Диагностика скрытых повреждений биологических мембран при действии малых доз гамма-излучения

УДК 612.11.014.4

ДИАГНОСТИКА СКРЫТЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН ПРИ ДЕЙСТВИИ МАЛЫХ ДОЗ ГАММА-ИЗЛУЧЕНИЯ

Е. К. Козлова, А. П. Черняев, П. Ю. Алексеева, А. М. Черныш, A.A. Долгополова, М.А. Назарова

Представлены экспериментальные данные по исследованию воздействия 7 -излучения в малых дозах на мембрану эритроцитов человека. Выявление скрытых мембранных повреждений эритроцитов после облучения 226 Ra проводили методом воздействия калиброванным импульсом электрического поля. Данный метод сравнивается с классическим методом оценки состояния мембраны с помощью измерения осмотической резистентности. Предлагается математическая модель, адекватно описывающая экспериментальные результаты.

Исследование биологической мембраны как объекта радиационного воздействия является актуальной проблемой современной физики и биофизики [1, 2]. Целью данной работы было экспериментальное исследование скрытых изменений биофизических свойств мембран в результате воздействия слабого 7-излучения. Исследования проводили с помощью метода калиброванной электропорации мембран, позволяющего оценить изменения свойств мембран на начальных стадиях повреждения [3, 4]. Для сравнения приведены данные тех же экспериментов, полученные с помощью метода измерения осмотической резистентности.

Методика и результаты экспериментов

Суспензию эритроцитов человека (3 мл) через час после приготовления облучали 7-квантами от источника 226 Иа в течение 30 мин. При этом поглощенная доза составляла 2.5 Р. После облучения суспензию подвергали действию импульсного электрического поля (ИЭП) (напряженность поля в растворе Е = 1700 В/см, длительность импуль-

са 6 мс), вызывающего электропорацию мембран эритроцитов. Эффект от воздействия 7-излучения оценивали по скорости гемолиза эритроцитов. Методика приготовления суспензии эритроцитов и выбор рабочих параметров ионизирующего излучения, импульсного электрического поля и температуры подробно изложены в работах [3, 4].

Кинетика изменения состояния мембраны в течение нескольких суток после приготовления представлена на рис. 1. На рис. 1 ,а приведены зависимости скоростей уменьшения числа эритроцитов от времени в результате воздействия ИЭП на предварительно облученную и необлученную суспензии У(Ь). Скорость уменьшения числа эритроцитов определяется как V = Дп/Д£, Ап — изменение числа эритроцитов за промежуток времени после воздействия ИЭП, = 20 мин. Скорость гемолиза в результате электропорации в первые сутки после облучения возрастала, на вторые и третьи уменьшалась, а на четвертые снова возрастала (кривая /). Для сравнения представлены соответствующие результаты для контрольной необлученной суспензии

3.5

V, клеток/мин

з.о-

2.5.

2.0-

1.5'

1.0'

0.5'

0.0'

t, сут

^r/fiontrol 2.22.01.81.61.41.21.0 0.8 0.6 0.40.2 0.0

0

4 t, сут 5

Рис. 1. Скорость изменения числа эритроцитов в результате электропорации в зависимости от времени после приготовления суспензии : (а) для облученной (/) и необлученной (2) суспензий (за единицу принята скорость для контрольной суспензии в день ее приготовления); (б) отношение скоростей Т^7/У"сопгго1  Источник 226На с активностью А = 9.25 мКи, доза облучения 5 Р, температура ^ = 20 °С. Оптическая плотность суспензий до электропорации

во всех опытах была равна единице

«negeraol/«0, %

Рис. 2. Зависимость доли негемолизированных эритроцитов в суспензии (пПе&ет/по) от концентрации соли ЫаС1 (С). Первые сутки: / — контрольная суспензия, 2 — суспензия после облучения. Пятые сутки: 3 — контрольная суспензия, 4 — после облучения

кривая 2). Характер кривых для облученной и не-облученной суспензий одинаков, однако кривая 1 смещена относительно кривой 2 по оси времени на сутки.

На рис. 1,6 приведена зависимость отношения скоростей от времени после приготов-

ления суспензии. В первые сутки У7 > Ко^шЬ В условиях наших опытов {У71УС0Т1%т\) = 1.6 ±0.2 (а = 0.95). На вторые и третие сутки наблюдался обратный эффект: У7 < • При этом в течение

первых пяти суток оптическая плотность облученной и необлученной суспензии без электропорации не изменялась и равнялась исходной (Д) = 1).

Метод электропорации позволил проявить скрытые эффекты воздействия 7-излучения на мембраны уже в первые сутки после облучения. Наша методика выявления скрытых повреждений была сопоставлена с классической, которая дает информацию о состоянии мембраны с помощью измерения осмотической резистентности, которая определяется по концентрации соли №С1 С50%, при которой гемолизируется 50% исходных эритроцитов [5]. Однако значимого различия между осмотической резистентностью облученной и контрольной суспензий этот метод не показал ни в первые, ни в последующие сутки (рис. 2). Осмотическая резистентность уменьшалась одинаково как для облученной, так и для необлученной суспензии в первые сутки и пятые, когда оптическая плотность суспензии становилась меньше единицы.

Модель

Количество возникающих в мембране пор и их радиус в результате действия НЭП определяются наведенным трансмембранным потенциалом и пороговым потенциалом электрического пробоя <рр. Под действием 7-излучения изменяются локальные свойства биомембран, а следовательно, и <рр. Выделим поверхность мембраны единичной площади. Разобьем эту площадь на N одинаковых областей,

в каждой из них может образоваться пора. Число областей N велико. Образование поры в каждой такой области зависит от собственных свойств этой области. Мембрана эритроцита изначально неоднородна по своим электрохимическим свойствам. Белки, разные сорта липидов, границы межмолекулярных разделов, наличие ионных каналов, аква-пор, асимметрия липидов на внутренних и внешних сторонах клетки, наличие дефектов в мембранах являются причиной этих неоднородностей. Поэтому в различных участках мембраны потенциалы (рр неодинаковые. Собственные свойства каждого из N участков определяют два параметра электропорации: (fp и радиус поры. Набор элементарных макроскопических областей мембраны N можно рассматривать как статистический ансамбль. Выделим в фазовом пространстве состояний объем d(fp около точки (fp. В данный момент времени в этом объеме заключены точки, характеризующие состояния dN систем ансамбля из их полного числа N. Тогда предел отношения lim = /jv(Vi» t) d(fp

определяет плотность распределения (функцию статистического распределения) микроскопических состояний систем ансамбля в момент времени t. Для расчета суммарной площади образовавшихся пор необходимо вычислить интеграл

С N f ( ( к\2

Ч? min

где (ppai — средний по мембране пороговый потенциал; i^min — минимальный потенциал, при котором в мембране образуется одна пора, к — коэффициент, характеризующий связь радиуса поры с пороговым потенциалом в данной области мембраны.

Развитие процессов перекисного окисления липидов после облучения приводит к их структурным нарушениям, проявляющимся через несколько суток [1]. Наряду с этим уменьшается поверхностный заряд эритроцитов [6]. Оба этих процесса наблюдаются и для необлученной крови, но с меньшими скоростями. Известно, что при хранении цельной крови, даже при пониженной температуре, через несколько суток начинается интенсивный процесс уменьшения поверхностного заряда эритроцитов [7].

В результате облучения в мембране возникает второй статистический ансамбль N7, площадь повреждения за счет этого ансамбля S7. За счет перекисного окисления средний пороговый потенциал уменьшается: ippar(t) = ipparQ exp(^At), где фрsro = фрsr(0), А — показатель уменьшения среднего потенциала. Поверхностный заряд и соответственно поверхностный потенциал в результате облучения начинают уменьшаться со временем, причем быстрее, чем для необлученной суспензии:

фа = ipsg — erf ^ > ipsa — поверхностный

потенциал сразу после приготовления суспензии,

8 ВМУ, физика, астрономия, №6

Ьд, сгд — константы. В этом случае изменятся трансмембранные потенциалы со стороны катода и анода:

4>с = |Усе11/2| - 1^1, 4>а = |Усе11/2| -Тогда суммарная площадь образовавшихся пор + Я = + где

<Рс 9 2

/ «р ш

^ГШП

Iра

^гшп

Отношение скоростей уменьшения числа эритроцитов определяется отношением соответствующих площадей:

У^/УсопЬт! = (¿>7 + Б)! Б. При этом увеличение активных центров электро-порации в результате облучения будет приводить

V, клеток/мин

Рис. 3. Теоретические данные для скорости изменения числа эритроцитов в результате электропорации в зависимости от времени после приготовления суспензии для облученной

к увеличению этого отношения, а уменьшение поверхностного заряда — к уменьшению. Различие кинетики увеличения активных центров и изменения поверхностного заряда и приводит к изменению во времени отношения У7/УСопШ1^) (рис. 3). Таким образом, зависимость Ky/V^ontroi(t) может быть использована в качестве рабочей характеристики биосенсора 7-излучения.

Выводы

Метод электропорации позволил исследовать кинетику биофизических изменений в мембранах эритроцитов, возникающих в результате воздействия 7-излучения с дозой 2.5 Р. Разработана математическая модель, адекватно описывающая экспериментальные результаты.

Авторы выражают благодарность научному сотруднику НИИЯФ МГУ В. И. Смирнову за помощь в проведении экспериментов.

Литература

1. Benderitter М., Vincent-Genod L., PougetJ. et al. //Rad. Res. 2003. 159, N 4. P. 471.

2. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения). М., 2004.

3. Козлова Е.К., Черняев А.П., Шведунов В.И. и др. // Биомед. технол. и радиоэлектроника. 2004. №6. С. 65.

4. Козлова Е.К., Черняев А.П., Алексеева П.К). и др. // Тр. V Межвузовской научной школы молодых специалистов «Концентрированные потоки энергии в космической технике, электронике, экологии и медицине», НИИЯФ МГУ, 22-23 ноября 2004 г. С. 105.

5. Шмидт Р., Тевс Г. Физиология человека. Т. 2. М., 1996. С. 422.

6. Зима Г.В., Древаль В.И. // Радиац. биол. радиоэкол. 2000. 40, №3. С. 261.

7. Godin С., Caprani А. // Eur. Biophys. J. 1997. 26, N 2. P. 175.

Поступила в редакцию 06.05.05