Прогнозирование преждевременных родов по профилю экспрессии генов врожденного иммунитета в клетках цервикального канала
PREDICTION OF PREMATURE BIRTH BASED ON GENE EXPRESSION PROFILE OF INNATE IMMUNITY IN CERVICAL CELLS

Изобретение предназначено для прогнозирования преждевременных родов по профилю экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов и TLRs в клетках цервикального канала беременных методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени. С 22 недель беременности проводят соскоб эпителия эндоцервикса и с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией определяют уровень мРНК генов. По соотношению уровней эксперссии генов TLR4/CD68 и TNF/GATA3 рассчитывают вероятность преждевременных родов, что позволяет своевременно начать комплекс профилактических и лечебных мероприятий, что позволит снизить частоту акушерских и перинатальных осложнений. На сегодняшний день доказано, что в случае пролонгирования беременности на срок, равный или более 48 ч, возможно проведение полного курса профилактики РДС плода, и таким образом улучшить перинатальные исходы на 5% [1, 2].
Предложен способ прогнозирования преждевременных родов начиная с 22 недель беременности путем определения соотношения уровней экспрессии мРНК генов в цервикальном канале.
В частности, предложен способ прогнозирования преждевременных родов путем определения соотношения уровней экспрессии мРНК генов TLR4/CD68 и TNF/GATA3 в клетках соскобов из цервикального канала у беременных женщин с преждевременными родами. У данных пациенток существенно возрастает относительное количество экспрессии генов TLR4/CD68 мРНК и снижается относительное количество TNF/GATA3.
Уровень представленности мРНК генов цитокинов у беременных женщин может служить как самостоятельным, так и дополнительно исследуемым параметром при прогнозировании преждевременных родов.
Для оценки уровня представленности мРНК исследуемых генов в цервикальном канале используются методы обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, в том числе метод полимеразной цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции в режиме «реального времени» (РВ-ПЦР).
Технический результат достигается за счет определения соотношения уровней экспрессии мРНК генов TLR4/CD68 и TNF/GATA3; в цервикальном канале методом ПЦР в реальном режиме времени в период начиная с 22 недель гестации.
Использован метод определения соотношения уровней экспрессии генов, позволяющий на практике не осуществлять нормировку на референсные гены, что существенно упрощает исследование. Расчет вероятности развития преждевременных родов проводится с помощью бинарной логистической регрессии, что существенно повышает точность.
На основании экспериментальных данных при сравнении женщин с угрожающими преждевременными родами и преждевременными родами были получены и проанализированы результаты с применением методов математической статистики (дискриминантный анализ), построена математическая модель, позволяющая вычислить значение канонической линейной дискриминантной функции для каждого клинического образца.
Во избежание деградации сразу после взятия материала (соскобы из цервикального канала) помещают в пластиковую пробирку объемом 1,5 мл, в которую предварительно внесено 500 мкл транспортной среды для стабилизации РНК (визирующий раствор из комплекта реагентов для выделения нуклеиновых кислот ПРОБА-НК (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Допускается хранение материала при -20°С в течение 6 месяцев.
Выделение нуклеиновых кислот для определения экспрессии мРНК проводили с использованием комплекта реагентов ПРОБА-НК (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) или аналогичный. Метод использует лизис клеток с последующей депротеинизацией и осаждением нуклеиновых. Объем образцов после выделения составил 100 мкл.
Полученные препараты РНК желательно сразу использовать для постановки реакции обратной транскрипции.
Для определения уровня представленности мРНК исследуемых генов используют метод ПЦР «в реальном времени» в стандартных условиях с праймерами, специфичными к последовательности определяемых мРНК. Для исключения коамплификации геномной ДНК желательно расположить праймеры на стыках экзонов. Проявку накопления продуктов реакции можно вести с использованием флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов (зондов). Нормированные значения, соответствующие уровню представленности транскриптов каждого гена, можно рассчитывать с помощью метода ΔСр или аналогичного. Полученные автоматически в ходе реакции значения пороговых циклов генов апмлификации (Ср) позволяют определить относительный уровень экспрессии соответствующего гена. Натуральный логарифм соотношения мРНК исследуемых генов равен разнице пороговых циклов (Ср1-Ср2).
На основании полученных уровней экспрессии вычисляется значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ), значение которой используется для вычисления вероятности преждевременных родов у конкретной пациентки.
Уравнение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ): z=-ln(TLR4/CD68)*1,152+m(TNF/GATA3)*1,608-1,526, (1)
где Z-КЛДФ;
TLR4/CD68 - соотношение уровней экспрессии мРНК генов TLR4 и CD68;
TNF/GATA3 - соотношение уровней экспрессии мРНК генов TNF и GATA3;
вероятность развития преждевременных родов рассчитывается по формуле:
p=1/(1+e-z) (2),
где р - вероятность развития преждевременных родов;
Ζ - КЛДФ (1).
При вероятности, большей или равной 67%, прогнозируются преждевременны роды в ближайшие 7 дней.
ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ.
Пример №1
Беременная Α., 30 лет, поступила в стационар с диагнозом: «Беременность 28-29 недель. Головное предлежание. Угроза преждевременных родов».
Из анамнеза: Менструальная функция с 15 лет, регулярная через 28 дней, по 6 дней. При обследовании методом ПЦР изменений не выявлено. Данная беременность 2-я, наступила самопроизвольно, в анамнезе 1 самопроизвольные роды в сроке 39 беременности. Беременность протекала на фоне угрозы прерывания беременности. Беременность осложнилась ранним токсикозом легкой степени в первом триместре, угрозой выкидыша. II триместр - ОРВИ без подъема температуры. III триместре в связи угрозой преждевременных родов в 28-29 недель была госпитализирована, при поступлении взят биоматериал для оценки профиля экспрессии гена TLR4/CD68 и TNF/GATA из цервикального канала.
Получены следующие результаты:
Ln(TLR4/CD68)=-7,83256
Ln(TNF/GATA3)=-4,57477
z=-ln(TLR4/CD68)*1,152+ln(TNF/GATA3)*1,608-1,526=0,14
p=1/(1+e-z)=53%, прогнозируется возможность пролонгирования беременности.
Беременность удалось пролонгировать на 6 недель, что считается положительным результатом прогнозирования. Так как в случае пролонгирования беременности на срок, равный или более 48 ч, возможно проведение полного курса профилактики РДС плода, что в свою очередь позволяет улучшить перинатальные исходы на 5% [1, 2].
Пример №2
Беременная К., 28 лет, поступила в стационар с диагнозом: «Беременность 25 недель. Головное предлежание. Угрожающие преждевременные роды».
Из анамнеза: Менструальная функция с 12 лет, регулярная, через 28 дней, по 5 дней. Данная беременность 1-я, наступила самопроизвольно. Беременность осложнилась угрозой прерывания беременности, анемией. При поступлении осуществили взятие материала слизистой цервикального канала, был определен уровень экспрессии гена TLR4/CD68 и TNF/GATA из цервикального канала. Получены следующие результаты:
Ln(TLR4/CD68)=-1,66355
Ln(TNF/GATA3)=-4,436142
z=-ln(TLR4/CD68)*1,152+ln(TNF/GATA3)*1,608-1,526=0,14
p=1/(1+e-z)=100%, прогнозируется преждевременные роды.
У данной пациентки на следующий день после госпитализации произошли преждевременные роды в сроке 25 недель, родился мертвый недоношенный мальчик 1080 г, 42 см.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Di Renzo, G.C. The "Great Obstetrical Syndromes". J. Matern. Fetal Neonatal. Med. - 2009. 22 (8). - P. 633-635.
2.  O., Olausson P.O., Sedin G., Serenius F., Svenningsen N., Thiringer K., Tunell R., Wennergren M.,  G. The Swedish national prospective study on extremely low birthweight (ELBW) infants. Incidence, mortality, morbidity and survival in relation to level of care. Acta Paediatr. - 1997. - Vol. 86 (5). - P. 503-11.
3. Goldenberg R.L., Culhane J.F., lams J.D., Romero R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 2008; 5; 371 (9606): 75-84.
4. Romero R., Miranda J., Chaemsaithong P., Chaiworapongsa T., Kusanovic J.P., Dong Z., Ahmed A.I., Shaman M., Lannaman Κ., Yoon B.H., Hassan S.S., Kim C.J., Korzeniewski S.J., Yeo L., Kim Y.M. Sterile and microbial-associated intra-amniotic inflammation in preterm prelabor rupture of membranes. J Matern Fetal Neonatal Med. 2015; 28 (12):1394-1409.
5. Romero R., Miranda J., Chaiworapongsa T., Chaemsaithong P., Gotsch F., Dong Z., Ahmed A.I., Yoon B.H., Hassan S.S., Kim C.J., Korzeniewski S.J., Yeo L., Kim Y.M. Sterile intra-amniotic inflammation in asymptomatic patients with a sonographic short cervix: prevalence and clinical significance. J Matern Fetal Neonatal Med. 2014; 24: 1-17.
6. Левит Д.А., Лейдерман И.Н. Острое катаболическое состояние при синдроме системного воспалительного ответа различной этиологии. Попытка клинического анализа. // Вестник интенсивной терапии 2006; 2: 9-14.
7. Макацария А.Д., Бицадзе В.О., Акиныпина C.B. Синдром системного воспалительного ответа в акушерстве: Учебное пособие для врачей. М.: МИА, 2006.- 448 с.
8. Singer M., Biomarkers in sepsis. Curr Opin Pulm Med. 2013, May; 19(3):305-9.
9. Beigi R.H., Yudin M.H., Cosentino L., Meyn L.A., Hillier S.L. Cytokines, pregnancy, and bacterial vaginosis: comparison of levels of cervical cytokines in pregnant and nonpregnant women with bacterial vaginosis. Journal of Infectious, 2007, J Infect Dis. 2007; 196 (9): 1355-60.
10. Сухих Г.Т., Ванько Л.В. Иммунные факторы в этиологии и патогенезе осложнений беременности. // Акушерство и гинекология. 2012: №1. - С. 128-136.
11. Иммунология. Практикум. Учебное пособие. Под ред. Л.В. Ковальчука, Г.А. Игнатьевой, Л.В. Ганковской. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012; 176 с.
12. Honest H., Forbes С.А., Duree K.H., Norman G., Duffy S.B., Tsourapas Α., Roberts Т.Е., Barton P.M., Jowett S.M., Hyde C.J., Khan K.S. Screening to prevent spontaneous preterm birth: systematic reviews of accuracy and effectiveness literature with economic modelling. Health Technol Assess. 2009; 13(43): 1-627.
13. Leitich, H., Kaider A. Fetal fibronectin - How useful is it in the prediction of preterm birth? Br. J. Obstet. Gynecol. - 2003. - Vol. 110 (Suppl. 20). - P. 66-70.