Аллергическая альтерация лейкоцитов in vitro при пенициллиновой аллергии

Медицинская Иммунология 2002, Т. 4, №3, стр 453-458 © 2002, СПб РО РААКИ

Оригинальные статьи

АЛЛЕРГИЧЕСКАЯ АЛЬТЕРАЦИЯ

ЛЕЙКОЦИТОВ in vito

ПРИ ПЕНИЦИЛЛИНОВОЙ АЛЛЕРГИИ

Гервазиева В.Б., Степанова Е.В., Гюнтер Е.А., Сверановская В.В., Жирова С.Н., Воробьева H.JI.

Лаборатория аллергодиагностики НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, Москва

Резюме. С помощью теста альтерации лейкоцитов определяли наличие повышенной чувствительности к бен-зилпенициллину и ампициллину у 428 больных, имевших в анамнезе аллергические реакции к этим препаратам. Показатели альтерации у больных в среднем составили 42% и превышали таковые у лиц контрольной группы без лекарственной аллергии (11%). Метод обеспечивал высокий уровень диагностики непереносимости лекарств: чувствительность его в среднем составила 83%, а специфичность - 96%. На модели пассивной сенсибилизации лейкоцитов здоровых доноров сыворотками больных с установленной непереносимостью бензилпенициллина, часть из которых истощали моноклональными анти-IgE и анти-^О-антителами, показано, что одним из ведущих факторов альтерации лейкоцитов в тесте являются IgE-антитела со специфичностью к медикаментам. Тест альтерации лейкоцитов, моделирующий in vitro морфологические проявления аллергической реакции на клетках-мишенях, может быть использован для диагностики аллергии к лекарственным препаратам, обусловленной IgE ответом.

Ключевые слова: аллергическая альтерация лейкоцитов, аллергия на пеушциллины.

Gervazieva V.B., Stepanova E.V., Gunter E.A., Sveranovskaja V.V, Zhirova S. N„ Vorobieva N.L.

LEUKOCYTE ALLERGIC ALTERATION IN VITRO IN PATIENTS WITH PENICILLIN ALLERGY Abstract. In 428 patients with allergic reactions to benzylpenicillin and ampicillin, registered in their medical history, the presence of high sensitivity to these preparations was determined by means of the leukocyte allergic alteration

Современные представления о лекарственной аллергии основаны на теории гаптенов, согласно которой низкомолекулярные химические соединения (лекарства или их метаболиты) ковалентно связываются с белками, образуя конъюгаты, распознаваемые как иммуноген-ные детерминанты гуморальным и/или клеточным звеньями иммунной системы. Лекарства, попадая в организм, биотрансформируются, часто образуя множество высокореактивных соединений, каждое из которых является потенциальным аллергеном. Основные сложности аллергодиагностики медикаментозной гиперчув-

Адрес для переписки:

Гервазиева Валентина Борисовна,

Лаборатория аллергодиагностики НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

103064, Москва, Малый Казенный пер., д. 5а. Тел/факс 917-20-26, e-mail: escolibri@yandex.ru

ствительности связаны с незнанием антигенных детерминант большинства лекарственных веществ и их метаболитов и отсутствием или недоступностью диагностических реагентов.

Наиболее полно изучен метаболизм часто применяемого антибиотика бензилпенициллина. Из препаратов бензилпенициллина выделено несколько биологически активных молекул, которые оказались сильными иммуногенами. В организме в процессе метаболизма пенициллина образуется более 10 химических соединений, каждое из которых может быть гаптеном [1, 4]. В ходе метаболизма 90% препарата превращается в гаптенную составляющую - пенициллоил. Он получил название большой антигенной детерминанты пенициллина. Из этого вещества готовят аллерген для in uitro и in vivo тестирования путем конъюгирования с поли-О-лизином. Наличие такого диагностического препарата позволило изучить закономерности и особенности аллергии на антибиотики (3-лактамы, сделав пенициллиновую гипер-

чувствительность общепризнанной моделью для изучения лекарственной аллергии.

Лекарства чаще запускают иммунный ответ, чем аллергию. Нередко у обследуемых людей без клиники аллергии выявляются антитела к препаратам, особенно класса IgG. В одних случаях они - предвестники клинических проявлений аллергии, в других - антитела IgG-изотипа (особенно IgG4-cy6miacca) могут играть роль “блокирующих”, препятствующих связыванию IgE-антител с аллергеном [4,5].

Основным патогенетическим механизмом лекарственной аллергии является повышенная чувствительность немедленного типа.

Наиболее широко применяемые методы in vitro диагностики и иммунологические исследования природы лекарственной аллергии основаны на обнаружении в сыворотке больных IgE и IgG - антител к иммуноген-ным детерминантам лекарств (ИФА, РАСТ). Тесты, основанные на стимуляции клеток крови под воздействием медикаментов (РБТЛ, метод гистаминолиберации, тест дегрануляции базофилов и т. д.) не нашли широкого практического применения. До сих пор не существует клинического или лабораторного метода или диагностического алгоритма, позволившего бы полностью разрешить проблему диагностики непереносимости лекарств.

Известно, что инкубирование крови больных пол-линозом с причинным аллергеном приводит к альтерации лейкоцитов, которую можно наблюдать в витальном препарате, окрашенном флюорохромом [1, 2, 3]. Цель и задачи настоящего исследования состояли в применении теста аллергической альтерации лейкоцитов (ТААЛ) для выявления непереносимости антибиотиков из группы (3-лактамов ампициллина и бензилпени-циллина и в оценке его информативности в связи с данными анамнеза и результатами некоторых in vitro и in vivo методов, а также в выяснении роли IgE- и IgG-антител в активации клеток, приводящей к структурным изменениям полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) в этом тесте.

Материалы и методы

Обследовано 428 пациентов, отмечавших в анамнезе аллергические реакции на пенициллины, и 58 человек, никогда не имевших таких реакций, среди которых

19 были практически здоровы и 39 страдали атопическими заболеваниями (контрольная группа).

Тест аллергической альтерации лейкоцитов. ТААЛ использовали для выявления чувствительности к бен-зилпенициллину, ампициллину и аллергену из основной детерминанты бензилпенициллина - пенициллоил-полилизину (ППЛ) фирмы “GALK Ltd”, США.

Для этого гепаринизированную кровь больных и людей из контрольной группы в объеме 100 мкл инкубировали в лунках микропланшетов при температуре 37°С в течение 30 минут после добавления 20 мкл лекарственного препарата в дозах, не вызывавших морфологического изменения гранулоцитов у здоровых. Концентрация бензилпенициллина составляла 2тыс. ЕД/мл, ампициллина - 0,5 тыс. ЕД/мл. Разводящей жидкостью для лекарств, а также отрицательным конт-

ролем служил изотонический раствор хлорида натрия. 53 пациентам с непереносимостью бензилпенициллина проводили тестирование с ППЛ в количестве 20 мкл раствора концентрации 5 мкг/мл.

После инкубирования из образцов крови готовили витальные препараты для люминесцентного микроско-пирования, окрашивая их акридиновым оранжевым в разведении 1:20000, и проводили исследование морфологии клеток при увеличении 90x5.

Неизмененные клетки имели округлую форму, четкие границы внутриклеточных структур, целостную наружную клеточную мембрану. Цитоплазма гранулоцитов светилась тускло-зеленым светом с обилием рубиновых гранул и ярко изумрудным ядром, эозинофи-лы имели характерное ядро и более крупные гранулы, базофилы и нейтрофилы различались по форме ядра, лимфоциты обладали меньшими размерами, крупным изумрудным ядром и единичными крупными гранулами в цитоплазме. Эритроциты и тромбоциты практически не были видны.

Альтерированные гранулоциты представляли собой следующую картину по степени повреждения: 1) лейкоциты овальной или округлой формы со слабо окрашенными негомогенными гранулами внутри цитоплазмы, с неясной внутриклеточной структурой, но с сохраненной клеточной оболочкой; 2) лейкоциты с дефектами наружной мембраны, расположением гранул внутри и/или за пределами клетки и сохранением морфологии ядра; 3) лейкоциты амебовидные, с вакуолями в ядре и цитоплазме, с поврежденной мембраной и «высыпавшимися» гранулами; 4) погибшие лейкоциты (краснооранжевого цвета). В опытных образцах крови подавляющее большинство измененных клеток относились к 2 и 3 группам.

В препарате подсчитывали 100 гранулоцитов и вычисляли процент морфологически измененных клеток, или показатель альтерации (ПА). Результаты реакций учитывали лишь в том случае, если в отрицательном контроле ПА, учитывающем число морфологически измененных и погибших клеток, не превышало 10%.

Тест пассивной альтерации лейкоцитов. Гепаринизированную кровь здоровых доноров IV((0)a,(3) группы крови центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут, надосадок удаляли и клеточную взвесь трижды отмывали средой Хенкса при таком же режиме центрифугирования. К 50 мкл клеточной взвеси добавляли 50 мкл сыворотки больных с установленной повышенной чувствительностью к бензилпенициллину и спустя 30 минут инкубации при комнатной температуре вносили в смесь 20 мкл раствора бензилпенициллина натриевой соли или ППЛ. Далее осуществляли тот же порядок операций, что и в прямом тесте альтерации лейкоцитов.

Иммуноферментный метод определения IgE -, IgG IgG4 - антител к ПИЛ и IgE -антител к ампициллину.

В качестве твердой фазы использовали полистироло-вые микротитрационные планшеты фирмы Nunc (Дания). ППЛ растворяли в карбонат-бикарбонатном буферном растворе (pH 9,6±0,2), вносили в лунки планшетов и инкубировали в термостате при 37°С в течение 18 часов. Доза сорбции твердой фазы составляла 20 мкг/ мл. Параллельно в качестве контроля в лунки шести

вертикальных рядов планшета (по два ряда для каждой референс-системы) вносили моноклональные анти-IgE (анти-IgG, анти-^С4)-антитела в карбонат-бикарбонат-ном буферном растворе (pH 9,6+0,2) в дозах 10 мкг/мл,

20 мкг/мл и 20 мкг/мл, соответственно, и инкубировали, как описано выше.

После трехкратной отмывки планшетов фосфат-но-солевым буферным раствором (pH 7,4±0,2) с

0,05% содержанием детергента Твин-20 (ФСБ-T) в соответствующие лунки планшетов вносили рефе-ренс-реагенты фирмы “Полигност”, Россия и исследуемые образцы сывороток в рабочих разведениях. Так, для определения IgE-антител сыворотки разводили ФСБ-T в соотношении 1:3, IgG-антител - 1:39, a IgG4-aHTm^ - 1:19. После инкубации (1 час при 37°С) и трехкратной отмывки в лунки вносили конъюгат соответствующих моноклональных анти-IgE (анти-IgG, анти-^С4)-антител (“Полигност”, Россия) с пероксидазой корня хрена (“SIGMA”, США) в рабочем разведении, инкубировали 1 час при 37°С и пятикратно отмывали ФСБ-Т.

Реакцию проявляли внесением в лунки субстратной смеси, состоящей из цитратного буферного раствора (pH 4,7±0,2), хромогена о-фенилендиамина и 33% раствора перекиси водорода и через 30 минут останавливали 50% раствором серной кислоты. Соотношение компонентов субстратной смеси на один планшет составило 25 мл, 10 мкг и 30 мкл, соответственно. Результаты реакции учитывали на фотометре Униплан фирмы “Picon” при длине волны 492 нм. Содержание аллергенспецифических антител определяли по калибровочным кривым титрования референс-реагентов.

Аналогично определяли уровни специфический IgE-антител к ампициллину, используя в качестве твердой фазы диски с этим медикаментом фирмы “CYPRESS DIAGNOSTICS”, Бельгия.

Кожные пробы. Больным с лекарственной аллергией капельные и скарификационные кожные пробы проводили по общепринятой в России методике. В этом исследовании использовали стерильный свежеприготовленный раствор натриевой соли бензилпеницилли-на в концентрации 200 тыс. ЕД/мл, ампициллина в концентрации 50 тыс. ЕД/мл и антиген для кожного тестирования ППЛ (PRE-PEN) фирмы “SCHWARZ PHARMA, INC”, США.

Метод истощения сывороток моноклональными антителами. В реакции использовали сыворотки больных с высоким содержанием IgE- и IgG-антител к ППЛ и высокими показателями TAAJI. При этом сыворотки истощали моноклональными антителами против соответствующих иммуноглобулинов и тестировали в методе пассивной альтерации лейкоцитов. Опытным путем было установлено, что при разведении сыворотки крови физиологическим раствором хлорида натрия более чем в 4 раза не было различий ПА в пассивном ТААЛ между пробами от больных и здоровых людей. Т.о., сравнительный анализ проводили только в пробах с разведением сыворотки крови в 2 раза. В каждый образец сыворотки крови больных объемом 100 мкл добавляли равный объем растворов моноклональных анти-IgE (анти-^С)-антител в рабочем разведении и инкубировали 1 час при 37°С.

Результаты

Характеристика обследованных больных. По данным анамнеза, гиперчувствительность к медикаментам у обследованных больных клинически проявлялась в виде отека Квинке (36,2%), крапивницы (34,1%), различных по времени возникновения макулопапулезных высыпаний (22,4%), явлений бронхоспазма (3,5%), анафилактического шока (3,7%). В отдельных случаях применение пенициллинов сопровождалось узловой эритемой, аллергическим васкулитом и синдромом Лоэлла.

Повышенную чувствительность к бензилпеницил-лину отмечали 216 человек, к ампициллину -212.

Об аллергии на один из препаратов сообщали 322 пациента, на оба медикамента- 106 человек (24,8%). Около половины из описываемых реакций носили характер перекрестных, т.е. при наличии непереносимости одного из (3-лактамов, не наблюдалось периода сенсибилизации перед аллергической реакцией на другой антибиотик.

Выявление галер чувствительности к антибиотикам с помощью теста аллергической альтерации лейкоцитов. Результаты исследований образцов крови больных и лиц контрольной группы, проведенных с помощью ТААЛ, представлены в табл. 1. Из таблицы видно, что ПА лейкоцитов у больных с лекарственной аллергией при использовании медикамента, вызвавшего, по данным анамнеза, реакцию, существенно выше, чем у лиц контрольной группы.

Значения ПА в группе больных находились в диапазоне от 4 до 98%, однако в большинстве случаев они превышали 20%. Учитывая, что значения средних ПА (с учетом двойного доверительного интервала) при действии каждого из тестируемых препаратов в контрольной группе не превышали 20%, результаты теста условно считали положительными при ПА>20%.

Была установлена достаточно высокая информативность ТААЛ (табл. 2). Однако, как видно из таблицы, чувствительность его (совпадение положительных результатов теста с положительным анамнезом) была неодинаковой и оказалась более высокой при испытании ампициллина и несколько ниже при использовании бен-зилпенициллина и его основной детерминанты. Специфичность теста (совпадение отрицательных результатов с отрицательным анамнезом) была высока для всех препаратов, несмотря на несколько случаев гипердиагностики. Уровень совпадений результатов теста с анамнезом был практически одинаковым при всех клинических формах реакций на препарат, но снижался с увеличением интервала между манифестацией и моментом исследования (рис.1).

Определение IgE-, IgG, IgG4-антител к ППЛ и IgE -антител к ампициллину с помощью иммунофермент-ного метода. Специфические IgE-антитела к основной детерминанте пенициллина в сыворотке крови были обнаружены у 28 из 53 обследованных больных и у 5 из 30 здоровых человек (р<0,01) в количестве от 1,7 до 7,8 КЕ/ л. Средний уровень IgE-антител у больных составил 5,1±1,1 КЕ/л, а у здоровых - 4,2±0,9 КЕ/л (р>0,05). IgG и IgG4-aimrraa к пенициллоилполилизину выявлены во всех сыворотках крови больных и здоровых людей. Содержание специфических антител класса IgG у боль-

Табл. 1. АЛЛЕРГИЧЕСКАЯ АЛЬТЕРАЦИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ т уИго У БОЛЬНЫХ С ЛЕКАРСТВЕННОЙ АЛЛЕРГИЕЙ НА АНТИБИОТИКИ-ПЕНИЦИЛЛИНЫ

Лекарственный препарат Средние значения (М±т) ПА в % у Достоверность различий

больных здоровых

ампициллин 41,78 ± 1,59 11,12 ± 1,29 р<0,01

бензилпенициллин 36,37 ± 1,55 12,17 ± 0,82 р<0,01

пенициллоилполилизин 42,33 ± 1,48 4,9 ± 2,11 р<0,001

ных было выше (183,1±4,7 мкг/мл), чем у здоровых (89,3±9,8 мкг/мл, р<0,05), в то время как уровни IgG4 в этих группах не различались (5,8±6,7 мкг/мл и 5,7±4,9 мкг/мл, р>0,05).

^Е-антитела к ампициллину определены в сыворотках крови 8 из 10 пациентов (80%) с подтвержденной в ТААЛ лекарственной аллергией на этот препарат. Средний уровень их составил 7,4±1,2 КЕ/л.

Далее мы сравнивали результативность кожного тестирования, иммуноферментного метода и теста альтерации лейкоцитов. Капельное накожное тестирование не дало ни одного положительного результата. Скари-фикационное исследование с бензилпенициллином было положительным у 9 больных и 2 здоровых человек. На скарификацию с ППЛ и ампициллином 19 и 2 пациента, соответственно, реагировали позитивно, а в контрольной группе все пробы были отрицательными.

При сравнении результатов выявления повышенной чувствительности к пенициллину разными методами (табл. 2) установлено, что ТААЛ с бензилпенициллином и ППЛ по своей чувствительности соответствует иммуноферментному методу, но превышает кожное тестирование (р<0,01). Аналогичная картина наблюдалась и в отношении ампициллина. Все использованные методы обладали сопоставимой и достаточно высокой специфичностью.

Механизмы реализации аллергической альтерации лейкоцитов. Исследование влияния сывороточных и клеточных факторов на альтерацию лейкоцитов в присутствии бензилпенициллина проведено нами с применением пассивной альтерации лейкоцитов при использовании клеточной взвеси 12 здоровых людей с IV группой крови и сывороток крови 60 больных с высоким ПА

Рис.1. Информативность теста альтерации лейкоцитов в зависимости от отсроченности исследования:

| - менее трех месяцев, *

- менее одного года,

- более одного года

в прямом ТААЛ. Результаты этой серии опытов, отраженные в табл. 3, показали, что ПА лейкоцитов здоровых доноров под воздействием бензилпенициллина натриевой соли в присутствии сыворотки крови больных был выше, чем в контрольном исследовании с сывороткой крови здоровых людей, и не отличался от ПА в пробах, в которых использовали лейкоциты больных и их собственную сыворотку. В свою очередь, лейкоциты больных после соединения с сывороткой крови здоровых людей оказались существенно менее чувствительными к добавлению лекарства, однако ПА в этом случае был выше, чем при использовании лейкоцитов здоровых доноров.

Для изучения роли антител IgE и изотипов в механизме аллергической альтерации, проводили истощение сывороток 6 больных, чувствительных к ППЛ с высоким содержанием соответствующих специфичес-.ких антител и высоким значением ПА в прямом ТААЛ (44,31±2,79%) мышиными моноклональными анти ^Е-и ^С- антителами. Истощенные сыворотки исследовали в пассивной альтерации лейкоцитов.

Из табл.4 видно, что истощение сывороток больных с установленной гиперчувствительностью к основной детерминанте пенициллина анти-^Е-антителами приводило к достоверному снижению ПА в тесте пассивной альтерации, в то время как истощение ^О-антител не изменяло этот показатель.

Обсуждение

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что ТААЛ обеспечивает с достаточно высокой степенью достоверности выявление непереносимости антибиотиков (3-лактамов. Вместе с тем, в ряде случаев положительную альтерацию выявляли при отрицательном анамнезе и наоборот, причем случаи гиподиагностики преобладали над случаями гипердиагностики. Последние могут быть объяснены наличием латентной, клинически не проявленной сенсибилизации.

Полученные отрицательные результаты теста альтерации у больных, отмечавших наличие повышенной чувствительности к использованному в тесте медикаменту, требовали тщательного анализа и проведения дополнительных исследований. В ряде случаев отрицательный результат на конкретный препарат сочетался с выявлением положительного результата на другое лекарство, вводимое совместно с тестируемым. Так, у 8 человек, перенесших, по их мнению, аллергическую реакцию после инъекций ампициллина или пенициллина, был установлен повышенный уровень альтерации лейкоцитов в присутствии новокаина при отрицательных

результатах теста на антибиотики. Полученные результаты позволяли рассматривать данные случаи непереносимости как проявление сенсибилизации, вызванной не антибиотиками, а новокаином, который обычно используется для их разведения. Подобное несовпадение отрицательных результатов теста с данными анамнеза наблюдали и в ряде других случаев, когда "причинный" препарат применялся на фоне полимедикаментозной

терапии. Гиподиагностика также может быть связана с большим интервалом между манифестацией реакции и временем проведения ТААЛ (рис. 1). Следует отметить, что сенсибилизация к ППЛ у больных пенициллиновой аллергией была выявлена лишь в 51 % случаев. Это, на наш взгляд, свидетельствует о том, что довольно часто ответственными за сенсибилизацию являются другие детерминанты пенициллина [1,9].

Табл. 2. РЕЗУЛЬТАТИВНОСТЬ КОЖНОГО ТЕСТИРОВАНИЯ, ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА И ТЕСТА АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ АЛЬТЕРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ

Вид исследования и испытуемый реагент Чувствительность метода* Специфичность метода**

Капельные кожные пробы с

пенициллоилполилизином 0%

бензилпенициллином 0%

Скарификационные кожные пробы с

пенициллоилполилизином 36%

бензилпенициллином 17%

ампициллином 10%

Иммуноферментное определение 1дЕ-антител

к пенициллоилполилизину 53%

к ампициллину 80% (п=10) -

Тест альтерации лейкоцитов с пенициллоилполилизином бензилпенициллином ампициллином 51%

* процент положительных результатов метода в группе больных. ** процент отрицательных результатов метода в группе контроля.

Табл. 3. ВЛИЯНИЕ СЫВОРОТОЧНЫХ ФАКТОРОВ НА АЛЬТЕРАЦИЮ ЛЕЙКОЦИТОВ В ПРИСУТСТВИИ БЕНЗИЛПЕНИЦИЛЛИНА НАТРИЕВОЙ СОЛИ

№ п/п Состав опытных проб Значения ПА в % (М±т) Достоверность различий

1. Лейкоциты здоровых доноров + сыворотка больных 48,16 ± 13,90% Pl-2^0,01

2. Лейкоциты здоровых доноров + сыворотка здоровых 8,00 ± 3,22% Рі-з>0,05

3. Лейкоциты больных + их собственная сыворотка 48,00 ± 3,42% Р2-4<0,01

4. Лейкоциты больных + сыворотка крови здоровых доноров 29,62 ± 6,01% Рз-4^0,01

Табл. 4. РОЛЬ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В РЕАЛИЗАЦИИ АЛЬТЕРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ С ПОВЫШЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К ПЕНИЦИЛЛОИЛПОЛИЛИЗИНУ.

N» п/п Состав опытных проб с пенициллоилполилизином Значения ПА в % (М±т) Достоверность различий

1. Лейкоциты здоровых доноров + сыворотка больных 38,00 ± 1,27%

2. Лейкоциты здоровых доноров-1- сыворотка, истощенная анти-1дЕ 23,71 ± 3,22% Рі 2<0,05

3. Лейкоциты здоровых доноров + сыворотка, истощенная анти-1д0 36,8,16 ± 3,90% Рі.з^0,05

При сравнении результатов использованных методов аллергодиагностики мы показали, что Т ААЛ так же, как и скарификационный метод кожного тестирования с ампициллином, бензилпенициллином и аллергеном из его главной антигенной детерминанты, обладает высокой специфичностью в диагностике лекарственной аллергии, т. е. практически не дает положительных результатов у здоровых людей. Поскольку чувствительность ТААЛ намного выше, чем у скарификационного метода, тест можно рекомендовать для выявления повышенной чувствительности к пенициллину в практике. Капельный метод накожного тестирования оказался бесполезным для использования в диагностических целях у больных пенициллиновой аллергией.

Можно полагать, что в механизме реализации ТААЛ при пенициллиновой гиперчувствительности существенную роль играют IgE-обусловленные иммунологические реакции. В пользу этого говорит выявление IgE-антител к ППЛ, которое коррелировало с результатами ТААЛ (r=+0,47; р<0,01) и было существенно выше у обследованных больных, чем у здоровых. Результаты исследования роли сывороточных факторов в альтерации лейкоцитов in vitro под воздействием бензилпени-циллина методом пассивной альтерации показали ведущую роль факторов сыворотки крови в реализации этой реакции. Так, снижение ПА после истощения сывороток моноклональными анти-IgE-антителами позволило идентифицировать ведущую роль IgE-антител в реализации альтерации лейкоцитов (табл.4).

У больных с аллергией на ампициллин результаты ТААЛ и ИФА совпали у 80% пациентов.

Аллергенспецифичные IgE-антитела определяли также в сыворотках крови здоровых лиц (17%) с нормальной переносимостью (3-лактамов и отрицательными результатами кожного тестирования и теста альтерации лейкоцитов. По-видимому, обнаружение этих IgE-антител свидетельствует о наличии латентной, возможно, перекрестной сенсибилизации к препарату.

Интересно, что у всех больных с аллергией на бен-зилпенициллин и у всех здоровых обследованных в сыворотке крови были обнаружены специфические IgG-и ^С4-антитела к ППЛ, которые не оказывали существенного влияния на показатели ТААЛ. По-видимому, выявленные антитела являются свидетелями иммунного ответа на имевший место контакт с антигеном -ППЛ.

Таким образом, результаты нашего исследования показали, что у больных с непереносимостью антибио-тиков-(3-лактамов при инкубировании образца цельной крови с соответствующим лекарственным препаратом возникает альтерация лейкоцитов, одним из ведущих факторов в реализации которой являются антитела класса IgE со специфичностью к медикаментам. Способность IgE-антител связывать активные детерминанты пенициллина и цефалоспоринов была показана ранее [5,6,7].

Мы полагаем, что этот тест моделирует in vitro морфологические проявления аллергической реакции на клетках-мишенях. IgE- антитела к медикаментам, фиксируясь на базофилах и эозинофилах, несущих рецеп-

торы для этого иммуноглобулина, в присутствии соответствующего лекарственного препарата активируют эти клетки, вызывая их дегрануляцию. Дегрануляция сопровождается высвобождением гистамина, лейкотри-енов и других биологически активных веществ, включая триптазу [10]. Последняя конвертирует СЗ компонент комплемента в СЗа - анафилатоксин, рецепторы для которого имеются на мембране нейтрофилов [8]. Такая активация нейтрофилов сопровождается их дегрануляцией. В свою очередь, лейкотриены, даже в очень небольших концентрациях способны обеспечить дегрануляцию нейтрофилов [8], увеличивая этот эффект.

Таким образом, ТААЛ можно предложить для диагностики аллергии к лекарственным препаратам, обеспеченной ^Е ответом, поскольку он обладает высокой информативностью, безопасностью для больного, допускает одновременное тестирование большого количества медикаментов, а его проведение позволяет довольно быстро (в течение 35-40 минут) получить результат при минимальном объеме крови.

Список литературы

1. Аллергические болезни: диагностика и лечение: Пер. с англ./Под ред. А.Г.Чучалина, И.С.Гущина, Э.Г.Улумбекова, Р.С.Фассахова. - М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 2000. - 768 С.

2. Гервазиева В.Б. Роль гуморальных факторов в аллергической альтерации лейкоцитов. // Пат. физиол. -1970. - № 4. - С. 23-27.

3. Медуницын Н.В., Гервазиева В.Б. Аллергическая альтерация лейкоцитов у больных поллинозами. // Бюлл. экспер. биол. - 1967. - № 6. - С. 77-80.

4. Новиков П.Д., Новиков Д.К., Сергеев Ю.В. // Иммунопатология, аллергология, инфектология - 2001. -№1,-С. 51-64.

5. Савельева В.Ф., Курманова Л.В., Ермолин Г.А., Польнер А.А., Багаева Л.В. Роль иммуноглобулинов различных классов при аллергии к пенициллину. // Иммунология. - 1986. - №4. - С. 43-46.

6. Allergic Reactions to Drugs. / Ed. de Week AL, Bundgaard H. - Berlin Heidelberg New York Tokio.: Springer-Verlag, 1983. - Vol.63. - P.207-240.

7. Harle DG, Baldo BA. Identification of penicillin allergenic determinants that bind IgE antibodies in the sera of subjects with penicillin allergy. // Molec Immunol. -1990.

- Vol.27. - P. 1063.

8. Nagy L, Zee TH, Goetzl EJ et al. Complement receptor enhancement and chemotaxis of human neutrophils and eosinophils by leucotrienes and other lipoxigenase products. // Clin Exp Immunol. - 1982. - Vol.47. - P. 541-547.

9. Pham ND, Baldo BA. (3-Lactam drug allergens: Fine structural recognition patterns of cephalosporin-reactive antibodies. // J Molec Recognition. - 1996. - Vol. 9. - P. 287.

10. Schwartz LB, Atcins PC, Brandford TR et al. Release of tryptase with histamine during the immediate cutaneous response to allergen. //] Allergy and Clin Immunol. - 1987.

- Vol. 80. - P. 850-855.

поступила в редакцию 31.07.2001 принята к печати 20.11.2001