Универсальный рекомбинантный вектор pSVO и плазмидные генетические конструкции pSVO-Gluc и pSVO-Vic, обеспечивающие синтез и секрецию целевых белков в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis и полученные с использованием указанного универсального вектора
UNIVERSAL RECOMBINANT VECTOR pSVO AND PLASMID GENETIC CONSTRUCTS pSVO-Gluc AND pSVO-Vic, PROVIDING SYNTHESIS AND SECRETION OF TARGET PROTEINS IN YEAST CELLS OF THE KLUYVEROMYCES LACTIS SPECIES AND OBTAINED USING THIS UNIVERSAL VECTOR

Изобретение относится к универсальному рекомбинантному вектору, который используют для получения плазмидных генетических конструкций, обеспечивающих синтез и секрецию целевых рекомбинантных белков в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis и может быть использовано в молекулярной генетике и биотехнологии.
Уровень техники. Более 30 лет дрожжи Kluyveromyces lactis использовались для продукции гетерологичных белков (Van Ooyen A. J. J. et al. Heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis. FEMS yeast research 2006; 6; 3: 381-392; Spohner S.C. et al. Kluyveromyces lactis: an emerging tool in biotechnology 2016. J Biotechnol 222:104-116). K. lactis имеет множество свойств, которые делают этот организм привлекательным для продукции белка; он легко поддается генетическим манипуляциям, имеет секвенированный геном (Dujon В. et al. Genome evolution in yeasts. Nature 2004; 430:35-44; Chuzel L. et al. Complete genome sequence of Kluyveromyces lactis strain GG799, a common yeast host for heterologous protein expression. Genome Announc 2017; 5:e00623-17), имеет отрицательный Крэбтри метаболизм (Gonzalez-Siso М.I. et al. Respirofermentative metabolism in Kluyveromyces lactis: insights and perspectives. Enzyme Microb Technol 2000; 26:699-705; Merico A. et al. The oxygen level determines the fermentation pattern in Kluyveromyces lactis. FEMS Yeast Res 2009; 9:749-756). Kluyveromyces lactis можно культивировать с использованием простых питательных сред. На сегодняшний момент при помощи в K. lactis получено более 100 гетерологичных белков (Van Ooyen A. J. J. et al. Heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis. FEMS yeast research 2006; 6; 3: 381-392; Spohner S. С.et al. Kluyveromyces lactis: an emerging tool in biotechnology 2016. J Biotechnol 222:104-116). Кроме того, K. lactis имеет долгую историю безопасного использования в пищевой промышленности и считается безопасным (GRAS) микроорганизмом (Coenen Т.М. et al. Safety evaluation of a lactase enzyme preparation derived from Kluyveromyces lactis. Food Chem Toxicol 2000; 38:671-677).
В совокупности эти особенности сделали K. lactis удобной дрожжевой системой продукции белков как для лабораторных, так и для промышленных процессов. Несмотря на долгую историю этого организма как системы экспрессии, только небольшое количество промоторов было использовано для экспрессии чужеродные гены в K. lactis (Van Ooyen A. J. J. et al. Heterologous protein production in the yeast Kluyveromyces lactis. FEMS yeast research 2006; 6; 3: 381-392; Spohner S.C. et al. Kluyveromyces lactis: an emerging tool in biotechnology 2016. J Biotechnol 222:104-116). Кроме того, для этих дрожжей не описано ни одного регулируемого промотора, который функционирует с такой же эффективностью и жесткой регуляцией, как индуцируемый метанолом промотор АОХ1 (Tschopp J. F. et al. Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris. Nucleic Acids Res 1987; 15:3859-3876) из Pichia pastoris. Чаще всего для экспрессии чужеродных генов в K. lactis используют промотор LAC4 (PLAC4), сильный промотор, регулирующий экспрессию гена эндогенной - галактозидазы (Lac4p) в ответ на добавление лактозы или галактозы. Таким образом, все еще существует потребность в разработке вектора в обеспечивающего эффективную и регулируемую экспрессию генов, для производства гетерологичных белков в любом масштабе.
Ближайшие аналоги. Известна коммерческая плазмида pKLAC2. компании NEB (США), представляющая собой экспрессионный вектор, способный к репликации как в Е. coli, так и к стабильной интеграции в геном дрожжей Kluyveromyces lactis. pKLAC2 содержит универсальный сайт множественного клонирования (MCS). После трансформации компетентных клеток K. lactis pKLAC2 интегрируется в хромосому K. lactis в локусе LAC4. Для отбора клонов используется селекционный маркер ацетамидаза (amdS), синтез которого находится под контролем дрожжевого промотора ADH1. Ацетамидаза, синтезируемая дрожжами при интеграции фрагмента pKLAC2 в хромосому, позволяет трансформированным клеткам использовать ацетамид в качестве источника азота в селективной питательной среде. Сайт множественного клонирования (MCS) расположен так, чтобы сделать возможным трансляционное слияние сигнальной последовательности полового α-фактора (α-MF) с N-концом рекомбинантного белка-мишени. Это адресует химерный белок в общий секреторный путь, но α-MF отщепляется в аппарате Гольджи протеазой Kех, что приводит к секреции только рекомбинантного белка. Синтез рекомбинантного слитого белка находится под контролем промотора LAC4 K. lactis.
Несмотря на перечисленные преимущества данный вектор имеет ряд недостатков. В частности, как говорилось выше, интеграция целевого гена под контроль дрожжевого промотера LAC4 может приводить к значительному фоновому синтезу целевого белка в отсутствии индуктора, что может быть критическим в случае экспрессии генов токсичных белков. Кроме того, промотор LAC4 не является автоиндуцибильным, что вносит дополнительную стадию при культивировании целевого белка. Еще одним недостатком данного вектора является использование гена ацетамидазы в качестве селективного маркера. Питательная среда YEB, используемая для селекции клонов K. lactis имеет высокую стоимость, и не позволяет регулировать количество селективного маркера, вносимого в среду.
350
350
350
Наиболее близким аналогом (прототипом) является плазмида pUC19/Pr описанная в статье Hassan Sakhtah и его коллег (Sakhtah, Н., Behler, J., АН-Reynolds, A., Causey, Т.В., Vainauskas, S., & Taron, С.Н. А novel regulated hybrid promoter that permits autoinduction of heterologous protein expression in Kluyveromyces lactis. 2019. Applied and environmental microbiology. 85(14), e00542-19), спроектированная на основе коммерческого вектора pUC19. Данный экспрессионный вектор (pUC19/Pr) способен к репликации в Е. coli и к стабильной интеграции в геном дрожжей Kluyveromyces lactis, различных гетерологических белков. Используемый для контроля экспрессии рекомбинантных генов гибридный промотер Робеспечивает автоиндукцию синтеза белка в K. lactis.
350
Однако кроме нового промотера, остальные структурные элементы плазмиды pUC19/Pr не отличается от коммерческого вектора pKLAC2, что налагает те же ограничения в ее использовании. Так использование в качестве сигнальной последовательности полового α-фактора (α-MF) имеет ряд недостатков. Этот сигнал секреции способствует посттрансляционной транслокации в эндоплазматический ретикулум (ЭР), поэтому белки, скрадывающиеся в цитозоле, могут неэффективно транслоцироваться и как следствие плохо секретироваться. Кроме того, если белок самоассоциируется, про-область α-фактора потенциально может вызывать агрегацию, тем самым препятствуя экспорту из ЭР.
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание универсального рекомбинантного вектора pSVO и плазмидных генетических конструкций pSVO-Gluc и pSVO-Vic, обеспечивающих синтез и секрецию целевых белков в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis и полученные с использованием указанного универсального вектора, которые лишены недостатков прототипа.
Указанный технический результат достигается тем, что универсальный рекомбинантный вектор pSVO для создания плазмидных генетических конструкций, обеспечивающих синтез и секрецию целевых белков в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 1г, следующие элементы:
- автоиндуцибильный гибридный промотор с 341 по 1017, включающий коровую последовательность промотера глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAP) и регуляторную последовательность промотера изоцитрат лиазы (ICL);
- гибридную сигнальную последовательность (Ost2) для обеспечения секреции белка во внеклеточное пространство с 1018 по 1287;
- регион встройки целевого гена (MCS) с 1297 по 1353;
- терминаторную область гена S. Cerevisiae (CYC) с 1360 по 1638;
- промотер гена алкогольдегидрогеназы (ADH1 promoter) с 1647 по 2339;
- ген устойчивости к зеоцину (BleoR) с 2360 по 2734;
- 5' последовательность гена промотера изоцитрат лиазы (ICL-5') с 2735 по 3694;
- ориджин репликации (ori) с 4504 по 5092;
- ген устойчивости к ампициллину (AmpR) с 5263 по 6122.
Указанный технический результат достигается также тем, что плазмидная генетическая конструкция pSVO-Gluc обеспечивает синтез и секрецию целевого белка люциферазы из Gaussia princeps в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 2, следующие элементы:
- автоиндуцибильный гибридный промотор с 341 по 1017, включающий коровую последовательность промотера глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAP) и регуляторную последовательность промотера изоцитрат лиазы (ICL);
- гибридную сигнальную последовательность (Ost2) для обеспечения секреции белка во внеклеточное пространство с 1018 по 1287;
- последовательность гена люциферазы из Gaussia princeps (Glue) с 1300 по 1803;
- терминаторную область гена S. cerevisiae (CYC) с 1813 по 2091;
- промотер гена алкогольдегидрогеназы (ADH1 promoter) с 2100 по 2792;
- ген устойчивости к зеоцину (BleoR) с 2813 по 3187;
- 5' последовательность гена промотера изоцитрат лиазы (ICL-5') с 3188 по 4147;
- ориджин репликации (ori) с 4957 по 5545;
- ген устойчивость к ампициллину (AmpR) с 5716 по 6576.
Указанный технический результат достигается также тем, что плазмидная генетическая конструкция pSVO-Vic обеспечивает синтез и секрецию целевого белка прохимозина альпака в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 3 и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 4, следующие элементы:
- автоиндуцибильный гибридный промотор с 341 по 1017, включающий коровую последовательность промотера глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAP) и регуляторную последовательность промотера изоцитрат лиазы (ICL);
- гибридная сигнальная последовательность (Ost2) для обеспечения секреции белка во внеклеточное пространство с 1018 по 1287;
- последовательность гена прохимозина альпака (Vic) с 1300 по 2397;
- терминаторную область гена S. Cerevisiae (CYC) с 2405 по 2682;
- промотер гена алкогольдегидрогеназы (ADH1 promoter) с 2691 по 3383;
- ген устойчивости к зеоцину (BleoR) с 3404 по 3778;
- 5' последовательность гена промотера изоцитрат лиазы (ICL-5') с 3779 по 4738;
- ориджин репликации (ori) с 5548 по 6136;
- ген устойчивость к ампициллину (AmpR) с 6307 по 7167.
Заявляемые плазмиды лишены недостатков прототипа т.к. в качестве сигнальной последовательности в них использован гибридный сигнал секреции Ost2, который по сравнению с сигналом α-MF увеличивает секрецию гетерогенных белков до 20 раз (Barrero, J.J., Casler, J.С, Valero, F., Ferrer, P., & Glick, B.S. An improved secretion signal enhances the secretion of model proteins from Pichia pastoris. Microbial cell factories. 2018; 17(1), 161).
Автоиндуцибильный гибридный промотер, включающий коровую последовательность промотера глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAP1) и регуляторную последовательность промотера изоцитрат лиазы (ICL1) с одной стороны, обеспечивает эффективный синтез целевой РНК, а с другой - жестко подавляет экспрессию их генов в отсутствии индукции. Использованный в векторе гена устойчивости к зеоцину (BleoR), позволяет регулировать количество вносимого в среду селективного маркера, для более эффективного отбора многокопийных клонов. В приведенных примерах показано, что заявляемый универсальный плазмидный вектор pSVO позволяет создавать целевые плазмиды (на примерах pSVO-Gluc и pSVO-Vic), которые обеспечивают эффективный синтез целевых белков, с жестким контролем до момента автоиндукции.
Изобретение поясняется следующими графическими материалами. На фиг. 1, (А, Б, В, Г) приведена схема конструирования универсального рекомбинантного вектора pSVO. На фиг. 2 изображена электрофореграмма продуктов амплификации вектора pSVO-Vic (дорожка 1) и вектора pSVO-Gluc (дорожка 2). На фиг. 3 представлен рекомбинантный вектор pSVO-Gluc для экспрессии гена люциферацы из Gaussia princeps в клетках K. lactis. На фиг. 4 приведены данные о люциферазной активности белка, продуцируемого плазмидой pSVO-Vic в клетках K. lactis. На фиг. 5 представлен рекомбинантный вектор pSVO-Vic для экспрессии гена прохимозина альпака в клетках K. lactis.
Ниже приведены примеры 1-3 конкретного осуществление изобретения.
Пример 1. Конструирование вектора pSVO.
Схема конструирования заявляемого изобретения приведена на Фиг. 1.
Последовательность с) гибридного лидерного сигнала Ost2 была синтезирована на заказ. Остальные составные части сконструированного вектора были амплифицированны с использованием спроектированных олигонуклеотидов (таблица 1).
С матрицы к ДНК K. lactis были получены амликоны: а) 3'-часть ICL1 промотера, b) 5'-часть GAP промотера и g) 5'-часть ICL1 промотера. С матрицы геномной ДНК S. cerevisiae получен ампликон i) терминаторной области гена CYC1.
С матрицы вектора pKLAC2 получены ампликоны гена f) алкогольдегидрогеназы и ген ацетамидазы amdS (Фиг. la). Реакционные смесь для ПНР на 50 мкл содержала: 1 мМ раствор dNTP; 100 пМ каждого из праймеров; 5 мкл 10× буфера Pfu ДНК полимеразы; 0,5 ед.а. Рfu ДНК полимеразы; 20 нгр матричной ДНК. Реакционную смесь денатурировали при 95°С в течении 10 минут, с последующей амплификацией (25 циклов), состоящей из денатурации при 94°С в течении 30 сек, отжига при 59°С в течении 30 секунд и элонгации при 72°С продолжительность рассчитывалась из расчета 1 минута на 1000 п. н. После завершения амплификации достройка концов ДНК осуществлялась при 72°С в течении 5 минут. Реакции проводили на ПЦР-амплификаторе (ООО «БИС-Н», Россия).
Далее полученные части были объединены с использованием отжига в три фрагмента по следующей схеме 1: а) b) с) 2: i) 3: f) g) (Фиг. 1б). Полученные фрагменты были встроены в челночный вектор pJet1.2 с целью проверки целостности нуклеотидных последовательностей. После проверки вектора обрабатывали ферментами CciNI, ВаmHI, XmaI, PspXI (Фиг. 1в) для их одновременной встройки в состав челночного вектора pjet1.2. В результате на основе коммерческого вектора pJet1.2 был получен вектор pSVO (Фиг. 1г), имеющий следующие структурные элементы:
- автоиндуцибильный гибридный промотор с 341 по 1017, включающий коровую последовательность промотера глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAP) и регуляторную последовательность промотера изоцитрат лиазы (ICL)
- гибридная сигнальная последовательность (Ost2) для обеспечения секреции белка во внеклеточное пространство с 1018 по 1287;
- регион встройки целевого гена (MCS) с 1297 по 1353;
- терминаторную область гена S. Cerevisiae (CYC) с 1360 по 1638;
- промотер гена алкогольдегидрогеназы (ADH1 promoter) с 1647 по 2339;
- ген устойчивости к зеоцину (BleoR) с 2360 по 2734;
- 5' последовательность гена промотера изоцитрат лиазы (ICL-5') с 2735 по 3694;
- ориджин репликации (ori) с 4504 по 5092;
- ген устойчивость к ампициллину (AmpR) с 5263 по 6122.
Сконструированный универсальный вектор pSVO далее был протестирован на способность к экспрессии и секреции белков в системе Kluyveromyces lactis, путем встройки генов целевых ферментов, которые входят в состав разработанных плазмидных векторов pSVO-Gluc и pSVO-Vic, а также определена их специфическая активность в полученной культуральной жидкости.
Пример 2. Конструирование вектора pSVO-Gluc и детекция экспрессии гена люциферазы из Gaussia princeps в культуральной среде после трансформации клеток Kluyveromyces lactis сконструированной плазмидой. Для конструирования вектора pSVO-Gluc гена люциферазы из Gaussia princeps амплифицировали с матрицы плазмиды pCDH-EFl-GausLuc-IRES-copGFP с использованием спроектированных праймеров:
- Gluc-G-F (5'-aaaaaaggatccaaaagaaagcccaccgagaacaacgaag-3') и
- Gluc-G-R (5'-atcgacaaaggaaaaggggcctgtcctaggttagtcaccaccggcccccttg-3'). После продукт ПЦР лигировали в регион встройки целевого гена вектора pSVO по уникальным сайтам BamHI/AspA2I, фирмы «ЗАО Сибэнзим, Россия», согласно рекомендациям производителя. В результате был получен вектор pSVO-Gluc (Фиг. 3), содержащий следующие структурные элементы:
- автоиндуцибильный гибридный промотор с 341 по 1017, включающий коровую последовательность промотера глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAP) и регуляторную последовательность промотера изоцитрат лиазы (ICL);
- гибридная сигнальная последовательность (Ost2) для обеспечения секреции белка во внеклеточное пространство с 1018 по 1287;
- последовательность гена люцифирацы из Gaussia princeps (Gluc) с 1300 по 1803;
- терминаторную область гена S. cerevisiae (CYC) с 1813 по 2091;
- промотер гена алкогольдегидрогеназы (ADH1 promoter) с 2100 по 2792;
- ген устойчивости к зеоцину (BleoR) с 2813по 3187;
- 5' последовательность гена промотера изоцитрат лиазы (ICL-5') с 3188 по 4147;
- ориджин репликации (ori) с 4957 по 5545;
- ген устойчивость к ампициллину (AmpR) с 5716 по 6576.
Сконструированным вектором pSVO-Gluc трансформировали электрокомпетентные клетки K. lactis штамма GG799, для этого проводили ПЦР с использованием спроектированных праймеров:
- J-F (5' -cgactcactatagggagagcggc-3') и
- J-R (5'-aagaacatcgattttccatggcag-3')
Затем получений продукт ПЦР (Фиг 2, дорожка 2) в количестве 1 мкг был встроен в клетки K. lactis штамма GG799, путем электропорации с использованием прибора MicroPulser Electroporator (BioRad, США), согласно рекомендациям производителя. После электропорации клетки высевали на агарезированную среду YPDS содержащую 500, 1000, 2000 мкг/мл зеоцина в качестве селективного маркера и культивировли в термостате при 30°С в течении 72 часов. Далее по 3 индивидуальные колонии с каждой чашки переносили в жидкую среду YEP содержащей 2%, и растили в течение ночи на орбитальном шейкере при 30°С и 220 об/мин. Инокулят, в соотношении 1:100, переносили в колбу Эрленмейера, содержащую среду YEP содержащей 2% и культивировали в течении четырех дней при 30°С и 220 об/мин, каждый день снимая пробы культуральной жидкости. Затем полученные пробы анализировали на наличие люциферазной активности с использованием в качестве субстрата нативного коэлентеразина (NanoLight Technologies, США). В качестве положительного контроля выступала культуральная среда клеток HEK293FT, трансфецированных плазмидой pCDH-EF1-GausLuc-IRES-copGFP. В качестве отрицательного, культуральная жидкость K. lactis штамма GG799. Данные о люциферазной активности представлены на фиг. 4.
Пример 3. Конструирование вектора pSVO-Vic и детекция молокосвертывающей активности (МА) в культуральной среде после трансформации клеток Kluyveromyces lactis сконструированной плазмидой.
Для конструирования вектора pSVO-Vic последовательность гена прохимозина альпака была синтезирована на заказ в составе челночного вектора pGH и встроена в вектор pSVO по уникальным сайтам BamHI/AspA2I. В результате был получен вектор pSVO-Vic (Фиг. 5), содержащий следующие структурные элементы:
- автоиндуцибильный гибридный промотор с 341 по 1017, включающий коровую последовательность промотера глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAP) и регуляторную последовательность промотера изоцитрат лиазы (ICL);
- гибридная сигнальная последовательность (Ost2) для обеспечения секреции белка во внеклеточное пространство с 1018 по 1287;
- последовательность гена прохимозина альпака (Vic) с 1300 по 2397;
- терминаторную область гена S. Cerevisiae (CYC) с 2405 по 2682;
- промотер гена алкогольдегидрогеназы (ADH1 promoter) с 2691 по 3383;
- ген устойчивости к зеоцину (BleoR) с 3404 по 3778;
- 5' последовательность гена промотера изоцитрат лиазы (ICL-5') с 3779 по 4738;
- ориджин репликации (ori) с 5548 по 6136;
- ген устойчивость к ампициллину (AmpR) с 6307 по 7167.
Сконструированным вектором pSVO-Vic проводили электропорацию клеток K. lactis штамма GG799. Для этого проводили ПЦР с использованием спроектированных праймеров:
- J-F (5'-cgactcactatagggagagcggc-3')
- J-R (5'-aagaacatcgattttccatggcag-3')
Далее в клетки K. lactis штамма GG799 был встроен полученый продукт ПЦР (Фиг 2, дорожка 1) в количестве 1 мкг, путем электропорации с использованием прибора MicroPulser Electroporator (BioRad, США), согласно рекомендациям производителя. Культивирование полученных индивидуальных колоний, проводили как описано в примере 2. После получения образцов культуральной среды в них определяли молокосвертываюшую активность (МА) для анализа наличия целевого белка (прохимозина альпака) в ферментативно-активной форме. В начале проводили процедуру активации полученных образцов культуральной среды. Для этого в образцы, при постоянном перемешивании, вносили 2,0М НСl до рН 3,0. Останавливали перемешивание и инкубировали смесь при рН 3,0±0,1 в течение 2 часов. По истечении времени инкубации, доводили рН образца до 5,8±0,1, используя 0,5М NaOH. После в активированном таким способом образце определяли МА.
Для определения МА использовали стандартизированный сухой молочный субстрат ("Субстрат СТ.3"), выпускаемый ВНИИМС (г. Углич). Для подготовки к работе 25,0 гр. субстрата растворяли в 230 мл 0,01N СаСl2 в течение 1 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Доводили рН полученной смеси до 6,5±0,1, используя 1,0М NaOH. Конечный объем раствора доводили до 250 мл 0,01 N СаСl2. Активность исследуемых образцов определяли относительно отраслевого контрольного образца сычужного фермента (ОКО СФ), аттестованного по МА, выпускаемого ОАО "Московский завод сычужного фермента". Для подготовки к работе к 1,0 г ОКО СФ добавляли 80 мл дистиллированной воды, перемешивали 30 минут при 20-25°С, доводили объем смеси до 100 мл и выдерживали на водяной бане при 35°С в течение 15 мин. Перед определением МА исследуемые образцы выдерживали 15 минут при 35°С.
Определение МА проводили при 35°С. В сухую стеклянную пробирку вносили 2,5 мл раствора стандартизированного субстрата и прогревали при 35°С в течение 5 минут. В пробирку с субстратом добавляли 0,25 мл исследуемого образца, включали секундомер, содержимое пробирки сразу же тщательно перемешивали. Продолжительность свертывания субстрата отмечали по секундомеру с момента внесения образца до появления первых хлопьев коагуляции субстрата. Появление хлопьев проверяли путем периодического нанесения стеклянной палочкой капли реакционной смеси на стенку пробирки. Значения молокосвертывающей активности (МА) приведены в таблице 2.
Полученные в приведенных выше примерах 2-3 результаты показывают, что с использованием универсального рекомбинантного вектора pSVO удалось получить целевые плазмидные вектора pSVO-Gluc и pSVO-Vic, обеспечивающие синтез во внеклеточное пространство гетерогенных белков после трансформации клеток K. lactis. При этом следует отметить что использование в сконструированных векторах гена устойчивости к блеомецину позволяет с повышением концентрации антибиотика отбирать многокопийные клоны рекомбинантных клеток K. lactis. Использование гибридного промотера позволяет полностью подавить экспрессию целевого гена до момента автоиндукции.
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр
вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Роспотребнадзора)
<120> Универсальный рекомбинантный вектор pSVO и плазмидные генетические
конструкции pSVO-Gluc и pSVO-Vic, обеспечивающие синтез и секрецию целевых
белков в клетках дрожжей вида Kluyveromyces lactis и полученные с
использованием указанного универсального вектора
<160> SEQ ID NO: 3
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 6315
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Нуклеотидная последовательность вектора pSVO
<400> 1
1 gcccctgcag ccgaattata ttatttttgc caaataattt ttaacaaaag ctctgaagtc
61 ttcttcattt aaattcttag atgatacttc atctggaaaa ttgtcccaat tagtagcatc
121 acgctgtgag taagttctaa accatttttt tattgttgta ttatctctaa tcttactact
181 cgatgagttt tcggtattat ctctattttt aacttggagc aggttccatt cattgttttt
241 ttcatcatag tgaataaaat caactgcttt aacacttgtg cctgaacacc atatccatcc
301 ggcgtaatac gactcactat agggagagcg gccgcaattc atctagataa tcgggtatga
361 ttaacagcga catagctatg tgattatctg ccccattact taaagtaagg tttcactttc
421 ggactaagga cgaatgacac aagacacaga acgctcacac ggttgaaaca ttttttttcc
481 tgatcctttt gaccctgttt gttgtccctc ttttacgatg ggagaattga atcatccgcc
541 attaaaccga atgtgatagt ttttccagtt tttcttcccc tccctacatc catttctaaa
601 gaattcacgg acattttcgc atgaatgggg aaagttgact cagttgactc tatttggttc
661 ctcagcctcg actgctttgc ttcatcttct ctatgggcca atgagctaat gagcacaatg
721 tgctgcgaaa taaagggata tctaatttat attattacat tataatatgt actagtgtgg
781 ttattggtaa ttgtacttaa ttttgatata taaagggtgg atctttttca ttttgaatca
841 gaattggaat tgcaacttgt ctcttgtcac tattacttaa tagtaattat atttcttatt
901 aacctttttt ttaagtcaaa acaccaagga caagaactac tcttcaaagg tatttcaagt
961 tatcatacgt ctcacacacg cttcacagtt tcaagtaaaa aaaaagaata ttacacaatg
1021 agacaagttt ggttctcttg gatcgttggt ttgttcttgt gtttcttcaa cgtttcttct
1081 gctgctccag ttaacactac tactgaagat gagactgctc aaattccagc tgaagctgtt
1141 attggttact ctgatttgga aggtgatttc gatgttgctg ttttgccatt ctctaactca
1201 actaacaacg gtttgttgtt catcaacacc actattgctt ctatcgctgc taaagaagag
1261 ggagtttctt tggaaaaaag agaggctgga tccaaaagag aggctgaagc tagaagagct
1321 catatgtcca tgggcggccg cgatatcgtc gaccctagga caggcccctt ttcctttgtc
1381 gatatcatgt aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctcctcccac atccgctcta
1441 accgaaaagg aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt tttttaatag
1501 ttatgttagt attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacaaac
1561 gcgtgtacgc atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga
1621 aggctttaat ttgcaagcag cccgggtgtt tccgggtgta caatatggac ttcctctttt
1681 ctggcaacca aacccataca tcgggattcc tataatacct tcgttggtct ccctaacatg
1741 taggtggcgg aggggagata tacaatagaa cagataccag acaagacata atgggctaaa
1801 caagactaca ccaattacac tgcctcattg atggtggtac ataacgaact aatactgtag
1861 ccctagactt gatagccatc atcatatcga agtttcacta ccctttttcc atttgccatc
1921 tattgaagta ataataggcg catgcaactt cttttctttt tttttctttt ctctctcccc
1981 cgttgttgtc tcaccatatc cgcaatgaca aaaaaatgat ggaagacact aaaggaaaaa
2041 attaacgaca aagacagcac caacagatgt cgttgttcca gagctgatga ggggtatctc
2101 gaagcacacg aaactttttc cttccttcat tcacgcacac tactctctaa tgagcaacgg
2161 tatacggcct tccttccagt tacttgaatt tgaaataaaa aaaagtttgc tgtcttgcta
2221 tcaagtataa atagacctgc aattattaat cttttgtttc ctcgtcattg ttctcgttcc
2281 ctttcttcct tgtttctttt tctgcacaat atttcaagct ataccaagca tacaatcaag
2341 caattccaga tctgccacca tggccaagtt gaccagtgcc gttccggtgc tcaccgcgcg
2401 cgacgtcgcc ggagcggtcg agttctggac cgaccggctc gggttctccc gggacttcgt
2461 ggaggacgac ttcgccggtg tggtccggga cgacgtgacc ctgttcatca gcgcggtcca
2521 ggaccaggtg gtgccggaca acaccctggc ctgggtgtgg gtgcgcggcc tggacgagct
2581 gtacgccgag tggtcggagg tcgtgtccac gaacttccgg gacgcctccg ggccggccat
2641 gaccgagatc ggcgagcagc cgtgggggcg ggagttcgcc ctgcgcgacc cggccggcaa
2701 ctgcgtgcac ttcgtggccg aggagcagga ctgactttta cctttgttgt cttatgtgtt
2761 tttactccaa cacccctaac cctaattcca catagatcca accctaattc cgcagaggta
2821 caaataaaca caaccagcta gagatagcac accaccatga ggctaggttg cacataacac
2881 accaccgaat tttttgctac ccacttttct tcctctttgt ctctatacca acccatttag
2941 tacccacaaa taaactctgg ggtgtacggt accaagcttc gccaacgaga atgcaacaaa
3001 tgatgaatat actgtgatgt agtgattgct cattgaataa gtagcgttat tcgaagtaaa
3061 gaatagaaaa tcacaagact ggggttaaag ctgcatcaaa taggcaaatg tgcggcgtat
3121 cgtggtttgc gcgcacggat tatctaacaa gtttttccac cacttaaaaa ttgagggagc
3181 gttccgcata attataattg ctttttttgc tgacatcggc atcctgactt cttcttttgt
3241 agtgctctat ttgtgagtgg tgttaaaaaa acattcaaag tggcatgcta ttctaaggca
3301 atatggaaac atgagagttc ctctttgaat atctggagct ccagcctatt aggcaagttt
3361 tgtcagactg cttgtatgga agaggttttc gggaaaccat attcgactcg gtagagtaag
3421 agatatgtct gatttatcct catatgaaag gtttttaaga atataagaat caagtatcga
3481 aatatttgca aaattttggc actatggccg agtggttaag gcgacagact tgaaatctgt
3541 tgggctctgc ccgcgctggt tcaaatcctg ctggtgtcgt tattttttgg aaataacttt
3601 ttttaactag acaataagcg tttagccggg taatatttat ttatatatat cggctccttc
3661 catggagctg ataccgtaag ctcacctaat ctgcgaattg ctcgagtttt ttatctttct
3721 agaagatctc ctacaatatt ctcagctgcc atggaaaatc gatgttcttc ttttattctc
3781 tcaagatttt caggctgtat attaaaactt atattaagaa ctatgctaac cacctcatca
3841 ggaaccgttg taggtggcgt gggttttctt ggcaatcgac tctcatgaaa actacgagct
3901 aaatattcaa tatgttcctc ttgaccaact ttattctgca ttttttttga acgaggttta
3961 gagcaagctt caggaaactg agacaggaat tttattaaaa atttaaattt tgaagaaagt
4021 tcagggttaa tagcatccat tttttgcttt gcaagttcct cagcattctt aacaaaagac
4081 gtctcttttg acatgtttaa agtttaaacc tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat
4141 tccacacatt atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag
4201 ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gccaattgct ttccagtcgg gaaacctgtc
4261 gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg
4321 ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt
4381 atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa
4441 gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc
4501 gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag
4561 gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt
4621 gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg
4681 aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg
4741 ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg
4801 taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac
4861 tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg
4921 gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt
4981 taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg
5041 tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc
5101 tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt
5161 ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt
5221 taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag
5281 tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt
5341 cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc
5401 gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc
5461 cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg
5521 ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac
5581 aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg
5641 atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc
5701 tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact
5761 gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc
5821 aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat
5881 acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc
5941 ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac
6001 tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa
6061 aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact
6121 catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg
6181 atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg
6241 aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag
6301 gcgtatcacg aggcc
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 6768
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Нуклеотидная последовательность вектора pSVO-Gluc
<400> 2
1 gcccctgcag ccgaattata ttatttttgc caaataattt ttaacaaaag ctctgaagtc
61 ttcttcattt aaattcttag atgatacttc atctggaaaa ttgtcccaat tagtagcatc
121 acgctgtgag taagttctaa accatttttt tattgttgta ttatctctaa tcttactact
181 cgatgagttt tcggtattat ctctattttt aacttggagc aggttccatt cattgttttt
241 ttcatcatag tgaataaaat caactgcttt aacacttgtg cctgaacacc atatccatcc
301 ggcgtaatac gactcactat agggagagcg gccgcaattc atctagataa tcgggtatga
361 ttaacagcga catagctatg tgattatctg ccccattact taaagtaagg tttcactttc
421 ggactaagga cgaatgacac aagacacaga acgctcacac ggttgaaaca ttttttttcc
481 tgatcctttt gaccctgttt gttgtccctc ttttacgatg ggagaattga atcatccgcc
541 attaaaccga atgtgatagt ttttccagtt tttcttcccc tccctacatc catttctaaa
601 gaattcacgg acattttcgc atgaatgggg aaagttgact cagttgactc tatttggttc
661 ctcagcctcg actgctttgc ttcatcttct ctatgggcca atgagctaat gagcacaatg
721 tgctgcgaaa taaagggata tctaatttat attattacat tataatatgt actagtgtgg
781 ttattggtaa ttgtacttaa ttttgatata taaagggtgg atctttttca ttttgaatca
841 gaattggaat tgcaacttgt ctcttgtcac tattacttaa tagtaattat atttcttatt
901 aacctttttt ttaagtcaaa acaccaagga caagaactac tcttcaaagg tatttcaagt
961 tatcatacgt ctcacacacg cttcacagtt tcaagtaaaa aaaaagaata ttacacaatg
1021 agacaagttt ggttctcttg gatcgttggt ttgttcttgt gtttcttcaa cgtttcttct
1081 gctgctccag ttaacactac tactgaagat gagactgctc aaattccagc tgaagctgtt
1141 attggttact ctgatttgga aggtgatttc gatgttgctg ttttgccatt ctctaactca
1201 actaacaacg gtttgttgtt catcaacacc actattgctt ctatcgctgc taaagaagag
1261 ggagtttctt tggaaaaaag agaggctgga tccaaaagaa agcccaccga gaacaacgaa
1321 gacttcaaca tcgtggccgt ggccagcaac ttcgcgacca cggatctcga tgctgaccgc
1381 gggaagttgc ccggcaagaa gctgccgctg gaggtgctca aagagatgga agccaatgcc
1441 cggaaagctg gctgcaccag gggctgtctg atctgcctgt cccacatcaa gtgcacgccc
1501 aagatgaaga agttcatccc aggacgctgc cacacctacg aaggcgacaa agagtccgca
1561 cagggcggca taggcgaggc gatcgtcgac attcctgaga ttcctgggtt caaggacttg
1621 gagcccatgg agcagttcat cgcacaggtc gatctgtgtg tggactgcac aactggctgc
1681 ctcaaagggc ttgccaacgt gcagtgttct gacctgctca agaagtggct gccgcaacgc
1741 tgtgcgacct ttgccagcaa gatccagggc caggtggaca agatcaaggg ggccggtggt
1801 gactaaccta ggacaggccc cttttccttt gtcgatatca tgtaattagt tatgtcacgc
1861 ttacattcac gccctcctcc cacatccgct ctaaccgaaa aggaaggagt tagacaacct
1921 gaagtctagg tccctattta ttttttttaa tagttatgtt agtattaaga acgttattta
1981 tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca aacgcgtgta cgcatgtaac attatactga
2041 aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct cgaaggcttt aatttgcaag cagcccgggt
2101 gtttccgggt gtacaatatg gacttcctct tttctggcaa ccaaacccat acatcgggat
2161 tcctataata ccttcgttgg tctccctaac atgtaggtgg cggaggggag atatacaata
2221 gaacagatac cagacaagac ataatgggct aaacaagact acaccaatta cactgcctca
2281 ttgatggtgg tacataacga actaatactg tagccctaga cttgatagcc atcatcatat
2341 cgaagtttca ctaccctttt tccatttgcc atctattgaa gtaataatag gcgcatgcaa
2401 cttcttttct ttttttttct tttctctctc ccccgttgtt gtctcaccat atccgcaatg
2461 acaaaaaaat gatggaagac actaaaggaa aaaattaacg acaaagacag caccaacaga
2521 tgtcgttgtt ccagagctga tgaggggtat ctcgaagcac acgaaacttt ttccttcctt
2581 cattcacgca cactactctc taatgagcaa cggtatacgg ccttccttcc agttacttga
2641 atttgaaata aaaaaaagtt tgctgtcttg ctatcaagta taaatagacc tgcaattatt
2701 aatcttttgt ttcctcgtca ttgttctcgt tccctttctt ccttgtttct ttttctgcac
2761 aatatttcaa gctataccaa gcatacaatc aagcaattcc agatctgcca ccatggccaa
2821 gttgaccagt gccgttccgg tgctcaccgc gcgcgacgtc gccggagcgg tcgagttctg
2881 gaccgaccgg ctcgggttct cccgggactt cgtggaggac gacttcgccg gtgtggtccg
2941 ggacgacgtg accctgttca tcagcgcggt ccaggaccag gtggtgccgg acaacaccct
3001 ggcctgggtg tgggtgcgcg gcctggacga gctgtacgcc gagtggtcgg aggtcgtgtc
3061 cacgaacttc cgggacgcct ccgggccggc catgaccgag atcggcgagc agccgtgggg
3121 gcgggagttc gccctgcgcg acccggccgg caactgcgtg cacttcgtgg ccgaggagca
3181 ggactgactt ttacctttgt tgtcttatgt gtttttactc caacacccct aaccctaatt
3241 ccacatagat ccaaccctaa ttccgcagag gtacaaataa acacaaccag ctagagatag
3301 cacaccacca tgaggctagg ttgcacataa cacaccaccg aattttttgc tacccacttt
3361 tcttcctctt tgtctctata ccaacccatt tagtacccac aaataaactc tggggtgtac
3421 ggtaccaagc ttcgccaacg agaatgcaac aaatgatgaa tatactgtga tgtagtgatt
3481 gctcattgaa taagtagcgt tattcgaagt aaagaataga aaatcacaag actggggtta
3541 aagctgcatc aaataggcaa atgtgcggcg tatcgtggtt tgcgcgcacg gattatctaa
3601 caagtttttc caccacttaa aaattgaggg agcgttccgc ataattataa ttgctttttt
3661 tgctgacatc ggcatcctga cttcttcttt tgtagtgctc tatttgtgag tggtgttaaa
3721 aaaacattca aagtggcatg ctattctaag gcaatatgga aacatgagag ttcctctttg
3781 aatatctgga gctccagcct attaggcaag ttttgtcaga ctgcttgtat ggaagaggtt
3841 ttcgggaaac catattcgac tcggtagagt aagagatatg tctgatttat cctcatatga
3901 aaggttttta agaatataag aatcaagtat cgaaatattt gcaaaatttt ggcactatgg
3961 ccgagtggtt aaggcgacag acttgaaatc tgttgggctc tgcccgcgct ggttcaaatc
4021 ctgctggtgt cgttattttt tggaaataac tttttttaac tagacaataa gcgtttagcc
4081 gggtaatatt tatttatata tatcggctcc ttccatggag ctgataccgt aagctcacct
4141 aatctgcgaa ttgctcgagt tttttatctt tctagaagat ctcctacaat attctcagct
4201 gccatggaaa atcgatgttc ttcttttatt ctctcaagat tttcaggctg tatattaaaa
4261 cttatattaa gaactatgct aaccacctca tcaggaaccg ttgtaggtgg cgtgggtttt
4321 cttggcaatc gactctcatg aaaactacga gctaaatatt caatatgttc ctcttgacca
4381 actttattct gcattttttt tgaacgaggt ttagagcaag cttcaggaaa ctgagacagg
4441 aattttatta aaaatttaaa ttttgaagaa agttcagggt taatagcatc cattttttgc
4501 tttgcaagtt cctcagcatt cttaacaaaa gacgtctctt ttgacatgtt taaagtttaa
4561 acctcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac attatacgag ccggaagcat
4621 aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc
4681 actgccaatt gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca
4741 acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc
4801 gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg
4861 gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa
4921 ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga
4981 cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag
5041 ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct
5101 taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg
5161 ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc
5221 ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt
5281 aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta
5341 tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac
5401 agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc
5461 ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat
5521 tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc
5581 tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt
5641 cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta
5701 aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct
5761 atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg
5821 cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga
5881 tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt
5941 atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt
6001 taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt
6061 tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat
6121 gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc
6181 cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc
6241 cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat
6301 gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag
6361 aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt
6421 accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc
6481 ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa
6541 gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg
6601 aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa
6661 taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac
6721 cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggcc
<210> SEQ ID NO: 3
<211> 7359
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Нуклеотидная последовательность вектора pSVO-Vic
<400> 3
1 gcccctgcag ccgaattata ttatttttgc caaataattt ttaacaaaag ctctgaagtc
61 ttcttcattt aaattcttag atgatacttc atctggaaaa ttgtcccaat tagtagcatc
121 acgctgtgag taagttctaa accatttttt tattgttgta ttatctctaa tcttactact
181 cgatgagttt tcggtattat ctctattttt aacttggagc aggttccatt cattgttttt
241 ttcatcatag tgaataaaat caactgcttt aacacttgtg cctgaacacc atatccatcc
301 ggcgtaatac gactcactat agggagagcg gccgcaattc atctagataa tcgggtatga
361 ttaacagcga catagctatg tgattatctg ccccattact taaagtaagg tttcactttc
421 ggactaagga cgaatgacac aagacacaga acgctcacac ggttgaaaca ttttttttcc
481 tgatcctttt gaccctgttt gttgtccctc ttttacgatg ggagaattga atcatccgcc
541 attaaaccga atgtgatagt ttttccagtt tttcttcccc tccctacatc catttctaaa
601 gaattcacgg acattttcgc atgaatgggg aaagttgact cagttgactc tatttggttc
661 ctcagcctcg actgctttgc ttcatcttct ctatgggcca atgagctaat gagcacaatg
721 tgctgcgaaa taaagggata tctaatttat attattacat tataatatgt actagtgtgg
781 ttattggtaa ttgtacttaa ttttgatata taaagggtgg atctttttca ttttgaatca
841 gaattggaat tgcaacttgt ctcttgtcac tattacttaa tagtaattat atttcttatt
901 aacctttttt ttaagtcaaa acaccaagga caagaactac tcttcaaagg tatttcaagt
961 tatcatacgt ctcacacacg cttcacagtt tcaagtaaaa aaaaagaata ttacacaatg
1021 agacaagttt ggttctcttg gatcgttggt ttgttcttgt gtttcttcaa cgtttcttct
1081 gctgctccag ttaacactac tactgaagat gagactgctc aaattccagc tgaagctgtt
1141 attggttact ctgatttgga aggtgatttc gatgttgctg ttttgccatt ctctaactca
1201 actaacaacg gtttgttgtt catcaacacc actattgctt ctatcgctgc taaagaagag
1261 ggagtttctt tggaaaaaag agaggctgga tccaaaagat ctggtatcac tagaatccca
1321 ttgcataagg gtaagacttt gagaaaggcc ttgaaagaac atggtttgtt ggaagatttc
1381 ttgcagagac aacaatacgc cgtttcttct aagtattcct cattgggtaa agtggctaga
1441 gaaccattga cttcatactt ggattctcag tacttcggta agatctacat tggtactcca
1501 ccacaagaat tcaccgttgt tttcgatact ggttcttctg atttgtgggt tccatctatc
1561 tactgtagat ctaacgtgtg caagaaccat catagattcg atccaagaaa gtcctctacc
1621 ttcagaaatt tgggtaagcc attgtctatc cattacggta ctggttcaat ggaaggtttt
1681 ttgggttacg ataccgttac cgtttctaac atcgttgatc caaatcaaac cgttggtttg
1741 tctactgaac aaccaggtga agttttcacc tactctgaat tcgatggtat cttgggttta
1801 gcttatccat ctttggcttc cgaatattct gttccagtgt tcgataacat gatggacaga
1861 catttggttg ctcaggattt gttctctgtg tacatggaca gaaatggtca aggttctatg
1921 ttgactttgg gtgctattga tccatcttac tacactggtt cattgcattg ggttccagtt
1981 actgttcaac aatactggca attcactgtt gattctgtta ccattaacgg tgttgctgtt
2041 gcttgtgttg gtggttgtca agctattttg gatacaggta cttcagtttt gttcggtcca
2101 tcttctgata tcttgaagat ccaaaaagct atcggtgcta ccgaaaacag atatggtgaa
2161 ttcgacgtta actgcggttc tttgagatct atgccaactg ttgtgttcga gattaacggt
2221 agagattatc cattgtctcc atctgcttac acctctaaag atcaaggttt ctgtacttct
2281 ggtttccagg gtgataacaa ctcagaattg tggattttgg gtgacgtttt catcagagag
2341 tactactcag ttttcgacag agctaacaat agagttggtt tggctaaggc tatctgacct
2401 aggacaggcc ccttttcctt tgtcgatatc atgtaattag ttatgtcacg cttacattca
2461 cgccctcctc ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag
2521 gtccctattt atttttttta atagttatgt tagtattaag aacgttattt atatttcaaa
2581 tttttctttt ttttctgtac aaacgcgtgt acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc
2641 ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcaa gcagcccggg tgtttccggg
2701 tgtacaatat ggacttcctc ttttctggca accaaaccca tacatcggga ttcctataat
2761 accttcgttg gtctccctaa catgtaggtg gcggagggga gatatacaat agaacagata
2821 ccagacaaga cataatgggc taaacaagac tacaccaatt acactgcctc attgatggtg
2881 gtacataacg aactaatact gtagccctag acttgatagc catcatcata tcgaagtttc
2941 actacccttt ttccatttgc catctattga agtaataata ggcgcatgca acttcttttc
3001 tttttttttc ttttctctct cccccgttgt tgtctcacca tatccgcaat gacaaaaaaa
3061 tgatggaaga cactaaagga aaaaattaac gacaaagaca gcaccaacag atgtcgttgt
3121 tccagagctg atgaggggta tctcgaagca cacgaaactt tttccttcct tcattcacgc
3181 acactactct ctaatgagca acggtatacg gccttccttc cagttacttg aatttgaaat
3241 aaaaaaaagt ttgctgtctt gctatcaagt ataaatagac ctgcaattat taatcttttg
3301 tttcctcgtc attgttctcg ttccctttct tccttgtttc tttttctgca caatatttca
3361 agctatacca agcatacaat caagcaattc cagatctgcc accatggcca agttgaccag
3421 tgccgttccg gtgctcaccg cgcgcgacgt cgccggagcg gtcgagttct ggaccgaccg
3481 gctcgggttc tcccgggact tcgtggagga cgacttcgcc ggtgtggtcc gggacgacgt
3541 gaccctgttc atcagcgcgg tccaggacca ggtggtgccg gacaacaccc tggcctgggt
3601 gtgggtgcgc ggcctggacg agctgtacgc cgagtggtcg gaggtcgtgt ccacgaactt
3661 ccgggacgcc tccgggccgg ccatgaccga gatcggcgag cagccgtggg ggcgggagtt
3721 cgccctgcgc gacccggccg gcaactgcgt gcacttcgtg gccgaggagc aggactgact
3781 tttacctttg ttgtcttatg tgtttttact ccaacacccc taaccctaat tccacataga
3841 tccaacccta attccgcaga ggtacaaata aacacaacca gctagagata gcacaccacc
3901 atgaggctag gttgcacata acacaccacc gaattttttg ctacccactt ttcttcctct
3961 ttgtctctat accaacccat ttagtaccca caaataaact ctggggtgta cggtaccaag
4021 cttcgccaac gagaatgcaa caaatgatga atatactgtg atgtagtgat tgctcattga
4081 ataagtagcg ttattcgaag taaagaatag aaaatcacaa gactggggtt aaagctgcat
4141 caaataggca aatgtgcggc gtatcgtggt ttgcgcgcac ggattatcta acaagttttt
4201 ccaccactta aaaattgagg gagcgttccg cataattata attgcttttt ttgctgacat
4261 cggcatcctg acttcttctt ttgtagtgct ctatttgtga gtggtgttaa aaaaacattc
4321 aaagtggcat gctattctaa ggcaatatgg aaacatgaga gttcctcttt gaatatctgg
4381 agctccagcc tattaggcaa gttttgtcag actgcttgta tggaagaggt tttcgggaaa
4441 ccatattcga ctcggtagag taagagatat gtctgattta tcctcatatg aaaggttttt
4501 aagaatataa gaatcaagta tcgaaatatt tgcaaaattt tggcactatg gccgagtggt
4561 taaggcgaca gacttgaaat ctgttgggct ctgcccgcgc tggttcaaat cctgctggtg
4621 tcgttatttt ttggaaataa ctttttttaa ctagacaata agcgtttagc cgggtaatat
4681 ttatttatat atatcggctc cttccatgga gctgataccg taagctcacc taatctgcga
4741 attgctcgag ttttttatct ttctagaaga tctcctacaa tattctcagc tgccatggaa
4801 aatcgatgtt cttcttttat tctctcaaga ttttcaggct gtatattaaa acttatatta
4861 agaactatgc taaccacctc atcaggaacc gttgtaggtg gcgtgggttt tcttggcaat
4921 cgactctcat gaaaactacg agctaaatat tcaatatgtt cctcttgacc aactttattc
4981 tgcatttttt ttgaacgagg tttagagcaa gcttcaggaa actgagacag gaattttatt
5041 aaaaatttaa attttgaaga aagttcaggg ttaatagcat ccattttttg ctttgcaagt
5101 tcctcagcat tcttaacaaa agacgtctct tttgacatgt ttaaagttta aacctcctgt
5161 gtgaaattgt tatccgctca caattccaca cattatacga gccggaagca taaagtgtaa
5221 agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgccaat
5281 tgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg
5341 gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc
5401 ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac
5461 agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa
5521 ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca
5581 caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc
5641 gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata
5701 cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta
5761 tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca
5821 gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga
5881 cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg
5941 tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg
6001 tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg
6061 caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag
6121 aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa
6181 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat
6241 ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc
6301 tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc
6361 atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc
6421 tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc
6481 aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc
6541 catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt
6601 gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc
6661 ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa
6721 aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt
6781 atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg
6841 cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc
6901 gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa
6961 agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt
7021 gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt
7081 caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag
7141 ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta
7201 tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat
7261 aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat
7321 catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggcc
<---