Роль клеток clara в поддержании постоянства и репарации повреждений эпителия легочных дыхательных путей

И I II II

тп

Новости клеточных технологий

Роль клеток Клара в поддержании постоянства и репарации повреждений эпителия дыхательных путей

Исследования стволовых клеток (СК) и прогенитор-ных клеток эпителия дыхательных путей млекопитающих характеризуются определенной спецификой: слишком часто экспериментальные результаты не дают ясного ответа на поставленные вопросы. В этом плане показательна работа коллектива авторов из Duke University, опубликованная в июньском номере Cell Stem Cell [1]. Исследование посвящено степени участия в постнаталь-ном росте, поддержании гомеостаза и репарации повреждений эпителия легких мыши нереснитчатых бронхиальных клеток, называемых клетками Клара. Известно, что после окончания постнатального роста ткань эпителия легких переходит в стационарное состояние с очень низкой скоростью обновления клеток. Повреждение же эпителия стимулирует его быстрое восстановление и обновление. Попытки выявить резидентные соматические СК или прогениторные клетки эпителия легких до сих пор приводили к получению неоднозначных результатов.

Понятнее всего обстоят дела с эпителием альвеол — в нем основными прогениторными клетками являются альвеолоциты 2-го типа (АЦ2) [2]. В эпителии бронхиол, содержащем реснитчатые, нереснитчатые (клетки Клара) и нейроэндокринные клетки, именно клетки Клара рассматриваются многими современными исследователями в качестве основного кандидата на роль резидентных стволовых или прогениторных клеток [3—5]. При этом было продемонстрировано, что необходимым и достаточным для восстановления эпителия бронхиол было выживание лишь определенных субпопуляций клеток Клара [6, 7]. Кроме того, в «бронхоальвеолярных сочленениях» (БАС) была обнаружена специфическая популяция клеток, одновременно несущих маркеры клеток Клара (секретоглобулин-1 а1 — Scgb1a1) и АЦ2 (белок С сурфактанта — SftpC или SpC), которые было предложено считать бронхоальвеолярными СК (БАСК) [8]. Наконец, в трахеальном эпителии роль СК обычно выполняют т.н. базальные клетки [9, 10], однако при селективном повреждении реснитчатых клеток в трахее происходит индукция деления клеток Клара, а не базальных эпителиоцитов [11].

Вопросы, на которые своими экспериментами попытались ответить авторы обсуждаемой статьи [1], были сформулированы следующих образом: только ли те субпопуляции клеток Клара, которые ведут себя как СК, вовлечены в развитие или репарацию слизистой оболочки дыхательных путей, или в этом участвует вся популяция нереснитчатых клеток? Не являются ли клетки Клара факультативными прогениторами, активирующимися только в ответ на повреждение эпителия? Можно ли считать, что в эпителии трахеи присутствуют две различных популяции СК (базальные и клетки Клара), или базальные клетки являются СК, а вторые — способны лишь к транзиторной пролиферации?

Для поиска ответов авторы получили особую генетически модифицированную линию мышей, у которых ген, кодирующий химерный белок (рецептор эстрогенов, модифицированный рекомбиназой Сге — CreER), был внедрен в локус Scgb1a1. Сге, являющаяся особым типом

топоизомеразы I, обеспечивает рекомбинацию сегментов ДНК, фланкированных loxP (floxed segments), в клетках, экспрессирующих Сге [12]. При использовании химерного белка CreER экспрессия Сге и, соответственно, сама рекомбинация индуцируется введением тамоксифена [13]. Это позволило получить «кпоскю»-мышей с меткой, позволяющей проследить наличие и судьбу клеток Клара и предполагаемых БАСК на различных стадиях развития животных. В ходе исследования авторы показали, что эффективность и специфичность Нпеаде-мечения зависит от дозы введенного тамоксифена. Количество меченых клеток в разных участках варьировало, но всегда их было больше всего в терминальных бронхиолах, несколько меньше в проксимальных бронхиолах и меньше всего в трахеях. В отсутствие тамоксифена (контроль) рекомбинация была выявлена лишь в 5% клеток Клара в бронхиолах, а клетки Клара в трахеях, БАСК и АЦ2 не метились. Введение тамоксифена приводило к эффективному Нпеаде-мечению клеток Клара и предполагаемых БАСК: четыре последовательных введения тамоксифена (по 0,25 мг/г массы, через день) позволяли пометить 80% бронхиальных клеток Клара и более 90% БАСК. Однако одновременная экспрессия Scgb1a1 (маркер клеток Клара) и SftpC (маркер АЦ2) наблюдается не только в предполагаемых БАСК, но и в небольшой части (8%) АЦ2.

Очень важно отметить, что Нпеаде-метка не обнаруживалась в легких новорожденных мышей, если инъекция тамоксифена выполнялась пренатально беременным мышам ранее, чем на 15-е сут. развития эмбриона. Это значит, что в онтогенезе клетки Клара дифференцируются лишь в последней трети периода эмбрионального развития. Отметим, что несколькими годами раньше другие исследователи обнаружили, что в культуре мышиных эмбриональных СК, клетки Клара также появляются именно на 15-е сут. развития [14].

В постнатальном развитии в бронхиолах процентное содержание Нпеаде-меченных клеток (клетки Клара + БАСК) и скорость самообновления популяции клеток Клара сохранялись постоянными в течение 1-го года жизни животных (дольше эксперимент не проводился). При этом в бронхиолах клетки Клара могут дифференцироваться в реснитчатые (но не нейроэндокринные или какие-либо иные) клетки. Скорость замещения реснитчатых клеток новыми клетками, образующимися из клеток Клара, составила 0,9% за неделю. В условиях повреждения эпителия бронхиол активация этих клеток обеспечивает восстановление эпителия.

В отличие от бронхиол, в трахее функции клеток Клара, видимо, иные. В трахее с возрастом происходило уменьшение количества этих клеток (рис. Б). Самообновление популяции этих клеток не было выявлено, хотя часть новых реснитчатых клеток происходила из клеток Клара. Их значимая прогениторная роль в эпителии трахеи была показана только в ситуации, связанной с репарацией эпителия после воздействия S02. В альвеолах клетки Клара не обнаруживались, а БАСК были неспособны к самообновлению или к порождению других типов клеток.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 4, 2009

И I II II

тп

Новости клеточных технологий

Перечисленные наблюдения позволили авторам статьи [1] заключить:

Клетки Клара играют роль прогениторных клеток в эпителии бронхиол и трахеи мышей. Появление и их активация у плода наблюдается только в последней трети периода эмбрионального развития.

Клетки Клара в бронхиолах способны к самообновлению собственной популяции и к порождению реснитчатых клеток, а в трахее — только к порождению реснитчатых клеток, но не к самообновлению.

Повреждение эпителия, как в бронхиолах, так и в трахее приводит к активации пролиферации клеток Клара, необходимой для репарации эпителия.

Клетки Клара и БАСК не проявляют прогениторных свойств в альвеолярном эпителии.

Не получено доказательств, что БАСК являются функционально особой популяцией клеток эпителия легких.

Однако нельзя обойти вниманием тот факт, что, несмотря на общее весьма значительное число включенных в исследование животных, в каждом эксперименте на одну временную точку приходилось от 2 до 5 живот-

ных. Кроме того, авторы приводят лишь количество проанализированных микроскопических изображений из каждого опыта и анатомического региона, но не указывают суммарное число проанализированных клеток, т.е. пропорции содержания клеток определяются из сходных проанализированных площадей эпителия, но не из сходного числа клеток. Обе эти особенности планирования экспериментов в принципе могут служить источником повышения вероятности систематического сдвига в анализе полученных результатов. Правда, скорее всего, эти возможные смещения не настолько велики, чтобы поставить под сомнение качественные выводы, сделанные авторами обсуждаемой статьи [1]. Главным результатом обсуждаемой статьи, по мнению редакции Science Daily [15], является прямое доказательство факта, что для поддержания стабильности состава и для восстановления повреждений легочного эпителия требуются различные типы резидентных стволовых/прогениторных клеток. Этот факт имеет большое значение для исследований патологического ремоделирования легочного эпителия и для работ в области регенеративной медицины.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Rawlins E.L., Okubo Т., Xue Y. et al. The role of ScgM a1 1 Clara cells in the long-term maintenance and repair of lung airway, but not alveolar, epithelium. Cell Stem Cell 2009; 4(61: 525-34.

2. Evans M.J., Cabral L.J., Stephens R.J., Freeman G. Transformation of alveolar type 2 cells to type 1 cells following exposure to N02. Exp. Mol. Pathol. 1975; 22: 142-50.

3. Reynolds S.D., Hong K.U., Giangreco A. et al. Conditional clara cell ablation reveals a self-renewing progenitor function of pulmonary neuroendocrine cells. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2DDD; 278(B): L1256-63.

4. Have-Opbroek A.A.W., Randell S.H., Stripp B.R. Stem cells in lung morphogenesis, regeneration, and carcinogenesis. In Sell S. editor. Stem Cell Handbook. Humana Press; 2DD4: 455—72.

5. Emura M. Stem cells of the respiratory tract. Paediatric Resp. Rev. 2002; 3C1]: 36-40.

6. Hong K.U., Reynolds S.D., Giangreco A., Hurley C.M., Stripp B.R. Clara cell secretory protein-expressing cells of the airway neuroepithelial body microenvironment include a label-retaining subset and are critical for epithelial renewal after progenitor cell depletion. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2001; 24(61: 671-81.

7. Giangreco A., Reynolds S.D., Stripp B.R. Terminal bronchioles harbor a unique airway stem cell population that localizes to the bronchoalveolar duct junction. Am. J. Pathol. 2002; 161Ш: 173—82.

8. Kim C.F., Jackson E.L., Woolfenden A.E. et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung cancer. Cell 2005; 121: 823-35.

9. Hong K.U., Reynolds S.D., Watkins S., Fuchs E., Stripp B.R. In vivo differentiation potential of tracheal basal cells: evidence for multipotent and unipotent subpopulations. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2004; 286(41: L643-9.

10. Rock J.R., Onaitis M.W., Rawlins E.L. et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. PNAS 2009; 31 [1061: 12771-5.

11. Evans M.J., Shami S.G., Cabral-Anderson L.J., Dekker N.P. Role of nonciliated cells in renewal of the bronchial epithelium of rats exposed to N02. Am. J. Pathol. 1986; 123(11: 126-33.

12. Akagi K., Sandig V., Vooijs M. et al. Cre-mediated somatic site-specific recombination in mice. Nucl. Acids Res. 1997; 25[91: 1766-73.

13. Hayashi S., McMahon A.P. Efficient recombination in diverse tissues by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 2002; 244(2): 305—18.

14. Coraux C., Nawrocki-Raby B., Hinnrasky J. et al. Embryonic stem cells generate airway epithelial tissue. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 2005; 32C2]: 87-92.

15. Sleuths follow lung stem cells for generations to shed light on healing. ScienceDaily http://www.sciencedaily.com/releases/2009/06/ 090604144336.htm.

Порготовип В.Г. Зайцев

По материалам: Rawlins E.L., Okubo T„ Xue Y. et al. The role of Scgb 1a1T Clara cells in the long-term maintenance and repair of lung airway, but not alveolar, epithelium. Cell Stem Cell 2009; 4(6): 525-34

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 4, 2009

А