Получение и изучение каллусных культур клеток женьшеня вьетнамского Panax vietnamensis Ha et Grushv

УДК 57.085.23; 57.085.25 Г. И. Соболькова, Д. В. Кочкин, М. В. Титова, Р. О. Григорьев, А. Г. Клюшин, А. М. Носов

получение и изучение каллусных культур клеток женьшеня вьетнамского Panax vietnamensis Ha et Grushv.

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва, Россия

Аннотация. Женьшень вьетнамский (Panax vietnamensis Ha et Grushv) - уникальный вид рода Panax (семейство Araliaceae), который занимает особое положение среди других представителей этого рода. Для него характерна уникальная композиция тритерпеновых гликозидов, среди которых преобладающими являются гликозилированные производные редкого тритерпенового агликона - окотиллола. Женьшень вьетнамский является эндемиком Вьетнама и активно используется в народной вьетнамской медицине. К настоящему времени природные запасы P. vietnamensis существенно истощены, что делает актуальным как проблему сохранения этого редкого вида, так и поиск альтернативных источников получения его биологически активных веществ. Известно, что культура клеток высших растений является уникальной, экспериментально созданной популяцией соматических дедифференцированных клеток. Эта система может быть универсальным инструментом, с помощью которого можно решать как фундаментальные, так и многие практические задачи, в частности, связанные с исследованием специфики получения штаммов-продуцентов и особенностей их вторичного метаболизма. Прикладные аспекты изучения растительных клеток in vitro обусловлены возможностью их использования в качестве источника ценных биологически активных веществ растительного происхождения. Таким образом, оптимизация методов получения культур клеток женьшеня вьетнамского, изучение роста полученных культур и образования в них вторичных метаболитов (гинзенозидов) представляет как теоретическую, так и практическую значимость. В данной работе приведены результаты работ по оптимизации методов получения каллусных культур клеток из корневища Panax vietnamensis (в том числе по оптимизации состава питательных сред), а также данные скрининга основных целевых вторичных метаболитов. Получены несколько линий каллусных культур клеток женьшеня вьетнамского, для двух наиболее активно растущих линий подробно исследованы ростовые характеристики. Для полученных каллусных культур P. vietnamensis проведен предварительный анализ состава

СОБОЛЬКОВА Галина Ивановна - н. с. лаборатории биологии культивируемых клеток Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

SOBOLKOVA Galina Ivanovna - research associate, Cultured cells biology laboratory, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences.

КОЧКИН Дмитрий Владимирович - к. б. н., н. с. лаборатории биологии культивируемых клеток Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

E-mail: dmitry-kochkin@mail. ru

KOCHKIN Dmitry Vladimirovich - Candidate of Biological Sciences, research associate of Cultured cells biology laboratory, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences.

ТИТОВА Мария Владимировна - к. б. н., ст. н. с. лаборатории биологии культивируемых клеток Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

E-mail: titomirez@mail.ru

TITOVA Maria Vladimirovna - Candidate of Biological Sciences, research associate of Cultured cells biology laboratory, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences.

тритерпеновых гликозидов (гинзенозидов). Установлено, что предлагаемая методика получения каллусных культур клеток женьшеня вьетнамского достаточно эффективна, полученные линии имеют удовлетворительные ростовые характеристики и содержат не менее 5 основных гинзенозидов, производных окотиллола, протопанаксадиола и олеаноловой кислоты, характерных для этого вида женьшеня.

Ключевые слова: женьшень вьетнамский, Panax vietnamensis, культуры клеток высших растений, каллусная культура клеток, среды культивирования каллусов, фитогормоны, вторичные метаболиты, тритерпеновые гликозиды (гинзенозиды), адаптогены, лекарственное растительное сырье.

DOI 10.25587/SVFU.2018.65.14067

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ № 14-50-00029 («Научные основы создания национального банка-депозитария живых систем. Направление «Растения»).

G. I. Sobolkova, D. V. Kochkin, M. V. Titova, R. O. Grigoryev, A. G. Klyushin, A. M. Nosov

Obtaining and Study of Callus Cell Cultures of Ginseng Vietnamese Panax Vietnamensis Ha Et Grushv.

K. A. Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences,

Moskow, Russia

Abstract. Ginseng Vietnamese (Panax vietnamensis Ha et Grushv) is a unique species of the genus Panax (the Araliaceae family), which occupies a special position among other members of this genus. It is characterized by a unique composition of triterpene glycosides, among which glycosylated derivatives of the rare triterpene aglycone-ocotylol are predominant. Ginseng Vietnamese is endemic to Vietnam and is actively used in folk medicine in Vietnam. To date, the natural reserves of P. vietnamensis are substantially depleted, which makes both the conservation of this rare species and the search for alternative sources of sources of its biologically active substances relevant. It is known that the culture of cells of higher plants is a unique, experimentally created population of somatic dedifferentiated cells. This system can be a universal tool with which you can solve both fundamental and many practical problems, in particular related to the study of the specifics of obtaining producer strains and the characteristics of their secondary metabolism. Applied aspects of the study of plant cells in vitro are due to the

ГРИГОРЬЕВ Роман Олегович - аспирант лаборатории биологии культивируемых клеток Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

E-mail: 1991grom22@gmail.com

GRIGORYEV Roman Olegovich - PG student of Cultured cells biology laboratory, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences.

КЛЮШИН Андрей Геннадьевич - к. б. н., н. с. лаборатории биологии культивируемых клеток Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

E-mail: andreyklyushin@list.ru

KLYUSHIN Andrey Gennadievich - Candidate of Biological Sciences, research associate of Cultured cells biology laboratory, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences.

НОСОВ Александр Михайлович - д. б. н., профессор, зав. лаборатории биологии культивируемых клеток Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

NOSOV Alexander Mihaylovich - Doctor Biological Sciences, Professor, Head of Cultured cells biology laboratory, K.A. Timiryazev Institute of Plant Physiology of Russian Academy of Sciences.

possibility of their use as a source of valuable biologically active substances of plant origin. Thus, the optimization of methods for obtaining Vietnamese ginseng cell cultures, the study of the growth of the cultures obtained and the formation of secondary metabolites (ginsenosides) is of both theoretical and practical importance. In this paper, we present the results of work on optimization of methods for obtaining callus cell cultures from the rhizomes of Panax vietnamensis (including optimizing the composition of nutrient media), as well as screening data for the main target secondary metabolites. Several lines of the callus cell cultures of Vietnamese ginseng cells were obtained, the growth characteristics were studied in detail for the two most actively growing lines. For the obtained callus cultures P. vietnamensis, a preliminary analysis of the composition of triterpene glycosides (ginsenosides) was carried out. It has been established that the proposed method of obtaining callus cultures of Vietnamese ginseng cells is quite effective, the lines obtained have satisfactory growth characteristics and contain at least 5 basic ginsenosides, derivatives of ocotyllol protopanaxadiol and oleanolic acid, characteristic for this type of ginseng.

Keywords: ginseng vietnamese, Panax vietnamensis, cell cultures of higher plants, callus cell culture, callus culture media, phytohormones, secondary metabolites, triterpene glycosides (ginsenosides), adaptogens, medicinal plant material.

The research was funded by RSF # 14-50-00029 (titled "Scientific foundations of living systems' depositary bank building").

Введение

В настоящее время в мире наблюдается тенденция к широкому использованию лекарственных средств, полученных на основе растительного сырья. Особый интерес уделяется препаратам, направленным на усиление защитных свойств организма и повышение иммунитета, обладающим адаптогенными свойствами. Из всего растительного разнообразия растения рода Panax (женьшень) являются, пожалуй, самыми знаменитыми лекарственными растениями, обладающими подобными свойствами. Увеличение интереса к лекарствам, созданным на основе различных видов женьшеня, привело к печальным последствиям экологического плана - к практически полному исчезновению дикорастущих экземпляров этих реликтовых растений. Например, в Дальневосточном федеральном округе нашей страны практически полностью уничтожены дикорастущие формы женьшеня настоящего.

Известно, что культура клеток высших растений является уникальной, экспериментально созданной популяцией соматических дедифференцированных клеток. Эта система может быть универсальным инструментом, с помощью которого можно решать как фундаментальные, так и многие практические задачи, в частности, связанные с исследованием специфики получения штаммов-продуцентов и особенностей их вторичного метаболизма. Прикладные аспекты изучения растительных клеток in vitro обусловлены возможностью их использования в качестве источника ценных биологически активных веществ растительного происхождения.

Исследование вторичного метаболизма в клетках высших растений in vitro может быть использовано в качестве нетрадиционного подхода к решению одной из фундаментальных проблем физиологии растений - функциональной значимости вторичных метаболитов в жизнедеятельности клетки и целого растительного организма.

Вьетнамский женьшень (P. vietnamensis) впервые обнаружен нашим соотечественником И. В. Грушвицким и др. [1]. Он занимает особое положение среди других представителей рода Panax L (семейство Araliaceae). Этот вид женьшеня имеет самый южный ареал

Таблица 1

Состав питательных сред для инициации каллусообразования

Вещество Количество на 1 л среды

Среда 1 Среда 2 Среда 3

Минеральная основа MS MS В5

Сахароза 30 г - 30 г

Глюкоза - 20 г -

Тиамин - 1 мг -

Пиридоксин - 1 мг -

Агар 5 г 7 г 5 г

Таблица 2

Состав питательных сред для выращивания первичных каллусных культур клеток женьшеня вьетнамского

Вещество Количество на 1 л среды

Среда 4 Среда 5 Среда 6 Среда 7

Сахароза 30 г 30 г - -

Глюкоза - - 20 г 20 г

НУК - 1 мг 1 мг 1 мг

Кинетин - 0,1 мг 0,1 мг -

2,4-Д - - - 5 мг

БАП - - - 0,1 мг

Агар 5 г г г г

Примечание: общие для всех вариантов - минеральная основа по Мурасиге-Скуга, 500 мг гидролизата казеина, 100 мг мезоинозита, 1 мг тиамина, 1 мг пиридоксина, 5 мг никотиновой кислоты, 10 мг Са-пантотената

распространения среди других представителей рода. Кроме того, для P. vietnamensis характерна уникальная композиция тритерпеновых гликозидов, среди которых преобладающими являются гликозилированные производные редкого тритерпенового агликона - окотиллола [2-5].

Женьшень вьетнамский является эндемиком горного Вьетнама и активно используется в народной медицине Вьетнама. К настоящему времени природные запасы P. vietnamensis существенно истощены, что делает актуальным как проблему сохранения этого редкого вида, так и поиск альтернативных источников его биологически активных веществ.

До настоящего времени в литературе есть лишь единичные сведения о получении и исследовании культуры клеток женьшеня вьетнамского из листьев [6-11].

Таким образом, улучшение методов и условий получения каллусных культур клеток Panax vietnamensis, оптимизации их роста, а также скрининг образования вторичных метаболитов в полученных линиях являются актуальными задачами, которые имеют как теоретическую, так и практическую значимость.

Методы

Для инициации каллусных культур клеток в качестве экспланта использовали корневище интактного растения Panax vietnamensis, полученного из Коллекции ЦБС НАН Беларуси [12].

Корневище стерилизовали сначала 20 секунд в 70%-ом этаноле, затем в 0,1%-ом растворе сулемы (Sigma) в течение 5 мин. После стерилизации его ополаскивали, а затем трехкратно промывали в течение 20 мин в стерильной дистиллированной воде. Потом разрезали на экспланты и помещали на безгормональные среды 1-3 (табл. 1). После трех пассажей через каждый месяц сформировавшийся первичный каллус переносили на среды 4-7 (табл. 2). После разрастания полученные первичные каллусы переносили

Таблица 3

Состав регуляторов роста (мг/л) в питательных средах для выращивания каллусных культур клеток женьшеня вьетнамского

Вариант среды 2,4-Д НУК Кинетин 6-БАП

8 1 - 0,5

9 - 0,1 0,05 -

10 5 2 0,05 -

11 5 2 - 0,05

12 1 0,1 0,05 -

13 2 1 0,5 -

14 0,5 1 - 0,3

15 0,5 1 - 0,05

16 2 1 - 0,3

17 0,5 1 0,05 -

Примечание: для вариантов 8-15 минеральная основа по Гамборгу (В5); для вариантов 16-17 минеральная основа по Мурасиге-Скуга (MS); общие для всех вариантов - сахароза 30 г/л, гидролизат казеина 500 мг/л, мезоинозит 100 мг/л, тиамин 1 мг/л, пиридоксин 1 мг/л, никотиновая кислота 5 мг/л, пантотенат кальция 10 мг/л, агар 7 г/л

на варианты сред 8, 9, 12, 13 (табл. 3). Длительное субкультивирование каллусов осуществляли последовательно на парах сред 10-11, 14-16 и 15-17. Составы питательных сред

Для выращивания первичного каллуса использовали среды 4-7 (табл. 2). Для дальнейшего выращивания каллусов использовали несколько вариантов сред, отличающихся по составу регуляторов роста и минеральной основе. Состав сред представлен в табл. 3 [16].

Культивирование полученных линий проводили в темноте при 26 оС. Цикл субкультивирования составлял 4 недели. Для выращивания каллусных культур использовали чашки Петри ^=60 мм), каллус при пересеве делили на 4-6 частей стерильным скальпелем и пинцетом в ламинарном боксе.

Расчет ростовых характеристик проводили по следующим формулам:

1) Удельную скорость роста ц определяли по формуле:

ц = 1п +1 - 1п / ^,4,

г п+1 п п+1 п 4 '

где п - порядковый номер анализа, t - время. Для получения величины удельной скорости роста в экспоненте определяли границы на графике, где ц максимальная и относительно постоянна. В этих пределах справедлива формула:

Цср=

Для этого построили график роста культуры в полулогарифмическом виде (Ьп Х/Х0), далее определяли отрезок кривой, где точки лежат примерно на одной линии. Соединяя между собой не менее трех точек, рассчитывали величину ц, справедливую для данного периода.

2) Время удвоения т (сут.) определяли по формуле:

т = 1п 2/ц,

где ц - удельная скорость роста.

3) Индекс роста I определяли по формуле:

1= X /Х0,

тах 0^ у '

где Хтах - максимальное и Х0 - исходное значение параметров [13, 15].

Предварительный фитохимический анализ биомассы двух линий каллусных культур клеток вьетнамского женьшеня (выращены на двух разных средах: В5 и МБ, возраст культур 18 суток) был проведен с помощью хроматографии в тонком слое силикагеля (ТСХ).

Воздушно-сухую биомассу (40 мг) экстрагировали 3 раза по 1 мл 70% (по объему) этилового спирта в течение 25 минут на ультразвуке (УЗВ «Сапфир», Россия), после

чего центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут и отбирали супернатант в грушевидную колбу. Объединенные спиртовые экстракты упаривали под вакуумом при температуре 45 оС. Полученный сухой экстракт растворяли в 1 мл дистиллированной воды и наносили на патрон для твердофазной экстракции Superclean ENVI-18 («Supelco», США). Патрон промывали в 3 мл воды, аналиты смывали 3 мл этанола. Полученный раствор упаривали под вакуумом при 45 оС. Перед анализом экстракты растворяли в 1 мл 70% (по объему) этилового спирта.

Очищенные экстракты (по 10 мкл) наносили на хроматографическую пластинку Kieselgel 60 (Merk, Германия). Для разделения гликозидов использовали систему этилацетат - ледяная уксусная кислота - вода (32:9:9 по объему). Хроматограммы проявляли реактивом анисовый альдегид - серная кислота.

«Мягкий» щелочной гидролиз полученных экстрактов осуществляли следующим образом. К 0,4 мл очищенного спиртового экстракта добавляли 50 мкл водного раствора КОН (86 мг/мл). Полученную смесь инкубировали в ультразвуковой ванне (УЗВ «Сапфир», Россия) в течение 15 минут. Перед анализом гидролизат нейтрализовали, добавляя 50 мкл ледяной уксусной кислоты. [17-23].

Результаты и обсуждение

Для получения каллусных культур клеток на корневищах женьшеня вьетнамского оказалось эффективным последовательное использование двух сред, вначале безгормональной (2-3 пассажа) с последующим переносом на среду с оптимальной комбинации гормонов.

Согласно проведенным исследованиям, оптимальная методика получения каллусных культур клеток женьшеня вьетнамского может быть представлена следующей схемой. После стерилизации из внутренней части корневища вырезали экспланты в виде квадратных пластин со стороной 5 мм и толщиной 2 мм. Экспланты выдерживали несколько пассажей на питательных средах без регуляторов роста (варианты 1-3) для инициации первичного каллусообразования. Затем образовавшиеся первичные каллусы отделяли от эксплантов и переносили на среды 4-7 для завершения каллусообразования. Дальнейший стабильный рост каллуса удалось получить на среде 7 (табл. 2).

Полученные каллусные культуры пассировали на средах 8, 9, 12 и 13 (с основой по В5). Отличительной особенностью каллусов на этих средах была твердая консистенция. Для разрыхления каллусы через два месяца были перенесены на среды 10 и 11 с содержанием 5 мг/л 2,4-Д и 2 мг/л НУК. После образования рыхлого каллуса его перенесли на среды 14 (В5) и 16 (MS) - с меньшим содержанием ауксинов.

Через 5 месяцев сформированный рыхлый каллус характеризовался медленным, но стабильным ростом. Для улучшения роста полученных каллусных культур они были пересажены на питательные среды (15 и 17) с другим содержанием фитогормонов. В результате проведенных работ были получены несколько стабильно растущих линий каллусных культур клеток женьшеня вьетнамского, выращиваемых на двух вариантах питательных сред: одна среда с минеральной основой по В5, содержащая 2,4-Д, НУК, БАП в качестве регуляторов роста (среда 15), другая - с минеральной основой по MS, содержащая 2,4-Д, НУК, кинетин (среда 17). Внешний вид полученных каллусных культур клеток представлен на рис. 1.

Для наиболее активно растущих каллусных линий женьшеня вьетнамского были определены ростовые характеристики и построены ростовые кривые по изменению сухого веса каллуса, которые представлены на рис. 2 а, б в полулогарифмической системе координат.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что обе изученные каллусные линии на данном этапе обладают стабильной скоростью роста, достаточной для накопления биомассы. Причем немного более активный рост отмечен на среде 17 (MS). Однако для большей оптимизации условий выращивания этой культуры необходимо провести дальнейшие исследования.

а) б)

Рис. 1. Каллусные культуры клеток женьшеня вьетнамского на средах 15

Рис. 2а. Динамика роста каллусной культуры Panax vietnamensis на среде 15 по сухой биомассе клеток в полулогарифмической системе координат

Увеличение сухой массы каллуса на среде 17

15 20 25 Сутки культивирования

Рис. 2б. Динамика роста каллусной культуры Panax vietnamensis на среде 17 по сухой биомассе клеток в полулогарифмической системе координат

Таблица 4

Основные ростовые характеристики каллусных культур клеток Panax vietnamensis, рассчитанные по сухой биомассе

Параметр На среде 15 На среде 17

Удельная скорость роста (ц) 0.064 0.093

Время удвоения (Т, сут.) 10,83 7,45

Индекс роста (I) 3.09 2.40

Рис. 3. Результаты ТСХ экстрактов из биомассы каллусных культур клеток P. vietnamensis. * *Система растворителей: этилацетат: ледяная уксусная кислота: H2O (16:4,5:4,5, по объему).

Проявление: реактив анисовый альдегид - серная кислота. 1, 2 - экстракты из культур клеток, выращенных на средах B5 и MS, соответственно; 4, 5 - экстракты из культур клеток, выращенных

на средах B5 и MS, после мягкого щелочного гидролиза, соответственно; 3 - стандарт гинзенозида Rb1; 6 - очищенная сумма тритерпеновых гликозидов из биомассы культуры клеток японского женьшеня; 7 - стандарт псевдогинзенозида F11. ОТ - производные окотиллола, ППД - 20^)-производные протопанаксадиола, ОК - производные олеаноловой кислоты

Изучение состава тритерпеновых гликозидов (ТСХ) каллусных линий P. Vietnamensis, культивируемых на различных питательных средах

Как было отмечено выше, для женьшеня вьетнамского характерна уникальная композиция тритерпеновых гликозидов, среди которых преобладающими являются гликозилированные производные окотиллола [2-5].

Был проведен предварительный фитохимический анализ спиртовых экстрактов из биомассы двух наиболее интенсивно растущих каллусных линий вьетнамского женьшеня, которые выращивали на двух разных питательных средах 15 и 17 (минеральная основа по B5 и MS соответственно). Биомассу для анализа отбирали на 18 сутки культивирования, анализ проводили с помощью хроматографии в тонком слое силикагеля (ТСХ). Результаты ТСХ представлены на рис. 3.

Полученные результаты свидетельствуют о присутствии в спиртовых экстрактах из биомассы исследованных линий каллуса вьетнамского женьшеня нескольких тритерпено-вых гликозидов - предположительно, производных окотиллола (характерная коричневая окраска при проявлении ТСХ пластинки реактивом анисовый альдегид - серная кислота), а также протопанаксадиола и олеаноловой кислоты (характерная синяя окраска).

При проведении мягкого щелочного гидролиза экстрактов происходило изменение подвижности хроматографических пятен некоторых гликозидов, что позволяет предположить наличие ацильных заместителей у соответствующих соединений.

Таким образом, в полученных каллусных линиях женьшеня вьетнамского наиболее высокие значения параметров роста данной культуры отмечены на среде Мурасиге-Скуга, содержащей 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), а-нафтилуксусную кислоту (НУК) и кинетин. При этом можно заключить, что состав питательных сред слабо влияет на качественный состав тритерпеновых гликозидов в каллусах женьшеня вьетнамского.

Заключение

В результате данной работы была отработана и оптимизирована методика получения каллусных культур из корневища Panax vietnamensis, в частности был оптимизирован состав питательных сред для интенсификации роста полученных линий. Получено несколько активно растущих линий каллусной культуры клеток женьшеня вьетнамского, для двух из них подробно исследованы ростовые характеристики. Проведен предварительный анализ состава тритерпеновых гликозидов (гинзенозидов) в полученных линиях каллусных культур P. vietnamensis. Установлено, что изученные линии сохраняют способность к образованию гинзенозидов и содержат не менее 5 основных гинзенозидов -производных окотиллола, протопанаксадиола и олеаноловой кислоты.

Л и т е р а т у р а

1. Ха Тхи Зунг, Грушвицкий И.В. Новый вид рода Panax (Araliaceae) из Вьетнама // Ботан. журн. -1985. - Т. 70, № 4. - C. 518-522.

2. Кочкин Д. В., Качала В. В., Носов А. М. Обнаружение малонил-гинзенозида Rb1 в суспензионной культуре клеток женьшеня Panax japonicus var. repens. Доклады РАН, 2011, 441 - 837-840.

3. Christensen L. P. // Adv. Food. Nutr. Res. - 2008. - V. 55. - P. 1-99.

4. Qi L. W., Wang C. Z., and Yuan C. S., Ginsenosides from American ginseng: chemical and pharmacological diversity, Phytochemistry. - 2011. - vol. 72. - pp. 689-699.

5. Ramachandra Rao S. and Ravishankar G. A., Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites, Biotechnol. Adv. - 2002. - vol. 20. - pp. 101-153.

6. Tuan T. T., Dieu-Hien T., Hoang C. N., Dieu-Thai T., Huyen-Trang N. T., Giap D. D., Ho N. H. Biomass accumulation of Panax vietnamensis in cell suspension cultures varies with addition of plant growth regulators and organic additives // Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 2017; 10(9): 907-915

7. Jacques P., Kevers C., Gaspar T., Dommes J., Thonart P. Conditioning Panax vietnamensis cell mass production in bioreactors // Acta Bot Gallica 2007; 154(1): 21-26.

8. Ho N. H., Duc L. T., Thanh N. T. Production of some in vitro materials of Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) with capable use in genetic transformation // In: Proceedings of Biotechnology Conference of Southern Provinces of Vietnam. Ho Chi Minh City, Vietnam: Science and Technology Publisher, 2009.

9. Nhut D. T., Luan V. Q., Binh N. V., Phong P. T., Huy B. N., Ha D. T., et al. The effects of some factors on in vitro biomass production of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) and preliminary analysis of saponin content // J. Biotechnol. Viet. - 2009; 7: 365-370.

10. Thanh N. T., Ket N. V., Paek K. Y. Effect of medium composition on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture of Panax vietnamensis Ha et Grushv // VNU J. Sci. Nat. Sci. Technol. -2007; 23: 269-274.

11. Nguyen V. K., Truong L. A., Nguyen H. U. D. Effecting of sucrose concentrations and inoculum density on adventitiuos root growth in cell suspension culture of Panax vietnamensis and initially growth in a

bioreactor // Southeast Asian J. Sci. - 2012; 61: 811-817.

12. Фролова Л. В., Смоленская И. Н., Суханова Е. С. (составители). Всероссийская коллекция культур клеток высших растений (ВККК ВР). http://www.cytspb.rssi.ru/rkkk/katalog4.pdf

13. Самыгин Г. А. Сравнение разных методов для оценки жизнеспособности клеток суспензионных и каллусных культур / Г. А. Самыгин, Л. А. Волкова, А. С. Попов // Физиол. раст. - 1985.

- Т. 32, В. 4. - С. 813-817.

14. Смирнова Ю. Н., Решетняк О. В., Смоленская И. Н., Воевудская С. Ю., Носов А. М. Влияние регуляторов роста на синтез гинзенозидов в культуре клеток двух видов женьшеня // Физиология растений. - 2010. - Т. 57, № 3. - С. 458-466.

15. Носов А. М. Методы оценки и характеристики роста культур клеток высших растений. Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений // Молекулярно-генетические и биохимические методы в современной биологии растений, 487с (ISBN: 978-5-9963-0738-8). - БИОНОМ Москва, 2011. - С. 386-403.

16. Murashige T. and Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant. - 1962, vol. 15. - pp. 473-497.

17. Демидова Е. В. Синтез тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток Panax japonicus var. repens при разных условиях выращивания: дисс. канд. биол. наук // Демидова Елена Викторовна. - Москва, 2007. - 136 с.

18. Еляков Г. Б., Оводов Ю. С. Гликозиды аралиевых // Химия природных соединений. - 1972.

- № 6. - С. 697-709.

19. Журавлев Ю. Н., Коляда А. С. Женьшень и другие ARALIACEAE // Владивосток Дальнаука, 1996. - 280 с.

20. Кочкин Д. В. Качественный и количественный состав тритерпеновых гликозидов культур клеток in vitro представителей семейства Araliaceae (на примере Panax spp. и Polyscias spp.): автореф. дисс. канд. биол. наук // Кочкин Дмитрий Владимирович. - М., 2012. - 28 c.

21. Гришковец В. И. Тритерпеновые гликозиды аралиевых: выделение, установления строения, биологическая активность и хемотаксономическое значение: дис. докт. хим. наук / Гришковец Владимир Иванович. - Симферополь, 2004. - 460 с.

22. Verpoorte R. Biotechnology for the production of plant secondary metabolites / R. Verpoorte, A. Contin, J. Memelink // Phytochem. Rev. - 2002. - Vol. 1. - Pp. 13-25.

23. Кочкин Д. В., Суханова Е. С., Носов А. М. Закономерности накопления тритерпеновых гликозидов в цикле выращивания суспензионной культуры клеток Polyscias fruticosa // Вестник Поволжского государственного технологического университета. Сер.: Лес. Экология. Природопользование. - 2014. - №4 (24). - С. 67-73.

R e f e r e n c e s

1. Ha Thi Zung, Grushvickij I.V. Novyj vid roda Panax (Araliaceae) iz V'etnama // Botan. zhurn.

- 1985. - T. 70, № 4. - C. 518-522.

2. Kochkin D. V., Kachala V. V., Nosov A. M. Obnaruzhenie malonil-ginzenozida Rb1 v suspenzionnoj kul'ture kletok zhen'shenya Panax japonicus var. repens. Doklady RAN, 2011, 441 - 837-840.

3. Christensen L. P. // Adv. Food. Nutr. Res. - 2008. - V. 55. - P. 1-99.

4. Qi L. W., Wang C. Z., and Yuan C. S., Ginsenosides from American ginseng: chemical and pharmacological diversity, Phytochemistry. - 2011. - vol. 72. - pp. 689-699.

5. Ramachandra Rao S. and Ravishankar G. A., Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites, Biotechnol. Adv. - 2002. - vol. 20. - pp. 101-153.

6. Tuan T. T., Dieu-Hien T., Hoang C. N., Dieu-Thai T., Huyen-Trang N. T., Giap D. D., Ho N. H. Biomass accumulation of Panax vietnamensis in cell suspension cultures varies with addition of plant growth regulators and organic additives // Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 2017; 10(9): 907-915

7. Jacques P., Kevers C., Gaspar T., Dommes J., Thonart P. Conditioning Panax vietnamensis cell mass production in bioreactors // Acta Bot Gallica 2007; 154(1): 21-26.

8. Ho N. H., Duc L. T., Thanh N. T. Production of some in vitro materials of Ngoc Linh ginseng

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) with capable use in genetic transformation // In: Proceedings of Biotechnology Conference of Southern Provinces of Vietnam. Ho Chi Minh City, Vietnam: Science and Technology Publisher, 2009.

9. Nhut D. T., Luan V. Q., Binh N. V., Phong P. T., Huy B. N., Ha D. T., et al. The effects of some factors on in vitro biomass production of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) and preliminary analysis of saponin content // J. Biotechnol. Viet. - 2009; 7: 365-370.

10. Thanh N. T., Ket N. V., Paek K. Y. Effect of medium composition on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture of Panax vietnamensis Ha et Grushv // VNU J. Sci. Nat. Sci. Technol. -2007; 23: 269-274.

11. Nguyen V. K., Truong L. A., Nguyen H. U. D. Effecting of sucrose concentrations and inoculum density on adventitiuos root growth in cell suspension culture of Panax vietnamensis and initially growth in a bioreactor // Southeast Asian J. Sci. - 2012; 61: 811-817.

12. Frolova L. V., Smolenskaya I. N., Suhanova E. S. (sostaviteli). Vserossijskaya kollekciya kul'tur kletok vysshih rastenij (VKKK VR). http://www.cytspb.rssi.ru/rkkk/katalog4.pdf

13. Samygin G. A. Sravnenie raznyh metodov dlya ocenki zhiznesposobnosti kletok suspenzion-nyh i kallusnyh kul'tur / G. A. Samygin, L. A. Volkova, A. S. Popov // Fiziol. rast. - 1985. - T. 32, V. 4.

- S. 813-817.

14. Smirnova YU. N., Reshetnyak O. V., Smolenskaya I. N., Voevudskaya S. YU., Nosov A. M. Vliyanie regulyatorov rosta na sintez ginzenozidov v kul'ture kletok dvuh vidov zhen'shenya // Fiziologiya rastenij. -2010. - T. 57, № 3, - S. 458-466.

15. Nosov A. M. Metody ocenki i harakteristiki rosta kul'tur kletok vysshih rastenij. Molekulyarno-geneticheskie i biohimicheskie metody v sovremennoj biologii rastenij // Molekulyarno-geneticheskie i biohimicheskie metody v sovremennoj biologii rastenij, 487s (ISBN: 978-5-9963-0738-8). - BIONOM Moskva, 2011. - S. 386-403.

16. Murashige T. and Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant. - 1962, vol. 15. - pp. 473-497.

17. Demidova E. V. Sintez triterpenovyh glikozidov v suspenzionnoj kul'ture kletok Panax japonicus var. repens pri raznyh usloviyah vyrashchivaniya: diss. kand. biol. nauk // Demidova Elena Viktorovna. - Moskva, 2007. - 136 s.

18. Elyakov G. B., Ovodov YU. S. Glikozidy aralievyh // Himiya prirodnyh soedinenij. - 1972. - № 6.

- S. 697-709.

19. ZHuravlev YU. N., Kolyada A. S. ZHen'shen' i drugie ARALIACEAE // Vladivostok Dal'nauka, 1996.

- 280 s.

20. Kochkin D. V. Kachestvennyj i kolichestvennyj sostav triterpenovyh glikozidov kul'tur kletok in vitro predstavitelej semejstva Araliaceae (na primere Panax spp. i Polyscias spp.): avtoref. diss. kand. biol. nauk // Kochkin Dmitrij Vladimirovich. - M., 2012. - 28 c.

21. Grishkovec V. I. Triterpenovye glikozidy aralievyh: vydelenie, ustanovleniya stroeniya, biologich-eskaya aktivnost' i hemotaksonomicheskoe znachenie: dis. dokt. him. nauk / Grishkovec Vladimir Ivanovich.

- Simferopol', 2004. - 460 s.

22. Verpoorte R. Biotechnology for the production of plant secondary metabolites / R. Verpoorte, A. Contin, J. Memelink // Phytochem. Rev. - 2002. - Vol. 1. - Pp. 13-25.

23. Kochkin D. V., Suhanova E. S., Nosov A. M. Zakonomernosti nakopleniya triterpenovyh glikozi-dov v cikle vyrashchivaniya suspenzionnoj kul'tury kletok Polyscias fruticosa // Vestnik Povolzhskogo gosudarstvennogo tekhnologicheskogo universiteta. Ser.: Les. EHkologiya. Prirodopol'zovanie. - 2014.

- №4 (24). - S. 67-73.