ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ СВИНЕЙ ПРОТИВ ЦИРКОВИРУСА ТИПА 3 И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
IMMUNOGENIC COMPOSITIONS FOR IMMUNIZATION OF PIGS AGAINST CIRCOVIRUS TYPE 3 AND METHODS OF PRDUCTION AND APPLICATION THEREOF

[1] По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США № 62/248666, поданной 16 октября 2015 года и которая полностью включена в настоящее описание в виде ссылки.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[2] Заявка содержит список последовательностей, представленный в бумажном и в машиночитаемом формате, данные и содержание которого включены в настоящее описание в виде ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[3] Цирковирус свиней типа 2 (PCV2) был впервые спорадически идентифицирован у свиней с мультисистемным синдромом истощения после отъема (поросят от свиноматки) (PMWS) в Канаде в середине 1990-х годов. Эпидемии тяжелого системного заболевания, ассоциированного с PCV2, впоследствии были идентифицированы в Европе и Азии, а затем и в Северной Америке. Широкое использование коммерческих вакцин позволяет эффективно контролировать PCV2-ассоциированное заболевание (PCVAD), которое включает PMWS, пневмонию, синдром свиного дерматита и нефропатии (PDNS) и репродуктивную недостаточность. Ретроспективные исследования продемонстрировали, что PCV2 циркулировал среди свиней незаметно в течение нескольких десятилетий до того, как стал широкого распространенным клиническим заболеванием. Смена доминирующего генотипа с PCV2a на PCV2b, по-видимому, соответствует тяжелой форме PCVAD. Недавно новый вид цирковируса, названный цирковирусом свиней типа 3 (PCV3), был идентифицирован у свиноматок с клиническими симптомами, которые, как правило, ассоциированы с инфекцией PCV2; этот вид цирковируса также идентифицирован у абортированных плодов.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[4] Ткани брали от четырех свиноматок из фермы с хронической низкой репродуктивностью, смерть которых наступила внезапно и сопровождалась клиническими симптомами, соответствующими PDNS. Патологическое исследование тканей свиней выявило фиолетовые поражения кожи с остронекротическими поражениями дермы и эпидермиса, ассоциированные с кровоизлияниями и периваскулярными скоплениями лейкоцитов. В почках наблюдались расширенные почечные канальцы с кластерами лимфоцитов и макрофагов в интерстиции и клубочках и мягкая дисплазия в трубчатых эпителиальных клетках. Несмотря на макроскопические и микроскопические поражения, обычно наблюдаемые при инфекции PCV2, иммуногистохимия и количественная ПЦР (кПЦР) дали отрицательные результаты на наличие PCV2, а также вируса, вызывающего репродуктивный и респираторный синдром у свиней (PRRSV) и вируса гриппа A (IAV). Одновременно с этим на той же ферме собирали мумифицированных выкидышей от свиноматок с аналогичными повреждениями кожи. Результаты кПЦР также были отрицательными в отношении PCV2, а также вируса, вызывающего репродуктивный и респираторный синдром у свиней (PRRSV) и парвовируса свиней (PPV).
Sus scrofa
de novo
XhoI
[5] Пул тканевых гомогенатов получали от трех мумий, и выполняли секвенирование описанных выше вирусных метагеномов. Из 989478 собранных прочтений, 926380 картировали относительно эталонного генома . При сборке  несгруппированных прочтений получили 27 контигов (наборов перекрывающихся последовательностей). Большинство (54%) прочтений картировали в контиг длиной 1246 п.о., который согласно анализу BLASTN имел 98% гомологию с неполным цирковирусным геномом, обнаруженным в поставляемом на рынок мясе свиньи, подвергнутом метагеномному секвенированию. Остальные прочтения не показали сходства с известными эукариотическими вирусами. После этого выполняли амплификацию пула ДНК, полученных от мумий, по типу крутящегося кольца, а затем обратную ПЦР с использованием праймеров, перекрывающих сайт , содержащийся в цирковирусном контиге. Результаты электрофореза в агарозном геле показали наличие одной полосы размером примерно 2 кб. Геном длиной 2000 п.о. (SEQ ID No.1) определяли секвенированием по Сэнгеру с использованием перекрывающихся ампликонов, охватывающих весь геном.
Circovirus
[6] Генетический анализ позволил выявить открытую рамку считывания (ORF1, SEQ ID No.3), кодирующую предсказанный белок длиной 296 аминокислот (aa) (SEQ ID No.4), который по результатам BLASTP анализа оказался на 96% идентичным неполному белку, репликазе (rep), цирковируса PorkNW2/USA/2009 (номер доступа ADU77001, 221 aa) и на 54% идентичным 293 aa rep белку, определенному в Китае из цирковируса летучих мышей (номер доступа AIF76248). Консервативные вирусные домены rep и геликазы определили как aa 9-93 и 162-251 SEQ ID No.1, соответственно. Аналогично как в случае PorkNW2/USA/2009, не был определен подходящий инициирующий кодон, и был предложен альтернативный инициирующий кодон GTC или сплайсинг от расположенного выше ATG. Вторая ORF (ORF2, SEQ ID No.5) в противоположной ориентации кодировала предсказанный 214 aa белок (SEQ ID No.6) на 87% идентичный неполной последовательности (110 аа) капсидного (cap) белка PorkNW2/USA/2009 и на 36-37% идентичный капсидным белкам PCV2 и цировирусов уток (233 и 257 аа, соответственно). Аналогично другим cap белкам цирковируса, N-конец состоял из богатой аргинином области длиной примерно 32 аа. Третья ORF (ORF3, SEQ ID No.7), кодирующая предсказанный 233 аа белок (SEQ ID No.8), была на 94% идентична ORF, идентифицированной в неполном геноме циркувируса, полученном из говяжьего фарша, и на 39% идентична белку герпеса Murid с неизвестной функцией. Прогнозируемая точка начала репликации содержала структуру типа "стебель-петля" с нонамерной петлей, идентичной таковой у PCV1, TAGTATTAC (SEQ ID No.15), расположенной на кодирующей нити между rep и cap (фиг. 1). Учитывая общее генетическое и структурное сходство с представителями рода  и <70% аа идентичность капсидного белка с другими видами, этот вид упоминается в настоящей заявке как цирковирус свиней типа 3 (PCV3).
[7] Филогенетический анализ выполняли в MEGA с последовательностями, выровненными с помощью программы ClustalW. Филогенетический анализ выполняли с помощью метода максимального правдоподобия с наилучшим LG совпадением с моделью гамма-распределения с топологией типа "дерево" для 500 бутстрэп репликатов для последовательностей rep белка (фиг. 2). Показана шкала, представляющая количество аминокислотных изменений. Номера доступа в GenBank приведены в скобках. На фиг. 2 CaCV представляет собой циркувирус канареек; GuCV - циркувирус чаек; FiCV - цирковирус вьюрков; StCV - циркувирус скворцов; PiCV - цирковирус голубей; BFDV - вирус болезни клюва и пера; DuCV - цирковирус уток; GoCV - цирковирус гусей; SwCV - цирковирус лебедей; BtCV - цирковирус летучих мышей; PCV1 - цирковирус свиней типа 1; и PCV2 - цирковирус свиньи типа 2. Как показано на чертежах, PCV3 образует кластеры с PorkNW2/USA/2009, которые наиболее тесно связаны с цирковирусом летучих мышей из Китая. Интересно, что PCV1 и PCV2 также эволюционно связаны с другим цирковирусом летучих мышей из Мьянма (Myanmar).
[8] Гомогенаты тканей от трех разных мумий и гомогенаты легких от четырех свиноматок, которые умерли от PDNS, анализировали методом кПЦР, направленным на rep ген PCV3. Все мумии были положительными со значениями порогового цикла (Ct) 16,7-21,3. Три из четырех свиноматок также были положительными с величинами Ct, равными 27,7-29,7.
[9] Для определения частоты PCV3 проводили скрининг в общей сложности 271 образца назальных мазков, жидкостей из ротовой полости или гомогенатов легкого, полученные от свиней для диагностического тестирования, с помощью мультиплексированного анализа Taqman, направленного на гены rep и cap. Тридцать четыре (12,5%) образца оказались положительными по результатам обоих анализов с аналогичными значениями Ct. Два образца были положительными только по результатам анализа, направленного на cap PCV3. Значения Ct для положительных образцов составили 20,3-35,8.
E. coli
[10] Пептид, охватывающий 35-214 аа cap SEQ ID No.1, экспрессировали в виде N-терминального 6x-гистидин рекомбинантного белка в  и очищали аффинной хроматографией. Денактирующий электрофорез показал, что белок экспрессируется в виде димера, аналогично наблюдаемого для PCV2. ELISA выполняли, как описано выше. Восемнадцать образцов сыворотки от 3-недельных свиней из определенного стада, не зараженного патогеном, использовали в качестве отрицательных контролей, средняя оптическая плотность которых составила 0,49. Пороговое значение на положительный результат было установлено в виде трех стандартных отклонений выше среднего (OD>0,87). Сыворотки от десяти многократно рожавших свиноматок из той же фермы оказались положительными со средним значением OD, равным 1,27. Также были протестированы двадцать семь сывороток, полученных от молодых свиней фермы, которых выращивали для замены свиноматок; семнадцать (63%) дали положительный результат. Наконец, положительными оказались результаты, полученные для сорока шести (55%) из 83 образцов сыворотки (неизвестных животных), предоставленных для диагностического тестирования из нескольких штатов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
[11] Описанные ниже чертежи являются частью настоящего описание и включены с целью дальнейшей демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение может быть лучше понято со ссылкой на один или более из этих чертежей в комбинации с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленных в настоящем описании.
Фиг.1 представляет собой схему организации генома цирковируса свиньи типа 3; и
Фиг.2 представляет собой филогенетическое дерево белков-репликаз цирковируса.
[12] В настоящей заявке SEQ ID No.1 представляет собой нуклеотидную последовательность генома PCV3; SEQ ID No.2 представляет собой аминокислотную последовательность генома PCV3; SEQ ID No.3 представляет собой нуклеотидную последовательность репликазы (ORF1) PCV3; SEQ ID No.4 представляет собой аминокислотную последовательность репликазы (ORF1) PCV3; SEQ ID No.5 представляет собой нуклеотидную последовательность капсидного белка (ORF2) PCV3; SEQ ID No.6 представляет собой аминокислотную последовательность капсидного белка (ORF2) PCV3; SEQ ID No.7 представляет собой нуклеотидную последовательность ORF3 PCV3; SEQ ID No.8 представляет собой аминокислотную последовательность ORF3 PCV3; SEQ ID No.9 представляет собой нуклеотидную последовательность репликазы PCV3 с праймером 1; SEQ ID No.10 представляет собой нуклеотидную последовательность репликазы PCV3 с праймером 2; SEQ ID No.11 представляет собой нуклеотидную последовательность репликазы PCV3 с зондом; SEQ ID No.12 представляет собой нуклеотидную последовательность капсидного белка PCV3 с праймером 1; SEQ ID No.13 представляет собой нуклеотидную последовательность капсидного белка PCV3 с праймером 2; SEQ ID No.14 представляет собой нуклеотидную последовательность капсидного белка PCV3 с зондом; SEQ ID No.15 представляет собой сайт начала репликации, содержащий структуру типа "стебель-петля" с нонамерной петлей; SEQ ID No.16 представляет собой внутренний праймер cap гена; SEQ ID No.17 представляет собой внутренний праймер cap гена; SEQ ID No.18 представляет собой праймер для части гена PCV3, кодирующей аминокислоты (аа) 35-214; и SEQ ID No.19 представляет собой праймер для части гена PCV3, кодирующей аминокислоты (аа) 35-214.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[13] В приведенном ниже подробном описании и примерах изложены предпочтительные материалы и процедуры, используемые в соответствии с настоящим изобретением. Однако следует понимать, что это описание и примеры приведены только в качестве иллюстрации, и не должны рассматриваться как ограничивающие общий объем настоящего изобретения.
[14] Иммуногенные композиции и способы получения и применения таких композиций
[15] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения и/или извлечения рекомбинантного белка ORF2 PCV3 путем: 1) инфицирования нескольких восприимчивых клеток в культуре рекомбинантным вирусным вектором, кодирующим белок PCV3, 2) экспрессию белка PCV3 с помощью рекомбинантного вирусного вектора, 3) извлечение белка PCV3 и 4) отделение клеточного дебриса от экспрессированного белка PCV3 на этапе разделения.
[16] В другом аспекте настоящего изобретения включение стадии инактивации является предпочтительным для инактивации вирусного вектора до извлечения белка PCV3, который будет использоваться в иммуногенной или иммунологической композиции, такой как вакцина. Такая стадия может быть выполнена как стадия 5) дополнительно к описанным выше стадиям 1-4.
[17] В некоторых формах эту инактивацию проводят либо непосредственно перед, либо сразу после стадии фильтрации или отделения. Для целей настоящего изобретения можно использовать любой обычный способ инактивации. Таким образом, инактивацию можно выполнять химическими и/или физическими методами. Один из вариантов инактивации включает добавление циклизованного бинарного этиленимина (BEI).
[18] Описанный выше способ также необязательно может включать стадию нейтрализации после стадии 5). Например, если инактивирующим агентом является BEI, предпочтительным является добавление к эквивалентному количеству тиосульфата натрия. Для инактивации предпочтительно добавлять эквивалентное количество тиосульфата натрия по сравнению с добавлением BEI.
[19] "Иммуногенная или иммунологическая композиция" относится по существу к композиции, которая содержит по меньшей мере один антиген, вызывающий иммунологический ответ у хозяина клеточного и/или антитело-опосредованного иммунного ответа на представляющую интерес композицию или вакцину. Обычно "иммунологический ответ" включает, без ограничения, один или более из следующих эффектов: продуцирование или активацию антител, В-клеток, хелперных Т-клеток, супрессорных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток и/или yd T-клеток, направленных конкретно на антиген или антигены, включенные в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно, у хозяина будет наблюдаться либо терапевтический, либо защитный иммунологический ответ такой, при котором повышается устойчивость к новой инфекции и/или уменьшается клиническая тяжесть заболевания. Такая защита проявляется в уменьшении либо тяжести, либо проявления, вплоть до исчезновения, симптомов, обычно наблюдаемых у зараженного хозяина, более быстрым временем восстановления и/или уменьшенным вирусным титром в зараженном хозяине.
[20] В предпочтительных формах и особенно формах, в которых рекомбинантный белок PCV3 используется в иммуногенной композиции, такой как вакцина, каждая партия или только отдельные партии собранного белка PCV3 могут быть протестированы в отношении инактивации. Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения относится к тесту инактивации для определения эффективности инактивации рекомбинантного вирусного вектора, включающему стадии: 1) контактирования, по меньшей мере, части культуральной жидкости, содержащей рекомбинантный вирусный вектор, с инактивирующим агентом, 2) добавление нейтрализующего агента для нейтрализации инактивирующего агента и 3) определение остаточной инфицирующей способности.
[21] В предпочтительных формах рекомбинантный вирусный вектор, содержащий ДНК PCV3 и экспрессирующий белок PCV3, используемый для заражения клеток, получают путем трансфекции в вирусный вектор вектора переноса, который содержит клонированный в него ген PCV3. Предпочтительно, в вирусный вектор трансфицируют только часть вектора переноса, которая содержит требуемую ДНК PCV3, такую как ДНК, кодирующую ORF1, ORF2 или ORF3.
[22] Термин "трансфицированный в вирусный вектор" означает и используется как синоним "введению" или "клонированию" гетерологичной ДНК в вирусный вектор, такой как, например, бакуловирусный вектор. "Вектор переноса" означает молекулу ДНК, которая включает по меньшей мере один сайт начала репликации, гетерологичный ген, в данном случае PCV3, последовательности ДНК, позволяющие клонировать указанный гетерологичный ген в вирусный вектор. Предпочтительно последовательности, позволяющие клонировать гетерологичный ген в вирусный вектор, являются фланкирующими гетерологичный ген. Еще более предпочтительно, чтобы эти фланкирующие последовательности были гомологичными, по меньшей мере частично, последовательностям вирусного вектора. Гомология последовательностей позволяет далее выполнять рекомбинацию обеих молекул, вирусного вектора и вектора переноса, для получения рекомбинантного вирусного вектора, содержащего гетерологичный ген.
[23] В более предпочтительных формах способы по настоящему изобретению начинают с выделения ДНК PCV3. Для целей настоящего изобретения можно использовать любой ген PCV3. ДНК PCV3 предпочтительно амплифицируют методом ПЦР. Затем полученную ДНК клонируют в вектор переноса.
[24] Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу конструирования рекомбинантного вирусного вектора, содержащего ДНК PCV3. Этот способ обычно включает стадии: 1) клонирования по меньшей мере одного рекомбинантного гена PCV3 в вектор переноса; и 2) трансфекцию в вирусный вектор части вектора переноса, содержащего рекомбинантный ген PCV3, для получения рекомбинантного вирусного вектора. Как отмечено выше, ген PCV3 может кодировать ORF1, ORF2 или ORF3.
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
[25] Согласно другому аспекту, ДНК PCV3 может быть амплифицирована до стадии 1) , где фланкирующие последовательности ДНК PCV3 модифицируют. Методы  амплификации ДНК PCV3 и модификации фланкирующих последовательностей, клонирования  амплифицированной ДНК PCV3 в вектор переноса и подходящие векторы переноса, описаны выше или известны специалисту в данной области. Таким образом, в соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу конструирования рекомбинантного вирусного вектора, содержащего ДНК PCV3, и экспрессии требуемого белка PCV3, где способ включает стадии: 1) амплификации ДНК PCV3 , где фланкирующие последовательности ДНК PCV3 модифицируют, 2) клонирования амплифицированной ДНК ORF2 PCV3 в вектор переноса; и 3) трансфекции вектора переноса или его части, содержащей рекомбинантную ДНК PCV3, в вирусный вектор для генерации рекомбинантного вирусного вектора. В некоторых аспектах модификация фланкирующих последовательностей ДНК PCV3 осуществляется путем введения последовательности 5'-Козак и/или сайта EcoR 1.
in vitro
[26] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения композиции, содержащей белок PCV3, и инактивированный вирусный вектор. Этот способ обычно включает стадии: 1) клонирования амплифицированной ДНК PCV3 в вектор переноса; 2) трансфекции в вирус части вектора переноса, содержащей рекомбинантную ДНК PCV3; 3) инфицирование клеток в средах трансфицированным вирусным вектором; 4) осуществление экспрессиии трансфецированным вирусным вектором рекомбинантного белка с ДНК PCV3; 5) отделение клеток от суперната; 6) извлечение экспрессированного белка PCV3; и 7) инактивации рекомбинантного вирусного вектора. В предпочтительных формах и, как описано выше, стадия нейтрализации, стадия 8), выполняется после стадии 7). Конечно, перед стадией 1) ДНК PCV3 можно амплифицировать , предпочтительно с фланкирующими последовательностями ДНК PCV3, как описано выше.
[27] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции, предпочтительно иммуногенной композиции, такой как вакцина, для индукции иммунного ответа против PCV3. Как правило, этот способ включает стадии трансфекции конструкции в вирус, причем конструкция содержит 1) рекомбинантную ДНК ORF PCV3, 2) инфицирование клеток в ростовой среде трансфицированным вирусом, 3) обеспечение экспрессии вирусом рекомбинантного белка ORF PCV3, 4) извлечение экспрессированного рекомбинантного белка ORF, и 5) получение композиции путем объединения выделенного белка с подходящим адъювантом и/или другим фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления композиция также включает, по меньшей мере, часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ORF PCV3 и/или часть супернатата клеточной культуры.
[28] "Адъюванты", используемые в настоящем описании, могут включать гидроксид алюминия и фосфат алюминия, например, сапонины Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), эмульсию вода-в-масле, эмульсию масло-в-воде, эмульсию вода-в-масле в воде. Эмульсия может быть основана, в частности, на легком жидком парафиновом масле (европейский тип Фармакопеи); масле изопреноидной структуры, таком как сквален или скваленовое масло, полученном в результате олигомеризации алкенов, в частности изобутена или децена; сложных эфирах кислот или спиртов, содержащих линейную алкильную группу, более конкретно растительные масла, этилолеат, пропиленгликоль ди- (каприлат/капрат), глицерилтри-(каприлат/капрат) или диолеат пропиленгликоля; сложных эфирах разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности сложных эфиров изостеариновой кислоты. Масло используется в комбинации с эмульгаторами для образования эмульсии. Предпочтительными эмульгаторами являются неионные поверхностно-активные вещества, в частности сложные эфиры сорбитана, маннита (например, олеата ангидроманнита), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рицинолевой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно этоксилированы, и полиоксипропилен-полиоксиэтилен блок-сополимеры, в частности Плюроник продукты, в частности L121. См. Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D.E.S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997).
[29] Например, можно использовать эмульсию SPT, описанную на стр. 147 ʺVaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approachʺ edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995, и эмульсию MF59, описанную на стр. 183 этой же книги.
[30] Другим примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного. Преимущественными адъювантными соединениями являются полимеры акриловой или метакриловой кислоты, которые являются сшитыми, в частности с полиалкенильными эфирами сахаров или полиспиртов. Эти соединения известны под общим названием Карбомер (Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996). Специалисты в данной области техники также могут обратиться к патенту США №2909462, в котором описаны такие акриловые полимеры, сшитые с полигидроксилированным соединением, имеющим по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, причем атомы водорода по меньшей мере трех гидроксилов заменены ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере 2 атома углерода. Предпочтительными радикалами являются радикалы, содержащие от 2 до 4 атомов углерода, например, винильные, аллильные и другие этилен-ненасыщенные группы. Ненасыщенные радикалы могут сами содержать другие заместители, такие как метил. В частности подходящими являются продукты, продаваемые под названием Карбопол; (BF Goodrich, Ohio, USA). Они сшиты с аллилсахарозой или с аллилпентаэритритом. Среди них можно упомянуть Карбопол 974P, 934P и 971P; а среди сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного - сополимеры EMA (Monsanto), которые являются сополимерами малеинового ангидрида и этилена. Растворение этих полимеров в воде дает кислый раствор, который может быть нейтрализован предпочтительно до физиологического рН для получения раствора адъюванта, в который будет включена сама иммуногенная, иммунологическая композиция или вакцина.
[31] Другие подходящие адъюванты включают, без ограничения, среди прочего, адъювантную систему RIBI (Ribi Inc.), блок-сополимер (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), монофосфорильный липид A, липид-аминный адъювант Авридин, термолабильный энтеротоксин E.coli (рекомбинантный или полученный другим способом), холерный токсин, IMS 1314 или мурамилдипептид.
[32] Адъювант предпочтительно добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу. Более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу. Наиболее предпочтительно аъювант добавляют в количестве примерно 1 мг на дозу.
[33] В другом аспекте настоящего изобретения способ получения иммуногенной композиции, такой как вакцина, для индукции иммунного ответа против PCV3 включает стадии: 1) экспрессии и извлечения белка ORF PCV3, и 2) смешивания извлеченного белка с подходящим адъювантом. Стадия 1) экспрессии предпочтительно включает стадию, описанную для получения и извлечения белка PCV3. Другая необязательная стадия этого способа включает клонирование амплифицированной ДНК ORF PCV3 в первый вектор, вырезание ДНК ORF из первого вектора, и использование этой вырезанной ДНК ORF PCV3 для клонирования в вектор переноса. Стадия извлечения в этом способе предпочтительно также включает стадию отделения среды от клеток и клеточного дебриса. Это может быть выполнено любым традиционным способом, предпочтительно способом, содержащим фильтрование клеток, клеточного дебриса и питательных сред через фильтр с порами размером в пределах от примерно 0,45 мкм до примерно 1,0 мкм. Наконец, для этого аспекта, способ предпочтительно включает стадию инактивации вируса до включения извлеченного рекомбинантого белка ORF PCV3 в композицию. Если стадия инактивации включена, предпочтительным является также включение стадии нейтрализации, как описано выше.
in vitro
[34] Кроме того, композиция может включать один или более фармацевтически приемлемых или ветеринарно приемлемых носителей. Используемый в настоящем описании термин "фармацевтически приемлемый носитель" или "ветеринарно приемлемый носитель" включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, стабилизирующие агенты, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, поддерживающие изотоничность агенты, агенты, замедляющие адсорбцию и т.д. В одном из предпочтительных вариантов осуществления представленная в настоящем описании композиция содержит белок ORF PCV3, выделенный из культивируемых  клеток, где указанные клетки инфицированы рекомбинантным вирусным вектором, содержащим ДНК ORF PCV3 и экспрессирующим белок ORF PCV3, и где клеточную культуру обрабатывают, чтобы инактивировать вирусный вектор, и добавляют эквивалентную концентрацию нейтрализующего агента, а также добавляют адъювант и физиологический раствор. Как и в других аспектах, белок ORF PCV3 может представлять собой ORF1, ORF2 или ORF3. Количество физиологического солевого раствора, если содержится, предпочтительно составляет от примерно 50 до примерно 90% (об./об.), более предпочтительно от примерно 60 до 80% (об./об.), еще более предпочтительно примерно 70% (об./об.). Этот способ необязательно также может включать добавление защитного средства. Защитное средство, используемое в настоящем описании, относится к антимикробиологическому активному агенту, такому как, например, гентамицин, мертиолат и т.п. В частности, добавление защитного средства является наиболее предпочтительным для получения композиции для многократного приема. Эти антимикробиологические активные агенты добавляют в концентрации, эффективной для предотвращения любого микробиологического загрязнения представляющей интерес композиции или для подавления роста любого микробного агента в представляющей интерес композиции.
[35] Способы по настоящему изобретению также могут включать добавление любого стабилизирующего агента, такого как, например, сахариды, трегалозу, маннит, сахарозу и т.п., для увеличения и/или обеспечения срока годности продукта и/или для повышения стабильности.
[36] В другом аспекте настоящее изобретение относится к продуктам, полученным в результате описанных выше способов. В частности, настоящее изобретение по существу относится к композиции, содержащей рекомбинантно экспрессированный белок ORF PCV3. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления композиция по существу также содержит средство, подходящее для инактивации вирусных векторов, и содержит средство, подходящее для инактивации вирусных векторов. Такие продукты полезны в качестве иммуногенных композиций, которые индуцируют иммунный ответ, и более предпочтительно, обеспечивают защитный иммунитет против появления клинических признаков инфекции PCV3. Композиция обычно содержит полипептид или его фрагмент, экспрессируемый ORF1, ORF2, ORF3 или любую комбинацию одной или более из этих ORF PCV3 в качестве антигенного компонента композиции. Разумеется, понятно, что полипептид ORF PCF3, используемый в иммуногенной композиции в соответствии с настоящим изобретением, может быть получен любым способом, включая выделение и очистку, стандартный синтез белка и рекомбинантный способ.
[37] Клинические признаки инфекции PCV3 наблюдаются как после отъема в возрасте 6-8 недель, так и у растущих особей и кормящих свиней в возрасте 12-14 недель, а также спорадически в других возрастных группах. Клинические признаки включают появление обширных пурпурно-красных, слегка припухлых пятен различных размеров и форм над грудью, на животе, бедрах и передних конечностях. Со временем пятна покрываются темными корками, а затем исчезают, оставляя шрамы. Кроме того, свиньи находятся в состоянии депрессии, могут иметь повышенную температуру, обычно не хотят двигаться и есть, теряют в весе, тяжело дышат или страдают респираторным дистресс-синдромом, на конечностях и вокруг век можно наблюдать заметные отеки или жидкость, поверхностные лимфатические узлы могут быть увеличенными, щетина может стать грубой, а кожа - бледной, у них может наблюдаться желтуха, а у некоторых свиней даже диарея. Несмотря на высокую смертность, большинство свиней с поражением кожи умирают. Признаки инфекции PCV3 также можно обнаружить в желудке и кишечнике, такие как язва желудка и кровоизлияние, наличие жидкости в брюшной полости; повреждения могут быть обнаружены в легких, миндалинах, селезенке, печени и почках, размеры которых увеличены, и которые становятся бледными и испещренными многочисленными небольшими кровоизлияниями, проявляющимися на поверхности.
[38] Любая ORF PCV3 была бы эффективной в качестве источника ДНК ORF PCP3 и/или полипептида, используемого в настоящем описании. В предпочтительных формах ДНК ORF представляет собой ORF2. Предпочтительным белком ORF2 PCV3 является белок с SEQ ID No.6, но специалистам в данной области понятно, что эта последовательность, так же как и последовательность для ORF1 и ORF3, может отличаться на 10% при гомологии последовательностей, но сохранять при этом антигенные характеристики, которые делают ее полезной для использования в иммуногенных композициях. Антигенные характеристики иммунологической композиции могут быть, например, оценены путем проведения экспериментов. Более того, антигенная характеристика модифицированного антигена по-прежнему сохраняется, если модифицированный антиген обеспечивает по меньшей мере 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% защитного иммунитета по сравнению с белком ORF PCV3, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ ID No.3, 5 или 7. В некоторых формах иммуногенные части белка ORF PCV3 используются в качестве антигенного компонента в композиции. Используемый здесь термин "иммуногенная часть" относится к укороченным и/или замещенным формам или фрагментам белка и/или полинуклеотида ORF2 PCV3, соответственно. Предпочтительно такие укороченные и/или замещенные формы или фрагменты могут содержать по меньшей мере 6 смежных аминокислот из полноразмерного полипептида ORF. Более предпочтительно укороченные или замещенные формы или фрагменты могут иметь по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15 и еще более предпочтительно по меньшей мере 19 смежных аминокислот из полноразмерного полипептида ORF. Кроме того, понятно, что такие последовательности могут быть частью более крупных фрагментов или укороченных форм. Предпочтительно такие укороченные или замещенные формы или фрагменты могут содержать по меньшей мере 18 смежных нуклеотидов из полноразмерной нуклеотидной последовательности ORF, например, SEQ ID No.3, 5 или 7. Более предпочтительно укороченные или замещенные формы или фрагменты могут иметь по меньшей мере 30, более предпочтительно по меньшей мере 45 и еще более предпочтительно по меньшей мере 57 смежных нуклеотидов из полноразмерной ORF нуклеотидной последовательности.
[39] "Идентичность последовательностей", как известно в данной области, относится к взаимосвязи между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, а именно между эталонной и заданной последовательностью, сравниваемой с эталонной последовательностью. Идентичность последовательностей определяется путем сравнения заданной последовательности с эталонной последовательностью после оптимального выравнивания последовательностей, обеспечивающего наибольшую степень сходства последовательностей, определенную путем совпадений между нитями таких последовательностей. При таком выравнивании идентичность последовательностей устанавливается по принципу позиционного сравнения, например, последовательности являются "идентичными" по конкретному положению, если в этом положении нуклеотиды или аминокислотные остатки являются идентичными. Общее количество таких позиционных идентичностей затем делят на общее количество нуклеотидов или остатков в эталонной последовательности, получая процент идентичности последовательностей. Идентичность последовательностей может быть легко вычислена известными способами, включая, без ограничения, способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки. Предпочтительные методы определения идентичности последовательностей предназначены для определения наибольшим соответствием между тестируемыми последовательностями. Методы определения идентичности последовательностей реализованы в общедоступных компьютерных программах, которые определяют идентичность между заданными последовательностями. Примеры таких программ включают, без ограничения, пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). Программа BLASTX находится в общем доступе в NCBI и других источниках (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки. Выравнивание последовательностей с помощью этих программ осуществляется путем назначения заданных по умолчанию штрафов за открытие разрыва (гэпа) для получения наивысшего уровня идентичности последовательностей между заданной и эталонной последовательностями. В качестве иллюстрации, полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% "идентичность последовательности" с эталонной нуклеотидной последовательностью, означает, что нуклеотидная последовательность заданного полинуклеотида идентична исходной последовательности, за исключением того, что заданная полинуклеотидная последовательность может включать до 15, предпочтительно до 10, еще более предпочтительно до 5 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов эталонной нуклеотидной последовательности. Другими словами, в полинуклеотиде с нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% идентичность с эталонной нуклеотидной последовательностью, до 15%, предпочтительно 10%, более предпочтительно 5% от общего количества нуклеотидов в эталонной последовательности могут быть удалены или замещены другим нуклеотидом, или до 15%, предпочтительно 10%, более предпочтительно 5% от общего количества нуклеотидов в эталонной последовательности могут быть вставлены в эталонную последовательность. Эти мутации эталонной последовательности могут встречаться в 5'- или 3'-концевых положениях эталонной нуклеотидной последовательности или в любом месте между этими конечными положениями либо по отдельности среди нуклеотидов эталонной последовательности, либо в виде одной или более смежных групп в эталонной последовательности. Аналогично, полипептид с заданной аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью, означает, что данная аминокислотная последовательность полипептида идентична эталонной последовательности, за исключением того, что данная полипептидная последовательность может включать до 15, предпочтительно до 10, более предпочтительно до 5 изменений аминокислот на каждые 100 аминокислот эталонной аминокислотной последовательности. Другими словами, для получения заданной полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 85%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95% идентичности последовательности с эталонной аминокислотной последовательностью, до 15%, предпочтительно до 10%, еще более предпочтительно до 5% аминокислотных остатков в эталонной последовательности могут быть удалены или замещены другой аминокислотой, или несколько аминокислот в количестве до 15%, предпочтительно до 10%, более предпочтительно до 5% от общего количества аминокислотных остатков в эталонной последовательности могут быть вставлены в эталонную последовательность. Эти изменения эталонной последовательности могут встречаться в амино- или карбокси-терминальных положениях эталонной аминокислотной последовательности или в любом месте между этими терминальными положениями либо по отдельности среди остатков эталонной последовательности, либо в виде одной или более смежных групп в эталонной последовательности. Предпочтительно, положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Однако при определении идентичности последовательности консервативные замены не рассматриваются как совпадение.
[40] "Гомология последовательностей", как используется в настоящем описании, относится к способу определения родства двух последовательностей. Чтобы определить гомологию последовательностей, две или более последовательности оптимально выравнивают, и при необходимости вводят разрывы. Однако, в отличие от "идентичности последовательностей", при определении гомологии последовательностей консервативные аминокислотные замены рассматриваются как совпадение. Другими словами, для получения полипептида или полинуклеотида, имеющего 95% гомологию последовательности с эталонной последовательностью, 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% аминокислотных остатков или нуклеотидов в эталонной последовательности должны совпадать или содержать консервативную замену на другую аминокислоту или нуклеотид, или в эталонную последовательность могут быть вставлены аминокислоты или нуклеотиды в количестве до 15%, предпочтительно до 10%, более предпочтительно до 5% от общего количества аминокислотных остатков или нуклеотидов в эталонной последовательности, не включая консервативные замены. Предпочтительно гомологичная последовательность содержит, по меньшей мере, участок из 50, более предпочтительно 100, еще более предпочтительно 250, еще более предпочтительно 500 нуклеотидов.
[41] "Консервативная замена" относится к замене аминокислотного остатка или нуклеотида другим аминокислотным остатком или нуклеотидом, имеющим схожие характеристики или свойства, включая размер, гидрофобность и т.д., такие, при которых общая функциональность существенно не изменяется.
[42] "Изолированный" означает измененный "действиями человека" по отношению к естественному состоянию, т.е., если что-то встречается в природе, оно было изменено или удалено из своего первоначального окружения, или то и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, естественно присутствующий в живом организме, не "изолирован", но такой же полинуклеотид или полипептид, отделенный от материалов, сосуществующих с ним в его естественном состоянии, "изолирован", согласно тому, как этот термин используется в настоящем описании.
[43] В следующем аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, эффективной для уменьшения тяжести клинических симптомов, ассоциированных с инфекцией PCV3, содержащей белок ORF PCF3. Предпочтительно белок ORF2 PCV3 выбирают из группы, состоящей из: 1) полипептида, содержащего последовательность SEQ ID No.4, 6, 8 или любую их комбинацию; 2) любого полипептида, который по меньшей мере на 90% гомологичен полипептиду 1); 3) любой иммуногенной части полипептидов 1) и/или 2); 4) иммуногенной части 3), содержащей по меньшей мере 10 смежных аминокислот, включенных в последовательности SEQ ID No.4, 6 или 8; 5) полипептида, эквивалентного (из-за вырожденности генетического кода) полипептиду, кодируемому ДНК, содержащей последовательность SEQ ID No.3, 5 или 7; 6) любого полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который по меньшей мере на 80% гомологичен полинуклеотиду 5); 7) любой иммуногенной части полипептидов, кодируемых полинуклеотидом 5) и/или 6); или 8) иммуногенной части 7), где полинуклеотид, кодирующий указанную иммуногенную часть, содержит по меньшей мере 30 смежных нуклеотидов, включенных в последовательности SEQ ID No.3, 5 или 7.
[44] В предпочтительных формах эти иммуногенные части могут иметь иммуногенные характеристики белка ORF PCV3, который кодируется последовательностью SEQ ID No.3, 5 или 7.
[45] Согласно еще одному аспекту, белок ORF2 PCF3 представлен в иммунологической композиции на уровне включения антигена, эффективном для индукции желаемого иммунного ответа, а именно для уменьшения частоты появления или уменьшения тяжести клинических признаков, возникающих в результате инфекции PCV3. Предпочтительно, уровень включения белка ORF2 PCV3 составляет, по меньшей мере, 0,2 мкг антигена/мл готовой иммуногенной композиции (мкг/мл), более предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/мл.
[46] Полипептид включен в композицию, которая может быть введена животному, восприимчивому к инфекции PCV3. В предпочтительных формах композиция также может включать дополнительные компоненты, известные специалистам в данной области (см. также Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton).
[47] Специалисту в данной области понятно, что композиция по настоящей заявке может включать известные инъекционные, физиологически приемлемые стерильные растворы. Для приготовления готового к употреблению раствора для парентеральной инъекции или инфузии можно использовать готовые водные изотонические растворы, такие как, например, физиологический раствор или соответствующие растворы белков плазмы. Кроме того, иммуногенные и вакцинные композиции по настоящему изобретению могут включать разбавители, поддерживающие изотоничность агенты, стабилизаторы или адъюванты. Разбавители могут включать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и т.п. Поддерживающие изотоничность агенты могут включать, среди прочих, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают, среди прочего, альбумин и соли щелочных металлов этилендиаминтетрауксусной кислоты. Подходящими адъювантами являются описанные выше адъюванты.
[48] Согласно еще одному аспекту иммуногенная композиция по настоящему изобретению дополнительно включает фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно фосфатную соль в физиологически приемлемых концентрациях. Предпочтительно рН указанной иммуногенной композиции доводят до физиологического значения рН, что означает примерно от 6,5 до 7,5.
[49] Описанные в настоящей заявке иммуногенные композиции могут дополнительно включать один или более других иммуномодулирующих агентов, таких как, например, интерлейкины, интерфероны или другие цитокины. Иммуногенные композиции могут также включать гентамицин и мертиолат. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет вакцинные композиции, содержащие от примерно 1 мкг до примерно 60 мкг/мл антибиотиков и более предпочтительно менее примерно 30 мкг/мл антибиотиков.
[50] Обнаружено, что иммуногенные композиции, содержащие рекомбинантный белок ORF PCV3, как предусмотрено в настоящем описании, очень эффективны для уменьшения тяжести или частоты появления клинических признаков, ассоциированных с инфекциями PCV3, вплоть до предотвращения появления таких признаков.
[51] Другой аспект настоящего изобретения относится к набору. Как правило, набор включает контейнер, содержащий по меньшей мере одну дозу иммуногенной композиции белка ORF PCV3, как указано в настоящем описании, где одна доза содержит по меньшей мере 2 мкг белка ORF PCF3. Указанный контейнер может содержать от 1 до 250 доз иммуногенной композиции. В некоторых предпочтительных формах контейнер содержит 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200 или 250 доз иммуногенной композиции белка ORF PCV3. Предпочтительно каждый из контейнеров, содержащих более одной дозы иммуногенной композиции белка ORF PCV3, дополнительно содержит антимикробиологический активный агент. Этими агентами являются, например, антибиотики, включая гентамицин и мертиолат и т.п. Таким образом, один из аспектов настоящего изобретения относится к контейнеру, который содержит от 1 до 250 доз иммуногенной композиции белка ORF PCV3, причем одна доза содержит по меньшей мере 2 мкг белка ORF PCV3 и гентамицин и/или мертиолат, предпочтительно от примерно 1 мкг/мл до примерно 60 мкг/мл антибиотиков и более предпочтительно менее примерно 30 мкг/мл. В предпочтительных формах набор также включает инструкцию по применению, содержащую информацию для внутримышечного введения по меньшей мере одной дозы иммуногенной композиции белка ORF PCV3 животным, предпочтительно свиньям и поросятам, для уменьшения частоты и/или тяжести клинических симптомов, ассоциированных с инфекцией PCV3. Кроме того, в соответствии с еще одним аспектом упомянутая инструкция по применению содержит информацию о втором или последующем введении(введениях) по меньшей мере одной дозы иммуногенной композиции ORF2 PCF3, где второе введение или любое последующее введение происходит по меньшей мере через 14 дней после первоначального или любого предшествующего введения. В некоторых предпочтительных формах упомянутая инструкция также включает информацию о введении иммунного стимулятора. Предпочтительно, указанный иммунный стимулятор должен быть введен как минимум два раза. Между первым и вторым или любым последующим введением иммуностимулятора предпочтительно проходит по меньшей мере 3, более предпочтительно по меньшей мере 5 и еще более предпочтительно по меньшей мере 7 дней. Предпочтительно иммунный стимулятор вводят по меньшей мере через 10 дней, предпочтительно 15, еще более предпочтительно 20, и еще более предпочтительно по меньшей мере 22 дня после первоначального введения иммуногенной композиции белка ORF PCV3. Понятно, что также может быть использован любой иммунный стимулятор, известный специалисту в данной области. "Иммунный стимулятор", используемый в настоящей заявке, означает любой агент или композицию, которая может вызывать общий иммунный ответ, предпочтительно без индукции или увеличения специфического иммунного ответа, например иммунного ответа к конкретному патогену. Согласно инструкции, также предлагается вводить иммунный стимулятор в подходящей дозе. Набор также может содержать второй контейнер, включающий по меньшей мере одну дозу иммунного стимулятора.
[52] Еще один аспект настоящего изобретения относится к набору, как описано выше, содержащему иммуногенную композицию ORF PCV3, как предусмотрено настоящим изобретением, и инструкцию по применению, причем инструкция по применению дополнительно включает информацию о том, что иммуногенную композицию ORV PCV3 следует вводить совместно, или примерно в то же самое время, что и иммуногенную композицию, содержащую дополнительный антиген, эффективный для уменьшения тяжести или частоты появления клинических признаков, ассоциированных с другим патогеном свиней. Предпочтительно инструкция содержит информацию о том, когда следует вводить композицию, содержащую ORF PCV3, и иммуногенную композицию, содержащую дополнительный антиген.
[53] Еще один аспект относится к применению любой из представленных в настоящем описании композиций, в качестве лекарственного средства, предпочтительно в качестве ветеринарного лекарственного средства, еще более предпочтительно в качестве вакцины. Кроме того, настоящее изобретение также относится к применению любой из описанных в настоящей заявке композиций для получения лекарственного средства для уменьшения тяжести клинических симптомов, ассоциированных с инфекцией PCV3. Предпочтительно лекарственное средство предназначено для предотвращения инфицирования свиней PCV3, еще более предпочтительно поросят.
[54] Еще один аспект относится к способу (1) профилактики инфекции или повторного инфицирования PCV3 или (2) уменьшению частоты появления или тяжести или устранению клинических симптомов, вызванных PCV3 у пациента, включающему введение любой из предоставленных в настоящей заявке иммуногенных композиций пациенту. Предпочтительно, пациентом является свинья. Понятно, что уменьшение происходит по сравнению с пациентом, который не получал композицию по настоящему изобретению. Предпочтительно вводят одну или две дозы иммуногенной композиции, причем одна доза предпочтительно содержит по меньшей мере примерно 2 мкг белка ORF PCV3. Еще один аспект относится к описанному выше способу лечения, содержащему второе введение иммуногенной композиции. Предпочтительно второе введение выполняют, используя ту же самую иммуногенную композицию, предпочтительно с тем же количеством белка ORF PCV3. Предпочтительно второе введение выполняют по меньшей мере через 14 дней после первоначального введения, еще более предпочтительно, по меньшей мере через 4 недели после первоначального введения. В предпочтительных формах способ эффективен сразу после введения одной дозы иммуногенной композиции, при этом для обеспечения защиты у пациента второе или последующее введение не требуется.
[55] Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к поливалентной комбинированной вакцине, которая включает иммунологический агент, эффективный для уменьшения частоты или степени тяжести инфекции PCV3, и по меньшей мере один иммунологически активный компонент, направленный против другого организма, вызывающего болезнь у свиней.
[56] В частности, иммунологический агент, эффективный для уменьшения частоты или тяжести инфекции PCV3, представляет собой антиген PCV3. Предпочтительно, указанный антиген PCV3 представляет собой белок ORF PCV3, как предусмотрено в настоящей заявке, или любую описанную выше иммуногенную композицию, которая содержит белок ORF PCV3. Белок ORF PCV3 может представлять собой ORF1, ORF2, ORF3 или любую их комбинацию. Например, ORF1 в комбинации с ORF2, ORF2 в комбинации с ORF3, ORF1 в комбинации с ORF3 и комбинация ORF1, 2 и 3, являются возможными комбинациями ORF PCV3, которые могут быть объединены в одной иммуногенной композиции. В предпочтительных формах ORF представляет собой ORF2 или комбинацию, включающую ORF2.
[57] Термины "иммуногенный белок", "иммуногенный полипептид" или "иммуногенная аминокислотная последовательность", как используется в настоящем описании, относятся к любой аминокислотной последовательности, которая вызывает иммунный ответ у хозяина против патогена, содержащего указанный иммуногенный белок, иммуногенный полипептид или иммуногенную аминокислотную последовательность. "Иммуногенный белок", "иммуногенный полипептид" или "иммуногенная аминокислотная последовательность", используемая в настоящей заявке, включает полноразмерную последовательность любых белков, их аналогов или их иммуногенные фрагменты. Под "иммуногенным фрагментом" подразумевается фрагмент белка, который включает один или более эпитопов и, таким образом, вызывает иммунный ответ к соответствующему патогену. Такие фрагменты могут быть идентифицированы любым количеством методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области техники. См., например, протоколы картирования эпитопов в Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Например, линейные эпитопы могут быть определены, например, путем одновременного синтеза большого количества пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих частям белковой молекулы, и путем реакции пептидов с антителами, при этом пептиды все еще прикреплены к подложкам. Такие способы известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 4708871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. Аналогичным образом, конформационные эпитопы можно легко идентифицировать путем определения пространственной конформации аминокислот, например, методом рентгеновской кристаллографии и методом двумерного ядерного магнитного резонанса. См., например, протоколы картирования эпитопов, см. выше. Это определение также включает синтетические антигены, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетически полученные антигены. См., например, Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998.
Actinobacillus pleuropneumonia
Bordetella bronchiseptica
Brachyspira spp
B. hyodyentheriae; B. piosicoli, Brucella suis
Clostridium spp
Cl. difficile
Cl. perfringens
Cl. novyi, Cl.septicum, Cl. tetani;
Eperythrozoonosis suis; Erysipelothrix rhsiopathiae;
Escherichia coli; Haemophilus parasuis
Lawsonia intracellularis;
Leptospira spp
Leptospira australis; Leptospira canicola; Leptospira grippotyphosa; Leptospira icterohaemorrhagicae
Leptospira interrogans; Leptospira pomona; Leptospira tarassovi; Mycobacterium spp
M. avium; M. intracellulare;
M.bovis
Mycoplasma hyopneumoniae
M hyo
Pasteurella multocida
Salmonella spp
S. thyhimurium
S. choleraesuis
Staph. hyicus; Staphylococcus spp
Streptococcus spp
Strep. suis
Leptospira Hardjo
Mycoplasma hyosynoviae
,
;
;
[58] Другой вызывающий болезнь организм у свиней предпочтительно выбирают из группы, состоящей из: ; аденовируса; альфавируса, такого как вирусы восточного лошадиного энцефаломиелита; ; ., предпочтительно , предпочтительно биоваров 1, 2 и 3; вируса классической чумы свиней; ., предпочтительно  типов A, B и C,  коронавирса, предпочтительно свиного респираторного коронавируса; , предпочтительно подтипов 1, 7 и 14; вируса гемагглютинирующего энцефаломиелита; вируса японского энцефалита; .; ; и . предпочтительно и ();; свиного цитомегаловируса; свиного парвовируса; вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS); псевдорецепторного вируса; ротавируса; .; предпочтительно ;и . предпочтительно ., предпочтительно; вируса свиного герпеса; вируса свиного гриппа; вируса свиной оспы; вируса свиной оспы; вируса везикулярного стоматита; вируса везикулярной экзантемы свиней; ; и/или .
[59] Используемый в настоящем описании "иммунологический активный компонент" означает компонент, который индуцирует или стимулирует иммунный ответ у животного, которому вводится указанный компонент. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления указанный иммунный ответ направлен на указанный компонент или на микроорганизм, содержащий указанный компонент. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления иммунологический активный компонент представляет собой аттенуированный микроорганизм, включающий модифицированный живой вирус (MLV), убитый микроорганизм или, по меньшей мере, иммунологическую активную часть микроорганизма.
[60] "Иммунологическая активная часть микроорганизма", как используется в настоящем описании, означает фракцию, содержащую белок, сахар и/или гликопротеин микроорганизма, который содержит по меньшей мере один антиген, индуцирующий или стимулирующий иммунный ответ у животного, которому вводят указанный компонент. Согласно предпочтительному варианту осуществления указанный иммунный ответ направлен на указанную иммунологическую активную часть микроорганизма или микроорганизм, содержащий указанную иммунологическую активную часть.
[61] В другом аспекте настоящее изобретение относится к инфекционным химерным ДНК-клонам цирковируса свиней (PCV3) и живым химерным вирусам, полученным из ДНК-клонов, которые могут быть использованы в качестве вакцин. Новые живые химерные, генетически авирулентные вирусы получают из непатогенной геномной структуры PCV1, в которой иммуногенный ген патогенного штамма PCV3 заменен геном из PCV1, как правило, в таком же соответствующем положении. В объем изобретения также входят биологически функциональные плазмиды, вирусные векторы и т.п., которые содержат описанные в настоящей заявке новые молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, подходящие клетки-хозяева, трансфицированные векторами, содержащими эту ДНК и продукты экспрессии иммуногенных полипептидов. В объем настоящего изобретения входит новый способ защиты свиней или обеспечение защитного действия от вирусной инфекции или появления клинических признаков, описанных выше, а также от мультисистемного синдрома истощения после отъема (PMWS), пневмонии, репродуктивной недостаточности и синдрома свиного дерматита и нефропатии (PDNS), вызываемых PCV3, где указанный способ включает введение нуждающейся в такой защите свинье иммунологически эффективного количества вакцины, содержащей, например, клонированную в плазмиду химерную ДНК, химерный вирус, полученный из химерного ДНК-клона, полипептидные продукты, экспрессированные из описанной в настоящей заявке ДНК, или любую их комбинацию. Другой аспект изобретения относится к новым мутантам иммуногенного капсидного гена и белка PCV3 и введению мутаций в химерные клоны для облегчения роста культуры клеток и обеспечения безопасности вакцин. В другом аспекте предоставляются новая инфекционная молекулярная ДНК PCV3 и реципрокные химерные ДНК-клоны PCV, которые полезны в качестве экспериментальных моделей для получения или характеристики новых авирулентных вирусных вакцин.
[62] В соответствии с одним из аспектов настоящее изобретение относится к молекулам инфекционной молекулярной и химерной нуклеиновой кислоты свиного цирковируса (PCV), живым химерным вирусам, полученным из молекулы химерной нуклеиновой кислоты, и ветеринарным вакцинам для защиты свиней от вирусной инфекции, пневмонии, репродуктивной недостаточности, PMWS и/или PDNS, вызываемых PCV3. Изобретение также включает иммуногенные продукты экспрессии полипептидов, которые могут быть использованы в качестве вакцин. Новая авирулентная, инфекционная химерная молекула ДНК PCV (PCV1-3) содержит в геноме PCV1 молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую инфекционный, непатогенный PCV1, который содержит иммуногенный ген открытой рамки считывания (ORF) патогенного PCV3 вместо гена ORF PCV1. Инфекционный химерный ДНК-клон PCV1-3 предпочтительно содержит иммуногенный капсидный ген (ORF2) ДНК PCV3, клонированной в геномный остов инфекционного, непатогенного клона ДНК PCV1. Как правило, капсидным геном ДНК PCV3 заменяют ген ORF2 ДНК PCV1 в непатогенной геномной структуре PCV1, но предполагается, что с помощью генной инженерии можно создать множество позиционных перестановок для получения других авирулентных или аттенуированных химерных ДНК-клонов. Раскрыт реципрокный химерный инфекционный ДНК-клон PCV3-1 между PCV1 и PCV3, используемый в качестве контроля для анализа химерного клона PCV1-3 по изобретению, который сконструирован путем замены капсидного гена PCV3 геном PCV1 в остове патогенного инфекционного ДНК-клона PCV3. В дополнение к экспериментальной модели, реципрокный химерный ДНК-клон PCV3-1 может найти применение при изготовлении специально разработанных вакцин.
[63] В других формах ORF3 PCV3 может быть замещена ORF2 или ORF3 инфекционного клона PCV1-3 или PCV3-1. В других предпочтительных формах ORF1 и ORF3 PCV3 могут быть заменены ORF2 PCV3 инфекционного клона PCV1-3 или PCV3-1.
in vitro
in vivo
[64] Ниже показано, что описанная в настоящей заявке клонированная геномная ДНК PCV3 является  и  инфекционной при трансфекции в клетки PK-15 и трансфицируется в организм свиней. Инфекционные ДНК-клоны PCV3 вызывают патологические поражения, характерные для PMWS и PDNS у свиней, что позволяет улучшить определение характеристик клинического заболевания и понимание распространения вируса в тканевых клетках. Этот новый, легко воспроизводимый патогенный агент является пригодным для использования в разработке подходящей программы вакцинации для предотвращения PMWS и PDNS у свиней.
in vitro
in vivo
[65] Инфицировать свиней новым химерным ДНК-клоном PCV1-3 также можно как путем трансфекции  клеток PK-15, так и путем введения . В трансфицированных клетках PK-15 один предпочтительный химерный ДНК-клон PCV1-3 может экспрессировать капсидный антиген ORF2 PCV3 (иммуногенный капсидный белок PCV3), тогда как реципрокный химерный ДНК-клон PCV3-1 может экспрессировать капсидный антиген PCV1, что может быть продемонстрировано с помощью иммунофлуоресцентного анализа (IFA) с использованием антител, специфичных к капсидному антигену PCV1 или PCV3. Сероконверсия в PCV3-специфическое антитело будет обнаруживаться у свиней, которым инокулирован инфекционный клон PCV3, а также химерный клон PCV1-3. Обнаружение сероконверсии в PCV3-специфическое антитело позволяет установить, что химерный ДНК-клон PCV1-3 индуцирует PCV3-специфическое антитело у инфицированных свиней и, следовательно, обеспечивает защиту инокулированных свиней от инфекции PCV3.
in vitro
in vivo
[66] Неожиданно было обнаружено, что химерный инфекционный ДНК-клон PCV1-3, имеющий иммуногенный капсидный ген (ORF2) патогенного PCV3, клонированный в непатогенный геномный остов PCV1, может индуцировать специфический антительный ответ на патогенный капсидный антиген PCV3, однозначно при этом исключительно непатогенный характер PCV1 у свиней. Животные, инокулированные химерным инфекционным ДНК-клоном PCV1-3, могут вырабатывать умеренно выраженную инфекцию, похожую на инфекцию у животных, которым инокулировали PCV1, в результате сероконверсии в антитело к капсидному белку ORF2 патогенного PCV3. Средняя продолжительность виремии, наблюдаемой у животных с инокулированными PCV1 и химерными PCV1-3, будет короче, чем у животных с инокулированным патогенным PCV3. Отсутствие обнаруживаемой виремии химерной PCV1-3 у некоторых инокулированных животных не повлияет на сероконверсию в антитело к капсидному белку ORF2 PCV3 у PCV1-3-инокулированных свиньях. Согласно полученным результатам, несмотря на короткую и недетектируемую у некоторых инокулированных животных виремию химерной PCV1-3, химерный вирус PCV1-3 способен индуцировать антительный ответ к капсидному белку ORF2 PCV3. Особая способность химерного инфекционного ДНК-клона PCV1-3 индуцировать иммунный ответ, специфичный к патогенному иммуногенному капсидному белку ORF2 PCV3, все еще непатогенному для свиней, делает химерный клон(клоны) PCV1-3 особенно полезным в качестве созданной методом генной инженерии живой аттенуированной вакцины и вакцин других типов. Подходящие клетки, содержащие молекулу химерной нуклеиновой кислоты, будут однозначно продуцировать живые, инфекционные цирковирусы свиней. В некоторых предпочтительных формах живой, инфекционный химерный вирус получают из химерного ДНК-клона путем  и  трансфекции клеток PK-15. В изобретении также предусмотрено получение химерного вируса из комплементарной цепи или нуклеотидных последовательностей, имеющих высокую гомологию, по меньшей мере 90%, более предпочтительно 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% с химерной нуклеотидной последовательностью.
[67] В объем настоящего изобретения также включены биологически функциональные плазмиды, вирусные векторы и т.п., которые содержат описанные в настоящей заявке новые молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, подходящие клетки-хозяева, трансфицированные векторами, содержащими химерные и молекулярные ДНК-клоны и иммуногенные полипептидные продукты экспрессии. Некоторые особенно предпочтительные иммуногенные белки могут иметь аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID No.4, 6 или 8. В объем изобретения также включены их биологически активные варианты. Специалист в данной области техники знает, каким образом можно модифицировать, заменить, удалить и т.д. аминокислоту(аминокислоты) из полипептидной последовательности и продуцировать биологически активные варианты, которые сохраняют такую же или практически такую же активность, что и родительская последовательность, не прилагая при этом чрезмерных усилий.
[68] Для получения иммуногенных полипептидных продуктов по настоящему изобретению способ может включать следующие стадии: выращивание в подходящих питательных условиях прокариотических или эукариотических клеток-хозяев, трансфицированных описанными в настоящей заявке новыми молекулами рекомбинантной нуклеиновой кислоты способом, позволяющим экспрессию указанных полипептидных продуктов, и выделение требуемых полипептидных продуктов экспрессии указанных молекул нуклеиновой кислоты стандартными способами, известными в данной области. Предполагается, что иммуногенные белки могут быть получены другими способами, такими как, например, биохимический синтез и т.п.
[69] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к новым мутациям в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях иммуногенного капсидного гена и белка PCV3. PCV3 является возбудителем PMWS, PDNS, пневмонии и репродуктивной недостаточности, тогда как цирковирус свиней типа I (PCV1), полученный из культуры клеток PK-15, является непатогенным для свиней. Вакцина PCV1-3, содержащая мутацию, может быть дополнительно протестирована в культуре клеток с помощью рутинных процедур для выбора комбинации, которая способствует росту культуры клеток или обеспечивает более высокие меры безопасности при вакцинации свиней благодаря дополнительному ослаблению вирулентных свойств PCV3, в случае их персистирования. Несмотря на преимущество химеры PCV1-3, состоящее в ее природной авирулентной особенности, альтернативное применение мутированной ORF2 PCV3 для получения химеры PCV1-3 предоставляет другой вариант настоящего изобретения, доступный в случае, если дополнительное усиление безопасности вакцины природной живой химеры является оправданным.
[70] Вакцины химерных вирусных и молекулярных ДНК-клонов и способы их применения также включены в объем настоящей заявки. Инокулированные свиньи защищены от серьезной вирусной инфекции, пневмонии, репродуктивной недостаточности, PDNS и PMWS, вызванных PCV3. Новый способ защищает свиней, нуждающихся в защите от вирусной инфекции, пневмонии, репродуктивной недостаточности, PDNS или PMWS, путем введения свиньям иммунологически эффективного количества вакцины по настоящей заявке, такой как, например, вакцина, содержащая иммуногенное количество химерной ДНК PCV1-3, клонированный химерный вирус, плазмиду или вирусный вектор, содержащий химерную ДНК PCV1-3, продукты экспрессии полипептидов, рекомбинантную ДНК PCV3 и т.д. Одновременно могут вводиться и другие антигены, такие как описанные выше антигены, и иммунные стимуляторы свиньям для обеспечения широкого спектра защиты от инфекций. Такое одновременное введение может быть выполнено в виде раздельного введения или объединено в виде одной поливалентной композиции.
[71] Вакцины содержат, например, инфекционную химерную ДНК PCV1-3, клонированный химерный ДНК-геном PCV в подходящие плазмиды или векторы, такие как, например, вектор pSK, авирулентный живой химерный вирус, инактивированный химерный вирус и т.д., в комбинации с нетоксичным, физиологически приемлемым носителем и, необязательно, одним или более адъювантами, как описано выше. Вакцина может также содержать описанный в настоящей заявке инфекционный молекулярный ДНК-клон PCV3. Авирулентная живая вирусная вакцина по настоящему изобретению обеспечивает преимущество по сравнению с традиционными вирусными вакцинами, в которых используются либо аттенуированные живые вирусы, подверженные риску возврата в вирулентное состояние, либо цельный убитый вирус, который был размножен в культуре клеток, и который не может индуцировать достаточный иммунный антительный ответ для защиты от вирусного заболевания.
[72] Хотя у живой вирусной вакцины есть некоторые преимущества, можно использовать другие типы вакцин для инокуляции свиньям нового химерного вируса и других описанных в настоящей заявке антигенов. Получение инактивированных вирусных вакцин, например размножение вируса из инфекционного ДНК-клона, осуществляют способами, известными в данной области или описанными в настоящей заявке. Инактивацию серийного вируса затем оптимизируют согласно обычным протоколам, известным специалистам в данной области техники.
[73] Инактивированные вирусные вакцины могут быть получены путем обработки выделенного вируса или химерного вируса, полученного из клонированной ДНК PCV, инактивирующими агентами, такими как формалин или гидрофобные растворители, кислоты и т.д., путем облучения ультрафиолетовым светом или рентгеновским излучением, нагреванием и т.д. Инактивацию выполняют способом, принятым в данной области техники. Вирус считается инактивированным, если он не способен инфицировать чувствительную к инфекции клетку.
[74] Для получения аттенуированной вакцины из патогенных клонов, живой патогенный PCV3, адаптированный к тканевой культуре, сначала ослабляют (превращают в непатогенный или безвредный) способами, известными в данной области, как правило, путем серийных пассажей через клеточные культуры. Аттенуированные патогенные клоны также могут быть получены путем делеции генов или мутации генов, продуцирующих вирусы. Затем аттенуированные вирусы PCV3 можно использовать для создания дополнительных химерных вирусов PCV1-3, которые сохраняют непатогенный фенотип PCV1, но могут отличаться выраженностью характеристик иммуногенности, выбранных из генома PCV3 с помощью рекомбинантной технологии.
[75] Настоящее изобретение также относится к вакцинам, содержащим нуклеотидную последовательность генома PCV3, SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, или ее гомолог или фрагмент и приемлемый фармацевтический или ветеринарный носитель. В одном из вариантов осуществления изобретения нуклеотидную последовательность выбирают из ее гомолога или фрагмента. В другом варианте осуществления изобретения гомолог имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID No.2, SEQ ID No.4, SEQ ID No.6 или SEQ ID No.8. В другом варианте осуществления вакцина дополнительно содержит адъювант.
[76] Другой аспект настоящего изобретения относится к вакцинам, содержащим вектор и приемлемый фармацевтический или ветеринарный носитель, причем вектор содержит нуклеотидную последовательность генома PCV3, такую как SEQ ID No.2, 4, 6, 8 или любую их комбинацию, или ее гомолог или фрагмент.
[77] Настоящее изобретение также относится к вакцинам, иммуногенным композициям, содержащим клетку и приемлемый фармацевтический или ветеринарный носитель, где клетку трансформируют нуклеотидной последовательностью генома PCV3 или ее гомологом или фрагментом.
[78] Кроме того, настоящее изобретение относится к вакцинам или иммуногенным композициям, содержащим фармацевтически приемлемый носитель и один полипептид, где указанный один полипептид состоит из SEQ ID No.2, 4, 6 или 8.
[79] Кроме того, настоящее изобретение относится к способам иммунизации млекопитающего против PCV3, включающим введение млекопитающему эффективного количества описанной выше вакцины или иммуногенной композиции.
[80] Настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям генома PCV3, выбранным из последовательностей SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7 или одного из их фрагментов.
[81] Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, отличающимся тем, что их выбирают из: а) нуклеотидной последовательности специфического фрагмента последовательности SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7 или одного из их фрагментов; b) нуклеотидной последовательности, гомологичной нуклеотидной последовательности, такой как определено в а); с) нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, такой как определено в а) или b), и нуклеотидной последовательности их соответствующей РНК; d) нуклеотидной последовательности, способной к гибридизации в жестких условиях с последовательностью, такой как определено в a), b) или с); e) нуклеотидной последовательности, содержащей последовательность, такую как определено в a), b), c) или d); и f) нуклеотидной последовательности, модифицированной нуклеотидной последовательностью, такой как определено в a), b), c), d) или е).
[82] В контексте настоящего изобретения нуклеотидная, полинуклеотидная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты означает как двухцепочечную или одноцепочечную ДНК в мономерных и димерных (так называемых в тандемных) формах, так и продукты транскрипции указанных ДНК.
[83] Следует понимать, что настоящее изобретение не относится к геномным нуклеотидным последовательностям, взятым в естественной для них окружающей среде, т.е. в естественном состоянии. Оно относится к последовательностям, которые можно выделить, очистить или частично очистить, начиная с методов разделения, таких как, например, ионообменная хроматография, путем исключения, исходя из молекулярного размера или сродства, или альтернативных методов фракционирования на основе растворимости в различных растворителях, или начиная с методов генной инженерии, таких как амплификация, клонирование и субклонирование, причем последовательности по изобретению можно переносить с помощью векторов.
[84] Под нуклеотидной последовательностью, комплементарной последовательности по изобретению, следует понимать любую ДНК обратной ориентации, нуклеотиды которой комплементарны нуклеотидам последовательности по изобретению (антипараллельная последовательность).
[85] Гибридизация в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью по изобретению означает гибридизацию в условиях температуры и ионной силы, выбранных таким образом, чтобы они обеспечивали гибридизацию между двумя фрагментами комплементарной ДНК.
[86] Среди нуклеотидных последовательностей по изобретению предпочтительными являются нуклеотидные последовательности, которые могут быть использованы в качестве праймера или зонда в способах, позволяющих получать гомологичные последовательности по изобретению, эти способы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), клонирование и секвенирование нуклеиновых кислот, хорошо известны специалистам в данной области.
[87] Среди указанных нуклеотидных последовательностей по изобретению предпочтительными также являются последовательности, которые могут быть использованы в качестве праймера или зонда в способах, позволяющих диагностировать наличие PCV3 или одного из его вариантов, таких как определено ниже.
[88] Предпочтительными также являются нуклеотидные последовательности по изобретению, способные модулировать, ингибировать или индуцировать экспрессию гена PCV3 и/или способны модулировать цикл репликации PCV3 в клетке-хозяине и/или в организме-хозяине. Цикл репликации означает инвазию и размножение PCV3 и его передачу от клетки-хозяина к клетке-хозяину в организме-хозяине.
[89] Среди упомянутых нуклеотидных последовательностей по изобретению раскрыты последовательности, которые соответствуют открытым рамкам считывания, называемым ORF последовательностями, и которые кодируют полипептиды, такие как, например, последовательности SEQ ID No.4 (ORF1), SEQ ID No.6 (ORF2) и SEQ ID No.8 (ORF3), соответственно. Фрагменты нуклеотидной последовательности по изобретению могут быть получены, например, путем специфической амплификации, такой как ПЦР, или в результате расщепления нуклеотидных последовательностей по изобретению соответствующими рестрикционными ферментами, эти способы, в частности, описаны в работе Sambrook et al., 1989. Указанные репрезентативные фрагменты также могут быть получены химическим синтезом, если они не очень большого размера, и методами, хорошо известными специалистам в данной области техники.
[90] Модифицированная нуклеотидная последовательность означает любую нуклеотидную последовательность, полученную посредством мутагенеза методами, хорошо известными специалисту в данной области, и содержащую модификации относительно нормальных последовательностей по изобретению, например мутации в регуляторных и/или промоторных последовательностях экспрессии полипептида, в частности приводящие к изменению скорости экспрессии указанного полипептида или к модуляции репликативного цикла.
[91] Модифицированная нуклеотидная последовательность также означает любую нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный полипептид, такой как определено ниже.
[92] Настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям PCV3 по изобретению, отличающимся тем, что они выбраны из последовательностей SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQ ID No.6, SEQ ID No.7, SEQ ID No.8 или одного из их фрагментов.
[93] Изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, отличающимся тем, что они содержат нуклеотидную последовательность, выбранную из: а) нуклеотидной последовательности SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, SEQ ID No.9 или одного из их фрагментов; b) нуклеотидной последовательности определенного фрагмента последовательности, такой как определено в а); c) гомологичной нуклеотидной последовательности, имеющей по меньшей мере 80% идентичность с последовательностью, такой как определено в а) или b); d) комплементарной нуклеотидной последовательности или последовательности РНК, соответствующей последовательности, такой как определено в а), b) или с); и e) нуклеотидной последовательности, модифицированной последовательностью, такой как определено в пунктах а), b), с) или d).
[94] Что касается гомологии с нуклеотидными последовательностями SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7 или одним из их фрагментов, предпочтительно, чтобы гомологичные, главным образом специфические, последовательности имели процент идентичности с одной из последовательностей SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7 или одним из их фрагментов, равный по меньшей мере 80%, предпочтительно 90% или 95%. Указанные конкретные гомологичные последовательности могут содержать, например, последовательности, соответствующие последовательностям ORF1, ORF2, ORF3, PCV3. Таким же образом эти специфические гомологичные последовательности могут соответствовать изменениям, связанным с мутациями внутри штаммов PCV3, и в частности соответствовать усечениям, замещениям, делециям и/или добавлениям по меньшей мере одного нуклеотида.
[95] Изобретение включает полипептиды, кодируемые нуклеотидной последовательностью по изобретению, предпочтительно полипептид, последовательность которого представлена фрагментом, в частности конкретным фрагментом; эти шесть аминокислотных последовательностей соответствуют полипептидам, которые могут быть кодированы в соответствии с одной из трех возможных рамок считывания последовательности SEQ ID No.1 или последовательности SEQ ID No.2.
[96] Изобретение также относится к полипептидам, отличающимся тем, что они содержат полипептид, выбранный из аминокислотных последовательностей SEQ ID No.2, SEQ ID No.4, SEQ ID No.6, SEQ ID No.8 или одного из их фрагментов.
[97] Изобретение также относится к полипептидам, отличающимся тем, что они содержат полипептид, выбранный из: а) специфического фрагмента, имеющего по меньшей мере 5 аминокислот, полипептида аминокислотной последовательности по изобретению; b) полипептида, гомологичного полипептиду, такому как определено в а); c) специфического биологически активного фрагмента полипептида, такого как определено в а) или b); и d) полипептида, модифицированного полипептидом, таким как определено в a), b) или c).
[98] Среди полипептидов по изобретению также предпочтительны полипептиды аминокислотных последовательностей SEQ ID No.2, SEQ ID No.4, SEQ ID No.6 и SEQ ID No.8, причем эти полипептиды особенно полезны, в частности, для распознавания антител, полученных при инфицировании PCV3. Таким образом, эти полипептиды имеют эпитопы, специфичные для PCV3, и поэтому могут быть использованы, в частности, в области диагностики или в качестве иммуногенного агента для обеспечения защиты свиней против инфекции PCV3.
[99] В настоящем описании термины полипептид, пептид и белок являются взаимозаменяемыми.
[100] Следует понимать, что изобретение не относится к полипептидам в их природном состоянии, т.е. их не используют в их естественной среде, но они могут быть выделены или получены путем очистки из природных источников или получены методами генетической рекомбинацией или, альтернативно, химическим синтезом, и поэтому могут содержать не встречающиеся в природе аминокислоты, как описано ниже.
[101] Под полипептидным фрагментом согласно изобретению следует понимать полипептид, содержащий по меньшей мере 5 последовательных аминокислот, предпочтительно 10 последовательных аминокислот или 15 последовательных аминокислот.
[102] В настоящем описании конкретный полипептидный фрагмент следует понимать как непрерывный полипептидный фрагмент, кодируемый определенным фрагментом нуклеотидной последовательности по изобретению.
[103] Гомологичный полипептид означает полипептиды, имеющие по отношению к природному полипептиду определенные модификации, такие как, в частности, делеция, добавление или замещение по меньшей мере одной аминокислоты, усечение, удлинение, химерное слияние и/или мутацию. Среди гомологичных полипептидов предпочтительными являются те, у которых аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 80%, предпочтительно 90% гомологию с аминокислотными последовательностями полипептидов по изобретению.
[104] Под конкретным гомологичным полипептидом следует понимать гомологичные полипептиды, такие как определено выше, и имеющие специфический фрагмент полипептида по изобретению.
[105] В случае замещения одна или более последовательных или не являющихся последовательно расположенными аминокислот заменены "эквивалентными" аминокислотами. Выражение "эквивалентная" аминокислота означает в настоящем описании любую аминокислоту, способную быть замещенной одной из аминокислот базовой структуры, без изменения, по существу, биологической активности соответствующих пептидов и, таким образом, их можно определить следующим образом. Эти эквивалентные аминокислоты могут быть определены либо в зависимости от их структурной гомологии с аминокислотами, которые они замещают, либо по результатам возможных сравнительных испытаний биологической активности между различными полипептидами. В качестве примера можно упомянуть возможность замещений, которые могут быть выполнены без существенной модификации биологической активности соответствующих модифицированных полипептидов, например, замещений лейцина валином или изолейцином, аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой, глутамина аспарагином, аргинина лизином и т.д., естественно, что также возможны обратные замены в тех же условиях.
[106] Конкретные гомологичные полипептиды также соответствуют полипептидам, кодируемым специфическими гомологичными нуклеотидными последовательностями, такими как определено выше, и, таким образом, включают, согласно определению по изобретению, полипептиды, которые мутированы или соответствуют вариантам, которые могут существовать в PCV3 и которые в частности соответствуют усечениям, замещениям, делециям и/или добавлениям по меньшей мере одного аминокислотного остатка.
[107] Специфический биологически активный фрагмент полипептида по изобретению, в частности, означает специфический полипептидный фрагмент, такой как определено выше, имеющий по меньшей мере одну из характеристик полипептидов по изобретению, в частности, в том смысле, что он: способен индуцировать иммуногенную реакцию, направленную против PCV3; и/или способен распознавать специфическое антитело полипептида по изобретению; и/или способен связываться с полипептидом или с нуклеотидной последовательностью PCV3; и/или способен проявлять физиологическую активность, даже частичную, такую как, например, активность, направленную на распространение, или структурную (капсидную) активность; и/или способен модулировать, индуцировать или ингибировать экспрессию гена PCV3 или одного из его вариантов и/или способен модулировать цикл репликации PCV3 в клетке и/или организме хозяина.
[108] Полипептидные фрагменты по изобретению могут соответствовать выделенным или очищенным фрагментам, естественно присутствующим в PCV3, или соответствующим фрагментам, которые могут быть получены расщеплением указанного полипептида протеолитическим ферментом, таким как трипсин или химотрипсин или коллагеназа, или химическим реагентом, таким как цианогенбромид (CNBr), или, альтернативно, путем помещения указанного полипептида в очень кислую среду, например, при рН 2,5. Такие полипептидные фрагменты также могут быть легко получены химическим синтезом из хозяев, трансформированных вектором экспрессии по изобретению, содержащему нуклеиновую кислоту, обеспечивающую экспрессию указанных фрагментов, находящихся под контролем соответствующих регуляторных и/или экспрессирующих элементов.
[109] "Модифицированный полипептид" полипептида по изобретению означает полипептид, полученный генетической рекомбинацией или химическим синтезом, как будет описано ниже, имеющий по меньшей мере одну модификацию по отношению к нормальной последовательности. Эти модификации в частности могут влиять на исходные аминокислоты полипептида по изобретению в отношении специфичности, патогенности и/или вирулентности, или структурной конформации и способности внедряться в мембрану. Таким образом, возможно создание полипептидов с эквивалентной, увеличенной или уменьшенной активностью и эквивалентной, более узкой или более широкой специфичностью. Среди модифицированных полипептидов необходимо упомянуть полипептиды, в которых до 5 аминокислот могут быть модифицированы, усечены на N- или С-конце, или даже удалены или добавлены.
[110] Как указано, целью модификации полипептида, в частности, является: сделать его способным модулировать, ингибировать или индуцировать экспрессию гена PCV3 и/или способным модулировать цикл репликации PCV3 в клетке и/или организме хозяина, что позволит включить его в вакцинные композиции, и/или модифицировать его биодоступность в качестве соединения для терапевтического применения.
[111] Показано, что способы, обеспечивающие указанную модуляцию в эукариотических или прокариотических клетках, хорошо известны специалистам в данной области. Также следует понимать, что можно использовать нуклеотидные последовательности, кодирующие указанные модифицированные полипептиды для указанных модуляций, например, посредством векторов по изобретению, описанных ниже, для, например, профилактики или лечения патологий, связанных с инфекцией.
[112] Описанные выше модифицированные полипептиды могут быть получены методами комбинаторной химии, которые позволяют последовательно изменять части полипептида до их тестирования на моделях, культурах клеток или микроорганизмах, например, для отбора наиболее активных соединений или искомых свойств.
[113] Химический синтез также имеет преимущество, позволяющее использовать не встречающиеся в природе аминокислоты или непептидные связи. Таким образом, для улучшения продолжительности жизни полипептидов по изобретению может представлять интерес использование не встречающихся в природе аминокислот, например, в D-форме, или аналогов аминокислот, в частности, серосодержащие формы.
[114] Наконец, можно интегрировать структуру полипептидов по изобретению, их специфические или модифицированные гомологичные формы, в химические структуры полипептидного типа или другие. Таким образом, интерес может представлять получение на N- и С-терминальных концах не распознаваемых протеазами соединений.
[115] Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид по изобретению, также являются частью изобретения.
[116] Изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, которые можно использовать в качестве праймера или зонда, отличающиеся тем, что указанные последовательности выбраны из нуклеотидных последовательностей по изобретению.
[117] Клонирование и секвенирование PCV3 позволяет идентифицировать нуклеотидные последовательности по результатам сравнительного анализа с нуклеотидными последовательностями других цирковирусов свиней, которые, в отличие от других последовательностей фрагментов этих нуклеиновых кислот, являются строго специфичными к PCV3, и которые соответствуют консенсусной последовательности цирковирусов свиней, отличной от PCV3. Существует также большая потребность в нуклеотидных последовательностях, используемых в качестве праймера или зонда, специфичных для всех других известных и непатогенных цирковирусов свиней.
[118] Следует также понимать, что настоящее изобретение также относится к конкретным полипептидам известных цирковирусов свиней, отличных от PCV3, кодируемых указанными консенсус-нуклеотидными последовательностями, которые могут быть получены путем очистки из природных полипептидов путем генетической рекомбинации или путем химического синтеза с помощью процедур, хорошо известных специалисту в данной области техники и описанных, в частности, ниже. Таким образом меченые или немеченые моно- или поликлональные антитела к указанным специфическим полипептидам, кодируемым указанными консенсус-нуклеотидными последовательностями, также являются частью изобретения.
[119] Указанные консенсусные нуклеотидные последовательности, указанные соответствующие полипептиды, а также указанные антитела к указанным полипептидам можно использовать в процедурах или наборах для обнаружения и/или идентификации, таких как описано ниже, вместо или дополнительно к нуклеотидным последовательностям, полипептидам или антителам по изобретению, специфичным к PCV3 типа A и/или B.
[120] Эти протоколы были улучшены для дифференциального обнаружения циклических мономерных форм конкретных репликативных форм вириона или ДНК при репликации и димерных форм, обнаруженных в так называемых тандемно расположенных молекулярных конструкциях.
[121] Изобретение также относится к применению нуклеотидной последовательности по изобретению в качестве праймера или зонда для обнаружения и/или амплификации последовательностей нуклеиновых кислот.
[122] Таким образом, нуклеотидные последовательности по изобретению могут быть использованы для амплификации нуклеотидных последовательностей, в частности методом ПЦР (полимеразной цепной реакцией) (Erlich, 1989; Innis et al., 1990; RoIfs et al., 1991; White et al., 1997). Эти олигодезоксирибонуклеотидные или олигорибонуклеотидные праймеры преимущественно имеют длину по меньшей мере 8 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 12 нуклеотидов и более предпочтительно по меньшей мере 20 нуклеотидов. Помимо ПЦР можно использовать другие альтернативные способы амплификации целевой нуклеиновой кислоты могут.
[123] Нуклеотидные последовательности по изобретению, в частности, праймеры по изобретению, также можно использовать в других процедурах амплификации целевой нуклеиновой кислоты, таких как: метод TAS (система амплификации на основе транскрипции), описанный Kwoh et al. в 1989 году; метод 3SR (самоподдерживающаяся репликация последовательности), описанный Guatelli et al. в 1990 году; метод NASBA (амплификация на основе нуклеиновой кислоты), описанная Kyivitis et al. в 1991 году; метод SDA (амплификация со смещением цепи) (Walker et al., 1992); метод TMA (транскрипционно-опосредованная амплификация).
[124] Полинуклеотиды по изобретению также могут быть использованы в методах амплификации или модификации нуклеиновой кислоты, служащей в качестве зонда, таких как: метод LCR (лигазная цепная реакция), описанная Landegren et al. в 1988 году и усовершенствованная Barany et al. в 1991 году, в котором используется термостабильная лигаза; метод RCR (реакция восстановления цепи), описанный Segev в 1992 году; метод CPR (реакция циклического зонда), описанный Duck et al. в 1990 году; метод амплификации с Q-бета-репликазой, описанный Miele et al. в 1983 году и усовершенствованный, в частности, Chu et al. в 1986 году, Lizardi et al. в 1988 году, затем Burg et al., а также Stone et al. в 1996 году.
[125] Если предназначенный для обнаружения целевой полинуклеотид может представлять собой РНК, например mRNA, перед реакцией амплификации с использованием по меньшей мере одного праймера по изобретению или перед процедурой детекции с использованием, по меньшей мере, одного зонда по изобретению, можно использовать фермент типа обратной транскриптазы для получения кДНК из РНК, содержащейся в биологическом образце. Таким образом, полученная кДНК будет служить мишенью для праймера(праймеров) или зонда(зондов), используемых в процедуре амплификации или детекции в соответствии с изобретением.
[126] Зонд для детекции можно выбирать таким образом, чтобы он гибридизовался с целевой последовательностью или ампликоном, генерируемым из целевой последовательности. Что касается последовательности, такой зонд преимущественно может иметь последовательность, состоящую из по меньшей мере 12 нуклеотидов, в частности, по меньшей мере, 20 нуклеотидов и предпочтительно по меньшей мере 100 нуклеотидов.
32
35
3
125
[127] Изобретение также включает нуклеотидные последовательности, используемые в качестве зонда или праймера в соответствии с описанием, отличающиеся тем, что они являются мечеными радиоактивным соединением или нерадиоактивным соединением. Немеченые нуклеотидные последовательности могут быть использованы непосредственно в качестве зондов или праймеров, хотя, как правило, последовательности метят радиоактивным элементом (P, S, H, I) или нерадиоактивной молекулой (биотина, ацетиламинофлуорена, дигоксигенина, 5-бромдезоксиуридина, флуоресцеина) для получения зондов, которые можно использовать в многочисленных приложениях. Примеры нерадиоактивного мечения нуклеотидных последовательностей описаны, например, во французском патенте N 78.10975 или у Urdea et al. или Sanchez-Pescador et al. в 1988 году. В последнем случае также можно использовать один из способов мечения, описанных в патентах FR-2 422 956 и FR-2 518 755.
[128] Метод гибридизации может быть осуществлен различными способами (Matthews et al., 1988). Наиболее общий способ заключается в иммобилизации экстракта нуклеиновой кислоты из клеток на подложке (такой как нитроцеллюлозная, нейлоновая, полистирольная) и инкубации иммобилизованной целевой нуклеиновой кислоты с зондом в четко определенных условиях. После гибридизации избыток зонда удаляют, и образующиеся гибридные молекулы определяют соответствующим методом (путем измерения радиоактивности, флуоресценции или ферментативной активности, связанной с зондом).
[129] Изобретение также включает нуклеотидные последовательности по изобретению, отличающиеся тем, что они иммобилизованы на подложке посредством ковалентных или нековалентных связей.
[130] Согласно другому предпочтительному способу применения нуклеотидных последовательностей по изобретению, последние могут быть иммобилизованы на подложке и, таким образом, могут служить для захвата посредством специфической гибридизации целевой нуклеиновой кислоты, полученной из исследуемого биологического образца. При необходимости твердую подложку отделяют от образца, и затем гибридизационный комплекс, образованный между указанным зондом-захватчиком и целевой нуклеиновой кислотой, детектируют с помощью второго зонда, так называемого зонда детекции, меченого легко детектируемым элементом.
[131] Другой объект настоящего изобретения представляет собой вектор для клонирования и/или экспрессии последовательности, отличающийся тем, что он содержит нуклеотидную последовательность по изобретению.
[132] В соответствии с изобретением векторы, которые содержат элементы, обеспечивающие экспрессию и/или секрецию указанных нуклеотидных последовательностей в определенной клетке-хозяине, также являются частью изобретения. Вектор также должен содержать промотор, сигналы инициации и терминации трансляции, а также соответствующие области регулирования транскрипции. Он должен стабильно поддерживаться в клетке-хозяине и необязательно иметь конкретные сигналы, определяющие секрецию транслированного белка. Эти различные элементы выбирают в зависимости от используемой клетки-хозяина. С этой целью нуклеотидные последовательности по изобретению могут быть вставлены в автономные векторы репликации внутри выбранного хозяина или интегрированные векторы выбранного хозяина. Такие векторы можно получать методами, используемыми в настоящее время специалистами в данной области, и полученные из них клоны можно вводить в подходящий хозяин стандартными способами, такими как, например, липофекция, электропорация и тепловой шок. В соответствии с изобретением векторы представляют собой, например, плазмидные или вирусные векторы. Предпочтительным вектором экспрессии полипептидов по изобретению является бакуловирус.
[133] Эти векторы могут быть использованы для трансформации клеток-хозяев для клонирования или экспрессии нуклеотидных последовательностей по изобретению. Изобретение также включает клетки-хозяева, трансформированные вектором по изобретению. Эти клетки могут быть получены путем введения в клетки-хозяева нуклеотидной последовательности, вставленной в вектор, такой как определено выше, затем культивирования указанных клеток в условиях, обеспечивающих репликацию и/или экспрессию трансфицированной нуклеотидной последовательности. Клетки-хозяева могут быть выбраны из прокариотических или эукариотических систем, таких как, например, бактериальные клетки (Olins and Lee, 1993), а также дрожжевые клетки (Buckholz, 1993), клетки животных, в частности культуры клеток млекопитающих (Edwards and Aruffo, 1993), в частности клетки яичников китайского хомячка (CHO), а также клетки насекомых, в которых можно, например, использовать процедуры с применением, например, бакуловирусов (Luckow, 1993). Предпочтительная клетка-хозяин для экспрессии белков по изобретению представляет собой клетки насекомого sf9.
[134] Изобретение также относится к животным, содержащим одну из указанных трансформированных клеток по изобретению. Трансгенных животных по изобретению со сверхэкспрессией одного или более генов PCV3 или части генов предпочтительно получают из крыс, мышей или кроликов методами, хорошо известными специалисту в данной области, такими как трансфекция вирусов или невирусов. Можно получить трансгенных животных со сверхэкспрессией одного или более указанных генов путем трансфекции множественных копий указанных генов под контролем сильного универсального промотора или промотора, селективного к одному типу ткани. Аналогичным образом можно получить трансгенных животных путем гомологичной рекомбинации в штаммах эмбриональных клеток, переноса этих клеточных штаммов в эмбрионы, отбора подвергшихся воздействию химер на уровне репродуктивных линий и выращивания указанных химер. Трансформированные клетки, а также трансгенные животные по изобретению могут быть использованы в способах получения рекомбинантных полипептидов.
[135] В настоящее время возможно получение рекомбинантных полипептидов в относительно большом количестве с помощью генной инженерии с использованием клеток, трансформированных векторами экспрессии по изобретению или с использованием трансгенных животных по изобретению. Настоящее изобретение также включает способы получения полипептида по изобретению в рекомбинантной форме, отличающиеся тем, что в них используется вектор и/или клетка, трансформированная вектором по изобретению и/или трансгенное животное, содержащее одну из указанных трансформированных клеток в соответствии с изобретением. Среди указанных способов получения полипептида по изобретению в рекомбинантной форме, предпочтительными являются способы получения с использованием вектора и/или клетки, трансформированной указанным вектором, и/или трансгенного животного, содержащего одну из указанных трансформированных клеток, содержащую нуклеотидную последовательность по изобретению, кодирующую полипептид PCV3. Рекомбинантные полипептиды, полученные, как указано выше, могут также присутствовать как в гликозилированной, так и негликозилированной форме, и могут иметь или не иметь естественную третичную структуру.
in vitro
[136] Предпочтительный вариант состоит в получении рекомбинантного полипептида, используемого для белка-"носителя" (химерного белка). Преимущество этой системы заключается в том, что она позволяет стабилизировать и уменьшать протеолиз рекомбинантного продукта, увеличивать растворимость в процессе ренатурации  и/или упрощать очистку, если партнер слияния имеет сродство к конкретному лиганду.
[137] Более конкретно, изобретение относится к способу получения полипептида по изобретению, включающему следующие стадии: а) культивирование трансформированных клеток в условиях, позволяющих экспрессию рекомбинантного полипептида нуклеотидной последовательности по изобретению; b) если необходимо, извлечение указанного рекомбинантного полипептида.
[138] Когда в способе получения полипептида по изобретению используется трансгенное животное в соответствии с изобретением, рекомбинантный полипептид затем извлекают из указанного животного.
[139] Изобретение также относится к полипептиду, который можно получить описанным выше способом.
[140] Изобретение также включает способ получения синтетического полипептида, отличающийся тем, что в нем используется аминокислотная последовательность полипептидов по изобретению. Изобретение также относится к синтетическому полипептиду, полученному с помощью процедуры в соответствии с изобретением.
[141] Полипептиды по изобретению также могут быть получены способами, которые являются обычными в области синтеза пептидов. Этот синтез может быть осуществлен в гомогенном растворе или в твердой фазе. Например, можно сослаться на метод синтеза в гомогенном растворе, описанную Houben-Weyl в 1974 году. Этот метод синтеза состоит в последовательной конденсации, две по две, последовательных аминокислот в требуемом порядке или конденсации аминокислот и фрагментов, сформированных ранее и уже содержащих несколько аминокислот в соответствующем порядке, или, альтернативно, нескольких фрагментов, предварительно полученных таким образом, при этом следует понимать, что необходимо заранее обеспечить защиту всех реакционных функциональных групп, переносимых этими аминокислотами или фрагментами, за исключением аминной группы у одной и карбоксильной у другой или наоборот, которые обычно участвуют в образовании пептидных связей, особенно после активации карбоксильной группы, в соответствии с методами, хорошо известными в области синтеза пептидов. Согласно другому предпочтительному методу по изобретению, можно применить способ, описанный Меррифилдом (Merrifield). Для получения пептидной цепи в соответствии с методом Меррифилда, используют полимерную смолу, на которой иммобилизуют первую С-концевую аминокислоту цепи. Эту аминокислоту иммобилизуют на смоле посредством ее карбоксильной группы, а аминогруппу защищают. Таким образом, аминокислоты, из которых образуется пептидная цепь, иммобилизуют одну за другой, присоединяя к аминогруппам, с которых каждый раз предварительно удаляют защиту, уже сформированной и прикрепленной к смоле пептидной цепи. После образования полной целевой пептидной цепи защитные группы различных аминокислот, образующих пептидную цепь, удаляют, а пептид отделяют от смолы с помощью кислоты.
[142] Изобретение дополнительно относится к гибридным полипептидам, имеющим по меньшей мере один полипептид по изобретению, и последовательность полипептида, способного индуцировать иммунный ответ у человека или животных.
[143] Преимущественно, антигенная детерминанта способна индуцировать гуморальный и/или клеточный ответ. Такая детерминанта может содержать полипептид по изобретению в гликозилированной форме, используемой с целью получения иммуногенных композиций, способных индуцировать синтез антител, направленных против множества эпитопов. Указанные полипептиды или их гликозилированные фрагменты также являются частью изобретения. Эти гибридные молекулы могут быть образованы частично из полипептидной молекулы-носителя или ее фрагмента в соответствии с изобретением, связанной с возможной иммуногенной частью, в частности эпитопом дифтерийного токсина, столбнячного токсина, поверхностным антигеном гепатита B (патент FR 79 21811), антигеном VP1 вируса полиомиелита или любым другим вирусным или бактериальным токсином или антигеном. Процедуры для синтеза гибридных молекул охватывают методы, используемые в генной инженерии для конструирования гибридных нуклеотидных последовательностей, кодирующих искомые полипептидные последовательности. Например, можно указать способ получения генов, кодирующих слитые белки, описанный Minton в 1984 году. Указанные гибридные нуклеотидные последовательности, кодирующие гибридный полипептид, а также гибридные полипептиды по изобретению, отличающиеся тем, что они являются рекомбинантными полипептидами, полученными экспрессией указанных гибридных нуклеотидных последовательностей, также являются частью изобретения.
[144] Изобретение также включает векторы, отличающиеся тем, что они содержат одну из указанных гибридных нуклеотидных последовательностей. Клетки-хозяева, трансформированные указанными векторами, трансгенные животные, содержащие одну из указанных трансформированных клеток, а также процедуры получения рекомбинантных полипептидов с использованием указанных векторов, указанных трансформированных клеток и/или указанных трансгенных животных, конечно, также являются частью изобретения.
[145] Полипептиды по изобретению, антитела по изобретению, описанные ниже, и нуклеотидные последовательности по изобретению преимущественно можно использовать в процедурах обнаружения и/или идентификации PCV3 или цирковируса свиней, который не является PCV3, в биологическом образце (биологической ткани или жидкости), в котором он может содержаться. Эти процедуры, в зависимости от специфичности используемых полипептидов, антител и нуклеотидных последовательностей по изобретению позволяют, в частности, обнаруживать и/или идентифицировать PCV3 или цирковирус свиньи, который не является PCV3.
[146] Полипептиды по изобретению преимущественно можно использовать в способе обнаружения и/или идентификации PCV3 в биологическом образце (биологической ткани или жидкости), в которой он может содержаться, отличающемся тем, что он включает следующие стадии: а) контактирования этого биологического образца с полипептидом или одним из его фрагментов по изобретению (в условиях, обеспечивающих иммунологическую реакцию между указанным полипептидом и антителами, возможно присутствующими в биологическом образце); и b) демонстрацию образованных комплексов антиген-антитело. Предпочтительно, биологический образец получают из жидкости, например сыворотки, цельной крови свиньи или методом биопсии. Для осуществления такого обнаружения возможных комплексов антиген-антитело может быть использована любая обычная процедура. В качестве примера предпочтительный способ включает иммуноферментные процессы в соответствии с методом ELISA, иммунофлуоресценцию или радиоиммунологические процессы (RIA) или их эквивалент.
[147] Таким образом, изобретение также относится к полипептидам по изобретению, меченым подходящей меткой, такой как ферментативная, флуоресцентная или радиоактивная. Такие способы включают, например, следующие стадии: 1) осаждение определенных количеств полипептидной композиции по изобретению в лунках планшета для микротитрования; 2) введение в указанные лунки серийных разведений подлежащей анализу сыворотки или биологического образца, отличного от указанного ранее; 3) инкубацию микропланшета; и 4) введение в лунки планшета для микротитрования меченых антител к иммуноглобулинам свиньи, причем мечение этих антител осуществляют с помощью фермента, выбранного из тех, которые способны гидролизовать субстрат путем модификации поглощения излучения последним, по меньшей мере, при определенной длине волны, например, при 550 нм, и детектирование количества гидролизованной подложки, относительно контрольного теста.
[148] Изобретение также относится к набору или комплекту для детекции и/или идентификации PCV3, отличающемуся тем, что он содержит следующие элементы: 1) полипептид по изобретению; 2) если необходимо, реагенты для образования среды, благоприятной для иммунологической или специфической реакции; 3) если необходимо, реагенты, позволяющие детектировать комплексы антиген-антитело, продуцируемые иммунологической реакцией между полипептидом(полипептидами) по изобретению и антителами, возможно присутствующими в биологическом образце, эти реагенты также могут иметь метку или, в свою очередь, быть распознаваемыми меченым реагентом, в частности в случае немеченого полипептида по изобретению; 4) если необходимо, биологический контрольный образец (отрицательный контроль), лишенный антител, распознаваемых полипептидом по изобретению; и 5) если необходимо, биологический контрольный образец (положительный контроль), содержащий заданное количество антител, распознаваемых полипептидом по изобретению.
[149] Полипептиды по изобретению позволяют получать моноклональные или поликлональные антитела, которые характеризуются тем, что они специфически распознают полипептиды по изобретению. Преимущественно можно получать моноклональные антитела из гибридом в соответствии с методом, описанным Kohler и Milstein в 1975 году. Можно получать поликлональные антитела, например, путем иммунизации животного, в частности мыши, полипептидом или ДНК по изобретению, ассоциированной с адъювантом иммунного ответа, а затем очистки специфических антител, содержащихся в сыворотке иммунизированных животных, на колонке для аффинной хроматографии с ранее иммобилизованым полипептидом, служащим в качестве антигена. Поликлональные антитела по изобретению также могут быть получены путем очистки антитела, содержащегося в сыворотке инфицированных PCV3 свиней, на колонке для аффинной хроматографии с ранее иммобилизованным полипептидом.
[150] Изобретение также относится к моно- или поликлональным антителам или их фрагментам или химерным антителам, отличающимся тем, что они способны специфически распознавать полипептид по изобретению. Также возможно, чтобы описанные в заявке антитела были мечеными таким же образом, как описано ранее для нуклеиновых зондов по изобретению, например имели ферментативную, флуоресцентную или радиоактивную метку.
[151] Изобретение также относится к способу детекции и/или идентификации PCV3 в биологическом образце, отличающемуся тем, что он включает следующие стадии: a) контактирования биологического образца (биологической ткани или жидкости) с моно- или поликлональным антителом по изобретению (в условиях, обеспечивающих иммунологическую реакцию между указанными антителами и полипептидами PCV3, включая ORF1, ORF2 и/или ORF3, возможно присутствующими в биологическом образце); и b) демонстрации возможного образования комплекса антиген-антитело.
[152] Также в рамках изобретения представлен набор или комплект для детекции и/или идентификации PCV3, отличающийся тем, что он содержит следующие компоненты: а) поликлональное или моноклональное антитело по изобретению, если необходимо меченое; b) если необходимо, реагент для образования среды, благоприятной для проведения иммунологической реакции; c) если необходимо, реагент, позволяющий детектировать комплексы антиген-антитело, продуцируемые иммунологической реакцией, причем этот реагент также способен нести метку или, в свою очередь, быть распознаваемым меченым реагентом, в частности если указанное моноклональное или поликлональное антитело не является меченым; и d) если необходимо, реагенты для проведения лизиса клеток испытуемого образца.
[153] Настоящее изобретение также относится к способу детекции и/или идентификации PCV3 в биологическом образце, отличающемуся тем, что в нем используется нуклеотидная последовательность по изобретению. Более конкретно, изобретение относится к методу детектировагния и/или идентификации PCV3 в биологическом образце, отличающемуся тем, что он содержит следующие стадии: a) если необходимо, выделение ДНК из биологического образца для анализа; b) специфичную амплификацию образца ДНК с использованием по меньшей мере одного праймера или пары праймеров по изобретению; и c) демонстрацию продуктов амплификации. Продукты могут быть обнаружены, например, методом молекулярной гибридизации с использованием нуклеинового зонда по изобретению. Этот зонд преимущественно может быть меченым нерадиоактивным (холодным зондом) или радиоактивным элементом.
[154] Для целей настоящего изобретения "ДНК биологического образца" или "ДНК, содержащаяся в биологическом образце" следует понимать либо как ДНК, присутствующую в рассматриваемом биологическом образце, либо, возможно, как кДНК, полученную после действия фермента типа обратной транскриптазы на РНК, присутствующую в указанном биологическом образце.
[155] Другая цель настоящего изобретения заключается в способе по изобретению, отличающемуся тем, что он включает следующие стадии: а) контактирования нуклеотидного зонда по изобретению с биологическим образцом, ДНК, содержащейся в биологическом образце, которая, при необходимости, была сконструирована с целью обеспечения гибридизации в условиях, позволяющих гибридизацию зонда с ДНК указанного образца; и b) демонстрации гибрида, образованного между нуклеотидным зондом и ДНК биологического образца.
[156] Настоящее изобретение также относится к способу по изобретению, отличающемуся тем, что он включает следующие стадии: а) контактирования нуклеотидного зонда, иммобилизованного на подложке в соответствии с изобретением с биологическим образцом, ДНК образца которая, при необходимости, была сконструирована с целью обеспечения гибридизации в условиях, позволяющих гибридизацию зонда с ДНК указанного образца; b) контактирования гибрида, образованного между нуклеотидным зондом, иммобилизованным на подложке, и ДНК, содержащейся в биологическом образце, при необходимости после исключения ДНК биологического образца, которая не гибридизовалась с зондом, с нуклеотидным зондом, меченым в соответствии с изобретением; и c) демонстрации нового гибрида, полученного на стадии b). Согласно предпочтительному варианту осуществления определенного ранее способа детекции и/или идентификации, он отличается тем, что перед стадией а) ДНК биологического образца сначала амплифицируют с использованием по меньшей мере одного праймера по изобретению.
[157] Описание также относится к набору или комплекту для детекции и/или идентификации PCV3, отличающемуся тем, что он содержит следующие элементы: а) нуклеотидный зонд по изобретению; b) если необходимо, реагенты, необходимые для проведения реакции гибридизации; и с) если необходимо, по меньшей мере один праймер по изобретению, а также реагенты, необходимые для реакции амплификации ДНК.
[158] Изобретение также относится к набору или комплекту для детекции и/или идентификации PCV3 или цирковируса свиней, отличного от PCV3, отличающемуся тем, что он содержит следующие компоненты: a) нуклеотидный зонд, называемый зондом для захвата, по изобретению; b) олигонуклеотидный зонд, называемый выявляющим зондом, по изобретению, и с) если необходимо, по меньшей мере один праймер по изобретению, а также реагенты, необходимые для реакции амплификации ДНК.
[159] Изобретение также относится к набору или комплекту для детекции и/или идентификации PCV3, отличающемуся тем, что он содержит следующие элементы: а) по меньшей мере один праймер по изобретению; b) если необходимо, реагенты, необходимые для проведения реакции амплификации ДНК; и c) в случае необходимости компонент, позволяющий проверять последовательность амплифицированного фрагмента, более конкретно олигонуклеотидный зонд по изобретению.
[160] Изобретение дополнительно относится к применению нуклеотидной последовательности по изобретению, полипептида по изобретению, антитела по изобретению, клетки по изобретению и/или животного, трансформированного в соответствии с изобретением, для выбора органического или неорганического соединения, способного модулировать, индуцировать или ингибировать экспрессию генов и/или модифицировать клеточную репликацию PCV3, или способного индуцировать или ингибировать патологии, включая уменьшение частоты появления и тяжести клинических признаков, связанных с инфекцией PCV3.
[161] Изобретение также включает способ выбора соединений, способных связываться с полипептидом или одним из его фрагментов по изобретению, нуклеотидной последовательностью по изобретению или способных распознавать антитело по изобретению, и/или способных модулировать, индуцировать или ингибировать экспрессию генов и/или модифицировать клеточную репликацию PCV3, или способных индуцировать или ингибировать патологию, включая уменьшение частоты появления и тяжести клинических признаков, связанных с инфекцией PCV3, отличающийся тем, что он включает следующие стадии: а) контактирования указанного соединения с указанным полипептидом, указанной нуклеотидной последовательностью или клеткой, трансформированной в соответствии с изобретением и/или введение указанного соединения животному, трансформированному в соответствии с изобретением; и b) определения способности указанного соединения связываться с указанным полипептидом или указанной нуклеотидной последовательностью или модулировать, индуцировать или ингибировать экспрессию генов, или модулировать рост или репликацию PCV3, или индуцировать или ингибировать в указанном трансформированном животном патологии, связанные с инфекцией PCV3 (обозначенной как активность указанного соединения). Соединения, которые могут быть выбраны, представляют собой органические соединения, такие как полипептиды или углеводы, или любые другие известные неорганические или неорганические соединения, или новые органические соединения, разработанные методами молекулярного моделирования и полученные химическим или биохимическим синтезом, причем эти методы известны специалисту уровня техники. Можно использовать указанные выбранные соединения для модуляции клеточной репликации PCV3, и таким образом, для борьбы с инфекцией, вызванной этим вирусом; методы, позволяющие определять указанные модуляции хорошо известны специалистам в данной области. Эта модуляция может быть осуществлена, например, с помощью агента, способного связываться с белком и, таким образом, ингибировать или потенцировать его биологическую активность, или способным связываться с белком оболочки на внешней поверхности указанного вируса и блокировать проникновение этого вируса в клетку-хозяина, или способного стимулировать действие иммунной системы инфицированного организма, направленное против указанного вируса. Эта модуляция также может быть осуществлена с помощью агента, способного связываться с нуклеотидной последовательностью ДНК указанного вируса и блокировать, например, экспрессию полипептида, биологическая или структурная активность которого необходима для репликации или для пролиферации вируса в клетках-хозяевах у животного-хозяина.
[162] Изобретение относится к соединениям, которые могут быть выбраны методом выбора согласно изобретению.
[163] Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение, выбранное из следующих соединений: а) нуклеотидной последовательности по изобретению; b) полипептида по изобретению; c) вектора, вирусной частицы или клетки, трансформированной в соответствии с изобретением; d) антитела по изобретению; и e) соединения, которое может быть выбрано способом выбора по изобретению; возможно, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и, при необходимости, одним или более адъювантами соответствующего иммунитета.
[164] Изобретение также относится к иммуногенной и/или вакцинной композиции, отличающейся тем, что она включает соединение, выбранное из следующих соединений: а) нуклеотидной последовательности по изобретению; b) полипептида по изобретению; c) вектора или вирусной частицы по изобретению; и d) клетки по изобретению.
[165] В одном из вариантов осуществления вакцинная композиция по изобретению отличается тем, что она содержит смесь по меньшей мере двух из указанных выше соединений a), b), c) и d) и тем, что одно из двух указанных соединений относится к PCV3.
[166] В другом варианте осуществления изобретения вакцинная композиция характеризуется тем, что она содержит по меньшей мере одно из указанных выше соединений a), b), c) и d), которое относится к PCV3. В другом варианте осуществления вакцинная композиция характеризуется тем, что она содержит по меньшей мере одно из указанных выше соединений a), b), c) и d), которое относится к ORF2 PCV3.
[167] Соединение, относящееся к PCV3, следует понимать как означающее соединение, полученное из геномной последовательности PCV3 и/или ORF1, ORF2 и ORF2 PCV3.
[168] Это раскрытие дополнительно относится к иммуногенной и/или вакцинной композиции, отличающейся тем, что она содержит по меньшей мере одно из следующих соединений: 1) нуклеотидной последовательности SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7 или одного из их фрагментов или гомологов; 2) полипептида с последовательностью SEQ ID No.2, SEQ ID No.4, SEQ ID No.6, SEQ ID No.8 или одного из их фрагментов, или их модификации; 3) вектора или вирусной частицы, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7 или одного из их фрагментов или гомологов; 4) трансформированной клетки, способной экспрессировать полипептид с последовательностью SEQ ID No.2, SEQ ID No.4, SEQ ID No.6, SEQ ID No.8 или одного из их фрагментов, или их модификации; или 5) смеси по меньшей мере двух из указанных соединений.
[169] Это раскрытие также включает иммуногенную и/или вакцинную композицию по изобретению, отличающуюся тем, что она содержит указанную смесь по меньшей мере двух из указанных соединений в качестве комбинированного продукта для одновременного, раздельного или длительного применения для профилактики или лечения инфекции PCV3.
TM
[170] В предпочтительном варианте осуществления вакцинная композиция по изобретению включает смесь следующих соединений: 1) плазмиды pcDNA3, содержащей нуклеиновую кислоту с последовательностью SEQ ID No.1; 2) плазмиды pcDNA3, содержащей нуклеиновую кислоту с последовательностью SEQ ID No.3, SEQ ID No.5 или SEQ ID No.7; 3) плазмиды pcDNA3, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок GM-CSF; 4) рекомбинантный бакуловирус, содержащий нуклеиновую кислоту с последовательностью SEQ ID No.1; 5) рекомбинантный бакуловирус, содержащий нуклеиновую кислоту с последовательностью SEQ ID No.3, SEQ ID No.5 или SEQ ID No.7; и 6) при необходимости, адъювант соответствующего иммунитета, в частности адъювант AIF.
[171] Это раскрытие также относится к фармацевтической композиции по изобретению для профилактики или лечения инфекции PCV3.
[172] Понятно, что "профилактика", используемая в настоящем описании, включает полное предотвращение инфицирования PCV3, но также включает уменьшение тяжести или частоты появления клинических признаков, ассоциированных с инфекцией PCV3 или вызванной ею. Такая профилактика также упоминается в настоящем описании как защитное действие.
[173] Это раскрытие также относится к применению композиции в соответствии с описанием для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики или лечения инфекции PCV3.
[174] В другом аспекте изобретение относится к вектору, вирусной частице или клетке по изобретению для лечения и/или профилактики заболевания с помощью генной терапии.
[175] Наконец, изобретение включает применение вектора, вирусной частицы или клетки по изобретению для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики заболевания с помощью генной терапии.
[176] Полипептиды по изобретению, входящие в иммуногенные или вакцинные композиции по изобретению, могут быть выбраны способами, известными специалисту в данной области, такими как, например, в зависимости от способности указанных транслируемых полипептидов стимулировать Т-клетки, например, путем их пролиферации, или секреции интерлейкинов, и которые приводят к продуцированию антител, направленных против указанных полипептидов.
[177] У свиней, как и у мышей, которым вводится доза вакцинной композиции, рассчитанная на вес, сравнимая с дозой, используемой человеком, реакцию антитела тестируют путем взятия сыворотки с последующим исследованием обычными методами на образование комплекса между антителом, присутствующим в сыворотке, и антигеном вакцинной композиции.
[178] Фармацевтические композиции по изобретению могут содержать эффективное количество соединений по изобретению, т.е. достаточное количество указанного соединения(соединений), обеспечивающее требуемый эффект, например, модуляцию клеточной репликации PCV3. Специалисту в данной области техники известно, как определить такое количество в зависимости, например, от возраста и веса человека, подлежащего лечению, тяжести патологии, возможных побочных эффектов, а также помощью теста оценки эффектов, полученных в пределах популяции; эти тесты известны в этих областях применения.
[179] Согласно изобретению, указанные комбинации вакцин предпочтительно объединяют с фармацевтически или ветеринарно приемлемым носителем и, при необходимости, с одним или более адъювантами соответствующего иммунитета.
in vivo
in situ
[180] В настоящее время существуют различные типы вакцин для защиты животных или человека от инфекционных заболеваний: аттенуированные живые микроорганизмы (M. bovis - BCG для туберкулеза), инактивированные микроорганизмы (вирус гриппа), клеточные экстракты (Bordetella pertussis для коклюша), рекомбинантные белки (поверхностный антиген вируса гепатита В), полисахариды (пневмококковые). Вакцины, полученные из синтетических пептидов или генетически модифицированных микроорганизмов, экспрессирующих гетерологичные антигены, находятся в процессе экспериментов. Совсем недавно рекомбинантные плазмидные ДНК, несущие гены, кодирующие защитные антигены, были предложены в качестве альтернативной стратегии разработки вакцины. Этот тип вакцинации проводят путем использования конкретной плазмиды, происходящей из плазмиды E. coli, которая не реплицируется  и которая однозначно кодирует вакцинный белок. Животных иммунизируют путем простого введения голой плазмидной ДНК в мышцу. Этот метод приводит к экспрессии вакцинного белка  и к иммунному ответу клеточного типа (CTL) и гуморального типа (антительного). Эта двойная индукция иммунного ответа является одним из основных преимуществ метода вакцинации голой ДНК.
[181] Конститутивная нуклеотидная последовательность вакцинной композиции по изобретению может быть введена в организм хозяина после присоединения к соединениям, которые способствуют проникновению этого полинуклеотида внутрь клетки или ее переносу в клеточное ядро. Полученные конъюгаты могут быть инкапсулированы в полимерные микрочастицы, как описано в международной заявке № WO 94/27238 (Medisorb Technologies International).
[182] Согласно другому варианту осуществления вакцинной композиции по изобретению нуклеотидная последовательность, предпочтительно ДНК, находится в комплексе с DEAE-декстраном (Pagano et al., 1967) или с ядерными белками (Kaneda et al., 1989), липидами (Felgner et al., 1987) или инкапсулирована в липосомах (Fraley et al., 1980), или вводится в виде геля, что облегчает ее трансфекцию в клетки (Midoux et al., 1993, Pastore et al., 1994). Полинуклеотид или вектор по изобретению также может быть суспендирован в буферном растворе или объединен с липосомами.
[183] Такую вакцину преимущественно получают способом, описанным Tacson et al. или Huygen et al. в 1996 году или, альтернативно, способом, описанным Davis et al. в международной заявке № WO 95/11307.
in vivo
[184] Такую вакцину можно также получить в виде композиции, содержащей вектор по изобретению, находящийся под контролем регуляторных элементов, обеспечивающих его экспрессию у человека или животного. Например, можно использовать вектор экспрессии полипептидного антигена , плазмиду pcDNA3 или плазмиду pcDNA1/neo, поставляемые фирмой Invitrogen (R&D Systems, Abingdon, United Kingdom). Также можно использовать плазмиду V1Jns.tPA, описанную Shiver et al. в 1995 году. Такая вакцина предпочтительно включает, помимо рекомбинантного вектора, физиологический раствор, например раствор хлорида натрия.
[185] Что касается препаративных форм вакцины, они могут содержать адъюванты соответствующего иммунитета, которые известны специалисту в данной области, такие как, например, описанные выше.
[186] Эти соединения могут вводиться системно, в частности, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно или подкожно, или перорально. В более предпочтительном варианте вакцинную композицию, содержащую полипептиды по изобретению, вводят внутримышечно, с пищей или путем многократного распыления через определенные промежутки времени.
[187] Способы введения, дозы и оптимальные фармацевтические формы могут быть определены в соответствии с критериями, которые обычно учитываются при назначении лечения, адаптированного к животному, такими как, например, возраст или вес, тяжесть общего состояние, толерантность к лечению и наблюдаемые вторичные эффекты. Предпочтительно вакцину по настоящему изобретению вводят в количестве, которое является защитным или обеспечивает защитное действие против инфекции PCV3.
[188] Например, в случае вакцины по настоящему изобретению, содержащей полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью генома PCV3, или его гомолог или фрагмент, полипептид вводят один или более раз, который распространяется со временем, непосредственно или с помощью трансформированной клетки, способной экспрессировать полипептид, в количестве от 0,1 до 10 мкг на килограмм веса животного, предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 5 мкг/кг, более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 2 мкг/кг на дозу.
in vivo
[189] Настоящее изобретение также относится к применению нуклеотидных последовательностей PCV3 по изобретению для создания авторепликативных ретровирусных векторов и к их терапевтическому применению, в частности, в области генной терапии .
[190] Нет необходимости в дополнительной демонстрации возможности использования генной терапии применительно к человеку, и это также относится к многочисленным терапевтическим применениям, таким как генетические заболевания, инфекционные заболевания и раковые заболевания. В многочисленных документах предшествующего уровня техники описаны способы применения генной терапии, в частности, с использованием вирусных векторов. В общем случае, векторы получают путем делеции по меньшей мере некоторых вирусных генов, которые заменяются генами, представляющими терапевтический интерес. Такие векторы могут быть размножены в комплементирующей линии клеток, которая обеспечивает в транс-положении удаленные вирусные функции, позволяя генерировать дефектную по репликации вирусную векторную частицу, но способную заражать клетку-хозяина. На сегодняшний день ретровирусные векторы являются наиболее широко используемыми, и способ инфицирования ими хорошо описан в литературе, доступной специалисту в данной области.
[191] Принцип генной терапии заключается в доставке функционального гена, называемого представляющим интерес геном, РНК которого или соответствующий белок обеспечит желаемый биохимический эффект в целевых клетках или тканях. С одной стороны, введение генов позволяет осуществлять длительную экспрессию сложных и нестабильных молекул, таких как РНК или белки, которые чрезвычайно трудно или даже невозможно получить или непосредственно вводить. С другой стороны, контролируемая вставка нужного гена внутрь целевых специфических клеток позволяет регулировать продукт экспрессии в определенных тканях. Для этого необходимо иметь возможность вставлять нужный терапевтический ген внутрь выбранных клеток и, таким образом, иметь доступный способ введения, способный направленно воздействовать конкретно на выбранные клетки или ткани. Некоторыми предпочтительными генами, представляющими интерес с точки зрения настоящего изобретения, являются гены, кодирующие ORF1, ORF2 или ORF3.
in vivo
[192] Среди способов введения генов широко распространены способы введения генов, такие как, например, микроинъекция, особенно инъекция голой плазмидной ДНК, электропорация, гомологичная рекомбинация, использование вирусных частиц, таких как ретровирусы. Однако, применяемые , системы переноса генов рекомбинантного ретровирусного типа в то же время обладают слабой инфекционной способностью (недостаточная концентрация вирусных частиц) и отсутствием специфичности в отношении выбранных клеток-мишеней.
[193] Получение специфических к определенным типам клеток вирусных векторов, имеющих тканеспецифический тропизм и содержащих представляющий интерес ген, который может адекватно транслироваться в клетке-мишени, реализуется, например, путем слияния специфического лиганда целевых клеток-хозяев с N-концевой частью поверхностного белка оболочки PCV3. Можно упомянуть, например, конструкцию ретровирусных частиц, имеющих молекулу CD4 на поверхности оболочки, для нацеливания на клетки человека, инфицированные ВИЧ-вирусом, вирусные частицы, имеющие пептидный гормон, слитый с белком оболочки для специфичного инфицирования клеток, экспрессирующих соответствующий рецептор, или, альтернативно, вирусные частицы, имеющие слитый полипептид, способный прикрепляться к рецептору эпидермального фактора роста (EGF). В другом подходе одноцепочечные фрагменты антител к поверхностным антигенам клеток-мишеней вводят путем слияния с N-концевой частью белка оболочки.
[194] Для целей настоящего изобретения ген, представляющий интерес для применения в изобретении, может быть получен из эукариотического или прокариотического организма или из вируса любым традиционным способом. Предпочтительно он способен продуцировать продукт экспрессии, имеющий терапевтический эффект, и может быть продуктом, гомологичным или, альтернативно, гетерологичным клетке-хозяину. В рамках настоящего изобретения представляющий интерес ген может кодировать (1) внутриклеточный или (2) мембранный продукт, присутствующий на поверхности клетки-хозяина или (3), секретируемый вне клетки-хозяина. Следовательно, он может содержать соответствующие дополнительные элементы, такие как, например, последовательность, кодирующую сигнал секреции. Эти сигналы известны специалисту в данной области техники.
[195] В соответствии с целями, преследуемыми настоящим изобретением, представляющий интерес ген может кодировать белок, соответствующий всему или части нативного белка, встречающегося в природе. Он также может быть химерным белком, например, возникшим в результате слияния полипептидов различного происхождения, или мутантным, имеющим улучшенные и/или модифицированные биологические свойства. Такой мутант может быть получен обычными биологическими методами путем замещения, делеции и/или добавления одного или более аминокислотных остатков.
[196] Таким образом, изобретение относится к векторам, отличающимся тем, что они содержат нуклеотидную последовательность PCV3 по изобретению, и тем, что они дополнительно содержат представляющий интерес ген.
[197] Аналогично, настоящее изобретение относится к вирусным частицам, полученным из указанного вектора в соответствии с изобретением. Оно также относится к способам получения вирусных частиц в соответствии с изобретением, отличающимся тем, что в них используется вектор по изобретению, включая вирусные псевдочастицы (VLP, вирусоподобные частицы).
[198] Изобретение также относится к клеткам животных, трансфицированных вектором по изобретению. В изобретении также представлены клетки животных, в частности млекопитающих, инфицированные вирусной частицей по изобретению.
[199] В одной из предпочтительных вакцин используется ДНК-клон живого химерного вируса, в частности, клон, содержащий иммуногенные гены PCV3, клонированные в остов непатогенного PCV1. Преимущественно живой химерный вирус, который, естественно, является авирулентным при создании методом генной инженерии, не требует длительных процедур аттенуации. Вирус используется исключительно в виде живого, но непатогенного реплицирующегося вируса, который продуцирует иммуногенные белки против PCV3 во время репликации, которые затем могут вызывать полный спектр иммунных реакций против патогенного PCV3.
in vitro
in vivo
[200] В качестве дополнительного преимущества живой химерный вирус по настоящему изобретению обеспечивает генетически стабильную вакцину, которую легче изготавливать, хранить и доставлять, по сравнению с другими типами аттенуированных вакцин. Авирулентные или аттенуированные вакцины на основе химерных вирусов обычно считаются настолько же, если не более, безопасными, как и традиционно модифицированные живые вакцины. Например, было показано, что вакцина ChimeriVax-JE против вируса японского энцефалита (JEV), которая представляет собой полученное методом генной инженерии производное вакцины против вируса желтой лихорадки YFV17D, в которой гены, кодирующие структурные prM и E белки YFV17D, заменены соответствующими генами аттенуированного штамма SA14-14-2 JEV, является генетически стабильной после длительных пассажей как , так и . Было обнаружено, что другая химерная вирусная вакцина ChimeriVax-D2 против вируса денге типа 2, которая является аттенуированным химерной вирусом желтой лихорадки (YF) типа 2 (вирус денге-2), является генетически стабильной; также имеется сообщение о том, что ее последовательность не изменилась после 18 пассажей в клетках Vero.
[201] В другой предпочтительной вакцине по настоящему изобретению используются подходящие плазмиды для доставки непатогенного химерного ДНК-клона свиньям. В отличие от традиционной вакцины, в которой используется живая или убитая клеточная культура, в которой был размножен цельный вирус, в настоящем изобретении предусмотрена непосредственная инокуляция свиней плазмидной ДНК, содержащей инфекционный химерный вирусный геном.
[202] Дополнительные вакцины, сконструированные методом генной инженерии, используемые в настоящем изобретении, получают способами, известными в данной области. Такие способы включают, без ограничения, дополнительные способы обработки рекомбинантной ДНК, модификацию или замещение аминокислотных последовательностей рекомбинантных белков и т.п. Генетически сконструированные вакцины на основе технологии рекомбинантной ДНК получают, например, путем идентификации альтернативных частей вирусного гена, кодирующих белки, отвечающие за индукцию более сильного иммунного или защитного ответа у свиней (например, белки, полученные из ORF1, ORF2, ORF3). Такие идентифицированные гены или иммунодоминантные фрагменты могут быть клонированы в стандартные векторы экспрессии белка, такие как вектор бакуловируса, и могут использоваться для инфицирования соответствующих клеток-хозяев. Клетки-хозяева культивируют, таким образом обеспечивая экспрессию требуемых белков вакцины, которые могут быть очищены до нужной степени и введены в подходящий вакцинный продукт.
[203] Если у клонов сохранилась нежелательная природная способность вызывать заболевание, можно точно определить нуклеотидные последовательности в вирусном геноме, ответственные за любую остаточную вирулентность, и методом генной инженерии создать авирулентный вирус с помощью, например, сайт-направленного мутагенеза. Сайт-направленный мутагенез позволяет добавлять, удалять или изменять один или более нуклеотидов. Синтезируют олигонуклеотид, содержащий требуемую мутацию и подвергают отжигу на части одноцепочечной вирусной ДНК. Гибридная молекула, получающаяся в результате этой процедуры, используется для трансформации бактерий. Затем содержащую соответствующую мутацию двухцепочечную ДНК, которую выделяют, используют для получения полноразмерной ДНК путем лигирования рестрикционных фрагментов последней, которую затем трансфицируют в подходящую клеточную культуру. Лигирование генома в подходящий вектор для переноса может быть осуществлено любым стандартным методом, известным специалистам в данной области техники. Трансфекцию вектора в клетки-хозяева для продуцирования вирусного потомства можно проводить любым обычным способом, таким как кальций-фосфатный способ или DEAE-декстран трансфекция, электропорация, слияние протопластов, а также другими хорошо известными способами. Затем клонированный вирус демонстрирует требуемую мутацию. Альтернативно, могут быть синтезированы два олигонуклеотида, которые содержат соответствующую мутацию. Они могут быть подвергнуты отжигу с образованием двухцепочечной ДНК, которая может быть вставлена в вирусную ДНК с получением полноразмерной ДНК.
[204] Генетически сконструированные белки, используемые в вакцинах, например, могут быть экспрессированы в клетках насекомых, дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Генетически сконструированные белки, которые могут быть очищены или выделены обычными способами, могут быть непосредственно введены свиньям для обеспечения защиты от вирусной инфекции или мультисистемного синдрома истощения после отъема (PMWS), вызванного PCV3. Линию клеток насекомых (например, HI-FIVE) можно трансформировать вектором переноса, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты, полученные из вируса, или скопированные с вирусного генома, который кодирует один или более иммунодоминантных белков вируса. Вектор переноса включает, например, линеаризованную бакуловирусную ДНК и плазмиду, содержащую требуемые полинуклеотиды. Линию клеток-хозяев можно котрансфицировать линеаризованной бакуловирусной ДНК и плазмидой для получения рекомбинантного бакуловируса.
[205] В качестве альтернативы, в живые векторы, такие как поксвирус или аденовирус, может быть вставлена и использована в качестве вакцины ДНК из свиньи, страдающей пневмонией, репродуктивной недостаточностью, PDNS и/или PMWS, которая кодирует один или более капсидных белков, PCV3-инфекционный молекулярный ДНК-клон или PCV-клонированный геном химерной ДНК.
[206] Иммунологически эффективное количество вакцин или иммуногенных композиций по настоящему изобретению вводят свинье, нуждающейся в защите от вирусной инфекции, пневмонии, репродуктивной недостаточности, PDNS и/или PMWS. Иммунологически эффективное количество или иммуногенное количество, которое вводят свинье, можно легко определить или легко оттитровать обычным тестированием. Эффективным количеством является количество, при котором достигается достаточный иммунологический ответ на вакцину для защиты свиньи, подверженной воздействию вируса, вызывающего PMWS. Предпочтительно свинью защищают в той степени, при которой все неблагоприятные физиологические симптомы или эффекты вирусного заболевания уменьшаются или облегчаются в существенной степени или полностью предотвращаются.
in vitro
50
[207] Вакцину можно вводить в виде единичной дозы или в виде повторных доз, при этом единичные дозы являются предпочтительными. Вакцины для однократного применения обеспечивают защиту после единичной дозы без необходимости в каких-либо бустерных или последующих дозах. Защита может включать полное предупреждение появления клинических признаков инфекции или уменьшение тяжести, продолжительности или вероятности проявления одного или более клинических признаков инфекции. Дозировки могут варьировать, например, от примерно 1 микрограмма до примерно 1000 микрограммов плазмидной ДНК, содержащей инфекционный химерный ДНК-геном (в зависимости от концентрации иммуноактивного компонента вакцины), предпочтительно от 100 до 200 микрограммов химерного ДНК-клона PCV1-3, но не должны содержать количество антигена на основе вируса, достаточное для того, чтобы вызвать неблагоприятную реакцию или физиологические симптомы вирусной инфекции. В данной области техники известны способы определения или титрования подходящих доз активного антигенного агента для определения минимальных эффективных доз, исходя из веса свиньи, концентрации антигена и других типичных факторов. В качестве вакцины предпочтительно использовать инфекционный химерный вирусный ДНК-клон, или можно получить  живой инфекционный химерный вирус, а затем использовать этот живой химерный вирус в качестве вакцины. В этом случае свинье можно вводить, например, от 50 до 10000 50% инфекционной дозы для тканевой культуры (TCID) живого химерного вируса.
[208] Желательно вводить вакцину свинье, еще не зараженной вирусом PCV. Вакцина, содержащая химерный ДНК-клон PCV1-3 или другие его антигенные формы, удобно вводить интраназально, трансдермально (т.е. наносить на поверхность кожи для системной абсорбции), парентерально и т.д. Парентеральный путь введения включает, без ограничения внутримышечное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутрикожное (т.е., вводимое путем инъекции или наносимое иным способом под кожу) введение и т.п. Поскольку внутримышечная и внутрикожная инокуляции были успешными в других исследованиях с использованием вирусных инфекционных ДНК-клонов, эти способы введения являются наиболее предпочтительными, дополнительно к удобному интраназальному введению. Хотя это и менее удобно, также предполагается введение вакцины свинье путем инокуляции в лимфоузлы. Один уникальный, предпочтительный способ введения включает прямое впрыскивание свинье плазмидной ДНК, содержащей PCV1-3-химеру, в мышцу, под кожу, в лимфоузлы и т.д.
[209] При введении в виде жидкости настоящая вакцина может быть получена в виде водного раствора, сиропа, эликсира, настойки и т.п. Такие препараты известны в данной области, и их обычно получают растворением антигена и других типичных добавок в соответствующих системах носителей или растворителей. Подходящие носители или растворители включают, без ограничения, воду, физиологический раствор, этанол, этиленгликоль, глицерин и т.д. Типичными добавками являются, например, сертифицированные красители, ароматизаторы, подсластители и противомикробные консерванты, такие как тимеросал (натрий-этилмеркуритиосалицилат). Такие растворы могут быть стабилизированы, например, путем добавления частично гидролизованного желатина, сорбита или клеточной культуральной среды и могут быть забуферены обычными способами с использованием реагентов, известных в данной области, таких как гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, дигидрофосфат калия, их смесь и т.п.
[210] Жидкие составы также могут включать суспензии и эмульсии, которые содержат суспендирующие или эмульгирующие агенты в сочетании с другими стандартными компонентами лекарственного состава. Эти типы жидких составов могут быть получены обычными способами. Суспензии, например, могут быть получены с помощью коллоидной мельницы. Эмульсии, например, могут быть получены с использованием гомогенизатора.
[211] Парентеральные препараты, предназначенные для инъекций в системы циркуляции жидкостей в организме, требуют правильной изотоничности и буферизации pH до соответствующих уровней рН жидкостей в организме свиней. Изотоничность может быть соответствующим образом отрегулирована с помощью хлорида натрия и других солей, по мере необходимости. Подходящие растворители, такие как этанол или пропиленгликоль, могут быть использованы для повышения растворимости ингредиентов в составе и стабильности жидкого препарата. Дополнительные добавки, которые могут быть использованы в настоящей вакцине, включают, без ограничения, декстрозу, обычные антиоксиданты и обычные хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). Парентеральные лекарственные формы также требуют стерилизации перед их применением.
[212] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к белку, кодируемому химерной молекулой ДНК. Этот белок можно вводить отдельно или дополнительно к другим описанным в настоящей заявке композициям. В предпочтительных формах белок вводят в количестве от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/мл. Раскрытая в настоящем описании химерная молекула ДНК является предпочтительной.
[213] Конкретный ДНК-клон PCV3 конструируют согласно изобретению так, чтобы обеспечивалась возможность получения биологически чистого и гомогенного маточного раствора вируса для изучения патогенеза и разработки непатогенных химерных вакцин. Использование этого молекулярного ДНК-клона и биологически чистого и гомогенного маточного раствора вируса PCV3, полученного из клона молекулярной ДНК, позволяет более точно, чем раньше, охарактеризовать динамику клинического заболевания, распространения вируса и патологических поражений, ассоциированных с инфекцией PCV3, что обеспечивает возможность для разработки нужных вакцинных продуктов по настоящему изобретению.
in vitro
in vivo
[214] Молекулярный клон PCV3 генерируют путем лигирования двух копий полного генома PCV3 в тандеме в вектор pSK. Резко отличаясь от генома с единственной копией, известного из области техники, PCV3-инфекционной ДНК-клон, полученный описанными в настоящей заявке способами, содержит две полные копии генома PCV3, лигированные вместе в тандемном повторе. Лигирование двух копий генома в тандеме обеспечивает аналогичный кольцевой геном, который имитирует обычный кольцевой геном PCV3. Преимущество наличия двух копий генома в тандеме в PCV3-инфекционном ДНК-клоне заключается в увеличении репликации при  и  инфицировании ДНК-клоном. Таким образом, клон по изобретению работает более эффективно, эффективнее, чем предыдущий геном с единственной копией.
in vivo
[215] Инфицирование животных молекулярным вирусным клоном чрезвычайно полезно для изучения генетических детерминант вирусной репликации и вирулентности у хозяина. PCV3 был идентифицирован как возбудитель пневмонии, репродуктивной недостаточности, PMWS и PDNS. PMWS и PDNS представляют собой сложные синдромы заболеваний у свиней, и в клиническом проявлении PMWS и/или PDNS может участвовать несколько факторов. Однако трудность получения биологически чистой формы PCV3 из-за наличия других обычно встречающихся у свиней агентов в тканях гомогенатов пораженных свиней препятствовала окончательной характеристике клинических заболеваний и патологических поражений, которые были связаны исключительно с инфекцией PCV3. Это будет первый случай, когда PCV3-инфекционный молекулярный ДНК-клон будет сконструирован и использован для характеристики заболевания и патологических поражений, ассоциированных с инфекцией PCV3, путем прямой трансфекции свиньям  молекулярного клона.
in vitro
[216] Было показано, что гомогенный маточный раствор живого вируса PCV3, полученный из молекулярного клона, является инфекционным  при трансфекции в клетки PK-15. Клонированная геномная ДНК PCV3 также является инфекционной при непосредственном введении в печень и поверхностные подвздошные лимфатические узлы не содержащих патогена (SPF) свиней. У животных с введенной клонированной плазмидной ДНК PCV3, как правило, развивается инфекция и заболевание, сходные с теми, которые возникают в результате интраназальной инокуляции гомогенного инфекционного маточного раствора живого вируса PCV3. Сероконверсия в PCV3-специфическое антитело обнаруживается у большинства свиней из инокулированных групп через 35-дневной постинокуляции (DPI).
in vitro
[217] Начало и продолжительность виремии у свиней, инокулированных химерным ДНК-клоном PCV1-3, являются такими же, как у свиней, инокулированных непатогенным клоном ДНК PCV1, тогда как виремия у свиней, инокулированных клоном PCV3, появляется раньше и является более продолжительной. Начиная с дня 14 DPI и далее в течение примерно 2-6 недель, виремия наблюдается у большинства животных, зараженных PCV3. Аналогичным образом, большинство инокулированных свиней, при вскрытии на 35 день DPI, оказываются сероконвертированными к PCV3-антителам. Антиген PCV3 обнаруживается в различных тканях и органах инокулированных свиней. Большие поражения ограничены легкими и лимфатическими узлами и характеризуются системно увеличенными лимфоузлами желтовато-коричневого цвета, легкими, которые не спадают, и мягкими мультифокальными очагами уплотнения желтовато-коричневого цвета. Большие поражения лимфатических узлов как у свиней, инфицированных непатогенным PCV1, так и у свиней, инфицированных химерным PCV1-3, являются умеренными и наблюдаются только у нескольких животных, тогда как среди свиней, инфицированных патогенным PCV3, случаи отека от умеренной до тяжелой степени и обесцвечивания лимфоидных тканей являются более частыми. Статистический анализ показывает, что количество обширных поражений в лимфатических узлах животных, инокулированных химерным PCV1-3, является таким же, как и у свиней, инокулированных непатогенным PCV1. На 21 DPI, у свиней, зараженных PCV3, наблюдаются серьезные поражения, которые статистически являются более тяжелыми, чем у свиней, инокулированных PCV1 и химерным PCV1-3. Гистопатологические поражения и PCV3-специфический антиген обнаруживаются в многочисленных тканях и органах, включая мозг, легкие, сердце, почки, миндалины, лимфатические узлы, селезенку, подвздошную железу и печень зараженных (инфицированных) свиней. В случае клона молекулярной ДНК PCV3, а также инфекционного вируса, полученного  из клона молекулярной ДНК, гистопатологические поражения во многих тканях и органах, подобны тем, которые наблюдаются при PMWS. При изучении под микроскопом, как на 21, так и на и 49 DPI, животные, инфицированные химерным PCV1-3, имеют статистически менее значимые микроскопические повреждения, чем животные, зараженные PCV3. Показатели микроскопических поражений в лимфатических узлах свиней, инокулированных химерным PCV1-3, аналогичны таковым у животных, инокулированных непатогенным PCV1, реципрокным химерным PCV3-1, и у неинфицированных контрольных животных. Микроскопические поражения, от умеренных до тяжелых, наблюдаются во многих тканях животных, зараженных патогенным PCV3, включая легкие, печень, лимфоидную ткань, селезенку, мозг, сердце, почки и миндалины. Однако у животных, инокулированных химерным PCV1-3, микроскопические поражения, от легкой до умеренной степени, ограничены только тканями печени, лимфатических узлов и почек.
[218] Доступность инфекционного ДНК-клона PCV3, описанного в настоящей заявке, позволяет разработать генно-модифицированную аттенуированную вакцину для предотвращения инфицирования свиней PCV3 и PDNS и PMWS.
[219] Структурные и функциональные отношения генов PCV можно лучше понять благодаря наличию инфекционных ДНК-клонов PCV3, PCV1, химерного PCV1-3 и реципрокного химерного PCV3-1, описанных в настоящей заявке.
in vivo
in vitro
in vivo
[220] Конструирование PCV3-инфекционного клона молекулярной ДНК и демонстрация инфекции путем прямой инъекции клонированной ДНК плазмиды PCV3 в печень и лимфатические узлы свиней в контексте настоящего изобретения будут полезны для изучения PCV3. Эта система трансфекции  позволяет улучшить изучение структурной и функциональной связи генов PCV3 с помощью рекомбинантных плазмид, сконструированных , для тестирования различных областей или генов PCV3 в отношении их роли в репликации вируса и патогенезе у хозяина. Репликация и патогенез PCV3 могут быть изучены  без необходимости создания инфекционных маточных растворов вируса путем размножения PCV3 в культурах клеток. Это выгодно, так как для вирусных вариантов можно выбирать серийные пассажи в клеточных культурах. Другим преимуществом использования клонированной геномной ДНК PCV3, вместо живого вируса, в случае изучения на животных является относительная легкость количественного определения инокулируемой дозы. Количество клонированной ДНК PCV3, используемой для инокуляции животным, может быть легко определено с помощью спектрофотометра, тогда как доза живого вируса PCV3 требует титрования инфекционной активности в культурах клеток и подтверждения заражения методом IFA. Прямая инъекция животным клонированной плазмидной ДНК PCV3 устраняет проблемы, связанные с присутствием других местных агентов в организме свиньи, в случае введения гомогената ткани для изучения на животных.
in vitro
in vivo
[221] В одном из аспектов настоящего изобретения иммуногенный ген капсидного белка ORF2 переключают между патогенным PCV3 и непатогенным PCV1 для получения уникальной структуры химерного вирусного ДНК-клона PCV1-3. Неожиданно оказалось, что химерный PCV1-3-инфекционный клон реплицируется, экспрессирует иммуногенный антиген капсидного белка ORF2  и  и индуцирует специфический антительный ответ против ORF2 PCV3, сохраняя при этом непатогенную природу PCV1. Химерный PCV1-3-инфекционный ДНК-клон обладает способностью индуцировать сильный иммунный ответ против PCV3, одновременно вызывая только ограниченную инфекцию с легкими патологическими поражениями, аналогичными таковым в случае непатогенного PCV1. При разработке вакцины, относительно простое хранение и стабильность клонированной ДНК, а также экономия при массовом производстве рекомбинантной плазмидной ДНК PCV3 и химерного ДНК-клона PCV1-3 обеспечивают привлекательное средство для доставки живой, инфекционной вирусной ДНК-вакцины или генетически модифицированных аттенуированных вирусных вакцин для свиней. Следовательно, химерный PCV1-3-инфекционный ДНК-клон, описанный в настоящей заявке, является полезной вакциной-кандидатом против инфекции PCV3 и PMWS.
[222] Следует понимать, что все используемые здесь научные и технологические термины имеют такое же значение, в каком они обычно используются специалистами в данной области техники. Для целей настоящего изобретения термин "инфекционный" означает, что вирус реплицируется в организме свиней независимо от того, вызывает ли он какие-либо заболевания. "SPF" относится к свинье, не содержащей патогены.
[223] "Гнотобиотические" свиньи относятся к свиньям, свободным от микробов. Термины "плазмидная ДНК PCV3", "геномная ДНК PCV3" и "молекулярная ДНК PCV3" используются взаимозаменяемо, означая одну и ту же клонированную нуклеотидную последовательность.
[224] В приведенных ниже примерах продемонстрированы некоторые аспекты настоящего изобретения. Однако следует понимать, что эти примеры приведены только с целью иллюстрации и не претендуют на полноту в отношении условий и объема настоящего изобретения. Следует учесть, что когда указаны типичные условия реакции (например, температура, время реакции и т.д.), условия, как выше, так и ниже указанных диапазонов, также могут быть использованы, хотя обычно они являются менее удобными. Примеры выполняли при комнатной температуре (от примерно 23°С до примерно 28°С) и при атмосферном давлении. Все части и проценты, упомянутые в настоящем описании, даны по весу, и все температуры выражены в градусах Цельсия, если не указано иное. Кроме того, если не указано иное, все компоненты по изобретению следует понимать в объеме терминов "включающий", "состоящий по существу из" и "состоящий из", используемых в формуле изобретения, в том смысле, в котором эти термины обычно используются в патентных документах.
[225] Другим аспектом настоящего изобретения является получение комбинированной вакцины(вакцин) или иммуногенных композиций. Такие комбинации могут быть составлены из различных компонентов вакцины, описанных в настоящей заявке. Например, вакцина по настоящему изобретению может включать обе части белка и части ДНК PCV3, как описано в настоящей заявке, которые вводят одновременно или раздельно. Кроме того, комбинации могут быть составлены из компонентов вакцины PCV3, описанных в настоящей заявке, и антигенов других болезнетворных организмов, таких как описано выше.
[226] Согласно еще одному аспекту вакцина или иммуногенная композиция сначала обезвоживается. Если композицию сначала лиофилизируют или обезвоживают другими способами, то перед вакцинацией указанную композицию регидратируют в водном растворе (например, физиологическом растворе, PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор)) или неводных растворах (например, масляной эмульсии (одинарной или двойной эмульсии на основе минерального масла или растительного/метаболизируемого масла), адъюванта на основе алюминия или на основе карбомера).
[227] Согласно настоящему изобретению эффективное количество комбинированной вакцины, вводимой свинье, обеспечивает эффективный иммунитет или защитное действие против микробиологических инфекций, вызванных PCV3 и по меньшей мере одним дополнительным патогеном. Предпочтительные комбинации антигенов для лечения и профилактики микробиологических заболеваний у свиней перечислены выше.
[228] Согласно еще одному варианту осуществления комбинированную вакцину вводят свиньям в одной или двух дозах с интервалом от 2 до 4 недель. Например, первое введение выполняют животному в возрасте от примерно 2-3 недель до примерно 8 недель. Второе введение выполняют примерно через 1-4 недель после первого введения первой вакцинации. В соответствии с еще одним вариантом осуществления ревакцинацию выполняют в интервале от 3 до 12 месяцев после введения второй дозы. Введение последующих доз вакцины предпочтительно осуществляют через каждые 6 месяцев. В другом предпочтительном варианте осуществления животные, вакцинированные до достижения возраста 2-3 недель, должны быть ревакцинированы. Введение последующих доз вакцины предпочтительно проводится ежегодно. В случае, если один из компонентов комбинированной вакцины эффективен после однократной дозы, такой компонент необходимо вводить только один раз с другим компонентом(компонентами), вводимым в соответствии с их предпочтительным режимом.
2
9
3
8
4
8
3
9
4
8
5
6
50
50
50
о
[229] Количество эффективной комбинированной вакцины зависит от ингредиентов вакцины и режима введения. Когда в комбинированной вакцине используется инактивированный вирус или модифицированный живой вирусный препарат, его количество в вакцине составляет от примерно 10 до примерно 10 TCID на дозу, предпочтительно от примерно 10 до примерно 10 TCID на дозу, более предпочтительно примерно от 10 до примерно 10 TCID на дозу. В общем случае, инактивированный антиген обычно используется в бльших количествах, чем живые модифицированные вирусы. Обычно, когда бактериальный антиген используется в комбинированной вакцине, вакцина содержит от примерно 10 до примерно 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) на дозу, предпочтительно от примерно 10 до примерно 10 (КОЕ) на дозу, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 10 (КОЕ) на дозу. Обычно субъединичные вакцины вводят с уровнем включения антигена по меньшей мере 0,2 мкг антигена на дозу, предпочтительно примерно от 0,2 до 400 мкг/доза, более предпочтительно от 0,3 до 200 мкг/доза, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до 100 мкг/доза, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/доза, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/доза, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 15 мкг/доза, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/доза, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/доза и еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/доза. Например, уровень включения антигена для антигена ORF2 PCV3, предпочтительно белка ORF2 PCV3, как предусмотрено в настоящей заявке, содержит от примерно 2 до примерно 150 мкг, предпочтительно от примерно 2 до примерно 60 мкг, еще более предпочтительно от примерно 2 мкг до примерно 50 мкг, еще более предпочтительно от примерно 2 мкг до примерно 40 мкг, еще более предпочтительно от примерно 2 мкг до примерно 30 мкг, еще более предпочтительно от примерно 2 мкг до примерно 25 мкг, еще более предпочтительно от примерно 2 мкг до примерно 20 мкг, еще более предпочтительно от примерно 4 мкг до примерно 20 мкг и еще более предпочтительно от примерно 4 мкг до примерно 16 мкг.
[230] Композиция по изобретению может быть введена внутрикожно, внутритрахеально или интравагинально. Композицию предпочтительно наносить внутримышечно или интраназально. Более предпочтительным может оказаться введение описанной выше фармацевтической композиции в организм животного путем внутривенной инъекции или путем прямой инъекции в ткани-мишени. Для системного применения предпочтительными являются внутривенный, внутрисосудистый, внутримышечный, интраназальный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, пероральный или интратекальный способы введения. Более локальное применение возможно путем подкожного, внутрикожного, чрескожного, внутрисердечного, внутриполостного, внутрижелудочного, внутримышечного введения или введения непосредственно в подлежащую лечению ткань (соединительную, костную, мышечную, нервную, эпителиальную ткань) или вблизи от нее. В зависимости от желаемой продолжительности и эффективности лечения композиции по изобретению можно вводить один или более раз, а также периодически, например, ежедневно в течение нескольких дней, недель или месяцев и в разных дозах.
Пример 1
[231] В этом примере разрабатывается кПЦР для специфического обнаружения гена капсидного белка PCV3.
[232] Вирусную ДНК выделяли из клинических образцов с помощью полного набора для выделения нуклеиновых кислот MagMax-96 в соответствии с протоколом производителя. Нуклеиновую кислоту из фиксированных формалином и залитых парафином тканей экстрагировали с помощью набора QIAamp DNA FFPE Tissue, согласно инструкции производителя (Qiagen, Valencia, CA). 5'-нуклеазный анализ проводили для нацеливания на область 112 п.о. нуклеиновой кислоты гена PCV3 в образцах: зонд, 5'-FAM-ACC CCA TGG-Zen-CTC AAC ACA TAT GAC C-Iowa Black-3' (SEQ ID No.14); прямой праймер, 5'-AGT GCT CCC CAT TGA ACG-3' (SEQ ID No.13); обратный праймер, 5'-ACA CAG CCG TTA CTT CAC-3' (SEQ ID No.12). Количественную ПЦР выполняли с помощью набора Qiagen Quantitect PCR в следующих условиях: 95°C, 15 минут; и 45 циклов при 94°C, 15 секунд и 60°C в течение 60 секунд. Чувствительность и специфичность анализа определяли методом серийных разведений плазмиды (pSF-CMV-cap), содержащей полный cap ген PCV3, клонированный в pSF-CMV-AMP (Oxford Genetics, UK), и нуклеиновую кислоту PCV2, экстрагированную из клеточной культуры. Значения порога цикла (Ct), определенные методом серийных разведений плазмиды, использовали для получения стандартной кривой для расчетов для определения геномных копий/мл (гк/мл).
TM
TM
[233] Полный геном для PCV3 определяли из пула гомогенатов образцов зародышевой ткани, полученных из фермы со вспышкой PDNS, и из образца в исследовании распространенности с помощью секвенирования по Сэнгеру четырех перекрывающихся ампликонов, полученных с помощью праймеров, приведенных в таблице 1. ПЦР выполняли, используя набор TaKaRa Taq, следующим образом: 94°C, 4 минуты; затем 40 циклов 94°C, 20 секунд; 50°C, 30 секунд; 72°C, 1 минута; и 72°С в течение 5 минут. Секвенирование для подтверждения выбора положительных образцов PCV3 выполняли с использованием набора праймеров для внутреннего гена 330 п.о.: 5'-CCA CAG AAG GCG CTA TGT C-3' (SEQ ID No.16) и 5'-CCG CAT AAG GGT CGT CTT G-3' (SEQ ID No.17). ПЦР реакции cap гена выполняли с помощью набора TaKaRa Taq, как описано выше. Продукты ПЦР секвенировали по Сэнгеру для проверки.
Пример 2
[234] В этом примере выделяли вирус.
[235] Вирус выделяли из тестикулярных клеток (ST) и почечных клеток (PK-15) свиней, поддерживаемых в минимальной основной среде (МЭМ), дополненной L-глутамином и 5%-ной фетальной сывороткой. Клетки высевали на 6-луночные планшеты (60-80% конфлюентные), и 100 мкл образца инокулировали в 1 мл вирусной среды для замещения, которая состояла из раствора MEM и пенициллина-стрептомицина. Клетки наблюдали ежедневно на наличие цитопатических эффектов, а рост PCV3 контролировали методом кПЦР и иммунофлюоресценцией.
Пример 3
[236] В этом примере продемонстрировано клонирование, экспрессия и очистка капсидного белка PCV3.
GCT AGC
GAA TTC
E.coli
E.coli
[237] Для создания рекомбинантной cap конструкции PCV3, создавали праймеры для амплификации части гена PCV3, кодирующей аминокислоты (aa) 35-214: F, 5'-AAA AAA  GCT GGA ACA TAC TAC ACA-3' (SEQ ID No.18); R, 5'-AAA AAA  TTA GAG AAC GGA CTTGTA ACG-3' (SEQ ID No.19). 5'-концы прямого и обратного праймеров содержали сайты рестрикции NheI и EcoRI (подчеркнутые), соответственно. Продукты ПЦР клонировали в вектор pET28a (Novagen, Madison, WI) для обеспечения экспрессии N-терминального усеченного cap PCV3 в виде N-терминального 6х гистидин (His) рекомбинантного белка в . Плазмиду pET28a-cap трансформировали в клетки BL21 (DE3)  и экспрессировали, как описано ранее. После экспрессии бактерии собирали центрифугированием и лизировали с помощью реагента B-PER (Pierce, Rockford, IL) после очистки в Ni-NTA-агарозе (Qiagen, Valencia, CA) согласно инструкции изготовителя. Чистоту и идентичность рекомбинантного белка оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) в условиях денатурации, а также с помощью Вестерн-блоттинга, позволяющего обнаружить His-метку на N-конце рекомбинантного белка.
Пример 4
in vitro
[238] В этом примере показано получение и дана  характеристика моноклонального антитела к капсидному белку PCV3.
6
TM
[239] Мышей BALB/c иммунизировали очищенным, усеченным капсидным белком (35-214aa). Мышей инокулировали 50 мкг антигена, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда, раз в две недели в течение восьми недель. Затем мышиные клетки спленоцитов сливали с клетками миеломы NS-1. Моноклональные антитела (MAbs), специфичные к PCV3, идентифицировали с помощью иммунофлюоресцентных антител (IFA) с использованием клеток HEK293, экспрессирующих нативный cap PCV3. Клетки HEK293 в 6-луночном планшете, выращиваемые в MEM среде с 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и антибиотиками (ципрофлоксацин, пенициллин, стрептомицин и гентамицин), трансфицировали с помощью pSF-CMV-AMP или плазмиды, полученной из pSF-CMV-AMP, которая содержала полный cap ген PCV3, клонированный в сайт рестрикции XhoI (pSF-CMV-cap). В 6-луночном планшете 10 клеток трансфицировали Липофектамином 2000 (Invitrogen), согласно инструкции производителя, и 10 мкг ДНК. Через 48 часов планшеты фиксировали 80% ацетоном в течение 10 минут при комнатной температуре (RT) и оставляли сушить. Трансфицированные клетки инкубировали с неразбавленными MAb к PCV3-cap при 37°С в течение 1 часа, с последующим промыванием три раза фосфатным буферным раствором (PBS), затем инкубировали с козьими антителами к антимышиным IgG, конъюгированными с флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc West Grove, PA), разбавленными в PBS в соотношении 1:100, при 37°С в течение одного часа. После окончательной промывки клетки визуализировали, используя инвертированный флуоресцентный микроскоп Eclipse TE2000-U (Nikon). ST-клетки, инфицированные PCV2, использовали для оценки специфичности MAb к PCV3.
Пример 5
[240] В этом примере показано обнаружение PCV3 и иммуногистохимия в случаях PDNS.
[241] Ткани фиксировали в 10% нейтральном буферизованном формалине при RT и заливали парафином до получения срезов. Иммуногистохимию выполняли согласно стандартному протоколу, а микроскопические препараты визуализировали с помощью конфокального сканирующего микроскопа LSM 700 (Zeiss).
Пример 6
[242] В этом примере продемонстрирована разработка ELISA для рекомбинантного капсидного белка PCV3.
[243] ELISA выполняли аналогично описанному ранее анализу, используя 2 мкг/мл очищенного рекомбинантного капсидного белка PCV3 на лунку для покрытия планшетов с высокой степенью связывания Corning EIA/RIA (33-35).
[244] Результаты для примеров 1-6
Columbid
[245] Полные геномные последовательности PCV3, используемые в филогенетических анализах, были предоставлены в Genbank под номерами доступа KT869077 (штамм PCV3 29160) и KX458235 (штамм 2164 PCV3). Ранее опубликованные последовательности, используемые для филогенетического анализа, включают: цирковирус сомов (Barbel) (BarCV) GU799606; цирковирус-1 летучих мышей (BtCV-1), JX863737; цирковирус-2 летучих мышей (BtCV-2) KC339249; цирковирус-3 летучих мышей (BtCV-3) JQ814849; вирус болезни клюва и пера (BFDV) AF080560; цирковирус канареек (CaCV) AJ301633; цирковирус собак (CanineCV) KC241983; цирковирус, ассоциированный с фекалиями шимпанзе (ChfaCV) GQ404851; цирковирус уток (DuCV) AY228555; цирковирус европейского сома (EcatfishCV) JQ011377; цирковирус вьюрков (FiCV) DQ845075; цирувирус гусей (GoCV) AJ304456; циркувирус чаек (GuCV) DQ845074; ассоциированный с человеческими фекалиями циркувирус (HufaCV) GQ404856; цирковирус норок (MiCV) KJ020099; циркувирус  (PiCV) AF252610; цирровирус 1 свиней (PCV1) Y09921; цирровирус 2 свиней (PCV2) AF027217; PorkNW2/USA/2009 HQ738638; циркувирус ворон (RaCV) DQ146997; циркувирус скворцов (StCV) DQ172906; цирковирус лебедей (SwCV) EU056309; цировирус зебровой амадины (ZfiCV) KP793918.
[246] Клинические и гистологические результаты изучения вспышки PDNS-подобных заболеваний на коммерческой ферме.
[247] В течение июня 2015 года на коммерческой свиной ферме смертность свиноматок увеличилась на 10,2%, а зачатия снизились на 0,6% по сравнению с историческими средними значениями на ферме, из-за вспышки PDNS. Согласно клиническим оценкам, пораженные свиноматки были анорексичными и имели многофокальные папулы, макулы и поверхностный дерматит. Образцы тканей были предоставлены в ISUVDL для проведения диагностических тестов. Гистологически поражение кожи характеризовалось острым некротическим дерматитом и эпидерматитом, ассоциированным с лимфоплазматическими периваскулярными скоплениями клеток. В почках наблюдались расширенные корковые канальцы, ослабление и регенерация эпителия, выстилающего почечные канальцы, и крупными кластерами лимфоцитов и макрофагов, диффузно инфильтрованными в корковый интерстиций и гломерулы. На ферме количество абортированных мумифицированных плодов на помет увеличилось в 1,19 раз по сравнению с историческим средним показателем абортов. Абортированные пометы содержали мумифицированные плоды различного гестационного возраста, соответствующие ранее описанным абортам, ассоциированным с PCV2. В то время как обширные и гистологические поражения, наблюдаемые у свиноматок, а также наличие абортов, соответствовали PCVAD, все ткани свиней, включая почки, лимфатические узлы, легкие и кожу, оказались отрицательными по результатам иммуногистохимии (IHC) и кПЦР на наличие PCV2, PRRSV и IAV. Кроме того, зародышевые ткани оказались отрицательными на наличие PCV2, PRRSV и PPV согласно результатам кПЦР.
[248] Метагеномное секвенирование
Sus scrofa
de novo
[249] Пул тканевых гомогенатов, полученный от трех плодов, анализировали путем секвенирования вирусных метагеномов. В результате Miseq прогона было сгенерировано 989478 прочтений с картированием 926380 относительно генома хозяина . Оставшиеся прочтения группировали , что дало в результате 27 контигов. Примерно 54% прочтений картировали в 1246 п.о. контиг, который на 98% был аналогичным частичному геному циркувируса, идентифицированному в коммерческом свином фарше PorkNW2/USA/2009 (номер доступа HQ738638), согласно результатам BLASTN анализа. Остальные прочтения не показали сходства с каким-либо известным эукариотическим вирусом.
De novo
Sus scrofa
[250] Метагеномное секвенирование также проводили в отношении объединенного тканевого гомогената, полученного из образцов тканей свиноматок с PDNS-подобными поражениями.  группировка последовательностей, не вошедших в картирование относительно , дала 735 контигов, которые были проанализированы методом BLASTN. Два контига имели примерно 97% идентичности с вирусом гепатита 1 (TTV-1). Группировка с использованием эталонного PCV3 (KT869077) идентифицировала картирование четырех прочтений в геноме. Оставшиеся прочтения не показали гомологию с известными эукариотическими вирусами.
[251] Генетический анализ
rep
cap
rep
cap
rep
[252] Амплификация по типу крутящегося кольца с последующим секвенированием методом ПЦР и по Сэнгеру полученных ампликонов позволило получить из гомогената зародышевых тканей сборку кольцевого генома, состоящего из 2000 нуклеотидов (нт, nt). Анализ на ORF выявил три ORF, кодирующих белки размером более 200 аминокислот (aa), причем согласно результатам BLASTP анализа две ORF показали гомологию с  и  белками циркувируса, ориентированными в противоположных направлениях (фиг.1). В пределах 235 нт 5'-интергенной области между  и  ORF на нити  гена была предсказанная структура типа "стебель-петля", состоящая из 9 нт стебля и наномерной петли, идентичной таковой у PCV1 (TAGTATTAC) (SEQ ID No.15). Следуя соглашению, остаток ʺAʺ в положении 8 в наномерной петли определяли как положение ʺ1ʺ в геноме.
Circoviridae
rep
rep
[253] Самая большая ORF кодировала предсказанный 297 aa белок, который согласно результатам BLASTP анализа был на 69,4% идентичным неполному белку-репликазе  PorkNW2/USA/2009 (номер доступа ADU77001, 221 aa) и на 54% идентичным цирковирусу летучих мышей из Китая (номер доступа AIF76248, 293aa). Геном PorkNW2/USA/2009 получали из коммерческих свиных мясных продуктов, и он кодировал полную репликазу и неполный ген капсидного белка, которые по организации и последовательности оказались наиболее схожими с циркувирусными. Консервативные домены репликазы и геликазы цирковируса идентифицировали BLASTP анализом соответственно из aa 9-93 и 162-251 участков в  ORF. Дальнейшее изучение последовательности белка  ORF выявило консервативные мотивы репликации по типу крутящегося кольца (RCR) и мотив P-петли, аналогичные GoCV и PiCV. Из трех консервативных мотивов RCR цирковирусов, мотив FTLNN (SEQ ID No.20) в PCV3 содержал одну мутацию, представленную как FTINN (SEQ ID No.21). Эта мутация наблюдается у других цирковирусов, таких как GoCV. Два других мотива RCR, HLQG (SEQ ID No.22) и YCKK (SEQ ID No.23), также присутствуют в PCV3. Кроме того, в PCV3 были идентифицированы три консервативных мотива в белках-репликазах цирковируса с неизвестной функцией, включая WWDGY (аминокислоты 196-200) (SEQ ID No.24), DDFYGWVP (аминокислоты 209-216) (SEQ ID No.25) и DRYP (аминокислоты 225-228) (SEQ ID No.26). Интересно, что канонический инициирующий кодон не был идентифицирован. Кодон GTC (кодирующий валин) (SEQ ID No.27) присутствует на 5'-конце ORF с ближайшим ATG (SEQ ID No.28) внутри рамки считывания, находящимся ниже примерно на 400 п.о. Этот альтернативный инициирующий кодон был также найден в PorkNW2/USA/2009. Были предложены альтернативные инициирующие кодоны нескольких цирковирусов птиц, включая цирковирус гусей, цирковирус голубей и вирус болезни клюва и пера.
cap
rep
cap
[254] Согласно результатам BLASTP анализа, предполагаемый ORF с противоположной ориентацией относительно  кодирует 214 aa белок с 87% идентичностью к неполной последовательности капсидного белка (110 aa) PorkNW2/USA/2009 и 36-37% идентичностью к PCV2 и цирковирусам уток (233 и 257 аа, соответственно) (фиг.1). Подобно другим капсидным белкам цирковируса, N-конец содержал многочисленные остатки аргинина и был сильно основным. Консервативный домен капсидного белка цирковируса идентифицировали с BLASTP анализом из 26-173 aa. Кроме того,  белок PCV3 не имел прогнозируемых N-связанных сайтов гликозилирования, но содержал два предсказанных O-связанных сайта гликозилирования в положениях 146 и 150 aa (S и T, соответственно). Это отличается от PCV2, который имеет два экспериментально подтвержденных N-связанных сайта гликозилирования.
rep
[255] Третья ORF, расположенная на той же нити, что и предсказанный , кодирует 231 aa белок, который на 94% идентичен ORF, идентифицированной в PorkNW2/USA/2009, и на 39% идентичен мышиному герпесвирусу M169, белку с неизвестной функцией. Аналогично rep, неясен кодон инициации для ORF3. Кодон на 5'-конце приставляет собой TCG (кодирующий серин). Метионин в положении 55 aa ORF3 представляет собой альтернативный возможный сайт инициации, который дает 177 aa белок.
Circovirus
[256] Из-за генетического и структурного сходства с родом  и <70% капсидной aa идентичностью с другими видами новые виды предлагаются в качестве цирковируса свиней типа 3 (PCV3). Последовательности генома PCV3 были представлены в Genbank с номерами доступа KT869077 и KX458235.
[257] Филогенетический анализ
Circoviridae
[258] Для изучения эволюционной связи PCV3 с другими членами семейства , были проанализированы последовательности геномов из двадцати трех членов семейства и два генома PCV3. Анализ полных геномов цирковирусов позволил сгруппировать обе PCV3-последовательности в кладе с PorkNW2/USA/2009, отдельно от всех других членов рода (фиг.2). Филогенетический анализ показал, что PCV3 является наиболее тесно связанным с собачьим цирковирусом (KC241983), однако у этой связи отсутствует сильная бутстрэп поддержка. Филогенетический анализ также предполагает, что PCV3 и CV собак имеют общего предка с кладом, содержащим PCV1, PCV2 и BatCV-2 (KC339249). За исключением циркувируса человека (HufaCV, GQ404856), цирровирусы млекопитающих и птиц принадлежат к отдельным, хорошо подтвержденным кладам.
[259] Детектирование PCV3 методом ПЦР
cap
8
6
4
4
2
4
[260] Для подтверждения наличия PCV3 в образцах свиней, был разработан 5'-нуклеазный анализ для определения наличия  гена PCV3. Образцы гомогената зародышевых тканей, полученных из фермы со вспышкой заболевания, оказались сильно положительными на PCV3 со значениями Ct между 16,7 и 21,3, что соответствует высоким уровням PCV3 примерно до 1,88×10 и 7,55×10 гк (геномных копий)/мл. Ткани от трех свиноматок с PDNS-подобными поражениями оказались положительными на PCV3, имеющими от 2,13×10 до 8,62×10 кг/мл. Кроме того, на наличие PCV3 методом кПЦР были проанализированы 30 образцов сыворотки, представленных в ISUVDL. Образцы сыворотки оказались положительными на PCV3 с показателем, составляющим 5,63×10-2,28×10 гк/мл. Образец сыворотки с самым высоким титром PCV3 использовали для амплификации методом ПЦР для создания перекрывающихся ампликонов для получения второго полного генома PCV3, который оказался на 99,0% идентичным исходному PCV3 из фермы со вспышкой заболевания. Этот второй геном PCV3 был представлен в Genbank с номером доступа KX458235.
2
7
[261] Кроме того, для изучения распространенности PCV3, был проанализирован в общей сложности 271 образец, поданный в ISUVDL для диагностического тестирования респираторных заболеваний методом кПЦР. Тридцать четыре (12,5%) образца имели положительные титры: 3,00×10-1,52×10 гк/мл.
cap
[262] Характеристика MAb14 к PCV3-
[263] Клетки HEK293, трансфицированные pSF-CMV-cap, инкубировали отдельно с четырьмя различными супернатантами клональных клеток MAb и скринировали методом IFA. Локализованную в ядре флуоресценцию, как и ожидалось согласно предсказанному сигналу локализации высокоосновного ядра, наблюдали для клона 14 (MAb14). Флуоресценцию не наблюдали для клеток, трансфицированных pSF-CMV-Amp. Кроме того, в клетках ST, инфицированных PCV2, флуоресценцию не наблюдали.
[264] Выделение вирусов
[265] Вирус выделяли из клеток ST и PK-15. В клетки инокулировали отфильтрованными гомогенатами зародышевых тканей и трижды пассировали. Никаких цитопатических эффектов не наблюдали, и значения Ct увеличивались с каждым последующим пассажем. IFA не показал флуоресценцию в случае использования MAb14.
[266] Гистологические поражения, ассоциированные с наличием антигена PCV3 в случаях PDNS
[267] Образцы тканей от свиноматок с PDNS-подобными поражениями и архивных случаев PDNS изучали путем H&E окрашивания и методом IHC, используя MAb14 к PCV3. В легких была выявлена переменная степень бронхоинтерстициальной пневмонии, иногда осложненная вторичной гнойной бронхопневмонией. Небольшие и средние дыхательные пути и мелкие кровеносные сосуды были забиты перибронхиолярными и периваскулярными агрегатами лимфоцитов и плазматических клеток. Смежные альвеолярные перегородки были инфильтрированы лимфоцитами и плазматическими клетками. В просвете альвеол наблюдался сильный интралюминальный отек, смешанный с умеренным количеством пенистых макрофагов, редких многоядерных гигантских клеток и небольших кластеров нейтрофилов. Случайные лимфоциты и рассеянные макрофаги дали умеренное интрацитоплазматическое иммуноокрашивание против PCV3. В участке кожи дерма и подкожный слой имели характерный некротический васкулит с фибриноидным изменением и трансмуральной инфильтрацией нейтрофилов, кровоизлияние и экссудацию фибрина. Воспалительный инфильтрат во многих случаях распространяется на окружающие дерму и подкожный слой. Также были обнаружены рассеянные лимфоплазматические агрегаты, которые иногда окружали сосуды, и кожная аднекса. В некоторых случаях наблюдали гиперпластический эпидермис с мягким ортокератотическим гиперкератозом. Кожная лимфоцитарная инфильтрация дала выраженное интрацитоплазматическое иммуноокрашивание против PCV3. Минимальное окрашивание фона было очевидным при замене PCV3MAb14 на PBS.
[268] В лимфатических узлах был обнаружен диффузный гранулематозный лимфаденит. В корковых фолликулах наблюдали умеренное лимфоидное истощение и инфильтрированные гистиоциты и многочисленные многоядерные гигантские клетки. Подкорковые и медуллярные синусы были расширены из-за наличия умеренного количества отеков и кровоизлияний, смешанных с многочисленными макрофагами и плазматическими клетками. Фолликулярная и перифолликулярная лимфоцитарная популяции показали диффузное интенсивное внутрицитоплазматическое окрашивание против PCV3 по сравнению с окрашиванием фона, где PCV3 MAb14 был заменен на PBS, или по сравнению с тканью лимфатического узла, полученной от свиньи отрицательной на наличие PCV3 по данным кПЦР.
[269] Срезы почек характеризовались наличием диффузионного мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита. Наблюдался сильный гломерулосклероз, капсулы Боумена часто были утолщены, а корковые канальцы ослаблены и ассоциированы с проявляемым в разной степени интерстициальным фиброзом. Гломерулярный мезангий был гиперклеточным и утолщен аморфным эозинофильным материалом. В некоторых случаях канальцы были эктатическими, выстланными утонченным эпителием и иногда с выраженным протеозом. Во всех срезах наблюдали рассеянные кластеры лимфоцитов и плазматических клеток в интерстиции от малого до среднего размера. В трубчатом эпителии наблюдали случайные области положительного окрашивания на PCV3. Минимальная фоновая флуоресценция наблюдалась в слайдах, имитирующих PBS и козьи антимышиные FITC, или тканях почек, полученных от свиньи, отрицательной на PCV3 по результатам кПЦР.
[270] Детектирование нуклеиновой кислоты PCV3 в тканях с поражениями PDNS
4
cap
[271] Для дальнейшего изучения этиологической роли PCV3 в PDNS оценивали 48 случаев гистологических поражений, соответствующих PDNS, которые по результатам ранее проведенных тестов методом IHC (иммуногистохимии) оказались отрицательными на PCV2. Образцы ткани из залитых парафином блоков ткани проанализированы на наличие PCV3 методом кПЦР. Сорок пять (93,8%) случаев оказались положительными на PCV3 с вирусными титрами 1,60-3,47×10 гк/мл. Для подтверждения этих результатов пять образцов с самыми высокими вирусными титрами проанализированы методом ПЦР, нацеленной на 330 п.о. фрагмент гена. Целевой ампликон амплифицировали во всех образцах, и последовательности продуктов ампликона показали 100% идентичность с последовательностью генома PCV3. Ткани из пяти случаев ПЦР-положительных на PCV3 протестировали методом IHC на наличие PCV3. Три из пяти оказались положительными.
[272] Доминирование серотипа PCV3
cap
cap
cap
[273] Распространенность антител к  PCV3 в сыворотках свиней изучали методом ELISA с использованием антигена PCV3-. Восемнадцать образцов сыворотки от 3-недельных свиней, полученных из определенного патогенного стада, которое по результатам кПЦР оказалось отрицательным на PCV3, использовали в качестве отрицательных контролей со средним значением абсорбции 0,49. Пороговое значение, дифференцирующее положительную и отрицательную сыворотку, определяли как три стандартных отклонения от среднего значения отрицательных контролей (0,87). Сыворотки от десяти свиноматок из фермы со вспышкой инфекции, собранные через три месяца после вспышки PDNS, оказались положительными со средним значением абсорбции 1,27. Кроме того, также были протестированы 27 сывороток, полученных от молодых свиней из фермы, которая поставляет животных на фермы для замены свиноматок, причем семнадцать животных (63%) имели абсорбцию, равную 0,88-1,37. Анти-PCV3- антитела были обнаружены в 47 из 83 (56,6%) образцов, представленных для независимого диагностического тестирования из нескольких штатов. Из положительных образцов 13 были получены из Айовы, один из Индианы, пять из Мексики, четыре из Северной Каролины, пять из Небраски, один из Оклахомы и 18 были неизвестного происхождения.
[274] Обсуждение
6
8
7
[275] Впервые описанный в 1993 году в Европе, PDNS был зарегистрирован во многих странах мира. Хотя распространенность заболевания в стаде обычно является низкой (<1%), смертность среди пораженных свиней может быть высокой. Частота PDNS может превышать заболеваемость PMWS в Европе и Соединенном Королевстве. Хотя этиология PDNS неизвестна, нуклеиновая кислота PCV2 обычно обнаруживается у пораженных свиней методом кПЦР, в то время как антиген PCV2 обнаруживается не во всех случаях. Это привело к предположению о роли PCV2 в PDNS. Настоящее изобретение позволило обнаружить сильно отличающийся новый вид цирковируса свиней, обозначенный как PCV3, в образцах мумифицированных абортированных плодов свиноматок с PDNS-подобными повреждениями, и образцах, полученных от свиноматок, умерших в результате острой инфекции, с клиническими признаками, соответствующими PDNS. PCV3 был единственным вирусом, идентифицированным методом метагеномного секвенирования объединенных образцов зародышевых тканей, что было подтверждено результатами кПЦР. Значения порогового цикла 16,7-21,3 в пулах зародышевых тканей показывают высокие вирусные титры 7,55×10-1,88×10 гк/мл образца. Существует корреляция между PCV2 титром у плодов и репродуктивным заболеванием, с уровнем PCV2, составляющим 10 копий ДНК PCV2/500 нг зародышевой ткани, или в более высокой степени связанная с PCV2-ассоциированной репродуктивной недостаточностью, включая мумификацию. На основе количества нуклеиновых кислот PCV3 и распределения в ткани, обнаруженных во время этой вспышки, была обнаружена аналогичная корреляция для PCV3 и репродуктивной недостаточности.
[276] PCV3 также был обнаружен методами ПЦР и IHC в коже, легких, почках и лимфатических узлах свиноматок с PDNS-подобными поражениями. Как ПЦР, IHC, так и метагеномное секвенирование не смогли идентифицировать PCV2 в образцах, собранных на ферме со вспышкой инфекции. Эти результаты показывают, что инфекция PCV3 вносит вклад в PDNS-подобные поражения, абортивные случаи и PCV3 у плодов являются результатом вертикальной передачи. В подтверждение этой этиологической роли PCV3 в PDNS поражениях был проведен скрининг архивных PDNS случаев, отрицательных на PCN2 по результатам IHC, который показал, что нуклеиновая кислота PCV3 является широко распространенной (93,8%), а три из пяти случаев, исследованных методом IHC на PCV3, оказались положительными. Следует отметить, что относительно низкие титры PCV3 в тканях могут стать препятствием для достоверного обнаружения.
Anelloviridae
[277] Попытки экспериментально воспроизвести PDNS с использованием PCV2 оказались безуспешными, однако PDNS был воспроизведен экспериментально в отсутствие PCV2 с использованием PRRSV и тканевого гомогената, содержащего TTV. Относительно мало известно о клиническом значении инфекции TTV. TTV встречается у свиней во всем мире. В то время как TTV обычно обнаруживается у здоровых свиней, в нескольких работах было выдвинуто предположение, что инфекция TTV замедляет развитие заболевания до тяжелой формы во время коинфицирования. Например, инокуляция свиней тканевым гомогенатом, содержащим TTV с последующим инфицированием PCV2, приводила к развитию PMWS, тогда как при моноинфекции этого не наблюдали. Свиноматок из фермы со вспышкой PDNS инфицировали как PCV3, так и TTV1. Воздействие сопутствующей инфекции TTV1 неизвестно. Неясно, влияет ли сопутствующее инфицирование генетически разнородными небольшими циклическими ДНК-вирусами, такими как TTV1 (), PCV2 и PCV3, на развитие PDNS. Аддитивные эффекты на тяжесть заболевания, вызванного сопутствующими инфекциями PCV2, были продемонстрированы для PMWS. Сопутствующая инфекция PPV и PCV2 показала, что болезнь усугубляется. Сопутствующие инфекции PCV2 и PRRSV являются значимым компонентом комплекса респираторных заболеваний свиней. Инфицирование стада этими агентами вызывает тяжелые респираторные заболевания и экономически разрушительные аборты и смертность.
[278] Патогенез PDNS, который включает характерный некротический васкулит, считается проявлением иммунного комплекса, опосредованного расстройством с участием PCV2. В контрольном исследовании все свиньи с клиническими признаками PDNS были положительными на PCV2 по результатам ПЦР и имели значительно более высокие титры антител к PCV2, чем у клинически нормальных свиней. Исследование почек свиней, положительных на PDNS, выявило увеличение фибриноидных отложений в клубочках, состоящих из накопленных IgG1, IgG2, IgM и факторов комплемента C1q и C3, по сравнению с клинически нормальными свиньями. Хотя антиген PCV2 был идентифицирован методом IHC в легочной ткани этих свиней с PDNS, антиген PCV2 не был идентифицирован в иммунных комплексах. Этот результат аналогичен нестабильному обнаружению PCV2 в почечных тканях свиней PDNS, о котором сообщают другие источники. Известно, что вирусные инфекции способствуют иммунологическим нарушениям, из-за которых алеутская болезнь норок (AMD), вызванная вирусом алеутской болезни норок (AMDV), имеет сходный патогенез с PDNS. Патогенез AMD связан с сверхпродуцированием специфичных к AMDV антител IgG. Роль PCV3 в возможном опосредованном иммунным комплексом нарушении, приводящем к патогенезу PDNS, нуждается в дальнейшем изучении.
[279] PCV2 является одним из наиболее экономически значимых вирусных патогенов свиней во всем мире. Наиболее распространенными генотипами, ассоциированными с PCVAD, являются PCV2a и PCV2b. До 2003 года PCV2a был основным генотипом, идентифицированным в США и Канаде, хотя и PCV2a и PCV2b были обнаружены по всему миру. Примерно в 2003 году произошел резкий сдвиг в частоте генотипов PCV2 в глобальном масштабе от PCV2a к PCV2b, совпадающий с серьезным системным заболеванием, ассоциированным с PCV2b. Всемирную эпидемию успешно контролировали разработкой коммерческих вакцин, которые содержат антиген PCV2a, которые, как было показано, являются перекрестно защитными. Совсем недавно новый генотип PCV2d, впервые обнаруженный в Швейцарии в 1999 году, распространился на Китай, а затем на США. Как и в случае с PCV2b, эпидемиологические исследования свидетельствуют о том, что в настоящее время происходит смена генотипа, о чем свидетельствуют сообщения о непригодности вакцины PCV2 и увеличении клинических случаев заболевания. Показано участие PCV2d в развитии более серьезных клинических признаков и поражений.
[280] Цирковирусы генетически разнообразны и заражают широкий круг хозяев путем документально подтвержденной межвидовой передачи. Филогенетический анализ предполагает наличие наиболее тесной эволюционной связи между PCV3 и CanineCV. Интересно, что CanineCV был идентифицирован в печени собаки с выраженным некротическим васкулитом и гранулематозным лимфаденитом, оба из которых наблюдались у инфицированных PCV3 свиней, а также сообщалось об инфекциях PCV2. Неясно, эволюционировал ли PCV3 у свиней в качестве недетектируемой инфекции в течение некоторого времени, или он возник в результате перекрестной передачи или путем рекомбинации между неидентифицированными родительскими цирковирусами. PCV2 способен преодолевать видовые барьеры, вызывая смертельные заболевания у видов, отличных от свиней; недавний отчет показал наличие PCV2 у шести норок, которые умерли от диареи в Китае.
[281] Открытие нового циркувируса свиней с вероятной этиологической ролью в PDNS и репродуктивной недостаточности вызывает беспокойство. Ретроспективные исследования показывают, что PCV2 вызывал спорадически системное заболевание раньше 1985 года до того, как возникла эпидемия в конце 1990-х годов. Возможность того, что PCV3 развивается аналогичным образом, заслуживает дальнейшего изучения, и свидетельствует о необходимости производства иммуногенных композиций по настоящему изобретению. Необходимо отметить, что с учетом того, что капсидные белки PCV2 и PCV3 идентичны примерно на 30%, перекрестная защита кажется маловероятной.
Заключение
[282] Цирковирус свиней 2 является одним из наиболее значимых патогенов свиней во всем мире. В настоящей заявке продемонстрировано обнаружение сильно отличающегося нового вида цирковируса PCV3 свиней у свиноматок с выкидышами и признаками PDNS, клиническое проявление которого обычно ассоциировано с инфекцией PCV2. Геном PCV3 включает ORF1, ORF2 и ORF3. Никакие другие вирусы не были обнаружены методом метагеномного секвенирования, и результаты ПЦР были отрицательными на PCV2, PPV, PRRSV и IAV. Это, в сочетании с высокой вирусной нагрузкой в ткани мумий, позволяет предположить, что PCV3 может вызывать клиническое заболевание, подобное PCV2. Молекулярные и серологические анализы на PCV3 также предполагают, что вирус является обычным, циркулирующим в стадах свиней США. Поскольку инфицирование PCV2 изначально не проявлялось на клиническом уровне и только спорадически вызвало заболевание, прежде чем стать глобальной эпидемией, PCV3 требует дальнейшего изучения.
Содержание приведенных ниже документов включено в настоящее описание в виде ссылки.
[283] Segalés J, Kekarainen T, Cortey M. The natural history of porcine circovirus type 2: from an inoffensive virus to a devastating swine disease? Vet Microbiol. 2013; 165:13-20
[284] Chae C. Commercial porcine circovirus type 2 vaccines: efficacy and clinical application. Vet J. 2012; 194:151-7
[285] Opriessnig T, Langohr I. Current state of knowledge on porcine circovirus type 2-associated lesions. Vet Pathol. 2012; 50:23-38
[286] Meehan BM, McNeilly F, McNair I, Walker I, Ellis JA, Krakowka S, et al. Isolation and characterization of porcine circovirus 2 from cases of sow abortion and porcine dermatitis and nephropathy syndrome. Arch Virol. 2001; 146:835-842
[287] Jacobsen B, Krueger L, Seeliger F, Bruegmann M, Segalés J, Baumgaertner W. Retrospective study on the occurrence of porcine circovirus 2 infection and associated entities in Northern Germany. Vet Microbiol. 2009; 138:27-33
[288] Cortey M, Pileri E, Sibila M, Pujols J, Balasch M, Plana J, et al. Genotypic shift of porcine circovirus type 2 from PCV-2a to PCV-2b in Spain from 1985 to 2008. Vet J. 2011; 187:363-8.
[289] Cheung AK, Lager KM, Kohutyuk OI, Vincent AL, Henry SC, Baker RB, et al. Detection of two porcine circovirus type 2 genotypic groups in the United States swine herds. Arch Virol. 2007; 152:1035-44
[290] Hause BM, Collin EA, Anderson J, Hesse RA, Anderson G. Bovine rhinitis viruses are common in U.S. cattle with bovine respiratory disease. PLoS One 2015 10:e0121998
[291] Li L, Shan T, Soji OB, Alam MM, Kunz TH, Zaidi SZ, Delwart E. Possible cross-species transmission of circoviruses and cycloviruses among farm animals. J Gen Virol. 2011; 92:768-772
[292] Zhang W, Li L, Deng X, Kapusinszky B, Delwart E. What is for dinner? Viral metagenomics of U.S. store bought beef, pork and chicken. Virology 2014; 468-470:303-310.
[293] Li L, Kapoor A, Slikas B, Bamidele OS, Wang C, et al. Multiple diverse circoviruses infect farm animals and are commonly found in human and chimpanzee feces. J Virol. 2010; 84:1674-1682
[294] King AMQ, Adams MJ, Carstens EB, Lefkowitz EJ, Carstens EB, editors. Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses: ninth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego: Academic Press, Elsevier; 2011.
[295] He B, Li Z, Yang F, Zheng J, Guo H, et al. Virome profiling of bats from Myanmar by metagenomics analysis of tissue samples reveals more novel Mammalian viruses. PLoS One 2013; 8:e61950.
[296] Wu PC, Lin WL, Wu CM, Chi JN, Chien MS, et al. Characterization of porcine circovirus type 2 (PCV2) capsid particle assembly and its application to virus-like particle vaccine development. Appl Microbiol Biotechnol. 2012; 95:1501-7
[297] Lin M, Trottier E, Pasick J. Antibody responses of pigs to defined Erns fragments after infection with classical swine fever virus. Clin Diagn Lab Immunol. 2005; 12:180-186.