СИНТЕТИЧЕСКИЕ ГЕНЫ
SYNTHETIC GENES

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Было обнаружено, что для достижения необходимых уровней экспрессии гетерологичных белков в трансгенных растениях целесообразно изменять нативную кодирующую последовательность ДНК, иногда называемую последовательностью дикого типа или исходной последовательностью, различными способами, например, таким образом, чтобы использование кодонов точнее соответствовало использованию кодонов для вида растения-хозяина, и/или чтобы содержание G+C в кодирующей последовательности точнее соответствовало уровню G+C, обычно имеющемуся в кодирующих последовательностях для вида растения-хозяина, и/или чтобы определенные последовательности, которые дестабилизируют мРНК, были удалены. Например, экспрессия в растениях кристаллических белковых токсинов Bacillus thuringiensis (B.t.) против насекомых было улучшено с применением одного или более указанных способов. См., например, патент США No. 5380301, патент США No. 5625136, патент США No. 6218188, патент США No. 6340593, патент США No. 6673990, патент США No. 7741118. Вырожденность кодонов позволяет создавать синтетические последовательности ДНК, которые кодируют представляющий интерес белок с использованием кодонов, которые отличаются от используемых в исходной кодирующей последовательности ДНК.
Что касается удаления последовательностей, которые могут дестабилизировать мРНК, в патенте США No. 7741118 изложен список из 16 последовательностей сигналов полиаденилирования (столбец 15, таблица II) и требования по снижению количества таких последовательностей в синтетических кодирующих последовательностях, которые предназначены для экспрессии в растениях. Последовательности сигналов полиаденилирования, приведенные в таблице II US 7741118, приведены ниже в таблице 1:
Таблица 1
Последовательности сигналов полиаденилирования, приведенные в таблице II US 7741118
1
AATAAA
6
ATACTA
11
ATACAT
16
CATAAA
2
AATAAT
7
ATAAAA
12
AAAATA
3
AACCAA
8
ATGAAA
13
ATTAAA
4
ATATAA
9
AAGCAT
14
AATTAA
5
AATCAA
10
ATTAAT
15
AATACA
В US 7741118 также, предпочтительно, требуется удаление последовательности ATTTA (известной как последовательность Шоу-Камена), поскольку она была идентифицирована как потенциально дестабилизирующая мРНК.
В отличие от изложенного в US 7741118, мы обнаружили, что снижение количества последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных выше в таблице 1, не является ни необходимым, ни достаточным для обеспечения повышенной экспрессии синтетических генов в растениях.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ниже в таблице 2 идентифицировано 20 потенциальных последовательностей сигналов полиаденилирования, которые часто появляются в генах кукурузы.
Таблица 2
Потенциальные последовательности сигналов полиаденилирования, найденные в генах кукурузы
1
ATATAT
6
TATTTT
11
TAATAA
16
TATTAT
2
TTGTTT
7
TTTTTT
12
ATTTAT
17
TGTTTG
3
TTTTGT
8
ATTTTT
13
TATATT
18
TTATAT
4
TGTTTT
9
TTATTT
14
TTTTAT
19
TGTAAT
5
TATATA
10
TTTATT
15
ATATTT
20
AAATAA
Ниже в таблице 3 идентифицировано 20 потенциальных последовательностей сигналов полиаденилирования, которые часто появляются в генах сои.
Таблица 3
Потенциальные последовательности сигналов полиаденилирования, найденные в генах сои
1
ATTTTT
6
TTTTAT
11
AAATTT
16
ATATAT
2
TATTTT
7
AATTTT
12
AAATAA
17
ATTATT
3
TTATTT
8
TTTTTA
13
ATATTT
18
ATTTTA
4
TTTATT
9
TAATTT
14
TTTGTT
19
TTTAAT
5
TTTTTT
10
TTAATT
15
TTGTTT
20
TTTTAA
Настоящее изобретение предоставляет синтетическую последовательность ДНК для экспрессии представляющего интерес белка в клетках кукурузы, которая содержит:
a) оптимизированную по кодонам последовательность ДНК, кодирующую представляющий интерес белок,
b) по меньшей мере, одну последовательность сигнала полиаденилирования, выбранную из группы, состоящей из класса I и класса II, где
класс I выбирают из группы, состоящей из AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA и CATAAA; и
класс II выбирают из группы, состоящей из ATATAT, TTGTTT, TTTTGT, TGTTTT, TATATA, TATTTT, TTTTTT, ATTTTT, TTATTT, TTTATT, TAATAA, ATTTAT, TATATT, TTTTAT, ATATTT, TATTAT, TGTTTG, TTATAT, TGTAAT и AAATAA; и
где указанная оптимизированная по кодонам последовательность ДНК содержит, по меньшей мере, одну последовательность сигнала полиаденилирования из класса II, и где указанная синтетическая последовательность ДНК содержит меньше последовательностей сигналов полиаденилирования класса II, чем нативная последовательность ДНК белка, и содержит такое же количество последовательностей сигналов полиаденилирования класса I по сравнению с нативной последовательностью ДНК.
Настоящее изобретение также предоставляет синтетическую последовательность ДНК для экспрессии представляющего интерес белка в клетках сои, которая содержит:
a) оптимизированную по кодонам последовательность ДНК, кодирующую представляющий интерес белок,
b) по меньшей мере, одну последовательность сигнала полиаденилирования, выбранную из группы, состоящей из класса I и класса III, где
класс I выбирают из группы, состоящей из AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA и CATAAA; и
класс III выбирают из группы, состоящей из ATTTTT, TATTTT, TTATTT, TTTATT, TTTTTT, TTTTAT, AATTTT, TTTTTA, ATATAT, TAATTT, TTAATT, AAATTT, AAATAA, ATATTT, TTTGTT TTGTTT, ATTATT, ATTTTA, TTTAAT и TTTTAA, и
где указанная оптимизированная по кодонам последовательность ДНК содержит, по меньшей мере, одну последовательность сигнала полиаденилирования из класса III, и где указанная синтетическая последовательность ДНК содержит меньше последовательностей сигналов полиаденилирования из класса III, чем нативная последовательность ДНК белка, и содержит такое же количество последовательностей сигналов полиаденилирования класса I по сравнению с нативной последовательностью ДНК.
Изобретение также предоставляет способ создания синтетической последовательности ДНК, которая кодирует представляющий интерес белок, который включает (a) сначала, использование аминокислотной последовательности представляющего интерес белка, полученной из встречающегося(ихся) в природе полипептида(ов), кодируемого(ых) нативной(ыми) последовательностью(ями), которые содержат, по меньшей мере, одну последовательность сигнала полиаденилирования, приведенную в таблице 2, и (b) создание синтетической последовательности ДНК, которая кодирует указанную аминокислотную последовательность и содержит меньше последовательностей сигналов полиаденилирования, приведенных в таблице 2, по сравнению с соответствующей кодирующей последовательностью нативной(ых) последовательности(ей), и содержит такое же количество последовательностей сигналов полиаденилирования, приведенных в таблице 1.
В другом варианте осуществления изобретение предоставляет способ создания синтетической последовательности ДНК, которая кодирует представляющий интерес белок, который включает (a) сначала, использование аминокислотной последовательности представляющего интерес белка, полученной из встречающегося(ихся) в природе полипептида(ов), кодируемого(ых) нативной(ыми) последовательностью(ями), которые содержат, по меньшей мере, одну последовательность сигнала полиаденилирования, приведенную в таблице 3, и (b) создание синтетической последовательности ДНК, которая кодирует указанную аминокислотную последовательность и содержит меньше последовательностей сигналов полиаденилирования, приведенных в таблице 3, по сравнению с соответствующей кодирующей последовательностью нативной(ых) последовательности(ей), и содержит такое же количество последовательностей сигналов полиаденилирования, приведенных в таблице.
В некоторых вариантах осуществления синтетические последовательности ДНК, предоставляемые в изобретении, не содержат последовательностей сигналов полиаденилирования, приведенных в таблице 2 и/или таблице 3, или количество последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 2 и/или таблице 3, снижено насколько это возможно при условии поддержания того же количества последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 1, и поддержания последовательностей из таблицы 1 в их исходных положениях в последовательности.
В некоторых вариантах осуществления синтетические последовательности ДНК, предоставляемые изобретением, кодируют инсектицидный белок, необязательно, полученный из Bacillus thuringiensis, а также последовательности ДНК, полезные для устойчивости к гербицидам, недостатку воды и/или устойчивости к тепловому стрессу, модификации масел для здорового питания и для маркерных генов и селектируемых маркерных генов трансформации.
Синтетические последовательности ДНК по изобретению могут быть применены в ДНК-конструкции для экспрессии представляющего интерес белка, при этом конструкция содержит 5'-нетранслируемую последовательность, синтетическую последовательность ДНК по изобретению и 3'-нетранслируемую область, и указанная 5'-нетранслируемая последовательность содержит промотор, функциональный в растениях, и указанная 3'-нетранслируемая последовательность содержит сигнал терминации транскрипции и полиаденилирования.
Изобретение также предоставляет трансгенное растение, содержащее синтетические последовательности ДНК по изобретению.
Также представлен способ борьбы с насекомыми-вредителями в растении, который включает экспрессию синтетической последовательности ДНК по изобретению в растении, где синтетическая последовательность ДНК кодирует токсины против насекомых, например, белок Cry Bacillus thuringiensis.
Также представлен способ для устойчивости к гербицидам у растения, который включает экспрессию синтетической последовательности ДНК по изобретению в растении, где синтетическая последовательность ДНК кодирует известный фермент устойчивости к гербицидам, например, такой фермент, как арилоксиалканоат диоксигеназа (AAD1), см. WO/2005/107437, или фосфинотрицин ацетилтрансфераза, или 5-энолпирувилшикимат-3-фосфат синтаза.
Также представлен способ для изменения масляных профилей в растении, который включает экспрессию одной или более синтетических последовательностей ДНК по изобретению в растении, где синтетическая последовательность ДНК кодирует один или более известных ферментов для изменения масляных профилей в растениях, например, десатуразу жирных кислот.
Также представлен способ для устойчивости к стрессу в растении, который включает экспрессию синтетической последовательности ДНК по изобретению, где синтетическая последовательность ДНК кодирует известные гены устойчивости к стрессу недостатка воды и/или тепловому стрессу, например, для ассоциированного со стрессом белка (SAP1); патентная публикация США NO:2010/0275327, и для белков 1-Cys пероксиредоксина (Per1) (Mowla, et al, 2002, Planta 215:716-726).
Также представлен способ добавления генов-репортеров к растению, который включает экспрессию синтетической последовательности ДНК по изобретению в растении, где синтетическая последовательность ДНК кодирует известный маркерный белок трансформации, являющийся функциональным в растениях, например, зеленый флуоресцентный белок (GFP) или фермент бета-глюкуронидазу.
Также представлен способ защиты от вредителей для зерен или семян, который включает получение указанных зерен или семян у растений, содержащих синтетический ген по изобретению, который экспрессирует токсин против насекомых, и способ защиты от вредителей для муки крупного и мелкого помола, который включает получение указанной муки крупного и мелкого помола из зерна, содержащего синтетический ген по изобретению, который экспрессирует токсин против насекомых.
Также представлена композиция, полученная из трансгенных растений, содержащая синтетическую ДНК по изобретению, где указанная композиция представляет собой товарный продукт, выбранный из группы, состоящей из муки крупного помола, муки мелкого помола, белкового концентрата и масла.
В некоторых случаях количество сигналов полиаденилирования, приведенных в таблице 1, может поддерживаться в синтетических последовательностях ДНК по изобретению путем удаления экземпляров AATAAA и их замены на другие последовательности сигналов полиаденилирования, приведенные в таблице 1. Пример указанного показан в примере 1, SEQ ID NO:5.
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO:1 представляет собой нативную последовательность ДНК, кодирующую ядерный токсин Cry1Fa Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:2 представляет собой последовательность ядерного токсина Cry1Fa Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:3 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую ядерный токсин Cry1Fa Bacillus thuringiensis с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:4 представляет собой последовательность ядерного токсина Cry1Fa Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:5 представляет собой синтетическую последовательность ДНК по изобретению, кодирующую ядерный токсин Cry1Fa Bacillus thuringiensis с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой удалены последовательности, идентифицированные в таблице 2, и поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:6 представляет собой последовательность ядерного токсина Cry1Fa Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:7 представляет собой нативную последовательность ДНК, кодирующую токсин Cry34Ab1 Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:8 представляет собой последовательность токсина Cry34Ab1 Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:9 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую токсин Cry34Ab1 Bacillus thuringiensis с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:10 представляет собой последовательность токсина Cry34Ab1 Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:11 представляет собой синтетическую последовательность ДНК по изобретению, кодирующую токсин Cry34Ab1 Bacillus thuringiensis с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой удалены последовательности, идентифицированные в таблице 2, и поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:12 представляет собой последовательность токсина Cry34Ab1 Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:13 представляет собой нативную последовательность ДНК, кодирующую токсин Cry35Ab1 Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:14 представляет собой последовательность токсина Cry35Ab1 Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:15 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую токсин Cry35Ab1 Bacillus thuringiensis с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:16 представляет собой последовательность токсина Cry35Ab1 Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:17 представляет собой синтетическую последовательность ДНК по изобретению, кодирующую токсин Cry35Ab1 Bacillus thuringiensis с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой удалены последовательности, идентифицированные в таблице 2, и поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:18 представляет собой последовательность токсина Cry35Ab1 Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:19 представляет собой нативную последовательность ДНК, кодирующую ядерный токсин Cry1Ab1 Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:20 представляет собой последовательность ядерного токсина Cry1Ab1 Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:21 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую ядерный токсин Cry1Ab1 Bacillus thuringiensis с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:22 представляет собой последовательность ядерного токсина Cry1Ab1 Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:23 представляет собой синтетическую последовательность ДНК по изобретению, кодирующую ядерный токсин Cry1Ab1 Bacillus thuringiensis с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой удалены последовательности, идентифицированные в таблице 2, и поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:24 представляет собой последовательность ядерного токсина Cry1Ab1 Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:25 представляет собой нативную последовательность ДНК, кодирующую ядерный токсин Cry1Ca Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:26 кодирует последовательность ядерного токсина Cry1Ca Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:27 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую ядерный токсин Cry1Ca Bacillus thuringiensis с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:28 кодирует последовательность ядерного токсина Cry1Ca Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:29 представляет собой синтетическую последовательность ДНК по изобретению, кодирующую ядерный токсин Cry1Ca Bacillus thuringiensis с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой удалены последовательности, идентифицированные в таблице 2, и поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:30 кодирует последовательность ядерного токсина Cry1Ca Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:31 представляет собой нативную последовательность ДНК, кодирующую токсин Cry6Aa Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:32 представляет собой последовательность токсина Cry6Aa Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:33 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую токсин Cry6Aa Bacillus thuringiensis с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:34 представляет собой последовательность токсина Cry6Aa Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:35 представляет собой синтетическую последовательность ДНК по изобретению, кодирующую токсин Cry6Aa Bacillus thuringiensis с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой удалены последовательности, идентифицированные в таблице 2, и поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:36 представляет собой последовательность токсина Cry6Aa Bacillus thuringiensis.
SEQ ID NO:37 представляет собой нативную последовательность ДНК, кодирующую белок AAD1 Sphingobiurn herbicidovorans.
SEQ ID NO:38 представляет собой последовательность белка AAD1 Sphingobiurn herbicidovorans.
SEQ ID NO:39 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую белок AAD1 Sphingobiurn herbicidovorans с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой поддерживаются последовательности из таблицы 1 и таблицы 2.
SEQ ID NO:40 представляет собой последовательность белка AAD1 Sphingobiurn herbicidovorans.
SEQ ID NO:41 представляет собой синтетическую последовательность ДНК по изобретению, кодирующую белок AAD1 Sphingobiurn herbicidovorans с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой удалены последовательности, идентифицированные в таблице 2, и поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:42 представляет собой последовательность белка AAD1 Sphingobiurn herbicidovorans.
SEQ ID NO:43 представляет собой нативную последовательность ДНК, кодирующую белок дельта-9-десатуразы жирных кислот Aspergillus nidulans.
SEQ ID NO:44 представляет собой последовательность белка дельта-9-десатуразы жирных кислот Aspergillus nidulans.
SEQ ID NO:45 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую белок дельта-9-десатуразы жирных кислот Aspergillus nidulans с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой поддерживаются последовательности из таблицы 1 и таблицы 2.
SEQ ID NO:46 представляет собой последовательность белка дельта-9-десатуразы жирных кислот Aspergillus nidulans.
SEQ ID NO:47 представляет собой синтетическую последовательность ДНК по изобретению, кодирующую белок дельта-9-десатуразы жирных кислот Aspergillus nidulans с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой удалены последовательности, идентифицированные в таблице 2, и поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:48 представляет собой белок дельта-9-десатуразы жирных кислот Aspergillus nidulans.
SEQ ID NO:49 представляет собой нативную последовательность ДНК, кодирующую белок SAP1 Xerophyta viscosa.
SEQ ID NO:50 представляет собой последовательность белка SAP1 Xerophyta viscosa.
SEQ ID NO:51 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую белок SAP1 Xerophyta viscosa с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой поддерживаются последовательности из таблицы 1 и таблицы 2.
SEQ ID NO:52 представляет собой последовательность белка SAP1 Xerophyta viscosa.
SEQ ID NO:53 представляет собой синтетическую последовательность ДНК по изобретению, кодирующую белок SAP1 Xerophyta viscosa с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой удалены последовательности, идентифицированные в таблице 2, и поддерживаются последовательности из таблицы 1
SEQ ID NO:54 представляет собой последовательность белка SAP1 Xerophyta viscosa.
SEQ ID NO:55 представляет собой нативную последовательность ДНК, кодирующую белок GFP1 Aequorea victoria.
SEQ ID NO:56 представляет собой последовательность белка GFP1 Aequorea victoria.
SEQ ID NO:57 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую белок GFP1 Aequorea victoria с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой поддерживаются последовательности из таблицы 1 и таблицы 2.
SEQ ID NO:58 представляет собой последовательность белка GFP1 Aequorea victoria.
SEQ ID NO:59 представляет собой синтетическую последовательность ДНК по изобретению, кодирующую белок GFP1 Aequorea victoria с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой удалены последовательности, идентифицированные в таблице 2, и поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:60 представляет собой последовательность белка GFP1 Aequorea victoria.
SEQ ID NO:61 представляет собой нативную последовательность ДНК, кодирующую белок дельта-9-десатуразы жирных кислот Leptosphaeria nodorum.
SEQ ID NO:62 представляет собой последовательность белка дельта-9-десатуразы жирных кислот Leptosphaeria nodorum.
SEQ ID NO:63 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую белок дельта-9-десатуразы жирных кислот Leptosphaeria nodorum с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой поддерживаются последовательности из таблицы 1 и таблицы 2.
SEQ ID NO:64 представляет собой последовательность белка дельта-9-десатуразы жирных кислот Leptosphaeria nodorum.
SEQ ID NO:65 представляет собой синтетическую последовательность ДНК по изобретению, кодирующую белок дельта-9-десатуразы жирных кислот Leptosphaeria nodorum с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой удалены последовательности, идентифицированные в таблице 2, и поддерживаются последовательности из таблицы 1
SEQ ID NO:66 представляет собой последовательность белка дельта-9-десатуразы жирных кислот Leptosphaeria nodorum.
SEQ ID NO:67 представляет собой нативную последовательность ДНК, кодирующую белок PER1 Xerophyta viscosa.
SEQ ID NO:68 представляет собой последовательность белка PER1 Xerophyta viscosa.
SEQ ID NO:69 представляет собой синтетическую последовательность ДНК, кодирующую белок PER1 Xerophyta viscosa с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой поддерживаются последовательности из таблицы 1 и таблицы 2.
SEQ ID NO:70 представляет собой последовательность белка PER1 Xerophyta viscosa.
SEQ ID NO:71 представляет собой синтетическую последовательность ДНК по изобретению, кодирующую белок PER1 Xerophyta viscosa с использованием кодонов, оптимизированных для кукурузы, и в которой удалены последовательности, идентифицированные в таблице 2, и поддерживаются последовательности из таблицы 1.
SEQ ID NO:72 представляет собой последовательность белка PER1 Xerophyta viscosa.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение предоставляет синтетические последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие представляющие интерес белки. Синтетические кодирующие последовательности, в частности, приспособлены для применения в экспрессии представляющих интерес белков в трансгенных растениях.
Представляющий интерес белок может быть любым белком или полипептидом, который встречается в природе, или любым встречающимся в природе вариантом, включая процессированные формы таких белков, но не ограничиваясь ими. Представляющий интерес белок также может являться белком, образованным путем объединения частей или фрагментов более чем одного встречающегося в природе белка, например, путем смешивания и сопоставления функциональных белковых доменов.
Предпочтительная группа представляющих интерес белков представляет собой группу, в которой получаемый в результате фенотип является агрономическим признаком или белком-репортером, применяемым для создания агрономических признаков. Это включает в себя резистентность к насекомым, устойчивость к гербицидам, устойчивость к недостатку воды и/или тепловому стрессу и изменению масляного профиля, но не ограничивается перечисленным.
Более предпочтительная группа представляющих интерес белков представляет собой группу, в которой получаемый в результате фенотип является агрономическим признаком. Другой предпочтительной группой является группа, в который получаемый в результате фенотип обеспечивает устойчивость к гербицидам. Другой предпочтительной группой является группа, в которой получаемый в результате фенотип обеспечивает устойчивость к стрессу. Другой предпочтительной группой является группа, в которой получаемый в результате фенотип обеспечивает модифицированный масляный профиль для более здоровой пищи. Более предпочтительной группой является группа, в которой представляющим интерес белком является белок Cry, который обеспечивает резистентность к насекомым.
Нативные последовательности ДНК/последовательности ДНК дикого типа, кодирующие представляющий интерес белок, должны быть идентифицированы и проанализированы для определения присутствия последовательностей сигналов полиаденилирования, приведенных в таблицах 1 и 2 и/или 3. В соответствии с изобретением, для кодирующих последовательностей, предназначенных для применения в кукурузе, количество последовательностей сигналов полиаденилирования, приведенных в таблице 2, снижается по сравнению с количеством, присутствующим в нативной последовательности. Для кодирующих последовательностей, предназначенных для применения в сое, снижается количество последовательностей сигналов полиаденилирования, приведенных в таблице 3. Очень важно удалить последовательности сигналов полиаденилирования, приведенные в таблицах 2 и 3, в частности, когда они появляются во вложенной мультимерной форме.
В дополнение к удалению последовательностей сигналов полиаденилирования, приведенных в таблицах 2 и 3, может быть необходимым удаление появлений последовательности Шоу-Камен, ATTTA.
В дополнение к удалению последовательностей сигналов полиаденилирования и последовательностей Шоу-Камен, является предпочтительным построение синтетических кодирующих последовательностей ДНК, в которых кодоны используются приблизительно с той же частотой, с которой они используются, в среднем, во встречающихся в природе генах в растениях тех видов, в которых будет применяться синтетическая последовательность ДНК. В таблице 4 приведены подходящие процентные значения для использования кодонов в синтетических генах, предназначенных для применения в различных сельскохозяйственных растениях, а также для применения, в общем случае, в двудольных растениях, или, в общем случае, в растениях.
Таблица 4
Целевые ремасштабированные составы кодонов синтетических генов растений
Аминокислота
Кодон
% в кукурузе
% в сое
Аминокислота
Кодон
% в кукурузе
% в сое
ALA (A)
GCA
18,0
33,1
LEU (L)
CTA
0
0
GCC
34,0
24,5
CTC
29,9
22,4
GCG
24,0
0
CTG
33,3
16,3
GCT
24,0
42,3
CTT
19,5
31,5
ARG (R)
AGA
18,8
36,0
TTA
0
0
AGG
32,5
32,2
TTG
17,2
29,9
CGA
0
0
LYS (K)
AAA
22,0
42,5
CGC
30,0
15
AAG
78,0
57,5
CGG
18,8
0
MET (M)
ATG
100
100
CGT
0
16,9
PHE (F)
TTC
71,0
49,2
ASN (N)
AAC
68,0
50,0
TTT
29,0
50,8
AAT
32,0
50,0
PRO (P)
CCA
26,0
39,8
ASP (D)
GAC
63,0
38,1
CCC
24,0
20,9
GAT
37,0
61,9
CCG
28,0
0,0
CYS (C)
TGC
68,0
50,0
CCT
22,0
39,3
TGT
32,0
50,0
SER (S)
AGC
25,3
16,0
END
TAA
0
0
AGT
0,0
18,2
TAG
0
0
TCA
17,6
21,9
TGA
100
100
TCC
25,3
18,0
GLN (Q)
CAA
38,0
55,5
TCG
15,4
0
CAG
62,0
44,5
TCT
16,5
25,8
GLU (E)
GAA
29,0
50,5
THR (T)
ACA
21,0
32,4
GAG
71,0
49,5
ACC
37,0
30,2
GLY (G)
GGA
19,0
31,9
ACG
22,0
0,0
GGC
42,0
19,3
ACT
20,0
37,4
GGG
19,0
18,4
TRP (W)
TGG
100
100
GGT
20,0
30,4
TYR (Y)
TAC
73,0
48,2
HIS (H)
CAC
62,0
44,8
TAT
27,0
51,8
CAT
38,0
55,2
VAL (V)
GTA
0
11,5
ILE (I)
ATA
14,0
23,4
GTC
34,8
17,8
ATC
58,0
29,9
GTG
42,4
32,0
ATT
28,0
46,7
GTT
22,8
38,7
ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ
Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является трансформация растений генами, кодирующими токсины против насекомых. Трансформированные растения, которые экспрессируют гены токсинов против насекомых, являются устойчивыми к нападению целевого насекомого-вредителя благодаря наличию контролируемых объемов соответствующего инсектицидного белка или его вариантов в клетках трансформированного растения. В результате включения генетического материала, который кодирует инсектицидные свойства инсектицидных токсинов B.t., в геном растения, съеденного конкретным насекомым-вредителем, взрослая особь или личинка погибает после употребления кормового растения. Было трансформировано множество представителей односемядольных и двусемядольных. Трансгенные агрономические сельскохозяйственные культуры, а также фрукты и овощи, представляют коммерческий интерес. Такие сельскохозяйственные культуры включают кукурузу, рис, сою, канолу, подсолнечник, люцерну, сорго, пшеницу, хлопок, арахис, томат, картофель и т.п., но не ограничиваются перечисленным. Существует несколько методик внесения чужеродного генетического материала в клетки растений и для получения растений, которые стабильно поддерживают и экспрессируют внесенный ген. Такие методики включают запуск генетического материала, нанесенного на микрочастицы, непосредственно в клетки (патент США No. 4945050 и патент США No. 5141131). Растения могут трансформироваться с применением агробактериальной технологии, см. патент США No. 5177010, Европейский патент No. EP 131624B1, Европейский патент No. EP 159418B1, Европейский патент No. EP176112B1, патент США No. 5149645, EP120516B1, патент США No. 5464763, патент США No. 4693976, Европейский патент No. EP 116718B1, Европейский патент No. EP290799B1, Европейский патент No. EP320500B1, Европейский патент No. EP604662B1, патент США No. 7060876, патент США No. 6037526, патент США No. 6376234, Европейский патент No. EP292435B1, патент США No. 5231019, патент США No. 5463174, патент США No. 4762785, патент США No. 5608142 и патент США No. 5159135. Другой технологией трансформации является технология WHISKERS™, см. патент США No. 5302523 и патент США No. 5464765. Для трансформации растений также была применена технология электропорации, см. WO1987006614, патент США No. 5472869, патент США No. 5384253, WO199209696, патент США No. 6074877, WO1993021335 и патент США No. 5679558. В дополнение к множеству технологий для трансформирования растений, также может изменяться тип ткани, который контактирует с чужеродными генами. Такая ткань могла бы включать зародышевую ткань, ткань каллуса типа I и типа II, гипокотиль, меристему и т.п., но не ограничивается перечисленным. Практически все растительные ткани могут быть трансформированы во время дедифференциации с применением соответствующих методик, известных специалисту в данной области техники.
Известные методики вставки ДНК в растения включают трансформацию с помощью Т-ДНК, доставляемой Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве посредника трансформации. Применение Т-ДНК-содержащих векторов для трансформации растительных клеток тщательно исследовалось и в достаточном объеме описано в европейском патенте No. EP120516B1; Lee and Gelvin (2008) Plant Physiol. 146:325-332; Fraley et al. (1986) Crit. Rev. Plant Sci. 4: 1-46; и An et al. (1985) EMBO J. 4:277-284; и является общепризнанным в данной области. Кроме того, может быть применено слияние растительных протопластов с липосомами, содержащими ДНК, которая должна быть доставлена, прямое инъецирование ДНК, биолистическая трансформация (бомбардировка микрочастицами) или электропорация, а также другие возможные способы.
После того, как вставленная ДНК была интегрирована в растительный геном, она остается сравнительно стабильной в последующих поколениях. Вектор, используемый для трансформации растительной клетки, обычно содержит ген селектируемого маркера, кодирующий белок, который придает трансформированным растительным клеткам устойчивость к гербициду или антибиотику, таким как, в том числе, биалафос, канамицин, G418, блеомицин, или гигромицин. Отдельно используемый ген селектируемого маркера должен позволять выбирать трансформированные клетки, при этом рост клеток, которые не содержат вставленную ДНК, подавляется посредством селективного комонента.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растения трансформируются генами, в которых использование кодонов в кодирующем белок участке было оптимизировано для растений. См., например, патент США No. 5380831. Также, предпочтительно, могут быть использованы растения, кодирующие усеченный токсин, например, функциональный белковый домен. Усеченный токсин обычно кодирует от около 55% до около 80% нативного полноразмерного токсина. Способы создания синтетических генов B.t. для применения в растениях известны в технике (Stewart 2007, Frontiers in Drug Design and Discovery 1:297-341).
Независимо от методики трансформации, ген предпочтительно встраивается в вектор передачи генов, приспособленный для экспрессии представляющего интерес белка путем включения в вектор растительного промотора. В дополнение к растительным промоторам, промоторы из ряда источников могут быть эффективно использованы в растительных клетках для экспрессии чужеродных генов. Например, могут быть использованы промоторы из бактериального источника, такие как промотор октопин-синтазы, промотор нопалин-синтазы, промотор маннопин-синтазы; промоторы из вирусного источника, такие как промоторы 35S и 19S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и т.п. Полученные из растений промоторы включают, но не ограничиваются перечисленным, рибулозу-1, малую субъединицу (ssu) 6-бисфосфат (RUBP) карбоксилазы, промотор бета-конглицинина, промотор фазеолина, промотор ADH (алкогольдегидрогеназы), промоторы белков теплового шока, промотор ADF (фактор деполимеризации актина) и тканеспецифичные промоторы. Промоторы также могут содержать определенные элементы последовательностей энхансеров, которые могут повышать эффективность транскрипции. Типичные энхансеры включают ADH1-интрон 1 и ADH1-интрон 6, но не ограничиваются указанным. Также могут быть использованы конститутивные промоторы. Конститутивные промоторы управляют непрерывной экспрессией генов практически во всех типах клеток практически в любые моменты времени (например, актин, убиквитин, CaMV 35S). Тканеспецифичные промоторы отвечают за экспрессию генов в конкретных типах клеток или ткани, таких как листья или семена (например, зеин, олеозин, напин, ACP (ацилпереносящий белок)), и такие промоторы также могут использоваться. Также могут быть использованы промоторы, которые являются активными во время определенной стадии развития растений, а также которые являются активными в конкретных тканях и органах растений. Примеры таких промоторов включают, но не ограничиваются перечисленным, специфичные для корней, специфичные для пыльцы, специфичные для зародышей, специфичные для кукурузных рылец, специфичные для хлопкового волокна, специфичные для эндосперма семени, специфичные для флоэмы и т.п.
В определенных обстоятельствах может потребоваться использование индуцируемого промотора. Индуцируемый промотор отвечает за экспрессию генов в ответ на конкретный сигнал, такой как: физическое стимулирование (например, гены теплового шока); свет (например, RUBP-карбоксилаза); гормон (например, глюкокортикоид); антибиотик (например, тетрациклин); метаболиты; и стресс (например, засуху). Также могут быть использованы другие необходимые элементы транскрипции и трансляции, которые функционируют в растениях, такие как 5'-нетранслируемые лидерные последовательности, последовательности терминации транскрипции РНК и сигнальные последовательности добавления полиаденилирования. Множество специфичных для растений векторов переноса генов известно в технике.
Трансгенные сельскохозяйственные растения, содержащие свойства устойчивости к насекомым (IR), преобладают в растениях кукурузы и хлопка в Северной Америке, и использование данных свойств расширяется по всему миру. Коммерческие трансгенные сельскохозяйственные растения, объединяющие свойства IR и устойчивости к гербицидам (HT), были разработаны множеством компаний, производящих семена. Это включает комбинации свойств IR, придаваемых инсектицидными белками B.t., и свойства HT, такие как устойчивость к ингибиторам ацетолактатсинтазы (ALS), таким как сульфонилмочевины, имидазолиноны, триазолопиримидин, сульфонанилиды и т.п., ингибиторы глутаминсинтетазы (GS), такие как биалафос, глюфосинат и т.п., ингибиторы 4-гидроксифенилпируват диоксигеназы (HPPD), такие как мезотрион, изоксафлютол и т.п, ингибиторы 5-энолпирувилшикимат-3-фосфат синтазы (EPSPS), такие как глифосат и т.п., и ингибиторы ацетил-кофермент А карбоксилазы (ACCase), такие как галоксифоп, квизалофоп, диклофоп и т.п. Известны другие примеры, в которых трансгенно полученные белки обеспечивали устойчивость растений к химическим классам гербицидов, таким как феноксикислотные гербициды и гербициды, основанные на пиридилоксиацетатах ауксина (см. WO2007053482), или феноксикислотные гербициды и арилоксифеноксипропионатные гербициды (см. заявку на патент США No. 20090093366). Способность решения проблем с множеством вредителей через свойства IR является ценной концепцией в производстве товарных продуктов, и удобство данной концепции товара повышается, если свойства борьбы с насекомыми и средства борьбы с сорняками объединяются в одном и том же растении. Кроме того, повышенная ценность может быть получена через объединение в одном растении свойств IR, придаваемых инсектицидным белком B.t., таким образом, как в настоящем изобретении, с одним или более дополнительными свойствами HT, такими как были указаны выше, плюс одно или более дополнительных входных свойств (например, устойчивость к другому насекомому, придаваемая полученными из B.t. или другими инсектицидными белками, устойчивость к насекомому, придаваемая такими механизмами, как РНКi и т.п., устойчивость к нематодам, устойчивость к заболеваниям, устойчивость к стрессам, улучшенная утилизация азота и т.п.) или выходных свойств (например, высокое содержание масел, здоровый состав масел, улучшение питательных свойств и т.п.). Такие комбинации могут быть получены через обычное скрещивание (селекционные гибриды) или совместно в форме нового факта трансформации, включающего одновременное введение множества генов (молекулярные гибриды или совместная трансформация). Преимущества включают возможность борьбы с насекомыми-вредителями и улучшения борьбы с сорняками в сельскохозяйственном растении, которые обеспечивают вторичные преимущества для производителя и/или потребителя. Таким образом, настоящее изобретение может быть применено в связи с множеством свойств для предоставления полного агрономического комплекса улучшенного качества сельскохозяйственного растения с возможностью гибко и с оптимальными затратами бороться с любым количеством агрономических проблем.
Все патенты, заявки на патенты, предварительные заявки и публикации, цитируемые в настоящей заявке или на которые имеются ссылки в настоящей заявке, включены посредством ссылки во всей их полноте до той степени, в которой они не противоречат явно изложенному в настоящей спецификации. Если это конкретно не указано или не подразумевается, то термин "один" означает "по меньшей мере один" при использовании в настоящем описании. Под "изолированными" заявители понимают, что нуклеотидные или полипептидные молекулы были удалены из своего нативного окружения и были помещены в другое окружение с помощью человека.
Варианты осуществления настоящего изобретения подробнее определены в приведенных ниже примерах. Следует понимать, что данные примеры приведены только в качестве иллюстрации. На основании приведенного выше обсуждения и данных примеров специалист в данной области техники может установить важные характеристики настоящего изобретения и, без отклонения от его формы и объема, может вносить различные изменения и модификации в варианты осуществления изобретения с целью их настройки для различных применений и условий. Таким образом, различные модификации вариантов осуществления изобретения, в дополнение к показанным и описанным в настоящей заявке, будут очевидны специалистам в данной области техники на основании приведенного выше описания. Предполагается, что такие модификации также попадают в пределы объема прилагаемой формулы изобретения.
Все проценты приведены по весу, и все пропорции смешанного растворителя приведены по объему, если не отмечено обратное. Все температуры приведены в градусах Цельсия.
ПРИМЕР 1
Синтетическая кодирующая область, кодирующая ядерный токсин Cry1Fa Bacillus thuringiensis
Последовательность для сравнения. Нативная последовательность ДНК, кодирующая ядерный токсин Cry1Fa, приведена под SEQ ID NO:1. Данная последовательность анализировалась с целью определения того, какие из последовательностей, идентифицированных в таблице 1, присутствуют в SEQ ID NO:1, и их положений. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:1, затем подвергалась обратной трансляции с использованием целевых частот кодонов, приведенных в столбце таблицы 4 для синтетических генов, предназначенных для использования в кукурузе. Полученная в результате последовательность ДНК анализировалась, и кодоны заменялись при необходимости для удаления нежелательных открытых рамок считывания и удаления нежелательных сайтов рестрикции, и восстановления последовательностей, идентифицированных в таблице 1. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:1, сохранялась. Полученная в результате последовательность ДНК дана под SEQ ID NO:3.
SEQ ID NO:3 анализировалась, и кодоны были изменены для удаления потенциальных последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 2, при этом поддерживалось то же самое количество последовательностей, идентифицированных в таблице 1. Полученная в результате последовательность, которая является вариантом осуществления настоящего изобретения, дана под SEQ ID NO:5. В таблице 5 показано, что количество и положения последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 1, поддерживается в SEQ ID NO:5, за исключением того, что два вхождения AATAAA, одно в 426 н.п. и одно в 582 н.п., в SEQ ID NO:1 были заменены на AATCAA, в результате чего поддерживается количество и положение последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 1, но производится замена каждой из двух последовательностей AATAAA на менее проблемные последовательности. В таблице 6 показано, что количество последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 2, снижается в SEQ ID NO:5. Поскольку имеется перекрытие последовательностей, идентифицированных в таблицах 2 и 3 (последовательности 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 13 и 20 в таблице 2 соответствуют последовательностям 16, 15, 2, 5, 1, 3, 4, 6, 13 и 12, соответственно, в таблице 3), также получается, что количество последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 3, снижается в SEQ ID NO:5.
Синтетическая кодирующая область SEQ ID NO:5 была оптимизирована для экспрессии в кукурузе.
Конструкция для применения в экспрессии синтетической кодирующей области SEQ ID NO:5 сделана путем объединения синтетической кодирующей области SEQ ID NO:5 с 5'-нетранслируемой областью, содержащей промотор, функциональный в растительных клетках, и 3'-нетранслируемой областью, содержащей последовательность терминации транскрипции и полиаденилирования.
В одном из вариантов осуществления такой конструкции продуцирование первичного транскрипта мРНК, содержащего SEQ ID NO:5, управлялось копией промотора убиквитина 1 кукурузы со своим нативным интроном 1 (патент США No. 5510474). Фрагмент, содержащий 3'-нетранслируемую область из гена пероксидазы 5 кукурузы (ZmPer5 3'UTR v2; патент США No. 6699984), был использован для терминации транскрипции. Бинарная плазмида для трансформации растений, pDAB111440, содержащая указанную выше кассету экспрессии генов, была сконструирована и применена в продуцировании трансгенных растений кукурузы. Плазмида pDAB111440 также содержит ген устойчивости к гербицидам, содержащий кодирующую область для арилоксиалконат диоксигеназы (AAD-1 v3; патент США No. 7838733(B2), и Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5) под транскрипционным контролем промотора палочковидного баднавируса сахарного тростника (ScBV) (Schenk et al. (1999) Plant Molec. Biol. 39: 1221-30). Фрагмент, содержащий 3'-нетранслируемую область из гена липазы кукурузы (ZmLip 3'UTR; патент США No. 7179902), был использован для терминации транскрипции.
Таблица 5
Последовательности таблицы 1, обнаруженные в нативной кодирующей области ядерного токсина Cry1Fa (SEQ ID NO:1) и в ее перестроенной версии (SEQ ID NO:5)
Последовательность из таблицы 1
Число участков в нативной последовательности ядерного токсина Cry1Fa (SEQ ID NO:1)
Положение в нативной последовательности ядерного токсина Cry1Fa, н.п. (SEQ ID NO:1)
Число участков в перестроенной последовательности ядерного токсина Cry1Fa (SEQ ID NO:5)
Положение в перестроенной последовательности ядерного токсина Cry1Fa, н.п. (SEQ ID NO:5)
1
AATAAA
2
426; 582
0
NA*
2
AATAAT
5
7; 46; 358; 430; 562
5
7; 46; 358; 430; 562
3
AACCAA
0
NA
0
NA
4
ATATAA
1
1520
1
1520
5
AATCAA
2
19; 628
4
19; 426; 582; 628
6
ATACTA
1
1508
1
1508
7
ATAAAA
0
NA
0
NA
8
ATGAAA
2
314; 1211
2
314; 1211
9
AAGCAT
0
NA
0
NA
10
ATTAAT
2
579; 1690
2
579; 1690
11
ATACAT
0
NA
0
NA
12
AAAATA
0
NA
0
NA
13
ATTAAA
2
66; 1266
2
66; 1266
14
AATTAA
2
368; 779
2
368; 779
15
AATACA
3
400; 1369; 1693
3
400; 1369; 1693
16
CATAAA
0
NA
0
NA
итого
22
22
*NA = Не применимо
Таблица 6
Последовательности таблицы 2, обнаруженные в нативной кодирующей области ядерного токсина Cry1Fa (SEQ ID NO:1) и в ее перестроенной версии (SEQ ID NO:5)
Последовательность из таблицы 2
Число участков в нативной последовательности ядерного токсина Cry1Fa (SEQ ID NO:1)
Положение в нативной последовательности ядерного токсина Cry1Fa, н.п. (SEQ ID NO:1)
Число участков в перестроенной последовательности ядерного токсина Cry1Fa (SEQ ID NO:5)
Положение в перестроенной последовательности ядерного токсина Cry1Fa, н.п. (SEQ ID NO:5)
1
ATATAT
1
104
0
NA*
2
TTGTTT
3
39; 612; 907
0
NA
3
TTTTGT
1
1089
0
NA
4
TGTTTT
2
1086; 1334
0
NA
5
TATATA
1
1771
0
NA
6
TATTTT
0
NA
0
NA
7
TTTTTT
0
NA
0
NA
8
ATTTTT
1
1615
0
NA
9
TTATTT
2
172; 217
0
NA
10
TTTATT
0
NA
0
NA
11
TAATAA
4
357; 416; 561; 581
0
NA
12
ATTTAT
3
319; 497; 793
0
NA
13
TATATT
1
322
0
NA
14
TTTTAT
3
192; 464; 1063
0
NA
15
ATATTT
0
NA
0
NA
16
TATTAT
0
NA
0
NA
17
TGTTTG
2
613; 908
0
NA
18
TTATAT
2
321; 1770
0
NA
19
TGTAAT
0
NA
0
NA
20
AAATAA
2
45; 429
0
NA
итого
28
0
NA
*NA = Не применимо
ПРИМЕР 2
Синтетическая кодирующая область, кодирующая токсин Cry34A Bacillus thuringiensis
Последовательности для сравнения. Нативная последовательность ДНК, кодирующая токсин Cry34A, дана под SEQ ID NO:7. Данная последовательность была проанализирована с целью определения того, какие последовательности из идентифицированных в таблице 1 присутствуют в SEQ ID NO:7, и их положений. Нативная последовательность ДНК была протранслирована в соответствующую аминокислотную последовательность с использованием стандартного генетического кода. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:7, подвергалась обратной трансляции с использованием целевых частот кодонов, приведенных в столбце таблицы 7 для синтетических генов, предназначенных для использования в кукурузе. Полученная в результате последовательность ДНК анализировалась, и кодоны заменялись при необходимости для удаления нежелательных открытых рамок считывания и удаления нежелательных сайтов рестрикции, и восстановления всех последовательностей, идентифицированных в таблице 1. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:7, сохранялась. Полученная в результате последовательность ДНК дана под SEQ ID NO:9. Была синтезирована ДНК, имеющая последовательность SEQ ID NO:9.
SEQ ID NO:9 была проанализирована, и кодоны были изменены с целью удаления потенциальных последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 2, при этом поддерживалось то же самое количество последовательностей, идентифицированных в таблице 1. Полученная в результате последовательность, которая является вариантом осуществления настоящего изобретения, дана под SEQ ID NO:11. В таблице 7 показано, что количество и положения последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 1, поддерживается в SEQ ID NO:11. В таблице 8 показано, что количество последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблицах 2 и 3, снижается в SEQ ID NO:5.
ДНК с SEQ ID NO:5 синтезируется, и уровни экспрессии, наблюдаемые в растительных клетках, трансформированных для экспрессии данной последовательности, сравниваются с уровнями экспрессии, наблюдаемыми в растительных клетках, трансформированных для экспрессии SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3.
Синтетическая кодирующая область SEQ ID NO:5 была оптимизирована для экспрессии в кукурузе.
Конструкция для применения в экспрессии синтетической кодирующей области SEQ ID NO:5 сделана путем объединения синтетической кодирующей области SEQ ID NO:5 с 5'-нетранслируемой областью, содержащей промотор, функциональный в растительных клетках, и 3'-нетранслируемой области, содержащей последовательность терминации транскрипции и полиаденилирования.
Таблица 7
Последовательности таблицы 1, обнаруженные в нативной кодирующей области Cry34Ab1 (SEQ ID NO:7), и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:11)
Последовательность из таблицы 1
Число участков в нативной последовательности Cry34Ab1 (SEQ ID NO:7)
Положение в нативной последовательности Cry34Ab1, н.п. (SEQ ID NO:7))
Число участков в перестроенной последовательности Cry34Ab1 (SEQ ID NO:11)
Положение в перестроенной последовательности Cry34Ab1, н.п. (SEQ ID NO:11)
1
AATAAA
2
247; 268
2
247; 268
2
AATAAT
1
31
1
31
3
AACCAA
0
NA*
0
NA
4
ATATAA
0
NA
0
NA
5
AATCAA
2
146; 310
2
146; 310
6
ATACTA
1
329
1
329
7
ATAAAA
1
65
1
65
8
ATGAAA
1
281
1
281
9
AAGCAT
0
NA
0
NA
10
ATTAAT
0
NA
0
NA
11
ATACAT
1
47
1
47
12
AAAATA
0
NA
0
NA
13
ATTAAA
1
127
1
127
14
AATTAA
1
126
1
126
15
AATACA
0
NA
0
NA
16
CATAAA
1
361
1
361
итого
12
12
*NA = Не применимо
Таблица 8
Последовательности таблицы 2, обнаруженные в нативной кодирующей области Cry34Ab1 (SEQ ID NO:7) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:11)
Последовательность из таблицы 2
Число участков в нативной последовательности Cry34Ab1 (SEQ ID NO:7)
Положение в нативной последовательности Cry34Ab1, н.п. (SEQ ID NO:7))
Число участков в перестроенной последовательности Cry34Ab1 (SEQ ID NO:11)
Положение в перестроенной последовательности Cry34Ab1, н.п. (SEQ ID NO:11)
1
ATATAT
1
181
0
NA*
2
TTGTTT
0
NA
0
NA
3
TTTTGT
0
NA
0
NA
4
TGTTTT
0
NA
0
NA
5
TATATA
1
180
0
NA
6
TATTTT
1
220
0
NA
7
TTTTTT
0
NA
0
NA
8
ATTTTT
0
NA
0
NA
9
TTATTT
0
NA
0
NA
10
TTTATT
0
NA
0
NA
11
TAATAA
2
33; 246
2
33; 246
12
ATTTAT
0
NA
0
NA
13
TATATT
2
182; 218
0
NA
14
TTTTAT
1
156
0
NA
15
ATATTT
1
219
0
NA
16
TATTAT
1
184
0
NA
17
TGTTTG
0
NA
0
NA
18
TTATAT
1
217
0
NA
19
TGTAAT
0
NA
0
NA
20
AAATAA
1
30
1
30
итого
12
3
*NA = Не применимо
ПРИМЕР 3
Синтетическая кодирующая область, кодирующая токсин Cry35Ab1 Bacillus thuringiensis
Последовательности для сравнения. Нативная последовательность ДНК, кодирующая токсин Cry35Ab1, дана под SEQ ID NO:13. Данная последовательность была проанализирована с целью определения того, какие последовательности из идентифицированных в таблице 1 присутствуют в SEQ ID NO:13, и их положений. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:13, подвергалась обратной трансляции с использованием целевых частот кодонов, приведенных в столбце таблицы 4 для синтетических генов, предназначенных для использования в кукурузе. Полученная в результате последовательность ДНК анализировалась, и кодоны заменялись при необходимости для удаления нежелательных открытых рамок считывания и удаления нежелательных сайтов рестрикции, при этом поддерживались все последовательности, идентифицированные в таблице 1. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:13, сохранялась. Полученная в результате последовательность ДНК дана под SEQ ID NO:15. Данная последовательность будет синтезирована и использована для сравнения с синтетической кодирующей областью, спроектированной по изобретению.
SEQ ID NO:15 была проанализирована, и кодоны были изменены с целью удаления потенциальных последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 2, при этом поддерживалось то же самое количество последовательностей, идентифицированных в таблице 1, за исключением двух вхождений AATAAA, одного в 228 н.п. и одного в 276 н.п. в SEQ ID NO:8, которые были заменены на AATCAA. Полученная в результате последовательность, которая является вариантом осуществления настоящего изобретения, дана под SEQ ID NO:17. В таблице 9 показано, что количество и положение последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 1, поддерживается в SEQ ID NO:17. В таблице 10 показано, что количество последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблицах 2 и 3, снижается в SEQ ID NO:17 по сравнению с SEQ ID NO:13.
ДНК из SEQ ID NO:17 синтезируется, и уровни экспрессии, наблюдаемые в растительных клетках, трансформированных для экспрессии данной последовательности, сравниваются с уровнями экспрессии, наблюдаемыми в растительных клетках, трансформированных для экспрессии SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:15.
Синтетическая кодирующая область SEQ ID NO:17 была оптимизирована для экспрессии в кукурузе.
Конструкция для применения в экспрессии синтетической кодирующей области SEQ ID NO:17 сделана путем объединения синтетической кодирующей области SEQ ID NO:17 с 5'-нетранслируемой областью, содержащей промотор, функциональный в растительных клетках, и 3'-нетранслируемой области, содержащей последовательность терминации транскипции и полиаденилирования.
Таблица 9
Последовательности таблицы 1, обнаруженные в нативной кодирующей области Cry35Ab1 (SEQ ID NO:13) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:17)
Последовательность из таблицы 1
Число участков в нативной последовательности Cry35Ab1 (SEQ ID NO:13)
Положение в нативной последовательности Cry35Ab1, н.п. (SEQ ID NO:13)
Число участков в перестроенной последовательности Cry35Ab1 (SEQ ID NO:17)
Положение в перестроенной последовательности Cry35Ab1, н.п. (SEQ ID NO:17)
1
AATAAA
5
13; 100; 228; 276; 810
3
13; 100; 810
2
AATAAT
4
193; 217; 385; 864
4
193; 217; 385; 864
3
AACCAA
0
NA*
0
NA
4
ATATAA
1
966
1
966
5
AATCAA
3
394; 750; 914
5
228; 276; 394; 750; 914
6
ATACTA
1
8
1
8
7
ATAAAA
5
101; 224; 277; 575; 811
5
101; 224; 277; 575; 811
8
ATGAAA
5
23; 671; 769; 806; 854
5
23; 671; 769; 806; 854
9
AAGCAT
0
NA
0
NA
10
ATTAAT
1
522
1
522
11
ATACAT
1
734
1
734
12
AAAATA
7
226; 578; 618; 838; 862; 873; 1137
7
226; 578; 618; 838; 862; 873; 1137
13
ATTAAA
4
462; 589; 834; 1131
4
462; 589; 834; 1131
14
AATTAA
5
461; 521; 588; 833; 1130
5
461; 521; 588; 833; 1130
15
AATACA
3
261; 303; 733
3
261; 303; 733
16
CATAAA
0
NA
0
NA
итого
45
45
*NA = Не применимо
Таблица 10
Последовательности таблицы 2, обнаруженные в нативной кодирующей области Cry35Ab1 (SEQ ID NO:13) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:17)
Последовательность из таблицы 2
Число участков в нативной последовательности Cry35Ab1 (SEQ ID NO:13)
Положение в нативной последовательности Cry35Ab1, н.п. (SEQ ID NO:13)
Число участков в перестроенной последовательности Cry35Ab1 (SEQ ID NO:17)
Положение в перестроенной последовательности Cry35Ab1, н.п. (SEQ ID NO:17)
1
ATATAT
1
168
0
NA*
2
TTGTTT
0
NA
0
NA
3
TTTTGT
0
NA
0
NA
4
TGTTTT
0
NA
0
NA
5
TATATA
1
959
0
NA
6
TATTTT
2
609; 1144
0
NA
7
TTTTTT
0
NA
0
NA
8
ATTTTT
1
1145
0
NA
9
TTATTT
3
63; 145; 1143
1
1143
10
TTTATT
2
144; 1056
0
NA
11
TAATAA
2
12; 216
1
12
12
ATTTAT
0
NA
0
NA
13
TATATT
2
169; 607
0
NA
14
TTTTAT
1
143
0
NA
15
ATATTT
1
608
0
NA
16
TATTAT
4
171; 549; 604; 1141
1
1141
17
TGTTTG
0
NA
0
NA
18
TTATAT
2
606; 958
0
NA
19
TGTAAT
1
300
0
NA
20
AAATAA
8
26; 192; 227; 275; 384; 809; 863; 1097
2
809; 863
итого
31
5
*NA = Не применимо
ПРИМЕР 4
Синтетическая кодирующая область, кодирующая ядерный токсин Cry1Ab Bacillus thuringiensis
Последовательности для сравнения. Нативная последовательность ДНК, кодирующая ядерный токсин Cry1Ab, дана под SEQ ID NO:19. Данная последовательность была проанализирована с целью определения того, какие последовательности из идентифицированных в таблице 1 присутствуют в SEQ ID NO:19, и их положений. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:19, подвергалась обратной трансляции с использованием целевых частот кодонов, приведенных в столбце таблицы 4 для синтетических генов, предназначенных для использования в кукурузе. Полученная в результате последовательность ДНК анализировалась, и кодоны заменялись при необходимости для удаления нежелательных открытых рамок считывания и удаления нежелательных сайтов рестрикции, при этом поддерживались все последовательности, идентифицированные в таблице 1. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:19, сохранялась. Полученная в результате последовательность ДНК дана под SEQ ID NO:21.
SEQ ID NO:21 была проанализирована, и кодоны были изменены с целью удаления потенциальных последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 2, при этом поддерживалось то же самое количество последовательностей, идентифицированных в таблице 1. Полученная в результате последовательность, которая является вариантом осуществления настоящего изобретения, дана под SEQ ID NO:23. В таблице 11 показано, что количество и положение последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 1, поддерживается в SEQ ID NO:23. В таблице 12 показано, что количество последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблицах 2 и 3, снижается в SEQ ID NO:23 по сравнению с SEQ ID NO:19.
Синтетическая кодирующая область SEQ ID NO:23 была оптимизирована для экспрессии в кукурузе.
Конструкция для применения в экспрессии синтетической кодирующей области SEQ ID NO:23 была сделана путем объединения синтетической кодирующей области SEQ ID NO:23 с 5'-нетранслируемой областью, содержащей промотор, функциональный в растительных клетках, и 3'-нетранслируемой области, содержащей последовательность терминации транскрипции и полиаденилирования.
В одном из вариантов осуществления такой конструкции, продуцирование первичного транскрипта мРНК, содержащего SEQ ID NO:23, управлялось копией промотора убиквитина 1 кукурузы со своим нативным интроном 1 (патент США No. 5510474). Фрагмент, содержащий 3'-нетранслируемую область из гена пероксидазы 5 кукурузы (ZmPer5 3'UTR v2; патент США No. 6699984), был использован для терминации транскрипции. Бинарная плазмида для трансформации растений, pDAB111449, содержащая указанную выше кассету экспрессии генов, была сконструирована и применена в продуцировании трансгенных растений кукурузы. Плазмида pDAB111449 также содержит ген устойчивости к гербицидам, содержащий кодирующую область для арилоксиалконат диоксигеназы (AAD-1 v3; патент США No. 7838733(B2), and Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-5) под транскрипционным контролем промотора палочковидного баднавируса сахарного тростника (ScBV) (Schenk et al. (1999) Plant Molec. Biol. 39: 1221-30). Фрагмент, содержащий 3'-нетранслируемую область из гена липазы кукурузы (ZmLip 3'UTR; патент США No. 7179902), был использован для терминации транскрипции.
Таблица 11
Последовательности таблицы 1, обнаруженные в нативной кодирующей ядерный токсин Cry1Ab области (SEQ ID NO:19) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:23)
Последовательность из таблицы 1
Число участков в нативной последовательности ядерного токсина Cry1Ab (SEQ ID NO:19)
Положение в нативной последовательности ядерного токсина Cry1Ab, н.п. (SEQ ID NO:19)
Число участков в перестроенной последовательности ядерного токсина Cry1Ab (SEQ ID NO:23))
Положение в перестроенной последовательности ядерного токсина Cry1Ab, н.п. (SEQ ID NO:23)
1
AATAAA
0
NA*
0
NA
2
AATAAT
3
960, 1126, 1387
3
960, 1126, 1387
3
AACCAA
2
253, 280
2
253, 280
4
ATATAA
2
185, 1391
2
185, 1391
5
AATCAA
2
688, 1129
3
688, 1129, 1639
6
ATACTA
0
NA
0
NA
7
ATAAAA
0
NA
0
NA
8
ATGAAA
1
1232
1
1232
9
AAGCAT
0
NA
0
NA
10
ATTAAT
1
1636
1
1636
11
ATACAT
2
1366, 1613
2
1366, 1613
12
AAAATA
0
NA
0
NA
13
ATTAAA
3
249, 704, 785
3
249, 704, 785
13
AATTAA
0
NA
0
NA
15
AATACA
0
NA
0
NA
16
CATAAA
0
NA
0
NA
итого
16
NA
17
NA
*NA = Не применимо
Таблица 12
Последовательности таблицы 2, обнаруженные в нативной кодирующей области Cry1Ab (SEQ ID NO:19) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:23)
Последовательность из таблицы 2
Число участков в нативной последовательности ядерного токсина Cry1Ab (SEQ ID NO:19)
Положение в нативной последовательности ядерного токсина Cry1Ab, н.п. (SEQ ID NO:19)
Число участков в перестроенной последовательности ядерного токсина Cry1Ab (SEQ ID NO:23))
Положение в перестроенной последовательности ядерного токсина Cry1Ab, н.п. (SEQ ID NO:23)
1
ATATAT
0
NA*
0
NA
2
TTGTTT
1
42
0
NA
3
TTTTGT
0
NA
0
NA
4
TGTTTT
0
NA
0
NA
5
TATATA
2
1097, 1792
0
NA
6
TATTTT
0
NA
0
NA
7
TTTTTT
0
NA
0
NA
8
ATTTTT
2
199, 1649
0
NA
9
TTATTT
0
NA
0
NA
10
TTTATT
1
470
0
NA
11
TAATAA
2
1340, 1386
0
NA
12
ATTTAT
2
503, 799
0
NA
13
TATATT
0
NA
0
NA
14
TTTTAT
0
NA
0
NA
15
ATATTT
1
110
0
NA
16
TATTAT
2
937, 940
0
NA
17
TGTTTG
1
530
0
NA
18
TTATAT
2
1096, 1791
0
NA
19
TGTAAT
0
NA
0
NA
20
AAATAA
2
959, 1125
1
959
итого
18
1
*NA = Не применимо
ПРИМЕР 5
Синтетическая кодирующая область, кодирующая ядерный токсин Cry1Ca Bacillus thuringiensis
Последовательности для сравнения. Нативная последовательность ДНК, кодирующая ядерный токсин Cry35A, дана под SEQ ID NO:25. Данная последовательность была проанализирована с целью определения того, какие последовательности из идентифицированных в таблице 1 присутствуют в SEQ ID NO:25, и их положений. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:25 подвергалась обратной трансляции с использованием целевых частот кодонов, приведенных в столбце таблицы 4 для синтетических генов, предназначенных для использования в кукурузе. Полученная в результате последовательность ДНК анализировалась, и кодоны заменялись при необходимости для удаления нежелательных открытых рамок считывания и удаления нежелательных сайтов распознавания рестрикционных ферментов, при этом поддерживались все последовательности, идентифицированные в таблице 1. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:25, сохранялась. Полученная в результате последовательность ДНК дана под SEQ ID NO:27. Данная последовательность будет синтезирована и использована для сравнения с синтетическим геном, спроектированным по изобретению.
SEQ ID NO:27 была проанализирована, и кодоны были изменены с целью удаления потенциальных последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 2, при этом поддерживалось то же самое количество последовательностей, идентифицированных в таблице 1. Полученная в результате последовательность, которая является вариантом осуществления настоящего изобретения, дана под SEQ ID NO:29. В таблице 13 показано, что количество и положение последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 1, поддерживается в SEQ ID NO:29. В таблице 14 показано, что количество последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблицах 2 и 3, снижается в SEQ ID NO:29 по сравнению с SEQ ID NO:25.
Синтезируется ДНК из SEQ ID NO:29, и уровни экспрессии, наблюдаемые в растительных клетках, трансформированных для экспрессии данной последовательности, сравниваются с уровнями экспрессии, наблюдаемыми в растительных клетках, трансформированных для экспрессии SEQ ID NO:25 и SEQ ID NO:27.
Синтетический ген SEQ ID NO:29 был оптимизирован для экспрессии в кукурузе.
Конструкция для применения в экспрессии синтетического гена SEQ ID NO:29 была сделана путем объединения синтетического гена SEQ ID NO:29 с 5'-нетранслируемой областью, содержащей промотор, функциональный в растительных клетках, и 3'-нетранслируемой области, содержащей терминатор транскрипции и последовательность полиаденилирования.
Таблица 13
Последовательности таблицы 1, обнаруженные в нативной кодирующей Cry1Ca области (SEQ ID NO:25) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:29)
Последовательность из таблицы 1
Число участков в нативной последовательности ядерного токсина Cry1Ca (SEQ ID NO:25)
Положение в нативной последовательности ядерного токсина Cry1Ca, н.п. (SEQ ID NO:25)
Число участков в перестроенной последовательности ядерного токсина Cry1Ca (SEQ ID NO:29)
Положение в перестроенной последовательности ядерного токсина Cry1Ca, н.п. (SEQ ID NO:29)
1
AATAAA
0
NA*
0
NA
2
AATAAT
2
646, 916
2
646, 916
3
AACCAA
0
NA
1
1042
4
ATATAA
2
684, 1757
2
684, 1757
5
AATCAA
1
1405
1
1405
6
ATACTA
0
NA
0
NA
7
ATAAAA
1
1826
1
1826
8
ATGAAA
2
254, 569
2
254, 569
9
AAGCAT
1
335
1
335
10
ATTAAT
7
177, 246, 250, 813, 817, 1402, 1534
7
177, 246, 250, 813, 817, 1402, 1534
11
ATACAT
0
NA
0
NA
12
AAAATA
0
NA
0
NA
13
ATTAAA
4
245, 249, 816, 1401
4
245, 249, 816, 1401
13
AATTAA
1
642
1
642
15
AATACA
1
1381
1
1381
16
CATAAA
0
NA
0
NA
итого
22
23
*NA = Не применимо
Таблица 14
Последовательности таблицы 2, обнаруженные в нативной кодирующей ядерный токсин Cry1Ca области (SEQ ID NO:25) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:29)
Последовательность из таблицы 2
Число участков в нативной последовательности ядерного токсина Cry1Ca (SEQ ID NO:25)
Положение в нативной последовательности ядерного токсина Cry1Ca, н.п. (SEQ ID NO:25)
Число участков в перестроенной последовательности ядерного токсина Cry1Ca (SEQ ID NO:29)
Положение в перестроенной последовательности ядерного токсина Cry1Ca, н.п. (SEQ ID NO:29)
1
ATATAT
4
323, 325, 908, 1024
0
NA*
2
TTGTTT
NA
0
NA
3
TTTTGT
3
186, 1302, 1512
0
NA
4
TGTTTT
0
NA
0
NA
5
TATATA
3
324, 1023, 1819
0
NA
6
TATTTT
1
1346
0
NA
7
TTTTTT
1
1326
0
NA
8
ATTTTT
2
529, 959
0
NA
9
TTATTT
1
901
0
NA
10
TTTATT
2
900, 962
0
NA
11
TAATAA
0
NA
0
NA
12
ATTTAT
1
899
0
NA
13
TATATT
2
510, 909
0
NA
14
TTTTAT
2
470, 961
0
NA
15
ATATTT
1
110
0
NA
16
TATTAT
0
NA
0
NA
17
TGTTTG
0
NA
0
NA
18
TTATAT
1
1818
0
NA
19
TGTAAT
1
525
0
NA
20
AAATAA
1
645
1
645
итого
26
1
*NA = Не применимо
ПРИМЕР 6
Синтетическая кодирующая область, кодирующая токсин Cry6Aa Bacillus thuringiensis
Последовательности для сравнения. Нативная последовательность ДНК, кодирующая токсин Cry6Aa, дана под SEQ ID NO:31. Данная последовательность была проанализирована с целью определения того, какие последовательности из идентифицированных в таблице 1 присутствуют в SEQ ID NO:31, и их положений. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:31 подвергалась обратной трансляции с использованием целевых частот кодонов, приведенных в столбце таблицы 4 для синтетических генов, предназначенных для использования в кукурузе. Полученная в результате последовательность ДНК анализировалась, и кодоны заменялись при необходимости для удаления нежелательных открытых рамок считывания и удаления нежелательных сайтов распознавания рестрикционных ферментов, при этом поддерживались все последовательности, идентифицированные в таблице 1. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:31, сохранялась. Полученная в результате последовательность ДНК дана под SEQ ID NO:33. Данная последовательность была синтезирована и использована для сравнения с синтетическим геном, спроектированным по изобретению.
SEQ ID NO:33 была проанализирована, и кодоны были изменены с целью удаления потенциальных последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 2, при этом поддерживалось количество последовательностей, идентифицированных в таблице 1. Полученная в результате последовательность, которая является вариантом осуществления настоящего изобретения, дана под SEQ ID NO:35. В таблице 15 показано, что количество и положение последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 1, поддерживается в SEQ ID NO:35. В таблице 16 показано, что количество последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблицах 2 и 3, снижается в SEQ ID NO:35 по сравнению с SEQ ID NO:31.
Синтезируется ДНК из SEQ ID NO:35, и уровни экспрессии, наблюдаемые в растительных клетках, трансформированных для экспрессии данной последовательности, сравниваются с уровнями экспрессии, наблюдаемыми в растительных клетках, трансформированных для экспрессии SEQ ID NO:31 и SEQ ID NO:33.
Синтетическая кодирующая область SEQ ID NO:35 была оптимизирована для экспрессии в кукурузе.
Конструкция для применения в экспрессии синтетической кодирующей области SEQ ID NO:35 сделана путем объединения синтетической кодирующей области SEQ ID NO:35 с 5'-нетранслируемой областью, содержащей промотор, функциональный в растительных клетках и 3'-нетранслируемой области, содержащей терминатор транскрипции и последовательность полиаденилирования.
Таблица 15
Последовательности таблицы 1, обнаруженные в нативной кодирующей области Cry6Aa (SEQ ID NO:31) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:35)
Последовательность из таблицы 1
Число участков в нативной последовательности Cry6Aa (SEQ ID NO:31)
Положение в нативной последовательности Cry6Aa, н.п. (SEQ ID NO:31)
Число участков в перестроенной последовательности Cry6Aa (SEQ ID NO:35)
Положение в перестроенной последовательности Cry6Aa, н.п. (SEQ ID NO:35)
1
AATAAA
1
292
1
292
2
AATAAT
6
430, 1309, 1360, 1384, 1402, 1420
6
430, 1309, 1360, 1384, 1402, 1420
3
AACCAA
0
NA*
0
NA
4
ATATAA
2
824, 1344
2
824, 1344
5
AATCAA
5
103, 634, 832, 1234, 1270
5
103, 634, 832, 1234, 1270
6
ATACTA
0
NA
0
NA
7
ATAAAA
3
269, 293, 826
3
269, 293, 826
8
ATGAAA
1
794
1
794
9
AAGCAT
0
NA
0
NA
10
ATTAAT
2
919, 1183
2
919, 1183
11
ATACAT
0
NA
1
1275
12
AAAATA
3
530, 806, 1358
3
530, 806, 1358
13
ATTAAA
5
51, 56, 188, 495, 963
5
51, 56, 188, 495, 963
14
AATTAA
7
52, 57, 316, 463, 496, 718, 964
7
52, 57, 316, 463, 496, 718, 964
15
AATACA
2
922, 1238
3
922, 1238, 1274
16
CATAAA
1
664
1
664
итого
38
40
*NA = Не применимо
Таблица 16
Последовательности таблицы 2, обнаруженные в нативной кодирующей области Cry6Aa (SEQ ID NO:31) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:35)
Последовательность из таблицы 2
Число участков в нативной последовательности Cry6Aa (SEQ ID NO:31)
Положение в нативной последовательности Cry6Aa, н.п. (SEQ ID NO:31)
Число участков в перестроенной последовательности Cry6Aa (SEQ ID NO:35)
Положение в перестроенной последовательности Cry6Aa, н.п. (SEQ ID NO:35)
1
ATATAT
4
147, 218, 1275, 1372
0
NA*
2
TTGTTT
1
788
0
NA
3
TTTTGT
NA
0
NA
4
TGTTTT
0
NA
0
NA
5
TATATA
1
941
0
NA
6
TATTTT
2
388, 489
0
NA
7
TTTTTT
NA
0
NA
8
ATTTTT
2
236, 555
0
NA
9
TTATTT
1
113
0
NA
10
TTTATT
1
109, 257
0
NA
11
TAATAA
5
66, 429, 1383, 1401, 1419
0
NA
12
ATTTAT
3
108, 299, 938
0
NA
13
TATATT
2
148, 1373
0
NA
14
TTTTAT
2
1314, 1365
0
NA
15
ATATTT
1
387
0
NA
16
TATTAT
1
111
0
NA
17
TGTTTG
0
NA
0
NA
18
TTATAT
4
247, 301, 940, 1190
0
NA
19
TGTAAT
1
1204
0
NA
20
AAATAA
2
1308, 1359
1
1359
итого
33
1
*NA = Не применимо
ПРИМЕР 7
Синтетическая кодирующая область, кодирующая AAD1 Sphingobiurn herbicidovorans
Последовательности для сравнения. Нативная последовательность ДНК, кодирующая белок AAD1, дана под SEQ ID NO:37. Данная последовательность была проанализирована с целью определения того, какие последовательности из идентифицированных в таблице 1 присутствуют в SEQ ID NO:37, и их положений. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:37, подвергалась обратной трансляции с использованием целевых частот кодонов, приведенных в столбце таблицы 4 для синтетических генов, предназначенных для использования в кукурузе. Полученная в результате последовательность ДНК анализировалась, и кодоны заменялись при необходимости для удаления нежелательных открытых рамок считывания и удаления нежелательных сайтов распознавания рестрикционных ферментов, при этом поддерживались все последовательности, идентифицированные в таблице 1. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:37, сохранялась. Полученная в результате последовательность ДНК дана под SEQ ID NO:39. Данная последовательность была синтезирована и использована для сравнения с синтетическим геном, спроектированным по изобретению.
SEQ ID NO:39 была проанализирована, и кодоны были изменены с целью удаления потенциальных последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 2, при этом поддерживалось количество последовательностей, идентифицированных в таблице 1. Полученная в результате последовательность, которая является вариантом осуществления настоящего изобретения, дана под SEQ ID NO:41. В таблице 17 показано, что количество и положение последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 1, поддерживается в SEQ ID NO:41. В таблице 18 показано, что количество последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблицах 2 и 3, снижается в SEQ ID NO:41 по сравнению с SEQ ID NO:37.
Синтезируется ДНК из SEQ ID NO:41, и уровни экспрессии, наблюдаемые в растительных клетках, трансформированных для экспрессии данной последовательности, сравниваются с уровнями экспрессии, наблюдаемыми в растительных клетках, трансформированных для экспрессии SEQ ID NO:37 и SEQ ID NO:39.
Синтетическая кодирующая область SEQ ID NO:41 была оптимизирована для экспрессии в кукурузе.
Конструкция для применения в экспрессии синтетической кодирующей области SEQ ID NO:41 сделана путем объединения синтетической кодирующей области SEQ ID NO:41 с 5'-нетранслируемой областью, содержащей промотор, функциональный в растительных клетках, и 3'-нетранслируемой области, содержащей терминатор транскрипции и последовательность полиаденилирования.
Таблица 17
Последовательности таблицы 1, обнаруженные в нативной кодирующей области AAD1 (SEQ ID NO:37) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:41)
Последовательность из таблицы 1
Число участков в нативной последовательности AAD1 (SEQ ID NO:37)
Положение в нативной последовательности AAD1, н.п. (SEQ ID NO:37)
Число участков в перестроенной последовательности AAD1 (SEQ ID NO:41)
Положение в перестроенной последовательности AAD1, н.п. (SEQ ID NO:41)
1
AATAAA
0
NA*
0
NA
2
AATAAT
0
NA
0
NA
3
AACCAA
0
NA
1
652
4
ATATAA
0
NA
0
NA
5
AATCAA
0
NA
0
NA
6
ATACTA
0
NA
0
NA
7
ATAAAA
0
NA
0
NA
8
ATGAAA
0
NA
0
NA
9
AAGCAT
0
NA
0
NA
10
ATTAAT
0
NA
0
NA
11
ATACAT
0
NA
0
NA
12
AAAATA
0
NA
0
NA
13
ATTAAA
0
NA
0
NA
14
AATTAA
0
NA
0
NA
15
AATACA
0
NA
0
NA
16
CATAAA
0
NA
0
NA
итого
0
1
*NA = Не применимо
Таблица 18
Последовательности таблицы 2, обнаруженные в нативной кодирующей области AAD1 (SEQ ID NO:37) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:41)
Последовательность из таблицы 2
Число участков в нативной последовательности AAD1 (SEQ ID NO:37)
Положение в нативной последовательности AAD1, н.п. (SEQ ID NO:37)
Число участков в перестроенной последовательности AAD1 (SEQ ID NO:41)
Положение в перестроенной последовательности AAD1, н.п. (SEQ ID NO:41)
1
ATATAT
0
NA*
0
NA
2
TTGTTT
0
NA
0
NA
3
TTTTGT
0
NA
0
NA
4
TGTTTT
0
NA
0
NA
5
TATATA
0
NA
0
NA
6
TATTTT
1
166
0
NA
7
TTTTTT
0
NA
0
NA
8
ATTTTT
0
NA
0
NA
9
TTATTT
0
NA
0
NA
10
TTTATT
0
NA
0
NA
11
TAATAA
0
NA
0
NA
12
ATTTAT
0
NA
0
NA
13
TATATT
0
NA
0
NA
14
TTTTAT
0
NA
0
NA
15
ATATTT
0
NA
0
NA
16
TATTAT
0
NA
0
NA
17
TGTTTG
0
NA
0
NA
18
TTATAT
0
NA
0
NA
19
TGTAAT
0
NA
0
NA
20
AAATAA
0
NA
0
NA
итого
1
0
*NA = Не применимо
ПРИМЕР 8
Синтетическая кодирующая область, кодирующая дельта-9-десатуразу Aspergillus nidulans
Последовательности для сравнения. Нативная последовательность ДНК, кодирующая белок дельта-9-десатуразы Aspergillus nidulans, дана под SEQ ID NO:43. Данная последовательность была проанализирована с целью определения того, какие последовательности из идентифицированных в таблице 1 присутствуют в SEQ ID NO:43, и их положений. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:43, подвергалась обратной трансляции с использованием целевых частот кодонов, приведенных в столбце таблицы 4 для синтетических генов, предназначенных для использования в кукурузе. Полученная в результате последовательность ДНК анализировалась, и кодоны заменялись при необходимости для удаления нежелательных открытых рамок считывания и удаления нежелательных сайтов рестрикции, при этом поддерживались все последовательности, идентифицированные в таблице 1. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:43, сохранялась. Полученная в результате последовательность ДНК дана под SEQ ID NO:45. Данная последовательность была синтезирована и использована для сравнения с синтетическим геном, спроектированным по изобретению.
SEQ ID NO:45 была проанализирована, и кодоны были изменены с целью удаления потенциальных последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 2, при этом поддерживалось количество последовательностей, идентифицированных в таблице 1. Полученная в результате последовательность, которая является вариантом осуществления настоящего изобретения, дана под SEQ ID NO:47. В таблице 1 показано, что количество и положение последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 1, поддерживается в SEQ ID NO:47. В таблице 20 показано, что количество последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблицах 2 и 3, снижается в SEQ ID NO:47 по сравнению с SEQ ID NO:43.
Синтезируется ДНК из SEQ ID NO:47, и уровни экспрессии, наблюдаемые в растительных клетках, трансформированных для экспрессии данной последовательности, сравниваются с уровнями экспрессии, наблюдаемыми в растительных клетках, трансформированных для экспрессии SEQ ID NO:43 и SEQ ID NO:45.
Синтетическая кодирующая область SEQ ID NO:47 была оптимизирована для экспрессии в кукурузе.
Конструкция для применения в экспрессии синтетической кодирующей области SEQ ID NO:47 сделана путем объединения синтетической кодирующей области SEQ ID NO:47 с 5'-нетранслируемой областью, содержащей промотор, функциональный в растительных клетках, и 3'-нетранслируемой области, содержащей последовательность терминации транскрипции и полиаденилирования.
Таблица 19
Последовательности таблицы 1, обнаруженные в нативной кодирующей области дельта-9-десатуразы Aspergillus nidulans (SEQ ID NO:43) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:47)
Последовательность из таблицы 1
Число участков в нативной последовательности Asp-Δ9 (SEQ ID NO:43)
Положение в нативной последовательности Asp-Δ9, н.п. (SEQ ID NO:43)
Число участков в перестроенной последовательности Asp-Δ9 (SEQ ID NO:47)
Положение в перестроенной последовательности Asp-Δ9, н.п. (SEQ ID NO:47)
1
AATAAA
0
NA*
0
NA
2
AATAAT
0
NA
0
NA
3
AACCAA
1
1326
1
1326
4
ATATAA
0
NA
0
NA
5
AATCAA
0
NA
0
NA
6
ATACTA
0
NA
0
NA
7
ATAAAA
0
NA
0
NA
8
ATGAAA
0
NA
0
NA
9
AAGCAT
1
94
1
94
10
ATTAAT
0
NA
0
NA
11
ATACAT
0
NA
0
NA
12
AAAATA
0
NA
0
NA
13
ATTAAA
0
NA
0
NA
14
AATTAA
0
NA
0
NA
15
AATACA
0
NA
0
NA
16
CATAAA
0
NA
0
NA
итого
2
2
*NA = Не применимо
Таблица 20
Последовательности таблицы 2, обнаруженные в нативной кодирующей области дельта-9-десатуразы Aspergillus nidulans (SEQ ID NO:43) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:47)
Последовательность из таблицы 2
Число участков в нативной последовательности Asp-Δ9 (SEQ ID NO:43)
Положение в нативной последовательности Asp-Δ9, н.п. (SEQ ID NO:43)
Число участков в перестроенной последовательности Asp-Δ9 (SEQ ID NO:47)
Положение в перестроенной последовательности Asp-Δ9, н.п. (SEQ ID NO:47)
1
ATATAT
0
NA*
0
NA
2
TTGTTT
0
NA
0
NA
3
TTTTGT
0
NA
0
NA
4
TGTTTT
0
NA
0
NA
5
TATATA
0
NA
0
NA
6
TATTTT
1
166
0
NA
7
TTTTTT
0
NA
0
NA
8
ATTTTT
0
NA
0
NA
9
TTATTT
0
NA
0
NA
10
TTTATT
0
NA
0
NA
11
TAATAA
0
NA
0
NA
12
ATTTAT
0
NA
0
NA
13
TATATT
0
NA
0
NA
14
TTTTAT
0
NA
0
NA
15
ATATTT
1
479
0
NA
16
TATTAT
0
NA
0
NA
17
TGTTTG
0
NA
0
NA
18
TTATAT
0
NA
0
NA
19
TGTAAT
0
NA
0
NA
20
AAATAA
0
NA
0
NA
итого
1
0
*NA = Не применимо
ПРИМЕР 9
Синтетическая кодирующая область, кодирующая SAP1 Xerophyta viscosa
Последовательности для сравнения. Нативная последовательность ДНК, кодирующая белок SAP1 Xerophyta viscosa, дана под SEQ ID NO:49. Данная последовательность была проанализирована с целью определения того, какие последовательности из идентифицированных в таблице 1 присутствуют в SEQ ID NO:49, и их положений. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:49 подвергалась обратной трансляции с использованием целевых частот кодонов, приведенных в столбце таблицы 4 для синтетических генов, предназначенных для использования в кукурузе. Полученная в результате последовательность ДНК анализировалась, и кодоны заменялись при необходимости для удаления нежелательных открытых рамок считывания и удаления нежелательных сайтов рестрикции, при этом поддерживались все последовательности, идентифицированные в таблице 1. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:49, сохранялась. Полученная в результате последовательность ДНК дана под SEQ ID NO:51. Данная последовательность была синтезирована и использована для сравнения с синтетическим геном, спроектированным по изобретению.
SEQ ID NO:52 была проанализирована, и кодоны были изменены с целью удаления потенциальных последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 2, при этом поддерживалось количество последовательностей, идентифицированных в таблице 1. Полученная в результате последовательность, которая является вариантом осуществления настоящего изобретения, дана под SEQ ID NO:53. В таблице 1 показано, что количество и положение последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 1, поддерживается в SEQ ID NO:53. В таблице 21 показано, что количество последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблицах 2 и 3, снижается в SEQ ID NO:53 по сравнению с SEQ ID NO:49.
Синтезируется ДНК из SEQ ID NO:53, и уровни экспрессии, наблюдаемые в растительных клетках, трансформированных для экспрессии данной последовательности, сравниваются с уровнями экспрессии, наблюдаемыми в растительных клетках, трансформированных для экспрессии SEQ ID NO:49 и SEQ ID NO:51.
Синтетическая кодирующая область SEQ ID NO:53 была оптимизирована для экспрессии в кукурузе.
Конструкция для применения в экспрессии синтетической кодирующей области SEQ ID NO:53 сделана путем объединения синтетической кодирующей области SEQ ID NO:53 с 5'-нетранслируемой областью, содержащей промотор, функциональный в растительных клетках, и 3'-нетранслируемой области, содержащей терминатор транскрипции и последовательность полиаденилирования.
Таблица 21
Последовательности таблицы 1, обнаруженные в нативной кодирующей области SAP1 Xerophyta viscosa (SEQ ID NO:49) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:53)
Последовательность из таблицы 1
Число участков в нативной последовательности XvSAP1 (SEQ ID NO:49)
Положение в нативной последовательности XvSAP1, н.п. (SEQ ID NO:49)
Число участков в перестроенной последовательности XvSAP1 (SEQ ID NO:53)
Положение в перестроенной последовательности XvSAP1, н.п. (SEQ ID NO:53)
1
AATAAA
0
NA*
0
NA
2
AATAAT
0
NA
0
NA
3
AACCAA
0
NA
0
NA
4
ATATAA
0
NA
0
NA
5
AATCAA
0
NA
0
NA
6
ATACTA
0
NA
0
NA
7
ATAAAA
0
NA
0
NA
8
ATGAAA
0
NA
1
25
9
AAGCAT
0
NA
0
NA
10
ATTAAT
0
NA
0
NA
11
ATACAT
0
NA
0
NA
12
AAAATA
0
NA
0
NA
13
ATTAAA
0
NA
0
NA
14
AATTAA
0
NA
0
NA
15
AATACA
0
NA
0
NA
16
CATAAA
0
NA
0
NA
итого
0
1
*NA = Не применимо
Таблица 22
Последовательности таблицы 2, обнаруженные в нативной кодирующей области SAP1 Xerophyta viscosa (SEQ ID NO:49) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:53)
Последовательность из таблицы 2
Число участков в нативной последовательности XvSAP1 (SEQ ID NO:49)
Положение в нативной последовательности XvSAP1, н.п. (SEQ ID NO:49)
Число участков в перестроенной последовательности XvSAP1 (SEQ ID NO:53)
Положение в перестроенной последовательности XvSAP1, н.п. (SEQ ID NO:53)
1
ATATAT
0
NA*
0
NA
2
TTGTTT
0
NA
0
NA
3
TTTTGT
0
NA
0
NA
4
TGTTTT
0
NA
0
NA
5
TATATA
0
NA
0
NA
6
TATTTT
1
755
0
NA
7
TTTTTT
0
NA
0
NA
8
ATTTTT
1
756
0
NA
9
TTATTT
0
NA
0
NA
10
TTTATT
0
NA
0
NA
11
TAATAA
0
NA
0
NA
12
ATTTAT
0
NA
0
NA
13
TATATT
0
NA
0
NA
14
TTTTAT
0
NA
0
NA
15
ATATTT
1
754
0
NA
16
TATTAT
1
665
0
NA
17
TGTTTG
1
696
0
NA
18
TTATAT
0
NA
0
NA
19
TGTAAT
0
NA
0
NA
20
AAATAA
0
NA
0
NA
итого
5
0
*NA = Не применимо
ПРИМЕР 10
Синтетическая кодирующая область, кодирующая GFP1 Aequorea victoria
Последовательности для сравнения. Нативная последовательность ДНК, кодирующая GFP1 Aequorea victoria, дана под SEQ ID NO:55. Данная последовательность была проанализирована с целью определения того, какие последовательности из идентифицированных в таблице 1 присутствуют в SEQ ID NO:55, и их положений. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:55, подвергалась обратной трансляции с использованием целевых частот кодонов, приведенных в столбце таблицы 4 для синтетических генов, предназначенных для использования в кукурузе. Полученная в результате последовательность ДНК анализировалась, и кодоны заменялись при необходимости для удаления нежелательных открытых рамок считывания и удаления нежелательных сайтов рестрикции, при этом поддерживались все последовательности, идентифицированные в таблице 1. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:55, сохранялась. Полученная в результате последовательность ДНК дана под SEQ ID NO:57. Данная последовательность была синтезирована и использована для сравнения с синтетическим геном, спроектированным по изобретению.
SEQ ID NO:57 была проанализирована, и кодоны были изменены с целью удаления потенциальных последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 2, при этом поддерживалось количество последовательностей, идентифицированных в таблице 1. Полученная в результате последовательность, которая является вариантом осуществления настоящего изобретения, дана под SEQ ID NO:59. В таблице 1 показано, что количество и положение последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 1, поддерживается в SEQ ID NO:59. В таблице 23 показано, что количество последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблицах 2 и 3, снижается в SEQ ID NO:59 по сравнению с SEQ ID NO:55.
Синтезируется ДНК из ID NO:59, и уровни экспрессии, наблюдаемые в растительных клетках, трансформированных для экспрессии данной последовательности, сравниваются с уровнями экспрессии, наблюдаемыми в растительных клетках, трансформированных для экспрессии SEQ ID NO:55 и SEQ ID NO:57.
Синтетическая кодирующая область SEQ ID NO:59 была оптимизирована для экспрессии в кукурузе.
Конструкция для применения в экспрессии синтетической кодирующей области SEQ ID NO:59 сделана путем объединения синтетической кодирующей области SEQ ID NO:59 с 5'-нетранслируемой областью, содержащей промотор, функциональный в растительных клетках, и 3'-нетранслируемой области, содержащей терминатор транскрипции и последовательность полиаденилирования.
Таблица 23
Последовательности таблицы 1, обнаруженные в нативной кодирующей области GFP1 Aequorea victoria (SEQ ID NO:55) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:59)
Последовательность из таблицы 1
Число участков в нативной последовательности GFP1 (SEQ ID NO:55)
Положение в нативной последовательности GFP1, н.п. (SEQ ID NO:55)
Число участков в перестроенной последовательности GFP1 (SEQ ID NO:59)
Положение в перестроенной последовательности GFP1, н.п. (SEQ ID NO:59)
1
AATAAA
0
NA*
0
NA
2
AATAAT
0
NA
0
NA
3
AACCAA
1
467
1
467
4
ATATAA
0
NA
0
NA
5
AATCAA
0
NA
0
NA
6
ATACTA
0
NA
0
NA
7
ATAAAA
0
NA
0
NA
8
ATGAAA
1
237
1
237
9
AAGCAT
0
NA
0
NA
10
ATTAAT
0
NA
0
NA
11
ATACAT
1
450
1
450
12
AAAATA
1
551
1
551
13
ATTAAA
1
511
1
511
14
AATTAA
0
NA
0
NA
15
AATACA
1
425
1
425
16
CATAAA
0
NA
1
480
итого
6
7
*NA = Не применимо
Таблица 24
Последовательности таблицы 2, обнаруженные в нативной кодирующей области GFP1 Aequorea victoria (SEQ ID NO:55) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:59)
Последовательность из таблицы 2
Число участков в нативной последовательности GFP1 (SEQ ID NO:55)
Положение в нативной последовательности GFP1, н.п. (SEQ ID NO:55)
Число участков в перестроенной последовательности GFP1 (SEQ ID NO:59)
Положение в перестроенной последовательности GFP1, н.п. (SEQ ID NO:59)
1
ATATAT
0
NA*
0
NA
2
TTGTTT
0
NA
0
NA
3
TTTTGT
0
NA
0
NA
4
TGTTTT
0
NA
0
NA
5
TATATA
0
NA
0
NA
6
TATTTT
1
293
0
NA
7
TTTTTT
0
NA
0
NA
8
ATTTTT
0
NA
0
NA
9
TTATTT
1
137
0
NA
10
TTTATT
1
136
0
NA
11
TAATAA
0
NA
0
NA
12
ATTTAT
0
NA
0
NA
13
TATATT
1
291
0
NA
14
TTTTAT
1
135
0
NA
15
ATATTT
1
292
0
NA
16
TATTAT
0
NA
0
NA
17
TGTTTG
0
NA
0
NA
18
TTATAT
0
NA
0
NA
19
TGTAAT
0
NA
0
NA
20
AAATAA
0
NA
0
NA
итого
6
0
*NA = Не применимо
ПРИМЕР 11
Синтетическая кодирующая область, кодирующая FAD9 Leptosphaeria nodorum
Последовательности для сравнения. Нативная последовательность ДНК, кодирующая белок FAD9 Leptosphaeria nodorum, дана под SEQ ID NO:61. Данная последовательность была проанализирована с целью определения того, какие последовательности из идентифицированных в таблице 1 присутствуют в SEQ ID NO:61, и их положений. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:61, подвергалась обратной трансляции с использованием целевых частот кодонов, приведенных в столбце таблицы 4 для синтетических генов, предназначенных для использования в кукурузе. Полученная в результате последовательность ДНК анализировалась, и кодоны заменялись при необходимости для удаления нежелательных открытых рамок считывания и удаления нежелательных сайтов рестрикции, при этом поддерживались все последовательности, идентифицированные в таблице 1. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:61, сохранялась. Полученная в результате последовательность ДНК дана под SEQ ID NO:63. Данная последовательность была синтезирована и использована для сравнения с синтетическим геном, спроектированным по изобретению.
SEQ ID NO:63 была проанализирована, и кодоны были изменены с целью удаления потенциальных последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 2, при этом поддерживалось количество последовательностей, идентифицированных в таблице 1. Полученная в результате последовательность, которая является вариантом осуществления настоящего изобретения, дана под SEQ ID NO:65. В таблице 1 показано, что количество и положение последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 1, поддерживается в SEQ ID NO:65. В таблице 25 показано, что количество последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблицах 2 и 3, снижается в SEQ ID NO:65 по сравнению с SEQ ID NO:61.
Синтезируется ДНК из ID NO:65, и уровни экспрессии, наблюдаемые в растительных клетках, трансформированных для экспрессии данной последовательности, сравниваются с уровнями экспрессии, наблюдаемыми в растительных клетках, трансформированных для экспрессии SEQ ID NO:61 и SEQ ID NO:63.
Синтетическая кодирующая область SEQ ID NO:65 была оптимизирована для экспрессии в кукурузе.
Конструкция для применения в экспрессии синтетической кодирующей области SEQ ID NO:65 сделана путем объединения синтетической кодирующей области SEQ ID NO:65 с 5'-нетранслируемой областью, содержащей промотор, функциональный в растительных клетках, и 3'-нетранслируемой области, содержащей терминатор транскрипции и последовательность полиаденилирования.
Таблица 25
Последовательности таблицы 1, обнаруженные в нативной кодирующей области FAD9 Leptosphaeria nodorum (SEQ ID NO:61) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:65)
Последовательность из таблицы 1
Число участков в нативной последовательности Ln FAD9 (SEQ ID NO:61)
Положение в нативной последовательности Ln FAD9, н.п. (SEQ ID NO:61)
Число участков в перестроенной последовательности Ln FAD9 (SEQ ID NO:65)
Положение в перестроенной последовательности Ln FAD9, н.п. (SEQ ID NO:65)
1
AATAAA
0
NA*
0
NA
2
AATAAT
0
NA
0
NA
3
AACCAA
0
NA
0
NA
4
ATATAA
0
NA
0
NA
5
AATCAA
0
NA
0
NA
6
ATACTA
0
NA
0
NA
7
ATAAAA
0
NA
0
NA
8
ATGAAA
0
NA
0
NA
9
AAGCAT
0
NA
0
NA
10
ATTAAT
0
NA
0
NA
11
ATACAT
0
NA
0
NA
12
AAAATA
0
NA
0
NA
13
ATTAAA
0
NA
0
NA
14
AATTAA
0
NA
0
NA
15
AATACA
0
NA
0
NA
16
CATAAA
0
NA
0
NA
итого
0
0
*NA = Не применимо
Таблица 26
Последовательности таблицы 2, обнаруженные в нативной кодирующей области FAD9 Leptosphaeria nodorum (SEQ ID NO:61) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:65)
Последовательность из таблицы 2
Число участков в нативной последовательности Ln FAD9 (SEQ ID NO:61)
Положение в нативной последовательности Ln FAD9, н.п. (SEQ ID NO:61)
Число участков в перестроенной последовательности Ln FAD9 (SEQ ID NO:65)
Положение в перестроенной последовательности Ln FAD9, н.п. (SEQ ID NO:65)
1
ATATAT
0
NA*
0
NA
2
TTGTTT
0
NA
0
NA
3
TTTTGT
0
NA
0
NA
4
TGTTTT
1
1275
0
NA
5
TATATA
0
NA
0
NA
6
TATTTT
0
NA
0
NA
7
TTTTTT
0
NA
0
NA
8
ATTTTT
0
NA
0
NA
9
TTATTT
0
NA
0
NA
10
TTTATT
1
1090
0
NA
11
TAATAA
0
NA
0
NA
12
ATTTAT
0
NA
0
NA
13
TATATT
0
NA
0
NA
14
TTTTAT
0
NA
0
NA
15
ATATTT
0
NA
0
NA
16
TATTAT
1
416
0
NA
17
TGTTTG
0
NA
0
NA
18
TTATAT
0
NA
0
NA
19
TGTAAT
0
NA
0
NA
20
AAATAA
0
NA
0
NA
итого
3
0
*NA = Не применимо
ПРИМЕР 12
Синтетическая кодирующая область, кодирующая PER1 Xerophyta viscosa
Последовательности для сравнения. Нативная последовательность ДНК, кодирующая белок PER1 Xerophyta viscosa, дана под SEQ ID NO:67. Данная последовательность была проанализирована с целью определения того, какие последовательности из идентифицированных в таблице 1 присутствуют в SEQ ID NO:67, и их положений. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:67, подвергалась обратной трансляции с использованием целевых частот кодонов, приведенных в столбце таблицы 4 для синтетических генов, предназначенных для использования в кукурузе. Полученная в результате последовательность ДНК анализировалась, и кодоны заменялись при необходимости для удаления нежелательных открытых рамок считывания и удаления нежелательных сайтов рестрикции, при этом поддерживались все последовательности, идентифицированные в таблице 1. Аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID NO:67, сохранялась. Полученная в результате последовательность ДНК дана под SEQ ID NO:69. Данная последовательность была синтезирована и использована для сравнения с синтетическим геном, спроектированным по изобретению.
SEQ ID NO:69 была проанализирована, и кодоны были изменены с целью удаления потенциальных последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 2, при этом поддерживалось количество последовательностей, идентифицированных в таблице 1. Полученная в результате последовательность, которая является вариантом осуществления настоящего изобретения, дана под SEQ ID NO:71. В таблице 1 показано, что количество и положение последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблице 1, поддерживается в SEQ ID NO:71. В таблице 27 показано, что количество последовательностей сигналов полиаденилирования, идентифицированных в таблицах 2 и 3, снижается в SEQ ID NO:71 по сравнению с SEQ ID NO:67.
Синтезируется ДНК из ID NO:71, и уровни экспрессии, наблюдаемые в растительных клетках, трансформированных для экспрессии данной последовательности, сравниваются с уровнями экспрессии, наблюдаемыми в растительных клетках, трансформированных для экспрессии SEQ ID NO:67 и SEQ ID NO:69.
Синтетическая кодирующая область SEQ ID NO:71 была оптимизирована для экспрессии в кукурузе.
Конструкция для применения в экспрессии синтетической кодирующей области SEQ ID NO:71 сделана путем объединения синтетической кодирующей области SEQ ID NO:71 с 5'-нетранслируемой областью, содержащей промотор, функциональный в растительных клетках, и 3'-нетранслируемой области, содержащей терминатор транскрипции и последовательность полиаденилирования.
Таблица 27
Последовательности таблицы 1, обнаруженные в нативной кодирующей области PER1 Xerophyta viscosa (SEQ ID NO:67) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:71)
Последовательность из таблицы 1
Число участков в нативной последовательности XvPER1 (SEQ ID NO:67)
Положение в нативной последовательности XvPER1, н.п. (SEQ ID NO:67)
Число участков в перестроенной последовательности XvPER1 (SEQ ID NO:71)
Положение в перестроенной последовательности XvPER1, н.п. (SEQ ID NO:71)
1
AATAAA
0
NA*
0
NA
2
AATAAT
0
NA
0
NA
3
AACCAA
0
NA
0
NA
4
ATATAA
0
NA
0
NA
5
AATCAA
0
NA
0
NA
6
ATACTA
0
NA
0
NA
7
ATAAAA
1
605
1
605
8
ATGAAA
0
NA
0
NA
9
AAGCAT
0
NA
0
NA
10
ATTAAT
0
NA
0
NA
11
ATACAT
0
NA
0
NA
12
AAAATA
1
282
1
282
13
ATTAAA
0
NA
0
NA
14
AATTAA
0
NA
0
NA
15
AATACA
0
NA
0
NA
16
CATAAA
0
NA
0
NA
итого
2
2
*NA = Не применимо
Таблица 28
Последовательности таблицы 2, обнаруженные в нативной кодирующей области PER1 Xerophyta viscosa (SEQ ID NO:67) и ее перестроенной версии (SEQ ID NO:71)
Последовательность из таблицы 2
Число участков в нативной последовательности XvPER1 (SEQ ID NO:67)
Положение в нативной последовательности XvPER1, н.п. (SEQ ID NO:67)
Число участков в перестроенной последовательности XvPER1 (SEQ ID NO:71)
Положение в перестроенной последовательности XvPER1, н.п. (SEQ ID NO:71)
1
ATATAT
0
NA*
0
NA
2
TTGTTT
0
NA
0
NA
3
TTTTGT
0
NA
0
NA
4
TGTTTT
0
NA
0
NA
5
TATATA
0
NA
0
NA
6
TATTTT
0
NA
0
NA
7
TTTTTT
0
NA
0
NA
8
ATTTTT
0
NA
0
NA
9
TTATTT
0
NA
0
NA
10
TTTATT
0
NA
0
NA
11
TAATAA
0
NA
0
NA
12
ATTTAT
0
NA
0
NA
13
TATATT
0
NA
0
NA
14
TTTTAT
0
NA
0
NA
15
ATATTT
0
NA
0
NA
16
TATTAT
0
NA
0
NA
17
TGTTTG
0
NA
0
NA
18
TTATAT
0
NA
0
NA
19
TGTAAT
0
NA
0
NA
20
AAATAA
0
NA
0
NA
итого
0
0
*NA = Не применимо
ПРИМЕР 13

WHISKERS-трансформация кукурузы с применением XvSAP1
Был сконструирован стандартный вектор трансформации WHISKERS, в котором промотор Arabidopsis thaliana, Rd29A, был помещен в 5'-направлении от перестроенной последовательности кодирующей области XvSAPl по изобретению (SEQ ID NO:53). Данные последовательности были фланкированы PER5 Zea maize, 3' и 5'-нетранслируемыми областями, с целью стабилизации экспрессии перестроенной кодирующей области. Выборочная кассета pat (см., например, US 5648477), управляемая промотором актина1 риса, была помещена в 3'-направлении от экспрессионной кассеты XvSAP1.
Векторная ДНК расщеплялась соответствующими рестрикционными ферментами с целью высвобождения фрагмента, содержащего бактериальный ген устойчивости к ампициллину, присутствующий в остове вектора, и для продуцирования линейного фрагмента ДНК, подходящего для WHISKERS™-опосредованной трансформации. Очистка линейного фрагмента, содержащего XvSAP1 и экспрессионные кассеты pat, достигалась на уровне подготовки посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Данная ДНК для трансформации растения доставлялась в клеточные культуры суспензии Hi-II кукурузы посредством WHISKERS™-опосредованной трансформации (по существу, в соответствии с описанным в патентах США No. 5302523 и 5464765; публикации патента США No. 2008/0182332; и работе Petolino and Arnold (2009), (Methods Molec. Biol. 526:59-67).
3
Трансформанты были помещены в селективную среду, после чего трансформированные изоляты были получены в течение приблизительно 8 недель. Селективная среда представляла собой основанную на LS среду (минимальная среда LS, витамины N6, 1,5 мг/л 2,4-D, 0,5 г/л MES моногидрат (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты; PhytoTechnologies Labr.), 30,0 г/л сукрозы, 6 мМ L-пролина, 1,0 мг/л AgNO, 250 мг/л цефотаксима, 2,5 г/л геллановой камеди, pH=5,7), содержащую биалафос (Gold BioTechnology). Зародыши были перенесены в селективную среду, содержащую 3 мг/л биалафоса, пока не были получены зародышевые изоляты. Восстановленные изоляты насыщались путем переноса в свежую селективную среду через 2-недельные интервалы для регенерации и дальнейшего анализа.
-2
-1
-2
-1
Для регенерации культуры были перенесены в индукционную среду "28" (MS-соли и витамины, 30 г/л сукрозы, 5 мг/л бензиламинопурина, 0,25 мг/л 2, 4-D, 3 мг/л биалафоса, 250 мг/л цефотаксима, 2,5 г/л геллановой камеди, pH 5,7) на одну неделю в условиях низкой освещенности (14 мкEmc), затем на 1 неделю в условиях высокой освещенности (приблизительно 89 мкEmc). После этого ткани были перенесены в регенерационную среду "36" (такая же, как индукционная среда, за исключением отсутствия регуляторов роста растений). После того, как ростки достигали 3-5 см в длину, они переносились в стеклянные пробирки для культур, содержащие среду SHGA (соли и витамины Schenk и Hildebrandt (1972); PhytoTechnologies Labr.), 1,0 г/л мио-инозитола, 10 г/л сукрозы и 2,0 г/л геллановой камеди, pH 5,8) для обеспечения возможности дальнейшего развития побега и корней. Растения пересаживались в такую же почвенную смесь, как была описана выше в настоящем документе, и росли в теплице до цветения. Проводились контролируемые опыления для получения семян.
ПРИМЕР 14
Агробактериальная трансформация
Стандартные способы клонирования использовались при конструировании бинарных плазмид трансформации растений и экспрессии. Рестрикционные эндонуклеазы и ДНК-лигазу T4 получали из NEB. Подготовка плазмид выполнялась с использованием набора для подготовки плазмид NucleoSpin или набора NucleoBond AX Xtra Midi (оба поставляются компанией Macherey-Nagel) в соответствии с инструкциями производителей. Фрагменты ДНК очищались с использованием набора для очистки ПЦР QIAquick или набора для экстракции из геля QIAEX II (оба поставляются компанией Qiagen) после выделения геля.
Синтетические гены по изобретению могут быть синтезированы коммерческим поставщиком (например, DNA2.0, Menlo Park, CA) и поставлены в форме клонированных фрагментов в стандартных плазмидных векторах, или могут быть получены посредством стандартных манипуляций молекулярной биологии с другими конструкциями, содержащими соответствующие нуклеотидные последовательности.

В неограничивающем примере базовая стратегия клонирования может состоять в субклонировании полноразмерных кодирующих последовательностей (CDS) в плазмиду для экспрессии в растениях в сайтах рестрикции NcoI и SacI. Получающиеся в результаты растительные экспрессионные кассеты, содержащие соответствующую кодирующую область под управлением экспрессионных элементов растений (например, обеспечивающих экспрессию в растениях промоторов, детерминант 3'-концевой терминации транскрипции и добавления полиаденилирования и т.п.), субклонируются в бинарный плазмидный вектор с применением, например, технологии Gateway или стандартных процедур клонирования фрагментов с применением рестрикционных ферментов. Например, LR Clonase™ (Invitrogen) может быть использована для рекомбинации растительных экспрессионных кассет полноразмерного и модифицированного гена в бинарную плазмиду для трансформации растений, если применяется технология Gateway. Удобно использовать бинарный вектор трансформации растений, который содержит бактериальный ген, придающий устойчивость к антибиотику спектиномицину, когда плазмида присутствует в клетках E. coli и Agrobacterium. Также удобно использовать бинарный плазмидный вектор, который содержит имеющий возможность экспрессии в растениях селектируемый маркерный ген, который является функциональным в желаемых растениях-хозяевах. Примеры имеющих возможность экспрессии в растениях селектируемых маркерных генов включают, но не ограничиваются перечисленным, гены, которые кодируют ген аминогликозидной фосфотрансферазы (aphII) транспозона Tn5, который придает устойчивость к антибиотикам канамицину, неомицину и G418, а также гены, который кодируют устойчивость или резистентность к глифосату; гигромицину; метотрексату; фосфинотрицину (биалафосу), имидазолиновым, сульфонилмочевинным и триазолопиримидиновым гербицидам, таким как хлорсульфурон, бромоксинил, далапон и т.п.
Электро-компетентные клетки Agrobacterium tumefaciens, штамм Z707S (устойчивая к стрептомицину производная Z707; Hepburn et al., 1985, J. Gen. Microbiol. 131:2961-2969) приготовляются и трансформируются с применением электропорации (Weigel and Glazebrook, 2002, Arabidopsis: A Laboratory Manual). После электропорации, 1 мл жидкой среды YEP (г/л: дрожжевой экстракт, 10; пептон, 10; NaCl, 5) добавляется в кювету и суспензия клеток и YEP переносится в 15 мл пробирку для культур для инкубирования при 28° на водяной бане при постоянном перемешивании в течение 4 часов. Клетки наносятся на чашки с YEP и агаром (25 г/л) со спектиномицином (200 мкг/мл) и стрептомицином (250 мкг/мл), и чашки инкубируются в течение 2-4 дней при 28°. Хорошо разделенные одиночные колонии отбираются и наносятся на свежие чашки с YEP и агаром со спектиномицином и стрептомицином, как и ранее, и инкубируются при 28° в течение 1-3 дней.
Присутствие синтетической генной вставки в бинарном векторе трансформации растений подтверждается посредством ПЦР-анализа с использованием специфичных для вектора праймеров с шаблонной плазмидной ДНК, приготовленной из выбранных колоний Agrobacterium. Клеточная масса из 4 мл аликвоты 15 мл культуры, выросшей в течение ночи в YEP со спектиномицином и стрептомицином, как и ранее, извлекалась с использованием Qiagen Spin Mini Preps, в соответствии с инструкциями производителя. Плазмидная ДНК из бинарного вектора, использованного для электропорационной трансформации Agrobacterium, использовалась в качестве контроля. Реакция ПЦР выполняется с использованием ДНК-полимеразы Taq, поставляемой Invitrogen, в соответствии с инструкциями производителя в концентрациях 0,5X. Реакции ПЦР проводятся в термоциклере MJ Research Peltier, запрограммированном на следующие условия: шаг 1) 94° в течение 3 минут; шаг 2) 94° в течение 45 секунд; шаг 3) 55° в течение 30 секунд; шаг 4) 72° в течение 1 минуты на т.н.п. ожидаемой длины продукта; шаг 5) 29 раз повторяется шаг 2; шаг 6) 72° в течение 10 минут. Реакция поддерживается на 4° после проведения циклов. Продукты амплификации анализируются посредством электрофореза в агарозном геле {например, от 0,7% до 1% агарозы, вес/объем) и визуализируются посредством окрашивания этидия бромидом. Выбирается колония, ПЦР-продукт которой идентичен плазмидному контролю.
Альтернативно, плазмидную структуру бинарного вектора трансформации растений, содержащего вставку синтетического гена, получают путем фингерпринтингового отображения фрагментов рестрикции плазмидной ДНК, приготовленной из кандидатов-изолятов Agrobacterium с помощью стандартных методов молекулярной биологии, хорошо известных специалистам в области работы с Agrobacterium.
Специалистам в области получения трансформированных растений с помощью способов трансформации, опосредованной Agrobacterium, будет понятно, что могут быть с выгодой использованы другие штаммы Agrobacterium помимо Z707S, и выбор штамма может зависеть от вида растений-хозяев, подлежащих трансформации.
ПРИМЕР 15
Продуцирование инсектицидных белков в двудольных растениях
Трансформация Arabidopsis. Arabidopsis thaliana Col-01 трансформировался с применением способа погружения цветочных почек в суспензию (Weigel and Glazebrook, см. выше). Выбранная колония Agrobacterium использовалась для инокуляции от 1 мл до 15 мл культур жидкой среды YEP, содержащей соответствующие антибиотики для отбора. Культура инкубировалась в течение ночи при 28° с постоянным помешиванием на 220 об/мин. Каждая культура использовалась для инокуляции двух 500 мл культур жидкой среды YEP, содержащих соответствующие антибиотики для отбора, и новые культуры инкубировалась в течение ночи при 28° с постоянным помешиванием. Клетки осаждались центрифугированием приблизительно на 8700g в течение 10 минут при комнатной температуре, и получающийся в результате супернатант удалялся. Сгусток клеток мягко ресуспендировался в 500 мл инфильтрационной среды, содержащей: 1/2x солей Murashige и витамины B5 Skoog (Sigma-Aldrich)/Gamborg (Gold BioTechnology, St. Louis, MO), 10% (вес/объем) сукрозы, 0,044 мкМ бензиламинопурина (10 мкл/л исходного раствора 1 мг/мл в DMSO) и 300 мкл/л Silwet L-77. Растения с возрастом приблизительно 1 месяц окунались в среду на 15 секунд, при этом принимались меры по обеспечению погружения новейших соцветий. Затем растения укладывались на бок и накрывались (прозрачным или непрозрачным материалом) на 24 часа, промывались водой и размещались вертикально. Растения выращивались при 22°, со световым периодом 16 часов света/8 часов темноты. Приблизительно после 4 недель после погружения собирались семена.
2
Рост и отбор Arabidopsis. Свежесобранные семена T1 подсушивались в течение, по меньшей мере, 7 дней при комнатной температуре в присутствии влагопоглотителя. Семена суспендировались в 0,1% растворе агар/вода (Sigma-Aldrich) и затем стратифицировались при 4° в течение 2 дней. Для подготовки посадок смесь Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) в поддонах для проращивания размером 10,5 дюйм × 21 дюйм (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN) покрывалась мелким вермикулитом, подвергалась подпочвенному орошению питательной смесью Хогланда (Hoagland and Arnon, 1950) до увлажнения, затем допускалось дренирование в течение 24 часов. Стратифицированные семена высеивались на вермикулит и покрывались камерами для увлажнения (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canada) на 7 дней. Семена проращивались и растения росли в Conviron (модели CMP4030 или CMP3244; Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada) в условиях длинного дня (16 часов света/8 часов темноты) при интенсивности света 120-150 мкмоль/мс при постоянной температуре (22°) и влажности (40-50%). Растения сначала увлажнялись питательной смесью Хогланда и затем деионизированной водой для сохранения почвы влажной, но не сырой.
Камеры удалялись через 5-6 дней после посева, и растения опрыскивались веществом химического отбора для уничтожения растений, выросших из нетрансформированных семян. Например, если имеющий возможность экспрессии в растениях селектируемый маркерный ген, представленный в бинарном векторе трансформации растений, представляет собой ген pat или bar (Wehrmann et al., 1996, Nat. Biotech. 14: 1274-1278), то трансформированные растения могут быть отобраны путем распыления 1000X раствора Finale (5,78% гюфосинат аммония, Farnam Companies Inc., Phoenix, AZ). Два следующих опрыскивания выполняются через 5-7 дневные интервалы. Выжившие (продолжающие активно расти) растения идентифицировались через 7-19 дней после последнего опрыскивания и пересаживались в горшки, подготовленные с использованием Sunshine Mix LP5. Пересаженные растения накрывались камерами для увлажнения на 3-4 дня и помещались в Conviron при указанных выше условиях роста.
Специалистам в области трансформации двудольных растений будет понятно, что существуют другие способы отбора трансформированных растений, в которых используются другие имеющие возможность экспрессии в растениях селектируемые маркерные гены (например, гены устойчивости к гербицидам).
Определение биологической активности трансгенных Arabidopsis против насекомых. Было продемонстрировано, что трансгенные линии Arabidopsis, экспрессирующие белки Cry, имеют активность против чувствительных к ним видов насекомых, при анализе методом наслаивания в питательной среде. Белки, извлеченные из трансгенных и нетрансгенных линий Arabidopsis, количественно оценивались посредством соответствующих способов, и объемы проб настраивались с целью нормализации концентрации белка. Определение биологической активности проводилось в искусственной питательной среде, как описано выше. Нетрансгенный Arabidopsis и/или буфер и вода включались в исследования в качестве контрольных проверочных обработок.
ПРИМЕР 16
Агробактериальная трансформация для создания супербинарных векторов
Супербинарную систему Agrobacterium удобно использовать для трансформации однодольных растений-хозяев. Способы конструирования и проверки супербинарных векторов подробно изложены и включены в настоящее описание посредством ссылки (руководство пользователя по плазмиде pSB1, версия 3.1, от компании Japan Tobacco, Inc., Tokyo, Japan). Стандартные методы молекулярной биологии и микробиологии применяются для создания супербинарных плазмид. Верификация/проверка структуры супербинарной плазмиды выполняется с применением способов, описанных выше для бинарных векторов, и может быть модифицирована в соответствии с предложенным в руководстве пользователя по плазмиде pSB1.
ПРИМЕР 17
Продуцирование инсектицидных белков в однодольных растениях
1
2
Опосредованная Agrobacterium трансформация кукурузы. Семена скрещивания F High II (Armstrong et al., 1991, Maize Genet. Coop. Newsletter 65:92-93) высаживались в 5-галлонные горшки, содержащие смесь 95% беспочвенной среды Metro-Mix 360 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) и 5% глинистой/суглинистой почвы. Растения выращивались в теплице с применением комбинации натриевых ламп высокого давления и металло-галогеновых ламп со световым периодом 16:8 свет:темнота. Для получения незрелых зародышей F для трансформации выполнялись контролируемые клональные опыления. Незрелые зародыши изолировались через 8-10 дней после опыления, когда зародыши имели размер приблизительно от 1,0 до 2,0 мм.
3
Инфицирование и совместное культивирование. Початки кукурузы подвергались поверхностной стерилизации путем чистки жидким мылом, погружения в 70% этанол на 2 минуты и последующего погружения в 20% промышленный отбеливатель (0,1% гипохлорит натрия) на 30 минут, и затем промывались стерильной водой. Суспензия клеток Agrobacterium, содержащих супербинарный вектор, приготовлялась путем переноса 1-2 поколений бактерий, выросших на твердой среде YEP, содержащей 100 мг/л спектиномицина, 10 мг/л тетрациклина и 250 мг/л стрептомицина при 28° на 2-3 дня в 5 мл жидкой инфекционной среды (базовая среда LS (Linsmaier and Skoog, 1965, Physiol. Plant. 18: 100-127), витамины N6 (Chu et al, 1975, Scientia Sinica 18:659-668), 1,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D), 68,5 г/л сукрозы, 36,0 г/л глюкозы, 6 мМ L-пролина, pH 5,2), содержащей 100 мкМ ацетосирингона. Раствор перемешивался на вортексе до получения однородной суспензии, и концентрация может быть подобрана для конечной плотности, составляющей около 200 единиц Клетта, с применением колориметра Клетта-Саммерсона с фиолетовым фильтром, или оптической плотностью приблизительно 0,4 на 550 нм. Незрелые эмбрионы выделялись непосредственно в микроцентрифужную пробирку, содержащую 2 мл инфекционной среды. Среда удалялась и заменялась на 1 мл раствора Agrobacterium с плотностью, составляющей 200 единиц Клетта, и раствор, содержащий Agrobacterium и зародыши, инкубировался в течение 5 минут при комнатной температуре, и затем переносился в среду для совместного культивирования (базовая среда LS, витамины N6, 1,5 мг/л 2,4-D, 30,0 г/л сукрозы, 6 мМ L-пролина, 0,85 мг/л AgNO, 100 мкМ ацетосирингона, 3,0 г/л геллановой камеди (PhytoTechnology Laboratories, Lenexa, KS), pH 5,8) на 5 дней при 25° в темноте.
3
После совместного культивирования зародыши переносились на селективную среду, после чего трансформированные изоляты получали в течение приблизительно 8 недель. Для отбора тканей кукурузы, трансформированных с использованием супербинарной плазмиды, содержащей экспрессируемый в растениях селектируемый маркерный ген pat или bar, применялась основанная на LS среда (базовая среда LS, витамины N6, 1,5 мг/л 2,4-D, 0,5 г/л MES (моногидрат 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты; PhytoTechnologies Labr.), 30,0 г/л сукрозы, 6 мМ L-пролина, 1,0 мг/л AgNO, 250 мг/л цефотаксима, 2,5 г/л геллановой камеди, pH 5,7) с биалафосом (Gold BioTechnology). Зародыши переносились на селективную среду, содержащую 3 мг/л биалафоса, до тех пор, пока не были получены изоляты зародышей. Восстановленные изоляты объединялись путем переноса на свежую селективную среду в 2-недельные интервалы для регенерации и дальнейшего анализа.
Специалистам в области трансформации кукурузы будет понятно, что существуют другие способы отбора трансформированных растений, в которых применяются другие имеющие возможность экспрессии в растениях селектируемые маркерные гены (например, гены устойчивости к гербицидам).
-2
-1
-2
-1
Регенерация и получение семян. Для регенерации культуры переносились в индукционную среду "28" (MS-соли и витамины, 30 г/л сукрозы, 5 мг/л бензиламинопурина, 0,25 мг/л 2, 4-D, 3 мг/л биалафоса, 250 мг/л цефотаксима, 2,5 г/л геллановой камеди, pH 5,7) на одну неделю в условиях низкой освещенности (14 мкEmc), затем на 1 неделю в условиях высокой освещенности (приблизительно 89 мкEmc). После этого ткани были перенесены в регенерационную среду "36" (такая же, как индукционная среда, за исключением отсутствия регуляторов роста растений). После того, как ростки достигали 3-5 см в длину, они переносились в стеклянные пробирки для культур, содержащие среду SHGA (соли и витамины Schenk и Hildebrandt (1972); PhytoTechnologies Labr.), 1,0 г/л мио-инозитола, 10 г/л сукрозы и 2,0 г/л геллановой камеди, pH 5,8) для обеспечения возможности дальнейшего развития побега и корней. Растения пересаживались в такую же почвенную смесь, как была описана выше в настоящем описании, и росли в теплице до цветения. Проводились контролируемые опыления для получения семян.
Альтернативно, бинарные векторы могут применяться для получения трансгенных растений кукурузы, который содержат один или более химерных генов, стабильно встроенных в геном растения и содержащих кодирующую область, описанную в настоящей заявке. Например, растения, содержащие, по меньшей мере, одну кодирующую область из SEQ ID NO:5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65 или 71, получают после опосредованной Agrobacterium трансформации. Способы трансформации растений, в которых применяются бинарные векторы трансформации, известны в технике. В одном из вариантов осуществления трансформированные ткани отбираются по их способности к росту в содержащей галоксифоп среде, и исследуются на предмет продуцирования белков при необходимости.
Стерилизация початков и выделение зародышей. Незрелые зародыши кукурузы были получены из растений Zea mays инбредной линии B104, выращенных в теплице, и самоопыленных или клонально опыленных для получения початков. Початки собирались приблизительно через 9-12 дней после опыления. В день эксперимента очищенные от оберток початки подвергались поверхностной стерилизации посредством погружения в 20% раствор гипохлорита натрия (6,15%) и встряхивания в течение от 20 до 30 минут, после чего проводилось трехкратное ополаскивание в стерильной воде. После стерилизации незрелые зиготные зародыши (от 1,5 до 2,4 мм) стерильно вырезались из каждого початка и случайным образом распределялись по микроцентрифужным пробиркам, содержащим жидкую среду для инокуляции. Среда для инокуляции содержала: 2,2 г/л MS-солей (Frame et al, 2011, Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN: Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe and E. C. Yeung, (Eds), SPRINGER SCIENCE AND BUSINESS MEDIA, LLC. pp 327-341); 1X ISU модифицированные MS-витамины (Frame et al, 2011 см. выше); 68,4 г/л сукрозы; 36 г/л глюкозы; 115 мг/л L-пролина; 100 мг/л мио-инозитола; и 200 мкМ ацетосирингона (приготовленного в DMSO); при pH 5,4. В указанном множестве экспериментов зародыши из объединенных в группу початков использовались для каждой трансформации.
Стимулирование культур Agrobacterium. Содержащийся в глицерине штамм Agrobacterium DAt13192 (международная PCT-публикация No. WO2012016222(A2)), содержащий бинарный вектор трансформации pDAB111440 (пример 1) наносился на чашки с минимальной средой AB (Watson, et al, (1975) J. Bacteriol. 123:255-264), содержащей соответствующие антибиотики, и выращивался при 20°C в течение от 3 до 4 дней. Единичная колония собиралась и наносилась на чашки с YEP (г/л: дрожжевой экстракт, 10; пептон, 10; NaCl 5), содержащие те же самые антибиотики, и инкубировалась при 20°C в течение 1-2 дней.
550
3
-2
-1
Культуры Agrobacterium и совместное культивирование. Культуры Agrobacterium брались с чашек YEP, суспендировались в 10 мл среды для инокуляции в 50 мл одноразовой пробирке, и плотность клеток подбиралась для значения OD от 0,2 до 0,4 (оптическая плотность, измеренная при 550 нм; мера роста клеток) с применением спектрофотометра. Культуры Agrobacterium инкубировались на ротационном шейкере при 125 об/мин (комнатная температура) во время выполнения разрезания зародышей. Незрелые зиготные зародыши (ранее выделенные из стерилизованных зерен кукурузы и помещенные в 1 мл среды для инокуляции) однократно промывались в той же среде. Два мл суспензии Agrobacterium было добавлено к каждой пробирке с зародышами, и пробирки были помещены на платформу шейкера на время от 10 до 15 минут. Зародыши были перенесены в среду для совместного культивирования, ориентированы так, чтобы щиток зародыша смотрел вверх, и инкубировались при 25°C, при 24-часовом свете с интенсивностью 50 мкEmc в течение 3 дней. Среда для совместного культивирования содержала 4,33 г/л MS-солей; 1X ISU модифицированные MS-витамины; 30 г/л сукрозы; 700 мг/л L-пролина; 3,3 мг/л дикамбы в KOH (3,6-дихлор-o-анисовая кислота или 3,6-дихлор-2-метоксибензойная кислота); 100 мг/л мио-инозитола; 100 мг/л ферментного гидролизата казеина; 15 мг/л AgNO; 100 мкМ ацетосирингона в DMSO; и 3 г/л GELZAN™ (SIGMA-ALDRICH); при pH 5,8.
-2
-1
-2
-1
-2
-1
3
Отбор каллуса и регенерация для предполагаемых случаев. После периода совместного культивирования зародыши переносились на среду покоя и инкубировались при 24-часовом свете с интенсивностью 50 мкEmc в течение 3 дней. Среда покоя содержала 4,33 г/л MS-солей; 1X ISU модифицированные MS-витамины; 30 г/л сукрозы; 700 мг/л L-пролина; 3,3 мг/л дикамбы в KOH; 100 мг/л мио-инозитола; 100 мг/л ферментного гидролизата казеина; 15 мг/л AgNO; 0,5 г/л MES - моногидрата (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты; PHYTOTECHNOLOGIES LABR.; Lenexa, KS); 250 мг/л карбенициллина; и 2,3 г/л GELZAN™; при pH 5,8. Зародыши переносились в селективную среду 1 (которая состояла из среды покоя (см. выше) с 100 нМ R-галоксифоповой кислоты (0,0362 мг/л)), и инкубировались в темноте и/или при 24-часовом свете с интенсивностью 50 мкEmc в течение от 7 до 14 дней при 28°C. Размножающиеся зародышевые каллусы переносились на селективную среду 2 (которая состояла из среды покоя (см. выше) с 500 нМ R-галоксифоповой кислоты (0,1810 мг/л)), и инкубировались при 24-часовом свете с интенсивностью 50 мкEmc в течение от 14 до 21 дней при 28°C. Данный этап отбора позволял осуществляться дальнейшему размножению и дифференциации трансгенного каллуса.
-2
-1
-2
-1
-2
-1
3
Размножающиеся зародышевые каллусы переносились на пререгенерационную среду и культивировались при 24-часовом свете с интенсивностью 50 мкEmcв течение 7 дней при 28°C. Пререгенерационная среда содержала 4,33 г/л MS-солей; 1X ISU модифицированные MS-витамины; 45 г/л сукрозы; 350 мг/л L-пролина; 100 мг/л мио-инозитола; 50 мг/л ферментного гидролизата казеина; 1,0 мг/л AgNO; 0,25 г/л MES; 0,5 мг/л нафталинуксусной кислоты в NaOH; 2,5 мг/л абсцизовой кислоты в этаноле; 1 мг/л 6-бензиламинопурина; 250 мг/л карбенициллина; 2,5 г/л GELZAN™; и 500 нМ R-галоксифоповой кислоты; при pH 5,8. Зародышевые каллусы с похожими на побеги почками переносились на регенерационную среду и культивировались при 24-часовом свете с интенсивностью 50 мкEmc в течение 7 дней. Регенерационная среда I содержала 4,33 г/л MS-солей; 1X ISU модифицированные MS-витамины; 60 г/л сукрозы; 100 мг/л мио-инозитола; 125 мг/л карбенициллина; 3,0 г/л GELZAN™; и 500 нМ R-галоксифоповой кислоты; при pH 5,8. Небольшие побеги с первичными корнями переносились в среду побегов/корней в PHYTATRAYS (PHYTOTECHNOLOGIES LABR.; Lenexa, KS) и инкубировались в условиях 16:8 ч свет:темнота при интенсивности света от 140 до 190 мкEmcв течение 7 дней при 27°C. Среда побегов/корней содержала 4,33 г/л MS-солей; 1X ISU модифицированные MS-витамины; 30 г/л сукрозы; 100 мг/л мио-инозитола; 3,5 г/л GELZAN™; при pH 5,8. Предполагаемые трансгенные проростки анализировались относительно числа копий трансгена посредством количественной ПЦР в реальном времени или других стандартных методик молекулярного анализа, и переносились в почву.
0
Перенос и укоренение растений T в теплице для получения семян.
Трансформированные растительные ткани, отобранные по их способности к росту в среде, содержащей 500 нМ R-галоксифоповой кислоты, пересаживались в беспочвенную среду для роста METRO-MIX 360 (SUN GRO HORTICULTURE) и закаливались в фитотроне. Растения пересаживались в почвенную смесь SUNSHINE CUSTOM BLEND 160 и выращивались в теплице до цветения. Проводились контролируемые опыления для получения семян.
0
Образцы тканей листьев отобранных растений T собирались на стадиях от V-3 до V-5. Два образца листьев диаметром 6 мм хранилось в 96-луночной подставке для кассетных пробирок при -80°C до дня анализа. Два стальных буферных основания DAISY™ и 200 мкл экстракционного буфера (раствор PBS, содержащий 0,05% Tween 20 и 5 мкл/мл смеси ингибитора протеазы SIGMA (каталожный номер 9599)) добавлялись к каждой пробирке. Образцы перемалывались в шаровой мельнице KLECO (Visalia, CA) в течение 3 минут на максимальной скорости. Образцы центрифугировались на 3000g в течение 5 минут, затем 100 мкл супернатанта переносилось в пустую пробирку для образцов. Еще 100 мкл экстракционного буфера добавлялось к растительному образцу, и осуществлялось перемалывание на шаровой мельнице в течение дополнительных 3 минут. После повторного центрифугирования 100 мкл данного экстракта объединялось с первыми 100 мкл. Объединенные супернатанты смешивались и анализировались в день экстракции.
Белки, экстрагированные из измеренных областей ткани листа, анализировались на предмет экспрессии белка Cry1Fa и белка AAD-1 посредством стандартного ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) или иммуноблоттинга белков (вестерн-блоттинг). Для обнаружения белка Cry1Fa посредством ELISA использовались реагенты из набора ENVIROLOGIX для ELISA (каталожный номер AP 016 NW V10; Portland, ME) в соответствии с инструкциями производителя. Обнаружение AAD-1 выполнялось посредством стандартных методик ELISA (например, в соответствии с изложенным в Ausubel et al. (1995 и обновления), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York) с использованием антител кролика, приготовленных против очищенного белка AAD-1.
Результаты ELISA, полученные для экстрактов трансформированных pDAB111440 растений, изложены в таблице 29. Уровни белков выражены в нг искомого белка, обнаруженного на 1 квадратный сантиметр собранной области листа.
Таблица 29
Уровни экспрессии белков Cry1Fa и AAD-1, экстрагированных из растений кукурузы, трансформированных с помощью плазмиды pDAB111440, в соответствии с определенным посредством методов ELISA
Идентификатор образца
Cry1Fa, нг/см<sup>3</sup>
AAD-1, нг/см<sup>3</sup>
111440[3]-001.001
2,30
14,0
111440[3]-015.001
3,80
0,0
111440[3]-023.001
3,80
320,0
111440[3]-020.001
5,40
190,0
111440[3]-011.001
17,00
0,0
Экстракты белков пяти трансформированных с pDAB111440 растений, приведенные в таблице 29 (а также экстракт из нетрансформированного растения, использованного в качестве отрицательного контроля), были приготовлены в соответствии с описанным выше и зондировались с помощью антитела к Cry1Fa на иммуноблотах (вестерн-блоты). Процедуры иммуноблоттинга, по существу, соответствовали описанному в работе Gallagher et al. (2008; Immunoblotting and Immunodetection. Current Protocols in Immunology 8.10.1 - 8.10.28). Образы белка (80 мкл) смешивались с 20 мкл буфера для образцов INVITROGEN NuPAGE LDS, нагревались при >90°C в течение пяти минут, загружались в 4-12% бис-трис гель INVITROGEN NuPAGE и запускались в подвижном буфере MOPS SDS (200 вольт в течение 45 минут). Двухцветные стандарты BIORAD PRECISION PLUS загружались на отдельную дорожку. Белки переносились на 0,2 мкМ нитроцеллюлозную мембрану посредством системы переноса геля INVITROGEN iBLOT в соответствии с инструкциями производителя. Мембрана блокировалась посредством смеси для блокирования INVITROGEN WESTERN BREEZE, затем осуществлялась реакция с первичным антителом (очищенное антитело кролика против Cry1F No. D0609RA07-A0; Strategic Diagnostics Inc., Newark, DE), и затем со вторым антителом (биотинилированное козье антитело против кролика, производства INVITROGEN). За этим следовал конъюгат HRP-стрептавидин производства INVITROGEN, и реагирующие полоски определялись посредством PIERCE SUPERSIGNAL WEST PICO LUMINOL ENHANCER AND STABLE PEROXIDE (No. 34080).
Дорожки с положительным контролем содержали 0,5 нг или 1,0 нг очищенного белка ядерного токсина Cry1Fa, продуцированного посредством экспрессии полноразмерной кодирующей области Cry1Fa в экспрессионной системе Pseudomonas fluorescens (см., например, заявку на патент США No.20100269223A1). Полноразмерный белок Cry1Fa обрабатывался трипсином с целью высвобождения сегмента ядерного токсина Cry1Fa с рассчитанным молекулярным размером 68 кДа, который использовался в качестве стандарта положительного контроля на иммуноблоте. Не было обнаружено полос реагирования с антителом в экстракте из растения отрицательного контроля, тогда как во всех пяти экстрактах из трансгенных растений содержалась единственная преобладающая полоса (приблизительно соответствующая по интенсивности контрольным белкам Cry1Fa) с оцененным размером несколько более 75 кДа.
Способы борьбы с насекомыми-вредителями. Когда насекомое взаимодействует с эффективным количеством токсина, доставляемым посредством экспрессии в трансгенном растении, результатом обычно является смерть насекомого, или насекомые не питаются в источнике, в котором токсины доступны насекомым.