СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ АНТИСМЫСЛОВОЙ ВИРУСНОЙ РНК В КЛЕТКАХ СОБАКИ

1. Выделенная нуклеиновая кислота, включающая регуляторную последовательность РНК-полимеразы I собаки.
2. Нуклеиновая кислота по п.1, в которой регуляторная последовательность является промотором.
3. Нуклеиновая кислота по п.1, в которой регуляторная последовательность РНК-полимеразы I представляет собой нуклеотиды 1-469 последовательности SEQ ID NO:26, комплементарной ей последовательности, обратной комплементарной ей последовательности или ее функционально активного фрагмента.
4. Нуклеиновая кислота по п.1, 2 или 3, в которой регуляторная последовательность функционально связана с кДНК, кодирующей вирусную геномную РНК с минус-нитью или соответствующей кРНК.
5. Нуклеиновая кислота по п.4, которая дополнительно включает последовательность терминации транскрипции.
6. Нуклеиновая кислота по п.5, в которой вирусная геномная РНК с минус-нитью является геномной РНК вируса гриппа.
7. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по п.6.
8. Способ получения геномной РНК вируса гриппа, включающий транскрибирование нуклеиновой кислоты по п.6 в клетке, в результате которого вырабатывается геномная РНК вируса гриппа.
9. Способ получения рекомбинантного вируса гриппа, включающий культивирование клеток собаки, включающих вектор экспрессии по п.7 и один или несколько векторов экспрессии, экспрессирующих иРНК, кодирующую один или несколько полипептидов вируса гриппа, выбранных из группы, включающей полипептиды: РВ2, РВ1, PA, НА, NP, NA, M1, M2, NS1 и NS2, и выделение рекомбинантного вируса гриппа.
10. Способ получения рекомбинантного вируса гриппа, включающий интродукцию в популяцию клеток собаки векторов экспрессии, способных экспрессировать в указанных клетках сегменты геномной вРНК для получения сегментов полной геномной вРНК указанного вируса, в котором указанные вирусы экспрессии включают нуклеотиды 1-469 последовательности SEQ ID NO:26 или ее функционально активного фрагмента, и (б) интродукцию в указанные клетки векторов экспрессии, способных к экспрессии иРНК, кодирующей один или несколько полипептидов указанного вируса, и (в) культивирование указанных клеток, в результате которого образуются вирусные частицы.
4
11. Способ по п.10, в котором титр частиц вируса гриппа, получаемых при культивировании указанных клеток в течение 48-72 ч, составляет по меньшей мере 1,0·10 бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл.
5
12. Способ по п.10, в котором титр частиц вируса гриппа, получаемых при культивировании указанных клеток в течение 48-72 ч, составляет по меньшей мере 1,0·10 БОЕ/мл.
13. Способ по п.9, в котором полученные частицы вируса гриппа являются инфицирующими.
14. Способ по п.10, в котором получаемые частицы вируса гриппа являются инфицирующими.
15. Клетка, включающая вектор экспрессии по п.7.
16. Клетка по п.15, являющаяся клеткой собаки.
17. Клетки собаки по п.16, которые являются клетками почки.
18. Клетки почки собаки по п.17, которые относится к клеточной линии MDCK.
19. Способ получения в культивируемых клетках собаки рекомбинантного сегментированного вируса с минус-нитью РНК, содержащего более 3 геномных сегментов вРНК, включающий: (а) интродукцию в популяцию клеток собаки первого набора векторов экспрессии, способных экспрессировать в указанных клетках сегменты геномной вРНК для обеспечения сегментов полной геномной вРНК указанного вируса, (б) интродукцию в указанные клетки второго набора векторов экспрессии, способных к экспрессии иРНК, кодирующей один или несколько полипептидов указанного вируса, и (в) культивирование указанных клеток, в результате которого образуются вирусные частицы.
20. Способ получения рекомбинантного вируса гриппа, включающий
i) интродукцию в популяцию клеток собаки векторов экспрессии,
а) способных к экспрессии в указанных клетках сегментов геномной вРНК для обеспечения сегментов полной геномной вРНК указанного вируса, причем один или несколько из указанных векторов экспрессии включает нуклеотиды 1-469 последовательности SEQ ID NO:26 или ее функционально активного фрагмента, и
б) также способных к экспрессии в указанных клетках иРНК, кодирующей один или несколько полипептидов вируса гриппа, выбранных из группы, состоящей из полипептидов: РВ2, РВ1, РА, НА, NP, NA, Ml, M2, NS1 и NS2, и
ii) культивирование указанных клеток и в результате получение частиц вируса гриппа.
4
21. Способ по п.19 или 20, в котором титр частиц вируса гриппа, образуемых при культивировании указанных клеток в течение 48-72 ч, составляет по меньшей мере 1,0·10 БОЕ/мл.
5
22. Способ по п.19 или 20, в котором титр частиц вируса гриппа, образуемых при культивировании указанных клеток в течение 48-72 ч, составляет по меньшей мере 1,0·10 БОЕ/мл.
23. Вирусы гриппа, получаемые способом по п.20.
24. Способ по пп.10, 19, 20, в котором применяют вирус-помощник.
25. Вектор экспрессии pAD4000, представленный выше в виде последовательности SEQ ID NO:29.
26. Выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, включающая по меньшей мере 250, или по меньшей мере 350, или по меньшей мере 450 соприкасающихся нуклеотидов последовательности, представленный выше в виде последовательности SEQ ID NO:26, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты будучи функционально связанной с кДНК, которая кодирует вРНК вируса гриппа, и будучи интродуцированной в клетки MDCK способна направлять экспрессию указанной вРНК вируса гриппа.
27. Выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, включающая полинуклеотид, который по меньшей мере на 80% идентичен указанной выше нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:26, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты будучи функционально связанной с кДНК, которая кодирует вРНК вируса гриппа, и будучи интродуцированной в клетки MDCK, способна направлять экспрессию указанной вРНК вируса гриппа.
28. Выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, включающая полинуклеотид, который гибридизируется в жестких условиях гибридизации с нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, включающей последовательности SEQ ID NO:1-26, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты будучи функционально связанной с кДНК, которая кодирует вРНК вируса гриппа, и будучи интродуцированной в клетки MDCK, способна направлять экспрессию указанной вРНК вируса гриппа.
29. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по пп.26, 27 или 28.
30. Способ получения геномной РНК вируса гриппа, заключающийся во введении экспрессирующего вектора по п.29 в клетку и за счет этого в выработке геномной РНК вируса гриппа.
31. Способ получения геномной РНК вируса гриппа, заключающийся во введении экспрессирующего вектора по п.7 в клетку и за счет этого в выработке геномной РНК вируса гриппа.