Способ прогнозирования репродуктивных потерь в сроке до 22 недель беременности у женщин с угрожающим выкидышем и привычным невынашиванием в анамнезе
METHOD FOR PREDICTING REPRODUCTIVE LOSSES BEFORE 22 WEEKS OF PREGNANCY IN WOMENT WITH THREATENED MISCARRIAGE AND RECURRENT MISCARRIAGE IN HISTORY

Изобретение относится к медицине, а именно, к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования репродуктивных потерь, представляющих собой неразвивающуюся беременность и самопроизвольный выкидыш, в сроке до 22 недель гестации у женщин с угрожающим выкидышем в сроке 5-12 недель и привычным невынашиванием в анамнезе.
Актуальность предлагаемого способа определяется тем, что у женщин с привычным невынашиванием беременности каждая прервавшаяся беременность наносит женщине не только психологическую травму, но и отрицательно сказывается на состоянии репродуктивной системы в целом за счет последствий самого прерывания беременности, а также выполнения инвазивных процедур. Таким образом, с каждой неудачной попыткой беременности усугубляются патологические процессы, приводящие к невынашиванию, что все больше затрудняет решение этой проблемы [Привычное невынашивание беременности: социальная проблема, медицинские решения / С.И. Михалевич, А.Н. Гришкевич, Т.В. Марковская, Л.Г. Гракович // Медицинские новости. - 2012. -№ 2. -С. 12-18].
Репродуктивные потери включают в себя наряду с плодовыми и материнские потери при беременности и до 42 дней после ее завершения [Бушмелева Н.Н. Репродуктивные потери и пути их снижения в регионе (на примере Удмуртской Республики) // Социальные аспекты здоровья населения. -2014. - № 4. - С. 1-17]. При желанной маточной беременности плодовые потери в сроке до 22 недель включают в себя самопроизвольный выкидыш и неразвивающуюся беременность [Стародубов В.И., Суханова Л.П., Сыченков Ю.Г. Репродуктивные потери как медико-социальная проблема демографического развития России // Электронный научный журнал «Социальные аспекты здоровья населения». - 2011. - № 6(22)]. По данным различных авторов, в структуре невынашивания частота привычного невынашивания составляет от 5 до 20% [Невынашивание беременности: общий взгляд на проблему / Г.С. Богданова, З.С. Зайдиева, Д.М. Магометханова и др. // Медицинский совет. - 2012. - № 3. - С. 67-71]. Установлено, что риск потери желанной беременности после двух предшествующих самопроизвольных прерываний беременности возрастает более чем в 2 раза и составляет 36-38 %, а вероятность 3-го самопроизвольного выкидыша достигает 40-45 %. [Тетруашвили Н. К. Привычный выкидыш // Акушерство и гинекология: новости, мнения, обучения. - 2017. - № 4(18). - С. 70-87]. Женщины, страдающие от повторных репродуктивных потерь, представляют собой группу риска по развитию различных осложнений беременности, таких как плацентарная недостаточность, синдром задержки роста плода и хроническая гипоксия плода [Стрижаков А.Н., Игнатко И.В. Профилактика осложнений беременности у женщин с привычным невынашиванием // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2006. - Т. 5, № 1. - С. 33-41].
Таким образом, прогнозирование репродуктивных потерь, представляющих собой неразвивающуюся беременность и самопроизвольный выкидыш, у женщин с угрожающим выкидышем и привычным невынашиванием в анамнезе позволит применить персонифицированный подход к ведению беременной, своевременно провести лечено-профилактические мероприятия и снизить риск самопроизвольного выкидыша и неразвивающейся беременности.
Известен способ прогнозирования высокого риска репродуктивных потерь в первом триместре беременности, при котором из периферической венозной крови женщин выделяют ДНК с последующей амплификацией полиморфных вариантов A66G гена MTRR, -31С-Т (rs 1143627) IL-1[3, - 174G-C (rsl800795) IL-6 и C677T (rsl801133) MTHFR. При выявлении одного из четырех генотипов: -31СТ IL-1(3 / -174GG IL-6 / 677СТ MTHFR / 66GG MTRR; -31 СТ IL-1(3 / -174СС IL-6 / 677CC MTHFR / 66AG MTRR; - 31CC IL-ip / -174CC IL-6 / 677CC MTHFR/ 66AG MTRR; -31CC IL-1(3 / - 174GC IL-6 / 677CT MTHFR/ 66AG MTRR прогнозируют высокий риск репродуктивных потерь в первом триместре беременности. [Патент № 2611358 Российская Федерация. Способ прогнозирования высокого риска репродуктивных потерь в первом триместре беременности / Шкурат Т.П., Машкина Е.В., Коваленко К.А., Волосовцова Г.И. // Изобретения. Полезные модели. -2017. - № 6].
Данный способ не позволяет прогнозировать репродуктивные потери с 13 по 22 недели беременности, является трудоемким, трудновоспроизводимым, требует большого количества времени для проведения эксперимента и больших материальных затрат. Кроме того, авторы не указывают точность, чувствительность и специфичность способа.
Известен способ прогнозирования прерывания беременности в первом триместре, при котором в сыворотке крови в ранние сроки гестации (до 13 недель) определяют содержание (3-субъединицы хорионического гонадотропина ((3-ХГЧ) и растворимого рецептора васкуло- дискриминантного анализа рассчитывают прогностический индекс (PI) по формуле: Р1=0,02949X1+1,26055X2-0,91007, где XI - концентрация (3-ХГЧ, нг/мл; Х2 - концентрация sVEGFR-1, пг/мл; 0,91007 - constanta [Патент № 2522244 Российская Федерация. Способ прогнозирования прерывания беременности в первом триместре / Газиева И.А., Чистякова Н.Н., Ремизова И.И., Тарасова М.Н. // Изобретения. Полезные модели. - 2014. - № 19]. При PK0 прогнозируют прерывание настоящей беременности в первом триместре, а при Р1>0 делают заключение о низком риске потери плода в ранние сроки. Недостатками данного способа является то, что метод ограничен прогнозом риска репродуктивных потерь только в I триместре, а также имеет более низкую специфичность по сравнению с заявляемым способом.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ прогнозирования исхода беременности у женщин с угрожающим выкидышем, при котором определяют продукцию фактора, угнетающего миграцию лейкоцитов, до и после проведения сохраняющей терапии, и при его снижении на 25% и более по сравнению с исходным уровнем прогнозируют досрочное прерывание беременности [Патент № 2033607 Российская Федерация. Способ прогнозирования исхода беременности у женщин с угрожающим выкидышем / Барсегян О.К., Сотникова Н.Ю., Кудряшова А.В. // Изобретения. Полезные модели. - 1995. - № 11. - С. 200- 201].
Данный способ был выбран в качестве прототипа, однако он имеет ряд недостатков:
1. Не указаны сроки беременности, в которых возможно применение данного способа.
2. Необходимость обследования пациентки дважды - до и после проведения сохраняющей терапии.
3. Определение прогноза исхода беременности отсрочено и осуществляется только после проведения сохраняющей терапии;
4. В способе не указаны точность, чувствительность и специфичность.
Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.
Техническим решением заявляемого способа является упрощение способа, расширение арсенала прогностических средств, повышение точности, чувствительности и специфичности прогнозирования репродуктивных потерь, представляющих собой неразвивающуюся беременность и самопроизвольный выкидыш, в сроке до 22 недель беременности у женщин с угрожающим выкидышем в сроке 5-12 недель и привычным невынашиванием в анамнезе.
Заявляемый технический результат достигается тем, что в периферической венозной крови беременных с угрожающим выкидышем в сроке 5-12 недель гестации и привычным невынашиванием в анамнезе до назначения сохраняющей терапии определяют относительное содержание IL-10+ клеток среди CD20+ В- лимфоцитов, и при его значении равном 4,5% или менее прогнозируют репродуктивные потери, представляющие собой неразвивающуюся беременность и самопроизвольный выкидыш, в сроке гестации до 22 недель с точностью 87,9%.
Способ осуществляется следующим образом.
1. К 3 мл гепаринизированной крови из кубитальной вены добавляют 3 мл Среды 199 и выделяют обогащенную популяцию мононуклеарных клеток стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографин (d-1,078) при скорости центрифугирования 1500 оборотов/мин в течение 40 мин.
2. Суспензию мононуклеарных клеток отбирают в интерфазе Среда 199-фиколл-урографин, дважды отмывают центрифугированием в 10 мл физиологического раствора.
3. К 0,05 мл полученной суспензии клеток в концентрации 1><106 кл/мл добавляют 20 мкл моноклональных антител анти-СО20, конъюгированных с конъюгированных с FITC.
4. Клетки инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте, отмывают физиологическим раствором.
5. Клетки фиксируют в течение 15 минут в 100 мкл фиксирующего буфера А из набора FIXandPERM cell permeabilization reagents (Beckman Coulter, Франция) в темноте, отмывают физиологическим раствором.
6.  Клетки инкубируют в течение 15 минут в 100 мкл пермеабилизирующего буфера В совместно с анти-10-мАТ для внутриклеточного окрашивания, отмывают физиологическим раствором.
7. Фиксируют клетки в 0,5 мл фиксирующего раствора CellFix (BD Biosciences, Belgium).
8. Анализ результата проводят на проточном цитофлуориметре,
определяя относительное содержание IL-10+ клеток среди CD20+ В- лимфоцитов. Результат оценивают в процентах (%). При значении относительного содержания IL-10+ клеток среди CD20+ В-лимфоцитов, равном 4,5% и менее, прогнозируют репродуктивные потери,
представляющие собой неразвивающуюся беременность и самопроизвольный выкидыш, в сроке гестации до 22 недель у беременных с угрожающим выкидышем в сроке 5-12 недель и привычным невынашиванием в анамнезе.
Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать репродуктивные потери, представляющие собой неразвивающуюся беременность и самопроизвольный выкидыш, у женщин с угрожающим выкидышем в сроке 5-12 недель и привычным невынашиванием в анамнезе по определению содержания IL-10+ клеток среди CD20+ В-лимфоцитов в венозной крови.
Во время беременности материнская иммунная система должна обеспечивать вынашивание полуаллогенного плода [Human chorionic gonadotropin and IL-35 contribute to the maintenance of peripheral immune tolerance during pregnancy through mediating the generation of IL-10+ or IL- 35+ Breg cells / J. Liu, X. Chen, S. Hao et al. // Exp. Cell. Res. - 2019. - Vol. 15, № 383(2). - P. 111513]. IL-10-продуцирующие В-лимфоциты относят к популяции регуляторных В-клеток (Breg), обладающих супрессорными функциями, что является одним из периферических механизмов толерантности, в том числе и к антигенам плода [В Regulatory Cells: Players in Pregnancy and Early Life / A. Esteve-Sole, Y. Luo, A. Vlagea et al. // Int. J. Mol. Sci. - 2018. - Vol. 19, № 19(7). - P. 2099].
Мы предполагаем, что дефицит продукции IL-10 В-лимфоцитами препятствует их полноценной пролиферации, выживаемости и дифференцировки. При этом нарушается созревание плазмоцитов - основных продуцентов антител, в том числе и блокирующих антител класса G (algG), являющихся фактором защиты семиаллогенного плода от реакций клеточной цитотоксичности и фагоцитоза материнской иммунной системы [Fab fragment glycosylated IgG may play a central role in placental immune evasion / J. Gu, Y. Lei, Y. Huang [et al.] // Hum. Reprod. - 2015. - Vol. 30, № 2. - P. 380-391]. Кроме того, недостаточный уровень IL-10+ В- лимфоцитов в сочетании с повышенной продукцией воспалительных цитокинов [Jessica Е. Thaxton and Surendra Sharma. Interleukin-10: A Multi- Faceted Agent of Pregnancy//Am. J. Reprod. Immunol. - 2010. - Vol. 63, №6. - Р. 482—491 ] может определить сдвиг иммунного баланса в сторону воспалительных ТЫ-зависимых реакций. В то же время недостаточный уровень IL-10 в сочетании с другими воспалительными триггерами нарушает баланс про- и противовоспалительных реакций на границе между матерью и плодом и, как следствие, приводит к окислительному стрессу плаценты, воспалению и апоптозу, а также высвобождению антиангиогенных факторов [Cheng S.B., Sharma S. Interleukin-10: A Pleiotropic Regulator in Pregnancy // Am. J. Reprod. Immunol. - 2015. - Vol. 73, № 6. - P. 487-500]. Все это в итоге может приводить к нарушению развития плода и к отторжению плодового трансплантата.
Отличительные признаки способа: в сроке 5-12 недель гестации до начала сохраняющей терапии определяют относительное содержание IL-10+ клеток среди CD20+ В-лимфоцитов, и при его значении равном 4,5% и менее прогнозируют репродуктивные потери, представляющие собой неразвивающуюся беременность и самопроизвольный выкидыш, в сроке гестации до 22 недель.
Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:
Пример 1.
Больная К., 39 лет, беременность пятая, желанная, наступила самостоятельно, в первом браке. В анамнезе четыре неразвивающиеся беременности в сроках 10, 11, 19 недель. В сроке 6 недель беременности госпитализирована в стационар с жалобами на тянущие боли внизу живота. При влагалищном исследовании: наружные половые органы развиты правильно, влагалище узкое, шейка матки конической формы, длинная, наружный зев сомкнут. Тело матки увеличено до 6 недель беременности, округлой формы, плотное, подвижное, безболезненное. Выделения слизистые. Срок по данным ультразвукового исследования 6 недель, сердцебиение эмбриона регистрируется.
Диагноз: Беременность 6 недель. Угрожающий выкидыш. Привычное невынашивание беременности.
До назначения сохраняющей терапии было проведено обследование по заявляемому способу: относительное содержание IL-10+ клеток среди  CD20+ B-лимфоцитов составило 2,8%.
Заключение: прогноз - репродуктивные потери до 22 недель беременности.
Пациентке проводилась сохраняющая терапия. Через 5 дней выполнено повторное ультразвуковое исследование, в ходе которого диагностирована неразвивающаяся беременность (сердцебиение эмбриона не регистрировалось).
Диагноз: Неразвивающаяся беременность в сроке 6-7 недель. Привычное невынашивание беременности.
Прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Пример 2.
Больная З., 30 лет, беременность пятая, желанная, наступила самостоятельно, в первом браке. В анамнезе 2 неразвивающиеся беременности и 2 самопроизвольных выкидыша в сроках 5-6 недель. В сроке 5 недель беременности госпитализирована в гинекологическое отделение с жалобами на тянущие боли внизу живота, сукровичные выделения из половых путей. При влагалищном исследовании: наружные половые органы развиты правильно, влагалище узкое, шейка матки конической формы, длинная, наружный зев сомкнут. Тело матки увеличено до 5-6 недель беременности, округлое, плотное, подвижное, безболезненное. Выделения сукровичные, скудные. По данным ультразвукового исследования выявлены повышение тонуса миометрия и отслойка хориона; сердцебиение эмбриона регистрируется.
Диагноз: Беременность 5-6 недель. Угрожающий выкидыш. Привычное невынашивание беременности.
До назначения сохраняющей терапии было проведено обследование по заявляемому способу: относительное содержание IL-10+ клеток среди  CD20+ B-лимфоцитов составило 4,5%.
Заключение: прогноз - репродуктивные потери до 22 недель беременности.
Проводилась сохраняющая терапия с положительным эффектом. При проведении контрольного ультразвукового исследования гениталий признаков угрозы прерывания обнаружено не было. Женщина выписана из стационара с развивающейся беременностью.
В сроке 20 недель беременности пациентка повторно госпитализирована в стационар с жалобами на тянущие боли внизу живота, пояснице, кровянистые выделения из половых путей. При влагалищном исследовании диагностировано: шейка матки сглажена, произошел самопроизвольный выкидыш мертвым плодом.
Диагноз: Беременность 20 недель. Неполный поздний самопроизвольный выкидыш. Привычное невынашивание беременности.
Прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Пример 3.
Больная И., 36 лет, беременность третья, желанная, наступила самостоятельно, в первом браке. Первичное бесплодие 5 лет. В анамнезе 2 неразвивающиеся беременности в сроке 6 недель. В сроке 12 недель беременности госпитализирована в гинекологическое отделение с жалобами на тянущие боли внизу живота. При влагалищном исследовании: наружные половые органы развиты правильно, влагалище узкое, шейка матки конической формы, длинная, наружный зев сомкнут. Тело матки увеличено до 12-13 недель беременности, округлое, плотное, подвижное, безболезненное. Выделения слизистые. По данным ультразвукового исследования выявлены ретрохориальная гематома 13×17 мм, в зоне  плацентации и повышение тонуса миометрия.
Диагноз: Беременность 12 недель. Угрожающий выкидыш. Привычное невынашивание беременности.
До назначения сохраняющей терапии было проведено обследование по заявляемому способу: относительное содержание IL-10+ клеток среди CD20+ В-лимфоцитов составило 8,5%.
Заключение: прогноз пролонгирования беременности.
Проводилась сохраняющая терапия с положительным эффектом. Женщина выписана из стационара с развивающейся беременностью.
В сроке 38 недель беременности пациентка повторно госпитализирована в акушерское отделение для родоразрешения. Учитывая отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (первичное бесплодие, привычное невынашивание беременности), возраст первородящей проведено плановое кесарево сечение, извлечен доношенный ребенок женского пола (вес 3150 г, рост 52 см) с оценкой по шкале Апгар 8/9.
Диагноз: I своевременные роды путем операции кесарева сечения в сроке 38 недель беременности. Отягощенный акушерско-гинекологический анамнез. Первичное бесплодие. Привычное невынашивание беременности.
Прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Указанным способом обследовано 33 женщины с угрожающим выкидышем в сроке 5-12 недель и привычным невынашиванием беременности в анамнезе.
Результаты исследования приведены в таблице №1.
Преимущества заявляемого способа:
1. Способ позволяет осуществлять раннее прогнозирование репродуктивных потерь, представляющих собой неразвивающуюся беременность и самопроизвольный выкидыш, начиная с пяти недель гестации.
2. Способ имеет высокую точностью 87,9%, чувствительность 100% и специфичность 82,6%.
3. Заявляемый способ прост в выполнении: основывается на определении одного показателя, не требует больших временных затрат и сложных математических расчетов (время выполнения 2 часа)
4. Способ может использоваться в качестве скринингового.