Способ выделения и дозревания незрелых ооцит-кумулюсных комплексов из ткани яичника после овариэктомии
METHOD FOR ISOLATION AND MATURATION OF IMMATURE OOCYTE-CUMULUS COMPLEXES FROM OVARIAN TISSUE AFTER OOPHORECTOMY

Изобретение относится к области медицины, а именно - к гинекологии, к способу выделения и дозревания незрелых ооцит-кумулюсных комплексов из ткани яичника после овариэктомии. Ценность данного метода заключается в том, что он позволяет сохранить репродуктивный потенциал пациенткам, которым показана резекция или радикальное удаление яичников. Может быть применен одновременно с выполнением хирургических вмешательств, а также совместно с криоконсервацией коркового слоя овариальной ткани.
Существующие в настоящее время методы сохранения фертильности: криоконсервация ооцитов или эмбрионов в результате контролируемой стимуляции суперовуляции, а также криоконсервация ткани яичника имеют ряд ограничений. Во многих клинических ситуациях данные способы сохранения фертильности не могут быть использованы в связи с существующими рисками. Контролируемая стимуляция суперовуляции не может быть применена к пациенткам, которым показана неотложная операция, химиотерапия, а также девочкам препубертатного возраста. Стимуляция яичников также имеет ограничения в большинстве случаев онкологических заболеваний яичников, тела и шейки матки. Метод криоконсервации и аутотрансплантации яичниковой ткани не может быть применен в случае высокого риска метастазирования опухолевых клеток в яичники, имеющий место при многих онкологических заболеваний, в том числе органов репродуктивной системы. Так было показано, что образцы овариальной ткани, полученные от пациенток с пограничными опухолями яичников, лейкемией, Ходжкинскими и неходжкинскими лимфомами могут содержать опухолевые клетки (Masciangelo et al. 2018; Soares et al. 2017; Gronier et al. 2014; Bittinger et al. 2011). Опасения вызывает риск рецидивирования при трансплантации овариальной ткани у пациенток с раком молочной железы. Частота метастаз в яичники при раке молочной железы у пациенток репродуктивного возраста составляет 20-25% (Kyono et al. 2010), а в криоконсервированных фрагментах овариальной ткани от пациенток с поздними стадиями онкологического процесса были обнаружены клетки, экспрессирующие ген MGB2, являющийся маркером рака молочной железы [Luyckx et al. 2013).
Незрелые ооцит-кумулюсные комплексы (ооциты на стадии зародышевого пузырька) присутствуют в достаточно большом количестве в ткани яичника (Yin et al. 2016), Способ выделения и дозревания незрелых ооцит-кумулюсных комплексов, выделенных из ткани яичника после овариэктомии, позволяет в кратчайшие сроки сохранить репродуктивный материал, не прибегая к гормональной стимуляции. Кроме того, данный метод является в настоящее время единственным способом сохранения фертильности пациенткам с раком яичника.
Задачей, решаемой изобретением, является способ выделения и дозревания незрелых ооцит-кумулюсных комплексов из ткани яичника после овариэктомии. Поставленная задача решается предлагаемым способом, состоящим в препарировании яичника, выделения ооцит-кумулюсных комплексов, и дозревания их в условиях in vitro.
Способ выделения и дозревания незрелых ооцит-кумулюсных комплексов из ткани яичника после овариэктомии, отличающийся тем, что яичники транспортируют в стерильном контейнере, заполненном HEPES-буфером, ооцит-кумулюсные комплексы выделяют из мозгового слоя яичника путем его измельчения при помощи скальпелей, идентифицируют в чашках Петри, промывают в HEPES-буфере, помещают в среду для дозревания, обогащенную 0.75 МЕ/мл высокоочищенного менотропина и 10% человеческим сывороточным альбумином на 48 часов.
Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученных в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области. Сущность изобретения поясняется таблицами.
В Таблице 1 приведен краткий анализ примеров клинического применения способа выделения и дозревания незрелых ооцит-кумулюсных комплексов из ткани яичника после овариэктомии.
В Таблице 2 представлены показатели, характеризующие эффективность способа выделения и дозревания незрелых ооцит-кумулюсных комплексов из ткани яичника после овариэктомии.
Пример
Была проведена оценка эффективности способа выделения и дозревания незрелых ооцит-кумулюсных комплексов из ткани яичника после овариэктомии.
Яичники транспортировали из операционной в стерильном контейнере, заполненном HEPES-буфером. Далее яичник поместили в чашку Петри диаметром 90 мм. Препарирование яичника осуществляли при помощи одноразового скальпеля и пинцета в ламинарном шкафу на полном потоке. Яичник разрезали продольно на две равные половины. Мозговой слой яичника отделили от коркового при помощи скальпеля и измельчили на небольшие фрагменты. При этом произошло разрушение антральных фолликулов, и ооцит-кумулюсные комплексы высвободились в чашку Петри, заполненную HEPES-буфером. После завершения препарирования чашки просматривали на наличие ооцит-кумулюсных комплексов в бинокулярный микроскоп. Идентификация ооцит-кумулюсных комплексов происходила по следующим отличительным особенностям: темный ооцит диаметром 100-120 мкм окружен плотным слоем клеток кумулюса. Незрелые ооцит-кумулюсные комплексы сначала промыли в чашке Петри с нагретым до 37°С HEPES-буфером, а затем отсадили в заранее приготовленный планшет со средой для дозревания.
Среда для дозревания ооцит-кумулюсных комплексов приготовили по следующей формуле:
Среда для дозревания IVM medium (Sage, CooperSurgical) обогащается
2
2
0.75 МЕ/мл высокоочищенного менотропина и 10% человеческим сывороточным альбумином. За 3-24 часов среду разливают в планшет для культивирования человеческих эмбрионов, покрывают маслом, для покрытия во время ЭКО и манипуляция, и помещают планшет в инкубатор с температурой 37°С, 5% ссодержанием О и 6% ссодержанием СО.
Ооцит-кумулюсные комплексы культивировали в среде для дозревания в течение 48 часов. Затем ооцит-кумулюсные комплексы денудировали при помощи фермента гиалуронидазы. Зрелость ооцитов определяли по наличию полярного тельца. Все зрелые яйцеклетки были пригодны для витрификации или оплодотворения в программе ЭКО с ИКСИ.
В Таблице 1 приведен краткий анализ примеров клинического применения способа выделения и дозревания незрелых ооцит-кумулюсных комплексов из ткани яичника после овариэктомии.
В Таблице 2 представлены показатели, характеризующие эффективность способа выделения и дозревания незрелых ооцит-кумулюсных комплексов из ткани яичника после овариэктомии.
Приведенные данные демонстрируют возможность успешного выделения и дозревания незрелых ооцит-кумулюсных комплексов из ткани яичника после овариэктомии у пациенток со злокачественными заболеваниями. Таким образом, предложенный способ сохраняет репродуктивный материал пациенток, которым показана овариэктомия.
Список литературы
Bittinger, Sophie Е., Simon P. Nazaretian, Debra A. Gook, et al. 2011 Detection of Hodgkin Lymphoma within Ovarian Tissue. Fertility and Sterility 95(2): 803.e3-803.e6.
Gronier,  Louis Terriou, Geoffroy Robin, et al. 2014 Detection of Non-Hodgkin's Lymphoma in Ovarian Cortex Pieces during the Process of Cryopreservation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 31(9): 1251-1255.
Kyono, Koichi, Masakazu Doshida, Mayumi Toya, et al. 2010Potential Indications for Ovarian Autotransplantation Based on the Analysis of 5,571 Autopsy Findings of Females under the Age of 40 in Japan. Fertility and Sterility 93(7): 2429-2430.
Luyckx, V., J.F. Durant, A. Camboni, et al. 2013 Is Transplantation of Cryopreserved Ovarian Tissue from Patients with Advanced-Stage Breast Cancer Safe? A Pilot Study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 30(10): 1289-1299.
Masciangelo, Rossella, Chiara Bosisio, Jacques Donnez, Christiani A Amorim, and Marie-Madeleine Dolmans
2018 Safety of Ovarian Tissue Transplantation in Patients with Borderline Ovarian Tumors. Human Reproduction 33(2): 212-219.
Soares, Michelle, Pascale Saussoy, Mathilde Maskens, et al. 2017 Eliminating Malignant Cells from Cryopreserved Ovarian Tissue Is Possible in Leukaemia Patients. British Journal of Haematology 178(2): 231-239.
Yin, Huiqun, Hong Jiang, Stine Gry Kristensen, and Claus Yding Andersen 2016Vitrification of in Vitro Matured Oocytes Collected from Surplus Ovarian Medulla Tissue Resulting from Fertility Preservation of Ovarian Cortex Tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 33(6): 741-746.