Участие активных форм кислорода в регуляции Са2+-активируемых к+-каналов эритроцитов

Участие активных форм кислорода в регуляции Са2+-активируемых К+-каналов эритроцитов

Трубачева О.А.\ Кремено С.В2, Петрова И.В.\ Ситожевский А.В.2, Груздева О.В2, Иванов В.В.1, Суслова Т.Е.2

Participation of reactive oxygen species in regulation of Са2+-activated

К+ channels of erythrocytes

Trubacheva О.А., Kremeno S.V., Petrova I.V., SitozhevskyA.V., Gruzdeva

O.V., Ivanov V.V., Suslova Т^е.

1 Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

2 НИИ кардиологии СО РАМН, г. Томск

© Трубачева О.А., Кремено С.В., Петрова И.В. и др.

Изучен эффект предынкубации эритроцитов с активными формами кислорода, генерируемыми системой ксантиноксидаза - ксантин, на Са2-зависимую калиевую проницаемость мембраны этих клеток. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция в присутствии кальциевого ионофора А2318/ вело к гиперполяризации эритроцитарной мембраны вследствие открывания Са2-зависимых калиевых каналов. Мембранный потенциал эритроцитов был зарегистрирован благодаря измерению рН среды инкубации в присутствии прото-нофора. Инкубация эритроцитов в присутствии ксантина (100 мкмоль) и ксантиноксидазы (10 ми/мл) приводило к значительному снижению амплитуды и скорости развития гиперполяризации, а также к уменьшению скорости восстановления мембранного потенциала. Эти эффекты могут быть вызваны перекисью водорода - одним из продуктов ксантиноксидазной реакции.

Ключевые слова: эритроциты, са2-активируемые калиевые каналы, активные формы кислорода.

In this study, we investigated the effects of preincubation with the reactive oxygen species-generating system xanthine oxidase/xanthine on Ca2+-dependent potassium permeability of erythrocyte membrane. The increase of intracellular calcium concentration in presence of calcium ionophore A23187 led to erythrocyte membrane hyperpolarization due to opening of Ca2+-activated potassium channels. Erythrocyte membrane potential was recorded via measurement of pH of the incubation medium in presence of prothonophore. Incubation of erythrocytes with xanthine (100 ^mol)/ xanthine oxidase (10 mU/ml) mixture resulted in significant loss of amplitude and rate of hyperpolarization response and also loss the rate of membrane potential restoration. These effects can be caused by hydrogen peroxide, one of products of reaction of xanthine oxidase/xanthine.

Key words: erythrocytes, Ca2+-activated potassium channels, reactive oxygen species.

УДК 612.111:612.014.464

Введение

Роль активных форм кислорода (АФК) в развитии патологий, связанных с окислительным стрессом, таких как атеросклероз, ишеми-ческая болезнь сердца, диабет и другие, достаточно хорошо изучена [з]. Однако в последние годы появляется все больше работ, в которых

исследуется сигнальная роль АФК, в частности обсуждается механизм включения этих соединений в регуляцию ионтранспортных систем клетки. Так, активные кислородные радикалы, образующиеся при активации мембраносвязан-ной НАДФН-оксидазы, регулируют Са2-активи-руемые калиевые каналы эозинофилов [9]. Известно ингибирующее влияние супероксид-ани-

она на Са2-АТФ-азу саркоплазматического ре-тикулума гладкомышечных клеток сосудов [6].

Традиционной моделью для изучения ионного транспорта служат клетки красной крови. Мембрана эритроцитов содержит только один тип каналов, а именно Са2-активируемые калиевые каналы, что позволяет проводить исследования на суспензии интактных эритроцитов. Показано, что Са2-активируемые калиевые каналы вносят определенный вклад в деформируемость красных клеток крови [8]. В процессе функционирования эритроциты подвергаются действию многих физико-химических факторов, одним из которых являются АФК, постоянно образующиеся в организме. Роль этих соединений в регуляции Са2-активируемых калиевых каналов эритроцитов не изучена, в связи с чем проведение настоящего исследования представляется весьма актуальным.

Материал и методы

В работе использовалась кровь практически здоровых добровольцев (18 человек). Кровь забиралась из локтевой вены утром натощак в пробирки с гепарином (25 ЕД на i мл крови). После центрифугирования (10003, 5 мин, 4 °С) плазму и клетки белой крови удаляли, а эритроциты дважды промывали тремя частями изоосмотического раствора NaCl (150 ммоль), содержащего Na-фосфатный буфер с концентрацией 5 ммоль (рН = 7,4), при тех же условиях центрифугирования. Для исследования Са2-активи-руемых калиевых каналов был применен метод регистрации мембранного потенциала в суспензии эритроцитов по изменениям рН среды инкубации в присутствии протонофора, основанный на том, что в этих условиях распределение протонов зависит от мембранного потенциала [6]. Эксперименты проводились по следующему плану. Для получения гиперполяризационного ответа к 4,75 мл среды инкубации ( среда N ), содержащей 150 ммоль NaCl, 1 ммоль kci, 1 ммоль MgCl2, 10 ммоль глюкозы и 10 мкмоль Са02, добавляли 0,25 мл упакованных эритроцитов. Через 5 мин инкубации при температуре 37 °С и постоянном перемешивании добавляли

протонофор О-ССР до конечной концентрации 20 мкмоль и спустя 2 мин добавляли Са2-ионо-фор А23187 в концентрации 0,5 мкмоль. Добавление кальциевого ионофора А23187 к суспензии клеток, содержащей хлорид кальция, приводило к выходу ионов калия и развитию гиперполяризационного ответа (ГО) мембраны эритроцитов, что находило отражение в изменении рН суспензии. Защелачивание среды инкубации соответствовало гиперполяризации мембраны, а восстановление рН — возвращению мембранного потенциала (МП) к исходному значению. Амплитуда ГО и скорость его развития характеризуют Са2-активируемые калиевые каналы, а скорость восстановления МП — активность Са2-АТФ-азы [6] (рис. 1).

6,5 \- 1 мин

Рис. 1. Типичная кинетика изменения рН в суспензии эритроцитов человека в ответ на добавление Са2-ионофора А23187 в концентрации 0,5 мкмоль в присутствии 10 мкмоль Саа2 и протонофора

С1-ССР в концентрации 20 мкмоль (представлена как иллюстрация

метода расчета стационарных и кинетических параметров)

В качестве продуцента АФК — супероксид-аниона и перекиси водорода использовалась система, включающая ксантин (100 мкмоль) и ксантиноксидазу (10 мu/мл). Продукцию супероксид-аниона оценивали спектрофотометриче-ски. В одну кювету объемом 1 мл добавляли к среде инкубации эритроцитов ксантин в концентрации 100 мкмоль, ксантиноксидазу — 10 мu/мл и цитохром с — 50 мкмоль. Измерения проводи-

лись против кюветы, содержащей среду N и ци-тохром с в концентрации 50 мкмоль. Продукцию супероксид-аниона оценивали по степени восстановления цитохрома с при длине волны 550 нм. Спектрофотометрические исследования показали, что максимальная продукция супероксид-аниона наблюдалась при ю мин инкубации. Концентрация супероксид-аниона в среде инкубации в описанных условиях составила 9 мкмоль. Другим продуктом реакции с участием ксанти-ноксидазы является перекись водорода, что находит отражение в снижении содержания супероксид-аниона.

В первой серии экспериментов эритроциты инкубировались в присутствии ксантина (100 мкмоль) и ксантиноксидазы по ми/мл) в среде N. Инкубация проводилась в течение ю, 20, зо мин, после чего клетки отмывали в стандартных условиях. Такой же процедуре подвергались эритроциты, используемые в контрольных экспериментах, но среда их инкубации не содержала ксантин и ксантиноксидазу. Измерения параметров ГО проводились в среде N.

Во второй серии экспериментов к суспензии эритроцитов добавлялась перекись водорода в концентрациях 0,05; 0,1; 0,5 и 1 мкмоль. В ряде случаев среда инкубации эритроцитов содержала аминотриазол — проникающий ингибитор ка-талазы в концентрации 0,026 моль.

Для оценки влияния изученных факторов на параметры гиперполяризационного ответа эритроцитов рассчитывались средние значения каждого параметра, определялась ошибка среднего. Для оценки достоверности различия средних значений по малым независимым выборкам, если распределение было ненормальным или достоверно различались генеральные дисперсии, использовался непараметрический У-кри-терий Манна—Уитни. Для сравнения зависимых групп, если распределение было ненормальным или достоверно различались генеральные дисперсии, использовался непараметрический критерий Вилкоксона [2, з].

Результаты и обсуждение

Амплитуда ГО эритроцитов, подвергнутых предынкубации в присутствии ксантина и ксан-

тиноксидазы в течение 10 мин, не отличалась от контрольных значений и составила (97,57 ± 0,96)% (п = 7; р > 0,05). Как показали спектрофотометрические исследования, максимальная продукция супероксид-аниона наблюдалась через 10 мин инкубации ксантина и ксантиноксидазы в выбранных концентрациях. Известно, что о2- практически не проникает через мембрану клеток и к тому же обладает малой реакционной способностью [1]. Другим продуктом ксантиноксидазной реакции является перекись водорода, для которой липидный би-слой мембраны не является препятствием. Увеличение времени предынкубации до 20 и 30 мин вызвало достоверное снижение амплитуды ГО эритроцитов: (91,8 ± 0,84)% (П = 7; р < 0,05) и (86,36 ± 0,76)% (п = 7; р < 0,05) соответственно (рис. 2,о. Кроме того, при всех вариантах пре-динкубации обнаружено достоверное снижение скорости развития ГО эритроцитов ( параметр V,), которая составила (54,38 ± 1,39%) (п = 7;

р < 0,02), (65,52 ± 1,39%) (П = 7; р < 0,02) и

( 56,39 ± 1,95%) (п = 7; р < 0,02) соответственно для 10, 20 и 30 мин (рис. 2,6). Скорость восстановления мембранного потенциала эритроцитов (параметр У2), отражающая активность Са2-на-соса мембраны этих клеток, достоверно снижалась только при 30 мин предынкубации: (75,74 ± 2,01%) (п = 7; р < 0,05) (рис. 2,в). Наиболее вероятным объяснением полученных данных может быть влияние перекиси водорода на Са2-активируемую калиевую проницаемость и Са2-насос мембраны эритроцитов. Действительно, имеются сведения, что Н2О2 ингибирует активность Са2-АТФ-азы саркоплазматического ретикулума гладкомышечных клеток [5, 6].

а

100 95 90 85

в

Рис. 2. Изменения параметров гиперполяризационного ответа эритроцитов, предынкубированных с системой ксантин — ксантиноксидаза: * — параметры, достоверно отличающиеся от контрольных с р < 0,05; а — амплитуда гиперполяризационного ответа эритроцитов; б — скорость гиперполяризации эритроцитов; в — скорость

восстановления мембранного потенциала эритроцитов

Для проверки предположения о влиянии Н2О2 на Са2-активируемые калиевые каналы эритроцитов была проведена серия экспериментов с добавлением перекиси водорода в среду инкубации клеток. Достоверное снижение амплитуды ГО до ( 93,86 ± 5,04)% (п = 5; р < 0,05) обнаруживалось в присутствии перекиси водорода в концентрации 0,5 мкмоль в среде инкубации (рис. 3,а). Параметры V, и V достоверно не изменялись в присутствии всех использованных концентраций перекиси водорода.

0,05 0,10 0,50 1,00

Концентрация перекиси водорода, мкмоль — Без аминотриазола —— С аминотриазолом

а

140 130 120 100 90 80 70 60

Vb %

0,05 0,10 0,50 1,00

Концентрация перекиси водорода, мкмоль — Без аминотриазола —— С аминотриазолом

б

160 140 120 100 80 60 40

Vi, % *

0,05 0,10 0,50 1,00

Концентрация перекиси водорода, мкмоль ♦ Без аминотриазола —— С аминотриазолом в

Рис. 3. Влияние перекиси водорода на параметры гиперполяризационного ответа эритроцитов в присутствии и отсутствии аминотриазола: * — обозначены параметры, достоверно отличающиеся от контрольных с р < 0,05; а — амплитуда гиперполяризационного ответа эритроцитов; б — скорость гиперполяризации эритроцитов; в —

скорость восстановления мембранного потенциала эритроцитов

Обработка эритроцитов проникающим ингибитором каталазы аминотриазолом привела к достоверному снижению амплитуды ГО эритроцитов и при более низких концентрациях Н2О2. Так, этот параметр составил (86,82 ± 5,69)% (п = 5;

р < 0,05); (85,05 ± 0,85)% (П = 5; р < 0,05) и

(79,02 ± 0,91)% (п = 5; р < 0,05) соответственно при

концентрациях Н2О2 0,05; 0,1 и 1 мкмоль (рис. 3,6). В присутствии аминотриазола обнаружено значительное снижение скорости развития ГО эритроцитов при всех использованных концентрациях перекиси водорода. Этот параметр составил

(77,08 ± 1,09)% (п = 5; р < 0,05); ( 74,73 ± 4,24)% (п = 5; р < 0,05); (83,78 ± 4,26)% (п = 5; р < 0,05) и

(78,51 ± 1,55)% (п = 5; р < 0,05) соответственно при концентрациях 0,05; 0,1; 0,5 и 1 мкмоль (рис. 3,в). Кроме того, оказалось, что скорость восстановления ГО эритроцитов, обработанных аминотри-азолом, достоверно увеличивалась и составила при концентрациях 0,05; 0,1; 0,5 и 1 мкмоль Н2О2 соответственно (146,35 ± 5,59)% (п = 5; р < 0,05);

(151,06 ± 3,52)% (п = 5; р < 0,05); (143,27 ± 4,32)% (п = 5; р < 0,05) и (146,85 ± 3,57)% (п = 5; р < 0,05).

Полученные данные свидетельствуют о снижении Са2-зависимой калиевой проницаемости и, напротив, об увеличении активности Са2-на-соса мембраны эритроцитов, причем эффект возрастал в присутствии ингибитора каталазы. Последнее, видимо, связано с ростом концентрации перекиси в цитозоле эритроцитов.

Ранее было показано, что управление Са2-активируемыми калиевыми каналами имеет сложный характер. Возможно, наблюдаемые эффекты в присутствии перекиси водорода связаны с изменением сульфгидрильных sн-групп белков самого канала или белков цитоскелета. Действительно, ранее были получены сведения о снижении амплитуды гиперполяризационного ответа в присутствии модификаторов sн-групп [5, 6]. Кроме того, имеются данные о влиянии про-теинкиназы С на Са2-активируемые калиевые каналы эритроцитов [6]. Известно, что активность этого фермента меняется в присутствии АФК. Возможно, изменение активности протеин-киназы С в присутствии перекиси водорода вносит свой вклад в изменение Са2-зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов. Кроме того, известно, что мишенью действия АФК является №/к-АТФ-аза [3]. Ее инги-бирование способствует снижению градиента ионов калия, имеющегося на мембране эритроцита, что, в свою очередь, может привести к уменьшению активности Са2-активируемых калиевых каналов. Действительно, ранее было обнаружено, что диссипация калиевого градиента эритроцитов вследствие ингибирования №*/к*-

АТФ-азы оубаином приводила к снижению амплитуды ГО эритроцитов [5, 6, 11]. Увеличение активности Са2-АТФ-азы эритроцитов, обнаруженное в присутствии перекиси водорода и ингибитора каталазы, о чем свидетельствует рост параметра V2, может быть также связано с изменением активности протеин-киназы С. Протеинкиназа С может не только непосредственно влиять на Са2-АТФ-азу, фосфо-рилируя белки насоса, но и модулировать активность этой ионтранспортирующей системы через другие регуляторные системы клетки, например через аденилатциклазный сигнальный путь [10, 12].

Заключение

В ходе настоящего исследования установлено, что АФК, в частности перекись водорода, вмешиваются в регуляцию Са2-активируемых калиевых каналов и, вероятно, Са2-АТФ-азы эритроцитов. Свое действие на Са2-активируе-мую калиевую проницаемость эритроцитов АФК могут реализовывать различными путями. Один из них связан с влиянием на sH-группы белков канала или цитоскелета. Другой путь может быть опосредован протеинкиназой С, активность которой меняется под действием АФК. Не исключено также, что подавление активности Na/к-АТФ-азы АФК, приводящее к диссипации градиента ионов калия, вызывает снижение амплитуды ГО.

Литература

1. Боровиков В.П., Боровиков И.П. Статистика. Статистический анализ и обработка данных в среде

Windows. М., 1998. 591 с.

2.

3. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в клетке // Нейрохимия. 1996. № 13. С. 47—54.

4. Болдырев А.А. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине / Под ред. Т.М. Турпаева. М.: Изд-во МГУ, 1998. С. 119—

139.

5. Колесниченко Л.С., Кулинский В.И. Глута-тионтранс-

феразы // Успехи соврем. биологии. 1989. Т. 107.

С. 179—194.

6. Колосова М.В., Петрова И.В., Соколова И.Б. и др.

Роль внутриклеточных сигнальных систем в регуляции Са2*-активируемых калиевых каналов эритроцитов // Бюл. эксперим. биологии и медицины.

1997. Т. 124. № 6. С. 653—655.

7. Орлов С.Н., Петрова И.В., Покудин Н.И. и др. Са2*-

активируемые калиевые каналы эритроцитов, исследованные методом регистрации Са2*-индуциро-ванных изменений мембранного потенциала // Биол. мембраны. 1992. Т. 9. № 9. С. 885—903.

8. Сторожок С.А., Санников А.Г., Захаров Ю.М. Молекулярная структура мембран эритроцитов и их механические свойства. Тюмень, 1997. 140 с.

9. Bor-Kucukatay M., Wenby R.B., Meiselman H.J.,

Baskurt O.K. Effect of nitric oxide on red blood cell deformability // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2003. V. 284. P. H1577—H1584.

10. De Vriese A.S., Verbeuren T.J., De Voorde J.V et al.

Endothelial dysfunction in diabetes // J. Pharmacol. 2000. V. 130. P. 963 — 974.

11. Symeonidis A., Athanassiou G., Psiroyannis A. et al.

Impairment of erythrocyte viscoelasticity is correlated with levels of glycosylated haemoglobin in diabetic patients // Clin. Lab. Haem. 2001. V. 23. P. 103—109.

12. Sohal R.S., Svensson I., Sohal B.H., Brunk U.T. superoxide anion radikal production in different animal species // Med. Ageing and Develop. 1989. № 49. P. 129—135.

13. Vestergaard-Bogind B. Spontaneous inactivation of the Ca2+-sens-itive K+ channels of human red cells at high intracellular Ca2+ activity // Biochim. et biophys. acta. 1983. V. 730. P. 285—294.

Поступила в редакцию 24.02.2009 г. Утверждена к печати 19.03.2009 г.

Сведения об авторах

И.В. Петрова — д-р биол. наук, профессор кафедры биофизики и функциональной диагностики СибГМУ (г. Томск).

B.В. Иванов — канд. биол. наук, доцент кафедры биохимии СибГМУ

А.В. Ситожевский — канд. мед. наук, научный сотрудник НИИ кардиологии СО РАМН, (г. Томск). Т.Е. Суслова — канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник НИИ кардиологии СО РАМН, (г. Томск).

C.В. Кремено — канд. мед. наук, научный сотрудник НИИ кардиологии СО РАМН (г. Томск). О.В. Груздева — канд. мед. наук, научный сотрудник НИИ кардиологии СО РАМН (г. Томск).

О.А. Трубачева — аспирант кафедры биофизики и функциональной диагностики СибГМУ (г. Томск).

Для корреспонденции

Трубачева Оксана Александровна, тел. 8-909-954-9916, otrubacheva@inbox.r