УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРЯМОЙ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЙ РЕГИСТРАЦИИ КИНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК СИНТЕЗА ДНК НА ОСНОВЕ pH-ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО СЕНСОРА

Полезная модель относится к биосенсорным аналитическим устройствам с областью применения в молекулярной биологии и биотехнологии, бионанотехнологии, медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве, биобезопасности, установлении личности. Устройство выполняет регистрацию кинетических характеристик синтеза молекул ДНК на основании регистрации изменения pH в ходе реакции синтеза молекул ДНК (в данном описании его действие рассмотрено при регистрации непраймированного синтеза). Полезная модель включает в качестве потенциометрического электрода pH-чувствительный полевой транзистор, термостатирующий блок, реакционный блок, прецизионный блок подачи растворов. Блок подачи растворов осуществляет подачу на транзистор реакционной смеси, время прогрева которой и, следовательно, время реакции синтеза линейно растет со временем, что и обеспечивает возможность измерения ее кинетических параметров. Устройство может функционировать при использовании любого другого варианта полупроводникового или иного типа pH-сенсора. Устройство позволяет регистрировать в режиме реального времени реакцию синтеза ДНК по непрерывному измерению величины pH реакционной смеси. На основании регистрируемого изменения pH во времени производится оценка кинетических фаз процесса - времени задержки начала реакции от момента ее запуска, изменения скорости реакции во времени, ее интенсивность в текущий момент времени, время окончания реакции. В качестве модельной системы синтеза ДНК использовали реакцию непраймированного синтеза ДНК, в которой применяется три компонента - ДНК-полимераза, никующая эндонуклеаза (никаза) и дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ). Устройство может быть использовано для оценки наличия в пробе фермента синтеза ДНК-полимеразы, наличия в пробе дезоксинуклеозидтрифосфатов, а также наличия фермента-индуктора синтеза ДНК никазы. Устройство можно применять для регистрации/детекции как непраймированного (неспецифического), так и специфического синтеза молекул ДНК любой природы - клеток теплокровных, микроорганизмов.
Известна безметочная (прямая) детекция синтеза молекул ДНК, в которой не используются специализированные реагенты, называемые метками и обеспечивающие индикацию синтезируемых целевых молекул ДНК. Этот подход интенсивно развивается в последнее время. Методология позволяет значительно упростить и удешевить процесс регистрации синтеза ДНК и способствует ее ускоренному практическому применению в различных целях, и, прежде всего, в диагностических. Впервые безметочная детекция синтеза молекул ДНК на основе электрохимической регистрации процесса была рассмотрена в работе (Pourmand, Karhanek et al. 2006). Авторы сформулировали принцип измерения и показали, что процесс синтеза ДНК можно регистрировать непосредственно с помощью известных в электрохимических измерениях схем, в частности, используя амперометрические измерения. Метод может быть применен как для регистрации ферментативного синтеза ДНК или РНК, так и любой другой биологической реакции, основанной на аналогичных принципах. Суть безметочной детекции синтеза ДНК состоит в следующем. Само-праймированную одноцепочечную молекулу ДНК иммобилизуют на поверхности измерительного электрода, выполненного из золота. На поверхности золота находится слой тиол-содержащих молекул, полученный самосборкой. Электрод обрабатывают раствором фрагмента Кленова ДНК-полимеразы. В среду, содержащую измерительный электрод, раздельно подаются растворы одного из дезоксинуклеозидтрифосфатов (аденозинтрифосфата, гуанозинтрифосфата, цитозинтрифосфата, тимидинтрифосфата). В случае, если подаваемый дезоксинуклеозидтрифосфат является комплементарным очередному месту связывания, при связывании возникает электрический сигнал, выраженный током и свидетельствующий о связывании нуклеотида с ДНК-матрицей. Если в некоторый момент времени к электроду подается раствор некомплементарного дНТФ, токовый сигнал не возникает. Также не возникает сигнал в случае, если комплементарный дНТФ подается в отсутствие ДНК полимеразы, в отсутствие ДНК-матрицы, или если ДНК-матрица не находится в иммобилизованном состоянии на поверхности электрода. В силу принципа электронейтральности увеличение общего отрицательного заряда молекулы ДНК компенсируется эквивалентным увеличением положительного заряда раствора, который достигается за счет освобождения протона. Выделившийся протон не связан с молекулой ДНК и с высокой скоростью диффундирует в раствор, обеспечивая изменение величины его pH (Pourmand, Karhanek et al. 2006).
Известен также подход к регистрации секвенирования ДНК, основанный на использовании электрохимических методов, связанных с применением полупроводниковых приборов. В последнее время значительно интенсифицировались исследования данного типа (Rothberg, Hinz et al. 2009; Rothberg, Schultz et al. 2010; Rothberg, Hinz et al. 2011). Значимость направления состоит в важности информации, получаемой при расшифровке последовательности геномной ДНК. Отметим основные моменты, связанные с использованием принципов полупроводникового секвенирования ДНК, представленного в работе (Rothberg, Hinz et al. 2011). Техника регистрации основана на прямой безметочной детекции. Данные секвенирования получаются путем прямого считывания последовательности, которое основано на регистрации выброса ионов (протонов) в ходе ДНК-полимеразной реакции. Одиночный считывающий элемент, который можно рассматривать как первичный датчик, представлен ион-чувствительным (pH-чувствительным) полевым транзистором, содержащимся в измерительной ячейке, являющейся необходимым элементом в предлагаемой схеме. Набор ячеек обеспечивает возможность производить параллельное считывание результатов независимых реакций. Для регистрации процесса секвенирования применяют мультисенсорную систему, содержащую 1.2 миллиона одиночных сенсоров - полевых транзисторов, регистрирующих изменение pH раствора в ячейках, в которые они встроены. Принцип секвенирования основан на том, что в цикле присоединения нуклеотида к однонитевой ДНК-матрице, являющейся фрагментом целой молекулы ДНК, происходит закисление среды, связанное с выбросом протона. Процесс выброса протона регистрируется pH-чувствительным полевым транзистором. Синтез ДНК осуществляется ДНК-полимеразой. Однонитевая ДНК, представляющая фрагмент целой молекулы, иммобилизована на затворе полевого транзистора. На каждом транзисторе иммобилизован свой фрагмент ДНК. Суммированный по множеству одинаковых фрагментов для каждого транзистора, такой сигнал представляет значительную величину, характеризующуюся высоким отношением "сигнал/шум" и может быть надежно зарегистрирован первичным датчиком - полевым транзистором. Поскольку выброс протона связан со встраиванием нуклеотидов, которые подаются в известной последовательности, прибор производит построение картины выброса протонов по всему набору сенсоров. Полученные данные поступают на цифровую обработку и в результате использования специальных программ распознавания создают основу для расшифровки общей последовательности ДНК. Несмотря на то, что существует значительное число различных электрохимических систем для регистрации протонов, в качестве считывающего элемента выбран полевой транзистор. Это связано с его высокими характеристиками по химической чувствительности при регистрации концентрации протонов.
Известны два типа синтеза двухцепочечной ДНК - специфический, происходящий на основе одноцепочечной матрицы ДНК, и, условно неспецифический или непраймированный - осуществляющийся в отсутствии матрицы и праймера. Известно, что для начала специфического синтеза ДНК-полимеразами необходимы матричная нить и праймер - короткий олигонуклеотид со свободным 3'-OH концом, комплементарный участку матричной цепи. После выделения ДНК-полимеразы I E.coli было обнаружено, что частично очищенные препараты этого фермента могут синтезировать длинные сополимеры дезоксиаденина и дезокситимидина без добавления праймеров и матрицы. В настоящее время этому синтезу, названному синтезом de novo или непраймированным синтезом ДНК, уделяется значительное внимание исследователей. При детальном анализе эффекта было обнаружено, что термофильные ДНК-полимеразы синтезируют высокомолекулярную ДНК из дезоксинуклеозидтрифосфатов в отсутствии любой инициирующей нуклеиновой кислоты (Ogata and Miura 1997; Ogata and Miura 1998). Было исключено возможное влияние примесей нуклеиновых кислот, которые могли бы служить матрицей/праймером в реакции синтеза. Нашли, что при таком синтезе последовательности синтезированной ДНК были представлены тандемными повторами, подобными (CTAGATAT)n или (AGATATCT)n. Подобные повторяющиеся последовательности ДНК широко распространены в природе, например в сателлитной ДНК, а также в кодирующих участках генома эукариот. Этот синтез называют «креативным» или синтезом ДНК de novo (также синтезом ДНК ab initio) и высказывается предположение, что генетическая информация потенциально может создаваться непосредственно белком. При анализе параметров синтеза ДНК, независимого от матрицы и праймера, было также показано, что достаточно медленный «креативный» синтез ДНК значительно стимулируется при добавлении эндонуклеаз рестрикции в реакционную смесь с ДНК-полимеразой (Liang, Jensen et al. 2004; Liang, Li et al. 2006). Обнаруженный синтез в присутствии эндонуклеаз рестрикции характеризуется коротким лаг-периодом. После лаг-периода синтез ДНК переходит в линейный режим и заканчивается за 1-2 часа. За это время используются практически все дезоксинуклеозидтрифосфаты, введенные в реакционную среду. Стимуляция синтеза ДНК, независимого от матрицы и праймера, зарегистрирована в присутствии никующих эндонуклеаз (Zyrina, Zheleznaya et al. 2007). Для регистрации неспецифического/непраймированного синтеза молекул ДНК используется техника электрофореза в агарозном геле. Этот набор данных позволяет говорить только о том, завершилась ли процедура синтеза или нет, т.е. производить оценку реакции по принципу "ДА-НЕТ". Вместе с тем производить оценку кинетических характеристик непраймированного синтеза молекул ДНК данный подход не позволяет.
Суммируем состояние исследований по данному вопросу. В работе (Pourmand, Karhanek et al. 2006) показана возможность амперометрической регистрации синтеза ДНК. В работе (Rothberg, Hinz et al. 2011) показана возможность детекции матрицей pH-чувствительных полевых транзисторов процесса секвенирования ДНК. Вопрос о регистрации кинетических характеристик реакции синтеза с помощью полупроводникового pH-чувствительного сенсора (pH-чувствительного полевого транзистора, pH-чувствительного светоадресуемого сенсора или любого другого полупроводникового pH-чувствительного сенсора) ни для традиционного, ни для непраймированного синтеза в опубликованных к настоящему времени работах не рассматривался.
Представленная полезная модель позволяет производить регистрацию кинетических характеристик непраймированного синтеза молекул ДНК - регистрировать в режиме реального времени задержку начала реакции от момента ее запуска, изменение скорости реакции во времени, нахождение максимального значения скорости, среднего значения скорости, ее интенсивность в текущий момент времени, время окончания реакции. В качестве pH-чувствительного сенсора использован pH-чувствительный полевой транзистор. На Фигуре 1 схематически представлена конструкция измерительного устройства. Устройство содержит pH-чувствительный полевой транзистор (измерительный электрод) (1), сопряженный с проточной кюветой (2), блок управления режимом работы полевого транзистора (3), блок регистрации сигналов полевого транзистора (X-Y регистратор и/или компьютер) (4), электрод сравнения (5), источник промывочного раствора (6), управляемый компьютером перистальтический насос (7), реакционный блок (8), размещаемый в блоке термостатирования (9), блок измерения контрольного состояния (10), сливную емкость для приема отработанного раствора (11). Блок подачи растворов осуществляет подачу на транзистор реакционной смеси, время прогрева которой и, следовательно, время реакции синтеза линейно растет со временем, что и обеспечивает возможность измерения ее кинетических параметров.
На Фигуре 2 представлена контрольная регистрация профиля pH транзистором при подаче растворов с различной концентрацией протонов. На отрезке времени, обозначенном 1-1', транзистор находился в потоке буферного раствора с pH, равным 2.0. На отрезке времени, обозначенном 2-2' транзистор находился в потоке буфера с pH, равным 7.0. На отрезке времени, обозначенном 3-3' транзистор находился в потоке буфера с pH, равным 10.0. Транзистор с высокой скоростью отслеживал изменение концентрации протонов в среде. В промежутке между указанными периодами времени транзистор находился в потоке дистиллированной воды, pH~6.0.
2
При регистрации синтеза ДНК в режиме реального времени устройство функционирует следующим образом. Устанавливается требуемая скорость подачи реакционной смеси на полевой транзистор. Полевой транзистор функционирует в режиме сенсора, регистрирующего pH раствора в проточном режиме. В реакционный блок в начальный момент времени вводится реакционная смесь - раствор А, объемом 30 микролитров, содержащий 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl, 150 мкМ дНТФ, никазу Nt.BspD6I (5 единиц активности) и ДНК-полимеразу Bst (2 единицы активности, использовали большой фрагмент ДНК-полимеразы Bst), и раствор Б объемом 30 микролитров, содержащий 150 мМ NaCl. В растворе А при температуре 55°C протекает реакция непраймированного синтеза ДНК. Раствор Б рассматривается как контрольный, относительно которого производится замер значений рН. Реакционный блок А выполнен в виде соленоида радиусом 2.0 см. Реакционный блок А, помещается в термостатируемый отсек, стабилизирующий температуру (55°C), в котором реакция синтеза продолжается до выработки всего количества введенных дНТФ. Блок, содержащий раствор Б, не подвергается подогреву. Включение перистальтического насоса обеспечивает подачу растворов на транзистор в последовательности "Раствор Б", "Раствор А". Время прохождения растворов можно варьировать за счет скорости их подачи перистальтическим насосом. В рассмотренном варианте скорость потока была выбрана из условий прохождения полного синтеза ДНК. При этом время прокачки составляло 40 мин для контрольного раствора Б и столько же для раствора А. Методом контроля завершенности реакции синтеза являлась оценка присутствия высокомолекулярных продуктов электрофорезом в 1% агарозном геле для порций раствора А, поступавших в сливное устройство.
На Фигуре 3 представлен результат непрерывной регистрации реакции синтеза ДНК по измерению смещения pH реакционной среды. О ходе реакции свидетельствует смещение pH в кислую область. Базовый уровень обозначен точечной линией. Видны типичные фазы реакции: "Начало" - показана стрелкой 1 - соответствует величине pH начального участка реакционной смеси, не подвергавшегося нагреванию. За ней следует фаза "Развитие", характеризующаяся снижением/закислением pH (эта фаза характеризуется линейным ростом времени нагрева реакционной смеси; она расположена между стрелками 1 и 2). Фаза "Завершение" характеризуется практически неизменным, стационарным уровнем pH, который достигается реакционной смесью в результате окончания реакции синтеза (расположена между стрелками 2 и 3). Через 40 мин на регистратор (pH-чувствительный транзистор) снова поступает контрольный раствор, что приводит к восстановлению (росту) исходного значения pH.
Данные, полученные на основании применения устройства, позволили получить для представленного на Фигуре 3 процесса следующие значения величин. Реакция синтеза начинается непосредственно с началом создания условий для синтеза (температура среды составляет 55°C), максимальная скорость реакции (скорость изменения pH) составляет 0.29 pH/мин и соответствует времени 2.4 мин, средняя скорость синтеза составляет 0.12 pH/мин (регистрация на отрезке времени 2-10 мин), общее время реакции составляет ~10 мин (продолжительность периода обозначена стрелками 1 и 2), общее время регистрации составляет ~40 мин (продолжительность периода обозначена стрелками 1 и 3), максимальная величина сдвига pH (Δ pH) составляет 1.2 единицы pH.
Результат, который получается при использовании предлагаемой полезной модели, заключается в том, что устройство обеспечивает прямое определение кинетических параметров реакции непраймированного синтеза ДНК без использования дорогостоящего оборудования и дорогостоящих реактивов. Устройство может быть использовано как для регистрации непраймированного синтеза ДНК, так и синтеза, происходящего по стандартной схеме с использованием одноцепочечной матрицы ДНК.
В заключение отметим, что данную полезную модель применили для прямой безметочной регистрации кинетики непраймированного синтеза ДНК. Показали, что полезная модель позволяет определять основные параметры реакции синтеза, связанного с временными характеристиками - определять время начала реакции синтеза, скорости в различные фазы реакции, величину эффекта, выраженную изменением pH раствора в любой момент времени. Указанные параметры регистрировали с помощью электрохимического преобразователя - pH-чувствительного полевого транзистора. Отметим, что вместо pH-чувствительного полевого транзистора можно использовать pH-сенсор другого типа, например, pH-чувствительный потенциометрический сенсор (Мс Connell, Parce et al. 1987).
Список цитированной литературы
Liang, X., К. Jensen, et al. (2004). "Very efficient template/primer-independent DNA synthesis by thermophilic DNA polymerase in the presence of a thermophilic restriction endonuclease." Biochemistry 43: 13459-13466.
Liang, X., В. C.-Y. Li, et al. (2006). "Ab initio DNA synthesis by endonuclease." Nucleic Acids Res. 50: 95-96.
Mc Connell, H., J. Parce, et al. (1987). "Light addressable potentiometric biosensor." J Electrochem. Soc. 134 (8 В).
Ogata, N. and T. Miura (1997). "Genetic information 'created' by archaebacterial DNA polymerase." Biochem. J. 324: 667-671.
Ogata, N. and T. Miura (1998). "Genetic information 'created' by DNA polymerase the archaeon Thermococcus litoralis: influences of temperature and ionic strength." Nucleic Acids Res. 26: 4652-4656.
Pourmand, N., M. Karhanek, et al. (2006). "Direct electrical detection of DNA synthesis." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103 (17): 6466-6470.
Rothberg, J. M., W. Hinz, et al. (2009). Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays. USA, Patent Application Publication, Ion Torrent Systems Incorporated, Guilford, US 2009/0127589 A1. Publication date May 21, 2009.
Rothberg, J. M., W. Hinz, et al. (2011). "An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing." Nature 475(7356): 348-352.
Rothberg, J. M., J. C. Schultz, et al. (2010). Patent - Integrated sensor arrays for biological and chemical analysis. International Publication Number WO 2010/047804 A1. Publication date 29 April 2010.
Zyrina, N. V., L. A. Zheleznaya, et al. (2007). "N.BspD6I DNA nickase synthesis of non-palindromic repetitive DNA by Bst DNA polymerase." Biol. Chem. 388: 367-372.