Способ адаптации микроклонов стевии Stevia rebaudiana Bertoni к условиям ex vitro
METHOD FOR ADAPTING MICROCLONES OF STEVIA STEVIA REBAUDIANA BERTONI TO EX VITRO CONDITIONS

Изобретение относится к области биотехнологии, предназначено для получения высококачественного посадочного материала стевии в культуре in vitro из микрочеренков растений, культивируемых на питательной среде Мурасига и Скуга (МС), содержащей препарат Эпин в концентрации 0,1 мг/л в сочетании с ИУК 0,5 мг/л. На этапе укоренения необходимо применять питательную среду МС, в состав которой входит препарат Циркон в концентрации 0,5 мг/л. На этапе адаптации рекомендуется применять новый способ - «Адаптация в культуральном сосуде». Применение данной технологии позволит исключить этап доращивания микроклонов перед их пересадкой в почвенный субстрат.
Для получения высококачественного посадочного материала в неограниченном количестве применяют метод клонального микроразмножения, который состоит из четырех заимосвязанных этапов, следующих друг за другом. Технология включает в себя следующие этапы: 1) выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры; 2) собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества микропобегов; 3) укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям; 4) выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле (Калашникова Е.А. Клеточная инженерия растений: учебник и практикум для вузов. - 2-е изд. -Москва: Издательство Юрайт, 2020. - 333 с). Все перечисленные выше этапы, несомненно, являются главными в единой технологи. Однако, как показывает практика, адаптация микроклонов к почвенным условиям ex vitro, является основным элементом, от которого зависит успех предлагаемой технологии.
В результате многочисленных исследований установлено, что одним из трудоемких этапов, от которых зависит успех клонального микроразмножения, является адаптация микроклонов к естественным условиям произрастания. Перевод микроклонов в нестерильные условия нередко бывает затруднен. Трудности адаптации ex vitro являются ограничивающим фактором развития микроклонов при их промышленном выращивании (Бородулина И.Д., Плаксина Т.В. Адаптация растений-регенерантов земляники садовой сорта Московский Деликатес к условиям ех vitro // ActaBiologica Sibirica, -2015. -1 (1-2). - С. 74-84; Галдина Т.Е. Совершенствование технологии доращивания растений, полученных в культуре ткани in vitro // Успехи современной науки и образования. - 2017. - Т. 7, №2. - С. 174-177; Иванова-Ханина Л. В. Влияние состава субстрата на приживаемость микрорастений Vitis vinifera L. in vivo // Экосистемы. - 2018. - №13 (43). - С. 84-88).
Для того чтобы микроклоны прижились в нестерильных условиях, они должны быть готовы преодолеть стрессы, которым подвергаются в процессе адаптации. В момент перевода микроклонов из условий in vitro в условия ех vitro они, прежде всего, подвергаются водному стрессу, что приводит к обезвоживанию тканей и разрушению мембран. Особенно чувствительны растения к иссушению сразу после их удаления из культуральных сосудов, что связано с тем, что условия роста внутри культурального сосуда приводят к появлению аномальной морфологии и изменению физиолого-биохимических процессов. К таким изменениям можно отнести следующие: 1) недостаток развития кутикулярного воска, 2) появление нефункционирующих устьиц. Устьичный аппарат в условиях in vitro не функционирует, и устьица представляют собой промежуточную стадию между формами in vitro и ex vitro; 3) сокращение поглощения воды корнями; 4) проявление сильной не регулирующей транспирацией; 5) низкая фотосинтетическая активность листьев. Гетеротрофное питание растений в течение 6 месяцев и более размножения их in vitro приводит к полной или частичной потере способности листового аппарата к активному фотосинтезу.
Основной причиной анатомических, морфологических и физиологических отклонений в строении и развитии микроклонов является их специфический морфотип в условиях in vitro, отличающихся от нестерильных условий ex vitro. Микроклоны in vitro должны адаптироваться к условиям пониженной влажности, высокой интенсивности и качественному составу света, новым условиям получения источника углерода, патогенной микрофлоре почвы и окружающей среды. Дополнительная гибель микроклонов может достигаться при использовании нестерильного почвенного субстрата, где при благоприятной температурной и влажностной среде, недостатке аэрации создаются условия для развития бактерий, грибов, а иногда и насекомых паразитов.
В настоящее время предложено и запатентовано достаточное количество технологий по адаптации микроклонов растений к нестерильным условиям выращивания (СССР 4777300/13, А01Н 4/00, 30.01.1993; РФ 2335119, A01G 17/00, А01С 14/00, 10.10.2008; RU 2366153 С1, МПК A01G 1/00, 10.09.2009; RU 2483530, МПК А01Н 4/00, 06.10.2013). Предлагаемые способы основываются на адаптации и доращивании микроклонов в условиях повышенной влажности воздуха с применением искусственных субстратов. В качестве субстратов применяют, как правило, смесь перлита и низинного торфа в равных соотношениях. Выращивают микроклоны в обогреваемых теплицах или в пленочных укрытиях, где поддерживается высокая относительная влажность воздуха 65-80% и температура 25-28°С.
Однако данные технологии являются дорогостоящими, приживаемость микроклонов составляет не более 60-70%, наблюдается медленный рост вегетативной массы и корней растений на начальных этапах адаптации. Поэтому необходимо разрабатывать новые приемы адаптации микроклонов к условиям ex vitro.
Анализ научной литературы и патентный поиск показал, что нет универсальной технологии, позволяющей получать высококачественный, адаптированный к условиям ex vitro посадочный материал растений разных таксономических групп. В связи с этим существует необходимость разработки регламента для конкретных видов растений для решения частных проблем клонального микроразмножения.
На четвертом этапе клонального микроразмножения применяют различные технологии адаптации микроклонов к условиям ex vitro.
Например, известен способ «Доращивания in vitro растений ягодных и декоративных кустарников в нестерильных условиях», заключающийся в пересаживании пробирочных растений в пластиковые кассеты с ячейками небольшого объема (d 4 см, V - 10 см 3) на искусственные субстраты, состоящие из обезвоженных стабилизированных осадков городских сточных вод (ОГСВ), не более одного года хранения и нейтрализованного (рН 6-6,5) верхового торфа в соотношении 1:4. Субстраты предварительно не обеззараживают и не пропаривают, готовят простым перемешиванием компонентов. Первые две недели после пересадки микрорастения содержат в кассетах под герметичными пленочными укрытиями на стеллажах с насыпным слоем керамзита (2-3 см) при температуре 22-26°С и досвечивании с начала января до конца февраля (освещенность 2000 лк, 16 часов). В начале апреля микроклоны с неповрежденным корневым комом пересаживают из ячеек в контейнеры объемом 1,6 л (d 11 см) (RU 2366153 С1, МПК A01G 1/00, 10.09.2009). Недостатками данного способа является применение в качестве субстрата обезвоженных стабилизированных осадков городских сточных вод, в состав которых могут входить не только продукты жизнедеятельности микроорганизмов, но и соли тяжелых металлов, которые отрицательно повлияют на адаптацию микроклонов к естественным условиям произрастания.
Известен другой способ адаптации микроклонов к нестерильным условиям, заключающийся в применении смешивания компонентов почвенного субстрата, стерилизации его в автоклаве и высадку в него микроклоны (RU 2483530, МПК А01Н 4/00, 06.10.2013). Причем после смешивания компонентов, почвенный субстрат обрабатывают водным раствором препарата Агровит-Кор, постепенно увлажняя субстрат до влажности 75-80%, и выдерживают во влажных условиях в течение 3-6 месяцев. Затем после стерилизации в автоклаве в течение 45 минут при температуре 115-120°С и давлении 1-1,25 Па субстрат повторно обрабатывают водным раствором препарата Агровит-Кор и выдерживают 2-3 недели до высадки в него микроклоны, при этом периодически подсушивают до влажности 65% и увлажняют водой до 75-80% до прекращения образования мицелия плесневых грибов на поверхности субстрата. Недостатком данного способа является применение стерилизации почвенного субстрата в автоклаве. Данный прием не может быть рекомендован для применения данной технологии для массовой адаптации микроклонов в связи с ограниченным объемом самого автоклава. Данный способ может быть применен только для адаптации ограниченного количества растений.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу, взятом за прототип, относится «Способ адаптации растений к нестерильным условиям» (А.с. №1792269 А01Н 4/00, 30.01.1993), предусматривающий отбор микроклонов, подготовку субстрата, высадку микроклонов в субстрат, покрытие их прозрачным пластиковым материалом и содержание в контролируемых условиях внешней среды с последующим снятием покрытия согласно изобретению, отбор микроклонов, имеющие 3-5 листьев, не менее 2-3 корней длиной 1,5-3 см, которые последовательно обрабатывают 1%-ным раствором марганцевокислого калия, а затем в течение 3-5 минут обрабатывают индолилуксусной кислотой (ИМК) в концентрации 10-15 мг/л, после чего их высаживают в субстрат в торфоперегнойные горшочки, затем растения содержат в контролируемых условиях при освещенности 8-10 тыс, лк и 16-часовом фотопериоде. Снимают покрытие с горшочков через 7-10 суток. Недостатком данного способа является применение высоких концентраций ИМК, которая может привести к образованию аномальных корней, что затрудняет процесс адаптации микроклонов к нестерильным условиям и замедляет формирование нормальных по морфологии растений. Кроме того, способ сложен в исполнении и требует проведения многоступенчатой обработки растений.
Анализ известных технических решений показал, что технической проблемой в данной области является необходимость создания высокоэффективной технологии, для получения высококачественного посадочного материала микроклонов стевии.
Технический результат предлагаемого изобретения - обеспечение выхода качественного, генетически стабильного материала стевии.
Для решения указанной проблемы и получения заявленного технического результата в способе адаптации микроклонов стевии Stevia rebaudiana Bertoni к условиям ex vitro, включающем их размножение in vitro, укоренение, и адаптацию микроклонов к условиям ex vitro, которую осуществляют в течение 10 суток непосредственно в культуральном сосуде с питательной средой, на которую наносят силикон слоем 2-3 мм, в качестве которого используют силикон из серии Dragon Skin 10 NV.
В предлагаемом способе адаптация микроклонов начинается на этапе укоренения in vitro и включает этап выращивания микроклонов в условиях культурального сосуда с нанесением на питательную среду раствора силикона в течение 10 суток. В этих условиях микроклоны не претерпевают стресс, постоянно получают необходимые питательные элементы и гормоны для своего роста и развития и легко переносят пересадку в нестерильный почвенный субстрат.
Конкретный пример осуществления предлагаемого способа.
Для проведения адаптации стевии к условиям ex vitro проводят первоначально визуальный отбор микроклонов по морфологии. Культуральный сосуд, в котором находятся растения, должен быть не выше 13-15 см и достаточно широкий - для возможности манипуляции шприцом и скальпелем стандартных длин.
Затем культуральный сосуд открывают и с помощью длинного шприца, в условиях ламинар-бокса, наносят на поверхность питательной среды, в которой растут микроклоны стевии, слоем толщиной 2-3 мм силикон - из серии высококачественных полупрозрачных силиконовых резин (Dragon Skin 10 NV). Селикон данной серии, в отличии от других силиконов, имеет достаточно низкую вязкость, а также не требует вакуумной дегазации (для минимизации пузырьков воздуха при отверждении), что позволяет работать с ним без специального оборудования. Время жизни смеси - 15 минут, время отверждения - 75 минут при комнатной температуре. Селикон равномерно распределяется по всей поверхности питательной среды и плотно прилегает к стенкам сосуда и стеблю растений, что препятствует появлению контаминации. После нанесения силикона, сосуды снова закрывают пленкой, в которой создают отверстие диаметром 2 мм. Через каждые 2-3 суток отверстие увеличивают на 1 мм для снижения влажности внутри культурального сосуда. Это приводит к адаптации надземной части побега к нормальной влажности без опасности заражения извне питательного субстрата. Адаптацию проводят в течение 10±2 суток в условиях световой комнаты, где поддерживается 16-часовой фотопериод, температура 22-25°С и освещение люминесцентными лампами с интенсивностью освещения 3 тыс.лк. Контроль сохранения стерильности осуществляют на основе визуальных наблюдений, особое внимание обращая на те места, где силикон соприкасается со стенками сосуда.
Далее, адаптированные микроклоны стевии извлекают из сосуда вместе с питательной средой и освобождают стволик растений от силикона с помощью скальпеля. После этого микроклоны переносят в почвенный субстрат.
Предлагаемый способ адаптации микроклонов стевии сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать ее в практической работе и для других растений:
1. Способ предполагает использовать в небольших количествах легкодоступный селиконовый материал для проведения работ по адаптации микроклонов.
2. Способ обеспечивает проведение работ в лабораторных условиях не зависимо от сезона.
3. Предлагаемая технология легка в исполнении и не требует привлечения дорогостоящего оборудования.
4. Предлагаемый способ позволяет ускоренно адаптировать микроклоны стевии.
По сравнению с прототипом изобретение позволит увеличить выход качественного, генетически стабильного материала стевии за более короткое время, за счет исключения этапа доращивания микроклонов перед их пересадкой в почвенный субстрат.