БИОРЕАКТОР
BIOREACTOR

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано в клеточной биологии, молекулярной биологии, хирургии для создания тканеинженерного органа.
Трансплантация органов является эффективным методом лечения пациентов, страдающих заболеваниями в терминальной стадии. К сожалению, она связана с постоянным недостатком донорских органов, необходимостью пожизненной иммуносупрессивной терапии, имеет высокий процент смертности, а также по этическим соображениям пересадка органов не проводится во многих странах [Fuchs J.R. et al., 2001]. Это вызывает потребность в новых, не требующих иммуносупрессии методах лечения для восстановления или замещения поврежденных органов и тканей, что позволит избежать сложностей, связанных с аллогенной трансплантацией. Многообещающей стратегией в репарации или замещении поврежденных органов и тканей является тканевая инженерия [Ott et al., 2008]. На сегодняшний день уже существует ряд примеров применения биоинженерных тканей и органов в клинической практике [Dohmen et al., 2011, Atala et al., 2006, Raya-Rivera et al., 2011, Macchiarini et al., 2008, Biancosino et al., 2006, Zehr et al., 2005, Cebotari et al., 2006, Brewer et al., 2011], а также множество экспериментальных примеров [Ott et al., 2011]. Тканевая инженерия может стать альтернативным способом лечения и органов с нарушенными функциями. Она требует ряда ключевых компонентов, включая, но не ограничиваясь перечисленными ниже: каркасы или матриксы (биологические или искусственные), клетки (ауто-, алло-, ксеногенные), биореактор и биоактивные молекулы [Langer R. Et al., 1999]. Одним из определяющих компонентов является устройство (биореактор), которое разнонаправленно можно было бы использовать как для получения естественного каркаса (полученного при децеллюляризации - процессе, направленном на удаление клеток с сохранением внеклеточного матрикса и трехмерности структуры органа различными методами), так и для проведения последующей рецеллюляризации, т.е. засеивания тканеинженерного каркаса клетками реципиента. Важным свойством такого устройства является точное воспроизведение физиологических параметров определенной ткани или органа, возможность размножения клеток в биореакторе со специальными условиями культивирования.
В частности, известен ферментер [Виестур У.Э. Культивирование микроорганизмов / У.Э. Виестур, М.Ж. Кристапсонс, Е.С. Былинкина. - М.: Пищевая промышленность, 1980. - 142 с.], который представляет собой сложноустроенный аппарат или даже сооружение, основной целью которого является создание оптимальных условий для развития определенных клеток и микроорганизмов. Ферментер состоит из емкости с крышкой, снабженной расположенной в ней циркуляционной трубой с раструбом, насосом и патрубками для протока воздуха и рабочей жидкости, укрепленными в раструбе отбойными пластинами.
Такие камеры используют во многих видах деятельности: от производства кисломолочной продукции до фармакологии и медицинских исследований.
Термин «ферментер» или «система ферментера» относится, в общем, к устройству, которое можно применять для аэробного или анаэробного культивирования клеток. Данная система может содержать, по меньшей мере, один резервуар ферментера, который можно герметично закрывать таким образом, что содержимое резервуара изолировано от среды снаружи системы, что исключает загрязнение определенной клеточной культуры, выращиваемой в системе ферментера. Резервуар содержит несколько впускных узлов или выпускных узлов, ведущих в/из резервуара, которые служат для подсоединения патрубков и трубопроводов для управляемого ввода и/или отведения жидкостей или газов, например компонентов питательных сред или кислорода. Данные трубы и патрубки, подсоединенные к резервуару, также входят в состав системы ферментера. Как правило, данные части чистят и стерилизуют за один этап вместе с резервуаром. Как правило, для контроля процессов внутри резервуара биореактора устанавливают смотровое отверстие. Для создания оптимальных условий предусмотрено нагревательное устройство, которое может быть выполнено в виде лампы, расположенной снаружи объема резервуара, в виде проводника, расположенного на поверхности прозрачного элемента, или в виде внутреннего нагревательного проводника, встроенного в прозрачный элемент. Нагревательные устройства могут быть использованы поочередно или группой.
Ферментер используют следующим образом: до помещения в него исходный рабочий продукт - необходимую биологическую культуру - хранят в специальных условиях, так сказать в неактивном состоянии - например замораживают. Для культивации небольшую пробу микроорганизмов наращивают в лабораторных условиях до состояния «рабочей порции» - достаточного для динамичной культивации количества. После данного асептического этапа культуру помещают в биореактор, предварительно его поверхность, воздух в камере и все соединительные отверстия стерилизуют, используя для этого водяной пар и вентиляцию. После очистки начинается этап инокуляции, когда помещенные внутрь ферментера культуры начинают активно размножаться и расти, благодаря тому, что для них создают оптимальные условия и питательную среду. Конечным продуктом подобных процессов является необходимое количество биомассы или полезные метаболиты микроорганизмов.
Недостатки:
1. Ограниченность возможностей использования ферментера, т.к. его используют для культивирования только микроорганизмов и клеток, но не целостного органа или ткани, что не позволяет применять ферментер для создания тканеинженерной конструкции.
2. Значительные объемы ферментера, что влечет за собой неоправданное использование дорогих средств - реагентов.
3. Неудобство в обслуживании: трудности замены культуральной среды, большие объемы резервуара.
За ближайший аналог принят биореактор ORCA Bioreactor Harvard Apparatus Regenerative Technology.
Биореактор состоит из:
1 - емкости для среды с поддержанием в ней постоянной температуры путем погружения нагревательных элементов в емкости теплообменника;
2 - ряда перистальтических насосов для автономного подогрева сред;
3 - камеры для размещения нативного органа;
4 - насоса-пульсатора;
5 - оксигенатора;
6 - системы коммуникационных трубок коммуникационной системы.
Используют биореактор следующим образом: в камеру помещают орган (сердце, легкие). Камера приспособлена именно к перечисленным выше органам, так как для проведения манипуляций с другими органами, например такими, как трахея, диафрагма и пищевод, конструкция не приспособлена. После помещения органа в камеру через него перфузионным методом по системе коммуникационных трубок, связанных с насосами, пропускают среды (детергенты и энзимы для децеллюляризации, либо культуральную среду с клетками при проведении рецеллюляризации). Забор жидкостей осуществляется из специальной емкости, снабженной теплообменником. Предусмотрена рециркуляция жидкости. Проходящие через орган растворы возможно насыщать газами определенных концентраций. Управление работой составляющими элементами биореактора осуществляется с помощью специализированного программного обеспечения.
Недостатки:
1. Значительный объем камеры биореактора ведет к нерациональному расходу рабочих растворов (сред).
2. Создание движущегося потока сред для отмывания биологического материала насосов-пульсаторов вызывает ударные воздействия на внеклеточный матрикс органов и тканей в биореакторе, что может дополнительно их повреждать.
3. Конструкция камеры биореактора не позволяет осуществлять оперативной замены (смены) образца.
4. Сложность конструкции камеры и трудности с ее стерилизацией (автоклавирование) в парах при высоких температурах, что вызывает в ряде случаев повреждения камеры.
5. Некачественное удаление клеточного материала из биологического плоскостного образца.
6. Трудность в управлении параметрами, при сбое программы возникает необходимость ее обновления посредством интернет-связи с центральным сервером производителя.
7. Нет возможности быстрой смены жидкостей без нарушения герметичности и стерильности системы, что снижает достоверность результатов процесса.
8. Ограниченная производительность биореактора.
Задачи: обеспечение рационального расхода рабочих сред, повышение уровня «чистоты» процесса, щадящий режим обработки биологического материала и упрощение его замены и обеспечения стерилизации, надежность организации задаваемой программы, расширение возможностей биореактора.
Сущностью предложенного изобретения является то, что в биореакторе новым является: для размещения биологического материала камера снабжена внутренней емкостью, в которой объемный образец биологического материала фиксируют на штуцере, емкость установлена на отливах стенок камеры, имеет съемную герметичную крышку с предохранительным клапаном и штуцерами для соединения с сосудами со средами, расположенными в водяной бане, а также с оксигенатором и системой дренажа отработанных сред, причем камера снабжена шейкером со смонтированной на нем с помощью стоек платформой, в фиксаторы которой могут быть вставлены одна или несколько камер, а весь комплекс конструкции обеспечен программируемым логистическим централизованным контроллером, а камера - оксигенатором с предохранительными клапанами и, кроме того, редуктором-регулятором подачи сред и электромагнитными клапанами на трубках подачи сред и предохранительными клапанами на дренажной системе под камерой биореактора.
Технический результат:
Сокращение объема внутренней емкости, непосредственно в которой происходит процесс подготовки матрицы, обеспечивает снижение расхода дорогостоящих реагентов на 40-60%; снабжение камеры дополнительной внутренней емкостью позволяет расширить возможности биореактора, т.к. в емкости, закрепленной на отливах, возможно разместить в том числе и плоскостные образцы (диафрагма, мышечный лоскут, кожу) и обеспечить лучшее смывание тканей средами. Этот режим позволяет более тщательно удалить клеточный материал при подготовке матриц. Обеспечение разнонаправленного движения среды с помощью шейкера позволяет ускорить процесс, т.е. повысить производительность биореактора, причем в процессе децеллюляризации образец не надо жестко фиксировать, что обеспечивает более равномерное и щадящее воздействие сред. Автономная подача реагентов позволяет упростить ведение процесса децеллюляризации и/или рецеллюляризации за счет раздельной установки в водяной бане сред, не нарушая стерильности системы и таким образом исключая дополнительные манипуляции.
Таким образом, использование предлагаемого биореактора позволяет повысить качество изготовления тканеинженерного органа при одновременном снижении расходов реагентов и повышении производительности биореактора.
Централизованное программное логистическое обеспечение с помощью контроллера позволяет управлять процессом в режиме on-line, не требует постоянной связи с центральным сервером производителя, обеспечивает непрерывность процесса, причем это не требует высокой квалификации специалиста (ноу-хау заявителя).
Водяная баня обеспечивает щадящий режим нагрева и поддержание задаваемой температуры, исключая локальный перегрев растворов в сосудах.
Наличие оксигенатора обеспечивает подачу в систему кислорода, углекислого газа и др. для создания оптимальных физиологических условий рецеллюляризации, а снабжение оксигенатора предохранительными клапанами позволяет обеспечить жесткую дозированную подачу соответствующих газов.
Электромагнитные предохранительные клапаны обеспечивают автоматизированное управление работой биореактора.
Фиксирование объемного образца через штуцер в герметичной крышке устраняет возможность его смещения, обеспечивая равномерную обработку.
Герметичность камеры не допускает разбрызгивания сред, исключает контаминацию и обеспечивает поддерживание «чистоты» технологии, гигиеничность и технику безопасности при работе.
В данном случае камера носит функцию защитного футляра для емкости с биологическим образцом.
Снабжение шейкера платформой также позволяет увеличить производительность биореактора за счет возможности одновременного ведения процесса разных биологических образцов.
Для лучшего понимания схема биореактора изображена на фиг.1, где:
1 - камера для размещения биологического материала;
2 - коммуникационная система;
3 - оксигенатор;
4 - перистальтический насос;
5 - водяная баня;
6 - внутренняя емкость в камере;
7 - отливы в камере;
8 - герметичная крышка;
9 - редуктор-регулятор оксигенатора;
10 - штуцеры;
11 - сосуды со средами;
12 - система дренажа отработанных сред;
13 - шейкер:
14 - платформа на стойках;
15 - фиксаторы для камер;
16 - программируемый логистический контроллер;
17 - предохранительный клапан оксигенатора;
18 - редуктор-регулятор подачи сред;
19 - электромагнитные клапаны коммуникационной системы подачи сред;
20 - предохранительный клапан дренажной системы;
21 - электромагнитный клапан дренажной системы;
22 - биологический материал в емкости.
Биореактор используют следующим образом: в емкость 6 камеры 1 помещают биологический материал 22 (сердце, диафрагма, скелетная мышца), располагая его на отливах 7 емкости. Образец фиксируют на внутренней части штуцера 10. Герметичную крышку 8 закрывают. После этого к наружной части штуцера подсоединяют трубку коммуникационной системы 2, по которой будет производиться подача сред в емкость 6. В водяной бане 5 размещают сосуды 11 со средами и подключают подогреватель, расположенный под водяной баней. В коммуникационной системе подключают электромагнитные клапаны 19 на трубках для подачи сред. Вводят в работу дренажную систему 12 для вывода отработанных сред с предохранительным клапаном 20 и электромагнитным клапаном 21. Оксигенатор 3, снабженный редуктором-регулятором 9, соединяют с емкостью 6 и трубкой, снабженной предохранительным клапаном 17. Камеры устанавливают и закрепляют фиксаторами 15 на платформе на стойках 14 и соединяют с дренажной системой отработанных сред 12. Платформу 14 устанавливают на шейкер 13. При этом постоянное разнонаправленное активное смывание образца биологического материала позволяет улучшить качество получаемого тканеинженерного органа, сократить время процедуры и объем используемых реагентов. Между трубками подачи сред и камерой устанавливают перистальтический насос 4, снабженный редуктором-регулятором 18. После этого ко всей системе подключают программируемый логистический контроллер 16. Таким образом, вся система биореактора предварительно подготовлена к работе и объединена коммуникационной системой 2. После этого подогревают теплоагент в водяной бане до необходимой t°C, погружают сосуды со средами в баню, загружают емкость образцом, закрывают крышку и последовательно подключают дренажную систему, оксигенатор, перистальтический насос и программируемый логистический контроллер. С помощью программного управления систему подключают в работу на заданное время.
Устройство апробировано в течение 3 лет на различном биологическом материале экспериментальных животных (крысах) и образцах организма человека. Результаты полностью подтвердили решаемые задачи. Получены естественные матриксы тканей и органов, с сохранным внеклеточным матриксом и отсутствием клеточных структур.
Пример:
Предварительно выполнена подготовка биореактора к работе по вышеописанной схеме. В емкость размещена диафрагма крысы. Система подключена и в течение 24 часов получен качественный каркас, состоящий из сохранного внеклеточного матрикса.