Способ оценки качества биопрепаратов на основе грибов арбускулярной микоризы
METHOD FOR ASSESSING THE QUALITY OF BIOLOGICAL PRODUCTS BASED ON ARBUSCULAR MYCORRHIZA FUNGI

Область техники
Изобретение относится к биотехнологиям и может быть использовано при оценке эффективности и активности грибов арбускулярной микоризы (АМ) в биопрепаратах на их основе, обладающих рост-стимулирующим действием на растения и/или усиливающими их адаптивные свойства к стресс-факторам среды абиотической и биотической природы.
Данная биотехнология применима для биопрепаратов на основе АМ-грибов, используемых в сельском, городском и лесном хозяйстве, в областях растениеводства, целью ведения которого является: 1) устойчивый рост здоровых растений; 2) получение урожая; 3) получение экологически чистого растительного сырья; 4) устойчивое развитие природных и антропогенно-измененных экосистем; 5) сохранение растительного покрова сильно измененных урбанизированных территорий; 6) рекультивация нарушенных земель, содержащих высокий уровень вредных веществ, например, тяжелых металлов.
Уровень техники
Известен способ производства биоудобрения, включающий, по меньшей мере, четыре стадии, а именно: i) получение чистых культур или материнских культур по меньшей мере одного из видов грибов арбускулярной микоризы; ii) приготовление биоудобрения, которое включает только одну из соответствующих чистых культур или материнских культур каждого из видов грибов арбускулярной микоризы, полученных на этапе i); iii) получение мультиспоровых культур каждого из видов грибов арбускулярной микоризы, полученных с использованием каждой из соответствующих чистых культур или материнских культур, полученных на стадии ii); и iv) приготовление биоудобрения, которое включает только одну или равные части смеси каждой из соответствующих многоспоровых культур видов грибов арбускулярной микоризы, полученных на предыдущем этапе (см WO 2020145834 A1, опуб. 16.07.2020). Недостатком способа является отсутствие как таковой оценки качества биопрепаратов на основе грибов арбускулярной микоризы.
Также известен способ оптимизации производства привитых саженцев винограда, включающий посадку саженцев винограда в почву школки, при этом перед посадкой саженцев в почву школки корни привитых виноградных саженцев замачивают на 50-60 минут в 2%-ном растворе биопрепарата, состоящего из 200 г почвенно-корневого субстрата при соотношении почвы и корней люцерны хмелевидной 1:1, 75% и более корней которой микоризовано штаммом гриба арбускулярной микоризы Glomus intraradices Shenck & Smith, депонированным в ВНИИСХМ под номером RCAM02146, и 1 л воды, где перед посадкой саженцев в почву школки корни привитых виноградных саженцев замачивают на 20-30 минут в приготовленном 2%-ном растворе биопрепарата на основе штамма гриба арбускулярной микоризы Glomus intraradices Shenck & Smith, депонированного в ВНИИСХМ под номером RCAM02146, и сразу после посадки дополнительно производится полив почвы 2%-ным раствором биопрепарата в районе корней из расчета 150-200 л на 1 га. (см. RU 2672381 С2, опуб. 14.11.2018). Изобретение позволяет оптимизировать почвенно-биотический комплекс виноградных школок, а также способствует формированию сбалансированного ризосферного микробиоценоза, что положительно влияет на восстановление почвенного плодородия, повышает биологическую продуктивность наземной части и ризогенез виноградных саженцев, увеличивая их приживаемость в школке в стрессовых средовых условиях на 9,5-19,0%; стандартность на 15,4-15,9% и в целом выход высококачественных стандартных саженцев на 20-25. При этом в известном способе также отсутствует оценка качества биопрепаратов на основе грибов арбускулярной микоризы.
Наиболее близким аналогом, взятым в качестве прототипа является cпособ экспресс-определения параметров симбиотического взаимодействия грибов арбускулярной микоризы и растения, включающий: а) применение в качестве тест-растения селектированного из полиморфного вида облигатно-микотрофного растения в условиях низкого содержания доступного фосфора; б) проведение стерильного относительно иных грибов арбускулярной микоризы вегетационного теста на симбиотическую эффективность анализируемого гриба арбускулярной микоризы; в) оценку параметров симбиотического взаимодействия, включая симбиотическую эффективность, или индексы микоризации, или их совокупность (см. RU 2528864 C2, опуб. 20.09.2014). Известный способ подразумевает оценку качества биопрепаратов на основе арбускулярной микоризы (АМ), но в нем не рассматривались точные сроки формирования наибольшей симбиотической эффективности АМ по показателям продуктивности, при этом оценка, как правило, проводилась в фазу цветения растений в период с 45 по 52 сут от инокуляции и посадки.
Сущность изобретения
Технический результат изобретения заключается в повышении точности оценки качества биопрепаратов на основе АМ-грибов при одновременном сокращении сроков такой оценки.
Medicago lupulina
Предлагаемый способ, как и прототип, включает модельную систему (линия MlS-1 ), блок оценки эффективности арбускулярной микоризы и оценки параметров микоризации, условия эксперимента - низкое содержание фосфора доступного в субстрате, параметры искусственного освещения.
M. lupulina
Главным отличием и преимуществом от существующего уровня техники является следующее: 1) точность характеристики «эффективный штамм гриба арбускулярной микоризы», «эффективный биопрепарат на основе гриба арбускулярной микоризы»; 2) меньшие сроки проведения анализа в фазу начала бокового ветвления (35-42 сут от посадки и инокуляции) в сравнении с учетом в фазу развитого цветения (см. Таблицу; стандартный анализ эффективности АМ на растениях  на 60-е сут от посадки и инокуляции, и, соответственно, менее дорогой анализ).
Medicago lupulina
Medicago lupulina
Согласно литературным данным анализ эффективности АМ стандартно проводится на  (исходных линиях дикого типа и на мутагенизированных линиях с отклонениями в развитии эффективной АМ) на 60-е сут от посадки и инокуляции в фазу развитого цветения (см. Юрков А.П., Якоби Л.М. Линии  с отклонениями в развитии эффективной арбускулярной микоризы. // Экологическая генетика. 2018. Т. 16. № 4. С. 61-74), что существенно позднее фазы начала бокового ветвления растения (на 3-4 недели).
Выявлена стадия развития растения-хозяина, а именно, начало бокового ветвления, на которой достигается максимум эффективности арбускулярной микоризы (АМ), когда наступают основные изменения в развитии симбиоза гриба и растения-хозяина, характеризующие развитие эффективного/неэффективного АМ-симбиоза. Это определяет характеристику АМ-гриба / биопрепарата на его основе: эффективный/неэффективный.
Medicago lupulina
Сущность изобретения заключается в том, что максимальные значения АМ-эффективности на сильно отзывчивой на микоризацию линии MlS-1  L. наблюдаются в период более ранний, а именно в момент перехода от фазы стеблевания к фазе бокового ветвления. Так, например, максимальная эффективность по содержанию фосфора в надземных частях растений наблюдается в фазу стеблевания на 35 сут от посадки. Наибольший рост эффективности по сырому весу корней и ряду других показателей наблюдается в период с фазы стеблевания на фазу бокового ветвления.
Именно данный период характеризуется наиболее важными перестройками в физиологии взаимодействия партнеров АМ-симбиоза, наблюдается изменение биохимических показателей - содержания фитогормонов цитокининов и ауксина (Юрков А.П., Лактионов Ю.В., Кожемяков А.П., Степанова Г.В. Анализ симбиотической эффективности бактериальных и грибных препаратов на кормовых травах по данным урожайности семян. // Кормопроизводство. 2017. №3. С. 16-21), а также изменение экспрессии ключевых генов углеводного метаболизма и транспорта фосфора.
M. lupulina
Таким образом, предлагается способ оценки качества биопрепаратов на основе грибов арбускулярной микоризы с применением модельной системы, включающей сильно отзывчивое на микоризацию растение (линия MlS-1 ), а также с применением точных сроков учета по фазе развития растения-хозяина в период перехода от фазы стеблевания к фазе бокового ветвления (начало бокового ветвления).
Ранее известный уровень знаний о симбиозе не позволял корректно оценить наибольшее значение симбиотической эффективности АМ, поскольку проводился в фазу цветения растения-хозяина, когда все показатели эффективности существенно снижались (см. Таблицу), это не позволило бы применить имеющийся способ для оценки качества биопрепаратов на основе АМ-грибов.
Ниже приведен пример, в котором проведен расчет значений симбиотической эффективности для всех ключевых фаз развития люцерны хмелевидной (развитие 1-го настоящего листа, развитие 2-го настоящего листа, начало стеблевания и развитие 3-го листа, стеблевание и развитие 4-го листа, начало бокового ветвления и развитие 5-го листа, начало цветения и развитие 6-7-го листа, плодоношение зелеными незрелыми плодами и развитие 8-9-го листа, зрелые плоды и развитие 10-11-го листа, зрелые плоды при отсутствии цветения и развитие 12-13-го листа, зрелые плоды при старении растения с пожелтением листьев и развитием 17-18-го листа).
Пример
Растительный и грибной материал.
Medicago lupulina
В качестве модельного растения для оценки симбиотической эффективности АМ используется сильно отзывчивая на микоризацию линия MlS-1 . Растения этой линии проявляют признаки карликовости при отсутствии инокуляции грибом AM при низком уровне доступного фосфора в почве.
Rhizophagus irregularis
Glomus intraradices
В качестве тестового гриба взят штамм RCAM00320  (из коллекции лаборатории экологии симбиотических и ассоциативных ризобактерий Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии). Штамм ранее был известен как  CIAM8, в 2018 году проведена его точная идентификация.
Plectranthus australis
Поскольку грибы AM являются облигатными симбионтами, то гриб поддерживали на накопительной культуре плектрантуса южного ( R.Br.) в стандартных условиях.
P. australis
P. australis
R. irregularis
P. australis
M. lupulina
Этапы приготовления грибкового инокулята: 1) черенки  подвергали поверхностной дезинфекции 0,5% гипохлоридом натрия в течение 60 мин, а затем трижды тщательно промывали стерильной водой в течение 30 мин; 2) обеззараженные черенки инокулировали двумя 10-миллиметровыми фрагментами корней  (содержащих около 100 везикул штамма  на 1 черенок) и высаживали в субстрат, описанный ниже в разделе «Условия роста растений»; 3) после 180 сут культивирования в условиях, описанных в разделе «Условия роста растений», корни накопительной культуры  были извлечены из субстрата, разрезаны на фрагменты длиной 10 мм и затем перемешаны; 4) для инокуляции модельных растений  в эксперименте использовали смешанный грибной инокулят, содержащий примерно из 100 везикул AM-гриба на 1 саженец.
Микровегетационный метод.
M. lupulina
M. lupulina
M. lupulina
2
4
Семена  подвергали поверхностной стерилизации следующим образом: скарификация в течение 5 мин в концентрированной HSO, а затем многократная промывка стерильной водой в течение 120 мин. Стерилизованные семена  помещали на стерильные бумажные фильтры в чашки Петри на 1 сут при +4 °С для стратификации. Затем семена  проращивали в течение 2 сут при температуре +27 °С в темноте. Саженцы одинакового размера высаживали в субстрат, описанный в разделе «Условия роста растений». Половина растений была инокулирована грибным инокулятом перед посадкой (+AM); другая половина не была обработана грибным инокулятом в качестве контроля (-AM). Для анализа случайным образом на каждой стадии развития растений брали по двадцать растений на обработку.
Растения были извлечены из почвы, а их корневые системы тщательно промыты. Определяли высоту растения, свежую массу надземных частей растений, количество и площадь листьев, число междоузлий.
Условия роста растений.
2
5
2
KCl
4 проростка были посажены в один сосуд, заполненный 210 г смеси «почва:песок» (2:1). Тип почвы - дерновоподзолистая, содержание PO - 25 мг/кг, KO - 78 мг/кг, содержание органического вещества - 3,64%, pH- 6,44. Субстрат для выращивания подвергали автоклавированию при температуре 134 °С, 2 атм. в течение 1 ч с повторной автоклавированием через 2 сут.
Таким образом, микровегетативный метод обеспечивает оптимальные условия для развития АМ и позволяет избежать спонтанного заражения ризобиями и другими симбиотическими микроорганизмами. Испытания проводились на ключевых этапах развития растения-хозяина: анализ растений проводили на 14, 21, 24, 29, 38, 45, 52, 66, 84 и 98-й сут после посадки и инокуляции в фазы развитие 1-го настоящего листа, развитие 2-го настоящего листа, начало стеблевания и развитие 3-го листа, стеблевание и развитие 4-го листа, начало бокового ветвления и развитие 5-го листа, начало цветения и развитие 6-7-го листа, плодоношение зелеными незрелыми плодами и развитие 8-9-го листа, зрелые плоды и развитие 10-11-го листа, зрелые плоды при отсутствии цветения и развитие 12-13-го листа, зрелые плоды при старении растения с пожелтением листьев и развитием 17-18-го листа, соответственно.
Оценка эффективности симбиоза AM.
Эффективность (ростовой отклик на микоризацию) рассчитывалась для параметров продуктивности растений по формуле Ю. Одума:
Е = ([+АМ] - [-АМ]) × 100%/[-АМ],
t
где E - симбиотическая эффективность АМ; [+АМ] - значение параметра продуктивности у растений с АМ (например, значение веса свежих надземных частей); [- АМ] - это значение параметров продуктивности контрольных растений без АМ. Достоверность различий средних значений показателей эффективности оценена с применением -критерия Стьюдента при P<0,01.
В Таблице представлены сведения о симбиотической эффективности в разные сроки учета.
Из таблицы можно видеть, что наибольшая эффективность зафиксирована в фазу начала бокового ветвления (38 сут). При этом ранее фиксируемая для оценки АМ-эффективность в фазу развитого цветения (52 сут) отличается от наибольшей в фазу начала бокового ветвления (38 сут) в 1,12 раза при расчете по сырому весу надземных частей, в 1,86 раза - по числу листьев на главном стебле, в 2,95 раза - по высоте стебля, в 1,46 раза - по числу междоузлий на главном стебле, в 1,97 раза - по площади листьев. Таким образом, предложенный способ обладает явно более точной оценкой симбиотической эффективности АМ, причем при более раннем тестировании, чем предлагалось ранее.
Оценка качества должна проводиться в модельной тест-системе “отзывчивое растение - гриб арбускулярной микоризы (АМ)”.
Для точной оценки эффективности АМ (прибавки урожая) и оценки ее активности (показателей микоризации) необходимо выполнение 3-х условий:
Medicago lupulina
1) растение-хозяин с высоким и быстрым откликом на микоризацию - подобранная ранее высокомикотрофная линия MlS-1 люцерны хмелевидной (L.);
2) использование почвы с низким уровнем фосфора;
Medicago lupulina
3) важный элемент - то, что эффективность АМ сильно изменяется в процессе развития АМ и зависит от фазы развития. Так, в начале стеблевания растения (около 35 сут от посадки и инокуляции) растения люцерны обладают минимальной эффективностью, энергоресурсы растения-хозяина идут на развитие стебля с опережением этого развития по сравнению с контрольным вариантом без АМ. Но после начала его формирования наблюдается резкий рост эффективности по ряду показателей продуктивности и становление эффективного симбиоза с максимумом эффективности происходит к фазе бокового ветвления. Поэтому важно проводить оценку эффективности АМ не по сроку учета (день от посадки или инокуляции), а по фазе развития растения-хозяина. Первенство влияния фазы развития в сравнении со сроком учета было впервые показано в статье - Yurkov A., Puzanskiy R., Avdeeva G., Yacobi L., Gorbunova A., Kryukov A., Kozhemyakov A., Laktionov Y., Kosulnikov Y., Romanyuk D., Yemelyanov V., Shavarda A., Kirpichnikova A., Smolikova G., Shishova M. Mycorrhiza-induced alterations in metabolome of  leaves during symbiosis development. // Plants 2021, 10. Так, по результатам метаболомного профилирования с проведением факторного и кластерного анализа выявленных 320 метаболитов листьев показана более высокая зависимость метаболома от фазы развития растения-хозяина в сравнении со сроком учета и с влиянием самой АМ.
M. lupulina
В результате применения изобретения возможна точная сравнительная оценка биопрепаратов - усилителей роста растений по основным параметрам симбиотической эффективности, выраженным в усилении роста растения-хозяина, а именно таких параметров как: сырой вес надземных частей растений, число листьев, междоузлий, площадь листьев, высота главного стебля. Впервые выявлено, что симбиотическая эффективность АМ лучше всего оценивать на сильно отзывчивом на микоризацию растении - селектированной автором линии MlS-1  с учетом параметров продуктивности в фазу начала бокового ветвления (~38 сут от посадки и инокуляции) в условиях низкого доступного для питания растений фосфора в субстрате.
Актуальность и наличие спроса на анализ биопрепаратов на основе АМ-грибов и лабораторных инокулянтов объясняется тем, что в последние 5 лет наблюдается выход на российский рынок зарубежных АМ-биопрепаратов, а также разработка и появление на рынке АМ-препаратов российского производства. В связи с этим применение данного изобретения является промышленно применимым и будет востребованным.
Технический результат изобретения заключается в повышении точности оценки качества биопрепаратов на основе АМ-грибов при одновременном сокращении сроков такой оценки.
Таблица.
Medicago lupulina
Rhizophagus irregularis
Эффективность арбускулярной микоризы (%) у сильно отзывчивой на микоризацию линии MlS-1  при инокуляции эффективным грибом шт. RCAM00320
Срок, сут от посадки и инокуляции
Фаза развития растения
Эффективность рассчитана по сырому весу надземных частей, %
Эффективность рассчитана по числу листьев на главном стебле, %
Эффективность рассчитана по высоте главного стебля, %
Эффективность рассчитана по числу междоузлий на главном стебле, %
Эффективность рассчитана по площади листьев, %
14
развитие 1-го настоящего листа
0,8
±
2,1
0,0
±
0,0
0,0
±
0,0
0,0
±
0,0
0,6
±
4,5
21
развитие 2-го настоящего листа
55,0
±
5,0
53,0
±
8,3
0,0
±
0,0
0,0
±
0,0
98,7
±
7,9
24
начало стеблевания, развитие 3-го листа
65,3
±
5,2
13,7
±
3,2
0,0
±
0,0
0,0
±
0,0
57,5
±
7,1
29
стеблевание, развитие 4-го листа
72,4
±
8,9
8,6
±
3,0
119,4
±
9,3
43,7
±
6,8
74,5
±
7,6
38
начало бокового ветвления, развитие 5-го листа
95,0
±
5,4
39,5*
±
2,6
203,4*
±
3,9
51,5*
±
2,6
164,7*
±
8,7
45
начало цветения, развитие 6-7-го листа
89,3
±
7,9
31,2
±
3,7
104,4
±
4,5
43,8
±
3,8
162,7
±
11,4
52
зеленые плоды, цветение, развитие 8-9-го листа
85,1
±
9,6
21,2
±
3,7
69,0
±
3,0
35,4
±
4,6
83,7
±
12,0
66
зрелые плоды, цветение, развитие 10-11-го листа
69,7
±
9,5
17,1
±
8,5
36,3
±
4,1
8,6
±
4,3
41,6
±
12,4
84
зрелые плоды, развитие 12-13-го листа
68,3
±
11,2
8,9
±
8,1
4,8
±
6,7
13,8
±
4,9
37,5
±
13,7
98
зрелые плоды, старение растения, пожелтение листьев, развитие 17-18-го листа
66,1
±
3,2
6,9
±
7,5
2,6
±
4,2
7,1
±
2,5
10,5
±
13,4
203,4*
Примечание: представлены средние значения (выборка - 20 растений) и ошибки средней.  - значения достоверно (P<0.01) выше на 38 сут в сравнении со значением на 52 сут