Биодеструкция нефти отдельными штаммами и принципы составления микробных консорциумов для очистки окружающей среды от углеводородов нефти

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2013. Вып. 2. Ч.1. С. 241-257

Химия =

УДК 579.252.5:579.6

Биодеструкция нефти отдельными штаммами и принципы составления микробных консорциумов для очистки окружающей среды от углеводородов

нефти *

А. А. Ветрова, А. А. Иванова, А. Е. Филонов, В. А. Забелин, А. Б. Гафаров, С. Л. Соколов, И. А. Нечаева, И. Ф. Пунтус,

А. М. Боронин

Аннотация. Из коллекции микроорганизмов лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН и коллекции микроорганизмов-деструкторов ЗАО «Биоойл» отобраны штаммы, обладающие высокой нефтеокисляющей и биоэмульгирующей активностью, несущие катаболические плазмиды, способные к деградации углеводородов нефти в диапазоне температур 4-42° С при значениях рН 4-10 в присутствии 5 % соли. В лабораторных условиях исследованы свойства отдельных штаммов к деградации нефти. На основании полученных данных составлен консорциум микроорганизмов-деструкторов для очистки почвенных и водных экосистем от нефти, в том числе в условиях высокой концентрации нефтепродуктов, в широком температурном и рН-диапазоне.

Ключевые слова: биодеградация, микроорганизмы, плазмиды, нефть.

Введение

Огромное количество органических соединений, поступающих в окружающую природную среду при освоении нефтегазовых ресурсов, приводят к тому, что данный вид загрязнения становится приоритетным для многих районов нефтедобычи [1]. Разработка и совершенствование технологий биоремедиации, особенно почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в настоящее время является областью активных

* Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП ГК № 14.515.11.0027 и гранта Президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых -кандидатов наук, договор № 16.120.11.4341-МК.

фундаментальных и прикладных исследований [2]. В большинстве случаев в данных биотехнологиях используются биопрепараты, которые содержат жизнеспособные клетки как отдельных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов («Путидойл», «Олеворин») [3,4], так и бактериальные консорциумы, например, «Деворойл» [5]. Известно, что для повышения эффективности биодеградации нефти и нефтепродуктов чаще всего используются смешанные культуры, состоящие из двух и более микроорганизмов [6-9]. Однако, работы по составлению «искусственных» ассоциаций нефтедеструкторов продолжаются. По результатам патентного поиска выявлено, что основными недостатками существующих биопрепаратов являются: либо использование монокультур, что является недостаточно эффективным, либо в составе содержится большое количество микроорганизмов, что затрудняет процесс наработки биомассы биопрепарата; узкий диапазон температур; неспособность микроорганизмов, входящих в состав биопрепаратов, продуцировать биосурфактанты; узкий диапазон рН; медленная деградация высоких концентраций нефти и нефтепродуктов; отсутствие данных о катаболических плазмидах в микроорганизмах-нефтедеструкторах. Ранее было показано [10], что присутствие плазмид ускоряет и расширяет деградативные возможности штамма-хозяина, поэтому представляется целесообразным использование плазмидосодержащих штаммов для составления микробного консорциума для очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов.

Целью настоящей работы являлся скрининг углеводородокисляющих культур из коллекции микроорганизмов Лаборатории биологии плазмид (ЛБП) ИБФМ РАН и ЗАО «Биоойл», исследование их физиологических свойств и способности к эффективной биодеградации углеводородов нефти в лабораторных условиях, а также разработка критериев составления микробных консорциумов и создание на их основе бактериальной ассоциации, для биоремедиации территорий, загрязненных высокими концентрациями нефти и нефтепродуктов в широких температурном и рН-диапазоне.

Материалы и методы исследования

Бактериальные штаммы. В работе использовали 7 штаммов бактерий из коллекции ЛБП ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина, г. Пущино, выделенных из почвенных образцов, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами, с территории Московской, Тульской, Тверской, Кировской и Тюменской областей. 10 штаммов-нефтедеструкторов, выделенных из различных нефтезагрязненных территорий РФ, были предоставлены Забелиным В.А., ЗАО «Биоойл» (табл.1).

Питательные среды, источники углерода и энергии. В качестве минеральной среды использовали среду Эванса [10]. Для получения

Таблица 1

Бактериальные штаммы, использованные в работе

Штамм Характеристика Источник

1A Phn+Npht+ Dsf+Hde+ ЗАО «Биоойл»

Acinetobacter baumannii 1B Oct+ Dec+ Non+ Tol+ Npht+ Dsf+Hde+ ЗАО «Биоойл»

2A Oct+ Dec+ Non+ Npht+ Dsf+Hde+ ЗАО «Биоойл»

2B Oct+ Dec+ Non+ Npht+ Dsf+Hde+ ЗАО «Биоойл»

2C Oct+ Dec+ Non+ Npht+ Dsf+Hde+ ЗАО «Биоойл»

3 Oct+ Dec+ Non+ Npht+ Dsf+Hde+ ЗАО «Биоойл»

4 Npht+ Dsf+Hde+ ЗАО «Биоойл»

5 Oct+ Dec+ Non+ Tol+ Npht+ Dsf+Hde+ ЗАО «Биоойл»

Serratia sp. 6 Oct+ Dec+ Non+ Npht+ Dsf+Hde+ ЗАО «Биоойл»

Acinetobacter baumannii 7 Dec+ Non+ Npht+ Dsf+Hde+ Oct+ ЗАО «Биоойл»

Rhodococcus sp. S25 Oct+ Dec+ Non+ Tol+ Nah+ Npht+ Dsf+Hde+ Лаборатория биологии плазмид, ИБФМ РАН

Rhodococcus erythropolis S26 Oct+ Dec+ Non+ Npht+ Dsf+Hde+ Лаборатория биологии плазмид, ИБФМ РАН

Rhodococcus sp. S67 Benz+Oct+ Dec+ Non+ Tol+ Npht+ Dsf+Hde+ Лаборатория биологии плазмид, ИБФМ РАН

Rhodococcus sp.X5 Benz+Oct+ Dec+ Non+ Npht+ Dsf+Hde+ Лаборатория биологии плазмид, ИБФМ РАН

Rhodococcus sp. X25 Benz+Oct+ Dec+ Non+ Npht+ Dsf+Hde+ Лаборатория биологии плазмид ИБФМ РАН

Pseudomonas sp. 142NF Benz+Sal+ Nah+ Npht+ Dsf+Hde+ Лаборатория биологии плазмид ИБФМ РАН

Pseudomonas putida F701 Cam+ Benz+Tol+ Phn+Sal+ Nah+ Npht+ Dsf+Hde+ Лаборатория биологии плазмид ИБФМ РАН

Примечания: способность к росту на: РИп+ — фенантрене, МаИ+ — нафталине,

Ба1+ — салицилате, — дизельном топливе, МрМ+ — нефти, Ше+ —

гексадекане, То1+ — толуоле, Ое1+ — октане, Бес+ — декане, Моп+ — нонане,

Веш+ — бензоате.

агаризованной среды добавляли 2% (вес/объем) агара («БИсо», США). В качестве полноценных — агаризованные среды Лурия-Бертани (ЛБ) [10]. Выращивание бактерий на минимальной агаризованной среде с различными углеводородами проводили по методике, описанной в работе [10].

Приготовление сред с диспергированным углеводородным субстратом осуществляли по методике, описанной в работе [10].

Условия культивирования. С целью определения способности микроорганизмов к росту на различных субстратах и средах ЛБ, КБ и ТСА

при различных температурах, в присутствии повышенной концентрации соли (3, 5, 7 и 10 %) штаммы высевали на соответствующие агаризованные среды, используя метод отпечатков.

Культивирование штаммов проводили в колбах Эрленмейера со 100 мл минеральной среды Эванса с добавлением нефти или дизельного топлива до конечной концентрации 2, 10, 15, 20, 25 и 30 % весовых (по объёму). Инокулирование колб проводили суспензией микроорганизмов (посевная доза 1-5х107кл/мл). После засева колбы помещали на круговую качалку (120 об/мин) и выращивали в течение 10 суток при температурах 24 и 4 °С.

Определение эмульгирующей активности. Эмульгирующую активность определяли визуально согласно методике [11] по четырёхбальной шкале и по изменению оптической плотности супернатанта с гексадеканом согласно методике [12]. Оценка поверхностной активности проводилась по оптической плотности исследуемых образцов на ФЭК-56М-У42 при 540 нм.

Измерение индекса эмульгирования. Индекс эмульгирования определяли по методике, описанной в работе [13].

Определение степени деструкции нефти. Деградацию нефти исследуемыми штаммами оценивали по суммарному показателю убыли нефти в жидкой среде, определяемому весовым методом (гравиметрия) [14]. Степень деструкции нефти (D) весовым способом определяли по следующей формуле с учетом данных, полученных для контроля без микроорганизмов (Рк) и экспериментальных образцов с бактериями (Pi), по формуле:

Pk — Pi D, % = 100%.

Определение фракционного состава остаточной нефти в пробах.

Оценку фракционного состава остаточной нефти проводили методом жидкостно-адсорбционной хроматографии, описанном в работе [10].

Выделение плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК выделяли методом, описанным в работе [15].

Конъюгационный перенос бактериальных плазмид. Коньюгаци-онный перенос плазмид осуществляли, используя метод Данна и Гонзалеса [16].

Элиминация бактериальных плазмид. Спонтанную элиминацию плазмид осуществляли путем длительного культивирования в богатой среде LB. Элиминацию плазмид подтверждали с помощью метода, описанного ранее [17].

Генотипирование штаммов. Тотальную ДНК бактерий выделяли при помощи набора UltraCleanMicrobial DNA Isolation Kit (Mo Bio, США). Полимеразную цепную реакцию осуществляли в термоциклере GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США) с праймерами, специфичными к генам 16S РНК эубактерий: 8f 5’-AGA GTT TGA TCM

TGG CTC AG-3’ и 1492r 5’-TAC GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3’. Реакцию проводили в стандартных условиях, при конечной концентрации дезоксирибонуклеотидтрифосфатов 200 мкМ и 1.5 мМ MgCl2. Электрофорез ДНК проводили в 0.8% агарозе в 0.5 х трис-боратном буфере. Визуализацию ДНК проводили путем окрашивания геля в растворе бромистого этидия. ДНК очищали из геля, используя «Qiaex II» Agarose Gel Extraction Sistem («Oiagen» GmbH, Германия), по протоколу фирмы-изготовителя. Нуклеотидную последовательность ДНК определяли с помощью CEQ™ 2000XL DNA Analysis System, используя набор реактивов Dye Terminator Cycle Sequencing Chemistry («Beckman», США) по протоколу фирмы производителя. Количество ДНК в реакции составляло 60—100 нг.

Статистическая обработка результатов. Обработку результатов проводили c помощью встроенного статистического пакета Excel (MS Office 2007).

Результаты и их обсуждение

Для разработки эффективной ассоциации микроорганизмов-деструкторов нефти был проведен анализ запатентованных аналогов с целью выявления их недостатков. При планировании работы были определены критерии и принципы составления микробных консорциумов для эффективной деградации углеводородов нефти:

1) способность к росту на средах с концентрацией нефти и нефтепродуктов не менее 30 % (так как высокий уровень загрязнения характерен для аварийных разливов нефти при ее добыче и транспортировке);

2) способность к деградации углеводородов в присутствии 3-5 % морской соли в среде (галотолерантность бактерий имеет особое значение в биоремедиации морских побережий и акваторий, а также болот в случае их засоленности);

3) способность к деградации углеводородов в диапазоне рН 4-10 (так как многие нефтезагрязнения в Западной Сибири локализованы в кислых грунтах, а для почв южных регионов России характерны щелочные значения

рН);

4) продуцирование биологических поверхностно-активных веществ при культивировании в нефтезагрязненных средах (биоэмульгаторы снижают вязкость нефти и повышают ее биодоступность);

5) присутствие катаболических плазмид в штаммах-нефтедеструкторах, что способствует расширению спектра утилизируемых субстратов клетки-хозяина за счет присутствия генов, контролирующих деградацию отдельных углеводородов нефти.

Одновременно все вышеперечисленные критерии не были учтены в патентах аналогах.

Характеристика наиболее эффективных штаммов-деструкторов нефти и нефтепродуктов. После предварительного отбора эффективных

штаммов-нефтедеструкторов в работе были исследованы 7 штаммов микроорганизмов из коллекции ЛБП ИБФМ РАН и 10 бактерий из коллекции коммерческой фирмы ЗАО «Биоойл» (табл.1).

Для исследуемых микроорганизмов был определён температурный диапазон, способность продуцировать биоэмульгаторы, галотолерантность, спектр утилизируемых субстратов (табл. 1) и диапазон рН. Все исследуемые микроорганизмы способны к росту на нефти, дизельном топливе, мазуте и гексадекане. Использование нафталина в качестве единственного источника углерода и энергии было обнаружено у штаммов 825, 142КР и Р701, причем, только два последних микроорганизма способны утилизировать салицилат. Штаммы 825, 867, Р701, 5 и 1В обладали способностью использовать толуол в качестве единственного источника углерода и энергии. Следует отметить, что все исследуемые штаммы не способны к деструкции камфары, гентизата, м-/о-/п-ксилола, капролактама, этилбензола и 3,4-дигидроксибензоата. Штамм Р701 деградировал фенантрен. Деструкция октана, декана, нонана не была выявлена у штаммов микроорганизмов 1А, 4, 142КР и Р701. Разрушение бензоата было обнаружено у штаммов бактерий 867, Х5, Х25, 142КР и Р701 (см. табл. 1). Таким образом, исследованные штаммы способны утилизировать различные субстраты (см. табл. 1), что необходимо для подбора микроорганизмов при составлении микробных консорциумов. Как известно, смешанные культуры микроорганизмов могут взаимодействовать между собой, посредством кооперации, т.е. интермедиаты, полученные в результате деградации углеводородов нефти одними микроорганизмами, могут служить субстратами для других штаммов бактерий [18].

Все 17 исследованных штаммов бактерий были способны утилизировать дизельное топливо в присутствии 5 % морской соли. Причем, штаммы 142КР и 2В утилизировали дизельное топливо в присутствии 7 % соли, а микроорганизм Х5 — 10 % .

Кроме того, штаммы из коллекции ЛБП способны деградировать дизельное топливо в диапазоне рН среды 5-7, причем микроорганизмы 825, 826 и Р701 устойчивы к рН 8. Практически все бактерии из коллекции ЗАО «Биоойл»’, за исключением штаммов 2С, 3, 4 и 5, были способны к росту в жидкой минеральной среде, содержащей 2 % дизельного топлива в диапазоне рН 5-9. Для микроорганизмов 1В, 2А, 6 и 7 из данной коллекции наблюдался рост при более кислых (рН 4) и более щелочных (рН 10) показателях рН. Почти все изученные микроорганизмы способны деградировать нефть и дизельное топливо в температурном диапазоне 4-30 °С, кроме штаммов

4, 2В и 2С, которые росли при температуре 14-30 °С. Деградация нефти или дизельного топлива при температуре 42 °С была выявлена у штаммов бактерий Р701, 1В, 6, 7, 826 и 825.

Была проведена оценка роста бактерий по 3 бальной шкале в жидкой минеральной среде Эванса с добавлением различных концентрации нефти при температурах 24 и 4 °С. Следует отметить, что бактериальные штаммы 2А, 2В и 2С были не способны к росту при концентрации нефти

10 % при исследуемых температурах. При росте микроорганизмов в жидкой минеральной среде при температуре 24 °С в течение 10 суток с концентрацией нефти 30 % наилучшие показатели были отмечены только у штаммов S25, S26, 1B, 6 и F701, а при 4 °С в аналогичных условиях только штамм S26 обладал наилучшими показателями роста. Бактерии Х25 и 7, а также все ранее перечисленные штаммы, разрушают нефть в концентрации 25% при комнатной температуре, а штаммы 7, 6 и S26 деградируют аналогичную концентрацию нефти и при температуре 4 °С.

При культивировании микроорганизмов в жидкой минеральной среде с дизельным топливом в концентрации 30 % и с добавлением 3 % морской соли при температуре 24 °С наилучшие результаты были отмечены для штаммов F701,1B, S26, 2C и 6, а при 4 °С микроорганизмы 1B и S26 были способны к росту в данных условиях. Бактерии F701,1B, S26, 2C, 7 и 6 минерализовали дизельное топливо в концентрации 25 % в присутствии 3% морской соли при 24 °С, а в аналогичных условиях при низкой температуре деструкция дизельного топлива наблюдалась у штаммов F701,1B, S26, 7 и 6.

Таким образом, микроорганизмы Rhodococcus erythropolis S26, Rhodococcus sp. S25, Rhodococcus sp. Х25, 2С, Acinetobacter baumannii 1B, Serratia sp. 6, Pseudomonas putida F701, Acinetobacter baumannii 7 деградировали высокие концентрации нефти и нефтепродуктов в присутствии 3 % морской соли в диапазоне температур 4-42 °С и рН 4-10 (см. табл. 1). Это предполагает возможность их использования в засоленных природных ареалах (например, на территории нефтеразлива, где кроме нефти присутствуют минерализованные пластовые воды). Не исключено, что исследуемые штаммы способны выделять осмопротекторы, что может позволить другим микроорганизмам — нефтедеструкторам, присутствующим в среде, катаболизировать углеводороды нефти в присутствии повышенных концентраций морской соли. Выявленная у исследуемых штаммов способность к деструкции нефтяных углеводородов в кислой среде может использоваться для биоремедиации нефтязагрязненных объектов, характеризующихся повышенной кислотностью грунта [19].

Нефть и нефтепродукты являются сложными, многокомпонентными загрязнителями окружающей среды, содержащими несколько сотен различных химических соединений. При оценке степени деструкции загрязнителя для штаммов ЛБП и бактерий коллекции ЗАО «Биоойл» использовались разные типы нефти, а именно, Уфимская нефть и нефть с Московского нефтеперерабатывающего завода (Капотня), соответственно, поэтому данные представлены в двух таблицах. Изменение процентного содержания каждой фракции отражает не абсолютную величину, а изменение доли фракций в остаточном содержании нефти относительно контроля. В настоящее время известно, что окислению при благоприятных условиях могут быть подвергнуты практически любые углеводороды, причём скорость их деградации прямо зависит от вида микроорганизма [20]. Применение фракционирования на силикагеле позволяет разделить

остаточную нефть на три условные фракции [21]. Различия фракционного состава остаточной нефти в экспериментальных образцах свидетельствует

о способности изученных микроорганизмов использовать ту или иную фракцию загрязнителя в качестве источника углерода и энергии (табл. 2 и табл. 3).

Таблица 2

Степень деструкции и изменение фракционного состава нефти после ее разложения микроорганизмами из коллекции ЛБП при росте в жидкой минеральной среде с концентрацией нефти 2 % при температурах

24 и при 4 °С

Штамм Степень деструкции нефти, % Убыль фракций нефти относительно содержания в контроле, %

Гексановая фракция Бензольная фракция Бензольно- спиртовая фракция

24 ◦С 4 ◦С С ◦ 4 2 4 ◦С 24 ◦С 4 ◦С С ◦ 4 2 4 ◦С

S25 26 2S 37 22 15 26 24 3S

S26 1S 35 34 33 6 3S 6 43

S67 21 46 31 43 5 3S 12 5О

X5 13 36 2S 33 ЗО 31 13 3S

X25 2О ЗО 36 25 13 2S 13 25

142NF 9 44 21 ЗО 35 33 19 1S

F701 21 39 24 н/о 31 н/о 37 н/о

Контроль (исходная нефть) О О О О О О

Наибольшая убыль гексановой фракции при температуре 24 °С наблюдалась у штаммов Rhodococcus erythropolis S26, Rhodococcus sp. S25, Rhodococcus sp. X25, Serratia sp. 6 и Acinetobacter baumannii 7. В этих же условиях бактерии Acinetobacter baumannii 1B и Pseudomonas putida F701 эффективно разлагали асфальтено-смолистые компоненты нефти. При температуре 24°С бактерии рода Pseudomonas F701 и 142NF также эффективно разлагали углеводороды бензольной фракции. При пониженной положительной температуре способность к деградации бензольно-спиртовой фракции была отмечена у микроорганизмов Rhodococcus erythropolis S26, Rhodococcus sp. S25, Rhodococcus sp. S67, Serratia sp. 6 и Acinetobacter baumannii 1B, а у штамма Acinetobacter baumannii 7 была выявлена способность к деструкции в первую очередь лёгких фракций нефти и твёрдых парафинов.

Как видно из табл. 2, для штамма Pseudomonas sp. 142NF была отмечена наибольшая убыль бензольной фракции нефти при температуре

Таблица 3

Степень деструкции и изменение фракционного состава нефти после ее разложения микроорганизмами из коллекции ЗАО «Биоойл» при росте в жидкой минеральной среде с концентрацией нефти 2% при 24°С и при 4°С

Штамм Степень деструкции нефти Убыль фракций нефти относительно содержания в контроле, %

Гексановая фракция Бензольная фракция Бензольно- спиртовая фракция

24° С 4 °С С ° 4 2 4 °С 24 °С 4 °С 24 °С 4 °С

1А 17,9 8,8 17 21 17 н/о 23 11

1В 13,7 15,1 21 16 15 н/о 29 17

2А 14,7 11,6 21 25 5 н/о 24 10

2В 17,2 11,6 23 14 2 н/о 25 13

2С 18,8 7,8 23 13 20 н/о 26 6

3 14 10,6 16 13 12 н/о 9 16

4 11,9 7,6 15 8 1 н/о 13 15

5 14,1 8,8 19 16 6 н/о 15 12

6 12,3 15,4 26 4 16 2 13 29

7 11,5 16,4 26 31 12 н/о 17 н/о

Контроль (исходная нефть) 0 0 0 0 0 0

24 °С. Следует отметить, что при низкой температуре наблюдалась убыль бензольно-спиртовой фракции в системах с интродуцированными штаммами Rhodococcus sp. 825, Rhodococcus sp. Х5, Rhodococcus sp. 825, Rhodococcus sp. 826, Rhodococcus sp. 867, 3, 4 и 6. Штаммы Р701, 1А, 1В, 2А, 2В и 2С наиболее эффективно разлагали асфальтено-смолистые компоненты нефти при комнатной температуре. В процессе анализа результатов табл. 2 и 3, было выявлено, что многие штаммов при температуре 4 °С деградировали в большей степени углеводороды бензольно-спиртовой фракции, а при комнатной температуре эти же штаммы наиболее эффективно разлагали гексановую фракцию.

Одной из причин высокой устойчивости нефтепродуктов в окружающей среде является их ограниченная растворимость в водных средах. Поэтому такие соединения малодоступны для микроорганизмов и с трудом подвергаются биодеградации. Однако известно, что при культивировании в минеральных средах с использованием в качестве источника углерода и энергии различных нефтепродуктов некоторые микроорганизмы синтезируют биоэмульгаторы, повышающие эффективность биоутилизации. Рассматривая физиологическое значение биосурфактантов, важно подчеркнуть, что они продуцируются широким спектром разнообразных

микроорганизмов и имеют различную химическую структуру и поверхностные свойства. Поэтому уместно допустить, что разные типы биосурфактантов играют различную роль в физиологии продуцирующих их микроорганизмов. Вполне вероятно, что одни биосурфактанты будут обеспечивать преимущество в развитии конкретных продуцентов в определенной экологической нише, тогда как другие будут более эффективны при других экологических условиях [22]. Поскольку углеводородокисляющие микроорганизмы растут на границе раздела фаз «углеводород/вода», синтез эмульгаторов при высокой клеточной плотности увеличивает площадь поверхности углеводородных капель, создавая оптимальные условия питания для большего числа бактерий. В то же время при использовании такого сложного субстрата, как сырая нефть, по окончании процесса ферментативного окисления её легкодеградируемых фракций присутствие эмульгатора позволяет бактериям отсоединяться от «использованной» нефтяной капли и переходить к «свежему» субстрату [23]. Недавние исследования указывают на то, что существует горизонтальный перенос высокомолекулярных биоэмульгаторов от продуцирующих бактерий к гетерологичным микроорганизмам [24]. Такой перенос биоэмульгаторов от представителя одного бактериального вида или даже рода к другому имеет большое значение в природных микробных сообществах. Большинство биосурфактантов изученных микроорганизмов-деструкторов были связаны с клеточной стенкой, так как оптическая плотность культуральной жидкости после центрифугирования в присутствии гексадекана была низкой.

Также были обнаружены эмульгаторы, несвязанные с клеточной стенкой, выделяемые штаммами 2В, 826, 867, 142КР, Х25, Р701 и 5. Исследованные штаммы продуцируют биоэмульгаторы разных типов, что, несомненно, является одним из важных аспектов при выборе штаммов для создания биопрепаратов для очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов. Ранее показано, что максимальная эмульгирующая способность микроорганизмов проявлялась через 12-30 часов культивирования [25]. Поэтому в нашей работе для оценки эмульгирующей активности штаммов определяли индекс эмульгирования при росте на гидрофобном субстрате через 24 часа. Были отмечены штаммы, продуцирующие наибольшее количество биологических поверхностно-активных веществ: 1В, 7, Х5, 826, 867 и Р701.

Важным критерием отбора микроорганизмов для составления консорциума было наличие катаболических плазмид. Бактерии, содержащие плазмиды биодеградации, обладают рядом преимуществ в составе биопрепаратов для биоремедиации. Прежде всего, плазмидосодержащие штаммы обладают расширенным спектром утилизируемых углеводородов нефти. В тоже время, интродукция микроорганизмов - эффективных деструкторов нефти, может значительно увеличить деградативный потенциал аборигенной микрофлоры, так как при взаимодействии бактерий в окружающей среде происходит обмен генетической информацией [26].

Показано, что в сайтах, загрязненных нефтепродуктами, происходит увеличение популяции микроорганизмов, содержащих катаболические плазмидв. В ЛБП ИБФМ РАН показано широкое распространение плазмид среди штаммов Pseudomonas, контролирующих деградацию полициклических ароматических углеводородов [27]. Конъюгативные плазмиды деградации углеводородов при интродукции в загрязненный сайт бактерий, содержащих эти плазмиды, способны распространяться среди аборигенных микроорганизмов. В настоящей работе в результате скрининга 17 штаммов, обнаружены плазмидные ДНК у В штаммов-деструкторов (рис. 1).

I

АВР _

И

§" I

123456 78

Рис. 1. Электрофореграмма плазмидных ДНК штаммов-деструкторов:

1 — Rhodococcus sp. X25; 2 — Rhodococcus sp. S25; 3 — Pseudomonas putida F701; 4 — Acinetobacter baumannii 7; 5 — Serratia sp. 6; 6 — Acinetobacter baumannii 1B; 7 — Rhodococcus erythropolis S26; 8 — штамм 4; 1 т.п.н.

ДНК-маркер, A Ladder PFG маркер

Плазмида биодеградации нафталина pNF142 в штамме Pseudomonas sp. 142NF (pNF142) описана ранее [28]. Присутствие плазмид у двух штаммов Pseudomonas еще раз подтверждает известные данные о значительном метаболическом потенциале, определяемом плазмидами [29]. Для выяснения возможности локализации генов биодеградации нафталина (F701) или гексадекана (1В, 4, 6, 7, S26, X25 и S25) на плазмидах, выявленных

у исследуемых бактерий, были проведены эксперименты по спонтанной элиминации плазмид путем культивирования штаммов в неселективных условиях (ЛБ-среда). В результате было установлено, что длительное культивирование в богатой среде микроорганизмов Pseudomonas putida F701 и 4 приводило к появлению в популяциях бесплазмидных вариантов. У полученных элиминантов отсутствовала способность к деградации нафталина и гексадекана соответственно.

Микроорганизмы 7 и F701 содержат конъюгативные катаболические плазмиды и, таким образом, способны увеличивать деградативный потенциал почвенных микробных популяций за счет распространения генов среди аборигенных бактерий. Даже в том случае, если эти микроорганизмы после интродукции в окружающую среду окажутся неконкурентоспособными и постепенно элиминируются, тем не менее, они могут быть донорами катаболических генов вследствие конъюгационного переноса плазмид. В данной работе показано наличие плазмидных ДНК в штаммах 4, Acinetobacter baumannii 1B, Serratia sp. 6, Rhodococcus erythropolis S25 и Rhodococcus erythropolis S26. Было показано, что выявленные плазмидные ДНК стабильно наследовались у штаммов 1В, 6, 7, S26, X25 и S25. В результате инкубации клеток бактерий 1В, 6, 7, S26 и S25 в присутствии бромистого этидия (10 мкг/мл) были получены элиминанты, утратившие способность расти на средах, содержащих гексадекан. Высокая частота элиминации признака деструкции гексадекана при обработке элиминирующие агентом позволила предположить плазмидный контроль деградации поллютанта у этих штаммов. Если обнаруженные плазмидные ДНК окажутся неконъюгативными плазмидами, контролирующими деградацию углеводородов нефти, они также могут участвовать в распространении катаболических генов путем трансформации. Например, когда клетка-хозяин погибает и лизируется, ДНК с катаболическими генами попадает в окружающую среду и некоторое время может в ней сохраняться. При контакте с подходящим новым бактериальным хозяином путем трансформации ДНК может встраиваться в генетическую систему микробной клетки [26]. Поэтому включение в состав биопрепарата микроорганизмов, содержащих конъюгативные и даже неконъюгативные плазмиды биодеградации, представляется перспективным аспектом при разработке новых технологий биоремедиации.

Составление ассоциации для очистки почвы от нефти

и нефтепродуктов

Известно, что при применении ассоциаций микроорганизмов биодеградация нефти происходит более эффективно и за меньшие сроки, чем при использовании индивидуальных бактерий [30]. Этот факт можно объяснить тем что, обладая разными ферментными системами, при совместном действии микроорганизмы, входящие в состав

ассоциации, способны разлагать углеводороды с большей эффективностью. Для составления микробного консорциума углеводородов нефти были использованы два этапа: 1) анализ и последующее комбинирование

физиологических, метаболических и деструктивных свойств штаммов (табл.

4); 2) смесь выбранных на первом этапе штаммов выращивали в жидкой минеральной среде в условиях периодического культивирования с нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии.

Таблица 4

Критерии отбора микроорганизмов для составления ассоциации

Критерии отбора микроорганизмов Микроорганизмы

рН среды 4-9* 1А, 1В, 2А, 2B, б, Т, S25, S26 и F701

5 % МаС1* 1А, 1В, 2А, 2B, 2C, 3, 4, 5, б, Т, Х5, Х25, S25, S26, SбТ, 142NF и F701

Температура 2-42 °С* 1В, б, Т, S25, S26 и F701

Концентрация нефти 30% при 24 °С 1В, б, Т, Х25, S25, S26 и F701

Концентрация нефти 20 % при 4 °С б, Т, S25, S26 и F701

Концентрация дизельного топлива 30 % при 24 °С 1В, 2C, б, Т, S26 и F701

Концентрация дизельного топлива 30 % при 4 °С 1В, б, Т, S26 и F701

Активный продуцент биосурфактантов 1В, Т, Х5, S26, SбТ и F701

Наличие плазмидной ДНК 1В, 4, б, Т, S26, X25, S25, 142NF и F701

* — способность утилизировать углеводороды нефти в указанных условиях

На основании первого этапа были отобраны штаммы S26, S25, 1В, 6, F7G1 и 7. На втором этапе смесь отобранных штаммов культивировали в жидкой минеральной среде с 15 % нефти при рН среды 5 в течение 1G суток при температурах 4 °С и 24 °С. Бактерии Rhodococcus erythropolis S26, Acinetobacter baumannii 1B, Acinetobacter baumannii 7 и Pseudomonas putida F7G1 имели преимущества в скорости роста, доминировали в смешанной популяции. Поэтому перечисленные микроорганизмы были отобраны в состав микробного консорциума. Штаммы бактериального консорциума были определены по совокупности морфологических характеристик и сравнению гена 16S РНК с известными последовательностями. Данные нуклеотидные последовательности были депонированы в Международном банке данных последовательностей GenBank под номерами: Rhodococcus erythropolis S26 - KF43G613, Acinetobacter baumannii 1В - KF498713, Acinetobacter baumannii 7 - KF498715 и Pseudomonas putida F7G1 - KF498711.

Таким образом, были разработаны критерии составления микробных консорциумов и на их основе получена эффективная ассоциация плазмидосодержащих штаммов-деструкторов углеводородов нефти. Отличительными свойствами отселектированного консорциума является

то, что штаммы, входящие в его состав, способны к деградации высоких концентраций нефти (до 30 %) в широких диапазонах температур (4-42 °С) и рН (4-10). Все микроорганизмы консорциума являются продуцентами биосурфактантов, снижающих вязкость нефти и повышающих ее биодоступность. Наличие катаболических плазмид расширяет спектр утилизируемых субстратов клетки хозяина за счет присутствия генов, кодирующих ключевые ферменты деградации различных углеводородов нефти.

Список литературы

1. Бачурин Б.А, Авербух Л.М., Одинцова Т.А. Особенности нефтезагрязнения природных геосистем Западной Сибири // Горные науки на рубеже XXI века: матер. Междун. конф. Екатеринбург: УрО РАН, 1998. C. 400-408.

2. Бельков В.В. Стандартизация формата описаний промышленных технологий биоремедиации // Биотехнология. 2001. № 2. С. 70-76.

3. Жолобов В.Л., Новохватко Т.Н., Шумская Г.И. Проблемы, способы и средства защиты окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами // Тез. докл. конф. М., 1995. C. 73-74.

4. Щеблыкин И.Н., Биттеева М.Б., Бирюков В.В. Биовосстановление загрязненной нефтью почвы при ликвидации последствий аварии на магистральном нефтепроводе Лисичанск-Тихорецк // Трубопроводный транспорт нефти. 1995. № 3. C. 19-28.

5. Микробиологическая деструкция мазута в почве при использовании биопрепарата «Деворойл» / Д.Г. Сидоров [и др.] // Прикл. Биохимия и микробиология. 1998. Т. 34. № 3. C. 281-286.

6. Кобзев Е.Н., Петрикевич С.Б., Шкидченко А.Н. Исследование устойчивости ассоциации микроорганизмов-нефтедеструкторов в открытой системе // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. № 4. С. 413-417.

7. Шкидченко А.Н., Аринбасаров М.У. Изучение нефтедеструктивной активности микрофлоры прибрежной зоны Каспийского моря // Прикл. биохим. и микробиол. 2001. Т. 38. № 5. С. 509-512.

8. Сидоров Д.Г. Современные методы очистки территорий от нефтяных загрязнений // Материалы конференции. М.: НТЦ ЛУКойл, 1996. С. 50-54.

9. Бактериальные штаммы-деструкторы топочного мазута: характер деградации в лабораторных условиях / В.Г. Грищенков [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. № 4. С. 423-427.

10. Влияние катаболических плазмид на физиологические параметры бактерий рода Pseudomonas и эффективность биодеструкции нефти / А.А. Ветрова [и др.] // Микробиология. 2007. № 3. C. 354-360.

11. Emulsification of hydrocarbons by subsurface bacteria / D. Francy [et al.] // J. Industrial Microbiol. 1991. V. 8. № 3. P. 237-246.

12. Cirigliano M.C., Carman G.M. Isolation of bioemulsifier from Candida lipolitica // Appl. And Environ. Microbiol. 1984. P. 747-750.

13. Cooper D.G., Goldenberg B.G. Surface-active agents from two Bacillus species // Appl. Environ. Microbiol. 1987. V. 53. P. 224-229.

14. Другов Ю.С., Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов. Практическое руководство. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007. 270 с.

15. Birnboim H.C., Doly J.A. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmids DNA // Nucl. Acid. Res. 1979. V. 7. № 6. P. 1513.

16. Dunn N.W., Gunsalus I.C. Transmissible plasmid coding early enzymes of naphthalene oxidation in Pseudomonas putida // J. Bacteriol. 1973. V. 114. P. 974-979.

17. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1989. 480 p.

18. Динамика численности и взаимодействие псевдомонад, стимулирующих рост растений, и штаммов-деструкторов нафталина в ризосфере горчицы белой / А.А. Игнатова [и др.] // Биотехнология, 2006. № 6. C. 35-43.

19. Gemmell R.T., Knowlas C.J. Utilisation of aliphatic compounds by acidophilic heterotrophic bacteria. The potential for bioremediation of acidic wastewaters contaminated with toxic organic compounds and heavy metals // FEMS Microbiology Letteers. 2000. V. 192. P. 185-190.

20. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. Уфа: Изд-во БашГУ, 1995. 172 с.

21. Сафонова Г.И. Современные методы исследования нефтей. Л.:Недра, 1984. C.153-156.

22. Bodour A., Drees K.P., Maier R.M. Distribution of biosurfactant-producing bacteria in undisturbed and contaminated arid southwestern soils // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 6. P. 3280-3287.

23. Ron E.Z., Rosenberg Е. Natural roles of biosurfactants // Environ. Microbiol. 2001. V. 3. P. 229-236.

24. Osterreicher-Ravid D., Ron E.Z., Rosenberg E. Horizontal transfer of an exopolymer complex from one bacterial species to another // Environ. Microbiol. 2000. V. 2. P. 366-372.

25. Physical structure and expression of alk BA encoding alkane hydroxylase and rubredoxin reductase from Pseudomonas maltophilia / N. Lee [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V. 218. P. 17-21.

26. Прозоров А.А. Горизонтальный перенос у бактерий: лабораторное

моделирование, природные популяции, данные геномики // Микробиология. 1999. Т. 68, № 5. C. 635-646.

27. Boronin A.M., Kosheleva I.A. Diversity of naphthalene biodegradation systems in soil Bacteria. Handbook of hidrocarbon and lipid microbiology. Springer. 2009. P. 1155-1165.

28. Горизонтальный перенос плазмиды биодеградации нафталина в процессе микробной деструкции дизельного топлива и нефти в открытом проточном биореакторе / Л.И. Ахметов [и др.] // Биотехнология. 2006. № 4. C. 79-86.

29. Sayler G.S. The use of DNA: DNA colony hybridization in the rapid isolation of 4-chlorobiphenyl degradative bacterial phenotypes // Microb. Ecol. 1990. V. 19, № 1. P. 1-20.

30. Сидоренко О.Д., Войно Л.И., Павликова Т.А. Влияние нефти на микрофлору почв и подбор ассоциации микроорганизмов, способных к ее деструкции // Качество и безопасность продовольственного сырья и продуктов питания: сб.

докл. Всероссийской научно-технической конференции-выставки. М.: Изд-во

МГУП, 2002. С.176-178.

Ветрова Анна Андрияновна (vetrova123@rambler.ru), к.б.н., н.с.,

лаборатория биологии плазмид, Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Иванова Анастасия Алексеевна (anastasia_777@rambler.ru), к.б.н., н.с., лаборатория биологии плазмид, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Филонов Андрей Евгеньевич (filonov@ibpm.pushchino.ru), к.б.н., н.с., лаборатория биологии плазмид, Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Забелин Владимир Аркадиевич (zabelin53@mail.ru), к.т.н., директор ЗАО «Биоойл».

Гафаров Арслан Булатович (gafarov@ibpm.pushchino.ru), м.н.с., лаборатория биологии плазмид, Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Соколов Сергей Львович (sls@ibpm.pushchino.ru), к.б.н., н.с., лаборатория биологии плазмид, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Нечаева Ирина Александровна (pyrchenkova@rambler.ru), к.б.н.,

ассистент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Пунтус Ирина Филипповна (puntus66@mail.ru), к.б.н., н.с., лаборатория биологии плазмид, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Боронин Александр Михайлович (boronin@ibpm.pushchino.ru), д.б.н., член-корреспондент РАН, зав. лабораторией, лаборатория биологии плазмид, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Oil biodegradation by individual strains and principles for establishing the microbial consortia for oil hydrocarbons environmental clean-up

A. A. Vetrova, A. A. Ivanova, A.E. Filonov, V. A. Zabelin, A.B. Gafarov,

S.L. Sokolov, I.A. Nechaeva, A.M. Boronin

Abstract. The strains with high oil-oxidizing and bioemulsifying activity, carrying catabolic plasmids capable of oil hydrocarbons degradation in the temperature range 4-42°C at pH 4-10 in the presence of 5% salt were selected from the

Laboratory of Plasmid Biology microbial collection of IBPM RAS and collection of degrader microorganisms of JSC «Biooil». The ability of individual strains of the oil degradation was investigated under laboratory conditions. Consortium of degrader microorganisms to clean up soil and water ecosystems from oil, including a high concentration of oil products in a wide temperature and pH-range was compiled on the experimental data basis.

Keywords: biodegradability, microorganisms, plasmid, oil.

Anna Vetrova (vetrova123@rambler.ru), candidate of biological sciences, researcher, laboratory of plasmid biology, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Anastasiya Ivanova (anastasia_777@rambler.ru), candidate of biological sciences, researcher, laboratory of plasmid biology, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Andrey Filonov (filonov@ibpm.pushchino.ru), candidate of biological sciences, researcher, laboratory of plasmid biology, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Vladimir Zabelin (zabelin53@mail.ru), candidate of technical sciences, director of JSC «Biooil».

Arslan Gafarov (gafarov@ibpm.pushchino.ru), junior researcher, laboratory of plasmid biology, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Sergei Sokolov (sls@ibpm.pushchino.ru), candidate of biological sciences, researcher, laboratory of plasmid biology, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Nechayeva Irina (pyrchenkova@rambler.ru), candidate of biological sciences, assistant, department of chemistry, Tula State University.

Irina Puntus (puntus66@mail.ru), candidate of biological sciences, researcher, laboratory of plasmid biology, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Alexander Boronin (boronin@ibpm.pushchino.ru), doctor of biological sciences, corresponding member of RAS, head of laboratory, laboratory of plasmid biology, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.

Поступила 14-06.2013