СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГОТОВОЙ К ПРИМЕНЕНИЮ КОМБИНИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ PCV2/M.hyo
METHOD FOR PREPARING A READY-TO-USE COMBINED PCV2 / MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE VACCINE

Настоящее изобретение относится к области ветеринарии, а именно, к вакцинам для свиней против Mycoplasma hyopneumoniae и против свиного цирковируса 2 типа. В частности, изобретение относится к новому способу получения композиции, содержащей вакцинные антигены. Затем такую композицию можно использовать для получения эффективных готовые к применению комбинированных вакцин для свиней. Кроме того, изобретение относится к применению антигенной композиции, полученной с помощью нового способа, к вакцине, полученной из такой антигенной композиции, а также к разным способам получения и применения антигенной композиции и вакцины.
Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) является основным агентом, вызывающим (у свиней) энзоотическую пневмонию (ЕР), хроническое респираторное заболевание свиней, встречающееся по всему миру. В опубликованных ранее документах используют объективный синоним: М. suipneumoniae, в отношении к той же бактерии. Бактерия является относительно маленькой, не имеет клеточную стенку и принадлежит к классу Mollicutes. Молодые поросята особенно подвержены этому крайне заразному заболеванию, передающемуся, как правило, по воздуху или при непосредственном контакте.
Легочная болезнь, обусловленная M.hyo, представляет собой в значительной степени иммуноопосредованную патологию, приводящую к консолидированной пневмонии. Хотя данные бактерии не выделяют известные токсины, они колонизируют и повреждают легочный мерцательный эпителий, приводя к снижению его активности. В зависимости от условий содержания и воздействия окружающей среды, последствием этого заболевания, создающим больше всего проблем, является то, что оно способствует предрасположенности к вторичному инфицированию дыхательной системы свиней другими бактериальными и вирусными патогенами. Это приводит к развитию так называемого комплекса респираторных заболеваний у свиней (PRDC) и серьезному повреждению легких. Кроме дискомфорта для животного, EP и PRDC приводят к значительным экономическим потерям в свиноводстве вследствие снижения скорости роста и коэффициента кормоотдачи, а также вследствие затрат на ветеринарную помощь и применение антибиотиков (Thacker & Minion, 2012, Mycoplasmosis, в: Disease of swine, 10th ed., J. Wiley & Sons, p. 779-797).
Другие патогены свиней, связанные с PRDC, включают: вирусы, такие как: свиной цирковирус 2 типа, вирус свиного гриппа и вирус свиного репродуктивного и респираторного синдрома; и бактерии, такие как: Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis и Actinobacillus pleuropneumoniae.
Поскольку антибиотики эффективны лишь отчасти, основным способом лечения заболеваний, связанных с M.hyo, и уменьшения производственных потерь является вакцинация, предпочтительно в начале жизни. Обзор можно найти в Maes et al. (2008, Vet. Microbiol., vol. 126, p. 297-309). Обычно поросят вакцинируют в питомнике в возрасте до 4-х недель, при необходимости с повторной вакцинацией через несколько недель.
Точный механизм подавления заболевания посредством развития поствакцинального иммунитета против M.hyo до конца не изучен. Хотя вакцинация не может полностью предотвратить колонизацию легких или передачу бактерий, она, тем не менее, эффективно обеспечивает значительное уменьшение клинических признаков, таких как колонизация легких, поражение легких и пневмония, уменьшение выделения бактерий, а также восстановление экономических показателей, таких как средний суточный прирост массы. Для контроля эффективности вакцины можно оценивать и регистрировать разные клинические параметры заболевания, такие как частота заболеваний, пневмония, плеврит, а также путем детекции или количественного определения повторно выделенных M.hyo, например, с помощью серологических методов, гистологических методов, или метода ПЦР.
Традиционный способ определения эффективности и защитной функции вакцины против M.hyo включает в себя оценку снижения тяжести поражений легких. Такие поражения, как правило, оценивают во время некропсии путем макроскопического определения консолидации легкого, например, по шкале Гудвина (Goodwin et al., 1969, J. Hyg. Camb., vol. 67, p. 465-476), которая включает в себя оценки от нуля до максимум 55 баллов за полностью пораженные легкие. При использовании эффективных вакцин оценки могут соответствовать уменьшению поражения легких более чем на 50% при сравнении эффекта внесения инфекции у вакцинированных и невакцинированных животных. Такое уменьшение оценки поражения легких является показателем эффективной иммунной защиты и коррелирует с существенным восстановлением здоровья свиней, а также производительностью свиноводства, измеряемой по коэффициенту кормоотдачи и среднему суточному приросту массы (Maes et al., 2008, Vet. Microbiol., vol. 126, p. 297-309).
M.hyo можно культивировать in vitro, однако такое культивирование требует в высокой степени обогащенной культуральной среды, чтобы компенсировать небольшой геном, который не способен сам обеспечивать превращение необходимых питательных веществ. Примером может служить среда, описанная Friis (1975, Nord Vet. Med., vol. 27, p. 337-339), которая представляет собой сложную среду, содержащую дрожжевой экстракт, сыворотку животных и разные свиные и бычьи экстракты. По завершению выращивания полную культуру M.hyo обычно инактивируют химическими или физическими способами, например, с помощью формалина, чтобы получить антиген типа "бактерина": антигены убитой целой клеточной культуры M.hyo. Затем инактивированную культуру можно сконцентрировать (например, в 10-20 раз), например, путем фильтрации, и использовать для получения вакцины. В результате применения обогащенной среды и концентрирования такие антигены M.hyo типа бактерина содержат множество полученных из среды белков, жирных кислот и др., которые могут влиять на последующую обработку в процессе получения вакцины.
Существует много коммерческих вакцин против M.hyo, которые часто используются в большинстве коммерческих свиноводческих хозяйств. Как правило, это инактивированные вакцины, содержащие бактерины и адъюванты, которые вводят путем парентеральной инъекции. Примерами таких вакцин являются: RespiSure™ (Zoetis), Ingelvac™ M. Hyo, MycoFLEX™ (Boehringer Ingelheim), Hyoresp™ (Merial), Stellamune™ Mycoplasma (Elanco Animal Health) и M+Pac™ (Merck Animal Health).
Хорошо известные штаммы M.hyo, используемые в производстве или разработке вакцин включают: штамм J (АТСС № 25934), штамм 11 или штамм 232.
Существует несколько вариаций и усовершенствований, осуществленных в применении к указанным вакцинам, которые касаются, например, типа используемого адъюванта (минеральное масло, неминеральное масло, соли алюминия, синтетические полимеры и т.д.), дозы, предназначенной для применения (1 или 2 мл), возраста вакцинации (1 день, 7 дней и старше, 3 недели, 6 недель или старше, и т.д.) или способа введения (такого как внутримышечное, подкожное или внутрикожное введение).
Вакцина М+Pac содержит двойной адъювант, Emunade™, который представляет собой эмульсию типа масло-в-воде, полученную путем диспергирования минерального масла в водном носителе с получением водного носителя, содержащего гидроксид алюминия в качестве адъюванта. Вакцина М+Pac коммерчески доступна с 1996 года.
Последние разработки в области вакцин против M.hyo включают адаптации к режиму введения с получением вакцин, которые не требуют бустерной вакцинации, таких как вакцины, предназначенные для однократного или одиночного введения. В качестве альтернативы были разработаны вакцины, которые можно вводить по гибкому графику, содержащие однократную или двойную дозу, так называемые вакцины с "гибким введением", например, 2 раза по 1 мл, или один раз 2 мл.
m
4
n
4
2
При получении вакцин M.hyo в качестве адъювантов наряду с эмульсиями на масляной основе используют соли алюминия. Соли алюминия являются хорошо известными адъювантами и представляют собой основной тип адъювантов, используемых для получения человеческих вакцин. Можно использовать разные соли: "адъювант гидроксид алюминия", который представляет собой кристаллический оксигидроксид алюминия (AlO(OH)); "адъювант фосфат алюминия", который представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия (Al(OH)(PO)) и "адъювант сульфат алюминия" или "алюм", который представляет собой аморфный гидроксисульфат алюминия (AlK(SO)). Два последних адъюванта являются производными оксигидроксида алюминия, полученными путем замены гидроксильных групп на фосфатные или, соответственно, сульфатные группы. Обзор можно найти в: Hem & HogenEsch (2007, Expert Rev. Vaccines, vol. 6, p. 685-698).
Механизм действия алюминиевых солей как адъювантов до сих пор полностью не ясен; в его основе лежит адсорбция антигенов на соли алюминия и их высвобождение внутри организма вакцинированной мишени. Связывание антигенов с солью алюминия обусловлено взаимодействиями разных типов, такими как физическое улавливание и электростатические взаимодействия между противоположно заряженными молекулами. Кроме того могут образовываться ковалентные связи в результате обмена анионными лигандами, при этом фосфатные группы из антигена заменяются на гидроксильные группы соли алюминия. Посредством указанных взаимодействий разных типов антиген и соль алюминия, используемая в качестве адъюванта, образуют комплекс, в котором связанный антиген может иметь измененную и стабилизированную структуру.
Внутри организма мишени комплекс адъювант-антиген разрушается под действием условий и ферментов, присутствующих в интерстициальной жидкости, антиген отделяется и становится доступным для иммунной системы. Таким образом соль алюминия стимулирует поглощение антигена антиген-презентирующими клетками. Кроме того, алюминиевые соли индуцируют интенсивный ответ Th2, и, следовательно, продукцию антител (Exley et al. 2010, Trends in Immunol., vol. 31, p. 103-109).
В адъюванте на основе гидроксида алюминия соль алюминия находится в виде кристалла бемита. Соль в виде такого кристалла имеет волокнистую структуру, которая в воде образует коллоидный водный гель. Такие адъюванты также могут находиться в виде коммерчески доступных продуктов, таких как: Alhydrogel™ (Brenntag Biosector), Rehydragel™ (Reheis) и Rehsorptar™ (Armour Pharmaceutical). Указанные продукты имеют разные концентрации и разное качество, они также могут отличаться по размеру кристаллов; более мелкие кристаллы обладают более высокой антигенсвязывающей способностью. Адъювант на основе гидроксида алюминия имеет точку нулевого заряда, равную примерно 11, это означает, что при рН ниже 11 он приобретает положительный заряд. Следовательно, при физиологических значениях рН от 6 до 8 адъювант может адсорбировать отрицательно заряженные антигенные белки (Al-Shakshir et al., 1994, Vaccine, vol. 12, p. 472-474).
Адсорбция и образование комплекса вначале протекают быстро, но завершение адсорбции может занять несколько часов. Уровень адсорбции также зависит от связывающей способности используемой соли алюминия. Способность солей алюминия связывать белки можно количественно определить путем анализа связывания с использованием известного количества стандартного белка; стандартный анализ связывания для адъюванта на основе гидроксида алюминия описан в монографии Европейской фармакопии 1664. Коммерческий адъювант на основе гидроксида алюминия обычно связывает до 2,5 мг альбумина на мг алюминия при физиологических значениях рН.
Другим распространенным патогеном свиней, оказывающим большое влияние на экономику, является свиной цирковирус типа 2 (PCV2). Обзор см. в Gillespie et al. (2009, J. Vet. Intern. Med., vol. 23, p. 1151-1163). PCV2 изначально был идентифицирован как агент, вызывающий "мультисистемный синдром истощения после отъема" (PMWS), наблюдающийся у молодых свиней. Клинические и патологические признаки включают прогрессирующее истощение, одышку, тахипноэ и иногда иктерус и желтуху. Свиной цирковирус принадлежит к семейству Circoviridae и представляет собой небольшой (17 нм) икосаэдрический, не имеющий оболочки вирус, капсид которого содержит геном из циклической одноцепочечной ДНК размером примерно 1760 нуклеотидов. Геном содержит лишь несколько открытых рамок считывания, среди которых ORF2 кодирует белок вирусного капсида размером примерно 28 кДа. В нем содержатся основные эпитопы вирус-нейтрализующих антител.
PCV2 является относительно стабильным и очень заразным. Он выделяется с разными секретами организма и распространяется как горизонтально, так и вертикально в стаде свиней. Поскольку PCV2 является лимфотропным, основным повреждением, вызванным инфекцией PCV2, является истощение лимфоидной ткани. Оно приводит к иммуносупрессии, в результате чего животное, инфицированное PCV2, становится восприимчивым к вторичным инфекциям. Следовательно, наряду с PMWS PCV2 также относится к ряду заболеваний свиней, имеющих общее название: цирковирусная болезнь свиней (заболевание свиней, ассоциированное с цирковирусом) (PCVD или PCVAD). Наиболее изученными PCVD являются комплекс респираторных заболеваний у свиней, дерматиты и синдром нефропатии свиней, репродуктивная недостаточность, гранулематозный энтерит, врожденный тремор и экссудативный эпидермодермит.
Однако при отсутствии явных признаков вторичной инфекции большинство PCV2-инфицированных свиней не имеют четких клинических симптомов заболевания. Такие субклинические инфекции PCV2 проявляются только в плохом росте и плохих потребительских качествах практически здоровых свиней.
(Суб)клинические симптомы PCVD, вызванного PCV2, обычно наблюдаются у свиней возрастом 3 или 4 недели и старше, поскольку в это время поросят отлучают от матери и количество защитных антител, полученных из организма матери, начинает снижаться.
Для защиты от PCV2 разработаны коммерческие вакцины, которые используются во всем мире. Существуют следующие типы вакцин: вакцина на основе инактивированного целого вируса PCV2 (Circovac™, Merial) или инактивированного химерного вируса PCV1/PCV2 (Suvaxyn™ PCV/Fostera™ PCV, Zoetis); или субъединичная вакцина на основе экспрессированного рекомбинантными методами капсидного белка (Ingelvac™ CircoFLEX, Boehringer Ingelheim; Porcilis™ PCV/Circumvent™ PCV, Merck/MSD AH). Вакцину последнего типа получают путем рекомбинантной экспрессии ORF2 PCV2 в системе экспрессии бакуловирус/клетка насекомого. Экспрессированные капсиды способны к самосборке с образованием вирусоподобной частицы (VLP). Такая частица напоминает нативный вирион PCV2, но не содержит вирусный геном, и, следовательно, не способна к репликации. Показано, что вакцины на основе таких VLP PCV2 являются безопасными и эффективными уже в дозе 20 микрограмм VLP PCV2 на животного, в сочетании с адъювантом в виде эмульсии типа масло-в-воде (см: WO 07/028823).
В зависимости от типа используемого адъюванта эффективность вакцины против PCV2 обуславливается в большей степени гуморальным или клеточным иммунитетом. Титры можно измерить, например, с помощью коммерческого анализа Elisa: Synbiotics SERELISA™ PCV2 Ab Mono Blocking ELISA. Альтернативно можно использовать непрямой анализ Elisa собственной разработки, описанный в Haake et al. (2014, Vet. Microbiol., vol. 168, p. 272-280).
Вакцины против PCV2 уменьшают репликацию и распространение вируса PCV2. Это приводит к снижению вирусной нагрузки PCV2 в легких и лимфоидной ткани и обеспечивает защиту от истощения лимфоидной ткани, PCVD и горизонтального распространения инфекции. Таким образом, вакцинация восстанавливает общее состояние здоровья и улучшает производственные показатели в стадах вакцинированных свиней, например, она обеспечивает: снижение смертности, улучшение среднесуточного прироста массы и повышение конверсии корма.
Эффективность и защитные свойства вакцины можно измерить путем определения уровней специфических антител против PCV2, или путем определения вирусной нагрузки PCV2 в сыворотке или в выделениях (ротовой полости, назальных, фекальных, мочевых), или путем детекции других патогенов, участвующих в PCVD, методами ПЦР, (иммуно)гистологии, гибридизации или серологии.
Штаммы PCV2, используемые для разработки вакцин, как правило, имеют генотип PCV2a; они также обеспечивают перекрестную защиту от штаммов генотипа PCV2b.
st
Описано, что вакцина против PCV2, содержащая масляный адъювант, такая как Porcilis PCV, индуцирует умеренные или тяжелые местные реакции в участке инъекции. См., например, Astrup & Larsen (2010, Poster no. P.049, in: Proceedings 21 IPVS Congress, Canada, 18-21 July). В течение нескольких дней после прививки наблюдается местный отек размером до нескольких сантиметров. Однако указанные реакции в участке инъекции являются безболезненными и преходящими и, следовательно, находятся в приемлемых пределах. Кроме того, они не коррелируют с соответствующими системными реакциями и не оказывают никакого влияния на эффективность вакцинации. Тем не менее, существует потребность в повышении безопасности вакцин данного типа.
Симптомы заболевания, обусловленного инфекцией PCV2, могут усугубляться инфекцией M.hyo, и наоборот. Поэтому для эффективной защиты свиней требуется вакцинация как против PCV2, так и против M.hyo, обеспечивающая поддержание здоровья свиней и экономическую рентабельность. Таким образом, можно проводить двойную вакцинацию с использованием отдельных одноантигенных вакцин против PCV2 и против M.hyo. Однако с точки зрения простоты введения и экономии трудовых затрат предпочтительно использовать комбинированную вакцину. Кроме того, поскольку молодые свиньи очень чувствительны к стрессогенным факторам окружающей среды, уменьшение числа обработок непосредственно оказывает благоприятное влияние на их здоровье и потребительские характеристики. Еще лучше, если комбинированная вакцина не требует бустерной вакцинации и однократное введение защищает от нескольких болезней в течение всего периода откорма.
Существуют коммерческие комбинированные вакцины против PCV2 и M.hyo, которые позволяют проводить вакцинацию против обоих возбудителей путем однократного введения, см. Kim et al. (2011, Vaccine, vol. 29, p. 3206-3212). Их примеры включают: Circumvent™ PCV-M (MSD AH) и Fostera™ PCV MH (Zoetis), которые представляют собой готовые к применению комбинированные вакцины гибкой дозы в виде эмульсий масло в воде, содержащих масляные адъюванты. В проспектах продукции Fostera PCV MH, Zoetis, написано, что перекрестное взаимодействие антигенов M.hyo и PCV преодолено путем очистки антигена M.hyo методом хроматографии на колонке, содержащей белок A, перед объединением с антигеном PCV2. Однако опытные специалисты понимают, что такая сложная очистка является трудоемкой и дорогой, и снижает экономическую целесообразность вакцинного продукта.
Существует также вакцина Ingelvac™ CircoFLEX/MycoFLEX™ (Boehringer Ingelheim), которая содержит водный полимерный адъювант. Однако указанная последняя вакцина не является готовой к применению и требует наружного смешивания двух компонентов вакцины, содержащихся в разных бутылках, непосредственно перед введением, что является непрактичным.
Таким образом, хотя все указанные вакцины являются эффективными, требуются дополнительные доработки и усовершенствования, касающиеся безопасности, эффективности или простоты применения и приносящие прибыли в области ветеринарии.
st
Ранее описана экспериментальная вакцина против PCV2/M.hyo в адъюванте Emunade (Eggen et al., 2010, Oral presentation no. O.072, in: Proceedings 21 IPVS Congress, Canada, 18-21 July). Данная вакцина обеспечивает достаточно хорошее восстановление поражений легких, вызванных M.hyo (NB: n=8, с учетом выпадающих результатов наблюдений), и индуцирует уровни антител против PCV2, считающиеся эффективными для данного типа вакцины. Эту вакцину получают путем смешивания антигенов M.hyo и PCV2 с пустой эмульсией масло в воде Emunade. Авторы делают вывод, что антигены PCV2 и M.hyo в принципе можно объединить в составе готовой к применению вакцины без иммунологического наложения в организме мишени.
Однако эта вакцина не подходит для крупномасштабной коммерциализации, поскольку используемый антиген PCV2, VLP, очищают до чистоты более 90% путем ультрацентрифугирования в градиенте CsCl. Это делают в попытке повысить безопасность и предотвратить местные реакции. Поскольку этот тип последующей обработки антигенов очень трудоемкий и крайне дорогой, экономически нецелесообразно использовать его в крупном масштабе, особенно в области ветеринарных вакцин, известных высокой стоимостью.
В недавно опубликованной международной патентной заявке WO 2014/182872 описана готовая к применению комбинированная вакцина PCV2/M.hyo. Для получения этой вакцины вначале солюбилизируют антиген M.hyo и смешивают его с сапонином; затем солюбилизируют антиген PCV2 и добавляют его к смеси M.hyo/сапонин. Наконец, смесь солюбилизированных антигенов объединяют с масляным адъювантом или с алюминиевым адъювантом. Ни в одном из примеров не описан способ получения или применения вакцины, содержащей алюминиевый адъювант.
Кроме того, в недавно опубликованном документе демонстрируется, что разработка готовой к применению комбинированной вакцины PCV2/M.hyo еще является очень сложной: компания Boehringer Ingelheim, производящая и поставляющая на рынок вакцину Ingelvac™ CircoFLEX/MycoFLEX™ для наружного смешивания, недавно выпустила пресс-заявление, что она прекращает свои усилия по разработке готовой к применению комбинированной вакцины PCV2/M.hyo. Это обусловлено невозможностью достичь приемлемых уровней безопасности и эффективности. В корпоративном пресс-релизе от 1 сентября 2014 года Boehringer Ingelheim (www.boehringer-ingelheim.com/ news/news_releases/ press_releases/2014/01_september_2014animal.html) заявляет: "Boehringer Ingelheim Animal Health, лидирующий на рынке производитель свиных вакцин, принял решение сосредоточиться на свежесмешанных готовых к применению комбинированных вакцинах против свиного цирковируса 2 (PCV2)/Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), и не продолжать разработку готовой к применению (RTU) комбинированной вакцины PCV2/M.hyo. Как следствие, компания прекратила свою исследовательскую программу по разработке PCV2/M.hyo RTU. Хотя начальные результаты были многообещающими, со временем стало очевидным, что в данном случае дизайн RTU не отвечает высоким стандартам эффективности и безопасности, которыми отличается платформа Boehringer Ingelheim's FLEXcombo".
Таким образом, в данной области остается потребность в усовершенствованной комбинированной вакцине против M.hyo и PCV2, которая является эффективной и безопасной, удобной для потребителей и экономически целесообразной.
Следовательно, целью настоящего изобретения является преодоление недостатков, присутствующих в известном уровне техники, и удовлетворение указанной потребности, существующей в данной области, путем получения комбинированной вакцины против PCV2/M.hyo, которая обеспечивает эффективную защиту от инфекций PCV2 и М.hyo, а также от вызванных ими заболеваний уже после однократного введения, характеризуется очень высоким уровнем безопасности при введении и готова к применению.
Вначале авторы настоящего изобретения были разочарованы, узнав, что результатов, опубликованных Eggen et al. (выше), нельзя достичь при использовании стандартного антигена PCV2, VLP. Такой стандартный антиген используется в коммерческих вакцинах PCV2 VLP, таких как вакцины Porcilis PCV/Circumvent PCV. Он характеризуется приемлемым уровнем безопасности и является весьма эффективным. Однако для его получения вместо методов, обеспечивающих высокую степень очистки, используют экономически более обоснованные методы последующей обработки. Полученный в результате антиген является гораздо менее чистым.
С помощью способа, предложенного Eggen et al., авторы изобретения просто объединили бактерин M.hyo и указанный стандартный антиген PCV2, VLP, с пустым адъювантом Emunade. К сожалению, полученная вакцина обеспечивает менее половины от нормального уровня защиты против инфекции M.hyo: поражение легких уменьшается лишь на 30%, тогда как при использовании вакцины, содержащей только антиген M.hyo в Emunade (M+Pac™), оно уменьшается на 66%. Результаты приведены ниже в разделе Примеры.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что эффективность вакцины против M.hyo в готовой к применению комбинированной вакцине для свиней против PCV2/M.hyo можно довести до желательного уровня путем применения особого процесса при получении композиции, содержащей вакцинные антигены, включающего добавление антигена PCV2 только после образования комплекса антигена M.hyo с гидроксидом алюминия, используемым в качестве адъюванта.
Кроме того, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что описанная здесь комбинированная вакцина против PCV2/M.hyo имеет значительно улучшенный профиль безопасности по сравнению с одноантигенной вакциной против PCV2.
Комбинированная вакцина против PCV2/M.hyo, которую можно получить на основе указанной, полученной с помощью особого способа антигенной композиции, является в высокой степени эффективной в отношении инфекций PCV2 и М.hyo, а также вызванных ими заболеваний уже после однократного введения, характеризуется очень высоким уровнем безопасности при введении, готова к применению и является экономически целесообразной, поскольку она может содержать антиген PCV2, не имеющий высокой степени чистоты. Фактически эффективность вакцины равна эффективности одноантигенных вакцин против M.hyo или PCV2. Кроме того, безопасность при введении является полной с точки зрения отсутствия индуцированных вакциной местных или системных реакций у свиней.
Поскольку комбинированная вакцина может использоваться в свиноводстве в большом масштабе, указанные эффекты и усовершенствования являются существенными, представляя собой неожиданный технический эффект, который имеет большое коммерческое значение. Таким образом можно достичь цели настоящего изобретения, и следовательно, преодолеть недостатки предшествующего уровня техники.
В настоящее время не известно, почему антиген PCV2 должен отсутствовать в момент адсорбции антигена M.hyo на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта. Также неизвестно, почему безопасность новой комбинированной вакцины против PCV2/M.hyo так высока.
Не желая быть связанными с какой-либо теорией или моделью, которая могла бы объяснить указанные результаты наблюдений, авторы изобретения полагают, что антиген PCV2, присутствующий при образовании комплекса между антигеном M. hyo и гидроксидом алюминия, используемым в качестве адъюванта, может препятствовать некоторым образом, или в некоторой форме, эффективной адсорбции антигена M.hyo на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта. Кроме того, антиген PCV2, который не связывается, как антиген M.hyo, с гидроксидом алюминия, используемым в качестве адъюванта, может участвовать в образовании комплекса. Таким или другим способом он препятствует последующему развитию иммунного ответа на антиген M.hyo.
Предположительной так же является причина повышенной безопасности новой комбинированной вакцины. Безопасность может повышаться за счет некоторого взаимодействия данного антигена с компонентами двойного адъюванта Emunade: минеральным маслом и гидроксидом алюминия, причем указанное взаимодействие не наблюдается в масляном адъюванте в отсутствии алюминия. Это взаимодействие может уменьшить активность веществ, входящих в состав антигена PCV2, которая может привести к реакции в участке инъекции.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения антигенной композиции готовой к применению комбинированной вакцины для свиней, где композиция содержит антигены Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) и свиного цирковируса 2 типа (PCV2), а способ отличается тем, что включает в себя стадию добавления антигена PCV2 к уже образовавшемуся комплексу антиген/адъювант, содержащему антиген M.hyo, адсорбированный на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта.
В соответствии с настоящим изобретением термин "готовый к применению" означает: не требующий объединения (компонентов) содержимого 2 или более контейнеров перед введением животному-мишени. Например: не требующий стадии растворения или смешивания и доступный для конечного пользователя в виде эмульсии в одном флаконе.
При получении готовой к применению вакцины необходимое объединение соединений выполняет производитель вакцины в контролируемой среде. Это имеет разные преимущества по сравнению со смешиванием на поле, заключающиеся, в основном, в простоте применения для конечного пользователя, особенно при вакцинации большого числа животных. Другие преимущества заключаются в том, что производитель может проводить объединение в асептических условиях и использовать разные тесты для подтверждения качества конечной смеси, чтобы гарантировать, что она имеет правильный состав и надлежащее качество.
Однако это не исключает того, что готовая к применению вакцина может потребовать какой-то простой предварительной обработки, такой как краткое встряхивание вручную, чтобы преодолеть оседание или расслаивание эмульсии, или нагревание перед введением, если вакцину хранят в холодильнике.
Термин "свиньи" относится к животным семейства Suidae, предпочтительно к животным рода Sus, которые также упоминаются как свинообразные. Их примерами могут служить: дикая или домашняя свинья, боров, кабан, бабирусса или бородавочник. Этот термин также включает произвольные названия свиней, например, указывающие на их пол и возраст, такие как: свиноматка, плодущая самка, кабан, кастрированный хряк, боров, молодая свинья, отъемыш или поросенок.
Термины "Mycoplasma hyopneumoniae" (M.hyo) и "свиной цирковирус 2 типа" (PCV2) относятся соответственно к бактериальным и вирусным микроорганизмам, которые имеют отличительные признаки членов таксономических групп, такие как морфологические, геномные и биохимические характеристики, а также биологические характеристики этой группы, например, в их физиологическом, иммунологическом или патологическом проявлении. Это термин также включает любые классификационные подгруппы бактерий M.hyo и вирусов PCV2, соответственно, такие как подвид, штамм, изолят, генотип, вариант, подтип, подгруппа и т.п.
Оба микроорганизма хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в таких справочниках, как "The Merck veterinary manual" (10th ed., 2010, C.M. Kahn edt., ISBN: 091191093X), и "Diseases of Swine" (10th ed., 2012, J. Zimmerman et al., edt., ISBN-10: 081382267X).
Для специалистов в данной области очевидно, что, хотя бактерии M.hyo или вирусы PCV2, в соответствии с этим изобретением, в настоящее время относят к конкретным видам и родам, это таксономическая классификация, которая может изменяться со временем, по мере того, как новые представления приводят к переклассификации в новые или другие таксономические группы. Однако, поскольку переклассификация не изменяет сам микроорганизм, или его антигенный состав, а только его научное название или классификацию, такие переклассифицированные микроорганизмы также входят в объем настоящего изобретения.
В соответствии с этим изобретением, "антигены" микроорганизма, как правило, могут относиться к любому типу антигенного материала, полученного из бактерии M.hyo или из вируса PCV2, при условии, что они могут индуцировать иммунный ответ (либо самостоятельно, либо в присутствии адъюванта). Предпочтительно соответствующий антигенный материал имеет размер, структуру, форму или качество, обеспечивающие, например, индукцию защитного иммунного ответа у вакцинированной свиньи-мишени, т.е. иммунного ответа, достаточно сильного, чтобы предотвратить или уменьшить инфекцию M.hyo или PCV2 и связанных с ней симптомов заболевания.
В качестве антигена в настоящем изобретении можно использовать инактивированный микроорганизм или его часть, такую как субъединица, экстракт, фракция, гомогенат или гомогенат, полученный под воздействием ультразвука. Антиген может содержать молекулы одного или нескольких типов, такие как белок, липопротеин, гликопротеин и нуклеиновая кислота. Антиген может иметь биологическое или (полу)синтетическое происхождение и может быть получен непосредственно или косвенно из микроорганизма, такого как бактерия M.hyo, или вирус PCV2.
Примером антигена M.hyo является бактерин. Его можно получить с помощью способов, хорошо известных в данной области техники, путем инактивации целой бактериальной культуры или ее части. Инактивацию можно проводить любым подходящим способом, например, путем нагревания, облучения, или обработки химическими веществами, такими как формалин, бета-пропиолактон, бинарный этиленимин (BEI) или бета-этаноламин. Полученный в результате бактерин представляет собой сложную смесь убитых бактериальных клеток, как интактных, так и поврежденных, фрагментов клеток, клеточного содержимого, а также факторов, секретированных из клеток во время культивирования, а также факторов, присутствующих в культуральной среде, и разных компонентов среды.
Примером антигена PCV2 является субъединичная вакцина, например, содержащая белок капсида вируса, обычно используемый в данной области. Его можно получить путем рекомбинантной экспрессии геномной последовательности вирусного ORF2, например, в системе бакуловирус/клетка насекомого. Затем из культуры клеток насекомых можно выделить сформировавшиеся в результате самосборки VLP, например, путем центрифугирования.
Термин "содержит" (а также его вариации, такие как "содержать", "содержащий" и "содержал"), в соответствии с данным описанием, относится ко всем элементам, а также к любым их возможным сочетаниям, подходящим для применения в этом изобретении, указанным или присутствующим в разделе, абзаце, пункте текста и т.д., в котором используется этот термин, даже если такие элементы или сочетания не указаны в явной форме; и не исключает никакой из указанных элементов или их сочетание. Следовательно, любой такой раздел, абзац, пункт текста и т.д., также может относиться к одному или нескольким вариантам осуществления, в которых термин "содержит" (или его вариации) заменяется на такие термины, как "состоит из", "состоящий из" или "в основном состоит из".
Термин "комплекс антиген/адъювант" относится к макромолекулярной структуре, которая образуется в результате адсорбции (компонентов) антигена M.hyo на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, как указано в настоящем документе. Поскольку эта адсорбция происходит благодаря ряду физических и химических взаимодействий, комплекс не может быть точно определен в химических терминах. Состав и структура комплекса также зависят от состава и характеристик антигена и используемого адъюванта, а также от условий, в которых он образуется. Это хорошо известно и признано в данной области техники. Необходимые и предпочтительные характеристики антигена и адъюванта, а также условия образования их комплекса, описаны в данном документе.
Термин "предварительно образованный" указывает на то, что образование комплекса антиген/адъювант, к которому относится этот термин, происходит в более ранний момент времени. В соответствии с настоящим изобретением это означает, что комплекс антигена M.hyo и гидроксида алюминия, используемого в качестве адъюванта, образуется до добавления антигена PCV2 к композиции, и следовательно, образование комплекса происходит в отсутствие антигена PCV2.
Авторы настоящего изобретения полагают, что это позволяет конкретному антигену M.hyo адсорбироваться на гидроксиде алюминия, используемому в качестве адъюванта, настолько полно, насколько это возможно, в условиях, исключающих препятствующее воздействие со стороны антигена PCV2, или совместное улавливание антигена PCV2. В результате иммунный ответ против антигена M.hyo, индуцированный вакциной, полученной из антигенной композиции согласно настоящему изобретению, является оптимальным.
Общие условия адсорбции антигена на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, хорошо известны в данной области и описаны, например, в фармацевтических справочниках, государственных руководствах по производству (человеческих) вакцин, а также в инструкциях производителей адъювантов. Однако гидроксид алюминия, используемый в качестве адъюванта, и бактерин, используемый в качестве антигена M.hyo, не имеют четко определенного состава. Поэтому трудно точно определить условия процесса, а также конечные уровни, необходимые для образования комплекса антиген/адъювант настоящего изобретения. Тем не менее, специалист в области получения фармакологических композиций, такой как биохимик или фармацевт, или группа таких специалистов, может легко изменить и оптимизировать указанные условия с целью достижения максимально возможной адсорбции конкретного антигена M.hyo на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта. Затем можно определить уровень достигнутой адсорбции и сравнить влияние разных условий и материалов.
Например, поскольку кристаллы гидроксида алюминия можно легко осадить центрифугированием, с помощью биохимических методов можно легко определить, адсорбируется ли в действительности антиген M.hyo на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, и, если да, то в каком количестве. С помощью таких методов можно определить количество антигена M.hyo в указанном осадке, которое свидетельствует о степени образования комплекса антиген/адъювант; альтернативно можно определить количество антигена M.hyo в супернатанте, если образование комплекса не произошло, или не завершено.
Детекцию антигенов M.hyo в осадке или супернатанте можно проводить с использованием антител, например, методом ELISA, как описано в примерах. Альтернативно можно отделить связанный антиген M.hyo от осажденного гидроксида алюминия, используемого в качестве адъюванта, и анализировать высвобожденный антиген, например, методом электрофореза. Отделение антигена можно проводить разными способами, например, путем изменения рН с использованием фосфат-ионов, или путем обработки осадка ультразвуком. Все указанные методы описаны в данной области.
Дальнейшую оптимизацию можно проводить на основе определения, какой адсорбционной емкостью обладает адъювант гидроксид алюминия в условиях образования комплекса с антигеном M.hyo. Для этого можно провести последующее образование комплекса с использованием конкретного количества известного белка, и определить, сколько указанного тестируемого белка может быть дополнительно связано; например, с помощью анализа связывания, описанного в Ph. Eur. monograph 1664. Полученный результат показывает, существует ли адсорбционная емкость, и если да, какова ее величина.
Для конкретного антигена M. hyo или конкретного адъюванта на основе гидроксида алюминия, образование комплекса является максимально полным, если количество антигена M.hyo в комплексе антиген/адъювант нельзя дополнительно увеличить в значимой степени, например, путем изменения условий адсорбции, таких как температура, рН, продолжительность взаимодействия или относительные количества компонентов. Кроме того, образование комплекса является максимально полным, если связывающая способность адъюванта на основе гидроксида алюминия используется в максимальной степени для связывания антигена M.hyo, и по существу не может быть дополнительно уменьшено.
Например, антигенную композицию можно получить с помощью способа настоящего изобретения. Ее можно центрифугировать и затем полученные осадок и супернатант можно анализировать по отдельности. С помощью поликлональной кроличьей антисыворотки против M.hyo можно анализировать диапазоны разведения супернатанта или ресуспендированного осадка, например, в формате Elisa, чтобы определить относительное количество антигена M.hyo.
Обнаружено, что некоторые условия обеспечивают оптимальное образование комплекса антиген M.hyo/адъювант на основе гидроксида алюминия.
Таким образом, в одном варианте осуществления способа настоящего изобретения комплекс антиген/адъювант получают заранее с помощью следующих стадий:
a. смешивание адъюванта на основе гидроксида алюминия и антигена M.hyo в водном носителе при таком значении рН, при котором гидроксид алюминия, используемый в качестве адъюванта, является положительно заряженным, и
b. инкубацию смеси, полученной на стадии a., обеспечивающую адсорбцию антигена M.hyo на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, с образованием комплекса антиген/адъювант.
"Водный носитель", как правило, может представлять собой любую водосодержащую жидкость, при условии, что она способствует эффективному и полному образованию комплекса антиген/адъювант. В предпочтительном варианте осуществления водный носитель является относительно простым и содержит только буферы или соли, растворенные в очищенной воде, например, водный носитель может представлять собой физиологический буфер, такой как сбалансированный солевой раствор, или физиологический раствор соли, также называемый "нормальный физиологический раствор"; такой раствор хорошо известен и содержит 0,85% масс/объем хлорида натрия в очищенной воде. В соответствии с настоящим изобретением, жидкость является "водной", если содержание воды в ней составляет более 50% по объему или массе.
"Очищенная вода" предпочтительно представляет собой "воду для инъекций"; как правило, такая вода включает дистиллированную воду, бидистиллированную воду, воду, очищенную методом микрофильтрации, или воду, очищенную методом осмоса, которая является стерильной и практически не содержит пирогены.
Как известно в данной области техники: термин "положительно заряженный" относится к соединению, имеющему общий положительный заряд в водном растворе при определенных условиях.
Диапазон рН, в котором гидроксид алюминия, используемый в качестве адъюванта, является положительно заряженным, включает значения от 0 до примерно 11, где 11 является точкой нулевого заряда. Следовательно, в условиях, включающих значения рН до примерно 11, антиген M.hyo может эффективно связываться с гидроксидом алюминия, используемым в качестве адъюванта. Однако, поскольку при высоких или низких значениях рН может происходить некоторая денатурация антигена M.hyo, предпочтительно использовать более физиологические значения рН. Таким образом, рН водного носителя предпочтительно составляет от 5 до 10, более предпочтительно от 5,5 до 9, от 6 до 8, или даже от 6,2 до 7,8. Наиболее предпочтительные значения рН водного носителя составляют примерно от 6,5 до 7,5. При таких значениях рН антиген M.hyo находится в физиологических условиях, а гидроксид алюминия, используемый в качестве адъюванта, еще является положительно заряженным, и следовательно, антиген M.hyo может эффективно адсорбироваться.
Условия для «инкубацию смеси со стадии а.» также не очень критично, хотя эффективное формирование антиген/адъювантного комплекса требуется.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что адсорбция антигена M.hyo на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, начинается быстро после смешивания обоих компонентов, но для ее завершения требуется определенное время. Таким образом, предпочтительный период инкубации смеси, указанный на стадии a., составляет по меньшей мере 15 минут, более предпочтительно, по меньшей мере 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 24 часов, в указанном порядке предпочтения. На практике инкубацию предпочтительно проводят "в течение ночи", что соответствует периоду, составляющему примерно от 12 до 18 часов.
Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что адсорбция антигена M.hyo на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, может протекать в широком диапазоне температуры; эффективная адсорбция наблюдается как при охлаждении до температуры 4°С, так и при комнатной температуре. Однако в данной области хорошо известно, что адъювант на основе гидроксида алюминия не следует замораживать, чтобы не повредить кристаллическую структуру. Кроме того, при температуре, значительно превышающей нормальную температуру тела млекопитающего, которая для свиней составляет от 38 до 40°С, может наблюдаться некоторая денатурация антигена M.hyo. Поэтому предпочтительная температура инкубации смеси, описанной на стадии a., находится в диапазоне примерно от 2 до 45 градусов Цельсия. Более предпочтительно, она составляет от 4 до 40°С, или даже от 10 до 38°С. Наиболее предпочтительной является "комнатная температура", также называемая "температура окружающей среды", которая находится в диапазоне примерно от 15 до 30°С.
С учетом вязкой природы геля, в виде которого находится гидроксид алюминия, используемый в качестве адъюванта, во время инкубации на стадии а. способа настоящего изобретения смесь предпочтительно приводят в движение. Однако в данной области хорошо известно, что энергичное перемешивание гидроксида алюминия, используемого в качестве адъюванта, может привести к повреждению кристаллической структуры. Поэтому предпочтительным является осторожное перемешивание смеси. Примером может служить перемешивание с помощью магнитной мешалки или разных форм шейкеров или платформ, которые обеспечивают слабое вращательное или качательное движение. Все они, как правило, являются доступными. В данном изобретении осторожное перемешивание - в случае смешивающего или вращательного движения - составляет 250 оборотов в минуту или менее, предпочтительно 150 оборотов в минуту или менее; один "оборот" представляет собой завершение движения по кругу с возвращением в исходное положение. В случае качательного движения: 200 циклов/мин или менее, предпочтительно 100 циклов/мин или менее. Один "цикл" представляет собой завершение последовательности движений вверх и вниз с возвращением в исходное положение.
Антигены, используемые в способе настоящего изобретения:
1
10
4
10
6
10
7
9
7
9
Антиген M.hyo предпочтительно представляет собой бактерин, полученный из целой культуры; бактерин предпочтительно инактивируют BEI; бактерин предпочтительно концентрируют в 10-30 раз, например, методом (ультра)фильтрации или диализа. Как отмечено, состав бактерина точно не известен, однако его можно охарактеризовать, например, путем указания числа клеток M.hyo в культуре во время инактивации, и скорректировать во время концентрирования. В настоящем изобретении антиген M.hyo, представляющий собой бактерин, получают из культуры M.hyo, содержащей от 10 до 10 клеток M.hyo на мл целой культуры. Предпочтительно от 10 до 10; от 10 до 10; от 10 до 5×10; и от 5×10 до 5×10 клеток M.hyo/мл целой культуры, в указанном порядке предпочтения. Антиген M.hyo, используемый для получения антигенной композиции согласно настоящему изобретению, получают из инактивированной суспензии такой культуры. Его также можно сконцентрировать фильтрованием или центрифугированием.
Предпочтительно количество антигена M.hyo, добавляемое на стадии a., рассчитывают с учетом последующего добавления антигенной композиции, полученной по указанному способу, с получением вакцины. Это означает, что, если конечная вакцина также содержит определенный объем масляной фазы, количество антигена M.hyo в антигенной композиции корректируют с учетом последующего разведения.
Объем бактерина M.hyo из инактивированной и концентрированной культуры может находиться в диапазоне от 1 до 50% об/об по отношению к объему конечной композиции вакцины. Предпочтительно его содержание составляет от 2 до 40%, от 3 до 30%, от 4 до 20%, или примерно от 5 до 15% об/об по отношению к объему конечной композиции вакцины, в указанном порядке предпочтения.
Предпочтительно антиген M.hyo получают из штамма J, штамма 11 или штамм 232 M.hyo. Более предпочтительно антиген M.hyo получают из штамма J.
7
9
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления способа настоящего изобретения антиген M.hyo представляет собой бактерин, который получают путем химической инактивации культуры M.hyo штамма J с плотностью клеток примерно от 10 до 10 клеток/мл и концентрирования инактивированной культуры путем фильтрации в 10-20 раз, после чего инактивированную, концентрированную культуру используют в количестве, составляющем примерно от 5 до 10% об/об по отношению к объему конечной композиции вакцины, содержащей антиген M.hyo.
Антиген PCV2 предпочтительно представляет собой субъединицу, кодируемую ORF2, и предпочтительно находится в виде VLP. Антиген VLP предпочтительно не является высоко очищенным. Количество антигена PCV2, добавляемое на стадии b. способа настоящего изобретения, предпочтительно составляет примерно от 2 до 200 мкг/мл PCV2 ORF2 VLP. Более предпочтительно оно составляет от 4 до 100 мкг/мл PCV2 ORF2 VLP.
Как и в случае антигена M.hyo, количество добавляемого антигена PCV2 предпочтительно рассчитывают с учетом последующего добавления антигенной композиции, полученной по указанному способу, с получением вакцины. Это означает, что, если конечная вакцина также содержит определенный объем минерального масла, количество антигена PCV2 в антигенной композиции корректируют с учетом последующего разведения. На стадии b. добавляют такое количество антигена PCV2, которое обеспечивает содержание ORF2 VLP в конечной вакцине, составляющее, по меньшей мере, 20 мкг/дозу.
Поскольку антиген PCV2 является только частично очищенным, он может представлять собой образец, полученный путем инактивации и центрифугирования культуры клеток насекомых/бакуловируса, с содержанием общего белка от 50 до 1000 мкг/мл. Кроме того, с практической точки зрения это означает, что объем антигена PCV2 составляет примерно от 3 до 30% по отношению к объему конечной композиции вакцины. Более предпочтительно он составляет от 5 до 25, или даже примерно от 10 до 20% об/об по отношению к объему конечной композиции вакцины.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления способа настоящего изобретения антиген PCV2 представляет собой кодируемый ORF2 субъединичный антиген в виде VLP, который получают путем химической инактивации и центрифугирования экспрессионной культуры клеток насекомых/бакуловируса, причем конечная композиция вакцины содержит такое количество антигена PCV2, которое обеспечивает содержание по меньшей мере 20 мкг ORF2 VLP в дозе, рассчитанной на одного животного.
Особые взаимозависимости между антигенами M.hyo и PCV2, такие как тип или количество в пересчете на дозу, отсутствуют. Следовательно, при необходимости типы антигенов и/или их относительные количества в антигенной композиции согласно настоящему изобретению могут варьировать независимо друг от друга, при условии, что они обеспечивают эффективное образование комплекса антиген/адъювант и эффективный результат вакцинации.
Чтобы определить количество антигена в партии M.hyo или PCV2, необходимое для получения антигенной композиции и вакцины настоящего изобретения, как правило, проводят количественное определение активного вещества in vitro. С помощью такого анализа также можно установить, что новая партия антигена M.hyo или PCV2 имеет нужную антигенную массу. Такой анализ на внутреннее высвобождение из партии, как правило, проводят путем определения антигенной массы методом Elisa. Для проведения такого анализа можно использовать, например, поликлональную антисыворотку против M.hyo или PCV2, полученную, например, путем иммунизации кроликов, и эталонный стандарт антигена M.hyo или PCV2. Эффективность эталонного антигена определяют с помощью ряда экспериментов по вакцинации-стимуляции антигеном, в котором устанавливают соответствие определенного числа условных единиц антигена с желательной эффективностью вакцинации. Примером является содержание регистрационного файла: вакцина настоящего изобретению должна содержать по меньшей мере 2,7 "условных единиц активности" бактерина как антигена M.hyo и по меньшей мере 2800 "антигенных единиц" антигена PCV2 на дозу вакцины объемом 2 мл. Указанные количества антигенов, содержащиеся в вакцине настоящего изобретения, определены для того, чтобы гарантировать эффективную защиту от тяжелой инфекции M.hyo и PCV2, как описано в настоящем описании.
Чтобы обеспечить необходимую эффективность, доза вакцины настоящего изобретения, предназначенная для одного животного, должна содержать бактерин, используемый в качестве антигена M.hyo, в количестве от 5 до 15%, а антиген PCV2 в количестве от 10 до 20% по отношению к объему конечной композиции вакцины, содержащей указанные антигены.
Разработка такого теста по выпуску партии, включающего получение соответствующей антисыворотки и эталонных стандартов, относится к компетенции рядового специалиста в данной области.
Количество адъюванта на основе гидроксида алюминия, используемое для смешивания с антигеном M.hyo, должно быть достаточным, чтобы обеспечить максимально полную адсорбцию антигена M.hyo. С другой стороны, используемое количество адъюванта на основе гидроксида алюминия должно соответствовать допустимым пределам количества алюминия в дозе, предназначенной для одного животного, а также должно быть совместимым с составом вакцины, полученной с использованием антигенной композиции по способу настоящего изобретения. В предпочтительном варианте осуществления смесь, полученная на стадии а., содержит количество адъюванта на основе гидроксида алюминия, соответствующее содержанию алюминия примерно от 0,1 до 10 мг/мл; предпочтительно, примерно от 0,5 до 5 мг/мл. Для достижения данной цели можно использовать, например, коммерческий адъювант на основе гидроксида алюминия, такой как Alhydrogel™, который в одном варианте существует в виде "2%" раствора. Это определение является не совсем корректным, поскольку относится к продукту, содержащему примерно 2% масс/масс оксида алюминия, что соответствует примерно 3% масс/масс гидроксида алюминия и примерно 1% масс/объем алюминия. Такой продукт можно использовать в объеме, составляющем от 3 до 30% от объема конечной композиции вакцины. Предпочтительно адъювант на основе гидроксида алюминия используют в количестве, составляющем от 4 до 20% об/об, предпочтительно примерно от 5 до 15% об/об по отношению к объему конечной композиции вакцины.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления способа настоящего изобретения антигенная композиция содержит антиген M.hyo в количестве от 5 до 15% об/об, адъювант на основе гидроксида алюминия в количестве от 5 до 15% об/об, и антиген PCV2 от 10 до 20% об/об, где содержание всех компонентов указано по отношению к объему конечной композиции вакцины.
В одном варианте осуществления антигенную композицию согласно настоящему изобретению используют как основу для полной водной фазы вакцины, которую получают из указанной антигенной композиции. Так, если вакцину получают в виде эмульсии, содержащей, например, 10 или 20% масляной фазы, водная фаза составляет 90 или 80%, соответственно, от конечной композиции вакцины. Указанная водная фаза содержит антигенную композицию согласно настоящему изобретению, включающую в себя комплекс антигена M.hyo с адъювантом на основе гидроксида алюминия, водный носитель и антигены PCV2. Точное объемное содержание разных соединений в антигенной композиции согласно настоящему изобретению может варьировать, например, относительный объем используемого антигена M.hyo или PCV2 может варьировать в зависимости от активности конкретной используемой партии антигена, как описано выше. Кроме того, водная фаза вакцины также может содержать другие компоненты, такие как наполнители, стабилизаторы, консерванты, поверхностно-активные вещества, другие антигены и любые другие соединения или растворы, необходимые для получения конечной вакцины. В соответствии с настоящим изобретением, различия в объемах компонентов водной фазы, используемой для получения вакцины, компенсируют за счет изменения объема водного носителя, с достижением нужного общего объема водной фазы.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что образование комплекса антиген/адъювант настоящего изобретения предпочтительно проводить в относительно малом объеме; это обеспечивает оптимальный контакт для адсорбции антигена M.hyo на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта. Однако вследствие гелеобразной природы адъюванта на основе гидроксида алюминия использование смеси, содержащей только антиген M.hyo и определенный объем коммерческого адъюванта на основе гидроксида алюминия, не может дать наилучшие результаты, для получения которых адъювант, как правило, нужно разбавить в некоторой степени. Поэтому образование комплекса антиген/адъювант проводят в смеси, которая также содержит водный носитель.
Как описано выше, указанный водный носитель также используют для корректировки объема водной фазы при получении вакцины.
В предпочтительном варианте осуществления образование комплекса антиген/адъювант настоящего изобретения проводят в смеси, содержащей водный носитель, где объем водного носителя, присутствующего при образовании комплекса, меньше общего объема водного носителя, используемого для получения полной водной фазы и последующего получения вакцины. Это означает, что, если полная водная фаза, используемая для получения вакцины, содержит водный носитель в некотором объеме Х, то для получения комплекса антиген/адъювант используют водный носитель в объеме, меньшем, чем указанный объем Х; предпочтительно в объеме, составляющем 75% от объема X, более предпочтительно 50, 40, 33, 30, 25, 20 или даже 10% от объема X, в указанном порядке предпочтения. Остальную часть объема водного носителя можно добавить к антигенной композиции после образования комплекса антиген/антитело.
Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что для образования комплекса антигена M.hyo и адъюванта на основе гидроксида алюминия предпочтительно, чтобы смесь, полученная на стадии а., была как можно более простой, а это означает: предпочтительно не добавлять в смесь другие компоненты, которые составляют полную водную фазу, до образования комплекса антиген/адъювант. Указанные другие компоненты могут представлять собой наполнители, стабилизаторы, консерванты, поверхностно-активные вещества, другие антигены и т.д.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления смесь, полученная на стадии а. способа настоящего изобретения, содержит антиген M.hyo, адъювант на основе гидроксида алюминия (которые оба, возможно, уже содержат некоторое количество водного носителя) и водный носитель.
Примеры соединений, которые, могут быть добавлены к водной фазе перед эмульгированием с получением конечной вакцины, но предпочтительно после образования комплекса антиген M.hyo/гидроксид алюминия, используемый в качестве адъюванта, включают: стабилизаторы, такие как этанол или глицерин, другие антигены или поверхностно-активные вещества, такие как Tween™.
Таким образом, предпочтительный вариант осуществления способа настоящего изобретения включает применение одного или нескольких, или всех нижеследующих условий:
- антиген M.hyo представляет собой бактерин M.hyo,
- антиген PCV2 кодируется ORF2 PCV2,
- ORF2 PCV2-кодируемый антиген представляет собой вирус-подобную частицу,
- водный носитель, используемый на стадии а., представляет собой сбалансированный солевой раствор,
- рН водного носителя, используемого на стадии а., находится в диапазоне от 6 до 8,
- объем водного носителя, используемый на стадии а., меньше, чем общий объем водного носителя, используемый для получения водной фазы и конечной вакцины,
- смесь, полученная на стадии а., практически не содержит других компонентов,
- инкубацию на стадии b. проводят в течение периода, составляющего от 10 до 20 часов,
- инкубацию на стадии b. проводят при комнатной температуре и/или
- инкубацию на стадии b. проводят при осторожном перемешивании инкубируемой смеси.
В предпочтительном варианте осуществления способа настоящего изобретения комплекс антиген/адъювант получают заранее с помощью следующих стадий:
a. добавление адъюванта на основе гидроксида алюминия и бактерина M.hyo в физиологический раствор при рН от 6,5 до 7,5 и
b. инкубация смеси, полученной на стадии a., обеспечивающая адсорбцию бактерина M.hyo на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, и образование комплекса антиген/адъювант, где инкубацию проводят при температуре от 15 до 30°С в течение 12-18 часов, при осторожном перемешивании смеси.
В соответствии с настоящим изобретением, термин "практически не содержит" соединение означает: не содержит какое-либо существенное количество соединения, например: содержит менее 10% по массе или по объему соединения, в зависимости от того, является ли соединение жидкостью или твердым веществом. Среды, которые практически не содержат соединение, предпочтительно содержат менее 8, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,09, 0,05, 0,01, или даже менее 0,001% по массе или по объему соединения, в указанном порядке предпочтения.
Как может оценить специалист в данной области, способ настоящего изобретения можно проводить с применением стадий, описанных в настоящем документе, в хронологическом порядке, то есть: смешивание антигена M.hyo и адъюванта на основе гидроксида алюминия в водном носителе, инкубирование их с образованием комплекса антиген/адъювант и добавление антигена PCV2 к ранее полученному комплексу; все указанные стадии описаны в настоящем описании.
Однако в начало, середину или конец способа можно добавить или вставить одну или несколько стадий, например, с целью масштабирования или оптимизации способа. Например: после стадии b. полученный комплекс антиген/адъювант можно хранить, или его можно очистить, если это необходимо, например, путем центрифугирования и ресуспендирования. Все такие стадии входят в объем настоящего изобретения.
С помощью способа согласно настоящему изобретению можно получить антигенную композицию, которые может служить основой водной фазы, используемой для получения готовой к применению комбинированной вакцины для свиней, где указанная вакцина может предотвращать или уменьшать инфекцию M.hyo или PCV2 и связанные с ней симптомы заболевания уже после введения одной дозы.
Таким образом, в следующем аспекте настоящее изобретение относится к антигенной композиции, полученной с помощью способа настоящего изобретения. Антигенная композиция содержит антиген PCV2 и комплекс антиген/адъювант, включающий антиген M.hyo, адсорбированный на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, как описано в настоящем описании.
Антигенная композиция согласно настоящему изобретению отличается от известных композиций тем, что она содержит комплекс антигена M.hyo и адъюванта на основе гидроксида алюминия, где антиген M.hyo адсорбируется на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, в степени, максимально возможной для этой партии антигена M.hyo и используемого адъюванта на основе гидроксида алюминия.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления антигенная композиция согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что по меньшей мере 50% антигена M.hyo, присутствующего в антигенной композиции, адсорбируется на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, и находится в составе комплекса антиген/адъювант.
Это можно подтвердить путем следующего анализа: после центрифугирования антигенной композиции согласно настоящему изобретению в течение 1-2 мин при 1000-2000 g проводят детекцию антигена M.hyo с помощью соответствующих серодиагностических методов, как описано в настоящем описании, где результаты детекции демонстрируют, что по меньшей мере 50% антигена M.hyo, присутствующего в антигенной композиции, находится в осадке.
Так определяют относительное количество антигена M.hyo, адсорбированного на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, и находящегося в составе комплекса антиген/адъювант.
Предпочтительно относительное количество антигена M.hyo, присутствующего в антигенной композиции согласно настоящему изобретению, адсорбированного на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, и находящегося в составе комплекса антиген/адъювант, составляет более 60%; более предпочтительно, более 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%, в указанном порядке предпочтения.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления антигенная композиция согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что 100% антигена M.hyo, присутствующего в композиции, адсорбировано на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, и находится в составе комплекса антиген/адъювант.
Для специалиста в данной области очевидно, что дополнение этих процентов относится к количеству антигена M.hyo, оставшегося в супернатанте антигенной композиции согласно настоящему изобретению после центрифугирования: если более 50% антигена M.hyo, присутствующего в композиции, находится в осадке, то логично предположить, что в супернатанте присутствует менее 50% антигена M.hyo, входящего в состав антигенной композиции.
Так, в одном варианте осуществления антигенная композиция согласно настоящему изобретению отличается тем, что менее 50% антигена M.hyo, присутствующего в композиции, не входит в состав комплекса антиген/адъювант и, соответственно, не адсорбируется на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, а находится в супернатанте после центрифугирования.
Предпочтительно относительное количество антигена M.hyo, присутствующего в антигенной композиции согласно настоящему изобретению, который не входит в состав комплекса антиген/адъювант и не адсорбируется на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, составляет менее 40%; более предпочтительно, менее 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0%, в указанном порядке предпочтения.
В соответствии с настоящим изобретением предпочтительным способом характеристики антигенной композиции согласно настоящему изобретению является определение относительного количества антигена M.hyo, адсорбированного на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта.
Кроме того, антигенная композиция согласно настоящему изобретению отличается от известных композиций тем, что она содержит адъювант на основе гидроксида алюминия, связывающая способность которого максимально используется для связывания антигена M.hyo.
Так, в одном варианте осуществления антигенная композиция согласно настоящему изобретению содержит адъювант на основе гидроксида алюминия, способность которого связывать белки более чем на 50% используется для связывания антигена M.hyo.
Это можно подтвердить путем анализа (как описано выше) последующей адсорбции определенного количества известного белка и определения с помощью соответствующих серодиагностических методов, какое количество известного белка может дополнительно адсорбироваться на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, входящего в состав антигенной композиции, подлежащей тестированию.
Результаты данного анализа показывают, присутствует ли неиспользованная белок-связывающая способность адъюванта на основе гидроксида алюминия, входящего в состав антигенной композиции согласно настоящему изобретению.
Предпочтительно белок-связывающая способность адъюванта на основе гидроксида алюминия, входящего в состав антигенной композиции согласно настоящему изобретению, используется антигеном M.hyo более чем на 60%; более предпочтительно, она используется антигеном M.hyo более чем на 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%, в указанном порядке предпочтения.
В наиболее предпочтительном способе применения антигенную композицию согласно настоящему изобретению, или антигенную композицию, полученную по способу настоящего изобретения, используют для получения вакцины для свиней, которая способна эффективно предотвращать или уменьшать инфекцию M.hyo или PCV2, и предотвращать или уменьшать симптомы заболевания, связанного с такой инфекцией, является безопасной в использовании, экономически целесообразной и удобной для пользователей, поскольку она готова к применению.
Таким образом, в другом аспекте изобретение предлагает готовую к применению вакцину для свиней, предназначенную для профилактики или уменьшения инфекции M.hyo или PCV2 и связанных с ней симптомов заболевания, которая содержит антигенную композицию, полученную по способу согласно настоящему изобретению, или антигенную композицию согласно настоящему изобретению, и дополнительный адъювант.
"Дополнительный адъювант" является дополнительным в том смысле, что его используют в дополнение к адъюванту на основе гидроксида алюминия, который уже присутствует в антигенной композиции. Указанный дополнительный адъювант обеспечивает вакцине согласно настоящему изобретению по меньшей мере такую же эффективность, как у одноантигенной вакцины против PCV2 или M.hyo предшествующего уровня техники.
"Адъювант" представляет собой хорошо известный компонент вакцин, который стимулирует неспецифической иммунный ответ у мишени. В данной области техники известно много разных адъювантов. Примеры адъювантов включают: полный и неполный адъювант Фрейнда, витамин Е, неионные блок-сополимеры и полиамины, такие как сульфат декстрана, Carbopol™, пиран, сапонин, такой как: Quil A™ или Q-Vac™. Сапонин и компоненты вакцины могут быть объединены в ISCOM™.
Кроме того, в качестве адъюванта часто используют пептиды, такие как мурамилдипептиды, диметилглицин и туфтсин, минеральные масла, такие как Bayol™, Drakeol™, Klearol™ или Marcol™, Montanide™ или легкое минеральное масло (парафин); не минеральные масла, такие как сквален, сквалан; и растительные масла или их производные, такие как этилолеат. Также можно использовать комбинированные продукты, такие как ISA™ от Seppic или DiluvacForte™.
В качестве справочника по адъювантам, их применению и эффектам можно использовать: "Vaccine adjuvants" (Methods in molecular medicine, vol. 42, D. O'Hagan ed., 2000, Humana press, NJ, ISBN-10: 0896037355).
В одном варианте осуществления вакцину согласно настоящему изобретению получают в виде эмульсии в водной и масляной фазе; предпочтительными типами эмульсии являются: вода-в-масле (w/o), масло-в-воде (o/w), вода-в-масле-в-воде (w/o/w), или двойная масляная эмульсия (DOE). Более предпочтительной является вакцина настоящего изобретения, которая представляет собой эмульсию типа масло-в-воде, поскольку в данном случае в качестве "дополнительного адъюванта" можно использовать масляную фазу. Предпочтительно масло представляет собой минеральное масло.
Масляная фаза обеспечивает эффект депо у вакцинированного животного путем медленного высвобождения антигена, тем самым обеспечивая длительную стимуляцию иммунитета мишени. Таким образом, вакцина, которая представляет собой эмульсию типа масло-в-воде, предпочтительно обеспечивает непосредственную стимуляцию иммунитета, обусловленную водной фазой, и задержанную стимуляцию иммунитета, обусловленную масляной фазой.
Таким образом, в одном варианте вакцины согласно настоящему изобретению вакцина находится в виде эмульсии типа масло-в-воде.
В другом варианте вакцины согласно настоящему изобретению дополнительный адъювант представляет собой минеральное масло.
Известно, что такие адъюванты оказывают благоприятное воздействие на иммуногенность ветеринарных вакцин.
В одном варианте вакцины согласно настоящему изобретению, вакцина представляет собой эмульсию типа масло-в-воде, а дополнительный адъювант представляет собой минеральное масло.
В предпочтительном варианте вакцины согласно настоящему изобретению минеральное масло представляет собой легкое или светлое минеральное масло или парафиновое масло, коммерчески доступное под такими торговыми названиями, как: Marcol™ Marcol™ (ExxonMobil), Klearol™ (Sonneborn) или Drakeol™ (Penreco).
В одном варианте осуществления вакцина согласно настоящему изобретению содержит антигенную композицию согласно настоящему изобретению в количестве от 30 до 80% об/об по отношению к объему конечной вакцины. Предпочтительно содержание антигенной композиции составляет от 40 до 75% об/об, от 45 до 70% об/об, от 50 до 65%, или даже от 55 до 65% об/об по отношению к объему конечной вакцины, в указанном порядке предпочтения.
В одном варианте осуществления вакцина согласно настоящему изобретению содержит минеральное масло в качестве дополнительного адъюванта в количестве от 3 до 50% об/об по отношению к объему конечной вакцины. Предпочтительно содержание минерального масла составляет от 4 до 40% об/об, от 5 до 30% об/об, от 5 до 20% об/об, или даже от 5 до 15% об/об по отношению к объему конечной вакцины, в указанном порядке предпочтения.
Само собой разумеется, что другие способы добавления адъювантов, компонентов среды или разбавителей, эмульгирующих или стабилизирующих вакцину согласно настоящему изобретению, также входят в объем настоящего изобретения.
Термин "вакцина" подразумевает применение иммунологически эффективного количества антигенов, входящих в ее состав. "Иммунологически эффективное количество" в применении к вакцине согласно настоящему изобретению зависит от желаемого эффекта и от конкретных характеристик используемого типа вакцины. Определение эффективного количества относится к компетенции рядовых специалистов-практиков и включает, например, мониторинг иммунного ответа мишени после вакцинации, или после экспериментального заражения, например, путем отслеживания клинических симптомов и серологических параметров мишени, и сравнивания их с ответами, наблюдаемыми у невакцинированных экспериментальных животных.
Наличие у свиньи инфекции M.hyo и/или PCV2 и степень тяжести такой инфекции может определить квалифицированный специалист, такой как опытный заводчик скота или ветеринар, с использованием общих знаний о симптомах заболевания, или с помощью подходящих диагностических средств.
Обычно вакцины также содержат фармацевтический приемлемый носитель, который способствует промышленному получению, применению или хранению вакцины и не вызывает побочные эффекты (тяжелые). Такой носитель может представлять собой водный носитель, используемый в способе настоящего изобретения. В более сложной форме раствор носителя может представлять собой, например, буфер, который может содержать дополнительные добавки, такие как стабилизатор, консервант или адъювант. Подробное описание и примеры такого носителя описаны, например, в хорошо известные справочниках, таких как: "Remington: the science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), и: "Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).
Примером готовой к применению комбинированной вакцины согласно настоящему изобретению против PCV2/M.hyo является вакцина Porcilis PCV M Hyo (MSD AH), которая поступит на рынок в 2015 году. Обнаружено, что данная вакцина имеет все приемлемые с точки зрения настоящего изобретения характеристики, такие как эффективность вакцины против M.hyo и PCV2 даже после однократного введения, превосходный профиль безопасности, она является готовой к применению и экономически целесообразной. Подробности описаны в разделе Примеры и в отчете CVMP по оценке Porcilis PCV M Hyo (ЕМЕА/В/С/003796/0000, 11 сентября 2014). В данном отчете указано, что новая вакцина удовлетворяет критериям эффективности вакцин при экспериментальном заражении M.hyo и PCV2 даже после 27 месяцев хранения при 2-8°C. Результаты большого числа лабораторных и полевых исследований по вакцинации демонстрируют, что вакцина является безопасной при внутримышечном введении поросятам в возрасте примерно 3 недели в дозе 2 мл, поскольку реакции, отличные от опухания, обусловленного объемом вводимого вещества, в участке введения отсутствуют, также отсутствуют системные реакции, кроме преходящего и случайного увеличения ректальной температуры примерно на 1°C. Кроме того, вакцина является эффективной, поскольку она способна уменьшать вирусемию, вирусную нагрузку в легких и лимфоидной ткани и вирусовыделение, обусловленные инфекцией PCV2, а также уменьшать тяжесть поражения легких, вызванного инфекцией M.hyo. Кроме того, вакцина уменьшает снижение ежедневного прироста массы в заключительном периоде откорма. Индуцированный вакциной иммунитет детектируется в течение до 22 недель после инокуляции, что охватывает весь заключительный период откорма свиней.
Таким образом, ветеринарный лечебный эффект вакцины согласно настоящему изобретению у свиней заключается в предотвращении или уменьшении инфекции, вызванной M.hyo или PCV2, и связанных с ней симптомов заболеваний. Терапевтические и профилактические эффекты вакцины согласно настоящему изобретению включают: снижение уровня вирусемии и инфекции путем уменьшения репликации и распространения M.hyo или PCV2; и уменьшение или даже предотвращение клинических симптомов, таких как поражение легких, пневмония, снижение ADWG и конверсии корма и т.д.
В предпочтительном варианте осуществления вакцина согласно настоящему изобретению предназначена для уменьшения легочных поражений, вызванных инфекцией M.hyo и/или для уменьшения вирусемии, обусловленной PCV2, у свиней.
Еще один полезный эффект вакцины согласно настоящему изобретению заключается в предотвращении или уменьшении распространения M.hyo и/или PCV2 в стаде свиней, как по вертикали, потомству, так и по горизонтали, в пределах стада или популяции, и в пределах географической зоны. Следовательно, применение вакцины согласно настоящему изобретению приводит к уменьшению распространенности M.hyo и/или PCV2.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцина согласно настоящему изобретению способна снизить распространенность M.hyo и/или PCV2 в географической зоне.
В других аспектах настоящее изобретение относится к:
- Применению вакцины согласно настоящему изобретению для снижения распространенности M.hyo и/или PCV2 в популяции или в географической зоне, и
- Вакцине согласно настоящему изобретению для снижения распространенности M.hyo и/или PCV2 в популяции или в географической зоне.
В одном варианте осуществления вакцина согласно настоящему изобретению также может содержать стабилизатор. Стабилизатор может служить для улучшения характеристик вакцинной эмульсии, для защиты склонных к деградации компонентов, и/или для увеличения срока годности вакцины. Как правило, такие стабилизаторы представляют собой большие молекулы с высокой молекулярной массой, такие как липиды, углеводы или белки; их примеры включают молочный порошок, желатин, сывороточный альбумин, сорбит, сахарозу, трегалозу, спермидин, NZ-амины, декстран или поливинилпирролидон и буферы, такие как фосфаты щелочных металлов.
Предпочтительно стабилизатор не содержит соединений животного происхождения, или даже: имеет известный химический состав, как описано в заявке WO 2006/094974.
Вакцина согласно настоящему изобретению может содержать консервант, такой как тимеросал, мертиолат, фенольные соединения и/или гентамицин. Предпочтительно консервант не используют.
Вакцина согласно настоящему изобретению предпочтительно является стабильной в течение, по меньшей мере, 12 месяцев, более предпочтительно 18 месяцев, или даже 24 месяцев. Термин "стабильный" относится к сохранению химической и физической структуры, а также биологической эффективности после длительного хранения при соответствующих условиях; в частности: эффективность вакцины сохраняется до конца рекомендованного срока годности.
Само собой разумеется, что добавление других вспомогательных веществ, необходимых или полезных для фармацевтической стабильности и эффективности вакцины согласно настоящему изобретению, также входит в объем настоящего изобретения.
Мишенью для вакцины согласно настоящему изобретению является свинья. Возраст, масса тела, пол, иммунологический статус и другие параметры мишени, подлежащей вакцинации, не являются критическими, хотя для вакцинации предпочтительно использовать здоровых, неинфицированных мишеней и желательно проводить вакцинацию как можно раньше, чтобы предотвратить любую полевую инфекцию PCV2 или M.hyo. Поскольку такая инфекция может появиться уже в молодом возрасте, вакцину согласно настоящему изобретению предпочтительно вводят в возрасте, начиная примерно с 3 недель.
Предпочтительно эффективность вакцины согласно настоящему изобретению не зависит от уровня материнских антител, которые могут присутствовать у молодой свиньи.
Таким образом, вакцина согласно настоящему изобретению может служить для эффективной первичной вакцинации, которая впоследствии может сопровождаться и усиливаться бустерной вакцинацией. Например, вакцину согласно настоящему изобретению можно ввести в возрасте примерно 2-10 дней и затем повторить введение примерно через 3 недели, причем каждый раз вакцину вводят в объеме 1 мл. Однако, поскольку вакцина согласно настоящему изобретению является эффективной уже после однократного введения, в предпочтительном варианте осуществления проводят однократное введение, например, в объеме примерно 2 мл, в возрасте, начиная примерно с 3 недель. Такая вакцинация защищает свиней в течение всего периода откорма.
Для свиней-мишеней вакцины согласно настоящему изобретению, которых держат в течение более 6 месяцев, таких как свиноматки для разведения, или кабаны для получения спермы, можно проводить регулярные бустерные вакцинации 1, 2 или 3 раза в год, например, для свиноматок проводят одну бустерную вакцинацию перед каждым опоросом, что в среднем составляет примерно 2,2 раза/год.
Таким образом, вакцину согласно настоящему изобретению можно использовать для профилактической или терапевтической обработки, или той и другой, поскольку она препятствует как появлению, так и развитию инфекции M.hyo и/или PCV2.
Режим введения вакцины согласно настоящему изобретению предпочтительно интегрируют в существующие графики вакцинации другими вакцинами, которые могут потребоваться свинье-мишени, чтобы уменьшить стресс у животных и снизить затраты труда. Указанные другие вакцины можно вводить одновременно, параллельно или последовательно, по схеме, совместимой с их зарегистрированным применением.
Вакцину согласно настоящему изобретению можно вводить в объеме, который является приемлемым для животного-мишени, и может составлять, например, примерно от 0,1 до 10 мл. Предпочтительно объем одной дозы составляет примерно от 0,1 до 5 мл, более предпочтительно объем дозы для одного животного составляет от 0,2 до 3 мл. Предпочтительно доза для внутримышечного введения составляет примерно от 1 до 3 мл, предпочтительно примерно 2 мл; а доза для внутрикожного введения составляет примерно от 0,1 до 0,5 мл, предпочтительно примерно 0,2 мл.
Вакцину согласно настоящему изобретению можно вводить свинье-мишени с помощью способов, известных в данной области техники. Предпочтительно использовать парентеральное введение, например, путем инъекции в или через кожу, такое как внутримышечное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутрикожное, подслизистое или подкожное введение. Более предпочтительным способом введения вакцины согласно настоящему изобретению является внутримышечная или подкожная инъекция. Еще более предпочтительным является внутримышечное введение в заднюю ногу или в шею.
Само собой разумеется, оптимальный способ применения зависит от характерных особенностей используемой вакцины и от конкретных параметров мишени.
В одном варианте осуществления вакцину согласно настоящему изобретению вводят внутримышечно свиньям в возрасте примерно от 3 недель, в виде однократной дозы объемом примерно 2 мл.
Предпочтительным участком для внутримышечного введения является шея.
Дополнительная оптимизация вакцины согласно настоящему изобретению относится к компетенции специалиста в данной области. Как правило, такая оптимизация включает тонкую настройку эффективности вакцины, чтобы обеспечить достаточную иммунную защиту. Это можно осуществить путем коррекции дозы вакцины, объема вакцины или содержания антигена в вакцине; путем применения вакцины, имеющей другую форму или другой состав; путем подбора других компонентов вакцины (таких как стабилизатор или дополнительный адъювант); или путем применения другого пути, способа или режима введения.
Вакцина согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать другие соединения, такие как дополнительный антиген, цитокин или иммуностимуляторная нуклеиновая кислота, содержащая неметилированный CpG и др. Альтернативно вакцину согласно настоящему изобретению можно успешно сочетать с фармацевтическим компонентом, таким как антибиотик, гормон, противовоспалительное средство или противопаразитарное средство. Или вакцину согласно настоящему изобретению можно саму добавить к вакцине.
Вакцину согласно настоящему изобретению можно успешно сочетать с другим антигеном, например, полученным из другого патогена. Преимущество такой комбинированной вакцины заключается в том, что она индуцирует иммунный ответ не только против M.hyo и PCV2, но и против других патогенов, хотя при этом требуется только одна обработка животного-мишени с целью вакцинации, что позволяет снизить у животного стресс от вакцинации и уменьшить временные и трудовые затраты.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцина согласно настоящему изобретению содержит дополнительный антигенный материал, полученный из микроорганизма, патогенного для свиней.
"Дополнительный антигенный материал" сам по себе может находиться в репликативной или в неактивной форме, или в субъединичной форме, и может необязательно содержать адъювант. Дополнительный антигенный материал может представлять собой антиген, который может состоять из биологической или синтетической молекулы, такой как молекула белка, углевода, липополисахарида или нуклеиновой кислоты. Альтернативно он может представлять собой продукт экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты другого микроорганизма, или вектора, содержащего такой фрагмент нуклеиновой кислоты; вектор может представлять собой сам микроорганизм или эукариотическую клетку-хозяина.
Дополнительный антигенный материал можно "получить из" другого микроорганизма, патогенного для свиней любым способом, например, в виде экстракта, фракции, гомогената или гомогената, полученного путем обработки ультразвуком.
"Микроорганизмы, патогенные для свиней", в соответствии с настоящим изобретением, хорошо известны в данной области техники. Так, дополнительный антигенный материал можно получить, как правило, из любых вирусов, бактерий, паразитов, грибков, риккетсий, простейших и/или паразитов, которые являются патогенными для свиней.
Примеры таких патогенных для свиней микроорганизмов включают: вирус свиного репродуктивного и респираторного синдрома, вирус псевдобешенства, свиной парвовирус, вирус классической чумы свиней, вирус свиного гриппа, вирус ящура, вирус эпизоотической диареи свиней, вирус трансмиссивного гастроэнтерита, вирус везикулярного стоматита, Lawsonia intracellularis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Brachyspira, E. coli, Haemophilus, Streptococcus, Salmonella, Clostridia, Pasteurella, Erysipelothrix, Bordetella, Toxoplasma, Isospora и Trichinella.
В предпочтительном варианте осуществления дополнительный антигенный материал добавляют к вакцине согласно настоящему изобретению в виде инактивированного лиофилизированного антигена, который можно ресуспендировать в вакцинной эмульсии настоящего изобретения. Этот способ описан, например, в WO 2010/106095.
В предпочтительном варианте осуществления вакцина согласно настоящему изобретению содержит антигены M.hyo, PCV2, Lawsonia intracellularis и PRRSV.
Поскольку указанные патогены широко распространены среди свиней, их сочетание в предназначенной для однократного введения, готовой к применению вакцине, является очень желательным.
Вакцину согласно настоящему изобретению можно получить с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области.
Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ получения вакцины согласно настоящему изобретению, включающий в себя стадию смешивания антигенной композиции, полученной по способу согласно настоящему изобретению, или антигенной композиции согласно настоящему изобретению, с дополнительным адъювантом.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения вакцины согласно настоящему изобретению, включающему стадию эмульгирования антигенной композиции, полученной по способу согласно настоящему изобретению, или антигенной композиции согласно настоящему изобретению, в минеральном масле с получением эмульсии типа масло-в-воде.
С помощью указанных способов можно получить вакцину согласно настоящему изобретению, способную оказывать благоприятный эффект, заключающийся в предотвращении или уменьшении инфекции M.hyo и/или PCV2 и связанных с ней симптомов заболевания у свиней, как описано выше.
Детали и примеры описанного здесь "способа получения вакцины" могут легко использоваться специалистами в данной области техники. Например, антигенную композицию согласно настоящему изобретению можно получить в промышленности в более мелком или более крупном масштабе, затем ее можно смешать с фармацевтически приемлемыми наполнителями с получением вакцины, и полученную вакцину можно поместить в контейнеры подходящего размера. Разные стадии производственного процесса контролируют с помощью соответствующих анализов, таких как иммунологические анализы качества и количества антигенов; микробиологические анализы, с помощью которых можно определить степень инактивации, стерильности и отсутствие посторонних агентов; и, в конечном итоге, исследования на животных для подтверждения эффективности и безопасности вакцины. После завершения анализов качества, количества и стерильности вакцинный продукт может поступить в продажу.
Все указанные способы хорошо известны специалистам в данной области, а общие методы и рекомендации, которые можно использовать при получении вакцин, описаны, например, в правительственных нормативах и постановлениях (фармакопея), а также в хорошо известных справочниках.
Вакцину согласно настоящему изобретению можно получить в виде формы, подходящей для введения свиньи-мишени и соответствующей желательному способу применения и целевому эффекту.
Предпочтительно вакцину согласно настоящему изобретению получают в виде формы, подходящей для парентерального введения, т.е. в виде жидкости для инъекций, такой как суспензия, раствор, дисперсия или эмульсия. Обычно такие вакцины являются стерильными и имеют физиологические значения рН.
Таким образом, в других аспектах настоящее изобретение предлагает:
- Антигенную композицию, полученную по способу согласно настоящему изобретению, или антигенную композицию согласно настоящему изобретению, для применения в способе получения вакцины для свиней, предназначенной для предотвращения или уменьшения инфекции M.hyo или PCV2 и связанных с ней симптомов заболевания.
- Применение антигенной композиции, полученной по способу согласно настоящему изобретению, или антигенной композиции согласно настоящему изобретению, в способе получения вакцины, предназначенной для предотвращения или уменьшения инфекции M.hyo или PCV2 и связанных с ней симптомов заболевания.
- Применение вакцины согласно настоящему изобретению, или вакцины, полученной по способу согласно настоящему изобретению, предназначенной для предотвращения или уменьшения инфекции M.hyo или PCV2 и связанных с ней симптомов заболевания.
- Способ предотвращения или уменьшения инфекции M.hyo или PCV2 у свиней и связанных с ней симптомов заболевания, где указанный способ включает введение свиньям вакцины согласно настоящему изобретению, или вакцины, полученной по способу согласно настоящему изобретению.
Далее изобретение описывается посредством нижеследующих неограничивающих примеров.
ПРИМЕРЫ
Получение антигена M.hyo
1.
Бактерин, используемый в качестве антигена M.hyo, получают по способу, практически аналогичному способу получения коммерческой вакцины M+Pac (WO 1993/016726). Краткое описание способа: штамм J M.hyo культивируют в суспензии в обогащенной среде, полученной на основе среды, первоначально описанной Friis (1975, выше). Это сложная среда, которая содержит дрожжевой экстракт, сыворотку и разные свиные и бычьи экстракты. После нескольких циклов предварительного культивирования основное культивирование проводят в большом ферментере при 37°С, перемешивании и контроле рН до достижения стационарной фазы, что обычно занимает от 20 до 60 часов. Чтобы инактивировать культуру, в ферментер добавляют BEI, перемешивают в течение 1 часа, после чего все содержимое переносят во второй сосуд и инкубируют в течение 24 часов при перемешивании и 37°С. Затем избыток BEI нейтрализуют тиосульфатом натрия, перемешивая в течение периода до 24 часов при 37°С. Инактивированную и нейтрализованную культуру концентрируют ультрафильтрацией не более чем в 15 раз. Партию бактерина, используемого в качестве антигена M.hyo, хранят при 4°С до применения. Массу и относительную активность антигена определяют методом Elisa, используя M.hyo-специфичную поликлональную кроличью антисыворотку, а также путем сравнения со стандартным бактерином M.hyo с известной активностью.
Получение антигена PCV2
2.
6
Антиген PCV2 в виде субъединичной формы, которая представляет собой ORF2-кодируемую VLP, получают по способу, практически аналогичному способу получения Porcilis PCV, описанному ранее (например, в WO 2007/028823). Краткое описание способа: суспензию культуры клеток насекомых Sf21 инфицируют рекомбинантным бакуловирусом, содержащим ген ORF2 PCV2, находящийся под контролем промотора гена бакуловируса р10; плотность клеток в момент инфицирования составляет примерно 1,4×10 клеток/мл, множественность заражения (MOI) составляет 0,01. После культивирования в течение 4-8 дней при температуре примерно 27°С целую культуру обрабатывают ультразвуком путем пропускания ее через ультразвуковой дезинтегратор промышленного масштаба. Далее рекомбинантный бакуловирус инактивируют BEI при 37°С в течение 72 часов при перемешивании и контроле рН. После инактивации BEI нейтрализуют тиосульфатом натрия. После нейтрализации клеточный дебрис удаляют центрифугированием. В полученном супернатанте определяют антигенную массу капсидных VLP PCV2 методом гель-электрофореза в присутствии SDS по сравнению с диапазоном разведения известного количества маркерного белка, или методом Elisa собственной разработки.
Получение антигенной композиции, содержащей антигены M.hyo и PCV2, и композиции готовой к применению вакцины
3.
Пример способа получения антигенной композиции согласно настоящему изобретению и затем вакцины согласно настоящему изобретению включает получение партии вакцины согласно настоящему изобретению объемом 100 мл, содержащей 18% масляной фазы, а именно: в мензурке объединяют в асептических условиях: 5 мл партии бактерина как антигена M.hyo с концентрацией примерно 60 RPU/мл, 10 мл 2% альгидрогеля и 12 мл физиологического раствора. Указанные количества соответствуют содержанию в конечной вакцине антигена M.hyo 3 RPU/мл и алюминия примерно 1 мг/мл. Полученную смесь объединяют с водным носителем, здесь: физиологическим раствором. Всего для получения водной фазы вакцины добавляют 37 мл физиологического раствора и 33% от этого объема, 12 мл, используют для получения комплекса антиген/адъювант.
рН смеси доводят до 6,5, используя 4 N хлористоводородную кислоту, затем смесь инкубируют при комнатной температуре (примерно 20°C) в течение ночи (16 часов) при осторожном перемешивании с помощью магнитной смесительной лопатки и стерильного магнитного бруска. На следующее утро к смеси добавляют оставшийся объем физиологического раствора, 17 мл партии антигена PCV2 с концентрацией 14000 AU/мл (что соответствует примерно 2300 AU/мл в конечной вакцине), 96% этанол и глицерин (стерилизованный). Перемешивание продолжают в течение 10 минут, после чего водную фазу вакцины считают готовой. Затем добавляют 18 мл масляной фазы, содержащей смесь Tween, Span и Drakeol. Две фазы гомогенизируют с помощью смесителя Ultra-Turrax в течение 2 мин при 10000 об/мин.
Более крупные партии вакцины объемом до 100 литров получают по существу таким же способом и используют их в разных лабораторных и полевых экспериментах по вакцинации, как описано в настоящем описании. В данном масштабе используют смесительные сосуды большого размера, вмещающие большие объемы, и корректируют время смешивания предварительно полученного комплекса антиген/адъювант с антигеном PCV2 и другими компонентами водной фазы: его увеличивают до 60 минут; рН поддерживают на уровне от 6,2 до 7,5, инкубацию проводят при комнатной температуре. Кроме того, изменяют объемы водной фазы и партий антигена в соответствии с активностью используемых партий антигена. Разумеется, эмульгирование данных объемов также проводят с использованием гомогенизатора большого размера (реактор Dispax, IKA).
Продолжают эксперименты по оптимизации условий способа настоящего изобретения, используемых для предварительного получения комплекса антиген/адъювант. Например, варьируют температуру и продолжительность инкубации, рН смеси и соотношение адъюванта на основе гидроксида алюминия и антигена M.hyo.
Затем из водной фазы перед эмульгированием берут образцы, чтобы определить, адсорбируется ли антиген M.hyo на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта, и, если да, то в каком количестве, указанные образцы центрифугируют и затем анализируют супернатант и осадки. Если вакцину получают в виде эмульсии типа масло-в-воде, такой анализ можно провести с использованием образцов конечной вакцины.
Влияние разных условий на образование комплекса антиген/адъювант
4.
Комбинированные вакцины M.hyo/PCV2 получают, как описано выше, используя антигенные композиции, полученные с помощью разных способов: в присутствии или отсутствии антигена PCV2 во время образования комплекса антигена M.hyo с гидроксидом алюминия, используемым в качестве адъюванта. Путем тестирования указанных вакцин на экспериментальных животных определяют влияние разных способов получения на эффективность антигена M.hyo.
Материалы и методы
4.1.
Антигенную композицию получают с использованием 5% (по отношению к объему конечной вакцины) 10× концентрированной партии бактерина M.hyo и стандартного количества антигена PCV2, сравнимого с количеством, используемым для получения коммерческих вакцин против PCV2. Вакцины получают по следующей схеме:
Вакцина
Загрузка антигена M.hyo (об/об)
Количество антигена PCV2 (AU)/дозу
Образование комплекса с гидроксидом алюминия:
A
5%
-
M.hyo
B
5%
> 2800
M.hyo+PCV2
C
5%
> 2800
M.hyo
По завершению стадии адсорбции добавляют остальные компоненты водной фазы и затем масляную фазу, после чего эмульгируют, получая конечный вакцинный продукт. Вакцины хранят до использования при 2-8°С.
Далее проводят эксперименты по вакцинации-заражению, используя четыре группы по 8 поросят: каждая из трех групп получает одну из конкретных вакцин, одну группу используют в качестве невакцинированного контроля. Три вакцины вводят внутримышечно в дозе объемом 2 мл в возрасте трех недель.
Через четыре недели, в возрасте 7 недель, всех свиней заражают путем интратрахеального вливания 5 мл культуры вирулентного изолята M.hyo в среде Фриза в течение двух дней подряд. Еще через три недели (в возрасте 10 недель) свиней умерщвляют, вскрывают и суммарные поражения легких, обусловленные M.hyo, оценивают по шкале Гудвина.
В ходе эксперимента образцы крови для серологических анализов берут во время вакцинации, заражения и вскрытия. Уровни антител против PCV2 определяют в произвольных единицах методом Elisa.
Результаты
40.2.
Таблица 1: Результаты оценки поражений легких, обусловленных M.hyo, и серологических анализов PCV2
Группа
Ср. значение поражения легких под действием M.hyo
Титр антител против PCV2 (log2) в возрасте:
оценка
% восстановления по сравнению с контролем
3 недели
7 недель
10 недель
Вакцина A
3,3±4,6*
66
6,7±1,5
5,1±1,1
2,9±0,3
Вакцина B
6,8±6,7
30
6,8±1,6
8,1±1,2
8,2±1,1
Вакцина C
4,1±3,5*
58
6,9±1,6
8,4±1,0
8,6±1,3
Невакцинированный контроль
9,7±7,2
0
6,8±1,6
5,3±0,8
3,5±1,0
<*>: Оценка поражения существенно отличается от контроля (р <0,05, U-критерий Манна-Уитни)
Как показано в таблице 1, вакцинация одноантигенной вакциной A против M.hyo приводит к значительному снижению тяжести M.hyo-индуцированных поражений легких, на 66%, по сравнению с тяжестью поражений у невакцинированных контрольных свиней. Данную вакцину можно сравнить с коммерческим продуктом M+Pac. Однако вакцина B, полученная из антигенной композиции, в которой содержится и антиген M.hyo, и антиген PCV2, причем оба они присутствуют при образовании комплекса, приводит к другим результатам: данная вакцина индуцирует уменьшение поражения легких только на 30%. Эффективность вакцины C в отношении M.hyo возрастает, соответствуя уменьшению поражения легких на 58%, что по существу является уровнем эффективности одноантигенной вакцины,; данную вакцину получают из антигенной композиции, полученной по способу согласно настоящему изобретению.
Что касается уровней антител против PCV2: свиньи во всех группах содержат материнские антитела против антигена PCV2 в момент вакцинации. Уровень указанных материнских антител понижен в группе, получающей вакцину A, и в контрольной группе. В группах, получающих вакцины В и С, содержащие антиген PCV2, наблюдается гуморальный иммунный ответ защитного уровня. Среди данных групп отсутствуют существенные различия, свидетельствуя о том, что эффективность вакцины против PCV2 не зависит от способа адсорбции антигенов на гидроксиде алюминия, используемом в качестве адъюванта.
Выводы
4.3.
Существует четкое и значимое различие в эффективности вакцин против инфекции M.hyo в зависимости от способа получения антигенной композиции: если антиген PCV2 присутствует при адсорбции антигена M.hyo на гидроксиде алюминия, эффективность вакцины составляет только половину эффективности, достигаемой при добавлении антигена PCV2 после образования комплекса антиген M.hyo/адъювант на основе гидроксида алюминия.
Расширенное тестирование безопасности и эффективности готовой к применению вакцины против PCV2/M.hyo
5.
Целью описанных ниже исследований является оценка эффективности и безопасности новой вакцины Porcilis PCV M Hyo в лабораторных и полевых условиях.
Материалы и методы
5.1.
5.1.1. Вакцина
Тестируемая вакцина содержит бактерин в качестве антигена M.hyo, бакуловирус-экспрессированный антиген PCV2 ORF2 VLP и адъювант Emunade, как описано выше. Вакцину вводят 3-недельным поросятам внутримышечно в область шеи в виде однократной дозы объемом 2 мл.
5.1.2. Испытание на безопасность GLP
Используют две группы по 12 здоровых свиней SPF в каждой, одной группе вводят вакцину Porcilis PCV M Hyo в возрасте 19-21 день (вакцинированная группа), а другой вводят забуференный фосфатом физиологический раствор (контрольная группа). В течение 14 дней после вакцинации поросят ежедневно обследуют на наличие аномальных системных или местных реакций. Ректальную температуру регистрируют за день до вакцинации, непосредственно перед вакцинацией, через 4 часа после вакцинации и затем ежедневно в течение четырех дней. На 14 дней после вакцинации всех животных умерщвляют для исследования участка инъекции.
5.1.3. Эксперименты по иммунизации и заражению
Появление иммунитета (OOI) и продолжительность иммунитета (DOI) против каждого из двух указанных вакцинных антигенов определяют в исследованиях с экспериментальным заражением. В каждом эксперименте свиней возрастом 3 недели из стад, не несущих инфекции M.hyo и серопозитивных по PCV2 случайным образом распределяют в две группы (получающие вакцину и контроль) в момент вакцинации (PCV2, OOI/DOI: 15 свиней в группе, M.hyo OOI: 19 животных в группе, DOI: 40 свиней в группе). Образцы крови берут непосредственно перед вакцинацией, во время заражения и через 2 (только в исследованиях с заражением PCV) и 3 недели после заражения. Для определения DOI также берут образцы крови с регулярными интервалами времени между вакцинацией и заражением.
6
Заражение PCV2 проводят путем интраназального закапывания (3 мл в каждую ноздрю, примерно 10 TCID50) свежеполученного голландского полевого изолята PCV2 животным в возрасте 5 или 25 недель. Через три недели после заражения PCV2 всех свиней умерщвляют, вскрывают и собирают брыжеечные и паховые лимфатические узлы, миндалины и легкие для количественного определения вирусной нагрузки PCV2.
7
Заражение M.hyo проводят интратрахеально в течение двух последовательных дней путем введения 10 мл культуры датского полевого изолята (предоставленного Dr N. Friis, National Veterinary Laboratory, Copenhagen), содержащего примерно 10 единиц изменения цвета/мл (CCU/мл), животным в возрасте 7 или 24 недель. Через три недели после заражения свиней умерщвляют и вскрывают, чтобы определить поражения легких, которые оценивают по шкале, описанной Goodwin et al. (выше).
Во всех исследованиях свиней ежедневно обследуют на клинические нарушения.
5.1.4. Полевые испытания
Полевые испытания по безопасности проводят на молодых поросятах с использованием рандомизированных и слепых исследований в двух свинофермах в Нидерландах и одной в Германии. В каждой ферме, по меньшей мере, 56 здоровых трехнедельных поросят-сосунов в возрасте 17-24 дней распределяют случайным образом в одну из двух групп. Поросятам из одной группы (получающей вакцину) вводят вакцину Porcilis PCV M Hyo, а поросятам из другой группы (получающей контроль) вводят стерильный буферный солевой раствор. Общее состояние здоровья поросят проверяют при поступлении (за день до вакцинации), непосредственно перед вакцинацией, через 1 и 4 часа после вакцинации и ежедневно в течение 14 дней. Ректальную температуру у всех поросят измеряют за день до вакцинации, непосредственно перед вакцинацией, через 4 часа после вакцинации, и ежедневно в течение 4 дней после вакцинации. Участок инъекции исследуют на местные реакции путем пальпации через 1 и 4 часа после вакцинации, и затем ежедневно в течение 14 дней. Всех исследуемых поросят взвешивают по отдельности при поступлении (день -1) и в конце исследования (на 21 день после вакцинации).
Кроме того, проводят комбинированные полевые испытания по безопасности и эффективности с использованием контролируемых, рандомизированных и слепых исследований на французском стаде свиней, страдающих от полевых инфекций M.hyo и PCV2. Здоровых трехнедельных поросят-сосунков распределяют случайным образом, в пределах выводка, в одну из двух групп примерно по 300 поросят в каждой. Свиньям из одной группы (получающей вакцину) вводят вакцину Porcilis PCV M Hyo, а свиньям из другой группы (получающей контроль) вводят стерильный забуференный физиологический раствор. Параметры первичной эффективности включают поражения легких при убое, вирусемию PCV2 и среднесуточный прирост массы (ADWG) во время откорма (т.е. в период от 7 до 19 недель после вакцинации (wpv)). Вторичные параметры включают общий ADWG (т.е. в период от вакцинации до 19 wpv), смертность, заболеваемость, поражения при плеврите и выделение PCV2. Кроме того, определяют серологический ответ на вакцинацию или полевую инфекцию. Свиней взвешивают по отдельности при вакцинации, при переходе в зону предубойного содержания и перед убоем. Медикаментозное лечение регистрируют и свиней, которые умерли во время эксперимента, исследуют путем аутопсии, чтобы установить причину смерти. Легкие исследуют по отдельности после убоя, чтобы оценить тяжесть типичных поражений и плеврита, вызванных M.hyo. У двадцати пяти поросят из опытной группы примерно каждые 4 недели берут кровь, из которой получают образцы сыворотки, а также ректальные мазки и мазки из носа. Хотя безопасность не является основной задачей данного исследования, исследователь обычно обследует животное при вакцинации и, в составе группы, через 4 часа и через 1, 4, 7 и 14 дней после вакцинации.
5.1.5. Серология
Серологический анализ M.hyo проводят с использованием коммерческого метода Elisa (тест M.hyo Ab, IDEXX) в соответствии с инструкциями производителя. Результаты анализа выражают как отрицательный результат, положительный результат или не подтвержденный результат.
Серологический анализ PCV2 проводят с использованием описанного ранее метода ELISA собственной разработки (Haake et al., выше).
5.1.6. Количественное определение PCV2 ДНК
Количественное определение вирусной нагрузки PCV2 в сыворотке крови, лимфоидных органах, легких и экскрементах проводят методом qPCR, как описано ранее (Haake et al., выше).
5.1.7. Статистический анализ
Площадь под кривой (AUC), полученная с использованием результатов анализа методом qPCR образцов сыворотки, собранных после заражения PCV2, рассчитывают по линейному правилу трапеций и анализируют с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона. Оценки поражения легких в экспериментах с заражением и результаты qPCR для паховых и брыжеечных лимфатических узлов, легких и миндалин также анализируют с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона.
В полевом исследовании, данные AUC классифицируют перед проведением анализа с использованием ANOVA с учетом группы вакцинации, производственной партии и их взаимодействия, как фиксированных эффектов. Оценки поражения легких, определенные в полевом исследовании, сравнивают между группами с использованием смешанной модели ANOVA. Группы вакцинации, производственные партии и их взаимодействие используют в качестве фиксированных эффектов, а свиноматок в качестве случайного эффекта. Относительное число свиней с плевритом (отсутствие или наличие), смертность и заболеваемость сравнивают между группами вакцинации с использованием критерия Кохрана-Мантеля-Хенселя и производственной партии в качестве классификационной переменной. Среднесуточный прирост массы сравнивают между группами с использованием смешанной модели ANOVA. Группу вакцинации, производственную партию и пол с соответствующими взаимодействиями используют в качестве фиксированных эффектов, а свиноматок в качестве случайного эффекта. Массу тела при включении в исследование используют в данной модели в качестве ковариата. Число свиней с местными или системными реакциями сравнивают с использованием точного теста Фишера.
5.2. Результаты
5.2.1. Исследование безопасности
Объединенные результаты всех исследований безопасности приведены в таблице 1.
В исследовании безопасности GLP ни у одного из животных не обнаружены местные или системные реакции, кроме того, при аутопсии не обнаружены макроскопические аномалии в участке инъекции. Через 4 часа после вакцинации ректальная температура вакцинированных животных была в среднем на 1,1°C выше, чем у контрольных животных (р <0,001), но на следующий день после вакцинации она возвращалась к норме.
В полевом исследовании безопасности обработка вызывает местную реакцию в участке инъекции с максимальным диаметром 1 см у 13% вакцинированных животных и 0,3 см у 4% животных из контрольной группы. Указанные местные реакции наблюдаются только через 4 часа после вакцинации и исчезают на следующий день. Число поросят с отклонением от нормального общего состояния здоровья после обработки является одинаковым в обеих группах (6% и 5% в группах вакцинированных и контрольных животных, соответственно). Через 4 часа после вакцинации у вакцинированных животных наблюдают повышение (р <0,0001) средней ректальной температуры на 1,1°С (40,6°С по сравнению с 39,5°С), которая возвращается к нормальному уровню на следующий день после вакцинации. Прирост массы не различается в разных группах в течение периода наблюдения, составляющего три недели после обработки.
В полевом исследовании безопасности и эффективности наблюдались местные реакции примерно у 1% свиней в обеих группах. Максимальный размер местных реакций у вакцинированных животных составляет 2 см, а максимальная длительность реакции составляет один день. Отклонение от нормального общего состояния здоровья наблюдается у 3% вакцинированных животных и у 1% контрольных животных. У некоторых животных наблюдаются незначительные признаки дискомфорта через 4 часа после вакцинации.
5.2.2. Эксперименты по заражению
10
Клинические отклонения, которые могут быть связаны с обработкой, отсутствуют в период между вакцинацией и заражением. Однако некоторые вакцинированные и контрольные поросята страдали хромотой в ходе исследования, скорее всего, вследствие инфекции Streptococcus suis. Заражение PCV2 не вызывает каких-либо клинических симптомов, однако результаты qPCR ясно демонстрируют инфицирование разных лимфоидных тканей и легких (рис 1). Как правило, средние вирусные нагрузки у вакцинированных свиней ниже примерно в 2-3 log, причем различия между группами являются статистически значимыми (р <0,05).
2
После введения Porcilis PCV М Hyo титр специфических антител против PCV2, составляющий примерно 3 log и выше, коррелирует со значительным снижением вирусной нагрузки. В указанных экспериментах вакцинация также приводит к четкому гуморальному ответу против PCV2, тогда как контрольная группа остается серологически отрицательной после снижения титра материнских антител до момента заражения. После заражения у вакцинированных животных развивается анамнестическая реакция, а у животных в контрольной группе наблюдается изменение серологической специфичности.
Гуморальный иммунный ответ после вакцинации также наблюдается в эксперименте с заражением M.hyo у 84% животных, сероположительных через 4 wpv, и у 97% животных, сероположительных через 21 wpv (фигура 2). Почти все контрольные животные серологически отвечают на заражение. Аутопсия, проведенная через три недели после заражения, демонстрирует, что срединные значения M.hyo-индуцированных поражений легких на 77% (исследование OOI) и 50% (исследование DOI) ниже, чем в вакцинированных группах (р <0,05).
5.2.3. Полевое исследование эффективности
Серологический профиль PCV2 у свиней в полевом исследовании (фигура 3) свидетельствует о наличии полевой инфекции PCV2 в период от 8 до 12 wpv. И действительно, через 8 недель после вакцинации можно детектировать PCV2 в небольших количествах у контрольных животных, уровень которого достигает пика в носовых и фекальных выделениях через 12 wpv и в сыворотке через 16 wpv. Однако по сравнению с контрольными животными вирусная нагрузка у вакцинированных животных (рассчитывается как AUC) значительно снижается, а именно, на 79% (p<0,0001), 70% (р<0,0001) и 55% (р=0,0159) в сыворотке крови, носовых и фекальных выделениях, соответственно.
Как показано на фигуре 4, 46% вакцинированных животных становятся сероположительными по M.hyo через 4 wpv. Сероположительные по M.hyo контрольные животные появляются через 16 wpv. Оценки поражения легких, определенные после убоя, в вакцинированной группе были на 46% ниже, чем в контрольной группе (р <0,0001). В частности, процент животных с тяжелым поражением легких (оценка >10) уменьшается на 56%. Число животных с плевритом ниже в группе вакцинированных животных (32% по сравнению с 39%), однако это снижение не является статистически значимым (р=0,121).
Кроме того, вакцинация Porcilis PCV M Hyo вызывает повышение ADWG на 34 г в период откорма (р<0,0001) и на 19 г в течение всего периода исследования (р=0,0019) по сравнению с контрольными животными (таблица 3). Хотя и заболеваемость, и смертность ниже в группе вакцинированных животных, отличие от контрольной группы не является статистически значимым.
5.3. Обсуждение
Настоящее исследование подтверждает, что новую вакцину Porcilis PCV M Hyo можно безопасно вводить поросятам 3-недельного возраста. Встречаемость системных реакций является очень низкой, и, поскольку эти реакции также наблюдаются в контрольной группе, получающей физиологический раствор, они, по всей вероятности, скорее обусловлены обработкой, как таковой (инъекции объемом 2 мл), чем вакцинацией. Вакцинация также не оказывают негативного влияния на рост свиней в период отъема, а местные реакции являются незначительными и кратковременными. Среднее увеличение ректальной температуры примерно на 1°С наблюдается через 4 часа после вакцинации. Однако, поскольку температура возвращается к нормальному значению на следующий день, и, поскольку ни общее поведение животных, ни потребление ими корма (измеряемое по массе тела через 3 или 7 недель после вакцинации в полевых исследованиях) не изменяется, указанное преходящее повышение ректальной температуры является приемлемым явлением, обусловленным введением вакцины. Кроме того, такое среднее увеличение температуры на 1°C находится в пределах 1,5°C, допускаемых в соответствии с монографией 2448 Европейской фармакопеи (свиная вакцина против энзоотической пневмонии (инактивированная)).
Исследования с экспериментальным заражением демонстрируют, что иммунитет появляется уже в период от 2 недель (PCV2) до 4 недель (M.hyo) после вакцинации и сохраняется в течение периода, составляющего, по меньшей мере, от 21 (M.hyo) до 22 (PCV2) недель. Об этом свидетельствует значительное сокращение вирусной нагрузки PCV2 в лимфоидных органах и легких, а также значительное сокращение вызванных M.hyo поражений легких. Соответственно, одна вакцинация животных в возрасте 3 недель может защитить откормочных свиней от инфекций PCV2 и M.hyo в течение периода откорма.
Наблюдения, сделанные в ходе экспериментов с заражением, подтверждают полевые исследования эффективности: результаты измерений свидетельствуют о значительном уменьшении вирусной нагрузки PCV2 и M.hyo-индуцированных поражений легких. Полевое исследование эффективности демонстрирует, что вакцинация Porcilis PCV M Hyo не только снижает уровень вирусной нагрузки в сыворотке крови свиней, но и сокращает время, в течение которого происходит назальная и фекальная экскреция вируса после заражения. Инфекция PCV2, встречающаяся в полевом исследовании, в основном является субклинической, однако в стаде отмечается кашель, как симптом инфекции M.hyo.
Серологические и вирусологические профили животных в полевом исследовании эффективности указывают на то, что инфекция PCV2 появляется примерно через 8 wpv, и что увеличение числа M.hyo-сероотвечающих животных наблюдается в период 12-16 wpv. С учетом того, что сероконверсия в отношении M.hyo обычно происходит примерно через 3-4 недели после инфицирования, серологический профиль указывает на наличие инфекции M.hyo примерно во время пика инфекции PCV2 (12-16 wpv, что соответствует возрасту от 15 до 19 недель). В случае двойной инфекции PCV2 и M.hyo, показано, что PCV2 усиливает тяжесть поражений, вызванных M.hyo, а M.hyo усиливает тяжесть вирусемии PCV2. И вакцинация против одного из двух патогенов не является достаточной для защиты животных от двойного инфицирования обоими патогенами. Таким образом, совместные инфекции оказывают более пагубное влияние на показатели продуктивности и состояния животных, чем инфекция только одного из двух патогенов. Преимущество комбинированной вакцины против PCV2-M.hyo, заключающееся в защите от указанных синергических эффектов заболеваний, подтверждается результатами полевого исследования, включающими в себя увеличение ADWG на 34 г в течение периода откорма (что соответствует возрасту от 10 до 22 недель).
Выводы
5.4. :
Безопасность:
- Вакцинация вызывает умеренное повышение температуры в день вакцинации и мягкие системные и местные реакции у низкого процента вакцинированных свиней.
- Наблюдаемые местные реакции являются небольшими (макс. 2 см) и преходящими (макс. 1 день).
Эффективность:
- В краткосрочных (появление иммунитета) и долгосрочных (длительность иммунитета) исследованиях с заражением отдельными патогенами комбинированная вакцина PCV2/M.hyo значительно снижает нагрузку PCV2 в сыворотке крови, лимфоидной ткани и легких, а также M.hyo-индуцированные поражения легких.
- В плацебо-контролируемых полевых испытаниях на ферме, где присутствуют и PCV2, и M.hyo, вакцинация поросят в возрасте 3 недель приводит к снижению вирусемии и выделения PCV2, а также к уменьшению оценки повреждения легких, определяемой после убоя.
- Кроме того, наблюдается положительное влияние вакцинации на среднесуточный прирост массы (+34 г/сутки) в период откорма
Таблицы
5.5. :
Таблица 2: Анализ безопасности комбинированной вакцины PCV2/M.hyo
Вакцина
Контроль
p-значение
Исследование безопасности GLP
число свиней (n)
12
12
количество свиней с местными реакциями (%)
0
0
1000
количество свиней с макроскопическими видимыми местными реакциями при аутопсии (%)
0
0
1000
количество свиней с системной реакцией (%)
0
0
1000
ректальная температура через 4 часа после вакцинации (°C)
40,5±0,4
39,4±0,2
<0,001
Полевое исследование безопасности
число свиней (n)
84
85
количество свиней с местными реакциями (%)
13,1
3,5
0,0276
количество свиней с системной реакцией (%)
6,0
4,7
0,7464
ректальная температура через 4 часа после вакцинации (°C)
40,6±0,6
39,5±0,4
<0,0001
среднесуточный прирост массы (г/день) в течение периода наблюдения (возраст 3-6 недель)
245±8
248±8
0,7053
Полевое исследование безопасности и эффективности
число свиней (n)
302
303
количество свиней с местными реакциями (%)
1,3
0,7
количество свиней с системной реакцией (%)
2,6
0,7
среднесуточный прирост массы (г/день) в течение периода отъема (возраст 3-10 недель)
360±4
369±5
0,0839
Таблица 3: Описательные данные по экспериментальным животным, их продуктивности и состоянию, полученные в полевом исследовании эффективности комбинированной вакцины против PCV2/M.hyo.
Возраст (недели)
Вакцина
Контроль
Разница<sup>1</sup>
p-значение
число свиней (n)
включение в исследование
302
302
число самцов/самок (n)
155/147
160/143
возраст (дни)
17,9
17,9
заболеваемость (%)
3-22
2,6
3,3
-0,7
0,6373
смертность (%)
3-10
1,3
1,3
0,0
0,9960
10-22
2,7
3,7
-1,0
0,4890
3-22
3,6
5,0
-1,4
0,5563
ADWG (г/день)
3-10
360±4
369±4
-9
0,0839
10-22
757±7
723±7
+34
<0,0001
3-22
612±5
593±5
+19
0,0019
1
Значение, полученное в вакцинированной группе, минус значение, полученное в контрольной группе
Влияние условий на связывание антигена M.hyo с гидроксидом алюминия, используемом в качестве адъюванта
6.
Введение
6.1.
В дальнейшем исследовании варьируют условия связывания антигена M.hyo с гидроксидом алюминия, используемом в качестве адъюванта, чтобы определить их влияние на эффективность образования комплекса антиген/адъювант.
А именно, определяют влияние температуры, рН и количества гидроксида алюминия на связывание антигена M.hyo путем получения ряда полных вакцинных композиций o/w в малом масштабе. Затем определяют относительное количество связанного антигена M.hyo, входящего в состав комплекса антиген/адъювант, как в целой эмульсии вакцины, так и в образцах осадка или супернатанта после центрифугирования эмульсии вакцины.
Материалы и методы
6.2.
6.2.1. Получение эмульсии вакцины
Получение разных вакцинных композиций проводят, в основном, по способу, описанному в примере 3. Получают стандартные партии антигена M.hyo или PCV2, затем антиген M.hyo добавляют в концентрации 6% (масс/об), а антиген PCV2 добавляют до конечной концентрации 2500 ед/мл. Получают эмульсии вакцин объемом 20 мл в разных условиях, см. таблицу 4. После получения все вакцины хранят при температуре 2-8°С до анализа.
Таблица 4: Варьирование параметров для получения разных вакцин
№
Температура адсорбции
pH адсорбции
Количество гидроксида алюминия (масс/масс)
1
температура окружающей среды (20-25°C)
не корректируют(pH 7,0-7,3)
9,8%
2
4°C
3
30°C
4
температура окружающей среды
6,0
5
8,0
6
не корректируют
5%
7
25%
6.2.2. Получение образцов
Десять мл вакцины центрифугируют при низком значении g (20 мин при 600 g) и супернатант (8,5 мл) удаляют. Из образца №7 можно удалить только 7,5 мл супернатанта, так как осадок имеет больший объем вследствие большего количества гидроксида алюминия. Осадки дополняют и гомогенизируют в объеме 0,9% раствора физиологической соли, который равен объему удаленного супернатанта, чтобы иметь возможность сравнивать одинаковые объемы осадка и супернатанта.
6.2.3. Количественное определение антигена M.hyo
Количество антигена M.hyo в исследуемом образце супернатанта или осадка можно измерить с помощью стандартного метода Elisa. Расчет количества антигена на основании измеренных значений OD проводят с помощью компьютерной программы. Каждый образец анализируют два раза, причем вакцину, осадок и супернатант конкретной смеси анализируют одновременно в одном планшете для микротитрования. Результаты, представленные в таблице 5, выражены в виде средних значений от каждого двойного повтора. Значения относительных единиц активности (RPU) для осадка и супернатанта рассчитывают по отношению к количеству антигена M.hyo в соответствующей целой эмульсии вакцины, которое принимают за 100%.
Результаты
6.3.
Центрифугирование образцов проводят при низком значении g; этого достаточно, чтобы осадить гидроксид алюминия, не осаждая антиген M.hyo, независимо от его связывания с адъювантом. Кроме того, при таких низких значениях g супернатант еще представляет собой эмульсию типа масло-в-воде.
Чтобы убедиться в том, что центрифугирование не является слишком интенсивным, получают контрольный образец путем непосредственного смешивания антигенов M.hyo и PCV2 с пустой эмульсией Emunade o/w, и затем сразу центрифугируют при указанном низком значении g. Результаты, полученные с использованием указанных контрольных образцов, показывают, что в этих условиях антиген M.hyo как таковой не осаждается на значительном уровне: 13% антигена M.hyo, детектированные в осадке, просто соответствуют объемной доле осадка по отношению к общему объему тестируемой вакцины (1,5 мл из 10 мл).
За исключением образцов с отклонением в значениях рН или температуры инкубации, другие образцы получают при рН от 6,8 до 7,3 и температуре окружающей среды, которая во время эксперимента составляет 22°С.
Стандартные условия: инкубация O/N при температуре окружающей среды, рН от 6,5 до 7,5 и содержании гидроксида алюминия, используемого в качестве адъюванта, 9,8% масс/масс.
Процентные значения RPU антигена M.hyo, измеренные в осадке и супернатанте разных образцов, приведены в таблице 5. Температура и рН не оказывают существенного влияния на связывание антигена M.hyo с гидроксидом алюминия, используемом в качестве адъюванта. В указанных условиях относительное количество антигена M.hyo, детектированное в фазе гидроксида алюминия, находится в диапазоне 74-82%.
Однако содержание гидроксида алюминия в эмульсии оказывает значительное влияние: уменьшение этого содержания от 9,8 до 5% масс/масс, почти в два раза уменьшает относительное количество антигена M.hyo в осадке (48%), тогда как увеличение содержания гидроксида алюминия до 25% приводит к почти полному связыванию антигена M.hyo (96%).
Таблица 5: Относительное процентное содержание антигена M.hyo в осадке и супернатанте
Ср. содержание антигена M.hyo, RPU/мл, в виде % от содержания в соответствующей вакцине
№
условия
значение
осадок
супернатант
1
стандартные
74%
26%
2
температура инкубации и адсорбции
4°C
81%
19%
3
30°C
82%
18%
4
pH адсорбции
pH=6
80%
20%
5
pH=8
75%
25%
6
содержание гидроксида алюминия
5%
48%
52%
7
25%
96%
4%
контроль
непосредственное смешивание и центрифугирование
13%
87%
6.4. Вывод
Существенные различия в связывании антигена M.hyo с гидроксидом алюминия при изменении температуры или рН как условий связывания, не обнаружены. Обнаружено влияние содержания гидроксида алюминия на связывание.
Описание чертежей
Фигура 1: Результаты исследований с заражением PCV2:
Появление и длительность иммунитета, показателем которого является титр антител против PCV2, а также вирусная нагрузка PCV2, определяемая методом qPCR.
Фигура 2: Результаты исследований с заражением M.hyo:
Появление и длительность иммунитета, показателем которого является титр антител против M.hyo, а также оценка поражения легких.
Фигура 3: данные по PCV2, полученные в полевом исследовании эффективности:
Результаты полевого исследования эффективности, в котором полевая инфекция PCV2 обнаруживается в период от 8 до 12 недели эксперимента. Представлены результаты серологического анализа и детекции вирусной ДНК.
Фигура 4: данные по M.hyo, полученные в полевом исследовании эффективности:
Результаты полевого исследования эффективности, в котором полевая инфекция M.hyo обнаруживается примерно на 12 неделе эксперимента. Представлены результаты серологического анализа и оценки поражения легких.