Действие водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного на функциональную актив ность клеток лимфоузлов в условиях цитостатической терапии перевиваемой опухоли

ДЕЙСТВИЕ ВОДОРАСТВО РИМЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ КОРНЕВИЩ АИРА БОЛОТНОГО НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ЛИМФОУЗЛОВ В УСЛОВИЯХ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ОПУХОЛИ

К.А. Лопатина1, А.М. Гурьев2, Т.Г. Разина1, Е.Н. Амосова1,

С.Г. Крылова1, Н.В. Шилова1, Е.П. Зуева1

ГУ «НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН»1 Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск2

Продемонстрирована способность водорастворимых полисахаридов аира болотного при их изолированном введении и на фоне вызванной цитостатиком иммунодепрессии повышать активность клеток лимфоузлов по отношению к опухолевым клеткам. При трансплантации мышам совместно с опухолевыми клеток лимфоузлов, выщеленных у леченных полисахаридами аира животных, наблюдалось торможение роста и метастазирования карциномы легких Льюис.

INFLUENCE OF POLYSACCHARIDES FROM ACORUS CALAMUS RIZOMES ON FUNCTIONAL ACTIVITY OF MURINE LIMPHNODE CELLS AFTER EXPERIMENTAL TUMOR CHEMOTHERAPY Lopatina K.A.1, Guriev A.M.2, Razina T.G.1, Amosova E.N.',

Krylova S.G.1, Shilova N.V1, Zueva E.P.1

Institute of Pharmacology of Tomsk Scientific Centre, Siberian Branch of Russian Academy of Medical Science1

Siberian State Medical University, Tomsk 2

Polysaccharides from Acorus calamus L. rizomes stimulated the functional activity of tumorbearing mice’s lymphnode cells, even after cytostatic immunodepression. Transplantation of untreated mice tumor cells with lymphnode cells from tumorbearing mice after polysaccharide therapy led to inhibition of lung Lewis carcinoma growth and metastasing.

Полисахариды - самые распространенные в природе биополимеры, в том числе входящие в состав клеточной стенки высших растений. Они разнообразны по структуре, физико-химическим свойствам, могут быть малорастворимыми и нерастворимыми в воде, малотоксичными или нетоксичными, в отличие от липополисахаридов и других комплексных углеводов, не обладают антигенными и пирогенными свойствами [4]. Полисахариды растительного происхождения оказывают противовоспалительное [11], обволакивающее, спазмолитическое [8], ранозаживляющее [6], противогрибковое действие [2]. В проведенных ранее экспериментах выявлена способность водорастворимых полисахаридов (ВРПС) корневищ аира болотного повышать эффективность цитостати-

ческой терапии перевиваемых опухолей, а также самостоятельно ингибировать развитие злокачественных новообразований [7]. Известно, что характер развития злокачественного новообразования во многом зависит от состояния лимфатических узлов - первого физиологического барьера на пути распространения опухолевых клеток. С целью выгяснения вопроса о механизме продемонстрированной активности ВРПС аира в настоящем исследовании изучено их влияние на функциональную активность клеток лимфоузлов у мышей с карциномой легких Льюис в тесте нейтрализации опухолевых клеток Винна [14], который позволяет интегрально оценить состояние системы противоопухолевой защиты организма у животных после лечебнык воздействий.

Материал и методы

Исследование проведено на 57 мышах-самках линии С57В1/6, полученных из лаборатории экспериментального биомоделирования ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). В качестве доноров лимфоидных клеток использовали мышей-самок линии С57В1/6 с карциномой легких Льюис (ЬЬС), которую трансплантировали гомогенатом опухолевой ткани в стерильном физиологическом растворе по 5х106 опухолевых клеток в 0,1 мл внутримышечно [7]. У животных-доноров по окончании курса лечения ВРПС корневищ аира болотного (50 мг/кг х 10, внутрибрюшинно, начиная с 7-х сут развития опухоли) и введения циклофосфана (125 мг/кг однократно внутрибрюшинно, на 11-е сут после перевивки ЬЬС) выделяли подмышечные лимфоузлы, гомогенизировали их и смешивали с клетками карциномы легких Льюис в соотношении (1: 10)х106, после чего полученную взвесь трансплантировали мышам-реципиентам - самкам линии С57В1/6. Контрольной группе перевивали только взвесь опухолевых клеток. На 26-е сут эксперимент заканчивали, животных умерщвляли методом дислокации шейных позвонков, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные М3 РФ. После этого определяли массу первичного опухолевого узла, количество метастазов на одну мышь, их среднюю площадь, вычисляли процент торможения роста опухоли (ТРО), частоту метастазирования [9]. Индекс ингибирования метастазирования (ИИМ) вычисляли по формуле ИИМ= =[(А1хВ1) - (А2хВ2)]/ (А1хВ1), где А1, А2 - частота метастазирования в контроле и в опыте, В1, В2 - количество метастазов на 1 животное в контрольной и в опытной группе [1]. Достоверность полученных результатов определяли с помощью непараметрического критерия Вилкоксо-на - Манна - Уитни и точного теста Фишера [5].

Результаты и обсуждение

Полученные от интактных животных клетки лимфоузлов при совместной трансплантации с карциномой легких Льюис не повлияли на рост опухолевого узла: его масса не отличалась от таковой в контрольной группе мышей. Однако обнаружено, что при введении клеток лимфоузлов интактных мышей несколько снижались показатели метастазирования перевитой вместе с ними опухоли по сравнению с контрольными значениями: отмечалась тенденция к уменьшению количества метастатических узлов (в 1,2 раза) и их площади (таблица). Клетки лимфоузлов -популяция, богатая клетками-эффекторами различных звеньев иммунитета, наиболее многочисленны среди них Т-лимфоциты. Т-клетки становятся сенсибилизированными и готовыми к реализации специфического иммунного ответа лишь в лимфоидных органах: лимфатических узлах, протоках и селезенке, где происходит антигензависимая дифференцировка лимфоцитов (иммунный ответ или прайминг), после которой разворачиваются эффекторные реакции по элиминации антигена [13]. По-видимому, клетки лимфоузлов интактных животных, у которых не было опухоли, а значит, и первичной антигенной стимуляции, оказались не готовы к нейтрализации злокачественного новообразования, как показали результаты эксперимента.

При добавлении клеток лимфоузлов от нелеченых животных с карциномой легких Льюис к перевиваемой опухоли количество метастазов достоверно увеличивалось в 1,7 раза относительно показателей в группе мышей, которым трансплантировали опухоль с лимфоидными клетками интактных животных, наблюдалась тенденция к увеличению площади метастатического поражения. Индекс ингибирования метастазирования в этой группе имел отрицательное значение и составил - 43 % (таблица), что также свидетельствует о снижении активности лимфоидных клеток по отношению к опухолевым в результате развития у мышей карциномы легких Льюис.

Как известно, одним из важных факторов опухолевого роста является дефектность иммунного отве-

Действие водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного на функциональную активность клеток лимфоузлов в условиях цитостатической терапии перевиваемой опухоли

Таблица

Функциональная активность клеток лимфоузлов мышей-самок линии С57Б1/6 с карциномой легких Льюис после введения циклофосфана и водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного

Группа наблюдения (количество животных) Масса опухоли (Х±ш) , г Тормо- жение роста опухоли, % Частота метастазирования, % Количество метастазов на 1 мышь (Х±т) Площадь метастазов на 1 мышь (Х±т), мм2 ИИМ,%

1.Контроль (9) 5,55±0,22 - 100 32,8±5,2 121,3±41,0 -

2. Опухоль + лимфоузлы интактных мышей (10) 5,70±0,15 -3 100 28,1±3,1 105,4±23,5 14

3.Опухоль + лимфоузлы нелеченых мышей с ЬЬС (9) 5,70±0,36 -3 100 46,8±8,2 2-3р<0,05 177,5±46,0 -43

4. Опухоль + лимфоузлы леченных ЦФ мышей (9) 6,47±0,30 3-4р<0,05 -17 100 35,3±2,6 171,2±17,6 -8

5. Опухоль + лимфоузлы леченных ВРПС аира мышей (10) 4,50±0,51 3-5р<0,05 19 100 28,7±4,7 3-5р<0,05 113,9±26,0 13

6. Опухоль + лимфоузлы леченных ЦФ и ВРПС аира мышей (10) 4,03±0,40 3-6р<0,01 4-6р<0,01 27 100 27,3±2,6 3-6р<0,05 52,6±12,6 3-6р<0,05 4-6р<0,01 17

Примечание: перед уровнем значимости р указаны номера сравниваемых групп.

та, что проявляется в его неадекватной инициации, и, как следствие, развитии иммуносупрессии. Механизмы «ускользания» опухоли от иммунологического надзора разнообразны.

Так, в литературе есть сведения о существовании популяции незрелых кроветворных клеток, так называемых естественных супрессорных клеток (ЕСК), способных подавлять пролиферацию иммунокомпе-тентных клеток неспецифически, то есть без предварительного контакта с мишенями и распознавания по антигенам комплекса гистосовместимости. Показано, что сама опухоль вырабатывает факторы, стимулирующие ЕСК, которые, в свою очередь, угнетают противоопухолевый иммунитет [3]. Результаты нашего исследования являются подтверждением того, что опухоль в организме мышей-доноров действует на клетки лимфоузлов таким образом, что они теряют способность к эффекторной элиминации злокаче-

ственно измененных клеток, более того, они способствуют процессу метастазирования трасплантирован-ной совместно с ними карциномы легких Льюис, что выражалось в достоверном увеличении количества метастатических колоний в легких животных-реципи-ентов.

Следующий этап эксперимента позволил оценить влияние ВРПС корневищ аира болотного при изолированном применении и в комбинации с циклофос-фаном на функциональную активность клеток лимфоузлов мышей с ЬЬС. В начале опухолевой агрессии в определенной части организма быстро развивается воспаление, в которое вовлекается регионарный лимфатический узел. Это сопровождается временной задержкой в нем рециркулирующих лимфоцитов, преимущественно Т-класса. Известно, что около 70 % клеток лимфатических узлов представлено Т-клетками, из них около 30 % составляют Т-киллеры

(CD8+) и около 40 % - T-хелперы (CD4+). В регионарном лимфатическом узле избирательно скапливаются Т-клетки тех клонов, которые распознают антиген и которым предстоит реагировать на него [10]. Полисахариды корневищ аира болотного, по-видимому, способствуют процессу формирования специфического иммунного ответа по Т-типу, что подтверждается полученными результатами. При трансплантации опухоли совместно с клетками лимфоузлов мышей, леченных полисахаридами аира болотного, отмечалось снижение массы опухолевого узла (в 1,3 раза, р<0,05) по сравнению с соответствующим контролем. Активированные клетки лимфоузлов мышей, леченных полисахаридами аира, тормозили диссеминацию опухоли, что выражалось в снижении числа метастазов в легких в 1,6 раза (р<0,05) относительно этого показателя в группе животных, которым опухоль перевивали совместно с клетками лимфоузлов нелеченых мышей.

Способность Т-киллеров отвечать на злокачественно измененные клетки также зависит от наличия на их мембранах молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС - Major Histocompatibility Complex). Молекулы MHC класса I, экспрессируемые на опухолевой клетке в неизменном виде, присущи всем тканям организма-хозяина и необходимы для дифференцировки иммуноцитами «своего» от «чужого». Именно факт наличия МНС I становится одним из способов «ускользания» опухоли от иммунного надзора. Однако у злокачественных клеток на поверхности появляются и молекулы МНС I в измененной форме, которая эффективно распознается Т-киллером, уничтожающим в дальнейшем трансформированную клетку. Чем выше экспрессия на мембране опухолевой клетки специфичных только для нее молекул МНС I, являющихся активаторным сигналом для киллеров, тем эффективнее процесс уничтожения злокачественного новообразования [10]. Показано, что растительные полисахариды способны увеличивать экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости на поверхности опухолевых клеток [12]. Можно предположить, что исследуемые ВРПС аира болотного могут усиливать противоопухолевую защиту организма, участвуя в описанных процессах.

Циклофосфан имеет широкий спектр противоопухолевой активности, реализующийся за счет угнетения митоза интенсивно пролиферирующих тканей, как злокачественно перерожденных, так и здоровых, в том числе и лимфоидной, что приводит к глубокой иммунодепрессии. Под влиянием цитостатика в данном эксперименте наблюдалось снижение функциональной активности тестируемых клеток: масса опухолевого узла мышей, которым были введены клетки лимфоузлов от получавших циклофосфан мышей с ЬЬС, была достоверно больше на 17 %, чем в группе животных, которым трансплантировали смесь лимфоидных и опухолевых клеток нелеченых мышей.

При комбинированной терапии циклофосфаном и полисахаридами аира наблюдалась стимуляция активности клеток лимфатических узлов: после их перевивки совместно с опухолью достоверно снижалась ее масса относительно группы животных, которым трансплантировали совместно с ЬЬС лимфоидные клетки леченных циклофосфаном мышей (р<0,01). Следует отметить, что после введения цитостатика клетки лимфоузлов не оказывали влияния на изменение такого показателя их активности, как количество метастатических узлов, тогда как лимфоузлы мышей после курсового лечения ВРПС на фоне циклофос-фана обладали способностью ингибировать образование метастазов перевитой совместно с ними опухоли (таблица).

Таким образом, одним из механизмов действия водорастворимых полисахаридных комплексов корневищ аира болотного при сочетанном применении с циклофосфаном для лечения перевиваемых опухолей является их активирующее влияние на клетки лимфоузлов, в состав которых, как известно, на 70 % входят Т-лимфоциты. Использование ВРПС корневищ аира болотного может обеспечить дополнительное разрушающее воздействие на опухоль путем повышения эффективности специфического противоопухолевого иммунного ответа.

ЛИТЕРАТУРА

1. Архипов С.А., Юнкер В.М., Грунтенко Е.В. Изменение интенсивности метастазирования в легкие перевиваемых опухолей мышей в зависимости от величины перевивочной дозы опухолевых клеток // Исследование по индукции и мета-

Действие водорастворимых полисахаридов корневищ аира болотного на функциональную активность клеток лимфоузлов в условиях цитостатической терапии перевиваемой опухоли

стазированию опухолей у экспериментальных животных. Новосибирск, 1984. С. 14-32.

2. Белоусов М.В. Новые фармакологические свойства сырья Ledum palustre L. флоры Сибири и возможности его комплексного использования // Растительное сырье. 1998.

Вып. 3. С. 23-25.

3. Белъский Ю.П. Механизмы регуляции активности естественных супрессорных клеток в норме и при опухолевом росте: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Томск, 2004. 38 с.

4. Беседнова Н.Н., Иванушко Л.А., Звягинцева Т.Н. и др. Иммунотропные свойства 1 - 3; 1 - 6-в^-глюканов // Антибиотики и химиотерапия. 2000. № 2. С. 37-44.

5. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. Л.,1978. 193 с.

6. Лазарева Е.Б., Спиридонова Т.Г., Чернега Е.Н. и др. Эффективность местного применения пектинов в лечении ожоговых ран // Антибиотики и химиотерапия. 2002. № 9. С. 9-13.

7. Лопатина К.А., Гуръев АМ. Влияние водорастворимых полисахаридных комплексов растительного происхождения на эффективность цитостатической терапии перевиваемых опухолей // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии: Материалы конференции. Томск, 2005. С. 23-25.

8. Салъникова Е.Н. Исследование полисахаридного ком-

плекса полыни горькой, п. Сиверса, п. якутской // Теоретические и практические аспекты изучения лекарственных растений. Томск, 1996. С. 139.

9. Софъина З.П., Сыркин А.Б., Голдин А., Кляйн А. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. М.: Медицина, 1980. 296 с.

10.Хаитов Р.М. Взаимодействие клеток иммунной системы: физиологические и медицинские аспекты иммунитета // Аллергия и клиническая иммунология. 1999. № 1. С. 6-20.

11.Bae J., Ahn S., Yim H. et al. Prevention of intraperitoneal adhesions and abscesses by polysaccharides isolated from Phellinus spp. in a rat peritonitis model // Annals of Surgery. 2005. Vol. 241, № 3. P. 534-540.

12.Iguchi C., Nio Y., Takeda H. et al. Plant polysaccharide PSK: cytostatic effects on growth and invasion; modulating effect on the expression of HLA and adhesion molecules on human gastric and colonic tumor cell surface // Anticancer research. 2001. Vol. 21. P. 1007-1013.

13.Jaheway C.A., Travers P. Immunology: The immune system in health and sisease / Second ed. Publishing Inc, 1996. 235 p.

14.Winn H.J. Mechanisms in Homotransplantation. 2. Quantitative Assay of the Immunologic Activity of lymphoid cells stimulated by Tumor Homografts // J. Immunol. 1961. Vol.

86, № 2. P. 228-241.

Поступила 10.04.06