Некоторые особенности воздействия кластерного  серебра на дрожжевые клетки Candida utilis

Некоторые особенности воздействия кластерного серебра на

дрожжевые клетки Candida utilis

Ревина А.А. (1), Баранова Е.К. (1) (arev@elchem.ac.ru), Мулюкин А.Л. (2) ,

Сорокин В.В.

(1) Институт электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, Москва, 119071, Ленинский пр., 31 (2) Институт микробиологии РАН, Москва, 117812, пр. 60 лет Октября, 7-а

В настоящее время уделяется большое внимание к изучению взаимодействия микроорганизмов с ионами металлов, что связано с их ключевой ролью в различных биотехнологических и многих природных процессах. Одним их таких металлов является серебро. Высокая токсичность по отношению к большинству микроорганизмов объясняет использование серебра в качестве эффективного биоцида [1-3]. Однако, большинство работ по взаимодействию серебра с клетками посвящено его действию в ионной форме.

Известно, что клетки некоторых микроорганизмов способны концентрировать ионы металлов из растворов. Созданы биосорбенты и разработаны технологические схемы удаления металлов из жидких сред пищевой промышленности и сточных вод. Особый интерес представляет извлечение благородных металлов из растворов с помощью микроорганизмов. Показано, что серебро хорошо сорбируется широким кругом микроорганизмов: водорослями, грибами и бактериями [4,5].

Одной из важных технологических проблем является очистка сточных вод пищевых производств, содержащих отработанные дрожжевые клетки [6]. Использованные фильтры быстро выходят из строя и требуют регенерации. Модифицирование фильтровальных элементов солями или комплексами ионов Ag+ ограничено десорбцией этих ионов и снижением биоцидной активности адсорбентов. В последнее время на базе использования достижений современной нанотехнологии разрабатываются эффективные фильтровальные элементы, содержащие наноструктурные агрегаты серебра, имеющие высокие бактерицидные и каталитические свойства [7-9]. На основании наночастиц серебра разработано новое поколение биологически активных алкидных и водоэмульсионных красок [10].

Для использования современных достижений нанотехнологий в медицине, биотехнологии, пищевой промышленности необходимо обратить особое внимание на исследования биологического действия наночастиц серебра на дрожжевые клетки. Взаимодействие ионов и стабильных наноразмерных кластеров серебра, синтезированных радиационно-химическим методом в обратных мицеллах, исследовано в широком диапазоне концентраций с дрожжевыми клетками Candida utilis и Saccharomyces Cerevisiae в водных и водно-органических растворах [4,11]. Было установлено, что биоцидный эффект кластеров Ag превосходит действие ионов серебра. Показано, что ионы Ag не влияют на рост дрожжевых клеток, в то время как наночастицы угнетают процесс ферментации.

Перспектива использования наночастиц серебра в биотехнологии и пищевой промышленности обусловлена не только их биоцидным эффектом, но и тем, что в отличие от ионов серебра, они могут прочно удерживаться на поверхности фильтров. В частности, применение наночастиц серебра может быть целесообразным для предотвращения развития микроорганизмов на фильтрах, используемых для отделения продуктов бродильных производств от микробной биомассы. Для оценки возможности использования наночастиц серебра в пищевой промышленности необходимо установить характер действия разных концентраций серебра, как в ионной форме, так и в виде

наночастиц по отношению к дрожжевым клеткам, широко используемых в различных биотехнологических производствах. В работе [12,13] показано, что токсический концентрационно-зависимый эффект ионов в отношении бактерий и дрожжей, обусловлен связыванием Ag+ с белками и липидами клеточных мембран и, вследствие этого, изменением трансмембранного потенциала, вплоть до пробоя мембран и гибели клетки. Механизм действия наночастиц серебра на живые клетки остается невыясненным. За исключением предварительных данных скрининговых исследований, показавших ингибиторное влияние наночастиц серебра на развитие ряда микроорганизмов [3,9].

Для установления механизма специфического действия наночастиц серебра на дрожжевые клетки также требуются дополнительные исследования с использованием современных экспериментальных методов. В настоящей работе изучено действие ионного и кластерного серебра на клетки дрожжей Candida utilis с помощью спектрофотометрии, электронной микроскопии и рентгеновского микроанализа.

Объекты и методы исследования.

Микроорганизмы и условия культивирования.

Основным объектом исследования был штамм дрожжей Candida utilis . Культуру дрожжей выращивали на питательной синтетической среде следующего состава (г/л): сахароза-0,5; ( NH 4 ) 2 SO 4 -1,0; К 2 НРО 4 -0,5; MgSO 4 *7Н 2 О-0,1; микроэлементы (мг/л): FeSO4 7H2O- 20; MnCh^O - 20; ZnSO4 7H2O - 0,4; В(ОН)з - 0,5; CuSO4^O - 0,05; Na2MoO42H2O - 0,2; дистиллированная вода -1,0 л; рН среды-6,0. Раствор микроэлементов стерилизовали отдельно при 0,5 атм (30 мин) и добавляли стерильно в среду. Культуру дрожжей выращивали в колбах объемом 250 мл (50 мл среды) или стерильных пробирках на 20 мл с 2 мл среды при 28 °С с использованием качалки (140160 об/мин). В качестве инокулята использовали суточную культуру дрожжей, вносимую в количествах, соответствующих начальной оптической плотности (ОП), равной 0,2.

Микробиологические методы.

Микроскопические наблюдения проводили с помощью микроскопа Reichard (Австрия) с фазово-контрастным устройством. Оптическую плотность (ОП) суспензий дрожжевых культур измеряли при Х=660 нм нефелометрически на спектрофотометре Specord М-40 (Carl Zeiss , Jena , Германия), l =10 мм. Динамику роста дрожжевых культур оценивали по данным нефелометрических измерений оптической плотности клеточных суспензий.

Электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ.

Электронно-микроскопические исследования проводили на электронном микроскопе JEOL JEM-100CXII со сканирующей приставкой EM-ASID4D и рентгеновским микроанализатором Link 860 с детектором Е5423. Ускоряющее напряжение 60 keV. При этом препараты готовили следующим образом: клетки микроорганизмов отделяли от культуральной среды центрифугированием и трижды промывали деионизированной водой, затем суспензии клеток наносили на медные сетки с форваровой пленкой-подложкой.

Синтез наночастиц серебра.

Наночастицы серебра ( НЧ Ag) получали методом радиационно-химического синтеза [7] при восстановлении ионов серебра сольватированными электронами в обратно-мицеллярных растворах, содержащих 8 мМ Ag+ (в виде AgClO 4), 0,15 М бис-2 (этилгексил) сульфосукцината натрия (поверхностно-активное соединение АОТ и изооктан. При радиационно-химическом синтезе НЧ Ag растворы подвергали гамма-

облучению в дозах от 0,2 до 2,5 Мрад на установке ГУРХ 100000 (ИЭЛ РАН) с использованием Со-60 как источника излучения. Спектры оптического поглощения мицеллярных растворов кластеров серебра, помещенных в кварцевые кюветы шириной l =10 мм, регистрировали на спектрофотометре Specord М-40 (Jena, Carl Zeiss, Германия) с использованием в качестве контроля необлученных растворов [3]. О стабильности НЧ Ag при хранении в течение 4 мес. судили по форме спектра и наличию характерного пика поглощения при Хтах = 400-420 нм [3]. Металлические агрегаты представляют собой коллоидные наноразмерные частицы металлов (d-2-Юнм) и обладают особыми свойствами; каталитическими, бактерицидными, магнитными, отличными как от свойств изолированных атомов, так и от массивного металла [14].

Результаты и обсуждение.

В первой серии экспериментов об образовании НЧ Ag при облучении водно-органических мицеллярных растворов ионов серебра, судили по результатам спектрофотометрических анализов. Как показано, в настоящих экспериментах и ранее в работе [14], 55% образовавшихся НЧ характеризовались размерами порядка 2-3 нм. Спектры оптического поглощения раствора НЧ Ag, полученных в мицеллярных растворах, содержащих 8 мМ ионов серебра и имеющих степень гидратации ю=[ H 2 O ]/[ AOT ] = 10, представлены на рис. 1. Для спектров растворов НЧ Ag, зарегистрированных через 40 мин после облучения, характерно появление широкой полосы поглощения с двумя максимумами при длине волны 380 нм и 513 нм. В зависимости от времени хранения образца наблюдалась изменение спектра и формирование одиночной полосы с Хтах=400-420нм (рис. 1, спектр 2), интенсивность которой возрастала в течение 2-3 недель, а затем снижалась (спектры 3 и 4). Предварительные исследования показали, что разбавление полученного раствора наночастиц не сопровождалось изменением спектральных характеристик. Стабильность полученных НЧ Ag в течение периода, превышающего время контакта с тест-объектом - дрожжевых клеток, неизбежном при подборе концентраций для реализации рост -ингибирующего эффекта, является необходимым условием для дальнейшей проверки микробоцидного и микробостатического действия растворов наночастиц.

Различия в характере действия кластерной и ионной форм серебра при концентрации Ag 8 мкМ подтверждены в экспериментах по изучению их влияния на рост дрожжевых клеток C. utilis на питательной синтетической среде определенного состава [11]. После внесения препарата НЧ Ag до указанной концентрации вместе с инокулятом рост культуры дрожжей прекращался, на что указывало отсутствие приращения ОП суспензии дрожжевых клеток (рис. 2). При действии водно-органического препарата ионного Ag+ до той же конечной концентрации (8 мкМ) наблюдался микробостатический эффект, проявлявшийся в задержке роста с последующим его возобновлением. Степень ингибирующего эффекта (торможение, полное подавление роста и гибель культуры) должна определяться числом клеток - мишеней, поэтому нами проверено исследование влияния обеих форм серебра на развивающиеся культуры C.utilis при различном содержании клеток (рис.2а) и на разных стадиях роста (рис.2б).

Рис.1-А.

Спектры оптического поглощения растворов НЧAg при исходной концентрации ионов серебра в мицеллярном растворе 8,1 мМ и степени гидратации ю=[Ы20]/[А0Т], равной10. Спектры зарегистрированы (1) через 40 минут, (2) 2 недели, (3) 4 недели, (4) 4месяца после синтеза НЧAg.

%

60 50 40 30120 10 0

950

17

I

1 г

о

т

2

М-

3 4

10£(1 [тип]

Рис.1-Б.

Гистограмма распределения по размерам НЧ серебра в интервале 3-3000 нм, через две недели после синтеза. Цифры над колонками указывают размер НЧ (нм).

.0

53

°10

н о с;

^контроль

У_

2 3

времяД

ионное серебро

кластерное

серебро

8

6

а)

контроль

¡2 7

о

о

Е 6

о

Е 5 к

2 4 о

* 3

I-

с 2

о 2

/

/

/

ионное серебро

кластерное серебро

2 время,! 3

9

8

1

0

4

5

б)

Рис. 2.

Рост культуры С.пТШз в контроле и после внесения кластерной и ионной форм серебра до конечной концентрации Ag - 8мкМ на начальной стадии роста - а) и на стадии развития клеток - (ОП исх=1,5) - б). Приведенная оптическая плотность соответствует значениям неразбавленных проб.

Как представлено на рис. 2б), развитие дрожжевых клеток подавлялось действием и ионов серебра, и препарата наночастиц на культуру в линейной фазе роста (соответственно от ОП=1,5 до 2,0). Однако при увеличении численности клеток на стадии роста биоцидный эффект ионов серебра был существенно слабее и носил скорее микробостатический характер, а в присутствии кластеров серебра рост клеток прекращался.

При исследовании непосредственного взаимодействия токсичных тяжелых металлов и клеток микроорганизмов остается неясным вопрос, в какой химической форме тот или иной металл (Ag) связывается с мишенями (белковыми и липидными компонентами биологических мембран) и проникает в клетку. Поэтому нами была исследована возможность биогенного перехода ионной формы Ag, вносимого в

суспензию дрожжевых клеток Candida utilis, в форму кластерного серебра. При просмотре под электронным микроскопом с рентгеновским микроанализатором (детектором) препаратов клеток C.utilis, приготовленных после 2-х кратной отмывки дрожжевых суспензий в деионизированной воде и прединкубирования в течение 1 ч в присутствии 45 мкМ AgNO3 при t = 200 С, обнаружено наличие наночастиц (d~ 2 нм) во внеклеточном пространстве и на поверхности клеток (рис.3а). Внесение наночастиц серебра в суспензию дрожжевых клеток, как показано на рис. 3б, приводит к разрушению поверхности мембран.

а) б)

Рис.3.

Фотография клетки Candida utilis в присутствии ионов серебра (AgNO3) - а), в присутствии НЧ Ag - б).

Таким образом, на основании анализа отечественных и зарубежных публикаций, посвященных взаимодействию ионов серебра с клетками про- и эукариотных микроорганизмов следует, что токсический эффект ионов серебра обусловлен его связыванием с мембранно-ассоциированными белками и липидной стромой мембран, вследствие чего происходит изменение трансмембранного потенциала и, в некоторых случаях, пробой клетки. Другим результатом взаимодействия ионов серебра с микроорганизмами (при концентрациях Ag+ выше 45 мкМ) является образование наночастиц серебра, как вне клеток, так и в предплазматическом пространстве (у бактерий) или на поверхности клеточной стенки (у дрожжей).

Выводы.

Полученные данные позволяют сделать вывод о различных механизмах действия серебра в ионной и кластерной формах. С практической точки зрения, кластерное серебро может быть более эффективным при использовании в качестве биоцидного агента, особенно в случаях, когда не допустимы повышенные концентрации серебра. В пищевой промышленности для очистки жидких сред, содержащих дрожжевые клетки,

могут найти широкое применение фильтровальные элементы, модифицированные наночастицами серебра.

Литература

1. Кульский Л.А. Серебряная вода, ее свойства и применение.//Киев. «Наукова думка», 1982.

2. Nies D.H.. Microbial heavy-metal resistance//Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999)51:730-750.

3. Баранова Е.К., Ревина А. А., Войно Л.И., Горбатюк В.И. Сравнение действия ионов и наночастиц серебра на клетки дрожжей и кишечной палочки (Е. соН) //Наночастицы в природе. Нанотехнологии их создания в приложении к биологическим системам. Материалы 1-го Российского научно-методологического семинара (4 июня 2003 года). Москва. 2003. С.53-60.

4. Кореневский А. А., Сорокин В.В., Каравайко Г.И. Взаимодействие ионов серебра с клетками Candida utilisV/Микробиология. Вып.6 1993. Т. 62. С.1085-1092.

5. Klaus T.,.Joerger R, Olsson E., Grangvist C-G.. Silver-based crystalline nanoparticles, microbially fabricated.// PNAS. 1999. V. 96. №24. P.13611-13614.

6. Шмаудер Х-П, Пака Я. На пути к более чистой окружающей среде - ситуация, (химические, биотехнологические, общие) технологии, тенденции. Материалы 1-го международного конгресса. «Биотехнология - состояние и перспектива развития». Москва. 2002. С. 261.

7 . Докучаев А.Г., Мясоедова Т.Г., Ревина А.А. Изучение влияния различных факторов на образование агрегатов серебра в обратных мицеллах под действием у-излучения //Химия высоких энергий. 1997. Т. 31. №5. С. 353-356.

8. Ревина А.А. Система модифицирования объектов наночастицами. Патент РФ № 2212268. Приоритет от 10.08.2001.

9. Егорова Е.М., Ревина А.А., Ростовщикова Т.Н., Киселева О.И. Бактерицидные каталитические свойства стабильных металлических наночастиц в обратных мицеллах. //Вестник МГУ. 2001. Сер.2. Химия. Т. 42. С.332-338.

10. Ревина А.А., Егорова Е.М., Кудрявцев Б.Б. Возможности применения нанотехнологий в производстве лакокрасочных материалов и покрытий. //Перспективные технологии. Химическая промышленность. 2001. №4. С.28-32.

11. Баранова Е.К., Мулюкин А. Л., Козлова А.Н., Ревина А. А., Эль-Регистан Г.И. Взаимодействие ионов и кластеров серебра в водных и водно-органических растворах с клетками Candida utilis и Saccaromyces cerevisia. (в печати).

12. Zhang S. and Crow S.A. Jr. Toxic Effects of Ag(I) and Hg(II) on Candida albicans and C. maltosa: a Flow Cytometric Evaluation. Applied and Environmental Microbiology. 2001, Vol. 67, No. 9. Р. 4030-4035.

13. Dibrov, P., Dzioba, J., Gosink, K.K., and Hase, C.C. Chemiosmotic Mechanism of Antimicrobial Activity of Ag+ in Vibrio cholerae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, Vol. 46, No. 8. Р. 2668-2670.

14. Egorova E.M, , Revina A.A. Synthesis of metallic nanoparticles in reverse micelles in the presence of quercetin.// Colloids and Surfaces. A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2000. Vol. 168. Р. 87-96.