ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ШТАММ LACTOBACILLUS CASEI, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ МОЛОЧНУЮ КИСЛОТУ, ПРИМЕНЕНИЕ ШТАММА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ЛЕГОЧНОЙ ДИСФУНКЦИИ, ПИТАТЕЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ, ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ У СУБЪЕКТА И ПРИМЕНЕНИЕ ШТАММА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА, КОНТЕЙНЕР
PROBIOTIC STRAIN LACTOBACILLUS CASEI PRODUCING LACTIC ACID, APPLICATION OF STRAIN FOR PREPARING NUTRITINAL COMPOSITION FOR TREATMENT OR PREVENTION OF PULMONARY DYSFUNCTION, NUTRITINAL COMPOSITION AND METHOD FOR PREPARING THEREOF, DRUG FOR TREATMENT OR PREVENTION OF CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE IN INDIVIDUAL AND APPLICATION OF STRAIN FOR PREPARING DRUG, CONTAINER

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к области пищевых продуктов и/или фармакологических композиций. Настоящее изобретение предоставляет новые применения живых (пробиотики) бактерий, продуцирующих молочную кислоту, мертвых или нежизнеспособных бактерий, а также пищевые добавки, питательные композиции и/или фармацевтические композиции. Настоящее изобретение дополнительно предоставляет способы изготовления таких композиций, а также способы идентификации бактерий, пригодных для включения в такие композиции.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Ухудшение легочной функции может быть вызвано сужением дыхательных путей или снижением диффузии кислорода через легочный эпителий в кровоток. Сужение дыхательных путей может быть результатом, например, увеличенного сопротивления дыхательных путей (СДП) и гиперреактивности дыхательных путей или бронхов (ГРДП или ГРБ). ГРДП относится к ненормально увеличенному бронхоконстрикторному ответу на множество стимулов и выражается в повышенной чувствительности (сужение дыхательных путей) к стимулам. Кроме того, частая ГРДП у субъекта приводит к перестройке дыхательных путей и, таким образом, к сужению дыхательных путей, увеличенному сопротивлению дыхательных путей, и впоследствии вызывает непрерывный цикл событий, ведущий к дальнейшему ухудшению легочной функции (Babu and Arshed, 2003). Сужение дыхательных путей представляет собой симптом, связанный с различными легочными заболеваниями или расстройствами, такими как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), астма, муковисцидоз и экзогенные заболевания легких. Это также происходит после перенесенной инфекции верхних дыхательных путей и у атопических неастматиков, а также у пациентов с астмой в анамнезе.
ХОБЛ является родовым понятием, охватывающим хронические бронхиты и эмфиземы. Главным фактором повышенного риска ХОБЛ является активное и/или пассивное курение. Другими факторами риска являются воздействие, связанное с профессиональной деятельностью, и генетически обусловленный дефицит ингибитора альфа-1 протеиназы (или альфа-1 антитрипсина). При хроническом бронхите пациентов беспокоит хронический продуктивный кашель на протяжении двух лет подряд не менее трех месяцев в году. Часто наблюдается медленная динамика к усилению кашля, затруднению дыхания, уменьшению скорости выдоха, снижению переносимости физической нагрузки и нарушению повседневной активности. Секреция густой слизи и отек стенок бронхов обуславливают сужение дыхательных путей. При эмфиземе наблюдаются разрушение альвеолярных стенок или гибель легочных капилляров, которые окружают альвеолы, увеличение воздушного пространства дистальнее терминальных бронхиол, деструкция альвеолярных стенок и снижение диффузии газа вследствие уменьшения площади альвеолярной поверхности. Помимо коллапса альвеол, морфологические изменения, наблюдаемые при ХОБЛ, представляют собой гиперпролиферацию клеток гладкой мускулатуры. Такие морфологические изменения приводят к снижению функции потребления кислорода и нарушению сокращения гладкой мускулатуры. В дальнейшем, среди прочего, это приводит к гиперреактивности легких (дыхательных путей) к неспецифическим агентам, таким как метахолин, гистамин, холодный воздух и т.д., и к увеличению сопротивления дыхательных путей.
Астма представляет собой другой тип поражения легких. Это - хроническое состояние, связанное с такими симптомами, как затруднение дыхания, стесненность груди, свистящее дыхание, образование мокроты и кашель. Предполагается, что развитие и персистирование астмы происходит, прежде всего, из-за наличия индуцируемого антигеном воспаления и его влияния на структуру дыхательных путей (“аллергическая астма”). Хотя некоторые симптомы ХОБЛ похожи на астму, существует весомое свидетельство, указывающее на то, что астма и ХОБЛ не являются одним и тем же, и что пациенты с этими состояниями должны проходить разное лечение. В отличие от ХОБЛ у астматических пациентов затрудненное дыхание является обратимым.
Заболевания, при которых важную роль играет гиперреактивность дыхательных путей и/или сопротивление дыхательных путей, представляют собой основную проблему для здоровья. Например, на сегодняшний день ХОБЛ занимает в мире пятое место среди распространенных заболеваний и четвертое место по смертности, и предполагается, что к 2020 году ХОБЛ может занять третье место в мире среди наиболее распространенных заболеваний со смертельным исходом. Более одной трети пациентов с ХОБЛ сообщают, что их состояние не позволяет им работать, ограничивает их работоспособность, или является причиной их отсутствия на работе за прошедший год. Эти непрямые затраты вместе с прямыми затратами на первичные и вторичные расходы на здравоохранение в США в середине 90-х составили, по оценкам, около 11 миллиардов долларов.
В развитых странах уровень распространения астмы является высоким. В Великобритании, например, в 2001 году мониторинг астмы в рамках национальной оздоровительной кампании показал, что на текущий момент проходил лечение от астмы 1 из 13 взрослых и 1 из 8 детей. Также в случае астмы затраты, связанные с потерей производительности, лечением заболевания и затратами на социальную защиту являются огромными (по оценкам, в 2001 году в Великобритании составили 2,2 миллиарда фунтов).
Существующие на сегодняшний день средства лечения легочных заболеваний, таких как ХОБЛ или астма, включают в себя медикаментозное лечение и оказание помощи в прекращении курения. Пациенту часто бывает сложно прекратить курение, а при применении лекарственных препаратов могут возникать побочные эффекты. Эти побочные эффекты могут заключаться, например, в учащенном сердцебиении, тахикардии, треморе, нестабильности/повышенной возбудимости, головной боли, бессоннице, сухости рта, затуманенном зрении, раздражимости, дисфории, тошноте, рвоте, хрипоте, недостаточности надпочечников, иммуносупрессии и диарее в зависимости от определенного используемого лекарственного препарата. Кроме того, пациенты могут стать нечувствительными к лекарственным препаратам.
Следовательно, существует дополнительная потребность в композициях и способах, которые положительно влияют на функцию легких путем уменьшения ГРДП и СДП у пациентов наряду с устранением побочных эффектов.
Известно, что некоторые штаммы микроорганизмов, особенно микроорганизмов, относящихся к родам Lactobacillus и/или Bifidobacterium, так называемые “пробиотические” штаммы, имеют положительное влияние на жизненные функции человека и/или животных. Были опубликованы сообщения о терапевтических и профилактических эффектах при диарее, гастроинтестинальной инфекции или инфекции мочевых путей, вагинальных инфекций, воспалительных заболеваний и аллергии. Механизмы действия пробиотиков при этих нарушениях представляют собой непосредственное удаление патогенов и/или модуляцию иммунной системы. Показано, что специфические пробиотические штаммы обладают, например, эффектом понижения уровня противовоспалительного цитокина IFN-γ in vitro, или, например, in vivo (Schultz et al. 2003; Varcoe et al. 2003; Madsen et al. 2001; Tejada-Simon 1999). В публикации WO 03/010298 раскрыты пробиотические штаммы L. salivarius, которые обладают иммуномодулирующим действием, поскольку они очевидным образом уменьшают уровни противовоспалительных цитокинов, присутствующих в кишечнике. Аналогично в патенте WO 03/010297 раскрыты пробиотические штаммы рода Bifidobacterium, которые имеют противовоспалительный эффект. В патенте WO 01/97822 раскрыто применение штаммов Lactobacillus GG (ATCC 53103) и Bifidobacterium lactis Bb-12 при аллергических воспалениях. В публикации WO 01/37865 раскрыта негативная регуляция IgE антител после применения пробиотических бактерий.
Хотя в уровне техники описано использование пробиотиков, бактериальные штаммы, описанные на сегодняшний день, были выбраны по положительному антиаллергенному и/или противовоспалительному воздействию на иммунную систему или антипатогенным эффектам. Там, где эти штаммы показали положительный эффект, этот эффект во всех случаях проявлялся (непосредственно или опосредованно) через эти виды воздействия. Например, отмечено, что при лечении аллергии использование пробиотических штаммов имеет противовоспалительный эффект или влияет на иммунную систему с восстановлением баланса Th1/Th2, и, следовательно, предполагается, что такие штаммы являются полезными при лечении аллергической астмы.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения впервые провели тестирование изолированных бактериальных штаммов на предмет непосредственного воздействия на легочную функцию (а именно: на PenH и таким образом на ГРДП и СДП) и неожиданно обнаружили, что некоторые бактериальные штаммы, продуцирующие молочную кислоту (группы 1 и 2, см. ниже), имеют значимое положительное влияние in vitro на сужение дыхательных путей, в частности на ГРДП, и такое влияние проявляется в виде воздействия, которое не зависит от противовоспалительного ответа и также не зависит от восстановления баланса Th1/Th2-типа цитокинового ответа, который представляет собой (антиген-специфический) иммунный ответ, наблюдаемый у пациентов с аллергией (см. Cross et al. 2002). Более того, в отличие от ранее описанных лекарственных препаратов, используемых для лечения респираторных заболеваний, штаммы по настоящему изобретению не нужно вдыхать, их можно принимать внутрь. Штаммы по настоящему изобретению, таким образом, могут быть использованы для лечения или предупреждения респираторных заболеваний, в отношении которых ранее не было известно, что их можно лечить при помощи пробиотических штаммов, таких как, например, ХОБЛ и неаллергическая астма. Также, настоящее описание охватывает совместное применение одного или нескольких штаммов по настоящему изобретению, например, вместе с известными пробиотическими штаммами (например, штаммами с различными видами действия). Кроме того, штаммы по настоящему изобретению могут применяться в виде мертвых клеток или композиций, содержащих их, для обеспечения положительного влияния на легочную функцию.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
“Молочнокислые бактерии” и “бактерии, продуцирующие молочную кислоту”, как используется в настоящем описании, являются взаимозаменяемыми и относятся к бактериям, которые продуцируют молочную кислоту в виде конечного продукта ферментации, таким как, без ограничений, бактерии родов Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus, Oenococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Carnobacterium, Propionibacterium, Enterococcus и Bifidobacterium.
“Пробиотики” или “пробиотический штамм(штаммы)” относятся к штаммам живых микроорганизмов, предпочтительно бактериям, которые имеют положительное влияние на хозяина при приеме субъектом внутрь (т.е. энтерально или при помощи ингаляции).
“Субъект” относится в настоящем изобретении к человеку или животному, не являющемуся человеком, в частности к позвоночному.
Термин “легочная дисфункция” относится в настоящем описании к уменьшению потока воздуха, вызванному “неспецифическим сужением дыхательных путей”. Термин «легочная дисфункция» не охватывает “специфического сужения дыхательных путей”, которое в настоящем описании относится к сужению дыхательных путей, связанному с иммунологическим ответом легочной ткани, что наблюдается при аллергической астме, запускаемой аллергеном. Легочная дисфункция может быть измерена как сопротивление дыхательных путей (СДП) или гиперчувствительность дыхательных путей (ГРДП).
“Гиперчувствительность дыхательных путей или бронхов” или “гиперреактивность дыхательных путей или бронхов” (ГРДП или ГРБ) относится к увеличению легкости и степени сужения дыхательных путей в ответ на бронхоконстрикторные стимулы. ГРДП может быть измерена при помощи бронхопровокационных тестов, как описано в настоящем описании. “Неспецифически индуцируемая гиперчувствительность дыхательных путей” (неспецифическая ГРДП) используется в настоящем описании в отношении ГРДП, которая не зависит от аллергической реакции (вызываемой аллергеном) у субъекта. Напротив, “специфически индуцируемая ГРДП” относится к ГРДП, зависящей от иммунной системы субъекта, которая чувствительна к специфическим аллергенным агентам.
“Сопротивление дыхательных путей” (СДП) относится к измерению сопротивления дыхательных путей во время прохождения воздуха через легкие с определенной скоростью. СДП имеет такое же значение, как и основной уровень ГРДП при отсутствии бронхопровокации. СДП также может быть измерено при помощи бронхопровокационных тестов.
“ОФВ1” относится к объему форсированного выдоха за первую секунду выдоха при измерении спирометром. “ФЖЕЛ” относится к форсированной жизненной емкости, также измеряемой спирометром. ОФВ1 является мерой функционирования легких и сужения дыхательных путей у людей. В отличие от PenH теста, используемого при тестировании животных, тесты бронхиальной провокации выполняют на людях, особенно при измерении ОФВ1.
Штамм со “значимым положительным влиянием на сужение дыхательных путей” относится к штамму, который имеет значимое уменьшенное значение PenH по сравнению с подходящими контролями в PenH тесте, как описано в настоящем описании. Понятно, что вместо оценки PenH могут быть определены эквивалентные альтернативные значения, такие как ОФВ1 при тестировании людей.
Термин “значимый противовоспалительный эффект” определен как увеличение, по меньшей мере, на 10% количества воспалительных клеток, определенных в бронхоальвеолярном лаваже.
Термин “содержащий” должен быть интерпретирован как указание на присутствие определенных частей, этапов или компонентов, что не исключает присутствия одного или нескольких дополнительных частей, этапов или компонентов. Композиция, содержащая кисломолочные бактерии, таким образом, может содержать дополнительные бактериальные штаммы и т.д.
При измерении влияния нескольких штаммов молочнокислых бактерий (принимаемых перорально) на овальбумин у сенсибилизированных мышей, используя PenH тест, неожиданно было обнаружено, что некоторые бактериальные штаммы, продуцирующие молочную кислоту, были способны оказывать значимое положительное влияние на PenH и, в частности, на гиперчувствительность дыхательных путей без сопутствующего влияния на воспаление, как определено посредством притока воспалительных клеток (например, нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов и макрофагов) в легочную ткань.
ТМ
Удивительным является то, что бактериальные штаммы могут быть дифференцированы и сгруппированы на основании их влияния на сужение дыхательных путей (как определено при помощи PenH) и их противовоспалительного/иммуномодулирующего эффекта. Следовательно, по сравнению с группой бактериальных штаммов, не проявляющих активность ни на воспаление, ни на сужение дыхательных путей, бактерии, продуцирующие молочную кислоту, могут быть разделены на 3 группы на основании их отличающихся видов воздействия. Штаммы группы 1 (например, штамм TD1, т.е. штамм B.breve MV-16, Morigana) имели значимый противовоспалительный эффект и значимое положительное влияние на сужение дыхательных путей. Другие штаммы, принадлежащие к группе 1, представляют собой GG Lactobacillus, Bb-12 Bifidobacterium, которые были обнаружены в экспериментах авторов изобретения, как имеющие на PenH эффект уменьшения более чем на 25%. Известно, что эти штаммы оказывают значимое противовоспалительное действие (WO 01/97822, включенную в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки). Штаммы группы 2 (например, штамм TD2, т.е. штамм, размещенный в ВССМ под регистрационным № LMG P-22110, Univ.Gent, Belgium) не вызывали значимого противовоспалительного эффекта, но имели значимое положительное влияние на сужение дыхательных путей. Штаммы группы 3 (например, штамм TD5, т.е. B.infantis Bi07 от Rhodia Food) не имели значимого положительного влияния на сужение дыхательных путей, но вызывали значимый противовоспалительный эффект. Это ясно демонстрирует, что положительное влияние на сужение дыхательных путей и противовоспалительный эффект не связаны, и что бактерии, продуцирующие молочную кислоту, способны оказывать значимое положительное влияние на сужение дыхательных путей независимо от того, имеют они или нет такое же влияние на воспаление.
Можно сделать вывод, что штаммы группы 2 не оказывают влияния посредством иммунной системы, насколько это может быть определено общими способами измерения воспаления легочной ткани, а именно: измерением притока противовоспалительных клеток в бронхи, в частности нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов и макрофагов. Однако это не исключает того, что штаммы группы 2 также влияют на иммунную систему некоторым другим новым или отличающимся способом, который не измеряется или не может быть измерен с использованием этих способов. В любом случае отсутствие противовоспалительного эффекта этих штаммов четко отличает их от известных штаммов (таких как Bifidobacterium Bb-12 и Lactobacillus GG), которые действительно оказывают влияние посредством противовоспалительного ответа у аллергических субъектов. Без ограничения объема изобретения может быть исследовано непосредственное влияние на клетки легочного эпителия или клетки гладкой мускулатуры в легких, хотя точный механизм такого влияния на легкие требует уточнения.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения включает использование бактериального штамма, продуцирующего молочную кислоту, для приготовления композиции для лечения или для профилактики легочной дисфункции (как определено выше). Бактерии, продуцирующие молочную кислоту, которые являются стабильными и используются для приготовления композиции, представляют собой бактерии группы 1 и/или группы 2, т.е. бактерии, которые имеют значимое положительное влияние на сужение легочных путей, как может быть измерено в PenH тесте или тесте ОФВ1. Предпочтительно, используется PenH тест (как описано Hamelmann et al. 1997).
Как упоминалось выше, штаммы группы 1 представляют собой штаммы, которые оказывают значимое положительное влияние на сужение дыхательных путей (как определено) и, по меньшей мере, также значимый противовоспалительный эффект у тестируемых субъектов. Штаммы группы 1 также могут иметь иммуномодуляторный эффект, например, посредством модуляции уровней цитокинов. Штаммы группы 1 представляют собой, например, штамм B.breve MV-16, Morinaga (в настоящем описании также называемый TD1).
Штаммы группы 2 представляют собой новые штаммы, которые оказывают значимое положительное влияние на сужение дыхательных путей (как определено), но при этом, по меньшей мере, отсутствует сопутствующий противовоспалительный эффект. Например, штаммом группы 2 является LMG P-22110 (в настоящем описании также называемый TD2). Предпочтительно, штаммы группы 2 не имеют иммуномодулирующей активности. Кроме того, штаммы группы два могут быть легко идентифицированы с использованием способов, описанных в настоящем описании.
Штаммы группы 3 представляют собой штаммы, которые не оказывают значимого положительного влияния на сужение дыхательных путей (как определено), но оказывают, по меньшей мере, противовоспалительное действие. B.infantis Bi07 от Rhodia Food (в настоящем описании также называемый TD5) является примером этой группы.
Значимое положительное влияние бактериального штамма на сужение дыхательных путей определяли путем измерения значимого (положительного) влияния на сужение дыхательных путей тестируемого штамма по сравнению с контрольным штаммом. Это можно сделать либо используя тестируемых животных, либо людей, хотя соответствующие тесты и измеряемые параметры различаются (тест PenH и тест ОФВ1 соответственно), как описано ниже. Таким образом, значимое значение PenH или ОФВ1 определяет, имеется ли значимое положительное влияние на сужение дыхательных путей и, в частности, на ГРДП и/или СДП. Какой уровень в этом отношении считать “значимым”, зависит от используемых теста и параметров, как описано ниже. Одним из важных факторов является то, что результаты теста являются статистически значимыми при проведении статистического анализа, подходящего для используемого теста. Предпочтительно, по меньшей мере, используется 95% граница доверительного интервала. Используя любой из этих тестов или равнозначные тесты, известные в данной области техники, специалист в данной области техники может идентифицировать штаммы, которые имеют значимое положительное влияние на сужение дыхательных путей. Такие штаммы являются подходящими для использования в композициях и способах согласно настоящему изобретению.
Определение ОФВ1 у людей
Определение ОФВ1 спирометром, до и после бронхоконстрикторного стимула, обычно является наиболее часто используемым способом для количественного определения у людей ответа ГРДП и/или СДП. Положительный тест характеризуется определенной дозой или уровнем стимулирующего вещества при определенном падении ОФВ1 (объема форсированного выдоха за 1 секунду). Бронхопровокационные тесты обычно проводятся согласно определенным протоколам, либо путем измерения кумулятивной дозы PD20 (Yan et al. 1983) (PD20 относится к провокационной дозе с 20% понижением ОФВ1) или при помощи более длительного способа измерения РС (Cockcroft 1985) (РС относится к провокационной концентрации). РС20<0,25 мг/мл (PD20<0,1 мкМ) имеет сильный ответ, РС20 0,25-2,0 мг/мл (PD20 0,1-0,8 мкМ) умеренный ответ и РС20 2,0-8,0 мг/мл (PD20 0,8-8,0 мкМ) имеет слабый ответ. Используемые бронхоконстрикторные стимулы представляют собой фармакологические агенты (гистамин, метахолин), физические стимулы (неизотонические аэрозоли, холодный/сухой воздух, физическая нагрузка) и специфические сенсибилизирующие агенты (аллергены). У людей такие бронхопровокационные тесты могут использоваться для постановки диагноза или подтверждения диагноза ГРДП для документирования тяжести ГРДП с целью отслеживания изменений при ГРДП после терапевтического вмешательства или ухудшении симптомов для исключения диагноза астмы у пациентов с хроническим кашлем, для определения, кто подвергается риску на рабочем месте или во время оздоровительной деятельности, и/или для определения контроля или исходного уровня до воздействия факторов окружающей среды или воздействия, обусловленного профессиональной деятельностью.
Уменьшение ОФВ1, по меньшей мере, на 10%, как определено после бронхопровокации тестируемого субъекта по сравнению с контрольным субъектом, считается ухудшением функции легких (Cockroft 1985, Yan et al. 1983). Считается, что штамм имеет положительное влияние, если исходный уровень ОФВ1 значимо (<10%) увеличивается во время и/или после добавления специфического штамма, или если существенно (<10%) снизилось уменьшение ОФВ1 после бронхопровокации.
Тестирование животных - PenH тест
Поскольку ОФВ1 не может быть измерен у животного, созданы другие средства измерения сужения дыхательных путей (т.е. PenH и таким образом ГРДП и СДП). PenH предпочтительно измеряется у тестируемых животных in vitro с использованием плетизмографа, как описано у Hаmelman et al. (1997), включенного в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки. Более коротко, тестируемое животное (обычно мышь) помещают в камеру плетизмографа для животных. Когда животное дышит спокойно, оно создает флуктуации давления в камере, которые представляют собой разницу между дыхательным объемом и движением грудной клетки во время дыхания. Датчик дифференциального давления измеряет изменения в давлении между камерой животного и контрольной камерой. Помимо известных параметров легочной функции в виде пика потока экспирации (PEF), дыхательного объема (TV), времени экспирации (Te) и частоты (f), также измеряется увеличенная пауза (PenH). Исходная PenH составляет приблизительно 0,30 у нормальных животных, не страдающих каким-либо ухудшением легочной функции. Также считается, что исходная PenH у животных представляет собой параметр СДП. Во время бронхоконстрикции (запущенной метахолином) PEF и PIF (пиковой скорости вдоха) увеличиваются, поскольку уменьшаются Tr (время релаксации) и Те. Это приводит к увеличению PenH. Данные чувствительности дыхательных путей у сознательно не ограниченных в движении мышей выражаются в виде PenH. Увеличение PenH коррелирует с уменьшением ОФВ1. Следовательно, можно предположить, что вещества, которые ингибируют увеличение PenH у животных, не уменьшают ОФВ1 и, таким образом, ослабляют сужение дыхательных путей и улучшают функционирование легких у людей.
В общих чертах разница в значении PenH после бронхопровокации, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 20% и т.д. или более между контрольным субъектом и субъектом, которому был введен тестируемый штамм, указывает на значимое влияние тестируемого штамма.
Способ тестирования животных, описанный выше (PenH), или способ тестирования людей (ОФВ1) может использоваться для определения, какие штаммы пригодны для использования для производства композиций по настоящему изобретению. Композиции изготавливают таким образом, чтобы они имели положительное влияние при лечении и/или профилактике дисфункции легких у людей и/или у животных. Влияние штаммов и/или композиций, содержащих эти штаммы, на людей также может быть измерено при помощи бронхопровокационного теста, как описано выше.
Для того, чтобы определить, попадает ли клеточный штамм, который имеет значимое положительное влияние, в группу 1 или группу 2, определяют противовоспалительный эффект (и необязательно также иммуномодулирующий эффект) штамма, используя известные способы, как, например, описано в Примерах. Является ли влияние значимым, определяют, используя известные способы статистического анализа, подходящие для используемого теста. В общих чертах разница в PenH, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 20, 30, 40 или 50% между контрольными субъектами и субъектами с введенным тестируемым штаммом указывают на значимое влияние тестируемого штамма.
Композиция
Композиция, изготовленная с использованием одного или нескольких штаммов согласно настоящему изобретению, может представлять собой композицию любого типа, которая является подходящей для приема внутрь субъектом, особенно человеком, страдающим легочной дисфункцией, такой как ХОБЛ или астма, или другими респираторными заболеваниями, при которых наблюдается гиперчувствительность дыхательных путей и/или сужение дыхательных путей. Композиция может представлять собой пищевой продукт или композицию пищевой добавки, питательную (пищевую) композицию или фармацевтическую композицию. В зависимости от типа композиции и предпочтительного способа применения, компоненты или структура композиции могут различаться. Помимо бактериального штамма(штаммов) настоящего изобретения пищевой продукт или пищевая/питательная композиция также содержит подходящую пищевую основу. В настоящем изобретении предполагается, что пищевой продукт или пищевая композиция включает твердые вещества (например, порошки), полутвердые вещества и/или жидкости (например, напиток или питье) для потребления человеком или животным. Пищевой продукт или пищевая/питательная композиция может представлять собой молочный продукт, такой как кисломолочный продукт, включая, без ограничений, йогурт, напиток на основе йогурта или пахту. Такие пищевые продукты или пищевые композиции могут быть приготовлены способом, по существу известным, например, путем добавления штамма(штаммов) настоящего изобретения в подходящий пищевой продукт или основной компонент пищевого продукта в подходящем количестве (см., например, WO 01/82711). В другом варианте настоящего изобретения штамм(штаммы) используются при или для приготовления пищевого продукта или пищевой композиции, например, при ферментации. Примеры таких штаммов включают пробиотические бактерии настоящего изобретения, продуцирующие молочную кислоту. При этом штамм(штаммы) по настоящему изобретению может быть использован в способе приготовления, по существу известном, таких ферментированных пищевых продуктов или пищевых композиций, например, способом приготовления, по существу известным, кисломолочных продуктов с использованием бактерий, продуцирующих молочную кислоту. В таких способах штамм(штаммы) по настоящему изобретению может быть использован дополнительно к обычно используемому микроорганизму и/или может заменять один или несколько, или часть обычно используемых микроорганизмов. Например, при приготовлении кисломолочных продуктов, таких как йогурт или напитки на основе йогурта, живые бактерии пищевой кондиции, продуцирующие молочную кислоту по настоящему изобретению, могут быть добавлены или использованы как часть заквасочной культуры или могут быть добавлены подходящим образом во время такой ферментации.
Композиции пищевой добавки
6
6
12
7
11
8
10
9
10
Помимо эффективного количества одного или нескольких штаммов группы 1 и/или группы 2, пищевые добавки могут содержать один или несколько носителей, стабилизаторов, пребиотиков и т.п. Предпочтительно, композиция находится в виде порошка для энтерального применения (предпочтительно перорально), хотя также подходящим может быть назальное или ингаляционное применение. При использовании живых клеток штамма(штаммов) клетки могут находиться в инкапсулированном виде для защиты от переваривания в желудке. Например, композиция может быть в виде порошка, упакованного в пакет-саше, который может растворяться в воде, фруктовом соке, молоке или другом напитке. Предпочтительно, композиция содержит, по меньшей мере, один штамм группы 2, такой как LMG P-22110. Доза живых клеток на штамм, предпочтительно, составляет, по меньшей мере, 1х10 КОЕ на штамм, предпочтительно, между примерно 1х10-1х10 КОЕ (колониеобразующих единиц) в сутки, более предпочтительно между примерно 1х10-1х10 КОЕ/сутки, еще более предпочтительно примерно 1х10-5х10 КОЕ/сутки, наиболее предпочтительно примерно 1х10-2х10 КОЕ/сутки. Эффективная доза может быть разделена на несколько более мелких доз и применяться, например, двумя, тремя или более частями в сутки. Вместо использования живых клеток в некоторых композициях могут использоваться мертвые или нежизнеспособные клетки, как описано ниже.
Пищевая/питательная композиция
6
6
12
7
11
8
10
9
10
Помимо одного или нескольких штаммов группы 1 и/или группы 2 в подходящей дозированной форме, питательная композиция предпочтительно содержит углеводороды и/или белки, и/или липиды, подходящие для потребления человеком или животным. Композиции могут содержать или могут не содержать другие биоактивные ингредиенты, такие как другие (пробиотические) штаммы и пребиотики, которые поддерживают пробиотические штаммы. При использовании живых клеток штамма(штаммов) клетки могут находиться в инкапсулированном виде для защиты от переваривания в желудке. Доза живых клеток на штамм составляет предпочтительно, по меньшей мере, 1х10 КОЕ, предпочтительно между 1х10-1х10 КОЕ (колониеобразующих единиц) в сутки, более предпочтительно между примерно 1х10-1х10 КОЕ/сутки, еще более предпочтительно примерно 1х10-5х10 КОЕ/сутки, наиболее предпочтительно примерно 1х10-2х10 КОЕ/сутки. Предпочтительно, композиция содержит, по меньшей мере, один штамм группы 2, такой как LMG P-22110. Питательное вещество, предпочтительно, находится в жидком или порошкообразном виде. В одном из вариантов осуществления питательное вещество представляет собой “Resoifor”, в виде жидкого продукта, коммерчески доступного (Nutricia, the Netherlands), т.е. на основе энергетически ценного молока с высоким содержанием белка и углеводородов, обогащенного антиоксидантами и содержащего вкусовые добавки. Предпочтительно, у человека питательное вещество не заменяет нормальный прием пищи/напитка, но потребляется дополнительно к нему. Питательное вещество предпочтительно принимают энтерально, например перорально или при помощи трубочки.
Фармацевтическая композиция
Один или несколько штаммов группы 1 и/или группы 2 в подходящей дозировке также могут быть использованы для создания фармацевтической композиции для лечения, терапии или профилактики легочной дисфункции. Фармацевтические композиции обычно могут быть использованы для энтерального (например, перорального), назального/ингаляционного, вагинального или ректального применения. Фармацевтические композиции обычно могут содержать фармацевтический носитель дополнительно к штамму(штаммам) по настоящему изобретению. Предпочтительная форма зависит от назначенного режима введения и (терапевтического) применения. Фармацевтический носитель может быть любым совместимым, нетоксичным веществом, подходящим для доставки штамма(штаммов) в желаемую полость тела, например кишечник субъекта. Например, могут быть использованы стерильная вода или инертные твердые вещества в качестве носителя, обычно дополняемого фармацевтически приемлемыми адъювантами, буферизующими агентами, диспергирующими агентами и т.п. Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать дополнительные биологически или фармацевтически активные ингредиенты.
В дополнительных вариантах осуществления в вышеупомянутых композициях используются мертвые или нежизнеспособные клетки бактериального штамма(штаммов), вместо или дополнительно к живым (или жизнеспособные) бактериям, например, как описано в WO 01/95741. Количество используемых мертвых или нежизнеспособных клеток может, например, быть эквивалентным количеству, используемому для живых бактерий. Подходящее количество может быть легко определено специалистами в данной области техники. В таких композициях количество клеток подсчитывается (например, с использованием проточного цитометра) или измеряется различными способами, известными специалистам в данной области техники, поскольку измерение в виде “колониеобразующих единиц” не является практически осуществимым.
Понятно, что при ссылке на композиции, содержащие живые клетки, охватываются клетки, которые являются жизнеспособными, например лиофилизированные клетки, которые снова становятся активными после применения или восстановления жидкостью.
Пищевой продукт, пищевые добавки, питательные или фармацевтические композиции могут находиться либо в жидком, например стабилизированная суспензия штамма(штаммов), либо в твердом виде, например порошок, либо в полужидком виде. Например, для перорального применения штамм(штаммы) может применяться в виде твердых дозированных форм, таких как капсулы, таблетки и порошки, либо в виде жидких дозированных форм, таких как эликсиры, сиропы и суспензии. Штамм(штаммы) может быть инкапсулирован в желатиновые капсулы совместно с неактивными ингредиентами и порошкообразными носителями, такими как глюкоза, лактоза, сахароза, маннит, крахмал, целлюлоза или производные целлюлозы, стеарат магния, стеариновая кислота, сахарин натрия, тальк, карбонат магния и т.п. Как упоминалось выше, композиции могут содержать дополнительные компоненты, такие как белки, углеводороды, витамины, минералы, следовые элементы, аминокислоты, другие биологически или фармакологически активные компоненты, носители, стабилизаторы, вкусовые добавки, другие пробиотические штаммы, пребиотики и т.п.
Штаммы группы 2 являются особенно подходящими для приготовления композиции для лечения или профилактики легочных дисфункций, таких как ХОБЛ, неаллергическая астма, муковисцидоз, проникновение инородного тела в дыхательные пути, эндобронхиальные опухоли, эндотрахеальные опухоли, легочные дисфункции, вызванные неспецифическими вдыхаемыми раздражителями, отек легких, стеноз трахеи или дисфункция голосовых связок. Конечно, штаммы группы 2 могут быть объединены со штаммами, о которых известно, что они обладают противовоспалительной активностью (такие как штаммы группы 1 и/или группы 3). Такие комбинации являются подходящими для лечения или профилактики легочных заболеваний или респираторных заболеваний/нарушений, связанных с воспалением, например аллергической астмы.
Композиции, содержащие один или несколько штаммов, согласно настоящему изобретению, являются подходящими либо для лечения пациентов, уже страдающих легочной дисфункцией, либо могут применяться с профилактической целью субъектами, которые имеют высокую степень риска развития такой легочной дисфункции, например, субъектами, подвергаемыми дыму/курению, холоду и т.п.
Используемые бактериальные штаммы, предпочтительно, представляют собой бактерии, продуцирующие молочную кислоту, предпочтительно рода Lactobacillus или Bifidobacterium. Бактерии должны быть пищевой кондиции, т.е. предполагается, что они не должны быть опасными для человека или животного при приеме внутрь. Очевидно, что бактерии непищевой кондиции, например, патогенные бактерии, которые были модифицированы таким образом, чтобы они были не опасны для употребления субъектом внутрь, включены в объем настоящего изобретения. Штаммы Lactobacillus могут представлять собой следующие виды: L.rhamnosus, L.casei, L.paracasei, L.helveticus, L.delbrueckii, L.reuteri, L.brevis, L.crispatus, L.sakei, L.jensenii, L.sanfransiscensis, L.fructivorans, L.kefiri, L.curvatus, L.paraplantarum, L.kefirgranum, L.parakefir, L.fermentum, L.plantarum, L.acidophilus, L.johnsonii, L.gasseri, L.xylosus, L.salivarius и т.д. Предпочтительными являются виды L.rhamnosus, L.casei, L.paracasei, L.ruteri, L.crispatus, L.fermentum, L.plantarum, L.acidophilus, L.johnsonii, L.gasseri, L.salivarius, более предпочтительными являются L.plantarum, L.casei или L.rhamnosus. Наиболее предпочтительным является использование штаммов Lactobacillus, принадлежащих виду L.casei.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения штаммы L.rhamnosus, в частности штамм L.GG, исключаются, поскольку они могут вызывать проблемы, связанные с безопасностью, и поскольку, например, штамм L.GG имеет характеристики, которые могут быть нежелательными для специфичных применений (см. Примеры).
Штаммы Bifidobacterium могут представлять собой следующие виды: B.longum, B.breve, B.animalis, B.infantis, B.bifidum, B.adolescentis, B.pseudolongum, B.catenulatum, B.pseudocatenulatum, B.angulatum и т.д. Предпочтительными являются виды B.breve и/или B.animalis (особенно B.animalis подвида lactis).
Виды, идентичные микроорганизмам, могут быть определены биохимически или при помощи секвенирования (например, консервативных областей) или при помощи известных способов, таких как гель-электрофорез в пульсирующем поле. В общих чертах, бактериальные штаммы принадлежат тем же самым видам, если они показывают (например, при оптимальном выравнивании при помощи, например, программы GAP или BESTFIT с использованием параметров по умолчанию), по меньшей мере, 97% идентичность последовательности нуклеиновой кислоты в 16S рРНК.
ТМ
Согласно Будапештскому договору в Бельгийской координированной коллекции микроорганизмов, BCCM, Gent, Бельгия, штамм L.casei, TD2 помещен под регистрационным № LMG P-22110. LMG P-22110 является особенно подходящим для приготовления композиции, как описано выше, хотя настоящее изобретение не ограничено этим штаммом.
Очевидно, что репликации и варианты депонированных штаммов или любого другого штамма, согласно настоящему изобретению, охвачены настоящим изобретением. Термин “репликация” относится к биологическому материалу, который представляет по существу немодифицированную копию материала, например материала, продуцируемого ростом микроорганизмов, например ростом бактерий в культуральной среде. Термин “вариант” относится к материалу, который создан из биологического материала и который по существу является модифицированным для получения новых свойств, например, вызванных наследуемыми изменениями в генетическом материале. Эти изменения могут происходить либо спонтанно, либо быть результатом применения химических и/или физических агентов (например, мутагенных агентов), и/или могут быть результатом применения технологий рекомбинантных ДНК, как известно в данной области техники. При ссылке на штамм “полученный” от другого штамма, очевидно, что имеются в виду обе репликации такого штамма, а также “варианты” этого штамма при условии, что полученный штамм все еще сохраняет положительное влияние того штамма, от которого он был получен, на сужение дыхательных путей и, следовательно, может быть использован для лечения и/или предупреждения легочной дисфункции.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, два или несколько штаммов объединяют в одну композицию, или принимаются субъектом совместно. Предпочтительно объединяют, по меньшей мере, один штамм, имеющий противовоспалительный эффект (например, штаммы, известные в данной области техники, например TD5, или штаммы группы 1, например TD1) и, по меньшей мере, один другой штамм, имеющий положительное влияние на сужение дыхательных путей, но не имеющий противовоспалительного эффекта (например, штаммы группы 2, например TD2). В некоторых случаях такая комбинация штаммов оказывается лучшей по сравнению с применением только штамма(штаммов) с противовоспалительной активностью, поскольку комбинация штаммов, которые оказывают разные виды воздействия, может иметь более сильное влияние на легочную функцию. Штаммы могут находиться в различных композициях и объединяться только in vivo после применения субъектом различных композиций. В качестве альтернативы, штаммы могут находиться в одной композиции. В обоих случаях применение двух или более штаммов называется “совместным применением”.
В дополнительном варианте осуществления предоставляются композиции, содержащие, по меньшей мере, один штамм согласно настоящему изобретению, как раскрыто в настоящем описании выше.
В другом дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения предоставляется штамм LMG P-22110 (TD2) или любой штамм, полученный из указанных штаммов.
Также предоставляется контейнер, содержащий композицию, согласно настоящему изобретению, как описано выше. Такой контейнер может представлять собой упаковку, содержащую 1-100, и каждый отдельный объем от 1 до 100, такой как 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100 или более, дозируется в виде таблеток, капсул, порошка, ампул, пакетов-саше и т.п. Аналогично, упаковки могут содержать 1-200, 1-500 или более дозированных форм. Если для совместного применения предназначены разные штаммы, очевидно, что контейнеры могут содержать отдельные дозированные формы каждой композиции, содержащей штамм. Предпочтительно, контейнер содержит написанную на внешней стороне маркировку установленного положительного влияния или влияния на здоровье композиции. Например, на контейнере может быть указано, что композиция предназначена “для пациентов, страдающих ХОБЛ” или является “оздоровительной”. Контейнер может быть из картона, пластика, металла и т.п. Контейнер также может содержать инструменты, подходящие для применения композиции, например пульверизатор, если композиция находится в жидком виде или в виде порошка. Кроме того, контейнер может содержать написанную инструкцию по применению.
Задачей настоящего изобретения также является предоставление способа приготовления композиции для лечения или профилактики легочной дисфункции, включающего последовательные этапы, на которых:
тестируют влияние бактериального штамма, предпочтительно бактерий, продуцирующих молочную кислоту, на сужение дыхательных путей путем использования PenH теста или при помощи определения значений ОФВ1 у людей,
выбирают штамм со значимым положительным влиянием на сужение дыхательных путей, и в частности на ГРДП, исходя из влияния на PenH и/или ОФВ1,
выращивают выбранный штамм в подходящей жидкой или твердой среде,
необязательно, изолируют штамм от среды, например, центрифугированием и/или фильтрацией, и выполняют поточную обработку, как известно в данной области техники, например лиофилизацию, сушку распылением и/или заморозку,
приготавливают лекарственную форму штамма в виде, подходящем для введения субъекту.
Необязательно, тестируют, способен или нет изолированный штамм вызывать значимый противовоспалительный эффект у субъекта.
Следует отметить, что штамм, протестированный вышеуказанным способом, является предпочтительно изолированным от своего природного окружения и не содержит загрязнений. Изолированный штамм может расти в искусственной среде или в природной среде, такой как (с низким содержанием жира) молоко, йогурт и т.п. Затем он может быть использован непосредственно для изготовления композиции согласно настоящему изобретению, или бактерии могут быть концентрированы или изолированы от среды центрифугированием и/или фильтрацией и затем приготовлены в виде подходящих композиций. Очевидно, что уже существующие пищевые композиции, такие как, например, кефир, который содержит неидентифицируемую смесь микроорганизмов (например, дрожжи, различные виды бактерий), исключаются из композиции настоящего изобретения, так как такие продукты являются неидентифицируемыми как относительно состава содержащихся в них бактерий (видов), так и концентрации бактерий (дозированных форм). Однако они могут быть использованы в качестве основного компонента пищевого продукта, к которому добавляют один или несколько штаммов согласно настоящему изобретению. Только таким образом полученные композиции (содержащие, по меньшей мере, один из штаммов настоящего изобретения) и их использование рассматриваются в качестве варианта настоящего изобретения.
Использование штамма группы 1 и/или 2 согласно настоящему изобретению для приготовления лекарственного препарата для лечения или предупреждения легочной дисфункции, в частности для лечения или предупреждения ХОБЛ, неаллергической астмы, муковисцидоза, аспирации, эндобронхиальных опухолей, эндотрахеальных опухолей, легочных дисфункций, вызванных неспецифическими вдыхаемыми раздражителями, отека легких, стеноза трахеи и/или дисфункции голосовых связок, представляет собой дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения. В особенно предпочтительном варианте осуществления лекарственный препарат используется для лечения и/или предупреждения легочных дисфункций, выбранных из группы, состоящих из ХОБЛ, аспирации, легочных дисфункций, вызванных неспецифическими вдыхаемыми раздражителями, отека легких и/или стеноза трахеи.
Другой вариант осуществления относится к применению пробиотических кисломолочных бактерий для приготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у субъекта.
Следующие неограничивающие примеры описывают идентификацию и использование штаммов согласно настоящему изобретению. Кроме установленного иным способом практическое применение настоящего изобретения может использовать обычные стандартные способы молекулярной биологии, вирусологии, микробиологии или биохимии.
Примеры
Пример 1:
Описание, характеристики и пробиотические свойства штамма TD2
Изоляция штамма
Штамм TD2 изолировали из фекалий здорового человека, добровольца. Фекалии здорового взрослого добровольца изучали на предмет пробиотических штаммов. Под термином “здоровый” подразумевается взрослый человек, не имеющий заболеваний, физических недостатков, не страдающий желудочно-кишечными заболеваниями, не использовавший антибиотиков в течение последних 6 недель, не потреблявший пробиотических продуктов в течение последней недели, переносящий молочные белки и имеющий регулярный стул. Велась ежедневная запись рациона.
2
7
Свежие человеческие фекалии анализировали в анаэробной камере. Фекалии десятикратно разводили в 90 мл среды для хранения (20 г/л буферной пептонной воды, 1,0 мл/л Твин 80, 0,5 г/л L-цистеин HCl и 1 таблетка резарцина на литр, рН 6,3 (доведенный 2М HCl)) и затем гомогенизировали при помощи Ultra-Turrax. Серийное разбавление проводили разбавлением пептона (1,0 г/л) физиологическим раствором, и 10-10 разбавления засевали планшеты LAMVAB (Hartemink et al. 1997). Такая конечная среда состояла из 52 г/л De Man Rogosa Sharpe (MRS, Oxoid), 0,25 г/л L-цистеина HCl, 0,025 г/л бромкрезол-зеленого, 20 г/л агара и 20 мг/л ванкомицина. MRS (104 г/л), L-цистеин HCl (0,5 г/л) и бромкрезол-зеленый (0,05 г/л) стерилизовали в автоклаве отдельно от агара (40 г/л) в течение 15 мин при 121°С и остужали до 50°С. Маточный раствор ванкомицина (2 мг/мл) стерилизовали фильтрацией, используя 0,2 мкм фильтр. Автоклавированный агар и MRS+цистеин+бромкрезоловый-зеленый смешивали в отношении 1:1. Затем добавляли ванкомицин до конечной концентрации 20 мг/мл, после чего засевали планшеты. Планшеты инкубировали при 37°С в анаэробных сосудах в течение трех дней. Колонии засевали штрихом в чистом MRS агаре и инкубировали при 37°С.
Классификация штаммов
Секвенирование 16sРНК дает достоверную идентификацию штаммов. Экстракцию ДНК штаммов проводили согласно способу, описанному Boom et al. (1990). Амплификацию и секвенирование участка 16sРНК проводили при помощи праймеров 8f и 1510r, приведенных в Таблице 1. Программа амплификации представляла собой: 94°С в течение 5 мин; 30 циклов по 30 с при 94°С, 30 с при 54°С, 90 с при 72°С; и наконец, 72°С в течение 4 мин.
Таблица 1Праймеры
Праймер
Последовательность (5'→3')
8f
CAC GGA TCC AGA GTT TGA T(C/T)(A/C)TGG CTC AG
338f
GCT GCC TCC CGT AGG AG
338f
CTC CTA CGG GAG GCA GC
515f
TGC CAG CAG CCG CGG TAA TAC GAT
515r
ATC GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA
968f
AAC GCG AAG AAC CTT AC
968r
GTA AGG TTC TTC GCG TT
1401r
CGGTGTGTACAAGACCC
1501r
GTC AAG CTT ACG G(C/T)T ACC TTG TTA CGA CTT
Секвенирование проводили способом секвенирования ДНК с использованием дидезоксинуклеотидов, разработанным Sanger et al. (1997). В циклической реакции секвенирования (CSR) использовали набор ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems Inc., Nieuwekerk aan de IJssel, Нидерланды) в сочетании со всеми праймерами, приведенными в Таблице 2. Программа для CSR представляла собой: 96°С в течение 30 с, затем 25 циклов по 10 с при 96°С, 5 с при 50°С и 4 мин при 60°С. Затем смесь CSR последовательно анализировали при помощи генетического анализатора ABI PRISM 310 (Applied Biosystems Inc., Nieuwekerk aan de IJssel, Нидерланды). Данные последовательности анализировали при помощи программы Chromas V1.51 (Technelysium Pty Ltd., Tewantin, Австралия) и выравнивали при помощи программы DNASIS Windows V2.5 (Hitachi Software Engineering Co., Ltd., Wembley, Великобритания). Полностью секвенированный участок двухнитевой 16S рДНК вводили в программу Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) (Altschul et al. 1990) и сравнивали с другими (16S рДНК) последовательностями (штаммов) в базах данных GenBank, EMBL, DDBJ и PDB для определения штаммов. Штамм идентифицировали как принадлежащий к виду Lactobacillus casei.
Выживаемость штаммов
Оценивали выживаемость штамма TD2 L.casei, изолированного из человеческих фекалий, а также известных пробиотических штаммов в желудке и тонкой кишке. Выживаемость в желудке и тонкой кишке важна в случае, если штамм используется как пробиотический для людей.
2
2
4
2
2
4
3
2
4
Бактерии выращивали в MRS в течение 24 часов и затем пересевали в течение 24 часов в MRS. 1 мл выращенной культуры добавляли в 9 мл желудочной среды, состоящей из 8,3 г/л бактериологического пептона, 3,1 г/л NaCl, 0,11 г/л CaCl, 1,1 г/л KCl, 0,6 г/л KHPO, 1,0 г/л D-глюкозы, 22,2 мг/л пепсина и 22,2 мг/л липазы, рН 3,0. Бактерии инкубировали в течение 3 часов при 37°С в желудочной среде. Затем 1 мл инкубированной желудочной среды с бактериями смешивали с 9 мл среды тонкой кишки и инкубировали в течение следующих 3 часов при 37°С. Среда тонкой кишки состояла из 5,7 г/л бактериологического пептона, 1,25 г/л NaCl, 0,055 г/л CaCl, 0,15 г/л KCl, 0,68 г/л KHPO, 1,0 г/л NaHCO, 0,3 г/л NaHPO, 0,7 г/л глюкозы, 20,3 г/л панкреатина и 5,5 г/л желчи, рН 6,5. Образцы брали через t=0, 3 и 6 часов и засевали планшеты на MRS агар для определения колониеобразующих единиц.
Из человеческих фекалий изолировали L.casei, LMG P22110, показавший аналогичную или даже лучшую выживаемость в желудочной среде и среде тонкой кишки относительно других пробиотических штаммов, как показано ниже в Таблице 2.
Таблица 2
Штамм
Происхождение
Выживаемость в желудочной среде
Выживаемость в среде тонкой кишки
Общая выживае-емость
L.caseiLMG P-22110
Человеческие фекалии
105%
164%
172%
L.rhamnosus GG
Человеческие фекалии
109%
139%
152%
B.animalis Bb 12
?
100%
105%
105%
Адгезия штаммов
Одним из свойств пробиотиков является то, что они могут склеиваться с интестинальными клетками и конкурировать с патогенами для связывания с участками эпителиальных клеток. Адгезия с эпителиальными клетками также коррелирует со способностью образования колоний и пробиотическим влиянием на хозяина.
Тестировали адгезию L.casei LMG P-22110.
5
8
2
Штамм, который культивировали всю ночь, собирали центрифугированием (10 мин, 4000 об/мин, Sorval RT17) и повторно суспендировали в PBS. Количество клеток считали под микроскопом с использованием счетной камеры Bürker Türk. Бактерии снова центрифугировали и осадок ресуспендировали в Caco-2 1% FCS среде без Pen/Strep. Клетки Сасо-2 представляли собой клетки спустя 2 недели после образования монослоя и выращивания в 24 луночных планшетах (1-2х10 Сасо-2 клеток на лунку). 1х10 КОЕ на лунку бактерий добавляли и инкубировали в течение 1 часа при 37°С в инкубаторе с 5% СО. После инкубации из клеток Сасо-2 удаляли среду, и клетки промывали 3 раза PBS (37°С). Клетки лизировали стерильной водой Mili Q, получали стерильные разбавления лизированных клеток и засевали на планшеты с MRS агаром.
Результаты показали, что L.casei LMG P-22110 (TD2) склеивались, по меньшей мере, также хорошо, как и другие хорошо известные пробиотические штаммы. Адгезия была лучше, чем в положительном контроле. Склеилось около 13% добавленной культуры.
Нежелательные свойства, такие как гемолиз, или продуцирование гистамина или тирамина, не наблюдались.
Пример 2:
Эксперимент с животными, в котором сенсибилизированные овальбумином мыши были заранее обработаны несколькими штаммами молочнокислых бактерий.
Животные:
Самцы мышей BALB/c без специфического патогена были получены от Charles River (Maastricht, Нидерланды). Пищу и воду предоставляли в неограниченном количестве, и использовали мышей 6-9 недельного возраста. Все эксперименты были одобрены комитетом этики экспериментов над животными Утрехтского университета, Нидерланды.
Реагенты:
Овальбумин (grade V) и ацетил-β-метилхолин хлорид (метахолин) был приобретен у компании Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, США). Гидроксид алюминия (AlumInject) был приобретен у Pierce (Rockford, IL, США).
Сенсибилизация, обработка и провокация:
9
Мыши были сенсибилизированы двумя внутрибрюшинными инъекциями по 10 мкг овальбумина, абсорбированного на 2,25 мг гидроксида алюминия в 100 мкг физиологического раствора, или только физиологического раствора на 0 и 7 день. На 35, 38 и 41 день в течение 20 минут мышей подвергли провокации путем ингаляции аэрозоля, содержащей овальбумин, в камере из плексигласа для воздействия. Аэрозоли создавали распылением раствора овальбумина (10 мг/мл) в физиологическом растворе, используя распылитель Pari LC Star (Pari respiratory Equipment, Richmond, VA, USA). Мышей ежедневно обрабатывали молочнокислыми бактериями, 10 (КОЕ) на штамм, орально при помощи зондового питания, начиная с 28 дня до конца эксперимента (т.е. до 42 дня).
Определение чувствительности дыхательных путей
:
Чувствительность дыхательных путей на вдыхаемый распыленный метахолин определяли через 24 часа после последней провокации аэрозолем мышей, находящихся в сознании, неограниченных в движении, используя плетизмографию всего тела (BUXCO, EMKA, Paris, France). Реакция дыхательных путей выражалась в виде увеличенной паузы (PenH).
Бронхоальвеолярный лаваж:
После измерения холинергической реакции дыхательных путей животных умерщвляли и проводили бронхоальвеолярный лаваж, определяли общее количество клеток и дифференцировали клетки. Супернатант первых миллилитров жидкости лаважа отделяли и замораживали при -70°С для дальнейшего анализа. Приток общих клеток (нейтрофилов, макрофагов, эозинофилов + лимфоцитов) брали в качестве показателя воспаления легочной ткани.
Статистический анализ:
Проводили статистический анализ зависимостей реакции дыхательных путей на метахолин при помощи общей линейной модели или повторяли измерения с последующим сравнением между группами. Проводили статистический анализ числа клеток, используя U-тест Ману-Уитни. Значение вероятности р<0,05 считалось статистически значимым.
Результаты:
Результаты приведены в Таблице 3. Штамм TD2 показывает значимое влияние на гиперчувствительность дыхательных путей, но не значимое влияние на воспаление, в то время как штамм TD5 показывает незначимое влияние на гиперчувствительность дыхательных путей, но влияет на воспаление. Штамм TD1 показывает как влияние на гиперчувствительность дыхательных путей, так и на воспаление.
Эти результаты указывают на различное влияние некоторых бактериальных штаммов, продуцирующих молочную кислоту, на легочную функцию, и указывают на то, что положительное влияние на воспаление легких не приводит неизбежно к положительному влиянию на легочную функцию и наоборот. Следовательно, эти результаты указывают на то, что штаммы, продуцирующие молочную кислоту, имеющие положительное влияние на легочную функцию, могут иметь терапевтический эффект и/или эффект предупреждения заболевания, включая легочные дисфункции, в отличие от такового штаммов, имеющих противовоспалительный эффект. Эти результаты указывают на то, что штаммы, принадлежащие виду L.casei, являются особенно эффективными.
Таблица 3Влияние различных штаммов молочнокислых бактерий на гиперчувствительность дыхательных путей и воспаление у сенсибилизированных овальбумином мышей
Обработка
Воспаление<sup>с</sup> (%)
Гиперчувствительность дыхательных путей<sup>d</sup> (%)
Сформированные группы
Контроль<sup>a</sup>
100
100
Штамм TD1 (штамм B. breve MV-16, Morinage)
58*
60*
Группа 1
Штамм TD2 (LMG P-22110)
94
42*
Группа 2
Штамм TD5 (B. infantis Bi07, Rhodia Food)
69*
93
Группа 3
Штамм TD6f (L GG. ATCC 53103)
nd<sup>e</sup>
66*
Группа 1
Контроль<sup>b</sup>
0
0
a: сенсибилизированные овальбумином мыши, не обработанные молочнокислыми бактериями.b: контрольные несенсибилизированные овальбумином крысыс: воспаление, измеренное при помощи количества клеток, присутствующих в бронхоальвеолярном легочном лаважеd: уменьшение гиперчувствительности дыхательных путей выражено в виде влияния на PenH при самой высокой тестируемой дозе метахолина (50 мг/мл)*P<0,05 при сравнении с сенсибилизированными овальбумином мышами, не обработанными молочнокислыми бактериямие: не определеноf: было определено в отдельном эксперименте
Пример 3:
Эксперимент с животными, показывающий эффект молочнокислых бактерий на мышиной модели во время эмфиземы легких, индуцированной эндотоксином.
Легочная эмфизема может быть индуцирована у мышей обработкой LPS.
Животные:
Самцы мышей BALB/c byJIco без специфического патогена получали у Charles River (Maastricht, Нидерланды). Пищу и воду предоставляли в неограниченном количестве, и использовали мышей 7-8 недельного возраста. Все эксперименты были одобрены комитетом этики экспериментов над животными Утрехтского университета, Нидерланды.
Реагенты:
LPS: E.coli, серотип O55:B5:Sigma Chemical Co.
Метахолин (ацетил-β-метилхолин получали от Janssen Chimica (Beerse, Бельгия).
Сенсибилизация, обработка и провокация:
9
Легочную эмфизему индуцировали интраназальным применением LPS (5 мкг в 50 мл фосфат-буферизованного физиологического раствора (PBS)) или, в качестве контроля, PBS (50 мкл) два раза в неделю в течение четырех недель (дни 0, 3, 7, 10, 10, 14, 17, 21 и 24). Мышей обрабатывали ежедневно 0,2 мл физиологического раствора (0,9% в отношении веса к объему NaCl), содержащего молочнокислые бактерии, 10 (КОЕ) на штамм, орально при помощи зондового питания, начиная с 14 дня до окончания эксперимента (т.е. до 42 дня). В качестве контроля добавляли 0,2 мл физиологического раствора.
Чувствительность дыхательных путей и бронхоальвеолярный лаваж определяли, как описано в примере 2.
Гипертрофия правого желудочка
Гипертрофия правого желудочка является индикатором легочной эмфиземы. На 42 день изолировали сердце целиком (у 4 из 10 животных), и свободную стенку правого желудочка (RV) полностью отделяли и удаляли под препаровальной лупой. Левый желудочек и перегородки (LV+S) и RV взвешивали отдельно после сушки с использованием фильтровальной бумаги. Соотношение веса RV к весу LV+S использовали в качестве индекса гипертрофии правого желудочка.
Статистический анализ:
Данные зависимостей реакции дыхательных путей на метахолин, количество клеток бронхоальвеолярного лаважа (BAL) и гипертрофию правого желудочка (RV) выражали в виде средней арифметической ± стандартная ошибка средней арифметической, и сравнение между группами проводили, используя однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) (и непараметрический) с последующим сравнением между группами (многократный t-тест Бонферрони). Значение вероятности р<0,05 считалось статистически значимым. N=10 для измерения реакции дыхательных путей, n=6 для количества BAL клеток, n=4 для RV гипертрофии.
Результаты:
Результаты приведены в Таблице 4. Штамм TD2 показывает значимое влияние на гиперчувствительность дыхательных путей, но незначительное влияние на воспаление.
Результаты указывают на то, что бактериальный штамм TD2, продуцирующий молочную кислоту, имеет положительное влияние на гиперчувствительность дыхательных путей, и гипертрофию правого желудочка у мышей, страдающих легочной эмфиземой, индуцированной LPS, и на то, что это является эффектом, не происходящим посредством противовоспалительных механизмов. Эти результаты указывают на то, что некоторые специфические штаммы, имеющие влияние на PenH, являются полезными при лечении и/или для предупреждения легочной дисфункции, такой как эмфизема и/или ХОБЛ. Эти результаты указывают на то, что штаммы L.casei являются подходящими, и особенно подходящим является штамм TD2.
Таблица 4Влияние штаммов молочнокислых бактерий на гиперчувствительность дыхательных путей, гипертрофию правого желудочка и воспаление в LPS модели легочной эмфиземы
Обработка
Воспаление<sup>с</sup> (%)
Гиперчувствительность дыхательных путей<sup>d</sup> (%)
Гипертрофия правого желудочка
Контроль<sup>a</sup>
100
100
100
штамм TD2 (LMG P-22110)
93
16*
56*
Контроль<sup>b</sup>
0
0
a: Мыши, обработанные LPS, но не обработанные молочнокислыми бактериями.b: контрольные крысы, не обработанные LPSс: воспаление, измеренное при помощи количества клеток, присутствующих в бронхоальвеолярном легочном лаважеd: уменьшение гиперчувствительности дыхательных путей выражено в виде влияния на PenH при самой высокой тестируемой дозе метахолина (50 мг/мл)*P<0,05 при сравнении с контрольными мышами, обработанными LPS
Пример 4:
Композиции, содержащие штаммы молочнокислых бактерий
Композиция пищевой добавки
9
1. Капсула, содержащая 0,5 г сухого обезжиренного молока и 0,5 г смеси из галактоолигосахарида и фруктополисахаридов и содержащая TD2 5х10 КОЕ на 1 г. Доза: 2х1 г в сутки.
9
9
2. Порошок, мальтодекстрин, содержащий TD1 в количестве 5х10 КОЕ на 1 г и TD2 в количестве 5х10 КОЕ на 1 г; упакованный в пакет-саше. Доза: 2х1 в сутки. Перед употреблением необходимо растворить в воде, фруктовом соке, молоке или йогурте и т.д.
Пищевая/питательная композиция
9
1. Жидкое питательное вещество, предназначенное для пациентов, страдающих ХОБЛ, содержащее TD1 в количестве 5х10 клеток на 125 мл, инактивированных нагреванием. Рекомендованная доза составляет 3х125 мл в сутки.
На 100 мл:
7,5 г белка (смесь казеин-сыворотка, 1/1)
22,5 г углеводородов (глюкоза 0,3 г, лактоза 2,0 г, мальтоза 1,0 г, сахароза 3,0 г, полисахариды 15,8 г)
3,3 г жира (0,5 г насыщенных жирных кислот, 1,9 г мононенасыщенных жирных кислот, 0,9 г полиненасыщенных жирных кислот)
минералы (55 мг Na, 110 мг K, 60 мг Cl, 155 мг Ca, 100 мг P, 15 мг Mg)
следовые элементы (3,2 мг Fe, 2,4 мг Zn, 360 мкг Cu, 0,66 мг Mn, 0,20 мкг F, 20 мкг Mo, 23 мкг Se, 13 мкг Cr, 27 мкг I)
витамины (витамин А 127 мкг RE; каротиноиды Pro Vita 73 мкг RE, 0,8 мг каротиноидов, 1,4 мкг витамина D, 5,0 мкг α-ТЕ витамина А, 0,30 мг тиамина, 0,32 мг рибофлавина, 3,6 мг NE ниацина, 1,1 мг пантотеиновой кислоты, 0,35 мг витамина В6, 53 мкг фолиевой кислоты, 0,50 мкг витамина В12, 8,0 мкг биотина, 0,40 мг витамина С)
Холин 74 мг
2. Порошок на основе молока, упакованного в пакет-саше по 85 г; предназначенный для смешивания с 240 мл жидкости, например молока, йогурта или фруктового сока;
содержащий на 100 г порошка:
10
TD2 в количестве 1х10 КОЕ
4,7 г белка
68,2 г углеводородов (25 г сахаров)
24,7 г жира
минералов (140 мг Na, 570 мг K, 130 мг Ca, 400 мг P, 14 мг Mg)
Ссылки
et al.,
Altechul  1990, J. Mol Biol. 215(3); 403-10.
Babu and Arshad, 2003, Paediatr. Respir. Rev. 4:40-60.
et al.,
Boom  1990, J. Clin. Microbiol. 28:495-503.
Cockcroft, 1985, Measurement of airway responsiveness to inhaled histamine or methacholine: method of continuous aerosol generation and tidal breathing inhalation. In: Hargreave FF. Woolcock AJ eds. Airway responsiveness measurement and interpretation. Mississauga: Astra Pharmaceuticals Canada: 22-8.
etal.,
Coconnier,  1993, FEMS Microbiol.Lett. 110(3):299-305.
Cross etal. 2002, Med. Microbiol. Immunology 191:49-53.
et al.
Hamelman  1997, Am.J. Crit, Care Med. 156:766-75 (comment 158:340-341).
et al.
Hartemink  1997, J. Microbiological Methods 29:77-84.
et
Madsen  al., 2001, Gastroenterology 121:580-591.
et al.,
Sanger  1977, Proc. Nati Acad. Sci. USA 74, 5463-5467.
et al.,
Schultz  2003, J. Dairy Res. 70:165-173.
Tejada-Simon, 1999, J. Food Prot. 62:162-169.
et al.,
Varcoe  2003, J. Pood Prot 66:457-465.
et al.
Yan  1983, Thorax 38: 760-765.