Способ получения 7-замещенных 4,4-диметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9Н-ксантен-2-карбоновых кислот и их цитотоксическая активность
METHOD FOR PRODUCING 7-SUBSTITUTED 4,4-DIMETHYL-9-OXO-4,4A-DIHYDRO-9H-XANTEN-2-CARBONIC ACIDS AND THEIR CYTOTOXIC ACTIVITY

Изобретение относится к области органической и медицинской химии, а именно: к способу получения ряда полифункциональных гетероциклических соединений - 7-замещенных 4,4-диметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9Н-ксантен-2-карбоновых кислот Ia-д и их цитотоксической активности, которые могут быть использованы в органическом синтезе и в медицине в качестве потенциальных противоопухолевых средств.
где:
3
R=СНО (Iа - 4,4-диметил-7-метокси-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновая кислота);
3
R=СН (1б - 4,4,7-триметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновая кислота);
R=Н (Iв - 4,4-диметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновая кислота);
R=Br (Iг - 7-бром-4,4-диметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновая кислота);
R=Cl (Iд - 4,4-диметил-9-оксо-7-хлор-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновая кислота).
Структурное сходство соединений Ia-д с известными 4,4а-дигидроксантонами природного происхождения - нидулалинами II, обладающими цитотоксическими свойствами [Sato, S. Syntheses of novel antitumor dihydroxanthone derivates with inhibitory activity against DNA topoisimerase II / S. Sato, Y. Sato, T. Yoshimura, et al. // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. - 1999. - Vol. 9. - P. 2653-2656], делает данный класс соединений перспективным для поиска новых противоопухолевых агентов.
1
2
R = Н, Ac; R=Н, ОН
В научно-технической литературе представлен единственный метод синтеза 4,4а-дигидроксантонов Ia-г [Палев, Н.А. Бензо-γ-пиронил-3-винилкарбоновые кислоты в реакции Дильса-Альдера / Н.А. Палев, Н.М. Чернов, Р.В. Шутов и др. // Бутлеровские сообщения. - 2013. - Т. 35. - №9. - С. 28-31]. Реакцию проводили путем взаимодействия 6-замещенных 3-(4-оксо-4Н-хромен-3-ил)акриловых кислот IIIа-г с N-(2-метилпроп-1-енил)пиперидином IV, используемых авторами в мольном отношении 1:1,5, в среде 1,2-дихлорэтана (DCE) при 25°С с последующим многостадийным выделением целевого продукта из промежуточно образующихся солей Va-г:
3
3
R=CHO (a), CH (б), H (в), Br (г)
Несмотря на то, что авторы данного метода указывают хороший (78,1-81,3%) выход 4,4а-дигидроксантонов Ia-г, у имеющегося способа существуют следующие недостатки:
- Длительность процесса. Так, в случае получения 7-метокси- и 7-метилпроизводных Iа и Iб длительность процесса составляет более 7 суток.
- Применение высокотоксичного растворителя 1 класса опасности - 1,2-дихлорэтана [ОФС.1.1.0008.15 Остаточные органические растворители // Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. - 2015. - Том 1. - Режим доступа: http://193.232.7.120/feml/clinical_ref/pharmacopoeia_1/HTML. - С. 187-191], что влияет на безопасность получаемых продуктов и затрудняет их использование в качестве потенциальных биологически активных веществ.
- Сложная технология выделения целевых продуктов из реакционной массы, включающая замену исходного растворителя на ацетонитрил для кристаллизации соединений Iа-г.
Таким образом, задачей предлагаемого изобретения является разработка более эффективного и безопасного метода синтеза 7-замещенных 4,4-диметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновых кислот Ia-д, что позволит расширить ассортимент потенциальных противоопухолевых средств.
Техническими результатами, на решение которых направлено изобретение, являются эффективный и безопасный способ получения заявляемых веществ за счет сокращения времени процесса, замены не рекомендуемого к использованию в фармацевтической промышленности высокотоксичного растворителя и упрощения технологии выделения гетероциклических соединений формулы Ia-д, проявляющих цитотоксическую активность.
Задача решается тем, что разработан способ получения 7-замещенных 4,4-диметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновых кислот общей формулы I
где:
3
R=СНО (Iа - 4,4-диметил-7-метокси-9-оксо-4,4а-дигидро-9H ксантен-2-карбоновая кислота);
3
R=СН (Iб - 4,4,7-триметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновая кислота);
R=Н (Iв - 4,4-диметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновая кислота);
R=Br (Iг - 7-бром-4,4-диметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновая кислота);
R=Сl (Iд - 4,4-диметил-9-оксо-7-хлор-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновая кислота), путем взаимодействия 6-замещенных 3-(4-оксо-4Н-хромен-3-ил)акриловых кислот, где R имеет вышеуказанные значения, с енамином, отличается тем, что в качестве енамина используют N-(2-метилпроп-1-енил)пирролидин, реакцию ведут при температуре от 20 до 80°С в течение от 0,5 до 4 часов в присутствии катализатора нитрата лантана (III) в количестве от 0 до 20 мол. % в среде растворителя, выбранного из группы: дихлорметан, этилацетат или ацетонитрил, N-(2-метилпроп-1-енил)пирролидин используют в 10-100% избытке по отношению к акриловым кислотам, а целевой продукт кристаллизуется при подкислении реакционной массы.
Задача решается также тем, что разработан способ получения 7-замещенных 4,4-диметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновых кислот по п. 1 общей формулы I, обладающих цитотоксической активностью, где R имеет вышеуказанные значения.
В ходе оптимизации имеющего способа синтеза 4,4а-дигидроксантонов Ia-д был разработан двухстадийный метод их получения по следующей схеме:
3
3
R=СНO (а), СН (б), Н (в), Br (г), Сl (д)
В отличие от представленного в научно-технической литературе метода разработанный способ обеспечивает:
3
3
- Технологически приемлемую продолжительность процесса. В зависимости от заместителя R, температуры проведения синтеза (от 20 до 80 °С) и количества используемого нитрата лантана (III) La(NO) (кислота Льюиса, применяемая в качестве катализатора в количестве от 0 до 20 мол. %) время прохождения реакции составляет от 0,5 до 4 часов. Сокращению времени синтеза также способствует замена N-(2-метилпроп-1-енил)пиперидина IV на более реакционноспособный N-(2-метилпроп-1-енил)пирролидин VI, используемый в 10-100% избытке по отношению к акриловым кислотам IIIа-д.
- Безопасность получаемого продукта из-за исключения из схемы высокотоксичного 1,2-дихлорэтана. В качестве растворителя (solvent) в описываемом способе выступают дихлорметан (наиболее предпочтителен), этилацетат или ацетонитрил в количестве от 1 до 5 мл на 1 ммоль исходной акриловой кислоты IIIа-д, наиболее предпочтительно - от 2 до 3 мл растворителя на 1 ммоль соединения IIIа-д.
- Простоту выделения целевых продуктов. После окончания процесса реакционная масса подкисляется добавлением 0,1-4,0 М (наиболее предпочтительно 1,0-2,0 М) соляной кислоты, при этом 4,4а-дигидроксантоны Ia-д кристаллизуются с выходом 74-82%.
Параметры процесса, а именно температура, растворитель, количество катализатора и избыток реагента VI? выбираются исходя из удобства проведения синтеза и строения субстрата IIIа-д. Так, реакционная способность акриловых кислот IIIа, б при наличии в них электронодонорных заместителей (МеО (а) и Me (б)) значительно падает, что обуславливает необходимость проведения синтеза 4,4а-дигидроксантонов Iа и Iб при 60-80°С (при этом неприемлемо использование легкокипящего дихлорметана и в качестве растворителя выбираются этилацетат или ацетонитрил) с добавлением 15-20 мол. % нитрата лантана и 1,5-2,0 эквивалентов енамина VI на 1 эквивалент акриловой кислоты, при этом длительность процесса составляет 1-2 часа. В то же время получение 7-галогензамещенных 4,4а-дигидроксантонов Iг, д из реакционноспособных кислот IIIг, д гладко протекает в дихлорметане при 35-40°С без добавления катализатора за 4 часа или при 20°С с добавлением 10 мол. % нитрата лантана за 0,5 часа.
1
13
Разработанный способ получения 4,4а-дигидроксантонов Ia-д изучен и проверен в лабораторных условиях. Структура и чистота полученных продуктов установлены методами спектроскопии ЯМР Н, С и масс-спектрометрии высокого разрешения (HRMS-ESI).
Биологические испытания 7-замещенных 4,4-диметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9Н-ксантен-2-карбоновых кислот Ia-д показали наличие у них цитотоксической активности в отношении линии клеток карциномы молочной железы MCF-7.
Предлагаемое изобретение проиллюстрировано примерами практического осуществления.
Пример 1. Получение 4,4-диметил-7-метокси-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновой кислоты (Iа).
1
4а
5
3
6
8
1
13
-
6
H
6
C
17
15
5
В круглодонную колбу, снабженную термометром и обратным холодильником, помещают 30 мл этилацетата, 4,9 г (20 ммоль) акриловой кислоты IIIа, 5,0 г (40 ммоль, 100% избыток) енамина VI и 2,2 г (5 ммоль, 20 мол. %) нитрата лантана (в виде гексагидрата). Реакционную смесь нагревают при 75-80°С в течение 1-1,5 часов, конец реакции определяют по ТСХ (этилацетат, проявление в УФ свете). Затем массу охлаждают и по каплям прибавляют 1 М соляную кислоту до рН<2 в водном слое, после чего перемешивают 30 минут при 20-25°С и отфильтровывают выпавший осадок 4,4а-дигидроксантона Iа. Продукт сушат на воздухе, получая 4,5 г (74%, считая на кислоту IIIа) желто-зеленых кристаллов с температурой плавления 214-216°С.Спектр ЯМР Н (400 МГц, ДМСО-d): δ (м.д.) 1,04 (с, 3Н, Me), 1,44 (с, 3Н, Me), 3,77 (с, 3Н, МеО), 5,20 (дд, J=1,5, 3,0 Гц, 1Н, СН), 7,04 (д, J=9,0 Гц, 1Н, СН), 7,06 (т, J=1,5 Гц, 1Н, СН), 7,21 (дд, J=3,0, 9,0 Гц, 1H, СН), 7,23 (д, J=3,0 Гц, 1Н, СН), 7,31 (дд, J=1,5, 3,0 Гц, 1H, СН), 13,04 (уш.с, 1Н, СООН). Спектр ЯМР С (100 МГц, ДМСО-d): δ (м.д.) 17,53, 25,88, 38,62, 56,00, 81,71, 108,07, 120,15, 121,60, 125,36, 126,36, 126,81, 130,54, 152,73, 154,50, 155,00, 165,89, 179,22. Масс-спектр HRMS-ESI: m/z вычислено для CHO [М-Н] 299,0925, найдено 299,0926.
Пример 2. Получение 4,4,7-триметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновой кислоты (Iб).
1
4а
5
3
1
6
8
13
-
6
H
6
С
17
15
4
В круглодонную колбу, снабженную термометром и обратным холодильником, помещают 20 мл дихлорметана, 4,6 г (20 ммоль) акриловой кислоты IIIб, 3,8 г (30 ммоль, 50% избыток) енамина VI и 1,3 г (3 ммоль, 15 мол. %) гексагидрата нитрата лантана. Реакционную смесь нагревают при 35-40°С в течение 3-4 часов, конец реакции определяют по ТСХ (этилацетат, проявление в УФ свете). Затем массу охлаждают и по каплям прибавляют 1 М соляную кислоту до рН<2 в водном слое, после чего перемешивают 30 минут при 20-25°С и отфильтровывают выпавший осадок 4,4а-дигидроксантона Iб. Продукт сушат на воздухе, получая 4,6 г (81%, считая на кислоту IIIб) бледно-желтых кристаллов с температурой плавления 225-226°С. Спектр ЯМР Н (400 МГц, ДМСО-d): δ (м.д.) 1,02 (с, 3Н, Me), 1,42 (с, 3Н, Me), 2,26 (с, 3Н, Me), 5,17 (с, 1H, СН), 6,94 (д, J=8,3 Гц, 1Н, СН), 7,03 (с, 1Н, СН), 7,29 (с, 1Н, СН), 7,36 (д, J=8,3 Гц, 1Н, СН), 7,58 (с, 1Н, СН), 13,00 (уш.с, 1Н, СООН). Спектр ЯМР С (100 MГц, ДМСО-d): δ (м.д.) 17,47, 20,44, 25,87, 38,60, 81,82, 118,47, 121,13, 126,39, 126,74, 126,78, 130,61, 131,48, 137,73, 152,55, 158,53, 165,85, 179,25. Масс-спектр HRMS-ESI: m/z вычислено для СНO [М-Н] 283,0976, найдено 283,0981.
Пример 3. Получение 4,4-диметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновой кислоты (Iв).
1
4а
3
5
7
1
6
8
13
-
6
H
6
С
16
14
4
В круглодонную колбу, снабженную термометром и обратным холодильником, помещают 25 мл ацетонитрила, 4,3 г (20 ммоль) акриловой кислоты IIIв, 3,8 г (30 ммоль, 50% избыток) енамина VI и 0,87 г (2 ммоль, 10 мол. %) гексагидрата нитрата лантана. Реакционную смесь нагревают при 60-65°С в течение 2-3 часов, конец реакции определяют по ТСХ (этилацетат, проявление в УФ свете). Затем массу охлаждают и по каплям прибавляют 1 М соляную кислоту до рН<2 в водном слое, после чего перемешивают 30 минут при 20-25°С и отфильтровывают выпавший осадок 4,4а-дигидроксантона Iв. Продукт сушат на воздухе, получая 4,1 г (77%, считая на кислоту IIIв) бледно-желтых кристаллов с температурой плавления 186-188°С. Спектр ЯМР Н (400 МГц, ДМСО-d): δ (м.д.) 1,06 (с, 3Н, Me), 1,46 (с, 3Н, Me), 5,33 (дд, J=1,6, 3,1 Гц, 1Н, СН), 7,07 (т, J=1,6 Гц, 1Н, СН), 7,09 (д, J=8,5 Гц, 1Н, СН), 7,12 (т, J=7,5 Гц, 1Н, СН), 7,33 (дд, J=1,6, 3,1 Гц, 1Н, СН), 7,59-7,63 (м, 1Н, СН), 7,83 (дд, J=1,8, 7,8 Гц, 1Н, СН), 13,05 (уш.с, 1H, СООН). Спектр ЯМР, С (100 МГц, ДМСО-d): δ (м.д.) 17,51, 25,87, 38,67, 81,99, 118,73, 121,46, 122,51, 126,36, 126,88, 127,34, 130,52, 136,96, 152,79, 160,52, 165,87, 179,36. Масс-спектр HRMS-ESI: m/z вычислено для CHO [М-Н] 269,0819, найдено 269,0832.
Пример 4. Получение 7-бром-4,4-диметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновой кислоты (Iг).
1
4а
3
5
1
6
8
13
-
6
H
6
C
16
13
4
В круглодонную колбу, снабженную термометром и обратным холодильником, помещают 20 мл дихлорметана, 5,9 г (20 ммоль) акриловой кислоты IIIг и 3,0 г (24 ммоль, 20% избыток) енамина VI. Реакционную смесь нагревают при 35-40°С в течение 3-4 часов, конец реакции определяют по ТСХ (этилацетат, проявление в УФ свете). Затем массу охлаждают и по каплям прибавляют 1 М соляную кислоту до рН<2 в водном слое, после чего перемешивают 30 минут при 20-25°С и отфильтровывают выпавший осадок 4,4а-дигидроксантона Iг. Продукт сушат на воздухе, получая 5,6 г (80%, считая на кислоту IIIг) желтых кристаллов с температурой плавления 246-247°С. Спектр ЯМР Н (400 МГц, ДМСО-d): δ (м.д.) 1,05 (с, 3Н, Me), 1,44 (с, 3Н, Me), 5,32 (д, J=2,8 Гц, 1Н, СН), 7,05-7,08 (м, 2Н, СН, СН), 7,32 (д, J=2,8 Гц, 1Н, СН), 7,71 (дд, J=2,2, 8,8 Гц, 1Н, СН), 7,84 (д, J=2,2 Гц, 1H, СН), 13,05 (уш.с, 1Н, СООН). Спектр ЯМР С (100 МГц, ДМСО-d): δ (м.д.) 17,50, 25,79, 38,68, 82,32, 114,06, 121,36, 122,84, 126,35, 127,73, 129,22, 129,62, 139,13, 153,03, 159,50, 165,74, 178,22. Масс-спектр HRMS-ESI: m/z вычислено для CHBrO [М-Н] 346,9924, найдено 346,9935.
Пример 5. Получение 4,4-диметил-9-оксо-7-хлор-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновой кислоты (Iд).
1
4а
3
5
1
6
8
13
-
6
H
6
С
16
13
4
В круглодонную колбу, снабженную термометром и обратным холодильником, помещают 20 мл дихлорметана, 5,0 г (20 ммоль) акриловой кислоты IIIд, 2,8 г (22 ммоль, 10% избыток) енамина VI и 0,87 г (2 ммоль, 10 мол. %) гексагидрата нитрата лантана. Реакционную смесь выдерживают при 20-25°С в течение 0,5-1 часа, конец реакции определяют по ТСХ (этилацетат, проявление в УФ свете). Затем массу охлаждают и по каплям прибавляют 1 М соляную кислоту до рН<2 в водном слое, после чего перемешивают 30 минут при 20-25°С и отфильтровывают выпавший осадок 4,4а-дигидроксантона Iд. Продукт сушат на воздухе, получая 5,0 г (82%, считая на кислоту IIIд) желтых кристаллов с температурой плавления 243-245°С. Спектр ЯМР Н (400 МГц, ДМСО-d): δ (м.д.) 1,05 (с, 3Н, Me), 1,44 (с, 3Н, Me), 5,33 (дд, J=1,5, 3,0 Гц, 1Н, СН), 7,08 (т, J=1,5 Гц, 1Н, СН), 7,13 (д, J=8,8 Гц, 1Н, СН), 7,33 (дд, J=1,5, 3,0 Гц, 1Н, СН), 7,61 (дд, J=2,8, 8,8 Гц, 1H, СН), 7,72 (д, J=2,8 Гц, 1H, СН), 13,07 (уш.с, 1Н, СООН). Спектр ЯМР С (100 МГц, ДМСО-d): δ (м.д.) 17,50, 25,80, 38,68, 82,32, 121,06, 122,36, 126,15, 126,35, 126,53, 127,71, 129,66, 136,39, 153,02, 159,12, 165,75, 178,34. Масс-спектр HRMS-ESI: m/z вычислено для СНСlO [М-Н] 303,0430, найдено 303,0444.
Пример 6. Цитотоксическая активность 7-замещенных 4,4-диметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновых кислот (Iа-д).
Цитотоксическую активность соединений Ia-д исследовали на клеточной линии карциномы молочной железы MCF-7 (АТСС НТВ-22) с помощью МТТ-теста [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под. ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.]. Тест основан на ферментативном (митохондриальном) восстановлении бромида 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) с образованием окрашенных кристаллов формазана.
2
50
4
Клеточную линию выращивали в среде DMEM/F-12 с добавлением 10% бычьей эмбриональной сыворотки, 1% L-глутамина, 50 Е/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина при 37°С и содержании СО 5% в течение 24 часов. Затем суспензию клеток (100 мкл) с концентрацией 5⋅10 клеток/мл помещали в лунки 96-луночных микропланшетов и инкубировали 1 час при 37°С, после чего в каждую лунку добавляли исследуемые соединения Ia-д или препарат сравнения – фторурацил - в концентрациях 0,0625-256 мкг/мл и инкубировали в течение 48 часов при тех же условиях. По окончании инкубации в каждую лунку добавляли по 30 мкл раствора МТТ (5 мг/мл в фосфатно-солевом буфере) и инкубировали еще в течение 2 часов. Затем осторожно удаляли среду из лунок и добавляли по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для растворения синих кристаллов формазана. Оптическую плотность полученных растворов определяли на планшетном ридере Infinite 200 PRO (производитель Tecan Trading AG). Из величины оптической плотности, измеренной при 540 нм, вычитали для коррекции фона оптическую плотность, измеренную при 690 нм. Исходя из полученных зависимостей доза-эффект (7 концентраций в трех повторяемостях, р<0,0001) были определены полуингибирующие концентрации IC, представленные в таблице 1.
50
Из результатов исследования цитотоксической активности следует, что значения IC 7-замещенных 4,4-диметил-9-оксо-4,4а-дигидро-9H-ксантен-2-карбоновых кислот Ia-д значительно меньше аналогичной концентрации препарата сравнения - фторурацила, что говорит о перспективности данной группы соединений для применения их в качестве потенциальных противоопухолевых средств.