ЦИКЛИЧЕСКИЙ ОКТАПЕПТИД, РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ (ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ) СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НОВООБРАЗОВАНИЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ СОМАТОСТАТИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ
CYCLIC OCTAPEPTIDE, RADIOPHARMACEUTICAL AGENT BASED THEREON AND METHOD OF USING RADIOPHARMACEUTICAL AGENT TO PRODUCE MEDICINAL (PHARMACEUTICAL) AGENTS FOR TREATING NEOPLASMS EXPRESSING SOMATOSTATIN RECEPTORS

Область техники
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается фармацевтических, радиофармацевтических (далее - РФП) препаратов, на основе пептидных носителей с адресной доставкой.
Настоящее изобретение относится к пептидным соединениям, а конкретно, к синтетическому октапептиду, регулирующему различные биологические процессы и используемые для получения различных лекарственных средств, радиофармацевтических препаратов для диагностики и лечения.
Пептиды - это семейство веществ, молекулы которых построены из остатков α-аминокислот, соединенных в цепь пептидными (амидными) связями.
Пептиды - это природные или синтетические соединения, содержащие десятки, сотни или тысячи мономерных звеньев - аминокислот. Полипептиды состоят из сотен аминокислот, олигопептиды состоят из небольшого числа аминокислот (не более 10-50), а простые пептиды содержат до 10 аминокислот.
Пептиды постоянно синтезируются во всех живых организмах для регулирования физиологических процессов. Свойства пептидов зависят, главным образом, от их первичной структуры - последовательности аминокислот, а также от строения молекулы и ее конфигурации в пространстве (вторичная структура).
Образование пептидов в организме происходит в течение нескольких минут, химический же синтез в условиях лаборатории - достаточно длительный процесс, который может занимать несколько дней, а разработка технологии синтеза - несколько лет. Однако, несмотря на это, существуют довольно весомые аргументы в пользу проведения работ по синтезу аналогов природных пептидов.
Во-первых, путем химической модификации пептидов возможно подтвердить гипотезу первичной структуры. Аминокислотные последовательности некоторых гормонов стали известны именно благодаря синтезу их аналогов в лаборатории.
Во-вторых, синтетические пептиды позволяют подробнее изучить связь между структурой аминокислотной последовательности и ее активностью. Для выяснения связи между конкретной структурой пептида и его биологической активностью была проведена огромная работа по синтезу не одной тысячи аналогов. В результате удалось выяснить, что замена лишь одной аминокислоты в структуре пептида способна в несколько раз увеличить его биологическую активность или изменить ее направленность. А изменение длины аминокислотной последовательности помогает определить расположение активных центров пептида и участка рецепторного взаимодействия.
В-третьих, благодаря модификации исходной аминокислотной последовательности, появилась возможность получать фармакологические препараты. Создание аналогов природных пептидов позволяет выявить более «эффективные» конфигурации молекул, которые усиливают биологическое действие или делают его более продолжительным.
В-четвертых, химический синтез пептидов экономически выгоден. Большинство терапевтических препаратов стоили бы в десятки раз больше, если бы были сделаны на основе природного продукта.
Зачастую активные пептиды в природе обнаруживаются лишь в нанограммовых количествах. Плюс к этому, методы очистки и выделения пептидов из природных источников не могут полностью разделить искомую аминокислотную последовательность с пептидами противоположного или же иного действия. А в случае специфических пептидов, синтезируемых организмом человека, получить их возможно лишь путем синтеза в лабораторных условиях.
Известен биологически активный октапептид Ангиотензин II, образующийся из крупного белка плазмы крови ангиотензиногена в результате действия двух протеолитических ферментов.
Первый протеолитический фермент ренин отщепляет от ангиотензиногена с N-конца пептид, содержащий 10 аминокислот, называемый ангиотензином I. Второй протеолитический фермент карбоксидипептидилпептидаза отщепляет от С-конца ангиотензина I 2 аминокислоты, в результате чего образуется биологически активный ангиотензин II, участвующий в регуляции АД и водно-солевого обмена в организме.
Октапептид Ангиотензин II имеет следующую аминокислотную последовательность:
Asp-Arg-Val-Tyr-Не-His-Pro-PHe
Функции пептидов зависят от их структуры. Ангиотензин I по структуре очень похож на ангиотензин II (имеет только две дополнительные аминокислоты с С-конца), но при этом не обладает биологической активностью.
Из уровня техники известен также другой октапептид - октреотид (циклический пептид), используемый в фармацевтической химии.
Октреотид является синтетическим аналогом соматостатина, который обладает сходным профилем фармакологической активности, но значительно превосходит природный пептид по силе и длительности действия. Подобно соматостатину он ингибирует секрецию соматотропин-рилизинг гормона в гипоталамусе и секрецию соматотропного и тиреотропного гормонов в передней доле гипофиза, а также подавляет секрецию различных гормонально активных пептидов (инсулина, глюкагона, гастрина, холецистокинина, вазоактивного интерстинального пептида, инсулиноподобного фактора роста - 1) и серотонина, продуцируемых органами желудочно-кишечного тракта (желудок, кишечник, печень и поджелудочная железа).
Октреотид применяется как лекарственное средство для лечения акромегалии, опухолей гастропанкреатической эндокринной системы, а также используется как действенное средство профилактики осложнений в панкреатической хирургии.
Октреотид представляет собой циклический октапептид следующей структуры:
Особенностями его структуры являются:
- наличие двух D-аминокислот;
- наличие дисульфидного цикла;
- восстановленный С-концевой остаток треонина (треонинол);
- высокое содержание гидрофобных ароматических аминокислот.
Существенным с точки зрения химического синтеза является также наличие неустойчивого к действию окислителей и сильных кислот остатка триптофана. Синтез октреотида может быть осуществлен как твердофазным методом, так и классическими методами пептидного синтеза в растворе.
4
5
1
6
Основные проблемы синтеза октреотида твердофазным методом связаны с наличием в его молекуле С-концевого остатка треонинола. Треонинол не содержит карбоксильной группы, что не дает возможности использовать традиционные методы присоединения первой (С-концевой) аминокислоты к полимерной матрице. В работе W.B. Edwards et al. (J. Med. Chem. 1994, 373749) синтез осуществляли, начиная с предпоследнего остатка Cys(Acm), присоединенного к полимеру сложноэфирной связью. После сборки пептид окисляли до дисульфида на полимере, затем получали защищенный [D-Trp(Boc), Lys(Boc), Thr(Bu)] - октреотид путем аминолиза пептидил-полимера избытком треонинола. Аминолиз протекал очень медленно, и общий выход защищенного пептида составил 14%.
Раскрытие изобретения
Задачей заявленного изобретения является получение другого октапептида, являющегося аналогом соматостатина, для получения новых радиофармацевтических препаратов с улучшенными свойствами, обеспечивающими терапию новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы.
Таким образом, заявленное изобретение описывает группу изобретений, в которую входит новый октапептид, являющийся производным октреотида, радиофармацевтическое средство (РФП) на его основе и способ применения радиофармацевтического средства для получения лекарственных (фармацевтических) средств для радионуклидной терапии новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы.
Одним из изобретений заявленной группы является октапептид общей формулы (I)
1
3
1
1
Представленный в изобретении циклический октапептид отличается от известных пептидных аналогов октреотида общей формулы D-PHe-Tyr (октреотид) тем, что в нем D-PHe заменен на Lys.
Циклический октапептид формулы 1 содержит концевую аминокислоту лизин (Lys), способную ковалентно присоединять хелатирующую группу и имеющий следующую структуру (Ia) и (Ib)
Х= хелатирующий агент
111
90
177
Таким образом, заявленный циклический октапептид имеет структуру, содержащую вышеуказанную последовательность из аминокислот, содержит N-концевую аминокислоту лизин (Lys), способную ковалентно присоединять хелатирующую группу, например, DOTA, и предназначен для получения радиофармацевтических препаратов с радионуклидами In, Y, Lu.
111
90
177
Изобретение также касается радиофармацевтического средства в виде комплекса соединения формулы (I) с радионуклидами In, Y, Lu. Это позволяет использовать РФП в качестве терапевтического радиофармацевтического средства для радионуклидной терапии новообразований, экспрессирующих соматостатиновые рецепторы.
111
90
177
При этом при получении радиофармпрепарата по изобретению в виде комплекса октапептида формулы (I) с радионуклидами In, Y, Lu используют различные хелатирующие агенты. В качестве хелаторов используют известные в данной области техники хелатирующие агенты.
В данной области техники, относящейся к получению радиофармацевтических и радиодиагностических препаратов на основе пептидных носителей с адресной доставкой, в качестве хелатирующих агентов могут быть использованы ДОТА (1,4,7,10-тетраазациклододекантетрауксусной кислоты), а также и другие известные в этой области хелатирующие агенты, такие как, например, полиаминополикислотные хелатирующие агенты NOTA, Охо, РСТА и другие, известные и широко применяемые для радиофармпрепаратов (см. например, RU 233557, RU 2010146497, RU 2006105644, US 4647447, US 5362475, EP 230893, WO 95/24225 и др.), а также статьи:
- Bioconjug Chem. 2011 Aug 17; 22(8): 1650-62. Epub 2011 Jul 26. Multivalent biflinctional chelator scaffolds for gallium-68 based positron emission tomograpHy imaging probe design: signal amplification via multivalency;
- Bioconjug Chem. 2010 {Fpub ahead of print};
- Evaluation of Bifunctional Chelates for the Development of Gallium - Based RadiopHarmaceuticals и др.
К ним, в частности, относятся полиаминополикислотные, бифункциональные хелатирующие группы: производные тетраацетоуксусной кислоты (приведены в латинице):
- HOTA (1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусной кислоты);
- Оксо-(1-окса-4,7,10-триазациклододекан-4,7,10-триуксусной кислоты);
- РСТА (3,6,9,15-тетраазабицикло{9.3.1}пентадека-1(15), 11,13-триен-3,6,9-триуксусной кислоты);
- Упомянутый ранее (ДОТА) 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триацетат.
Итак, поставленная задача достигается новым октапептидом, имеющим структуру (I), как производного октреотида, обладающего биологической активностью и представляющего интерес при создании фармацевтических средств, используемых при диагностике и лечении, в том числе и для создания с его использованием различных радиофармацевтических средств в виде комплексов их с различными радионуклидами.
Предлагаемое изобретение иллюстрируются соответствующими примерами, не ограничивающими его.
Синтез октапептидов общей формулы I:
Список использованных сокращений:
DMF - диметилформамид
DIPEA - N, N -диизопропилэтиламин
НОВТ - N-гидроксибензотиазол
TBTU - тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония
TFA - трифторуксусная кислота
Fmoc - флуоренилоксикарбонил
DCC - дициклогексилкарбодиимид
Trt - тритил
Вое - третбутилоксикарбонил
But - третбутил
Р - полимер
В синтезе использованы защищенные производные фирмы Bachem (Швейцария). Синтез аналогов октапептидов формулы (I) проводили твердофазным методом.
Пример 1. Синтез пептида, имеющего следующую аминокислотную последовательность и отвечающего общей формуле октапептида формулы (I):
Синтез пептидил-полимера - предшественника октапептидов с комплексообразующей группой DOTA проводят твердофазным способом, исходя из 6.0 г Fmoc-Thr(But)-полимера Ванга фирмы Bachem с содержанием стартовой аминокислоты 0.61 ммоль/г. Реакции конденсации проводили дициклогексилкарбодиимидным методом в присутствии N-гидрокси-бензотриазола (DCC/HOBT) в DMF, с использованием двукратных избытков производных: Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Thr(But)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-D-Trp-OH, Fmoc-Tyr(But)-OH. Для деблокирования аминогруппы использовали 20% пиперидин в диметилформамиде. Все операции проводили в соответствии со следующим протоколом (таблица 1):
Таблица 1
Протокол синтеза
Количество обработок (раз)
Время данной обработки (мин)
№
Операция
1
Активация 0.0074 моль Fmoc аминокислоты в присутствии 0.0074 моль DCC и 0.0074 моль НОВТ в 30 мл DMF
1
20
2
Промывка пептидил-полимера 50 мл DMF перед деблокированием
3
1
3
Деблокирование 30 мл 20% пиперидина в
1
5
DMF
1
15
4
Промывки 50 мл DMF
5
1
5
Конденсация
1
120
6
Промывки 50 мл DMF
3
1
По окончании синтеза пептидил-полимер отфильтровывали, промывали DMF (3×80 мл), дихлорметаном (5×80 мл), сушили на воздухе. При наращивании пептидной цепи на последней стадии по протоколу, приведенному в таблице 1, с использованием на последней стадии синтеза Fmoc-Lys(Boc)-OH. 1.0 г (0.5 ммоль) защищенного октапептидил-полимера деблокировали 10 мл 20% пиперидина DMF и промывали DMF, как описано в пп.3 и 4 таблицы №1. Пептидил-полимер суспензировали в 30 мл DMF, добавляли 0.47 г (1.0 ммоль) соответствующего производного лизина, 0.15 г (1.0 ммоль) НОВТ, 0.32 г (1.0 ммоль) TBTU и 0.5 мл DIPEA. Реакционную смесь перемешивали 2 часа при комнатной температуре, растворитель удаляли фильтрованием, Fmoc-пептидил-полимер промывали, деблокировали и опять промывали в соответствии с пп.3 и 4 таблицы №1.
Пример 2. Синтез  отвечающего общей формуле октапептида формулы (I)
3
2
2
t
Присоединяли DОТА(But)OH с использованием тех же реагентов, что и в случае производных лизина. Пептидил-полимер отфильтровывали, промывали DMF (3×30 мл), дихлорметаном (5×30 мл), сушили на воздухе. 1.1 г пептидил-полимера суспендировали в 10.0 мл смеси TFA-тиоанизол-три-изобутилсилан-этандитиол-вода (8.5:0.5:0.5:0.25:0.25), перемешивали 4 часа при комнатной температуре. Смолу отфильтровывали, промывали TFA (2 раза по 0.5 мл). Прибавляли к фильтрату 50 мл диэтилового эфира, выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром (5×15 мл), этилацетатом (2×15 мл). Сырой продукт растворяли в 0.5 л воды, добавляли водный раствор аммиака до pH 9, оставляли на ночь при слабом перемешивании при комнатной температуре. К реакционной смеси добавляли 1 мл 5% раствора НО, перемешивали 15 мин. Полноту образования дисульфидной связи проверяли при помощи реактива Элмана. Реакционную смесь упаривали, предварительно добавив 1 мл уксусной кислоты (pH 4-5). Продукт вычищали методом ВЭЖХ на Диасорбе-130 (25×250 мм), элюция в градиенте от 0 до 20% за 10 мин и от 20% до 60% за 40 мин буфера Б в буфере А (А - 0.1% TFA и Б - 80% ацетонитрил в А), скорость потока 12 мл/мин, детекция - при 226 нм. Фракции, соответствующие целевому веществу, объединяли и лиофилизировали. Выход соединения I - 0.108 г, что соответствует 15% в расчете на стартовую аминокислоту, m/z 1416.7 (вычислено 1416.0), R=13.32 мин (аналитическая ВЭЖХ на хроматографе Gilson, Франция, колонка Gromasil С 18, 4.6×250 мм, градиент концентрации буфера Б в буфере А от 20% до 80% за 30 мин, где А - 0.1% TFA и Б - 80% ацетонитрила в А, скорость потока 1 мл/мин).
Пример 3. Синтез  отвечающего общей формуле октапептида формулы (I).
t
Соединение Ia получали аналогично I с тем отличием, что на последней стадии твердофазного синтеза использовали Вос-Lys(Fmoc)-OH. Выход (16) - 0.099 г, что соответствует 13% в расчете на стартовую аминокислоту, m/z 1416.7 (вычислено 1416.0), R=13.37 мин в условиях, алогичных для соединения (I).
111
90
177
177
Ниже представлен пример получения радиофармацевтического средства в виде комплекса соединений формулы (Ia) и (Ib) с радионуклидами In, Y, Lu, на примере с радионуклидом Lu.
Нижеследующие примеры 4-6 иллюстрируют получение радиофармацевтического средства (препарата) по изобретению и его свойства.
111
90
177
177
Пример 4. Получение РФП на основе DOTA-конъюгированных пептидов (Ia) и (Ib), меченных радионуклидами In, Y, Lu, на примере Lu.
177
Данная методика описывает проведение реакции мечения радионуклидом Lu DOTA-конъюгированных пептидов - аналогов октреотида (I) и (Ia), полученных в примерах 2 и 3.
Исходный пептид (в виде сухого вещества) растворяют в деионизованной воде (18 МОм), в концентрации 1 мг/мл. Полученный раствор пептида автоматическим дозатором фасуют по 50 мкл в полипропиленовые пробирки типа Eppendorf Safe-Lock Tubes (1,5 мл).
177
Расфасованный раствор пептида хранят в морозильной камере при температуре не выше - 18°С. Перед проведением реакции мечения раствор пептида размораживают при комнатной температуре в течение 1-2 минут. К размороженному пептиду в ту же пробирку дозатором добавляют ацетатный буфер 0,4 М (так чтобы кислотность (pH) реакционной среды составляла 4,0-5,0) и переносят за свинцовую защиту, где в пробирку добавляют раствор Lu (в 0,05 N HCl) с активностью 5-100 мКи. Реакционную смесь инкубируют при температуре 80°С в течение 20 минут. По истечении 20 мин реакция мечения считается завершенной.
111
90
177
177
Пример 5. Определение радиохимической чистоты DOTA-конъюгированных пептидов (Ia) и (Ib), меченных радионуклидами In, Y, Lu, на примере Lu.
Радиохимическую чистоту полученного продукта (РХЧ) определяли высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).
ВЭЖХ (UV-детектор, 220 нм; радиодетектор Radiomatic Flo-ONE/Beta, Packard) проводили с использованием колонки Acclaim;
при скорости потока элюента 1 мл/мин; для градиентного элюирования использовали следующие элюенты: А - ацетонитрил (ACN), В: 0,1% фторуксусная кислота (TFA).
Радиохимическая чистота составила более 98%. Хроматограмма представлена на чертеже.
111
90
177
111
Пример 6. Изучение накопления РФП на основе соединений (Ia) и (Ib), меченных радионуклидами In, Y, Lu, на примере In, у животных с перевитой опухолью (меланома), экспрессирующей рецепторы соматостатина.
Эксперименты in vivo проводились на лабораторных самках мышей (гибриды F1 СВАхС57В1 весом 18-20 г). Животные были получены из питомника Научного центра биомедицинских технологий РАМН "Андреевка". Мышам перевивали пигментированную меланому В16. В асептических условиях подкожно вводили взвесь клеток меланомы В16. Рост опухоли отмечали визуально. Животных включали в эксперимент спустя 9-12 суток после имплантации, при достижении размера опухоли 8-12 мм в диаметре.
Во время экспериментов животных содержали в стандартных условиях (специальное помещение, рекомендованный рацион, свободный доступ к питьевой воде, естественное освещение).
111
Растворы соединений (I) и (Ia), меченные In, вводили в хвостовую вену, через 20 и 60 минут животных декапитировали, отбирали пробы крови, мышечной и опухолевой тканей, а также основные органы и ткани: печень, почки, наполненный мочевой пузырь, кровь, опухоль. Наполнение мочевого пузыря выполняли путем наложения лигатуры на наружное отверстие мочевыделительного канала. Радиоактивность в выбранных органах и тканях измеряли методом прямой радиометрии. На каждую временную точку использовали не менее 3-х животных. Полученные данные представлены в таблице 2.
Таблица 2
Распределение активности в организме мышей С57В1 с перевитой меланомой В 16 (% от введенной дозы)
Орган/ткань
20 минут
60 минут
% от введенной дозы
Кровь
3,5
1,6
Печень
2,9
3,4
Почки
4,4
5,1
Мочевой пузырь
53,3
73,2
Мышцы, %/г
1,7
1,2
Опухоль, %/г
5,2
2,6
Опухоль/мышца
3,1
2,2
Опухоль/кровь
1,5
1,6
Как видно из приведенных данных, полученное соединение показывает тропность к опухоли меланома В16 in vivo. Согласно полученным данным препарат практически полностью выводится через почки, умеренно накапливается в печени и имеет достаточно высокое соотношение опухоль/мышца и опухоль/кровь.
111
177
90
Совокупность результатов мечения, биологического поведения in vivo позволяют считать целесообразным применение соединений (I) и (Ia), меченных In, Lu, Y, а также другими радионуклидами, для радионуклидной терапии новообразований (опухолей), экспрессирующих соматостатиновые рецепторы.