СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ИЗ БИОМАССЫ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ РОДА CHLORELLA
METHOD OF SELECTING LIPIDES FROM BIOMASS OF MICROWAVES OF THE GENUS Chlorella

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам извлечения липидной фракции из биомассы одноклеточной микроводоросли рода Chlorella. Способ применяется для извлечения липидной фракции из биомассы микроводорослей, предварительно выращенной в фотобиореакторах различных типов (как открытых, так и закрытых, включая плоские и трубчатые). Выделенные липиды служат сырьем для получения биодизеля.
Устойчивая к химическим воздействиям клеточная стенка микроводорослей является основным препятствием для извлечения из клетки биологически активных веществ.
Известен способ получения комплекса биологически активных веществ, содержащих ферменты и антибиотические вещества, из биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris [Патент RU 2256700 C12R 1/89, C12N 1/12, С12Н 1/00, C12N 1/12, А23K1, A23J 3/20]. Данный способ предусматривает культивирование биомассы водоросли, разрушение клеток биомассы и экстракцию биологически активных веществ. Для разрушения клеточных стенок авторы используют двукратное замораживание биомассы: первичное замораживание биомассы в зависимости от вида конечного продукта осуществляют при температуре от -13 до -15°С в течении 40-60 мин. После дефростации осуществляют повторное замораживание биомассы при температуре -4°С в течение 5 часов. Для экстракции используют католит, полученный в диафрагменном электролизере. Данный способ имеет ряд недостатков, основным из которых является неэффективность разрушения клеток биомассы методом замораживания и длительность процесса. Кроме этого, на суммарной экономической эффективности процесса получения биологически активных веществ данным способом отрицательно сказывается и использование дорогостоящего католита.
Известен способ извлечения липидной фракции из биомассы микроводоросли Chlorella [Патент RU 2388812 C12N 1/12, С12Р 7/64], при котором на первой стадии разрушение клеточных оболочек микроводоросли Chlorella проводят в аппарате, создающем вихревое электромагнитное поле с хаотически движущимися ферромагнитными частицами, воздействующими на сырье. Далее полученную суспензию разрушенных таким образом клеток микроводоросли подвергают экстракции органическим растворителем нефрас-С с наложением импульсно-кавитационного воздействия в роторном импульсно-кавитационном аппарате. В данном техническом решении можно отметить следующие недостатки. Создание вихревого электромагнитного поля для разрушения клеток путем взаимодействия с хаотически движущимися ферромагнитными частицами требует больших энергозатрат.
2
Известен способ извлечения биологически активных веществ из биомассы одноклеточной водоросли рода Chlorella [Патент RU 2460771 C12N 1/12, А23К 1/00, F61K 8/00], согласно которому высушенную до влажности 10% биомассу механически активируют в активаторах планетарного, вибрационного или виброцентробежного типов, обеспечивающих ускорение мелющих тел 60-400 м/с при времени пребывания в зоне обработки 0.5-10 мин. Измельченную биомассу микроводоросли суспендируют в органическом растворителе (бензин или этиловый спирт) из расчета 5-7 литров органического растворителя на 1 кг сухой биомассы, с последующей экстракцией при комнатной температуре в течение 3-5 часов. Полученный экстракт фильтрованием разделяют на растворимую и нерастворимую части и сушат с получением сухого липидно-пигментного комплекса. К недостаткам данного способа можно отнести низкий выход липидно-пигментного комплекса 12-13% (массовых).
Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ извлечения биологически активных веществ из биомассы микроводоросли рода Chlorella [Патент RU 2044770 C1, C12N 1/12, С12Р 21/00, A23J 3/20, А23K 1/00,1992] - двухстадийный способ извлечения биологически активных веществ из биомассы микроводоросли рода Chlorella, который позволяет получить продукты различной природы. На первой стадии для получения липидно-пигментного комплекса с максимальным выходом сухую биомассу микроводоросли заливают 6 л экстрагента (этанол, бензин или смесь этанол-бензин (1:2)) и перемешивают в течение 6 ч при комнатной температуре. Экстракт отделяют фильтрованием, а оставшуюся биомассу заливают свежей порцией растворителя в объеме 4 л, перемешивают в течение 3 ч и фильтруют. Экстракты объединяют и концентрируют в вакуумном испарителе при температуре не выше 45°С. Конечными продуктами являются липидпигментный комплекс с выходом 11-15% (массовых) и обезжиренная биомасса. На второй стадии процесса обезжиренную биомассу подвергают гидролизу ферментами целлюлолитического и протеолитического действия, проводят термообработку для инактивации ферментов, разделяют белковый гидролизат и шрот. Недостатками данного способа являются неполное извлечение липидной фракции, длительность проведения экстракции, а также большие объемы используемых растворителей.
Техническим результатом, на которое направлено изобретение, является повышение выхода липидов при сокращении времени процесса, уменьшении объемов используемых растворителей, что приводит к удешевлению способа и повышению его экологичности.
Для достижения указанного результата предложен способ выделения липидов из биомассы микроводоросли рода Chlorella, заключающийся в том, что биомассу микроводоросли обрабатывают органическим растворителем, и полученные липиды отделяют, при этом указанные операции проводят дважды, с последующим объединением целевого продукта, при этом предварительно сухую биомассу микроводоросли с влагосодержанием не более 10% гомогенизируют измельчением, заливают органическим растворителем и полученную суспензию биомассы подвергают обработке ультразвуком.
При этом
- обработку ультразвуком проводят с частотой 30-50 кГц в течение 5-20 минут,
- в качестве органического растворителя используют смесь хлороформ-метанол в соотношении 1:2-2:1,
- в качестве органического растворителя используют смесь хлороформ-этанол в соотношении 1:2-2:1.
Недостатки известных способов будут устранены предлагаемым нами методом, основной задачей которого является разработка способа извлечения липидной фракции из биомассы микроводоросли рода Chlorella, обеспечивающего наиболее полное извлечение липидов.
Для достижения максимального извлечения липидной фракции предлагаемое нами изобретение предполагает проведение комплексного разрушения клеточной стенки микроводоросли с последующей экстракцией целевого продукта органическим растворителем. Согласно предлагаемому способу культивируют штамм микроводоросли Chlorella vulgaris GKV-1. Сухую биомассу с влагосодержанием не более 10% (это оптимальное значение, большее содержание влаги затрудняет процесс экстракции, приводя к необходимости увеличивать расход растворителя) гомогенизируют измельчением и суспензируют в органическом растворителе, например, смеси хлороформ-метанол, хлороформ-этанол. Дальнейшее разрушение клеток проводят ультразвуком. Полученную суспензию при комнатной температуре экстрагируют органическим растворителем. По окончанию экстрагирования проводят разделение, например, фильтрованием. Нерастворимую часть подвергают повторной экстракции и разделяют. Объединенный экстракт сушат и получают липидную фракцию, выход которой составляет до 25.5% (по массе). Нерастворимый остаток - обезжиренная биомасса (шрот) содержит белки и после дополнительной обработки может использоваться в качестве белковой кормовой добавки. Предлагаемый способ позволяет повысить степень извлечения липидов, сократив при этом время проведения процесса и уменьшить расход растворителей.
18
18:2
18:3
18:1
16
16:2
16:3
16:0
В качестве сырья используют, например, биомассу микроводоросли Chlorella vulgaris GKV-1, основной липидной фракцией которой являются триацилглицерины (триглицериды). При исследовании состава жирных кислот липидов микроводоросли установлено, что преобладающими являются ненасыщенные жирные кислот (суммарное содержание которых составляет более 60% от суммы жирных кислот), основными из которых являются C жирные кислоты: линолевая кислота (C, 31.54%), линоленовая (C, 10.50%) и олеиновая (C, 3.60%), а также C ненасыщенные кислоты, представленные C (7.75%) и C (13.44%). Насыщенные кислоты представлены в основном пальмитиновой кислотой (C, 21.57%).
Способ осуществляется следующим образом:
1. навеску сухой биомассы микроводоросли (влагосодержание не более 10%) гомогенизируют, например, с использованием шаровой мельницы (размер стеклянных бус 0.1-0.5 мм, скорость вращения ротора 2800-3000 об/мин) в течение 3-5 минут;
2. измельченную биомассу суспензируют в 0.5-1.5 л органического растворителя, например, смеси хлороформ-метанол (1:2, 2:1), хлороформ-этанол (1:2, 2:1). Указанные диапазоны позволяют достичь наибольшей степени извлечения целевого продукта при экстракции.
3. суспензию биомассы подвергают обработке ультразвуком при 30-50 кГц в течение 5-20 минут. Использование других параметров на этой стадии не оказывает влияния на технический результат - выход липидов не изменяется;
4. к суспензии добавляют 0.5-3.5 л органического растворителя, использованного на стадии 2;
5. экстракцию липидов проводят при комнатной температуре в течение 0.5-2 часов;
6. полученную суспензию разделяют фильтрованием;
7. нерастворимый остаток биомассы заливают свежей порцией 2-4 литра органического растворителя;
8. экстракцию липидов проводят при комнатной температуре в течение 0.5-2 часов;
9. полученную суспензию разделяют фильтрованием;
10. объединенный органический экстракт со стадии 6 и 9 упаривают в вакуумном испарителе;
11. выделенную липидную фракцию сушат.
Пример 1. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris GKV-1 культивируют в течение 96 часов. Клетки осаждают центифугированием. Полученную биомассу высушивают. 1 кг сухой биомассы Chlorella vulgaris GKV-1 (влагосодержание не более 10%) измельчают, например, с использованием шаровой мельницы (размер стеклянных бус 0.5 мм, скорость вращения ротора 3000 об/мин) в течение 4 минут. Полученный продукт суспензируют в 1 л смеси хлороформ-метанол (1:2) и подвергают обработке ультразвуком при 50 кГц в течение 10 минут. Далее к суспензии добавляют 3 л смеси хлороформ-метанол (1:2) и проводят экстракцию при комнатной температуре в течение 1 часа. Экстракт отделяют фильтрованием. Оставшуюся биомассу (нерастворимый осадок) заливают 3 л смеси хлороформ-метанол (2:1) и проводят экстракцию при комнатной температуре в течение 45 минут. Экстракт отделяют фильтрованием. Объединенный экстракт упаривают в вакуумном испарителе и далее сушат. Выход липидов составляет 22.05%.
Пример 2. То же, что в примере 2, но вместо смеси хлороформ-метанол использовали смесь хлороформ-этанол. Выход липидов составляет 25.50%.
Пример 3. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris GKV-1 культивируют в течение 96 часов. Клетки осаждают центрифугированием. Полученную биомассу высушивают. 1 кг сухой биомассы Chlorella vulgaris GKV-1 (влагосодержание не более 10%) измельчают, например, с использованием шаровой мельницы (размер стеклянных бус 0.5 мм, скорость вращения ротора 3000 об/мин) в течение 4 минут. Полученный продукт суспензируют в 1 л смеси хлороформ-метанол (1:2) и проводят экстракцию при обработке ультразвуком при 30 кГц, мощности 100 Вт в режиме непрерывного озвучивания в течение 5 минут. Далее к суспензии добавляют 3 л смеси хлороформ-метанол (1:2) и проводят экстракцию при комнатной температуре в течение 1 часа. Экстракт отделяют фильтрованием. Оставшуюся биомассу (нерастворимый осадок) заливают 3 л смеси хлороформ-метанол (2:1) и проводят экстракцию при комнатной температуре в течение 45 минут. Экстракт отделяют фильтрованием. Объединенный экстракт упаривают в вакуумном испарителе и далее сушат. Выход липидов составляет 14.77%.
Пример 4. То же, что и в примере 3, но обработку ультразвуком проводили в течение 10 минут. Выход липидов составляет 13.82%.
Пример 5. То же, что и в примере 3, но обработку ультразвуком проводили в течение 15 минут. Выход липидов составляет 13.38%.
Пример 6. То же, что и в примере 3, но обработку ультразвуком проводили 20 минут. Выход липидов составляет 12.92%.
Пример 7. То же, что и в примере 3, но и вместо смеси хлороформ-метанол использовали смесь хлороформ-этанол. Выход липидов составляет 19.49%.
Пример 8. То же, что и в примере 7, но обработку ультразвуком проводили в течение 10 минут. Выход липидов составляет 18.09%.
Пример 9. То же, что и в примере 3, но обработку ультразвуком проводили в течение 15 минут. Выход липидов составляет 17.94%.
Пример 10. То же, что и в примере 3, но обработку ультразвуком проводили в течение 20 минут. Выход липидов составляет 17.98%.
Выход липидов (% от асб) при различном времени обработки биомассы УЗ (рабочая частота 30 кГц, мощность 100 Вт, режим озвучивания непрерывный) с использованием различных смесей растворителей показан в таблице 1.
Аналогичные эксперименты были проведены при обработке биомассы ультразвуком 50 кГц и добавлены их результаты.
Выход липидов (% от асб) при различном времени обработки биомассы УЗ (рабочая частота 50 кГц, мощность 100 Вт, режим озвучивания непрерывный) с использованием различных смесей растворителей показан в таблице 2.
Согласно аналогу, время экстракции составляет не менее 9 часов (время необходимое на непосредственно экстракцию без дополнительных стадий разделения и пр.), в нашем способе время, затраченное на экстракцию, включая и стадию разрушения клеточной стенки, составляет 2 часа. Согласно аналогу расход растворителей на 1 кг исходной биомассы составляет 10 литров, в нашем способе расход растворителя снижен на 30%.
Таким образом, заявленная совокупность операций, последовательность и режимы их проведения, позволят достичь заявленного результата - повысить выход липидов при сокращении времени процесса, уменьшении объемов используемых растворителей, что приводит к удешевлению способа и повышению его экологичности - по сравнению с аналогом: время экстракции сокращено в 4,5 раза (с 9 часов аналога до 2 часов в нашем способе); расход растворителей на 1 кг исходной биомассы снижен на 30%.