиссинская капуста), (дыня), (африканская пальма), (соя), (хлопок), виды , такие как (подсолнечник), (ячмень), (лекарственный орех), (ореховое дерево арара), виды (ряска), такие как , , , (ряска горбатая), , , , , , , , , , , , (ойтикика), (лен), (люпин), (пальма бурити), (пальма инайа), виды , такие как и , виды (табак), такие как или , (bacaba-do-azeite), (patauã), (bacaba-de-leque), виды (рис), такие как и , (просо прутьевидное), (марь), (авокадо), (индийский бук), , (клещевина обыкновенная), виды (сахарный тростник), (кунжут), (картофель), виды , такие как , (купуасу), виды , (бразильская игольчатая пальма), виды (пшеница), такие как и (кукуруза).
20. Растение по п.1 или часть растения по п.12, где общее содержание стерола и/или композиции в неполярных липидах существенно отличается от общего содержания стерола и/или композиции в неполярных липидах в соответствующем растении или части растения, не содержащего одного или более экзогенных полинуклеотидов.
21. Растение по п.1 или часть растения по п.12, в котором повышенная концентрация одного или более неполярного липида (липидов) является такой, что применима одна или более, или все из следующих характеристик:
концентрация по меньшей мере на 0,5% больше в весовом выражении, чем концентрация в соответствующем растении или части растения, не содержащего одного или более экзогенных полинуклеотидов,
концентрация по меньшей мере на 1% больше в относительном выражении, чем в соответствующем растении или части растения, не содержащего одного или более экзогенных полинуклеотидов,
общее содержание неполярных липидов в растении или части растения по меньшей мере на 0,5% больше в весовом выражении, чем содержание в соответствующем растении или части растения, не содержащего одного или более экзогенных полинуклеотидов,
общее содержание неполярных липидов в растении или части этого растения по меньшей мере на 1% больше в весовом выражении, чем содержание в соответствующем растении или части растения, не содержащего одного или более экзогенных полинуклеотидов, и
Arabidopsis thaliana
концентрация одного или более неполярного липида (липидов) и/или общее содержание неполярных липидов в растении или части растения по меньшей мере на 0,5% больше в весовом выражении и/или по меньшей мере на 1% больше в относительном выражении, чем в соответствующем растении или части растения, не содержащего одного или более экзогенных полинуклеотидов, и содержащего экзогенный полинуклеотид, кодирующий диацилглицерин-ацилтрансферазу DGAT1 .
22. Растение по п.1 или часть растения по п.12, которое имеет следующие характеристики:
содержание TAG, DAG, TAG и DAG, или MAG, которое по меньшей мере на 10% больше в относительном выражении, чем содержание TAG, DAG, TAG и DAG, или MAG в соответствующем растении или части растения, не содержащего одного или более экзогенных полинуклеотидов, и/или
общее содержание полиненасыщенных жирных кислот (PUFA), которое увеличено или уменьшено по сравнению с общим содержанием PUFA в соответствующем растении или части растения, не содержащего одного или более экзогенных полинуклеотидов.
23. Растение по п.1 или часть растения по п.12, которое содержит повышенный уровень PUFA по сравнению с уровнем PUFA в соответствующем растении или части растения, не содержащего одного или более экзогенных полинуклеотидов, где PUFA представляет собой эйкозадиеновую кислоту, арахидоновую кислоту (ARA), альфа-линоленовую кислоту (ALA), стеаридоновую кислоту (SDA), эйкозатриеновую кислоту (ETE), эйкозатетраеновую кислоту (ETA), эйкозапентаеновую кислоту (EPA), докозапентаеновую кислоту (DPA), докозагексаеновую кислоту (DHA) или комбинацию двух или более из них.
24. Растение по п.1 или часть растения по п.12, в котором общее содержание неполярных липидов или одного или более неполярных липидов, и/или концентрация олеиновой кислоты или PUFA в растении или части растения определено анализом с использованием газовой хроматографии метиловых эфиров жирных кислот, полученных из растения или части растения.
25. Растение по п.1 или часть растения по п.12, в котором полипептид ацилтрансфераза жирной кислоты имеет активность диацилглицерин-ацилтрансферазы (DGAT), активность моноацилглицерин-ацилтрансферазы (MGAT), активность глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазы (GPAT), активност фосфолипид-диацилглицерин-ацилтрансферазы (PDAT) или активность ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты (LPAAT).
26. Растение по п.1 или часть растения по п.12, в отношении которого применима одна или более, или все из следующих характеристик:
полипептид, который участвует в разложении липидов и/или который снижает содержание липидов, представляет собой полипептид CGi58 или сахарозависимую триацилглицерин-липазу 1,
второй полипептид ацилтрансфераза жирной кислоты имеет активность диацилглицерин-ацилтрансферазы (DGAT), активность моноацилглицерин-ацилтрансферазы (MGAT) или активность глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазы (GPAT), и
полипептид, который стабилизирует один или более неполярных липидов, представляет собой олеозин, такой как полиолеозин или калеозин, предпочтительно полиолеозин.
27. Растение по п.1 или часть растения по п.12, в котором один или более экзогенных полинуклеотидов кодируют одну или более или любую комбинацию из следующего:
DGAT и молекулу РНК, которая ингибирует CGi58,
DGAT и молекулу РНК, которая ингибирует сахарозависимую триацилглицерин-липазу 1,
MGAT и молекулу РНК, которая ингибирует CGi58,
MGAT и молекулу РНК, которая ингибирует сахарозависимую триацилглицерин-липазу 1,
GPAT и молекулу РНК, которая ингибирует CGi58,
GPAT и молекулу РНК, которая ингибирует сахарозависимую триацилглицерин-липазу 1,
MGAT и DGAT,
MGAT и GPAT,
DGAT и GPAT,
MGAT, GPAT и DGAT,
MGAT и олеозин,
GPAT и олеозин,
DGAT и олеозин,
DGAT и молекулу РНК, которая ингибирует CGi58 и MGAT,
DGAT и молекулу РНК, которая ингибирует CGi58 и GPAT,
DGAT и молекулу РНК, которая ингибирует сахарозависимую триацилглицерин-липазу 1 и MGAT,
DGAT и молекулу РНК, которая ингибирует сахарозависимую триацилглицерин-липазу 1 и GPAT,
MGAT и молекулу РНК, которая ингибирует CGi58 и GPAT,
MGAT и молекулу РНК, которая ингибирует сахарозависимую триацилглицерин-липазу 1 и GPAT,
DGAT и молекулу РНК, которая ингибирует CGi58, MGAT и олеозин,
DGAT и молекулу РНК, которая ингибирует CGi58, GPAT и олеозин,
DGAT и молекулу РНК, которая ингибирует сахарозависимую триацилглицерин-липазу 1, MGAT и олеозин,
(ii) DGAT и молекулу РНК, которая ингибирует сахарозависимую триацилглицерин-липазу 1, GPAT и олеозин,
MGAT и молекулу РНК, которая ингибирует CGi58, GPAT и олеозин,
MGAT и молекулу РНК, которая ингибирует сахарозависимую триацилглицерин-липазу 1 и GPAT и олеозин,
DGAT и молекулы РНК, которая ингибирует CGi58 и олеозин,
DGAT и молекулу РНК, которая ингибирует сахарозависимую триацилглицерин-липазу 1 и олеозин,
MGAT и молекулу РНК, которая ингибирует CGi58 и олеозин,
MGAT и молекулу РНК, которая ингибирует сахарозависимую триацилглицерин-липазу 1 и олеозин,
GPAT и молекулу РНК, которая ингибирует CGi58 и олеозин,
GPAT и молекулу РНК, которая ингибирует сахарозависимую триацилглицерин-липазу 1 и олеозин,
DGAT и MGAT и олеозин,
DGAT и GPAT и олеозин,
MGAT и GPAT и олеозин,
где каждый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который способен направлять экспрессию полинуклеотида в растении или части растения.
28. Растение или часть растения по п.27, в котором
GPAT также обладает активностью фосфатазы для выработки MAG, такой как полипептид, имеющий аминокислотную последовательность GPAT4 или GPAT6 Arabidopsis, и/или
DGAT представляет собой DGAT1 или DGAT2, и/или
MGAT представляет собой MGAT1 или MGAT2.
29. Растение или часть растения по п.27, в отношении которого применима одна или более из следующих характеристик:
один или более экзогенных полинуклеотидов, кодирующих DGAT и олеозин, функционально связанных с конститутивным промотором или промотором, активным в зеленых тканях растения, по меньшей мере до и вплоть до цветения, который способен направлять экспрессию полинуклеотида (полинуклеотидов) в растении или части растения,
один или более экзогенных полинуклеотидов, кодирующих молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего липазу, такую как полипептид CGi58, функционально связанных с конститутивным промотором, активным в зеленых тканях растения, по меньшей мере до и вплоть до цветения, или с индуцибельным промотором, который способен направлять экспрессию полинуклеотида в растении или части растения, и
один или более экзогенных полинуклеотидов, кодирующих MGAT, функционально связанных с индуцибельным промотором, который способен направлять экспрессию полинуклеотида в растении или части растения.
30. Растение по п.1 или часть растения по п.12, в котором вегетативная растительная часть имеет общее содержание неполярное липидов по меньшей мере около 10%, более предпочтительно, по меньшей мере, около 11%, более предпочтительно, по меньшей мере, около 12%, более предпочтительно, по меньшей мере, около 13%, более предпочтительно, по меньшей мере, около 14% или более предпочтительно - по меньшей мере около 15% (масс./масс. из расчета на сухой вес).
31. Растение по п.1 или часть растения по п.12, в котором вегетативная часть растения имеет общее содержание TAG по меньшей мере около 7%, более предпочтительно по меньшей мере около 10%, более предпочтительно по меньшей мере около 11%, более предпочтительно по меньшей мере около 12%, более предпочтительно по меньшей мере около 13%, более предпочтительно по меньшей мере около 14%, более предпочтительно по меньшей мере около 15% или более предпочтительно по меньшей мере около 17% (масс./масс. из расчета на сухой вес).
32. Растение по п.1 или часть растения по п.12, в котором первый полипептид ацилтрансферазы жирных кислот представляет собой DGAT, такой как DGAT1, и где полипептид, который участвует в разложении липидов и/или который снижает содержание липидов, представляет собой липазу, и где полипептид, который стабилизирует один или более неполярных липидов, представляет собой олеозин, где растение или часть растения обладает одной или более, или всеми из следующих характеристик:
общее содержание липидов составляет по меньшей мере 8%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 12%, по меньшей мере 14% или по меньшей мере 15,5% по массе,
по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз или по меньшей мере в 10 раз, при более высокое общее содержание липидов в раститении или части растения, по сравнению с соответствующим растением или частью растения, не содержащего одного или более экзогенных полинуклеотидов,
общее содержание TAG составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 12,5%, по меньшей мере 15% или по меньшей мере 17% (масс./масс. из расчета на сухой вес или вес семян),
по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз или по меньшей мере в 70 раз или по меньшей мере в 100 раз более высокое общее содержание TAG по сравнению с соответствующим растением или частью растения, не содержащего одного или более экзогенных полинуклеотидов,
олеиновая кислота составляет по меньшей мере 15%, по меньшей мере 19% или по меньшей мере 22% (масс./масс. из расчета на сухой вес или вес семян) жирных кислот в TAG,
по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз или по меньшей мере в 17 раз более высокая концентрация олеиновой кислоты в TAG, по сравнению с соответствующим растением или частью растения, не содержащего одного или более экзогенных полинуклеотидов,
пальмитиновая кислота составляет по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30% или по меньшей мере 33% (мас.) жирных кислот в TAG,
по меньшей мере в 1,5 раза более высокий уровень пальмитиновой кислоты в TAG, по сравнению с соответствующим растением или частью растения, не содержащего одного или более экзогенных полинуклеотидов,
линолевая кислота составляет по меньшей мере 22%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30% или по меньшей мере 34% (по массе) жирных кислот в TAG,
α-линоленовая кислота составляет менее 20%, менее 15%, менее 11% или менее 8% (по массе) жирных кислот в TAG, и
по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 8 раз более низкая концентрация α-линоленовой кислоты в TAG, по сравнению с соответствующим растением или частью растения, не содержащего одного или более экзогенных полинуклеотидов.
33. Растение или часть растения по п.27, в котором экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT, содержит одно или более из следующего:
нуклеотиды, последовательность которых представлена как любая из SEQ ID NO: 204-211, 338-346,
нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена как любая из SEQ ID NO: 83, 212-219, 347-355, или его биологически активный фрагмент,
нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
полинуклеотид, который гибридизуется с любым из i) - iii) в жестких условиях.
34. Растение или часть растения по п.27, в котором экзогенный полинуклеотид, кодирующий MGAT, содержит одно или более из следующего:
нуклеотиды, последовательность которых представлена как любая из SEQ ID NO: 1- 44,
нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена как любая из SEQ ID NO: 45-82, или его биологически активный фрагмент,
нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
полинуклеотид, который гибридизуется с любым из i) - iii) в жестких условиях.
35. Растение или часть растения по п.27, в котором экзогенный полинуклеотид, кодирующий GPAT, содержит одно или более из следующего:
нуклеотиды, последовательность которых представлена как любая из SEQ ID NO: 84-143,
нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена как любая из SEQ ID NO: 144-203, или его биологически активный фрагмент,
нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
полинуклеотид, который гибридизуется с любым из i) - iii) в жестких условиях.
36. Растение или часть растения по п.27, в котором экзогенный полинуклеотид, кодирующий DGAT2, содержит одно или более из следующего:
нуклеотиды, последовательность которых представлена как любая из SEQ ID NO: от 204 до 211,
нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена как любая из SEQ ID NO: от 212 до 219 или ее биологически активный фрагмент,
нуклеотиды, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
полинуклеотид, который гибридизуется с любым из пунктов i) - iii) в строгих условиях.
37. Растение или часть растения по п.27, в котором экзогенный полинуклеотид, кодирующий олеозин, содержит одно или более из следующего:
нуклеотиды, последовательность которых представлена как любая из SEQ ID NO: 389-408,
нуклеотиды, кодирующие полипептид, содержащий аминокислоты, последовательность которых представлена как любая из SEQ ID NO: 362-338, или его биологически активный фрагмент,
нуклеотидов, последовательность которых по меньшей мере на 30% идентична i) или ii), и
полинуклеотид, который гибридизуется с любым из i) - iii) в жестких условиях.
38. Растение по п.1 или часть растения по п.12, которое содержит:
одну или более введенных мутаций в гене, который кодирует эндогенный фермент в растении или части растения, и/или
экзогенный полинуклеотида, который понижающе регулирует выработку и/или активность эндогенного фермента в растении или части растения,
sn
sn
где каждый эндогенный фермент выбран из группы, состоящей из DGAT, -1 глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазы (-1 GPAT), 1-ацил-глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазы (LPAAT), ацил-CoA:лизофосфатидилхолин-ацилтрансферазы (LPCAT), фосфатазы фосфатидных кислот (PAP), фермента, участвующего в биосинтезе крахмала, такого как пирофосфорилаза (АДФ)-глюкозы (АГФаза), десатуразы жирных кислот, такой как десатураза жирных кислот Δ12 (FAD2), полипептида, участвующего в разложении липидов и/или который снижает содержание липидов, такого как липаза, такого как полипептид CGi58, или комбинации двух или более из них.
39. Растение или часть растения по п.38, где экзогенный полинуклеотид выбран из группы, состоящей из антисмыслового полинуклеотида, смыслового полинуклеотида, каталитического полинуклеотида, микроРНК, полинуклеотида, который кодирует полипептид, связывающий эндогенный фермент, двухцепочечной молекулы РНК и полученной из нее процессированной молекулы РНК.
40. Растение по п.1 или часть растения по п.12, в котором неполярный липид
содержит TAG, DAG, TAG и DAG, или MAG, и
содержит специфическую PUFA, которая представляет собой EDA, ARA, SDA, ETA, EPA, DPA или DHA, причем концентрация специфической PUFA составляет по меньшей мере 1% от общего количества жирных кислот в неполярном липиде, или комбинацию двух из них, или
содержит жирную кислоту, содержание которой составляет по меньшей мере 1% от общего количества жирных кислот в неполярном липиде, и которая всодержит гидроксильную группу, эпоксигруппу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, сопряженные двойные связи, разветвленную цепь, такую как метилированная или гидроксилированная разветвленная цепь, или комбинацию двух или более из них, или любая из двух, трех, четырех, пяти или шести из вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей.
41. Семя, из которого получают неполярный липид, полученное из растения по п.1, содержащее один или более экзогенных полинуклеотидов, которые содержат первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий первый полипептид ацилтрансферазы жирной кислоты и один или более дополнительных экзогенных полинуклеотидов, кодирующих одно или нескольких из следующего:
молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего полипептид, который участвует в разложении липидов и/или который снижает содержание липидов, такого как липаза,
второй полипептид ацилтрансферазы жирных кислот, или
полипептид, который стабилизирует один или более неполярных липидов, таких как олеозин,
где каждый из одного или более экзогенных полинуклеотидов функционально связан с промотором, который способен направлять экспрессию полинуклеотида в растении.
42. Семя по п.41, которое содержит один или более экзогенных полинуклеотидов по п.27.
43. Рекомбинантная клетка растения, водоросли или гриба, продуцирующая неполярный липид, содержащая один или более экзогенных полинуклеотидов и имеющая повышенную концентрацию одного или нескольких неполярных липидов по сравнению с соответствующей клеткой, не содержащей одного или нескольких экзогенных полинуклеотидов, где один или более экзогенных полинуклеотидов содержат первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует первый полипептид ацилтрансферазы жирной кислоты и один или более дополнительных экзогенных полинуклеотидов, кодирующих одно или более из следующего:
молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего полипептид, который участвуюет в разложении липидов и/или который снижает содержание липидов, такого как липаза,
второй полипептид ацилтрансферазы жирных кислот, или
полипептид, который стабилизирует один или более неполярных липидов, такой как олеозин,
где каждый из одного или более экзогенных полинуклеотидов функционально связан с промотором, который способен направлять экспрессию полинуклеотида в клетке растения, водоросли или гриба.
44. Рекомбинантная клетка по п.43, которая обладает одной или более, или всеми из следующих характеристик:
если клетка представляет собой клетку вегетирующей части растения, то клетка имеет общее содержание неполярных липидов по меньшей мере 7% (мас./мас.),
если клетка представляет собой клетку вегетирующей части растения, то клетка имеет общее содержание неполярных липидов от 5 до 25% (мас./мас.),
если клетка представляет собой клетку водоросли, то водоросль выбрана из группы, состоящей из диатомовых водорослей (бациллариофиты), зеленых водорослей (хлорофиты), сине-зеленых водорослей (цианофиты), золотисто-коричневых водорослей (хризофиты), гаптофитов, коричневых водорослей и гетероконтных водорослей,
один или более неполярных липидов содержат жирную кислоту, которая содержит гидроксильную группу, эпокси-группу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, сопряженные двойные связи, разветвленную цепь, такую как метилированная или гидроксилированная разветвленная цепь, или комбинацию двух или более из них, или любые две, три, четыре, пять или шесть из вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей,
общее содержание жирных кислот в неполярном липиде (липидах) составляет по меньшей мере на 2% больше олеиновой кислоты и/или по меньшей мере на 2% меньше пальмитиновой кислоты, чем в неполярном липиде (липидах) в соответствующей клетке, не содержащей одного или более экзогенных полинуклеотидов,
неполярный липид (липиды) содержит измененную концентрацию общих стеролов, предпочтительно свободных (не эстерифицированных) стеролов, стероиловых эфиров, стероил-гликозидов, по сравнению с неполярным липидом (липидами) в соответствующей клетке, не содержащей одного или более экзогенных полинуклеотидов,
неполярный липид (липидыы) содержит воски и/или восковые эфиры,
клетка представляет собой одного члена популяции или группы по меньшей мере из около 1000 таких клеток, и
неполярный липид содержит по меньшей мере 90% триацилглицерина (TAG).
45. Способ получения углеводородного продукта, включающий следующие стадии:
получение растения по п.1, части растения по п.12 или рекомбинантной клетки по п.43 или 44, и
либо
а) превращение по меньшей мере части липида в растении или части растения, или в клетке со стадии i) в углеводородный продукт путем применения теплового, химического или ферментативного воздействия или любой их комбинации на липид in situ в растении, части растения или клетке, или
b) физическую обработку растения, части растения или клетки со стадии i), и последующего или одновременного превращение по меньшей мере липида в растении, части растения или клетки в углеводородный продукт путем применения тепла, химического или ферментативного воздействия или любой их комбинации на липид в растении, части растения или клетке, и
извлечение углеводородного продукта,
получая тем самым углеводородный продукт.
46. Способ по п.45, в котором стадия физической обработки растения или части растения включает одно или более из операций раскатывания, прессования, измельчения или помола растения или части растения.
47. Способ по п.45 или 46, дополнительно включающий стадии:
(а) экстрагирование, по меньшей мере, некоторого количества неполярных липидов, содержащихся в растении, части растения или клетке, в качестве неполярного липида, и
(b) выделение экстрагированного неполярного липида,
где стадии (а) и (b) выполняются до стадии превращения по меньшей мере некоторого количества липида в растении, части растения или клетке в углеводородный продукт.
48. Способ по п.47, в котором экстрагированный неполярный липид содержит триацилглицерины, где триацилглицерины составляют по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% экстрагированного липида.
49. Способ по п.45 или 46, в котором углеводородным продуктом являются сложные эфиры жирных кислот, предпочтительно сложные метиловые эфиры жирных кислот и/или этиловые эфиры жирных кислот, алканы, такие как метан, этан или алкан с более длинной цепью, смесь алканов с более длинной цепью, алкен, биотопливо, монооксид углерода и/или газообразный водород, биоспирт, такой как этанол, пропанол или бутанол, биоуголь или комбинация монооксида углерода, водорода и биоугля.
50. Способ получения экстрагированного липида, включающий стадии:
получение растения по п.1, части растения по п.12 или рекомбинантной клетки по п.43 или 44,
экстрагирование липида из растения, части растения или клетки, и
выделение экстрагированного липида,
получая тем самым экстрагированный липид.
51. Способ по п. 50, где часть растения представляет собой семя растения, а извлеченный липид представляет собой масло семян.
52. Способ по п. 50 или 51, который представляет собой способ получения экстрагированного масла канолы, где способ включает стадии:
получение семян канолы, содержащих по меньшей мере 45 мас.% масла,
экстрагирование масла из семян канолы, и
выделение масла, где выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
получая тем самым масло канолы.
53. Способ по п. 50 или 51, который представляет собой способ получения экстрагированного кукурузного масла, где способ включает стадии:
получение семян кукурузы, содержащих по меньшей мере 5 мас.% масла,
экстрагирование масла из семян кукурузы, и
выделение масла, где выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
получая тем самым кукурузное масло.
54. Способ по п. 50 или 51, который представляет собой способ получения экстрагированного соевого масла, где способ включает стадии:
получение семян сои, содержащих по меньшей мере 20 мас.% масла,
экстрагирование масла из семян сои, и
выделение масла, где выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
получая тем самым соевое масло.
55. Способ по п. 50 или 51, который представляет собой способ получения экстрагированного масла семян люпина, где способ включает стадии:
получение семян люпина, содержащих по меньшей мере 10 мас.% масла,
экстрагирование масла из семян люпина, и
выделение масла, где выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
получая тем самым масло семян люпина.
56. Способ по п. 50 или 51, который представляет собой способ получения экстрагированного арахисового масла, где способ включает стадии:
получение арахисовых орехов, содержащих по меньшей мере 50 мас.% масла,
экстрагирование масла из арахисовых орехов, и
выделение масла, где выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
получая тем самым арахисовое масло.
57. Способ по п. 50 или 51, который представляет собой способ получения экстрагированного подсолнечного масла, где способ включает стадии:
получение семян подсолнечника, содержащих по меньшей мере 50 мас.% масла,
экстрагирование масла из семян подсолнечника, и
выделение масла, где выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
получая тем самым подсолнечное масло.
58. Способ по п. 50 или 51, который представляет собой способ получения экстрагированного хлопкового масла, где способ включает стадии:
получение семян хлопчатника, содержащих по меньшей мере 41 мас.% масла,
экстрагирование масла из семян хлопчатника, и
выделение масла, где выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
получая тем самым хлопковое масло.
59. Способ по п. 50 или 51, который представляет собой способ получения экстрагированного сафлорового масла, где способ включает стадии:
получение семян сафлора, содержащих по меньшей мере 35 мас.% масла,
экстрагирование масла из семян сафлора, и
выделение масла, где выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
получая тем самым сафлоровое масло.
60. Способ по п. 50 или 51, который представляет собой способ получения экстрагированного льняного масла, где способ включает стадии:
получение семян льна, содержащих по меньшей мере 36 мас.% масла,
экстрагирование масла из семян льна, и
выделение масла, где выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
получая тем самым льняное масло.
61. Способ по п. 50 или 51, который представляет собой способ получения экстрагированного рыжикового масла, где способ включает стадии:
получение семян Camelina sativa, содержащих по меньшей мере 36 мас.% масла,
экстрагирование масла из семян Camelina sativa, и
выделение масла, где выделенное масло содержит по меньшей мере 90% (мас./мас.) триацилглицеринов (TAG),
получая тем самым рыжиковое масло.
62. Способ по п. 50 или 51, который включает в себя одну или более операций сушки, раскатывания, прессования, измельчения или помола растения или части растения, и/или очистки экстрагированного липида или масла семян.
63. Способ по п. 50 или 51, в котором в процессе экстракции используют органический растворитель для выделения масла.
64. Способ по п. 50 или 51, который включает выделение экстрагированных липидов или масла путем его сбора в контейнер и/или выполнение одного или более из дегумирования, дезодорации, обесцвечивания, высушивания, фракционирования экстрагированных липидов или масла, удаления по меньшей мере некоторых восков и/или восковых эфиров из экстрагированных липидов или масла, или анализа состава жирных кислот экстрагированных липидов или масла.
65. Способ по п. 50 или 51, в котором объем экстрагированных липидов или масла составляет по меньшей мере 1 литр.
66. Способ по п. 50 или 51, в отношении которого применима одна или более, или все из следующих характеристик:
экстрагированные липиды или масло содержат триацилглицерины, при этом триацилглицерины составляют по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% или 96% экстрагированных липидов или масла,
экстрагированные липиды или масло содержат свободные стеролы, стероиловые эфиры, стероил-гликозиды, воски или восковые эфиры или любую их комбинацию, и
общее содержание стерола и/или композиции в экстрагированных липидах или масле существенно отличается от содержания стерола и/или композиции в экстрагированных липидах или масле, полученных из соответствующего растения, части растения или клетки, не содержащих одного или более экзогенных полинуклеотидов.
67. Способ по п. 50 или 51, где способ дополнительно включает превращение экстрагированных липидов или масла в углеводородный продукт.
68. Способ по п. 67, в котором углеводородный продукт представляет собой сложные эфиры жирных кислот, предпочтительно сложные метиловые эфиры жирных кислот и/или этиловые эфиры жирных кислот, алкан, такие как метан, этан или алкан с более длинной цепью, смесь алканов с более длинной цепью, алкен, биотопливо, монооксид углерода и/или газобразный водород, биоспирт, такой как этанол, пропанол или бутанол, биоуголь или комбинация монооксида углерода, водорода и биоугля.
69. Способ по п.45 или 50, в отношении которого применима одна или более, или все из следующих характеристик:
содержание олеиновой кислоты составляет по меньшей мере 20% (мол.%), по меньшей мере 22% (мол.%), по меньшей мере 30% (мол.%), по меньшей мере 40% (мол.%), по меньшей мере 50% (мол.%) или по меньшей мере 60% (мол.%), предпочтительно по меньшей мере 65% (мол.%) или по меньшей мере 66% (мол.%) от общего содержания жирных кислот в экстрагированных липидах или масле,
экстрагированные липиды или масло содержат жирную кислоту, которая содержит гидроксильную группу, эпоксигруппу, циклопропановую группу, двойную углерод-углеродную связь, тройную углерод-углеродную связь, сопряженные двойные связи, разветвленную цепь, такую как метилированную или гидроксилированную разветвленную цепь, или комбинацию двух или более из них, или любые две, три, четыре, пять или шесть из вышеупомянутых групп, связей или разветвленных цепей.
70. Способ получения клетки с улучшенной способностью вырабатывать один или более неполярных липидов, включающий следующие стадии:
а) введение в клетку одного или более экзогенных полинуклеотидов, которые содержат первый экзогенный полинуклеотид, кодирующий первый полипептид ацилтрансферазы жирной кислоты, и один или более дополнительных экзогенных полинуклеотидов, кодирующих одно или более из следующего:
молекулу РНК, которая ингибирует экспрессию гена, кодирующего полипептид, который участвует в разложении липидов и/или который снижает содержание липидов, такого как липаза,
второй полипептид ацилтрансферазы жирных кислот, или
полипептид, который стабилизирует один или более неполярных липидов, таких как олеозин,
где каждый из одного или более экзогенных полинуклеотидов функционально связан с промотором, который способен направлять экспрессию полинуклеотида в клетке,
b) экспрессию одного или более экзогенных полинуклеотидов в клетке или в ее клетках-потомках,
c) анализ содержания липидов в клетке или клетках-потомках, и
d) отбор клетки или клетки-потомка, имеющей повышенную концентрацию одного или более неполярных липидов, по сравнению с соответствующей клеткой или клеткой-потомком, не содержащей одного или более экзогенных полинуклеотидов.
71. Способ по п.70, в котором один или более экзогенных полинуклеотидов являются такими, как определено в п.27.
72. Способ по п. 70 или 71, в котором один или более экзогенных полинуклеотидов стабильно интегрированы в геном клетки или клетки-потомка.
73. Способ по п.72, дополнительно включающий стадию регенерации трансгенного растения из клетки или клетки-потомка, включающей один или более экзогенных полинуклеотидов.
74. Способ по п.73, в котором стадию регенерации трансгенного растения проводят до стадии экспрессии одного или нескольких экзогенных полинуклеотидов в клетке или в ее клетке-потомке, и/или до стадии анализа содержания липидов в клетке или в клетке-потомке, и/или до стадии отбора клетки или клетки-потомка, имеющих повышенную концентрацию одного или нескольких неполярных липидов.
75. Способ по п. 79 или 74, который дополнительно включает стадию получения семян или растения-потомка из трансгенного растения, где семена или растение-потомок содержит один или более экзогенных полинуклеотидов.
76. Способ получения синтетического дизельного топлива, включающий:
превращение липида в растении по п.1 или части растения по п.12 в синтез-газ путем газификации, и
превращение синтез-газа в биотопливо с использованием металлического катализатора или микробного катализатора.