Способ очистки почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов
METHOD OF SOIL AND WATER PROTECTION FROM OIL

Способ очистки почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов
Изобретение относится к области экологии и охраны окружающей среды, а именно способам очистки почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов.
Известны штаммы микроорганизмов, используемые для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов: Pseudomonas putida 36 (см. SU № 1076446, МПК C02F3/34, B09C1/10, C12N1/20 C02F3/34, C02F101:32, C12N1/20, C12R1:40, опубл. 28.02.1984), Acinetronacter sp. HB-1 (см. RU № 2077579, МПК C12N1/20, C02F3/34, B09C1/10, C12R1:01, C12N1/20, B09C101:00, опубл. 20.04.1997), Pseudomonas alcaligenes E7 (см. RU № 2134723, МПК C12N1/20, C02F3/34, B09C1/10, C12N1/20, C12R1:38, опубл. 20.08.1999).
Недостатком известных штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.
Большую эффективность в условиях низких положительных температур показал штамм Rhodococcus erythroplis E-15 (см. RU № 2019527, МПК C02F3/34, E02B15/04, C09K17/00, опубл. 15.09.1994), но процесс биодеградация нефти протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры.
2
Известен консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов в составе Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ky-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 масс.% каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м(см. RU №2191643, МПК B09C1/10, C12N1/20, C12N1/20, C12R1:01, опубл. 27.10.2002).
Недостатком известного решения является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне +18…+22ºС, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, не способны к деградации нефтепродуктов при пониженных положительных температурах (+5ºС).
В качестве прототипа служит штамм бактерий «Bacillus subtilis Колыма 7/2» (см. RU №2446900, МПК B09C1/10, опубл. 10.04.2012), обладающий способностью снижать концентрацию нефти до 0,48%, то есть уровень нефти от 135143 мг/кг снижается до 645 мг/кг в течение 3 месяцев летнего периода. Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и только в почве и не способен утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), в том числе в водной среде в условиях широкого диапазона температур от +5 до +37°С.
Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, выражается в расширении номенклатуры эффективных способов очистки объектов окружающей среды (в частности, почвы и водной среды) от нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат) в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +5 до +37°С.
9
3
Для решения поставленной задачи способ очистки почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов отличается тем, что для очистки водной среды от нефти и нефтепродуктов применяется бактериальный препарат, состоящий из клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 в концентрации 1·10клеток/смсуспензии.
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».
Признаки отличительной части формулы изобретения обеспечивают решение поставленных функциональных задач.
Предлагаемый штамм бактерий Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 выделен 16 февраля 2015 года из мерзлых почвенных образцов, загрязненных соляркой, отобранных возле емкостей Момского РЭС ОАО «Сахаэнерго», Северо-Восток Якутии, Момский район, село Хонуу.
Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП «ГосНИИгенетика», 117545, Москва, 1-й Дорожный пр-д, 1, номер регистрации ВКПМ В-12247.
Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Stenotrophomonas.
При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:
Результаты обработки секвенсов, представляются в графическом виде.
По данным анализа RDP II 16S рРНК было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 (см. чертеж).
Критерием отнесения микроорганизма к тому или иному виду считается гомология не менее 97%.
По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм отнесен к видy Stenotrophomonas maltophilia (100%).
Полученный штамм характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки
Грамотрицательные палочки, в мазках расположены одиночно или беспорядочными скоплениями. Спор и капсул не образует.
Культуральные признаки
На мясопептонном агаре (МПА) (масс.%): ферментативный пептон – 1,0; натрий хлористый – 0,5; агар – 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2, формирует полупрозрачные желтоватые  колонии с ровным краем диаметром 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются. Старые культуры могут  образовывать  коричневатый  или сероватый пигмент.
На питательном агаре на основе гидролизата рыбной муки (масс.%): гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; рН 7,1 - 7,5,  формирует полупрозрачные желтоватые  колонии с ровным краем диаметром 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются. Старые культуры могут образовывать коричневатый или сероватый пигмент.
На среде Сабуро (масс.%): гидролизат рыбной муки – 1,0; панкреатический гидролизат казеина – 1,0; дрожжевой экстракт – 0,2; натрия фосфат однозамещенный – 0,2; D-глюкоза – 4,0; агар – 1,0; вода дистиллированная – остальное; рН 6,0±3, формирует желтоватые колонии, в старых культурах может образовывать коричневатый или серый пигмент, диаметр колоний 1-3 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.
В мясопептонном бульоне (масс.%): ферментативный пептон – 1,0, натрий хлористый – 0,5, вода мясная – остальное; рН 7,0-7,2, образует муть.
3
4
2
2
4
2
4
На минеральной среде Мюнца (см. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки. - Микробиология, 1963, №5. С.1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, бензин) следующего состава (масс.%): KNO– 0,4; MgSO·7HO– 0,08; NaCl – 0,1; KHPO–0,14; KHPO–0,06; агар-2,0; нефть или нефтепродукты – 1,0; вода дистиллированная – остальное, рН – 7,2, растет в виде полупрозрачных серовато-желтых  мелких колоний диаметром 1 мм.
Физиолого-биохимические признаки
Штамм аэроб, растёт при температуре от +5 до +37°С, более интенсивно растет + 10+30°С. Растёт при рН 5,0 – 8,5. Оптимум рН 6,5 – 8,0. Растёт в солевом бульоне с добавлением 0,1 - 2,0% NaCl.
Используемые источники углерода: сорбит, маннит.
Проверенные неиспользуемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия. Штамм индол-отрицателен. Реакция Фогес - Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Не ферментирует бета-галактозидазу. Не утилизирует инозит. Продукт, синтезируемый штаммом: поверхностно-активные вещества, способные деструктировать нефть. Использует в качестве источника энергии углеводороды нефти и нефтепродуктов.
Штамм не токсичен по отношению к высшим растениям (биотестирование проведено на семенах овса обыкновенного сорт «Скакун»).
Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном мясопептонном агаре или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°С.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. Выделение и культивирование штамма Stenotrophomonas  maltophilia СНБС-3
Штамм бактерий Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 выделен из мерзлых почвенных образцов, загрязненных соляркой, методом накопительных культур на среде Мюнца с нефтью с последующим пересевом на МПА.
3
4
2
2
4
2
4
3
Для этого 1,0 г мерзлого грунта с вышеуказанного объекта вносили в 250 мл минеральной среды Мюнца следующего состава: (масс.%) KNO– 0,4; MgSO·7HO– 0,08; NaCl – 0,1; KHPO– 0,14; KHPO– 0,06; вода дистиллированная – остальное, рН – 7,2, В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дмсреды. На первом этапе инкубация проводилась в качалочных условиях при 200 об/мин и температуре +20±1°С. Рост бактерий наблюдали уже через 3 дня инкубации по образованию мутной эмульсии и дезинтеграции слоя нефти.
Чистая культура бактерий Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 была получена путем культивирования при выше перечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с МПА.
Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах от +5 до +37°С. Через 72 ч на поверхности МПА наблюдали появление полупрозрачных колоний желтовато-серого цвета, диаметром до 5 мм, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и ключевых фенотипических признаков согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (см. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact.; July 1985, p. 408) идентифицированы, как штамм Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3.
Пример 2. Приготовление бактериального препарата на основе клеток штамма Stenotrophomonas  maltophilia  СНБС-3.
9
3
Изолированные колонии, полученные по примеру 1, пересевали на скошенный МПА и инкубировали 48 часов при температуре +20±1°С. Выросшие на МПА культуры Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 смывали 0,9% раствором NaCl; готовили исходную микробную суспензию бактериального изолята с титром 1·10 микробных клеток/смпо оптическому стандарту ГИСК им. А.М. Тарасевича.
9
3
Для получения препарата готовили жидкую минеральную среду по примеру 1 и культивировали в колбах в качалочных условиях в течение 48 часов, при температуре 20±1°С, при 200 об/мин. Полученную жидкую смесь клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 с титром 1·10 клеток/см использовали в качестве препарата для обработки почвы и воды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.
Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3
3
9
3
Клетки штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 смывают 0,9% раствором NaCl со скошенного мясопептонного агара. Готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см, с концентрацией 1·10 микробных клеток/смпо оптическому стандарту ГИСК им. А.М. Тарасевича.
Полученный бактериальный изолят штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 культивируют в водной среде с минеральным составом по примеру 1.
3
3
9
3
В колбочки объемом 250,0 смвносят по 100,0 см готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1·10 клеток/ см. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторениях. Колбы культивируют при разных температурах (от +5°C до +37°С) в течение 3-5 суток.
Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-025» (см. ФР.1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117 Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025»).
Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами, в условиях постоянной аэрации, предлагаемый штамм уже через  3-е суток при температуре +5°C утилизирует 4,4 – 5,5% - нефти и нефтепродуктов; при температуре +20°C – 56,4 – 59,8%; при температуре +30°C – 62,0 – 63,4%; при температуре +37°C – 67,0 – 69,6%; в зависимости от типа ксенобиотика (см. таблицу 1).
Пример 4. Очистка водопроводной воды от нефти с помощью клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3
3
3
3
9
3
3
В эксикатор объемом 5,0 дмвносят 3,0 дмводопроводной воды, отстоявшейся в течение суток при комнатной температуре. В воду добавляют 30000 мг сырой неочищенной нефти и 30,0 смбактериального изолята штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 (по примеру 2), содержащего 1,0·10 клеток/см суспензии. В качестве контроля используют воду в количестве 3,0 дмс добавлением 30000 мг нефти и без внесения микробной суспензии бактериального изолята.
Эксперимент проводят в течение 45 суток при температуре +20±1°С.
Полученные результаты (см. таблицу 2) показали, что в воде деструкция нефти под влиянием штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 за 45 суток составила 53,0%. Деструкция в контрольной ёмкости существенно не изменилась.
Пример 5. Очистка почвы от нефтезагрязнений с помощью клеток штамма Stenotrophomonas  maltophilia СНБС-3
Опыты с применением клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов  проведены на супесчаной почве в условиях модельного опыта, искусственно загрязненной нефтью и соляркой. Исходное содержание нефтепродуктов (НП) в почве до обработки почв клетками штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 составило 3000 мг/кг, что соответствовало среднему уровню загрязнения в соответствии с нормативными документами (см. Письмо Минприроды России от 27.12.1993 г. № 04-25/61-5678 «О порядке определения размеров ущерба от загрязнения земель химическими веществами»; Методические рекомендации по выявлению деградированных и загрязненных земель. Комитет РФ по земельным ресурсам от 27 марта 1995 г. № 3-15/582, 29 с.).
Эффективность применения штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 оценивали по степени деградации нефтезагрязнения в почвенных образцах, отобранных для анализа до и после внесения микробной суспензии на основе клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3.
Оценку остаточного содержания нефти в почве до и после проведения опыта проводили гравиметрическим методом согласно инструкции, общепринятым документам (см. РД 39-0177098-015-90 «Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтепрома»).
Для этого образцы почвы до и после обработки биопрепаратом подвергались экстракции в аппарате Сокслета четыреххлористым углеродом, после чего экстрагент удаляли перегонкой с дефлегматором, доводя остаток до постоянного веса. Определение влажности образцов проводили общепринятым методом (см. ГОСТ 28268-89 «Почвы. Методы определения влажности, максимальной гигроскопической влажности»), после чего производили перерасчет содержания нефтепродуктов на сухую почву.
Опыты проводили в условиях холодильной камеры при температуре +5±1ºС; в комнатных условиях при температуре +20±1°С и в термостатированных условиях при температуре +30±1°С и температуре +37±1°С.
Установлено, что степень биодеградации нефти и нефтепродуктов в опытных образцах через 45 суток после обработки почв бактериальной суспензией на основе клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 составила при температуре +5±1°С – 6,6-7,3%; при температуре +20±1°С – 54,8-58,0%; при температуре +30±1°С – 60,0-66,6%; при температуре +37±1°С – 60,6-63,3% в зависимости от типа ксенобиотика (см. таблицу 3).
9
3
Таким образом, показана эффективность способа очистки почвы и водной среды от нефти и нефтепродуктов (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), бактериальным препаратом, состоящим из клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 в концентрации 1·10клеток/смсуспензии, в относительно короткие сроки (от 3 до 45 суток), в широком диапазоне температур от +5 до +37°С.
Таблица 1
Степень утилизации нефтепродуктов штаммом Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3 в водной среде с минеральными компонентами
Вариант опыта
Отбор контрольных проб
Содержание нефтепродуктов, мг/дм<sup>3</sup>
t°С
+5
+20
+30
+37
Вода+минеральные компоненты+штамм+нефть
до опыта
1000,0
1000,0
1000,0
1000,0
после опыта
956,0
404,0
380,0
304,0
% деструкции
4,4
59,6
62,0
69,6
Вода+минеральные компоненты+штамм+дизельное топливо
до опыта
1000,0
1000,0
1000,0
1000,0
после опыта
950,0
436,0
366,0
330,0
% деструкции
5,0
56,4
63,4
67,0
Вода+минеральные компоненты+штамм+масло моторное
до опыта
1000,0
1000,0
1000,0
1000,0
после опыта
948,0
402,0
380,0
322,0
% деструкции
5,2
59,8
62,0
67,8
Вода+минеральные компоненты+штамм+масло гидравлическое
до опыта
1000,0
1000,0
1000,0
1000,0
после опыта
954,0
402,0
380,0
312,0
% деструкции
4,6
59,8
62,0
68,8
Вода+минеральные компоненты+штамм+газовый конденсат
до опыта
1000,0
1000,0
1000,0
1000,0
после опыта
945,0
404,0
376,0
320,0
% деструкции
5,5
59,6
62,4
68,0
Таблица 2
Деструкция нефти в воде штаммом Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3
Содержание нефтепродуктов, мг/дм<sup>3</sup>
Степень утилизации нефти, %
Вариант опыта
до опыта
после опыта
Вода+нефть+ штамм
30 000,0
15 900,0
53,0
Контроль: Вода+нефть
30 000,0
29 300,0
2,3
Таблица 3
Деструкция нефти и нефтепродуктов в почве под влиянием клеток штамма Stenotrophomonas maltophilia СНБС-3
Схема опыта
Содержание нефти, мг/кг
Деградация нефти,%
до очистки
после очистки
Опыт при температуре +5±1ºС
Контроль (почва + нефть)
3000,0
2940,0
2,0
Почва + нефть + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas  maltophilia  СНБС-3
3000,0
2800,0
6,6
Контроль (почва + солярка)
3000,0
2900,0
3,3
Почва + солярка + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas  maltophilia  СНБС-3
3000,0
2780,0
7,3
Опыт при температуре +20±1ºС
Контроль (почва + нефть)
3000,0
2820,0
6,0
Почва + нефть + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas  maltophilia  СНБС-3
3000,0
1356,0
54,8
Контроль (почва + солярка)
3000,0
2800,0
6,6
Почва + солярка + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas  maltophilia  СНБС-3
3000,0
1260,0
58,0
Опыт при температуре +30±1ºС
Контроль (почва + нефть)
3000,0
2794,0
6,8
Почва + нефть + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas  maltophilia  СНБС-3
3000,0
1200,0
60,0
Контроль (почва + солярка)
3000,0
2750,0
8,3
Почва + солярка + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas  maltophilia  СНБС-3
3000,0
1000
66,6
Опыт при температуре +37±1ºС
Контроль (почва + нефть)
3000,0
2760,0
8,0
Почва + нефть + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas  maltophilia  СНБС-3
3000,0
1180,0
60,6
Контроль (почва + солярка)
3000,0
2700,0
10,0
Почва + солярка + суспензия клеток штамма Stenotrophomonas  maltophilia  СНБС-3
3000,0
1100,00
63,3