Способ исследования воздействия компонента секретома - гранулина Opisthorchis felineus на формирование новых островков поджелудочной железы
METHOD FOR STUDYING EFFECT OF SECRETOME COMPONENT - GRANULIN OPISTHORCHIS FELINEUS ON FORMATION OF NEW ISLETS OF THE PANCREAS

Изобретение относится к медицине, в частности к клеточной биологии, цитологии и гистологии.
Актуальность заявляемого способа определяется тем, что описторхоз человека - паразитарное заболевание, вызываемое трематодой Opisthorchis felineus, является социально значимым гельминтозом в России и других странах. Описторхоз, особенно суперинвазионная форма (СО), является системным страданием с поражением многих органов и систем, что нередко приводит к снижению активности и потенциала жизни пациентов.
Описторхисы являются оригинальным фактором, запускающим продуктивные процессы, вследствие мутации многочисленных пролиферативных генов. Кроме того, установлено, что регенерация печени после частичной резекции на фоне суперинвазионного описторхоза происходит за счет активной пролиферации стволовых клеток, вследствие дифференцировки их в клетки паренхимы и стромы. При суперинвазионном описторхозе происходит инициация стволовых клеток печени с последующей дифференцировкой их по линиям различных дифферонов (холангиоцеллюлярный, гепатоцеллюлярный, фибропластический и гемопоэтический) [Хадиева Е.Д., Урузбаев P.M., Лазарев С.Д., Бычков В.Г. Пролиферативные реакции в печени и поджелудочной железе при хроническом суперинвазивном описторхозе // Актуальные вопросы патологоанатомической практики: материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Современные подходы к морфологической диагностике новообразований человека". Челябинск, 2016. - С. 117-119.].
Печень и поджелудочная железа являются органами, где длительно находятся паразиты. При суперинвазионном описторхозе они вегетируют в поджелудочной железе в 30,2-37,4% случаев. Вследствие рефлюкса содержимого 12-перстной кишки личинки паразитов в условиях дуоденальной гипертензии проникают в протоковую систему поджелудочной железы, увеличивая этот показатель до 48,1% и усиливают изменения структуры органа [Крылов Г.Г. Суперинвазионный описторхоз: пато- и морфогенез осложненных форм и микст-патологии: автореферат дис. доктора медицинских наук. Москва, 2005. - 45 с.].
При исследовании поджелудочной железы при суперинвазионной форме описторхоза чаще рассматриваются склеротические изменения головки и тела органа; данных о динамике пролиферативных реакций в железе с рассмотрением нескольких дифферонов в литературе не представлено [Начева Л.В., Беззаботнов Н.О., Кожемякин А.М. Патоморфология печени, поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки золотистых хомяков при экспериментальном описторхозе // Российский паразитологический журнал, 2012. №1. - С. 78-81.].
Техническая проблема, на решение которой направлено заявляемое изобретение - выявить дифференцировку региональных стволовых клеток и пролиферативные процессы в поджелудочной железе при суперинвазионном описторхозе.
Ожидаемый технический результат - расширение методов профилактики и коррекции обменов у лиц, страдающих сахарным диабетом за счет формирования вновь образованного эндокринного аппарата поджелудочной железы при суперинвазионном описторхозе.
Технический результат достигается тем, что в способе исследования воздействия секретома Opisthorchis felineus на формирование новых островков поджелудочной железы отбирают образцы ткани поджелудочной железы у лиц, прижизненно страдавших суперинвазионным описторхозом, фрагменты поджелудочной железы фиксируют в формалине, заливают в парафин, срезы окрашивают гематоксилином и эозином, проводят иммуногистохимическое исследование, вычисляют индекс пролиферативной активности клеток, проводят оценку количественных параметров островков поджелудочной железы с числом островков более 20 мкм в диаметре и с числом островков более 200 мкм в диаметре, высчитывают эндокриноцитарный индекс островков, получают новообразованные островки Лангерганса, площадью - 604,84-697,18 мкм2, с хаотичным расположением, скученностью до 1,4-3,05 в 1 поле зрения, с эндокриноцитарный индексом (ЭЦИ) 0,31-0,35, имеющими отсутствующую или формирующуюся капсулу.
Способ осуществляется следующим образом.
Отбирают образцы ткани поджелудочной железы у лиц, прижизненно страдавших суперинвазионным описторхозом, фрагменты поджелудочной железы фиксируют в 10% нейтральном формалине, заливают в парафин. Срезы окрашивают гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону и Маллори. Иммуногистохимическое исследование проводят с использованием маркеров Vimentin (клон - 3В4), инсулин (клон - К36аС10), Chromogranin А (клон - РНЕ5), СК7 (клон - ВА4, DakoCytomation), СК18 (клон - DC-10) и СК19 (клон - 34betaE12), CD34 (клон - QBEnd/10), CD31 (клон - JC70), CD117 (клон - YR145) и Ki-67 (клон - MIB-1, Agilent/Dako, RTU). Депарафинирование, дерегидратацию и демаскировку антигенов осуществляют при помощи буфера Dewax and HIER Buffer L (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) при pH 6,0 и температуре 95-98°С в течение 20 мин в модуле предобработки (PT-Module). Постановку иммуногистохимических реакций проводят в автоматизированном режиме с помощью иммуностейнера Autostainer 480S (Thermo Fisher ScientiHc, США). Время инкубации составляло 30 мин. Для оценки используют положительные контроли по рекомендации фирм-производителей. Интенсивность окрашивания оценивают по шкале от 0 до 3 (0 - отсутствует, 1 - слабая, 2 - умеренная, 3 - выраженная). Долю окрашенных клеток оценивают по шкале 0-100%: 1 - 1-49%; 2 - 50-89%; 3 - более 90%. Итоговый балл, определяющий выраженность иммуногистохимической реакции, формировался путем умножения интенсивности окрашивания на число прореагировавших клеток и деления полученного результата на 3. Значения итогового балла в диапазоне от 0 до 1 расценивали как показатель слабой реакции, от 1 до 2 - умеренная, от 2 до 3 - выраженная. Вычисляют индекс пролиферативной активности клеток (%) по формуле: I=n^+/N×100%, где n+- число меченых ядер, N - общее число ядер в поле зрения микроскопа. Изучение гистологических препаратов и микрофотосъемка производят на микроскопе Axio Lab.Al (производитель Carl Zeiss Microscopy, Германия) со встроенной цветной камерой Axiocam ICc 5, окуляр W-PI 10х/20 мм, объективы Achroplan: 5х/0,12, 20х/0,45, 40х/0,60, 63х/0,80 и 100х/1,25 oil с дальнейшим морфометрическим анализом. Проводят оценку количественных параметров: общее число островков (более 20 мкм в диаметре) и крупных островков (более 200 мкм). Число островков в кадре определяют в каждом случае визуально при увеличении объектива х400 в 5 произвольных полях зрения, затем высчитывают средний показатель; вычисляют индекс больших островков как соотношение их числа к общему количеству островков в кадре. Диаметр островков измеряют в программе NIH ImageJ 1.43u. Статистическую обработку материала и расчеты показателей проводят с использованием статистического пакета программ Statistica для Windows v. 10 и SPSS v.21.
Исследование поджелудочной железы проведено на 80 секционных наблюдениях. Материал собран из прозектур медицинских учреждении, расположенных на территории гиперэндемического очага (Хант-Мансийский автономный округ, Тюменская и Омская области). Сформированы следующие группы: I группа - в анамнезе суперинвазионный описторхоз, длительность инвазии более 10 лет (n-70); II группа - контрольная - лица, умершие от случайных причин (n-10). Образцы ткани железы отбирали из головки, тела и преимущественно, из хвостовой части, т.к. в этом отделе наблюдается большее количество инсулярных островков. В группах лиц с суперинвазионным описторхозом мужчин - 44, женщин - 26, соотношение 2,1/1, возраст колебался от 38 до 89 лет. В контрольной группе мужчины - 5, женщин - 5, возраст колебался от 42 до 82 лет.
Во всех наблюдениях в головке железы отмечаетя картина индуративного панкреатита с обширными разрастаниями собственно соединительной ткани. В теле органа выявлены немногочисленные островки Лангерганса, диффузный и периканаликулярный фиброзы. Склеротические изменения занимали большие поля, среди которых можно наблюдать скопление эндокринных клеток и мелких трубчатых структур (Фиг. 1). В протоках обнаруживаются паразиты, пролиферация эпителия слизистой и скопления прогениторных клеток (Фиг. 2).
Наименее измененной частью поджелудочной железы при СО является хвостовая часть. В пролиферативный процесс активно включается экзокринный дифферон, что свидетельствует экспрессия цитокератинов 7, 18, 19. Пролиферативная активность выстилки протоков наиболее выражена в головке и теле железы (14,0% и 12,0% соответственно), менее выражена в хвосте (8,0%).
При морфологическом исследовании α и β-клетки в островках Лангерганса (ОЛ) окрашивались по Маллори в соответствующие цвета, β-клетки занимали центральное положение и окружены α-клетками. Площадь ОЛ в контрольной группе составила 124,72±12,87 мкм2, они были распределены равномерно и достигали плотности до 5,17±1,08 в 10 полях зрения.
Эндокриноцитарный индекс (ЭЦИ), представляющий собой отношение плотности α-клеток к плотности β-клеток, достигал до 0,25±0,04, что соответствует параметрам в норме.
Гиперплазированные островки Лангерганса (ГОЛ) имели округлую форму, увеличены в размерах: площадь этих образований составила 362,14±28,74 мкм2, что достоверно выше в сравнении с обычными островками Лангерганса (р<0,05). ГОЛ расположены достаточно равномерно 3,21±2,01 в 10 полях зрения (Фиг. 3).
Вокруг гиперплазированных островков определялась сформированная капсула, которая при окраске по Ван-Гизону имела ярко-красный цвет, что свидетельствует о зрелости данной структуры. В этих островках определяется экспрессия хромогранина А, что подтверждает нейроэндокринную природу данных структур, а также наблюдается экспрессия глюкагона, но в большей степени инсулина (р≤0,05); α-клетки (глюкагонсодержащие) обнаруживались как на периферии островков, так и в центральной части, вблизи от капилляров (Фиг. 4). При вычислении эндокриноцитарного индекса (ЭЦИ) в этих ОЛ составлял 0,4±0,06 (p≤0,05). Важно отметить, что в гиперплазированных островка Лангерганса наблюдается экспрессия маркера CD-117, что свидетельствует о наличии стволовых клеток в предсуществующих островках. Индекс пролиферативной активности в ГОЛ составлял до 3%.
В поджелудочной железе с суперинвазионным описторхозом, наряду с гиперплазированными островками Лангерганса, наблюдаются увеличенные на 45,7% островки (площадь - 651,01±46,17 мкм2), которые располагаются достаточно хаотично, местами определяется их скученность до 2,45±1,05 в 1 поле зрения, в некоторых островках капсула полностью отсутствует, в части определяется нежный соединительнотканный каркас с небольшим количеством фибробластов (Фиг. 5, 6).
В данных структурах определяется экспрессия маркера хромогранин А, а также экспрессия рецепторов гена глюкагона и инсулина (Фиг. 7, 8). Эндокриноцитарный индекс (ЭЦИ) составляет 0,33±0,02; выявляется умеренная экспрессия маркера C-kit, что позволяет сделать вывод о том, что это не гиперплазированный островок, а именно новообразованный, т.к. именно CD117 (рецептор фактора стволовых клеток SCF-R) дает экспрессию до 2 баллов в данных структурах, что говорит о дальнейшей дифференцировке клеток в эндокриноциты. Кроме этого, вокруг данных структур формируются сосуды, которые дают экспрессию маркера CD31, индекс пролиферативной активности составляет до 11%, т.е. формирование новообразованных сосудов происходит из прогениторных клеток путем васкулогенеза. Ангиогенез - формирование сосудов из предсуществующих капилляров (пролиферация эндотелия и перицитов) менее выражен.
В результате наблюдается сформированный экзокринный аппарат и образующийся de novo из стволовых клеток под действием секретома (гранулина) Opisthorchis felineus.
Известно, что О. felineus в своем жизненном пути имеет определенную стратегию - сохранить и продолжить вид. Именно поэтому одним из главных доминантных инстинктов, который он реализует, является нутритивный рефлекс. Под действием секретома (гранулина) паразита происходит запуск пролиферации собственных стволовых клеток как в печени, так и в поджелудочной железе, которые являются - эконишами, т.е. местом его вегетирования. Кроме секретома, выделяемого паразитом, в последнее время уделяют большое внимание экскреторно-секреторным продуктам, таким как гемозоин, который обуславливает иммуномодулирующее действие на органы-мишени. Выраженная активация стволовых клеток поджелудочной железы приводит к мощному запуску транзиторных клеток, что впоследствии ведет к пролиферации эпителия протоков, который является нутрицевтическим субстратом паразита, а также процессу неоангиогенеза. Исследование материалов позволяет представить схему дифференцировки региональных стволовых клеток в поджелудочной железе при суперинвазионном описторхозе (Фиг. 9). Вполне очевидно, что описторхисы через инициацию региональных стволовых клеток реформируют фибробластический, гемопоэтический и другие диффероны хозяев паразита.
Проведенное исследование выявило 3 гистологических типа эндокринных образований поджелудочной железы: островки Лангерганса обычного строения, гиперплазированные островки и новообразованные островки поджелудочной железы. Последний вариант является результатом инициации и дифференцировки стволовых клеток поджелудочной железы при воздействии секретома Opisthorchis felineus. Новообразованные островки поджелудочной железы от предсуществующих форм отличаются хаотичным расположением, неопределенной формой, существенно большим размером с отсутствующей или формирующейся капсулой, могут возникать на территории склеротических изменений паренхимы железы. Все новообразованные островки содержат аналогичные клетки, обладающие идентичными свойствами островков Лангерганса.
В работе преимущественно рассматривалось формирование вновь образованного эндокринного аппарата поджелудочной железы с суперинвазионным описторхозом в поисках методов профилактики и коррекции обменов у лиц, страдающих сахарным диабетом.
Литература.
1. Григорьева И.Н. Описторхоз: традиции и инновации // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2012. №4. С. 54-59.
2. Беэр С.А. Биология возбудителя описторхоза. М., 2005. 336 с
3. Медицинская паразитология и паразитарные болезни: ред. А.Б. Ходжаян, С.С. Козлова, М.В. Голубевой. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 448 с.
4. Пахарукова М.Ю. Структурно-функциональная организация системы метаболизма ксенобиотиков у возбудителя описторхоза Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884): автореферат дис. … доктора биологических наук. Новосибирск, 2016. - 40 с.
5. Помазной М.Ю. Транскриптомный анализ трематоды Opisthorchis felineus: автореферат дис. … кандидата биологических наук. Новосибирск, 2015. - 13 с.
6. Бычков В.Г., Пантелеев С.М. Патоморфология печени после частичной гепатэктомии на фоне описторхоза // Эпителий и соединительная ткань в нормальных, экспериментальных и патологических условиях: материалы конференции морфологов. Тюмень, 1990. - С. 313-315.
7. Хадиева Е.Д., Урузбаев P.M., Лазарев С.Д., Бычков В.Г. Пролиферативные реакции в печени и поджелудочной железе при хроническом суперинвазивном описторхозе // Актуальные вопросы патологоанатомической практики: материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Современные подходы к морфологической диагностике новообразований человека". Челябинск, 2016. - С. 117-119.
8. Бычков В.Г., Лазарев С.Д., Хадиева Е.Д. Морфологические изменения билиарной системы при суперинвазионном описторхозе // Клиническая и экспериментальная морфология. 2018. №1 (25). - С. 19-24.
9. Lazarev S.D., Alekberov R.I. Features of liver regeneration after partial hepatectomy against the background of superinvasive opisthorchiasis. Regenerative zone B. // Abstracts. 4th International Medical Congress. Baku, 2017. P. 141-142.
10. Крылов Г.Г. Суперинвазионный описторхоз: пато- и морфогенез осложненных форм и микст-патологии: автореферат дис. … доктора медицинских наук. Москва, 2005. - 45 с.
11. Начева Л.В., Беззаботнов Н.О., Кожемякин А.М. Патоморфология печени, поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки золотистых хомяков при экспериментальном описторхозе // Российский паразитологический журнал, 2012. №1. - С. 78-81.
12. Волков В.П. Некоторые особенности функциональной морфологии эндокринной части поджелудочной железы в возрастном аспекте // Инновации в науке. 2014. №30-2. - С. 73-82.
13. Li J., Goodyer C.G., Fellows F. and Wang R. Stem cell factor/c-Kit interactions regulate human islet-epithelial cluster proliferation and differentiation. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2006, v. 38, p. 961-972.
14. Львова M.H., Дужак Т.Г., Центалович Ю.П., Катохин А.В., Мордвинов В.А. Секретом мариты печеночного сосальщика Opisthorchis felineus // Паразитология. 2014. Т. 48, вып.3. С. 169-184.
15. Бычков В.Г., Хадиева Е.Д., Зуевский В.П., Лазарев С.Д., Барышников А.П., Симонов А.В., Лукманов И.Р., Урузбаев P.M., Золотухина Е.В., Шидин В.А. (2015). Закономерности канцерогенеза на фоне суперинвазионного описторхоза // Тюменский медицинский журнал. 17 (3). С. 11-13.
16. Львова М.Н. Экспериментальное исследование патогенеза описторхоза, вызванного тремадой Opisthorchis felineus: автореферат дис. … кандидата биологических наук. Новосибирск, 2019. - 15 с.