РЕКОМБИНАНТНАЯ ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА ORF2 PCV2b В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ
RECOMBINANT EXPRESSION OF PROTEIN ORF2 PCV2b IN INSECT CELLS

Настоящее изобретение относится к области вакцин для домашнего скота, в частности к вакцинам против PCV2 для свиней. В частности, настоящее изобретение относится к клеткам насекомых, содержащим гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, экспрессирующую мутантный белок ORF2 PCV2b, к вирусоподобным частицам из мутантного белка ORF2 PCV2b, к способам получения или использования клеток насекомых или мутантного белка ORF2 PCV2b и к вакцинам для свиней.
Цирковирус 2 свиней (PCV2) является патогеном для свиней, который встречается во всем мире и причиняет много страданий животным и приводит к серьезным экономическим потерям в сельскохозяйственном секторе. В отношении обзора см. Gillespie et al. (2009, J. Vet. Intern. Med., vol. 23, p. 1151-1163).
PCV2 принадлежит к семейству Circoviridae и имеет небольшой (17 нм), икосаэдрический, не покрытый оболочкой вирион, содержащий геном в виде кольцевой одноцепочечный ДНК размером, составляющим приблизительно 1,76 т.п.н. Геном содержит только несколько открытых рамок считывания, из которых ORF2 кодирует белок вирусного капсида, который содержит основные вируснейтрализующие эпитопы.
th
th
PCV2 является относительно стойким и очень инфекционным. Он распространяется через различные виды секреций организма и может распространяться как горизонтально, так и вертикально в стаде свиней. Основными поражениями, вызванными PCV2 инфекцией, являются истощение лимфоидной ткани; результирующая иммуносупрессия также делает инфицированное животное чувствительным к вторичным или сопутствующим инфекциям. Следовательно, PCV2 участвует в ряде синдромов заболевания у свиней, которые в совокупности называются связанным с цирковирусом свиней заболеванием (PCVAD). Наиболее выраженным PCVAD является «синдром послеотъемного мультисистемного истощения» (PMWS), наблюдаемый у молодых свиней. Клинические признаки и патология PMWS включают прогрессирующее истощение, одышку, тахипноэ, и иногда желтуху и желтуху. Другими PCVAD являются комплекс респираторных заболеваний свиней, синдром дерматита и нефропатии у свиней, нарушение репродуктивной функции, гранулематозный энтерит, врожденное дрожание и экссудативный эпидермит. Ради обзора см. Merck Veterinary Manual, 11 ed., 2016, ISBN: 9780911910933; и “Diseases of Swine”, 10 ed., 2012, ISBN: 9780813822679.
Однако без вторичной инфекции у большинства свиней, инфицированных PCV2, могут отсутствовать четкие клинические симптомы заболевания, за исключением слабого роста и продуктивности у явно здоровых свиней. (Суб-)Клинические симптомы PCVAD, вызванные PCV2, могут наблюдаться у свиней, как правило, начиная с 3 или 4-недельного возраста, т.е. времени, когда поросят отнимают от груди, и защитные антитела материнского происхождения начинают снижаться.
Для защиты от PCV2 инфекции и связанных с ней признаков заболевания в распоряжении имеется несколько коммерческих вакцин, которые используются во всем мире в очень больших количествах. К различным типам вакцин против PCV2 относятся, например: вакцина на основе инактивированного целого вируса PCV2 (Circovac™, Merial) или на основе инактивированного химерного PCV1/PCV2 вируса (Suvaxyn™ PCV, Fostera™ PCV, Zoetis). Однако наиболее распространенной является субъединичная вакцина на основе рекомбинантного экспрессированного капсидного белка PCV2, обычно называемого белком ORF2 (Ingelvac™ CircoFLEX, Boehringer Ingelheim; и: Circumvent™ PCV, Porcilis™ PCV, MSD AH). Субъединичную вакцину на основе белка ORF2 обычно получают путем экспрессии гена ORF2 PCV2 в рекомбинантной экспрессионной системе; самой используемой является бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых. Экспрессированный белок ORF2 подвергается самосборке в вирусоподобные частицы (VLP), которые напоминают нативный PCV2 вирион, за исключением того, что в нем отсутствует содержимое в виде вирусного генома, и, следовательно, он не способен к репликации. Вакцины на основе таких VLP из ORF2 PCV2 являются очень стабильными, высокоиммуногенными при приготовлении вместе с адъювантом и, как было продемонстрировано, являются безопасными для свиней всех возрастов, независимо от того, являются ли они серопозитивными по антителам против PCV2 или нет. Типичная полная доза вакцины на основе белка ORF2 PCV2 содержит приблизительно 80 мкг белка ORF2 в объеме дозы, составляющем 2 мл на животное. Однако эти субъединичные вакцины являются эффективными уже в дозе, составляющей приблизительно 20 мкг ORF2 на животное, см. EP 1926496. Также их можно вводить в качестве вакцины для однократного введения, и их можно вводить с использованием различных путей введения, таких как внутримышечный (IM), подкожный (SC) или внутрикожный (ID).
Внутри вида PCV2 существуют различные генотипы вируса. Их можно различить по генетическому расстоянию между их генами ORF2, и в прошлом использовались различные соглашения о наименовании. Однако Segales et al. (2008, Vet. Rec, vol. 162, p. 867-868) опубликовал метод, который стал стандартом, которого в настоящее время придерживаются для определения и наименования генотипов PCV2. Из 5 различных генотипов PCV2, которые распознаны в настоящее время, только три в настоящее время имеют ветеринарную значимость в данной области техники: PCV2a, PCV2b и PCV2d.
Хотя все коммерческие вакцины против PCV2 в настоящее время основаны на PCV2a, генотипы PCV2b и 2d, по-видимому, увеличиваются по распространенности в этой области. В отношении обзора см.: Karuppannan & Opriessnig, 2017, Viruses, vol. 9, p. 9, doi: 10.3390/v9050099. Хотя эти авторы пришли к выводу, что между этими генотипами существует достаточный уровень перекрестного иммунитета, предпочитают, как правило, применять типологически гомологичные вакцины. Следовательно, в этой области существует потребность в производстве безопасных, дешевых и эффективных вакцин также для генотипов PCV2, отличных от PCV2a.
В WO 2009/000459 (University Gent) описана диагностика для идентификации антигенных или патогенных вариантов PCV2 на основе белка ORF2; в частности, способы и антитела, применимые для этой цели. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот описаны для ORF2 из двух штаммов PCV2b. Предложено несколько мутаций белка ORF2 для изменения профиля распознавания моноклональными антителами. Среди множества предложенных мутаций одна представляет собой замену треонина в аминокислотном положении 131 на пролин. Однако в WO 2009/000459 раскрыто в достаточной степени только серологическое тестирование немутированных (дикого типа) штаммов PCV2a (Stoon 1010, 1121) и PCV2b (48285), и раскрыта только экспрессия немутированного ORF2 одного из штаммов PCV2a дикого типа (Stoon 1010) в клетках насекомых.
Впоследствии Saha et al., 2012 (J. of Gen. Virol., vol. 93, p. 1548-1555) описывают, среди прочего, экспрессию белка ORF2 PCV2a с мутацией T131P в клетках PK-15 путем трансфекции инфекционными клонами мутированного PCV2 генома.
В WO 2010/068969 (Vectogen) описаны способы противо-PCV2 вакцинации путем доставки ORF2 с помощью вирусного вектора, в соответствии с которыми белок ORF2 был мутирован путем замены или удаления «сигнала ядерной локализации», т.е. N-концевой 41 аминокислоты ORF2. В результате ORF2 затем становится экспрессируемым в цитоплазме или секретируется клетками, инфицированными вектором. Предпочтительным вирусным вектором является аденовирус свиньи.
В WO 2015/051099 (Boehringer-lngelheim) описаны способы увеличения уровня экспрессии белка ORF2 PCV2b и вирусоподобных частиц из него в бакуловирусной системе экспрессии в клетках насекомых путем введения мутации в кодирующую ORF2 последовательность PCV2b: раскрытая мутация представляет собой замену аргинина в аминокислотном положении 63, предпочтительно, на треонин. Нет никаких упоминаний о какой-либо мутации в аминокислотном положении 131 ORF2 PCV2b, и нет информации о каких-либо проблемах с экспрессией этого белка в клетках насекомых.
В EP 17184630 (Intervet Int. BV) раскрыто, что в случае вакцины против PCV2, как было обнаружено, белок ORF2 генотипа PCV2b обеспечивает не только гомологичный иммунитет, но также хороший перекрестный иммунитет к гетерологичным генотипам PCV2a и PCV2d. Также этот эффект неожиданно был получен даже в случае очень низких количеств, составляющих менее 20 мкг белка ORF2 PCV2b в каждой дозе для животного. Следовательно, будет достаточно вакцинировать свиней низкой дозой белка ORF2 PCV2b для обеспечения эффективной иммунной защиты от всех существующих штаммов PCV2.
Использование клеток насекомых для рекомбинантной экспрессии белка хорошо известно и применяется по-разному: экспрессии у живых насекомых, в первичных клетках насекомых или в линиях иммортализованных клеток насекомых в культуре. Наиболее используемые клетки насекомых происходят от отряда Lepidopteran (чешуекрылых), например, от родов Spodoptera или Trichoplusia. Использование этих клеток часто происходит в связи с популярной бакуловирусной системой экспрессии в клетках насекомых, причем рекомбинантный бакуловирус используется для инфицирования клеток чешуекрылых в культуре. Бакуловирус содержит ряд сильных промоторов, которые не требуются, когда вирус реплицируется в культуре клеток; а значит, они могут быть использованы для управления экспрессией гетерологичного гена.
Задачей настоящего изобретения является преодоление недостатка предшествующего уровня техники и удовлетворение потребности в данной области путем обеспечения способа оптимизации рекомбинантной экспрессии белка ORF2 PCV2 в клетках насекомых.
При исследовании приготовления вакцин против PCV2 на основе белковых субъединиц ORF2 авторы настоящего изобретения обнаружили, что рекомбинантная экспрессия белка ORF2 вирусных штаммов с генотипом PCV2b в клетках насекомых не была такой простой, как в случае белка ORF2 генотипа PCV2a. Было обнаружено, что экспрессированный белок ORF2 PCV2b по своей природе склонен к накапливанию в ядре клеток насекомых, в которых он экспрессировался. В этой форме общие уровни экспрессии белка ORF2 PCV2b были значительно снижены, и оказалось, что белок очень трудно собирать и очищать с помощью последующей обработки; даже при использовании агрессивной диссоциации могли быть выделены лишь очень небольшие количества белка ORF2. К тому же, в небольших количествах белка, которые могли быть выделены, количество VLP было очень низким; ядерная локализация, по-видимому, не позволяла белку ORF2 подвергаться в значительной степени самосборке в VLP. В результате иммуногенность этого экспрессированного белка была значительно уменьшенной.
Неожиданно было обнаружено, что когда в белок ORF2 PCV2b вводится очень специфическая аминокислотная замена, накопление в ядре при экспрессии в клетках насекомых может быть в значительной степени предотвращено.
Специфическая аминокислотная замена включала замену аминокислоты, встречающейся в природе в положении 131 полноразмерного белка ORF2 PCV2b, на аминокислоту пролин. В случае пролина в положении 131 большая часть экспрессированного мутантного белка ORF2 PCV2b («ORF2b-131P») впоследствии находилась в цитоплазме клетки насекомого, а не накапливалась в ядре. Было обнаружено, что это увеличивает общие уровни экспрессии, а также значительно облегчает сбор мутантного белка ORF2 PCV2b из этих клеток насекомых; в этом цитоплазматическом состоянии можно использовать стандартные щадящие способы выделения, чтобы можно было бы легко выделить большие количества белка. К тому же было обнаружено, что большая часть ORF2b-131P эффективно собирается в VLP, которые являются очень эффективными в вакцине против PCV2 для животных в виде свиней.
Это было неожиданно, особенно по сравнению с ситуацией с белком ORF2 PCV2a: в то время как в белке ORF2 вируса PCV2b встречающейся в природе аминокислотой в положении 131, как правило, является треонин; в вирусах PCV2a у некоторых в положении 131 находится треонин, и у некоторых - пролин. Однако при экспрессии в клетках насекомых ни один из двух вариантов ORF2 PCV2a не накапливается в ядре. Следовательно, не было никаких оснований предполагать, что именно это положение аминокислоты будет причиной накопления в ядре, наблюдаемого в случае белка ORF2 PCV2b при экспрессии в клетках насекомых.
Еще более примечательным было то, что белок ORF2 PCV2d, который также демонстрирует накопление в ядре при экспрессии в клетках насекомых, не мог быть изменен на цитоплазматический профиль экспрессии после замены его природного треонина в положении 131 на пролин.
По-видимому, ситуация вокруг экспрессии белка ORF2 PCV2 в клетках насекомых является уникальной для каждого из генотипов.
Неизвестно, каким образом замена аминокислоты на 131P предотвращает накопление белка ORF2 PCV2b в ядре при экспрессии в клетках насекомых. Хотя авторы настоящего изобретения не хотят ограничиваться какой-либо теорией или моделью, которая могла бы объяснить эти данные, они предполагают, что наличие аминокислоты пролина в этом конкретном положении в белке ORF2 генотипа PCV2b вызывает изменение свойств этого белка ORF2. Изменение может, например, повлиять на трехмерное свертывание или профиль гидрофобности белка ORF2, что может повлиять на его маршрут внутри клетки насекомого.
Это открытие открывает путь для ряда выгодных применений в результате улучшения возможности получения и антигенного качества рекомбинантно экспрессируемого белка ORF2 PCV2b. Это, в свою очередь, позволяет удобно производить в больших масштабах эффективные субъединичные вакцины против PCV2 для свиней; поскольку для его выделения не требуются агрессивные диссоциирующие соединения или сложные методы, экспрессируемый белок может быть получен дешевым, безопасным и эффективным способом.
Таким образом, одна или более целей настоящего изобретения могут быть достигнуты, и, следовательно, может быть преодолен один или более недостатков предшествующего уровня техники.
Следовательно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к клеткам насекомых, содержащим гетерологичную нуклеиновую кислоту, включающую:
a. нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ORF2 цирковируса 2 свиней с генотипом 2b (PCV2b), и
b. контролирующую транскрипцию последовательность, которая функционально связана с указанной нуклеотидной последовательностью, отличающимся тем, что нуклеотидная последовательность кодирует мутантный белок ORF2 PCV2b, имеющий пролин в аминокислотном положении 131.
В случае настоящего изобретения «клетки насекомых» представляют собой клетки, происходящие из организма класса Insecta. Клетки являются жизнеспособными (т.е. способными к репликации) и достаточно интактны, чтобы быть способными к экспрессии белка. Клетки могут быть покоящимися или активными и могут находиться на любой стадии клеточного цикла. Клетки насекомых могут использоваться для настоящего изобретения различными путями: либо путем использования целого насекомого; путем использования экстракта или части насекомого; путем использования первичных клеток, происходящих от насекомого; путем использования ткани или органа насекомого; или путем использования линии иммортализованных клеток насекомых.
Клетки насекомых по настоящему изобретению обычно будут содержаться в подходящем носителе. Такой носитель представляет собой композицию, которая поддерживает жизнеспособность клеток насекомых, и представляет собой, например, жидкость, такую как забуференный раствор или культуральная среда. В связи с использованием целых насекомых организм самого насекомого функционирует в качестве носителя.
Используемый здесь термин «содержащий (включающий)» (а также такие варианты, как «содержат», «содержит» и «содержащийся») обозначает все элементы и в любой вероятной комбинации, возможной в случае настоящего изобретения, которые охватываются или включены в раздел текста, абзац текста, пункт формулы и т. д., в котором этот термин используется, даже если такие элементы или комбинации не указаны явно; а не к исключению любого из таких элементов или комбинаций.
Таким образом, любой такой раздел текста, абзац текста, пункт формулы изобретения и т.д. может также относиться к одному или более вариантов осуществления, в которых термин «содержащий» (или его варианты) заменен такими терминами, как «состоят из», «состоящие из» или «по существу состоят из».
В случае настоящего изобретения нуклеиновая кислота является« гетерологичной» по отношению к клеткам насекомых, которые ее содержат, если нуклеиновая кислота не присутствовала в нуклеиновых кислотах исходных клеток насекомых, от которых происходят эти клетки. Нуклеиновая кислота может быть любого типа, например ДНК или РНК.
Гетерологичная нуклеиновая кислота в соответствии с настоящим изобретением может быть введена в клетки насекомых по настоящему изобретению различными путями, такими как трансфекция или электропорация нуклеиновой кислоты, возможно на носителе; альтернативно, путем инфицирования рекомбинантным микроорганизмом, например вирусом.
Нуклеотидная последовательность «кодирует», или что-то подобное «кодирует» белок, когда транскрипция и/или трансляция с нее приводит к тому, что этот белок экспрессируется. Как правило, такая нуклеотидная последовательность, способная кодировать белок, называется открытой рамкой считывания (ORF), что указывает на отсутствие нежелательных стоп-кодонов, которые преждевременно прекращали бы трансляцию белка. Такая нуклеотидная последовательность может представлять собой ген, кодирующий полный белок, или может представлять собой фрагмент гена, кодирующий часть белка, например, кодирующий только зрелую или секретируемую форму белка, т.е. без «лидерной», «якорной» или «сигнальной последовательности». Нуклеотидная последовательность может быть природного или синтетического происхождения.
В случае настоящего изобретения «белок» представляет собой молекулярную цепь аминокислот. Белок может быть нативным или зрелым белком, пре- или про-белком или частью белка. Среди прочего: пептиды, олигопептиды и полипептиды включены в определение белка.
Белок «ORF2» по настоящему изобретению относится к белку, кодируемому открытой рамкой считывания 2 (ORF2) в геноме PCV или частью ORF2. Полноразмерный белок ORF2 PCV2 обычно имеет длину в 233 аминокислоты и при исследовании с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (SDS-ПААГ) проявляет относительную молекулярную массу, составляющую приблизительно 26 кДа. Однако хорошо известны и могут преимущественно использоваться для настоящего изобретения усеченные формы белка ORF2, например усеченная форма белка ORF2 PCV2, в которой отсутствует 30 аминокислот с его N-конца. Белок ORF2 также называется капсидом, а кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты называется геном ORF2 или геном капсида.
Компьютерные программы, которые могут помочь в анализе кодирующих областей и удобно представляют такую информацию, коммерчески доступны от различных поставщиков.
«Цирковирус 2 свиней» или PCV2 относится к цирковирусу этого вида, имеющему характерные признаки членов его таксономической группы, такие как морфологические, геномные и биохимические характеристики, а также биологические характеристики, например физиологические, иммунологические, или патологическое поведение.
Как известно в данной области, классификация микроорганизма как отдельного вида основана на комбинации таких признаков. Следовательно, настоящее изобретение также включает PCV2, которые подклассифицируются от него любым образом, например, как подвид, штамм, изолят, генотип, вариант, подтип или подгруппа и т.п.
Специалисту в области техники настоящего изобретения будет очевидно, что, хотя конкретный PCV2 по настоящему изобретению может в настоящее время быть отнесен к этому виду, однако это таксономическая классификация, которая может измениться со временем, поскольку новые идеи могут привести к переклассификации в новую или отличную таксономическую группу. Однако, поскольку это не меняет сам микроорганизм или его антигенный спектр, а только его научное название или классификацию, такие переклассифицированные микроорганизмы остаются в пределах объема настоящего изобретения.
PCV2 для применения в настоящем изобретении может быть получен из ряда источников, например, в виде полевого изолята от свиньи в дикой природе или на ферме, или из различных лабораторий, (депозитарных) учреждений или (ветеринарных) университетов. В качестве альтернативы, PCV2 может быть воссоздан исходя из цифровой информации о последовательности, путем синтеза его геномной нуклеиновой кислоты и ее трансфекции в соответствующие клетки.
Генотипирование PCV2 осуществляется путем сравнения нуклеотидных последовательностей. В случае настоящего изобретения «PCV2 с генотипом 2b» или «PCV2b» представляет собой вирус PCV2, который относится к группе b генотипа, используя метод Segales et al. (2008, Vet. rec. vol. 162, p. 867-868). В этом методе используется генотипирование PCV2 на основе P-расстояния между генами ORF2 PCV2, т.е. отношения нуклеотидов, которые различаются между двумя генами ORF2 PCV2, к общему числу нуклеотидов их гена ORF2 PCV2. Отсечка для различных генотипов PCV2, идентифицированных по Segales et al., находится на равном 0,035 значении Р-расстояния для ORF2; поэтому, когда Р-разница меньше, две последовательности относятся к одному и тому же генотипу.
В случае настоящего изобретения эталонным вирусом PCV2 с генотипом 2b является изолят «Imp.1011», также известный как штамм 48285, последовательность генома которого опубликована в GenBank™ под номером доступа: AF055394.
Следовательно, любой вирус PCV2, характеризующийся составляющим менее 0,035 Р-расстоянием между его геном ORF2 и геном ORF2 штамма 48285, рассчитанным с использованием метода Segales et al. (выше), является вирусом PCV2b по настоящему изобретению.
Однако, и это будет понятно специалисту, поскольку геном PCV является одноцепочечным и кольцевым, кодирующая область гена ORF2 может сразу не быть очевидной из конкретной линейной нуклеотидной последовательности, и может потребовать подвергание нуклеотидной последовательности инвертированию, комплементации и/или повороту. Например: в геномной последовательности штамма 48285 PCV2b под номером доступа в GenBank: AF055394, ген ORF2 простирается в опубликованной линейной цепи от нуклеотида под номером 314 до нуклеотида 1 и продолжается от нуклеотида 1767 вплоть до и включительно нуклеотида 1383; вместе это представляет 699 нуклеотидов гена ORF2 (не включая стоп-кодон) и кодируется цепью, комплементарной этой области опубликованной цепи. Опять же, такой анализ и представление кодирующих областей может быть удобно выполнен с использованием коммерчески доступной компьютерной программы.
Аналогичный подход используется для «генотипа 2a PCV2» (PCV2a) и «генотипа 2d PCV2» (PCV2d), как здесь используется; эталонным вирусом для PCV2a является изолят «Imp.1010», он же «Stoon 1010», с номером доступа: AF055392; а эталонным вирусом для PCV2d является изолят «S99-1542/3a», с номером доступа JX512856.
Способы идентификации вируса как вируса PCV2, определения нуклеотидной последовательности его гена ORF2 и вычисления P-расстояния по сравнению с геном ORF2 штамма 48285 хорошо известны и легкодоступны специалисту в области техники настоящего изобретения.
«Контролирующая транскрипцию последовательность» представляет собой функциональную область нуклеиновой кислоты, обычно в ДНК, которая посредством связывания контролирующих факторов индуцирует механизм экспрессии белка в клетке, чтобы инициировать и осуществлять транскрипцию ДНК в РНК расположенной ниже (3’) кодирующей области. Такая контролирующая транскрипцию область (TCR) также может называться промотором и обычно содержит ряд регуляторных областей, таких как «сайт инициации транскрипции», расположенный 5’ на расстоянии приблизительно 30-40 нуклеотидов от первого инициирующего кодона. Другими хорошо известными консервативными элементами являются TATA-блок, CAAT-блок и GC-блок. TCR также может включать так называемый энхансер, который участвует в связывании регуляторных факторов, которые могут влиять на время, продолжительность, условия и уровень транскрипции.
Следовательно, транскрипция (и последующая трансляция) может иметь временную или постоянную природу, т.е. быть транзиторной или постоянной экспрессией, в зависимости от особенностей используемой TCR и генетической конструкции в целом.
TCR для экспрессии (гетерологичного) гена должна быть способна к эффективному управлению транскрипцией находящейся 3’ кодирующей области. Это обычно называют TCR, «функционально связанной» с геном, так что ген находится «под контролем» или «управляется» TCR. Это обычно означает, что TCR и кодирующая область соединены в одной и той же молекуле в эффективной близости и без сигналов или последовательностей между ними, которые могли бы быть помехой для эффективной транскрипции.
Термины «мутантный белок ORF2 PCV2b» служат для указания на то, что экспрессированный белок ORF2 PCV2b не идентичен варианту этого белка дикого типа, но содержит мутацию. Такая мутация может быть введена различными способами, используя методы in vivo или in vitro. Однако самым эффективным является использование технологии рекомбинантных ДНК для субклонирование гена ORF2 PCV2b в бактериальную плазмиду и использования, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и синтетических праймеров для введения желаемой мутации в желаемом месте. Подробности представлены в примерах ниже. При таком подходе, например, манипулировали последовательностью ДНК исходного гена ORF2 PCV2b, с номером доступа в GenBank: AF055394, в результате чего триплет нуклеотидов дикого типа, кодирующий треонин в аминокислотном положении 131: 5'-ака-3', был мутирован в триплет: 5'-ccc-3', кодирующий пролин.
Дальнейшие манипуляции могут быть применены при оптимизации частоты использования кодонов в гене ORF2, чтобы он больше соответствовал предпочтениям кодонов в клетках насекомых и/или бакуловируса. Например, используя предпочтение кодонов в гене полиэдрина бакуловируса AcMNPV, как опубликовано в: Hooft van Iddekinge et al., 1983, Virology, vol. 131, p. 561-565. Концепция оптимизации частоты использования кодонов в гене для гетерологичной экспрессии хорошо известна; как правило, все такие мутации являются молчащими, что означает, что, хотя кодирующая нуклеотидная последовательность изменяется, не меняется аминокислотная последовательность кодируемого белка. Подробности приведены в примерах.
Было установлено, что оптимизация частоты использования кодонов повышает уровень экспрессии белка ORF2 в клетках насекомых. В минимальной степени также изменялась ядерная локализацию белка ORF2 PCV2b дикого типа при экспрессии в клетках насекомых. Однако существенное предотвращение накопления в ядре клеток насекомых могло быть достигнуто только в случае белка ORF2 из PCV2b при замене аминокислоты в положении 131 на пролин.
В случае настоящего изобретения «дикий тип» относится к форме (микро)организма, в которой он встречается в дикой природе, например: форме исходного организма до того, как он был изменен в результате вмешательства человека.
Создание, конструирование и сборка гетерологичной нуклеиновой кислоты, экспрессирующей мутантный белок ORF2 PCV2b по настоящему изобретению, может быть осуществлено с помощью хорошо известных молекулярно-биологических методов, включающих клонирование, трансфекцию, рекомбинацию, отбор и амплификацию. Эти и другие методы подробно объясняются в стандартных учебниках, таких как Sambrook & Russell: “Molecular cloning: a laboratory manual” (2001, Cold Spring Harbour Laboratory Press; ISBN: 0879695773); Ausubel et al., in: Current Protocols in Molecular Biology (J. Wiley and Sons Inc., NY, 2003, ISBN: 047150338X); C. Dieffenbach & G. Dveksler: “PCR primers: a laboratory manual” (CSHL Press, ISBN 0879696540); и “PCR protocols”, by: J. Bartlett and D. Stirling (Humana press, ISBN: 0896036421).
В случае настоящего изобретения конкретное «положение аминокислоты» пронумеровано на основе нумерации аминокислот в аминокислотной последовательности полноразмерного белка ORF2 эталонного штамма для этого генотипа PCV2. Для PCV2b эталонным штаммом является 48285, а полноразмерная аминокислотная последовательность его белка ORF2 опубликована в GenBank под номером доступа AAC35331.
Клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением могут экспрессировать ORF2b-131P; мутантный белок ORF2 PCV2b (почти всегда) больше не накапливается в ядре, а рассредоточивается по всей цитоплазме клетки насекомого. Это различие в клеточной локализации мутантного белка ORF2 PCV2b по сравнению с его немутированным аналогом может быть без труда обнаружено, среди прочего, с помощью (световой) микроскопии и визуализации с использованием иммунофлуоресцентной технологии. Подробности представлены в разделе «Примеры».
Было обнаружено, что остаточный уровень накопления белка ORF2b-131P в ядре несколько различается в зависимости от генетической конструкции, используемой для экспрессии мутантного белка ORF2 PCV2b в клетках насекомых: при экспрессии с помощью рекомбинантного бакуловируса, полученного с использованием системы Bac-to-Bac, все еще демонстрировалось некоторое накопление в ядре, например, приблизительно 10% от уровня, наблюдаемого для белка ORF2 PCV2b дикого типа. Однако когда мутантный белок получали из рекомбинантного бакуловируса, сконструированного с помощью системы ProEasy, больше не наблюдалось выявляемого накопления в ядре. К тому же, уровень экспрессии белка был выше, чем уровень, получаемый с помощью рекомбинантного бакуловируса Bac-Bac.
Это, по-видимому, можно объяснить исходя из строения используемой генетической конструкции: рекомбинантные бакуловирусы, полученные из конструкций Bac-to-Bac, все еще несут элементы экспрессионной кассеты вектора для переноса в своем геноме, такие как транспозон и ген устойчивости к антибиотику. Они могут влиять на уровень репликации и экспрессии. Однако рекомбинанты ProEasy больше не несут такие дополнительные генетические элементы.
Детали предпочтительных вариантов осуществления и другие аспекты настоящего изобретения будут описаны ниже.
В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая мутантный белок Orf2 PCV2b, была оптимизирована в отношении частоты использования кодонов. Более предпочтительно, когда она была оптимизирована в отношении частоты использования кодонов для соответствия предпочтению кодонов в гене полиэдрина бакуловируса AcMNPV.
Наиболее предпочтительная нуклеотидная последовательность, кодирующая мутантный белок Orf2 PCV2b, представляет собой SEQ ID NO:1. Она представляет собой последовательность ORF2 штамма 48285 PCV2b, в которой триплет, кодирующий аминокислоту в положение 131, был мутирован в 5'-ccc-3', кодирующий пролин. К тому же, частота использования кодонов была адаптирована для соответствия предпочтению кодонов в гене полиэдрина AcMNPV. SEQ ID NO:2, в свою очередь, приводит последовательность белка ORF2b-131P, которая кодируется SEQ ID NO:1.
В результате мутаций, применяемых к гену ORF2 PCV2b, в частности из-за оптимизации частоты использования кодонов, идентичность нуклеотидных последовательностей между SEQ ID NO:1 и соответствующей областью AF055394, геном ORF2b дикого типа, составляет 77,2%. Однако, поскольку мутации для оптимизации частоты использования кодонов являются молчащими, идентичность аминокислотных последовательностей между SEQ ID NO:2 и AAC35331 (которая является аминокислотной последовательностью белка ORF2 PCV2b дикого типа из штамма 48285) составляет 99,6%, а именно отличается только по аминокислоте в положении 131.
Использование клеток от различных насекомых хорошо известно. Некоторые из них могут также использоваться в связи с бакуловирусной системой экспрессии в клетках насекомых, поскольку они могут быть инфицированы бакуловирусом. См., например: Chen et al., 2005, In vitro Cell. Dev. Biol. Anim., vol. 41, p. 43-49.
Следовательно, в одном варианте осуществления клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением происходят от насекомых, выбранных из группы, состоящей из: Autographa californica (пяденицы калифорнийской люцерновой), Spodoptera frugiperda (совки травяной), Spodoptera exigua (совки малой), Trichoplusia ni (совки капустной), Lymantria dispar (непарника), Bombyx mori (шелкопряда тутового), Anticarsia gemmatalis (совки бархатных бобов), Heliothis virescens (табачной листовертки), Heliothis subflexa (совки вишневой), Mamestra brassicae (совки капустной), Helicoverpa armigera (совки хлопковой), Helicoverpa zea (совки кукурузной), Agrotis ipsilon (совки-ипсилон), Anagrapha falcifera (совки), Galleria mellonella (большой восковой моли), Rachiplusia ou (серой пяденицы), Plutella xylostella (капустной моли), Drosophila melanogaster (плодовой мушки) и Aedes aegypti (комара).
В одном варианте осуществления клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением происходят от насекомого отряда Lepidoptera; более предпочтительно семейства Noctuidae; еще более предпочтительно одного из родов: Spodoptera или Trichoplusia.
В одном варианте осуществления клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением происходят от насекомого вида Spodoptera frugiperda.
В одном варианте осуществления клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением происходят от насекомого вида Trichoplusia ni.
Известно и осуществимо размножение целых насекомых для экспрессии гетерологичного белка и, таким образом, применение клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением. Однако будет удобнее использовать клетки насекомых в форме линии иммортализованных клеток насекомых, поскольку это сделает возможным более гибкое производство и масштабирование в контролируемых условиях. Такие установленные линии клеток насекомых затем могут использоваться для конструирования клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением, используя обычные способы, описанные здесь.
Хорошо известными линиями клеток насекомых, подходящими для такого применения, являются: Sf9 и Sf21, обе происходящие от S. frugiperda; High Five™ (Hi-5), происходящая от T. ni; Bm5, происходящая от B. mori; и Ld652Y и LdElta, происходящие от L. dispar.
Следовательно, в одном варианте осуществления клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением готовят из клеток линии клеток насекомых, выбранной из группы, состоящей из Sf9, Sf21, Hi-5, Bm5, Ld652Y и LdElta, или из линии клеток, происходящей от одной из них.
Предпочтительно клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением готовят из линии клеток насекомых Sf9 или Sf21.
Процедуры, оборудование и материалы для культивирования линий клеток насекомых хорошо известны и могут применяться в любом желаемом масштабе, например от 5 мл до 5000 литров. В частности, доступны специализированные среды для культивирования клеток насекомых, например: Sf-900™ (Thermo Fisher Scientific); серия Ex-Cell™ 400 (Sigma Aldrich); и Insect-XPRESS™ (Lonza).
В зависимости от характеристик этих сред они либо нуждаются в добавлении определенного процента сыворотки, такой как эмбриональная сыворотка теленка, либо могут использоваться без сыворотки. Могут быть добавлены дополнительные добавки, такие как глютамин, антибиотики, пеногасители и т.д.
Существует несколько способов, с помощью которых клетка насекомого в соответствии с настоящим изобретением может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, одним примером является стабильная интеграция в геном клетки насекомого. Способами достижения интеграции в геном являются, например: случайные вставки, например, с помощью технологии с использованием транспозонов, или направленные вставки с использованием, например, гомологичной рекомбинации или технологии CRISPR-Cas.
Альтернативно, клетки насекомых могут быть трансфицированы с помощью химических средств (например, Lipofectin™) или физических способов (например, электропорации) гетерологичной нуклеиновой кислотой, которая сама может находиться на носителе, таком как плазмида. Гетерологичная нуклеиновая кислота может транзиторно или постоянно экспрессироваться клеткой насекомого.
Однако предпочтительным способом введения такой гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением является использование рекомбинантного бакуловируса. Такой бакуловирус, например, будет содержать представляющий интерес гетерологичный ген, стабильно интегрированный в его вирусный геном и функционально связанный с сильным бакуловирусным промотором, таким как промоторы очень поздних генов p10 или полиэдрина.
Следовательно, в одном варианте осуществления клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением контролирующая транскрипцию последовательность представляет собой промотор гена р10 бакуловируса или промотор гена полиэдрина бакуловируса.
Затем рекомбинантный бакуловирус побуждают проникать в клетку насекомого; это можно сделать пассивно, например, путем трансфекции генома рекомбинантного бакуловируса или активно путем инфицирования чувствительной клетки насекомого инфекционным рекомбинантным бакуловирусом. Следовательно, клетка насекомого, в результате включения рекомбинантного бакуловируса или его генома внутрь клетки, будет также включать гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. В случае настоящего изобретения «внутри клетки» просто относится к локализации рекомбинантного бакуловирусного генома, находящегося с внутренней стороны клеточной мембраны клетки насекомого, например, в цитоплазме.
Внутри клетки насекомого рекомбинантный бакуловирус или его геном будет реплицироваться, что приведет к экспрессии гетерологичного гена в клетке насекомого. Затем гетерологичный продукт экспрессии можно собрать либо из клеток насекомых, либо из окружающей клетки среды, такой как среда для культивирования клеток.
Следовательно, в одном варианте осуществления клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением гетерологичная нуклеиновая кислота содержится в геноме рекомбинантного бакуловируса.
«Бакуловирус» является членом семейства Baculoviridae; предпочтительно представителем рода Alphabaculovirus.
Бакуловирус по настоящему изобретению является «рекомбинантным», если он был изменен в результате вмешательства человека по сравнению с его формой дикого типа, с тем чтобы он включал гетерологичную нуклеиновую кислоту. Предпочтительно, когда такой рекомбинантный бакуловирус создается методами генетической манипуляции.
Как будет понятно специалисту при рассмотрении клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением, в конкретном сосуде для культивирования или в лунке планшета для культивирования число клеток, которые фактически содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, будет динамическим. Это связано с рядом биологических причин, таких как стадия жизненного цикла клетки или уровень инфицирования или трансфицирования. Хотя предпочтительно иметь как можно больше клеток, содержащих и экспрессирующих гетерологичную нуклеиновую кислоту, необязательно, чтобы в определенный момент времени каждая и всякая отдельная клетка насекомого этой группы содержала гетерологичную нуклеиновую кислоту.
Комбинированное использование клеток насекомых и рекомбинантного бакуловируса для экспрессии гетерологичного белка обычно называют «бакусовирусной системой экспрессии в клетках насекомых». Примерами статей, учебников и обзоров этой системы являются: Luckow et al., 1988, Bio-technology, vol. 6, p. 47; Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual by David R. O'Reilly, Oxford University press, 1993, ISBN: 0716770172; The Baculovirus Expression System: A laboratory guide, ed. King & Possee, 1992, ISBN: 9401050473; и обзором является: van Oers et al., 2015, J. of Gen. Virology, vol. 96, p. 6-23.
Эффективная экспрессия с использованием бакусовирусной системы экспрессии в клетках насекомых может быть применена в масштабе от лабораторного до очень крупного промышленного производства. Гетерологичные гены различного происхождения экспрессировали в течение 30 лет, когда была известна бакусовирусная система экспрессии в клетках насекомых, и для применения этой технологии коммерчески доступны многие инструменты.
Несколько видов бакуловирусов были использованы в качестве удобных векторов для экспрессии гетерологичных белков в клетках насекомых. Примерами бакуловирусов, используемых в бакусовирусной системе экспрессии в клетках насекомых, являются (мультикапсидные) нуклеополиэдровирусы Autographa californica (пяденица калифорнийская люцерновая): AcMNPV или Bombyx mori: BmNPV.
В одном варианте осуществления рекомбинантного бакуловируса, содержащего гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, указанный бакуловирус представляет собой AcMNPV или BmNPV.
Для эффективного создания и отбора рекомбинантных бакуловирусов для использования в настоящем изобретении коммерчески доступны многие инструменты и наборы. Например: Bac-to-Bac™ (Thermo Fisher Sci., Waltham, MA, США); ProEasy™ (AB Vector, San Diego, CA., США); и flashBAC™ (Oxford Expression Technologies, Oxford, Великобритания).
Для оптимизации уровней репликации и экспрессии белка рекомбинантный бакуловирус, содержащий гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, предпочтительно максимально приближен к бакуловирусу дикого типа, за исключением, конечно, вставки гетерологичной нуклеиновой кислоты и последующего разрушения или делеции в локусе вставки. На практике это означает, что рекомбинантный бакуловирус предпочтительно не содержит дополнительные генетические элементы из процесса рекомбинации в своем геноме, например такие элементы, как: метка, метка, ген-маркер, элемент транспозона, ген устойчивости к антибиотику и т.д.
Следовательно, в одном варианте осуществления рекомбинантный бакуловирус, содержащий гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, не содержит дополнительные генетические элементы из процесса рекомбинации в своем геноме.
В предпочтительном варианте осуществления рекомбинантный бакуловирус не содержит ген устойчивости к антибиотику из вектора для переноса, который использовался для конструирования этого рекомбинантного бакуловируса.
В одном варианте осуществления клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением применяется одно, несколько или все условия, выбранные из группы, состоящей из:
- нуклеотидная последовательность, кодирующая мутантный белок Orf2 PCV2b, была оптимизирована в отношении частоты использования кодонов; более предпочтительно: была оптимизирована в отношении частоты использования кодонов для соответствия предпочтению кодонов в гене полиэдрина бакуловируса AcMNPV;
- нуклеотидная последовательность, кодирующая мутантный белок ORF2 PCV2b, представляет собой SEQ ID NO:1;
- клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением происходят от насекомого отряда Lepidoptera; более предпочтительно семейства Noctuidae; еще более предпочтительно одного из родов: Spodoptera или Trichoplusia;
- клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением происходят от насекомого вида Spodoptera frugiperda;
- клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением происходят от насекомого вида Trichoplusia ni;
- клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением готовят из клеток линии клеток насекомых, выбранных из группы, состоящей из Sf9, Sf21, Hi-5, Bm5, Ld652Y и LdElta, или из линии клеток, происходящей из одной из них;
- клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением готовят из линии клеток насекомых Sf9 или Sf21;.
- контролирующая транскрипцию последовательность представляет собой промотор гена р10 бакуловируса или промотор гена полиэдрина бакуловируса;
- гетерологичная нуклеиновая кислота содержится в геноме рекомбинантного бакуловируса, который находится внутри клетки насекомого;
- рекомбинантный бакуловирус, содержащий гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, представляет собой AcMNPV или BmNPV; и
- рекомбинантный бакуловирус, содержащий гетерологичную нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, не содержит дополнительные генетические элементы из процесса рекомбинации в своем геноме.
Как здесь описано, мутация белка ORF2 PCV2b, описанного для настоящего изобретения, обеспечивает увеличение экспрессии белка ORF2b-131Р из клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением. В особенности, она позволяет создавать VLP, содержащие белок ORF2 PCV2b, в гораздо большей степени, чем насколько это возможно без этой мутации.
Следовательно, в дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к вирусоподобным частицам (VLP) из мутантного белка ORF2 PCV2b, отличающимся тем, что мутантный белок ORF2 PCV2b имеет пролин в аминокислотном положении 131.
Материалы и способы для характеристики и использования VLP из белка ORF2b-131P хорошо известны в данной области техники.
Предпочтительно, когда экспрессия мутантного белка ORF2 PCV2b по настоящему изобретению в клетках насекомых достигается при использовании бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых, описанной выше.
Следовательно, в дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к способу экспрессии мутантного белка ORF2 PCV2b в клетках насекомых в соответствии с настоящим изобретением, при этом в способе применяется бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых.
В частности, когда клетки насекомых в соответствии с настоящим изобретением, которые используются для экспрессии мутантного белка ORF2 PCV2b по настоящему изобретению, представляют собой клетки линии клеток насекомых, их можно удобно культивировать с использованием стандартного оборудования для культивирования клеток, что приводит к экспрессии мутантного белка ORF2 PCV2b. Оборудование для культивирования клеток насекомых доступно в любом масштабе; от простого Т-матраса или вращающейся колбы, помещенного(й) в инкубационный шкаф при соответствующей температуре; вплоть до крупномасштабного промышленного ферментера с обогревательной рубашкой, мешалкой и разбрызгивателем, с автоматическим контролированием параметров процесса, таких как температура, pH и растворенный кислород.
После культивирования клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением экспрессированный мутантный белок ORF2 PCV2b собирают из культуры клеток насекомых для дальнейшего использования. Как и культивирование, такой сбор может быть осуществлен с использованием стандартных процедур, хорошо известных в данной области техники. Кроме того, при необходимости культура может быть сначала инактивирована (т.е. стерилизована) с помощью физических способов (например, нагревания, облучения) или химических средств (например, бромэтиленимина (BEI)).
В зависимости от характеристик используемой клетки насекомого и применяемого типа экспрессии экспрессированный мутантный белок ORF2 PCV2b накапливается внутри клеток насекомых или на их мембране или секретируется из клетки. Даже когда он активно не секретируется, белок может в некоторой степени оказаться в среде для культивирования клеток при разрушении клеток.
В таком случае можно выбрать способ сбора экспрессированного белка:
Когда экспрессированный белок главным образом присутствует в культуральной среде, его можно собрать, например, в виде супернатанта после центрифугирования культуры. Основной объем культуры затем может уменьшить в желаемой степени, например, используя концентратор, обычно с помощью некоторого метода ультрафильтрации, все хорошо известны в данной области техники.
Когда белок находится главным образом в клетках, он может быть выделен из основного объема культуры, например, путем центрифугирования культуры и ресуспендирования осадка клеток в меньшем объеме. Затем клетки могут быть разрушены с использованием более или менее инвазивных методов.
Затем экспрессированный белок может быть получен, используя некоторый метод экстракции и/или очистки.
Все это может выполнить специалист в данной области, используя только известные методы и материалы.
Следовательно, в дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения мутантного белка ORF2 PCV2b, имеющего пролин в аминокислотном положении 131, при этом получение включает одну или обе стадии, выбранные из:
- культивирования клеток насекомых в соответствии с настоящим изобретением; и
- сбора мутантного белка ORF2 PCV2b из культуры клеток насекомых.
Особенно полезным результатом настоящего изобретения является то, что мутантный белок ORF2 PCV2b больше не накапливается в ядре клеток насекомых, в которых он экспрессируется. Это не только увеличило общий уровень экспрессии, но также значительно облегчило сбор мутантного белка ORF2 PCV2b из этих клеток насекомых. Это связано с тем, что в этом цитоплазматическом состоянии могли быть использованы очень щадящие и стандартные способы выделения, дающие относительно большие количества мутантного белка ORF2 PCV2b. К тому же, собранный белок имел превосходное иммунологическое качество, поскольку было обнаружено, что основная масса ORF2b-131P эффективно собирается в VLP.
Конкретнее: для сбора немутированного белка ORF2 PCV2b в существенных количествах потребовалась бы экстракция с использованием химических веществ, таких как детергенты или хаотропные агенты, например, SDS, мочевина, дезоксихолат или гуанидин-HCl и так далее. Впоследствии они должны быть снова удалены. Использование таких агрессивных химических веществ в большом масштабе, конечно, нежелательно.
Однако сбор мутантного белка ORF2 PCV2b может быть осуществлен с помощью безопасных, удобных и очень мягких методов без использования химических веществ, например, путем обработки ультразвуком или размораживания-оттаивания клеток насекомых.
Следовательно, в одном варианте осуществления способа получения мутантного белка ORF2 PCV2b в соответствии с настоящим изобретением на стадии сбора мутантного белка ORF2 PCV2b из культуры клеток насекомых не используется детергент или хаотропный агент.
В одном варианте осуществления для сбора используется физический, а не химический способ для лизиса клеток насекомых; примерами физического способа лизиса клеток являются: обработка ультразвуком, размораживание-оттаивание и пресс Френча.
В случае настоящего изобретения «культивирование» клеток насекомых или подобное «культивирование» относится к инкубации клеток насекомых в соответствующих условиях, позволяющих клеткам расти и делиться, и экспрессировать гетерологичную вставку.
Такое культивирование клеток насекомых, как правило, включает использование соответствующей среды для культивирования клеток и подходящего оборудования; все они хорошо известны в данной области техники и коммерчески доступны. Например, культуры линий клеток насекомых родов Spodoptera или Trichoplusia обычно культивируют в аэробных условиях, в монослое или в суспензии, при 26-28°C.
В практических условиях будет удобно иметь отдельный сосуд для культивирования для образования чистых клеток насекомых, сохраняемый на значительном расстоянии от оборудования, используемого для культивирования клеток насекомых, которые будут инфицированы или трансфицированы. Обычно клетки насекомых готовятся как основной запас клеток и рабочий запас клеток. Такой подход обеспечивает уровень контроля качества, который требуется для приготовления рекомбинантных белков для фармацевтического применения.
В одном варианте осуществления способа получения мутантного белка ORF2 PCV2b в соответствии с настоящим изобретением полученный белок находится в форме VLP.
Применяя способы получения мутантного белка ORF2 PCV2b в соответствии с настоящим изобретением, можно получить мутантный белок ORF2 PCV2b в достаточных количествах и с требуемой иммунологической эффективностью для производства вакцины против PCV2 или связанных с ним признаков заболевания.
Следовательно, в дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к вакцине для свиней для подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания, при этом вакцина содержит мутантный белок ORF2 PCV2b в фармацевтически приемлемом носителе, отличающейся тем, что указанный мутантный белок ORF2 PCV2b имеет пролин в аминокислотном положении 131.
В одном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением предназначена для подавления инфекции, обусловленной PCV2 с генотипом 2a, 2b и/или 2d.
Более предпочтительной является вакцина для подавления инфекции, обусловленной PCV2.
Хорошо известно, что «вакцина» представляет собой композицию, содержащую иммунологически активное соединение в фармацевтически приемлемом носителе. «Иммунологически активное соединение» - в форме «антигена» - будет распознаваться иммунной системой прививаемой мишени, индуцируя иммунологический ответ. Ответ может исходить от врожденной или приобретенной иммунной системы и может быть клеточного и/или гуморального типа.
В случае настоящего изобретения «свиньи» относятся к животным семейства Suidae и предпочтительно к животным рода Sus, например: дикой или домашней свинье, дикому кабану, бабирусе или бородавочнику. Сюда также входят свиньи, названные произвольным именем, относящимся к их полу или возрасту, таким как свиноматка, кабан, свинья, ремсвинка, отъемыш или поросенок.
Вакцина в соответствии с изобретением может обеспечивать «подавление PCV2 инфекции», что относится к предотвращению или подавлению возникновения или распространения продуктивной PCV2 инфекции у животного-мишени. Это достигается, например, путем снижения вирусной нагрузки или сокращения продолжительности репликации вируса. В свою очередь, это приводит к уменьшению числа, интенсивности или тяжести поражений и последующих клинических признаков заболевания, вызванного вирусной инфекцией, у животного-мишени. Такую вакцину в разговорной речи называют «вакциной» против «PCV2» или «противо-PCV2 вакциной».
В предпочтительном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением действует как средство для предотвращения PCV2-виремии и/или как средство для предотвращения выделения PCV2 инфицированными животными.
В дополнение к эффективности вакцины против PCV2 инфекции, вакцина в соответствии с настоящим изобретением может также обеспечивать «ослабление … связанных с ней признаков заболевания», которое относится к связанному с цирковирусом свиней заболеванию (PCVAD), которое может возникать как вторичное или сопутствующее заболевание. Как и в случае PCV2, вакцина в соответствии с настоящим изобретением может обеспечивать уменьшение тяжести и/или длительности симптомов или последствий такого PCVAD.
Вакцины против PCV2 уменьшает репликацию и распространение вируса PCV2. Это снижает PCV2-вирусную нагрузку в крови, легких и лимфоидных тканях (например, миндалинах, селезенке и лимфатических узлах) и защищает от истощения лимфоидной ткани, распространения инфекций и от заболеваний, связанных с PCV2. Следовательно, это восстанавливает общее состояние здоровья и продуктивность в стадах вакцинированных свиней, что отражается в одном или более параметров: снижении смертности, увеличении среднесуточного прироста веса, улучшении конверсии корма и улучшении репродуктивной эффективности.
Общее определение эффективности вакцины против PCV2 находится в пределах компетенции обычного практикующего специалиста. Это может быть сделано, например, путем мониторинга иммунологического ответа после вакцинации или путем проверки появления клинических симптомов или смертности после контрольного заражением, например, путем мониторинга признаков заболевания, клинических показателей, серологических параметров у мишени или путем повторного выделения провокационного патогена и сравнения этих результатов с ответом на вакцинацию и последующее заражение, наблюдаемым у псевдовакцинированных животных. В частности, эффективность вакцины и защиту можно определить путем серологического определения уровней антител, специфических для PCV2; детектирования вируса в сыворотке или в секретах животных (оральных, назальных секретах, фекалиях, моче); или путем обнаружения других патогенов, участвующих в PCVAD, с помощью ПЦР, (иммуно)гистологического анализа, гибридизации или серологически.
В случае вакцин против PCV2 в соответствии с настоящим изобретением эффективность предпочтительно определяют путем оценки уровня подавления PCV2 инфекции в вакцинированных и невакцинированных группах, в соответствии с чем такая инфекция может быть получена естественным путем, например, в полевых условиях, или может быть преднамеренной, например, в результате заражения в условиях эксперимента.
В зависимости от типа используемого адъюванта эффективность вакцины против PCV2 может основываться больше на гуморальном или клеточном иммунитете. Титры индуцированных антител можно измерить, например, используя один из множества доступных коммерческих наборов для ELISA, специфических для PCV.
Различные варианты осуществления, преимущества и примеры вакцины в соответствии с настоящим изобретением будут изложены ниже.
В одном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением, содержащей мутантный белок ORF2 PCV2b, имеющий пролин в аминокислотном положении номер 131, мутантный белок ORF2 PCV2b находится в форме вирусоподобных частиц.
Как правило, вакцина содержит «фармацевтически приемлемый носитель», который содержит антиген и может помочь в производстве, применении или сохранении вакцины, не вызывая (тяжелых) неблагоприятных эффектов. Таким носителем может быть водный раствор, например буфер или культуральная среда.
Предпочтительным фармацевтически приемлемым носителем для вакцины в соответствии с настоящим изобретением является среда для культивирования клеток насекомых, забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) или их комбинация.
Кроме того, фармацевтически приемлемый носитель может содержать дополнительные добавки и наполнители, такие как наполнитель, стабилизатор, консервант, поверхностно-активное вещество или адъювант. Детали и примеры общеизвестны, например, как описано в справочниках, таких как: Remington: the science and practice of pharmacy” (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), и: “Veterinary vaccinology” (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).
Кроме того, вакцина в соответствии с настоящим изобретением может содержать адъювант. Особенно в случае таких субъединичных вакцин это может значительно увеличить иммунный ответ на субъединичный антиген у мишени.
Следовательно, в одном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением содержит адъювант.
«Адъювант» представляет собой хорошо известный ингредиент вакцины, который стимулирует иммунный ответ у мишени неспецифическим образом. В данной области известно много различных адъювантов. Примерами адъювантов являются: полный и неполный адъювант Фрейнда, витамин Е или альфа-токоферол, неионные блоксополимеры и полиамины, такие как декстрансульфат, Carbopol™, пиран, сапонин, такой как: QuilA™ или Q-vac™, Сапонин и компоненты вакцины могут быть объединены в ISCOM™.
Кроме того, в качестве адъюванта часто используются пептиды, такие как мурамилдипептиды, диметилглицин, туфтсин, и минеральное масло, например, Bayol™, Drakeol™, Klearol™ или Marcol™, Montanide™ или легкое минеральное (парафиновое) масло; неминеральное масло, такое как сквален, сквалан; растительные масла или их производные, например этилолеат. Также полезно использовать комбинированные продукты, такие как ISA™ (Seppic) или DiluvacForte™ и Xsolve™ (оба от MSD Animal Health). Дополнительным вариантом является использование адъюванта SVEA (содержащего сквалан и ацетат витамина Е), как раскрыто в ЕР 16206789.
Руководством по адъювантам, их применению и эффектам является ”Vaccine adjuvants” (Methods in molecular medicine, vol. 42, D. O’Hagan ed., 2000, Humana press, NJ, ISBN: 0896037355).
Адъювант может использоваться в различных вакцинных препаратах в соответствии с настоящим изобретением для усиления иммунного ответа на мутантный белок ORF2 PCV2b. Например, когда адъювант представляет собой вещество в виде масла, масляная фаза может обеспечить депо-эффект у вакцинированного животного, медленно высвобождая антиген, тем самым обеспечивая длительную стимуляцию иммунной системы у мишени.
Вещество в виде масла можно скомбинировать различными способами с водной фазой, содержащей белок ORF2. В одном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена в виде эмульсии водной и масляной фазы; предпочтительно эмульсия имеет тип: «вода в масле» (вода/масло), «масло в воде» (масло/вода), «вода в масле в воде» (вода/масло/вода) или представляет собой двойную масляную эмульсию.
Более предпочтительной является вакцина в соответствии с настоящим изобретением, которая содержит масло в качестве адъюванта и приготовлена в виде эмульсии типа «масло в воде». Такая вакцина преимущественно проявляет свойства как в прямой иммунной стимуляции из водной фазы, так и длительной иммунной стимуляции из-за эффекта депо масляной фазы.
Следовательно, в одном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением вакцина приготовлена в виде эмульсии типа «масло в воде».
Способы и оборудование для приготовления эмульсии вакцины с адъювантом в любом желаемом масштабе коммерчески доступны, например, для гомогенизации, используя такое оборудование, как: Silverson, Ultra Turrax™, реактор Dispax (IKA) или Microfluidiser (Microfluidics).
Эмульсия типа «масло в воде» вакцины в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно имеет размер частиц дисперсной фазы, который является достаточно маленьким, предпочтительно меньше 1 микрометра; такие эмульсии обычно называют «субмикронными эмульсиями».
В одном варианте осуществления эмульсии типа «масло в воде» вакцины в соответствии с настоящим изобретением эмульсия представляет собой субмикронную эмульсию.
В одном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением адъювант выбран из группы, состоящей из: легкого минерального масла, Монтанида, Эмунада и SVEA.
Известно, что такие адъюванты оказывают положительные эффекты на иммуногенность вакцин для свиней. В одном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением вакцина представляет собой эмульсию типа «масло в воде», а адъювант представляет собой минеральное масло.
В предпочтительном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением минеральное масло представляет собой легкое или белое минеральное масло или парафиновое масло, коммерчески доступное под такими торговыми названиями, как: Marcol™ (ExxonMobil), Klearol™ (Sonneborn) или Drakeol™ (Penreco).
Более предпочтительным является использование дополнительного адъюванта, а именно: витамина Е, например альфа-токоферола или альфа-токоферола ацетата.
В предпочтительном варианте осуществления вакцинный препарат по настоящему изобретению содержит эмульсию типа «масло в воде» с поверхностно-активным веществом, легким парафиновым маслом и ацетатом альфа-токоферола. Более предпочтительным является препарат, в котором поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80 (Tween™ 80), и/или парафиновое масло представляет собой Marcol™ 52, и/или витамин Е представляет собой альфа-токоферола ацетат. Наиболее предпочтительным является препарат с Microsol Diluvac Forte™ или с Xsolve™ (оба: MSD Animal Health).
Другим преимущественным эффектом вакцины в соответствии с настоящим изобретением является предотвращение или уменьшение распространения PCV2 в стаде свиней: вертикально потомству и/или горизонтально внутри стада или популяции и в пределах географического района. В результате, применение вакцины в соответствии с настоящим изобретением приводит к уменьшению распространенности PCV2.
Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением вакцина предназначена для уменьшения распространенности PCV2 в популяции свиней или в географическом районе.
В одном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением также может содержать стабилизатор. Он может служить для улучшения характеристик эмульсии вакцины, для защиты склонных к деградации компонентов и/или для увеличения срока годности вакцины. Как правило, такие стабилизаторы представляют собой большие молекулы с большой молекулярной массой, такие как липиды, углеводы или белки; например, сухое молоко, желатин, сывороточный альбумин, сорбит, сахароза, трегалоза, спермидин, белковый гидролизат, декстран или поливинилпирролидон, и буферы, такие как фосфаты щелочных металлов.
Предпочтительно, когда стабилизатор не содержит соединений животного происхождения (без соединений от животных, ACF) или даже химически определен, например, как описано в WO 2006/094974.
Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может содержать консервант, такой как тимеросал, мертиолат, фенольные соединения и/или гентамицин. Предпочтительно, когда консервант не используется.
Само собой разумеется, что примешивание других добавок, которые необходимы или полезны для фармацевтической стабильности или для эффективности вакцины в соответствии с настоящим изобретением, вполне соответствует обычным возможностям специалиста и, следовательно, входит в объем настоящего изобретения.
Животными-мишенями для вакцины в соответствии с настоящим изобретением являются свиньи. Возраст, вес, пол, иммунологический статус и другие параметры вакцинируемой мишени не являются критическими, хотя вакцинировать здоровых, неинфицированных животных и вакцинировать как можно раньше, чтобы предотвратить любую полевую инфекцию, с помощью PCV2, очевидно, выгодно. Поскольку такая инфекция может укорениться уже в молодом возрасте.
Следовательно, в одном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением вакцина применяется для молодых свиней вскоре после рождения, предпочтительно в пределах 28 дней после рождения, более предпочтительно в пределах 21, 14, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или даже в пределах 1 дня после рождения, в этом порядке предпочтения.
Альтернативно, вакцину в соответствии с настоящим изобретением можно вводить беременной свиноматке для обеспечения поросят специфическими для PCV2 антителами материнского происхождения либо трансплацентарным путем, и/или посредством передачи через молозиво.
Преимущественно, когда на эффективность вакцины в соответствии с настоящим изобретением не влияет в значительной степени уровень антител против PCV2 материнского происхождения, которые молодые свиньи могут получить от своей матери; «молодой» относится к возрасту 4 недели или меньше.
Следовательно, в одном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением вакцина применяется для молодых свиней, имеющим антитела против PCV2 материнского происхождения.
Вакцина в соответствии с настоящим изобретением также может служить в качестве эффективной первичной вакцинации, за которой впоследствии может следовать бустерная вакцинация, и которая может усиливаться в результате бустерной вакцинации. Например, вакцина в соответствии с настоящим изобретением может вводиться поросенку в возрасте приблизительно 2-10 дней и снова приблизительно через 3 недели, при этом каждая вакцинация осуществляется в объеме, составляющем приблизительно 1 мл.
Однако, поскольку вакцина в соответствии с настоящим изобретением эффективна уже после однократного введения, предпочтительным вариантом осуществления является введение однократной дозы, составляющей, например, приблизительно 2 мл, в возрасте приблизительно от 3 недель. Эта вакцинация защищает свиней в течение всего периода откорма, приблизительно до 5-6 месячного возраста.
Если свинью-мишень для вакцины в соответствии с настоящим изобретением намерены содержать в течение более 6 месяцев, например свиноматок для разведения или хряков для производства сперматозоидов, им можно делать обычную бустерную вакцинацию 1, 2 или 3 раза в год, например, в случае свиноматок: одну бустерную вакцинацию перед каждым опоросом, что в среднем составляет приблизительно 2,2 раза в год.
В случае настоящего изобретения «приблизительно» означает, что число может варьироваться на ± 25% вокруг указанного для него значения. Предпочтительно «приблизительно» означает ± 20% от его значения, более предпочтительно «приблизительно» означает ± 15, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2% от его значения или даже «приблизительно» означает ± 1% от его значения, в этом порядке предпочтения.
Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может использоваться либо в качестве профилактического, либо в качестве терапевтического лечения, либо и того, и другого, поскольку она препятствует как укоренению, так и развитию PCV2 инфекции или связанных заболеваний.
Предпочтительно, когда вакцина в соответствии с настоящим изобретением приготовлена в форме, которая подходит для парентерального введения, т.е. в виде инъецируемой жидкости, такой как суспензия, раствор, дисперсия или эмульсия.
Схема введения вакцины в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно интегрирована в существующие схемы вакцинации с использованием других вакцин, которые могут потребоваться свиньям-мишеням, для уменьшения стресса для животных и сокращения трудозатрат. Эти другие вакцины могут вводиться одновременно, совместно или последовательно, способом, совместимым с их зарегистрированным применением.
Вакцина в соответствии с настоящим изобретением содержит от приблизительно 0,1 до приблизительно 1000 мкг белка ORF2b-131P PCV2b в каждой дозе для животного. Предпочтительно, когда вакцина содержит от 0,5 до 500 мкг, от 1 до 250 или даже от 2 до 200 мкг белка ORF2b-131P PCV в каждой дозе для животного, в этом порядке предпочтения.
Количество белка ORF2b-131P в каждой дозе для животного можно определить в готовой вакцинной эмульсии, используя стандартные биохимические лабораторные процедуры, например, путем разрушения эмульсии и исследования водной фазы, используя электрофорез в SDS-ПААГ. Затем определяют количества путем сравнения с известными количествами эталонного белка, например бычьего сывороточного альбумина. См., например: The Protein Protocols Handbook, 2nd edition, September 2002, ed. J.M. Walker, Humana Press Inc., Totowa, NJ; Chapter 29, p. 237-242.
Альтернативно, количественное определение белка ORF2 может быть выполнено с использованием масс-спектрометрии.
Предпочтительно количество белка ORF2b-131P PCV в каждой дозе для животного определяют в водном объеме антигенной фазы перед смешиванием и/или образованием эмульсии с масляной фазой.
Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может вводиться в объеме, приемлемом для животного-мишени, и ее объем может, например, составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мл. Предпочтительно, когда одна доза составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 мл, более предпочтительно, когда одна доза для животных составляет от 0,2 до 3 мл.
При введении внутримышечно объем одной дозы предпочтительно составляет от приблизительно 1 до приблизительно 3 мл, более предпочтительно приблизительно 2 мл. При внутрикожном введении объем одной дозы предпочтительно составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мл, более предпочтительно приблизительно 0,2 мл.
Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может вводиться свинье-мишени в соответствии со способами, известными в данной области техники. Предпочтительное применение осуществляется парентеральным путем, т.е. через кожу, например: внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно, подслизисто или подкожно. Более предпочтительным путем введения вакцины в соответствии с настоящим изобретением является внутримышечная или подкожная инъекция. Еще более предпочтительным является введение внутримышечно в заднюю ногу или в шею.
Само собой разумеется, что оптимальный путь применения будет зависеть от характерных особенностей используемой вакцины и от конкретных характеристик мишени.
В одном варианте осуществления вакцину в соответствии с настоящим изобретением вводят внутримышечно свинье в возрасте от приблизительно 3 недель в виде однократной дозы, составляющей приблизительно 2 мл.
Предпочтительным местом для внутримышечного введения является шея.
В одном варианте осуществления объем дозы введения вакцины в соответствии с настоящим изобретением внутримышечным путем является регулируемым, т.е. вакцину вводят либо в виде однократной дозы, составляющей 2 мл/животное, либо в виде двух последовательных доз по 1 мл/животное. При введении в виде двух доз, обе предпочтительно разделены во времени по крайней мере на 1 неделю, предпочтительно на 2-5 недель, более предпочтительно приблизительно на 3 недели.
В одном варианте осуществления вакцину в соответствии с настоящим изобретением вводят внутрикожно свинье в возрасте приблизительно от 3 недель в виде однократной дозы, составляющей приблизительно 0,2 мл.
Предпочтительное место для внутрикожного введения выбрано из: шеи, спины и задней ноги.
Специалист вполне может дополнительно оптимизировать вакцину в соответствии с настоящим изобретением. Как правило, это включает точную настройку эффективности вакцины для дальнейшего увеличения обеспечиваемой ею иммунной защиты. Это может быть сделано путем регулирования дозы, объема или содержания антигена в вакцине; путем использования вакцины в другой форме или препарате; путем адаптации других компонентов вакцины (например, стабилизатора или адъюванта); или путем применения другим путем, способом или по другой схеме. Все это входит в объем настоящего изобретения.
Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать другие соединения, такие как дополнительный антиген, цитокин или иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, содержащая неметилированный CpG и т.д. Альтернативно, вакцина в соответствии с настоящим изобретением может быть преимущественно скомбинирована с фармацевтическим компонентом, например, антибиотиком, гормоном, противовоспалительным или противопаразитарным средством. Или сама вакцина в соответствии с настоящим изобретением может быть добавлена к вакцине.
Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может быть преимущественно скомбинирована с одним или более дополнительных антигенов, например, происходящих от другого патогена для свиней. Преимущество такой комбинированной вакцины состоит в том, что она не только индуцирует иммунный ответ на PCV2, но и на другие патогены, в то время как для вакцинации требуется только одно манипулирование животным-мишенью, что также уменьшает стресс от вакцинации у животного, а также сокращает затраты времени и трудозатраты.
Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением содержит дополнительный антиген микроорганизма, патогенного для свиней.
«Дополнительный антиген» может быть самим инфекционным микроорганизмом, или быть инактивированным, или субъединицей, и может быть вместе с адъювантом или без него. Дополнительный антиген может состоять из биологической или синтетической молекулы, такой как белок, углевод, липополисахарид, липид или молекула нуклеиновой кислоты. Альтернативно, он может представлять собой продукт экспрессии с нуклеиновой кислоты этого другого микроорганизма или вектора, включающего такую нуклеиновую кислоту; вектор может представлять собой сам микроорганизм или эукариотическую клетку-хозяина.
Дополнительный антиген может быть «получен» из другого микроорганизма, патогенного для свиньи, любым способом, например, в виде экстракта, фракции, лизата, гомогената или полученного в результате воздействия ультразвука гомогената.
«Микроорганизм, патогенный для свиней» по настоящему изобретению, хорошо известен в данной области техники. Следовательно, дополнительный антиген может быть получен в принципе из любого вируса, бактерии, паразита, гриба, риккетсии, простейшего и/или паразита, который являются патогенным для свиней.
Примерами таких микроорганизмов, патогенных для свиней, являются: вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), вирус псевдобешенства, парвовирус свиней, вирус классической чумы свиней, вирус гриппа свиней, вирус ящура, вирус эпидемической диареи свиней, вирус трансмиссивного гастроэнтерита, вирус везикулярного стоматита, Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Escherichia coli, Streptococcus suis, или Salmonella, Brachyspira, Clostridia, Pasteurella, Erysipelothrix, Bordetella, Toxoplasma, Isospora или Trichinella.
В предпочтительном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением вакцина содержит наряду с антигеном из PCV2 один или более антигенов микроорганизма, патогенного для свиней, выбранных из группы, состоящей из M. hyopneumoniae, L. intracellularis и PRRSV.
Поскольку в настоящее время они являются самыми известными патогенами для свиней, их комбинация в готовой вакцине для однократного введения очень выгодна как с экономической, так и с ветеринарной точки зрения.
В предпочтительном варианте осуществления один или более дополнительных антигенов добавляют в вакцину в соответствии с настоящим изобретением в виде лиофилизированного препарата, и в результате комбинированную вакцину получают путем воссоздания с использованием вакцинной эмульсии по настоящему изобретению. Это описано, например, в WO 2010/106095.
В предпочтительном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением представляет собой комбинированную вакцину, содержащую мутантный белок ORF2 PCV2b и антиген из М. hyopneumoniae, и указанную комбинированную вакцину используют для воссоздания лиофилизированного препарата антигена из L. intracellulars и/или из PRRSV.
В предпочтительном варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением представляет собой комбинированную вакцину, содержащую мутантный белок ORF2 PCV2b, антиген из М. hyopneumoniae и антиген из L. intracellulars, и указанную комбинированную вакцину используют для воссоздания лиофилизированного препарата антигена из PRRSV.
В дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к способу подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания у свиньи, при этом способ включает введение указанному животному вакцины в соответствии с настоящим изобретением.
Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена способами, хорошо известными специалисту. Как описано, использование мутантного белка ORF2 PCV2b, описанного для настоящего изобретения, или клеток насекомых, описанных для настоящего изобретения, делает возможным производство вакцины для свиней, описанной для настоящего изобретения. В этом отношении мутантный белок ORF2 PCV2b также можно получить способом в соответствии с настоящим изобретением.
Следовательно, в дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к применению мутантного белка ORF2 PCV2b, имеющего пролин в аминокислотном положении под номером 131, для производства вакцины для свиней для подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания.
В дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к мутантному белку ORF2 PCV2b, имеющему пролин в аминокислотном положении под номером 131, для применения в вакцине для свиней для подавления PCV2 инфекции или связанных с ней признаков заболевания.
В дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к способу приготовления вакцины в соответствии с настоящим изобретением, включающему одну или более стадий, выбранных из:
- смешивания мутантного белка ORF2 PCV2b, имеющего пролин в аминокислотном положении под номером 131, с фармацевтически приемлемым носителем; и
- составления указанной смеси мутантного белка ORF2 PCV2b и фармацевтически приемлемого носителя вместе с адъювантом.
Для применения в способе приготовления вакцины в соответствии с настоящим изобретением мутантный белок ORF2 PCV2b получают способом экспрессии мутантного белка ORF2 PCV2b в клетках насекомых в соответствии с настоящим изобретением и/или получают способом получения мутантного белка ORF2 PCV2b в соответствии с настоящим изобретением.
В одном варианте осуществления способа приготовления вакцины в соответствии с настоящим изобретением мутантный белок ORF2 находится в форме VLP.
Вакцина в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена специалистом в форме, которая подходит для введения свинье-мишени и которая соответствует желаемому пути применения и желаемому эффекту. Обычно такие вакцины готовятся стерильными и при физиологическом pH.
Подробности и примеры способа, применения или способа приготовления вакцины в соответствии с настоящим изобретением описаны здесь, и такие процедуры легко применимы специалистом в данной области техники с использованием обычных материалов и способов. Например, мутантный белок ORF2 PCV2b, описанный для настоящего изобретения, можно продуцировать в клетках насекомых в промышленном масштабе, а затем объединить с фармацевтически приемлемыми наполнителями, составить в вакцину, например, путем эмульгирования с маслом в качестве адъюванта и заполнить вакциной контейнеры соответствующего размера. Различные стадии производственного процесса будут контролироваться с помощью соответствующих исследований, например иммунологических исследований на качество и количество антигенов; микробиологических исследований на инактивацию, стерильность и отсутствие посторонних агентов; и, в конечном итоге, путем проведений вакцинаций животных для подтверждения эффективности и безопасности. После завершения проверок качество, количества и стерильности вакцинный продукт может быть разрешен для продажи.
Все это хорошо известно специалисту, и общие методы и соображения, применимые к приготовлению вакцин, описаны, например, в правительственных директивах и правилах (Pharmacopoeia, 9CFR) и общеизвестных руководствах (Pastoret, Lippincot, выше).
Теперь настоящее изобретение будет дополнительно описано с помощью следующих неограничивающих примеров.
Примеры
Пример 1. Сборка различных рекомбинантных конструкций, экспрессирующих ORF2 PCV2.
Для экспрессии белков ORF2 PCV2 в клетках насекомых создавали рекомбинантные бакуловирусы, используя стандартные процедуры. Вкратце:
Использованные в этих экспериментах гены ORF2 PCV2 дикого типа были получены из различных источников: исходный вирус PCV2a был из вакцинного штамма из США; PCV2b был из французского изолята Imp1011, с номером доступа в GenBank: AF055394; PCV2d был из Китая, штамма BDH, с номером доступа в GenBank: HM038017.
Ген ORF2 субклонировали путем амплификации с использованием ПЦР и встраивания в плазмиду для клонирования. Затем некоторые из генов ORF2 были мутированы, также для кодирования пролина в аминокислотном положении 131, используя мутацию с помощью ПЦР. Альтернативно или дополнительно, гены ORF2 оптимизировали в отношении частоты использования кодонов, ради сходства с таблицей частоты использования кодонов в гене полиэдрина AcMNPV. Мутированные последовательности, используемые здесь для PCV2b, представлены в прилагаемом списке последовательностей, как описано.
Синтетические конструкции вставок мутированных генов ORF2 заказывали у коммерческого поставщика (BaseClear, Нидерланды; или Genscript, Piscataway, NJ, США).
Для использования с системой Bac-to-Bac их субклонировали в вектор для клонирования pFastBad, а для использования с системой ProEasy в вектор для переноса pVL1393. В обоих случаях вставка находилась за промотором гена полиэдрина. Создание и отбор рекомбинантного бакуловируса осуществляли в соответствии с инструкциями производителя. Некоторые из рекомбинантных бакуловирусных конструкций для PCV2a конструировали с использованием классического набора методов трансфекции и выделения рекомбинантов путем посева инфицированных клеток насекомых под мягким агаром и отбора бляшек налета.
Все рекомбинантные бакуловирусы амплифицировали в клетках Sf9, собирали, хранили в холодильнике или замораживали и титровали. Запасы вирусов, используемые для дальнейших экспериментов, составляли, как правило, от 7,5 до 8,5 Log10 TCID50/мл (дозы заражения 50% культуры ткани/мл).
Набор рекомбинантных бакуловирусов, используемых для экспрессии белка ORF2 PCV2 в клетках насекомых, приведен в таблице ниже:
Примечание: Все вставки находились за промотором гена полиэдрина. Оптимизация в отношении частоты использования кодонов (при применении) была направлена на частоту использование кодонов в гене полиэдрина AcMNPV.
Номер вируса
Генотип PCV2
Бакуловирусная конструкция
Оптимизация частоты использования кодонов
Аминокислота в положении 131
1
2a
отобранная бляшка
Нет
Пролин
2
2a
отобранная бляшка
Да
Пролин
3
2a
Bac-to-Bac
Нет
Пролин
4
2a
Bac-to-Bac
Да
Пролин
5
2a
ProEasy
Да
Пролин
6
2b
Bac-to-Bac
Нет
Треонин
7
2b
Bac-to-Bac
Да
Треонин
8
2b
Bac-to-Bac
Нет
Пролин
9
2b
ProEasy
Да
Пролин
10
2b
ProEasy
Да
Пролин
Пример 2: Экспрессия в клетках насекомых
Различные рекомбинантные бакуловирусные конструкции, описанные выше, использовали для инфицирования клеток насекомых и экспрессии нескольких вариантов белка ORF2 PCV2. Полученный белок визуализировали и анализировали для оценки эффекта различных введенных мутаций по сравнению с немодифицированным белком или с белком PCV2 другого генотипа. Некоторые рекомбинантные бакуловирусы были масштабированы для производства белка для приготовления субъединичной вакцины против PCV2 для тестирования на свиньях.
2.1 КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК НАСЕКОМЫХ
Стандартные эксперименты по инфицированию и экспрессии проводились в небольшом масштабе, используя клетки насекомых Sf9, которые были взяты из спин-культуры чистых клеток, которые регулярно разделялись для поддержания экспоненциального роста. Типичные показатели инфицирования составляли от 0,01 до 0,1 MOI (множественность заражения), а продолжительности культивирования составляли от 3 до 5 дней. Культуры регулярно контролировали с помощью световой микроскопии для проверки здорового состояния неинфицированных клеток или для контролирования хода репликации вирусов в инфицированных культурах.
Используемые сосуды для культивирования представляли собой или T25, или T75 матрасы (Falcon) с однослойными культурами объемом 5 или 15 мл, соответственно. Альтернативно, 100 мл суспензионных культур помещали во вращающиеся колбы (Corning). Колбы инкубировали при 27°С, и использовали культуральную среду Sf-900™ II (Thermo Fisher Scientific). Не добавляли сыворотку, но добавляли смесь антибиотиков: 50 мкг/мл гентамицина и 0,25% натамицина.
Когда большинство клеток демонстрировали цитопатическое действие (cpe), культуры собирали: в случае культур в T-матрасах требовалось постукивание изо всех сил для отсоединения клеток. Затем собранные культуры центрифугировали, и супернатант культуры отбрасывали, поскольку продуцированный белок ORF2 в основном содержался в клетках насекомых. В зависимости от предполагаемого дальнейшего использования клеточный осадок можно было затем ресуспендировать в требуемой жидкости в желаемой концентрации.
Мелкомасштабные культуры обычно не инактивировали; образцы либо использовали в защитных приспособлениях, либо обрабатывали денатурирующим буфером для образцов для электрофореза, а затем считали инактивированными.
Крупномасштабные культуры выполняли в основном по той же схеме, с регулированием объема и с адаптацией к оборудованию. В экспериментальных условиях промежуточные крупномасштабные суспензионные культуры клеток насекомых выполняли в объеме от 2 до 10 литров в промышленных ферментерах с автоматическим контролем процесса. Чистые клетки насекомых Sf9 получали из предварительной культуры. MOI составляла от 0,01 до 0,1, и культивирование длилось 5-7 дней. Когда инфекция развивалась в достаточной степени, клетки оставляли оседать под действием силы тяжести. Затем верхние 90% объема культуры удаляли, клетки собирали в 1/10 от исходного объема культуры и лизировали обработкой ультразвуком. Обработку ультразвуком в среднем масштабе выполняли партиями на льду с использованием ультразвукового дезинтегратора с тонким концом (Vibra Cell™, Sonics, CT, США). В больших масштабах (в объемах 100 л или более) обработка ультразвуком проводилась путем пропускания через проточную камеру для обработки ультразвуком (Sonobloc™, Bandelin).
Затем гомогенат, полученный при воздействии ультразвука, инактивировали с использованием BEI. Затем его нейтрализовали с использованием Na-тиосульфата. Затем инактивированный сбор осветляли центрифугированием, и супернатант, содержащий белок ORF2, сохраняли в виде водной фазы основной массы антигена. Ее хранили при 2-8°C для контроля качества и дальнейшей обработки. В этих продуктах фармацевтически приемлемый носитель для антигена, таким образом, представляет собой истощенную в результате культивирования клеток насекомых среду. При необходимости основную массу антигена можно было сконцентрировать или подвергнуть диализу против PBS. Альтернативно, антиген мог быть разбавлен свежей средой для культивирования клеток насекомых или PBS.
2.2 ELISA
2.2.1 Схема ELISA
Культуры клеток насекомых инфицировали рекомбинантными бакуловирусами под № 6 (Треонин в положении 131) или вирусом под № 8 (с заменой T131P) для проверки эффекта замены T131P в белке ORF2 PCV2b. Оба являются конструкциями в формате Bac-2-Bac и были без оптимизации в отношении частоты использования кодонов. В случае вируса 6 были исследованы два изолята.
Содержащиеся в T175 матрасах культуры клеток Sf9 инфицировали, инкубировали и собирали центрифугированием всей культуры. Клеточные осадки помещали в 10 мл воды для инъекций, которая эффективно лизировала все клетки. Клеточные лизаты затем исследовали на их антигенную массу в сэндвич-ELISA, кратко следующим образом:
Лунки микропланшета для титрования из полистирола покрывали моноклональным антителом, направленным против ORF2a PCV2. Серийные разведения образцов лизатов инкубировали вместе с рядом разведений известного аналитического стандарта ORF2 PCV2a. Затем планшеты инкубировали с фиксированным количеством второго антитела, также направленного против ORF2a PCV2, которое было конъюгировано с биотином. Наконец, количество связанного конъюгата затем количественно анализировали путем инкубации со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой, с последующим определением хромофоров с помощью автоматического планшет-ридера.
Количество антигена в лизатах рассчитывали по аналитическому стандарту, количество антигена в котором было произвольно установлено на уровне 100 антигенных единиц (AU)/мл.
2.2.2 Результаты и выводы ELISA
Количество белка ORF2, обнаруженного в лизатах, было следующим:
- клетки, инфицированные вирусом 6 (два варианта): 5,5 и 7,4 AU/мл,
- клетки, инфицированные вирусом 8: 68 AU/мл.
Лизат, приготовленный в чистой воде из клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом, экспрессирующим белок ORF2 PCV2b без мутации в положении 131, содержал лишь очень незначительное количество белка ORF2, как обнаружено с помощью ELISA. Однако такой лизат из клеток, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим ORF2 с заменой T131P, содержал приблизительно в 10 раз больше белка.
Эти результаты ELISA иллюстрируют большую разницу в количестве белка ORF2, который мог быть без труда выделен из инфицированных клеток насекомых, с заменой или без замены аминокислоты под номером 131 в ORF2. С одной стороны, это было связано с легкостью, с которой белок высвобождается в неденатурирующем лизате. С другой стороны, это также отражало разницу в общей продукции белка ORF2 PCV2b в клетках насекомых, без или без мутации аминокислоты в положении 131.
2.3 ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
2.3.1 Схема IFT анализов
4
Для иммунофлюоресцентных исследований (IFT) чистые клетки насекомых высевали в лунки 96-луночного микропланшета для титрования, обычно в количестве 2,5×10 клеток в каждую лунку, в 100 мкл среды. После прикрепления клетки инфицировали конкретным рекомбинантным бакуловирусом, подлежащим исследованию. Как правило, инокулировали ряд разведений вируса для обеспечения возможности наблюдения при различных MOI. Планшеты анализировали через 4-5 дней инкубации, когда клетки насекомых становились должным образом инфицированными, но еще не подвергались лизису. Среду удаляли, клетки фиксировали холодным этанолом и окрашивали соответствующими антителами в соответствии со стандартными процедурами. FITC-конъюгированное второе антитело использовали для визуализации. Клетки насекомых подвергали контрастному окрашиванию голубым Эванса для усиления контраста с фоном.
В этих IFT исследованиях используемое первое антитело представляло собой антисыворотку с поликлональными антителами против PCV2a свиней, оно была также способно окрашивать белок ORF2 генотипа PCV2b и PCV2d.
2.3.2 Результаты IFT анализов
При сравнении результатов IFT, наблюдаемых для различных продуктов экспрессии белка ORF2, было сделано несколько наблюдений:
- Рекомбинантные вирусы 1-5, описанные выше, все экспрессирующие белок ORF2 PCV2a, все без исключения приводили к картине цитоплазматического окрашивания, в результате чего по существу вся клетка насекомого демонстрировала яркую окраску.
- Однако клетки насекомых, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом под № 6, экспрессирующим белок ORF2 PCV2b дикого типа, демонстрировали существенно иную картину, когда окрашивание обнаруживалось исключительно вокруг ядра клеток насекомых. Цитоплазматического окрашивания не наблюдалось.
- Эта IFT картина была в значительной степени такой же для клеток насекомых, инфицированных вирусом под № 7, который также экспрессирует белок ORF2 PCV2b, но с оптимизированного в отношении частоты использования кодонов гена. Единственным отличием было то, что небольшое количество (приблизительно 10% клеток насекомых) продемонстрировало цитоплазматическое окрашивание, в то время как большинство клеток все еще демонстрировали ядерное окрашивание.
- Удивительно, но клетки насекомых, инфицированные вирусом под № 8, давали IFT картину, которая была противоположной картине в случае рекомбинантного вируса под № 7: большинство клеток насекомых демонстрировали цитоплазматическое окрашивание, при этом некоторые клетки все еще демонстрировали ядерное окрашивание. Вирус под № 8 имел ген ORF2 PCV2b, в котором кодон, кодирующий аминокислоту под № 131, был мутирован с заменой треонина на пролин (T131P).
- Наконец, клетки насекомых, инфицированные вирусом под № 9 (ген ORF2 PCV2b с оптимизацией в отношении частоты использования кодонов и с заменой T131P, в чистой конструкции), исключительно все продемонстрировали цитоплазматическое окрашивание.
- Примечательно, что клетки насекомых, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом под № 10 (кодирующим белок ORF2 PCV2d с заменой T131P, с оптимизацией в отношении частоты использования кодонов и в чистой конструкции), все еще демонстрировали картину ядерного окрашивания.
2.3.3 Выводы из IFT анализов
Был сделан вывод, что для эффективной экспрессии белка ORF2 из PCV2b в клетках насекомых требуется замена аминокислоты в положении под номером 131 на пролин, демонстрируя картину цитоплазматического окрашивания в IFT с использованием антитела против PCV2a. Без такой мутации белок ORF2 PCV2b демонстрировал окрашивание исключительно в или вокруг ядра клетки насекомого, экспрессирующей этот белок.
Мутация в гене ORF2 лишь в результате оптимизации в отношении частоты использования кодонов привела к небольшому смещению картины окрашивания при IFT, вероятно, в результате увеличения эффективности экспрессии.
Картина ядерного окрашивания могла быть, кроме того, изменена на противоположную, когда рекомбинантный бакуловирус не был основан на конструкции, содержащей остаточные элементы из вектора для клонирования (например, в рекомбинанте, полученном с использованием системы Bac-to-Bac), но представлял собой «чистую» бакуловирусную конструкцию, т.е. не содержал дополнительные генетические элементы в процессе рекомбинации в своем геноме. Такие чистые рекомбинантные бакуловирусы могут быть получены с использованием классической гомологичной рекомбинации и очистки из бляшек или, что более удобно, с использованием коммерческого набора, такого как система ProEasy.
Таким образом: изменение картины ядерного окрашивания при IFT на противоположную, наблюдаемое в клетках насекомых, экспрессирующих белок ORF2 PCV2b, может быть достигнуто путем мутации триплета, кодирующего аминокислоту ORF2 под номером 131, для кодирования пролина. Дальнейшая оптимизация цитоплазматической экспрессии белка ORF2 может быть достигнута с помощью оптимизации в отношении частоты использования кодонов кодирующего гена и использования чистой рекомбинантной бакуловирусной конструкции.
2.4 Количественная оценка с помощью гель-электрофореза
2.4.1 Схема гель-электрофорезных анализов
Для обеспечения количественной оценки уровня экспрессии различных белков ORF2 образцы культур инфицированных клеток насекомых были подвергнуты электрофорезу в SDS-ПААГ, вместе с дорожками с известными количествами бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве маркерного белка. После окрашивания гели сканировали и анализировали. Используя сильно денатурирующий буфер для образцов, этот эксперимент выявил общую способность к экспрессии клеток насекомых, инфицированных различными рекомбинантными бакуловирусными конструкциями.
Различные рекомбинантные бакуловирусы, подлежащие исследованию, культивировали в T75 матрасах, как описано, собирали, центрифугировали, и клеточные осадки суспедировали в 7,5 мл PBS. Образцы супернатанта и ресуспендированных клеток затем помещали в стандартный денатурирующий буфер для образцов Laemmli для электрофореза в SDS-ПААГ (содержащий индикатор бромфеноловый синий и бета-меркаптоэтанол).
Образцы подвергали электрофорезу в стандартных полиакриламидных гелях (готовых Criterion TGX™, Any kD (15%), Bio-Rad) в стандартном электродном буфере Трис-глицин-SDS. После электрофореза гели окрашивали Instant Blue™ (Expedeon). Наконец, гели оцифровывали и анализировали с помощью откалиброванного денситометра Bio-Rad GS-900, используя программное обеспечение Image Lab™, версии 5.2.1, для определения количества белка в отдельных полосах в геле.
2.4.2. Результаты гель-электрофорезного анализа
На фиг. 1 и 2 представлены некоторые репрезентативные изображения геля, например, использованные в этих экспериментах: Фиг. 1: образцы культур клеток насекомых, инфицированных вирусами под № 3, 6 или 7; и Фиг. 2: образцы культур с вирусами под № 8 или 9. Для каждого типа вируса первая дорожка содержит образец супернатанта культуры, следующие три дорожки содержат образцы 2х концентрированных клеток в объеме 30, 20 и 10 мкм, слева направо. Самая левая и самая правая дорожки: маркеры молекулярной массы 10-250 кДа (Precision Plus Protein™ Standards, Bio-Rad), размеры полос указаны на фигурах.
Каждый гель также содержал ряд разбавлений BSA (высококачественного альбумина в качестве стандарта, Thermo Fisher Scientific), который использовался в виде 100 нг/мкл раствора. Используемые количества были следующими: фиг. 1: на дорожках 14-17: 0,25, 0,5, 1 и 2 мкг BSA; фиг. 2: на дорожках 11-15: 0,25, 0,5, 1, 2 и 3 мкг BSA.
Анализы с помощью денситометра были сфокусированы на полосах белка ORF2 PCV2 с М.м. 26 кДа. Все образцы были проанализированы в гелях два раза, рассчитанные результаты по выходам являются средними двух повторов.
Выходы белка ORF2 PCV2 представлены в микрограммах белка на мл исходной культуры в Т75 (объем 15 мл). Было установлено, что выходы были следующими:
Номер вируса
Генотип PCV2
Бакуловирусная конструкция
Оптимизация частоты использования кодонов
Аминокислота в положении 131
Выход ORF2 (мкг/мл)
3
2a
Bac-to-Bac
Нет
Пролин
32
6
2b
Bac-to-Bac
Нет
Треонин
26
7
2b
Bac-to-Bac
Да
Треонин
36
8
2b
Bac-to-Bac
Нет
Пролин
58
9
2b
ProEasy
Да
Пролин
76
Можно было сделать несколько наблюдений:
- В случае вирусных инфекций, обусловленных вирусами под № 8 и 9, двух конструкций для PCV2b ORF2 с заменой T131P, дорожки в геле (см. фиг. 2) выглядели немного темнее, чем в случае других исследованных вирусов, даже несмотря на то, что для всех культур, сравниваемых с помощью электрофореза в SDS-ПААГ, MOE (0,1), время культивирования (4 дня) и другие условия были одинаковыми. Это могло указывать на то, что инфекция могла не развиться так далеко, как в случае других вирусов, что приводит к увеличению количества клеточного материала в образце. Возможно, замена на пролин вызывала небольшую аттенюацию рекомбинантного бакуловируса. Однако уровни экспрессии белка оказались незатронутыми и были выше, чем в случае ORF2 PCV2b без этой мутации.
- Ни один из образцов супернатанта не продемонстрировал количество белка ORF2, которое можно было бы визуализировать с помощью окрашивания CBB, которое использовали. Следовательно, в условиях, применяемых в этих экспериментах, фактически весь экспрессированный белок ORF2 содержался в клетках насекомых.
- Уровень экспрессии немутированного белка ORF2 PCV2b (вируса 6) был ниже, чем в случае ORF2 PCV2a (вируса 3), 26 мкг/мл в сравнение с 32 мкг/мл. Следует напомнить, что в этих образцах выявляется общее количество всего продуцированного белка из-за используемой агрессивной денатурации (кипячение в SDS и бета-меркаптоэтаноле). Это означает, что общая экспрессия белка с немутированного гена ORF2 PCV2b на самом деле ниже в целом в клетках насекомых.
- Примечание: эта разница в выходе намного больше на практике, когда сбор происходит без (сильной) денатурации. В этом случае в лизатах клеток насекомых, экспрессирующих немутированный ORF2 PCV2b, почти не обнаруживался какой-либо определяемый белок ORF2.
- Выход немутированного белка ORF2 PCV2b мог быть немного увеличен при использовании оптимизированного в отношении частоты использования кодонов гена ORF2: сравните выходы вирусных культур 6 и 7, при этом общие выходы составляли 26 и 36 мкг/мл, соответственно.
- Однако наиболее значительное увеличение было достигнуто введением замены T131P в белок ORF PCV2b, см. выходы вирусных культур 6 и 8, 26 мкг/мл в сравнение с 56 мкг/мл. Таким образом, замена T131P способна привести к увеличению более чем вдвое общего выхода белка ORF2 даже в этих мелкомасштабных культурах без какой-либо оптимизации.
- Еще лучшие выходы белка ORF2 PCV2b могли быть достигнуты, когда все мутации были объединены: замена T131P, оптимизация в отношении частоты использования кодонов и использование чистой бакуловирусной конструкции: сравнение выходов вирусных культур 6 и 9 показывает тройное увеличение выхода белка, 26 мкг/мл в сравнение с 76 мкг/мл.
Аналогичный анализ выхода белка также проводили на образцах, которые были получены в промежуточных крупномасштабных культурах объемом 2 литра. Сборы получали в 7,7x концентрации по сравнению с общим объемом культуры. Белок ORF2 из этих культур также использовали для получения экспериментальных вакцин против PCV2, описанных ниже.
Были получены следующие выходы белка ORF2, указанные в мкг/мл исходного 2-литрового объема культуры:
Номер вируса
Генотип PCV2
Бакуловирусная конструкция
Оптимизация частоты использования кодонов
Аминокислота в положении 131
Выход ORF2 (мкг/мл)
5
2a
ProEasy
Да
Пролин
44,2
9
2b
ProEasy
Да
Пролин
103,9
Условия культивирования в ферментерах были явно более оптимальными, чем в мелкомасштабных культуральных T-матрасах. Не только из-за автоматического контроля температуры, pH и растворенного кислорода, но также потому, что это были суспензионные культуры, которые допускают более высокую плотность клеток на мл культуры.
Используемые рекомбинантные бакуловирусы также были сконструированы оптимально в том смысле, что они имели оптимизированный в отношении частоты использования кодонов ген ORF2 в чистой бакуловирусной конструкции (полученной с использованием системы ProEasy).
Это привело к выходу белка для клеток насекомых, инфицированных вирусом под № 9, превышающему 100 мкг/мл культуры, в то время как в T-матрасах он составлял 76 мкг/мл.
Примечательно, что выход белка из клеток насекомых, экспрессирующих мутантный белок ORF2 PCV2b с заменой аминокислоты под номером 131 на пролин, был значительно выше, чем в случае немодифицированного белка ORF2 PCV2a, даже несмотря на то, что использовались одинаковые конструкций и условия культивирования. В частности, из-за того, что ген ORF2 PCV2a, использованный здесь, также имел пролин в аминокислотном положении 131 по сравнению с его нативной последовательностью. Не сразу очевидно, что может вызвать это разницу, хотя она, очевидно, очень благоприятна для производства белка ORF2 PCV2b для производства субъединичных вакцин против PCV2.
2.4.3 Выводы из анализов с помощью гель-электрофореза
Хотя не все наблюдаемые эффекты могут быть объяснены в настоящее время, анализ с помощью гель-электрофореза ясно показал, что экспрессия в клетках насекомых белка ORF2 PCV2b без какой-либо адаптации, в лучшем случае, дает меньшее количество белка, чем экспрессия ORF2 PCV2a. Эта разница даже больше, когда клетки собирают в неденатурирующих условиях.
Однако недостаток выхода может быть более чем восполнен заменой аминокислоты в положении 131 в ORF2 PCV2b на пролин, которая по крайней мере удваивает выход по сравнению с выходом немутированного белка ORF2 PCV2b.
Еще большее увеличение выхода может быть достигнуто путем экспрессии мутации 131P с оптимизированного в отношении частоты использования кодонов гена ORF2 и использования чистой бакуловирусной конструкции. Дальнейшие улучшения выходов могут быть достигнуты в крупномасштабных суспензионных культурах.
Вместе эти данные впервые делают возможным коммерческое и крупномасштабное производство белка ORF2 генотипа PCV2b с помощью рекомбинантной экспрессионной системы.
Пример 3. Эксперименты по вакцинации с последующим контрольным заражением на свиньях
3.1. ВВЕДЕНИЕ
3.1.1 Цель.
Это исследование было выполнено для сравнения и оценки эффективности вакцин для свиней на основе экспрессированных в клетках насекомых мутантных белков ORF2 PCV2 в соответствии с настоящим изобретением. Для обеспечения тщательной проверки их способности к защите белки ORF2 различных генотипов использовали для такой проверки от контрольного заражения не только гомологичным PCV2 вирусом, но и гетерологичным PCV2 вирусом. Также используемые дозы вакцины содержали относительно низкие количества белка ORF2.
3.1.2. Схема исследования
Для этого исследования использовали 140 поросят, распределенных на 2 совокупности по 7 групп лечения, 10 животных в каждой группе, одна совокупность для каждого из двух заражений. 140 животных были получены от 14 свиноматок. У поросят были обнаруживаемые уровни антител против ORF2 PCV2 в диапазоне от низких до очень высоких титров; средний титр MDA (материнских антител) для всех животных составлял 5,8 Log2 в соответствии с ELISA с использованием антител.
Поросят вакцинировали внутримышечно в шею с использованием 2 мл каждому, когда им было приблизительно три недели. Используемые вакцины содержали различные количества белка ORF2 PCV2, продуцируемого с помощью бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых, одного из трех генотипов: PCV2a, 2b или 2d. Использованные рекомбинантные бакуловирусы имели номера 5, 9 и 10, как описано выше, с пролином в аминокислотном положении 131, экспрессированным с кодирующего ORF2 гена, который был оптимизирован в отношении частоты использования кодонов в направление к таковой в гене полиэдрина AcMNPV, и с использованием чистой бакуловирусной конструкции. Вакцины были приготовлены в виде эмульсий типа «масло в воде» вместе с адъювантом Emunade™. Вакцина дополнительно содержала антиген из Mycoplasma hyopneumoniae (штамм J), для сходства с коммерческой вакциной: Porcilis™ PCV M Hyo. Что касается антигена ORF2 PCV2, то тестируемая вакцина содержала либо четвертую часть, либо шестнадцатую часть стандартной полной дозы на животное.
Для обеих совокупностей распределение вакцинотерапий по группам было таким, как указано в таблице ниже.
Примечание: Животных в группе 7 обеих совокупностей не вакцинировали, чтобы они служили в качестве контролей заражения.
Группа
1
2
3
4
5
6
7
Доза вакцины (мкг белка ORF2/животное)
20
5
20
5
20
5
Без вакцинации
Генотип вируса для белка ORF2
2a
2b
2d
Через две недели после вакцинации всех животных доставляли в помещения, используемые для заражения. Через 3 недели после вакцинации (в возрасте 6 недель) всех животных подвергали контрольному заражению вирулентным PCV2 либо с генотипом 2b, либо с генотипом 2d. Контрольное заражение осуществляли с помощью интраназального введения 6 мл (3 мл в каждую ноздрю) PCV2 в PBS в концентрации 5 Log10 TCID50/мл; используя для совокупности 1: PCV2b (голландский изолят, 2003 г.) в качестве вируса для заражения, а для совокупности 2: PCV2d (немецкий изолят, 2015 г.) в качестве вируса для заражения. Вирусы для заражения получали в клетках PK15, не содержащих PCV, и проверяли на отсутствие бактерий и грибов.
Через три недели после заражения (в возрасте 9 недель) всех животных подвергали эвтаназии и осматривали: внутренние органы обследовали на месте, уделяя особое внимание: легким, паховым и брыжеечным лимфатическим узлам, миндалинам, вилочковой железе, селезенке, печени и почкам. Затем образцы из миндалин, легких, брыжеечного лимфатического узла и пахового лимфатического узла брали и фиксировали для обнаружения используемого для заражения вируса PCV с помощью иммуногистохимического анализа (IHC).
Также были выполнены другие анализы, такие как серология на образцах крови и кПЦР на образцах тканей и мазков. Однако данные IHC дали наиболее точные результаты.
3.2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.2.1 Белки ORF2 PCV2:
Последовательности генов ORF2 PCV2a, 2b и 2d были получены в промежуточных крупномасштабных культурах, как описано в разделе 2.1 выше. Их количественный анализ с помощью гель-электрофореза описан в разделе 2.3.2 выше.
3.2.2. Подопытные животные
Подопытные животные были негативными по PCV2-вирусной нагрузке и имели умеренные уровни антител против PCV2. От тестирования отказались бы, если бы у какого-либо из животных развились клинические признаки PCV2 инфекции до заражения.
Только здоровых животных включали в исследование. Всех поросят наблюдали ежедневно в отношении общего состояния здоровья и клинических или системных признаков заболевания, таких как потеря аппетита, нежелание двигаться, склонность лежать, вялость или сонливость, дрожь, щетина, отек (особенно вокруг глаз), рвота и диарея и одышка.
Поросят метили индивидуально с помощью ушных бирок, причем поросят из 14 приплодов делили поровну между исследуемыми группами. После отъема водопроводная вода предоставлялась неограниченно, а кормление осуществлялось в соответствии со стандартными процедурами.
Вакцинацию делали на ферме для опороса. После транспортировки в используемые для заражения помещения включали акклиматизацию в течение одной недели.
3.2.3 Лабораторные экспериментальные процедуры
3.2.3.1 Иммуногистохимический анализ
Образцы тканей готовили для гистологического исследования путем фиксации в 10% формалине и заливки в парафин. Готовили микроскопические препараты. Их инкубировали с кроличьей поликлональной сывороткой против PCV2 в качестве первого антитела и визуализировали окрашиванием пероксидазой (Envision+™, DAKO). Препараты подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином. При микроскопическом исследовании миндалин и лимфатических узлов характерное коричневое окрашивание оценивалось в зависимости от степени окрашивания:
- оценка 0: лимфоидные фолликулы не демонстрировали специфическое положительное окрашивание;
- оценка 1: менее 10% лимфоидных фолликулов содержали до 15 клеток со специфическим положительным окрашиванием;
- оценка 2: 10-50% лимфоидных фолликулов содержали до 15 клеток со специфическим положительным окрашиванием, или менее 10% лимфоидных фолликулов содержали более 15 клеток со специфическим положительным окрашиванием;
- оценка 3: >50% лимфоидных фолликулов содержали клетки со специфическим положительным окрашиванием.
Сумму оценок отдельных тканей регистрировали как общую IHC оценку на животное, и их объединяли для всех животных группы.
3.2.3.2 Вакцинные препараты
Исследуемые вакцины готовили в виде эмульсий типа «масло в воде» с Emunade™, это двойной адъювант с минеральным маслом, диспергированным в водной фазе, содержащей антигены вакцины, а также гидроксид алюминия. Препарат с 9% антигена Mhyo соответствовал процедуре, описанной в WO 2016/091998.
Также вакцина была приготовлена в соответствии с EP 1926496, так что 25% полной дозы (2 мл/животное) содержали приблизительно 20 мкг белка ORF2, а 6,25% дозы содержали 5 мкг белка ORF2/животное.
3.3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
С помощью иммуногистохимического исследования образцы ткани миндалин, брыжеечных и паховых лимфатических узлов, собранные после смерти, анализировали для оценки количества обнаруживаемого заражающего вируса. Графический обзор этих результатов представлен на фиг. 3 и 4. На фиг. 3 представлены результаты для животных в группах 1-7 совокупности 1, подвергнутых контрольному заражению вирулентным вирусом PCV2b; на фиг. 4 представлены данные IHC для всех животных совокупности 2, в которой животных заражали вирулентным вирусом PCV2d. По вертикальной оси представлена оценка интенсивности IHC по шкале, описанной выше. Результаты IHC могут использоваться для определения эффективности вакцин на основе белка ORF2 PCV2 путем сравнения уровня подавления PCV2 инфекции в вакцинированных и невакцинированных группах.
Можно было сделать несколько наблюдений:
- Невакцинированные животные демонстрировали значительно более высокие IHC оценки, чем вакцинированные группы, что указывает на то, что доза заражения была достаточно высокой, и что контрольное заражением было эффективным, даже в случае средних уровней материнских антитела против PCV2 у поросят.
- Как можно видеть: дозы вакцины, содержащие 5 или 20 мкг белка ORF2, обеспечивали надежную защиту от репликации заражающего вируса, при этом снижение IHC оценки достигало вплоть до 90%. Поэтому эти вакцины против PCV2 были очень эффективными.
- Несколько меньшая степень защиты наблюдалась в случае самой низкой дозы белка ORF2 PCV2a от заражения PCV2d. Это означает, что вакцины против PCV2 на основе экспрессированного в клетках насекомых мутантного белка ORF2 из PCV2b или из PCV2d в соответствии с настоящим изобретением очень эффективны в качестве вакцины против PCV2 инфекции даже в однократной дозе и даже в контексте антител материнского происхождения. В равных дозах эти вакцины на основе мутантного белка ORF2 из PCV2b или из PCV2d даже оказались более эффективными, чем традиционная вакцина на основе белка ORF2 PCV2a.
- Хотя гомологичный иммунитет был в основном выше гетерологичного иммунитета, существовал четкий уровень перекрестного иммунитета к заражающим вирусам PCV2b и PCV2d по всем трем исследованным генотипам вакцин: вакцины на основе белка ORF2 PCV2a и PCV2d были сопоставимы по защитному эффекту в самой низкой дозе от заражения PCV2b, тогда как белок ORF2 PCV2a был лучше в более высокой дозе. Однако вакцина на основе мутантного белка ORF2 PCV2b была лучше белка ORF2 PCV2a от заражения PCV2d в обеих дозах.
Краткое описание чертежей
Фигура 1
:
Сканограмма геля после электрофореза в SDS-ПААГ с образцами культур клеток насекомых, экспрессирующих различные белки ORF PCV2 посредством инфицирования рекомбинантными бакуловирусами.
Номера дорожек и указание содержания дорожек даны над изображением геля.
Дорожки 1 и 18: маркеры молекулярной массы; Слева от изображения указаны значения молекулярной массы в кДа.
Дорожки 2-5: клетки, инфицированные вирусом 3; Дорожка 2: супернатант; Дорожки 3-5: клеточный осадок, соответственно: 30, 20 и 10 мкл.
Дорожки 6-9: клетки, инфицированные вирусом 6; Дорожка 6: супернатант; Дорожки 7-9 клеточный осадок, соответственно: 30, 20 и 10 мкл.
Дорожки 10-13: клетки, инфицированные вирусом 7; Дорожка 10: супернатант; Дорожки 11-13: клеточный осадок, соответственно: 30, 20 и 10 мкл.
Дорожки 14-17: контрольные образцы белка BSA, соответственно: 0,25, 0,5, 1 и 2 мкг.
Фигура 2
:
Сканограмма геля после электрофореза в SDS-ПААГ с образцами культур клеток насекомых, экспрессирующих различные белки ORF PCV2 посредством инфицирования рекомбинантными бакуловирусами.
Номера дорожек и указание содержания дорожек даны над изображением геля.
Дорожки 1 и 16: маркеры молекулярной массы; Слева от изображения указаны значения молекулярной массы в кДа.
Дорожки 2-5: клетки, инфицированные вирусом 8; Дорожка 2: супернатант; Дорожки 3-5: клеточный осадок, соответственно: 30, 20 и 10 мкл.
Дорожки 6-9: клетки, инфицированные вирусом 9; Дорожка 6: супернатант; Дорожки 7-9: клеточный осадок, соответственно: 30, 20 и 10 мкл.
Дорожка 10: пустая.
Дорожки 11-15: контрольные образцы белка BSA, соответственно: 0,25, 0,5, 1 и 2 мкг.
Фигуры 3 и 4
:
Графические представления результатов иммуногистохимического исследования на различных тканях свиней, которые подвергались контрольному заражению PCV2, после получения вакцины, приготовленной из экспрессированного в клетках насекомых белка ORF2 PCV2. Результаты по тканям представлены для миндалин, брыжеечных лимфатических узлов («Mes. In») и паховых лимфатических узлов («Ing. In»).
Различные применяемые (или нет) вакцины указаны по горизонтальной оси; вертикальная ось представляет произвольную оценку IHC интенсивности в соответствии с конкретной количественной оценкой.
На фиг. 3 представлены результаты IHC для животных в группах 1-7 совокупности 1, подвергнутых контрольному заражению вирулентным вирусом PCV2b;
На фиг. 4 представлены результаты IHC для животных в группах 1-7 совокупности 2, в которой животных заражали вирулентным вирусом PCV2d.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Intervet Int. BV
<120>  Рекомбинатная экспрессия белка ORF2 PCV2 в клетках насекомых
<130>  24469
<160>  2
<170>  Патент в версии 3.5
<210>  1
<211>  702
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутированный ген ORF2 PCV2b
<220>
<221>  Кодирующая последовательность
<222>  (1)..(699)
<400>  1
atg acc tac ccc cgt cgt cgt tac cgt cgt cgt cgt cac cgt ccc cgt        48
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1               5                   10                  15
agc cat ctg ggc caa atc ctt cgt cgt cgt ccc tgg ctg gtt cac ccc         96
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20                  25                  30
cgt cat cgt tac cgt tgg cgt cgt aag aac ggt atc ttc aac acc cgt        144
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35                  40                  45
ctt tca cgt acc ttc gga tac act gtt aag cgt acc act gtg aaa act        192
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr
50                  55                  60
ccc agc tgg gct gtt gac atg atg cgt ttc aac atc aac gac ttc ctt        240
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu
65                  70                  75                  80
ccc ccc gga ggt gga agc aac ccc cgt tct gtg ccc ttc gag tac tac        288
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85                  90                  95
cgt atc cgt aag gtt aaa gtg gaa ttc tgg ccc tgc tct ccc atc acc        336
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100                 105                 110
caa ggc gac cgt ggc gtt ggt agc tct gcc gtg atc ctt gac gac aac        384
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115                 120                 125
ttc gtt ccc aaa gct acc gcc ctc act tac gac ccc tac gtg aac tac        432
Phe Val Pro Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130                 135                 140
tca agc cgt cac acc atc act caa ccc ttc tct tac cat tca cgt tac        480
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145                 150                 155                 160
ttc acc ccc aag ccc gtt ctc gac tct act atc gac tac ttc caa ccc        528
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165                 170                 175
aac aac aaa cgt aac caa ctg tgg ctt cgt ctc caa acc act ggt aac        576
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn
180                 185                 190
gtt gac cac gtg gga ctg ggc acc gct ttc gag aac tca atc tac gac        624
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195                 200                 205
caa gaa tac aac atc cgt gtt act atg tac gtg caa ttc cgt gag ttc        672
Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210                 215                 220
aac ctc aag gac ccc ccc ctg aac ccc taa                                702
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
225                 230
<210>  2
<211>  233
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  2
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1               5                   10                  15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20                  25                  30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35                  40                  45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr
50                  55                  60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu
65                  70                  75                  80
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85                  90                  95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100                 105                 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115                 120                 125
Phe Val Pro Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130                 135                 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145                 150                 155                 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165                 170                 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn
180                 185                 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195                 200                 205
Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210                 215                 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
225                 230
<---