Способ получения сурфактанта из легких крупного рогатого скота
METHOD FOR OBTAINING SURFACTANT FROM BOVINE LUNGS

Изобретение относится к медицине, а именно к получению лекарственных препаратов из природного сырья, и может найти применение в промышленном производстве природных легочных сурфактантов.
Легочный сурфактант представляет собой природный комплекс веществ, состоящий из фосфолипидов, нейтральных липидов и сурфактант-ассоциированных белков. Он синтезируется в альвеолоцитах второго типа и экскретируется ими на внутреннюю поверхность альвеол, создавая, таким образом, высокоспецифичную легочную "смазку".
Легочный сурфактант является чрезвычайно эффективным средством профилактики и лечения синдрома дыхательных расстройств и бронхо-легочной дисплазии новорожденных.
В нашей стране в последние годы легочный сурфактант находит все более широкое применение при лечении дыхательной недостаточности некардиогенной природы у взрослых в критических состояниях, под которыми подразумевают острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), а также тяжелые двусторонние пневмонии.
Известно несколько препаратов сурфактанта: синтетические (Exosurf, Glaxo-Wellcome, США-Великобритания; ALEC, Britanica, Великобритания), полусинтетические (Surfactant-TA, Tokyo Tanabe, Tokyo, Япония; Survanta Ross/Abbout Lab, Chicago, США) и природные (Curosurf, Chiesi Farmaceutici Farma, Италия; Альвеофакт, Лиомарк Фарма, Гмбх, Германия; Infasurf, ONY Inc, Buffalo, NY, США; CLSE, Rochester, NY, США; Newfactant, Seoul, Korea и Сурфактант-БЛ, «ООО Биосурф, Россия).
Каждый из известных сурфактантов имеет свой специфический способ получения.
Наиболее близким к предлагаемому является способ по RU патенту №2198670, 2002 г., взятый нами в качестве прототипа, являющийся усовершенствованием описанных ранее способов по патентам 2066197 и 2066198.
Способ заключается в том, что легкие крупного рогатого скота в физиологическом растворе измельчают разрезанием на кусочки со сторонами не более 5 мм с одновременным проточным экстрагированием, фильтруют, фильтрат центрифугируют на проточной центрифуге при 100-150g и скорости протока 5-6 л/мин, надосадочную жидкость подвергают повторному проточному центрифугированию при 15000-20000g со скоростью протока 1-1.5 л/мин, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде, образовавшуюся суспензию центрифугируют при 10000-15000g в течение 45-60 мин., к осадку добавляют дистиллированную воду, экстрагируют смесью хлороформа и метанола в соотношении 1:1-3:1 в атмосфере аргона, экстракт промывают 0.1% раствором хлорида калия или кальция, суспензию оставляют до разделения фаз, затем нижнюю фазу отбирают и удаляют из нее органические растворители.
Способ обеспечивает получение целевого продукта (сурфактанта-БЛ) в течение 7 рабочих дней в количестве 2 г из 1 кг сырья.
К недостаткам прототипа следует отнести то, что он достаточно длительный, трудоемкий и обеспечивает относительно невысокий выход целевого продукта.
Технический результат настоящего изобретения состоит в сокращении времени получения целевого продукта и с более высоким выходом.
Этот результат достигается тем, что в известном способе, включающем измельчение сырья в физиологическом растворе разрезанием на кусочки с одновременным проточным экстрагированием, фильтрование полученного экстракта, центрифугирование его на проточной центрифуге при низких оборотах и скорости протока 5-6 л/мин, повторное проточное центрифугирование надосадочной жидкости со скоростью протока 1 л/мин, ресуспендирование полученного осадка в дистиллированной воде и дополнительное центрифугирование образовавшейся суспензии при 10000-15000g в течение 45-60 мин. с последующим экстрагированием полученной после ресуспендирования осадка в дистиллированной воде суспензии смесью хлороформа и метанола в атмосфере аргона, промывание полученного экстракта раствором хлористого калия и выдерживание смеси до разделения фаз с последующим отделением нижней фазы и отгонку из нее органических растворителей, согласно изобретению, легкие крупного рогатого скота предварительно освобождают от бронхов, разрезают на кусочки размером 30×30×30 мм, измельчают их в физиологическом растворе при температуре +4°С на роторно-статорном дезинтеграторе, надосадочную жидкость после центрифугирования при низких оборотах выдерживают при +4°С в течение 1 часа, повторное проточное центрифугирование выполняют при 22000-25000g, экстрагирование полученной после дополнительного центрифугирования суспензии выполняют в соотношении хлороформ : метанол : вода 1:2:0.8, для промывания полученного экстракта используют 0,2% раствор хлористого калия, оставляя смесь на 1 час при комнатной температуре, после чего отбирают нижний и промежуточный слои, добавляют к ним хлороформ в объеме, равном первоначальному его объему, смесь перемешивают и на роторном испарителе удаляют органические растворители, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде, в полученной эмульсии определяют липидный фосфор, после чего расфасовывают ее по флаконам и лиофилизируют.
Разрезание легкого на кусочки 30×30×30 мм с последующим измельчением их на роторно-статорном дезинтеграторе обеспечивает получение практически лаважной жидкости, при этом совмещение нарезки сырья с проточным экстрагированием значительно уменьшает загрязнение экстракта балластными веществами.
Последующее выдерживание надосадочной жидкости после центрифугирования при низких оборотах при +4°С в течение часа приводит к образованию агрегатов липопротеидов сурфактанта, что уменьшает время очистки препарата, снижает его потери, обеспечивая максимальный выход сурфактанта при экстрагировании.
Повторное проточное центрифугирование надосадочной жидкости при 22000-25000 g обеспечивает полное осаждение промежуточного продукта со значительно меньшим количеством примесей.
Использование для экстрагирования образованного осадка смеси хлороформ : метанол : вода в соотношении 1:2:0.8 с последующим промыванием экстракта 0,2% водным раствором хлорида калия обеспечивает максимальную экстракцию фосфолипидов, нейтральных липидов, холестерина и его эфиров, а также всего набора гидрофобных сурфактант-ассоциированных белков групп "В", "С" и "G", обеспечивая нативность получаемого препарата и его высокую терапевтическую активность.
Разработанные режимы получения препарата позволяют получать сурфактант (сурфактант-БЛ) в течение 5 рабочих дней и с выходом более 2,5 г из 1 кг сырья.
Сущность способа поясняется примерами.
ПРИМЕР 1.
10 кг легкого крупного рогатого скота отмывали холодной водой от крови, освобождали от бронхов, нарезали на кусочки 30×30×30 мм, загружали в реактор, снабженный роторно-статорным измельчителем, добавляли 50 л холодного +4°С физиологического раствора, измельчение совмещали с одновременным экстрагированием при +4°С. Полученный экстракт фильтровали через сетчатый фильтр. Осадок выбрасывали, а фильтрат центрифугировали на проточной центрифуге при 150 g и скорости протока 6 л/мин. Надосадочную жидкость (50 л) охлаждали до +4°С и выдерживали при этой температуре в течение часа. Суспензию подвергали повторному проточному центрифугированию при 22000 g со скоростью протока 1 л/мин, осадок ресуспендировали в 6 л дистиллированной воды и центрифугировали при 15000g.
К полученному осадку (28 г) добавляли 800 мл дистиллированной воды, перемешивали и экстрагировали 3000 мл смеси хлороформа и метанола в соотношении 1:2 (1000 мл хлороформа и 2000 мл метанола) [с учетом 800 мл воды, в которой ресуспендировали осадок, соотношение хлороформ-метанол-вода составляло 1000:2000:800 или 1:2:0,8], экстракцию продолжали в течение 30 минут. Гомогенат фильтровали через плотный бумажный фильтр и к полученной смеси добавляли 1000 мл хлороформа, перемешивали и добавляли 1000 мл 0,2% раствора КCL. Суспензию перемешивали и оставляли на 1 час при комнатной температуре. Нижнюю (хлороформенную) фазу и промежуточный слой отбирали и удаляли органические растворители. Было получено 25,5 г препарата, т.е. 2,55 г из 1 кг исходного сырья. Сухой остаток ресуспендировали в 850 мл дистиллированной воды. После определения содержания фосфолипидов, которая составила 30,0 мг/мл, полученную эмульсию разливали по 2,5 мл во флаконы (по 75 мг фосфолипидов в каждом флаконе) и лиофилизировали. Всего было получено 340 флаконов сурфактанта-БЛ.
Качество полученного препарата оценивали по содержанию фосфолипидов по Васьковскому и белка - по Лоури. Количество белка в каждом флаконе составляло 1.7 мг, фосфолипидов - 75 мг, т.е. препарат отвечал требованиям Фармакопейной статьи предприятия (ФПС) на сурфактант-БЛ, Р №003383/01 - 230710 (от 23.07.2010 г.), согласно которой содержание фосфолипидов должно быть от 68 до 82 мг, белка -от 1,5 до 2,3 мг во флаконе.
ПРИМЕР 2.
20 кг легких крупного рогатого скота обрабатывали аналогично примеру 1, добавляя для загрузки в реактор 100 л холодного (+4°С) физраствора. Все стадии получения препарата выполняли аналогично примеру 1, осуществляя повторное центрифугирование надосадочной жидкости при 25000g. Осадок ресуспендировали в 12 л дистиллированной воды и центрифугировали при 10000g. К полученному осадку (60 г) добавляли 1,6 л дистиллированной воды, 2 л хлороформа и 4 л метанола. Получили 50 г препарата (2,5 г сурфактанта из 1 кг легкого). Его суспендировали в 1,6 л дистиллированной воды. Содержание фосфолипидов составило 31,25 мг/мл. Полученную эмульсию разлили по 2,5 мл по флаконам. Получили 640 флаконов. С содержанием белка - 2,1 мг, фосфолипидов - 78,1 мг в каждом флаконе. Препарат отвечал требованиям Фармакопейной статьи предприятия (ФПС) на сурфактант-БЛ, Р №003383/01 - 230710 (от 23.07.2010 г.), согласно которой содержание фосфолипидов должно быть от 68 до 82 мг, белка - от 1,5 до 2,3 мг во флаконе.
Предлагаемый способ разработан авторами для получения сурфактанта-БЛ, единственного из известных препаратов сурфактанта, разрешенного Министерством здравоохранения РФ и Росздравнадзором РФ для применения его как у новорожденных, так и у взрослых, в то время как все другие известные препараты сурфактанта имеют разрешение для применения только у новорожденных.
Высокая эффективность сурфактанта-БЛ обусловлена тем, что в отличие от всех других препаратов сурфактанта, как выше сказано, он является полностью нативным и содержит 2% сурфактант-ассоциированных белков.
Доказано, что синтетические препараты сурфактанта менее эффективны при лечении РДС новорожденных и неэффективны при лечении ОРДС у взрослых, хотя они, безусловно, более доступны. Синтетические препараты сурфактанта не содержат сурфактант-ассоциированных белков. Наличие же в составе природных препаратов легочного сурфактанта, так называемых сурфактант-ассоциированных белков, чрезвычайно важно для проявления множества функций этого природного комплекса. Снижение силы поверхностного натяжения на поверхности легочных альвеол, осуществляемое фосфолипидами в кооперации с сурфактант-ассоциированными белками, облегчает процесс раскрытия альвеол во время вдоха, уменьшая необходимое для этого усилие мышц грудной клетки. С сурфактант-ассоциированными белками мы связываем антибактериальную и антивирусную активность сурфактантов, способность этих белков проявлять активность хемиатрактантов по отношению к альвеолярным макрофагам, стимулировать комплемент-зависимый и антитело-зависимый захват патогенных бактерий и вирусов альвеолярными макрофагами и т.д. Они, кроме того, подавляют in vitro способность полиморфно-ядерных лейкоцитов и альвеолярных макрофагов к экскреции (освобождению) цитокинов - молекулярных компонентов провоспалительного каскада. Последние повреждают альвеолокапиллярную мембрану - основное структурное и функциональное звено легочного газообмена.
Наиболее частыми причинами ОРДС являются сепсис, тяжелая множественная травма, массивные переливания крови, ожоги дыхательных путей и различные токсические состояния. Развитие ОРДС может происходить вследствие прямого повреждения легочной паренхимы (пневмония, аспирация желудочного содержимого (АЖС), вдыхание дыма, горячего пара или воздуха, токсических жидкостей и газов, контузия легкого) или при системном поражении организма (сепсис, множественная травма, например, автомобильная, синдром сдавления, острое лучевое поражение, длительная ИВЛ, осложнения после кардиохирургических операций с длительным применением искусственного кровообращения, посттрансфузионный и реперфузионный синдромы). Смертность от ОРДС чрезвычайно высока и зависит от фона, на котором он развивается. При множественной травме и синдроме сдавления смертность составляет 50-60%, при сепсисе до 90%.
2
Основой лечения таких больных долгие годы было применение ИВЛ, обычно с жесткими параметрами, т.е. высоким парциальным давлением кислорода во вдыхаемой смеси (FiO=0.8-1.0), высоким пиковым давлением на вдохе (больше 35-40 см водн. ст.), большими объемами подаваемой газовой смеси (12-15 мл/кг массы тела) и обязательным положительным давлением в конце выдоха. Эти, так называемые жесткие параметры ИВЛ, являются дополнительными мощными факторами повреждения легких, они нередко приводят к развитию вентилятор-индуцированной и нозокомиальной пневмоний и увеличивают смертность при ОРДС на 30% и более. В 2000 - 2015 годы в лечении ОРДС дополнительно к ИВЛ мы стали использовать препарат легочного сурфактанта сурфактант-БЛ, хорошо зарекомендовавший себя при лечении синдрома дыхательных расстройств новорожденных. Реаниматологи в настоящее время придерживаются концепции "безопасной" ИВЛ (концентрация кислорода менее 60%, пиковое давление менее 30 см водн. ст., дыхательный объем 4-6 мл/кг вместо 12-15 мл/кг). Как нами показано, именно использование сурфактанта-БЛ позволяет быстро переходить на режимы "безопасной" ИВЛ.
С использованием сурфактанта-БЛ нами совместно с врачами различных клиник проведено лечение более 14000 новорожденных с первичным и вторичным РДС и более 1500 новорожденных низкой и экстремально низкой массой тела при рождении, которые получали сурфактант-БЛ ингаляционно для профилактики бронхолегочной дисплазии (БЛД) (Патент №2012129772, 2014 год). Дети экстремально низкой массой тела (менее 1000 г) при рождении, получавшие лечение РДС итальянским препаратом Куросурф и после этого задержавшиеся на ИВЛ более 3 суток в результате получения дополнительно ингаляций сурфактанта-БЛ, быстро (в течение 5 суток), были сняты с ИВЛ и у 80% детей не развивалась бронхолегочная дисплазия, приводящая к инвалидизации. Кроме того, проведено лечение ОРДС взрослых около 7000 больных и пострадавших в чрезвычайных ситуациях (взрывы и пожары в Московском и Минском метро, кафе «Хромая лошадь - 2009 г) (Патенты №2149016 - 2000 г - Способ лечения респираторного дистресс-синдрома взрослых; Патент №2238757 - Способ лечения ингаляционных поражений - 2004 год), при этом значительно, более чем вдвое, сокращалось время пребывания больного на ИВЛ и в 3-4 раза снижалась летальность.
Сурфактан-БЛ используют и для лечения дыхательной недостаточности при критических состояниях у детей (Патент 2149017), что позволяет достаточно быстро добиться ее купирования. При этом значительно сокращается время нахождения детей на жестких параметрах ИВЛ - до 2-12 часов (от 12 часов до 13 суток в известных способах), обеспечивается быстрое устранение ятрогенных (врачебных) факторов повреждения легких, а также факторов повреждения, связанных с течением ОРДС, что является очень важным для профилактики фиброзировання легких -наиболее частого осложнения у выживших больных, число которых, как показывает наш опыт, составляет более 90%. При этом удается снизить количество вводимого сурфактанта-БЛ до 1,5-2 г на курс лечения, в то время как в известных способах лечения дыхательной недостаточности при критических состояниях используется 18-24 г природных сурфактантов (Infasurf) и 32-64 г полусинтетических (Survanta). Если учесть высокую стоимость известных препаратов сурфактанта, то уменьшение количества используемого сурфактанта-БЛ существенно снижает стоимость лечения ОРДС, Стоимость курса лечения с использованием, например, природного сурфактанта Infasurf оценивается в 35000 $ США [Timmons O.D. et al., J. Pediatrics, 1991, V. 119, 896-899].
Сурфактант-БЛ использован нами ранее и при лечении острых бронхопневмоний (ОБПН), осложненных ателектазом (AT) (Патент 2149014). Частота возникновения AT как осложнения ОБПН у детей составляет 16,7% от всех ОБПН. Экстраполяция на население России позволяет считать, что около 15000 детей ежегодно страдают ОБПН, осложненными AT. При этом традиционные методы лечения стойких AT позволяют лишь в 57-60% случаев добиться полного разрешения AT и требуют для этого многократных (5-6) санационных бронхо- или фибробронхоскопий, что чрезвычайно травматично, а у детей до 10 лет требуется применения общего наркоза. Длительное существование AT нередко (в 10-12% случаев) приводит к инфицированию зоны ателектаза, формированию бронхоэктазов и требует хирургического иссечения сегмента или доли легкого.
Нам удалось с применением сурфактанта-БЛ получить положительные результаты в виде полного, в течение 3-5 дней, расправления AT после о дно- двукратного введения нашего препарата в количестве 100-300 мг путем селективной фибробронхоскопий при сроке существования AT до 45 суток.
Таким образом, к настоящему времени при критических состояниях с использованием сурфактанта-БЛ прошло лечение более 14000 новорожденных РДС и 7000 взрослых с ОРДС с получением положительных результатов.
Сурфактант-БЛ нашел применение для профилактики пневмоний и ОРДС при аспирации желудочного содержимого (АЖС) (Патент 2149018). Тяжелые пневмонии и ОРДС, развивающиеся вследствие АЖС, являются критическими состояниями, обусловленными дыхательной недостаточностью некардиогенной природы, и требуют для лечения больных применения всего арсенала реанимационных мероприятий, в том числе ИВЛ. И только применение больному, находящемуся на ИВЛ, Сурфактанта-БЛ сразу, после снятия возникшего у него бронхоспазма, болюсно или в виде аэрозоля с помощью ингаляции в течение 4-6 часов ежедневно в течение 2-3 дней не позднее 12 часов после случившейся АЖС позволяет предотвратить развитие пневмонии и ОРДС и тем самым повысить выживаемость.
Работами В.В. Ерохина с соавт. (Сурфактантная система при туберкулезе легких. РАМН, Москва, ФГБУ «ЦНИИТ», «НЬЮ ТЕРРА», 2013, 260 стр. ) была доказана существенная роль повреждения легочного сурфактанта при туберкулезе легких. Нами совместно с врачами ЦНИИТ РАМН, Москва, были проведены многоцентровые клинические испытания при лечении туберкулеза легких, где сурфактант-БЛ был использован в качестве патогенетического средства в комплексном лечении на фоне специфической антибиотико- и химиотерапии (Патент №2195313, 2002 год). По этому патенту получили лечение более 8000 больных. Использование сурфактанта-БЛ в комплексном лечении туберкулеза легких позволило достичь в 83% случаев абациллирования (исчезновение микобактерии туберкулеза в мокроте больного), что делает больного безопасным для окружающих, в 100% случаев отмечалось уменьшение или исчезновение инфильтратов в легких и в 73% случаев закрытие каверн до 3 см. в диаметре. В дополнительных исследованиях было показано, что каверны величиной более 3 см (до 8 см в диаметре) при проведении курса сурфактант-терапии с использованием сурфактанта-БЛ на фоне специфической химио- и антибиотикотерапии уменьшаются в 4-12 раз. У больных туберкулезом легких при проведении курса сурфактант-терапии сурфактантом-БЛ на фоне правильно подобранной химиотерапии через 3-5 ингаляций (ежедневно) увеличивается количество мокроты, уменьшается болезненность кашля, затем он исчезает, увеличивается переносимость физической нагрузки и в большом проценте случаев происходит полное излечение туберкулеза. Наконец, в течение последних 5-6 лет препарат сурфактант-БЛ мы начали применять для лечения бронхиальной астмы (Патент №2611406), хронической обструктивной болезни легких (Патент №2600833), внебольничнной пневмонии - (Патент №2611414) и хронического обструктивного бронхита - (Патент №2600822). В настоящее время получили лечение более 40 больных бронхиальной астмой, 12 больных ХОБЛ, 26 больных хроническим обструктивным бронхитом и 8 - внебольничной пневмонией. Больные бронхиальной астмой уже после 2-3 ингаляций субъективно отмечают возможность выполнения глубокого вдоха и более свободного выдоха в сравнении с предшествующим состоянием. Больные отмечают увеличение времени выдоха с помощью пикфлюометра, через 3-5 ингаляций (по 10-20 мг ежедневно) увеличивается количество мокроты, затем ее количество уменьшается, исчезает шумное дыхание, ночные приступы удушья, а затем и резко уменьшается частота дневных приступов удушья, увеличивается переносимость физической нагрузки. Ряд больных прекращает прием ингаляционных глюкокортикостероидов (иГКС), а у большинства из них удается снизить дозу иГКС вдвое. У более чем 70% больных после получения курса сурфактант-терапии сурфактантом-БЛ отмечены ремиссии на 2-4 года.
Подводя итоги вышеописанному, можно констатировать, что сурфактант-терапия с использованием сурфактанта-БЛ при критических состояниях имеет решающее значение для профилактики и лечения возникающих при них ОРДС и возникающих при этом осложнений: вентилятор-индуцированных и нозокомиальных пневмоний, а в последствии и развития фиброза легких. Основные достоинства такой сурфактант-терапии заключаются в том, что именно она обеспечивает сокращение срока нахождения больного на ИВЛ до 7 суток (против 20-40 без его применения); купирование ОРДС в 85% случаев (против 40% при традиционном лечении); летальность больных, отвечающих на введение сурфактанта, а их большинство (86%) составляет 16% - 20% (а по литературным данным - от 34% - до 50%).
В настоящее время сурфактант-БЛ производится в нашей стране только в ООО "Биосурф" (СПб, пос. Песочный, ул. Ленинградская, д. 70).
В предлагаемом способе получения сурфактанта-БЛ решена задача получения его с высоким выходом из природного сырья, сохраняющего нативные свойства и высокую терапевтическую (специфическую) активность. Указанные свойства обуславливают возможность его эффективного использования в медицинской практике как при острой дыхательной недостаточности критических состояний новорожденных и взрослых, так и при других острых и хронических заболеваниях легких.
Сурфактант-БЛ разрешен Приказом МЗ РФ 261 от 14.07.2000 г. к медицинскому применению для лечения РДС новорожденных, в 2003 г. для лечения острого респираторного дистресс-синдрома взрослых (Протокол №1 Заседания Государственного Фармкомитета от 03.02.2003 года) и в 2008 г. в качестве патогенетического компонента для лечения туберкулеза легких (Протокол заседания специализированной комиссии НЦ ЭСМП МЗ РФ от 13 апреля 2007 г), на препарат сурфактант-БЛ утверждена ФСП Р №003383/01-230710 (от 23.07.10).
Сурфактант-БЛ включен:
1. в стандарт лечения РДС новорожденных на основании Приказа Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 13 марта 2006 г. N 147,
2. в Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению синдрома дыхательных расстройств (РДС) под ред. академика Н.Н. Володина (2016 г).
3. в «Перечень жизненно-важных и необходимых лекарственных средств», ЖНВЛ, утверждаемый Правительством РФ с 2005 г;
4. в «Региональный стандарт оказания специализированной медицинской помощи в Тюменской области при родах у женщин группы высокого риска по материнской смертности», утвержденный Приказом Департамента здравоохранения Тюменской области №693 от 02.12.2008;
5. в рекомендации по лечению тяжелых больных пневмонией в информационном письме Минздравсоцразвития №24-5/10/2-9533 от 28 ноября 2009 г. «Грипп A/H1N1 и вызванная им пневмония у Беременных. Этиотропная и респираторная терапия»; подписанное зам. министра В.И. Скворцовой. Письмо повторяется с 2009 года ежегодно, в том числе и в 2017 году.
8. в клинический протокол диагностики, лечения и реабилитации детского и взрослого населения с термическими поражениями и их последствиями, утвержденный приказом МЗ Республики Беларусь от 07.08.2009 г. №781/. - Минск, 2009. - 79 С.;
9. в «Формуляр лекарственных средств медицинской службы ВС РФ», 2010 г.;
11. в методически-информационное письмо «Применение препаратов сурфактанта при лечении острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС)», утвержденное главным врачом ГУЗ «Краевая клиническая больница Забайкальского края» 12.07.2011.
12. в Приказ №598 от 26.08.2013 «Об утверждении положения о резерве медицинских ресурсов МЗ РФ для ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций, его номенклатуры и объема»,
13. в Федеральные клинические рекомендации по лечению туберкулеза легких в качестве патогенетического средства в комплексном лечении заболевания на фоне этиотропной терапии 2013 г.;
14. В Федеральные клинические рекомендации Федерального общества анестезиологов и реаниматологов по диагностике и лечению ОРДС, 2015 г.
Производство сурфактанта-БЛ осуществляется в ООО «БИОСУРФ» с 2000 года. Лицензия на производство №12735-ЛС-П от 13.12.2013, бессрочная.