Выделение измененных форм микобактерий

ВЫДЕЛЕНИЕ ИЗМЕНЕННЫХ ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ А.М. Коваленко, Е.В. Тарасова

Аннотация. Представлены результаты исследований по выделению микобактерий из патологического материала от крупного рогатого скота, реагировавших на туберкулин, а также результаты выделения Ь-форм микобактерий из патологического материала по моди-

фицированному методу и изучение реверсии у выделенных культур в Ь-форме микобактерий.

Ключевые слова: патологический материал, Ь-

формы микобактерий, методы выделения.

Современные животноводческие предприятия могут быть рентабельными только в том случае, если они укомплектованы стадами здоровых и высокопродуктивных животных. Поэтому одной из важных задач ветеринарной науки и практики является полное оздоровление животноводства от инфекционных болезней, и в частности от туберкулеза, который причиняет большие экономические потери отрасли животноводства и представляет большую опасность для здоровья людей.

Одним из основных методов прижизненной диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота является внутрикожная туберкулиновая проба, по результатам которой оценивают эпизоотическую ситуацию по этому заболеванию.

Вместе с тем необходимо отметить, что в последние годы в благополучных по туберкулезу хозяйствах выделяют реагирующих на туберкулин животных, у которых на секции не обнаруживают в органах и тканях туберкулезных поражений. Кроме этого отмечаются и случаи повторного заболевания животных туберкулезом в ранее оздоровленных от этой инфекции хозяйствах. Известно, что реакции на туберкулин у крупного рогатого скота могут обуславливать возбудители туберкулеза так и атипичные микобактерии.

Исследования ряда авторов (Федосеев В.С., 1985; Бакулов А.И.; Макаров В.В., 1986; Донченко А.С.с со-авт., 1986; Колычв Н.М., 1987; Кассич Ю.Я., 1990 и др.) дают основания предположить, что одна из причин длительного неблагополучия хозяйств по туберкулезу крупного рогатого скота, а также рецидивы туберкулезной инфекции может быть обусловлена персистен-цией в организме животных микобактериями туберкулеза в Ь- форме.

Исследованиями последних лет большое внимание уделяется микобактериям с измененной клеточной стенкой. Такие микобактерии выделяют из патологического материала не только от человека, но и сельскохозяйственных животных Установлено, что Ь-формы микобактерий образуются под воздействием неблагополучных факторов внешней среды, а в организме человека под действием антибактериальных препаратов.

Выделение Ь-форм микобактерий из проб мокроты больных туберкулезом людей и послужило основанием для изучения этих форм микобактерий, а также роль их в этиологии заболевания людей туберкулезом. Что, касается Ь-форм микобактерий в патологии животных, то исследования в этом направлении не многочисленны и требуют детального изучения. Вместе с тем не стардан-тизованы и методы выделения, культивирования Ь-форм микобактерий.

Целью нашей работы было отработать метод по выделению Ь-форм микобактерий из патологического материала от реагировавших на туберкулин животных в хозяйствах с разной эпизоотической ситуацией по туберкулезу.

Для выполнения поставленной цели было отобрано 85 проб патологического материала от крупного рогатого скота, реагировавшего на туберкулин для млекопитающих (подчелюстные, заглоточные, бронхиальные, средостенные лимфатические узлы), принадлежавшего 2 хозяйствам Черкасской, одному хозяйству Киевской и одному хозяйству Харьковской областей.

Предпосевную обработку отобранного патологического материала с целью выделения Ь-форм микобактерий проводили двумя способами.

Первый способ в собственной модификации: отобранные от каждого в отдельности лимфатические узлы животного измельчали ножницами, помещали в стерильне фарфоровые ступки и заливали 3% раствором серной кислоты. После действия кислоты материал

трижды промыли стерильным физиологическим раствором. Затем кусочки тканей тщательно растирали со стерильным песком до получения однородной массы и добавляли 10-15 см3 стерильного физиологического раствора. Полученную таким образом взвесь фильтровали через стерильные мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм. Полученный таким образом фильтрат пастеровской пипеткой высевали по 0,25 см3 в 10 пробирок с полужидкой средой Школьниковой (на 1 см в глубину от поверхности среды).

Второй способ: материал обрабатывали по методу Аликаевой и высевали на среду Школьниковой без предварительной фильтрации.

Посевы культивировали в термостате при 37±5оС в вертикальном положении. Для выделения бактериальных форм (Я, 8) микобактерий патологический материал обрабатывали 5% серной кислотой, а полученную взвесь высевали на плотную яичную среду для культивирования микобактерий. Учет роста колоний из патологического материала проводили через каждые 5-7 суток на протяжении 3-х месяцев.

В пробах, выросших на среде Школьниковой, мазки просматривали методом фазово - контрастной микроскопии. Из выросших колоний на плотной яичной питательной среде для культивирования микобактерий готовили мазки, которые окрашивали по методу Циля -Нильсена и исследовали методом световой микроскопии.

При диагностическом убое 92 голов реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота, характерные для туберкулеза изменения выявлены в 37 пробах, отмечали в заглоточных, бронхиальных и средостенных лимфатических узлах.

Размер туберкулезных очагов в лимфатических узлах варьировался от просяного до горохового зерна. Содержимое очагов характеризовалось некротическими массами в большинстве случаев творожистой консистенции с примесями крупинок извести. В единичных случаях на разрезе в пораженных участках отмечали сметанообразную массу, а также содержали творожистую массу, которая была заключена в соединительнотканную оболочку. Лимфатические узлы, в которых выявлены туберкулезные изменения, были увеличены в 2 - 3 раза, бугристые при пальпации, с уплотнениями.

В отдельных лимфатических узлах на разрезе обнаруживали точечные, полосчатые, диффузные кровоизлияния под капсулой или паренхимой. Подобные изменения отмечали у 55 (62 %) животных, у которых не выявлено других видимых изменений, характерных для туберкулеза, хотя все они реагировали на внутрикож-ное введение туберкулина.

Результаты культурального исследования проб патологоанатомического материала, отобранного от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота, представлены на рисунке 1.

Из материалов, представленных на рисунке 1, видно, что, при бактериологическом исследовании 92 проб биоматериала, отобранного от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота, культуры микобактерий в Я-форме были выделены в 65 (67,4%) пробах. При этом смешанные культуры Я + Ь - формы были выделены в 19 (20,6%), а в 8-форме 2 (2,2%) пробах. Кроме этого, были выделены культуры только в Ь -форме в 6 (6,5%) пробах.

При исследовании 37 проб патологоанатомического материала, в котором при осмотре были в Я-форме выявлены характерные для туберкулеза изменения, культуры М. Ьоуіз были выделены в 37 (57,8%), а в Ь-форме - в 10 (15,6 %) случаях.

Вместе с тем, из 55 проб биоматериала, в котором не отмечали в лимфатических узлах туберкулезных изменений, в типичной бактериальной форме было выделено 39 % от числа выделенных. При этом выделялись атипичные культуры 2,2 %, а персистенция культур в Ь-форме в 17,2 %.

Также на плотной яичной среде для культивирования микобактерий были выделены культуры в Я - форме, первичный рост которых отмечали на 18±1,7 день после посева, в виде мелких колоний цвета слоновой кости, крошковатой консистенции.

При микроскопии мазков, окрашенных по методу Циль - Нильсена, в поле зрения обнаруживали короткие с закругленными краями кислотоустойчивые палочки, окрашенные в красный цвет. В некоторых из них отмечали незначительную зернистость.

Проведенные нами исследования показали, что из патологоанатомического материала выделяются микобактерии как в бактериальной форме, так и в измененной форме микобактерий. При этом особую значимость

К+Ь-форма

70%

Рисунок 1 - Выделение культур микобактерий из патологоанатомического материала

приобретают методы выделения микобактерий с измененной клеточной стенкой, при которых традиционные методы исследования не достаточно эффективны. Это и послужило основанием для проведения исследований по усовершенствованию способа выделения Ь-форм микобактерий из биоматериала. Так, патологоанатомический материал от крупного рогатого скота обрабатывали по методу Аликаевой и по методу собственной модификации. Результаты культурального исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты культурального исследования биоматериала от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота

Обработка проб по методу Количество исследо- ванных проб Скорость роста на среде Школь -никовой (дней) Выделено культур в Ь-форме Загрязне- нность посевов %

А.П.Аликае- вой 92 25±0,5 10 10,0

Модифици- рованный метод 92 14±0 25 0,5

Из материалов, представленных в таблице 1 видно, что при обработке 92 проб патологоанатомического материала от реагировавшего крупного скота по методу А.П. Аликаевой было выделено 10 культур в Ь-форме микобактерий. Первичный рост на среде Школьниковой отмечен на 25±0,5 сутки.

При использовании модифицированного метода предпосевной обработки биоматериала на среде Школьниковой первичный рост микобактерий в Ь-форме отмечали на 14±0 сутки в 25 случаях в виде облакоподобных помутнений в толще среды. Рост на среде Школьниковой был представлен в виде множествен-

ных мелких крупинок, варьирующих в размерах от не видимых невооруженным глазом до макового зерна. В отдельных случаях отмечался рост в виде легкой дымки, располагающейся по ходу посева (рост характерный для Ь-форм).

Если сравнивать количество выделенных культур при обработке патологоанатомического материала по модифицированному методу, выделено культур микобактерий в Ь-форме в два раза больше по сравнению с методом А.П. Аликаевой.

При этом следует отметить, что при обработке проб патологоанатомического материала по методу А.П. Аликаевой пророст среды посторонней микрофлоры составлял 10,0%, а при использовании модифицированного метода только 0,5%.

Свойства, выделенных в Ь-форме микобактерий, изучали методом последовательных пассажей, из 35 культур, выделенных из патологоанатомического материала от крупного рогатого скота в исходную бактериальную форму реверсировало 20 (57,2%) при втором - четвертом последовательном пассаже на плотной питательной среде. На восьмом-девятом последовательных пассажах реверсировало 8 (22,9%) культур. Тогда как 7 культур в Ь-форме утратили свои ростовые свойства на первом - третьем, на среде Школьниковой, на плотной яичной среде для культивирования микобактерий роста в бактериальной форме не выявлено.

Ь-варианты, у которых реверсия на питательных средах наблюдалась на первом - третьем пассаже, расценивали как нестабильные, а после четырех пассажей отнесли к условно стабильным.

Через 3-4 недели инкубирования из участков видимого роста культур с помощью пастеровской пипетки готовили мазки, которые исследовали методом фазовоконтрастной микроскопии. Микроструктурные элементы были представлены сферическими телами разного размера и оптической плотности и аморфной массой, сферобластами и другими морфологическими формами

ВЫВОДЫ

1. Исследование патологического материала от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота из хозяйств с различной эпизоотической ситуацией позволило установить, что микобактерии выделяются как в типичной Я, 8-форме так и в Ь-форме микобактерий.

2. Модифицированный метод предпосевной обработки патологического материала для выделения Ь-форм микобактерий больше эффективен чем традиционные методы выделения культур микобактерий и позволяет в два раза больше выделить культур в Ь-форме.

Список использованных источников

1 Мусин, А.Ж. Ь-трансформация микобактерий туберкулеза в организме крупного рогатого скота : автореф. дис... канд. вет. наук : 16.00.03 / А.Ж. Мусин. - Алма- Ата, 1985. - 22с.

2 Федосеев, В.С. Ь трансформация микобактерий / В. С. Федосеев, И. Н.Рубцова, М. Т. Кириленко // Ветеринария. - 1985. - № 2. - С. 30-32.

3 Туберкулёз сельскохозяйственных животных / В.П. Шишков, В.П. Урбана, А.М. Колычев, Ю.Я. Кассич.- М.: Агропромиздат, 1991. - 255с.

4 Вейсфейлер, Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулёза и атипичных микобактерий/ Ю.К. Вейсфейлер. - Будапешт: Изд-во Академии наук Венгрии, 1975.335с.

Информация об авторах

Коваленко Анатолий Михайлович, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры инфекционной и инвазионной патологии ФГБОУ ВПО «Белгородская ГСХА».

Тарасова Елена Владимировна, ассистент кафедры инфекционной и инвазионной патологии ФГБОУ ВПО «Белгородская ГСХА», тел. 89155209280, Elena.tarasova.82@bk.ru