ПРИМЕНЕНИЕ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ, ИНГИБИРУЮЩИХ ГАЗООБРАЗУЮЩИЕ КОЛИФОРМНЫЕ БАКТЕРИИ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ОТ НОВОРОЖДЕННЫХ, СТРАДАЮЩИХ КОЛИКАМИ
USING LACTIC ACID BACILLI INHIBITING GAS-PRODUCING COLIFORM BACTERIA RECOVERED FROM NEWBORN CHILDREN SUFFERING COLICS

Настоящее изобретение относится к штамму пробиотических бактерий, способных ингибировать газообразующие колиформные бактерии, выделенные от новорожденных, страдающих коликами. Кроме того, настоящее изобретение относится к пищевой композиции или добавке или фармацевтической композиции, содержащей указанный штамм бактерий, для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении кишечных расстройств и колик у новорожденных/младенцев.
Хорошо известно, что колики новорожденных являются одним из наиболее частых расстройств в первые три месяца жизни новорожденного. Также известно, что этиология колик новорожденных еще не вполне ясна и, вероятно, является многофакторной.
В последние несколько лет наблюдается рост объема данных, указывающих на участие бактериальной флоры кишечника в патогенезе колик. Недавние экспериментальные исследования, по-видимому, говорят о том, что изменение микробного окружения младенцев, страдающих коликами, может вызвать нарушение регуляции моторной функции кишечника и увеличение образования газа, что, приводя в результате к избыточному скоплению газов, является одним из классических симптомов расстройства.
Наконец, известно, что новорожденные, страдающие коликами, чаще колонизированы Clostndium difficile, газообразующим микроорганизмом, по сравнению со здоровыми новорожденными.
В настоящее время симетикон, по-видимому, наиболее показан для лечения колик. Симетикон рекомендован для лечения колик, хотя и существуют исследования, которые направлены на опровержение его подлинной эффективности in vivo по сравнению с плацебо у младенцев с коликами (Metcalf TJ, et al. Simethicone in the Treatment of Infant Colic: A Randomized, Placebo-Controlled, Multicenter Trial. 1994, Pediatrics. 94(1): 29-34; Sferra TJ, et al. Gastrointestinal gas formation and infantile colic. 1996, Pediatr Clin North Am. 43(2): 489-510).
Таким образом, остается необходимость в профилактическом и/или терапевтическом лечении расстройств желудочно-кишечного тракта и колик у новорожденных, которое является эффективным, без побочных эффектов и простым в применении.
Заявитель взялся за решение проблемы, связанной с профилактическим и/или терапевтическим лечением расстройств желудочно-кишечного тракта у новорожденных/младенцев. В частности, заявитель обратился к проблеме, связанной с профилактическим и/или терапевтическим лечением колик у новорожденных/младенцев.
После интенсивной научно-исследовательской деятельности заявитель отобрал специфические пробиотические штаммы бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus delbrueckii.
Задачей настоящего изобретения является пробиотический штамм бактерий, выбранный из группы, содержащей штаммы бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus delbrueckii.
Предпочтительные воплощения настоящего изобретения изложены ниже в следующем подробном описании, никоим образом не ограничивающем объем настоящего изобретения.
Таблица №1 относится к антагонистической активности, продемонстрированной на чашках Петри Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 в отношении колиформных бактерий, выделенных от новорожденных с коликами. Ингибирование роста патогенов выражено в виде радиуса зоны подавления, которая образуется вокруг дисков, пропитанных цельными клетками отобранных молочнокислых бактерий.
Таблица №2 относится к определению общего числа колиформных бактерий в фекальных образцах 20-ти новорожденных, страдающих коликами, во время проявления расстройства.
(*) общее число колиформных бактерий определяли путем подсчета колоний, выросших на чашках с агаром МакКонки, тогда как концентрации видов определяли, используя метод видоспецифичного ПЦР-фингерпринтинга и путем риботипирования.
Отобранные пробиотические штаммы бактерий действуют в качестве ингибиторов пролиферации колиформных бактерий. Предпочтительно, указанные колиформные бактерии выбраны из группы, содержащей колиформные бактерии, которые образуют газ при сбраживании сахара, предпочтительно лактозы.
Отобранные пробиотические штаммы бактерий обладают доказанной антибактериальной и/или антимикробной активностью (ингибиторная активность) в отношении видов Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae и, наконец, Enterococcus faecalis, которые выделены от новорожденных, страдающих коликами, и которые принадлежат к роду колиформных бактерий, участвующих в сбраживании лактозы и образовании газов в кишечнике, причем последнее считается основной сопутствующей причиной колик новорожденных.
В частности, указанные колиформные бактерии выбраны из группы, содержащей бактерии Escherichia соli.
В предпочтительном воплощении пробиотический штамм бактерий представляет собой Lactobacillus delbrueckii MB386, депонированный в DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур) компанией Steve Jones Sri, Florence, Italy, 10 декабря 2008 года и имеющий регистрационный номер DSM 22106.
Штамм Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 обладает эффективной антибактериальной и/или антимикробной активностью в отношении колиформных бактерий, выделенных от новорожденных, страдающих коликами.
Дополнительной задачей настоящего изобретения является пищевая композиция или добавка, содержащая по меньшей мере один пробиотический штамм бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus delbrueckii, как указано выше.
Дополнительной задачей настоящего изобретения является композиция, содержащая по меньшей мере один пробиотический штамм бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus delbrueckii, как указано выше, для применения в качестве лекарственного средства.
Все вышеупомянутые композиции по настоящему изобретению применяют в профилактическом и/или терапевтическом лечении расстройств или патологий, связанных с диареей, коликами, расстройством пищеварения и повышенной кислотностью желудка, синдромом раздраженного кишечника, метеоризмом, язвенной болезнью, язвой желудка или двенадцатиперстной кишки, диспепсией, болезнью Крона, абдоминальными поражениями и заболеваниями билиарной системы.
В предпочтительном воплощении все вышеупомянутые композиции по настоящему изобретению находят применение для использования в профилактическом и/или терапевтическом лечении субъектов, страдающих расстройствами желудочно-кишечного тракта, коликами и метеоризмом, в частности у новорожденных/младенцев.
В предпочтительном воплощении все вышеупомянутые композиции по настоящему изобретению дополнительно содержат по меньшей мере один дополнительный штамм бактерий с антиоксидантными свойствами, который выбран из группы, содержащей штаммы бактерий, принадлежащих к видам Lactobacillus plantarum; предпочтительно, указанный штамм представляет собой Lactobacillus plantarum LP1, депонированный в DSMZ компанией Steve Jones Sri, Florence, Italy, 10 декабря 2008 и имеющий регистрационный номер DSM 22107. Штамм Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107 обладает антиоксидантными свойствами. Штамм Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107 является пробиотическим штаммом, поскольку он демонстрирует антиоксидантную активность, связанную с отличной жизнеспособностью, протестированную in vitro, в желудочном соке и желчи, что подразумевает устойчивость при прохождении кишечного тракта.
Все вышеописанные композиции являются эффективными в предупреждении бактериальных инфекций и подавлении симптомов и расстройств со стороны желудочно-кишечного тракта, колик и метеоризма.
В одном воплощении настоящего изобретения пищевая композиция или добавка или фармацевтическая композиция может содержать вышеупомянутые бактериальные штаммы по настоящему изобретению в микроинкапсулированной форме, т.е. покрыта композицией, содержащей по меньшей мере один липид (липидная композиция), предпочтительно растительного происхождения. Кроме того, пищевая композиция или добавка или фармацевтическая композиция может содержать вышеупомянутые бактериальные штаммы по настоящему изобретению в виде микроинкапсулированных бактерий и немикроинкапсулированных бактерий.
Указанная липидная композиция содержит по меньшей мере один липид, и указанный по меньшей мере один липид имеет растительное происхождение.
Преимущественно указанный липид растительного происхождения выбран из группы, содержащей насыщенные жиры.
Преимущественно используют насыщенные жиры, имеющие температуру плавления ниже 75°C, предпочтительно от 45°C до 65°C.
В предпочтительном воплощении указанные насыщенные жиры выбраны из группы, содержащей моно- и диглицериды насыщенных жирных кислот, полиглицерины, этерифицированные насыщенными жирными кислотами, и свободные насыщенные жирные кислоты. Предпочтительно, указанные насыщенные жиры выбраны из полиглицерилдистеарата, глицерилпальмитостеарата и гидрогенизированных растительных жиров нелауринового происхождения.
В первом воплощении вышеупомянутые бактериальные штаммы по настоящему изобретению имеют однослойное покрытие.
С практической точки зрения, проводят однослойное покрытие одним липидом. Преимущественно, однослойное покрытие проводят на основе полиглицерилдистеарата (торговое наименование PIurol Stearique (полиглицерин стеарат) WL 1009).
Вышеупомянутые штаммы бактерий с однослойным покрытием по настоящему изобретению вводят в пищевую композицию или добавку или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению.
Во втором воплощении вышеупомянутые штаммы бактерий по настоящему изобретению имеют двухслойное покрытие. С практической точки зрения, проводят двухслойное покрытие последовательно двумя липидами, отличающимися друг от друга. Предпочтительно, два выбранных липида представляют собой гидрогенизированный пальмовый жир (Т.пл. составляет 60°C) и дипальмитостеарат глицерина (Т.пл. составляет 57-60°C); их последовательно распыляют на лиофилизат, то есть применяют двухслойное покрытие лиофилизата: первое покрытие гидрогенизированным пальмовым жиром (например, Revel С (ревел С)), а второе покрытие дипальмитостеаратом глицерина (например, Precirol Ato 5 (прецирол Ато 5)) в массовом соотношении 3:1, предпочтительно 2:1, например, 2/3 по массе составляет первое покрытие и 1/3 по массе составляет второе покрытие. Вышеупомянутые виды бактерий присутствуют в количестве, составляющем от 0,1% до 75% по массе, предпочтительно от 0,5% до 15% по массе и даже более предпочтительно от 1% до 10% по массе, относительно общей массы композиции или добавки. Однако указанное процентное содержание относительно общей массы композиции зависит от типа продукта композиции или добавки.
6
11
8
10
В предпочтительном воплощении композиция или добавка содержит бактерии с покрытием и/или без покрытия в концентрации, составляющей от 1×10 до 1×10 КОЕ/г, предпочтительно от 1×10 до 1×10 КОЕ/г.
6
11
8
10
В предпочтительном воплощении композиция или добавка содержит бактерии в концентрации, составляющей от 1×10 до 1×10 КОЕ/доза, предпочтительно от 1×10 до 1×10 КОЕ/доза. Доза может составлять от 0,2 г до 10 г; например, она может составлять 0,25 г, 1 г, 3 г, 5 г или 7 г.
Пробиотические бактерии, использованные в настоящем изобретении, могут находиться в твердой форме, в частности в виде порошка, дегидратированного, распыляемого или лиофилизированного порошка. Бактерии могут быть с покрытием и/или без покрытия. Бактерии, предпочтительно в микроинкапсулированной форме (с покрытием), могут быть микроинкапсулированы с использованием обычных методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, и с применением оборудования, которое известно и доступно в фармацевтической промышленности. Например, может быть использована технология кипящего слоя (например, верхнее или нижнее напыление), в которой для покрытия используются материалы липидной природы.
Во время микроинкапсулирования важным является регулирование температуры процесса производства. В частности, важно контролировать температуру применяемого липида, для того чтобы избежать гибели используемых штаммов.
В предпочтительном воплощении, композиция или добавка находится в форме масляной суспензии, содержащей:
- по меньшей мере одно пищевое масло, выбранное из группы, содержащей: оливковое масло, кукурузное масло, соевое масло, льняное масло, арахисовое масло, кунжутное масло, рыбий жир и рисовое масло, причем указанное по меньшей мере одно масло присутствует в количестве, превышающем или равном 70% по массе относительно общей массы суспензии, и
- по меньшей мере один пробиотический штамм бактерий, выбранный из группы, содержащей штаммы бактерий, принадлежащих к видам L. delbrueckii и L plantarum, причем указанный штамм присутствует в количестве, меньшем или равном 30% по массе относительно общей массы суспензии.
В предпочтительном воплощении масло для суспензии представляет собой только оливковое масло; предпочтительно оно представляет собой оливковое масло в смеси с кукурузным маслом, и/или соевым маслом, и/или льняным маслом.
В предпочтительном воплощении масляная суспензия может также содержать, в количестве от 0,1 до 15% по массе относительно общей массы суспензии, по меньшей мере одно тонкоизмельченное пищевое соединение, выбранное из группы, содержащей диоксид кремния, кремниевый ангидрид, силикагель, коллоидный диоксид кремния, осажденный диоксид кремния, тальк, силикат магния, оксид магния, карбонат магния, силикат кальция, лецитин, моно- или диглицериды, такие как глицерилмоностеарат, глицерилмоноолеат, полиглицеринолеат, крахмал, модифицированный крахмал, конжаковую камедь, ксантановую камедь, геллановую камедь и каррагинан.
В предпочтительном воплощении масляная суспензия может также содержать, в количестве от 0,5 до 25% по массе относительно общей массы суспензии, по меньшей мере одно пребиотическое волокно и/или бифидогенный углевод, выбранные из инулина, фруктоолигосахаридов (ФОС), галакто- и трансгалактоолигосахаридов (ГОС и ТГОС), глюкоолигосахаридов (ГОСα), ксилоолигосахаридов (КОС), олигосахаридов хитозана (ХОС), олигосахаридов сои (СОС), изомальтоолигосахаридов (ИМОС), мальтодекстрина, резистентного крахмала, пектина, псиллиума, арабиногалактанов, глюкоманнанов, галактоманнанов, ксиланов, лактосахарозы, лактулозы, лактита, волокна акации, волокна каррубы, волокна овса, бамбукового волокна и цитрусового волокна.
В предпочтительном воплощении масляная суспензия содержит по меньшей мере одно волокно и по меньшей мере один углевод, выбранные из глюкоолигосахаридов (ГОСα), фруктоолигосахаридов (ФОС), инулина и/или мальтодекстрина.
В предпочтительном воплощении масляная суспензия содержит Lactobacillus delbmekii MB386 DSM 22106 и Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107 (микроинкапсулированные) с однослойным покрытием (или с двухслойным покрытием) из по меньшей мере одного липида, имеющего температуру плавления ниже 75°С, которая предпочтительно составляет от 45°С до 65°С, как указано выше.
Масляную суспензию по настоящему изобретению получают способами, хорошо известными специалистам в данной области техники, и с использованием известного оборудования.
С практической точки зрения, данное количество масла вводят в сосуд, снабженный перемешивающим и нагревающим устройствами. Затем при перемешивании постепенно добавляют пробиотические бактерии в твердой форме, так чтобы избежать образования комков и агломератов. После того как добавление бактерий завершено, маслянистое вещество выдерживают при перемешивании в течение времени, составляющем от 1 до 30 минут, если необходимо с незначительным нагреванием до температуры, составляющей от 24 до 40°С, предпочтительно от 30 до 35°С.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения пробиотические бактерии могут быть использованы в микроинкапсулированной форме, то есть покрыты композицией, содержащей по меньшей мере один липид, предпочтительно растительного происхождения. Микроинкапсулированные бактерии затем добавляют в масло, используя те же рабочие методы, которые описаны выше.
В другом воплощении настоящего изобретения бактерии, добавляемые в масло, могут находиться в виде микроинкапсулированных бактерий и «непокрытых», немикроинкапсулированных бактерий.
Бактерии, предпочтительно в микроинкапсулированной форме, могут быть микроинкапсулированы с использованием обычных методов, известных специалистам в данной области техники. Например, можно использовать технологию кипящего слоя (например, верхнее или нижнее напыление), в которой для покрытия используют материалы липидной природы.
В предпочтительном воплощении используют насыщенные растительные жиры, имеющие температуру плавления ниже 75°C, которая предпочтительно составляет от 45°C до 65°C.
В предпочтительном воплощении могут быть использованы насыщенные растительные жиры, имеющие определенную степень гидрофильности; они могут быть выбраны из моно- и диглицеридов насыщенных жирных кислот, полиглицеринов, этерифицированных насыщенными жирными кислотами, и свободных насыщенных жирных кислот.
Например, возможно применение полиглицерилдистеарата (торговое наименование Plurol Stearique (полиглицерин стеарат) WL 1009) глицерилпальмитостеарата (торговое наименование Precirol Ato 5 (прецирол Ато 5)), насыщенных жирных кислот (торговое наименование Revel С (ревел С)) или гидрогенизированных растительных жиров нелауринового происхождения.
В предпочтительном воплощении массовое соотношение между лиофилизированным микроорганизмом и нанесенным на него липидным материалом покрытия составляет 50:50 или 40:60.
В первом воплощении два липида, представляющие собой гидрогенизированный пальмовый жир (Т.пл. составляет 60°C) и дипальмитостеарат глицерина (Т.пл. составляет 57-60°C), последовательно распыляют на лиофилизат, то есть применяют двухслойное покрытие лиофилизата: первое покрытие гидрогенизированным пальмовым жиром, а второе покрытие дипальмитостеаратом глицерина в соотношении 3:1. Двухслойное покрытие клеток обеспечивает лучшую изоляцию бактерий от окружающей среды, создавая непрерывную пленку без пор, сообщающихся с внешней средой. Однако эта оболочка должна раскрываться на уровне желудочно-кишечного тракта, чтобы высвободить бактерии и дать им возможность колонизировать пространство. Выбранные липиды фактически устойчивы к кислому pH, так что в желудке покрытие остается неповрежденным, но чувствительны даже к незначительному щелочному pH, что делает возможным образование пор в покрытии во время его прохождения через кишечник.
Масляная суспензия содержит бактерии в количестве, меньшем или равном 30% по массе, составляющем от 0,5 до 20% по массе относительно общей массы суспензии; предпочтительно в количестве, составляющем от 0,5 до 10%; даже более предпочтительно в количестве, составляющем от 1,5 до 5% по массе относительно общей массы суспензии.
Масляная суспензия имеет эффективное применение при использовании в качестве лекарственного средства для лечения кишечных расстройств, таких как колики у детей.
Исследование было проведено с целью оценки роли газообразующих колиформных бактерий в этиологии колик новорожденных.
С практической точки зрения, было проведено рандомизированное проспективное исследование, в котором участвовали 49 новорожденных, страдающих коликами, и 35 здоровых новорожденных; их возраст составлял от 20 до 90 дней, в соответствии с гестационным возрастом, они находились исключительно на грудном вскармливании и не имели заболеваний желудочно-кишечной системы. Фекальные образцы собирали у обеих групп новорожденных в заранее установленные моменты времени и изучали в течение следующих 48 часов. Цель исследования заключалась в том, чтобы установить, существуют ли значительные качественные/количественные отличия в двух группах новорожденных относительно наличия газообразующих колиформных бактерий.
Типичными родами микроорганизмов, включенными в группу колиформных бактерий, являются: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia coli, Klebsiella и другие небольшие группы. Идентификацию наиболее репрезентативных видов, выделенных из фекальных образцов, проводили на молекулярном уровне, используя ПЦР (полимеразную цепную реакцию) и автоматизированные методы риботипирования. В конце изучали способность микробных колоний образовывать газ при сбраживании лактозы и других сахаров.
10
10
-1
Молекулярная и фенотипическая идентификация различных видов колиформных бактерий показала различную картину колонизации в двух группах, с коликами и без колик, и, в частности, показала, что концентрация вида Escherichia coli значительно выше в группе новорожденных с коликами [(log 6,04 против log 4,47) КОЕ·г фекалий]. Считают, что именно аномальная концентрация этого вида Escherichia coli может способствовать развитию заболевания.
Не исключено, что большое количество видов колиформных бактерий, изученных в данном исследовании авторами изобретения, у новорожденных, страдающих этой патологией, может быть связано с сокращением некоторых других, еще не идентифицированных видов бактерий, полезных для хозяина, в результате чего возможны последствия в отношении состояния здоровья хозяина.
Краткое описание графических материалов
4
6
На Фиг. 1 представлена активность Lactobacillus delbrueckii DSM 22106 в отношении штамма Escherichia coli sp., выделенного от новорожденного 15. Диск А пропитан надосадочной жидкостью; диск В пропитан суспензией, содержащей от 1×10 до 1×10 целых клеток.
4
6
На Фиг. 2 представлена активность Lactobacillus delbrueckii DSM 22106 в отношении штамма Klebsiella pneumoniae sp., выделенного от новорожденного 12. Диск А пропитан надосадочной жидкостью; диск В пропитан суспензией, содержащей от 1×10 до 1×10 целых клеток.
Экспериментальная часть
1. Введение
Заявитель провел исследование, направленное на селекцию пробиотических штаммов, принадлежащих к роду Lactobacillus, отобранных и оцененных по эффективности их антиоксидантного, антибактериального и антимикробного действия в отношении видов колиформных бактерий, выделенных от новорожденных, страдающих коликами.
Десятки штаммов колиформных бактерий, образующих газ при сбраживании сахара, в частности лактозы, были выделены из фекалий новорожденных, страдающих коликами, для оценки in vitro ингибирования их роста пробиотическими штаммами бактерий, принадлежащих к роду Lactobacillus, которые приняты к рассмотрению.
2. Выделение штаммов и условия культивирования
С целью определения количества и исследования наличия колиформных бактерий собирали фекальные образцы от 49 находящихся исключительно на грудном вскармливании новорожденных, страдающих коликами, которые проявились за 6±1 суток до включения в исследование. Выделение штаммов проводили на чашках Петри с селективным агаром МакКонки (DIFCO №0075.17.1), который является средой, обычно используемой для выделения и подсчета энтеробактерий (называемых "колиформы"), после помещения их в идеальные условия для роста: 37°C в регулируемой атмосфере.
10
После 12 часов инкубации подсчитывают колонии, которые появляются на чашке, и тщательно фиксируют все морфологические различия между колониями. Численные результаты представлены в виде log числа колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм фекалий. Затем отдельно берут каждую выделенную колонию и инокулируют ее в пробирке с жидким LB-бульоном (Лурия-Бертани) для получения чистых культур.
3. Идентификация колоний колиформных бактерий
Все 20 культур фекальных бактерий, полученных из фекалий новорожденных, страдающих коликами, анализировали с целью выделения наиболее репрезентативных родов колиформных бактерий.
Видоспецифичное распознавание колоний было достигнуто при использовании двух различных молекулярных методов идентификации: праймер-специфичной ПЦР и автоматического риботипирования. Объединение результатов, полученных при использовании обоих методов, позволило идентифицировать выделенные штаммы с высокой степенью точности, а также определить, какие виды являются наиболее репрезентативными в популяции колиформных бактерий, которые колонизируют кишечник новорожденных, страдающих коликами.
Наконец, каждый бактериальный вид оценивали количественно путем подсчета, в каком процентном соотношении он представлен от всей выделенной популяции колиформных бактерий.
а. Автоматическое риботипирование
Автоматическое штаммспецифичное риботипирование включает в себя использование чрезвычайно сложного прибора: системы для идентификации и характеристики микроорганизмов RiboPrinter (Qualicon Inc., Wilmington, DE, USA). Бактериальные колонии, выделенные на чашке Петри, отбирают по отдельности; после температурной обработки и при помощи литических ферментов добиваются высвобождения ДНК, которая расщепляется эндонуклеазами рестрикции EcoRI. В итоге, фрагменты ДНК, разделенные гель-электрофорезом, анализируют при использовании модифицированного Саузерн-блоттинга. Гибридизационный анализ представлен в виде изображения отдельных хемилюминесцентных полос, которые прибор преобразует в компьютерные данные, или в виде шаблона RiboPrint, который он фиксирует и сохраняет в памяти. Окончательная идентификация достигается путем сравнения полученного шаблона RiboPrint с шаблонами, хранящимся в базе данных Dupont прибора. Профили со сходством, по меньшей мере равным 93%, как подсчитано с помощью соответствующего алгоритма, объединяют с формированием динамической рибогруппы, которая отражает родство или генетическую идентичность между выделенными колониями.
б. Праймер-специфичная ПЦР
С целью молекулярной идентификации колиформных бактерий амплифицировали фрагменты рибосомальной ДНК внутренних транскрибируемых спейсеров 16S-23S области.
Колонии чистых культур бактерий, выделенные на чашке Петри, отбирали по отдельности и ресуспендировали в стерильной дистиллированной воде и затем лизировали в течение 5 минут при 95°C для обеспечения высвобождения ДНК. Реакции амплификации проводили с использованием универсальных праймеров: к 16S области - прямой праймер (5'-GCTGGATCACCTCCTTTC-3') и к 23S области - обратный праймер (5'-AGTGCCAAGGCATCCACC-3').
Реакции амплификации проводили в термоциклере Biometra TGradient (с температурным градиентом) (Biometra, Gottingen, Germany), установив специфический профиль термоциклирования. Продукты амплификации разделяли гель-электрофорезом; фрагменты длиной приблизительно 400 пар оснований очищали с использованием набора экстракции из геля QIAquick (QIAGEN, Hilden, Germany); в итоге, фрагменты ДНК, амплифицированные с 16S и 23S праймерами, подвергали автоматическому секвенированию.
4. Образование газа колиформными бактериями
Способность образовывать газ, наблюдаемую у всех выделенных колиформных бактерий, оценивали путем инокулирования каждого отдельного штамма в жидком LB-бульоне (Лурия-Бертани) и/или в лаурилсульфат-триптозном (LST) бульоне, содержащем 10 г/л лактозы в качестве единственного источника углерода. Через 24-48 часов после инокулирования и после инкубации при 35°C бактериальные культуры исследовали на наличие пузырьков газа в жидкой среде по методу Jiang Т et al. 51. Присутствие газа служило признаком положительной реакции на тест.
5. Произвольный отбор молочнокислых бактерий и условия культивирования
Штаммы молочнокислых бактерий, антимикробная активность которых была протестирована в отношении колиформных бактерий новорожденных, представляли собой 30 произвольно отобранных штаммов, представляющих различные виды молочнокислых бактерий. Молочнокислые бактерии, использованные в данном исследовании, поступали из коллекций АТСС и DSMZ (Американская коллекция типовых культур, Rockville, Md., и Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Braunschweig, Germany, соответственно).
Таксономию штамма Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107 подтверждали на уровне вида с помощью автоматического риботипирования. Штамм, отобранный посредством скрининга, Lactobacillus delbrueckii MB386, поступил из Немецкой коллекции DSMZ (DSM 20074 или АТСС 9649).
Все молочнокислые бактерии, используемые в данном исследовании, культивировали в течение 24 часов при 37°C в MRS-бульоне (Ман Рогоза Шарп) для молочнокислых бактерий - Difco Laboratories, Sparks, Maryland, USA-(MRS), содержащем 0,5 г/л цистеина в качестве восстановителя.
6. Анализ с целью оценки антимикробных свойств
Антимикробные свойства оценивали с использованием двух методик:
ингибирования бактериального роста на чашках Петри или диско-диффузионного метода Кирби-Бауэра (1940), и приготовления совместных культур отобранных молочнокислых бактерий с одним или более чем одним видом колиформных бактерий, полученных от новорожденных, страдающих коликами.
а) Антимикробная активность на чашках Петри
4
6
3
6
Цель этого метода заключается в исследовании ингибирующего действия штаммов рассматриваемых молочнокислых бактерий на in vitro рост колиформных бактерий, выделенных от новорожденных. Штаммы молочнокислых бактерий выращивали в анаэробных условиях в жидком MRS-бульоне в течение 48 часов при 37°C. Клетки, полученные из культуральной жидкости посредством центрифугирования, ресуспендировали в физиологическом растворе до получения концентрации 10 и 10 клеток/мл, которую определяли посредством измерения оптической плотности при 600 нм. Надосадочную жидкость, отделенную от биомассы, нейтрализовали до pH 7,0. Клеточную суспензию, содержащую рассматриваемые колиформные бактерии в концентрации 10 и 10 клеток/мл, рассевали на твердой агаризованной (0,7%) LB-среде (Лурия-Бертани); затем на среду помещали два диска (6 мм в диаметре), причем один был пропитан клеточной суспензией рассматриваемых молочнокислых бактерий, а другой соответствующей надосадочной жидкостью. Контроль готовили таким же способом, но на среде размещали два непропитанных стерильных диска.
После 18 часов инкубации при 37°C измеряли зоны ингибирования псевдопатогена, которые появлялись вокруг дисков.
б) Антимикробная активность в жидких совместных культурах
5
Антагонизм, проявляемый молочнокислыми бактериями, рассматриваемыми в настоящем исследовании, в отношении роста колиформных бактерий, подтверждали с помощью совместного инкубирования в жидкой среде каждого потенциального пробиотического ингибитора с наиболее репрезентативными колиформными бактериями, выделенными от новорожденных. Инокулум совместной культуры получали посредством раздельного культивирования пробиотика и колиформных бактерий в оптимальных условиях. Бактериальные клетки от каждой из двух культур собирали посредством центрифугирования и ресуспендировали в свежей соответствующей среде, чтобы избежать создания каких-либо условий для роста, которые могут возникать в совместной культуре вследствие нежелательных колебаний pH или снижения питательных веществ. В жидкой питательной среде на основе модифицированного LB-бульона (Лурия-Бертани с добавлением 3% дрожжевого экстракта, pH 7) инокулировали молочнокислые бактерии с общей концентрацией 10 КОЕ/мл и известную бактериальную суспензию колиформных бактерий той же концентрации. Контроль готовили таким же способом, заменяя инокулум пробиотика на свежую среду без каких-либо клеток.
10
Полученные таким образом совместные культуры и контроли инкубировали при 37°C в регулируемых микроаэрофильных условиях и после 8-10 часов оценивали антагонистическую активность, продемонстрированную пробиотиками, путем определения ингибирования роста колиформных бактерий. Его подсчитывали посредством вычитания числа колиформных бактерий, обнаруженных в пробирке при совместной инкубации, из числа колиформных бактерий в контрольной пробирке, инокулированной только колиформными бактериями. Показатель КОЕ/мл жизнеспособной бактериальной популяции, которая выросла, измеряли путем распределения известных аликвот совместных культур и контролей по средам, селективным как для молочнокислых бактерий (агар MRS для молочнокислых бактерий), так и для колиформных бактерий (агар МакКонки) (Annuk 2003); в итоге определяли изменение pH после 24 часов совместной инкубации. Результаты относительно бактериальных концентраций молочнокислых бактерий и колиформных бактерий выражали в виде log КОЕ/мл.
Примеры
Следующие примеры представлены для иллюстративных целей и не предназначены ограничивать объем изобретения каким-либо образом.
Пример 1
3
6
Отобранный штамм Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 культивировали в анаэробных условиях в жидкой среде в течение 48 часов при 37°C. Выращенную в течение ночи культуру штамма колиформных бактерий Escherichia coli sp., выделенного от новорожденного 15 (см. таблицу 2), имеющего клинически диагностированные симптомы колик новорожденных, обрабатывали, как в описанном выше исследовании, для анализа антимикробной активности на чашках Петри. Суспензию колиформных бактерий, имеющую концентрацию 10-10 клеток/мл, рассевали на твердой LB-среде; затем на среду помещали два диска, причем один (диск В, фиг.1) был пропитан суспензией полученных клеток Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106, а другой соответствующей нейтрализованной надосадочной жидкостью (диск А, фиг.1).
Подготовленную таким образом чашку Петри оставляли в покое при 4°C в течение по меньшей мере одного часа. После 18 часов инкубации при 37°C проводили измерение зон ингибирования роста штамма Escherichia coli sp., которые проявлялись вокруг двух дисков.
Результат: зона подавления роста исследуемого штамма Escherichia coli, выделенного от новорожденного 15, страдающего детскими коликами, была видимой только вокруг диска, который был пропитан суспензией клеток Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106, тогда как никакой зоны ингибирования не возникало вокруг диска, пропитанного соответствующей надосадочной жидкостью молочнокислых бактерий. Зону подавления роста колиформных бактерий измерили, и было показано, что она имеет радиус 13 мм (фиг.1).
Пример 2
Была проведена оценка антимикробной активности, проявляемой пробиотической молочнокислой бактерией Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 в отношении штамма b Klebsiella pneumoniae, выделенного от новорожденного 12, страдающего детскими коликами (таблица 2). Для целей этого исследования два бактериальных штамма обрабатывали, как описано в примере 1.
Результат: было проведено измерение зоны ингибирования роста штамма b Klebsiella pneumoniae, выделенного от новорожденного 12 с детскими коликами, которая возникала вокруг диска, который был пропитан суспензией клеток Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106. В данном случае также не было обнаружено никакой антагонистической активности у диска, пропитанного только надосадочной жидкостью, лишенной клеток, взятых из культуры молочнокислых бактерий. Как было измерено, зона подавления имела радиус 12,5 мм, что можно видеть на фиг.2.
Пример 3
Была проведена оценка антимикробной активности, проявляемой пробиотической молочнокислой бактерией Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 в отношении всех штаммов Eschenchia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae и, наконец, Enterococcus faecalis, выделенных от новорожденных, страдающих детскими коликами, и от контрольных здоровых новорожденных.
Для целей этого исследования пробиотический штамм лактобактерий и колиформные бактерии, выделенные от новорожденных, обрабатывали, как описано в примере 1.
Результат: как правило, исследуемый штамм Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 всегда демонстрировал ингибирующую активность в отношении всех тестируемых колиформных бактерий. Чашку Петри с контролем готовили посредством помещения на агаризованную LB-среду двух одинаковых стерильных дисков, не пропитанных ни суспензией клеток, ни отдельной культуральной жидкостью. Контроль никогда не проявлял никакого ингибирующего действия на рост исследуемых штаммов колиформных бактерий. Все результаты, полученные с помощью тестов, проводимых для оценки антагонистической активности, проявляемой на чашках Петри рассматриваемой молочнокислой бактерией и выраженной в виде среднего радиуса зон ингибирования, представлены в таблице 1.
Пример 4
Также была проведена оценка антимикробной активности, проявляемой отобранной пробиотической молочнокислой бактерией Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107 в отношении всех штаммов Eschenchia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae и, наконец, Enterococcus faecalis, выделенных от новорожденных, страдающих детскими коликами, и от контрольных здоровых новорожденных. Для целей этого исследования пробиотический штамм лактобактерий и колиформные бактерии, выделенные от новорожденных, обрабатывали, как описано в примере 1.
Результат: как правило, исследуемый штамм Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107 никогда не демонстрировал никакого ингибирующего действия на исследуемые колиформные бактерии.
Пример 5
3
6
Была проведена оценка антимикробной активности, проявляемой совместно двумя пробиотическими штаммами лактобактерий по изобретению, Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 и Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107, в отношении всех выделенных штаммов колиформных бактерий: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae и, наконец, Enterococcus faecalis, выделенных от новорожденных, страдающих детскими коликами. Для целей этого исследования два пробиотических штамма лактобактерий культивировали по отдельности, как описано в примере 1, и каждую колиформную бактерию обрабатывали так же, как описано в примере 1. Суспензию колиформной бактерии, имеющую концентрацию 10-10 клеток/мл рассевали на твердой LB-среде. Затем на среду помещали два диска, причем один был пропитан суспензией полученных клеток Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 известной концентрации плюс суспензией, имеющей аналогичную концентрацию клеток, полученной из культуры L. plantarum DSM 22107, а другой диск - смесью, образованной двумя нейтрализованными надосадочными жидкостями, лишенными клеток, полученных из культур двух лактобактерий. Подготовленную таким образом чашку Петри оставляли в покое при 4°C в течение по меньшей мере одного часа. После 18 часов инкубации при 37°C проводили измерение зон ингибирования роста рассматриваемых колиформных бактерий, которые появлялись вокруг двух дисков там, где эти зоны присутствовали.
Результаты: тесты на антибактериальную активность, проявляемую при синергизме, выявили, что зона ингибирования роста каждого штамма колиформных бактерий, выделенных от новорожденных с коликами, всегда возникала только вокруг диска, который был пропитан двумя суспензиями клеток L. delbrueckii DSM 22106 и L. plantarum DSM 22107, тогда как никакой зоны ингибирования не возникало вокруг диска, пропитанного соответствующими надосадочными жидкостями, полученными из культур двух лактобактерий. В итоге, измерили зону ингибирования, возникающую под воздействием целых клеток, и показали, что она имеет средний радиус, сопоставимый с радиусом, полученным вследствие антагонистической активности, проявляемой только L. delbrueckii DSM 22106 (таблица 1).
Пример 6
5
Антагонистическую активность Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 in vitro оценивали посредством инокулирования модифицированной LB-среды, уже описанной в абзаце, посвященном способу оценки антимикробной активности в жидкой совместной культуре, молочнокислыми бактериями с общей концентрацией КОЕ/мл 10 и клетками штамма a Escherichia coli, выделенного от страдающего коликами новорожденного 15, в такой же концентрации (см. таблицы). Вторую пробирку, содержащую модифицированную LB-среду, инокулировали только клетками колиформных бактерий. Совместную культуру и контроль инкубировали при 37°C в микроаэрофильных условиях и после 8-10 часов оценивали антагонистическую активность, проявляемую лактобактериями в отношении штамма Escherichia coli.
Чтобы оценить рост Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 и штамма Escherichia coli, полученный как в результате тестов на совместную инкубацию, так и в контроле, измеряли показатель КОЕ/мл двух бактериальных штаммов как в нулевой момент инокулирования, так и через 24 часа, путем рассевания аликвот культуральной жидкости совместной культуры и контроля как на MRS-агаре, содержащем 0,2% ванкомицина (селективного для лактобактерий), так и на агаре МакКонки (селективном для Escherichia coli); в итоге определяли изменение pH в пробирке при совместной инкубации и в контроле через 24 часа.
5
5
9
5
5
9
Результаты: в момент времени t0 (время инокулирования) 2,7×10 клеток Lactobacillus delbrueckii DSM 22106 совместно инокулировали с 5,0×10 клеток Escherichia coli. Начальный pH составлял 6,8. Через 24 часа (t24) подсчет на чашках Петри с селективными средами выявил 7,0×10 КОЕ/мл Lactobacillus delbrueckii DSM 22106 и 5,0×10 КОЕ/мл Escherichia coli, тогда как pH снизилось до 4,3. В контрольную пробирку инокулировали только 4,5×10 КОЕ/мл Escherichia coli в момент времени t0; инокулум лактобактерий заменяли добавлением равного объема свежей среды без каких-либо клеток. Через 24 часа инкубации подсчет выявил 1,0×10 КОЕ/мл инокулированных бактерий Escherichia coli. рН среды, равный 6,8, оставался неизменным через 24 часа.
Пример 7
Оценка антимикробной активности, проявляемой комбинацией двух штаммов Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 и Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107, была проведена как в примере 5, но при совместной инкубации со штаммами колиформных бактерий наиболее репрезентативных для каждого идентифицированного вида, выделенного от новорожденных.
2
2
4
Антагонистическую активность, проявляемую при «синергизме» двумя лактобактериями, оценивали посредством инокулирования модифицированной LB-среды клетками L. delbrueckii DSM 22106 с общей концентрацией КОЕ/мл 10 и клетками L. plantarum DSM 22107 с концентрацией 10 и, наконец, клетками рассматриваемых колиформных бактерий в равной концентрации (10). Вторую пробирку, содержащую модифицированную LB-среду, инокулировали только клетками обеих лактобактерий. Совместную культуру и контроль, полученные таким образом, инкубировали при 37°С в микроаэрофильных условиях и после 8-10 часов оценивали полученную антагонистическую активность, при ее наличии.
Чтобы оценить рост лактобактерий и колиформных бактерий, полученный как в результате тестов на совместную инкубацию, так и в контроле, измеряли показатель КОЕ/мл каждого вида бактерий как в нулевой момент инокулирования, так и через 24 часа, как описано в примере 5.
Общий показатель КОЕ/мл лактобактерий подсчитывали вместе с показателем КОЕ/мл рассматриваемых колиформных бактерий; в итоге определяли изменение рН в пробирке при совместной инкубации и в контроле через 24 часа.
9
5
Результаты: независимо от видов и от новорожденного, от которого они выделены, концентрация колиформных бактерий в совместной культуре с двумя пробиотическими молочнокислыми бактериями уменьшилась по меньшей мере на 4 логарифмические единицы (от Е10 до Е10) по сравнению с контрольной пробиркой. рН, всегда измеряемый до и после 24 часов инкубации, изменялся на величину по меньшей мере 3,3±0,4 при совместной инкубации в пробирках с обеими лактобактериями и штаммом колиформных бактерий, тогда как рН в контрольных пробирках всегда оставался неизменным.
Из вышеизложенного следует, что штамм L. delbrueckii MB386 DSM 22106 обладает четко выраженной антибактериальной активностью в отношении видов Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae и, наконец, Enterococcus faecalis, выделенных от страдающих коликами новорожденных и принадлежащих к роду колиформных бактерий, участвующих в сбраживании лактозы и образовании газов в кишечнике, считающихся основной сопутствующей причиной колик новорожденных.
Снижение концентрации кишечных колиформных бактерий считается существенным для поддержания устойчивого равновесия кишечной микробиоты человека, благоприятно отражаясь на состоянии здоровья.
Таблица 2
№№ субъектов
Общее число колиформных бактерий (КОЕ·r<sup>1</sup> фекалий)*
Число морфологически различных колоний на чашке
Кратность разведения на чашке
Идентифицированные виды
2
5,0×10<sup>6</sup>
2
а. 10<sup>-6</sup>
а. E. coli
б. 10<sup>-6</sup>
б. Е. coli
3
1,0×10<sup>6</sup>
2
а. 10<sup>-6</sup>
а. К. pneumoniae
б. 10<sup>-4</sup>
б. Е. coli
4
1,0×10<sup>7</sup>
2
а. 10<sup>-6</sup>
а. E. coli
б. 10<sup>-6</sup>
б. К. oxytoca
6
3,0×10<sup>8</sup>
2
а. 10<sup>-8</sup>
а. Е. coli
б. 10<sup>-7</sup>
б. E. coli
7
2,0×10<sup>7</sup>
1
а. 10<sup>-7</sup>
а. Е. faecalis
9
7,0×10<sup>3</sup>
1
а. 10<sup>-3</sup>
а. E. coli
12
4,0×10<sup>7</sup>
2
а. 10<sup>-7</sup>
а. Е. coli
б. 10<sup>-7</sup>
б. К. pneumoniae
13
3,7×10<sup>7</sup>
2
а. 10<sup>-7</sup>
а. Е. coli
б. 10<sup>-5</sup>
б. Е. coli
15
3,4×10<sup>8</sup>
2
а. 10<sup>-6</sup>
а. Е. coli
б. 10<sup>-5</sup>
б. Е. coli
16
4,3×10<sup>8</sup>
2
а. 10<sup>-8</sup>
а. Е. coli
б. 10<sup>-5</sup>
б. К. oxytoca
1,1×10<sup>6</sup>
а. 10<sup>-6</sup>
а. Е. coli
17
2
б. 10<sup>-5</sup>
б. Enterobacter cloacae
18
8,1×10<sup>6</sup>
2
а. 10<sup>-6</sup>
а. К. oxytoca
б. 10<sup>-5</sup>
б. Е. faecalis
22
1,1×10<sup>3</sup>
1
а. 10<sup>-3</sup>
а. Е. coli
а. 10<sup>-6</sup>
а. К. oxytoca
б. 10<sup>-6</sup>
б. Е. aerogenes
23
9,5×10<sup>6</sup>
4
в. 10<sup>-6</sup>
в. Е. coli
г. 10<sup>-5</sup>
г. Е. coli
24
1,0×10<sup>3</sup>
1
а. 10<sup>-3</sup>
а. E. coli
29
5,8×10<sup>8</sup>
2
а. 10<sup>-8</sup>
а. E. coli
6. 10<sup>-7</sup>
б. Е. coli
а. 10<sup>-3</sup>
а. Е. coli
32
2,7×10<sup>6</sup>
4
б. 10<sup>-5</sup>
б. К oxytoca
в. 10<sup>-5</sup>
в. К. pneumoniae
г. 10<sup>-5</sup>
г. К. oxytoca
36
1,0×10<sup>4</sup>
1
а. 10<sup>-4</sup>
а. К. oxytoca
39
1,0×10<sup>4</sup>
1
а. 10<sup>-4</sup>
а. К. pneumoniae
48
2,6×10<sup>6</sup>
1
а. 10<sup>-6</sup>
а. К. oxytoca
(*) общее число колиформных бактерий определяли путем подсчета колоний, выросших на чашках с агаром МакКонки, тогда как концентрации видов определяли при использовании метода видоспецифичного ПЦР-фингерпринтинга и путем риботипирования.