ФОТОСИНТЕЗИРОВАННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, ОБОГАЩЕННЫЕ СЕЛЕНОМ ИЗ СЕЛЕНСОДЕРЖАЩИХ ГИДРОКСИКИСЛОТ, ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ПИЩЕ, КОСМЕТИКЕ И ФАРМАЦИИ
PHOTOSYNTHESISED MICROORGANISMS RICH IN SELENIUM FROM SELENIUM-CONTAINING HYDROXY ACIDS, USE THEREOF IN FOOD, COSMETICS AND PHARMACY

Изобретение относится к обогащению фотосинтезированных микроорганизмов органическим селеном, в частности, при помощи соединений типа селенсодержащих гидроксикислот и более конкретно при помощи 2-гидрокси-4-метилселенбутановой кислоты, в форме (D,L) или энантиомера, соли, сложного эфира или амида этого соединения, а также применение фотосинтезированных микроорганизмов, обогащенных таким образом, в пище животного или человека, косметике или фармации.
Селен является микропитательным веществом, существенным для человека и млекопитающих (Wendel, A.: Phosphorus, Sulfur Silicon Relat Elem., 1992, 67, 1-4, 405-415). Более конкретно он участвует в форме L(+)-селеноцистеина или L(+)-селенометионина (Muller, S. et al., Arch. Microbiol., 1997, 168, 421) в биосинтезе селенопротеинов, таких как глютатионпероксидаза, тиоредоксинредуктаза и селенопротеин Р.
У человека дефицит селена был выявлен, в частности, в случае пациентов, в течение длительно времени получавших питание парентеральным путем (Von Stockhausen, H.B., Biol. Trace Elem., Res., 1988, 15:147-155). Суточная добавка 200 мкг селена считается надежной и адекватной для взрослого человека, имеющего среднюю массу тела (Schrauzer, G.N., J. Am. Col. Nutr., 2001, 20: 1-14).
В природе селен находится в двух формах: органической и неорганической.
Неорганическими соединениями чаще всего являются соли, такие как селенит или селенит натрия. Эти соединения являются очень токсичными для человека и большей части животных.
Органические соединения (органические селенсодержащие соединения) представлены живыми организмами, в частности, аминокислотами L(+)-селенометионином, L(+)-метилселеноцистеином и L(+)-селеноцистеином.
L(+)-селенометионин является основным источником органического селена для человека и животных. Тем не менее, человек и животные являются ауксотрофными в отношении этой аминокислоты, которую можно получать только через пищу.
Поэтому в идеале селен должен включаться в состав пищевых добавок для лечения или предупреждения дефицита селена в этой органической форме.
Таким образом, было показано, что введение в пищу L(+)-селенометионина является значительно менее токсичным и более биодоступным, чем введение в виде селенита натрия (Mony, M.C. et al., J. of Trace Elem. Exp. Med., 2000, 13: 367-380).
В настоящее время неизвестны другие метаболические пути захвата селена живыми организмами, кроме тех, в которых в качестве субстратов используется неорганический селен, главным образом в виде селенита натрия и селенометионина.
Приемлемый источник органического селена можно найти у высших растений (в частности, пшеница, кукуруза, соя), в которых 80% селена составляет L(+)-селенометионин (Schrauzer, G.N., J. Am. Coll. Nutrit., 2001, 20(1):1-4). Однако содержание селена в этих растениях недостаточно для того, чтобы легко и с наименьшими затратами создать пищевые добавки.
Один из исследуемых путей получения композиций, богатых селенометионином, заключается в том, чтобы обогащать некоторые микроорганизмы органическим селеном из неорганического селена. Эти обогащенные микроорганизмы могут служить сырьем для получения пищевых или косметических продуктов.
В многочисленных публикациях описано, например, получение дрожжей, обогащенных селеном, и более конкретно дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Oh Tae-Kwang et al., патент KR950006950 от 26.06.1995) для их использования как таковых или для их включения в пищевые композиции (Moesgaard S. et al., патент DK200200408 от 16.09.2003); или для получения производных продуктов, обогащенных селеном, таких, например, как хлеб (Wang Boaquan, патент CN 1817143 от 16.08.2006), молоко (Jeng Chang-Yi, патент TW565432 от 11.12.2003), яйцо (Cui Li et al., патент CN1302723C от 07.03.2007), шоколад (In Gyeong Suk et al., патент KR20040101145 от 08.11.2004) или пиво (Jakovleva L.G. et al., патент RU2209237 от 27.07.2003), обогащенные селеном. В области лечебных пищевых продуктов препараты, содержащие дрожжи, обогащенные селеном, предлагались также для беременных женщин (Wang Weiyi, патент CN1778199 от 31.05.2006) или для улучшения микрофлоры кишечника у больных гипогликемией (Li Tao Zhao, патент CN1810161 от 02.08.2006). В области дермокосметики композиции, содержащие дрожжи, обогащенные селеном, были разработаны для уменьшения выпадения волос (Kazik Heinz, патент DE19858670 от 21.06.2000) или для предупреждения фотостарения (Kawai Norihisa et al., патент JP07300409 от 14.11.1995). Фармацевтические препараты, содержащие дрожжи, обогащенные селеном, использовали для профилактики и лечения патологий - воспалительных, таких как ретинопатия, связанная с диабетом (Crary Ely J., патент US5639482 от 17.06.1997), или сердечнососудистых (Nagy P.L. et al., патент HUT060436 от 28.09.1992).
Бактерии и более конкретно пробиотические бактерии также являлись объектом обогащения селеном (Calomme M. et al., Biol. Trace Elem. Res., 1995, 47, 379-383). Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus ferintoshensis, Lactobacillus buchnerilparabuchneri (Andreoni V. et al., патент US0258964) были описаны в качестве пищевых добавок, обогащенных селеном. Были получены пробиотические смеси, состоящие из дрожжей и лактобактерий, для укрепления иммунной системы и сопротивления заболеваниям (Huang Kehe Qin, патент CN1283171C от 08.11.2006).
Однако во всех этих препаратах микроорганизмы, обогащенные селеном, получали только из неорганического селена. Так, наиболее часто используемым источником селена является селенит или селенат натрия, растворенный в культуральных средах микроорганизмов. Обогащенные таким образом микроорганизмы, несмотря на то, что они синтезировали удовлетворительные количества органического селена, усваиваемые человеческим организмом, часто имеют повышенное остаточное содержание непревращенного неорганического селена, что может оказаться опасным для потребителя.
В предыдущей опубликованной заявке WO 2006/008190 новые органические соединения типа селенсодержащих гидроксикислот были описаны как могущие являться предшественниками синтеза L(+)-селенометионина в организме человека и животных.
Неожиданно заявитель констатировал, что органические соединения типа селенсодержащих гидроксикислот, такие как описаны в заявке WO 2006/008190, можно включать в культуральные среды для обогащения различных фотосинтезированных микроорганизмов органическим селеном. Полученные результаты показали, что эти соединения позволяют очень эффективно обогащать такие микроорганизмы, в частности, L(+)-селенометионином с равным и даже большим выходом, чем получаемый при помощи обычно используемых неорганических соединений.
Таким образом, оказалось, что обогащение фотосинтезированных микроорганизмов органическим селеном из органических соединений типа селенсодержащих гидроксикислот позволяет получать органический селен, не содержащий неорганический селен, и решать, таким образом, проблемы токсичности, связанные со способами из уровня техники.
Фотосинтезированные микроорганизмы, обогащенные таким образом, могут использоваться непосредственно в пище в рамках предупреждения или лечения недостатка селена, в частности, для получения фармацевтических, пищевых или косметических продуктов и композиций.
Подробное описание изобретения
Цель настоящего изобретения заключается в получении фотосинтезированных микроорганизмов, т.е. микроорганизмов, рост которых зависит от источника световой энергии.
Под микроорганизмом понимают любой живой одноклеточный организм, относящийся к одному из следующих царств: монеры, протисты, мицеты или протозоэры, имеющий эукариотическую или прокариотическую структуру, микроскопического или ультрамикроскопического размера, обладающий метаболическим и репродуктивным потенциалом. Указанные одноклеточные микроорганизмы могут участвовать в образовании филаментов или биопленок.
Предпочтительно фотосинтезированными микроорганизмами по изобретению являются эукариотические микроводоросли, более предпочтительно зеленые водоросли рода Chlorella или прокариотические микроводоросли, такие как цианобактерии, предпочтительно рода Spirulina или Arthrospira (спирулина). Эти последние хорошо известны специалисту для использования в качестве пищевых добавок, в частности, в развивающихся странах.
Под органическим селеном понимают совокупность молекул, содержащих по меньшей мере одно соединение, имеющее по меньшей мере один атом селена в своей химической структуре, который может продуцироваться живым организмом, таких, в частности, как аминокислоты селенометионин, метилселеноцистеин и селеноцистеин, пептиды или белки, их содержащие.
Фотосинтезированные микроорганизмы, обогащенные таким образом селеном, можно использовать как таковые или в качестве пищевой добавки. Они, например, могут подвергаться дегидрированию для получения устойчивого порошка, который можно включать в композиции, являющиеся основой для получения трансформированных продуктов, а также их можно использовать живыми в качестве пробиотиков в процессе трансформации пищевых продуктов в целях получения, например, ферментированных молока или напитков.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является новый способ обогащения фотосинтезированных микроорганизмов селенометионином и/или селеноцистеином, отличающийся тем, что указанный фотосинтезирующий микроорганизм культивируют в культуральной среде, содержащей соединение типа селенсодержащей гидроксикислоты.
Предпочтительно соединение типа селенсодержащей гидроксикислоты является соединением общей формулы (I), предшественником, солью или сложным эфиром или амидом, производным этой кислоты:
формулы, в которой:
n равно 0, 1 или 2;
1
3
3
2
3
4
5
6
R обозначает OH, OCOR, ОРОН, OPORR или OR;
2
3
7
2
1
R обозначает OH, R, NHR, S-цистеинил или S-глутатионил; при условии, что если n=1 и R обозначает OH, то R не может обозначать OH;
3
R обозначает алкоксил, керамид 1, керамид 2, керамид 3, керамид 4, керамид 5, керамид 6а и 6b, S-цистеинил, S-глутатионил или группу, выбранную из следующих групп:
или
3
Предпочтительно R обозначает алкоксил, S-цистеинил, S-глутатионил;
4
1
26
OR обозначает (C-C)алкоксил, керамид 1, керамид 2, керамид 3, керамид 4, керамид 5, керамид 6а и 6b, или группу, выбранную из следующих групп:
или
4
1
26
Предпочтительно OR обозначает (C-C)алкоксил;
5
1
26
OR обозначает (C-C)алкоксил, керамид 1, керамид 2, керамид 3, керамид 4, керамид 5, керамид 6а и 6b, или группу, выбранную из следующих групп:
или
5
1
26
Предпочтительно OR обозначает (C-C)алкоксил;
6
OR обозначает пируват, лактат, цитрат, фумарат, малеат, миристат, пальмитат, стеарат, пальмитолеат, олеат, линолеат, натуральные жирные кислоты или 13-цис ретиноат;
7
1
26
R обозначает Н, (C-C)алкил или натуральную аминокислоту или натуральный амин.
В приведенной выше формуле (I)
- под алкилом понимают группу, содержащую от 1 до 26 атомов углерода, линейную или циклическую, возможно разветвленную, возможно фторированную или полифторированную, и содержащую возможно одну или несколько двойных углерод-углеродных связей, такую как, например, метил, этил, изопропил, трифторметил, линолеил, линоленил, пальмитоил;
- под алкоксилом понимают группу, производную от первичного, вторичного или третичного спирта, содержащую от 1 до 26 атомов углерода, линейную или циклическую, возможно разветвленную, возможно фторированную или полифторированную, и содержащую возможно одну или несколько двойных углерод-углеродных связей, такую как, например, метоксил, этоксил, изопропоксил, трифторметоксил, линолеоксил, линоленоксил, пальмитоксил;
- структуры радикалов типа керамидов описаны, в частности, в “Cosmetic Lipids and the Skin Barier”, Thomas Forster Ed. 2002, Marcel Dekker, Inc., p.2, fig.2;
- под натуральным понимают любое соответствующее соединение, обнаруженное в обмене веществ в организмах из растительного, животного мира, а также в человеческом организме (Steglich W., Rompp Encyclopedia Natural Products, G. Thieme ed.);
- пол олигомером понимают любое соединение, состоящее из последовательности из 2-15 мономеров, связанных между собой посредством связи типа сложного эфира;
- под полимером понимают любое соединение, состоящее из последовательности из более чем 15 мономеров, связанных между собой посредством связи типа сложного эфира.
Согласно изобретению указанные соединения формулы (I) предпочтительно используют в форме солей кальция, цинка или магния, что главным образом обеспечивает лучшую растворимость в культуральной среде, а также лучшее усвоение фотосинтезированными микроорганизмами.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения фотосинтезирующий микроорганизм выбирают из группы, образованной сине-зелеными и зелеными водорослями. Таким образом, фотосинтезирующий микроорганизм преимущественно выбирают из сине-зеленых или зеленых водорослей, предпочтительно выбирают из группы, образованной зелеными водорослями рода Chlorella и сине-зеленых водорослей рода Spirulina или Arthrospira.
Более конкретно изобретение относится к применению соединения формулы (I), выбранному (или взятому) из:
- L-2-гидрокси-4-метилселенбутановой кислоты,
- D-2-гидрокси-4-метилселенбутановой кислоты,
- DL-2-гидрокси-4-метилселенбутановой кислоты,
или соли этих соединений.
Эти соединения описаны в заявке WO 2006/008190.
Объектом изобретения является также фотосинтезирующий микроорганизм, обогащенный органическим селеном, который может быть получен способом по изобретению. Такой микроорганизм содержит главным образом органический селен в количестве более 500 м.д., предпочтительно более 1000 м.д., более предпочтительно более 2000 м.д. в селеновом эквиваленте, и неорганический селен в количестве менее 0,5%, предпочтительно менее 0,2% и более предпочтительно менее 0,1% сухого веса указанного микроорганизма. Предпочтительно изобретение относится к случаям, когда фотосинтезирующий микроорганизм содержит менее 1,5%, предпочтительно менее 0,5%, более предпочтительно менее 0,1% масс. неорганического селена по отношению к общему количеству селена.
Иначе говоря, остатки селена в неорганической форме, присутствующие в фотосинтезированных микроорганизмах, обогащенных способом по изобретению, насчитывают главным образом менее 1,5% общего количества селена, присутствующего в микроорганизмах, что представляет собой главным образом менее 0,5% всей сухой биомассы (по сухому весу) указанного микроорганизма.
Более конкретно изобретение относится к фотосинтезированному микроорганизму, обогащенному органическим селеном, отличающемуся тем, что содержание селена в виде селенометионина в указанном микроорганизме составляет более 50%, предпочтительно более 70%, более предпочтительно более 80% и более предпочтительно более 90% масс. по отношению к общему количеству селена, содержащемуся в указанном фотосинтезированном микроорганизме. Такое содержание селенометионина является улучшением в отношении количества и качества органического селена, присутствующего в микроорганизме, существенным и преимущественным по сравнению с тем, что было достигнуто в известном уровне техники.
В частности, цель изобретения заключается в том, что микроорганизм отличается тем, что представляет собой зеленую микроводоросль, предпочтительно рода Chlorella, обогащенную селеном, и тем, что указанный микроорганизм содержит селенометионин в количестве главным образом более 50 микрограмм в селеновом эквиваленте на грамм (мкгSe/г), предпочтительно более 70 мкгSe/г и более предпочтительно более 100 мкгSe/г по сухому весу указанного микроорганизма.
Количество селена, содержащегося в микроорганизмах, выражают в виде органических (селенометионин, селеноцистеин или иное) или неорганических молекул (соли селена) по массе селена на грамм (мкгSe/г) сухого веса микроорганизмов. Иными словами, содержание селена в фотосинтезированных микроорганизмах устанавливают путем вычисления массы селена, присутствующей в этих молекулах, органических или неорганических, отнесенной к общей сухой биомассе микроорганизма. Кроме того, массовое содержание селена, присутствующего в органической и неорганической форме, также устанавливают и выражают в процентах по отношению к массе селена в целом.
Общее содержание селена и содержание в виде селенометионина в фотосинтезированных микроорганизмах по изобретению можно определить соответственно минерализацией и ферментативным пищеварением после центрифугирования и лиофилизации микроорганизмов, например, по методу Lobinsky et al., описанному в Mester, Z. et al., (2006) Annal. Bioanal. Chem. 385: 168-180.
Полученные по настоящему изобретению результаты, которые иллюстрируют примеры настоящего изобретения, показывают, что фотосинтезированные микроорганизмы, более конкретно, зеленые и сине-зеленые микроводоросли аккумулируют селен в виде селенометионина в количестве, главным образом превышающем 100 микрограмм в селеновом эквиваленте на грамм (мкгSe/г), предпочтительно более 200 мкгSe/г, более предпочтительно более 1000 мкгSe/г по сухому весу и даже более 1400 мкгSe/г по сухому весу этих микроводорослей.
Более конкретно целью изобретения являются зеленые или сине-зеленые водоросли, обогащенные органическим селеном, отличающиеся тем, что содержат органический селен в виде селенометионина, главным образом в количестве более 100 мкгSe/г, предпочтительно более 200 мкгSe/г, более предпочтительно более 500 мкгSe/г и еще более предпочтительно более 1000 мкгSe/г по сухому весу.
Такие зеленые или сине-зеленые водоросли, обогащенные органическим селеном, главным образом отличаются тем, что содержание в них органического селена в виде селенометионина составляет более 50%, предпочтительно более 70%, более предпочтительно более 80%, еще более предпочтительно более 90%, даже более 95% от общего количества селена, который они содержат, а также тем, что остаточное содержание неорганического селена в них, главным образом, составляющее менее 1,5%, предпочтительно составляет менее 0,5%, более предпочтительно менее 0,1% общего количества селена, которое она содержит. Главным образом остаточное содержание в них неорганического селена составляет менее 1%, предпочтительно менее 0,5%, более предпочтительно менее 0,2% и еще более предпочтительно менее 0,1% всей биомассы указанных зеленых водорослей по сухому весу.
Кроме того, изобретение относится к получению пищевых, косметических или фармацевтических продуктов из указанных фотосинтезированных микроорганизмов, обогащенных селеном способом по настоящему изобретению. Для этого получения используют технологии, известные специалисту.
Фотосинтезированные микроорганизмы по изобретению могут также быть пригодны для животной пищи, в частности, для получения вторичных производных, обогащенных селеном, в частности, рыбы, молока или яиц.
Производные молекулы и продукты, полученные таким образом, могут иметь различные применения, в том числе те, о которых говорилось во вступительной части, в частности, в качестве косметического, фармацевтического или питательного агента.
Объектом изобретения также является применение фотосинтезированных микроорганизмов, обогащенных селеном, по настоящему изобретению, в качестве косметического, фармацевтического (или лечебного) или питательного продукта (или агента).
Изобретение также относится к композициям, главным образом косметическим, фармацевтическим или питательным, содержащим указанные фотосинтезированные микроорганизмы.
Изобретение относится также к культуральной среде для фотосинтезированных микроорганизмов, отличающейся тем, что она содержит одно или несколько из соединений формулы (I), определение которых приведено выше. Такая культуральная среда пригодна для осуществления способа обогащения фотосинтезированных микроорганизмов селеном по изобретению.
В частности, изобретение относится к твердой или жидкой культуральной среде, содержащей по меньшей мере одно соединение формулы (I), предпочтительно 2-гидрокси-4-метилселенбутановую кислоту или одну из ее солей в концентрации от 0,5 до 2000 мг/л, предпочтительно от 1 до 1000 мг/л, более предпочтительно от 2 до 500 мг/л, т.е. соответственно примерно от 0,2 до 800 мг/л указанного соединения в селеновом эквиваленте, предпочтительно от 0,4 до 400 мг/л указанного соединения в селеновом эквиваленте, более предпочтительно от 0,8 до 200 мг/л указанного соединения в селеновом эквиваленте.
При использовании микроводорослей морского происхождения соединения формулы (I) можно разводить в стерильной фильтрованной морской воде или в синтезированной морской воде, например, полученной из среды “Reef Crystal” фирмы Aquarium Systems Inc., для получения минимальной культуральной среды.
Способ получения микроводорослей по изобретению может, в частности, включать одну или несколько следующих стадий:
- получение культуральной среды, предпочтительно, минимальной среды, содержащей химические элементы, необходимые для роста микроводоросли;
- введение в культуральную среду соединения формулы (I), предпочтительно 2-гидрокси-4-метилселенбутановую кислоту в качестве органического источника селена;
- регулирование рН смеси до значения от 6 до 10;
- культивирование инокулума прекультуры указанной микроводоросли в полученной таким образом смеси при температуре от 12 до 45°С, в условиях орбитального перемешивания со скоростью от 100 до 500 об/мин и в атмосфере, которая может содержать от 0 до 20% кислорода и от 0,3 до 20% углекислого газа, предпочтительно в течение 24-120 часов;
- центрифугирование смеси со скоростью от 400 до 10000 об/мин в течение нескольких минут или фильтрование через фильтр с отверстиями 0,2 микрометра и промывку физиологическим раствором на фильтре;
- извлечение клеточного осадка из физиологического раствора;
- повторное центрифугирование со скоростью от 4000 до 10000 об/мин в течение нескольких минут;
- извлечение влажного клеточного осадка, в котором находятся микроводоросли, обогащенные селеном.
Влажный клеточный осадок можно лиофилизировать или сушить на воздухе.
Другие характеристики и преимущества изобретения приведены в нижеследующих примерах. Нижеследующие примеры даны исключительно в качестве иллюстрации и никоим образом не ограничивают объем изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Получение аутотрофной микроводоросли Chlorella vulgaris, обогащенной селеном, в среде, содержащей 2-гидрокси-4-метилселенбутановую кислоту (THD-177)
Экспериментальные условия
В качестве фотоаутотрофного штамма использовали Chlorella vulgaris SAG211-11В: оригинальный аксенический штамм из коллекции SAG Геттингенского университета (SAG: Sammlung von Algenkulturen der Universitat Gottingen).
Этот штамм культивировали в среде BG-11 (Blue-green medium), описанной [Stanier RY et al. 1971 Bacteriol. Rev. 35:171-205], имеющей следующий состав (на 1 л):
3
(1) NaNO: 1,5 г
2
4
(2) KHPO: 0,04 г
4
2
(3) MgSO.7HO: 0,075 г
2
2
(4) CaCl.2HO: 0,0036 г
(5) лимонная кислота: 0,006 г
(6) железный цитрат аммония: 0,006 г
2
(7) EDTA-Na: 0,001 г
2
3
(8) NaCO: 0,02 г
(9) Дистиллированная вода 1,0 л
(10) Раствор следов элементов: 1 мл/л
3
3
HBO: 2,86 г
2
2
MnCl.4HO: 1,81 г
4
2
ZnSO.7HO: 0,222 г
2
4
2
NaMoO.2H: 0,39 г
4
2
CuSO.5HO: 0,08 г
3
2
2
Co(NO).6HO: 0,05 г
Величина рН была установлена равной 7,1 и среду стерилизовали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут.
initit660nm
660nm
Этот фотоаутотрофный штамм культивировали при 25°С, 2400 +/-200 Люкс в течение 2-7 дней при орбитальном перемешивании (80 об/мин), DO=0,05. DO штамма достигает 0,5 в течение 48 часов.
Условия культивирования
Органический источник селена, а именно 2-гидрокси-4-метилселенбутановую кислоту (THD-177, Tetrahedron SAS, Франция, CAS: 873660-49-2), вводили в концентрации от 0,5 мг/л до 100 мг/л в селеновом эквиваленте, т.е. соответственно 1,25 мг/л и 250 мг/л 2-гидрокси-4-метилселенбутановой кислоты. Введение селенсодержащего соединения осуществляли в один прием (т.е. количество от 0,125 мг до 25 мг на 100 мл культуры) в начале культивирования или в несколько приемов с регулярными временными интервалами, продолжительность которых составляла от 6 до 24 часов, причем культивирование продолжалось в течение 2-7 дней.
Пример 2
Получение микроводоросли Chlorella vulgaris, обогащенной селеном, в среде, содержащей 2-гидрокси-4-метилселенбутановую кислоту (THD-177) (пример по изобретению), или в среде, содержащей селенит натрия (сравнительный пример), в условиях миксотрофного питания (присутствие света и карбогидрата - глюкозы - в среде):
В этих опытах использовали штамм Chlorella vulgaris SAG211-11В: оригинальный аксенический штамм из коллекции SAG Геттингенского университета (SAG: Sammlung von Algenkulturen der Universitat Gottingen), который культивировали в условиях миксотрофного питания в следующей среде:
Дрожжевой экстракт
0,33 г
Мясной экстракт
0,33 г
Триптоза
0,66 г
FeSO<sub>4</sub>
0,66 г
Глюкоза
3,3 г
Дистиллированная вода
количество до 1,0 л
Величина рН была установлена равной 7,1 и среду стерилизовали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут.
Органический источник селена, а именно 2-гидрокси-4-метилселенбутановую кислоту (THD-177, Tetrahedron SAS, Франция, CAS: 873660-49-2), вводили в концентрации 20 мг/л в селеновом эквиваленте, т.е. 50 мг/л 2-гидрокси-4-метилселенбутановой кислоты.
Неорганический источник селена (SeNa, селенит натрия) вводили в концентрации 20 мг/л в селеновом эквиваленте, т.е. 43,9 мг/л селенита натрия.
Введение селенсодержащего соединения осуществляли в один прием в экспоненциальной фазе роста штамма Chlorella vulgaris, (т.е. через 3 дня после инокуляции).
Получение образцов для анализов
Через 7 дней после начала инкубации среду фильтровали через мембрану Nalgène 0,2 микрона (Ref a-Pes, диаметр 90 мм) и клеточный ретентат споласкивали физиологическим раствором. Влажную клеточную массу подвергали лиофилизации для анализа селенсодержащих компонентов (общее количество селена, селенометионин и селенит натрия).
Анализ селенсодержащих компонентов в Chlorella vulgaris
Общее количество селена дозировали при помощи ICP в сочетании с детектированием по массе после минерализации образца. Анализ селена осуществляли высокоэффективной жидкостной хроматографией в сочетании с детектированием масса-масса после ферментативного переваривания по методу, описанному Lobinsky et al. в Mester, Z. et al. (2006) Annal. Bioanal. Chem. 385: 168-180.
Результаты
Ниже в таблице 1 приведены средние величины в селеновых эквивалентах, полученные трижды при инкубационном периоде, равном 7 дням.
Таблица 1
Анализ селенсодержащих компонентов микроводоросли Chlorella vulgaris
Общее кол-во Se мгSe/кг биомассы
Se-метионинмгSe/кг биомассы
Se(IV)мгSe/кг биомассы
Введение THD177 20 мгSe/л
1293±23
1274±109(98,5% общего количества Se)
6±1(0,4% общего количества Se)
Введение SeNa 20 мгSe/л
144±5
29±2(20% общего количества Se)
4,1±0,4(2,7% общего количества Se)
Полученные результаты при одинаковой дозе селена, введенного в виде THD177 или SeNa, в данном случае 20 мгSe/л, показали что:
- было обнаружено в девять раз большее общее количество Se, полученное при введении в виде THD177, чем полученное при введении в виде SeNa;
- количество селена, аккумулированного внутриклеточно в виде селенометионина, полученное при введении THD177, в 44 раза превышало количество селена, полученное при введении SeNa;
- количество селена, аккумулированного внутриклеточно в виде селенометионина, достигает почти 100% (98,5%) во внутриклеточных селенсодержащих формах при введении в виде THD177 по сравнению с 20% при введении в виде SeNa; и что
- только 0,4% Se(IV) в общем количестве селена было обнаружено при введении в виде THD177, тогда как 2,7% Se(IV) было обнаружено в общем количестве селена при введении SeNa.
Пример 3
Получение аутотрофной микроводоросли Arthrospira platensis, обогащенной селеном, в среде, содержащей 2-гидрокси-4-метилселенбутановую кислоту (THD-177) (пример по изобретению) или в среде, содержащей селенит натрия (сравнительный пример)
В этих опытах использовали штамм Arthrospira platensis 3054-Е0001.
Штамм 3054-Е0001 культивировали как аутотрофный в следующей среде:
Дрожжевой экстракт
0,33 г
Мясной экстракт
0,33 г
Триптоза
0,66 г
FeSO<sub>4</sub>
0,66 г
Дистиллированная вода
количество до 1,0 л
Величина рН была установлена равной 7,2 и среду стерилизовали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут.
Органический источник селена, а именно 2-гидрокси-4-метилселенбутановая кислота (THD-177, Tetrahedron SAS, Франция, CAS: 873660-49-2) вводили в концентрации 25 мг/л в селеновом эквиваленте, т.е. 62,5 мг/л 2-гидрокси-4-метилселенбутановой кислоты.
Неорганический источник селена (SeNa, селенит натрия) вводили в концентрации 25 мг/л в селеновом эквиваленте, т.е. 54,4 мг/л селенита натрия.
Введение селенсодержащего соединения осуществляли в один прием сразу после инокуляции штамма Arthrospira platensis (т.е. Т=0).
Получение образцов для анализов:
Через 10 дней после начала инкубации клеточный остаток фильтровали через мембрану Nalgène 0,2 микрона и клеточный ретентат споласкивали физиологическим раствором. Влажную клеточную массу подвергали лиофилизации для анализа селенсодержащих компонентов (общее количество селена, селенометионин и селенит натрия).
Анализ селенсодержащих компонентов в Arthrospira platensis
Общее количество селена определяли при помощи ICP в сочетании с детектированием по массе после минерализации образца. Анализ селена осуществляли высокоэффективной жидкостной хроматографией в сочетании с детектированием масса-масса после ферментативного переваривания по методу, описанному Lobinsky et al. в Mester, Z. et al. (2006) Annal. Bioanal. Chem. 385: 168-180.
Результаты
Ниже в таблице 2 приведены средние величины в селеновых эквивалентах, полученные трижды при инкубационном периоде, равном 10 дням.
Таблица 2
Анализ селенсодержащих компонентов микроводоросли Arthrospira platensis
Общее кол-во Se мгSe/кг биомассы
Se-метионинмгSe/кг биомассы
Se(IV)мгSe/кг биомассы
Введение THD177 25 мгSe/л
1431±68
1402±47(98% общего количества Se)
17,2±0,7(1,2% общего количества Se)
Введение SeNa 25 мгSe/л
177±2
13±3(7% общего количества Se)
5,1±0,3(2,9% общего количества Se)
Полученные результаты при одинаковой дозе селена, введенной в виде THD177 или SeNa, в данном случае 25 мгSe/л, показали что:
- было обнаружено в восемь раз большее общее количество Se, полученное при введении в виде THD177, чем полученное при введении в виде SeNa;
- количество селена, аккумулированного внутриклеточно в виде селенометионина, полученное при введении THD177, в 108 раз превышало количество селена, полученное при введении в виде SeNa;
- количество селена, аккумулированного внутриклеточно в виде селенометионина, достигает 98% во внутриклеточных селенсодержащих формах при введении в виде THD177 по сравнению с 7% при введении в виде SeNa; и что
- только 1,2% Se(IV) в общем количестве селена было обнаружено при введении в виде THD177, тогда как 2,9% Se(IV) было обнаружено в общем количестве селена при введении в виде SeNa.
Пример 4
Получение микроводоросли Arthrospira platensis, обогащенной селеном, в среде, содержащей 2-гидрокси-4-метилселенбутановую кислоту (THD-177) (пример по изобретению)
В этих опытах использовали штамм Arthrospira platensis 3054-Е0001. Сравнивали результаты:
- предыдущего примера 3, в котором введение по изобретению селенсодержащего соединения THD-177 осуществляли в один прием сразу после инокуляции штамма Arthrospira plantensis с
- результатами нового эксперимента, в котором введение по изобретению селенсодержащего соединения THD-177 осуществляли в экспоненциальной фазе культивирования указанного штамма Arthrospira platensis, как в примере 2.
Результаты
Ниже в таблице 3 приведены средние значения в селеновых эквивалентах, полученные трижды при инкубационном периоде, равном 10 дням.
Таблица 3
Анализ селенсодержащих компонентов микроводоросли Arthrospira platensis
Анализ селенсодержащих компонентов в микроводоросли Arthrospira platensis
Общее кол-во Se мгSe/кг биомассы
Se-метионинмгSe/кг биомассы
THD177 мгSe/кг биомассы
Se(IV)мгSe/кг биомассы
Введение THD177 25 мгSe/л при инокуляции
1431±68
1402±47(98% общего количества Se)
5±1(0,35% общего количества Se)
17,2±0,7 (1,2% общего количества Se)
Введение THD177 25 мгSe/л в экспоненциальной фазе
1274±16
1078±89 (85% общего количества Se)
11±2 (0,86% общего количества Se)
14±2(1,1% общего количества Se)
Полученные результаты показали, что на 12% больше общего количества селена и на 30% больше селена в виде селенометионина было получено в тесте «введение в Т0» по сравнению с тестом «введение в экспоненциальной фазе». Эта разница может являться следствием более длительной продолжительности контакта биомассы с THD177 в тесте «введение в Т0» по сравнению с другим тестом «введение в экспоненциальной фазе».
В этих обоих случаях внутриклеточное содержание Se(IV) остается незначительным и составляет 1% общего количества селена.