Состав микробных сообществ при различном содержании нефтепродуктов в серых лесных почвах

ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 579.26

Т. В. Кузнецова, А. М. Петров, И. В. Князев, Р. Э. Хабибуллин

СОСТАВ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ ПРИ РАЗЛИЧНОМ СОДЕРЖАНИИ НЕФТЕПРОДУКТОВ

В СЕРЫХ ЛЕСНЫХ ПОЧВАХ

Ключевые слова: серые лесные почвы, нефтепродукты, микробное сообщество

Проведено изучение микробного пула при разном остаточном содержании нефтяных загрязнений в рекультивированных серых лесных почвах. Не выявлено отрицательного воздействия нефтепродуктов в концентрации 5,8-6,4 г/кг на почвенные микробные сообщества светло-серых, серых и темно-серых лесных почв.

Key words: grey forest soil, oil products, microbial community

Microbial pool at different residual contents of oil contamination in the re-cultivated grey forest soils was examined. No negative effect of oil products in the concentration of 5.8-6.4 g/kg on soil microbial communities of light-grey, grey and dark-grey forest soils was found.

Введение

Интенсивность процессов восстановления свойств и плодородия нефтезагрязненных почв при проведении рекультивационных мероприятий определяется активностью микробного сообщества, его ответной реакцией на содержание поллютанта. Поступление углеводородов в почву вызывает кардинальную перестройку состава микробного сообщества, стимулируя развитие популяций перерабатывающих новый субстрат и потребляющих значительное количество азота [1-4].

Изучение структуры микробного комплекса и функциональных взаимоотношений в системе «почва-микроорганизмы» является фундаментальной основой для понимания процессов восстановления техногенно-нарушенных экосистем и способов биорекультивации.

Целью работы являлось изучение влияния остаточного содержания нефтепродуктов (НП) на структуру микробного комплекса, численность ряда физиологических групп почвенных микроорганизмов.

Материалы и методы

В модельных лабораторных экспериментах были использованы образцы чистых и загрязненных сернистой нефтью серых лесных почв разного гранулометрического состава:

1. Светло-серая лесная (ССЛ). Среднесуглинистая, близкая к легкосуглинистой. Содержание органического вещества высокое, обычно характерное для гумусовых горизонтов лесных почв. Характеризуется слабокислой реакцией среды. Обеспеченность питательными элементами: подвижный фосфор - очень низкая, подвижный калий - очень низкая.

2. Серая лесная почва (СЛ). Легкосуглинистая. Содержание органического вещества относительно низкое для данного подтипа. Реакция среды - близкая к нейтральной. Обеспеченность подвижным фосфором -очень низкая, подвижным калием - низкая.

3. Темно-серая лесная почва (ТСЛ). Легкосуглинистая. Содержание органического вещества приближается к нижнему пределу, характерному для

данного подтипа почв. Реакция среды - близкая к нейтральной. Обеспеченность подвижным фосфором очень низкая, подвижным калием -низкая.

Влажность почвенных образцов в ходе лабораторных рекультивационных

экспериментов (рыхление) составляла 60% от полной влагоемкости, температура окружающего воздуха 20-24° С. Остаточное содержание НП в опытных образцах на момент анализа микробного пула варьировало в интервале от 0,7 до 6,4 г/кг. Содержание НП в контроле было меньше минимально определяемой

использованной методикой выполнения измерения [5] концентрации (<0,05 г/кг).

В процессе выполнения микробиологических исследований определяли общее микробное число (ОМЧ), численность спорообразующих и углеводородокисляющих (УОМ),

целлюлозоразрушающих микроорганизмов, азотофиксаторов и нитрификаторов,

актиномицетов и микромицетов при различных уровнях загрязнения почв углеводородами нефти. Результаты оценивали путем сопоставления числа колоний в опытных и контрольных вариантах.

Количественный и качественный состав различных эколого-трофических групп в почвах изучали методом посева почвенной суспензии на диагностические среды с использованием общепринятых методов почвенной

микробиологии (табл. 1).

Микробные сообщества почв характеризовали на основе изучения структуры и численности эколого-трофических групп микроорганизмов.

Засеянные чашки помещали в термостат и выдерживали при требуемой температуре. Каждый образец исследовали в трехкратной повторности.

Подсчет выросших колоний проводили через определенное время после посева, которое зависело от скорости роста выделяемых

микроорганизмов на конкретной среде при заданной методикой температуре. Численность микроорганизмов пересчитана на 1 г абсолютно сухой массы почвы и выражена в колониеобразующих единицах (КОЕ/г) [9].

Таблица 1 - Среды, использованные при учете численности отдельных групп микроорганизмов

Показатель Среда культивирования Методика

ОМЧ Питательный агар 6

Спорообразующие Питательный агар + пастеризованная суспензия 7

УОМ Среда Ворошиловой- Диановой агаризованная 8

Актиномицеты Крахмало-аммиачный агар 7

Микромицеты Среда Чапека 7

Нитрификаторы Среда Виноградского 7

Целлюлозоразрушающие Среда Гетчинсона 7

Азотфиксаторы Среда Эшби 7

Результаты и обсуждение

Количественный учёт физиологических групп микроорганизмов показал, что микробный пул контрольных образцов почв имеет относительно высокую общую численность микроорганизмов, которая составляла порядка 104-107 КОЕ/г (табл. 2). В составе сообществ доминировали сапротрофные микроорганизмы и бактерии, использующие минеральные формы азота (актиномицеты). Численность УОМ варьировала в пределах 1200-2700 тыс. КОЕ/г, что свидетельствует о большой доле аборигенных УОМ в составе естественного микробоценоза серых лесных почв.

Численность целлюлозоразрушающих

микроорганизмов была значительно ниже и варьировала от 24-26 тыс. КОЕ/г в ССЛ и СЛ до 59 тыс. КОЕ/г в ТСЛ почве. Количество микроскопических грибов было на три порядка ниже численности бактерий - 38-67 тыс. КОЕ/г. Следует отметить низкое содержание нитрификаторов в серой лесной почве (табл. 2).

Согласно показателям степени обогащенности почв микрофлорой [10], исследуемые чистые почвы можно отнести к очень богатым микроорганизмами, а их функциональные группы в порядке убывания составили ряд: сапротрофы > бактерии, использующие минеральные формы азота > > микроскопические грибы.

Таблица 2 - Численность микроорганизмов в контрольных образцах почв

Показатель Почва

ССЛ СЛ ТСЛ

ОМЧ 2,7*107 2,6*107 1,8*107

Спорообразующие 9,7*105 9,9*105 11,0*105

УОМ 1,5*106 1,2*106 2,7*106

Актиномицеты 22,9*105 16,2*105 26,5*105

Микромицеты 3,8*104 6,7*104 3,6*104

Нитрификаторы 1,5*104 7,4 7,1*104

Целлюлозоразрушающие 2,4*104 2,6*104 5,9*104

Азотфиксаторы 0% 6% 0%

Нефтесодержащие образцы светло-серой лесной почвы характеризовалась повышенным содержанием всех анализируемых групп микроорганизмов (рис. 1). Присутствие поллютанта в почве привело к резкому увеличению численности сапрофитной (в 4,3-8,8 раза), углеводородокисляющей (в 9,3-16,5 раз) микрофлоры, целлюлозоразрушающих

микроорганизмов (10,7-20,3 раза).

Азотфиксаторы не обнаружены как в контрольных, так и в опытных образцах ССЛ почвы.

10,7 г/кг 12,0 г/кг

3,7 г/кг 16,0 г/кг

Рис. 1 - Численность микроорганизмов при различном содержании нефтепродуктов в светло-серой лесной почве

Ответная реакция микробного пула серой лесной почвы на нефтепродукты была менее выражена. Зарегистрировано закономерное 9,214,5 и 3,0-6,0-кратное увеличение численности УОМ, ОМЧ (рис. 2), активное развитие нитрификаторов при концентрации НП в почве до 4,2 г/кг, численность которых была в десятки тысяч раз выше, чем в контроле.

10,9 г/кг 12,1 г/кг 4,2 г/кг  5,8 г/кг

с. 2 - сле ость роорга з ов р различном содержании нефтепродуктов в серой лесной почве

Численность остальных групп

микроорганизмов в опытных образцах незначительно отличалась от контроля (актиномицеты, спорообразующие,

целлюлозоразрушающие микроорганизмы,

азотфиксаторы) или была несколько ниже при максимальной испытанной концентрации поллютанта (микромицеты).

В темно-серой лесной почве наблюдалась прямая зависимость между концентрацией НП в почве и содержанием УОМ (рис. 3). Численность спорообразующих и целлюлозоразрушающих микроорганизмов, сапрофитной микрофлоры в загрязненных почвах была выше, чем в контрольных образцах и практически не зависела от остаточного содержания НП. Содержание актиномицетов, микромицетов, нитрификаторов в нефтезагрязненных почвах незначительно отличалось от их содержания в чистой почве.

11,4 г/кг

11.8 г/кг

14.9 г/кг 16,4 г/кг

Рис. 3 - Численность микроорганизмов при различном содержании нефтепродуктов в темно-серой лесной почве

С целью определения влияния остаточного содержания НП микробные сообщества почв были охарактеризованы на основе изучения структуры и численности эколого-трофических групп

микроорганизмов.

Анализ структурно-динамических и

функциональных откликов микрофлоры на параметры среды в техногенно-нарушенных почвах показал, что для ССЛ почвы при всех остаточных концентрациях поллютанта характерно повышение доли микроорганизмов, потребляющих органические формы азота, о чем свидетельствует значительное преобладание их над микроорганизмами, использующими минеральные формы азота (1,2-2,3*108 и 3,5-4,0х106, соответственно).

Динамика численности микроорганизмов в ССЛ почвах объясняется поступлением легкогидролизуемого органического вещества. Однако различия в остаточном содержании НП сказываются на некоторых особенностях строения микробоценозов. Так, во всех загрязненных образцах ССЛ почвы доля УОМ увеличилась (в 1,2-2,6 раза), целлюлозоразрушающих микроорганизмов (в 1,4-2,4 раза), при этом сократилась доля микромицетов, актиномицетов, спорообразующих форм, хотя численность каждой из этих групп была выше, чем их численность в контроле. Доля аммонификаторов в опытных вариантах осталась на уровне контроля. Следует отметить, что при минимальной концентрации загрязнителя (0,7 г/кг) (рис. 4) зафиксировано иное распределение представителей в микробоценозе - зарегистрировано значительное увеличение доли УОМ (17,0%, против 4,7% в контроле) и снижение доли аммонификаторов (с 85% в контроле до 79% в опыте).

70% 75% 80% 85% 90% 95% 100%

| РОМЧ ЯСпорообразующиеРУОМ  ДктиномицетыИМикромицетыРЦеллюлозоразр И Нитрификаторы

Рис. 4 - Соотношение эколого-трофических групп бактерий в почвах при различном остаточном содержании нефтепродуктов в почве

Развитие микробоценозов в загрязненных образцах серой лесной почвы имело схожие с развитием микробных комплексов ССЛ почвы тенденции. При минимальной концентрации НП (0,9 г/кг), доля УОМ составляла 16% (в контроле 4%). При этом на 7% снизилась доля аммонифицирующих бактерий и в 100 раз увеличилось количество нитрифицирующих бактерий, хотя их доля в микробном пуле почвы составляла менее 0,1%. При более высоких концентрациях поллютанта (2,1-5,8 г/кг), доля аммонификаторов была сравнима с контролем, доля УОМ возрастала до 10-12%. Снижение доли актиномицетов до 20% наблюдалось для концентраций 0,9 и 2,1 г/кг, для 4,2 и 5,8 г/кг - до 30%, по сравнению с контролем.

Полученные данные дают основание для предположения, что в СЛ почве при остаточном содержании НП 2,1-5,8 г/кг интенсивность процессов минерализации органического вещества снижается и наблюдается активизация биохимических процессов, направленных в сторону гумификации почвы.

В загрязненных образцах ТСЛ почвы в диапазоне концентраций НП 1,4-4,9 г/кг доля аммонификаторов увеличивается до 78-85%, при максимальной концентрации НП 6,4 г/кг снижается до 70%, при увеличении доли УОМ до 23% (в контроле - 11%). Следует отметить снижение доли микромицетов до 10% (относительно контроля) при концентрации загрязнителя 6,4 г/кг, актиномицетов - до 20% при содержании НП 1,4 и 4,9 г/кг и целлюлозоразрушающих микроорганизмов, доля которых максимально падает при концентрациях поллютанта 1,8 и 6,4 г/кг до 25 и 30%, соответственно.

Выводы

Согласно [11], «пороговой является та концентрация нормируемого вещества, которая вызывает любые достоверные отрицательные изменения нескольких показателей (более 1)». Для микробиологических показателей

действующей концентрацией химического вещества считается та, которая оказывает выраженное угнетающее действие на 50% и более по отношению к контролю.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что при концентрациях НП в ССЛ до 6,0 г/кг, в СЛ до 5,8 г/кг, в ТСЛ до 6,4 г/кг не наблюдается ингибирующее действие поллютанта на почвенный микробоценоз, что согласуется с ранее полученными данными [12,13,14,15].

Присутствие в среде НП приводит к изменению доли отдельных групп микроорганизмов при сохранении численности минорных компонентов на уровне их содержания в контрольных (чистых) почвах.

Литература

1. Д.Г. Звягинцев, М.М. Умаров, И.Ю. Чернов Микробные сообщества и их функционирование в процессах деградации и самовосстановления почв Деградация и охрана почв. Наука, Москва: 2002. С. 404-454.

2. Н.А.Киреева, Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. БГУ, Уфа. 1995. 172 с.

3. А.А. Вершинин, А.М.Петров, Л.К. Каримуллин, Ю.А. Игнатьев Влияние нефтяного загрязнения на эколого-биологическое состояние различных типов почв //Вестник Казанского технологического университета, 15, 8, 207-211 (2012).

4. А.М. Петров, Л.К. Каримуллин, Т.В. Кузнецова, А.А. Вершинин, Р.Э. Хабибуллин Влияние остаточного содержания нефтепродуктов на состав и активность почвенного микробного сообщества //Вестник Казанского технологического университета, 17, 23, 356-359, (2014).

5. ПНД Ф 16.1.2.2.22-98. Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в минеральных, органогенных, органо-минеральных почвах и донных отложениях методом ИК-спектрометрии. М.: 1998. -11 с.

6. Методы микробиологического контроля почвы. Методические рекомендации. Москва, 2004.

7. Н.С. Егоров, Практикум по микробиологии. Изд-во МГУ, Москва, 1976. 307 с.

8. Руководство по методам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений. Под ред. Абакумова В.А. Гидрометеоиздат, Ленинград, 1983. 240 с.

9. И. Сэги, Методы почвенной микробиологии. Колос, Москва, 1983. 295 с.

10. Д.Г. Звягинцев, Почва и микроорганизмы. Изд. МГУ, Москва, 1987. 256 с.

11. Методические рекомендации по гигиеническому обоснованию ПДК химических веществ в почве

12. Т.В. Кузнецова, А.М. Петров Состав и динамика численности почвенного микробиоценоза при воздействии нефтепродуктов ПЖурнал экологии и промышленной безопасности, 3, 47, 41-43(2010).

13. Т.В. Кузнецова, А.М. Петров, О.Ю. Тарасов Влияние длительного воздействия нефтяного загрязнения на микробные сообщества дерново-подзолистых почв разного гранулометрического состава //Сборник научных трудов Института проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, Отечество, Казань, 2014. С. 250-259.

14. Т.В. Кузнецова, А.М. Петров, О.Ю. Тарасов Ответная реакция почвенного микробного сообщества на нефтяное загрязнение // Журнал экологии и промышленной безопасности, 1-2, 42-43(2014).

15. А.М. Петров, Э.Р. Зайнулгабидинов, Р.Р. Шагидуллин, Д.В.Иванов, Т.В. Кузнецова, Л.К. Каримуллин Разработка нормативов допустимого остаточного содержания нефти и продуктов ее трансформации в почвах для земель лесного фонда Республики Татарстан //Вестник Казанского технологического университета, 16, 20, 265-270(2013).

© Т. В. Кузнецова - н.с. лаборатории экологических биотехнологий Института проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, kuznetsovatatyan@mail.ru; А. М. Петров - к.б.н., заведующий лабораторией экологических биотехнологий Института проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, zpam2@rambler.ru; И. В. Князев - н.с. лаборатории экологических биотехнологий Института проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, kneze3@yandex.ru; Р. Э. Хабибуллин - к.т.н., доцент кафедры ТММП КНИТУ, с.н.с. лаборатории экологических биотехнологий Института проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, hrustik@yandex.ru.

© T. V. Kuznetsova - Researcher of the Laboratory of Ecological Biotechnologies Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences, kuznetsovatatyan@mail.ru; A. M. Petrov - Cand. Sci. (Biol), Head of the Laboratory of Ecological Biotechnologies Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences, zpam2@rambler.ru; I. V. Knyazev - Researcher of the Laboratory of Ecological Biotechnologies Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences, kneze3@yandex.ru; R. E. Khabibullin - Cand. Sci. (Tech.), Associate professor, Department of Meat and Milk Products Technology, KNRTU; senior researcher of the Laboratory of Ecological Biotechnologies Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy of Sciences, hrustik@yandex.ru.