Полиморфизм участка ДНК, фланкирующего гены биосинтеза О-антигена, у штаммов Vibrio cholerae не О1 / не О139

гами 4il 61 и 5277, то штамм Р-16063 был чувствителен только к фагу 5277, а штамм Р-16065 был резистентным ко всем фагам, что говорит об их отличительных особенностях, хотя они изолированы в одном месте в один и тот же период времени (Азов, 1993 г.). В этом же аспекте интерес представляют штаммы MDO 12, МО 28 и РО 2, которые изолированы на территории Индии в 1992 г. Штамм MDO 12 оказался чувствителен ко всем изученным фагам, штамм МО 28 только к трем, а штамм РО 2 - к одному. А из 10 авирулентных штаммов, чувствительных к фагам, не обнаружено.

Установлено, что 22 атоксигенных холерных вибриона эльтор, различающихся по генетическим маркерам, имели различную чувствительность к диагностическим холерным фагам: эльтор, ctx+, ctx", ФБ, и лишь штамм 7930 был резистентным ко всем вышеперечисленным фагам. Изолированные от людей на, пяти различных территориях с 1969 по 2000 год атоксигенные холерные штаммы имели, разнообразные фаготипы.

Результаты наших опытов показывают, что штаммы V. cholerae eltor относятся к пятому, шестому и седьмому вариантам схемы оценки эпидемической значимости холерных вибрионов по чувствительности к бактериофагам ctx+ и ctx". Для оценки эпидемической значимости этих штаммов проводились дополнительные исследования на наличие генов ctxAB, tcpA и токсигенности на крольчатах-сосунках, которые показали, что у двух штаммов отсутствует ген ctx АВ, а у остальных гены ctx АВ и tcpA, и все культуры атоксигенны.

В исследования были взяты штаммы V. cholerae 0139 серогруппы, которые, как установлено ранее [4], устойчивы к диагностическим холерным фагам. Изолированные нами фаги I морфогруппы из штаммов холерных вибрионов эльтор обладали узким спектром литической активности в отношении этой группы вибрионов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Адамс М. Бактериофаги / Пер. с англ. - М., 1961. -522 с. - 2. Караваева- Т.Б. Дифференциация эпидемических и

неэпидемических вибрионов эльтор по типу иммунитета их умеренных фагов: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 1993. - 23ic.-3. Кудрякова Т. Д., Саямов С.Р.//Микробиол. журн. - 1993. - Т. 55, № 1. - С. 53-57. - 4. Кудрякова Т.А., Мишанькин Б.Н., Македонова Л.Д. и др. // Матер. юбил. науч. конф., поев. 50-летию Центра военно-технич. пробл. биол. защиты НИИ Микробиол. МО РФ. - Екатеринбург, 1999. - 5. Ломов Ю.М. // Холера: Матер. VIII Рос. на-уч.-практ. і конф. по пробл. «Холера». - Ростов н/Д, 2003. -С. 13-23. т 6. Методические рекомендации по фаготипиро-ванию холерных вибрионов / Сост.: Дрожевкина М.С.. Арутюнов Ю.И. jr М., 1983. - 10 с. - 7. Монахова Е.В., Михась

Н.К., Писанов Р.В. // Пробл. особо опасн инф. - 2004.-Вып. 87. -!С. 51-54. - 8. Остроумова Н.М., Мороз В.П., Караваева Т.Б. // ЖМЭИ. - 1993. - № 4. - С. 116-120. -

9. Савелиев В.Н. // Холера: Матер. VIII Рос. науч.-практ. конф. по пробл. «Холера». - Ростов н/Д, 2003. - С. 244-245. -

10. Смирнова Н.И. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. -1999. -№'4. - С. 3-11.-11. Смирнова Н.И., Костромити-на Е.А., Челдышева Н.Б. и др.//Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 2002.-№ 4. - С. 12-18. - 12.Смоликова Л.М., Монахова Е.В., Кудрякова Т.А. и др. // Холера и патогенные для человека вибрионы. - Ростов н/Д, 2004. - Вып. 17. -С. 65-67. - 13. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. - М., 1968. - 170 с. - 14. Karaolis D.K.R., Johnson J., Bailey С.С. et al. II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -

1998. - Vol. 95. - P. 3134-3139. - 15. Li М., Kotetish vili М., Chen Y.,-' Sozhamannan S. // Appl. Environ. Microbiol. -

2003.-Vol. 69, N3.-P. 1728-1738. - 16. Pal A., Saha P.K., Nair G.B. et.al. II Indian J. Med. Res.- 1999. - Vol. 109. -P. 208-211.' - 17. Pichil М., Rivas М., Chinen I. el сії. II J. Clin. Microbiol. -2003. - Vol. 41, N 1. -P, 124-134.

N.E.Gajevskaya

Characterization of Temperate Bacteriophages Derived. from1Non-Toxinogenic Vibrio cholerae El Tor Strains Isolated from Patients

.. Rqstov-On-Don Anti-Plague Research Institute

[j

Non-toxinogenic cholera El Tor vibrios isolated from human patients may be used! to make selections for 1 and V morphologic groups' phages. Temperate bacteriophages morphogroup I produced by non-toxinogenic cholera vibrios were found to manifest a narrow scope of lytic activity for V. cholerae serogroup 0139.

Поступила 26.01.05..

УДК 616.932:575

Г.А.ЕРОШЕНКО, Е.Ю.ЩЕЛКАНОВА

ПОЛИМОРФИЗМ УЧАСТКА ДНК, ФЛАНКИРУЮЩЕГО ГЕНЫ БИОСИНТЕЗА О-АНТИГЕНА, У ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE НЕ 017 НЕ 0139

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

В геноме штаммов V. с!го1егае не 01 / не 0139 (02, 037, 041, 042, 043 и 056 серогрупп), выделенных от больных людей в Российской Федерации и других странах СНГ, присутствуют гены г]%, £ткО и ог$2, которые фланкируют кластер генов биосинтеза О-антигена. Выявлен полиморфизм участка ДНК, содержащего gmhD и ог/2, что свидетельствует о вариабельности структуры этого генетического локуса у холерных вибрионов разных серогрупп.

Вид Vibrio cholerae представляет собой генетически неоднородную группу вибрионов, которая делится на 206 серогрупп в зависимости от антиген-

ных свойств поверхностных полисахаридов. Большие эпидемии холеры связаны, в основном, с вибрионами 01 серогруппы, которые также генетиче-

ски неоднородны и состоят из двух биоваров -классического и эльтор. В настоящее время принято считать, что все пандемии холеры, начавшиеся в 1817 г. и продолжающиеся по сей день, были вызваны вирулентными вибрионами именно 01 серо-группы, хотя убедительные доказательства этого на данный момент отсутствуют. Вторым этиологическим агентом холеры признаны вирулентные штаммы 0139 серогруппы, вызвавшие большие эпидемии холеры в 1992-1993 гг. в Юго-Восточной Азии, а также послужившие причиной многих локальных вспышек на других континентах. Холерные вибрионы не 01 / не 0139 серогруппы в отличие от вирулентных штаммов V. сИ.о1егае 01 и 0139 не могут вызвать значительных эпидемий холеры, а являются причиной лишь небольших вспышек или отдельных случаев диарейных заболеваний [3].

Гены биосинтеза О-антигена, обозначаемые как ууЬ* кластер, у всех серогрупп V. ско1егае локализованы в одном участке хромосомы, имеют одинаковую кассетную организацию и окружены, по данным и.Н^гоеЬег ег а/. [6] и З.ЗогЬатаппап ег а1. [5], генами rjg с правой стороны и генами gmhD и ог}2 с левой стороны. Считается, что холерные вибрионы могут обмениваться генами биосинтеза О-антигена за счет гомологичной рекомбинации по генам rjg и gmhD, ог/2, которая приводит к замене генов одной серогруппы на другую [5, 6]. В результате замещения генов биосинтеза 01 антигена у патогенных штаммов V. ско1егае 01 из них могут образовываться новые высокоэпидемические штаммы не 01 серогруппы, подобные возбудителю холеры V. ско-1егае 0139. Такие измененные штаммы могут в дальнейшем представить значительную проблему для здравоохранения, поскольку их своевременная идентификация, профилактика и лечение будут затруднены из-за отсутствия соответствующих диагностических и профилактических средств.

- Однако следует отметить, что окончательная точка зрения на конкретные генетические механизмы, лежащие в основе появления новых патогенных штаммов не 01 серогруппы, до сих пор не сформировалась. Кроме того, имеются лишь отдельные сообщения об организации генов биосинтеза О антигена у штаммов V. сИо1егае 01 и не 01 серогрупп, выделенных на территории России и других стран СНГ [4]. Отсутствуют публикации по изучению у этих штаммов участков хромосомной ДНК, фланкирующих кластер генов и>Ь* По этой причине остается неясным, может ли происходить обмен генами биосинтеза О-антигена у- холерных вибрионов, обитающих в водоемах на территории Российской Федерации, и какими могут быть эпидемические последствия такого обмена. В связи с этим нами было проведено изучение участков ДНК, фланкирующих гены биосинтеза О-антигена у штаммов не 01/ не 0139 серогруппы, полученных от больных людей в России других странах СНГ.

Материалы и методы

В работе использованы штаммы V. ско1егае не 01/ не 0139 серогруппы, полученные на территории Российской Федерации, Узбекистана и Турк-

Штаммы V. с1го1егае, использованные в работе Штамм | Серотип | Год выделения | Источник получения

19306 02 1971 Астрахань

1322-69 037 1969 Коллекция Саказаки

175 041 1971 Астрахань

Р-4107 041 1976 Ростов-на-Дону

897 041 1976 Астрахань

14520 041 1976 Астрахань

75350 042 1976 Астрахань

450 043 1976 Узбекистан

95 056 1971 Небит-Даг, Туркмения

Р16064 0139 1993 Ростовская обл.

17793 0139 1998 Московская обл.

мении (таблица) от больных людей, а также штаммы Р16064 и 17793 серогруппы 0139, выделенные соответственно от больного человека и из внешней среды. Все штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб».

Выделение хромосомной и плазмидной ДНК, рестрикционный анализ и блот-гибридизацию по Саузерну выполняли по общепринятым методам [2]. Мечение ДНК дигоксигенином и ее детекцию осуществляли в соответствии с рекомендациями фирмы производителя (Roche Biochemicals, Германия). Полимеразную цепную реакцию выполняли, как это было указано ранее [1].

Результаты и обсуждение

На первом этапе нашей работы с помощью метода ПЦР была изучена структура генетического ло-куса rjg, фланкирующего кластер генов биосинтеза О-антигена wb* с правой стороны. Для этого нами использованы праймеры, предложенные S.Sozha-mannan et al. [5]. Амплификацию ДНК в ПЦР проводили по следующей программе: 1-й цикл-95 °С, 5 мин; 2-35-й циклы - 95 °С, 30 с; 61 °С, 40 с; 72 °С, 30 с. В результате проведенных исследований у всех изученных штаммов не 01 серогруппы с праймерами на ген rjg получены специфические амплификаты (рис. 1).

Для подтверждения результатов, полученных в ПЦР, а также в связи с тем, что, по данным S.Sozha-mannan et al. [5], у некоторых штаммов V. cholerae в

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Рис. 1. Результаты анализа в ПЦР с праймерами на ген ДНК штаммов V. с1ю1егае:

У — Р16064; 2 — 175; 3 — 1322-69; 4 - отрицательный контроль (Н^О); 5 - Р-4107; 6 - 75350; 7-450; 8- 19306; 9-95; 10- 14520; 11- 897

1 к 3 4 5 6 7 8 т.п.н.

! —23,67

ііпМпГііііг шшт» ЩШШ їшшШі ‘шт^>

^— 9,46 • *— 6,66

-— 4,26

*— 2,30

— 2,30

Рис. 2. Блот-гибридизация по Саузерну хромосомной ДНК штаммов V. сігоіегае:

1 - Р16064; 2 - 175; 3 - 1322-69; 4 - 14520; 5 - 897; 6-450;

7 - Р-4107; 8 - 19306; обработанных ЕсоЯІ, с гу&зондбм.

Справа указаны размеры НіпсІШ рестриктов фага X

гене rjg могут содержаться инсерции и делеции, нами изучена организация этого генетического локуса в реакции блот-гибридизации по Саузерну. Хромосомная ДНК штаммов фрагментировалась с помощью эндонуклеазы рестрикции ЕсоЫ, переносилась на нейлоновую мембрану и гибридизовалась с ДНК зондом, в качестве которого был использован ам-плификат, синтезированный на хромосомной ДНК штамма Р16064 и помеченный дигоксигенином. В результате установлено, что все штаммы содержали ген г]2,  который располагался на ЕсоЫ фрагменте ДНК одинакового размера (рис. 2). Полученные результат^ свидетельствуют о том, что участок хромосомы, фланкирующий область биосинтеза О-антиге-на у изученных нами штаммов не 01 / не 0139 серо-группы справа, имеет сходную генетическую организацию и, по-видимому, достаточно стабилен.

Аналогичным образом изучен генетический локус V. сігоіегае не 01 / не 0139, фланкирующий область биосинтеза О-антигена с левой стороны и содержащий гены и о г/2. Амплификацию

ДНК в ПЦР с праймерами на гены %тіхО [5] проводили по следующей программе: 1 -й цикл - 95 °С, 5 мин; 2-35-й циклы - 95 °С, 30 с; 61 °С, 40 с; 72 °С, 30 с. У большинства изученных штаммов не 01 / не 0139 серогруппы наблюдалось образование специфического амплификата размером 930 п.н. (рис. 3). В то же|время у V. скоіегае 175 и 75350 выявлялись две полосы амплификата, которые по размеру отличались от продуктов амплификации других штаммов, а также между собой. По-видимому, у этих штаммов имеются отличия в нуклеотидной последовательности гена #т/г.О.

Аналогичным образом был изучен генетический локус ог/2, который расположен на этом же участке хромосомы вслед за геном #т/г/) и вместе с ним фланкирует жЬ* кластер генов биосинтеза О-антигена слева. Использование праймеров на ген ог/2 [5] в следующих условиях проведения ПЦР: 1-й цикл - 195 °С, 5 мин; 2-35-й циклы - 95 °С, 30 с; 61 °С, 40 с; 72 °С, 30 с выявило образование специфических амплификатов размером 1350 п.н. (рис. 4), которые свидетельствует о наличии гена ог/2 у всех

;1 23456789 10 11

Рис. 3. Результаты анализа в ПЦР с праймерами на ген gmhD ДНК штаммов V. сИоІегае.

1 - Р16064; 2 - 175; 3 - 1322-69; 4 - Р-4107; 5 - 75350;

6-450; 7- 19306; <8-95; 9- 14520; 10-897;

I 11- отрицательный контроль

изученных нами штаммов.

Генетическая структура участка, содержащего ген ог/2, |у штаммов не 01 /не 0139 серогруппы изучена нами в реакции блот-гибридизации по Саузерну. Хр&мосомную ДНК штаммов расщепляли с помощью;! эндонуклеазы рестрикции НіпсШІ, фрагментировали в агарозном геле и переносили на нейлоновый фильтр для гибридизации [2]. В качестве зонда на ген ог^2 использовали амплификат, синтезированный на матрице штамма V. сИоІегае Р16064 и меченный дигоксигенином. В результате проведенных экспериментов выявлена значительная вариабельность участка хромосомной ДНК, содержащего ген ог/2, у штаммов холерных вибрионов различных серогрупп (рис; 5).

У двух штаммов 041 серогруппы 897 и 14520, выделенных в 1976 г. в Астрахани, и у штамма этой же серогруппы Р-4107, полученного в 1976 г. в Рос-тове-на-Дону, с ог/2 зондом гибридизовалось по одному НіпсіїІІ фрагменту ДНК одинакового размера, что свидетельствует о сходной организации ог/2 участка хромосомной ДНК у штаммов этой серо-

2 3 4 5 6 7 8 9 1011

Рис; 4. Результаты анализа в ПЦР с праймерами на ген ог/2 ДНК штаммов V. сИо1егае:

1 - отрицательный контроль (Н20); 2 - Р16064; 3 - 897; 4-175;

5 - 1322-69; 6 - Р-4107; 7 - 75350; 8 - 450; 9 - 19306; 10 - 95; 11 - 14520

т.п.н.

23,67

9,46  6,66

4,26

2,30

1,96

Рис. 5. Блот-гибридизация по Саузерну хромосомной ДНК штаммов V. с!го1егае\

I - 1322-69; 2 - 14520;3- 17793; 4 - 897; 5-450; 6-Р-4107; обработанных НшШН, с огП2 зондом.

Справа указаны размеры НтсШ! ресгриктов фага X

группы. В то же время у штаммов 037, 0139 и 043 серогруппы, размеры фрагментов ДНК, содержат щих ген ог/2, значительно отличались друг от друга, а также от штаммов 041 серогруппы. Так у V. с/гокгае 1322-89 (037 серогруппы) и 450 (043 серогруппы) ген о г/2 располагался на фрагменте ДНК большего размера, чем у штаммов 041 серогруппы, а у штамма 17793 (0139 серогруппы) с о г/2 зондом гибридизовалось два различных по размеру Нтс11П фрагмента хромосомной ДНК (рис. 5). Эти данные указывают на существование вариабельности уча-, стка хромосомной ДНК, содержащей ген о г]2, у штаммов холерных вибрионов, представляющих различные серогруппы.

Таким образом, в результате проведенных нами исследований установлено, что у штаммов различных серогрупп, выделенных на территории России и других стран СНГ от больных людей, присутствуют гены /у'#, £тЬО и о г/2, которые, по литературным данным, граничат с генами биосинтеза О-антигена на хромосоме V. сИокгае. Установлено отсутствие у изученных нами штаммов вариабельности участка хромосомной ДНК, содержащего ген и примыкающего к генам биосинтеза О-антигена с правой стороны. В то же время ген о г/2, фланкирующий вместе с геном ^т/гЛ) кластер генов мЬ* слева, располагается у изученных штаммов не 01 / не 0139 серогруппы на рестрикционных фрагментах хромосомной ДНК различного размера, что свидетельствует о полиморфизме этого участка

ДНК у штаммов V. cholerae различных серогрупп. Возможно, что полиморфизм анализируемого участка хромосомы связан с присутствием в этом регионе кластера генов wb * инсерционной последовательности IS 1385, которая может индуцировать генетические перестройки в близлежащих генетических локусах [5]. С другой стороны, вариабельность gmhD, orf2 локуса может быть вызвана изменением этого участка ДНК в результате замены генов биосинтеза О-антигена одной серогруппы на другую на основе механизма гомологической рекомбинации. С учетом полученных нами результатов, а также в связи с тем, что ежегодно из водоемов в РФ выделяется большое количество штаммов холерных вибрионов различных, в том числе и не идентифицированных серогрупп, можно высказать предположение о том, что в климатических условиях РФ и других стран СНГ за счет различных генетических механизмов могут происходить изменения в области хромосомы, содержащей гены биосинтеза О-антигена. Следствием этого может быть появление штаммов V. cholerae новых серогрупп с измененными свойствами.

Работа выполнена на средства гранта Российского фонда фундаментальных исследований № 05-04-48727.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ерошенко Г.А., Осин А.В., Щелканова Е.Ю.,' Смирнова Н.И. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. -

2004. - № 2. - С. 11-16. - 2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэм-брук Дж. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. -480с. - 3.Bik Е.М., Bunschoten А.Е., Gouwn R.D. // The EMBO Journal. - 1995. - Vol. 14, N 2. - P. 209-216. -4.Smirnova N.I., Zhuravlyova E.A., Livanova L.F. el al. II Microb. Pathog. - 1995. - Vol. 19. - P. 65-72. - 5. Sozha-mannan S., Deng Y. K., Li M. et al. // Infect. Immun. -

1999.-Vol. 67, N10.-P. 5033-5040.-6. Stroeher U.H., Je-dani K.E., Manning P.A.// Gene. - 1998. - Vol. 223, N 1-2. -P. 269-282.

G.A.Yeroshenko, E.Yu.Shchelkanova

Polymorphism of the DNA Site Flanking O-Antigen Biosynthesis in Vibrio cholerae Non-01 and Non-0139 Strains

Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov

Genes rig, gmhD and or/2, flanking the O antigen biosynthesis genetic cluster, were found in the genome of V. cholerae strains non-01 /non-0139 (02, 037, 041, 042, 043 and 056 serogroups) isolated from patients in the Russian Federation and other CIS countries. Polymorphism of the DNA site containing gmhD and orfl was indicative of a variable structure of this genetic locus in cholera vibrios belonging to different serologic groups.

Поступила 07.07.05.