СОЕДИНЕНИЯ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ ИНДУЦИРУЕМОГО ГИПОКСИЕЙ ФАКТОРА-2 АЛЬФА КАК СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
COMPOUNDS AND COMPOSITIONS FOR STABILISATION OF HYPOXIA INDUCED FACTOR-2 ALPHA AS METHOD OF CANCER MEDICAL TREATMENT

Приоритет
Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на изобретение с номером 61/493,534, поданной 6 июня 2011 г., которая полностью включена в данную заявку путем ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
В данной заявке раскрыта {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусная кислота и ее сложноэфирные и амидные пролекарства, которые могут стабилизировать индуцируемый гипоксией фактор-2 альфа (HIF-2α) и, таким образом, обеспечивают способ лечения рака. Кроме того, раскрыты композиции, которые содержат {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусную кислоту и/или ее пролекарство, которые могут быть использованы для лечения рака.
Уровень техники
Лауреат Нобелевской премии доктор Джуда Фолькман (Dr. Judah Folkman) впервые в 1971 году предложил, что все раковые опухоли являются зависимыми от ангиогенеза и, вследствие этого, целевой ангиогенез является потенциальным способом лечения рака. Ангиогенез представляет собой рост новых капилляров из уже существующего микроциркуляторного русла. Широкий ряд патологических состояний, от атеросклероза до рака, связан с либо чрезмерным, либо недостаточным ангиогенезом.
Сейчас широко общепринятым является то, что рост новообразования свыше нескольких кубических миллиметров не может происходить без индукции нового кровоснабжения. Таким образом, ингибирование новой сосудистой сети (антиангиогенез) может обеспечить нехимиотерапевтический или нерадиационно-терапевтический подход к лечению рака путем препятствования опухолям доставлять питательные вещества, необходимые для роста новообразований. Несмотря на то, что обычно находятся в состоянии покоя, эндотелиальные клетки являются ответственными за образование новой сосудистой сети в ответ на различные стимулирующие воздействия. Данные стимулирующие воздействия имеют свой генезис во многих формах.
Эндотелиальные клетки, которые образуют новые сосудистые сетки в новообразованиях, отвечают за ангиогенные стимулирующие воздействия, вызываемые самим новообразованием. Наиболее известными такими стимулирующими воздействиями является сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Обнаруженные повсеместно в новообразованиях человека, повышенные уровни VEGF коррелируют с повышенной скоростью роста новообразования. Следовательно, подавление VEGF представляет способ контролирования скорости роста новообразований (первичных и метастатических), и предлагает возможный способ сокращения существующих новообразований.
Поэтому, существует давно испытываемая потребность в соединениях, композициях и способах подавления экспрессии VEGF клетками новообразования.
Краткое описание чертежей
2
2
Фигура 1А демонстрирует снижение экспрессии мРНК VEGF в мышиных эмбриональных фибробластах дикого типа при нормальных кислородных условиях (21% O) по сравнению с клетками в условиях гипоксии (1% O) при различных концентрациях стабилизатора HIF-2α, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино} уксусной кислоты. Раскрытый стабилизатор HIF-2α исследовали при концентрациях 1, 10 и 100 мкМ по отношению к контролю. Данные показывают относительные количества VEGF мРНК и являются, как следует далее слева направо, контролем при нормальных кислородных условиях (сплошной черный), стабилизатором HIF2-α при нормальных кислородных условиях, контролем при гипоксии и стабилизатором HIF2-α при гипоксии. Количество VEGF мРНК, которое присутствует, резко снижается при всех концентрациях стабилизатора HIF-2α в условиях гипоксии (дальние правые данные для каждой концентрации).
-/-
2
2
Фигура 1В демонстрирует снижение экспрессии мРНК VEGF в мышиных эмбриональных фибробластах, которые имеют делецию HIF1-α, то есть, HIF-1a фибробластах при нормальных кислородных условиях (21% О) по сравнению с клетками в условиях гипоксии (1% О) при различных концентрациях стабилизатора HIF-2α, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты. Раскрытый стабилизатор HIF-2α исследовали при концентрациях 1, 10 и 100 мкМ по отношению к контролю. Данные показывают относительные количества VEGF мРНК и являются, как следует далее, слева направо контролем при нормальных кислородных условиях (сплошной черный), стабилизатором HIF2-α при нормальных кислородных условиях, контролем при гипоксии и стабилизатором HIF2-α при гипоксии. Количество VEGF мРНК, которое присутствует, резко снижается при всех концентрациях стабилизатора HIF-2α в условиях гипоксии даже у мышей, имеющих делецию HIF1-α (дальние правые данные для каждой концентрации).
2
2
Фигура 2А демонстрирует снижение экспрессии мРНК фосфоглицераткиназы (PGK) в мышиных эмбриональных фибробластах дикого типа при нормальных кислородных условиях (21% O) по сравнению с клетками в условиях гипоксии (1% О) при различных концентрациях стабилизатора HIF-2α, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино} уксусной кислоты. Раскрытый стабилизатор HIF-2α исследовали при концентрациях 1, 10 и 100 мкМ по отношению к контролю. Данные показывают относительные количества присутствующего PGK и являются, как следует далее, слева направо контролем при нормальных кислородных условиях (сплошной черный), стабилизатором HIF2-α при нормальных кислородных условиях, контролем при гипоксии и стабилизатором HIF2-α при гипоксии. Количество фосфоглицераткиназы (PGK) мРНК, которое присутствует, резко снижается при всех концентрациях стабилизатора HIF-2α в условиях гипоксии.
-/-
2
2
Фигура 2В демонстрирует снижение экспрессии мРНК фосфоглицераткиназы (PGK) в мышиных эмбриональных фибробластах, которые имеют делецию HIF1-α, то есть HIF-1a фибробластах, при нормальных кислородных условиях (21% О) по сравнению с клетками в условиях гипоксии (1% O) при различных концентрациях стабилизатора HIF-2α, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино} уксусной кислоты. Раскрытый стабилизатор HIF-2α исследовали при концентрациях 1, 10 и 100 мкМ по отношению к контролю. Данные показывают относительные количества присутствующего PGK и являются, как следует далее, слева направо контролем при нормальных кислородных условиях (сплошной черный), стабилизатором HIF2-α при нормальных кислородных условиях, контролем при гипоксии и стабилизатором HIF2-α при гипоксии (Столбец D, наиболее светлый серый). Количество фосфоглицераткиназы (PGK) мРНК, которое присутствует, резко снижается при всех концентрациях стабилизатора HIF-2α в условиях гипоксии даже у мышей, имеющих делецию HIF1-α (дальние правые данные для каждой концентрации).
Фигура 3 демонстрирует снижение роста опухоли у C57BL/6 мышей, имеющих B16F 10 меланомные опухоли, по сравнению с лечением гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF). Фигура 3 демонстрирует, что раскрытый стабилизатор HIF-2α снижает рост опухоли сам по себе (Δ) по сравнению с GM-CSF самим по себе (▄) и ингибирование роста опухоли является дополнительным, когда раскрытый стабилизатор HIF-2α используют в комбинации с GM-CSF (X) по отношению к фосфатному буферному солевому раствору (PBS) (контроль) (♦).
Фигура 4 демонстрирует сравнение доставки GM-CSF посредством внутрибрюшинного введения (I.P.) по сравнению с внутриопухолевым введением (I.T.) при оценивании эффективности способа доставки по уменьшению объема опухоли. Раскрытый стабилизатор HIF-2α доставляли I.P. во всех случаях. Данные, изображенные как (Δ), представляют раскрытый стабилизатор HIF-2α в комбинации с GM-CSF, оба доставленные I.P., данные, изображенные как (♦), представляют GM-CSF плюс носитель, оба доставленные I.P., данные, изображенные как (▄), представляют GM-CSF, доставленный I.T., плюс носитель, доставленный I.P., и данные, изображенные как (x), представляют раскрытый стабилизатор HIF-2α, доставленный I.P., в комбинации с GM-CSF, доставленным I.T.
Фигура 5 демонстрирует количество относительных метастаз в легкие, как определено, используя Pmel17 мРНК экспрессию для способов инъекционного введения, изображенного на фигуре 3, при этом раскрытый стабилизатор HIF-2α вводили IP, а GM-CSF вводили IT. Группа А представляет собой контроль с носителем, как для раскрытого стабилизатора HIF-2α, так и для GM-CSF. Группа В представляет собой GM-CSF плюс 20% ПЭГ в 5% декстране (носитель для введения раскрытого стабилизатора HIF-2α). Группа С представляет собой раскрытый стабилизатор HIF-2α плюс PBS (носитель для введения GM-CSF). Группа D представляет собой раскрытый стабилизатор HIF-2α и GM-CSF. Раскрытый стабилизатор HIF-2α доставляли в носителе (20% ПЭГ в 5% декстране) и вводили I.P., а GM-CSF доставляли в носителе (PBS) и вводили I.T. Обратите внимание, что только группы с раскрытым стабилизатором HIF-2α показали сниженную метастазу, как измерено с помощью Pmel 17 мРНК экспрессии.
Фигура 6 демонстрирует снижение объема опухоли для мышей C57BL/6, которым ортотопически инъекционно вводили клетки от MMTV-PyMT трансгенных мышей в одну молочную железу. Животных обрабатывали три раза в неделю носителем (♦), 12 мг/кг раскрытого стабилизатора HIF-2α (▄) или 17,5 г/кг раскрытого стабилизатора HIF-2α (●).
7
Фигура 7 демонстрирует количество выживших животных во время курса исследования, в котором мышей инокулировали приблизительно 10 клетками опухоли А2780/СР, как раскрыто в данной заявке. Линия, показанная как (♦), представляет контрольную группу, линия, показанная как (), представляет группу, которая получала 18 мг/кг раскрытого стабилизатора HIF-2α, и линия, показанная как (▄), представляет группу, которая получала 36 мг/кг раскрытого стабилизатора HIF-2α.
Фигура 8 демонстрирует изменение массы опухоли мышей А2780/СР, которых подвергали лечению во время курса раскрытого исследования. Контрольная группа представлена (♦), группа, получающая 18 мг/кг раскрытого стабилизатора HIF-2α, представлена (), и группа, получающая 36 мг/кг раскрытого стабилизатора HIF-2α, представлена (▄).
Фигура 9 демонстрирует изменение в процентах массы опухоли мышей А2780/СР, которых подвергали лечению во время курса раскрытого исследования. Контрольная группа представлена (♦), группа, получающая 18 мг/кг раскрытого стабилизатора HIF-2α, представлена (), и группа, получающая 36 мг/кг раскрытого стабилизатора HIF-2α, представлена (▄).
Фигура 10 демонстрирует индукцию s-VEGFR-1 в моноцитах периферической крови человека при 10 мкМ по отношению к контролю (носителю).
Фигура 11А - повышение HIF-2α белка в клетках, обработанных раскрытым стабилизатором HIF-2α (р=0,001), с не соответствующим повышением HIF-1α (p=0,105).
Фигура 11В - sVEGFR-1 продуцирование GM-CSF-обработанными моноцитами, значительно повышенное, когда моноциты, кроме того, были обработаны раскрытым стабилизатором HIF-2α, как в белке, так и уровне транскрипта (p=0,007 и p=0,033, соответственно).
Фигура 11С - оценка уровней транскрипта VEGF, используя ПЦР в реальном времени, выведенными так, чтобы в тоже время GM-CSF повышало VEGF продуцирование, при этом не существовало отличий в продуцировании VEGF между моноцитами, стимулированными одним GM-CSF или GM-CSF и раскрытым стабилизатором HIF-2α, или в белке, или уровне транскрипта (p=0,133 и 0,556, соответственно).
Фигура 11D - не существовало отличий в продуцировании sVEGFR-1 от моноцитов, стимулированных одним GM-CSF, или моноцитов, совместно стимулированных раскрытым стабилизатором HIF-2α, или в белке, или уровне транскрипта (p=0,306 и p=0,566, соответственно).
Фигура 11E - раскрытый стабилизатор HIF-2α повышал моноцитарное продуцирование VEGF белка и мРНК (p=0,011 и p=0,007, соответственно).
Фигура 11F - раскрытый стабилизатор HIF-2α индуцировал транскрипцию sVEGFR-1 от контрольных макрофагов (p=0,036), но не от HIP-2α-дефицитных макрофагов (p=0,881).
Фигура 12А - комбинированное лечение GM-CSF и раскрытым стабилизатором HIF-2α, раскрытый стабилизатор HIF-2α, кроме того, снижал рост опухоли по сравнению с лечением по отдельности (p<0,001).
3
Фигура 12В - 3-дневное возрастание средней выживаемости (которое было определено как время к диаметру опухоли 20 мм) у мышей, которых подвергали лечению раскрытым стабилизатором HIF-2α (p=0,023).
Фигура 13А - Повышенные уровни sVEGFR-1 были обнаружены в опухолях мышей, которых подвергали лечению как GM-CSF, так и раскрытым стабилизатором HIF-2α (p=0,031).
Фигура 13В - GM-CSF (самостоятельно или в комбинации с раскрытым стабилизатором HIF-2α) не имело успеха в повышении уровней внутриопухолевых VEGF сверх уровней, наблюдаемых у контрольных мышей, которых лечили контролем-носителем (p=0,490).
Фигура 13С - комбинированное лечение GM-CSF и раскрытым стабилизатором HIF-2α значительно уменьшило наличие кровеносных сосудов в опухоли у мышей с меланомой, возможно, посредством индуцирования sVEGFR-1 (p<0,001).
Фигура 14А - раскрытый стабилизатор HIF-2α снижал рост опухоли у мышей, которых подвергали изотипическим контрольным антителом (p<0,001), но не имел эффекта на рост опухоли у мышей, которых также подвергали лечению анти-sVEGFR-1 нейтрализующим антителом (p=0,245).
Фигура 14В - раскрытый стабилизатор HIF-2α снижал наличие кровеносных сосудов в опухоли у мышей, которых подвергали лечению контрольным антителом (р=0,022), но не у мышей, которых подвергали лечению sVEGFR-1 нейтрализующим Ab.
Фигура 15 - раскрытый стабилизатор HIF-2α ингибировал рост опухоли у контрольных мышей LysMcre (которые содержат LysM-зависимую рекомбиназу Cre, а не аллели, фланкированные loxP-сайтами).
Подробное описание изобретения
Материалы, соединения, композиции, изделия и способы, описанные в данной заявке, могут быть поняты более легко при ссылке на следующее подробное описание конкретных аспектов раскрытого объекта и примеров, включенных в данное описание.
Перед раскрытием и описанием присутствующих материалов, соединений, композиций, изделий, устройств и способов следует понимать, что аспекты, описанные ниже, не ограничивается конкретными способами синтеза или конкретными реагентами, как таковыми, и конечно, могут варьироваться. Кроме того, следует понимать, что терминология, использованная в данной заявке, приведена только с целью описания конкретных аспектов и не предназначается для ограничения. Также по всему данному описанию упоминаются различные публикации. Раскрытия данных публикаций в их полном объеме включены в данное описание путем ссылки в данной заявке для того, чтобы более полно описать состояние уровня техники, к которому относится раскрытый предмет. Приведенные источники также являются индивидуально и конкретно включенными в данную заявку путем ссылки на материал, содержащийся в них, который обсуждается в предложении, в котором делается ссылка.
Общие определения
В данном описании и в формуле изобретения, которая следует далее, будет сделана ссылка на ряд терминов, которые должны быть определены как такие, что имеют следующие значения:
Все проценты, соотношения и пропорции в данной заявке даны по массе, если не указано иное. Все температуры приведены в градусах Цельсия (°С), если не указано иное.
Под «фармацевтически приемлемым» подразумевают материал, который не является биологически или иным образом нежелательным, то есть, материал может быть введен индивидууму вместе с соответствующим активным соединением, не вызывая клинически неприемлемых биологических эффектов или взаимодействия вредным образом с любыми другими компонентами фармацевтической композиции, в которой он содержится.
Массовый процент компонента, если специально не указано иное, основывается на общей массе состава или композиции, в которую компонент включен.
Под «эффективным количеством», как используется в данной заявке, подразумевают «количество одного или больше раскрытых соединений, эффективное при дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого или терапевтического результата». Эффективное количество может варьировать в зависимости от факторов, известных в данной области техники, таких как болезненное состояние, возраст, пол и масса человека или животного, которые подвергаются лечению. Хотя конкретные режимы дозировки могут быть описаны в примерах в данной заявке, специалист в данной области техники должен принимать во внимание, что режим дозировки может быть изменен, чтобы обеспечить оптимальную терапевтическую ответную реакцию. Например, несколько разделенных доз могут вводиться ежедневно или доза может быть пропорционально уменьшена, как указано в соответствии с предписаниями терапевтической ситуации. Кроме того, композиции согласно данному раскрытию могут быть введены так часто, как необходимо для достижения терапевтического количества.
«Смесь» или «композиция», как обычно используется в данной заявке, означает физическое сочетание двух или более различных компонентов.
«Эксципиент», как используется в данной заявке, включает любое другое соединение, которое может содержаться или комбинироваться с одним или больше из раскрытых ингибиторов, которое не является терапевтически или биологически активным соединением. Таким образом, эксципиент должен быть фармацевтически или биологически приемлемым или подходящим (например, эксципиент должен, как правило, быть нетоксичными к субъекту). «Эксципиент» включает одно такое соединение и, кроме того, предназначен включать множество эксципиентов.
Как используется в данной заявке, под «субъектом» подразумевается индивидум. Таким образом, «субъект» может включать домашних животных (например, кошек, собак и т.д.), сельскохозяйственных животных (например, крупный рогатый скот, лошадей, свиней, овец, коз и т.д.), лабораторных животных (например, мышь, кролика, крысу, морскую свинку и т.д.) и птиц.
«Субъект» также может включать млекопитающих, таких как приматы или человек.
Под «понижать» или другими формами слова, такими как «снижение» или «понижение», имеют в виду уменьшение явления или характеристики (например, сосудистой проницаемости). Подразумевается, что оно, как правило, представляется относительно некоторых стандартов или ожидаемых значений, другими словами, оно является относительным, но не всегда является необходимым для стандартного или подходящего значения, на которое следует ссылаться.
Термин «лечить» или другие формы этого слова, такие как «лечат» или «лечение», как используется в данной заявке, означает, что введение соединения в соответствии с настоящим изобретением облегчает заболевание или расстройство у реципиента и/или снижает, ингибирует или устраняет конкретную характеристику или явление, связанные с расстройством (например, сосудистую проницаемость). Таким образом, термин «лечение» включает предупреждение возникновения расстройства у реципиента, в частности, когда реципиент предрасположен к приобретению заболевания, но еще заболевание не является диагностированным; ингибирование расстройства; и/или облегчение или инвертирование расстройства. Поскольку способы в соответствии с настоящим изобретением направлены на предупреждение расстройств, следует понимать, что термин «предупредить» не требует, чтобы болезненное состояние полностью пресекалось. Скорее, как используется в данной заявке, термин «предупреждение» относится к способности специалиста в данной области техники идентифицировать популяцию, которая является восприимчивой к расстройствам, таким образом, чтобы введение соединений в соответствии с настоящим изобретением можно было осуществлять до начала заболевания. Термин не предполагает, что болезненного состояния удастся полностью избежать.
По всему описанию и формуле изобретения данной заявки слово «содержать» и другие формы этого слова, такие как «содержащий» и «содержит», означает включение, но не ограничивается этим, и не предназначено для исключения, например, других добавок, компонентов, целых чисел или стадий. Как используется в описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают множественное число, если контекст явно не диктует иное. Таким образом, например, ссылка на «композицию» включает смеси из двух или больше таких композиций, ссылка на «химиотерапевтическое средство» включает смеси из двух или больше таких химиотерапевтических средств, ссылка на «соединение» включает смеси из двух или больше таких соединения, например, их солей, и тому подобное.
«Необязательный» или «необязательно» означает, что впоследствии описанное событие или обстоятельство может или не может произойти, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит, и случаи, когда не происходит.
Диапазоны могут быть выражены в данной заявке как от «приблизительно» одного конкретного значения, и/или до «приблизительно» другого конкретного значения. Когда выражен такой диапазон, другой аспект включает от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Аналогичным образом, когда значения выражены как приближения, путем использования антецедента «приблизительно», следует понимать, что конкретное значение формирует другой аспект. Кроме того, следует понимать, что конечные точки каждого из диапазонов являются значащими как по отношению к другой конечной точке, так и независимо от другой конечной точки. Следует также понимать, что существует ряд значений раскрытых в данной заявке, и что каждое значение также является раскрытым в данной заявке как «приблизительно» этого конкретного значения в дополнение к самому значению. Например, если значение «10» является раскрытым, то «приблизительно 10» также является раскрытым. Следует также понимать, что если значение раскрыто, то «меньше или равно» значению, «больше или равно значению», и возможные диапазоны между значениями также являются раскрытыми, как соответственно понятно специалисту в данной области техники. Например, если значение «10» является раскрытым, то «меньше или равно 10», а также «больше чем или равно 10» также являются раскрытыми. Кроме того, следует понимать, что по всей заявке данные представлены в нескольких различных форматах, и что эти данные представляют конечные точки, и начальные точки, и диапазоны для любой комбинации точек данных. Например, если раскрыты конкретная точка данных «10» и конкретная точка данных «15», следует понимать, что больше чем, больше чем или равно, меньше чем, меньше чем или равно, и равно 10 и 15 считаются раскрытый, а также между 10 и 15. Кроме того, следует понимать, что каждая единица между двумя конкретными единицами также является раскрытой. Например, если 10 и 15 являются раскрытыми, то 11, 12, 13 и 14 также являются раскрытыми.
«VEGF-зависимый рак», «VEGF зависимые раки», «VEGF-зависимая опухоль» или «VEGF зависимые опухоли» относятся к ракам, которые находятся в зависимости от VEGF, чтобы пролиферировать.
1
4
3
4
3
4
1
2
3
3
3
4
4
4
4
4
Для целей представленного раскрытия термин «C-C линейный, С-С разветвленный или С-С циклический алкил» включает следующие единицы: метил (C), этил (C), н-пропил (С), изо-пропил (С), циклопропил (С), н-бутил (C), втор-бутил (C), изо-бутил (C), трет-бутил (С) и циклобутил (C).
В данной заявке раскрыты соединения, имеющие формулу:
где R выбран из:
1
i) -OR;
2
3
ii) -NRR; или
1
iii) -OM;
1
R представляет собой:
i) водород; или
1
6
3
6
3
6
ii) C-С линейный, С-С разветвленный или С-С циклический алкил;
2
3
R и R независимо представляют собой:
i) водород;
1
6
3
6
3
6
ii) C-С линейный, С-С разветвленный или С-С циклический алкил; или
2
3
2
3
iii) R и R могут быть взяты вместе с образованием кольца, которое имеет от 2 до 7 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы, включая атом азота, с которым связаны R и R.
1
М представляет собой катион, как далее описано в данной заявке ниже.
4
R выбран из:
i) -ОН; или
2
ii) -ОМ;
2
где М представляет собой катион, как далее описано в данной заявке ниже.
Обнаружено, что раскрытое соединение {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусная кислота, которая имеет формулу:
стабилизирует индуцируемый гипоксией фактор два-альфа (HIF-2α) и, как далее раскрыто в данной заявке, демонстрирует анти-ангиогенное поведение путем индукции продуцирования ингибитора эндогенного сосудистого эндотелиального фактора роста, s-VEGF-1.
Кроме того, раскрыты фармацевтически приемлемые соли раскрытого стабилизатора, имеющие формулу:
1
2
+
2+
3+
где М и М каждый независимо представляет собой моно-, ди- или три- валентный катион, то есть, М М или M.
Один аспект раскрытых солей относится к стабилизатору в форме моновалентной соли, имеющей формулу:
1
Один вариант осуществления данного аспекта относится к раскрытому стабилизатору, где М представляет собой неорганический катион. Одна итерация относится к неорганическим катионам, выбранным из натрия, лития, калия, аммония и серебра. Неограничивающие примеры включают:
i) натрия {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}ацетат;
ii) калия {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}ацетат; и
iii) аммония {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}ацетат.
1
Другой вариант осуществления данного аспекта относится к раскрытому стабилизатору, где М представляет собой органический катион. Один вариант осуществления относится к органическим катионам, которыми являются амины, например, соли, которые имеют формулу:
a
b
c
R, R и R каждый независимо представляет собой:
i) водород;
1
12
3
12
3
12
ii) замещенный или незамещенный C-C линейный, С-C разветвленный или С-С циклический алкил;
iii) замещенный или незамещенный бензил;
a
b
c
где один или больше из R, R и R независимо могут быть замещены одним или больше заместителями, выбранными из:
1
12
3
12
3
12
i) C-C линейного, С-С разветвленного или С-С циклического алкокси;
1
12
3
12
3
12
ii) C-C линейного, С-С разветвленного или С-С циклического галогеналкокси;
iii) галогена;
iv) гидроксила;
v) тио;или
a
b
c
vi) один или больше из R, R и R могут содержать одну или больше единиц, способных к образованию катиона, аниона или цвитерионов.
a
b
c
+
+
+
+
+
+
+
+
1
12
2
3
2
3
2
2
3
3
2
2
3
2
2
3
2
2
2
3
3
3
2
2
3
3
2
2
3
2
Одна итерация данного варианта осуществления относится к катионам, где каждый из R, R и R является водородом или C-C линейным алкилом. Неограничивающие примеры включают метиламмоний [HNН(СН)], диметиламмоний [HNН(СН)], триметиламмоний [HNН(СН)], этиламмоний [HNH(CHCH)], диэтиламмоний [HNH(CHCH)], триэтиламмоний [HNH(CHCH)], диметилэтиламмоний [HN(CH)(CHCH)] и метилдиэтиламмоний [HN(CH)(CHCH)].
a
b
c
+
+
+
+
+
+
1
12
3
12
3
12
1
12
3
12
3
12
1
12
3
12
3
12
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
2
3
2
3
2
n
2
Другая итерация данного варианта осуществления относится к катионам, где один или больше из R, R и R выбраны из водорода, незамещенного C-C линейного, C-C разветвленного или C-C циклического алкила или замещенного C-C линейного, C-C разветвленного или C-C циклического алкила. Один вариант осуществления относится к органическим катионам, которые имеют одну или больше C-C линейных, C-C разветвленных или C-C циклических алкильных цепей, замещенных гидрокси. Неограничивающие примеры включают 2-гидроксиэтиламмоний (катион моноэтаноламина, холинат) [HNH(CHCHOH)], метил-2-гидроксиэтиламмоний [HN(CH)(CHCHOH)], ди-(2-гидроксиэтил)аммоний [HN(CHCHOH)], три-(2-гидроксиэтил)аммоний [HN(CHCHOH)] и три-(гидроксиметил)метиламмоний (катион три-(гидроксиметил)аминометана) [HNC[(CHOH)]]. Кроме того, включены катионы, образованные из аминосахаров, например, аминосахаров, имеющих формулу HN(CH)CH[(CHOH)CHOH], где n означает от 1 до 7. Неограничивающим примером аминосахара, приемлемого для образования органического катиона, является меглюмин (1-дезокси-1-метиламиносорбитол). Дополнительная итерация данного варианта осуществления относится к катионам, образованным из аминокислот. Неограничивающие примеры включают лизин, орнитин, аргинин, глутамин и т.д.
a
b
c
Другой аспект органических аминов, приемлемых для образования солей раскрытого стабилизатора, включает амины, где один или больше из R, R и R взяты вместе с образованием гетероциклического кольца, которое может содержать от 3 до 20 атомов углерода и один или больше гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы. Неограничивающие примеры включают пиперазин, пиперидин, морфолин, тиоморфолин и т.д.
Другой органический амин, приемлемый для использования в качестве соединения, образующего катион, включает бензатин. Бензатин может быть моно- или ди-катионом, например, солями N-бензил-2-(бензиламино)этанамина, которые имеют формулу:
Другой аспект раскрытых солей относится к стабилизатору в форме дивалентной соли, которая имеет формулу:
1
Один вариант осуществления данного аспекта относится к раскрытому стабилизатору, где М представляет собой неорганический катион. Одна итерация относится к неорганическим катионам, выбранным из кальция, магния, бария и т.д. Неограничивающие примеры включают:
i) кальция бис-{[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино} ацетат;
ii) магния бис-{[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино} ацетат; и
iii) бария бис-{[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}ацетат.
1
4
2
Другой аспект фармацевтически приемлемых солей относится к солям, в которых R является ОМ и R является ОМ, например, соли, которые имеют формулу:
Первый вариант осуществления относится к солям, содержащим множество моно-валентных неорганических катионов. Например:
i) динатрия{[5-(3-фторфенил)-3-оксидопиридин-2-карбонил]амино}ацетат;
ii) дикалия{[5-(3-фторфенил)-3-оксидопиридин-2-карбонил]амино}ацетат;
iii) диаммония{[5-(3-фторфенил)-3-оксидопиридин-2-карбонил]амино} ацетат;
iv) натрия калия{[5-(3-фторфенил)-3-оксидопиридин-2-карбонил]амино}ацетат;
v) натрия аммония{[5-(3-фторфенил)-3-оксидопиридин-2-карбонил]амино} ацетат; и
vi) калия аммония{[5-(3-фторфенил)-3-оксидопиридин-2-карбонил]амино} ацетат.
В другом варианте осуществления, органические амины, способны к образованию дикатионных групп, например, бензатин, как раскрыто в данной заявке, могут быть использованы для образования подходящих фармацевтически приемлемых солей раскрытого стабилизатора.
Кроме того, в данной заявке раскрыты пролекарства, которые in vivo превращаются в активное соединение {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусную кислоту. Раскрытые пролекарства имеют формулу:
где R выбран из:
1
i) -OR; или
2
3
ii) -NRR;
1
1
6
3
6
3
6
R представляет собой C-С линейный, С-С разветвленный или С-С циклический алкил; и
2
3
R и R независимо представляют собой:
i) водород;
1
6
3
6
3
6
ii) C-С линейный, C-С разветвленный или C-С циклический алкил; или
1
2
1
2
iii) R и R могут быть взяты вместе с образованием кольца, которое имеет от 2 до 7 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы, включая атом азота, с которым связаны R и R.
1
1
1
1
6
3
6
3
6
1
1
Один аспект раскрытых пролекарств относится к соединениям, которые являются сложными эфирами, то есть R представляет собой C-С линейный, С-С разветвленный или С-С циклический алкил. В одном варианте осуществления, R является метилом (C), таким образом, обеспечивая пролекарство метил {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино} ацетат. В другом варианте осуществления, R является этилом (С), таким образом, обеспечивая пролекарство этил {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}ацетат.
1
3
4
3
3
3
4
4
4
4
4
В следующем варианте осуществления, R выбран из С-С линейного, разветвленного или циклического алкила, например, н-пропила (С), изо-пропила (С), циклопропила (С), н-бутила (С), втор-бутила (С), изо-бутила (C), трет-бутила (C) и циклобутила (С).
2
3
2
3
1
2
1
2
2
1
1
Другой аспект раскрытых пролекарств относится к соединениям, которые являются амидами, то есть R представляет собой -NRR. В одном варианте осуществления данного аспекта, R и R оба являются водородами, где R представляет собой -NH, таким образом, давая пролекарство 5-(3-фторфенил)-N-(2-амино-2-оксоэтил)-3-гидроксипиридин-2-иламид. В другом варианте осуществления, R является метилом (С) и R является водородом, таким образом, давая пролекарство 5-(3-фторфенил)-N-(2-метиламино-2-оксоэтил)-3-гидроксипиридин-2-иламид. В еще другом варианте осуществления, R и R оба являются метилами (C), таким образом давая пролекарство 5-(3-фторфенил)-N-(2-диметиламино-2-оксоэтил)-3-гидроксипиридин-2-иламид.
2
3
1
2
1
2
1
2
3
3
4
4
4
4
4
2
3
4
5
В следующем варианте осуществления данного аспекта, R и R каждый независимо является водородом, этилом, н-пропилом (С), изо-пропилом (С3), циклопропилом (С), н-бутилом (С), втор-бутилом (C), изо-бутилом (C), трет-бутилом (C) или циклобутилом (C). Неограничивающие примеры пролекарств в соответствии с данным аспектом включают 5-(3-фторфенил)-N-(2-диэтиламино-2-оксоэтил)-3-гидроксипиридин-2-иламид; 5-(3-фторфенил)-N-(2-пропиламино-2-оксоэтил)-3-гидроксипиридин-2-иламид; 5-(3-фторфенил)-N-(М-этил-N-изопропиламино-2-оксоэтил)-3-гидроксипиридин-2-иламид; 5-(3-фторфенил)-N-(2-диизопропиламино-2-оксоэтил)-3-гидроксипиридин-2-иламид; 5-(3-фторфенил)-N-(2-циклопропиламино-2-оксоэтил)-3-гидроксипиридин-2-ил амид и 5-(3-фторфенил)-N-(2-бутиламино-2-оксоэтил)-3-гидроксипиридин-2-ил амид. В еще следующем варианте осуществления данного аспекта, R и R могут быть взяты вместе с образованием кольца, которое имеет от 2 до 7 атомов углерода и от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы, включая атом азота, с которым связаны R и R. В первой итерации данного варианта осуществления, R и R взяты вместе с атомом азота, с которым они связаны, с образованием кольца, выбранного из азиридинила (С), азетидинила (С), пирролидинила (С) и пиперидинила (С).
1
2
3
3
3
3
3
4
4
В следующей итерация данного варианта осуществления, R и R взяты вместе с атомом азота, с которым они связаны, с образованием кольца, которое содержит второй гетероатом, выбранный из азота, кислорода и серы. Неограничивающие примеры данных колец включает тиазолил (С), изотиазолил (С), оксазолил (С), изоксазолил (С), имидазолил (С), морфолинил (С) и пиперазинил (С).
Раскрытый HIF-2α стабилизатор, 6, и сложноэфирные пролекарства, например, соединение 5, могут быть получены, используя способ, схематически представленный на Схеме I и далее описанный в Примере 1 в данной заявке ниже.
3
2
2
3
2
2
Реагенты и условия: (b) (CFOS)O, EtH, CHCl; комнатная температура, 16 часов.
3
2
3
Реагенты и условия: (с) EtN, NaCO, EtOH, комнатная температура, 16 часов.
2
3
4
2
Реагенты и условия: (d) Pd(dppf)Cl, KPO, HO, диоксан; 85°С, 16 часов.
2
Реагенты и условия: (е) (i) NaOH, ТГФ; 30 мин. (ii) HCl, ТГФ, НО; 85°С, 16 часов.
ПРИМЕР 1
{[5-(3-Фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусная кислота (6)
1
1
В реакциях, описанных в данной заявке ниже, если не указано иное, температуры даны в градусах Цельсия (°С); действия осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, «комнатная температура», «кт» или «КТ» (обычно в диапазоне от приблизительно 18°С до приблизительно 25°С); выпаривание растворителя осуществляли, используя роторный испаритель при пониженном давлении (как правило, 4,5-30 мм рт.ст.) с температурой бани вплоть до 60°С; ход реакций, как правило, отслеживали по тонкослойной хроматографии (ТСХ); продукты демонстрировали удовлетворительные данные Н ЯМР, ВЭЖХ и/или ЖХ-МС (ГХ-МС); и также были использованы следующие общепринятые сокращения: л (литр(ы)), мл (миллилитры), ммоль (миллимоли), г (граммы) и мг (миллиграммы). Если не указано другое, все растворители и реагенты были приобретены у поставщиков и использованы без дополнительной очистки. Реакции проводили под слоем азота, если не указано иное. Соединения визуально определяли под УФ лампой (254 нм). Н ЯМР спектры снимали на 300 МГц ЯМР.
пл.
6
1
Получение этилового эфира [(3,5-дигидроксипиридин-2-карбонил)амино]уксусной кислоты (2): 20 л круглодонную колбу наполняли азотом и загружали палладий на угле (10% Pd/C) (100 г, 60% влажная паста) и этанол (12 л), с последующим добавлением этилового эфира [(3,5-бис-бензилоксипиридин-2-карбонил)амино] уксусной кислоты, 1, (1000 г, 2,378 моль). Полученную смесь подвергали три раза циклу вакуум-продувание азотом и три раза циклу вакуум-продувание водородом. Вводили атмосферу водорода, и реакционную смесь перемешивали при 1-25°С до полного прохождения реакции по ТСХ анализу. Реакционную смесь, как правило, оставляли на 2-3 часа и интенсивное перемешивание было важным для полного завершения реакции. Реакционную систему затем подвергали циклу вакуум-продувание азотом, чтобы удалить водород из системы. Реакционную смесь фильтровали и осадок на фильтре промывали этанолом (2 л). Объединенный фильтрат концентрировали на роторном испарителе при температуре бани вплоть до 45°С постоянной массы, получая 558 г (выход 97,7%) желаемого продукта в виде твердого вещества почти белого цвета. Т: 138-140°С; МС (ESI+): m/z 241 (М+1); Н ЯМР (300 МГц, ДМСО-d) δ 12,28 (с, 1Н), 10,79 (с, 1Н), 9,09-9,05 (т, J=6 Гц, 1Н), 7,76-7,71 (д, J=2,4 Гц, 1Н), 6,68-6,67 (д, J=2,1 Гц, 1Н), 4,15-4,08 (кв, J=6,9 Гц, 2Н), 4,02-4,00 (д, J=6,3 Гц, 2Н), 1,22-1,17 (т, J=6,9 Гц, 2Н).
2
4
пл.
3
1
Получение N-фенилбис(трифторметансульфинимида) (3): 10 л круглодонную колбу наполняли анилином (232,5 г, 2,05 моль), триэтиламином (505 г, 5 моль) и дихлорметаном (5 л). Полученную смесь охлаждали на ледяной бане. По каплям добавляли трифторметансульфоновый ангидрид (1410 г, 5 моль) в дихлорметане (1 л). Реакционной смеси давали нагреться до КТ и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь затем добавляли к измельченному льду (4 кг) при перемешивании. Полученную двуфазную смесь разделяли. Органический слой промывали солевым раствором (2 л × 2), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали с образованием неочищенного твердого продукта. Неочищенное твердое вещество промывали этанолом, получая 767 г (выход 86%) желаемого продукта в виде твердого вещества белого цвета. Т: 96-98°С; Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ 7,64-7,51 (м, 3Н), 7,44-7,42 (м, 2Н).
1
1
2
3
6
Получение натриевой соли этилового эфира [(3-гидрокси-5-трифторметансульфонилоксипиридин-2-карбонил)амино]уксусной кислоты (4): 20 л круглодонную колбу наполняли этиловым эфиром [(3,5-дигидроксипиридин-2-карбонил)амино]уксусной кислоты, 2, (860 г, 3,58 моль) и этанолом (11 л). Смесь перемешивали с образованием раствора при от 10 до 20°С. Добавляли триэтиламин (602 мл, 4,3 моль). Полученную смесь охлаждали до 0-5°С и добавляли N-фенил-бис-(трифторметансульфинимид), 3, (1406 г, 3,94 моль). После добавления, реакционную смесь нагревали до 35-40°С и перемешивали на протяжении ночи. ТСХ анализ показал, что реакция прошла полностью. Реакционную смесь затем концентрировали, используя роторный испаритель при температуре бани вплоть до 40°С.Остаток (маслянистое твердое вещество) обрабатывали толуолом (4,5 л) и концентрировали до приблизительно 4,5 л. Замену растворителя на толуол повторяли до тех пор, пока остаточный уровень этанола не стал меньше, чем 0,5% по Н ЯМР анализу. Толуольный раствор обрабатывали 10% мас./мас. водным раствором NaCO (5,5 л, 1,3 экв.). Полученную суспензию фильтровали, и осадок на фильтре промывали водой (2×2 л) и потом смесью толуол/ТВМЕ (12) (2×2 л). Твердый продукт сушили, получая 1156 г (выход 82%) желаемого продукта в виде твердого вещества белого цвета. МС (ESI+): m/z 373 (М+1); Н ЯМР (300 МГц, ДМСО-d) δ 12,13 (1Н, с), 7,43-7,42 (д, J=2,1 Гц, 1Н), 6,72-6,71 (д, J=2,1 Гц, 2Н), 4,12-4,05 (м, 4Н), 1,21-1,15 (т, J=6,9 Гц, 3).
2
2
2
4
3
1
Получение этилового эфира {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино} уксусной кислоты (5): 5 л круглодонную колбу наполняли натриевой солью этилового эфира [(3-гидрокси-5-трифторметансульфонилоксипиридин-2-карбонил)амино] уксусной кислоты, 4, (310 г, 0,78 моль), 1,4-диоксаном (3 л) и водой (150 мл). Раствор подвергали циклу вакуум-продувание азотом, с последующим добавлением фосфата калия (50 г, 0,234 моль) и 3-фторфенилбороновой кислоты (163 г, 1,17 моль). После добавления, цикл вакуум-продувание азотом повторяли один раз. Потом добавляли комплекс 1,1-бис-(дифенилфосфино)ферроценпалладия (II) хлорид CHCl (72 г, 0,088 моль, 0,11 экв.). После другого цикла вакуум-продувание азотом, реакционную смесь затем нагревали до 75-85°С. Прохождение реакции контролировали по ТСХ. Реакция полностью завершалась через 14-16 часов. Реакционную смесь охлаждали до 15-25°С и концентрировали, используя роторный испаритель, при температуре бани вплоть до 45°С, до тех пор пока растворитель не прекращал собираться. Остаток обрабатывали водным раствором HCl (1 М, 1,5 л) и этилацетатом (1,5 л), и перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем слои разделяли. Органический слой промывали водой (1,5 л), солевым раствором (1,5 л), сушили над NaSO, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали при помощи колоночной хроматографии с силикагелем (гексан/этилацетат/уксусная кислота: 3:1:0,01 по об./об.), получая 226 г (выход 90%) желаемого продукта. МС (ESI+): m/z 319 (М+1); Н ЯМР (300 МГц, CDCl) δ 11,88 (с, 1Н), 8,44 (с, 1Н), 8,32-8,31 (д, J=1,5 Гц, 1Н), 7,51-7,44 (м, 2Н), 7,40-7,37 (м, 1Н), 7,32-7,27 (м, 1Н), 7,17-7,13 (т, J=6,6 Гц, 1Н), 4,33-4,25 (м, 4Н), 1,36-1,31 (т, J=7,2 Гц, 3Н).
пл.
6
1
Получение {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты (6): К суспензии этилового эфира {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты, 5, (226 г, 0,71 моль) в ТГФ (1 л) при комнатной температуре добавляли водный раствор гидроксида натрия (1 М, 2 л), при этом поддерживая внутреннюю температуру реакционной смеси ниже 25°С. Прохождение реакции контролировали по ТСХ. Через 20-30 минут реакция завершалась. pH реакционного раствора регулировали, используя концентрированную HCl до 5-5,5, при этом поддерживая внутреннюю температуру ниже 25°С. Реакционную смесь фильтровали, чтобы удалить нерастворимые вещества, и фильтрат концентрировали, используя роторный испаритель, при температуре бани вплоть до 40°С до тех пор, пока весь ТГФ не был удален. Полученное в результате твердое вещество собирали путем вакуумной фильтрации и промывали водой (1 л). Затем твердое вещество растворяли в смеси воды (1,5 л) и ТГФ (1,5 л) при комнатной температуре. pH регулировали от приблизительно 5 до приблизительно 2-2,25 концентрированной HCl. Полученную смесь перемешивали в течение 30 минут, pH которой после этого времени устанавливали в диапазоне 2-2,5. Двуфазную смесь концентрировали, используя роторный испаритель, при температуре бани вплоть до 40°С до тех пор, пока не прекращал удаляться ТГФ. Полученное в результате твердое вещество фильтровали, промывали водой (2×1 л), и сушили, получая 115 г (выход 55,8%) желаемого продукта в виде твердого вещества белого цвета. Т: 182-184°С; МС (ESI-): m/z 289 (М-1); Н ЯМР (300 МГц, ДМСО-d) δ 12,90 (с, 1Н), 12,38 (с, 1Н), 9,39-9,37 (т, J=6,3 Гц, 1Н), 8,55 (с, 1Н), 7,80-7,67 (м, 2Н), 7,59-7,52 (м, 1Н), 7,34-7,27 (м, 1Н), 4,02-3,99 (м, 2Н), 3,51 (с, 1Н).
Амидные пролекарства раскрытого HIF-2α стабилизатора могут быть получены при помощи способа, который схематически представлен на Схеме II и далее описан в Примере 2 в данной заявке ниже.
3
2
Реагенты и условия: (а) CHNH HCl, EDCI, HOBt, ДИПЭА, ДМФА; от 0°С до кт 2 дня.
ПРИМЕР 2
5-(3-Фторфенил)-N-(2-метиламино-2-оксоэтил)-3-гидроксипиридин-2-иламид(7)
2
2
2
2
4
2
2
Получение 5-(3-фторфенил)-N-(2-метиламино-2-оксоэтил)-3-гидроксипиридин-2-иламида (7): К раствору {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты, 6, (2,9 г, 10 ммоль) в ДМФА (50 мл) при комнатной температуре под N2 добавляют 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид (EDCI) (2,33 г, 14,4 ммоль), 1-гидроксибензотриазол (HOBt) (1,35 г, 10 ммоль) и диизопропилэтиламин (ДИПЭА) (15,65 мл, 30 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 5 минут, затем добавляют гидрохлорид метиламина (0,9 г, 130 ммоль). После перемешивания в течение 2 дней, растворитель удаляют при пониженном давлении, и остаток распределяют между CHCl и HO. Органический слой отделяют, промывают насыщенным раствором NaCl, сушат (NaSO), фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищают на кремнеземе (МеОН:CHCl 1:99), получая желаемое соединение.
Ниже описан дополнительный способ получения раскрытого HIF-2α стабилизатора и его пролекарств. Способ получения иллюстративного сложноэфирного пролекарства схематически представлен на Схеме III и описан в Примере 3.
Схема III
2
3
2
2
Реагенты и условия: (а) KCO, PdCl(dppf), ДМФА, HO; 45°С, 18 часов.
3
3
Реагенты и условия: (b) NaOCH, СНОН; кипячение с обратным холодильником, 20 часов.
Реагенты и условия: (с) 48% HBr; кипячение с обратным холодильником, 20 часов.
Реагенты и условия: (d) CDI, ДИПЭА, ДМСО; кт, 2,5 часа.
ПРИМЕР 3
2
3
2
4
4
Метил {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}ацетат (11) Получение 5-(3-фторфенил)-3-хлор-2-цианопиридин (8): В 100 мл круглодонную колбу, которая снабжена магнитной мешалкой и оборудована входным отверстием для азота, загружают (3-фторфенил)бороновую кислоту (4,48 г, 32 ммоль), 3,5-дихлор-2-цианопиридин (5,8 г, 34 ммоль), KCO (5,5 г, 40 ммоль), [1,Г-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия (II) [PdCl(dppf)] (0,1 г, 0,13 ммоль), диметилформамид (50 мл) и воду (5 мл). Реакционный раствор перемешивают и нагревают до 45°С и выдерживают при такой температуре в течение 18 часов, после чего полнота прохождения реакции может быть определена по отсутствию исходного вещества 3,5-дихлор-2-цианопиридина по ТСХ, используя этилацетат/метанол (4:1) как подвижную фазу и УФ 435 нм для визуализации каких-либо остаточных количеств исходного вещества. Реакционный раствор потом охлаждают до комнатной температуры и содержимое распределяется между этилацетатом (250 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (100 мл). Органическую фазу отделяют и промывают второй раз насыщенным водным раствором NaCl (100 мл). Органическую фазу сушат в течение 4 часов над MgSO, MgSO удаляют фильтрованием и растворитель удаляют при сниженном давлении. Остатки, которые остались, затем суспендируют в метаноле (50 мл) при комнатной температуре в течение 20 часов. Полученное в результате твердое вещество собирают фильтрацией и промывают холодным метанолом (50 мл), потом гексанами (60 мл) и сушат, получая желаемый продукт.
Получение 5-(3-фторфенил)-3-метокси-2-цианопиридина (9): В 500 мл круглодонную колбу, которая снабжена магнитной мешалкой и установленным обратным холодильником и оборудована входным отверстием для азота, загружают 5-(3-фторфенил)-3-хлор-2-цианопиридин, 8, (9,28 г, 40 ммоль), метоксид натрия (13,8 мл, 60 ммоль) и метанол (200 мл). При перемешивании реакционный раствор нагревают до кипения и кипятят с обратным холодильником в течение 20 часов. Полнота прохождения реакции может быть определена по исчезновению 5-(3-фторфенил)-3-хлор-2-цианопиридина, как измеряется по ТСХ анализу, используя гексан/этилацетат (6:3) как подвижную фазу и УФ 435 нм для визуализации компонентов реакции. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и объединяют с водой (500 мл). Смесь охлаждают до 0°С - 5°С и перемешивают в течение 3 часов. Полученное в результате твердое вещество собирают фильтрацией и промывают водой, затем гексаном. Полученный в результате осадок затем сушат в вакууме при 40°С, получая желаемый продукт.
Получение 5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбоновой кислоты (10): В 50 мл круглодонную колбу, которая снабжена магнитной мешалкой и установленным обратным холодильником, загружают 5-(3-фторфенил)-3-метокси-2-цианопиридин, 9, (0,912 г, 4 ммоль) и 48% водный раствор HBr (10 мл). При перемешивании реакционный раствор нагревают до кипения и кипятят с обратным холодильником в течение 20 часов. Полнота прохождения реакции может быть определена по исчезновению 5-(3-фторфенил)-3-метокси-2-цианопиридина как измеряется по ТСХ анализу, используя гексан/этилацетат (6:3) как подвижную фазу и УФ 435 нм для визуализации компонентов реакции. Реакционную смесь потом охлаждают до 0°С - 5°С с перемешиванием и pH регулируют до приблизительно 2 путем медленного добавления 50% водного NaOH. Затем перемешивание продолжают при 0°С - 5°С в течение 3 часов. Полученное в результате твердое вещество собирают фильтрацией и промывают водой, потом гексаном. Полученный в результате осадок сушат в вакууме при 40°С, получая желаемый продукт.
4
Получение метил {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино} ацетата (II): В 50 мл круглодонную колбу, которая снабжена магнитной мешалкой и установленным обратным холодильником с входным патрубком для азота, загружают 5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбоновую кислоту, 10, (0,932 г, 4 ммоль), N,N-карбонилдиимидазол (CDI) (0,97 г, 6 ммоль) и диметилсульфоксид (5 мл). Реакционную смесь перемешивают при 45°С в течение приблизительно 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры. Добавляют метиловый эфир глицина гидрохлорида (1,15 г, 12 ммоль) с последующим добавлением по каплям диизопропилэтиламина (3,2 мл, 19 ммоль). Затем смесь перемешивают в течение 2,5 часов при комнатной температуре, после чего добавляют воду (70 мл). Содержимое реакционной колбы охлаждают до 0°С - 5°С и добавляют 1N HCl до тех пор, пока pH раствора станет приблизительно 2. Раствор экстрагируют дихлорметаном (100 мл) и органический слой сушат над MgSO в течение 16 часов. Добавляют силикагель (3 г) и раствор суспендируют в течение 2 часов, после чего твердые вещества удаляют фильтрованием. Фильтрат концентрируют досуха при сниженном давлении, и полученный в результате остаток суспендируют в метаноле (10 мл) в течение двух часов. Полученное в результате твердое вещество собирают фильтрацией и промывают холодным метанолом (20 мл), потом гексаном, и полученный в результате осадок сушат, получая желаемый продукт.
Сложноэфирное пролекарство метил {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-ил]амино}ацетат, 11, может быть превращен в раскрытый HIF-2α стабилизатор, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино} уксусную кислоту, 6, используя процедуру, схематически представленную на Схеме I стадия (е) и описанную в Примере 1.
На Схеме IV в данной заявке ниже схематически представлен и в Примере 4 описан дополнительный неограничивающий пример процедуры для амидного пролекарства раскрытого HIF-2α стабилизатора.
Реагенты и условия: (а) EDCI, HOBt, ДИПЭА, ДМФА; кт.
ПРИМЕР 4
5-(3-Фторфенил)-Н-(2-амино-2-оксоэтил)-3-гидроксилпиридин-2-ил амид (12)
2
Получение 5-(3-фторфенил)-N-(2-амино-2-оксоэтил)-3-гидроксилпиридин-2-иламида (6): К раствору 5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбоновой кислоты, 10, (699 мг, 3 ммоль) в ДМФА (20 мл) при комнатной температуре под N3 добавляют 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид (EDCI) (0,925 г, 5,97 ммоль) и 1-гидроксибензотриазол (HOBt) (0,806 г, 5,97 ммоль). Полученный раствор перемешивают в течение 15 минут, потом добавляют гидрохлорид 2-аминоацетамида (0,66 г, 5,97 ммоль) и диизопропилэтиламин (1,56 мл, 8,96 ммоль). Реакцию контролируют по ТСХ и, когда реакция полностью прошла, реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении и добавляют НО. Желаемый продукт может быть отделен путем обычной обработки.
Представленное раскрытие, кроме того, включает фармацевтически приемлемые соли раскрытого стабилизатора. Ниже приведен неограничивающий пример получения фармацевтически приемлемой соли, как изображено на Схеме V.
ПРИМЕР 5
Натрия {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}ацетат (13)
3
В емкость, содержащую NaHCO (41,09 мг), добавляют раствор {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты (6) в ацетоне (0,64 мл из 400 мг образца в 5,12 мл). Раствор перемешивают и выделяют желаемый продукт путем концентрации в вакууме.
СПОСОБЫ
Хорошо известно, что рост рака и метастазы не контролируется исключительно аберрантным регулированием метастазов, которое активирует или подавляет гены в раковых клетках. Взаимодействие между раковыми клетками и стромальными клетками, как было показано, способствуют росту рака и метастазам. Макрофаги, найденные внутри опухоли, которые упоминаются как опухоль-ассоциированные макрофаги (ТАМ), представляют собой главнейший элемент стромальных клеток (см., Leek RD, Harris AL, «Tumour associated macrophages in breast cancer,» J Mamm Gland Biol Neoplasia 1: 177-189, 2002 и Lewis CE, Murdoch С, «Macrophage responses to hypoxia: implications for tumor progression and anti-cancer therapies.» Am J Pathol 167: 627-635, 2005). ТАМ являются производными моноцитов периферической крови, включенными в опухоль. После активации раковыми клетками, ТАМ может высвобождать многообразие факторов, среди прочих, факторы роста, протеолитические ферменты, цитокины и воспалительные медиаторы. Многие из этих факторов являются ключевыми агентами в активировании метастаз раковых клеток; в самом деле, обширная инфильтрация ТАМ, как было показано, коррелирует с метастазами рака и плохим прогнозом при различных карциномах человека. ТАМ способствует метастазам рака посредством нескольких механизмов, включая ангиогенез опухоли, рост опухоли и миграцию и инвазию опухолевых клеток. По существу, контроль над различными факторами, высвобождающими и/или стимулирующими ТАМ, то есть VEGF, является важным способом снижения, прекращения или предупреждения роста опухоли и метастаза раковых клеток.
Секреция сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) опухоль-инфильтрующими макрофагами в ответ на гипоксическое микроокружение опухоли, как хорошо известно, индуцирует образование кровеносных сосудов (ангиогенез), которое приводит к увеличению роста опухоли и метастазам. Ранее было продемонстрировано, что, в дополнение к продуцированию VEGF, мононуклеарные фагоциты, стимулированные гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) в условиях гипоксии, также секретируют высокие уровни растворимой формы рецептора VEGF (sVEGFR-1), который нейтрализует VEGF и ингибирует биологическую активность (Eubank TD, et al, «GM-CSF induces expression of soluble VEGF receptor-1 from human monocytes and inhibits angiogenesis in mice,» Immunity, 2004; 21(6): 8331-842). Кроме того, было установлено, что гипоксия-индуцируемый фактор-1 альфа (HIF-1α) контролирует продуцирование макрофагов VEGF, в то время как гипоксия-индуцируемый фактор альфа-2 (HIF-2α) контролирует продуцирование макрофагов sVEGFR-1, таким образом, демонстрируя противоположные роли HIF в регуляции ангиогенеза. Кроме того, HIF-1α демонстрирует проангиогенное поведение посредством его действия на VEGF, и HIF-2α демонстрирует антиангиогенное поведение путем индуцирования продуцирования эндогенного ингибитора VEGF, sVEGFR-1 (Eubank TD, et al, «Opposing roles for HIF-1α and HIF-2α in the regulation of angiogenesis by mononuclear phagocytes,» Blood, 2011; 117(1):323-332). Таким образом, существуют конкретные и независимые роли для HIF-1α и HIF-2α в регуляции ангиогенеза и роста опухоли.
Индуцируемые гипоксией факторы HIF-1α и HIF-2α являются конститутивно транскрибированными, однако оба быстро деградирует с помощью процесса, который начинается с гидроксилирования ключевых HIF пролиновых аминокислот. Существует три известных изоформы из домена пролилгидроксилазы (PHD) белков (то есть, 4-пролилгидроксилазные ферменты), каждая из которых действует, чтобы деградировать различные HIF. Например, PHD2 гидроксилирует HIF-1α, в то время как PHD3 гидроксилирует HIF-2α. Так как стабилизация HIF-1α увеличивает VEGF, ингибирование PHD2 увеличивает ангиогенез. В противоположность этому, стабилизация HIF-2α уменьшает VEGF посредством продуцирования макрофагов sVEGFR-1 и ингибирование PHD3 подавляет ангиогенез и обеспечивает способ лечения рака. (Пролилгидроксилирование генерирует сайт связывания для убиквитинлигазного комплекса, содержащего белок-супрессор опухолевого роста фон Гиппеля-Линдау (von Hippel-Lindau (VHL)), что в результате приводит к разрушению HIFa. Кроме того, функция транскрипционной активации HIFα модулируется дальше путем гидроксилирования аспарагина FIH (фактор-ингибирующим HIF), который влияет на пополнение соактиваторов р300 и СВР. Таким образом, гидроксилирование HIF путем PHD начинается необратимый процесс, который истощает клеточные уровни HIF.)
В данной заявке раскрыты способы воздействия на рост опухоли за счет стабилизации HIF-2α He желая быть ограниченными какой-либо теорией, {[5-(3-фторфенил)-3 -гидроксипиридин-2-карбонил] амино} уксусная кислота стабилизирует HIF-2α путем ингибирования PHD3, таким образом, позволяя макрофагам секретировать большие количества VEGF супрессора sVEGFR-1 (и, возможно, другим клеткам в опухоли, которые включают раковые клетки и другие стромальные клетки).
В дополнение к известному регулирования sVEGFR-1, HIF-2α стабилизатор, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусная кислота, неожиданно подавлял VEGF в гипоксических эмбриональных фибробластах (см. Фигуру 1). Этот эффект был сохранен в эмбриональных фибробластах при отсутствии HIF-1α.
В данной заявке раскрыты способы воздействия на рост опухоли за счет стабилизации HIF-2α. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусная кислота стабилизирует HIF-2α путем ингибирования PHD3, таким образом, неожиданно подавляя продуцирование VEGF в опухолевых клетках (в том числе раковых клетках и стромальных клетках).
В последние годы гипотеза Варбурга (Warburg) вновь привлекла к себе внимание в связи с открытиями, связывающими ослабленную митохондриальную функцию, а также ослабленное дыхание, с ростом, делением и распространением опухолевых клеток. Тело часто убивает поврежденные клетки путем апоптоза, механизма самоуничтожения, который включает митохондрии, но этот механизм может ослабевать в раковых клетках, где митохондрии закрыты. Реактивация митохондрии в раковых клетках могла бы перезапустить свою программу апоптоза. В дополнение к просто существующей реакции на ослабленное дыхание, увеличение гликолиза в опухолевых клетках также могло бы обеспечить углерод-содержащие конструктивные блоки, необходимые для репликации клеток.
В дополнение к понижающему регулированию VEGF HIF-2α стабилизатор, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино} уксусная кислота, неожиданно понижающе регулировал PGK ключевой гликолитический фермент в гипоксических эмбриональных фибробластах (см. Фигуру 2). Этот эффект сохранялся в эмбриональных фибробластах при отсутствии HIF-1α.
В данной заявке раскрыты способы воздействия на рост опухоли за счет стабилизации HIF-2α. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино} уксусная кислота стабилизирует HIF-2α путем ингибирования PHD3, таким образом, неожиданно подавляя продуцирование PGK. в опухолевых клетках.
Раскрытый HIF-2α стабилизатор и его пролекарства могут быть использованы для предотвращения, снижения, минимизирования, контроля и/или уменьшения роста опухоли и/или опухолевых метастаз в организме людей и животных. Раскрытый HIF-2α стабилизатор и его пролекарства также могут быть использованы для того, чтобы замедлить темпы роста первичной опухоли. Раскрытый HIF-2α стабилизатор и его пролекарства при введении субъекту, нуждающемуся в лечении, могут быть использованы для того, чтобы остановить распространение раковых клеток. Таким образом, HIF-2α стабилизатор и его пролекарства, раскрытые в данной заявке, могут быть введены как часть комбинированной терапии с одним или несколькими лекарственными средствами или другими фармацевтическими агентами. При использовании в качестве части комбинированной терапии, снижение метастазов и уменьшение роста первичной опухоли, предоставляемое раскрытым HIF-2α стабилизатором и его пролекарствами, позволяет более эффективное и результативное использование любого лечения фармацевтическими или лекарственными средствами, которое используется для лечения пациента. Кроме того, контроль метастазов с помощью раскрытого HIF-2α стабилизатора и его пролекарств дает субъекту большую возможность ограничивать заболевание в одной месте.
Раскрытое соединение, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусная кислота, ее соли и сложноэфирное и амидное пролекарство имеют антитуморогенные свойства, при которых соединения:
1. Заставляют клетки в условиях гипоксии демонстрировать существенное снижение количества сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), который присутствует, таким образом, удаляя один фактор, который стимулирует ангиогенез в опухолевом микроокружении, и значит, снижает способность опухолевых клеток использовать ангиогенез, как средство обеспечения питательными веществами для роста. Этот факт подтвержден на Фигурах 1А и 1В;
2. Заставляют клетки в условиях гипоксии демонстрировать значительное снижение количества фосфоглицераткиназы, присутствующей в клетке, при этом опухолевые клетки, как было показано, не использовали окислительное фосфорилирование как источник энергии вместо гликолиза. Таким образом, это устраняет или уменьшает способность опухолевых клеток вырабатывать энергию для роста. Этот факт подтвержден на Фигурах 2А и 2В; и
3. Вызывает стимулирование s-VEGFRl (растворимый VEGF), который является конкурирующим рецептором для VEGF и, следовательно, уменьшает количество VEGF, которое может стимулировать ангиогенез. Этот факт подтвержден на Фигуре 10.
По существу, раскрытые соединения обеспечивают атаку по трем направлениям на опухолевые клетки; преодолевая PGK, и, таким образом, устраняя основной источник энергии, снижая VEGF и, таким образом, обеспечивая сниженную способность опухолевых клеток получать питательные вещества и кровоснабжение посредством ангиогенеза, и путем увеличения s-VEGF, что дополнительно снижает способность опухоли индуцировать ангиогенез.
В данной заявке раскрыты способы предупреждения метастазов злокачественных опухолей или других раковых клеток, а также снижения скорости роста опухоли. Способы включают введение эффективного количества одного или больше из раскрытых соединений субъекту, у которого диагностировали злокачественную опухоль или раковые клетки, или субъекту, имеющему опухоль или раковые клетки. Например, способ лечения субъекта, у которого диагностировали злокачественную опухоль или раковые клетки, включает введение субъекту эффективного количества {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты. В другом примере, способ лечения субъекта, имеющего злокачественную опухоль или раковые клетки, включает введение субъекту эффективного количества {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино} уксусной кислоты.
В данной заявке раскрыт способ стабилизации индуцируемого гипоксией фактора-2 альфа (HIF-2α), который включает введение субъекту эффективного количества раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств. Например, способ стабилизации индуцируемого гипоксией фактора-2 альфа (HIF-2α) включает введение субъекту эффективного количества {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты.
Кроме того, в данной заявке раскрыт способ лечения рака, который включает введение субъекту эффективного количества раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств. Например, способ лечения рака, который включает введение субъекту эффективного количества {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты.
Кроме того, в данной заявке раскрыт способ уменьшения ангиогенеза опухоли у субъекта, имеющего рак, который включает введение субъекту эффективного количества раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств. Например, способ уменьшения ангиогенеза опухоли у субъекта, имеющего рак, который включает введение субъекту эффективного количества {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты.
Еще, кроме того, в данной заявке раскрыт способ уменьшения ангиогенеза опухоли у субъекта, у которого диагностировали рак, который включает введение субъекту эффективного количества раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств. Например, способ уменьшения ангиогенеза опухоли у субъекта, у которого диагностировали рак, который включает введение субъекту эффективного количества {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты.
Еще, кроме того, в данной заявке раскрыт способ снижения сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в клетке in vitro, in vivo или ex vivo посредством ингибирования связывания VEGF с VEGFR, который включает введение в клетку эффективного количества раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств. В одном варианте осуществления, клетка является раковой клеткой. В другом варианте осуществления, клетка является клеткой человека. В еще дополнительном варианте осуществления, клетка является раковой клеткой человека. Например, способ снижения сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в клетке in vitro, in vivo или ex vivo, который включает введение в клетку эффективного количества {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты.
Кроме того, дополнительно в данной заявке раскрыт способ увеличения секреции растворимого рецептора-1 сосудистого эндотелиального фактора роста (sVEGF-1) клеткой in vitro, in vivo или ex vivo, который включает введение в клетку эффективного количества раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств. В одном варианте осуществления, клетка является клеткой, ассоциированной с опухолью. В другом варианте осуществления, клетка является клеткой человека, ассоциированной с опухолью. В еще дополнительном варианте осуществления, клетка является раковой клеткой человека. Например, способ увеличения секреции растворимого рецептора-1 сосудистого эндотелиального фактора роста (sVEGF-1) клеткой in vitro, in vivo или ex vivo, который включает введение в клетку эффективного количества {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино} уксусной кислоты.
Еще дополнительно раскрыт способ контролирования роста опухоли у субъекта, который включает введение субъекту эффективного количества раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарства.
В данной заявке раскрыто применение раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарства для производства лекарственного средства для лечения рака. Например, применение {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты для производства лекарственного средства для лечения рака.
Кроме того, в данной заявке раскрыто применение раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств для производства лекарственного средства для предупреждения метастазов злокачественных опухолей или других раковых клеток и для уменьшения роста опухоли. Например, применение {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты для производства лекарственного средства для предупреждения метастазов злокачественных опухолей или других раковых клеток и уменьшения роста опухоли.
В данной заявке раскрыто применение раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарства в лечении рака. Например, применение {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты в лечении рака.
Кроме того, в данной заявке раскрыто применение раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарства для предупреждения метастазов злокачественных опухолей или других раковых клеток и для уменьшения роста опухоли. Например, применение {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты для предупреждения метастазов злокачественных опухолей или других раковых клеток и для уменьшения роста опухоли.
Кроме того, дополнительно в данной заявке раскрыто применение раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарства для снижения ангиогенеза опухоли. Например, применение {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты для снижения ангиогенеза опухоли.
Кроме того, дополнительно в данной заявке раскрыто применение раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарства для производства лекарственного средства для снижения ангиогенеза опухоли. Например, применение {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты для производства лекарственного средства для снижения ангиогенеза опухоли.
Еще дополнительно в данной заявке раскрыт способ лечения рака, который включает введение субъекту эффективного количества раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств и эффективного количества одного или больше химиотерапевтических средств, при этом раскрытый HIF-2α стабилизатор и/или его пролекарства и одно или больше химиотерапевтических средств вводят в любом порядке. Например, способ лечения рака, который включает введение субъекту эффективного количества {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты и эффективного количества одного или больше химиотерапевтических средств. Неограничивающие примеры химиотерапевтических средств включают таксол, IL-2, гемцитабин, эрлотиниб, доксил, иринортекан и бевацизумаб.
Еще также дополнительно в данной заявке раскрыт способ предупреждения метастазов раковых клеток, который включает введение субъекту, имеющему рак, эффективного количества раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств и эффективного количества одного или больше химиотерапевтических средств, при этом раскрытый HIF-2α стабилизатор и/или его пролекарства и одно или больше химиотерапевтических средств вводят в любом порядке. Например, способ предупреждения метастазов раковых клеток, который включает введение субъекту, имеющему рак, эффективного количества {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты и эффективного количества одного или больше химиотерапевтических средств. Неограничивающие примеры химиотерапевтических средств включают таксол, IL-2, гемцитабин, эрлотиниб, доксил, иринортекан и бевацизумаб.
Еще также дополнительно в данной заявке раскрыт способ лечения субъекта, у которого диагностировали рак, который включает введение субъекту, у которого диагностировали рак, эффективного количества раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств и эффективного количества одного или больше химиотерапевтических средств, при этом раскрытый HIF-2α стабилизатор и/или его пролекарства и одно или больше химиотерапевтических средств вводят в любом порядке. Например, способ лечения субъекта, у которого диагностировали рак, который включает введение субъекту, у которого диагностировали рак, эффективного количества {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино} уксусной кислоты и эффективного количества одного или больше химиотерапевтических средств. Неограничивающие примеры химиотерапевтических средств включают таксол, IL-2, гемцитабин, эрлотиниб, доксил, иринортекан и бевацизумаб.
Ниже приведены неограничивающие примеры рака, которые можно лечить с помощью раскрытых способов и композиций: острый лимфобластный рак; острая миелоцитарная лейкемия; адренокортикальная карцинома; адренокортикальная карцинома детского возраста; рак аппендикса; базально-клеточная карцинома; рак желчных протоков, внепеченочный; рак мочевого пузыря; рак костей; остеосаркома и злокачественная фиброзная гистиоцитома; глиома ствола мозга, детского возраста, опухоль головного мозга, у взрослых; опухоль головного мозга, глиома ствола мозга, детского возраста; опухоль головного мозга, атипичная тератоидная/рабдоидная опухоль центральной нервной системы, детского возраста; эмбриональные опухоли центральной нервной системы; астроцитома мозжечка; церебральная астроцитома/злокачественная глиома; краниофарингиома; эпендимобластома; эпендимома; медуллобластома; медуллоэпителиома; шишковидные паренхимные опухоли промежуточной дифференциации; супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли и пинеобластома; глиома зрительного пути и гипоталамуса; опухоли головного мозга и спинного мозга; рак молочной железы; бронхиальные опухоли; лимфома Беркитта; карциноидная опухоль; карциноидная опухоль желудочно-кишечного тракта; атипичная тератоидная/рабдоидная опухоль центральной нервной системы; эмбриональные опухоли центральной нервной системы; лимфома центральной нервной системы; астроцитома мозжечка; церебральная астроцитома/злокачественная глиома, детского возраста; рак шейки матки; хордома детского возраста; хроническая лимфоцитарная лейкемия; хроническая миелогенная лейкемия; хронические миелопролиферативные растройства; рак толстой кишки; рак толстой и прямой кишок; краниофарингиома; кожная Т-клеточная лимфома; рак пищевода; семейство опухолей Юинга; внегонадная гоноцитома; внепеченочный рак желчных протоков; рак глаза, внутриглазная меланома; рак глаз, ретинобластома; рак желчного пузыря; желудочный рак (рак желудка); карциноидная опухоль желудочно-кишечного тракта; стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта (GIST); гоноцитома, экстракраниальная; гоноцитома, внегонадная; гоноцитома, яичников; гестационная трофобластическая опухоль; глиома; глиома ствола мозга детского возраста; глиома, детского возраста церебральная астроцитома; глиома детского возраста зрительного пути и гипоталамуса; волосатоклеточный лейкоз, рак головы и шеи; гепатоцеллюлярный (печени) рак; гистиоцитоз, клетки Лангерганса; лимфома Ходжкина; гипофарингеальный рак; глиома гипоталамуса и зрительного пути; внутриглазная меланома; опухоли островков поджелудочной железы; рак почек (почечно-клеточный рак); лангергансоклеточный гистиоцитоз; рак гортани; лейкемия, острая лимфобластная; лейкемия, острая миелоидная; лейкемия, хроническая лимфоцитарная; лейкемия, хроническая миелогенная; лейкемия, волосатоклеточная; рак губ и полости рта; рак печени; рак легких, немелкоклеточный; рак легких, мелкоклеточный; лимфома, связанная со СПИДом; лимфома, Беркитта; лимфома, кожная Т-клеточная; лимфома, Ходжкинская; лимфома, неходжкинская; лимфома, первичная центральной нервной системы; макроглобулинемия, Вальденстрема; злокачественная фиброзная гистиоцитома кости и остеосаркома; медуллобластома; меланома; меланома, внутриглазная (глазная); клеточная карцинома Меркеля; мезотелиома; метастатический плоскоклеточный рак шеи с латентной первичностью; рак рта; синдром множественной эндокринной неоплазии, (детского возраста); множественная миелома/новообразование плазматических клеток; грибовидный микоз; синдромы миелодисплазии; миелодисплазия-миелопролиферативные растройства; миелогенная лейкемия, хроническая; миелоидная лейкемия, взрослых острая; миелоидная лейкемия, детского возраста, острая; миелома, множественная; миелопролиферативные растройства, хронические; рак носовой полости и околоносовых пазух; рак носоглотки; нейробластома; немелкоклеточный рак легких; рак ротовой полости; рак полости рта; рак ротоглоточной поверхности; остеосаркома и злокачественная фиброзная гистиоцитома кости; рак яичников; эпителиальный рак яичников; гоноцитома яичников; пограничная опухоль яичника; рак поджелудочной железы; рак поджелудочной железы, опухоли островков поджелудочной железы; папилломатоз; паратиреоидный рак; рак полового члена; фарингеальный рак; феохромоцитома; шишковидные паренхимные опухоли промежуточной дифференциации; пинеобластома и супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли; опухоль гипофиза; новообразование плазматических клеток/множественная миелома; плевролегочная бластома; первичная лимфома центральной нервной системы; рак предстательной железы; рак прямой кишки; почечно-клеточный (почки) рак; рак почечной лоханки и мочеточника, переходно-клеточный рак; карцинома дыхательных путей, включая NUT ген на хромосоме 15; ретинобластома; рабдомиосаркома; рак слюнной железы; саркома, семейство опухолей Юинга; саркома Капоши; саркома мягких тканей; саркома матки; синдром Сезари; рак кожи (немеланомный); рак кожи (меланомный); саркома кожи, клетки Меркеля; мелкоклеточный рак легких; рак тонкого кишечника; саркома мягких тканей; плоскоклеточная карцинома, плоскоклеточный рак шеи со скрытой первичностью, метастатический; рак живота (желудка); супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли; Т-клеточная лимфома, кожная; рак яичка; рак горла; тимома и тимусная карцинома; рак щитовидной железы; переходно-клеточный рак почечной лоханки и мочеточника; трофобластическая опухоль, гестациозная; рак уретры; рак матки, эндометриальный; саркома матки; вагинальный рак; рак вульвы; макроглобулинемия Вальденстрема; и опухоль Вильмса.
Кроме того, в данной заявке раскрыты способы лечения рака, которые включают введение субъекту эффективного количества соединения формулы:
или его фармацевтически приемлемой соли.
3
Рак может быть любым раком, описанным в данной заявке, включая VEGF-зависимые раки. Так как кислородная диффузионная длина составляет приблизительно 150 мкм, клетки, которые составляют солидную опухоль, которая растет свыше 2 мм, не могут пролиферировать без доступа к ближайшей сосудистой сети для обмена кислородом и отходами. В этом случае, низкий кислород стабилизирует HIF-1α в опухолевых клетках и продуцирует сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), который является пролиферирующим фактором для ендотелиальных клеток, которые входят в состав кровеносных сосудов. Так как VEGF является ключевым регулятором ангиогенеза, секвестрация VEGF посредством растворимой формы VEGF рецептора-1 (sVEGFR-1) регулирует ангиогенез. Ингибирование пролилгидроксилазы 3 (PHD3) одним или несколькими из соединений, раскрытых в данной заявке, стабилизирует HIF-2α. В то время как опухолевые клетки сами не продуцируют sVEGFR-1, соединения, раскрытые в данной заявке, могут повышать продуцирование sVEGFR-1 из моноцитов и макрофагов, которые прибывают в опухоли в ответ на воспалительные сигналы. Таким образом, любые опухоли, которые отвечают на VEGF, чтобы пролиферировать, являются потенциальными мишенями для соединений, раскрытых в данной заявке, поскольку их активность может, частично, повышать продуцирование sVEGFR-1.
Композиции
В данной заявке раскрыты композиции, которые могут быть использованы для лечения рака у субъекта, для лечения рака у субъекта, у которого диагностировали рак, для предупреждения роста опухоли у субъекта, для предупреждения метастазов раковых клеток у субъекта, при этом композиции содержат эффективное количество одного или больше соединений, раскрытых в данной заявке. Кроме того, в данной заявке раскрыты композиции, которые могут быть использованы для лечения опухолей у человека или других млекопитающих.
Один аспект относится к композиции, содержащей:
a) эффективное количество одного или больше раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств; и
b) один или больше фармацевтически приемлемых ингредиентов. Другой аспект относится к композиции, содержащей:
a) эффективное количество одного или больше раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств; и
b) эффективное количество одного или больше дополнительного химиотерапевтического средства;
при этом раскрытые соединения и одно или больше дополнительных химиотерапевтических средств могут быть введены вместе или в любом порядке.
Один вариант осуществления относится к композиции, содержащей:
a) эффективное количество одного или больше раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств; и
b) эффективное количество таксола;
при этом раскрытые соединения и таксол могут быть введены вместе или в любом порядке.
Другой вариант осуществления относится к композиции, содержащей:
a) эффективное количество одного или больше раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств; и
b) эффективное количество гемцитабина;
при этом раскрытые соединения и гемцитабин могут быть введены вместе или в любом порядке.
Дальнейший вариант осуществления относится к композиции, содержащей:
а) эффективное количество одного или больше раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств; и
b) эффективное количество эрлотиниба;
при этом раскрытые соединения и эрлотиниб могут быть введены вместе или в любом порядке.
Еще дополнительный вариант осуществления относится к композиции, содержащей:
a) эффективное количество одного или больше раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств; и
b) эффективное количество доксила;
при этом раскрытые соединения и доксид могут быть введены вместе или в любом порядке.
Еще следующий вариант осуществления относится к композиции, содержащей:
a) эффективное количество одного или больше раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств; и
b) эффективное количество иринортекана;
при этом раскрытые соединения и иринортекан могут быть введены вместе или в любом порядке.
Еще следующий вариант осуществления относится к композиции, содержащей:
a) эффективное количество одного или больше раскрытого HIF-2α стабилизатора и/или его пролекарств; и
b) эффективное количество бевацизумаба;
при этом раскрытые соединения и бевацизумаб могут быть введены вместе или в любом порядке.
«Химиотерапевтическое средство» или «химиотерапевтическое соединение» представляет собой химическое соединение, полезное в лечении рака. Химиотерапевтические противораковые средства, которые могут быть использованы в комбинации с теми, что раскрыты в данной заявке, включает, но не ограничиваются приведенным, митотические ингибиторы (алкалоиды барвинка). Они включают винкристин, винбластин, виндезин и Navelbine™ (винорелбин-5'-норангидробластин). В еще других вариантах осуществления, Химиотерапевтические противораковые средства включают ингибиторы топоизомеразы I, такие как камптотециновые соединения. Как используется в данной заявке, «камптотециновые соединения» включают Camptosar™ (иринотекан HCL), Hycamtin™ (топотекан HCL) и другие соединения, производные камптотецина и его аналогов. Другая категория химиотерапевтических противораковых средств, которые могут быть использованы в способах и композициях в соответствии с настоящим раскрытием, представляет собой производные подофиллотоксина, такие как этопозид, тенипозид и митоподозид. Настоящее раскрытие, кроме того, охватывает другие химиотерапевтические противораковые средства, известные как алкилирующие агенты, которые алкилируют генетический материал в опухолевых клетках. Они включают без ограничения цисплатин, циклофосфамид, азотистый иприт, триметилентиофосфорамид, кармустин, бусульфан, хлорамбуцил, белустин, урамустин, кломафазин и дакарбазин. Настоящее раскрытие охватывает антиметаболиты в качестве химиотерапевтических средств. Примеры таких типов агентов включают цитозинарабинозид, фторурацил, метотрексат, меркаптопурин, азатиоприм и прокарбазин. Дополнительная категория химиотерапевтических противораковых средств, которые могут быть использованы в способах и композициях в соответствии с настоящим раскрытием, включает антибиотики. Примеры включают, без ограничения, доксорубицин, блеомицин, дактиномицин, даунорубицин, митрамицин, митомицин, митомицин С и дауномицин. Существуют многочисленные липосомальные составы, коммерчески доступные для данных соединений. Настоящее раскрытие, кроме того, охватывает другие химиотерапевтические противораковые средства, включая, без ограничения, противоопухолевые антитела, дакарбазин, азацитидин, амсакрин, мелфалан, ифосфамид и митоксантрон.
Раскрытые соединения в данной заявке могут быть введены самостоятельно или в комбинации с другими противоопухолевыми агентами, включая цитотоксические/антинеопластические средства и антиангиогенные средства. Цитотоксические/антинеопластические средства определяют как агенты, которые атакуют и убивают раковые клетки. Некоторые цитотоксические/антинеопластические агенты представляют собой алкилирующие агенты, которые алкилируют генетический материал в опухолевых клетках, например, цисплатин, циклофосфамид, азотистый иприт, триметилентиофосфорамид, кармустин, бусульфан, хлорамбуцил, белустин, урамустин, кломафазин и дакарбазин. Другие цитотоксические/антинеопластические агенты представляют собой антиметаболиты для опухолевых клеток, например, цитозинарабинозид, фторурацил, метотрексат, меркаптопурин, азатиоприм и прокарбазин. Другие цитотоксические/антинеопластические средства представляют собой антибиотики, например, доксорубицин, блеомицин, дактиномицин, даунорубицин, митрамицин, митомицин, митомицин С и дауномицин. Существуют многочисленные липосомальные составы, коммерчески доступные для данных соединений. Еще другие цитотоксические/антинеопластические агенты представляют собой митотические ингибиторы (алкалоиды барвинка). Они включают винкристин, винбластин и этопозид. Разнообразные цитотоксические/антинеопластические средства включают таксол и его производные, L-аспарагиназу, противоопухолевые антитела, дакарбазин, азацитидин, амсакрин, мелфалан, VM-26, ифосфамид, митоксантрон и виндезин.
Антиангиогенные агенты хорошо известны специалистам в данной области техники из уровня техники. Приемлемые антиангиогенные агенты для использования в способах и композициях в соответствии с настоящим изобретением включают анти-VEGF антитела, в том числе гуманизированные и химерные антитела, анти-VEGF аптамеры и антисмысловые олигонуклеотиды. Другие известные ингибиторы ангиогенеза включают ангиостатин, эндостатин, интерфероны, интерлейкин 1 (включая α и β) интерлейкин 12, ретиноевую кислоту и тканевые ингибиторы металлопротеиназы-1 и -2. (TIMP-1 и -2). Также могут быть использованы малые молекулы, в том числе топоизомеразы, такие как разоксан, ингибитор топоизомеразы II с антиангиогенной активностью.
Другие противораковые агенты, которые могут быть использованы в комбинации с раскрытыми соединениями включают, но не ограничиваются приведенным: ацивицин; акларубицин; акодазола гидрохлорид; акронин; адозелезин; альдеслейкин; альтретамин; амбрмицин; аметантрона ацетат; аминоглютетимид; амсакрин; анастрозол; антрамицин; аспарагиназа; асперлин; азацитидин; азетепа; азотомицин; батимастат; бензодепа; бикалутамид; бисантрена гидрохлорид; биснафида димезилат; бизелезин; блеомицина сульфат; бреквинар натрия; бропиримин; бисульфан; кактиномицин; калустерон; карацемид; карбетимер; карбоплатин; кармустин; карубицина гидрохлорид; карзелезин; седефингол; хлорамбуцил; циролемицин; цисплатин; кладрибин; криснатола мезилат; циклофосфамид; цитарабин; дакарбазин; дактиномицин; даунорубицина гидрохлорид; децитабин; дексормаплатин; дезагуанин; дезагуанина мезилат; диазиквон; доцетаксел; доксорубицин; доксорубицина гидрохлорид; дролоксифен; дролоксифена цитрат; дромостанолона пропионат; дуазомицин; эдатрексат; эфлорнитина гидрохлорид; элсамитруцин; энлоплатин; энпромат; эпипропидин; эпирубицина гидрохлорид; эрбулозол; эзорубицина гидрохлорид; эстрамустин; эстрамустинфосфат натрия; этанидазол; этопозид; этопозида фосфат; этоприн; фадрозола гидрохлорид; фазарабин; фенретинид; флоксуридин; флударабина фосфат; фторурацил; фторцитабин; фосквидон; фостриецин натрия; гемцитабин; гемцитабина гидрохлорид; гидроксимочевина; идарубицина гидрохлорид; ифосфамид; илмофозин; интерлейкин II (включая рекомбинантный интерлейкин II, или rIL2), интерферон альфа-2а; интерферон альфа-2b; интерферон альфа-n1; интерферон альфа-n3; интерферон бета-Ia; интерферон гамма-1b; ипроплатин; иринотекана гидрохлорид; ланреотида ацетат; летрозол; леупролида ацетат; лиарозола гидрохлорид; лометрексол натрия; ломустин; лозоксантрона гидрохлорид; масопрокол; майтанзин; мехлоретамина гидрохлорид; мегестрола ацетат; меленгестрола ацетат; мельфалан; меногарил; меркаптопурин; метотрексат; метотрексат натрия; метоприн; метуредепа; митиндомид; митокарцин; митокромин; митогиллин; митомалцин; митомицин; митоспер; митотан; митоксантрона гидрохлорид; микофеноловая кислота; нокодазол; ногаламицин; ормаплатин; оксисуран; паклитаксел; пегаспаргаза; пелиомицин; пентамустин; пепломицина сульфат; перфосфамид; пипоброман; пипосульфан; пироксантрона гидрохлорид; пликамицин; пломестан; порфимер натрия; порфиромицин; преднимустин; прокарбазина гидрохлорид; пуромицин; пуромицина гидрохлорид; пиразофурин; рибоприн; роглетимид; сафингол; сафингола гидрохлорид; семустин; симтразен; спарфозат натрия; спарсомицин; спирогермания гидрохлорид; спиромустин; спироплатин; стрептонигрин; стрептозоцин; сулофенур; тализомицин; текогалан натрия; тегафур; телоксантрона гидрохлорид; темопорфин; тенипозид; тероксирон; тестолактон; тиамиприн; тиогуанин; тиотепа; тиазофурин; тирапазамин; торемифена цитрат; трестолона ацетат; трицирибина фосфат; триметрексат; триметрексата глюкуронат; трипторелин; тубузола гидрохлорид; урамустин; уредепа; вапреотид; вертепорфин; винбластина сульфат; винкристина сульфат; виндезин; виндезина сульфат; винепидина сульфат; винглицината сульфат; винлеурозина сульфат; винорелбина тартрат; винрозидина сульфат; винзолидина сульфат; ворозол; зениплатин; зиностатин; зорубицина гидрохлорид. Другие противораковые лекарственные средства включают, но не ограничивается приведенным: 20-эпи-1,25 дигидроксивитамин D3; 5-этинилурацил; абиратерон; акларубицин; ацилфулвен; адецилпенол; адозелезин; альдеслейкин, ALL-TK антагонисты; алтретамин; амбамустин; амидокс; амифостин; аминолевулиновая кислота; амрубицин; амсакрин; анагрелид; анастрозол; андрографолид; ингибиторы ангиогенеза; антагонист D; антагонист G; антареликс; анти-дорзализационный морфогенетический белок-1; антиандроген, карциномы предстательной железы; антиэстроген; антинеопластон; антисмысловые олигонуклеотиды; афидиколин глицинат; модуляторы гена апоптоза; регуляторы апоптоза; апуриновую кислоту; apa-CDP-DL-PTBA; аргининдезаминазу; асулакрин; атаместан; атримустин; аксинастатин 1; аксинастатин 2; аксинастатин 3; азасетрон; азатоксин; азатирозин; производные баккатина III; баланол; батимастат; BCR/ABL антагонисты; бензохлорины; бензоилстауроспорин; бета-лактамные производные; бета-алетин; бетакламицин В; бетулиновую кислоту; ингибитор bFGF; бикалутамид; бисантрен; бисазиридинилспермин; биснафид; бистратен А; бизелезин; брефлат; бропиримин; будотитан; бутионина сульфоксимин; кальципотриол; кальфостин С; производные камптотецина; канарипокс IL-2; капецитабин; карбоксамид-амино-триазол; карбоксиамидотриазол; CaRest M3; CARN 700; производная ингибитора хряща; карзелезин; ингибиторы казеинкиназы (ICOS); кастаноспермин; цекропин В; цетрореликс; хлорины; хлорхиноксалина сульфонамид; цикапрост; цис-порфирин; кладрибин; аналоги кломифена; клотримазол; коллисмицин; коллисмицин В; комбретастатин А4; аналог комбретастатина; конагенин; крамбесцидин 816; криснатол; криптофицин 8; производные криптофицина А; курацин А; циклопентантрахиноны; циклоплатам; суремицин; окфосфат цитарабина; цитолитический фактор; цитостатин; дакликсимаб; децитабин; дегидродидемнин В; деслорелин; дексаметазон; дексифосфамид; дексразоксан; дексверапамил; диазиквон; дидемнин В; дидокс; диэтилнорспермин; дигидро-5-азацитидин; дигидротаксол, 9-; диоксамицин; дифенилспиромустин; доцетаксел; докозанол; доласетрон; доксифлуридин; дролоксифен; дронабинол; дуокармицин SA; эбселен; экомустин; эделфозин; эдреколомаб; эфлорнитин; элемен; эмитефур; эпирубицин; эпристерид; аналог эстрамустина; агонисты эстрогена; антагонисты эстрогена; этанидазол; этопозида фосфат; эксеместан; фадрозол; фазарабин; фенретинид; филграстим; финастерид; флавопиридол; флезеластин; флуастерон; флударабин; фтордауноруницина гидрохлорид; форфенимекс; форместан; фостриецин; фотемустин; гадолиния тексафирин; нитрат галлия; галоцитабин; ганиреликс; ингибиторы желатиназы; гемцитабин; ингибиторы глутатиона; гепсульфам; херегулин; гексаметилен бисацетамид; гиперицин; ибандроновую кислоту; идарубицин; идоксифен; идрамантон; илмофозин; иломастат; имидазоакридоны; имиквимод; иммуностимуляторные пептиды; инсулиноподобный ингибитор рецептора фактора-1 роста; агонисты интерферона; интерфероны; интерлейкины; иобенгуан; иододоксорубицин; ипомеанол, 4-; ироплакт; ирзогландин; изобенгазол; изогомогаликондрин В; итасетрон; джасплакинолид, кахалалид F; ламелларин-N триацетат; ланреотид; леинамицин; ленограстим; сульфат лентинана; лептолстатин; летрозол; фактор, ингибирующий лейкемию; лейкоцитарный альфа-интерферон; леупролид + эстроген + прогестерон; лейпрорелин; левамизол; лиарозол; аналог линейного полиамина; липофильный пептид дисахарида; липофильные платиновые соединения; лиссоклинамид 7; лобаплатин; ломбрицин; лометрексол; лонидамин; лозоксантрон; ловастатин; локсорибин; лурторекан; лютеция тексафирин; лизофиллин; литические пептиды; мейтанзин; манностатин А; маримастат; мазопрокол; маспин; ингибиторы матрилизина; ингибиторы матричной металлопротеиназы; меногарил; мербарон; метерелин; метиониназу; метоклопрамид; ингибитор MIF; мифепристон; милтефозин; миримостим; несопряженная двунитиевая РНК; митогуазон; митолактол; аналоги митомицина; митонафид; митотоксиновый фактор роста фибробластов-сапорин; митоксантрон; мофаротен; молграмостим; моноклональное антитело, человеческий хорионический гонадотропин; монофосфориллипид + клеточной стенки микобактерии sk; мопидамол; ингибитор гена множественной лекарственной устойчивости; терапия на основе множественного опухолевого супрессора 1; горчичный противораковый агент; микапероксид В; экстракт клеточной стенки микобактерии; мириапорон; N-ацетилдиналин; N-замещенные бензамиды; нафарелин; нагрестип; налоксон + пентазоцин; напавин; нафтерпин; нартограстим; недаплатин; неморубицин; неридроновую кислоту; нейтральную эндопептидазу; нилутамид; низамицин; модуляторы азотного оксида; нитроксидный антиоксидант; нитруллин; O6-бензилгуанин; октреотид; окиценон; олигонуклеотиды; онапристон; ондансетрон; ондансетрон; орацин; пероральный цитокиновый индуктор; ормаплатин; осатерон; оксалиплатин; оксауномицин; паклитаксел; аналоги паклитаксела; производные паклитаксела; палауамин; пальмитоилризоксин; памидроновую кислоту; панакситриол; паномифен; парабактин; пазеллиптин; пегаспаргазу; пелдезин; пентозанполисульфат натрия; пентостатин; пентрозол; перфлуброн; перфосфамид; периллиловый спирт; феназиномицин; фенилацетат; ингибиторы фосфатазы; пицибанил; пилокарпина гидрохлорид; пирарубицин; пиритрексим; плацетин А; плацетин В; ингибитор активатора плазминогена; комплексы платины; соединения платины; триамин-платиновый комплекс; порфимер натрия; порфиромицин; преднизолон; пропил бис-акридон; простагландин J2; протеасомные ингибиторы; иммуномодулятор на основе белка А; ингибитор протеинкиназы С; ингибиторы протеинкиназы С, микроводоросли; ингибиторы протеинтирозинфосфатазы; ингибиторы пуриннуклеозидфосфорилазы; пурпурины; пиразолоакридин; пиридоксилированный конъюгат гемоглобина и полиоксиэтилена; антагонисты raf; ралтитрексед; рамосетрон; ингибиторы ras фарнезилпротеинтрансферазы; ras ингибиторы; ингибитор ras-GAP; деметилированный ретеллиптин; рения Re 186 этидронат; ризоксин; рибозимы; RII ретинамид; роглетимид; рохитукин; ромуртид; рохинимекс; рубигинон В1; рубоксил; сафингол; сейнтопин; SarCNU; саркофитол А; сарграмостим; Sdi 1 миметики; семустин; производное ингибитора старения 1; смысловые олигонуклеотиды; ингибиторы передачи сигнала; модуляторы передачи сигнала; одноцепочечный антигенсвязывающий белок; сизофиран; собузоксан; натрия борокаптат; натрия фенилацетат; солверол; соматомедин-связывающий белок; сонермин; спарфозовую кислоту; спикамицин D; спиромустин; спленопентин; спонгистатин 1; скваламин; ингибитор стволовых клеток; ингибиторы деления стволовых клеток; стипиамид; ингибиторы стромелизина; сульфинозин; суперактивный вазоактивный кишечный пептидный антагонист; сурадисту; сурамин; свейнзонин; синтетические глюкозаминогликаны; таллимустин; тамоксифена метиодид; тауромустин; тазаротен; текогалан натрия; тегафур; теллурапирил; ингибиторы теломеразы; темопорфин; темозоломид; тенипозид; тетрахлордекаоксид; тетразомин; талибластин; тиокоралин; тромбопоэтин; миметик тромбопоэтина; тималфазин; агонист рецептора тимопоэтина; тимотринан; тиреотропный гормон; олова этилэтиопурпурин; тирапазамин; титаноцена бихлорид; топсентин; торемифен; тотипотентный фактор стволовых клеток; ингибиторы трансляции; третиноин; триацетилуридин; трицирибин; триметрексат; трипторелин; трописетрон; туростерид; ингибиторы тирозинкиназы; тирфостины; UBC ингибиторы; убенимекс; ингибирующий фактор роста, производный мочеполового синуса; антагонисты рецепторов урокиназы; вапреотид; вариолин В; векторная система, эритроцитарную геннную терапию; веларесол; верамин; вердинс; вертепорфин; винорелбин; винксалтин; витаксин; ворозол; занотерон; зениплатин; зиласкорб и стималамер зиностатина. В одном варианте осуществления, противораковым лекарственным средством является 5-фторурацил, таксол или лейковорин.
ПРОЦЕДУРЫ
Отто Варбург (Warburg О. «On the origin of cancer cells,» Science 123 (3191): 309-14 (1956)) впервые наблюдал, что большинство раковых клеток производят энергию путем использования анаэробного гликолиза, а не в более энергетически эффективных аэробных условиях нормальных клеток. Ксю (Xu) сообщил (Xu R-H et al, «Inhibition of Glycolysis in Cancer Cells: A Novel Strategy to Overcome Drug Resistance Associated with Mitochondrial Respiratory Defect and Hypoxia.» Cancer Res. 65:(2), 613-621 (2005)), что гипоксия является важным фактором, который вносит свой вклад в «эффект Варбурга», который позволяет раковым клеткам расти и образовывать опухолевые массы, которые опережают нормальное поколение новой сосудистой системы.
Такое быстрое распространение опухолей оставляет раковые клетки в микросреде с ограниченным кровоснабжением, и, таким образом, с ограниченной способностью расти, используя аэробные условия. В целях поддержания достаточного источника энергии, опухолевые клетки сохраняют гипоксические условия в своей микросреде и, таким образом, используют полученную в результате увеличенную гликолитическую активность, как средство для производства энергии, а также способ стимулирования ангиогенеза. Вандер Хайден (Van Heiden, M.G., et al, «Evidence for an Alternative Glycolytic Pathway in Rapidly Proliferating Cells,» Science, 329, 1492-1499 (2010)) сообщил, что пролиферирующие клетки, которые включают раковые клетки, «в первую очередь усваивают глюкозу путем гликолиза, тогда как большинство нормальных клеток полностью катаболизируют глюкозу путем окислительного фосфорилирования».
Фосфоглицераткиназа является ферментом трансферазы, что на одной из конечных стадий гликолиза служит для передачи фосфатной группы к АДФ, таким образом, образуя АТФ, которая является повсеместным источником метаболической энергии. Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, уменьшение концентрации ферментной фосфоглицераткиназы в гипоксических клетках должно обеспечить способ создания пути анаэробного гликолиза, недоступного для пролиферирующих клеток, то есть, раковых клеток в качестве источника энергии. Кроме того, не желая быть ограниченными какой-либо теорией, путем ингибирования или уменьшения гипоксической среды, найденной в опухолевых клетках, количество сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), который вырабатывается в ответ на гипоксическую микросреду, уменьшается, таким образом, имея эффект снижения формирования новой сосудистой сети, что должно помочь в пролиферации раковых клеток.
Не желая быть ограниченными какой-либо теорией, анаплазия является характерным признаком раковых клеток. Так как раковые клетки остаются в высоко энергизированном метаболическом микроокружении, то есть гипоксической окружающей среде, то раковые клетки теряют способность входить в стадию большего покоя, в которой клетки могут стать зрелым, например, начать дифференцировать по способу нормальных клеток. Кроме того, подавление РОК концентрации в микросреде опухолевой массы может служить как способ снижения или устранения условий, присутствующих в индуцированной гипоксической среде раковых клеток, в результате чего замедляется или останавливается рост опухоли.
Растворимый VEGF рецептор-1 (sVEGFR1) представляет собой усеченный приблизительно 110-кДа сплайс-вариант из 180-кДа трансмембранного VEGFR1. Как сообщает By (Wu) (Wu F.T.H et al., «A systems biology perspective on sVEGFRl: its biological function, pathogenic role & therapeutic use,» J. Cell Mol Med. 2010 March 14(3): 528-552), анти-ангиогенные эффекты не были хорошо освещены, но, как полагают, включают: (1) секвестрацию VEGF лигандов, так же, как делает VEGFR1, и эффективно уменьшая VEGF-опосредованную активацию проангиогенных рецепторов; и (2) гетеродимеризацию с полнометражными VEGFR мономерами, чтобы приводить в неактивное состояние димер рецептора, поскольку sVEGFRl теряет внутриклеточный тирозинкиназный домен, необходимый для того, чтобы трансфосфорилировать его полноразмерный партнер. Точные молекулярные механизмы, посредством которых sVEGFRl оказывает ингибирующие эффекты на VEGF-зависимую сигнализацию, являются неясными. Тем не менее, было предложено два механизма: (1) прямой лигандный захват членов VEGF семейства (включая VEGF-A и P1GF), то есть снижение эффективных концентраций свободного VEGF, доступного для активации рецептора; и (2) гетеродимеризация с поверхностными VEGFR с формированием доминант-отрицательных комплексов, то есть снижение эффективной плотности незанятых VEGFR, доступных для активации лиганда.
2
2
Не ограничиваясь теорией, стабилизация HIF-2α с помощью раскрытого стабилизатора в результате приводит к увеличенной концентрации растворимого сосудистого эндотелиального фактора роста (sVEGFR-1), который в результате приводит к уменьшенной концентрации VEGF. Фигура 1А демонстрирует снижение экспрессии мРНК VEGF в мышиных эмбриональных фибробластах дикого типа при нормальных кислородных условиях (21% О) [столбец А, черный] и в мышиных эмбриональных фибробластах дикого типа в условиях гипоксии (1% O) [столбец С, светло-серый] при различных концентрация стабилизатора HIF-2α, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты. В условиях гипоксии, существует резкое сокращение в VEGF мРНК при концентрациях 1, 10 и 100 мкМ [столбец D, очень светло-серый] по сравнению с контролем при гипоксии [столбец С].
-/-
-/-
2
2
Фигура 1В демонстрирует снижение экспрессии мРНК VEGF в фибробластах, имеющих делецию HIF1-α, то есть HIF-1α фибробластов при нормальных кислородных условиях (21% O) [столбец А, черный], и в фибробластах, имеющих делецию HIF1-α, то есть, HIF-1α фибробластов в условиях гипоксии (1% O) [столбец С, светло-серый], при различных концентрациях стабилизатора HIF-2α, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты. В условиях гипоксии существует резкое снижение в VEGF мРНК при концентрациях 1, 10 и 100 мкМ [столбец D, очень светло-серый] по сравнению с контролем при гипоксии [столбец С].
2
2
Фигура 2А демонстрирует снижение экспрессии мРНК фосфоглицераткиназы (PGK) в мышиных эмбриональных фибробластах дикого типа при нормальных кислородных условиях (21% O) [столбец А, черный] и в мышиных эмбриональных фибробластах дикого типа в условиях гипоксии (1% O) [столбец С, светло-серый] при различных концентрациях стабилизатора HIF-2α, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты. В условиях гипоксии существует резкое снижение в PGK мРНК при концентрациях 1, 10 и 100 мкМ [столбец D, очень светло-серый] по сравнению с контролем при гипоксии [столбец С].
-/-
-/-
2
2
Фигура 2В демонстрирует снижение экспрессии мРНК фосфоглицераткиназы (PGK) в мышиных эмбриональных фибробластах, которые имеют делецию HIF1-α, то есть HIF-1α фибробластах при нормальных кислородных условиях (21% О) [столбец А, черный] и в фибробластах, которые имеют делецию HIF1-α, то есть HIF-1α фибробластах, в условиях гипоксии (1% O) [столбец С, светло-серый] при различных концентрациях стабилизатора HIF-2α, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты. В условиях гипоксии существует резкое снижение в PGK мРНК при концентрациях 1, 10 и 100 мкМ [столбец D, очень светло-серый] по сравнению с контролем при гипоксии [столбец С].
Изучали эффективность раскрытого стабилизатора HIF-2α в качестве лечения меланомы.
Количественный ПЦР анализ экспрессии генов
Общую РНК выделяли из тканей и клеток путем использования Trizol™ реагента (Invitrogen) и комплекта RNeasy (Qiagen), соответственно. 1 мкг РНК использовали для обратной транскрипции, используя Superscript II First-Strand Synthersis System (Invitrogen). кДНК были амплифицированы в SYR Green или TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems). Количественный ПЦР (кПЦР) проводили на системе обнаружения последовательности ABI Prism 7700. Условиями ПЦР являются: 10 мин при 95°С, 40 циклов по 15 секунд при 95°С и 1 минута при 60°С. Относительное количество мРНК было рассчитано после нормализации к β-актину.
Клеточная культура, иммортализация фибробластов
Клетки культивировали в DMEM (№11965-092, Invitrogen) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen), 100 ед./мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина. Для глюкозной депривации использовали DMEM без глюкозы (№11966-025, Invitrogen).
Мышиные эмбриональные фибробласты (МЕР) выделяли из эмбрионов Е12.5 и иммортализировали, используя стабильную трансфекцию с SV40 большим Т-антигеном.
Мышиная модель меланомной опухоли.
5
2
Мышам инъекционно вводили 1×10 B16F 10 мышиных клеток меланомы мышей подкожно в левый бок. Как только опухоли стали прощупываемыми (приблизительно 5 дней), мышей случайным образом распределяли, чтобы получать лечение либо: 20% полиэтиленгликоль (ПЭГ) в 5% декстране (контрольный носитель для раскрытого стабилизатора HIF-2α) и PBS (контрольный носитель для GM-CSF), 20% ПЭГ и GM-CSF (100 нг на мышь в объеме 50 мкл), раскрытый стабилизатор HIF-2α (17,5 мг/кг в объеме 100 мкл) и PBS, или раскрытый стабилизатор HIF-2α и GM-CSF (те же дозы). PBS и GM-CSF вводили внутриопухольно, в то время как 20% ПЭГ и раскрытый стабилизатор HIF-2α вводили внутрибрюшинно. Мышей обрабатывали 3 раза в неделю, пока опухоли не достигли размера 20 мм в любом измерении (приблизительно 2,5 недели), в этот момент мышей подвергали эвтаназии, в соответствии с ведомственной политикой. Диаметры опухоли измеряли 3 раза в неделю штангенциркулем, и объемы опухоли рассчитывали следующим образом: объем опухоли = 0,5 × [(большой диаметр) × (малый диаметр)].
Оценка легочных метастазов
Легочные метастазы оценивали путем определения мРНК для меланоцит-специфических белков в легких мышей с опухолью. Мышей B16F10 с опухолью лечили GM-CSF и/или раскрытым стабилизатором HIF-2α, как показано на фигуре 3. Во время умерщвления легкие вырезали и моментально замораживали в жидком азоте. Замороженные легкие гомогенизировали в жидком азоте и растертый в порошок материал растворяли в реагенте Trizol™ (Invitrogen). РНК экстрагировали в хлороформе и очищали с использованием RNeasy Minikit (Qiagen). кДНК генерировали из 1 мкг РНК с использованием Superscript First Strand Synthesis System (Invitrogen) и использовали для ПЦР в реальном времени, применяя SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя. Меланоцит-специфические Pmel17 обнаруживали с помощью вложенной ПЦР, используя модификацию протокола, описанного Цукамото (Tsukamoto) и другими. Для начальной реакции 30 циклов ПЦР осуществляли (95°С в течение 1 минуты, 58°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 1 минуты) в 20 мкл реакционного объема, содержащего 2 мкл кДНК. Для реамплификации с вложенными праймерами, 1 мкл первого продукта реакции амплифицировали в 20 мкл реакционного объема в течение дополнительных 30 циклов. Данные были проанализированы в соответствии со сравнительной пороговой чувствительностью способа и нормализованы относительно GAPDH внутреннего контрольного транскрипта. Результаты являются полуколичественными и представляют собой кратное различие в уровнях транскрипта у контрольных мышей, которых лечили носителем, по сравнению с уровнями у мышей, которых лечили раскрытым стабилизатором HIF-2α и/или GM-CSF.
Мышиная модель рака молочной железы
5
РуМТ трансгенные мыши, у которых средний Т антиген полиомы экспрессируется из промотора мышиного вируса опухоли молочной железы (MMTV), был описан ранее (Lin EY, Am J Pathol, 2003, включенная в данную заявку путем ссылки в полном объеме). У данных мышей спонтанно развивается карцинома эпителия молочных желез во всех 10 молочных железах. Использовали иммортализированную клеточную линию, полученную из опухоли на поздней стадии от C57BL/6PyMT трансгенных мышей. Опухолевые клетки C57BL/6PyMT 5 × 10вводили ортотопически инъекционно в №4 жировое тело молочной железы C57BL/6 мышей дикого типа. После того, как опухоли стали прощупываемыми (приблизительно 3 недели), мыши были рандомизированы для получения лечения или контрольным носителем (20% ПЭГ в 5% декстране) или 12 или 17,5 мг/кг раскрытого стабилизатора HIF-2α. Мышей обрабатывали 3 раза в неделю и объемы опухоли рассчитывали, как описано в данной заявке выше.
Фигура 3 демонстрирует результаты данного исследования для высокой дозы (17 мг/кг) стабилизатора HIF-2α. Эти данные показывают, что раскрытый стабилизатор HIF-2α снижает рост опухоли в одиночку (Δ) и является сравнимым с уменьшением видимого объема опухоли, когда животных лечат только GM-CSF (▄). Кроме того, снижение роста опухоли является аддитивным, когда раскрытый стабилизатор HIF-2α используют в комбинации с GM-CSF (X). Данные результаты сравнивали с контрольными животными (♦), которые получали только дозированный носитель в фосфатном буферном солевом растворе (PBS).
Данное исследование повторяли, сравнивая протоколы дозирования, то есть дозирование осуществляли или с помощью внутрибрюшинной (I.P.), или с помощью внутриопухолевой (I.T.) инъекции. Контрольная группа не была использована для данного повторного исследования. Фигура 4 показывает результаты данного исследования для высокой дозы (17 мг/кг) стабилизатора HIF-2α. Эти данные показывают, что инъекции I.T. обеспечивают большее уменьшение объема опухоли, чем инъекции I.P. Например, существовало большее снижение объема опухоли, когда GM-CSF вводили I.T. (♦) по сравнению с I.P. введением (Δ). Данные результаты были подтверждены во время лечения, которое включало раскрытый стабилизатор HIF-2α и GM-CSF, которые вводили I.T. (х) в сравнении с введением I.P. (▄).
Фигура 5 представляет количество относительных метастазов в легкие, как определено, используя Pme117 мРНК экспрессию для способов инъекционного введения, изображенных на Фигуре 3, где раскрытый стабилизатор HIF-2α вводили I.P., а GM-CSF вводили I.T. Группа А представляет собой контроль с носителем как для раскрытого стабилизатора HIF-2α, так и для GM-CSF. Группа В представляет собой GM-CSF плюс 20% ПЭГ в 5% декстране (носитель для введения раскрытого стабилизатора HIF-2α). Группа С представляет собой раскрытый стабилизатор HIF-2α плюс PBS (носитель для введения GM-CSF). Группа D представляет собой раскрытый стабилизатор HIF-2α и GM-CSF. Раскрытый стабилизатор HIF-2α доставляли в его носителе (20% ПЭГ в 5% декстране) и вводили I.P., а GM-CSF доставляли в его носителе (PBS) и вводили I.T. Обратите внимание, что только группы с раскрытым стабилизатором HIF-2α показали сниженную метастазу, как измерено с помощью Pmel17 мРНК экспрессии.
Фигура 6 демонстрирует снижение объема опухоли для мышей C57BL/6, которым ортотопически инъекционно вводили клетки от MMTV-PyMT трансгенных мышей в одну молочную железу. Животных обрабатывали три раза в неделю носителем (♦), 12 мг/кг раскрытого стабилизатора HIF-2α (▄) или 17,5 г/кг раскрытого стабилизатора HIF-2α (●).
Исследование ксенотрансплантата яичников человека
Реагенты и исследуемое соединение
Исследуемое соединение, {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусная кислота, было приготовлено в растворе 0,25% гидроксипропилметилцеллюлозы/0,1% Tween™ 80 в деионизированной обратным осмосом воде. Исследуемое соединение разбавляли в концентрациях 1,8 и 3,6 мг/мл, как указано на каждом флаконе доставленных доз 18 и 36 мг/кг, соответственно, при объеме дозы 10 мг/кг. Растворы исследуемого соединения получали еженедельно и хранили при 4°С в защищенном от света месте. Все препараты вынимали из холодильника и перемешивали в течение 30 минут перед дозированием, и непрерывно перемешивали во время дозирования.
Контрольный носитель получали путем приготовления 0,25% раствора гидроксипропилметилцеллюлозы/0,1% раствора Tween™ 80 в деионизированной обратным осмосом воде.
Клеточная культура
2
А2780/СР линия клеток опухоли яичников была получена от Sigma-Aldrich (St. Louis, МО). Культуры поддерживали в среде RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT), дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой, и размещали в атмосфере 5% СО. Культуры набухали в колбах с тканевыми культурами в разделенном соотношении 1:3 до тех пор, пока не был достигнут достаточный выход клеток.
Животные
Самки бестимусных голых мышей были поставлены Harian (Indianapolis, IN). Мыши были получены в возрасте от четырех до пяти недель, с массой 12-15 грамм, и они акклиматизировались в течение семи дней до манипуляций. Мышей содержали в клетках-микроизоляторах и удерживали в конкретных безпатогенных условиях. Мышей кормили Tekland Global Diet™ 2920x облученной диетой для лабораторных животных (Harian, Indianapolis, IN) и автоклавированная вода была в свободном доступе.
А2780/СР модель ксенотрансплантата опухоли яичников
7
Шестьдесят самок мышей инокулировали подкожно в правый бок 0,1 мл смеси 50% RPMI/50% Matrigel™ (BD Biosciences, Bedford, MA), содержащей суспензию клеток А2780/СР опухоли (приблизительно 1,0×10 клеток/мышь).
Через три дня после инокуляции, опухоли измеряли с помощью штангенциркулей и массу опухоли рассчитывали, используя программное обеспечение для управления исследованием на животных. Тридцать мышей с размерами опухоли 80,4-170,6 мг были рандомизированы на три группы по десять мышей (Группы 1-3) путем случайного уравновешивания. Массу тела записывали, когда мыши были рандомизированы, и брались два раза в неделю впоследствии в сочетании с измерениями опухоли.
Животных подвергали лечению до финальной точки исследования. Группа I получала только носитель (контроль). Группа II получала дозы 1,8 мг/мл {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты, в то время как Группа III получала дозы 3,6 мг/мл {[5-(3-фторфенил)-3-гидроксипиридин-2-карбонил]амино}уксусной кислоты. Все дозы давали путем перорального введения (РО). Вводимый объем каждой дозы составлял приблизительно 1 мл/100 г массы тела животного.
Массу опухоли (мг) определяли по формуле:
где «а» является наибольшим диаметром и «b» является наименьшим диаметром. Измерения проводились с помощью штангенциркулей. Средний размер опухоли, когда начались исследование, составлял 100-125 мг. В первый день исследования животные были случайным образом распределены на три группы, описанные выше.
Опухоли были собраны из Групп 1-3 основного исследования, когда отдельные опухоли достигли массы опухоли ≥ 2000 мг, используя процедуру, описанную выше. Измерения размера опухоли и массы тела животных проводили два раза в неделю. В Таблице I ниже и на Фигурах 7-9 представлены суммарные результаты данного исследования.
Фигура 7 демонстрирует количество выживших животных в каждой точке оценки в исследовании. Линия, показанная как (♦), представляет контрольную группу, линия, показанная как (), представляет группу, которая получала 18 мг/кг соединения, и линия, показанная как (▄), представляет группу, которая получала 36 мг/кг соединения.
Фигура 8 демонстрирует изменение массы опухоли во время курса исследования для контрольной группы (♦), для группы, которая получала 18 мг/кг соединения (), и для группы, которая получала 36 мг/кг в соединения (▄).
Фигура 9 демонстрирует изменение массы тела в процентах для контрольной группы (♦), для группы, которая получала 18 мг/кг соединения (), и для группы, которая получала 36 мг/кг соединения (▄).
Как может быть видно из Фигур 7-9 и данных в таблице, приведенных выше, скорость роста массы опухоли была значительно снижена по сравнению с контрольной группой, все из которых имели массы опухолей, превышающие 2000 мг (конечная точка исследования) на 16 день.
Очистка моноцитов периферической крови и поколения макрофагов, полученных из моноцитов
Мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) выделяли из свежей массы исходных лейкоцитов периферической крови (American Red Cross, Columbus ОН) путем центрифугирования в градиенте плотности над средой разделения лимфоцитов (Cellgro). Моноциты очищали от общей РВМС путем расслоения над FBS. Моноциты культивировали в свободной от эндотоксинов RPMI-1640, дополненной 1% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), 0,1% сывороточным альбумином человека (HSA) и 10 мкг/мл ингибитора эндотоксина полимиксина В. В некоторых экспериментах, свежевыделенные моноциты были дифференцированы в макрофаги, используя трехдневную культуру в среде, содержащей 10% FBS, 1% PSA (пенициллин G натрия, стрептомицина сульфат и амфотерицин В) и 20 нг/мл M-CSF. Макрофаги находились в бессывороточной среде в течение 2 часов перед стимуляцией. Моноциты или макрофаги, полученные из моноцитов, обрабатывали в течение 24 часов 10 нг/мл GM-CSF, 10 мкМ раскрытого стабилизатора HIF-2α или эквивалентным объемом контрольных носителей (PBS или ДМСО, соответственно). Бесклеточные супернатанты культуры собирали и анализировали для VEGF или sVEGFR-1, используя иммуно-ферментный анализ (ELISA) (R&D Systems).
фланк./фланк.
Генерация HIF-2α LysMcre мышей и культуры макрофагов, полученной из костного мозга
фланк./фланк.
фланк./фланк.
HIF-2α мыши (первоначально разработаные доктором Селесте Симоном (Dr. Celeste Simon), университет Пенсильвании) и LysMcre рекомбиназные мыши (первоначально разработанная Ирмгард Ферстер (Irmgard Foerster), университет Дюссельдорфа) (оба приобретенные в Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) были скрещены для получения мышей, гомозиготных как по LysMcre, так и по HIF-2α аллелю, фланкированному loxP-сайтами. LysMcre рекомбиназа мыши, которые экспрессировали не фланкированные loxP-сайтами аллели, были использованы в качестве контроля. Делеция HIF-2α в HIF-2α / LysMcre макрофагах, но не в контрольных LysMcre макрофагах, была подтверждена на уровне транскрипта, используя ПЦР в реальном времени.
Для создания макрофагов, полученных из костного мозга, (BDM) выделяли костный мозг бедренной кости и клетки-предшественники высевали в RPMI-1640, дополненную 10% FBS, 1% PSA, 10 мкг/мл полимиксина В и 20 нг/мл рекомбинантного мышиного M-CSF. Клетки культивировали в течение 5 дней с добавлением свежей M-CSF через день. Дифференцированный BDM находился в бессывороточной среде в течение 2 часов и затем его обрабатывали 100 нг/мл мышиного GM-CSF и/или 25 мкМ раскрытого стабилизатор HIF-2α в RPMI-1640, содержащей 1% FBS и 10 мкг/мл полимиксина В. Супернатанты культуры собирали через 72 часа и анализировали на содержание VEGF и sVEGFR-1 с помощью иммуно-ферментного анализа (ELISA) (R&D Systems).
2
Моноциты человека оставляли необработанными или стимулировали 100 нг/мл GM-CSF при нормальных кислородных условиях или при 0,5% О. В различные моменты времени клетки собирали в реагент Trizol (Invitrogen) и РНК экстрагировали в хлороформ, и затем очищали с помощью RNeasy Minikit (Qiagen). В исследованиях на мышах органы, собранные во время эвтаназии, моментально замораживали в жидком азоте, растирали в порошок в жидком азоте и затем растворяли в Trizol. кДНК генерировали с 1 мкг РНК, используя Superscript First Strand Synthesis System (Invitrogen), и использовали для ПЦР в реальном времени, используя описанные ранее праймеры и SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosciences), в соответствии с инструкциями производителя. Данные были проанализированы в соответствии со сравнительной пороговой чуствительностью способа и нормализованы по отношению к β-актиновому внутреннему контрольному транскрипту. Результаты являются поликоличественными и представляют собой кратное различие в уровнях транскрипта в конкретном образце по сравнению с уровнями в необработанных клетках из того же донора.
Мышиная модель меланомной опухоли
5
2
C57BL/6 мышам 6-8-недельного возраста инъекционно вводили 1×10 B16F10 мышиных клеток меланомы мышей подкожно в левый бок. После того, как опухоли стали прощупываемыми (приблизительно 5 дней), мыши были случайным образом распределены, чтобы получать лечение либо: 20% ПЭГ-400 в 5% сахарозе (носитель для раскрытого стабилизатора HIF-2α) и PBS (носитель для GM-CSF), 20% ПЭГ-400 и GM-CSF (100 нг на мышь в объеме 50 мкл), раскрытый стабилизатор HIF-2α (17,5 мг/кг в объеме 100 мкл) и PBS, либо раскрытый стабилизатор HIF-2α и GM-CSF (те же концентрации). Раскрытый стабилизатор HIF-2α (или контрольный носитель) вводили внутрибрюшинно, в то время как GM-CSF (или контрольный носитель) вводили внутриопухольно. Мышей обрабатывали внутриопухольно 3 раза в неделю до тех пор, пока опухоли не достигали размера 20 мм в любом измерении (приблизительно 2,5 недели), в этот момент мышей подвергали эвтаназии в соответствии с ведомственной политикой. Диаметры опухоли измеряли 3 раза в неделю с помощью штангенциркулей, и объемы опухолей будут рассчитываться следующим образом: Объем опухоли = 0,5 × [(большой диаметр) × (малый диаметр)]. Для экспериментов анализа влияния нейтрализации sVEGFR-1 в комбинации с лечением раскрытым стабилизатором HIF-2а, мышей лечили внутрибрюшинно 3х/неделя или раскрытым стабилизатором HIF-2α, или контрольным носителем, и внутриопухольно или 4 мкг анти-VEGFR-1 нейтрализующим антителом (R&D Systems), или 4 мкг поликлональным козьим IgG изотипическим контролем (Santa Cruz Biotechnology) в объеме 50 мкл. Все протоколы были одобрены университетом Ohio State University Animal Care и Use Committee, и мышей лечили в соответствии с ведомственными руководящими принципами для ухода за животными.
Оценка легочных метастазов
Легочные метастазы оценивали путем определения мРНК для меланоцит-специфических белков в легких мышей с опухолью. Мышей B16F10 с опухолью лечили внутриопухольным введением GM-CSF и/или раскрытого стабилизатора HIF-2α, как описано выше. Во время умерщвления легкие вырезали и моментально замораживали в жидком азоте. Замороженные легкие гомогенизировали в жидком азоте и растертый в порошок материал растворяли в реагенте Trizol (Invitrogen). РНК экстрагировали в хлороформе и очищали с использованием RNeasy Minikit (Qiagen). кДНК генерируровали из 1 мкг РНК с использованием Superscript First Strand Synthesis System (Invitrogen) и использовали для ПЦР в реальном времени, применяя SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя. Меланоцит-специфические мРНК TRP2 и Pmel17 обнаруживали с помощью вложенной ПЦР, используя модификацию протокола, описанного Цукамото (Tsukamoto) и другими. Для начальной реакции 30 циклов ПЦР осуществляли (95°С в течение 1 минуты, 58°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 1 минуты) в 20 мкл реакционного объема, содержащего 2 мкл кДНК. Для реамплификации с вложенными праймерами 1 мкл первого продукта реакции амплифицировали в 20 мкл реакционного объема в течение дополнительных 30 циклов. Данные были проанализированы в соответствии со сравнительной пороговой чуствительностью способа и нормализованы относительно β-актинового внутреннего контрольного транскрипта. Результаты являются полу-количественными и представляют собой кратное различие в уровнях транскрипта у мышей, которых лечили раскрытым стабилизатором HIF-2α и/или GM-CSF, по сравнению с уровнями у мышей, которых лечили контрольным носителем.
Статистический анализ
Тест ANOVA использовали для сравнения независимых измерений между несколькими группами лечения. Данные были логарифмированы, чтобы нормализовать расхождение в разных группах. Р-значения были скорректированы с использованием процедуры Холма (Holm), чтобы сохранить ошибку типа I на 0,05 из-за множественных сравнений. Для данных роста опухоли, изменения в объеме опухоли с течением времени были оценены посредством продольной модели. Значения опухоли были логарифмированы, и предполагаемые склоны (изменения в объеме опухоли с течением времени) были рассчитаны с 95% доверительными интервалами. Предполагаемые различия в объеме опухоли были рассчитаны, используя регрессию случайных эффектов продольных данных. Для всех анализов, p≤0,05 рассматривалось, как статистически значимое.
Ингибирование PHD3 раскрытым стабилизатором HIF-2α усиливает продуцирование моноцитов и макрофагов sVEGFR-1. но не VEGF
Продуцирование моноцитов sVEGFR-1 в ответ на GM-CSF и гипоксию зависит от HIF-2α, в то время как HIF-1α контролировал продуцирование моноцитов VEGF в тех же условиях. Не желая быть связанными теорией, авторы изобретения в данной заявке теперь считают, что избирательная стабилизация HIF-2α должна повышать sVEGFR-1 продуцирование из GM-CSF-стимулированных моноцитов, не оказывая воздействия на продуцирование VEGF.
Для того, чтобы подтвердить селективную повышающую регуляцию HIF-2α раскрытым стабилизатором HIF-2α, мышиные макрофаги, полученные из костного мозга, обрабатывали раскрытым стабилизатором HIF-2α в течение 18 часов, и клетки затем лизировали и иммуноблоттировали для HIF-1α и HIF-2α. Изобретатели наблюдали увеличение белка HIF-2α в клетках, обработанных раскрытым стабилизатором HIF-2α, без соответствующего увеличения HIF-1α (Фигура 11А).
Для того чтобы определить, увеличила ли стабилизация HIF-2α продуцированном sVEGFR-1, моноциты периферической крови человека стимулировали 100 нг/мл GM-CSF в присутствии или в отсутствие 10 мкМ раскрытого стабилизатора HIF-2α. Продуцирование sVEGFR-1, используя моноциты, обработанные GM-CSF, значительно возрастало, когда моноциты также обрабатывали раскрытым стабилизатором HIF-2α, как в белке, так и уровне транскрипта (p=0,007 и p=0,033, соответственно) (Фигура 11В).
Уровни VEGF в тех же супернатантах измеряли с помощью ELISA, который обнаруживает свободный (биодоступный) VEGF, но не обнаруживает VEGF, связанный с sVEGFR-1. Обработка клеток раскрытым стабилизатором HIF-2α существенно не увеличивает продуцирование VEGF (р=0,133). VEGF белок не был обнаружен в супернатантах моноцитов, стимулированных GM-CSF, за счет нейтрализации VEGF посредством sVEGFR-1 (Фигура 11С).
Оценка уровней транскриптов VEGF с помощью ПЦР в реальном времени показала, что в то время как GM-CSF увеличил продуцирование VEGF, не существовало никакого различия в продуцировании VEGF между моноцитами, стимулированными только GM-CSF или GM-CSF и раскрытым стабилизатором HIF-2α (р=0,556) (Фигура 11С).
Данные результаты показывают, что селективная стабилизация HIF-2α повышает моноцитарное продуцирование sVEGFR-1, но не VEGF.
Поскольку моноцитарное продуцирование VEGF зависело от HIF-1α, изобретатели в данной заявке определили, что селективная стабилизация HIF-1α путем ингибирования PHD2 должна увеличивать моноцитарное продуцирование VEGF, но не sVEGFR-1. Для того, чтобы сделать такое определение, моноциты периферической крови человека стимулировали GM-CSF в присутствии селективного ингибитора PHD2, что в результате приводит к стабилизации HIF-1α.
GM-CSF индуцировал моноцитарное продуцирование sVEGFR-1. Однако, не существовало никакого различия в продуцировании sVEGFR-1 из моноцитов, стимулированных только GM-CSF, или моноцитов, со-стимулированных с селективным ингибитором PHD2, при любом уровне белка или транскрипта (p=0,306 и p=0,566, соответственно) (Фигура 11D).
Однако селективный ингибитор PHD3 увеличивал моноцитарное продуцирование VEGF белка и мРНК (p=0,011 и p=0,007, соответственно) (Фигура 11E).
фланк./фланк.
Чтобы подтвердить, что продуцирование sVEGFR-1 было индуцировано стабилизацией HIF-2α, макрофаги мышей, полученные из костного мозга, были использованы с миелоид-специфической делецией HIF-2α (HIF-2α/LysMcre).
Раскрытый стабилизатор HIF-2α индуцировал sVEGFR-1 транскрипцию из контрольных макрофагов (p=0,036), но не из HIF-2α-дефицитных макрофагов (p=0,881) (Фигура 11F).
Данные результаты показывают, что продуцирование sVEGFR-1 является HIF-2α-зависимым эффектом. Кроме того, данные результаты демонстрируют, что ингибирование PHD3 раскрытым стабилизатором HIF-2α стабилизирует HIF-2α и избирательно индуцирует sVEGFR-1, но не VEGF, из GM-CSF-стимулированных моноцитов.
Стабилизация HIF-2α увеличивает противоопухолевые эффекты GM-CSF и повышает выживаемость в мышиной модели меланомы
Противоопухолевые эффекты GM-CSF зависят от HIF-2α-опосредованного продуцирования sVEGFR-1 макрофагами, ассоциированными с опухолью, в мышиной модели меланомы (Roda et al, J. Immunol, «Hypoxia-Inducible Factor-2a Regulates GM-CSF-Derived Soluble Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1 Production from Macrophages and Inhibits Tumor Growth and Angiogenesis», published on line before print July 15,2011, doi: 10.4049/jimmunol. 1100841).
Затем определяли, увеличивает ли химическая стабилизация HIF-2α продуцирование sVEGFR-1 макрофагами, ассоциированными с опухолью, и, таким образом, повышаются ли противоопухолевые эффекты GM-CSF.
3
Мышей с подкожными B16F10 меланомами лечили 3х в неделю GM-CSF (100 нг/мышь, внутриопухолевое) раскрытым стабилизатором HIF-2α (17,5 мг/кг, внутрибрюшинное) или комбинацией (или соответствующими контрольными носителями). На основании продольной модели с использованием логарифмически преобразованных значений, не было обнаружено никаких существенных различий в объеме опухоли между четырьмя группами в начале исследования. Однако, на 16 день лечения, средние объемы опухоли у мышей, получающих или GM-CSF, или раскрытый стабилизатор HIF-2α, были значительно меньше, чем у мышей, которых лечили контрольными носителями (каждый p<0,001). Кроме того, комбинированное лечение GM-CSF и раскрытым стабилизатором HIF-2α дополнительно снижали рост опухоли по сравнению с лечением только одним (Фигура 12А) (p<0,001). Эти данные демонстрируют, что раскрытый стабилизатор HIF-2α может повышать противоопухолевые эффекты GM-CSF в модели меланомы. Раскрытый стабилизатор HIF-2α самостоятельно также повышал выживаемость B16F10 мышей с меланомой. Фигура 12 В показывает 3-дневное увеличение средней выживаемости (которую определяли как время к диаметру опухоли 20 мм) у мышей, получавших раскрытый стабилизатор HIF-2α (p=0,023).
Раскрытый стабилизатор HIF-2α усиливает продуцирование sVEGFR-1 и уменьшает ангиогенез опухоли в ответ на GM-CSF
Опять же, не желая быть связанными теорией, авторы изобретения в данной заявке теперь считают, что химическая стабилизация HIF-2α раскрытым стабилизатором HIF-2α должна бы увеличивать продуцирование sVEGFR-1 в ответ на GM-CSF, таким образом, снижая рост опухоли и ангиогенез. ПЦР в реальном времени использовали для оценки уровней sVEGFR-1 и VEGF мРНК в опухолях мышей, получавших GM-CSF, раскрытый стабилизатор HIF-2α или комбинацию.
Повышенные уровни sVEGFR-1 были обнаружены в опухолях мышей, получавших как GM-CSF, так и раскрытый стабилизатор HIF-2α (Фигура 13А) (p=0,031). Наоборот, GM-CSF (самостоятельно или в комбинации с раскрытым стабилизатором HIF-2α) не удалось увеличить уровни внутриопухолевого VEGF над уровнями, наблюдаемыми у мышей, получавших контрольный носитель (Фигура 13B) (p=0,490). Чтобы подтвердить, что увеличенное продуцирование sVEGFR-1 в результате привело к сниженному ангиогенезу опухоли, опухоли от каждой из мышей окрашивали с помощью иммуногистохимии для маркера эндотелиальных клеток CD31. Как показано на Фигуре 13С, комбинированное лечение GM-CSF и раскрытым стабилизатором HIF-2α значительно уменьшали наличие кровеносных сосудов опухоли у мышей с меланомой, возможно посредством индуцирования sVEGFR-1 (p<0,001).
Так как увеличенный ангиогенез связан с повышенным риском метастазирования, авторы изобретения в данной заявке оценивали легочные метастазы у мышей, получавших GM-CSF, раскрытый стабилизатор HIF-2α или комбинацию. Существенно пониженные уровни меланома-специфического гена Pmel17 были обнаружены в легких мышей, получавших GM-CSF и раскрытый стабилизатор HIF-2α, по сравнению с мышами, получавшими контрольные носители (Фигура 13D).
Данные результаты показывают, что раскрытый стабилизатор HIF-2α усиливает антиангиогенные эффекты GM-CSF, путем увеличения продуцирования sVEGFR-1 макрофагами, ассоциированными с опухолью.
Противоопухолевые эффекты раскрытого стабилизатора HIF-2α зависят от продуцирования sVEGFR-1
Повышенные уровни sVEGFR-1 в опухолях мышей, получавших GM-CSF и раскрытый стабилизатор HIF-2α, коррелирует со сниженным ростом опухоли и ангиогенезом. Чтобы подтвердить, что модуляция роста опухоли и ангиогенеза была связана с продуцированном sVEGFR-1 в ответ на раскрытый стабилизатор HIF-2α, мышей лечили раскрытым стабилизатором HIF-2α в присутствии или отсутствии sVEGFR-1 нейтрализующего Ab.
Раскрытый стабилизатор HIF-2α снижал рост опухоли у мышей, получавших изотипическое контрольное антитело (p<0,001), но не имел никакого влияния на рост опухоли у мышей, также получавших анти-sVEGFR-1 нейтрализующее антитело (p=0,245) (Фигура 14А).
Чтобы подтвердить роль продуцирования sVEGFR-1 в ангиогенез опухоли, изобретатели в данной заявке иммуноокрашивали опухоли эндотелиальным клеточным маркером CD31. Как показано на Фигуре 14B, раскрытый стабилизатор HIF-2α уменьшал наличие кровеносных сосудов в опухоли у мышей, получавших контрольное антитело (p=0,022), но не у мышей, получавших sVEGFR-1 нейтрализующее Ab.
Данные результаты демонстрируют, что раскрытый стабилизатор HIF-2α уменьшает ангиогенез опухоли путем индуцирования sVEGFR-1.
Продуцирование sVEGFR-1 в ответ на раскрытый стабилизатор HIF-2α зависит от продуцирования макрофагов HIF-2α
фланк./фланк.
Раскрытый стабилизатор HIF-2α не является специфически нацеленным на макрофаги, и будет стабилизировать HIF-2α во всех тканях, а не только опухоль-ассоциированные макрофаги. Для того чтобы определить роль макрофагов в противоопухолевом ответе на раскрытый стабилизатор HIF-2α, были использованы мыши с миелоид-специфической делецией HIF-2α (мыши HIF-2α/LysMcre).
Раскрытый стабилизатор HIF-2α ингибировал рост опухоль у контрольных мышей LysMcre (которые содержат LysM-направляемую рекомбиназу, но не фланкированные loxP-сайтами аллели). Несмотря на то, что раскрытый стабилизатор HIF-2α уменьшал рост опухоли у мышей с HIF-2α-дефицитными макрофагами, величина противоопухолевого ответа была гораздо меньшей, чем у контрольных мышей (Фигура 15).
Данные результаты демонстрируют, что раскрытый стабилизатор HIF-2α ингибирует рост опухоли и ангиогенез, по крайней мере, частично, за счет стабилизации HIF-2α в опухоль-ассоциированных макрофагах и индуцирования продуцирования sVEGFR-1.
Клеточная линия меланомы человека (А375)
Иммунодефицитных мышей с клеточной линией меланомы человека (A3 75) и получавших GM-CSF, раскрытый стабилизатор HIF-2α или комбинацию, изобретатель взял для B16F10 мышиной модели меланомы. Комбинация GM-CSF и раскрытого стабилизатор HIF-2α значительно снижала рост опухоль в этой модели (p=0,05). Эти данные подтверждают определение изобретателями эффективности GM и раскрытого стабилизатора HIF-2α в дополнительной мышиной модели, и также являются высоко биологически релевантными раку человека, по крайней мере, отчасти, так как тестируют клеточную линию рака человека, выращенную у мышей. См. Фигуру 15.
Мышиные модели опухоли меланомы
5
6
2
Мышам C57BL/6 или мышам SCID 6-8-недельного возраста инъекционно вводили 1×10 B16F10 клеток мышиной меланомы или 1×10 А375 клеток меланомы человека, соответственно, подкожно в левый бок. После того, как опухоли стали прощупываемыми (приблизительно 5 дней), мыши были случайным образом распределены, чтобы получать лечение или: 20% ПЭГ-400 в 5% сахарозе (носитель для раскрытого стабилизатора HIF-2α) и PBS (носитель для GM-CSF), 20% ПЭГ-400 и GM-CSF (100 нг на мышь в объеме 50 мкл), раскрытый стабилизатор HIF-2α (17,5 мг/кг массы мыши в объеме 100 мкл) и PBS, или раскрытый стабилизатор HIF-2α и GM-CSF (в тех же концентрациях). Раскрытый стабилизатор HIF-2α (или контрольный носитель) вводили внутрибрюшинно, в то время как GM-CSF (или контрольный носитель) вводили внутриопухольно. Мышей обрабатывали внутриопухольно 3 раза в неделю до тех пор, пока опухоли не достигали размера 20 мм в любом измерении (приблизительно 2,5 недели), в этот момент мышей подвергали эвтаназии, в соответствии с ведомственной политикой. Диаметры опухоли измеряли 3 раза в неделю с помощью штангенциркулей, и объемы опухолей будут рассчитываться следующим образом: Объем опухоли = 0,5 × [(большой диаметр) × (малый диаметр)].
В исследовании иммунокомпрометированным SCID мышам инокулировали подкожно А375 опухоли меланомы человека. Начиная с момента, когда опухоли стали прощупываемыми (через 7 дней после инъекций), мышей лечили или с помощью цитотоксической химиотерапии доцетакселем, или раскрытым стабилизатором HIF-2α. Раскрытый стабилизатор HIF-2α давали в дозе 17 мг/кг, и доцетаксел давали в дозе 1 мг/кг. Оба лекарственных средства вводили IP 3 раза в неделю. Комбинация доцетаксела и раскрытого стабилизатора HIF-2α значительно ингибировала рост опухоли по сравнению с любым из лекарственных средств в одиночку. На момент умерщвления опухоли у мышей, которые получали только раскрытый стабилизатор HIF-2α, составляли приблизительно 78% от размера контрольных опухолей, опухоли у мышей, которые получали только химиотерапию, составляли приблизительно 50% от размера контрольных опухолей, и опухоли у мышей, которые получали оба лекарственных средства составляли приблизительно 16% от размера контрольных опухолей.
В то время как конкретные варианты осуществления представленного раскрытия были проиллюстрированы и описаны, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что различные другие изменения и модификации могут быть сделаны без отступления от сущности и объема раскрытия изобретения. Таким образом, имеется в виду, что прилагаемая формула изобретения включает все такие изменения и модификации, которые находятся в рамках данного раскрытия.