СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ МИКРОБНОГО СИНТЕЗА ЛИЗИНА
METHOD OF OBTAINING NUTRITIONAL MEDIUM FOR CARRYING OUT MICROBIAL LYSINE SYNTHESIS

Изобретение относится к биотехнологии, спиртовой и кормовой промышленности, может быть использовано при производстве кормовых добавок, обогащенных белком и аминокислотами, и касается способа получения питательной среды для проведения микробного синтеза лизина на основе биоконверсии полимеров зернового сырья и вторичных сырьевых ресурсов перерабатывающих отраслей АПК, в частности зерновой спиртовой барды.
Известны способы получения питательных сред для производства кормовых продуктов микробиологическим путем с содержанием в качестве источника углеводов мелассы (1-3). Однако меласса является дефицитным сырьем. Запасы мелассы в России как отхода свекловичного производства крайне ограничены. Не всегда обеспечено качество мелассы: в процессе ее хранения образуются токсины, подавляющие рост микроорганизмов и ингибирующие биосинтез конечного продукта.
Известен способ приготовления питательных сред, полученных на основе плодово-ягодного и овощного сырья и их отходов и используемых для получения кормовых аминокислот, например L-лизина (4).
Однако качество целевого продукта, получаемого по данному известному способу, недостаточно высокое. Существует риск инфицирования производства L-лизина в результате использования в составе питательных сред дефектного сырья, контаминированного микроорганизмами, в том числе спорообразующими, уксусно-кислыми и гнилостными бактериями.
Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является способ получения питательных сред из крахмалсодержащего сырья для проведения микробного синтеза (5). Сущность данного способа заключается в приготовлении питательных сред на основе ферментативного гидролиза крахмалсодержащего сырья. Для этого крахмалсодержащее сырье предварительно разваривают, для его гидролиза используют культуру или смесь культур - продуцентов ферментов в физиологически активном состоянии, процесс гидролиза ведут до содержания усвояемых углеводов в среде 3-7% при 55-65°С, осуществляя одновременно с гидролизом частичное разрушение клеток культуры - продуцента ферментов, затем полученную среду охлаждают до температуры, оптимальной для роста продуцента, и процесс биосинтеза аминокислот ведут одновременно с гидролизом крахмалсодержащего сырья путем совместного культивирования клеток продуцента аминокислот и частично разрушенных клеток продуцентов ферментов. В качестве культур - продуцентов гидролитических ферментов - используют штаммы Вас. subtilis-82, Aspergillus awamori ВУД, Aspergillus oryzae 251-90, Geotrichum candidum 3с или их смеси. С целью улучшения аэродинамических свойств среды для биосинтеза аминокислот в нее добавляют мелассу.
Однако в известном способе при получении питательной среды недостаточно полно используются все основные полимеры зернового сырья, что снижает эффективность его конверсии, увеличивает затраты сырья на производство получаемого продукта. Это происходит потому, что в известном способе используются низкоактивные микроорганизмы, синтезирующие узкий спектр ферментов, и их низкий уровень не обеспечивает эффективного гидролиза ксиланов зернового сырья, глубокого гидролиза глюканов и белковых веществ. В результате питательные среды имели высокую вязкость и низкую степень гидролиза полисахаридов, в т.ч. крахмала, что препятствовало полноценному развитию продуцентов получаемого продукта и рациональному использованию всех компонентов зернового сырья, повышая тем самым расход зернового сырья на единицу получаемого продукта и вызывая необходимость введения в состав питательных сред мелассы.
Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является повышение качества питательной среды, улучшение качественных ее характеристик и повышение выхода целевого продукта.
Указанный технический результат достигается за счет того, что в способе получения питательной среды для проведения микробного синтеза лизина в качестве источника углерода и азота используется зерновое сырье, биоконверсия полимеров которого осуществляется путем обработки зернового помола комплексом высокоактивных экзогенных ферментов, осуществляющих глубокий гидролиз крахмала, некрахмальных полисахаридов и белковых веществ зерна, включающим α-амилазу, глюкоамилазу, комплекс протеаз - протеиназы и пептидазы, эндо- и экзо-β-глюканазы, ксиланазы, источником которых могут быть грибы микромицеты, а именно высокопродуктивные штаммы Aspergillus awamori ВКПМ F-203 (ВУД-Т2) или ВКПМ F-3765 (1000У) - продуценты глюкоамилазы, Aspergillus oryzae ВКПМ F-683 или ВКПМ F-931- продуценты комплекса протеаз, включающего протеиназы, и пептидаз, альфа-амилазы, эндо- и экзо-β-глюканаз и ксиланазы, либо высокоактивные технические ферментные препараты-источники: α-амилазы, например амилосубтилин, амилолихетерм, амилекс ЗТ, амилайв АЗО; глюкоамилазы, например глюкаваморин, конверзим АМГ N, глюкомил L-706, глюкогам 500L; комплекса протеаз, включающего протеиназы, и пептидаз, например амилопротооризин, КФПА, CG-106, максазим NNPK, пролайв 30L; эндо- и экзо-β-глюканаз, ксиланазы, например целловиридин, ксибетен-цел, ксибетен-ксил, брюзайм, вискостар 150L.
Применение для получения питательной среды указанных высокопродуктивных штаммов-продуцентов или высокоактивных технических ферментных препаратов, способных осуществлять более глубокий гидролиз высокомолекулярных полисахаридов, белковых веществ и других компонентов зернового сырья с получением более высокого - в 2 раза по сравнению с известным способом - количества моно- и дисахаридов, аминокислот и дипептидов, являющихся стимуляторами роста микроорганизмов и синтеза целевого продукта, позволяет наиболее полно использовать все его компоненты, тем самым повышая питательную ценность среды, а также выход целевого продукта за счет увеличения количества легкоусваиваемых веществ сырья, конверсируемых в дальнейшем в лизин. Одновременно происходит обогащение питательной среды дополнительным количеством глюкозы в результате гидролиза β-глюканов зерна ферментными препаратами - источниками β-глюканаз. Кроме того, обеспечивается улучшение реологических свойств концентрированного сусла в результате действия ксиланаз, снижение его вязкости в 2,0-2,5 раза, улучшение массообменных и аэродинамических процессов, что в совокупности позволяет исключить из состава питательной среды мелассу.
Использование предлагаемого комплекса ферментов позволяет увеличить выход лизина в 1,5 раза по сравнению с аналогом, где использовались культуральные жидкости - источники α-амилазы, глюкоамилазы.
В качестве фактора роста в состав питательной среды вводится ферментолизат дрожжей Saccharomyces cerevisiae - Протамин (8) в количестве 0,5-2,0% - дополнительный источник незаменимых аминокислот, необходимых для эффективной жизнедеятельности продуцентов, что позволяет исключить из состава питательной среды кукурузный экстракт и повысить выход лизина на 13-42%.
При приготовлении питательной среды зерновой помол разводят тонкодисперсной послеспиртовой зерновой бардой (отход спиртового производства) в соотношении 1:10-1:30, а затем подвергают его ферментативной обработке, что также повышает питательную ценность и качество среды за счет ее обогащения присутствующими в барде продуктами автолиза биомассы спиртовых дрожжей, микро- и макроэлементами, а также частично решается проблема утилизации отхода спиртового производства - барды.
Все это в совокупности повышает качество питательной среды, что способствует увеличению выхода целевого продукта в 2,0-2,5 раза с единицы зернового сырья, снижению его себестоимости, а также повышению эффективности его производства, заключающейся в уменьшении расхода теплоэнергоресурсов при приготовлении питательной среды.
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.
3
3
2
4
Пример 1. Штаммы микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-931 и Aspergillus oryzae ВКПМ F-683 (6,7), используемые в способе согласно изобретению, и штамм Aspergillus oryzae 251-90, используемый в известном способе (5), выращивают в колбах Эрленмейера объемом 750 см на среде, содержащей, %: ячмень 3,0, пшеничные отруби 3,0, КНРО 1,5, остальное вода, рН естественный. Культивирование осуществляют в течение 48 часов. Штаммы микромицета Aspergillus awamori ВКПМ F-203 (ВУД-Т2) и ВКПМ F-3765 (1000У), используемые в способе согласно изобретению, и штамм Aspergillus awamori ВУД, используемый в известном способе (5), выращивают в колбах Эрленмейера объемом 750 см на среде, содержащей, %: пшеничная мука 20, диаммонийфосфат 0,45.
Сравнительная характеристика уровней активностей используемых культур по сравнению с прототипом приведена в табл.1 и 2.
Таблица 1
Штамм гриба Aspergillus oryzae
Ферментативная активность культуральной жидкости, ед./см<sup>3</sup>
ПС
β-ГкС
AC
КС
251-90
8,0
0
10,5
0
ВКПМ F-683
12,8
0,8
14,3
4,2
ВКПМ F-931
39,2
4,8
19,0
7,8
ПС - протеолитическая активность
β-ГкС - β-глюканазная активность
AC - ά-амилазная активность
КС - ксиланазная активность
Таблица 2
Штамм гриба Aspergillus awamori
Ферментативная активность культуральной жидкости, ед./см<sup>3</sup>
ГлС
AC
ед./см<sup>3</sup>
% увелич.*
ед./см<sup>3</sup>
% увелич.
ВУД
150
0
5
0
ВКПМ F-203
350
130
42
740
ВКПМ F-3765
750
400
58
1060
*/ % увеличение ферментативной активности (способности)
ГлС - глюкоамилазная активность
AC - ά-амилазная активность
Таким образом, штаммы микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-683 и F-931 продуцируют комплекс ферментов с повышенным уровнем активности: протеолитической в 1,6-4,9 раза, ά-амилазной в 1,4-1,7 раза, и дополнительно синтезируют β-глюканазу и ксиланазу по сравнению с активностью ферментов, синтезируемых штаммом Aspergillus oryzae 251-90, используемым в известном способе (5). Штаммы Aspergillus awamori ВКПМ F-203 (ВУД-Т2) и ВКПМ F-3765 (1000У) обладают высокой глюкоамилазной способностью, превышающей на 130-400% активность штамма Aspergillus awamori ВУД, используемого в известном способе (5). Это позволяет при проведении ферментативного гидролиза крахмалсодержащего сырья сократить расход ферментных препаратов, получаемых из культуральных жидкостей микромицетов Aspergillus oryzae ВКПМ F-931 и Aspergillus awamori F-3765, и при этом обеспечить более глубокую степень гидролиза полисахаридов зернового сырья, что приводит к увеличению количества в питательной среде ассимилируемых моно- и дисахаридов, обогащению сусла легкоассимилируемыми источниками азота, в том числе аминокислотами и дипептидами.
3
Пример 2. Для приготовления питательной среды в лабораторных условиях используют измельченное пшеничное сырье в соотношении с водой, равном 1:4. Пшеничный замес нагревают до 55-60°С и задают культуральную жидкость Aspergillus oryzae F-931, содержащую α-амилазу, комплекс протеиназ, пептидаз, β-глюканазу и ксиланазу при дозировке по α-амилазе 1,0 ед. АС/г крахмала сырья, по протеазе 2,7 ед. ПС/г крахмала, по ксиланазе 0,47 ед. КС/г крахмала и по β-глюканазе 0,3 ед. (β-ГкС/г крахмала. Одновременно для осуществления ферментативного гидролиза крахмала сырья вносят культуральную жидкость Aspergillus awamori F-3765 с активностью по глюкоамилазе 750 ед. ГлС/см в дозировке 6,0 ед. ГлС/г крахмала.
3
3
Ферментативный гидролиз осуществляют при периодическом перемешивании в течение 4-х ч при 55-60°С до содержания редуцирующих углеводов 8,0%. Затем питательную среду стерилизуют при 0,5 атм в течение 40 минут, охлаждают до 30°С, задают стерильно подготовленный раствор диаммонийфосфата 3,0, рН среды доводят до 7,2. Приготовленную питательную среду стерильно засевают вегетативным посевным материалом Brevibacterium sp. - продуцентом L-лизина в количестве 4% - и осуществляют культивирование микроорганизмов в аэробных условиях при 30°С в колбах Эрленмейера объемом 750 см. Процесс биосинтеза лизина длится 66 ч. Содержание лизина 27,5 г/дм. Выход лизина 13,7 г/100 г пшеницы.
3
Пример 3. В качестве источника углеводов используют сахарное сорго, подготовку которого осуществляют аналогично примеру 2. Процесс подготовки питательной среды для засева продуцента лизина Brevibacterium sp. и культивирование проводят аналогично примеру 2. Процесс биосинтеза лизина длится 66 ч. Содержание лизина 32,8 г/дм. Выход лизина 16,4 г/100 г сорго.
3
Пример 4. В качестве источника углеводов используют зерно кукурузы, подготовку которого осуществляют аналогично примеру 2. Процесс подготовки питательной среды для засева продуцента лизина Brevibacterium sp. и культивирование проводят аналогично примеру 2. Процесс биосинтеза лизина длится 66 ч. Содержание лизина 36,0 г/дм. Выход лизина 18,0 г/100 г кукурузы.
3
Пример 5. В качестве источника углеводов используют зерно ржи, подготовку которого осуществляют аналогично примеру 2. Процесс подготовки питательной среды для засева продуцента лизина Brevibacterium sp. и культивирование проводят аналогично примеру 2. Процесс биосинтеза лизина длится 66 ч. Содержание лизина 41,0 г/дм. Выход лизина 20,5 г/100 г ржи.
3
Пример 6. В качестве источника углеводов используют зерно ячменя, подготовку которого осуществляют аналогично примеру 2. Процесс подготовки питательной среды для засева продуцента лизина Brevibacterium sp. и культивирование проводят аналогично примеру 2. Процесс биосинтеза лизина длится 66 ч. Содержание лизина 36,5 г/дм. Выход лизина 18,3 г/100 г ячменя.
3
Пример 7. В качестве источника углеводов используют зерно овса, подготовку которого осуществляют аналогично примеру 2. Процесс подготовки питательной среды для засева продуцента лизина Brevibacterium sp. и культивирование проводят аналогично примеру 2. Процесс биосинтеза лизина длится 66 ч. Содержание лизина 42,0 г/дм. Выход лизина 21,0 г/100 г овса.
3
Пример 8. Подготовку питательной среды для проведения микробного синтеза лизина и культивирования продуцента - Brevibacterium sp. - проводят аналогично примеру 2. После стерилизации в стерильное сусло в асептических условиях в качестве стимулятора роста и дополнительного источника незаменимых аминокислот вносят ферментолизат дрожжей Saccharomyces cerevisiae - Протамин - в количестве 0,5%. Далее процесс осуществляют так же, как в примере 2. Содержание лизина 29,8 г/дм. Выход лизина 14,9 г/100 г сырья.
3
Пример 9. Подготовку питательной среды для проведения микробного синтеза лизина и культивирования продуцента - Brevibacterium sp. - проводят аналогично примеру 2. После стерилизации в стерильное сусло в асептических условиях в качестве стимулятора роста и дополнительного источника незаменимых аминокислот вносят ферментолизат дрожжей Saccharomyces cerevisiae - Протамин - в количестве 1,0%. Далее процесс осуществляют так же, как в примере 2. Содержание лизина 38,6 г/дм. Выход лизина 19,3 г/100 г сырья.
3
Пример 10. Подготовку питательной среды для проведения микробного синтеза лизина и культивирования продуцента - Brevibacterium sp. - проводят аналогично примеру 2. После стерилизации в стерильное сусло в асептических условиях в качестве стимулятора роста и дополнительного источника незаменимых аминокислот вносят ферментолизат дрожжей Saccharomyces cerevisiae - Протамин - в количестве 2,0%. Далее процесс осуществляют так же, как в примере 2. Содержание лизина 39,1 г/дм. Выход лизина 19,6 г/100 г сырья.
3
Пример 11. Для приготовления питательной среды используют пшеничный замес при гидромодуле 1:4, как в примере 2. Затем в нагретый до 55-60°С зерновой замес вносят ферментные препараты: амилосубтилин 0,5 ед. АС/г крахмала, глюкаваморин 8,0 ед. ГлС/г, КФПА 1,0 ед. ПС/г крахмала, при этом с КФПА вносится дополнительно: 1,1 ед. АС/г, 0,09 ед. β-ГкС/г, 0,4 ед. КС/г крахмала, целловиридин 0,5 ед. КС/г, при этом с целловиридином вносится дополнительно 1,2 ед. β-ГкС/г и 3,9 ед. ЦС/г крахмала. Ферментативный гидролиз осуществляют при периодическом перемешивании в течение 4-х ч при 55-60°С до содержания редуцирующих углеводов 12,0%. Далее процесс осуществляют так же, как в примере 2. Содержание лизина 41,2 г/дм. Выход лизина 20,6 г/100 г сырья.
3
Пример 12. Подготовку питательной среды для проведения микробного синтеза лизина и культивирования продуцента - Brevibacterium sp. - проводят аналогично примеру 11. В стерильное сусло в асептических условиях в качестве стимулятора роста вносят Протамин в количестве 1,0% по примеру 9. Далее процесс осуществляют так же, как в примере 2. Содержание лизина 46,4 г/дм. Выход лизина 23,2 г/100 г сырья.
3
Пример 13. Для приготовления питательной среды в лабораторных условиях измельченное пшеничное сырье разводят тонкодисперсной послеспиртовой зерновой бардой в соотношении зерновое сырье и барда 1:10. Полученный замес нагревают до 55-60°С и задают ферментные препараты в дозировках, как указано в примере 11. Ферментативный гидролиз осуществляют при периодическом перемешивании в течение 4-х ч при 55-60°С. Далее процесс осуществляют так же, как в примере 12. Содержание лизина 15,9 г/дм. Выход лизина 17,5 г/100 г сырья.
3
Пример 14. Для приготовления питательной среды в лабораторных условиях измельченное пшеничное сырье разводят тонкодисперсной послеспиртовой зерновой бардой в соотношении зерновое сырье и барда 1:20. Полученный замес нагревают до 55-60°С и задают ферментные препараты в дозировках, как указано в примере 11. Ферментативный гидролиз осуществляют при периодическом перемешивании в течение 4-х ч при 55-60°С. Далее процесс осуществляют так же, как в примере 12. Содержание лизина 13,2 г/дм. Выход лизина 27,7 г/100 г сырья.
3
Пример 15. Для приготовления питательной среды в лабораторных условиях измельченное пшеничное сырье разводят тонкодисперсной послеспиртовой зерновой бардой в соотношении зерновое сырье и барда 1:30. Полученный замес нагревают до 55-60°С и задают ферментные препараты в дозировках, как указано в примере 11. Ферментативный гидролиз осуществляют при периодическом перемешивании в течение 4-х ч при 55-60°С. Далее процесс осуществляют так же, как в примере 12. Содержание лизина 11,2 г/дм. Выход лизина 34,7 г/100 г сырья.
Результаты по синтезу лизина на различных видах зернового сырья приведены в табл.3.
Таблица 3
№ примера
Используемое зерновое сырье
Содержание лизина в к.ж., г/дм<sup>3</sup>
Выход лизина г/100 г сырья
2
пшеница
27,5
13,7
3
сорго
32,8
16,4
4
кукуруза
36,0
18.0
5
рожь
41,0
20,5
6
ячмень
36,5
18,3
7
овес
42,0
21,0
Результаты по выходу лизина с единицы сырья на питательных средах, приготовленных на основе пшеничного сырья и послеспиртовой барды, приведены в табл.4.
Таблица 4
№ примера
Соотношение зерна и барды
Содержание лизина в к.ж., г/дм<sup>3</sup>
Выход лизина г/100 г сырья
12
Без барды
46,4
23,2
13
1:10
15,9
17,5
14
1:20
13,2
27,7
15
1:30
11,2
34,7
3
3
3
3
3
3
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет: сократить расход ферментов, получаемых из более активных культуральных жидкостей микромицетов, используемых в данном изобретении; повысить степень гидролиза зернового сырья в результате использования подобранных ферментов и увеличить синтез лизина в 1,5 раза (с 27,5 г/см до 41,2 г/см); повысить выход лизина до 42% (с 27,5 г/см до 39,1 г/см) при введении в среду Протамина; вовлечь в производство лизина отходы спиртового производства в виде послеспиртовой барды, тем самым повысить выход лизина с единицы сырья в 2,0-2,5 раза (с 13,7 г/см до 34,7 г/см).
Литература
1. Патент США 3825472, кл. С12Р 13/08, 1974.
2. Технология микробного синтеза. Рига. Изд. Зинатне, 1978, с.16.
3. Патент RU 2027761, кл. С12Р 13/08. Штамм бактерий Brevibacterium sp. - продуцент лизина, 1995.
4. А.с. SU 1665693, кл. С12Р 13/08. Способ получения кормового концентрата L-лизина, 1988.
5. А.с. SU 1576566, кл. С12Р 13/08. Способ получения кормового L-лизина, 1990.
6. Патент RU 2070921, кл. С12N 1/14. Штамм гриба Aspergillus oryzae - продуцент комплекса кислых и слабокислых протеаз, амилолитических и цитолитических ферментов, 1996.
7. Патент RU 2315096, кл. С12N 1/14. Штамм гриба Aspergillus oryzae - продуцент комплекса протеиназ, пептидаз, β-глюканазы, α-амилазы и ксиланазы, 2008.
8. Патент RU 2104300, кл. С12N 1/06. Способ получения белкового гидролизата дрожжевой биомассы, 1998.