Микроводоросль Streblonema sp. в качестве сырья для получения ламинарана и способ повышения его содержания в микроводоросли Streblonema sp.
MICROALGA STREBLONEMA SPHAERICUM AS RAW MATERIAL FOR LAMINARAN PRODUCTION AND METHOD FOR INCREASING ITS CONTENT IN MICROALGAE STREBLONEMA SPHAERICUM

Изобретения относятся к биотехнологии и могут быть использованы, в частности, для получения биологически активного соединения – природного полисахарида ламинарана.
Ламинараны (или ламинарины) являются эффективными иммуностимуляторами растений, животных и человека, проявляют антилипемический эффект, оказывают радиопротекторное, противоопухолевое, противовирусное и антибактериальное действие, используются как криопротекторы. Ламинараны относятся к запасным полисахаридам бурых водорослей и представляют собой низкомолекулярные 1 → 3; 1 → 6β-D- глюканы, гетерогенные по молекулярным массам, расположению и содержанию β -1--->6-связанных остатков глюкозы.
Известно, что одним из наиболее богатых и легко возобновляемых источников широко известных, интересных по структуре и биологической активности водорастворимых полисахаридов: ламинаранов и фукоиданов являются бурые водоросли.
A61K 35/80
В связи с этим в настоящее время сырьем для получения этих полисахаридов являются крупноталломные бурые водоросли, собираемые из естественных зарослей или выращиваемые на плантациях в открытом море, в основном виды ламинарий. Это затрудняет получение сырья с заданными свойствами, т.е. известным высоким содержанием ламинарана определенной структуры. Выход ламинарана при известных способах выделения из ламинарий, как правило, не превышает 5-11%, а из фукуса – 3,9% от сухой массы водоросли (п. РФ № 2240816, МПК, A61K 31/715, опубл. 27.11.2004; п. РФ № 2135518, МПК C08B 37/00, C08B 37/18, C07H 1/08, опубл. 27.08.1999; п. РФ № 2028153, МПК A61K 35/80, опубл. 1995; п. РФ 1642725, МПК C08B 37/18, опубл. 15.11.1983).
Кроме того, использование культивируемых водорослей для производства ламинарана ограничивается тем, что в основном хозяйства марикультуры водорослей ориентированы на производство пищевого продукта и отчуждение части урожая для производства полисахарида им экономически невыгодно.
Техническая проблема, поставленная перед изобретением, найти новый источник получения ламинарана и разработать технологический процесс, позволяющий получать значительную биомассу водоросли с высоким содержанием этого полисахарида.
Техническая проблема решается тем, что в качестве сырья для получения ламинарана предложено использовать нитчатую бурую микроводоросль Streblonema sp.
Заявителем впервые обнаружено, что в качестве альтернативного источника для получения ламинарана может быть использована нитчатая бурая микроводоросль, Streblonema sp. Эта микроводоросль выделена заявителем из талломов ламинариевых водорослей.
Установлено, что она обладает высокой скоростью роста, а благодаря своим микроскопическим размерам она может выращиваться в контролируемых условиях в фотобиореакторах, что позволяет получать биомассу с воспроизводимым химическим составом, что в конечном результате позволит снизить себестоимость конечного продукта.
Нитчатая бурая микроводоросль Streblonema sp. является эндофитом, поселяющимся внутри водоросли-хозяина, глубоко поникая в его ткани. Репродуктивные органы образуются на поверхности водоросли-хозяина. В этот период изоляция Streblonema sp. и выделение ее в свободную культуру не представляет труда.
Микроводоросль Streblonema sp. была выделена с поверхности спорофилл Alaria fistulosa. Спорофиллы с бурыми пятнами, которые представляли собой ткани водоросли, пораженные эндофитом, осушивали бумажной салфеткой, на пятно помещали каплю стерилизованной кипячением морской воды, выдерживали 20 мин, собирали и помещали в 2 мл пробирку с закручивающейся крышкой, содержащую 1,5 мл стерилизованной кипячением морской воды.
2
2
Затем пробирки, содержащие споры водоросли, выдерживали в течение 1.5 мес. при температуре 16°С и освещенности 20-25 мкЕ/м с. За это время нити водоросли становились видны невооруженным глазом. Затем водоросли пересевали на свежую среду (морская вода, обогащенная ES) в конические колбы по 1 нитчатому таллому. Водоросли выращивали в течение 1 года при температуре 16°С, освещенности 20-25 мкЕ/м с на стерилизованной морской воде, обогащенной ES, при ежемесячной смене среды. Нитчатые талломы водоросли сформировали шарообразные плотные массы до 5 см в диаметре. Идентификацию водоросли до рода производили в свободноживущей культуре и при инфицировании фрагментов спорофитов Undaria pinnatifida и Saccharina japonica.
Морфологические признаки водоросли в свободной культуре.
Нити неправильно разветвленные, клетки нитей бочонкообразные, цилиндрические прямые и изогнутые 5-12 мкм шир., с одним пластинчатым хлоропластом. Многогнездные спорангии цилиндрические, 1-3 рядные, 75-110×10-14 мкм, развиваются терминально на латеральных ветвях. Волоски имеются.
Условия хранения.
2
Свободноживущую культуру микроводоросли Streblonema sp. хранят в коллекции «Гаметофиты бурых водорослей» ЦКП Биоресурсная коллекция «Морской биобанк» ННЦМБ ДВО РАН №506171 в альгологически чистой культуре на стерилизованной морской воде, обогащенной средой ES (см. Таблица) при 8°С, освещенности около 1 мкЕ/м с. Пересев осуществляют ежемесячно.
2
2
Заявленная техническая проблема решается также тем, что обогащение микроводоросли Streblonema sp. ламинараном ведут в два этапа, на первом этапе накапливают биомассу микроводоросли Streblonema sp. путем ее культивирования на питательной среде не менее 10 суток, температуре 8-18°С и освещенности - от 35 до 100 мкЕ/м с еженедельной заменой питательной среды, на втором этапе непосредственно накапливают ламинаран в микроводоросли Streblonema sp., для чего в накопленной биомассе микроводоросли Streblonema sp. меняют питательную среду на безнитратную питательную среду, и затем на ней в течение не менее 7 суток культивируют микроводоросль Streblonema sp., при температуре 8-18°С и освещенности - от 35 до 100 мкЕ/м.
В качестве питательной среды могут использоваться, в частности, искусственная морская вода - ASP-M; морская вода, обогащенная средой ES; морская вода, обогащенная средой von Stosch; стерилизованная морская вода, обогащенная нитратом и глицерофосфатом. Рекомендуемые составы питательных (культуральных) сред представлены в таблице.
2
2
2
2
Установлено, что для нормального роста микроводоросли Streblonema sp., освещенность должна быть в диапазоне 35-100 мкЕ/м с. Освещенность ниже 35 и выше 100 мкЕ/мсингибирует рост водоросли. Снижение освещенности ниже 35 мкЕ/мс. ведет к 1.5-кратному снижению скорость роста, а увеличение освещенности более 100 мкЕ/м ведет к обесцвечиванию микроводорослей и торможению их роста.
Для достижения заявленного технического результата культивирование (выращивание) микроводоросли Streblonema sp. целесообразно вести в диапазоне температур от 8 до 18°С. При температуре ниже 8°С скорость роста крайне низкая, при температуре выше 18°С микроводоросль погибает в течение недели.
Наибольший рост микроводоросли обеспечивает температура 13-16°С.
Для накопления биомассы микроводоросли Streblonema sp. её культивирование необходимо вести не менее 10 суток.
Накопление ламинарана в биомассе микроводоросли Streblonema sp. (второй этап) обеспечивается культивированием на безнитратной питательной среде. В качестве безнитратной среды могут использоваться, в частности, питательные среды, применяемые на этапе накопления биомассы микроводоросли, но не содержащие нитраты (см. Таблица), или стерилизованная морская вода без добавления элементов минерального питания. Использование безнитратной среды приводит к повышению содержания ламинарана в 2.5–4.5 раза.
Культивирование на безнитратной питательной среде целесообразно вести не менее 7 суток, поскольку установлено, что именно, начиная с 7 дня культивирования, наблюдается значительное повышение содержания ламинарана в микроводоросли Streblonema sp.
Содержание ламинарана в биомассе микроводоросли определяют фенол-сернокислым методом (Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK (1956) Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem 1956. Vol. 28. P. 350–356) после экстракции полисахарида в водную среду (рН=1.5, HCl) при 70°С в течение часа.
Способ демонстрируется таблицей, в которой приведены составы питательных сред, использованных в примерах осуществления изобретения, для культивирования микроводоросли Streblonema sp. cоставы сред взяты из следующих работ: среда Von Stosch(Guiry, M., and Cunningham, E. 1984. Photoperiodic and temperature responses in the reproduction of the northeastern Atlantic Gigartina acicularis (Rhodophyta: Gigartinales). Phycologia 23:357–67; среда ASP-M (McLachlan, J. 1964. Some considerations of the growth of marine algae in artificial media. Can. J. Microbiol. 10:769–82); среда ЕС (Provasoli, L. 1968. Media and prospects for the cultivation of marine algae. In: Watanabe, A., and Hattori, A., eds. Cultures and Collections of Algae. Proceedings of the U.S.–Japan Conference, Hakone, Japan, September 1966. Japanese Society of Plant Physiology, pp. 63–75).
Способ осуществляют следующим образом.
2
Для получения инокулята (суспензия клеток, являющаяся исходной для клеточной культуры и используемая для посева на питательную среду) берут ранее выделенную культуру микроводоросли Streblonema sp. в виде конгломерата, измельчают до получения однородной суспензии с помощью блендера при 3000 об/мин в течение 3 минут в стерильной морской воде, обогащенной ES (см. Таблица). Затем культуру разбавляют той же средой до достижения оптической плотности суспензии, измеренной при 664 нм, равной 1. Полученную культуру разливают в колбы объемом 2 л, заполняя их на 1/3 высоты и выращивают (культивируют) в течение 2 недель при освещении люминесцентными лампами Phillips 18W 4000 K 35 мкЕ/мс фотопериодом 12 часов свет : 12 часов темнота) при непрерывном барботаже воздухом и температуре 16°С. Частичную смену среды осуществляют еженедельно. В конце периода выращивания суспензию водоросли концентрируют с помощью отстаивания и используют в качестве инокулята.
Пример 1
2
В однолитровые конические колбы наливают немодифицированную среду ASP-M (см. Таблица), добавляют в неё инокулят микроводоросли Streblonema sp. и культивируют при освещении люминисцентными лампами Phillips 18W 4000К 50 мкЕ/м (с фотопериодом 12 часов свет : 12 часов темнота) при непрерывном барботаже воздухом и температуре 16°С. Объем культуры в колбах составлял 0.6 л, начальная плотность культуры 0.74 г микроводорослей/л (или 0.09 г сухой массы/л). Культивирование ведут в течение 10 суток, через неделю питательную среду обновляют. Биомасса микроводорослей за этот период увеличивается в 2.8 раза.
Биомасса микроводоросли содержит 7.4±0.9% ламинарана от сух. массы.
2
Полученную биомассу микроводорослей используют для накопления в ней ламинарана. В накопленной биомассе микроводорослей проводят смену культуральной среды на безнитратную питательную среду. Для чего аккуратно с помощью трубочки сливают около 0.5 л среды и добавляют модифицированную среду ASP-М, не содержащую нитратов (см. Таблица), и затем на ней в течение 10 суток культивируют микроводоросль Streblonema sp. при постоянном барботировании воздухом, температуре 16°С и освещенности – 35 мкЕ/м. Содержание ламинарана в микроводоросли составляет, % от сух. мас. 21.9±3.0 или 43.3±4.5 мг/л.
Пример 2
2
В двухлитровые конические колбы наливают стерильную морскую воду, обогащенную средой ES (см. Таблица), добавляют в неё инокулят микроводоросли Streblonema sp. и культивируют при освещении люминесцентными лампами Phillips 18W 4000 К 35 мкЕ/м (с фотопериодом 12 часов свет : 12 часов темнота), без барботажа воздухом и температуре 18°С. Объем культуры в колбах составлял 1 л, начальная плотность культуры 0.4 г микроводорослей/л (или 0.05 г сухой массы/л). Культивирование ведут в течение 14 суток, через неделю питательную среду обновляют. Биомасса микроводорослей за этот период увеличивается в 2.9 раза.
Содержание ламинарана в биомассе составляет 6.2±1.8 % от сух. массы водорослей.
2
Полученную биомассу микроводорослей используют для накопления в ней ламинарана. В накопленной биомассе микроводорослей проводят смену культуральной среды на среду с низким содержанием нитрата. Для чего аккуратно с помощью трубочки сливают около 0.8 л среды и добавляют модифицированную среду ASP-М, не содержащую нитратов (см. Таблица), и затем на ней в течение 7 суток культивируют микроводоросль Streblonema sp. при температуре 18°С, без барботажа воздухом и освещенности – 35 мкЕ/м. Содержание ламинарана в микроводоросли составляет 16.3±2.3% сух. массы или 24.6±3.9 мг/л.
Пример 3
2
В однолитровые конические колбы наливают стерильную морскую воду, обогащенную средой von Stosch (см. Таблица), добавляют в неё инокулят микроводоросли Streblonema sp. и культивируют при освещении люминесцентными лампами НЛ-HS-105Вт-6500K 100 мкЕ/м (с фотопериодом 12 часов свет : 12 часов темнота) и температуре 8°С. Объем культуры в колбах составлял 0.6 л, начальная плотность культуры 0.3 г микроводорослей/л (или 0.036 г сухой массы/л). Культивирование ведут в течение 14 суток, через неделю питательную среду обновляют. Биомасса микроводорослей за этот период увеличивается в 5 раз.
Содержание ламинарана в биомассе составляет 2.1±0.6 % от сух. массы водоросли.
2
Полученную биомассу микроводорослей используют для накопления в ней ламинарана. В накопленной биомассе микроводорослей проводят смену культуральной среды на среду с низким содержанием нитрата. Для чего аккуратно с помощью трубочки сливают около 0.5 л среды и добавляют стерильную морскую воду, и затем на ней в течение 14 суток культивируют микроводоросль Streblonema sp. при температуре 8°С и освещенности – 100 мкЕ/м. Содержание ламинарана в микроводоросли составляет, 8.6±1.2% сух. мас. или 18.7±3.6 мг/л.
Дальнейшее выращивание на безнитратной среде (до 21 дня) позволяет увеличить выход ламинарана до 16±2.5% от сух. массы водоросли.
Пример 4
2
В однолитровые конические колбы наливают стерильную морскую воду, к которой добавлен нитрат натрия (0.4252 г/л) и натрия глицерофосфат (0,0536 г/л), добавляют в неё инокулят микроводоросли Streblonema sp. и культивируют при освещении люминесцентными лампами НЛ-HS-105Вт-6500K 100 мкЕ/м (с фотопериодом 12 часов свет : 12 часов темнота) и температуре 8°С. Объем культуры в колбах составляет 0.6 л, начальная плотность культуры 0.4 г микроводорослей/л (или 0.048 г сухой массы/л). Культивирование ведут в течение 14 суток, через неделю питательную среду обновляют. Биомасса микроводорослей за этот период увеличивается в 3.8 раз.
Биомасса микроводоросли содержит 2.2±0.4 % ламинарана от сух. массы водоросли.
2
Полученную биомассу микроводорослей используют для накопления в ней ламинарана. В накопленной биомассе микроводорослей проводят смену культуральной среды на среду с низким содержанием нитрата. Для чего аккуратно с помощью трубочки сливают около 0.5 л среды и добавляют стерильную морскую воду и затем на ней в течение 14 суток культивируют микроводоросль Streblonema sp. при температуре 8°С и освещенности – 100 мкЕ/м. Содержание ламинарана в микроводоросли составляет, 5.7±1.9% сух. массы или 16.1±6.4 мг/л.
Пример 5
2
В двухлитровые конические колбы наливают стерильную морскую воду, обогащенную средой ES (см. Таблица), добавляют в неё инокулят микроводоросли Streblonema sp. и культивируют при освещении люминесцентными лампами Philips 18W 4000K 35 мкЕ/м (с фотопериодом 12 часов свет : 12 часов темнота), непрерывном барботировании и температуре 16°С. Объем культуры в колбах составляет 1 л, начальная плотность культуры 0.74 г микроводорослей/л (или 0.09 г сухой массы/л). Культивирование ведут в течение 10 суток, через 7 суток питательную среду обновляют. Биомасса микроводорослей за этот период увеличилась в 2.9 раз.
Биомасса микроводоросли содержит 11.2±1.1% ламинарана от сух. массы водоросли.
2
Полученную биомассу микроводорослей используют для накопления в ней ламинарана. В накопленной биомассе микроводорослей проводят смену культуральной среды на среду с низким содержанием нитрата. Для чего аккуратно с помощью трубочки сливают около 0.8 л среды и добавляют стерильную морскую воду и затем на ней в течение 7 суток культивируют микроводоросль Streblonema sp. при температуре 16°С, непрерывном барботировании и освещенности – 35 мкЕ/м.
Содержание ламинарана в микроводоросли составляет, 26±1.8% сух. массы или 67±6.4 мг/л.
Как видно из представленных примеров, нитчатая бурая микроводоросль Streblonema sp. может стать альтернативным источником получения биологически активного соединения – природного полисахарида ламинарана. Разработанный заявителем способ не только позволяет наработать необходимое количество биомассы микроводоросли, но и значительно повысить в ней содержание целевого продукта ламинарана.