СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНАЛОГОВ ИНСУЛИНА ИЗ ИХ СООТВЕТСТВУЮЩИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ (ВАРИАНТЫ)
METHOD FOR PRODUCING INSULIN ANALOGUES OF THEIR APPROPRIATE PRECURSORS (VERSIONS)

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение имеет отношение к получению соединений инсулина, включая их аналоги или производные из соответствующих предшествующих форм с помощью одностадийной ферментативной реакции, включающей комбинаторное и параллельное использование оптимальных количеств трипсина и карбоксипептидазы В, которые действуют, синергично направляя реакцию управляемым способом, для того чтобы избежать продукции случайных нежелательных побочных продуктов. В частности, ферментативные конверсионные реакции настоящего изобретения предлагают улучшения, заключающиеся в сокращении количества операционных стадий, более высоком выходе и чистоте желательных конечных продуктов.
Уровень техники
Способы генной инженерии делают все более доступной экспрессию предшественников инсулина в микроорганизмах (ЕР-А-347781, ЕР-А-367163). Препропоследовательности обычно расщепляются химически и/или ферментативно (DE-P-3440988, ЕР-А-0264250). Известные ферментативные конверсионные способы основаны на расщеплении трипсином и карбоксипептидазой В (Kemmler W. et. al. J. Biol. Chem., 246 (1971) 6786-6791; ЕР-А-195 691; ЕР-В-89007). В стандартном способе конверсии молекулы предшественника инсулина в соответствующую молекулу инсулина удаляют линкерный пептид между цепями А и В. Ферментативные реакции с трипсином представляют собой ферментативную и комплексную реакцию, которая расщепляет не только те пептидные связи, расщепление которых дает человеческий инсулин или желательные конечные продукты но также и, в конкурирующей реакции, дает расщепление на других восприимчивых участках, которое приводит к образованию множества нежелательных побочных продуктов.
Предшествующие способы из уровня техники включают использование трипсина и второго фермента - карбоксипептидазы таким образом, что второй фермент карбоксипептидаза добавляется, когда необходимый интермедиат сформируют в реакции. Недостаток указанных способов - формирование большого количества побочных продуктов примесей, которые только с трудом могут быть удалены из реакционного раствора. В частном случае конверсия человеческого предшественника в человеческий инсулин (человеческий инсулин, ЧИ) представляет собой формирование большого количества де-Thr(B30)-человеческого инсулина (де-Thr(B30)-ЧИ).
Из вышеупомянутого очевидно, что было бы выгодно следовать более простому способу ферментативной реакции для расщепления соединений-предшественников инсулина, их аналогов и производных до инсулина посредством намного более простой реакции, которая удаляет возможные формирования полимерных примесей настолько полно, насколько это возможно и, в то же самое время, увеличивает концентрацию желательного конечного продукта инсулина в максимально возможной степени. Дополнительное условие - необходимость гарантировать высокий выход повсюду, увеличивая простоту действий, качества так же как и количества желательного конечного продукта.
Недостатки известных способов были исправлены с помощью ферментативных реакций, выполненных согласно настоящему изобретению, и оказалось, что увеличение выработки без нежелательных побочных продуктов связано с оптимальной концентрацией трипсина и карбоксипептидазы, используемых в способствующих реакции условиях. Авторы настоящего изобретения попытались разработать улучшенный способ одностадийной ферментативной реакции, включающий комбинаторное и параллельное использование оптимальных количеств трипсина и карбоксипептидазы B, которые работают синергично, для того чтобы обеспечить желательные конечные продукты, увеличением легкости выполнения действий, чистоты и выхода конечных продуктов.
Раскрытие изобретения
Главная цель настоящего изобретения состоит в разработке способа получения соединений инсулина и его аналогов или производных из их соответствующих предшественников с минимальным формированием нежелательных побочных продуктов, который осуществляется одностадийной ферментативной реакцией, включающей комбинаторное и параллельное использование оптимальных количеств трипсина и карбоксипептидазы B, работающих синергично для того, чтобы получить желательные конечные продукты.
Другая основная цель настоящего изобретения состоит в получении предшественника аналога инсулина соответствующего последовательностям SEQ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8, который может использоваться в качестве исходного материала указанных предшественников, который может быть как в жидкой, так и в кристаллической форме.
Еще одна цель настоящего изобретения состоит в обеспечении вектора экспрессии для экспрессии проинсулина или его аналогов или производных, который включает указанную соответствующую последовательность ДНК, которая кодирует молекулы предшественника.
Еще одна другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить подходящий микроорганизм/хозяин, который трансформируется указанным вектором экспрессии и впоследствии обеспечивает способ для получения соответствующих соединений инсулина, который включает культивирование указанных трансформированных микроорганизмов в подходящей ферментационной среде и ферментацонных условиях для производства предшественников инсулина.
Еще одна другая цель настоящего изобретения включает способ преобразования соединений-предшественников инсулина в их соответствующие активные формы посредством одностадийной ферментативной реакции, в которой трипсин и карбоксипептидаза добавляются вместе в оптимальных количествах, которые обеспечивают синергичную и контролируемую реакцию, минимизирующую продукцию нежелательных конечных продуктов.
Еще одна другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить способ получения инсулина или его аналогов или производных из соответствующих эквивалентов-предшественников, включающий последовательное выполнение действий в определенном порядке. Еще одна другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы получить молекулу инсулина.
Еще одна другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы получить молекулу инсулина, выбранную из группы, включающей инсулин, лизпро, аспарт, глюлизин или IN-105.
Соответственно, настоящее изобретение имеет отношение к способу получения соединений инсулина и его аналогов или производных из их соответствующих предшественников, который включает обработку указанного предшественника трипсином и карбоксипептидазой, используемых комбинаторно и одновременно при условии, что соотношение концентрации трипсина к карбоксипептидазе представляет собой от приблизительно 5:1 до приблизительно 50:1; способ получения инсулина или его аналогов или производных из их соответствующих предшественников, включающий последовательное выполнение следующих действий в следующем последовательном порядке: (a) растворение оптимального количества предшественника инсулина или производного инсулина в буферном растворе; (b) получение различных аликвот раствора предшественника в диапазонах pH приблизительно от 7,0 до 9,0; (c) добавление ферментов трипсина и карбоксипептидазы одновременно к различным аликвотам, полученным, как на стадии (b), и инкубирование смеси в течение приблизительно 4-10 часов; (d) преципитация желательного продукта инсулина добавлением буфера лимонной кислоты и ZnCl2; получение молекулы инсулина и молекула инсулина, выбранная из группы, включающей инсулин, лизпро, аспарт, глулизин или IN-105.
Краткое описание сопутствующих списков последовательности
SEQ ID 1: Последовательность аминокислот молекулы предшественника аспарта.
SEQ ID 2: Последовательность аминокислот молекулы предшественника аспарта.
SEQ ID 3: Последовательность аминокислот молекулы предшественника аспарта.
SEQ ID 4: Последовательность аминокислот молекулы предшественника лизпро.
SEQ ID 5: Последовательность аминокислот молекулы предшественника лизпро.
SEQ ID 6: Последовательность аминокислот молекулы предшественника лизпро.
SEQ ID 7: Последовательность аминокислот молекулы предшественника глулизина.
SEQ ID 8: Последовательность аминокислот молекулы предшественника глулизина.
SEQ ID 9: Последовательность аминокислот молекулы предшественника глулизина.
Настоящее изобретение имеет отношение к способу получения соединений инсулина и его аналогов или производных из их соответствующих предшественников, соответствующих формуле:
где
R представляет собой водород, или способный к химическому или ферментативному отщеплению аминокислотный остаток, или способный к химическому или ферментативному расщеплению пептид, включающий по крайней мере два аминокислотных остатка,
1
1
2
R представляет собой OH или аминокислотный остаток, или Y-Y, в котором Y представляет собой аминокислотный остаток,
остатки с A1 до A21 соответствуют A цепи инсулина и остатки с B1 до B27 соответствуют B цепи инсулина, включая их аминокислотные замены, делеции и/или инсерции,
2
1
2
1
2
1
2
3
1
2
3
R представляет собой Z-Z, где Z выбран из Pro, Lys, Asp и Z выбран из Lys, или Pro, или Glu, или Z-Z-Z, где Z отобран из Pro, Lys, Asp и Z отобран из Pro, или Lys, или Glu, и Z представляет собой треонин или пептидный остаток, состоящий из по крайней мере трех аминокислотных остатков при условии, что аминокислота, соответствующая B30, является треонином,
X представляет полипептид, который соединяет цепь A с цепью B, который может быть расщеплен ферментативно, без разрыва цепи A или цепи B, содержащий по крайней мере два аминокислотных остатка, в котором первой и последней аминокислотой является Лизин или Аргинин,
который включает обработку указанного предшественника трипсином и карбоксипептидазой, используемых комбинаторно и одновременно при условии, что соотношение концентрации трипсина к карбоксипептидазе составляет от приблизительно 5:1 к приблизительно 50:1.
В другом воплощении настоящего изобретения соответствующая молекула предшественника включает последовательность аминокислот, которая является по крайней мере на 85% гомологичной последовательности аминокислот, как показано в последовательностях SEQ ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9.
В другом воплощении настоящего изобретения относительное количество трипсина к предшественнику инсулина составляет от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:500.
В еще одном воплощении настоящего изобретения относительное количество трипсина к предшественнику инсулина составляет около 1:100.
В еще одном воплощении настоящего изобретения относительное количество карбоксипептидазы к предшественнику инсулина составляет около 1:500.
В еще одном воплощении настоящего изобретения соотношение концентрации трипсина к карбоксипептидазе составляет от приблизительно 5:1 до приблизительно 50:1.
В другом воплощении настоящего изобретения отношение концентрации трипсина к карбоксипептидазе составляет 5:1.
В еще одном воплощении настоящего изобретения концентрация трипсина, используемого для конверсионной реакции, составляет по крайней мере 0,01 мг/мл.
В другом воплощении настоящего изобретения концентрация карбоксипептидазы, используемой для конверсионной реакции, составляет по крайней мере 0,001 мг/мл.
В еще одном воплощении настоящего изобретения предшественник находится в жидкой или кристаллической форме.
В другом воплощении настоящего изобретения конверсионная реакция проводится при pH от 6,5 до 10.
В еще одном воплощении настоящего изобретения конверсионная реакция проводится при pH от 7 до 9.
В другом воплощении настоящего изобретения конверсионная реакция проводится при температуре в пределах от приблизительно 2°C до 40°C.
В еще одном воплощении настоящего изобретения продолжительность ферментативной конверсионной реакции составляет приблизительно от 2 до 24 часов.
В еще одном воплощении настоящего изобретения реакционная среда содержит по крайней мере 30%-ный водный или водорастворимый растворитель.
В другом воплощении настоящего изобретения водорастворимый растворитель выбран из группы, включающей метанол, этанол, ацетон или N,N-диметилформамид.
В еще одном воплощении настоящего изобретения реакционная среда дополнительно включает соль, действующую в качестве буферного средства.
В еще одном воплощении настоящего изобретения соль выбрана из группы, включающей ТРИС, этилендиамин, триэтаноламин, глицин, HEPES (N-2-гидрокси-этилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота).
В еще одном воплощении настоящего изобретения концентрация соли, используемой в реакционной среде, составляет приблизительно от 10 ммоль до 1 моль.
В еще одном воплощении настоящего изобретения концентрация соли, используемой в реакционной среде, составляет около 0,6 моль.
Настоящее изобретение относится к способу получения инсулина или его аналогов или производных из их соответствующих предшественников, включающему последовательное выполнение следующих действий в следующем последовательном порядке:
(a) растворение оптимального количества предшественника инсулина или производного инсулина в буферном растворе.
(b) получение различных аликвот раствора предшественника в диапазонах pH приблизительно от 7,0 до 9,0.
(c) Добавление ферментов трипсина и карбоксипептидазы одновременно к различным аликвотам, полученным как на стадии (b), и инкубирование смеси в течение приблизительно 4-10 часов.
(d) Преципитация желательного продукта инсулина добавлением буфера лимонной кислоты и ZnCl2.
Настоящее изобретение относится к молекуле инсулина, полученной согласно любому из предыдущих пунктов.
Настоящее изобретение относится к молекуле инсулина, полученной согласно любому из предыдущих пунктов, выбранной из группы, включающей инсулин, лизпро, аспарт, глулизин или IN-105.
Далее будут описаны более подробно предпочтительные воплощения изобретения, которые, вместе со следующими примерами, служат для того, чтобы объяснить принципы изобретения.
В описании и формуле настоящего изобретения следующая терминология будет использоваться в соответствии с определениями, изложенными далее.
Если иначе не определено в описании, у научно-технических терминов, использованных в соответствии с настоящим изобретением, должны быть значения, которые обычно понимаются под таковыми для специалиста в уровне техники. Дополнительно, если иначе не требуется контекстом, термины в единственном числе должны включать множественное, и множественное число должно включать единственное. Способы и методики настоящего изобретения в целом выполнены согласно обычным способам, известным в уровне техники. В целом, номенклатура, используемая в описании, и способы, описанные здесь, являются известными и обычно используемыми в уровне техники. Способы и методики настоящего изобретения в целом выполнены согласно обычным способам, известным в уровне техники.
Как используется здесь, "аминокислота" относится к пептидной или белковой последовательностям или их частям. Термины "белок", "пептид" и "полипептид" использованы взаимозаменяемо.
Здесь, термин "инсулин" охватывает инсулины от любых видов, таких как свиной инсулин, бычий инсулин и человеческий инсулин и их комплексы, такие как цинковые комплексы, включая их димеры и олигомеры, например гексамеры. Дополнительно, термин "инсулин" здесь охватывает так называемые "аналоги инсулина". Аналог инсулина - молекула инсулина, имеющая одну или более мутаций, замен, делеций и/или инсерций в A и/или B аминокислотных цепях, относительно нативной человеческой молекулы инсулина. Более конкретно, один или больше аминокислотных остатков может быть заменен другим аминокислотным остатком, и/или один или более аминокислотных остатков могут быть удалены, и/или один или два аминокислотных остатков могут быть вставлены, с условием, что указанный аналог инсулина обладает достаточной активностью инсулина. Аналоги инсулина являются предпочтительно такими, в которых один или более естественных аминокислотных остатков, предпочтительно один, два, или три из них, замещены другим кодирующим аминокислотным остатком. Примеры аналогов инсулина описаны в следующих патентах и эквивалентах: US 5,618,913, ЕР 254,516, EP 280,534, US 5,750,497 и US 6,011,007. Примеры конкретных аналогов инсулина представляют собой инсулин аспарт (то есть инсулин человека AspB28) и инсулин лизпро (то есть инсулин человека LysB28, РгоВ29) и "инсулин глулизин" (Lys B (3), Glu B (29) человеческий инсулин).
Один аспект изобретения имеет отношение к соединениям-предшественникам инсулина, представленным следующей формулой:
где
R представляет собой водород, или способный к химическому или ферментативному отщеплению аминокислотный остаток, или способный к химическому или ферментативному расщеплению пептид, включающий по крайней мере два аминокислотных остатка.
1
1
2
R представляет собой ОН, или аминокислотный остаток, или Y-Y, в котором Y представляет собой аминокислотный остаток.
1
21
1
27
Остатки с А до А соответствуют A цепи инсулина и остатки с В до В, соответствуют B цепи инсулина, включая их аминокислотные замены, делеции и/или инсерции.
2
1
2
1
2
1
2
3
1
2
3
R представляет собой Z-Z, где Z выбран из Pro, Lys, Asp и Z выбран из Lys, или Pro, или Glu, или Z-Z-Z, где Z отобран из Pro, Lys, Asp и Z отобран из Pro, или Lys, или Glu, и Z представляет собой треонин или пептидный остаток, состоящий из по крайней мере трех аминокислотных остатков при условии, что аминокислота, соответствующая B30, является треонином.
X представляет полипептид, который соединяет цепь A с цепью B, который может быть расщеплен ферментативно, без разрыва цепи A или цепи B, содержащий по крайней мере два аминокислотных остатка, в котором первой и последней аминокислотой является Лизин или Аргинин.
Один из аспектов настоящего изобретения специфично относится к молекуле IN-105. IN-105 представляет собой молекулу инсулина конъюгированную по эпсилон аминокислоте Лизину в положении В29 B-цепи инсулина с амфифильным олигомером структурной формулы CH3O-(C4H2O)3-CH2-СН2-COOH. Данная молекула может быть моноконъюгирована в положениях A1, B1 и B29, ди-конъюгирована в различных комбинациях А1, В1 и В29, или триконъюгирована в различных комбинациях А1, В1 и В29.
В одном аспекте, изолированная молекула предшественника инсулина, которая включает последовательность аминокислот, имеющую по крайней мере приблизительно 80%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 81%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 82%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 83%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 84%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 85%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 86%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 87%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 88%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 89%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 90%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 91%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 92%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 93%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 94%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 95%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 96%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 97%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 98%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты и альтернативно по крайней мере приблизительно 99%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты молекулы полипептида, представленного SEQ ID 1, 2, 3, 4, 5 и 6.
Трипсин представляет собой типичную сериновую протеазу и гидролизует белок или пептид с карбокситерминального конца по аминокислотному остатку аргинина или лизина (Enzymes, pp.261-262(1979), ed. Dixon, M. & Webb, E.C., Longman Group Ltd., London). В частности, поверхностный гидролиз происходит на двухосновном участке, где находятся два последовательных остатка аргинина или лизина, и известно, что гидролиз происходит более легко там, где двухосновный участок расположен в или рядом с β-складчатой структурой (Rholam, M., et al., FEBS Lett., 207, 1-6 (1986). The Enzyme Vol.II, 3rd Edition, Editor Boyer, Acad. Press NY. pp.249-275). В частности, трипсин расщепляет пептидные связи в С-терминальных остатках аргинина (Arg) или лизина (Lys). Трипсинолиз молекул предшественника инсулина может происходить на различных участках расщепления одновременно. Поскольку в молекуле предшественника инсулина присутствует много сайтов для расщепления, в процессе трипсинолиза может образовываться много нежелательных побочных продуктов.
Рекомбинантный свиной панкреатический трипсин обладает молекулярной массой приблизительно 23000 дальтон и ферментативным оптимумом активности при pH 8,0. Трипсин используется в производственном процессе производства аналогов инсулина и инсулина. Продукция этих биомолекул описана в литературе, и было выбрано несколько подходов. Карбоксипептидаза B избирательно гидролизует основные аминокислоты: лизин, аргинин и орнитин в C-терминальном положении полипептидов. Карбоксипептидаза B является экзопептидазой, катализирующей гидролитическое отщепление C-терминальных основных аминокислотных остатков аргинина и лизина от пептидов и белков.
Термин "C-пептид" или "линкерный пептид" как использующийся здесь включает все формы C-пептида инсулина, включая нативные или синтетические пептиды. Такие C-пептиды инсулина могут быть человеческими пептидами, или могут быть из другого вида животных и родов, предпочтительно млекопитающих. Таким образом варианты и модификации естественного C-пептида инсулина включены в данный термин, пока они сохраняют активность C-пептида инсулина. В уровне техники известны модификации последовательности белков или пептидов, с сохранением их полезной активности, и они могут быть осуществлены с использованием методик, которые являются стандартными в уровне техники и широко описаны в литературе, например, случайный или сайт-специфичный мутагенез, расщепление и лигирование нуклеиновых кислот и т.д. Таким образом, функционально эквивалентные варианты или производные нативных последовательностей C-пептида инсулина могут легко быть получены согласно методикам, известным в уровне техники, и включают последовательности пептидов, имеющих функциональную, например биологическую, активность врожденного C-пептида инсулина. Все такие аналоги, варианты, производные или фрагменты C-пептида инсулина главным образом включены в охват настоящего изобретения, и подпадают под термин "С-пептид инсулина".
Основные требования к C-пептидам - чтобы они имели достаточную длину для образования дисульфидной связи между A и B-цепями, и они должны быть способны к расщеплению из предшественника инсулина, приводящему к формированию инсулина. Типичный дипептид, используемый в качестве C-пептида, представляет собой
-Arg-Arg-. C-пептиды могут иметь любую длину, которые начинаются с Arg или Lys и заканчиваются Arg или lys.
Настоящее изобретение обеспечивает векторы, включающие ДНК, кодирующую любой из описанных здесь генов. Клетка-хозяин, включающая любые такие векторы, также входит в охват настоящего изобретения. В качестве примера, клетки-хозяева могут быть бактериальными, грибковыми или из млекопитающих.
В изобретении используются рекомбинантные клетки-хозяева, в которых продуцируется по крайней мере часть последовательности нуклеиновой кислоты, экспрессирующей предшественник соединения инсулина. Рекомбинантная система экспрессии выбрана из прокариотических и эукариотических организмов. Эукариотические организмы включают дрожжевые клетки (например, Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris), клетки млекопитающих или клетки растений. Бактериальные и эукариотические клетки доступны из многих различных источников, включая коммерческие источники, известные квалифицированным в области техники специалистам, например Американская Коллекция Типовых Культур (ATCC; Rockville, Md.). Коммерческие источники клеток, используемых для рекомбинантной белковой экспрессии, также поставляют инструкции для использования клеток. Выбор системы экспрессии зависит от особенностей, желательных для экспрессируемого полипептида.
Наиболее предпочтительно в отношении к аспектам настоящего изобретения, наиболее предпочтительные клетки-хозяева представляют собой метилотрофные дрожжи. Штаммы метилотрофных дрожжей, которые могут быть модифицированы с использованием настоящего изобретения, включают, но не ограничены, штаммами дрожжей, способных к росту на метаноле, такие как дрожжи родов Pichia, Candida, Hansenula или Torulopsis. Предпочтительные метилотрофные дрожжи представляют собой дрожжи из рода Pichia. Метилотрофные штаммы дрожжей, которые могут быть модифицированы с использованием способов по настоящему изобретению, также включают те метилотрофные штаммы дрожжей, которые были сконструированны для того, чтобы экспрессировать один или более интересующих ксеногенных белков. Самая предпочтительная клетка-хозяин согласно аспекту настоящего изобретения - Pichia pastoris, GS115.
Клетка-хозяин или организм могут быть спроектированы для экспрессии рекомбинантного белка или пептида с использованием стандартных методики. Например, рекомбинантный белок может экспрессироваться из вектора или экзогенного гена, введенного в геном организма.
Векторы, которые могут использоваться для экспрессии экзогенных белков, известны в уровне техники и описаны ниже. Предпочтительные векторы настоящего изобретения, несущие гены молекулы предшественника инсулина, включают, но не ограничены, pPlC9K.
Самый значительный аспект настоящего изобретения относится к способу конвертации соединений инсулина и его аналогов или производных из их соответствующих предшественников, представленных формулой
где
R представляет собой водород, или способный к химическому или ферментативному отщеплению аминокислотный остаток, или способный к химическому или ферментативному расщеплению пептид, включающий по крайней мере два аминокислотных остатка,
1
1
2
R представляет собой ОН или аминокислотный остаток, или Y-Y, в котором Y представляет собой аминокислотный остаток,
1
21
1
27
остатки с А до А соответствуют A цепи инсулина и остатки с В до В соответствуют B цепи инсулина, включая их аминокислотные замены, делеции и/или инсерции,
2
1
2
1
2
1
2
3
1
2
3
R представляет собой Z-Z, где Z выбран из Pro, Lys, Asp и Z выбран из Lys, или Pro, или Glu, или Z-Z-Z, где Z отобран из Pro, Lys, Asp и Z отобран из Pro, или Lys, или Glu, и Z представляет собой треонин или пептидный остаток, состоящий из по крайней мере трех аминокислотных остатков при условии, что аминокислота, соответствующая В30, является треонином,
X представляет полипептид, который соединяет цепь A с цепью B, который может быть расщеплен ферментативно, без разрыва цепи A или цепи B, содержащий по крайней мере два аминокислотных остатка, в котором первой и последней аминокислотой является Лизин или Аргинин,
который включает обработку указанного предшественника трипсином и карбоксипептидазой, используемых комбинаторно и одновременно при условии, что отношение концентрации трипсина к карбоксипептидазе составляет от приблизительно 5:1 к приблизительно 50:1.
Молекула предшественника может быть в жидкой или кристаллической форме.
Способ преобразования молекулы предшественника инсулина в их соответствующую молекулу инсулина проводится в водной среде, включающей по крайней мере приблизительно 40% воды; это, однако, не препятствует наличию по крайней мере приблизительно 30%, или приблизительно 50%, или приблизительно 60%, или приблизительно 70%, или приблизительно 80% воды, а также наличию водорастворимых растворителей, таких как метанол, этанол, ацетон, N,N-диметилформамид и т.п.
Реакционная среда может дополнительно включать любую соль с буферными свойствами. Предпочтительно, реакционная среда включает Трис (трис-(гидроксиметил)-аминометан) в качестве соли при концентрации в пределах от 10 ммоль до 1 моль. Наиболее предпочтительно концентрация Трис, используемого в реакционной среде, составляет 0,6 моль.
Конверсия проводится при любой температуре в широких пределах, в основном от приблизительно 0°C до 40°C. Предпочтительно реакция проводится при температуре от приблизительно 10°C до приблизительно 30°C и наиболее предпочтительно от приблизительно 15°C до приблизительно 25°C.
pH реакционной смеси может быть в любом диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 12. Однако лучшие результаты получаются тщательным контролем pH таким образом, чтобы реакция проводилась в диапазоне pH приблизительно от 6,5 до 10. Предпочтительно реакция осуществляется в диапазоне pH от 7 до 9,5, предпочтительно от приблизительно 8 до 9, и в случае точного контроля при pH 8,5.
Контроль pH осуществляют при помощи буферного средства. Любой из подходящих используемых буферов в широком диапазоне включает ТРИС, этилендиамин, триэтаноламин, глицин, HEPES (-2-гидрокси-этилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота), и т.п.
Количество трипсина и карбоксипептидазы B, которые в основном используются, связано как с количеством каждого используемого фермента, так и с количеством молекул предшественника инсулина. Ферменты могут быть добавлены в реакционные смеси или в раствор или с использованием признанных методик, например иммобилизация на подходящей подложке, и таким образом доступные в реакционной среде.
Основываясь на массовом соотношении, трипсин в основном будет присутствовать в количестве относительно предшественника инсулина в пределах от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:500, предпочтительно от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:200, наиболее предпочтительно от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:100 или 1:10 до приблизительно 1:50 или от 1:10 до приблизительно 1:25. Самая предпочтительная концентрация трипсина относительно концентрации используемого инсулина представляет собой 1:100. Концентрация трипсина, используемого для конверсионной реакции, составляет по крайней мере 0,01 мг/мл.
Основываясь на массовом соотношении, карбоксипептидаза В в основном будет присутствовать в количестве относительно предшественника инсулина в пределах от приблизительно 1:500 до 3:500. Самая предпочтительная концентрация карбоксипептидазы относительно концентрации используемого инсулина 1:500. Концентрация карбоксипептидазы, используемой для конверсионной реакции, составляет по крайней мере 0,001 мг/мл.
Согласно другому аспекту существенным параметром настоящего изобретения является отношение трипсина к карбоксипептидазе B в реакционной смеси. В основном, на основе массы, отношение трипсина к карбоксипептидазе В находится в диапазоне от 5:1 до 50:1. Предпочтительно, на основе массы, отношение трипсина к карбоксипептидазе В составляет от 50:3 до приблизительно 5:3. Самое предпочтительное отношение трипсина к карбоксипептидазе B составляет около 5:1.
Продолжительность реакции может составлять приблизительно от 2 до 48 часов, предпочтительно продолжительность реакции составляет приблизительно от 2 до 24 часов.
Соответственно, настоящее изобретение имеет отношение к способу получения соединений инсулина и его аналогов или производных из их соответствующих предшественников, включающему последовательное выполнение следующих действий в следующем последовательном порядке:
(a) растворение оптимального количества предшественника инсулина или производного инсулина в буферном растворе;
(b) получение различных аликвот раствора предшественника в диапазонах pH приблизительно от 7,0 до 9,0;
(c) добавление ферментов трипсина и карбоксипептидазы одновременно к различным аликвотам, полученным, как на стадии (b), и инкубирование смеси в течение приблизительно 4-10 часов;
(d) преципитация желательного продукта инсулина добавлением буфера лимонной кислоты и ZnCl2.
Предпочтительное воплощение изобретения описано ниже на Рисунках и в Описании Предпочтительных Воплощений. В то время как эти описания непосредственно описывают вышеупомянутые воплощения, подразумевается, что квалифицированные в области техники специалисты могут задумать модификации и/или изменения к определенным воплощениям, показанным и описанным здесь. Любые такие модификации или изменения, которые попадают в область этого описания, также входят в объем настоящего изобретения. Если специально не отмечено, подразумевается, что слова и фразы в описании и формуле изобретения даны обычные и значения соответствуют таковым из обычного уровня техники. Описание предпочтительного воплощения и лучший способ изобретения, известные заявителю при регистрации заявки, были представлены и предназначены только в целях иллюстрации и описания. Они не предназначены, чтобы быть исчерпывающими или ограничить изобретение раскрытой точной формой, в свете вышеупомянутого раскрытия возможны много модификаций и изменений. Воплощение было выбрано и описано, чтобы лучше всего объяснить принципы изобретения и его практическое применение и позволить другим, квалифицированным в уровне техники специалистам, чтобы лучше всего использовать изобретение в различных воплощениях и с различными модификациями, которые подходят для специфического рассмотренного применения.
Изобретение дополнительно уточняется с помощью следующих примеров. Однако эти примеры не должны рассматриваться как ограничивающие охват изобретения.
Осуществление изобретения
Пример 1А: Предшественник аспарта (Seq ID 1, 2 и 3)
Предшественник аспарта формулы X-[аспарт B цепь (В1-В30)]-Y-[аспарт, A цепь (А1-А21)], где X представляет собой последовательность лидерного пептида, B цепь является последовательностью В цепи аспарта В1-В30, Y является последовательностью пептида линкера между цепью B и цепью A, A цепь представляет собой A-цепь аспарта. Последовательность может быть лишена лидера или другого лидерного пептида (например, EEAEAEAEPR или GAVR). Пептид линкер Y может быть любым из примера R и RDADDR.
Последовательность предшественника представлена последовательностями SEQ ID 1 и 2. Предшественник может быть продуцирован любой подходящей системой экспрессии, такой как Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, CHO клетки и т.д.
Предшественник аспарта клонировался в рамку с Mat-alfa сигнальным пептидом в вектор экспрессии Pichia, pPlC9K. Pichia pastoris штамм, GS115 был трансформирован рекомбинантной плазмидой для того, чтобы получить клон, экспрессирующий предшественник аспарта.
Предшественник аспарта секретировался Pichia pastoris в питательную среду. Бульон центрифугировался, и клетки отделялись от супернатанта. Существует множество способов, подходящих для захвата предшественника, включая ионообменную хроматографию и гидрофобную хроматографию. Для настоящего изобретения катион-обменная хроматография и ГИФ использовались, чтобы захватить определенный предшественник.
Пример 1В: Предшественник лизпро (Seq ID 4, 5 и 6)
Предшественник лизпро формулы Х-[лизпро В цепь (B1-B30)]-Y-[лизпро А цепь (А1-А21)], где Х последовательность лидерного пептида, В цепь является последовательностью В цепи лизпро В1-В30, Y является последовательностью пептида линкера между В цепью и А цепью, А цепь представляет собой А цепь лизпро. Последовательность может быть лишена лидера или другого лидерного пептида. Пептид линкер Y может быть любым из примера R или RDADDR. Последовательность предшественника представлена последовательностями SEQ ID 4 и 6. Предшественник может быть продуцирован любой подходящей системой экспрессии, такой как Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, клетки СНО и т.д. Предшественник лизпро клонировался в рамку с Mat-alfa сигнальным пептидом в вектор экспрессии Pichia, pPlC9K. Pichia pastoris штамм, GS115 был трансформирован рекомбинантной плазмидой для того, чтобы получить клон, экспрессирующий предшественник лизпро.
Предшественник лизпро секретировался Pichia pastoris в питательную среду. Бульон центрифугировался, и клетки отделялись от супернатанта. Существует множество способов, подходящих для захвата предшественника, включая ионообменную хроматографию и гидрофобную хроматографию. Для настоящего изобретения катион-обменная хроматография и ГИФ использовались, чтобы захватить определенный предшественник.
Пример 1C: Предшественник глулизина (Seq ID 7, 8 и 9)
Предшественник глулизина формулы Х-[В цепь глулизина (B1-B30)]-Y-[A цепь глулизина (А1-А21)], где Х представляет собой последовательность лидерного пептида, В цепь является последовательностью цепи глулизина В1-В30, Y является последовательностью пептида линкера между В цепью и А цепью, А цепь представляет собой А цепь глулизина. Последовательность может быть лишена лидера или другого лидерного пептида. Пептид линкер Y может быть любым из примера R или RDADDR. Последовательность предшественника представлена последовательностями SEQ ID 8 и 9. Предшественник может быть продуцировать любой подходящей системой экспрессии, такой как Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, клетки СНО и т.д. Предшественник глулизина клонировался в рамку с Mat-alfa сигнальным пептидом в вектор экспрессии Pichia, pPlC9K. Pichia pastoris штамм, GS115 был трансформирован рекомбинантной плазмидой для того, чтобы получить клон, экспрессирующий предшественник глулизина.
Предшественник глулизина секретировался Pichia pastoris в питательную среду. Бульон центрифугировался, и клетки отделялись от супернатанта. Существует множество способов, подходящих для захвата предшественника, включая ионообменную хроматографию и гидрофобную хроматографию. Для настоящего изобретения катион-обменная хроматография и ГИФ использовались, чтобы захватить определенный предшественник.
Кристаллизация предшественника
Различные соединения предшественники инсулина, выделенные из ферментационного бульона посредством использования стадии катионобменной хроматографии, были кристаллизованы с целью обесцвечивания и хранения. Кристаллизация была проведена таким образом, чтобы концентрация предшественника в начале кристаллизации составляла приблизительно от 2 до 20 г/л, предпочтительно от 8 до 14 г/л. Кристаллизация была проведена добавлением ZnCl2 и фенола и последующим регулированием pH до значения между 3,0 и 8,0, предпочтительно между 3,5 и 5,5. Фенол может быть добавлен в количестве от 0,1 до 0,5% от объема пула элюции CIEX. 4%-ный раствор ZnCl2 может быть добавлен в количестве 3-15% от объема пула элюции ClEX. pH может быть отрегулирован с использованием любой щелочи, предпочтительно NaOH или Трис. Кристаллизация может быть осуществлена при температуре между 2 и 30°C, и суспензия хранится в течение некоторого времени так, чтобы кристаллы полностью сформировались. Кристаллы предшественника могут быть отделены от супернатанта, или центрифугированием, или декантацией.
Пример 2А: Пример кристаллизации предшественника лизпро
Были взяты 463 мл раствора для элюции (концентрация предшественника 13,8 г/л) и 2,315 мл фенола (0.5% объема РЭ) было добавлено после необходимого размораживания. Оно сопровождалось добавлением 57,875 мл 4%-ного раствора ZnCl2 (12.5% объема РЭ). pH на данном этапе составлял 4,08, и он был доведен до 4,8, добавлением 420 мл 2,5 н. NaOH. Маточный раствор оставался в течение 15 мин при медленном перемешивании и затем был помещен в холодную (2-8°C) комнату, где оставался на ночь. Затем цельная смесь центрифугировалась при 5000 об/мин в течение 20 минут в центрифуге Beckman Coulter Avanti J-26 XP. Потеря в супернатанте составляла 1,55%.
Пример 2В: Пример кристаллизации предшественника аспарта
Были взяты 500 мл раствора для элюции (концентрация предшественника 2,9 г/л) и 0,625 мл фенола (0.125% объема РЭ) было добавлено после необходимого размораживания. Оно сопровождалось добавлением 15,625 мл 4%-ного раствора ZnCl2 (3,25% объема РЭ). pH на данном этапе составлял 4,08, и он был доведен до 4,8, добавлением 315 мл 2,5 н. NaOH. Маточный раствор оставался в течение 15 мин при медленном перемешивании и затем был помещен в холодную (2-8°С) комнату, где оставался на 5 часов. Затем супернатант был отделен центрифугированием. Потеря в супернатанте составляла 4%.
Комментарий: мы можем изменить нумерацию (аспарт как 2А и лизпро как 2B) - в части мест мы даем примеры, сохраняя последовательность A: аспарт, B: лизпро и C: глулизин.
Пример 2C: Пример кристаллизации предшественника глулизина
Были взяты 250 мл раствора для элюции Sp сефарозы, загруженной предшественником глулизина (концентрация предшественника 3,8 г/л) и 0,31 мл фенола (0,125% объема РЭ) было добавлено после необходимого размораживания. Оно сопровождалось добавлением 7 мл 4%-ного раствора ZnCl2 (3% объема РЭ). pH на данном этапе составлял 4,13, и он был доведен до 4,9, добавлением 2,5 н. NaOH. Маточный раствор оставался в течение 30 мин при медленном перемешивании и затем был помещен в холодную (2-8°C) комнату, где оставался на 5 часов. Затем супернатант центрифугировался. Потеря в супернатанте составляла 7%.
Пример 3A: Ферментативные реакции
Различные соединения инсулина могут быть получены из их соответствующих предшественников посредством ферментативной конверсии. Прямая конверсия предшественника в конечный продукт может быть обеспечена наличием двух протеазных ферментов. Ферментативные реакции были проведены двумя различными способами. 1-ый предшественник должен быть обработан трипсином или трипсиноподобными ферментами растения, животного или микробный рекомбинантного происхождения. Когда реакция трипсина дошла до половины, в те же самые реакционные смеси добавлялся 2-ой протеазный фермент карбоксипептидаза B или аналогичный фермент растения, животного или микробный рекомбинантного происхождения. Карбоксипептидаза B может действовать на основные аминокислоты на C-терминальном конце. Альтернативно, ферменты трипсин и карбоксипептидаза были добавлены в реакционную смесь как коктейль (вместе), и реакции продолжались до тех пор, пока не происходило оптимальное соответствующее образование продукта.
Пример 4А: Когда только трипсин был добавлен к отдельной реакционной смеси предшественника.
2 г. отдельного предшественника аспарта, лизпро и глулизина растворяли в 5 мл 6М Трис раствора. Концентрация продукта в индивидуальной реакционной смеси сохранялась как 3-5 мг/мл. pH реакционной смеси был доведен до 8,5. Трипсин был добавлен к индивидуальной реакционной смеси при концентрации 50 мкг/мл. Реакции проводились при температуре 4±0,5°C и при комнатной температуре (24±0.5°C). Было установлено, что хроматографический профиль в конце реакционной смеси не изменяется относительно температуры реакции, но время для завершения реакции уменьшалось с увеличением температуры. Температура для реакций сохранялась при 24±0.5°C. Реакции продолжались 8 часов, и в конце 8 часов пробы были проанализированы.
Аналогичным образом индивидуальные предшественники аспарта, лизпро и глулизина растворялись в Трис растворе и 50% диметилформамида при концентрации 3-5 мг/мл. pH реакционной смеси был доведен до 8,5, и температура реакционной смеси поддерживалась при 24±0,5°C. Трипсин добавлялся к индивидуальной реакционной смеси при концентрации 50 мкг/мл.
Наблюдение:
Предшественник аспарта был преобразован в В-30 дезтреонин аспарт и дезоктапептид инсулина. Процент дезтреонин аспарта составлял 45%, дезоктапептида инсулина составлял 36%. Образование необходимого промежуточного соединения, аспарта с дополнительным остатком Аргинина в положении В31, составляло приблизительно 10-14%. Таким образом даже при добавлении 2-ой ферментативной карбоксипептидазы В к реакционной смеси общий выход конечного продукта составлял бы <10-15%.
Подобный профиль продукта был найден, когда реакция проводилась в 50%-ном растворителе. Но скорость реакции является очень медленной в присутствии растворителя. Для достижения подобного типа профиля реакции она должна продолжаться почти 18 часов.
Таким образом образование аспарта из соответствующего предшественника посредством последовательной протеазной реакции не могла быть возможной. Таким образом подразумевалось, что B-29Lys аспарта - самый перспективный участок для расщепления Трипсином и поскольку реакция продолжается, участок B-22Arg также становится склонным для расщепления Трипсином, и в конце реакции получается смешанная совокупность дезтреонина B-30 и дезоктапептида для каждого отдельного предшественника. Продукт расщепления по аргинину B-31 очень низок для всех продуктов предшественника.
Предшественник лизпро, при подобных условиях, был преобразован в продукт лизпро с дополнительным остатком Аргинина в положении B31 наряду с высоким количеством дезоктапептида инсулина. Подобный тип данных наблюдался, когда предшественник глулизина обрабатывался трипсином при идентичных условиях. Однако хроматографические профили реакционной смеси вообще не были чисты в случае предшественника глулизина и лизпро. Это позволяет предположить, что даже если возможный конечный продукт, лизпро и глулизин, может быть получен с помощью последовательной реакции со 2-ой протеазой карбоксипептидазой B, то общий выход был бы очень низок.
Присутствие 50%-ного диметилформамида только замедляет скорость реакции в случае предшественника глулизина так же как и лизпро.
Чтобы проверить концепцию, подобный тип реакции с трипсином попробовали с IN-105 предшественником с остатком B-29Lys, когда предшественник был заблокирован короткоцепочечной молекулой ПЭГ так же как и с неконъюгированной молекулой предшественника. Оказалось, что в случае конъюгированного IN-105 предшественника трипсин расщепляет более предпочтительно по остатку Аргинина 31-ой аминокислоты на С-терминальном конце, с получением IN-105 с дополнительным остатком Аргинина на C-терминальном конце В цепи. Наряду с Аргинином B-31 IN-105 в данной реакционной смеси также образовывался дезоктаинсулин. Но когда неконъюгированный IN-105 предшественник обрабатывался Трипсином, протеаза расщепляла избирательно по остатку Лизина B-29 C-терминального конца, с получением дезтреонин инсулина. Хроматографический профиль в конце реакции был одинаков как при наличии, так и при отсутствии любого растворителя в реакционной смеси. Наблюдалось, что наличие растворителя замедляет скорость реакции.
Примеры 4B:
В следующей фазе экспериментальных условий реакции проводились с совместным добавлением трипсина и карбоксипептидазы B в реакционную смесь отдельного предшественника.
Концентрация предшественника составляла в основном приблизительно от 5 до 50 г/л. Реакция проводилась при pH приблизительно от 5 до 12, предпочтительно при pH от 8 до 10. Температура реакции составляла приблизительно от 0 до 40°C, предпочтительно приблизительно от 2 до 25°C. Трисгидроксиметиламинометан (Трис) или другие буферные системы использовались при различных ионных силах для того, чтобы поддерживать необходимый pH. Время реакции изменялось и зависело от других условий реакции. Реакция продолжалась до тех пор, пока чистота продукта не начинала уменьшаться из-за гидролиза продукта. Она продолжалась в основном приблизительно от 30 минут до 24 часов и в большинстве случаев приблизительно от 4 до 10 часов.
Концентрация фермента была определена в зависимости от концентрации субстратов и ферментативной активности. Например, кристаллический трипсин, доступный на рынке, использовался предпочтительно при концентрации приблизительно от 10 до 100 мг/л.
Пример 4B (I):
4 грамма кристаллического предшественника аспарта растворили в 20 мл 1 M раствора Триса. Концентрация продукта в растворе поддерживалась до 5 мг/мл, а концентрация Трис поддерживалась добавлением до 0,6 M. Аликвоты определенных количеств брались, посредством выравнивания pH реакционной смеси с помощью 2,5 н. NaOH или 2 н. ледяной уксусной кислотой. Были получены аликвоты реакционной смеси при pH 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0. 1 мл каждой из этих реакционных смесей были взяты в отдельную пробирку как отдельные реакционные смеси при различных условиях. Реакция проводилась во всех образцах совместным добавлением трипсина и карбоксипептидазы B в различных концентрациях. Различные изменяемые параметры сведены в таблицу.
Постоянные параметры:
- Концентрация продукта 5 г/л
- Концентрация трис-буфера 0,6 моль
Изменяемые параметры:
- Концентрация трипсина: 25-500 мг/л
- Концентрация карбоксипептидазы: 10-30 мг/л
- рН: 7,0-9,0.
Концентрация предшественника (г/л)
Концентрация Трис (M)
Концентрация трипсина мг/л
Концентрация карбоксипептидазы B (мг/л)
pH
Выход (%)
7,0
53
10
8,0
66
500
9,0
17,5
7,0
54
30
8,0
64
9,0
16
7,0
51
10
8,0
59
200
9,0
24
7,0
28
30
8,0
65
5
0,6
9,0
64
7,5
44
10
8,0
68
50
8,5
75
7,5
45
30
8,0
63
8,5
66
7,5
31
10
8,0
49
25
8,5
61
7,5
31
30
8,0
49
8,5
62
Результаты:
Выяснилось, что в случае, когда трипсин и карбоксипептидаза добавлялись вместе в реакционную смесь, не наблюдалось ни образования дезоктапептидной формы, ни дезтреонина. В конце реакции аспарт представлял собой целевой продукт реакции. Чистота и выход полученного аспарта изменяются при различных условиях реакции. Лучший выход составлял 75% аспарта при концентрации трипсина 50 мг/л, концентрации карбоксипептидазы 10 мг/л и при pH 8,5.
Пример 4B (II):
5 г кристаллического предшественника лизпро растворили в 25 мл 1 M раствора Триса. Концентрация продукта в растворе поддерживалась до 5 мг/мл, а концентрация Трис поддерживалась добавлением до 0,6 M. Аликвоты определенных количеств брались, посредством выравнивания рН реакционной смеси с помощью 2,5 н. NaOH или 2 н. ледяной уксусной кислотой. Были получены аликвоты реакционной смеси при рН 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0. 1 мл каждой из этих реакционных смесей были взяты в отдельную пробирку и промаркированы как A, B, C и т.д. Реакция проводилась во всех образцах совместным добавлением трипсина и карбоксипептидазы B в различных концентрациях. Различные изменяемые параметры сведены в таблицу.
Постоянные параметры:
- Концентрация продукта 5 г/л
- Концентрация трис-буфера 0,6 моль
Изменяемые параметры:
- Концентрация трипсина: 25-500 мг/л
- Концентрация карбоксипептидазы: 10-30 мг/л
- pH: 7,0-9,0.
Концентрация предшественника (г/л)
Концентрация Трис (M)
Концентрация трипсина мг/л
Концентрация карбоксипептидазы B (мг/л)
рН
Выход (%)
7,0
33
7,5
49
10
8,0
62
8,5
65
200
9,0
29
7,0
52
7,5
55
30
8,0
61
8,5
64
9,0
26
7,0
11
7,5
34
100
10
8,0
55
8,5
59
5
0,6
9,0
31
7,0
24
7,5
41
30
8,0
54
8,5
66
9,0
34
7,0
21
7,5
46
10
8,0
66
8,5
78
50
9,0
62
7,0
38
30
7,5
55
8,0
64
Концентрация предшественника (г/л)
Концентрация Трис (M)
Концентрация трипсина мг/л
Концентрация карбоксипептидазы B (мг/л)
pH
Выход (%)
50
30
8,5
71
9,0
65
7,0
13
7,5
25
10
8,0
41
5
0,6
8,5
44
25
9,0
51
7,0
22
7,5
25
30
8,0
33
8,5
46
9,0
55
Результаты:
Выяснилось, что в случае, когда трипсин и карбоксипептидаза добавлялись вместе в реакционную смесь, не наблюдалось ни образования дезоктапептидной формы, ни дезтреонина. Лучший выход составлял 78% лизпро при концентрации трипсина 50 мг/л, концентрации карбоксипептидазы 10 мг/л и при pH 8,5.
Пример 4B (III):
5 граммов кристаллического предшественника глулизина растворили в 25 мл 1 M раствора Триса. Концентрация продукта в растворе поддерживалась до 5 мг/мл, а концентрация Трис поддерживалась добавлением до 0,6 M. Аликвоты определенных количеств брались, посредством выравнивания pH реакционной смеси с помощью 2,5 н. NaOH или 2 н. ледяной уксусной кислотой. Были получены аликвоты реакционной смеси при pH 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0. 1 мл каждой из этих реакционных смесей были взяты в отдельную пробирку и промаркированы как A, B, C и т.д. Реакция проводилась во всех образцах совместным добавлением трипсина и карбоксипептидазы B в различных концентрациях. Различные изменяемые параметры сведены в таблицу.
Постоянные параметры:
- Концентрация продукта 5 г/л
- Концентрация трис-буфера 0,6 моль
Изменяемые параметры:
- Концентрация трипсина: 25-200 мг/л
- Концентрация карбоксипептидазы: 10-30 мг/л
- рН: 7,0-9,0.
Концентрация предшественника (г/л)
Концентрация Трис (M)
Концентрация трипсина мг/л
Концентрация карбоксипептидазы B (мг/л)
pH
Выход (%)
7,0
29
7,5
56
10
8,0
49
8,5
61
200
9,0
49
5
0,6
7,0
44
7,5
59
30
8,0
42
8,5
29
9,0
21
7,0
25
100
10
7,5
33
8,0
47
Концентрация предшественника (г/л)
Концентрация Трис (M)
Концентрация трипсина мг/л
Концентрация карбоксипептидазы B (мг/л)
pH
Выход (%)
100
10
8,5
61
9,0
64
7,0
41
7,5
62
30
8,0
65
8,5
71
9,0
49
7,0
28
7,5
46
10
8,0
68
8,5
78
5
0,6
50
9,0
70
7,0
36
7,5
44
30
8,0
59
8,5
69
9,0
72
7,0
14
7,5
29
10
8,0
35
8,5
49
25
9,0
51
7,0
24
7,5
35
30
8,0
44
8,5
64
9,0
68
Результаты:
Лучший выход составлял 78% глулизина при концентрации трипсина 50 мг/л, концентрации карбоксипептидазы 10 мг/л и при pH 8,5.
Пример 5: Заключительное осаждение
Были выполнены оптимальные условия, раскрытые выше для ферментативных реакций для соответствующих предшественников лизпро, аспарта и глулизина.
Каждая конечная ферментативная реакционная смесь преципитировалась добавлением буфера лимонной кислоты и раствора ZnCl2, и регулированием pH. (буфер лимонной кислоты включал 15,4 г/л лимонной кислоты (безводной), 90 г/л двунатриевого ортофосфатного буфера (безводного), рН доводился до 6,3+0,1 ортофосфорной кислотой). Осаждение осуществлялось в диапазоне pH от 4,0 до 10,0, предпочтительно от 6,0 до 8,0. Концентрация продукта составляла предпочтительно от 1 до 10 г/л. После осаждения продукт был отделен от чистого супернатанта или центрифугированием, или декантированием супернатанта, не нарушая твердого преципитата. Полученный таким образом преципитат был промыт охлажденной водой для того, чтобы удалить присутствующие несвязанные ионы.
Выход процесса осаждения 85-90%.
Вышеупомянутое описание и примеры были даны исключительно для облегчения понимания. Никакие ненужные ограничения не должны быть поняты оттуда, поскольку модификации будут очевидны для квалифицированных в уровне техники специалистов, которые понимают, что изобретение может испольоваться на практике с модификациями и изменениями в пределах объема формулы изобретения.
Способы, раскрытые в настоящем изобретении, преодолевают проблемы, которые обрисованы в общих чертах выше и улучшают технологию, обеспечивая способ реакции, который уменьшает потерю продукта и является более легким относительно других известных способов. Эта система уменьшает стоимость при использовании описанных способов для достижения заявленной увеличенной конверсионной эффективности относительно любого известного способа, таким образом преодолевая главные недостатки, известные в этой области технологии.