СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ РЕЦЕПТОРОВ К ЭСТРОГЕНУ И ПРОГЕСТЕРОНУ В ТКАНИ HER2-НЕГАТИВНОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
METHOD FOR DETECTING THE PRESENCE OF ESTROGEN AND PROGESTERONE RECEPTORS IN TISSUE OF HER2-NEGATIVE BREAST CANCER

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в патологической анатомии, медицинской диагностике и для медицинских исследований, в частности для определения наличия рецепторов к эстрогену и прогестерону в ткани рака молочной железы, необходимое для определения тактики лечения пациента.
В настоящее время экспрессия эстрогеновых рецепторов в >1% опухолевых клеток является показанием для назначения гормонотерапии и существенно меняет прогноз больных с раком молочной железы. Важно, что для рецепторов прогестерона характерна ко-экспрессия с рецепторами эстрогенов (Клинические рекомендации по диагностике и лечению больных раком молочной железы. - М., 2014. - 43 с.).
Существует способ определения наличия рецепторов к эстрогену и прогестерону в ткани рака молочной железы на гистологических срезах, приготовленных путем стандартной парафиновой проводки с последующим иммуногистохимическим исследованием с мышиными моноклональными антителами к рецепторам эстрогена и прогестерона. Фрагмент ткани рака молочной железы, полученный путем биопсии или во время операции, подвергают стандартной парафиновой проводке с последующим иммуногистохимическим исследованием на парафиновых срезах пероксидазно-антипероксидазным методом с демаскировкой антигенов в РТ-модуле (DAKO) с использованием буфера для демаскировки (Tris/EDTA рН 9) (DAKO). В качестве системы визуализации используют универсальный набор с полимером EnVision Flex (DAKO). Ядра докрашивают гематоксилином Майера. Используют мышиные моноклональные антитела к рецепторам эстрогена и рецепторам прогестерона (Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. - Казань, 2004. - 452 с). Затем интенсивность иммуногистохимической экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в ядрах клеток эпителия оценивают по методу Allred (оценка процента окрашенных ядер клеток (градации от 0 до 5) и интенсивности окраски ядер (градация от 0 до 3), окончательное значение получают суммированием показателей. Значение от 0 до 2 считают отрицательной экспрессией, от 3 до 8 - положительной) (Quresh A., Pervez S. Allred scoring for ER reporting and it's impact in clearly distinguishing ER negative from ER positive breast cancers. Journal Pakistan Medical Association.2010:60(5): 350-353).
Недостатки данного способа:
1) Необходимость дорогостоящего оборудования для автоматической стандартизированной окраски и специальных дорогостоящих реактивов.
2) Необходимость специальной подготовки материала перед парафиновой проводкой.
3) Трудоемкость и низкая объективность при обработке результатов.
4) Результаты способа во многом субъективны и зависят от квалификации специалиста, проводящего оценку экспрессии.
5) Высокая вероятность искажения результата при проведении исследования без дорогостоящего автоматизированного оборудования за счет высокой чувствительности метода к условиям его выполнения.
Техническим результатом предлагаемого способа является упрощение методики и повышение объективности получаемых результатов для определения экспрессии рецепторов к эстрогену и прогестерону клетками HER-2-негативного рака молочной железы.
262
303
262
303
262
303
Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что неокрашенные депарафинированные гистологические срезы ткани рака молочной железы, приготовленные путем стандартной парафиновой проводки, после подтверждения путем иммуногистохимического исследования отсутствия рецепторов к HER-2/neu подвергают флуориметрическому исследованию, поместив их на кварцевое стекло. Удаление парафина с гистологического среза проводят промыванием его в растворе гексана. После этого проводят измерение спектра возбуждения флуоресценции опухолевой ткани в диапазоне длин волн от 230 до 360 нм при длине волны регистрации 410 нм и определяют соотношение между интенсивностями кривых с максимумами в области 262 и 303 нм (I/I), и наличие максимума на 340 нм; при I/I менее 1,0 и отсутствии максимума на спектре возбуждения флуоресценции на 340 нм, делают вывод о наличии рецепторов к эстрогену и прогестерону; при I/I более и равному 1,0 и наличии максимума на спектре возбуждения флуоресценции на 340 нм, делают вывод об отсутствии рецепторов к эстрогену и прогестерону.
Способ осуществляют следующим образом.
Фрагмент ткани рака молочной железы, полученный путем биопсии или во время операции, подвергают стандартной парафиновой проводке. После подтверждения путем иммуногистохимического исследования отсутствия в ткани рака молочной железы рецепторов к HER-2/neu, с парафинового блока готовят параллельный срез толщиной 6-7 мкм без окрашивания гематоксилином и эозином, депарафинируют его в гексане в течение 3 мин, помещают на кварцевое стекло, не окрашивая, и измеряют спектры возбуждения флуоресценции с 230 до 360 нм при длине волны регистрации 410 нм и спектры флуоресценции при длине волны возбуждения 300 нм и длин волн регистрации от 330 до 450 нм на спектрофлуориметре SOLAR СМ-2203. На графиках фигуры 1 изображены типичные спектры возбуждения флуоресценции образцов рака молочной железы, не имеющего рецепторов к эстрогену и прогестерону. Спектр возбуждения флуоресценции имеет сложную структуру, состоящую из трех четко выраженных максимумов: первый на 268 нм, второй 303 нм и третий на 340 нм. При наличии в ткани HER-2 негативного рака молочной железы рецепторов к эстрогену и прогестерону максимум на 340 нм отсутствует, при этом появляется максимум на 239 нм (фигура 2).
Для анализа спектров их раскладывают на составляющие методом Гауссово-Лоренцевых кривых. На фигуре 3 приведен пример такого разложения типичного спектра. Кривая 1 представляет собой интенсивность света, после поглощения которого произойдет ионизация молекул-флуорофоров исследуемой ткани. Кривые 2 и 3 характеризуют свечение эндогенных флуорофоров исследуемой ткани. Кривая 4 характеризует рассеянный свет. Кривая 5 характеризует измеренный спектр, который разложили на составляющие. После разложения спектра на составляющие вычисляют отношение максимумов кривых 2 и 3, которое характеризует наличие или отсутствие рецепторов к эстрогену и прогестерону.
Способ основан на изменении спектральных свойств ткани из-за изменения его биохимического состава при наличии рецепторов к эстрогену и прогестерону. Данные рецепторы имеют белковую природу, в их состав входят аминокислоты, селективно поглощающие в исследуемом диапазоне длин волн.
Пример 1. Пациентка А., 45 лет. Выполнена правосторонняя мастэктомия по поводу протокового рака молочной железы, верифицированного предоперационной трепанобиоспией. Гистологическое исследование операционного материала подтвердило предоперационный диагноз. Иммуногистохимическое исследование выявило HER2-негативный рак молочной железы, применение моноклональных антител к эстрогену и прогестерону выявило выраженную экспрессию (8 баллов по Allred).
265
305
Результаты флуориметрического исследования: значение отношения I/I составляет 0,75, на спектре флуоресценции отсутствует максимум на 340 нм., делают вывод о наличии рецепторов к эстрогену и прогестерону в ткани рака молочной железы и необходимости назначения эндокринотерапии.
Пример 2. Пациентка О., 61 год. Выполнена левосторонняя мастэктомия по поводу протокового рака молочной железы, верифицированного предоперационной трепанобиоспией. Гистологическое исследование операционного материала подтвердило предоперационный диагноз. Иммуногистохимическое исследование выявило HER2-негативный рак молочной железы, применение моноклональных антител к эстрогену и прогестерону выявило отсутствие экспрессии (0 баллов по Allred).
265
305
Результаты флуориметрического исследования: значение отношения I/I составляет 1,25, на спектре возбуждения флуоресценции присутствует максимум на 340 нм, делают вывод об отсутствии рецепторов к эстрогену и прогестерону в ткани рака молочной железы и отсутствие необходимости назначения эндокринотерапии.
Таким способом исследовано 33 случая HER2-негативного рака молочной железы, в 100% случаев результаты флуориметрического исследования соответствовали результатам определения наличия рецепторов к эстрогену и прогестерону в ткани рака молочной железы путем иммуногистохимического исследования.
Преимуществами данного способа являются дешевизна, отсутствие необходимости приобретения дорогостоящего оборудования и реактивов, требующих определенных температурных условий хранения, упрощение методики определения гормонального статуса рака молочной железы, устранение влияния субъективности на обработку результатов, отсутствие необходимости специальной подготовки материала к исследованию и возможности искажения результатов под влиянием внешних условий, быстрота получения результата, что особенно важно для онкологических больных для скорейшего решения вопроса о назначении специфической терапии.