УСТРОЙСТВО ДЛЯ ДИСТАНЦИОННОЙ ДОСТАВКИ ВАКЦИН И ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ
REMOTE VACCINE AND VETERINARY PREPARATION DELIVERY SYSTEM

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к устройствам для дистанционной доставки животным вакцин, а также лекарственных, профилактических, обездвиживающих и иных ветеринарных препаратов.
Проблема вакцинации диких животных с целью профилактики зоонозов и предотвращению передачи этих инфекций сельскохозяйственным животным и человеку всегда имела большое значение и актуальность. Все большее вторжение человека в мир дикой природы усугубляет значение этой проблемы.
Для эффективной профилактики инфекционных болезней в дикой природе необходимо наличие двух компонентов: 1) эффективной и безопасной для животных вакцины и 2) эффективного и безопасного для человека метода доставки вакцин диким животным.
В настоящее время существует несколько методов дистанционной доставки лекарственных и профилактических препаратов как индивидуальному животному, так и популяциям животных. К ним относятся подкормки, аэрозоли, дротики, имплантаты, биопули и т.д. Каждый из них имеет свои достоинства и недостатки.
Использование таких методов, как подкормка и аэрозольная доставка, не позволяет контролировать выход действующего вещества, точную его дозировку и доставку конкретному целевому животному. Кроме того, использование указанных методов, так же как использование дротиков и приспособлений для отлова и фиксации животных (для введения имплантатов), не отвечает требованию минимизации воздействия на окружающую среду и на поведение природных стад диких животных.
В соответствии с этим использование таких методов дистанционной доставки лекарственных и профилактических препаратов животному запрещено во многих районах, особенно в заповедниках и других природоохраняемых районах.
Уровень техники
Учитывая вышеизложенное, наиболее приемлемым методом дистанционной доставки вакцин и других ветеринарных препаратов может быть метод с использованием пуль.
Безопасное для человека расстояние, необходимое для гарантированной доставки вакцины, зависит от вида животного. Для большинства диких животных оно составляет не менее 60-80 метров, а для пугливых видов животных - оленей, лосей, косуль и др. - еще больше.
В настоящее время для доставки биологических и ветеринарных препаратов домашним и диким животным применяются рассасывающиеся биопули калибра 0.25 (6,43 мм диаметр) и 0.20 (5,08 мм) [1-4].
Такие биопули состоят из наружного рассасывающегося контейнера, содержащего биологический материал в виде твердой, полутвердой или жидкой формы. Основными компонентами контейнера, который при опрессовке под высоким давлением становится твердым, подобно пластику, являются гидроксипропилцеллюлоза и карбонат кальция.
При вхождении в животное и контакте с тканевыми жидкостями контейнер растворяется и полностью расплавляется в течение 24 ч. В зависимости от состава препаративной формы вакцины или лекарственные вещества, помещенные в полость пули, имеют различную скорость растворения. В настоящее время производятся пули, способные доставлять 125-300 мг полезного груза.
Биопули обычно доставляются с помощью ружья, для стрельбы из которого необходим сжатый воздух. Существенным недостатком таких биопуль является то, что максимальная дальность их полета составляет в среднем 25 м, что совершенно недостаточно для безопасности персонала, проводящего вакцинацию. Кроме того, для хранения сжатого воздуха требуется специальная емкость, которая соединена с ружьем шлангом и которую необходимо транспортировать вместе с ним, что является крайне неудобным. К недостаткам следует отнести также возможные трудности при заполнении емкости газом.
Известна пуля (прототип) для иммобилизации (обездвиживания) животных [5], которая представляет собой полое тело, один конец которого открыт, а другой закрыт. На корпусе вышеназванного тела расположены направляющие, простирающиеся во взаимно перпендикулярных направлениях, по которым происходит деформация вышеназванного тела в результате удара о животное.
Внутрь полого тела помещается твердая обездвиживающая субстанция и средство для уплотнения, после чего открытый конец закрывается баллистической головкой.
Пуля-прототип выполнена из свинца, имеет калибр 5,6 мм и позволяет доставлять твердый препарат на расстояние 60-80 м, не нанося существенной травмы животному.
Недостатками пули по прототипу являются:
1) небольшой объем полости для вложения биологического материала, что позволяет использовать только твердые препараты и не позволяет использовать препараты в жидкой форме, поскольку они занимают больший объем, а вместить необходимую для животного дозу жидкого препарата в ограниченный объем полости не представляется возможным (например, необходимую дозу вакцины);
2) невозможность использования пули для доставки живых вакцин, поскольку материал пули (свинец) обладает токсичностью по отношению к живым бактериальным клеткам или вирусному материалу.
Раскрытие изобретения
11
Задача, стоявшая при создании предлагаемого технического решения, заключалась в создании баллистического устройства (пули), позволяющего с безопасного расстояния (не менее 80 м) осуществить доставку необходимой иммунизирующей дозы вакцины (не менее 10 клеток), сохранив ее жизнеспособность, обеспечив при этом минимальное повреждение животного, а также быстрое и полное высвобождение препарата в ткани животного.
3
Поставленная задача решается тем, что для дистанционной доставки вакцины предложено устройство, представляющее собой свинцовую пулю калибра 5,6 мм, внутри которой без изменения внешних размеров пули создается полость объемом 0,03-0,09 см, служащая контейнером для живой вакцины или ветеринарного препарата. Снизу полость закрыта перегородкой, которая обеспечивает сохранение содержимого пули и защищает его от воздействия пороховых газов при выстреле.
После заполнения полость сверху закрывают головкой из нетоксичного пластичного материала (например, пластилина или парафина), которая не позволяет вытекать содержимому полости и обеспечивает прямолинейность полета пули.
Если устройство используют для доставки живой вакцины, то для сохранения ее жизнеспособности на внутреннюю поверхность полости тонким слоем (0,01-0,02 мм) наносят нетоксичный защитный состав, например пищевой лак, фторполимерный лак, (0,5%-1%) агар и др.
Для изготовления заявленного устройства может быть использована пуля калибра 5,6 мм заводского производства (далее: стандартная пуля калибра 5,6 мм).
Краткое описание чертежей
На чертеже представлена заявляемая пуля в продольном разрезе.
Осуществление изобретения
Представленная пуля состоит из корпуса 1, полости 2 для вложения препарата, которая снизу имеет перегородку 3. Открытый конец полости 2 герметично закрыт головкой 4, имеющей выпуклую форму, а внутренняя поверхность полости покрыта защитным слоем 5. Перегородка 3 имеет вогнутую форму (может иметь также плоскую и конусовидную формы).
В полость 2 помещается живая вакцина или ветеринарный препарат, которые могут занимать всю полость либо ее часть, затем полость герметично закрывается головкой 4.
Пуля помещается в дульце гильзы и используется для зарядки ружья под мелкокалиберный патрон 5,6 мм. Для закрепления и фиксации пули в дульце гильзы на корпусе стандартной пули калибра 5,6 мм, внутри которой создается полость, имеется поперечная кольцевая канавка 6 (каннелюра) с гладкой или рифленой поверхностью. Фиксация предотвращает смещение пули, вдавливание пули в гильзу под действием отдачи.
Для осуществления баллистической иммунизации производится однократный выстрел в целевое животное с расстояния 80-100 м.
При стрельбе такими пулями необходимо целиться в крупные мышцы конечностей животного (бедро или область крупа). При попадании в цель в мышечной ткани животного свинцовый корпус пули, имеющий тонкие стенки, начинает деформироваться (сплющиваться или разрываться на мелкие фрагменты), высвобождая содержимое пули в окружающую мышечную ткань. Обычная глубина проникновения пули в мышечные ткани животного при стрельбе с расстояния 80-100 м составляет 3-5,5 см. Сама пуля или ее фрагменты остаются в тканях животного и не беспокоят его. Раны от воздействия пули небольшие и заживают в течение нескольких дней.
Создание внутри стандартной пули калибра 5,6 мм полости указанного объема без изменения ее внешних размеров позволяет:
- осуществить доставку необходимой иммунизирующей дозы вакцины или препарата;
- не нарушить баллистические характеристики пули и с расстояния 80-100 метров, добиться точного проникновения пули в целевой участок тканей животного на глубину 3-5,5 см (т.е. добиться минимального повреждения животного при введении вакцины в намеченный участок);
- добиться быстрого и полного высвобождения вакцины или ветеринарного препарата в ткани животного за счет сплющивания или распада на мелкие фрагменты утонченных стенок пули.
Заявляемая пуля позволяет сохранить жизнеспособность вакцины и доставить ее в оптимальной иммунизирующей дозе, что достигается как за счет нанесения на внутреннюю поверхность полости нетоксичного защитного слоя, так и за счет оптимизации толщины стенки модифицированной пули, которая оказывается достаточной для защиты от влияния повышенной температуры на выживаемость клеток вакцинного штамма в пуле при выстреле из ружья с различного расстояния, в то время как размер полученной полости дает возможность доставить животному необходимую дозу вакцины.
Сущность изобретения и его практическая применимость иллюстрируется примерами.
Пример 1. Подготовка пули к использованию
3
Полость делают вдоль продольной оси стандартной пули калибра 5,6 мм с использованием сверла диаметром 3,5 мм и сверлильного станка Einhell SB 1020/1W 42.507.85 с малым числом оборотов в минуту (около 120 об/мин). Для фиксации пули в станке используют зажимы, которые препятствуют расширению стенок пули в процессе сверления отверстия, т.е. увеличению калибра пули. При сверлении сверло опускают в пулю на глубину 8,5 мм, не доходя до основания пули, образуя, таким образом, полость объема 0,082 см, закрытую снизу перегородкой. Последняя обеспечивает сохранение и защиту содержимого полости от воздействия пороховых газов при выстреле.
Внутреннюю поверхность образовавшейся полости покрывают пищевым лаком ЭП-547 (состав (%): этилцеллозольв - 95, спирт этиловый - 5). С этой целью полость пули доверху заполняют лаком, затем пулю переворачивают и оставляют в течение 1 ч на воздухе для удаления лака и образования тонкой пленки. Толщина покрытия при этом составляет ~0,01±0,003 мм.
Пример 2. Определение жизнеспособности клеток В. abortus 82 в модифицированных пулях
Данный штамм вакцины наиболее часто применяется в России и странах СНГ.
12
Исходную музейную культуру вакцинного штамма В. abortus 82 выращивают на пептонно-печеночно-глюкозоглицериновом агаре течение 48 ч при температуре 37°С. Клетки смывают желатинно-сахарозной средой (сахароза 10%, желатин 1,5%) и доводят концентрацию до ~1×10 КОЕ/мл.
11
По 0,08 мл образовавшейся суспензии (содержащих дозу клеток 10 КОЕ) помещают в пули, подготовленные по примеру 1, без покрытия защитным составом (n=30, где n - количество подготовленных образцов) и покрытые защитным составом (n=30). Сверху полость закрывают головкой из парафина.
В качестве контроля такой же объем суспензии клеток помещают в пластиковые микропробирки (n=30). Пули и пробирки хранят при 4°С.
Через определенные промежутки времени из пуль извлекают суспензию клеток вакцинного штамма В. abortus 82, разводят в физиологическом растворе, делают последовательные десятикратные разведения и высевают на чашки с эритрит агаром. Посевы инкубируют при 37°С в течение 5 дней, после чего подсчитывают число выросших колоний.
Результаты экспериментов представлены в таблице 1.
Таблица 1
Сроки наблюдения (сутки)
Количество жизнеспособных клеток (КОЕ)
Микропробирки (контроль) (n=30)
Пуля без защитного покрытия (n=30)
Пули с защитным покрытием (n=30)
0
(11,2±2,2)×10<sup>10</sup>
(9,5±2,6)×10<sup>10</sup>
(9,4±2,6)×10<sup>10</sup>
2
(1,1±1)×10<sup>9</sup>
(0,66±0,04)×10<sup>9</sup>
(1,1±0,1)×10<sup>9</sup>
4
(5,6±0,4)×10<sup>8</sup>
(0,26±0,04)×10<sup>8</sup>
(3,7±0,2)×10<sup>8</sup>
6
(5,0±0,4)×10<sup>8</sup>
(0,15±0,08)×10<sup>8</sup>
(3,0±0,3)×10<sup>8</sup>
8
(4,8±0,3)×10<sup>8</sup>
(3,2±0,3)×10<sup>6</sup>
(3,2±0,2)×10<sup>8</sup>
10
(4,1±0,2)×10<sup>8</sup>
(1,6±0,2)×10<sup>5</sup>
(3,3±0,1)×10<sup>8</sup>
12
(4,2±0,2)×10<sup>8</sup>
(1,3±0,1)×10<sup>5</sup>
(3,0±0,2)×10<sup>8</sup>
Результаты показывают, что свинец, из которого сделана пуля, оказывает токсический эффект на клетки бруцелл вакцинного штамма В. abortus 82. Динамика выживаемости клеток бруцелл в пулях, покрытых защитным составом, практически не отличается от контроля.
Пример 3. Определение жизнеспособности клеток В. abortus 19 в модифицированных пулях
Этот штамм вакцины наиболее часто применяется в США, странах Северной, Латинской Америки и Европе.
Условия эксперимента аналогичны примеру 2. Результаты для суспензии клеток В. abortus 19 представлены в таблице 2.
Сравнивая показатели выживаемости клеток В. abortus 19, можно отметить, что в модифицированных пулях, покрытых защитным составом, количество живых клеток в течение 48 суток хранения при 4-6°С практически не изменялось и сравнимо с контролем (микропробирки). В пулях без покрытия защитным составом количество живых клеток существенно ниже.
Таблица 2
Сроки наблюдения (сутки)
Количество жизнеспособных клеток (КОЕ)
Микропробирки (контроль) (n=30)
Пуля без защитного покрытия (n=30)
Пули с защитным покрытием (n=30)
0
(109,8±3,2)×10<sup>9</sup>
(98±2,2)×10<sup>9</sup>
(110,8±2,5)×10<sup>9</sup>
5
(98,5±2,2)×10<sup>9</sup>
(0,71±0,02)×10<sup>9</sup>
(104,0±2,2)×10<sup>9</sup>
8
(105,3±1,6)×10<sup>9</sup>
(2,9±0,2)×10<sup>7</sup>
(108,0±1,1)×10<sup>9</sup>
11
(103,2±2,1)×10<sup>9</sup>
(5,5±0,8)×10<sup>5</sup>
(106,5±2,6)×10<sup>9</sup>
18
(103,0±1,8)×10<sup>9</sup>
(3,2±0,3)×10<sup>5</sup>
(104,3±1,5)×10<sup>9</sup>
26
(108,4±1,9)×10<sup>9</sup>
(2,0±0,2)×10<sup>5</sup>
(100,4±1,8)×10<sup>9</sup>
33
(106,6±3,0)×10<sup>9</sup>
(1,6±0,1)×10<sup>5</sup>
(98,20±3,7)×10<sup>9</sup>
48
(90,5±2,3)×10<sup>9</sup>
(6,8±0,3)×10<sup>4</sup>
(91,5±1,5)×10<sup>9</sup>
68
(82,05±1,9)×10<sup>9</sup>
(5,2±0,2)×10<sup>4</sup>
(80,5±2,4)×10<sup>9</sup>
Таким образом, покрытие внутренней поверхности полости пули защитным составом позволяет сохранить жизнеспособность клеток вакцинных штаммов различного происхождения внутри модифицированной пули.
Пример 4. Определение жизнеспособности клеток в пулях при выстрелах с различного расстояния
Известно, что в процессе выстрела пороховой заряд взрывается и почти одновременно выделяет пороховые газы, температура и высокое давление которых воздействуют на пулю. Действие пороховых газов продолжается и после вылета пули из канала ствола до тех пор, пока давление пороховых газов на дно пули не уравновесится сопротивлением воздуха. Кроме того, нагрев пули может происходить не только во время ее прохождения по каналу ствола ружья, но и при полете по воздуху в результате трения. В этой связи представлялось важным выяснение возможного влияния повышенной температуры на выживаемость клеток вакцинного штамма в пуле при выстреле из ружья с различного расстояния.
В экспериментах используют пули по примеру 1 (n=40), покрытые изнутри защитным составом и содержащие клетки вакцинного штамма В. abortus 82. Выстрелы проводят с расстояния 0,5 и 100 м в полипропиленовую трубу, заполненную стерильным физ. раствором. Количество живых клеток в пуле после выстрела определяют бактериологическим методом путем высева соответствующих разведений культуры штамма В. abortus 82. В качестве контроля используют содержимое нестреляной пули (n=20). Результаты экспериментов представлены в таблице 3.
Таблица 3
Эксперимент
Расстояние 0,5 м (n=20)
Расстояние 100 м (n=20)
концентрация КОЕ/мл (log)
концентрация КОЕ/пуля
концентрация КОЕ/мл (log)
концентрация КОЕ/пуля
Контроль
10,03±0,06
(8,98±1,35)×10<sup>8</sup>
9,01±0,03
(7,01±0,57)×10<sup>7</sup>
Опыт
9,95±0,06
(6,64±0,78)×10<sup>8</sup>
9,03±0,04
(7,22±0,63)×10<sup>7</sup>
Полученные данные показали, что статистически достоверной разницы между количеством живых клеток В. abortus 82 в пулях после выстрела и в пулях, не подвергшихся выстрелу, не обнаружено. Следовательно, сам выстрел, движение пули по стволу ружья и ее полет по воздуху оказывают минимальный эффект на выживаемость клеток штамма В. abortus 82, находящихся внутри заявляемой пули.
Пример 5. Определение пригодности модифицированной пули для доставки сухих препаратов
В эксперименте используют пули по примеру 1, но без покрытия внутренней поверхности полости пули защитным составом (n=10).
В полость засыпают по 20 мг сухого препарата (дитилин) для обездвиживания животного. Сверху полость закрывают головкой из пластилина. Выстрелы производят с расстояния 100 м в крупный рогатый скот.
Через 15 мин после попадания пули у животного наступал паралич. Таким образом, продемонстрирована возможность использования пули для доставки животным сухих препаратов на расстояние 100 м.
Пример 6. Определение точности попадания модифицированных пуль в мишень
Для проведения эксперимента используют пули по примеру 1 с незаполненной полостью (n=10) и содержащие по 0,08 мл суспензии клеток вакцинного штамма В. abortus 82 (n=10). В качестве контроля используют стандартную пулю калибра 5,6 мм. Выстрелы проводят из нарезного ружья калибра 5,6 мм на открытом воздухе с расстояния 100 м в бумажную мишень. Результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4
№
Конструкция пули
Отклонение пули от центра мишени (см)
1
Модифицированная, содержащая вакцину (n=10)
7,7±0,4
2
Модифицированная, не содержащая вакцину (n=10)
8,0±0,5
3
Не модифицированная (контроль) (n=10)
7,5±0,3
Результаты показывают, что при стрельбе с расстояния 100 м показатель кучности модифицированных пуль (как содержащих, так и не содержащих вакцину) близок к показателю кучности для стандартной пули, что указывает на стабильность баллистических характеристик модифицированной пули и их неизменности при закладке в них вакцинного материала.
Отверстия от пуль получаются округлыми, что свидетельствует о правильных аэродинамических свойствах пуль.
Пример 7. Определение глубины проникновения пули в ткани животного
Пулями по примеру 1, содержащими по 0,08 мл суспензии клеток вакцинного штамма В. abortus 82, с расстояния 100 м проводят выстрелы в крупный рогатый скот (n=7) и бизона (n=1).
Через 56 дней всех животных эвтаназировали и провели полную некропсию с взятием внутренних органов для бактериологического исследования.
При некропсии никаких серьезных повреждений органов и тканей животных, а также наличие воспалительных инфильтратов по ходу пулевых каналов не обнаружено. Пулевые каналы имеют ровные края и хорошо видны на разрезе.
Пули найдены в мышечной ткани всех животных на глубине 3-5,5 см (таблица 5). Обнаруженные пули деформированы (сплющены или распались на мелкие фрагменты).
Таблица 5
№
Вид животного
Глубина проникновения пули (см)
Состояние пуль в мышечной ткани животного
1.
Телки крупного рогатого скота (вес 150 кг)
4,0±1,5
Сплющены или распались на мелкие фрагменты
2.
Бизон (вес 600 кг)
3,0
Сплющена
Пример 8. Анализ иммунного ответа крупного рогатого скота на доставку живых бруцеллезных вакцин
Телки крупного рогатого скота 13-15-месячного возраста (весом 160-180 кг) в количестве 7 голов перед иммунизацией разделены методом случайного подбора на две группы. Опытную группу (4 животных) вакцинируют баллистическим способом с использованием модифицированной пули, контрольную группу (3 животных) - инъекционным способом. В качестве вакцин используют штаммы В. abortus 82 и В. abortus 19 (контроль). Через 5 недель после иммунизации всех животных реиммунизируют аналогичными культурами бруцелл, которые вводят в тех же дозах и теми же способами, но в противоположные конечности. Через 9 недель после вакцинации животных подвергли эвтаназии и полной некропсии с взятием образцов крови и внутренних органов для исследования.
Гуморальный иммунитет у вакцинированных животных оценивали путем определения уровня противобруцеллезных антител в сыворотках крови вакцинированных животных в серологических реакциях и методом ИФА.
Наличие клеток вакцинных штаммов во внутренних органах животных выявляли с помощью ПЦР.
Через 1-2 недели после иммунизации в сыворотках крови телок выявлены высокие титры специфических R-антител, низкие титры S-антител (на вакцину из штамма В. abortus 82) и высокие титры S-антител (на вакцину из штамма В. abortus 19). Динамика антителообразования при обоих способах вакцинации носила однотипный характер.
Об индукции у животных иммунного ответа свидетельствовали также высокий пролиферативный ответ лимфоцитов крови и повышение фагоцитарной активности клеток крови. Характер изменений показателей клеточного иммунитета и фагоцитоза у животных, вакцинированных обоими штаммами В. abortus с помощью баллистического и инъекционного способов, практически не отличался.
Пример 9. Анализ иммунного ответа бизона на доставку живой бруцеллезной вакцины
Бизона весом 600 кг иммунизируют вакциной из штамма В. abortus 82 непосредственно в стаде баллистическим методом с использованием модифицированной пули по примеру 2 двукратно с расстояния ~90 м в область левого и правого крупа. После вакцинации бизон помещен в отдельный загон. За животным осуществляли ежедневный ветеринарный надзор.
Через 36 дней после вакцинации при некропсии в мышечной ткани бизона на глубине 3 см найдены фрагменты двух пуль. С помощью ПЦР в лимфоузлах и селезенке выявлено присутствие клеток вакцинного штамма В. abortus 82. В сыворотке крови бизона выявлены высокий уровень клеточного и гуморального иммунитета (титр антител в ИФА=1:1280000), а с помощью реакции агглютинации обнаружены S-антитела (в титре 1:50), т.е. показано индуцирование напряженного и стойкого иммунологического ответа в организме бизона.
Таким образом, описанные результаты подтверждают возможность использования заявленной пули для доставки крупному рогатому скоту и дикому животному (бизону) с расстояния 80-100 м вакцины в необходимой дозе и с сохраненной жизнеспособностью клеток. Показана атравматичность заявленной пули для животных и небольшая глубина ее проникновения в ткани животного.
В связи со свойственными для разработанной пули аэродинамическими, баллистическими и конструктивными характеристиками она с высокой точностью попадает в целевое место вакцинируемого животного, проникает в мышечную ткань животного на глубину не более 3-5,5 см и за счет сплющивания или распада на мелкие фрагменты вакцина быстро и полностью выходит и эффективно колонизирует окружающую мышечную ткань животного с последующим размножением клеток.
Баллистическая вакцинация животных с расстояния 80-100 м не вызывает образования обширных травм, оказывает минимальный эффект на беспокойство и поведение животных, что позволяет проводить вакцинацию практически всех животных в одном стаде.
В результате баллистической вакцинации с использованием заявленной пули в организме животного формируется напряженный и стойкий иммунологический ответ, защищающий животное от инфицирования.
Остатки пули в мышечной ткани животного не вызывают серьезных клинических проявлений и могут находиться в теле животного на протяжении длительного времени.
Список литературы
1. Keith A, Kreeger TJ, Roffe TJ. Overview of delivery systems for the administration of vaccines to elk and bison of the Greater Yellowstone Area. In Kreeger TJ, editor. Brucellosis in Elk and Bison in the Greater Yellowstone Area. Cheyenne: Wyoming Game and Fish Department; 2002, p.66-79.
2. Jessup D., DeForge J.R., Sandberg S. Biobullet vaccination of captive and free-ranging bighorn sheep. Proceedings of the 2 International Game Ranching Symposium, 1992, p.429-34.
3. Roffer TJ, Jones LC, Coffin K, Sweeney SJ, and Hansen R. Parenteral delivery of vaccines to free-ranging bison in Yellowstone National Park. Proceedings U.S. Animal Health Association 2001; 105: 135-41.
4. Drake, Jr., James F.; Paul, Jr., Fred R. Ballistic animal implant. US Patent №3948263.
5. Komarov V.A. Shell for the immobilization of animals. US Patent №3616758.