СПОСОБ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ НА СТЕПЕНЬ ВЕЗИКУЛЯЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ
METHOD OF ASSESSING DRUG EFFECT ON DEGREE OF ERYTHROCYTE VESICULATION

Изобретение относится к области медицины и фармации и может использоваться для оценки влияния лекарственных веществ на степень везикуляции эритроцитов.
В качестве прототипа выбран способ оценки влияния аскорбиновой кислоты на образование везикул эритроцитов, который включает хранение эритроцитов при 4°C в присутствии аскорбиновой кислоты, выделение везикул и определение везикуляции эритроцитов с помощью проточной цитофлуориметрии (Stowell S.R. et al. Transfusion - 2013. - V. 53. - P. 2248-2257).
Однако этот способ требует дорогостоящего специального оборудования (проточный цитофлуориметр).
Задача предлагаемого изобретения - совершенствование способа.
Технический результат - упрощение процесса определения влияния лекарственных веществ на степень везикуляции эритроцитов.
Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем забор крови и хранение промытых эритроцитов при 4°C в течение 7 дней в присутствии лекарственных веществ, в супернатанте проводят осаждение везикул и определение в них ацетилхолинэстеразной активности. По активности ацетилхолинэстеразной активности везикул судят о степени везикуляции эритроцитов.
Способ осуществляется следующим образом.
Кровь от здоровых добровольцев забирают в вакуумные пробирки, содержащие цитрат натрия. Эритроциты трижды промывают физиологическим раствором. К 10 мл забуференного физиологического раствора (10 мМ трис-HCI, 150 мМ NaCI, pH 7.4) добавляют 50 мкл промытых эритроцитов и лекарственные вещества. Эритроциты с лекарственными веществами и без них хранят при 4°C в течение 7 дней. Затем для получения супернатанта, содержащего везикулы, суспензию эритроцитов перемешивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. К 9 мл супернатанта добавляют 1 мл хлористого гадолиния до конечной концентрации 400-600 мкМ, перемешивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин для получения осадка везикул. В осадке определяют активность маркерного фермента везикул ацетилхолинэстеразы (Greenwalt T.J. Tranfusion. - 2005. - V. 46. - P. 143-152). Степень везикуляции эритроцитов определяют путем измерения активности ацетилхолинэстеразы. Степень везикуляции эритроцитов при хранении в присутствии лекарственных веществ рассчитывают в процентах. За 100 процентов принимается степень везикуляции эритроцитов при хранении в отсутствие лекарственных веществ.
Известно, что глюкоза (Lang F et al. Cell Physiol. Biochem. - 2008. - V. 22. - P. 373-380) и аденозин (Niemoeller O.M. et al. Pflugers Arch - Eur. J. Physiol. 2007. - V. 454. 427-439) подавляют апоптоз эритроцитов.
Пример 1. Промытые эритроциты хранили в забуференном физиологическом растворе при 4°C в течение 7 дней, как в присутствии глюкозы (5 мМ), так и без нее. Суспензию эритроцитов перемешивали и центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. Затем к супернатанту добавляли хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ и центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. В полученном осадке везикул определяли активность ацетилхолинэстеразы. Глюкоза снижает степень везикуляции эритроцитов на 54.90±3.70%.
Пример 2. Промытые эритроциты хранили в забуференном физиологическом растворе при 4°C в течение 7 дней, как в присутствии аденозина (1 мМ), так и без него. Суспензию эритроцитов перемешивали и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. Затем к супернатанту добавляли хлористый гадолиний до конечной концентрации 400-600 мкМ и центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. В полученном осадке везикул определяли активность ацетилхолинэстеразы. Аденозин снижает степень везикуляции эритроцитов на 57.90±2,0%.
Преимуществом предлагаемого способа является простота, доступность, отсутствие необходимости в сложном дорогостоящем оборудовании.