СПОСОБ ОЦЕНКИ ТОЛЕРАНТНОСТИ К ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКЕ ПУТЕМ ИЗМЕРЕНИЯ АВТОФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ СВОЙСТВ КОЖИ
METHOD OF EVALUATING TOLERANCE TO PHYSICAL LOADING BY MEASUREMENT OF AUTOFLUORESCENT PROPERTIES OF SKIN

Изобретение относится к медицине, а именно к функциональной диагностике, и может быть использовано для экспресс-оценки и мониторинга функционального состояния человека в нормальных условиях, при патологических состояниях и при экстремальных условиях деятельности для выявления степени его утомления, скрытой патологии, установления резервных возможностей организма, выбора оптимальной тактики лечения, реабилитации и активизации.
Способ основан на измерении автофлуоресценции кожи и поэтому является неинвазивным.
Автофлуоресценция (АФ) или собственная флуоресценция биологических тканей (т.е. их способность к свечению без введения в ткань какого-либо внешнего агента), определяется наличием в них эндогенных флуорофоров, в том числе таких как пиридин нуклеотид (NAD), флавопротеины (Fp), конечные продукты гликирования (AGE) и др.
Свечение NAD и Fp зависит от нахождения их в окисленном или восстановленном состоянии. Для оценки окислительно-восстановительных процессов в органах и тканях чаще всего используется флуоресценция восстановленного пиридин нуклеотида NADH, который излучает в видимой области спектра в диапазоне 420-480 нм, при возбуждении в ультрафиолетовой области спектра в полосе поглощения 320-380 нм, отсутствующей в окисленном состоянии этого дыхательного фермента (Mayevsky A, Rogatsky G.G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: from animal models to human studies. Am. J. Physiol. Cell 292:C615-C640, 2007).
+
В основе известного способа лежит явление, заключающееся в том, что при недостатке кислорода в ткани происходит накопление избыточных количеств восстановленных пиридин нуклеотидов (NADH) в результате нарушения его окисления в NAD через цепь митохондриального транспорта электронов. Интенсивность автофлуоресценции зависит от соотношения восстановленных и окисленных пиридин нуклеотидов, возрастая при гипоксии. Таким образом, феномен автофлуоресценции тканей может быть использован для регистрации ишемических изменений в органах и тканях.
Известно исследование с применением мультифотонной микроскопии для оценки интенсивности автофлуоресценции НАДН в клетках эпидермиса у человека при окклюзииреперфузии плечевой артерии [Balu Μ, Mazhar A, Hayakawa СК, Mittal R, Krasieva ТВ, Konig К, Venugopalan V, Tromberg BJ. In vivo multiphoton NADH fluorescence reveals depth-dependent keratinocyte metabolism in human skin. Biophys J. 2013 Jan 8; 104(l):258-67].
Результат оценки уровня флуоресценции сопоставлялся с уровнем окси- и дезоксигемоглобина в ткани. Было показано, что в ходе 3-минутной окклюзии артерии происходит значимое повышение уровня НАДН флуоресценции, которое авторы связывают с уменьшением интенсивности окислительного метаболизма в кератиноцитах базального слоя эпидермиса.
Явление автофлуоресценции широко используется в медицинской диагностике, в том числе путем измерения свечения кожного покрова под воздействием ультрафиолетового излучения.
2
Известны способ и устройство, описанные в патенте (US 7966060. Method and apparatus for determining autofluorescence of skin tissue), которые предназначены для оценки конечных продуктов гликирования AGE путем измерения AФ участков кожи, расположенных в области предплечья пациента. Источником возбуждающего излучения служит люминесцентная лампа, излучающая в УФ области в диапазоне 300-420 нм. Сбор и регистрация излучения осуществляются с помощью спектрометра в диапазоне 420-600 нм. Для снижения влияния пигментации кожи, вводится параметр, представляющий собой отношение флуоресцентного излучения к отраженному возбуждающему излучению (285-420 нм). Измерения проводятся на участках кожи размером 0,4 см. Данный способ позволяет осуществлять скрининговые исследования населения для выявления больных сахарным диабетом, прогнозировать осложнения при заболеваниях сердечно-сосудистой системы и при почечной недостаточности.
Недостатком известного способа является ограниченная область его применения.
Известны также способ и устройство (патент US 6697657 Method and devices for laser induced fluorescence attenuation spectroscopy), которые предназначены для определения ишемии и гипоксии биологической ткани. Работа этой системы основана на измерении спектров флуоресценции NAD в диапазоне от 470 до 490 нм при двухфотонном лазерном возбуждении. Сложность данной технологии не позволяет использовать ее в рутинной практике клинических исследований.
Недостатком известного способа является также ограниченная область применения.
Известен способ измерения автофлуоресцентных свойств кожи для оценки функционального состояния организма, реализованный спектрометром «Skin-AGE», предназначенным для проведения флуоресцентно-отражательных медико-биологических исследований (Kang Uk; Папаян Г.В., Березин В.Б., Петрищев Н.Н., Галагудза М.М. Спектрометр для флуоресцентно-отражательных биомедицинских исследований. Оптический журнал. 2013. Т. 80.. №1. С. 32-38).
Этот способ является наиболее близким к заявляемому изобретению и может служить в качестве прототипа. Он заключается в освещении кожи возбуждающим излучением от осветителя, генерирующего излучение в ближней ультрафиолетовой области с центральной длиной волны 365 нм, измерении спектрометром сигналов, вызванных вторичным излучением кожи, в двух спектральных участках, из которых первый участок выбирается в области возбуждения, а второй - в области флуоресцентной эмиссии кожи, и последующем расчете параметра автофлуоресценции, являющегося функцией двух указанных сигналов. Способ реализуется при регулярном, в течение длительного времени, эпизодическом измерении автофлуоресцентных свойств кожи определенной локализации.
Недостаток известного способа состоит в том, что такая оценка возможна только при выполнении длительных измерений, когда можно установить значения индивидуальной нормы. Она может существенно различаться у разных людей, поскольку на сигнал флуоресценции влияет не только NADH, но и свечение других веществ. При исследовании кожи это, прежде всего, AGE, кератин, коллаген, спектры возбуждения и эмиссии которых находятся в тех же областях длин волн, что и у NADH. Такое перекрытие затрудняет однозначную трактовку результатов при оценке функционального статуса известными способами. Например, более высокое значение AФ у данного человека по сравнению со средними нормальными значениями может быть связано как с состоянием гипоксии в данный момент времени, так и с повышенным содержанием AGE, которое может быть вызвано долговременным воздействием различных неблагоприятных факторов.
Задачей настоящего изобретения является повышение достоверности оценки толерантности к физической нагрузке и возможность ее мониторинга путем измерения NADH-флуоресценции кожи, отражающей окислительно-восстановительное состояние организма в норме, при различных патологиях и при различных видах экстремальной деятельности человека, а также сокращение времени оценки толерантности к физической нагрузке за счет применения дифференциального принципа измерения и расширение функциональных возможностей.
Выполнение поставленной задачи достигается тем, что в способе оценки толерантности к физической нагрузке путем измерения автофлуоресцентных свойств кожи, включающем в себя освещение кожи возбуждающим излучением, измерение с помощью спектрометра сигналов, вызванных вторичным излучением кожи, в двух спектральных участках, из которых первый участок выбирается в области возбуждения, а второй - в области флуоресцентной эмиссии NADH, расчет параметра автофлуоресценции AF в соответствии с формулой:
m
x
0.85
AF=F(λ)/R(λ),
x
где R(λ) - сигнал, полученный из первого спектрального участка,
m
F(λ) - сигнал, полученный из второго спектрального участка,
согласно изобретению упомянутое измерение сигналов производят в симметричных зонах правой и левой области тела в исходном состоянии организма человека, после чего на организм человека воздействуют нагрузочной пробой и проводят измерения сигналов в тех же участках кожи, определяют индекс функционального статуса (ИФС) по формуле:
0/
p
ИФС=AFAF,
o
где AF - параметр автофлуоресценции до воздействия нагрузочной пробы,
p
AF - параметр автофлуоресценции после воздействия нагрузочной пробы,
p
o
причем используют значение AF, максимально отличающееся от AF, и по полученной величине ИФС оценивают толерантность к физической нагрузке.
Заявляемый способ оценки толерантности к физической нагрузке путем измерения автофлуоресцентных свойств кожи отличается от прототипа тем, что он основан на измерении AФ кожи (АФК), не зависящей от вариации флуорофоров, которые не участвуют в процессе биологического окисления. Это достигается за счет использования дифференциального принципа измерения, при котором отслеживают только изменения АФ, связанные с изменением концентрации NADH. Изменения можно стимулировать различными нагрузочными пробами.
Известно, что на состояние окислительно-восстановительного метаболизма организма можно влиять различными факторами: физической нагрузкой, ортостатической пробой, дыхательной пробой, электромагнитным излучением, воздействием в акупунктурных точках, гидровоздействием, температурным воздействием, медикаментозным воздействием и др. Влияние некоторых из них на АФ было проверено экспериментально. В приводимых ниже примерах показано такое воздействие.
В результате проведенных исследований способа оценки толерантности к физической нагрузке путем измерения автофлуоресцентных свойств кожи, можно сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение обеспечивает достижение поставленной задачи, выражающейся в повышении достоверности оценки толерантности к физической нагрузке и возможности ее мониторинга, а также в сокращении времени оценки толерантности к физической нагрузке и расширении функциональных возможностей.
Заявляемое изобретение является новым, не известным в практике медико-биологических исследований, а совокупность отличительных признаков не следует из уровня техники. Изобретение является применимым из-за простоты методики измерения и. возможности использования существующих устройств.
Предлагаемое изобретение поясняется чертежами, где
на фиг. 1- представлен график ИФС у спортсменов на разных этапах эксперимента в первый день тестирования;
на фиг. 2 - график ИФС у спортсменов на разных этапах эксперимента через неделю после первого тестирования;
на фиг. 3 - график ИФС при физической нагрузке у здоровых испытуемых и у пациентов с сердечной недостаточностью (пунктирные кривые);
на фиг. 4 - график связи между ИФС и объемом поглощенного кислорода в ходе выполнения нагрузочной пробы;
Способ осуществляется следующим образом.
x
x
m
m
В качестве прибора для проведения флуоресцентно-отражательных измерений может быть использован, например, волоконный спектрометр «Skin-AGE», в котором для возбуждения флуоресценции используется длина волны 365 нм, которая подходит для возбуждения NADH. Благодаря наличию в приборе волоконного щупа место измерений кожи может быть произвольным. Оно выбирается исходя из задачи исследования, удобства измерения и однородности кожи. В частности, для оценки толерантности к физической нагрузке, измерения могут проводиться на удобной для врача и пациента медиальной поверхности кожи плеча, которая обладает минимальной волосистостью. Проводится измерение сигнала R(λ) из первого спектрального участка λ, расположенного в области возбуждения флуоресценции и сигнала F(λ) из второго спектрального участка λ, расположенного в области флуоресцентной эмиссии NADH. Для устранения влияния разброса показаний в различных точках выбранного участка кожи производится усреднение сигналов при его сканировании щупом. По полученным сигналам рассчитывают параметр автофлуоресценции AF по формуле:
m
x
0.85
AF=F(λ)/R(λ)           (1)
x
где R(λ) - сигнал, полученный из первого спектрального участка,
m
F(λ) - сигнал, полученный из второго спектрального участка,
а для учета возможности асимметричной реакции организма на нагрузку проводятся парные измерения в участках, которые выбираются в симметричных зонах правой и левой области тела. Для учета влияния изменений сигналов с течением времени проводятся многократные измерения в одних и тех же участках кожи.
o
p.
p
p
o
o
p
После проведенных измерений в исходном состоянии и определения по формуле (1) параметра исходной автофлуоресценции AF, организм человека подвергают воздействию нагрузочной пробы и проводят измерения сигналов в тех же участках кожи. Вычисляют по той же формуле (1) параметр автофлуоресценции после нагрузочной пробы AFВ результате воздействия могут быть получены различные значения AF справа и слева. При расчете ИФС используют значение AF, максимально отличающееся от AF. По полученным величинам AF и AF по формуле:
0
p
ИФС=AF/Af (2)
o
где AF - параметр автофлуоресценции до воздействия нагрузочной пробы,
p
AF - параметр автофлуоресценции после воздействия нагрузочной пробы,
определяют индекс функционального статуса (ИФС), по величине которого оценивают толерантности к физической нагрузке.
x
m
Способ иллюстрируется примерами проведенных исследований по воздействию различных нагрузок на испытуемых, обладающих различной физической кондицией. Исследования проводились с помощью волоконного спектрометра «Skin-AGE». Место измерений - участок диаметром 20-30 мм на медиальной поверхности кожи плеча. Число измерений - 10 (5 на левой руке, 5 на правой руке), в строго фиксированных участках, которые выбирались, в симметричных зонах правой и левой области тела. Продолжительность одного измерения 0,5 секунды. Выходной параметр AF рассчитывался по формуле (2) на длинах волн λ=380 нм и λ,=440 нм и усреднялся по всем пяти замерам на каждой стороне.
Пример 1. Оценка функционального статуса спортсменов в ходе выполнения физической нагрузки
Контингент обследованных был представлен двумя группами спортсменов: 1) спортсмены-борцы (n=5), 2) спортсмены-легкоатлеты (n=5). Средний возраст испытуемых составил 21±1 год. Измерения функционального состояния спортсменов выполнялись в исходном состоянии (6-7 февраля 2013 г. ), а также через неделю (14 февраля 2013 г. ).
Протокол выполнения нагрузки включал следующие временные периоды:
1) Тест 1 (вело). Выполняется на велоэргометре в течение 30 секунд при предельно возможной для данного человека интенсивности.
2) Отдых 1. Выполняется в течение 30 мин после окончания нагрузки «вело».
3) Отдых 2. Выполняется в течение 2-4 часов.
4) Тест 2 (тредмилл). Выполняется на беговой дорожке в течение 20-25 минут со ступенчатым увеличением скорости примерно от 5 км/час до 15 км/час. Последняя 10 ступень продолжается столько времени, сколько выдерживает спортсмен.
5) Отдых 3. Выполняется в течение 30 мин после окончания нагрузки на тредмилле.
Результаты измерений АФ в исходном состоянии и в различные моменты тестовых испытаний представлены на Фиг. 1. При анализе полученных данных обращает на себя внимание следующее. После окончания кратковременной предельной нагрузки на велоэргометре наблюдается эффект «гиперкомпенсации», при котором ИФС в среднем составляет 103%. Отдых 1 в течение 30 минут после велоэргометра приводит к эффекту «утомления», при котором наблюдается падение ИФС в среднем до 96%. Отдых 2 в течение 2-4 часов после велоэргометра сопровождается практически полной компенсацией эффекта «утомления» Длительная нагрузка на беговой дорожке, которая сопровождается переходом от аэробного характера нагрузки к анаэробному, дает более значительный эффект «гиперкомпенсации» (ИФС повышается в среднем до уровня 109%).
Отдых 3 в течение 30 минут после беговой дорожки не приводит к эффекту «утомления» - АФ возвращается к уровню, который имел место до нагрузки на беговой дорожке. Индивидуальные различия в эффекте «гиперкомпенсации» при нагрузке на беговой дорожке в данном исследовании доходили до 30%. Так, наибольший эффект (повышение ИФС до 128%) имел место у испытуемого А. (самбо) и отсутствовал полностью (ИФС 98%) у испытуемого К. (лыжные гонки).
Результаты измерения ИФС через неделю после исходного тестирования по той же схеме представлены на Фиг. 2. В данном случае наблюдались те же закономерности, что и при исходном тестировании.
Однако у одного из испытуемых реакция была атипичной, а именно, отмечалось существенное непрерывное падение ИФС на всех этапах эксперимента, в особенности непосредственно после выполнения велоэргометрической пробы. При этом его самочувствие было плохим.
Таким образом, результаты проведенных измерений ИФС при различных видах физической нагрузки можно подытожить следующим образом. Во-первых, на группе обследованных спортсменов подтвержден ранее обнаруженный эффект корреляции показателей АФ кожи с физиологическим состоянием организма. Изменение АФ кожи при физических нагрузках объясняется изменением степени ее оксигенации. Обнаружено новое явление - эффект «гиперкомпенсации» - которое состоит в кратковременном увеличении степени оксигенации в период наиболее интенсивной нагрузки. Можно предположить, что этот эффект имеет место только у хорошо тренированных людей. Для подтверждения этой гипотезы должна быть оценена реакция на длительные нагрузки у нетренированных индивидуумов и у людей со сниженной толерантностью к физической нагрузке. Ранее наблюдавшийся эффект «утомления» проявляется и у спортсменов, но только после кратковременной предельной нагрузки.
Пример 2. Оценка функционального статуса у здоровых испытуемых и у пациентов с сердечной недостаточностью в ходе выполнения физической нагрузки
Нагрузка выполнялась испытуемыми на тредмилле и включала движение с начальной скоростью движения дорожки 5 км/ч при уровне подъема 0 ед. (в единицах тредмила) в течение первых 2-х минут. Каждые последующие 2 минуты осуществлялось увеличение нагрузки (скорость увеличивается на 1.6 км/ч). Работа выполняется до достижения субмаксимальной частоты сердечных сокращений. Регистрировали следующие параметры:
2
1. VOpeak (мл/мин)
2
2. VOpeak (мл/кг/мин)
2
3. VOpeak (% от должных максимальных величин)
2
4. Соотношение O/HRpeak
2
5. Соотношение O/HRpeak (% от должных максимальных величин)
6. VE на пике нагрузки (л/мин)
7. Дыхательный резерв (BR), %
2
8. VE/VCO покоя
2
9. VE/VCO на пике нагрузки
10. Объем поглощенного кислорода (% от МДВ)
Испытуемые были разделены на две группы: 1) практически здоровые молодые люди (n=6) в возрасте от 20 до 34 лет, 2) пациенты с кардиомиопатией и сердечной недостаточностью II-III функционального класса (n=2).
Результаты измерений параметров, характеризующих толерантность испытуемых обеих групп к физической нагрузке, даны в таблице. Из таблицы следует, что пациенты с сердечной недостаточностью были достоверно менее устойчивы к нагрузке, что подтверждается значимо меньшим значением пикового потребления кислорода.
Таблица. Показатели толерантности к физической нагрузке при выполнении тредмилл-теста у испытуемых
Результаты измерения ИФС у испытуемых обеих групп представлены на Фиг. 3.
Реакция на нагрузку оказалась различной в норме и патологии. Степень изменений после нагрузки различна для правой и левой руки. У подавляющего большинства экстремальные изменения были зафиксированы на правой руке и только у одного из кардиологических больных на левой руке.
У кардиологических больных (пунктирные кривые на Фиг. 3) ИФС составляло 91-97% (ср), 90-93% (экстр), причем у больного, готовящегося к операции, степень падения было наибольшей. У практически здоровых испытуемых ИФС наоборот увеличивается - 103-120% (ср), 106-125% (экстр).
Корреляционная зависимость между ИФС и объемом поглощенного кислорода приведена на Фиг. 4. Из нее следует, что функциональный статус хорошо коррелирует с таким показателем, как объем поглощенного кислорода, что позволяет рассматривать ИФС в качестве чувствительного маркера, определяющего объем резервных возможностей организма и, следовательно, максимально достижимый спортивный результат.
Приведенные примеры экспериментальных исследований показывают, что динамика АФ кожи при проведении нагрузочного тестирования четко коррелирует с резервными возможностями организма и его толерантностью к физической нагрузке. Корреляция наблюдается между уровнем АФ и большинством показателей, характеризующих устойчивость организма к физической работе. У лиц со сниженной толерантностью к нагрузке (сердечная недостаточность) наблюдалось падение ИФС, тогда как у практически здоровых людей и у спортсменов отмечалось повышение ИФС. Степень повышения ИФС при выполнении стандартного нагрузочного теста может являться скрининговым методом для отбора спортсменов, обладающих в данный момент времени максимальными показателями физической трудоспособности.
Способ оценки толерантности к физической нагрузке может использоваться для мониторинга не только при нормальных и экстремальных условиях деятельности человека, но также для выявления скрытой патологии и в процессе ее лечения, с целью контроля эффективности различных процедур, направленных на улучшение самочувствия и повышение физической работоспособности. Кроме того, способ может использоваться также для экспресс-оценки эффективности средств коррекции. Так, например, повторное нагрузочное тестирование со стандартной мощностью нагрузки до и после применения средства коррекции функционального статуса может указать на эффективность использованного метода коррекции и его безопасность. С учетом этих данных может производиться ускоренный выбор индивидуальных методов, средств и доз коррекции функционального состояния спортсмена.
Таким образом, заявляемое изобретение обеспечивает достижение поставленной задачи, а именно повышает достоверность и сокращает время оценки функционального состояния организма человека, а также расширяет функциональные возможности способа.