Способ дифференциации неоплазий шейки матки по липидному составу ткани
METHOD FOR DIFFERENTIATING CERVICAL NEOPLASIA BY LIPID COMPOSITION OF TISSUE

Изобретение относится к области медицины, а именно - к гинекологии, к способу оценки степени неопластической трансформации эпителия шейки матки по липидному составу ткани методами масс-спектрометрии. Может быть использовано для экспресс-анализа типа ткани при проведении операций гинекологического профиля с целью уточнения степени неопластической трансформации и риска ее малигнизации как дополнение/замена срочной гистологии.
Рак шейки матки (РШМ) является третьим по распространенности среди онкологических заболеваний органов репродуктивной системы у женщин в мире. В России у женщин репродуктивного возраста (от 20 до 45 лет) РШМ занимает второе место среди онкологических патологий, составляя 16,8%: в 2015 году наблюдалось более 170 тысяч пациентов с РШМ, а смертность составила более 6600 случаев [1]. Причем количество новых выявленных случаев постоянно увеличивается, что ставит на первое место необходимость более эффективного скрининга на ранних стадиях развития патологии при эпителиальных неоплазиях шейки матки. С другой стороны, вакцины против ВПЧ могут значительно снизить частоту заражения высокоонкогенными типами (вр) ВПЧ, основного возбудителя рака шейки матки [2]. Несмотря на достижения в области вакцинации против ВПЧ, эти вакцины не охватывают все типы врВПЧ и менее эффективны у женщин, ранее инфицированных ВПЧ. Более того, осторожный мониторинг программ вакцинации также требует точных методов обнаружения.
Постепенное развитие рака шейки матки (от 1 до 10 лет) через нескольких предраковых стадий (цервикальная интраэпителиальная неоплазия легкой степени LSIL, цервикальная интраэпителиальная неоплазия умеренной и тяжелой степени HSIL) и относительная легкость, с которой можно предотвратить опухоль на ранних стадиях, высокая распространенность неопластических трансформаций ШМ (более 40 млн выявленных случаев в мире) обусловливает необходимость скрининга при профилактических осмотрах [3]. Программы скрининга рака шейки матки, как правило, основаны на обнаружении врВПЧ по анализам на вирусную ДНК (РНК) и на обнаружении цитологических и/или молекулярных изменений в клетках эпителия с помощью различных методов окрашивания, таких как мазок Папаниколау. Недостатком таких диагностических методов является высокий процент ложноотрицательных результатов, а также невозможность определения риска малигнизации процесса. Результатом является зачастую неоправданно большое количество исследований и лечение женщин с клинически нерелевантными инфекциями врВПЧ и банальным цервицитом, что увеличивает затраты и возможный вред, причиняемый лечением. С другой стороны, недостаточно радикальное лечение пациентов с высоким риском злокачественной трансформации может иметь очень тяжелые последствия.
При прогрессировании неопластического процесса изменяется как транскриптом клетки, так и метаболические процессы, то есть меняется как спектр белков в клетке, так и уровень синтеза низкомолекулярных веществ, в частности, липидов [4; 5]. Липиды играют ключевую роль в поддержании физиологического баланса между процессами пролиферации и апоптоза, нарушенного в атипических клетках эпителия ШМ [6]. Изменения процентного содержания различных фосфатидилхолинов и сфингомиелинов в клеточной мембране приводит к терминации апоптотических сигнальных путей и неограниченному делению клеток, а также повышению способности к миграции и инвазии, то есть развитию онкологического процесса [7].
Таким образом, необходимы дополнительные тесты на базе современных высокоточных методов, в частности, масс-спектрометрии, чтобы обеспечить объективную и воспроизводимую основу для отбора пациентов с клинически значимым заболеванием. Вследствие недостаточной диагностической значимости одного биомаркера необходима разработка панели биомаркеров и на ее основе комплексного классификатора, который позволит различать состояния неоплазий шейки матки с хорошей клинической чувствительностью и специфичностью, а также давать точный прогноз вероятности дальнейшей трансформации эпителия шейки матки. Липидомный анализ тканей эпителия шейки матки методами масс-спектрометрии может служить основой для новых, высокоточных и специфичных методов дифференциальной диагностики. Масс-спектрометрические подходы для определения изменений липидома тканей объединяет быстрота получения результатов, быстрая пробоподготовка и снижение влияния внешних параметров эксперимента, таких как размер и форма образца ткани. Получаемые в результате характеристические масс-спектры, называемые также "отпечатки пальцев" (fingerprints), позволяют создать классификационную модель для отнесения данной конкретной ткани к определенной степени трансформации эпителия ШМ, а также определения риска дальнейшего прогрессирования процесса [8-10]. Внедрение предлагаемого метода в практическое здравоохранение позволит создать персонифицированные алгоритмы обследования и ведения пациенток с неопластической трансформацией эпителия шейки матки, направленных на профилактику злокачественной трансформации тканей, что особенно актуально при гиперплазиях эпителия ШМ у женщин репродуктивного возраста.
В качестве прототипа предлагаемого метода взят способ, описанный в [11], согласно которому методом HILIC-HPLC/ESI-MS органического экстракта тканей молочной железы продемонстрирована возможность классификации тканей различных видов опухоли молочной железы. На 10 образцах была разработана методология сравнительного липидомного анализа тканей опухоли и окружающей нормальной ткани, позволяющая идентифицировать панели липидов, специфичные именно для опухолевого процесса. В результате, были идентифицированы некоторые характерные липиды для опухоли молочной железы, включающей фосфатидилинозитолы, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилхолины и лизофосфатидилхолины. Методами классификационного анализа (PCA и OPLS) было достигнуто достоверное разделение опухолевых и нормальных образцов. Недостатком данной работы является очень малая выборка образцов (несколько образцов для каждого типа опухоли), что не позволяет предложить какой-либо воспроизводимый подход для дифференциации патологической ткани от здоровой. Кроме того, авторы рассматривали только различные формы рака молочной железы, а подобные работы для РШМ не проводились. Кроме того, разработанный авторами подход медленнее, чем предлагаемый в изобретении: анализ методом HILIC-HPLC/ESI-MS занимает около 30 минут, а прямой ввод органического экстракта ESI-MS - около 3 минут, что особенно актуально для принятия быстрого решения при оперативных вмешательствах.
Задачей, решаемой изобретением, является способ дифференциации неоплазий шейки матки по липидному составу ткани, отличающийся тем, что методом масс-спектрометрии определяют липидный профиль ткани, с помощью метода OPLS-DA и с использованием OPLS модели, построенной на основании уровней следующих липидов: фосфатидилхолины (PC 32:0, PC 34:1, PC 36:4, PC 34:0, PC 38:4), этаноламины (РЕ O-46:0, LPE 46:0, РЕ O-48:0, LPE 48:0, РЕ O-46:1) и сфингомиелины (SM 34:0, SM 42:2), - рассчитывают оценочный параметр (ОП); при значении ОП<-0,5 делают заключение о том, что ткань соответствует эпителию ШМ с хроническим цервицитом; при значении -0,5<ОП<0 делают заключение о том, что ткань соответствует эпителию ШМ с LSIL; при значении 0<ОП<1 делают заключение о том, что ткань соответствует эпителию ШМ с HSIL; при значении ОП>1 делают заключение о том, что ткань соответствует эпителию ШМ с РШМ.
Поставленная задача решается предлагаемым способом, состоящим в подготовке экстракта липидов ткани модифицированным методом Фолча, получении масс-спектров высокого разрешения методом электрораспыления ESI в режиме положительных ионов на коммерческом масс-спектрометре с разрешением более 10000 и точностью определения массы не хуже, чем 5-10 ppm, проведении многомерного анализа данных методом дискриминантного анализа ортогональных проекций на скрытые структуры (OPLS-DA) с последующей группировкой пиков на основе информации об интенсивности пиков масс-спектра каждого образца ткани с предварительным масштабированием по Парето, оценке вариабельности пиков, позволивших дифференцировать различные ткани, согласно результатам OPLS-DA метода, построении статистической классификационной OPLS-DA модели выделением нескольких компонент, позволяющих отличить эпителий с различной степенью неопластического процесса, оценку чувствительности и специфичности данной классификационной модели, а также ожидаемой точности классификации новых данных для определения диагностической ценности модели, анализ важности вклада независимых переменных в проекции (VIP), полученные в OPLS-DA моделях для выявления компонент, наиболее существенных для создания фенотипической классификации в исследовании, идентификации этих компонентов в соответствии с их точными массами и МС/МС спектрами. Построение OPLS-DA модели осуществляется следующим способом:
(1) Методом РСА рассчитывается А главных компонент матрицы ковариаций размером m×р
РСА
где Т - m х А матрица счетов, a W - р х А матрица нагрузок с ортонормальными столбцами.
(2) Рассчитывается n х А матрица предсказательных счетов Т=XW, которые являются координатам строк X по отношению к ортонормальному базису W.
(3) Рассчитывается n х р матрица остатков
orth
xy
T
(4) Рассчитывается w - наиболее существенное значение нагрузки РСА(TE).
(5) Из X последовательно удаляется структурированный шум
(6) Для получения дополнительных ортогональных компонентов повторить шаги (4), (5).
(7) Построить PLS модель из Y и отфильтрованной X.
(n+1)
(8) Чтобы классифицировать новый образец, х, сначала необходимо отфильтровать ортогональные компоненты вариации, а затем расчитать оценочный параметр (ОП)
где
Важно заметить, что большинство из выявленных данным методом веществ являются липидами и определение различий в их экспрессии является достаточным, чтобы дифференцировать эпителий шейки матки с различной степенью трансформации.
На Фиг. 1 показана схема предлагаемого способа: получение масс-спектров липидных экстрактов тканей после взятия биопсии для последующего статистического классификационного анализа. Образцы, замороженные в жидком азоте непосредственно после операции, хранятся при -75°С. Для масс-спектрометрического анализа замороженный биопсийный образец измельчается в жидком азоте, из него выделяются липиды по модифицированному методу Фолча. В источнике ионов в режиме электроспрея ESI с положительной модой образуются ионы веществ, присутствующих в органическом экстракте ткани (в основном, липиды). Получившиеся в результате описанного процесса положительные ионы, попадают в масс-спектрометр, который выдает масс-спектр, характерный для данной ткани.
На Фиг. 2 приведены примеры масс-спектров эпителия шейки матки одного пациента, зарегистрированных в режиме положительных ионов: (а) цервикальная интраэпителиальная неоплазия средней и тяжелой степени HSIL; (б) окружающая нормальная ткань. Более 1200 ионов в образце детектируются при выбранном пороге интенсивности равном 200 условных единиц. Наиболее интенсивные пики соответствуют липидам.
На Фиг. 3 приведены примеры масс-спектров образцов патологически измененного эпителия, зарегистрированных в режиме положительных ионов: (а) цервикальная интраэпителиальная неоплазия легкой степени LSIL; (б) цервикальная интраэпителиальная неоплазия умеренной и тяжелой степени HSIL; (в) рак шейки матки. Более 1300 ионов в образце детектируются при выбранном пороге интенсивности равном 200 условных единиц. Наиболее интенсивные пики соответствуют липидам.
2
2
На Фиг. 4 приведены графики счетов, построенные по результатам OPLS-DA анализа масс-спектрометрических данных по относительной интенсивности ионов, зарегистрированных в режиме положительных ионов патологической и пограничной тканей от пациенток с а) хроническим цервицитом (в сочетании с ВПЧ-инфекцией); б) LSIL; в) HSIL; г) РШМ. Статистическая модель OPLS-DA характеризуется значениями R и Q для группы с цервицитом (в сочетании с ВПЧ-инфекцией) 0.8130 и 0.784; для группы с LSIL 0.694 и 0.620; для группы с HSIL 0.553 и 0.386; для группы РШМ 0.673 и 0.575. Второй параметр свидетельствует о хорошей прогнозирующую способность для классификации ткани в случаях отделения патологически измененного эпителия шейки матки от окружающей нормальной ткани.
На Фиг. 5 приведены графики счетов OPLS-DA анализа, построенные согласно МС данным по относительной интенсивности ионов, зарегистрированных в режиме положительных ионов, для образцов эпителия шейки матки при различных гистологических диагнозах для дифференциации а) пограничных тканей; б) патологически измененных тканей эпителия ШМ. Данные модели демонстрирует высокую точность дифференцировки различных типов неопластического процесса в эпителии ШМ.
Способ был реализован на масс-спектрометре Maxis Impact qTOF (Bruker Daltonics, Бремен, Германия), который имеет типичный для современных масс-спектрометров входной интерфейс для работы с источниками ионизации при атмосферном давлении, в частности электроспрейного источника ESI. Экстракты липидов получали модифицированным методом Фолча: к гомогенату добавляется 4 мл смеси хлороформ-метанол 2:1, об/об; смесь инкубируется 10 мин, фильтруется, добавляется 800 мкл водного раствора NaCl, 1 моль/л, центрифугируется при 3000 об/мин 5 минут при комнатной температуре; органический нижний слой, содержащий липиды, высушивается в потоке азота и перерастворяется в смеси ацетонитрил-2-пропанол, 1:1, об/об. Для стабильного электрораспыления липидного экстракта ткани необходимо установить оптимальные параметры, которые зависят от модели прибора. В случае масс-спектрометра Maxis Impact использовались следующие параметры: напряжение на капилляре 4.1 кВ, давление распыляющего газа 0.7 бар, скорость потока осушающего газа 6 л/мин, температура осушающего газа 200°С. Сигнал записывается в течение 3 минут после выравнивания общего ионного тока (TIC). Схема МС анализа следующая: регистрация масс-спектров положительных ионов в течение 3 минут; 3 минуты анализа с помощью тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) для дальнейшей идентификации ионов. Масс-спектры регистрируются с частотой 2 Гц, то есть 360 спектров за 3 минуты. Диапазон масс m/z 400-1000. Тандемная МС проводится методом результат-зависимого анализа - DDA - со следующими параметрами: три наиболее интенсивных пика выбираются после полного сканирования всего диапазона масс и подвергаются фрагментации посредством столкновительной диссоциации с энергией 35 эВ, время исключения иона из анализа составило 1 минуту. Возможность реализации заявляемого метода с получением заявленного технического результата иллюстрируют нижеследующие примеры анализа тканей для демонстрации воспроизводимости метода, возможности дифференциации неопластических изменений в эпителии шейки матки, идентификации возможных маркерных веществ для классификации типа ткани, сравнение с классическими рутинными методами анализа тканей.
В качестве ПРИМЕРА 1, демонстрирующего воспроизводимость метода получения масс-спектров тканей на Фиг. 2 приведены масс-спектры липидного экстракта патологической и пограничной тканей от пациентки с LSIL в сочетании с ВПЧ в положительной моде. Обнаруживается воспроизводимая разница в распределении относительной интенсивности пиков. Относительное стандартное отклонение интенсивности пика составляет менее 5% для одного куска ткани и около 5-10% для близлежащих кусков ткани одного типа.
В качестве ПРИМЕРА 2, демонстрирующего возможности работы метода для дифференциации образцов биологических тканей, приведены масс-спектры эпителия шейки матки при неопластической трансформации различной степени тяжести (Фиг. 3), полученные после прицельной биопсии шейки матки у женщин с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями в поликлиническом отделении ФГБУ «НМИЦАГиП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ на масс-спектрометре Maxis Impact qTOF (BrukerDaltonics, Bremen, Germany), c использованием предлагаемого метода. Дифференциация тканей и идентификация возможных маркерных молекул опирается, в том числе, на спектры тандемной масс-спектрометрии, полученные при столкновительной диссоциации ионов в автоматическом режиме, что делает существенным стабильный ионный ток (здесь более 10 минут), получаемый при соответствующих оптимальных параметрах электроспрея ESI.
В качестве ПРИМЕРА 3 для демонстрации возможности предлагаемого метода приведена Фиг. 4 со списком идентифицированных липидов, полученная путем обработки масс-спектров положительных ионов, аналогичных представленным на Фиг. 2.
В качестве ПРИМЕРА 4 показана возможность дифференциации тканей эпителия шейки матки по признаку норма-патология на основании липидного состава. Для выявления изменений липидного профиля при неопластической трансформации эпителия сравнивалась патологически измененная и пограничная ткани эпителия шейки матки: при хроническом цервиците в сочетании с ВПЧ-инфекцией в качестве патологической анализировалась ткань с воспалением и койлоцитозом, в случаях LSIL и HSIL- неопластически измененная ткань с койлоцитоатипией и дискариозом, в случае РШМ - биоптат опухоли. В результате построения OPLS-DA модели для МС данных, полученных в режиме положительных ионов (Фиг. 5), были выделены две главные компоненты и разработан оценочный параметр (ОП); при значении ОП<-0,5 делают заключение о том, что ткань соответствует эпителию ШМ с хроническим цервицитом; при значении -0,5<ОП<0 делают заключение о том, что ткань соответствует эпителию ШМ с LSIL; при значении 0<ОП<1 делают заключение о том, что ткань соответствует эпителию ШМ с HSIL; при значении ОП>1 делают заключение о том, что ткань соответствует эпителию ШМ с РШМ.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Созданная статистическая модель при анализе эпителия ШМ с хроническим цервицитом (в сочетании с ВПЧ-инфекцией) и пограничной нормальной ткани позволяет описать 0.813 данных с использованием латентных переменных (R). По результатам перекрестной проверки значение Q для модели составило 0,784. Данная величина показывает ожидаемую точность классификации неизвестных тканей. Значения R для групп с LSIL, HSIL и РШМ составили, соответственно 0,694; 0,553; 0,673. Величина Q в аналогичном ряду менялась следующим образом: 0,620; 0,386; 0,575. Полученные значения R и Q разработанных моделей дифференциации тканей эпителия шейки матки по признаку норма-патология на основании липидного состава подтверждают высокую значимость и диагностическую ценность данных моделей. Наибольшие значения R и Q наблюдаются в группе с цервицитом (в сочетании с ВПЧ-инфекцией), что связано, по всей видимости, не столько с более значительными, по сравнению с другими группами, различиями липидома клеток, пораженных ВПЧ и прилежащих к ним нормальных клеток, сколько со сложностью получения здоровых пограничных тканей без примеси неопластически трансформированных клеток для групп LSIL, HSIL и РШМ. Некоторое повышение R и Q для образцов из группы с РШМ по сравнению с LSIL и HSIL может отражать выраженное изменение молекулярного состава малигнизированных клеток.
В качестве ПРИМЕРА 5 показана возможность определения степени неопластической трансформации ткани эпителия шейки матки по изменению липидома ткани и проведено сравнение с классическими рутинным методом анализа тканей (гистология). В результате построения OPLS-DA модели для МС данных, полученных в режиме положительных ионов, были выделены две главные компоненты, позволяющие отличить друг от друга ткани эпителия шейки матки пограничные с патологической тканью (Фиг. 6а) и сами патологически измененные ткани эпителия шейки матки при хроническом цервиците, LSIL, HSIL и РШМ (Фиг. 6б). Для нормальных тканей группы точек, соответствующих цервициту, LSIL и HSIL, пересекаются друг с другом, образуя достаточно равномерный кластер, а точки, соответствующие РШМ, группируются отдельно. Этот факт предполагает значительное отличие липидного состава тканей, граничащих с опухолью, от тканей, граничащих с воспалительными и предраковыми поражениями эпителия. В случае патологически измененных тканей в отдельный кластер выделилась большая часть точек, соответствующих хроническому цервициту. Точки HSIL и РШМ занимают перекрывающиеся участки графика, что свидетельствует о схожести липидного профиля соответствующих им образцов. Обращают на себя внимание выделенные области 1-4. В области с одинаковыми номерами попали точки образцов, гистологически охарактеризованных как HSIL и LSIL и соответствующие им пограничные ткани. Однако по липидному составу как патологические, так и пограничные образцы в указанных областях ближе к РШМ. Особенно ярко это сходство выражено для образцов, точки которых лежат в областях 3, 4.
В качестве ПРИМЕРА 6 приведены данные по веществам, важным для классификации степени неопластической трансформации эпителия шейки матки. Такие вещества характеризуются наибольшими VIP значениями, полученными в результате OPLS-DA анализа МС данных, полученных в режиме положительных ионов. Такими веществами являются липиды и их окисленные формы: фосфатидилхолины (PC 32:0, PC 34:1, PC 36:4, PC 34:0, PC 38:4), этаноламины (РЕ O-46:0, LPE 46:0, РЕ O-48:0, LPE 48:0, РЕ O-46:1) и сфингомиелины (SM 34:0, SM 42:2).
Литература
1. Злокачественные новообразования в России в 2015 году (заболеваемость и смертность). Под редакцией А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. Москва, 2017 г.
2. Arbyn М., Tommasino М., Depuydt С. and Dillner J. Are 20 human papillomavirus types causing cervical cancer? J. Pathol. 2014; 234: 431-435.
3. WHO guidelines for screening and treatment of precancerous lesions for cervical cancer prevention. Geneva: WHO; 2013.
4. Zoidakis I., Lygirou V., Kontostathi G., Vlahou A., Anagnou N.P., Pappa K.I. Cofilin-1 and Cathepsin-D are putative early cervical cancer biomarkers. EUROGIN 2015 - HPV infection and related cancers. 2015.
5. Zhao Q, He Y, Wang XL, Zhang YX, Wu YM. Differentially expressed proteins among normal cervix, cervical intraepithelial neoplasia and cervical squamous cell carcinoma. Clin. Transl. Oncol. 2015; 17(8): 620-31.
6. Vouk K., Hevir N., Ribic-Pucelj M., Haarpaintner G., Scherb H., Osredkar J., et al. Discovery of phosphatidylcholines and sphingomyelins as biomarkers for ovarian endometriosis. Human Reprod. 2012; 27:2955-65.
7. Huang C., Freter C. Lipid Metabolism, Apoptosis and Cancer Therapy. Int. J. Mol. Sci. 2015; 16:924-949.
8. Chagovets, V., Kononikhin, A., Starodubtseva, N., Kostyukevich, Y., Popov, I., Frankevich, V., Nikolaev, E.: Peculiarities of data interpretation upon direct tissue analysis by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. European journal of mass spectrometry. 22, 123-126 (2016)
9. Bodzon-Kulakowska, A., Cichon, Т., Golec, A., Drabik, A., Ner, J., Suder, P.: DESI-MS as a tool for direct lipid analysis in cultured cells. Cytotechnology. 67, 1085-1091 (2015)
10. Abbassi-Ghadi, N., Jones, E.A., Gomez-Romero, M., Golf, O., Kumar, S., Huang, J., Kudo, H., Goldin, R.D., Hanna, G.B., Takats, Z.: A Comparison of DESI-MS and LC-MS for the Lipidomic Profiling of Human Cancer Tissue. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27, 255-264 (2016).
11.  El,  M,  M,  D,  J, Melichar B. Determination of lipidomic differences between human breast cancer and surrounding normal tissues using HILIC-HPLC/ESI-MS and multivariate data analysis Anal Bioanal Chem. 2015 Jan; 407(3):991-1002.
Фиг. 1. Схема получения масс-спектров липидных экстрактов тканей после биопсии для последующего статистического классификационного анализа.
Фиг. 2. Примеры масс-спектров положительных ионов образцов эпителия шейки матки: одного пациента: (а) цервикальная интраэпителиальная неоплазия умеренной и тяжелой степени HSIL; (б) окружающая нормальная ткань.
Фиг. 3. Примеры масс-спектров положительных ионов образцов образцов патологически измененного эпителия, зарегистрированных в режиме положительных ионов: (а) цервикальная интраэпителиальная неоплазия легкой степени LSIL; (б) цервикальная интраэпителиальная неоплазия умеренной и тяжелой степени HSIL; (в) рак шейки матки.
Фиг. 4. Теоретические и экспериментальные значения m/z липидов, идентифицированных в режиме положительных ионов в образце ткани с заданной точностью.
Фиг. 5. Графики счетов OPLS-DA анализа масс-спектрометрических данных, полученных в режиме положительных ионов для патологической и пограничной тканей от пациенток с а) хроническим цервицитом (в сочетании с ВПЧ-инфекцией); б) LSIL; в) HSIL; г) РШМ. Область 1 - точки соответствуют пограничным тканям, область 2 - патологическим.
Фиг. 6. Графики счетов OPLS-DA анализа масс-спектрометрических данных, полученных в режиме отрицательных ионов для образцов эпителия шейки матки при различных гистологических диагнозах для дифференциации а) пограничных тканей; б) патологически измененных тканей эпителия ШМ. Цифрами обозначены области 1-4, в которые попадают точки попарно соответствующих образцов пограничных и патологически измененных тканей.