Способ определения величины адсорбции циннаризина липосомами
METHOD FOR DETERMINING THE AMOUNT OF ADSORPTION OF CINNARIZINE BY LIPOSOMES

Изобретение относится к области исследования и анализа различных веществ, в частности фармацевтических препаратов, и может быть использовано для определения концентрации исследуемого вещества при разработке новых лекарственных форм с использованием спектрофотометрического метода.
Известен способ, который заключается в дезинтеграции липосомальных везикул нагреванием до температуры 90-100°С [Gardner S.C. "Delipidation treatment for large-scale protein purification processing" Thesis for MS in Chem. Engineering, Virginia Polytechnic Inst., 1996].
Недостатком этого способа является относительно низкая точность, поскольку возникает обратная интеграция везикул при остывании смеси. В результате липосомальные везикулы и мицеллы формируются заново и часть препарата попадает обратно в липосомы, поэтому в водном растворе можно измерить лишь оставшуюся часть реальной концентрации препарата.
Заслуживает внимания способ осаждения липосом, нагруженных препаратом с помощью протамина сульфата, с последующим спектрофотометрическим определением неинкапсулированного вещества в полученном супернатанте [V. Torchilin and V.Weissig, "Liposomes 2nd eds., A Practical Approach" ed. Oxford Univercity Press, 2003, 384 pp].
Однако метод имеет существенные ограничения, связанные с возможностью соосаждения определяемого вещества.
Известен способ [Патент на изобретение №2711908 РФ/ федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ"). - №2019115732; заявлено 22.05.19; опубл. 24.01.2020; Бюл. №3.- 11 с] определения величины адсорбции винпоцетина липосомами, включающий количественное определение винпоцетина методом спектрофотометрии, проведение диализа при температуре 37°С в течение 12 ч в диализаторе с 12 мл коллоидного раствора липосом с массовой долей липосом 0,1342±0,02881% из соевого лецитина или водным раствором кислоты хлористоводородной 0,01 М; куда помещается диализная пробирка, заполненная 3 мл водного раствора кислоты хлористоводородной 0,01 М, содержащего винпоцетин в концентрации 0,24 мг/мл, для проведения диализа используется мембрана, характеристика пропускания которой 14 кДа; после достижения выравнивания концентрация винпоцетина измеряется в диализной пробирке, погруженной в диализатор с раствором липосом и диализатор, заполненный раствором кислоты хлористоводородной 0,01 М; определение величины адсорбции винпоцетина липосомами осуществляется по разности концентраций винпоцетина, вышедшего в диализную среду диализатора с водным раствором хлористоводородной 0,01 М кислоты и диализатора с раствором липосом.
Недостатком способа является недостаточная точность, так как определение величины адсорбции винпоцетина липосомами осуществляется без коррекции оптической плотности на лецитин, прошедший через диализную мембрану в основных диализаторах.
Наиболее близким по своей сущности к предлагаемому является способ определения концентрации липосомально инкапсулированных фармацевтических препаратов цитостатиков гидрофильной природы, включающий разрушение липосомальных везикул и последующее измерение концентрации вышедшего в раствор цитостатика [Патент на изобретение №2642275 РФ/ Некоммерческое организация Учреждение «Прогрессивные медицинские исследования». - №2007112306; заявлено 03.04.07; опубл. 27.10.2009; Бюл. №30 - 10 с]. Данный способ отличается тем, что липосомальные везикулы разрушают добавлением к липосомальной суспензии, разбавленной 2 М раствором хлорида натрия в соотношении 1:1, 3-кратного объема хлороформа, после чего пробы нагревают до 50-60°С, центрифугируют при 5000 g в течение 5 мин, концентрацию вышедшего в водную фазу цитостатика определяют спектрофотометрически.
Недостатком способа является образование различных мицеллярных форм определяемого препарата, что приводит к серьезным погрешностям в измерениях и вызывает трудности в интерпретации получаемых результатов.
Технический результат настоящего изобретения заключается в разработке неразрушающего способа, количественного определения циннаризина на поверхности липосом, полученных из соевого лецитина.
Технический результат достигается тем, что в способе определения величины адсорбции циннаризина липосомами, включающий, количественное определение циннаризина методом спектрофотометрии, согласно изобретению, диализ проводят в основном диализаторе, заполненным коллоидным раствором липосом с массовой долей липосом из соевого лецитина, равной 0,3059±0,0470%, и используемым при адсорбции раствором циннаризина в кислоте хлористоводородной 0,1 М, взятых в объемном соотношении раствор циннаризина и коллоидный раствор липосом - 1:1 соответственно; а также в диализаторе сравнения с раствором кислоты хлористоводородной 0,1 М и коллоидным раствором липосом с массовой долей липосом из соевого лецитина, равной 0,3059±0,0470%, при объемном соотношении коллоидный раствор и раствор кислоты хлористоводородной - 1:1 соответственно; при этом объемы растворов, заполняющие диализаторы, равны, в диализаторы помещают диализные пробирки, наполненные равными объемами раствора кислоты хлористоводородной 0,1 М; при объемном соотношении растворов диализатора и диализной пробирки, равном 10:3, для проведения диализа используют мембрану, характеристика пропускания которой 6-8 кДа; термостатирование ведут при температуре 40°С в течение 24 ч, после достижения равновесия осуществляют спектрофотометрирование растворов диализных пробирок диализаторов при длине волны 252 нм; определяют величину адсорбции циннаризина на липосомах по результатам определения равновесной концентрации в диализной пробирке с коррекцией оптической плотности на лецитин, прошедший через диализную мембрану в основных диализаторах.
Для изучения характеристик адсорбции циннаризина на поверхности липосом был использован метод равновесного диализа. Выбор данного метода обусловлен тем, что количественный анализ равновесной концентрации циннаризина в дисперсионной среде, необходимый для определения величины адсорбции, затруднен присутствием дисперсной фазы - липосом. Полупроницаемая мембрана, с диаметром пор, достаточным для проникновения молекул циннаризина, но не пропускающая липосомы, позволяет получить раствор циннаризина с концентрацией, достаточно близкой к концентрации в дисперсионной среде липосом. Получаемый таким образом раствор может быть подвергнут количественному анализу с использованием спектрофотометрии.
Липосомы из соевого лецитина получали методом гидратации/регидратации.
Пример.
Приготовление образцов липосом из соевого лецитина
Для получения липосом из соевого лецитина был использован метод гидратации/регидратации. Раствор соевого лецитина (Sigma) в этиловом спирте испаряли в роторном испарителе при температуре 45°С и давлении - 0,085 МПа. Затем добавляли раствор кислоты хлористоводородной 0,01 М (рН=2,0). Для получения липосом растворы были подвержены облучению на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 15 минут. Далее липосомы были отфильтрованы через стеклянный фильтр с диаметром пор 16 мкм.
Приготовление раствора циннаризина
Раствор А. Точную навеску циннаризина (0,0506 г) растворяли в 20 мл водного раствора хлористоводородной кислоты 0,1 М в мерной колбе объемом 100 мл и доводили тем же растворителем до метки.
Определение массовой доли коллоидного раствора липосом
В сушильном шкафу при температуре 80°С высушивали чашку Петри и производили ее взвешивание на аналитических весах Radwag 220/С/2 с точностью до 4-го знака после десятичной запятой в граммах. В чашку Петри помещали коллоидный раствор липосом и взвешивали. Далее чашку Петри с раствором липосом помещали в сушильный шкаф при температуре 80°С и высушивали ее содержимое до постоянной массы. Массовую долю коллоидного раствора липосом определяли по формуле:
где
пуст.
m - масса пустой чашки Петри, г;
жидк.
m - масса чашки Петри с коллоидным раствором, г;
сух.
m - масса чашки Петри с сухим остатком коллоидного раствора, г.
Для определения величины адсорбции циннаризина были приготовлены липосомы из соевого лецитина с растворами циннаризина различной концентрации, а также пустые липосомы. Для этого был использован метод гидратации/регидратации. Растворяли соевый лецитин (Sigma) в этиловом спирте (0,1 г соевого лецитина на 300 мл спирта этилового 96% при 38°С на водяной бане при перемешивании) и отфильтровывали через стеклянный фильтр с размером пор 16 мкм. Спирт этиловый испаряли в роторном испарителе при температуре 38°С, давлении - 0,08 МПа и скорости вращения 100 об/мин до образования полупрозрачной липидной пленки на стенках колбы. Затем добавляли 10 мл раствора циннаризина в 0,1 М водном растворе кислоты хлористоводородной или раствора кислоты хлористоводородной 0,1 М и перемешивали в течение 30 мин. Далее часть растворов была подвержена облучению ультразвуком в течение 15 минут. Растворы циннаризина для приготовления липосом были приготовлены из раствора А путем разбавления водным раствором 0,1М кислоты хлористоводородной в соответствии с таблицей 1 (фиг. 1). Для измерения концентрации данные растворы циннаризина были смешаны в объеме 0,1 мл с 2,5 мл водного раствора кислоты хлористоводородной 0,1 М. После чего были измерены оптические плотности исходных растворов при длине волны 252 нм с использованием спектрофотометра СФ-2000.
Для определения величины адсорбции циннаризина методом равновесного диализа коллоидные растворы липосом помещались в пробирки в объеме 0,3 мл с использованием пипеточного дозатора Тепло Scientific ДПОП-1-100-1000. Так же в данные пробирки помещались растворы циннаризина в растворе кислоты хлористоводородной 0,1 М по 0,3 мл. В пробирки помещались диализные пробирки GeBAflex Mini 250 мкл (Scienova, Германия) с диаметром пор мембраны 6-8 кДа. В диализные пробирки помещали 0,18 мл раствора кислоты хлористоводородной 0,1 М с использованием пипеточного дозатора. Так же был собран диализатор сравнения, в который вместо 0,3 мл раствора циннаризина помещались 0,3 мл раствора кислоты хлористоводородной 0,1 М.
Далее диализаторы выдерживались в термостате при температуре 40°С в течение 24 часов. После этого 0,1 мл раствора из диализной пробирки смешивались с 2,2 мл водного раствора кислоты хлористоводородной 0,1 М. Далее производилось измерение оптической плотности полученных растворов при длине волны 252 нм. Оптическая плотность диализата из диализатора сравнения была использована для коррекции оптической плотности на лецитин, прошедший через диализную мембрану в основных диализаторах.
По результатам определения равновесной концентрации в диализных пробирках был произведен расчет величины адсорбции циннаризина на липосомах.
На фиг 1 представлены оптические плотности и концентрации исходных растворов для приготовления растворов циннаризина, использованных для приготовления липосом с включением препарата.
На фиг 2 представлена схема проведения равновесного диализа для изучения адсорбции циннаризина на липосомах.
На фиг 3 представлены значения оптической плотности диализатов в эксперименте с адсорбцией циннаризина различной концентрации на липосомах.
На фиг 4 график зависимости величины адсорбции циннаризина на липосомах от равновесной концентрации. Из данного графика видно, что величина адсорбции циннаризина при обработке липосом ультразвуком меньше для всех исследуемых концентраций.
Так же на основе полученных данных была рассчитана степень связывания циннаризина в эксперименте с адсорбцией циннаризина на липосомах.
На фиг. 5 представлена зависимость степени связывания циннаризина липосомами от равновесной концентрации циннаризина в эксперименте с адсорбцией на липосомах.
Из графика видно, что при равновесной концентрации циннаризина более 0,0003 моль/л происходит стабилизация доли препарата, связанного с липосомами. Без обработки ультразвуком на уровне 24,83±1,15%, с обработкой ультравуком на уровне 18,4±1,20%.