Экспериментальная модель нефротоксического гломерулонефрита

БИОЛОГИЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА

УДК 616.611-002-092.9

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ НЕФРОТОКСИЧЕСКОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА

Н. Ю. Коломеец, Н. И. Аверьянова

Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е. А. Вагнера, г. Пермь

Целью работы явилось создание модели нефротоксического гломерулонефрита путем иммунизации белых беспородных крыс сывороткой, получаемой в результате предшествующей иммунизации морской свинки суспензией почечного антигена беспородной белой крысы. Эксперимент выполнен на 16 животных — самцах и самках беспородных белых крыс четырехмесячного возраста, содержащихся в стандартных условиях вивария (контрольная группа — 7 животных, опытная — 9). Для иммунизации животных использовалась следующая схема: сыворотку вводили двукратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией 24 часа, из расчета 100 мкл нефротоксической сыворотки на 100 г массы животного. При последующем гистологическом исследовании препаратов почек иммунизированных животных наблюдалась морфологическая картина, соответствующая патоморфологи-ческим изменениям, характерным для мезангиально-капиллярного гломерулонефрита. Воспроизводимость эксперимента составила 100%.

Ключевые слова: экспериментальная модель, нефротоксический гломерулонефрит, белые беспородные крысы.

Введение

Гломерулонефрит остается актуальной проблемой современной медицины, что обусловлено тяжестью течения заболевания и сложностью проводимой терапии. Среди всех заболеваний почек гломерулонефриты имеют постоянную тенденцию к прогресси-рованию, являясь самой распространенной причиной развития хронической почечной недостаточности [1, 4]. Это определяет одну из проблем современной нефрологии — проблему инвалидности и реабилитации, которая связана не столько с общей распространенностью заболевания, сколько с несомненным преобладанием среди заболев-

ших лиц молодого возраста и фатальным развитием хронической почечной недостаточности [2].

Изучение механизмов прогрессирования нефропатий в условиях эксперимента продиктовано поиском новых методов замедления развития почечной недостаточности, что, в свою очередь, имеет большое медицинское, социальное и экономическое значение. Изменение возможностей эксперимента позволяет воспроизводить конкретные, заданные формы нефритов для более тонкого анализа пато- и морфогенеза заболевания, закономерностей структурных и ультраструктурных изменений различных отделов нефрона, а также для доклинического исследования

эффективности новых лекарственных препаратов при данной патологии.

На сегодняшний день известно несколько моделей нефротоксического гломеруло-нефрита у экспериментальных животных, воспроизводимого путем введения нефро-токсической сыворотки, полученной от другого животного при иммунизации его почкой первого [3, 5, 6, 7, 8]. Наиболее близким аналогом является способ воспроизведения модели у белых беспородных крыс путем введения экспериментальному животному нефротоксической сыворотки, полученной от иммунизированных суспензией почечного антигена беспородной белой крысы кроликов [6]. Однако недостатками этой модели являются сложность проводимого эксперимента и дороговизна исследования. Для приготовления нефротоксической сыворотки авторами используются кролики, работа с которыми является трудоемкой и дорогостоящей.

Материалы и методы

ИССЛЕДОВАНИЯ

Нами разработана модель нефротокси-ческого гломерулонефрита путем иммунизации белых беспородных крыс сывороткой, получаемой в результате предшествующей иммунизации морской свинки суспензией антигена, выделенного из коркового вещества почек лабораторной крысы, по схеме: двукратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией 24 часа, из расчета 100 мкл нефротоксической сыворотки на 100 г массы животного. Эксперимент выполнен на 16 животных — самцах и самках беспородных белых крыс четырехмесячного возраста. Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к Приказу

МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.

Всех животных содержали в стандартных условиях вивария: стандартное содержание в пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой, стандартный рацион и питьевой режим вивария.

Для получения нефротоксической сыворотки брали самку белой беспородной крысы массой 230 г. Сразу после декапитации, проведенной под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии, почки перфу-зировали in situ стерильной охлажденной средой 199 до получения равномерного серо-коричневого цвета. После этого их отсекали от почечной ножки и переносили на стерильный металлический лоток. Все последующие манипуляции выполнялись при температуре +4°С. Почки отделяли от капсулы и разрезали сагиттально, выделяя корковый слой (масса коркового слоя составила 369 мг). Корковый слой суспендировали в стерильной ступке, дополнительно измельчали в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т, в режиме 44 мГц, в течение 10 минут, затем переносили суспензию в центрифужный стаканчик, добавляя охлажденный физиологический раствор до 10 мл и мер-тиолят (1 мг) в качестве антисептика. Полученную суспензию центрифугировали на холоде трехкратно по 3 минуты при 2000 об/мин, каждый раз удаляя супернатант с обрывками ткани и доводя объем суспензии до 10 мл охлажденным физиологическим раствором. После этого суспензию центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 минут. Осадок переносили на стерильную фольгу и взвешивали на торсионных весах. Масса осадка составила 370 мг. Полученный осадок состоял преимущест-

Пермский медицинский журнал

2010 том XXVII № 3

венно из гломерул, которые хорошо были видны при микроскопии неокрашенных препаратов.

Для приготовления суспензии брали 200 мг осадка и смешивали с 10 мл полного адъюванта Фрейнда, который применяют для стимуляции иммунных процессов, из расчета 1,0 мл на 20 мг осадка. Полученную взвешенную антигенную суспензию коркового слоя почки крысы хранили при температуре +4°С. В последующем проводили иммунизацию морских свинок (п=3) из расчета 100 мкл полученной антигенной суспензии на 100 г массы тела животного по следующей схеме: трехкратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией 24 часа. Во избежание анафилактической реакции внутрибрюшинное введение осуществляли дробно.

Спустя 30 дней от начала иммунизации морских свинок выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Сыворотку забирали из полостей сердца сразу после биологической смерти животного, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут до получения прозрачной жидкости. Полученную нефротоксическую сыворотку хранили в течение последующих двух дней при температуре +4°С.

Белые беспородные крысы были разделены на группы: I группа — контрольная (ин-тактные животные) (п=7); II группа — моделирование нефротоксического нефрита (п=9). Иммунизацию животных проводили по следующей схеме: двукратно внутрибрю-шинно с интервалом 24 часа, из расчета 100 мкл нефротоксической сыворотки на 100 г массы тела животного.

Перед началом эксперимента у животных контрольной (интактной) и опытной групп проводили анализ разовой порции мочи

на белок, используя качественную реакцию с 20%-ной сульфосалициловой кислотой. Через 1 час после иммунизации и в течение последующего эксперимента в динамике проводили контрольное исследование мочи на белок.

через 14 дней от начала иммунизации животных выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забирали для проведения гистологического исследования. Материал фиксировали в нейтральном забу-ференном формалине, подвергали обезвоживанию в спиртах возрастающей крепости, заливали в парафин. Срезы получали на ротационном микротоме, окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, нитратом серебра по Футу. Исследовали микропрепараты в проходящем свете светового микроскопа (объектив 40).

Результаты и их обсуждение

У животных контрольной группы не было выявлено лабораторных и гистологических признаков развития нефрита. В течение всего эксперимента в моче животных этой группы белок не выявлялся. При проведении гистологического исследования в почках четко выявлялись капсула, корковое вещество с почечными тельцами и извитыми канальцами и мозговое вещество. Прямые канальцы в мозговом веществе и собирательные трубочки были без особенностей. Визуализировались сосочки и почечная лоханка, выстланная переходным эпителием. Капсула Шумлянского — Боумена не утолщена, сосудистые клубочки нефрона не были изменены. Проксимальные и дисталь-ные почечные канальцы находились между почечными тельцами, их структура была типичной.

После проведения иммунизации нефротоксической сывороткой у животных опытной группы наблюдали выраженную протеи-нурию на 4, 9, 13-й день после иммунизации. Имелось значительное колебание выделения белка с мочой у отдельных животных. При проведении гистологического исследования аутопсийного материала в ткани почек выявлялось выраженное полнокровие сосудов коркового и мозгового слоев. В клубочках отмечалась пролиферация мезангиальных клеток. Клубочки были увеличены в размерах, в ряде случаев имелись спайки капиллярных петель с капсулой Шумлянского — Боумена, что значительно ограничивало объем мочевого пространства. У части клубочков отмечалось утолщение капсулы и стенок отдельных капилляров, выявляемое при окрашивании препаратов нитратом серебра по Футу. Капиллярные петли были полнокровны, отдельные капилляры содержали тромбы. В проксимальных и дис-тальных канальцах резко выражена гидропи-ческая дистрофия, а также атрофия эпителия.

Вывод

Воспроизводимость нашего эксперимента составила 100%. Предложенная модель позволяет воспроизвести в эксперименте гломерулонефрит, о чем свидетельствуют выявленные патоморфологические изменения, соответствующие мезангиально-капилляр-ному гломерулонефриту.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Игнатова М. С. Актуальные проблемы морфологии детского возраста в начале XXI века/М. С. Игнатова ^//Педиатрия.— 2007.— Т. 86.— № 6.— С. 6—14.

2. Комплексные программы медико-социальной реабилитации инвалидов вслед-

ствие болезней почек/И. В. Рудов, Ю. Ф. Кузьмин^//Гастроэнтерология юга России: ежегодное научно-практическое издание.— Ростов-на-Дону 2008.— С. 336— 338.

3. Моделирование экспериментального нефрита и его течение в зависимости от путей и частоты введения нефротоксической сывороткиД Т. Самойлова, Г. П. Шульцев, Л. В. Халютина, Э. Р. Булатова //Моделирование, методы изучения и экспериментальная терапия патологических процессов: Матер. Всес. конф.— М., 1973.— С. 53—55.

4. Морфологическая характеристика неамилоидной формы отложения моноклональ-ных иммуноглобулинов в почках/О. А. Воробьева, С. В. Наст, А. Н. Коэн//Архив патологии.— 2006.— № 6.— С. 19—22.

5. Нефрит Масуги: получение активной нефротоксической сыворотки/Н. В. Никифорова, Н. П. Перепечкина, В. А. Варшавский, М. А. Пальцев, В. В. Шалдаева//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.— 1985.— № 2.— С. 377—380.

6. Роль препарата GA-40 в коррекции тубуло-интерстициального синдрома при хроническом нефрите Масуги/М В. Дикал, Ю. Е. Роговый///Клиническая анатомия и оперативная хирургия.— 2006.— Т. 5.— № 3.— С. 10—14.

7. Cytoskeletal changes in podocytes associated with foot process effacement in Masugi nephritis//. Shirato, T. Sakai, K. Kimura, Y. Tomino, W. Kriz//Am. J. Pathol.— 1996.— Vol. 148.— № 4.— P. 1283—1296.

8. Modelos experimentales: aplicabilited en el esstudio de las enfermedades renales glomerulares de origen inmunologico/ F. Mampaso, E. Nieto, G. Peres de Lema//Rev Esp. de Patologia.— 2002.— Vol. 35.— № 2.— P. 127—138.

Пермский медицинский журнал

2010 том XXVII № 3

N. Yu. Kolomeets, N. I. Averyanova

EXPERIMENTAL MODEL OF NEPHROTOXIC GLOMERULONEPHRITIS

The aim of the work was to create nephrotoxic glomerulonephritis model by means of immunization of outbred rats with the serum obtained as a result of former immunization of a guinea pig with renal antigen suspension of outbred white rat. The experiment was performed on 16 rats — four-month-old outbred male and female white rats (control group — 7 animals, experimental one — 9). To immunize animals the following scheme was used: serum was administered twice intraperitoneally once a day with 24-hour interval between immunizations — 100 mcl of nephrotoxic serum per 100 g of the animal mass. The next

histological investigation of immunized animal renal preparations demonstrated morphological picture corresponding to pathomorphological changes typical for mesangial-capillary glomerulonephritis. Experimental reproducibility was 100%.

Keywords: experimental model, nephrotoxic glomerulonephritis, white outbred rats.

Контактная информация: Коломеец Надежда Юрьевна, канд. мед. наук, доцент кафедры пропедевтики детских болезней, факультетской педиатрии и сестринского дела в педиатрии Пермской государственной медицинской академии им. ак. Е. А. Вагнера, 614000, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26, тел. 8 (342) 298-51-12

Материал поступил в редакцию 20.03.2010