Противотуберкулёзное средство на основе (Z)-3-(3,3-Диметил-2-оксобутилиден)-3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-2-она и способ его синтеза
ANTI-TUBERCULOSIS DRUG BASED ON (Z)-3-(3,3-DIMETHYL-2-OXOBUTYLIDENE) -3,4-DIHYDRO-2H-1,4-BENZOXAZIN-2-ONE AND A METHOD FOR ITS SYNTHESIS

Изобретение относится к области органической химии и медицины, а именно к индивидуальному производному 1,4-бензоксазин-2-она - (Z)-3-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-2-ону, обладающему противотуберкулезной активностью, которое может быть использовано в фармакологии, медицине и ветеринарии, и к способу его синтеза.
Mycobacterium tuberculosis (МТБ) - возбудитель туберкулеза, характеризующегося высоким уровнем заболеваемости и смертности.
Туберкулез является одной из 10 ведущих причин смерти в мире. Согласно данным ВОЗ ежегодно в мире туберкулезом заболевают до 10 миллионов человек, и около 1,5 миллионов человек умирают от этой болезни, в т.ч. 20% от ко-инфекции ВИЧ и туберкулез.
Несмотря на достигнутые успехи мероприятий, направленных на снижение смертности от туберкулеза, данное заболевание по-прежнему крайне распространено, а в некоторых регионах России численность больных достигает показателей, характерных для уровня эпидемии. Многолетнее широкое применение антибиотиков, изменение состава микробиоты человека и ряд других факторов привели к появлению лекарственноустойчивых и высоковирулентных сублиний Mycobacterium tuberculosis. Основной проблемой, возникающей в борьбе с туберкулезом, является возникновение и распространение штаммов с множественной (МЛУ) и широкой (ШЛУ) лекарственной устойчивостью. По статистике, в мире МЛУ диагностируют в 4% новых случаев инфицирования и у 21% ранее прошедших лечение пациентов, а в России эти показатели составляют 22 и 53% соответственно [Даниленко В.Н., Зайчикова М.В., Дьяков И.Н., Шур К.В., Маслов Д.А. / Mycobacterium tuberculosis: проблемы лекарственной устойчивости, вирулентности и подходы к их решению/Вестник РГМУ. №3, 2018. С. 5-12].
В связи с недостаточной эффективностью лечения и критическим ростом устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам поиск новых противотуберкулезных агентов является одной из наиболее важных задач современного здравоохранения [информационный бюллетень ВОЗ от 5 февраля 2018, https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance].
Авторами настоящего изобретения была поставлена задача по разработке нового противотуберкулезного средства, эффективно действующего в низких концентрациях.
В литературе описан способ синтеза (Z)-3-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-2-она 1, проводимый путем кипячения 1,6-ди(трет-бутил)гексан-1,3,4,6-тетраона 2 и о-аминофенола 3 в этаноле, с последующей очисткой продукта перекристаллизацией в этаноле, [Козьминых Е.Н., Игидов Н.М., Шавкунова Г.А., Козьминых В.О. Известия Академии наук. Серия химическая. 1997, Том 46. №7. С. 1340-1345], осуществляемый по следующей схеме:
К недостаткам данного способа относятся образование побочного продукта (3,3-диметилбутан-2-она), использование труднодоступного исходного соединения 2.
Из уровня техники не выявлено информации противотуберкулезных свойствах (Z)-3-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-3,4-дигидро-2Н-1,4-бензоксазин-2-она 1 или о его применении в качестве противотуберкулезного средства.
Задачей изобретения является разработка простого способа синтеза (Z)-3-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-3,4-дигидро-2H-1,4-бензоксазин-2-она 1 и изучение его противотуберкулезной активности, что позволит расширить ассортимент доступных потенциальных противотуберкулезных препаратов.
Поставленная задача достигается путем кипячения метилового эфира пивалоилпировиноградной кислоты 4 с о-аминофенолом 3 в этаноле в течение 5 мин по следующей схеме:
К раствору 50 г (0.27 моль) метилового эфира пивалоилпировиноградной кислоты 4 в 100 мл этанола добавляли 29.5 г (0.27 моль) о-аминофенола 3. Полученную смесь кипятили при перемешивании в течение 5 мин. Охлаждали. Выпавший желтый осадок соединения 1 отфильтровывали. Маточный раствор упаривали досуха, полученный сухой остаток соединения 1 перекристаллизовывали из 100 мл этанола. Обе порции соединения 1 объединяли и перекристаллизовывали из 200 мл этанола. Выход 76% (50 г), т.пл. 86-88 (этанол). Из маточного раствора от перекристаллизации может быть выделена дополнительная порция соединения 1 упариванием растворителя. Выход дополнительной порции 17% (11.5 г), т.пл. 86-88 (этанол). Общий выход соединения 1 93%.
Соединение 1 - желтое кристаллическое вещество, легкорастворимое в ДМСО и ДМФА, растворимое в ацетоне, хлороформе, 1,2-дихлорэтане, 1,4-диоксане, этилацетате, труднорастворимое в ароматических углеводородах, четыреххлористом углероде, нерастворимое в алканах и воде. Устойчиво при хранении в обычных условиях.
14
15
3
6
аром
6
-1
2
1
13
Соединение 1. CHNO. Найдено, %: С 68.25; Н 5.99; N 5.78. Вычислено, %: С 68.56; Н 6.16; N 5.71. ИК спектр (вазелиновое масло), ν, см: 3180 (N-H), 1772 (С=O), 1632 (С(t-Bu)=O). Спектр ЯМР H 5, м.д. (ДМСО-d): 1.18 с (9Н, t-Bu), 6.36 с (1Н, СНСОВи-t), 7.06-7.50 гр.с (4Н, Н), 12.33 с (1H, NH). Спектр ЯМР С (ДМСО-d) δ, м.д.: 26.7 (3 С), 42.3, 92.1, 116.2, 116.3, 123.0, 124.0, 125.1, 138.6, 140.6, 156.0, 206.1.
Преимуществами данного способа являются использование в качестве исходного вещества легкодоступного метилового эфира пивалоилпировиноградной кислоты 4 (соединение 4 синтезируется конденсацией 1 моль 3,3-диметилбутан-2-она с 1 моль диалкилоксалата [Royals Е.Е. Journal of American Chemical Society. 1945, 67, 9, 1508-1509], в то время как тетракетон 2, используемый в известном методе синтеза соединения 1, синтезируется конденсацией 2 моль 3,3-диметилбутан-2-она с 1 моль диалкилоксалата [ Deljac А.,  1967, 98, 1344-1351]), побочными продуктами являются только метанол и вода. Еще одним преимуществом данного способа является возможность проведения синтеза в дециграммовой загрузке.
Изобретение иллюстрируется примерами исследования противотуберкулезных свойств.
Пример 1. Исследование заявляемого соединения 1 in vitro.
Для изучения бактерицидной активности заявляемого соединения 1 в отношении микобактерий туберкулеза штамма H37R.V использовали стандартную радиометрическую ростовую систему ВАСТЕС MGIT 960 (Becton Dickinson) метод пропорций. В пробирках MGIT содержалось по 7 мл стерильного питательного бульона Мидлбрук 7Н9. В каждую пробирку вносили по 0,8 мл обогатительной добавки ВАСТЕС MGIT OADC (олеиновая кислота, альбумин, декстроза и каталаза). Кроме жидкой среды в пробирке содержался бескислородный флюорохром - пентагидрат трис-4,7-дифенил-1,10-фенантролин хлорид рутения, помещенный на дно пробирки и покрытый силиконом. Соединение 1 растворяли в ДМСО, после чего добавляли в пробирки MGIT в количествах, обеспечивающих получение конечной концентрации от 200 до 0,31 мкг/мл.
7
Из культуры М. tuberculosis штамм H37R.V готовили бактериальную суспензию, которая была стандартизирована по оптическому стандарту мутности №5 с использованием денситометра, рабочая концентрация составила 5×10 клеток/мл.
Суспензию микобактерий туберкулеза вносили по 0,5 мл в опытные и контрольные пробирки. Для сравнения проводили аналогичные исследования с туберкулостатиком первого ряда - изониазидом (производитель Sigma-Aldrich, США, чистота субстанции 99%).
Все пробирки инкубировали при температуре 37°С градусов с последующим анализом, до 41 суток. Если тестируемое соединение 1 активно по отношению к выделенным микобактериям, оно будет ингибировать рост и подавлять флюоресценцию, при этом в контрольной пробирке рост не ингибируется и, соответственно, уровень флуоресцентности в данной пробирке будет выраженный, в результате чего происходит сравнение скорости роста микобактерий туберкулеза в контрольной пробирке и в пробирках с препаратом. Данные представлены в таблице 1.
37
По результатам исследования на ВАСТЕС MGIT 960 заявляемое соединение 1 ингибирует рост культуры М. tuberculosis HRv в концентрации 1,25 мкг/мл в течение 6 суток. Обладает высокой микобактерицидной активностью в концентрации 5,0 мкг/мл в течение 41-го дня. В контрольных пробирках отмечался выраженный рост микобактерий на 4-е сутки.
Пример 2. Исследование заявляемого соединения 1 in vitro. С целью выявления широты спектра противомикробной активности изучено действие в отношении грамположительных бактерий, грамотрицательных бактерий и дрожжевых грибков.
5
Для исследований использовали общепринятый метод двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде макро- и микрометодом [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ - М: И-во Медицина, 2005]. Микробную суспензию готовили в физиологическом растворе из суточных агаровых культур, рабочая концентрация соответствовала 2,5×10 клеток/мл.
Противомикробная активность заявляемого соединения 1 изучена на следующих коллекционных условно-патогенных микроорганизмов: Staphylococcus aureus (штамм 906), Escherichia coli (штамм 1257), Staphylococcus saprophyticus (АТСС 1530), Pseudomonas aeruginosa (АТСС 27853), Candida albicans (РКПГ Y 1353/1277), Candida krusei (РКПГ Y 1472/310), Candida glabrata (РКПГ Y 1485/47). Ингибирование клеток микроорганизмов отмечали после 24-ти часового термостатирования при 37°С по минимально действующей концентрации.
Из данных таблицы 2 следует, что заявляемое соединение 1 ингибирует рост грамположительных бактерий S. aureus и S. saprophyticus в высокой концентрации 250,0 мкг/мл, в отношении остальных исследованных культур противомикробными свойствами не обладает.
В результате проведенных исследований in vitro установлено, что заявляемое соединение 1 имеет избирательную активность, в низких концентрациях, действуя только на жизнеспособность микобактерий туберкулеза.
Пример 3. Исследование заявляемого соединения 1 in vivo. Острая токсичность.
В эксперименте использовались белые лабораторные аутбредные мыши самцы стока линии BALB/c в диапазоне масс от 16,0 до 24,6 г. Заявляемое соединение 1 растворяли в 1% крахмальном растворе, и вводили животным перорально (per os) в дозах 1000, 2000, 3000 и 4000 мг/кг в течение 15 дней. В качестве эквистрессового воздействия животным в контрольной группе вводился 1% крахмальный раствор.
Установлено, что заявляемое соединение 1 обладает низкой токсичностью (LD50>4000 мг/кг per os), что позволяет отнести его к классу 3 - «умеренно токсичные», согласно ГОСТу 12.01.007.76.
Пример 4. Исследование заявляемого соединения 1 in vivo. Эффективность лечения заявляемого соединения 1 на модели туберкулезной инфекции у мышей.
8
Терапевтическую активность заявляемого средства по изобретению определяли на модели экспериментального туберкулеза у 60 белых мышах-самках линии BALB/c массой 16-20 г. Препаратом сравнения служил - изониазид (30 мг/кг). Инфицирующую дозу вводили внутривенно в хвостовую вену в дозе 5×10 микробных тел/мл. Заражение мышей проводили двухнедельной культурой М. tuberculosis H37R.V.
Животные были разделены на 6 групп по 10 особей:
1 - незараженные животные, интактные;
2 - зараженные животные, не получавшие лечение;
3 - зараженные животные, получавшие лечение новым соединением, в дозе 10 мг/кг;
4 - зараженные животные, получавшие лечение новым соединением в дозе 30 мг/кг;
5 - зараженные животные, получавшие лечение новым соединением в дозе 50 мг/кг;
6 - зараженные животные, получавшие лечение препаратом сравнения - изониазидом, в дозе 30 мг/кг (производитель Sigma-Aldrich, США, чистота субстанции 99%).
Пероральное введение осуществлялось в дозах 10 мг/кг, 30 мг/кг и 50 мг/кг в 1,0% крахмальном растворе, ежедневно в течение 80 дней. Дозировка рассчитывалась согласно пересчета дозы на вес мышей. Группе зараженных животных, не получавших лечение, вводили в таком же объеме - 1,0% крахмальный раствор.
Эффективность лечения определяли, сравнивая оценочные критерии в опытных и контрольных группах животных. Оценивали следующие показатели: индекс выживаемости, массу тела, пораженность органов.
37
На 80 сутки после заражения мышей штаммом М. tuberculosis HRv летальность в группе контрольных нелеченых зараженных животных составила 70%. По окончанию эксперимента выживаемость животных составила у животных получавших 10 мг/кг -100%, 30 мг/кг - 90%, 50 мг/кг - 80%, у мышей, получавших препарат сравнения изониазид в дозе 30 мг/кг выживаемость составила 100%.
Из данных таблицы видно, что заявляемое соединение 1 в исследованных дозах и лекарственный препарат способствовали повышению массовых показателей самок мышей. Наибольший прирост массы принадлежит леченым мышам получавших 10 мг/кг заявляемого соединения 1 - 4,4 г, в дозе 30 мг/кг - 4,2 г, в дозе 50 мг/кг - 4,0 г, у животных получавших изониазид прирост массы составил 5,5 г.
Патоморфологическое исследование внутренних органов животных.
Морфологическая картина туберкулезных изменений у белых мышей в основном локализуется в легочной ткани. При визуальном изучении макроскопической картины туберкулеза у зараженных нелеченых мышей установлено, что объем легких увеличен, хорошо видны сероватые очаги туберкулеза. У леченых мышей легочная ткань при визуальном осмотре поражена максимально при получении 50 мг/кг - выраженные единичные очаги в виде мелких точек, затем 30 мг/кг - наличие мелких полупрозрачных очагов. Минимально поражены легкие очагами туберкулеза при дозе 10 мг/кг - местами мелкие полупрозрачные очаги.
Из полученных данных следует, что средство в концентрации 10 мг/кг способствовало уменьшению степени пораженности легочной ткани на 76,7%.
Повышение показателей поврежденности легких отмечено в группах животных, получавших дозу вещества 30 мг/кг и 50 мг/кг, эффективность которых составила лишь 40,0% и 26,7%, соответственно.
Таким образом, исходя из выше изложенного, следует, что заявляемое соединение 1 обладает избирательной противомикробной активностью в низких концентрациях, действуя только на жизнеспособность М. tuberculosis.
Соединение обладает низкой токсичностью (LD50>4000 мг/кг per os), что позволяет отнести его к классу 3 - умеренно токсичные.
Полученные результаты in vivo на модели туберкулезной инфекции, вызванной у мышей, показали, что эффективная терапевтическая концентрация вещества находится в диапазоне 10-30 мг/кг.