Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов в предстательной железе, исследуемых методом хромато-масс-спектрометрии
METHOD FOR DETERMINING REFERENCE VALUES OF INDICATORS OF MICROORGANISMS IN THE PROSTATE GLAND, INVESTIGATED USING CHROMATO-MASS SPECTROMETRY METHOD

Изобретение относится к молекулярно-биологическим методам исследования.
В частности, способ относится к исследованиям молекулярных маркеров микробного происхождения в биологических жидкостях методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) и найдет применение для клинических рутинных медицинских анализов биологических жидкостей предстательной железы.
В структуре урологических болезней простатит остается наиболее распространенным заболеванием у взрослых мужчин моложе 50 лет и третьим по распространенности урологическим диагнозом у мужчин старше 50 лет. По данным различных авторов, от 35 до 50% мужчин хотя бы 1 раз в жизни зафиксировали симптомы нижних мочевых путей, характерных для простатита. Несмотря на отсутствие опасности для угрозы жизни, хронический простатит (ХП) способствует существенному снижению ее качества, поскольку отрицательно влияет на семейные взаимоотношения, сексуальную жизнь, работоспособность и т.д. Протекание заболевания наряду с местными симптомами, нередко проявляется признаками расстройства других органов и систем [Кадыров З.А., Степанов В.Н., Фаниев М.В., Рамишвили Ш.В. Микробиота органов урогенитальной системы. Урология. 2020. №1. С. 116-120; Кадыров З.А., Степанов B.C., Рамишвили Ш.В., Машанеишвили Ш.Г. Диагностика хронического абактериального простатита. Андрология и генитальная хирургия. 2019;20 (3):36-42.].
В диагностике ХП на сегодня ведущую роль играет посев секрета простаты, от результата которого зависит дальнейшая тактика лечения больного. В этой связи в литературе значительное внимание уделяется изучению места различных микроорганизмов в этиопатогенезе простатита [Локшин К.Л. Простатит: что нового и полезного в фундаментальных и клинических исследованиях? Вестник урологии. 2017;5(4):69-78. DOI: 10.21886/23086424-2017-5-4-69-78.; Черногубова Е.А. Маркеры воспаления при разных формах хронического абактериального простатита. Вестник урологии. 2018;6(2):44-53. DOI: 10.21886/2308-6424-2018-6-2-44-43].
Большинство существующих методик исследования микроорганизмов не отвечает современным требованиям: стандартный посев обнаруживает более десяти родов аэробных микроорганизмов, которые культивируется из числа энтеробактерий, аэробных кокков и псевдомонад; ограничена информация о возможной эндогенной природе инфекции, связанной с транслокацией анаэробной кишечной флоры. В этой связи реальная частота абактериальных форм многих форм заболеваний, в частности простатита, не известна. Недооценка внутриклеточных возбудителей и вирусов как этиологического фактора ведет к хронизации заболевания и неудачам в лечении. Указанное выше способствует, соответственно, изменению методологии проведения таких исследований и поиску новых более усовершенствованных методик.
В настоящее время часть исследователей уходит от классических бактериологических методик и используют метод масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) [Хромато-масс-спектрометрический анализ микроорганизмов и их сообществ в клинических пробах при инфекциях и дисбиозах / В книге: Химический анализ в медицинской диагностике. - М.: Наука, 2010. - С. 293-368; Кадыров З.А., Степанов В.Н., Фаниев М.В., Рамишвили Ш.В. Микробиота органов урогенитальной системы. Урология. 2020. №1. С. 116-120]. В его основе лежит высокоточное детектирование молекулярных маркеров микроорганизмов из числа их клеточных липидов и микробных метаболитов (высшие жирные кислоты, альдегиды, спирты и стеролы) в анализируемой пробе с последующей реконструкцией качественного и количественного состава микробного сообщества. В каждом образце методом МСММ одновременно количественно определяют 57 микроорганизмов, включая анаэробы, актинобактерии, вирусы и грибы, методический подход был апробирован и зарегистрирован в качестве медицинской технологии [Оценка микроэкологического статуса человека методом хроматомасс-спектрометрии. / Баранов В.М., Осипов Г.А., Мухамедиева Л.Н., Белобородова Н.В., Пахомова А.А., Родионова Т.А. // Новая медицинская технология. МЗ РФ №НЮ-40006, 17.08.2009.].
Выбор в качестве методического подхода метода масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) обусловлен возможностью анализировать широкий спектр проб, в том числе абактериальные с точки зрения классических методик микробной диагностики материалы, а также возможность давать скрининговую оценку состава микробного сообщества с количественной характеристикой каждого компонента [Количественный in situ микробиологический анализ по липидным маркерам в биологических жидкостях с использованием метода газовой хроматографии - масс спектрометрии. / Осипов Г.А., Федосова Н.Ф., Лядов К.В. // Здравоохранение и медицинские технологии. 2007. №5 С. 20-23.]. По стандартной процедуре из биоматериала извлекают специфические компоненты - микробные маркеры, которые идентифицируют с помощью газового хроматографа масс-спектрометра и оценивают количественно по внутреннему стандарту. На основании значений совокупности маркеров также по стандартной процедуре расчета производят реконструкцию микробного сообщества в пробе с количественной оценкой присутствия 57 микроорганизмов, а также дополнительных показателей, таких как суммарная микробная нагрузка, уровень эндотоксина и плазмалогена. Медицинская технология разрешена к применению на территории Российской Федерации (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010). Недостатком существующего метода МСММ является отсутствие критериев оценки полученных при анализе секрета простаты численных значений для диагностических целей в рутинной практике.
Известен способ дифференциальной диагностики воспалительных процессов в мочеполовых путях у мужчин [Патент РФ №2153672, опубликован 27.07.2000], включающий микробиологическое исследование количественного содержания микроорганизмов в секрете предстательной железы, эякуляте, моче, отличающийся тем, что в качестве проб мочи исследуют первую порцию свободно истекающей мочи, среднюю порцию, порцию мочи, полученную сразу после проведения массажа и через 30-40 мин после массажа, регистрируют вид микроорганизмов и динамику изменения их концентрации и при получении микроорганизмов, выделенных из первой порции мочи, отличающихся от микроорганизмов, выделенных из других порций мочи или превышения концентрации микроорганизмов в первой порции мочи по сравнению с другими порциями мочи не менее чем на 2 lg КОЕ/мл диагностируют уретрит, если концентрация микроорганизмов, выделенных в средней порции мочи, превышает концентрацию в остальных пробах мочи не менее чем на 2 lg КОЕ/мл диагностируют цистит, при определении одного и того же вида микроорганизмов в одинаковой концентрации в первой, средней и полученной через 30-40 мин после массажа предстательной железы порциях мочи, а в порции мочи, полученной сразу после массажа, определение снижения концентрации того же вида микроорганизма не менее чем на 2 lg КОЕ/мл, диагностируют пиелонефрит, если концентрация микроорганизмов, выделенных из секрета предстательной железы, превышает концентрацию того же вида микроорганизма в средней и полученной сразу после массажа порции мочи не менее чем на 2 lg КОЕ/мл диагностируют простатит, а при получении различных видов микроорганизмов в эякуляте, секрете предстательной железы и моче и концентрации микроорганизмов в эякуляте, превышающей концентрацию микроорганизмов, выделенных из проб секрета предстательной железы и мочи не менее чем на 2 lg КОЕ/мл, диагностируют воспалительный процесс в репродуктивном отделе мочеполовой системы.
Недостатком данного метода является то, что микробиологическое исследование мочи производится на стандартные питательные среды, поэтому выделяют ограниченный набор известных патогенных микроорганизмов и определяется их концентрация в моче не по абсолютному уровню, а по относительным коэффициентам, что достаточно сложно для интерпретации результатов в повседневной лабораторной практике.
Известен способ дифференциальной диагностики заболеваний предстательной железы и уретры, включающий определение количества лейкоцитов в единице объема при исследовании 10 мл предмассажной и 10 мл постмассажной порций утренней мочи, и при увеличении количества лейкоцитов в постмассажной порции мочи на 2000-2500 в 1 мл диагностируют простатодинию, на 2500-6000 в 1 мл - застойный простатит, более чем на 6000 в 1 мл - инфекционный простатит, а увеличение количества лейкоцитов в предмассажной порции мочи свидетельствует о наличии уретрита [Патент РФ №2263915, опубликован 10.11.2005.].
Недостатком данного способа является возможность диагностировать сам факт наличия микроорганизма и оценить тяжесть, но не дает информации о природе инфекционно-воспалительного процесса и затрудняет выбор лечения.
Известен способ определения бактериологической обсемененности мочи, секрета предстательной железы и эякулята факультативно-анаэробными и неклостридиально-анаэробными бактериями, включающий забор материала, его посев на селективные питательные среды, выделение и идентификацию культур микроорганизмов, отличающийся тем, что производят посев мочи, секрета предстательной железы и эякулята на среду Блаурокка, бульон Шадлера, агар Шадлера, кровяной агар (КА) на основе среды Мюллер-Хинтон, желчно-эскулиновый агар для бактероидов - для культивирования неклостридиально-анаэробных бактерий; среду Эндо, хромогенный селективный агар для энтерококков, хромогенный селективный агар для кандид, хромогенный селективный агар для клебсиелл, хромогенный селективный агар для стафилококков, КА на основе среды Мюллер-Хинтон - для культивирования факультативно-анаэробных бактерий в последовательных разведениях от 10-1 до 10-10 и выявляют факультативно-анаэробные и неклостридиально-анаэробные бактерии и их концентрацию с минимального уровня разведений 10-1 [Патент РФ №2452774, опубликован 10.06.2012.].
Недостатком данного метода является то, что исследование констатирует наличие бактериального простатита, а не состав микрофлоры, что затрудняет выбор терапии.
Известен способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности, характеризующийся тем, что с помощью метода полимеразной цепной реакции в «реальном времени» в исследуемой биопробе определяют общее число геномов микроорганизмов, характерных для конкретного биотопа, число геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты, полученные величины сравнивают между собой, определяют соотношение между числом геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты и при превышении числа геномов нормобиоты относительно числа геномов условно-патогенной биоты в 1000 раз констатируют отсутствие дисбаланса, оценивая данный показатель как вариант нормы, а при значении данного показателя менее чем 1000 раз диагностируют дисбаланс и устанавливают степень его выраженности путем определения соотношения между числом геномов нормобиоты и общим числом геномов микроорганизмов, присутствующих в исследуемой пробе, а также между числом геномов условно-патогенной биоты и нормобиоты и при снижении числа геномов нормобиоты относительно общего числа геномов микроорганизмов в 10-100 раз и снижении числа геномов условно-патогенной биоты относительно числа геномов нормобиоты в 100-1000 раз устанавливают легкую степень дисбаланса, а при превышении числа геномов нормобиоты относительно общего числа геномов микроорганизмов более чем в 100 раз, и превышении числа геномов условно-патогенной биоты относительно числа геномов нормобиоты в 10 раз и более или менее этой величины устанавливают выраженную степень дисбаланса [патент РФ №2362808 опубликован 27.07.2009].
Данная технология - запатентованная компанией «ДНК-Технология» (патент РФ №2362808 опубликован 27.07.2009.) и зарегистрированная в МЗ РФ в качестве медицинского диагностикума Андрофлор (Регистрационное удостоверение №РЗН 2016/4490 от 25.07.2016 г. ) - это способ количественного исследования микрофлоры урогенитального тракта мужчин методом ПНР в реальном времени. В основе исследования - современные представления о сложном составе микробиома (набор микроорганизмов, живущих в организме человека) [https://www.uroweb.ru/partners_docs/ДНК_Технология/Андрофлор.pdf].
Недостатком указанного способа является исследование всего 24 микроорганизмов без определения вирусов, что ограничивает его возможности.
Наиболее близким к заявленному техническому решению является изобретение способ определения референтных значений показателей микроорганизмов, исследуемых методом хромато-масс-спектрометрии, включающий определение референтного диапазона норм, значение которых вычислено с применением калибровочного шаблона на основе выборки произвольной группы исследуемых объектов, и выбор аутентичных поставленной задаче групп специфических (селективных) ионов в пробах после анализа всех маркеров стандартной базы данных, отличающийся тем, что определяют референтный диапазон норм по каждому микроорганизму в конкретном биотопе конкретного объекта (обследуемого), выведенный по формуле среднеквадратичного отклонения, для чего полученные показатели проб биологических материалов вычисляют по формуле: корень квадратный из числа, полученного делением квадратичного отклонения совокупности количеств каждого из микроорганизмов, внесенных в таблицу протокола произвольной выборки обследуемых, на количество обследуемых этой выборки без экстремальных значений, определяют встречаемость в конкретном биотопе относительно предварительно рассчитанной как процентное отношение частоты встречаемости при статистической обработке каждого микроорганизма произвольной выборки обследуемых, группируют микроорганизмы по группам «Резидентные» и «Транзиторные» в зависимости от частоты встречаемости микроорганизмов в конкретном биотопе, если встречаемость микроорганизма свыше 50% случаев, то его относят к резидентной группе микроорганизмов, если встречаемость микроорганизма ниже 50% случаев, то его относят к транзиторной группе микроорганизмов, разделяют микроорганизмы по группам, соответствующим группировке на резидентные и транзиторные, вычисляют суммарную нагрузку по каждому виду микроорганизмов: резидентным микроорганизмам, транзиторным микроорганизмам, анаэробным микроорганизмам, микроскопическим грибам, вирусам, вычисляют общую бактериальную или микробную нагрузку, вычисляют процентное соотношение резидентных и транзиторных микроорганизмов от общей бактериальной или микробной нагрузки, вычисляют процентное соотношение анаэробных микроорганизмов от общей бактериальной или микробной нагрузки, определяют допустимый интервал отклонений от нормы для конкретного биотопа конкретного обследуемого (объекта) после сравнения допустимого интервала отклонений, рассчитанного без экстремальных значений, и допустимого интервала отклонений, рассчитанного по всем значениям выборки допустимого интервала отклонений, рассчитанного с применением калибровочного шаблона по стандартной произвольной выборки обследуемых, и находят референтный диапазон для каждой группы микроорганизмов исходя из допустимого интервала отклонений от нормы для конкретного обследуемого.
2. Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов по п. 1, отличающийся тем, что отображают после разделения микроорганизмов на группы резидентные и транзиторные в разных разделах таблицы протокола.
3. Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов по п. 1, отличающийся тем, что выделяют микроорганизмы в таблице протоколов с помощью окраски резидентных микроорганизмов цветами красного спектра и транзиторных микроорганизмов цветами синего или голубого спектра.
4. Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов по п. 1, отличающийся тем, что осуществляют произвольную выборку обследуемых с учетом возраста, или расовой группы, или региона проживания, или режима питания [Патент РФ №2715223, 02.26.2020].
Недостатком данного изобретения является отсутствие информации об исследовании биотопов урогенитального тракта мужчин и реферетных значений для лечения пациентов с простатитом, так как в нем речь идет об исследовании микробиоты кишечника, которая отличается от микробного состава простаты, имеющей собственные референтные значения. Кроме того, в настоящее время в разных областях клинической медицины пересматривается классическое представление о строгом делении микроорганизмов на патогенные, условно-патогенные и сапрофитные. Зачастую мы наблюдаем как фоновое присутствие ранее считавшихся патогенными микробов в отсутствие болезни, так и наоборот - количественное участие в инфекционных процессах компонентов нормофлоры человека, т.н. эндогенные инфекционно-воспалительные процессы. Это существенно затрудняет диагностику ХП, так как грань между резидентными и факультативными микроорганизмами стирается, и необходимо оценивать реальное количественное присутствие каждого компонента микробиоценоза для оценки его индивидуальной роли в патогенезе. Таким образом очевидна необходимость референсных значений по максимально широкому спектру показателей для целей диагностики и назначения этиотропной терапии.
Указанные недостатки устраняются в заявляемом изобретении.
Задачей заявляемого изобретения является количественная оценка фонового присутствия маркеров микроорганизмов в секрете простаты, исследуемом методом МСММ у здоровых пациентов без жалоб, разработка референтных значений (норм) для каждого из микроорганизмов, сопоставление показателей здоровых пациентов и больных хроническим абактериальном простатитом, и определение достоверных диагностических критериев, позволяющих отличить микрофлору здоровой простаты; разработка величин отклонений от нормы, которые могут свидетельствовать о наличие простатита вне зависимости от его формы.
Поставленная задача решается тем, что в исследуемом биоматериале - секрете предстательной железы, методом МСММ по стандартной медицинской технологии (МЗ РФ №НЮ-40006, 17.08.2009.) определяют количественно содержание 57 микроорганизмов с одновременной оценкой общей микробной нагрузки, уровня эндотоксина и референтного значения норм по каждому микроорганизму в образце; проводят сравнение численности микроорганизмов в норме и патологии; анализируют структуры распределения численности микроорганизмов при разделении обследуемых пациентов на больных и здоровых - без патологии в анамнезе; анализируют непараметрическими методами гистограммы частотного распределения микроорганизмов, которые в правой части имеют высокий столб в нуле и ненулевые значения; по различию в частоте появления ненулевых значений тех или иных маркеров делают заключение об относительной распространенности того или иного микроорганизма у пациентов в секрете простаты.
2. Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов в предстательной железе по п. 1, отличающийся тем, что микроорганизмы отображают в таблицах и диаграммах с указанием референтных значений.
3. Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов в предстательной железе по п. 1, отличающийся тем, что микроорганизмы, превышающие референтные значения выделяют в диаграммах и таблицах цветом.
4. Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов в предстательной железе по п. 1, отличающийся тем, что осуществляют произвольную выборку обследуемых с учетом возраста, или анамнеза, или жалоб, или клинической симптоматики.
5. Способ определения референтных значений показателей микроорганизмов в предстательной железе по п. 1, отличающийся тем, выявляют микроорганизмы в случаях, когда посев не дает результатов.
Техническим результатом предложенного изобретения является разработка референтных значений (норм) по каждому микроорганизму, определяемому с помощью методики МСММ, в секрете простаты у здоровых пациентов без жалоб путем определения достоверных диагностических критериев; повышение точности дифференциальной диагностики хронического абактериального простатита путем определения величин отклонений от нормы, которые могут свидетельствовать о наличие простатита вне зависимости от его формы.
Некультуральный подход к идентификации микроорганизмов методом МСММ (МЗ РФ №НЮ-40006, 17.08.2009.) позволяет избежать многих ограничений традиционно применяемых методик. Для диагностики простатита важны его способность достоверно обнаружить присутствие микроорганизма вне зависимости от его способности расти на искусственных питательных средах. Микробные маркеры - это либо структурные компоненты бактериальных стенок, либо микробные метаболиты, их извлекают непосредственно из клинического материала (секрет простаты) посредством простой и универсальной химической процедуры, что устраняет необходимости в сохранении жизнеспособности микроорганизмов в пробе, тем самым расширяя диагностический диапазон. Извлеченная смесь маркерных веществ микробного происхождения вместе с естественными компонентами биоматериала анализируют с помощью газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС). Специальная программа разделения многокомпонентной смеси и регистрации специфических ионов, являющая неотъемлемой частью медицинской технологии МСММ, позволяет целевым образом измерить содержание минорных молекул микробного происхождения на фоне подавляющих сигналов матрицы биологического материала. Ядром метода МСММ является математический алгоритм реконструкции микробного сообщества по набору зарегистрированных маркеров.
4
5
Метод МСММ стандартизован, разрешен к применению (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010) и используется в клинической практике для выявления у уточнения этиологии инфекционно-воспалительных процессов как готовое техническое решение. Метод является высокочувствительным (10-10 клеток/мл), быстрым (2,5 ч на - полный цикл исследования), универсальным (бактерии, грибы, вирусы, - все за один анализ образца без повторов), экономичным и имеет широкий диагностический спектр (одновременное количественное определение 57 микроорганизмов). Некультуральный подход дает возможность применения в тех случаях, когда традиционные методы диагностики неэффективны, что особенно актуально при терапии хронического абактериального рецидивирующего простатита.
Заявляемое изобретение иллюстрируется следующими графическими изображениями:
Фиг. 1 - Гистограмма распределения Streptococcus spp;
Фиг. 2 - Гистограмма распределения Staphylococcus aureus
Фиг. 3 - Гистограмма распределения Streptococcus mutans;
Фиг. 4 - Диаграмма типа «ящик с усами» для кокк и бацилл;
Фиг. 5 - Диаграмма типа «ящик с усами» для анаэробов;
Фиг. 6 - Суммарная концентрация микробов при норме и патологии;
Фиг 7 - Результаты посева у обследуемого К.;
Фиг. 8 - Результаты анализа Андрофлоры у обследуемого К.;
Фиг. 9. Результаты анализа МСММ у обследуемого К.;
Фиг. 10 - Результаты посева у обследуемого Г.;
Фиг. 11 Результаты анализа Андрофлоры у обследуемого Г.;
Фиг. 12 - Результаты анализа МСММ у обследуемого Г.;
Фиг. 13 - Результаты анализа МСММ у пациента Ш. С хроническим абактериальным простатитом.
Таблица 1. Описательные статистики для здоровых мужчин и пациентов с хроническим простатитом по группам микроорганизмов
Таблица 2. Описательные статистики для здоровых мужчин и пациентов с хроническим простатитом по всем микроорганизмам
Подробное описание способа и примеры его клинического выполнения
Способ осуществляется следующим образом.
У пациента с хроническим простатитом осуществляют забор секрета простаты с предварительной обработкой головки полового члена и наружного отверстия уретры водным раствором хлоргексидина. Накануне исследования пациент за сутки воздерживается от половых отношений и за 2 часа от мочеиспускания. Необходимые манипуляции осуществляет врач-уролог. Поскольку в естественных условиях секрет простаты, проходя по уретре в составе семенной жидкости, смешивается с секретом других желез, для получения «чистого» материала требуется принятие в работу 2 или 3 порции секрета, что позволяет получить секрет простаты в количестве 1-2 мл. Такого количества секрета предстательной железы достаточно для микробиологического исследования и анализ методом МСММ.
Все образцы секрета простаты обрабатывали на «Микробиологическом анализаторе МАЭСТРО» (ООО «Интерлаб», Россия), который представляет ГХ-МС, оснащенный системой автоматического ввода проб и полным пакетом программного обеспечения необходимого для анализа МСММ, возможно применение зарубежного ГХ-МС (Agilent Technologies, США), вручную настраиваемого под требования медицинской технологии. В результате исследования МСММ каждый отобранный образец характеризуется измеренным численным содержанием 57 микроорганизмов, включая анаэробы, актинобактериии, вирусы и грибы, а также тремя дополнительными показателями: суммарной микробной нагрузкой, содержанием эндотоксина и плазмало-гена, итого - 60 показателей.
Определение референтных значений показателей микроорганизмов в предстательной железе, исследуемых методом хромато-масс-спектрометрии проводили в три этапа.
На первом этапе исследования было проведено сравнение численности микроорганизмов в норме и в случае патологии при помощи специальных статистических критериев. При проведении статистического исследования у пациентов с ХП оценивалась диагностическая значимость каждого микроба с помощью метода МСММ. Сравнение проводилось по группам здоровых и пациентов с признаками ХП. Распределения показателей отличались от нормального, в связи с этим был использован U-критерий Манна-Уитни (сравнивались медианы выборок, нижний и верхний квартиль) с уровнем значимости 0,05. Для статистической обработки данных и работы с графикой использовалась среда R. Для построения диаграмм размахов использовалась функция boxplot в пакете ggplot2; для построения графиков - функция ggplot.
Разделение обследуемых пациентов на больных и здоровых было известно до проведения статистического исследования, однако применением стандартных статистических критериев, предназначенных для проверки различий между двумя выборками, не удалось однозначно сгруппировать данные пациентов по «норме» и «патологии». Это связано как с ожидаемыми трудностями (отсутствие возможности прямых параллельных сопоставлений полученных результатов с измерениями традиционными методами в связи с ограничениями последних; невозможность набора группы людей с достоверно нормальной микрофлорой), так и с особенностями данных, полученных в ходе эксперимента (были выявлены существенные отклонения в концентрации некоторых маркеров у практически здоровых людей, без патологии в анамнезе).
В связи с этим, на втором этапе нами были проанализированы структуры распределения численности микроорганизмов при разделении обследуемых пациентов на больных и здоровых, без патологии в анамнезе, и сделаны предположения об их структурных особенностях.
Рассмотрим распределение численности микроорганизмов, определяемых методом МСММ на примере трех из 57 микроорганизмов в МСММ исследовании (Фиг. 1-3). Все рассматриваемые распределения для 57 регистрируемых микробов имеют правостороннюю скошенность аналогично приведенным выше гистограммам: левая граница допустимых значений ограничена нулем (пределом обнаружения), медианы распределений находятся близко к нулевому краю, правая граница имеет форму длинного «хвоста», который образован одиночными, часто довольно далеко отстоящими друг от друга значениями; присутствует существенная неравномерность распределения значений по диапазону - 50% распределения (находящиеся между 25 и 75 перцентилями) приходятся на весьма узкую область. Также, на графике представлена кривая нормального распределения, которая наглядно показывает, что построенные распределения отличаются от нормального и требуют применения непараметрических методов статистического анализа.
На третьем этапе при анализе непараметрическими методами было продемонстрировано, что все гистограммы частотного распределения микробов в правой части имеют высокий столб в нуле (на который в отдельных случаях может приходиться до 80% наблюдений) и ненулевые значения. Характер правой части распределения зависит от абсолютного количества ненулевых значений в выборке. С учетом построенных диаграмм были сформированы описательные статистики для здоровых лиц без жалоб и пациентов с хроническим простатитом (медианы, 5-25-75-95 процентили), при отсутствии нормальности распределения использовали непараметрические методы исследования. По различию в частоте появления ненулевых значений тех или иных маркеров судили об относительной распространенности того или иного микроба у пациентов в секрете простаты.
На Фиг. 4-5 представлены диаграммы типа «ящик с усами» для всех микробов по группам: кокки и бациллы, анаэробы (аналогичным образом строили диаграммы для актинобактерий, энтеробактерий, грамотрицательных палочек, грибов и дрожжей, вирусов и хламидий).
Границами «ящика» служат первый и третий квартили (25-й и 75-й процентили соответственно), линия в середине ящика - медиана (50-й процентиль). «Усы» соответствуют значению квартиля ±1,5 межквартильных расстояния, кружками обозначены выпадающие значения (превышающие полтора межквартальных расстояния). Концы усов - края статистически значимой выборки (без выбросов); граница нижнего «уса» отражает минимальное значение выборки, граница верхнего «уса» отражает ее максимальное значение. На Фиг. 4-5 представлены также умеренные и экстремальные выбросы, которые имеют огромное значение для врача, так как отражают весь возможный диапазон значений количества микроба в СП, что влияет на выбор тактики лечения.
С учетом проведенного анализа выявлено увеличено суммарного содержания микроорганизмов у 31% лиц с ХП. Эти данные указывают на необходимость проведения антибактериальной терапии: местной или системной (в зависимости от вида микроорганизмов, степени увеличения их содержания, наличия признаков общей интоксикации).
На Фиг. 6 отмечены фактические данные суммарного содержания микробов в норме и при ХП. По рисунку видно, что больше трети значений (синяя линия) отличаются от нормы в сторону увеличения (красная линия) показателя суммы. Это объясняется тем, что у пациентов с ХП увеличены значения нескольких групп микробов, из которых складывается суммарная величина микробов.
С учетом построенных диаграмм рассчитали описательные статистики для здоровых и пациентов с хроническим абактериальным простатитом (медианы, 5-25-75-95 процентили), приведенные в таблицах 1 и 2.
В клинической практике результат анализа МСММ секрета простаты пациента, обратившегося с жалобами, сопоставляется с вычисленными нормами, зарегистрированные значения, превышающие референтные, автомататически выделяются цветом в отчете и отражаются в диаграмме для удобства работы врача.
Таким образом, с учетом построенных диаграмм и таблицы с описательными статистиками были определены референтные значения микробиоты секрета предстательной железы. Данные результаты имеют существенную клиническую значимость, так как облегчают врачу задачу постановки диагноза, правильного наблюдения за пациентом, выработки тактики лечения, подбора этиотропных препаратов. Также полученные нормы позволяют врачу на первоначальном этапе оценить степень тяжести заболевания и выработать прогноз течения болезни.
Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1.
Обследуемый К-ов, 32 года, обратился в рамках планового осмотра. Жалоб не предъявляет. Было проведено исследование секрета простаты. Посев на микрофлору и чувствительность к антибиотикам - рост не выявлен (Фиг. 7). Андрофлор - нормоценоз (Фиг. 8).
С целью верификации полученного результат была выполнена микроскопия секрета простаты. Лейкоциты - не обнаружено. Эритроцитов нет. Эпителий (клетки) - не превышают двух. Бактерии и клетки больших размеров отсутствуют. Воспаление отсутствует.
В анализе МСММ - суммарное содержание микробиоты - 773, плазмологен - 1.01; эндотоксин - 0,00 (Фиг. 9), т.е. значения микробов по методике МСММ у пациента не выходят за рамки норм (см. Таблицу 1 и 2). Пациенту рекомендовано динамическое наблюдение.
Пример 2. Обследуемый Г-ев, 32 года, обратился для планового обследования. Жалоб не предъявляет. Было проведено исследование секрета простаты с помощью посева на флору, Андрофлор и методом МСММ по заявляемому способу. В посеве секрета простаты роста флоры не выявлено (Фиг. 10). В исследование Андрофлор - нормоценоз (Фиг. 11) Отклонений от норм не обнаружено.
В анализе МСММ - суммарное содержание микробиоты - 651, плазмологен - 2; эндотоксин -0,21 (Фиг. 12), т.е. значения микробов по методике МСММ у пациента не выходят за рамки норм (см. Таблицу 1 и 2). Рекомендовано динамическое наблюдение.
Пример 3. Пациент Ш-ев, 27 лет. Диагноз: хронический абактериальный простатит. Поступил с жалобами: периодические ноющие боли в промежности, учащенное мочеиспускание, снижение либидо, эректильную дисфункцию. С целью верификации полученного результат была выполнена микроскопия секрета простаты: в секрете простаты обнаружены повышенные лейкоциты 12-15. Бактериологический посев не выявил роста микрофлоры при наличии повышенного содержания лейкоцитов в микроскопическом исследовании секрета предстательной железы. Андрофлор - нормоценоз. Проведено исследование МСММ по заявляемому способу (см. результат исследования). В анализе методом МСММ выявлено: суммарное содержание микробиоты увеличено до 11920 - повышение уровня почти в 2 раза по сравнению с нормой; плазмологен увеличен в 7,5 раз; кокки и бациллы -увеличение в 4 раза, анаэробы: - увеличение в 3 раза, актинобактерии - увеличение в 1,5 раз (Фиг. 13) т.е. значения многих микробов по методике МСММ у пациента выходят за рамки норм (см. Таблицу 1 и 2).
По результатам обследования были назначены этиотропные препараты. Контроль за ходом лечения осуществлялся проведением повторных анализов.
В ходе разработки данной методики, нами проведено исследование секрета простаты методом МСММ у 169 мужчин, возраст от 20 до 49 лет, средний возраст 32,75 года. Из них отобрано 30 мужчин без жалоб, условно здоровых, у которых было выполнено исследование секрета простаты: микроскопия секрета простаты (лейкоцитов не обнаружено - воспаление отсутствует). А также, посев на микрофлору и чувствительность к антибиотикам - рост не выявлен. По данным Андрофлор у части пациентов- нормоценоз.
Преимущества заявляемого способа определения референтных значений показателей микроорганизмов в предстательной железе, исследуемых методом хромато-масс-спектрометрии от известных состоят в следующем.
Предлагаемый способ определения референтных значений показателей микроорганизмов в предстательной железе позволяет провести высокоточную диагностику хронического простатита, путем сопоставления с разработанными нормами содержания микробиоты в секрете простаты.
Выявление у здоровых мужчин без жалоб фоновых микроорганизмов позволили определить достоверные диагностические критерии, позволяющие отличить микрофлору здоровой простаты от патологии. Таким образом, врач получает инструмент для оценки тяжести простатита у пациентов и для определения адекватной тактики лечения.
Способ может применяться как для диагностики, так и для контроля лечения. Способ доступен в применении и может быть рекомендован к широкому использованию в условиях любой клинической лаборатории.