УСТРОЙСТВО ДЛЯ НЕПРЕРЫВНОЙ КУЛЬТУРЫ С МОБИЛЬНЫМ СОСУДОМ, ПОЗВОЛЯЮЩИМ ВЫПОЛНЯТЬ ОТБОР НАИБОЛЕЕ ПОДХОДЯЩИХ ВАРИАНТОВ КЛЕТОК
CONTINUOUS CULTURE DEVICE WITH MOBILE VESSEL, WHICH ALLOWS FOR TAKING MOST SUITABLE CELL VERSIONS

Область техники, к которой относится данное изобретение
Описанное изобретение обеспечивает способ и устройство для обеспечения возможности отбора живых клеток с увеличенными темпами размножения и конкретными метаболическими свойствами в жидкой или полутвердой среде. В течение процесса отбора (адаптивной эволюции) генетически вариантные организмы (мутанты) возникают в популяции и конкурируют с другими вариантами того же самого происхождения. Варианты с наивысшим темпом размножения увеличиваются по относительной пропорции с течением времени, приводя к популяции (и индивидуальным организмам) с увеличенным темпом размножения. Этот процесс может улучшать производительность организмов, используемых в промышленных процессах или для теоретических целей.
Уровень техники
Отбор на увеличенный темп размножения (т.е. на пригодность) требует поддерживаемого роста, который достигается регулярным разбавлением растущей культуры. В предыдущем уровне техники это выполнялось двумя путями: серийным разведением и непрерывным культивированием, которые различаются прежде всего степенью разведения.
Серийная культура включает в себя повторяемый перенос небольшого объема выращенной культуры в гораздо больший сосуд, содержащий свежую среду для выращивания. Когда культивируемые организмы вырастают до насыщения в этом новом сосуде, этот процесс повторяют. Данный способ использовали для достижения самых продолжительных демонстраций поддерживаемой культуры в литературе (Lenski and Travisano: Dynamics of adaptation and diversication: a 10,000-generation experiment with bacterial populations. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15:6808-14), в экспериментах, которые ясно показали стойкое улучшение темпа размножения на протяжении периода нескольких лет. Этот способ обычно выполняют мануально, со значительным вложением труда, и он подвержен загрязнению вследствие экспонирования наружным условиям среды. Серийная культура является также неэффективной, как описано в следующем абзаце.
Скорость отбора или скорость улучшения темпа размножения зависит от размера популяции (Fisher: The Genetical Theory of Natural Selection. 1930. Oxford University Press, London, UK). Кроме того, в ситуации, подобной серийному переносу, где размер популяции подвергается быстрой флуктуации, отбор пропорционален гармоническому среднему (N) этой популяции (Wright: Size of population and breeding structure in relation to evolution. 1938. Science 87: 430-431), и, следовательно, может быть аппроксимирован с использованием самой низкой популяции во время этого цикла.
Размер популяции может поддерживаться и, следовательно, отбор может быть сделан более эффективным посредством непрерывной культуры. Непрерывная культура, как отличающаяся от серийного разведения, включает в себя меньший относительный объем, так что небольшая часть растущей культуры регулярно заменяется равным объемом свежей среды для выращивания. Этот процесс максимизирует эффективный размер популяции увеличением его минимального размера во время циклического разведения. Устройства, делающие возможной непрерывную культуру, называют «хемостатами», если разведения имеют место при конкретных временных интервалах, и «турбидостатами», если разведение осуществляется автоматически, когда культура вырастает до конкретной плотности.
Для простоты оба типа устройств будут далее объединены под названием «хемостат». Хемостаты были изобретены одновременно двумя группами исследователей в 1950-ых годах (Novick & Szilard: Description of the chemostat. 1950. Science 112: 715-716) и (Monod: La technique de la culture continue - Theorie et applications. 1950. Ann. Inst. Pasteur 79: 390-410). Хемостаты использовали для демонстрации коротких периодов быстрого улучшения темпа размножения (Dykhuizen DE. Chemostats used for studying natural selection and adaptive evolution. 1993. Methods Enzymol. 224:613-31).
Традиционные хемостаты не способны поддерживать продолжительные периоды отбора на увеличенный темп размножения вследствие непреднамеренного отбора устойчивых к разведению (статических) вариантов. Эти варианты способны выдерживать разведение посредством прикрепления к поверхности хемостата и таким образом побеждать в конкуренции менее липких индивидуумов, в том числе тех, которые имеют более высокие темпы размножения, элиминируя таким образом предполагаемую цель этого устройства (Chao & Ramsdell: The effects of wall populations on coexistence of bacteria in the liquid phase of chemostat cultures, 1985. J. Gen. Microbiol. 131: 1229-36).
Один способ и хемостатическое устройство (the Genetic Engine) были изобретены во избежание устойчивости к разведению в непрерывной культуре (Патент США 6686194-В1, поданный PASTEUR INSTITUT [FR] & MUTZEL RUPERT [DE]). Этот способ использует контролируемый клапанами перенос для периодического перемещения культуры между двумя хемостатами, что позволяет стерилизовать и промывать каждый из них между периодами активного роста культуры. Эти регулярные циклы стерилизации предотвращают отбор устойчивых к разведению вариантов посредством их разрушения. Эти способ и устройство решают рассматриваемую задачу, но требуют независимых сложных манипуляций несколькими жидкостями в стерильной (герметизированной) среде, в том числе одной жидкостью (NaOH), которая является едкой и потенциально очень реакционноспособной, быстро разрушающей клапаны и создающей проблемы удерживания и ликвидации отходов.
Сущность изобретения
Таким образом, предметом данного изобретения является обеспечение улучшенного (и полностью независимого) способа и устройства для непрерывной культуры организмов (в том числе бактерий, архебактерий, эукариот и вирусов) без помех, обусловленных устойчивыми к разведению вариантами. Подобно другим хемостатам это устройство обеспечивает средство для регулярного разведения выращенной культуры свежей средой для выращивания и средство для газообмена между этой культурой и наружной окружающей средой, стерильность и автоматическую работу либо в качестве хемостата, либо в качестве турбидостата.
Данное изобретение сконструировано для достижения этой задачи без переноса какой-либо жидкости, включающего в себя функции стерилизации или промывания. Это является специфическим преимуществом данного изобретения относительно предыдущего уровня техники, поскольку это устраняет опасности и трудности, связанные со стерилизацией и промыванием, в том числе с удерживанием и переносами комплексных жидкостей, включающих в себя едкие растворители.
Непрерывная культура достигается в гибком стерильном трубопроводе, заполненном средой для выращивания. Среда и поверхность этой камеры являются статичными относительно друг друга, и оба эти компонента регулярно и одновременно заменяются перистальтическим перемещением этого трубопровода через «ворота» или точки, в которых этот трубопровод стерильно разделяется зажимными приспособлениями (фиксаторами), которые препятствуют перемещению культивируемых организмов между зонами этого трубопровода. Могут быть также добавлены (необязательно) УФ-ворота выше и ниже по потоку от культурального сосуда для дополнительной надежности.
Данные способ и устройство являются также усовершенствованием в сравнении с предыдущим уровнем техники, поскольку они непрерывно, а не периодически, производят отбор против прикрепления устойчивых к разведению вариантов к поверхностям хемостата, так как замена пораженных поверхностей производится в тандеме с процессом разведения.
Этот трубопровод разделяется временно таким образом, что имеются зоны, которые содержат насыщенную (полностью выращенную) культуру, зоны, которые содержат свежую среду, и зону между этими двумя зонами, называемую камерой роста, в которой выращенную культуру смешивают со свежей средой для получения разведения. Эти ворота периодически размыкаются из одной точки на трубке и заменяются при другой точке, так что выращенная культура вместе со связанной с ней поверхностью камеры роста и прикрепленными статическими организмами удаляется из этой камеры роста и заменяется как свежей средой, так и свежей поверхностью камеры. При помощи этого способа статические варианты специфически контр-отбираются удалением из зоны, в которой осуществляется отбор (камеры роста).
Краткое описание графического материала
Неисчерпывающим и неограничивающим образом одна возможная общая конфигурация будет включать в себя несколько компонентов, описанных далее. В дальнейшем, данное изобретение объясняется примерным образом на основе предпочтительного варианта со ссылкой на фигуры, в которых:
Фигура 1 изображает общий вид возможной конфигурации устройства, в котором:
(1) представляет гибкий трубопровод, содержащий различные зоны устройства, которыми являются: свежая среда выше по потоку (7), камера роста (10), камера для взятия проб (11) и зона удаления выращенной культуры (15);
(2) представляет термостатически регулируемый бокс, позволяющий регулировать температуру в соответствии с условиями, определяемыми пользователем, причем в этом боксе могут быть помещены:
a. камера роста (10),
b. камера взятия проб (11),
c. расположенные выше по потоку зажимные приспособления (3), определяющие начало камеры роста (10),
d. расположенные ниже по потоку зажимные приспособления (4), определяющие конец камеры роста (10) и начало камеры для взятия проб (11),
e. вторые расположенные ниже по потоку зажимные приспособления (4), определяющие конец камеры для взятия проб (11),
f. турбидиметр (6), позволяющий пользователю или системе автоматического контроля осуществлять мониторинг оптической плотности растущей культуры и управлять системой контроля по принципу обратной связи (13), делающей возможным перемещение трубопровода (1) на основании плотности культуры (функция турбидостата),
g. одна или несколько мешалок (9).
Следует отметить, что элементы устройства, перечисленные в a-g, могут быть также расположены снаружи термостатического бокса или могут присутствовать в отсутствие термостатического бокса.
(7) представляет свежую среду в неиспользуемом гибком трубопроводе,
(8) представляет бак, загруженный заполненным свежей средой трубопроводом, для распределения свежей среды и трубопровода во время операций,
(12) представляет необязательные ворота ультрафиолетовой радиации,
(13) представляет систему контроля, которая может состоять из компьютера, соединенного со средствами коммуникации с различными интерфейсами мониторинга или операций, такими как турбидиметры оптической плотности, устройства для измерения и регуляции температуры, моторы мешалок и наклонения и т.д., которые делают возможными автоматизацию и регуляцию операций,
(14) представляет необязательный бак удаления отходов, на который наматывается трубопровод, содержащий удаляемый заполненный выращиваемой культурой трубопровод,
(15) представляет удаляемую выращенную культуру, расположенную ниже по потоку от камеры для взятия проб.
Фигура 2 изображает два возможных состояния этого устройства, являющиеся примером того факта, что термостатически регулируемый бокс (2) и другие части устройства, связанные с камерой для культуры, могут быть наклонены до различных степеней для целей перемешивания, для целей циркуляции и удаления газа и для целей гарантирования удаления гранулированных (агрегированных) клеток, которые могут избегать разведения осаждением на дно.
Фигуры 3-9 представляют гибкий трубопровод (1), помещенный в термостатически регулируемом боксе (2) и введенный через зажимные приспособления (3), (4) и (5), посредством которых трубопровод будет останавливаться во время всех стадий процесса и посредством которых трубопровод будет перемещаться в соответствии с его перестальтическим движением.
Фигура 3 изображает символически состояние Т0 устройства, в котором все зоны гибкого трубопровода заполнены свежей средой перед введением организма, предназначенного для непрерывного культивирования.
Фигура 4 изображает символически состояние Т1 гибкого трубопровода непосредственно после введения штамма организма.
Фигура 5 изображает символически состояние Т2 устройства, которое является периодом выращивания, во время которого культура растет в зону, определяемую камерой роста (10), ограниченную зажимными приспособлениями (3) и (4).
Фигура 6 изображает символически состояние Т3 устройства, непосредственно после первого перистальтического перемещения трубопровода и связанной с ним среды, которое определяет начало второго цикла выращивания, введение свежего трубопровода и среды посредством перемещения зажимных приспособлений (3) одновременно с переносом эквивалентного объема трубопровода, среды и выращенной культуры из зоны роста культуры (10) и в зону камеры для взятия проб (11) перемещением зажимных приспособлений (4).
Важно понять, что трубопровод, среда, находящаяся в этом трубопроводе, и любая культура, которая выращивалась в этой среде, - все перемещаются вместе. Перемещение только жидкости имеет место постольку, поскольку свежая среда и выращенная культура смешиваются вместе перемешиванием в зоне камеры роста.
Фигура 7 изображает символически состояние Т4 устройства, которое является вторым циклом выращивания; во время этого цикла организмы, которые остаются в камере роста после перистальтического перемещения трубопровода, могут теперь расти с использованием питательных веществ, обеспечиваемых в свежей среде, которая смешивается с оставшейся культурой во время этой стадии.
Фигура 8 изображает символически состояние Т5 устройства, непосредственно после второго перистальтического перемещения трубопровода и содержащейся в нем среды, которое определяет начало третьего цикла выращивания, введение свежего трубопровода и среды посредством перемещения ворот 3 одновременно с переносом эквивалентного объема трубопровода, среды и выращенной культуры из зоны камеры роста культуры (10) и в зону камеры для взятия проб (11) перемещением зажимных приспособлений (4).
Фигура 9 изображает символически состояние Т6 устройства, которое является третьим циклом выращивания; эта стадия эквивалентна состоянию Т4 и указывает на повторяющийся характер последующих операций. Пробы выбранных организмов могут быть удалены в любое время из зоны камеры для взятия проб (11) с использованием шприца или другого устройства для извлечения.
Фигура 10 изображает возможный профиль зубьев, определяющих зажимные приспособления в конфигурации, которая состоит из двух стыкующихся цепей зубьев, защемляющих гибкий трубопровод. Зажимные приспособления могли бы также определяться прижатием единственной цепи зубьев к перемещаемому ремню, удаляемыми зажимами или другими механизмами, которые препятствуют перемещению организмов через эти зажимные приспособления и которые могут чередующимся образом помещаться и удаляться в различных положениях вдоль трубопровода.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Основная работа устройства изображена на фигурах 3-9.
Одна возможная конфигурация данного устройства показана на фигуре 1, в том виде, какой она является после загрузки свежего трубопровода стерильной средой /показанной в виде среды, разделенной в зонах А-Н зажимными приспособлениями (3), (4) и (5)/.
Инокуляция этого устройства выбранным организмом может достигаться введением организма в камеру роста (фиг.3) посредством инжекции (фигура 4, зона В). Затем этой культуре дают расти до желаемой плотности и начинают непрерывное культивирование (фиг.5).
Непрерывное культивирование происходит повторяемыми перемещениями разделенных зажимными приспособлениями зон трубопровода. Это включает в себя одновременные перемещения ворот, трубопровода, среды и любой культуры в трубопроводе. Трубопровод будет всегда перемещаться в одном и том же направлении; неиспользуемый трубопровод, содержащий свежую среду (далее называемый как находящийся "выше по потоку" от камеры роста (7)), будет перемещаться в камеру роста и смешиваться с остающейся здесь культурой, обеспечивая субстрат для дальнейшего роста содержащихся в ней организмов. Перед введением в зону камеры роста эта среда и связанный с ней трубопровод будут поддерживаться в стерильном состоянии посредством отделения от камеры роста находящимися выше по потоку зажимными приспособлениями (3). Используемый трубопровод, содержащий выращенную культуру, будет одновременно перемещаться "вниз по потоку" и отделяться от камеры роста расположенными "ниже по потоку" зажимными приспособлениями (4).
Конфигурация зажимных приспособлений не является специфическим моментом данной заявки на патент. Например, в конкретной конфигурации, зажимные приспособления могут быть сконструированы посредством одной цепи множественных зубьев, перемещающейся одновременно, или, в другой конфигурации, посредством разделенных, по отдельности синхронизированных цепей, как изображено на фигуре 1. Зажимные приспособления могут состоять из системы, изготовленной из двух цепей зубьев, зажимающих трубопровод стыкующимся образом, как описано на фигуре 10, во избежание загрязнения между зонами G и Н трубопровода, посредством точности внутренней поверхности между этими зубьями. В другой конфигурации стерильные зажимные приспособления могут быть получены прижатием одной цепи зубьев к стороне трубопровода и тем самым прочным прижатием трубопровода к фиксированной ходовой части (шасси), вдоль которой трубопровод скользит во время его перистальтического движения, как изображено на фигурах 3-9, отметки 3, 4 и 5.
Термостатически регулируемый бокс (2) получают с использованием уже известных средств, таких как термометр, связанный с нагревающим или охлаждающим устройством.
Аэрация (газообмен), когда она является необходимой для роста культивируемого организма или в соответствии с планом эксперимента, достигается непосредственно и без механической помощи посредством использования газопроницаемого трубопровода. Например, без ограничения, гибкий газопроницаемый трубопровод может быть изготовлен из силикона. Аэрация может достигаться посредством газообмена с окружающей атмосферой или посредством газообмена с искусственно определенной атмосферой (жидкости или газа), которая находится в контакте с камерой роста или со всем хемостатом. При необходимости использования в эксперименте анаэробиоза этот гибкий трубопровод может быть непроницаемым для газа. Например, без ограничения, гибкий непроницаемый для газа трубопровод может быть изготовлен из силикона или может быть обработан силиконом.
Для анаэробных условий эволюции зоны трубопровода могут быть также заключены в специфической и контролируемой атмосферной зоне для контроля динамики газообмена. Это может быть достигнуто либо выполнением герметизации термостатически регулируемого бокса, чтобы он был непроницаемым для газа, и затем введением в него нейтрального газа, либо помещением всего устройства в помещение с регулируемой атмосферой.
Контр-отбор статических вариантов выполняют заменой поверхности камеры роста вместе со средой для выращивания.
Это устройство дополнительно сконструировано для работы в различных ориентациях относительно силы тяжести, т.е. в наклонных положениях, как показано на фигуре 2, в диапазоне до 360°.
Устойчивые к разведению варианты могут избежать разведения прилипанием друг к другу, а не к стенке камеры, если агрегированные клетки могут осаждаться выше по потоку и посредством этого избегать удаления из этой камеры. Таким образом, желательно, чтобы трубопровод был обычно наклонен книзу, так что агрегированные клетки будут опускаться в направлении зоны, которая будет удаляться из камеры роста во время цикла перемещения трубопровода. Эта конфигурация включает в себя наклон этого устройства таким образом, что ворота, расположенные ниже по потоку, находятся ниже зажимных приспособлений, расположенных выше по потоку, относительно силы тяжести.
Камера для выращивания может иметь пониженное давление или избыточное давление в соответствии с условиями, выбранными экспериментатором. Могут быть использованы различные пути коррекции давления. Например, приложение вакуума или сжатого воздуха к свежей среде и трубопроводу через его лежащий выше по потоку конец и через камеру роста; другой путь снижения давления или повышения давления трубопровода может быть выполнен чередующимся сжиманием или запиранием трубопровода выше по потоку от камеры роста.
Когда среда содержится в газопроницаемом трубопроводе, в этой среде могут образовываться пузырьки воздуха. Они будут подниматься к верхней части закрытой герметически зоны трубопровода и становиться захваченными там, пока перемещение этой зоны (и определяющих ее ворот) не высвободит эту зону либо в камеру роста, камеру для взятия проб или конечную точку хемостата (фигуры 6, зоны D-C, В или А соответственно). Если устройство наклонено книзу, такие пузырьки будут накапливаться в камере роста или камере для взятия проб и вытеснять культуру. Это устройство сконструировано для периодического наклона вверх в течение цикла перемещения трубопровода, что позволяет удалять накопленный газ из указанных камер.
Наклонные перемещения этого устройства и/или встряхивание камеры роста посредством наружного устройства (9) могут быть использованы для уменьшения агрегации клеток в камере роста. Альтернативно, один или несколько перемешивающих стержней могут быть включены в трубопровод, заполненный свежей средой, перед стерилизацией и перемешиваться под действием магнитного поля во время операций с культурой.
Пропорциональная длина зон свежей среды, определяемых расположенными выше по потоку воротами, в сравнении с длиной культуральной камеры будет определять степень разведения, достигаемую во время цикла.
Частота разведения может быть определена либо таймингом (функция хемостата), либо регуляцией по типу обратной связи, посредством которой плотность культуры в камере роста измеряют турбидиметром (фигура 1 - пометка 6), и цикл разведения происходит, когда мутность достигает пороговой величины (функция термостата).
Камера для взятия проб делает возможным извлечение выращенной культуры для анализа результата эксперимента, сбора организмов с улучшенной скоростью роста для дальнейшего культивирования, хранения или функционального использования или для других целей, таких как счет популяции, проверка химического состава среды или определение pH выращенной культуры. Для достижения перманентного мониторинга pH внутри камеры роста трубопровод может включать в себя посредством конструирования линию индикатора pH, заделанную/инкрустированную в стенке трубопровода.
Любая форма жидкого или полутвердого материала может быть использована в качестве среды для выращивания в данном устройстве. Способность использования полутвердых субстратов для выращивания является значительным прогрессом в сравнении с предыдущим уровнем техники. Среда для выращивания, которая будет определять метаболические процессы, улучшенные способом отбора, может быть выбрана и задана пользователем.
Если необходимо, это устройство может содержать множественные камеры роста, так что зажимные приспособления, расположенные ниже по ходу потока от камеры роста, становятся зажимными приспособлениями, расположенными выше по ходу потока для другой камеры роста. Это могло бы, например, позволить выращивание одного организма отдельно в первой камере, и затем использовать его в качестве источника питания для второго организма (или вируса) во второй камере.
Эти устройство и способ позволяют исследователям и разработчикам продукта выполнять эволюцию любого штамма культивируемых живых клеток в суспензии посредством поддерживаемого роста (непрерывной культуры); полученный улучшенный организм может быть новым штаммом или видом. Эти новые организмы могут быть идентифицированы посредством мутаций, приобретенных в ходе культивирования, и эти мутации могут обеспечить возможность отличия этих новых организмов от характеристик генотипа их предшественников. Данные устройство и способ позволяют исследователю отбирать новые штаммы любого живого организма посредством расщепления индивидуумов с улучшенными темпами размножения посредством процесса природного отбора.