РАНОЗАЖИВЛЯЮЩАЯ ПРОТИВОРУБЦОВАЯ МАЗЬ НА ОСНОВЕ КАПУСТЫ ОГОРОДНОЙ (BRASSICA OLERACEA)
WOUND HEALING OINTMENT BASED ON GARDEN CABBAGE (BRASSICA OLERACEA)

РАНОЗАЖИВЛЯЮЩАЯ ПРОТИВОРУЮЦОВАЯ МАЗЬ НА ОСНОВЕ КАПУСТЫ ОГОРОДНОЙ
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности, к способу получения на основе биологического сырья мази с выраженным заживляющим и противорубцовым действием для лечения ран.
Уровень техники
Одной из наиболее важных задач при лечении кожных ран различной этологии и патогенеза является создание оптимальных условий для успешного протекания процесса регенерации. Заживление ран - это сложный многосторонний процесс, результатом которого является восстановление внеклеточного матрикса и функционально активного покрова с возможным формированием рубца.
При лечении ран основными требованиями к лекарственному препарату являются следующие его характеристики:
- антибактериальные свойства препарата;
- обеспечение ускорения процессов регенерации поврежденных тканей с последующей эпителизации раны;
- эффективность против воспалительных процессов, вызванных продуктами распада тканей и продуктами жизнедеятельности клеток.
В настоящее время для лечения ран используют препараты в различных лекарственных формах:
• препаратов для перорального применения;
• тампонов, салфеток, повязок, пропитанных растворами лекарственных веществ;
• в виде мазей и порошков, содержащих, в том числе и антибиотики [1-3].
Препараты для внутреннего применения как правило применяются в качестве одного из элементов при комплексной терапии, кроме того, они обладают достаточно широким спектром противопоказаний и побочных эффектов.
К недостаткам наружных ранозаживляющих препаратов относят большой расход медикаментов, ограниченность применения для патологий, требующих длительного лечения и осложненных гнойными выделениями.
Широко используются для лечения повреждений кожи различные кремы и мази, содержащие активные начала в виде витаминов, экстракты трав и т.п., жировую основу-воск, вазелин, глицерин, полиэтиленоксид и т.д., а также вспомогательные вещества, улучшающие эксплуатационные характеристики крема-отдушки, консерванты и т.д. [4-6].
Наибольшую ранозаживляющую эффективность проявляют препараты, имеющие консистенцию геля или эмульсии, поскольку они легко наносятся на ожоговую поверхность и легко впитываются. Характер консистенции обеспечивается технологией получения лекарственного средства.
Наиболее удобными и перспективными лекарственными форами для дерматологии были и остаются являются кремы, мази, гели, биодеградируемые покрытия. Эти мягкие лекарственные формы используются накожно и/или наносятся непосредственно на слизистую. Основными преимуществами данных лекарственных средств являются равномерное распределение действующего вещества, простота использования, возможность применения в детской и гериатрической практике.
Однако, несмотря на высокую эффективность действующего вещества и местное применение, значительная часть препаратов имеет ряд существенных побочных эффектов, носящих как локальный (аллергические реакции), так и системный (глюкокортикоиды) характер. Следовательно, многие препараты имеют ряд ограничений для применения.
Задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента противовоспалительных и ранозаживляющих лечебных средств на основе растительного сырья.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения средства комплексного лечения ожоговых и посттравматических ран, применяемым самостоятельно, а также в комплексе с другими средствами для подобной цели. Средство представляет собой вазелин-ланолиновую основу, в которую включена для получения 2% мази 40%-ная спиртовая настойка из растительного сбора следующего состава, мас. ч.: трава смолевки татарской или поникшей - 3, цветки ноготков лекарственных - 1, листья кипрея узколистного - 1. Мазь обладает выраженными обезболивающим и противоотечными эффектами, ускоряет эпителизацию поверхностных ожогов, улучшает микроциркуляцию гранулирующих ран, активизирует краевую и островновую эпителизацию, сокращает сроки лечения и подготовку гранулирующих ран к аутодермопластике [13].
В заявляемом средстве отсутствуют токсические компоненты, но присутствуют экстракт листьев  ретинол, витамин А, витамин В, фруктовые кислоты и ряд других компонентов.
На настоящий момент для заживления ран наиболее часто используют следующие мази и гели: левомеколь, солкосерил, актовегин.
Левомеколь мазь белого цвета, для наружного применения, содержит в своем составе левомицетин. Препарат обладает выраженным антибактериальным эффектом, стимулирует восстановление нормальной структуры тканей ран различных форм. К недостаткам препарата можно отнести то, что его не рекомендуется применять длительное время из-за его аллергенности и токсического действия.
Солкосерил мазь для наружного применения, обладает ранозаживляющим, регенерирующим, антигипоксическим, мембраностабилизирующим, ангиопротективным, цитопротективным действием. При этом, применение Солкосерила может приводить к появлению аллергических реакций по типу крапивницы или дерматита.
Актовегин гель для наружного применения, улучшает трофику и регенерацию тканей. Актовегин обладает значительным рядом побочных действий. В частности, в начале лечения препаратом могут быть местные болевые ощущения, связанные с отеком тканей.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является расширение спектра ранозаживляющих средств и создание на основе растительного сырья лекарственного средства, обладающего высоким терапевтическим эффектом воздействия.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к повышению ранозаживляющих, противовоспалительных, регенерирующих свойств при отсутствии аллергического действия.
Технический результат достигается с помощью ранозаживляющей мази, содержащей экстракт листьев Brassica oleracea, вазелин, ланолин, лецинол, диоксидин (диоксисепт), лидокаин, гентамицин, витамин А (ретинола пальмитат), витамин Е (альфа-токоферола ацетат), мас. % (Таблица 1):
Осуществление изобретения
Предлагаемый препарат готовят следующим образом.
Экстракт Brassica oleracea готовился методом мацерации, или настаивания в соотношении сырье : экстраген - 1:5.
Сырье, в качестве которого использовались листья В. oleracea, измельчалось до 0,5-3 мм. Измельченное сырье (40,1 г), помещают вместе с экстрагеном (250 мл) в закрытый сосуд и настаивают 7 дней при температуре 20°С, периодически помешивая. В качестве экстрагена был использован 96% этиловый спирт. По окончании мацерации полученную вытяжку отфильтровывают через ватно-марлевый фильтр. Осадок отжимают, промывают еще раз экстрагеном, снова отжимают и объединяют обе вытяжки.
Для приготовления водной фазы мази к 4 г ланолина безводного добавляют 16 г косметического вазелина, полученную смесь расплавляют на водяной бане (t°=60°C), до получения однородной субстанции, и помещают в термостат (t°=50-60°C).
Для приготовления масляной фазы мази к 3,10 мл (2,5 г) экстракта листьев В. oleracea и 10 мл глицерина добавляют 2 г порошка лецинола. Смесь помещают в водяную баню (t°=66°C) до полного растворения лецинола, а затем в полученную смесь добавляют 0,095 г раствора ретинола пальмитата в масле (витамина А), 0,050 г витамина Е и 0,175 г фруктовых кислот.
В дальнейшем соединяют водную и масляную фазы с добавлением 0,05 г раствора диоксидина, 0,08 г раствора лидокаина, 0,025 г раствора гентамицина и 0,025 г эфирного масла Дамасской розы. Полученную субстанцию тщательно перемешивают, до образования стабильной эмульсии светло-желтого цвета, затем охлаждают при комнатной температуре в течение 30 мин., а затем расфасовывают в герметичные контейнеры и помещают в холодильную камеру при t°=3,6°C.
Капуста белокочанная (Brassica oleracea) - является одним из самых потребляемых овощей в мире. Исследования показали, что диета, богатая овощами рода Brassica, снижает риск развития нескольких видов рака, диабета 2 типа и сердечно-сосудистых заболеваний. Этанольный экстракт В. oleracea насыщен фенольными соединениями, обладает антиоксидантной активностью. Химический анализ экстракта из листьев В. oleracea показал наличие следующих веществ:
1. Витамины (ретинол, тиамин, аскорбиновая и фолиевая кислоты, токоферол и др.);
2. Кислоты органические (яблочная, муравьиная, лимонная и др.);
3. Аминокислоты (лизин, триптофан, метионин, гистидин);
4. Фенольные соединения (таннины, флавоноиды, гликозиды, алкалоиды и др.);
5. Каротиноиды;
6. Изотиоцианаты (сульфорафан и эруцин) [9-10].
Вазелин косметический (Vaselinum) - смесь жидких, полужидких и твердых углеводородов предельного ряда (алканов). Структуру вазелина составляет трехмерная сетка, образованная твердой фракцией вазелина, удерживающая вязкие и жидкие углеводороды. По внешнему виду это однородная тянущаяся нитями масса белого цвета. Вазелин нерастворим в воде, мало растворим в этаноле, растворим в эфире, хлороформе, смешивается во всех соотношениях с жирами, жирными маслами (кроме касторового) и восками. При нагревании в вазелине растворяются некоторые лекарственные средства [3].
Ланолин безводный (Lanolinum anhydricum seu Adeps Lanae) - жироподобное вещество, получаемое из промывных вод овечий шерсти. По внешнему виду это густая вязкая масса желтого или желто-бурого цвета, со своеобразным запахом. Состав ланолина очень сложен и до настоящего времени изучен недостаточно. Он содержит около 70 веществ различной химической природы, в основном представляет собой смесь сложных эфиров высокомолекулярных спиртов (холестерина, изохолестерина и др.) с высшими жирными кислотами (миристиновой, пальмитиновой, церотиновой и т.д.), и свободных высокомолекулярных спиртов. В химическом отношении достаточно инертен, нейтрален и устойчив при хранении. Ценнейшим свойством ланолина является его способность эмульгировать до 180-220% (от собственной массы) воды, до 140% глицерина и около 40% этанола (70% концентрации) и 16-17% (90% концентрации) с образованием эмульсий типа вода/масло [3].
Лецинол, или лецитин (Lecithin) - представляет собой смесь фосфолипидов, главным образом состоящую из фосфатидилхолина, но также может включать в себя триглицериды, жирные кислоты, углеводороды, гликолипиды и другие нефосфолипидные соединения, удаленные из масла в процессе рафинирования. Лецитин обладает эмульгирующими и солюбилизирующими свойствами, обладает антиоксидантной активностью, нейтрализуя свободные радикалы. Стимулирует пролиферацию клеток, уменьшает раздражение и увлажняет кожу, а также улучшает ее барьерную функцию [12].
Диоксидин, или диоксисепт (Dioxydinum) - является оригинальным отечественным антибактериальным препаратом широкого спектра действия. Эффективен при инфекциях, вызванных вульгарным протеем, синегнойной палочкой, палочкой дизентерии и клебсиеллой пневмонии, сальмонеллами, стафилококками, стрептококками, патогенными анаэробами. Действует на штаммы бактерий, устойчивых к другим противомикробным лекарственным средствам, в том числе к антибиотикам. Не оказывает местнораздражающего действия. Применяется для лечения тяжелых гнойно-воспалительных процессов различной локализации. Обработка ожоговых и гнойнонекротических ран способствует более быстрому очищению раневой поверхности, стимулирует репаративную регенерацию и краевую эпителизацию и благоприятно влияет на течение раневого процесса [1, 4].
Гентамицин (Gentamicin) - это бактерицидный антибиотик широкого спектра действия из группы аминогликозидов. Оказывает бактериостатическое действие в отношении многих грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, в том числе синегнойной и кишечной палочки, протея, сальмонелл и пр., влияет на штаммы стафилококков, устойчивые к пенициллину. Является одним из основных средств борьбы с тяжелой гнойной инфекцией, особенно обусловленной резистентной грамотрицательной флорой [4].
Лидокаин (Lidocainum) - является производным ацетанилида, это один из наиболее широко применяемых местных анестетиков, характеризующийся быстрым началом действия, умеренной активностью и токсичностью и средней продолжительностью действия. В основе его механизма лежит уменьшение проницаемости мембраны нейрона для ионов натрия. В результате этого снижается скорость деполяризации и повышается порог возбуждения, приводя к обратному местному онемению. Вызывает все виды местной анестезии: поверхностную, инфильтрационную, проводниковую, эпидуральную, спинальную [1, 4].
Витамин А, или ретинола пальмитат (Retinolum palmitus) - относится к группе жирорастворимых витаминов. Оказывает общеукрепляющее действие, нормализует тканевый обмен, участвует в окислительно-восстановительных процессах (вследствие большого количества ненасыщенных связей), в синтезе мукополисахаридов, белков, липидов, в минеральном обмене, процессах образования холестерина. Положительно влияет на функции слезных, сальных и потовых желез. Усиливает деление эпителиальных клеток кожи, тормозит процессы кератинизации, стимулирует регенерацию клеток [1, 4].
Витамин Е, или альфа-токоферола ацетат (Alfa-Tocopherol acetat) - относится к группе жирорастворимых витаминов. Улучшает тканевое дыхание, предупреждает увеличение проницаемости и ломкости капилляров. Обладает выраженной антиоксидантной активностью (тормозит свободнорадикальные процессы, предотвращает образование пероксидов, повреждающих клеточные и субклеточные мембраны) [1, 4].
Фруктовые кислоты, или альфагидроксильные кислоты (Alpha hydroxy acid) - проникают через эпидермальный барьер и активно влияют на физиологические процессы во всех слоях кожного покрова. Оказывают отшелушивающее, увлажняющее, противовоспалительное и антиоксидантное действие, а также стимулируют синтез коллагена и гликозаминогликанов в коже [11].
Эфирное масло Дамасской розы - стимулирует разглаживание рубцов и стрий, регенерируя клетки кожи. Оказывает общее омолаживающее действие, повышая эластичность и упругость кожи, обладает сильными защитными функциями, оберегая кожу от вредного воздействия внешних факторов.
Благодаря выбранному количественному соотношению компонентов состав имеет оптимальную для использования консистенцию, т.е. не застывает, образуя пленку, и не растекается по поверхности обрабатываемой раны.
Вязкость препарата (мази) при указанных количественных соотношениях компонентов соответствует фармакологическим свойствам мазевого препарата, приготовленного на водорастворимой основе. Его лечебные функции оптимальны, медикаментозные данные соответствуют требованиям для препаратов данной группы.
Результат испытания ранозаживляющей мази на белых лабораторных крысах линии Вистар в сравнительном аспекте.
Исследование влияния ранозаживляющей противовоспалительной мази по следующей методике.
Эксперимент проведен на белых крысах-самцах линии Вистар массой 200-220 г. Животные были разделены на три групп по 20 особей в каждой.
У всех крыс под общим наркозом (Золетил) моделировали линейную рану. Линейные раны у крыс представляют собой продольный разрез кожи и подкожной жировой клетчатки по средней линии спины длиной 5 см. После выполнения разреза края раны сближали, накладывая 3 шва на равном расстоянии друг от друга.
В I группе животных (контрольной) дефект заживал под струпом.
Во II группе животных применяли мазь «Левомеколь», выбранной в качестве препарата сравнения, в дозировке 0,5 мл с помощью шприца.
В III группе животных применяли предлагаемую мазь на основе капусты огородной в дозировке 0,5 мл с помощью шприца.
За животными наблюдали до 15 дня, учитывая при этом внешний вид зоны повреждения. На 15-е сутки животине были подвергнуты эвтаназии. Для патоморфологического и гистологического исследования забирался лоскут кожи 1 см на 2 см (с захватом пораженного и здорового участка), который фиксировался в 10% забуференном формалине. Забиралась кровь для гематологического анализа.
Индукция патологии (оперативное вмешательство по нанесению ран) осуществлялась под наркозом. В качестве анестезирующего вещества использовали «Золетил 100» (Virbac, Франция) - диссоциативный анестетик, разрешенный к применению на территории Российской Федерации. После наркотизации животного приступали к хирургическим вмешательствам.
Для нанесения линейных ран шерсть на дорсальной поверхности животных выстригалась вдоль позвоночника на ширину 300 мм и длину 700 мм. Рана наносилась по шаблону при помощи скальпеля посередине выстриженного участка на длину 500±2 мм до собственной фасции.
Затем на равном расстоянии накладывались 4 шва (нить капроновая с фторполимерным покрытием - Фторлин, Линтекс, РФ) сближающие края раны и обеспечивающие регенерацию раны от краев к центру. Для удобства последующего измерения размеров ран швы накладываются с таким расчетом, чтобы эпителий боковых краев раны не соприкасался, и эпителизация происходила от конечных краев раны.
Препараты наносили накожно (на область раны) в течение 14 дней, один раз в день дозе 1 г мази на 1 животное. После нанесения препаратов животные помещались в индивидуальные метаболические клетки на 1 час, для предотвращения слизывания препаратов.
Клинический осмотр каждого животного проводился ежедневно однократно. Выполняли подробный осмотр животного в клетке содержания и в руках.
Гематологический анализ был проведен с использованием гематологического анализатора Abacus Junior VET (Австрия).
Для патоморфологического и гистологического исследования забирался лоскут кожи 1 см на 2 см (с захватом пораженного и здорового участка) Органы фиксировались в нейтральном забуференном формалине, затем проводилась проводка и заливка в парафин по общепринятой методике.
С парафиновых срезов приготовлялись серийные срезы толщиной 5 мкм на роторном микротоме МПС-2. В дальнейшем для исследования использовали по четыре микропрепарата каждого органа.
Для микроморфометрии и патоморфологического анализа проводилась окраска препаратов гематоксилин-эозином (БиоВитрум, Россия). Так же проводилась окраска соединительной и мышечной тканей гематоксилин-пикрофуксином по методу Ван-Гизона. Окрашенные срезы заключали в монтирующую среду БиоМаунт (БиоВитрум, Россия).
Микроскопию гистологических препаратов проводили на цифровом микроскопе Nicon Eclipse 80I и цифровой фотокамеры Nicon DS-2 (Япония). Для микроскопии были использованы окуляры ×10, ×15, объективы ×4, ×10, ×20, ×40, ×100. С каждого исследованного препарата выполняли по 10 цифровых снимков случайно выбранных полей зрения при увеличении ×200, ×400.
Система микроциркуляции кожи крыс представляет собой соединение нескольких взаимодействующих друг с другом компонентов сосудистой системы, преобладающим из которых являются капилляры артериального типа, и значительно реже встречаются венулы и артериолы.
Производилась оценка удельной доли сосудов микроциркуляторного русла дермы по микрофотографиям препаратов, окрашенных гематоксилин-эозином. Проводили измерение суммарной площади сосудов микроциркуляторного русла субэпидермального слоя дермы, после этого измеряли общую площадь дермы в поле зрения. Расчет вели по формуле:
c
д
где Р - удельная доля сосудов (%), S - суммарная площадь сосудов в поле зрения, S - площадь дермы в поле зрения.
На гистологических препаратах, в дерме подсчитывали количество всех сосудов микроциркуляторного русла и отдельно число нормальных, расширенных и суженных. Исследованию подвергали как незатронутый фрагмент кожи, так и грануляционную и рубцовую ткани.
Морфометрию проводили при помощи программы ImageJ (США) и соответствующего плагина.
Для проведения статистического анализа было использовано программное обеспечение GraphPad Prism 6.0 (США). Данные приводятся в форма M±SD. В качестве параметрического критерия использовался критерий Стьюдента. Статистически значимые отличия определялись при уровне достоверности 0,05.
При визуальной оценке раны на 14 день исследования в группе контрольных животных, наблюдался переход раневого процесса от фазы регенерации к фазе рубцевания и эпителизации.
У животных этой группы воспалительных процессов не выявлено. Процесс регенерации наблюдался от краев раны к центру (ранозаживление смешанным образом - как первичным, так и вторичным натяжением). В области раны у животных отмечена гиперемия.
У крыс второй группы, с обработкой раны Левомеколем, регенерация также происходила от краев раны к центру, признаков воспаления не выявлено (ранозаживление происходило вторичным натяжением). Гиперемия в области раны встречалась в единичных случаях.
В третьей, экспериментальной группе отдельных случаях наблюдали гиперемию, и незначительное раздражение кожи, воспалительных процессов при визуальном осмотре не выявлено. При этом заживление раны происходит путем первичного натяжения, а степень регенерации превышает таковую во второй группе.
Гистологическое исследование кожи контрольных животных свидетельствует о наличие выраженных изменений дермальной и субэпидермальной зон, имеется выраженное хроническое продуктивное воспаление: отек стромы, ангиоматоз, очаговая гиперплазиея потовых желез, выраженная пролиферация переневральных зон, формирование воспалительного вала с преобладанием в нем лимфоцитарно-плазмацитарной клеточной дифференцировки. Эти явления свидетельствуют о переходе репаративной стадии раневого процесса к эпителизации и рубцеванию, с дальнейшим образованием рубца, что так же подтверждается результатами окраски по Ван-Гизону.
У крыс второй экспериментальной группы (Левомеколь) отмечается умеренно выраженное изменение преимущественно в дермальных слоях, гиперкератоз, выраженный акантоз, очаговая гиперплазия гладкомышечных волокон, слабо выраженная клеточная воспалительная реакция.
У животных третьей группы отмечается умеренно выраженной регенераторной активностью, отмечены ангиоматоз, умеренно выраженный акантоз. В этой группе животных выраженность акантоза была существенно меньше, чем во второй группе, что свидетельствует о том, что процесс эпителизации протекал более благоприятно, чем при применении препарата сравнения.
Таким образом, результаты гистологического исследования свидетельствуют о том, что во второй группе (Левомеколь) можно прогнозировать замещение эпителиальной ткани на соединительную в процессе регенерации. В то же время, в третьей группе предполагается заживление со значительно менее выраженной тенденцией к образованию рубца.
Исследование удельной доли сосудов в незатронутых операционным вмешательством фрагментах коже животных показало отличие достоверных отличий между показателями трех исследованных групп. Так, в контроле эта величина составила 5,40±0,20%, во второй группе - 5,28±0,25 и 5,31±0,18 в третьей.
Васкуляризация раны под действием мази на основе капусты огородной сопоставима с таковой во второй группе. Удельная доля сосудов в области раны в контроле составила 1,69±0,34%, в группе животных, рана которых обрабатывалась левомеколем - 2,35±0,41%, а в третьей - 2,40±0,44%.
Из результатов гематологического анализа следует, что в период после нанесения раны у животных второй и третьей групп происходит нормализация исследованных гематологических параметров (количества эритроцитов, лейкоцитов и гемоглобина крови), но в группе животных, где применялась исследуемая мазь, этот процесс протекает более успешно (Таблица 2).
Предлагаемое изобретение за счет своего состава имеет следующие преимущества по сравнению с другими известными техническими решениями:
- повышение, регенерирующих, противорубцовых, противовоспалительных свойств;
- отсутствие аллергического действия;
- является экологически чистым препаратом.
Источники информации:
1. Клюев М.А. Лекарственные средства: свойства, применение, противопоказания: Справочник / Под. ред. М.А. Клюева, М.: Русская книга, 1993, 576 с.
2. Коган Г.Я. Технология лекарственных форм / Г.Я. Коган, М.: Медгиз, 1992, 383 с.
3. Краснюк И.И. Фармацевтическая технология: технология лекарственных форм: учеб. для студ. высш. учеб. заведений / Под. ред. И.И. Краснюка, Г.В. Михайловой, М.: Издательский центр «Академия», 2006, 592 с.
4. Машковский М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский, М.: Новая волна, 2017, 1216 с.
5. Пат. РФ 2044541, 1995, кл. A61K 9/52.
6. Пат. США 5034228, кл. A61K 87/22, 1991.
7. Пат. США 4816271, кл. A61K 7/40, 1989.
8. Пат. Фр. 2668366, кл. A61K 7/48, 1992.
9. Bhandari, S.R., Kwak, J.-H., «Chemical Composition and Antioxidant Activity in Different Tissues of Brassica Vegetables». Molecules 2015, 20, 1228-1243.
10. Consolacion Y.R., Vincent Antonio S.N., Oscar В.Т., «Sterols, triglycerides and essential fatty acid constituents of Brassica oleracea varieties, Brassica juncea and Raphanus sativus». Chemical and Pharmaceutical Research, 2013, 5(12):1237-1243.
11.  "Oxidation of some α-hydroxy-acids with lead tetraacetate". Bulletin of the Chemical Society of Japan. 9 (1): 8-14.
12. Scholfield C.R., «Composition of soybean lecithin», American Oil Chemists Society, vol. 58, no. 10 (October 1981), p. 889-892.
13. Пат. РФ 97107625, кл. A61K 35/78, 1999.