Роль апоптоза, индуцированного Corynebacterium non diphtheriae, в альтерации макрофагов мышей

НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК

При исследовании апоптогенного воздействия циркулирующего штамма C.diphtheriae gravis tox+ в сочетании с S.pyogenes на макрофаги мышей было выявлено достоверное его увеличение (71 ±5,8 %). В то же время показатели апоптоза циркулирующего штамма C.diphtheriae gravis tox+ в сочетании с P.aeru-ginosae были достоверно (t>2) снижены (10,1±4,3 %). Апоптогенная активность токсигенных штаммов коринебактерий дифтерии с другими представителями микрофлоры верхних дыхательных путей -S.epidermidis (64,6±6,2 %), S.aureus (53,2±6,5 %) -не изменялась.

Обсуждение. Токсигенные штаммы возбудителя дифтерии обладают способностью индуцировать апоп-

тоз макрофагов, что обусловлено, по-видимому, действием дифтерийного экзотоксина. Причем, апопто-генное действие возбудителя дифтерии усугубляется в присутствии S.pyogenes. Данный факт может быть обусловлен их синергическими свойствами, связанными с массивной диффузией токсических веществ, выделяющихся в процессе жизнедеятельности стрептококков, и повышением проницаемости клеточных барьеров в зоне инокуляции возбудителя дифтерии. Такие межмикробные взаимодействия способствуют персистенции возбудителя дифтерии в присутствии S.pyogenes на слизистой миндалин и формированию затяжного бактерионосительства на фоне хронических тонзиллитов и ОРВИ.

РОЛЬ АПОПТОЗА, ИНДУЦИРОВАННОГО CORYNEBACTERIUM NON DIPHTHERIAE, В АЛЬТЕРАЦИИ МАКРОФАГОВ МЫШЕЙ

Г.Г. Харсеева, Н.А. Воронина, Н.И. Мамычева, Н.А. Голованова Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону

Цель работы - оценка патогенности штаммов Corynebacterium non diphtheriae по показателям апоптоза макрофагов белых мышей.

Материалы и методы. Исследованы штаммы Corynebacterium non diphtheriae (C.pseudotuberculosis, C.xerosis, C.amycolatum, C.striatum) (51 шт.), выделенные из влагалища, цервикального канала и мочи в бактериологических лабораториях ГУЗ «Областная детская больница» г. Ростова-на-Дону и МУЗ «Горбольница №1» г. Гуково Ростовской области от больных острым кольпитом, хроническим и острым пиелонефритом и беременных, а также лиц, проходивших профилактическое обследование за период с 2009 по 2011 г. Штаммы Corynebacterium non diphtheriae идентифицировали общепринятыми методами по морфологическим, тинк-ториальным, культуральным и биохимическим свойствам на питательных средах в соответствии с указаниями Н.Н. Костюковой (2002 г.).

Исследование апоптогенной активности штаммов Corynebacterium non diphtheriae проводили на белых беспородных мышах (18-20 г) из питомника ФГУЗ «Рос-товский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора. Умерщвление животных осуществляли методом цервикальной дислокации после предварительной наркотизации с помощью тиопентала натрия в дозе 5 мг/кг. Объектом исследования послужили перитонеальные макрофаги мышей. Клетки получали после асептического воспаления, вызванного внутрибрюшинным введением 1 % пептонной воды рН 7,2 (2 мл). Макрофаги получали через 4 суток после введения пептона. Взятие клеток проводили промыванием брюшной полости животных средой 199 (10 мл), содержащей 5 ед/мл гепарина, 20 % инактивированной (56 °С, 30 мин.) сыворотки крови человека и пенициллин - 100 ед/мл. Полученный экссудат смешивали со взвесями культур Corynebacterium

non diphtheriae в концентрациях 1:10 и 1:100 (0,1 мл) и подслаивали под покровное стекло, вложенное в стерильный пенициллиновый флакон. Флаконы, в которых покровные стекла находились на внутренней верхней стенке, инкубировали при +37 °С в течение часа. Контролем явилась культура макрофагов, к которой добавляли растворитель без микробной взвеси. Затем стекла промывали в 6 порциях стерильного раствора Хенкса, переносили в стерильные пенициллиновые флаконы с 2 мл среды 199 с 20 % инактивированной сыворотки и пенициллина - 100 ед/мл и вновь инкубировали при 37 °С 5 часов. После инкубации стекла подсушивали, фиксировали 20 минут и окрашивали азур-эозином по Романовскому-Гимзе. Мазки высушивали и на предметных стеклах с помощью иммерсионного масла просматривали в микроскопе при увеличении 90x7. В мазках подсчитывали процент клеток с апоптозом. Средний показатель вычисляли по трем экспериментам. Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов «Microsoft Office 2007» и «Statistica 6.0» для Windows XP. Достоверность полученных данных оценивали при уровне значимости t>2 (P>95 %).

Результаты. Штаммы Corynebacterium non diphtheriae (C.pseudotuberculosis, C.xerosis, C.amycolatum, C.striatum), выделенные из влагалища и цервикального канала, обнаруживали в количестве III-IV степени, из мочи - 105 и 106, что расценивали как диагностически значимый показатель, свидетельствовавший об этиологической роли данных микроорганизмов в инфекционном процессе. Установлено, что 55 % штаммов коринебактерий выделяли в ассоциации с другими микроорганизмами. Среди микробов-ассоциантов обнаруживали следующих представителей: E.faecalis, S.epidermidis, E.coli, P.mirabilis, K.pneumoniae и S.saprophyticus. Исследованы штаммы C.pseudotuberculosis и C.xerosis, выде-

ПРОЧИЕ ИНФЕКЦИИ

ленные как без микробов-ассоциантов, так и в ассоциации с Р.т1гаЬ1Ш, К.рпеитотае и ЕАеса^, а также штаммы С^паШш в ассоциации с Е.соН и S.saprophy-йсш, и C.amycolatum - с Е.соН. В ходе проведенного нами исследования установлено, что апоптогенный эффект носил дозозависимый характер.

Результаты исследования, выполненные на мышах с использованием микробной взвеси СогупеЬайе-гшт поп diphtheriae, показали, что гибель большинства клеток перитонеальных макрофагов происходит в результате апоптоза. При развитии клеточной гибели путем апоптоза в поле зрения микроскопа наблюдали характерные для него изменения: уменьшение размеров клетки, конденсация цитоплазмы, разделение хроматина на ряд округлых телец. При апопто-зе, в отличие от некроза, сохраняется структурная целостность мембран, тогда как при некрозе нарушена целостность цитоплазматических и ядерных мембран.

При изучении потенциальной апоптогенной активности микробных взвесей Corynebacterium поп diph-Лете установлено, что процесс апоптоза наблюдали в результате действия всех изученных штаммов ко-ринебактерий (С.pseudotuberculosis, С.хегс^, C.amyco-Ышт, C.striatum). Сравнительная оценка результатов показала, что наиболее выраженный (:>2) апоптоген-ный эффект наблюдали у штаммов, выделенных в ассоциации с другими микроорганизмами (69,5 ± 6,2 %), в отличие от штаммов, присутствовавших в монокультуре (49,3 ±7,2 % ).

Наиболее высокое апоптогенное действие среди всех исследованных штаммов было выявлено у C.amyco-Ьшт (73,0±7,6 %), выделенного в диагностически значимом количестве в ассоциации с Е.соН. Самый низкий апоптогенный эффект - у штамма С.хегсж (45,0 ±7,6 %), выделенного в монокультуре. Штамм C.amycolatum об-

ладал одинаково высоким апоптогенным действием на клетки как в монокультуре, так и в сочетании с другими недифтерийными коринебактериями. В то же время наблюдали снижение (t>2) показателей апоптоза C.amycolatum в сочетании со штаммами S.aureus (48,0± 7,1 %), S.pyogenes (47,0±7,0 %) и E.coli (54,5±6,8 %).

У штамма C.xerosis, обладавшего низкой апопто-генной активностью (45±7,6 %), в сочетании с другими микроорганизмами показатели апоптоза достоверно (t>2) увеличивались: с S.pyogenes (74,5±6,0 %), E.coli (68,6±6,7 %), C.pseudotuberculosis (73,0±6,4 %) и C.amycolatum (77,3±5,8 %). Показатели апоптоген-ной активности в отношении макрофагов мышей у штаммов C.pseudotuberculosis и C.striatum, исследованных как в монокультуре, так и в сочетании с другими микроорганизмами, достоверно не отличались между собой.

Обсуждение. Результаты исследований свидетельствовали об угнетающем действии штаммов Coryneba-cterium non diphtheriae на фагоцитарные клетки чувствительных к ним мышей. Наиболее значимыми индукторами, способными активировать процессы развития программированной клеточной гибели in vitro, могут быть факторы патогенности Corynebacterium non diphtheriae, оказывающие токсическое воздействие: поверхностные антигены, cord-фактор, нейрами-нидаза, N-ацетилнейраминидаза, а также адгезины (ге-магглютинин, гидрофобин и ферменты с транссиали-дазной активностью).

Выявленный синергетический характер апопто-генного действия на фагоцитарные клетки штаммов недифтерийных коринебактерий и условно-патогенных микроорганизмов обусловливает, по-видимому, развитие воспалительных заболеваний на фоне формирующегося дисбаланса микрофлоры.

ВЫДЕЛЕНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ НЕЙТРОФИЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ОЦЕНКА ИХ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ В ОТНОШЕНИИ МАКРОФАГОВ

И.А. Беспалова, Е.П. Дорошенко, Р.В. Писанов, Н.Д. Омельченко, И.А. Иванова, А.К. Киселева, А.В. Филиппенко, Л.В. Судьина

ФГУЗ «Ростовский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов межклеточного взаимодействия, участвующих, главным образом, в формировании и регуляции защитных реакций организма при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей, а также в регуляции ряда нормальных физиологических функций.

Значение цитокинов для жизнедеятельности организма трудно переоценить. Они необходимы на всех этапах иммунного ответа, участвуя как в неспецифическом звене защиты организма от инфицирую-

щих микроорганизмов, так и в формировании специфического иммунитета. Накопленные к настоящему времени знания позволяют рассматривать их как общую систему гомеостатической регуляции клеточной функции, как часть сложнейшей цепи взаимосвязанных сигналов, обеспечивающих сходную работу различных систем в живом организме. Наряду с выполнением своих специфических функций внутри иммунной системы цитокины способны осуществлять и межсистемные связи (А.С. Симбирцев и др., 2004; Smith R.S., 1991).