СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОГЛИКАНА
METHOD FOR OBTAINING PROTEOGLYCAN

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для препаративного выделения из мочи протеогликанов и гликозаминогликанов (ГАГ) для биотехнологических исследований, а также в качестве фармацевтической субстанции в медицине и ветеринарии, лекарственных средств и профилактических материалов, например глазных капель, гелевых суспензий и т.д., или в составе других изделий медицинского назначения, в сельском хозяйстве и ветеринарии для промышленного получения протеогликанов и гликозаминогликанов из мочи животных. Цель изобретения - повышение степени очистки целевого продукта за счет более полного отделения примесей.
Протеогликан - это общее название, относящееся к гликопротеину с очень сложными и разнообразными типами структуры, и обычно состоящему из одного корового белка с несколькими десятками ковалентно присоединенных линейных полисахаридных цепей (2, 10). Протеогликан является комплексным соединением, однако поскольку соединение полисахаридной цепи и корового белка имеет слабую силу связывания, они имеют тенденцию к легкому отделению друг от друга. По этой причине выделение или очистка протеогликана являются чрезвычайно тонким процессом, требующим максимально щадящего проведения отделения на всех этапах. Это требование подразумевает максимальное исключение процедур, повреждающих структуру протеогликана, в частности высокоскоростного центрифугирования, а также фильтрации через мелкопористый фильтр, не говоря уже об ультрафильтрации и ультрацентрифугировании. Таким образом, обычные способы не подходят для выделения протеогликана из-за сложных или ручных действий и т.д.
Протеогликаны и гликозаминогликаны привлекают внимание в свете многочисленных полезных свойств, включающих хорошую биосовместимость, выраженных коллоидных свойств, способствующих удержанию воды и стабилизации онкотического давления, а также смазывающих свойств, пригодных к использованию для кожи и поверхностных ран (9).
Протеогликаны в биологических средах представляют собой супрамолекулярные образования, которые характеризуются пространственным расположением своих компонентов, их архитектурой, «супраструктурой», а также типами межмолекулярных взаимодействий, удерживающих компоненты вместе.
В настоящее время разработано множество способов для эффективного получения и приготовления протеогликанов из природных источников. Однако практически все из них предполагают использование биологического сырья, полученного из тканей животных или рыб и моллюсков, имеющих низкую биосовместимость для человека, и требуют высокую степень очистки. Хрящевая ткань содержит протеогликан в комплексной форме с белком. При этом выделение протеогликана без каких-либо изменений часто затруднено из-за сложной структуры гликопротеинового комплекса. По этой причине обычно использовали способ выделения только хондроитинсульфата после полного разрушения части корового белка гликопротеина.
Между тем также были попытки получения, приготовления и использования собственно протеогликана вместо хондроитинсульфата. Установлено, что в хрящевой ткани рыбы, птицы и млекопитающего содержится протеогликан с хондроитинсульфатом в качестве основной полисахаридной цепи. Более того, в свете факта, что хрящевая ткань обычно выбрасывается как отходы, было предложено несколько способов получения протеогликана из хрящевой ткани, также в качестве эффективного пути использования промышленных отходов.
Например, сообщалось о способах выделения протеогликана из хрящей носа лосося с использованием гуанидиний гидрохлорида (Выложенная заявка на патент Японии №2001-172296 и с использованием уксусной кислоты (JP-A №2002-69097 (8)). Однако, к сожалению, нельзя сказать, что такие традиционные способы достигают уровня коммерческой применимости, так как стоимость выделения и очистки весьма высока, не говоря уже об ограничении их применения в качестве лечебных препаратов для парентерального введения.
+
Известен способ получения протеогликанов «Способ получения агрегатов протеогликанов из соединительной ткани животного», RU 2096038 (9), заключающийся в том, что первоначально для полного удаления солей в исходном препарате проводят диализ, освобождаются от растворимого коллагена и неагрегированных протеоглигликанов путем их осаждения лимонной кислотой, далее проводят диализ до полного удаления кислоты, полученный раствор обрабатывают Н- формой катионита для получения кислой формы агрегатов протеогликанов, далее солевой формой катионита для получения кислой солевой формы агрегат протеогликанов, которую затем обрабатывают не менее чем двойным объем 96°С этанола, насыщенного ацетатом металла, для осаждения основной формы агрегатов протеогликанов, с последующей промывкой и сушкой осадка этиловым спиртом и эфиром, при этом кисло-солевая и основная - солевая формы агрегатов протеогликанов могут быть лиофилизированы.
Недостатками способа являются:
1. Многоэтапность процесса получения протеогликана - не менее 12 этапов.
2. Длительность всего процесса получения протеогликана - более 50 часов.
3. Множественность различных сложных процедур способа: экстракция, диализ, дополнительные процедуры применения этанола и эфира, обработки катионообменной смолой.
4. Длительность этапа диализа для удаления солей, длительность второго этапа диализа для удаления лимонной кислоты.
5. Применение исходного сырья из тканей животных.
6. Применения разнообразных опасных для парентерального применения реактивов. В частности, по настоящему изобретению обязательно должны быть добавлены реактивы, не содержащиеся в биологических тканях. Поскольку многие из этих реактивов сами по себе вредны для человека, их использование нежелательно для производства протеогликана в качестве сырья для медицинских препаратов и пищевых продуктов.
Напротив, согласно настоящему изобретению такие реактивы не требуются и вышеупомянутых проблем можно избежать.
Наиболее близким по достигаемому эффекту является «Способ выделения гликозаминогликанов из мочи», патент SU 1556678, автор Косягин Д.В. (7), который осуществляется использованием 96° этанола. Способ предусматривает предварительную коррекцию кислотно-щелочного состояния мочи, доводя до значения рН 6,0-6,5, при котором происходит максимальное осаждение гликозаминогликанов. После этого 1 объем мочи смешивают с 1,6 объемами 96° этанола и оставляют при температуре +4°C на срок не менее 6 часов для образования осадка. Сформировавшийся хлопьевидный осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяют в 1-3 М водном растворе хлористого натрия, гликозаминогликаны переходят в раствор. Для большего выхода целевого продукта полученный раствор подвергают вторичному осаждению. Для этого к 1 объему центрифугата или фильтрата, содержащего гликозаминогликаны, прибавляют 1,6 объема 96° этанола, смешивают и оставляют не менее чем на 6 часов при температуре +4°С для формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Растворение осадка проводят 2М раствором NaCl. Нерастворившиеся частицы удаляют с помощью центрифугирования или фильтрования через среднепористый фильтр.
По мнению автора способ позволяет повысить на 10-15 раз выход гликозаминогликанов и обеспечивает упрощение и ускорение их выделения. Предлагается использовать предложенный способ как диагностический тест для косвенной оценки степени тяжести повреждения соединительной ткани при различных заболеваниях. Для этого в осадке определяют качественный состав или количественное содержание гликозаминогликанов по концентрации уроновых кислот карбазоловым методом.
Следует обратить внимание на методологические ошибки рассмотренного выше изобретения. Прежде всего, описанный автором способ получения гликозаминогликанов на самом деле является способом получения протеогликанов. Это замечание основывается на общеизвестных сведениях о структуре протеогликанов. Практически все гликозаминогликаны ковалентно связаны с белком в молекуле протеогликанов (2, 10). Поэтому для реального выделения гликозаминогликанов необходима дополнительная многоэтапная процедура разрушения протеогликана и отделение гликозаминогликанов от корового белка, которая не предусмотрена в предлагаемом способе, а это предполагает, как минимум, дополнительно еще 3-4 этапа (11). Существенными недостатками указанного способа являются низкая степень очистки целевого продукта и высокая степень сопутствующих соединений: солей, фосфолипидов, и белков. Эти выводы основаны на неизбирательном действии этанола как осадителя и проявляются в следующем:
1. Фосфолипиды и липопротеиды также выделяются способом с применением 96° этанола (1, 5, 6), поэтому выпавший осадок содержит и фосфолипиды, и липопротеиды.
2. Для осаждения белков традиционно используется 96° этанол на холоду (13), поэтому выпавший осадок содержит белки.
3. Выпавший осадок содержит соли, поскольку не предусмотрена процедура предварительного или последующего удаления мочевых солей.
4. Выпавший осадок содержит форменные элементы мочи - лейкоциты, эритроциты, содержит макрокомпоненты мочи - гиалиновые цилиндры, бактериальные клетки и их фрагменты, поскольку не предусмотрена процедура их предварительного удаления.
Указанные недостатки не позволяют достигнуть реально заявляемой цели или существенно уменьшают эффективность предложенного этим автором способа.
Предлагаемый способ позволяет устранить указанные недостатки. В известной нам научно-технической и патентной литературе не обнаружены способы с подобной совокупностью признаков. Полученный результат, обусловленный совокупностью этих признаков, не достигался в известных решениях.
Целью предлагаемого нами решения является создание простого в реализации и эффективного способа получения протеогликанов из биосовместимого и практически неограниченного, постоянно доступного исходного сырья - мочи, основанного на применении физического принципа охлаждения, конкретно, предварительного охлаждения исходного продукта с целью предварительного удаления подавляющей массы основных нежелательных компонентов мочи с последующим использованием на выбор неограниченного числа осадителей.
Техническим результатом, достигаемым при использовании предложенного способа, является получение высокоочищенного протеогликана, который может широко использоваться для получения фармацевтических субстанций и препаратов, а также целого ряда изделий медицинского назначения. Технический результат достигается тем, что в предложенном способе получения протеогликана мочу предварительно охлаждают до -1°C, выдерживают до образования и выпадения агрегатов, содержащих соли, денатурированные белки, липиды, клеточные компоненты мочи, а также слизь и бактерии, и после отделения последних используют надосадочную жидкость, содержащую протеогликан для его получения путем применения этилового спирта в растворе 0,01 N гидроксида натрия, осаждения протеогликана, отмывания осадка для его очистки, растворения и нейтрализации обработкой раствором 0,01 N HCl, отделением незначительного нерастворимого осадка, который используют по назначению.
Ранее, в проведенных нами исследованиях было неожиданно установлено, что охлаждение мочи до температуры 0°C – -2°C способствует выпадению агрегатов, которые состоят из солей и белков. Это процесс получил термин «криоагрегация». На фиг. 1 показаны результаты применения способа с предварительным охлаждением мочи (без химических реактивов): 1, 2 - исходная моча до обработки, 3 - осадок мочевых солей, денатурированных белков, некоторых нативных белков после предварительной криоагрегации, 4 - осадок протеогликана и надосадочная жидкость после применения осадителя протеогликана.
Криоагрегация мочи проводилась в двух режимах:
1. Стационарном - порция мочи 500 мл - до 3 часов.
2. Проточном - до 50 мин 500 мл, при скорости обработки 20 мл/мин.
Действующий, опытный образец аппарата для криоагрегации мочи в проточном режиме изготовлен и испытан.
На фиг. 2 показаны результаты процесса криоагрегации. Использован стационарный (прерывистый) режим охлаждения (до 30 мин). Вверху надосадочная жидкость с протеогликаном. Внизу осадок мочевых солей, денатурированных белков, части нативных белков.
Солевой состав осадка после криоагрегации представлен преимущественно оксалатами, в среднем до 80% от общего количества солей. Утраты составляют до 10% солевого состава криоагрегатов. При этом солевой состав варьирует в зависимости от индивидуальных особенностей, времени забора мочи и диетических особенностей питания. Подавляющая масса белкового состава криоагрегатов представлена денатурированными белками, которые чувствительны к температурному воздействию. Конкретно, при снижении температуры, в интервале 10°С-0°С прозрачность прогрессивно снижается, прежде всего за счет потери растворимости денатурированных белков с последующем выпадением осадка. Эти данные представлены на фиг. 3, где показана динамика изменения прозрачности мочи в процессе проточного охлаждения. В определенной степени это напоминает процесс криополимеризации плазмы крови, однако факторы, инициирующие криополимеризацию плазмы, в моче отсутствуют. В связи с этим, можно сделать вывод об участии принципиально иных механизмов в процессе криоагрегации мочи. Важно отметить, что в процесс криоагрегации не вовлекаются протеогликаны, которые остаются в надосадочной жидкости и могут быть в дальнейшем выделены с существенно большей степенью чистоты.
После криоагрегации отмечено полное исчезновение надмолекулярных соединений. Результаты исследований представлены в табл. 1.
Как видно в табл. 1, содержание надмолекулярных соединений после криоагрегации снижается до не регистрируемых величин. Эти данные подтверждают избирательное влияние криоагрегации как на надмолекулярные компоненты мочи, такие как эритроциты, лейкоциты, гиалиновые цилиндры, бактериальные клетки, так и крупные агрегаты и крупнополимерные белковые образования.
На представленных фиг. 1-2 видно, что криоагрегация вызывает выраженные изменения физико-химических свойств мочи, которые способствуют выпадению подавляющей массы солей. Результаты изменения солевого состава до и после криоагрегации показывают практически 20-кратное уменьшение содержания солей. Эти данные представлены в табл. 2.
После криоагрегации существенно изменяется состав и соотношение компонентов надосадочной жидкости. Это обусловлено тем, что протеогликаны не вовлекаются в процесс криоагрегации и устойчивы к охлаждению во всем диапазоне применяемых в заявляемом способе температур. Напротив, процесс криоагрегации сопровождается выпадением в осадок подавляющего количества белковых агрегатов и полипептидов, липопротеидов высокой и низкой плотности, фосфолипидов. Результаты этих исследований представлены в табл. 3.
Условные обозначения.
1. РФМК - растворимые фибрин-мономерные комплексы.
2. Общий белок по Лоури.
3. ЛПВП - липопротеиды высокой плотности.
4. ЛПНП - липопротеиды низкой плотности,
5. Определение фосфолипидов. Прямой ферментативный колориметрический тест. Набор производство "Sentinel". После криоагрегации концентрация фосфолипидов снижалась практически в 4 раза. Более существенно, в 4-15 раз, снижалось содержание ЛПВП и ЛПНП. Содержание РФМК после криоагрегации снижалось до нерегистрируемых величин. Это указывает на вовлеченность этих компонентов в этот процесс.
Нами неожиданно установлено, что скорость образования преципитата протеогликана в надосадочной жидкости, полученной после предварительной криоагрегации мочи, многократно возрастала, если в качестве осадителя использовался щелочной раствор этанола. На примере применения раствора щелочного металла, конкретно гидроксида натрия, установлено, что максимальный эффект скорости осаждения при сохранении режима охлаждения при 0°С достигается при использовании состава растворителя в соотношении 4 объема спирта и 1 объем раствора гидроксида натрия. При этом было установлено, что оптимальная концентрация спирта в этом составе находится в пределах от 70 об.% до 80 об.%, предпочтительно, 75 об.%. Одновременно с этим установлено, что оптимальная концентрация, обеспечивающая максимальный эффект, наблюдается при использовании его в концентрации от 0,05N до 0,015N раствора, предпочтительно, 0,01N раствора. Установленные предпочтительные показатели состава осадителя в дальнейшем использовали для реализации предлагаемого способа. Процесс образования агрегатов после добавления растворителя оценивали на основании изменения динамики образования агрегатов с помощью анализатора лазерной агрегации БИОЛА (Россия). На фиг.4 видно, что начало образования агрегатов в надосадочной жидкости наблюдается практически сразу после добавления осадителя. При этом максимальный пик этого процесса отмечается в интервале 2-10 мин, после чего прогрессивно снижается и практически прекращается к 20 мин. В связи с этим оптимальный период экспозиции надосадочной жидкости после добавления осадителя в заявляемом способе ограничивался в интервале от 10 мин до 20 мин, предпочтительно 15 мин. За это время надосадочная жидкость освобождается от агрегатов, прозрачность ее восстанавливается до исходных значений, которые определялись перед добавлением осадителя. Способ реализуется следующим образом. Моча, полученная ex tempore, но не более чем в течение часа, проходит предварительную обработку, путем охлаждения в течение не менее 20 мин и не более 40 мин, предпочтительно 30 мин, при 0°C – -2°C, предпочтительно при -1°C, до образования агрегатов и начала выпадения осадка солей, липопротеидов, фосфолипидов и белков, макрокомпонентов мочи - клеток крови, гиалиновых цилиндров, бактерий, слизи с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение не менее 8 минут и не более 12 минут, предпочтительно 10 минут, при 0°C – -2°C, предпочтительно при -1°C. Не прекращая режим охлаждения, надосадочную жидкость отделяют и используют для дальнейшего выделения протеогликанов. Для этого надосадочную жидкость смешивают с осадителем соотношении 1:1. Для этого используется состав осадителя в соотношении 4 объема 96° этилового спирта и 1 объем 0,01 N раствора гидроксида натрия. После добавления растворителя смесь оставляют, не изменяя температурный режим, на 20 мин для образования агрегатов, которые отделяют центрифугированием при 1000 об/мин в течение не менее 1 мин и не более 3 мин, предпочтительно 2 мин, при 0°C – -2°C, предпочтительно -1°C, а затем осадок протеогликана отделяют от надосадочной жидкости в режиме охлаждения при 0°C, центрифугированием при 1000 об/мин в течение 2 мин. Осадок отмывали повторным добавлением охлажденного до 0°C осадителя в соотношении 1:10, выдерживали в течение 5 мин для образования агрегатов, вновь центрифугировали при 1000 об/мин в течение 2 мин, отделяли надосадочную жидкость, а полученную гелевую форму осадка растворяли и одновременно проводили нейтрализацию добавлением 0,01 N раствора HCl, снижая значения pH конечного продукта в интервале от pH 6,8 до 7,4, предпочтительно pH 7,2. Время этапа растворения составляло не менее 1 мин и не более 3 мин, предпочтительно 2 мин.
Оставшийся незначительный нерастворимый осадок отделяют центрифугированием при 1000 об/мин в течение не менее 1 мин и не более 3 мин, предпочтительно 2 мин, при 18°С- 22°С, предпочтительно 20°С, а надосадочную жидкость, содержащую протеогликан, используют по назначению.
С применением предлагаемого способа из 1 литра исходной мочи, полученной от разных доноров, удалось выделить 94,7 г сырого осадка протеогликана. Общее содержание гликозаминогликана, определенного по уровню уроновых кислот карбазоловым методом, составило 399 мг/л, а по методу Greiling Н., (14) с резохином составило 459 мг/л. Определение содержания гликозаминогликанов в моче в модификации метода Greiling Н. основано на взаимодействии гликозаминогликанов с резохином, при этом образуются преципитаты, вызывающие помутнение пробы, степень которой оценивали нефелометрически.
Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-4 при длине волны 400 нм, синий светофильтр, в кювете с длиной оптического слоя 1 см.
Эти результаты представлены в таблице 4.
Более высокие показатели в последнем случае могут объясняться меньшей чувствительностью пробы с резохином и большим разбросом показателей из-за влияния других компонентов мочи на ход реакции. Полученный осадок растворялся в 0,01 М растворе HCl в соотношении 1:10, после чего проба концентрировалась и использовалась для определения доли сухого вещества в растворе. Для этого проба концентрата сушилась в сушильном шкафу при 100°С в течение 18 часов для полного удаления влаги. Тонкое взвешивание оставшегося сухого остатка проводилось на цифровых весах (GF-400, фирма "A&D Corp."). В итоге из 94,7 г сырого концентрата после сушки было получено 6,167 г сухого вещества, что составляет в процентном соотношении 6,5%.
Идентификацию протеогликанов осуществляли аналитическими методами по содержанию в них гексуроновых кислот (13), аминосахара (3), сульфатных групп (4), белкового компонента (по Лоури). Результаты этих исследований представлены в табл. 4, 5.
Электрофорез на ацетат целлюлозных мембранах по Gold, 1981 (в модификации Пауль, Русова, 1995) показал высокую степень очистки протеогликана, полученного заявляемым способом, от сопутствующих нежелательных белковых компонентов, что видно на фиг. 5. Позиция 1-4 – нет окрашивания. Белковые фракции не выявлены. Позиция 5 - нативный человеческий альбумин. Позиция 6 - нативный человеческий гемоглобин. Окраска PONS О red. Структура преципитата протеогликана после криоагрегации изменялась. На фиг. 6, позиция 2, показано, что конечный продукт, полученный заявляемым способом (с применением предварительной криоагрегации), состоит из, преимущественно, мелко- и среднедисперсных частиц, более прозрачен, меньше насыщен примесями. На позиции 1 показан конечный продукт, полученный известным способом. Эти признаки доказывают большую степень очистки конечного продукта предложенным способом. Дополнительные сведения, доказывающие эффективность предлагаемого способа, представлены в таблице 6.
В раскрытом выше способе получения протеогликана этап охлаждения (криоагрегации) и отделение криоосадка является базовым. При этом способ включает, по меньшей мере, два последующих основных этапа, а именно: осаждение протеогликана осадителем и отмывка осадка. В этой связи важно обратить внимание на то, что применение этанола, как осадителя, не является обязательным и предполагает использование любого другого осадителя, который обеспечивает аналогичный допустимый эффект.
Технический результат предложенного способа, имеющий существенные преимущества перед уже известными, заключается в следующем:
1. Способ позволяет применить физический принцип охлаждения, который обеспечивает возможность предварительного удаления подавляющего количества нежелательных компонентов: липопротеидов, фосфолипидов, денатурированных белков и их дериватов, а также мочевых солей в исходной моче, что существенно повышает степень очистки конечного продукта в 10-15 раз, а также расширяет выбор и применение любых приемлемых осадителей или их комбинации.
2. Способ позволяет исключить повторный этап переосаждения целевого продукта.
3. Способ позволяет исключить дополнительную процедуру диализа конечного продукта.
4. Способ позволяет существенно ускорить получение целевого продукта, конкретно, более чем в 11 раз, снизить время его получения с 13 часов, как у известного способа, до 70 минут.
5. Способ позволяет осуществить препаративное выделение очищенных протеогликанов для биотехнологического производства и дальнейшего получения высокоочищенных гликозаминогликанов, а также для биохимических исследований.
6. Способ можно использовать в клинической диагностике для оценки состояния организма при патологических состояниях различной этиологии, путем количественного определения протеогликанов, выделенных из мочи.
7. Способ позволяет исключить использование опасных химических реактивов, а также их отсутствие на выходе в конечном продукте.
8. Способ приводит к снижению антигенности конечного продукта, поскольку за счет повышения степени очистки значительно уменьшается количество примесей белка, фосфолипидов по сравнению с выбранным прототипом.
9. Конечный целевой продукт имеет высокую биосовместимость, что позволит резко снизить число осложнений при его использовании в виде лекарственного средства или в составе изделий медицинского назначения.
10. Способ прост в исполнении, безопасен, количество этапов минимально, а для его реализации не требуется дорогостоящего оборудования. Все реактивы для его применения полностью доступны и максимально дешевые.
Настоящее изобретение промышленно применимо, освоено в лабораторных условиях, результаты которых показывают практическую ценность полученной фармацевтической субстанции для применения в медицине и ветеринарии в качестве лекарственных средств и профилактических материалов, например глазных капель, гелевых суспензий и т.д., или в составе других изделий медицинского назначения.
Примеры реализации способа.
Пример 1. Для получения протеогликана в количествах, необходимых для биотехнологических исследований, использовали утреннюю мочу здорового человека в количестве 300 мл, которую получали ex tempore, помещали в охладитель, где охлаждали до -2°С, выдерживали до выпадения осадка, после чего центрифугировали при -2°С при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отделяли, не прекращая режим охлаждения, добавляли к ней охлажденный до 0°С осадитель в соотношении 1:1, состав которого включал 0,01N раствор гидроксида натрия и 96° этанол до конечной концентрации 75 об.%, после чего экспонировали при 0°С в течение 15 мин. Осадок отделяли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 2 мин при 0°С, после чего отмывали от остатков надосадочной жидкости повторным добавлением раствора осадителя в соотношении 1:10, осторожно размешивали и экспонировали в течение 5 мин для образования агрегатов, а затем центрифугировали при 1000 об/мин в течение 2 мин. Осадок отделяли от надосадочной жидкости, а полученную гелевую форму осадка растворяли добавлением 0,01N раствора HCl, снижая значения pH конечного продукта до pH 7.2.
Оставшийся незначительный нерастворимый осадок отделяли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 2 мин, при 20°С, а надосадочную жидкость, содержащую протеогликан, использовали по назначению.
В полученном растворе определяли содержание протеогликанов (уроновых кислот) карбазоловым методом, которое составило 46 мг на 100 мл исходной мочи.
Проба полученного концентрата - гелевая форма была использована для определения в ней доли сухого вещества. Проба концентрата сушилась в сушильном шкафу при 105°С в течение 24 часов для полного удаления влаги. Установлено, что из 50 г стартового материала было получено 2,78 г сухого вещества, что соответствует 5,56% стартового материала в пересчете на процентное содержание. В результате анализа сухого остатка установлено следующее: содержание белка - 6,1%, зольных компонентов - 27,3%, углеводов - 66%, липидов - 0,6%. На основании сопоставления количественного содержания углеводов, определенных в этом образце, конкретно 66%, можно считать степень чистоты протеогликана, полученного предлагаемым способом, в пределах 80%.
Пример 2. Для получения протеогликана в количествах, необходимых для биотехнологических исследований, использовали мочу здорового человека в количестве 300 мл, которую получали ex tempore, пропускали в проточном охладителе со скоростью 20 мл в мин, где моча охлаждалась до -1°С, с образованием криоагрегатов на выходе из охладителя, после чего центрифугировали при -2°С при 3000 об/мин в течение 10 мин. Не прекращая режим охлаждения, надосадочную жидкость отделяли и использовали для последующего выделения протеогликанов. Для этого к ней добавляли охлажденный до 0°С осадитель в соотношении 1:1, состав которого включал 0,01N раствор гидроксида натрия и 96° этанол до конечной концентрации 75 об.%, после чего экспонировали при 0°С в течение 15 мин. Осадок отделяли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 2 мин при 0°С, после чего отмывали от остатков надосадочной жидкости добавлением раствора осадителя в соотношении 1:10, осторожно размешивали и экспонировали в течение 5 мин для образования агрегатов, а затем центрифугировали при 1000 об/мин в течение 2 мин. Осадок отделяли от надосадочной жидкости, а полученную гелевую форму осадка растворяли добавлением 0,01N раствора HCl, снижая значения pH конечного продукта до pH 7,4.
Оставшийся незначительный нерастворимый осадок отделяли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 2 мин, при 20°С, а надосадочную жидкость, содержащую протеогликан, использовали по назначению.
В полученном растворе определяли содержание протеогликанов (уроновых кислот) карбазоловым методом, которое составило 71 мг на 100 мл исходной мочи.
Проба полученного концентрата - гелевая форма была использована для определения в ней доли сухого вещества. Проба концентрата сушилась в сушильном шкафу при 105°С в течение 24 часов для полного удаления влаги. Установлено, что из 44 г стартового материала было получено 7,34 г сухого вещества, что соответствует 8,45% стартового материала в пересчете на процентное содержание. В результате анализа сухого остатка установлено следующее: содержание белка - 5,8%, зольных компонентов - 19,9%, углеводов - 74%, липидов - 0,1%. На основании сопоставления количественного содержания углеводов, определенных в этом образце, конкретно 74%, можно в сопоставлении считать степень чистоты протеогликана, полученного предлагаемым способом в пределах 90%.
Пример 3. Практически здоровый человек, 42 года. Проведено получение мочи предлагаемым способом. 300 мл утренней мочи поместили в охладитель, где охлаждали до -2°С, выдерживали 15 мин до появления агрегатов и начала выпадения осадка, после чего центрифугировали при -2°С при 3000 об/мин в течение 10 мин. Не прекращая режим охлаждения, к надосадочной жидкости добавляли охлажденный до 0°С осадитель в соотношении 1:1, состав которого включал 0,01N раствор гидроксида натрия и 96° этанол до конечной концентрации 75 об.%, после чего экспонировали при 0°С в течение 15 мин. Осадок отделяли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 2 мин при 0°С, после чего отмывали от остатков надосадочной жидкости добавлением раствора осадителя в соотношении 1:10, осторожно размешивали и экспонировали в течение 5 мин для образования агрегатов, а затем центрифугировали при 1000 об/мин в течение 2 мин. Осадок отделяли от надосадочной жидкости, а полученную гелевую форму осадка растворяли добавлением 0,01N раствора HCl, снижая значения pH конечного продукта до pH 7,0.
Оставшийся незначительный нерастворимый осадок отделяли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 2 мин, при 20°С, а надосадочную жидкость, содержащую протеогликан, использовали по назначению. В полученном растворе определяли содержание протеогликанов (уроновых кислот) карбазоловым методом, которое составило 48 мг на 100 мл исходной мочи.
Проба полученного концентрата - гелевая форма была использована для определения в ней доли сухого вещества. Проба концентрата сушилась в сушильном шкафу при 105°С в течение 24 часов для полного удаления влаги. Установлено, что из 36 г стартового материала было получено 2,79 г сухого вещества, что соответствует 7,75% стартового материала в пересчете на процентное содержание. В результате анализа сухого остатка установлено следующее: содержание белка - 6,8%, зольных компонентов - 24,9%, углеводов - 68%, липидов - 0,3%. На основании сопоставления количественного содержания углеводов, определенных в этом образце, конкретно 68%, можно в сопоставлении считать степень чистоты протеогликана, полученного предлагаемым способом в пределах 84%.
Список использованной литературы
1. Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В., Молотковский Ю.Г. и др. Препаративная биохимия липидов. М.: Наука, 1981, 259 с.
2. Биохимия: Учеб. для вузов. Под ред. Е.С. Северина., 2003, стр. 707-712. ISBN 5-9231-0254-4.
3. Бычков С.М., Колесникова М.Ф. Биохимия, 1966, т.31, с. 533.
4. Бычков С.М., Фомина В.А. Т.6, 1960, с. 528.
5. Ефременко В.И., Оверченко В.В., Мисетова Е.Н., Савельева И.В., Таран Т.В., Кузякова Л.М., Ефременко Д.В. Способ получения комплекса фосфолипидов. Авт.св. СССР 1080825, A61K 37/22, опубл. 23.03.84. Бюл. 32.
6. Ефременко В.И., Оверченко В.В., Мисетова Е.Н., Савельева И.В., Таран Т.В., Кузякова Л.М., Ефременко Д.В. Способ получения комплекса фосфолипидов. Авт.св. СССР 1175486, A61K 37/22, опубл. 30.08.85. Бюл. 32.
7. Д.В. Косягин. Способ выделения гликозаминогликанов из мочи. SU 1556678 (51)5 A61K 31/70, G01N 33/50.
8. Й. Кудой. Способ получения протеогликана. RU 24011839 от 14.02.2006.
9. Кузьмина С.А.; Бычков С.М.; Маклакова И.А.; Багров С.Н. Способ получения агрегатов протеогликанов из соединительной ткани животного. Патент RU 2096038, дата публикации 20.11.1997.
10. Ленинджер А. Основы биохимии: в 3-х т. Т. 2. Пер. с англ. - М.: Мир, 1985. Глава: Гликопротеины и протеогликаны. Р. Марри, стр. 307-308.
11. Д.А. Саващук., Панасюк А.Ф. Способ получения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей. RU 2304441 С1, 27.10.2005.
12. T. Bitter, Н.М. Muir. Anal. Biochem. V.4, 1962, р.330.
13. Cohn Е., Strong L.E., Hughes W.L. et.al. Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV. A system for the separation into fraction of the proteins and lipoprotein components of biological tissues and fluids. J.Am.Chem.Soc. 1946. 68.459.
14. Greiling, H. Die turbdimetrische Bestimmung von Sulfbmucopolysacchariden mit Resochin. // Rheumafbrsch Z. - 1961. - Bd. 20. - S. 17.