Экспериментальное исследование токсического действия циклоплатама на почки и печень

лечение, рентгеновская ангиография проводится на последнем этапе обследования с целью определения анатомического строения сосудистого русла почки.

Выводы. Представлены результаты новых допплеровских методик исследования в диагностике объемных образований почек у 345 пациентов. Освещены преимущества цветового допплеровского и энергетического картирования, 3-мерной реконструкции сосудов и контрастной эхографии с левовистом, тканевой и второй гармоники в диагностике опухолей почек. Применение новых методик УЗИ почек позволило получить дополнительную информацию и значительно повысить точность диагностики.

Предсказуемость положительного теста допплеровских методик исследования, включающих контрастную эхографию, составила 95%, предсказуемость отрицательного теста — 98%, чувствительность — 98%, специфичность — 95%.

ЛИТЕРА ТУРА / REFERENCES

1. Денисов Л. Е., Николаев А. П., Виноградова H. Н., Подрегульский

К. Э. //Клин, вестн. — 1999. — № 1. — С. 47—49.

2. Зубарев А. В., Насникова И. Ю. Руководство по ультразвуковой

диагностике. Диагностический ультразвук /Под ред. А. В. Зубарева. — М., 1999. — С. 50—68.

3. Лопаткин Н. А., Козлов В. П., Гришин М. А., Суриков В. Н.

//Клин, вестн. — 1999. — № 1. — С. 44—46.

4. Руководство по урологии /Под ред. акад. РАМН проф. Н. А.

Лопаткина. — М., 1998.

5. Biondetti P. R. //Arch. Ital. Urol. Androl. — 1997. — Vol. 69, N 2. —

P. 117-122.

6. Goldberg В. B. Ultrasound Contrast Agents. — London, 1997. — P.

160,178-179.

7. Goldberg В. B. An Atlas of Ultrasound Color Flow Imaging. —

London, 1997. - P. 110-125.

© Коллектив авторов, 2000 УДК 615.277.3.065

В. М. Абаев, Н. В. Любимова, Л. М. Михайлова,

Н. П. Ермакова, И. Б. Меркулова, И. Н. Соколова,

Н. Е. Кушлинский

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЦИКЛОПЛАТАМА НА ПОЧКИ И ПЕЧЕНЬ

НИИ клинической онкологии, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей

Противоопухолевая химиотерапия широко применяется в онкологической практике. Одним из серьезных осложнений, лимитирующих дозу лекарственных веществ, является нефротоксичность, характерная для целого ряда цитоста-тиков, в частности комплексных соединений платины

[4,6]. Цисплатин является препаратом выбора при лечении большинства солидных опухолей, однако в соответствии

test predictability 80%, negative test predictability 79%, sensitivity 79%, specificity 81%, accuracy 80%. Complex ultrasound examination including angiography with opacification demonstrated positive test predictability 95%, negative test predictability 98%, sensitivity 98%, specificity 95%, accuracy 97%.

Our findings clearly show that Doppler methodologies and contrast echography had high informative value in the diagnosis of renal mass lesions and therefore increase considerably the possibility of early detection of kidney tumors on an outpatient basis. Annular screening of individuals above 40 years of age using ultrasound angiography without opacification will improve significantly the diagnosis and treatment quality. Basing on our study we suggest the following algorithm of examination of suspects for renal mass lesion (see the diagram). The examination should be started with sonography. If common cyst is found by ultrasound then no further examination is performed and the patient is assigned to the group at high risk of renal cancer and is subject to regular screenings. If ultrasound finds a solid or mixed lesion, ultrasound angiography in some cases with echocontrast agents should be performed. CT with opacity magnification is made to verify the diagnosis of benign or malignant tumors. If a patient is liable to surgery, x-ray angiography is indicated at the final stage of examination to assess kidney vascular anatomy.

8. Goldberg В. B. Diagnostic Ultrasound. — New York, 1998. — P.

787-862.

9. Kim A. Y., Kim S. H., Kim Y. !., Lee I. H. //J. Ultrasound. Med.

- 1999. - Vol. 18, N 9. - P. 581-588.

Поступила 24.03.2000 / Submitted 24.03.2000

V.M.Abayev, N. V.Lyubimova, L.M.Mikhailova, N.P.Ermakova, I.B.Merkulova, I.N.Sokolova, N.E.Kushlinsky

EXPERIMENTAL STUDY OF CYCLOPLATAM RENAL AND HEPATIC TOXICITY

Institute of Clinical Oncology, Institute of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors

Antitumor chemotherapy is a common modality of cancer treatment. Dose limiting nephrotoxicity is a serious complication of cytostatics, in particular platinum complexes

[4,6]. Cisplatin is the drug of choice in the treatment of most solid tumors though has dose-limiting renal toxicity [7].

Second-generation platinum complexes have a low nephrotoxicity potential and therefore are a good option in

с данными различных исследователей он вызывает дозозависимое токсическое поражение почек [7].

Альтернативными препаратами в плане низкой индукции нефротоксичности являются производные платины II поколения, к которым относится отечественный препарат циклоплатам, синтезированный П. А. Чельцовым в Институте общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова в 1982 г. [2]. Исследования его противоопухолевой активности показали, что препарат является достаточно перспективным отечественным лекарственным средством для лечения злокачественных новообразований различной локализации [3].

При сравнительном изучении в эксперименте на крысах влияния циклоплатама и цисплатина на функцию почек было установлено, что циклоплатам в максимально переносимой дозе (МПД) не вызывает увеличения концентрации креатинина и мочевины, в то время как цисплатин в адекватной по токсичности дозе (8 мг/кг) резко увеличивает эти показатели. При исследовании плазменной кинетики инулина и ортойодгиппурана у крыс Вистар было показано также, что цисплатин вызывает нарушение клубочковой фильтрации и канальцевой секреции, тогда как циклоплатам не оказывает подобных изменений, т.е. получены данные, свидетельствующие о том, что циклоплатам не влияет на функциональное состояние почек [8]. В то же время при доклиническом изучении безвредности циклоплатама и проведении I — II фаз клинического изучения было обнаружено увеличение концентрации мочевины, креатинина и трансаминаз сыворотки крови у некоторых больных. В этом аспекте определенный интерес представляет оценка токсического действия препарата на почки и печень на основе комплексного изучения биохимических показателей сыворотки крови и мочи крыс, получивших различные дозы циклоплатама, для отработки лабораторных критериев нефро- и гепатотоксичности.

Используемые в клинической практике рутинные лабораторные методы диагностики токсического поражения почек, к которым относятся общий анализ мочи и определение азотсодержащих соединений (мочевина и креатинин) сыворотки крови, недостаточно информативны. В последнее время с целью диагностики поражения почек, обусловленного токсическим воздействием противоопухолевых препаратов, широкое распространение получило исследование белков и ферментов мочи, которые дают представление о локализации и выраженности почечного повреждения [4,12].

Цель настоящей работы — оценка токсического воздействия циклоплатама на основе комплексного исследования биохимических показателей сыворотки крови и мочи и гистологического анализа почек и печени крыс при введении им различных доз препарата.

Материалы и методы. Для исследования токсических свойств препарата в опытах было использовано 45 крыс-самцов линии Вистар. Все животные содержались в одинаковых условиях и получали диклоплатам однократно, внутривенно в дозах: 40, 60 и 80 мг/кг массы тела животного, что соответствует МПД, среднесмертельной и смертельной дозе препарата [3, 5].

Биохимические исследования сыворотки крови и мочи лабораторных животных проводились до введения и затем на 3, 6 и 9-й дни после введения циклоплатама. В сыворотке крови крыс определяли концентрацию мочевины, креатинина, белка, альбумина и активность ферментов: щелочной фосфа-тазы (ЩФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), аланинаминотрансферазы (AJIT), аспартатаминотрансферазы (ACT), глутаматдегидрогеназы (ГЛДГ). Исследовали активность ферментов мочи, имеющих различную субклеточную локализацию в эпителии проксимальных канальцев почки: лизосомального

cancer therapy. A Russian drug cycloplatam synthesized by P.A.Cheltsov at the N.S.Kurnakov Institute of General and Non-Organic Chemistry in 1982 belongs to this class of drugs [2]. Study of cycloplatam antitumor activity demonstrated good prospects for the treatment cancers of various sites [3].

Comparative experimental study of cycloplatam and cis-platin effects on renal function in rats demonstrated that cycloplatam at the maximal tolerance dose (MTD) did not increase creatinine and urea concentrations while administration of cis-platin at an equivalent toxicity dosage (8 mg/kg) resulted in a sharp rise in the concentrations. Study of plasma inulin and orthoiodhyppuran kinetics in Vistar rats also showed that cis-platin induced impairment of glomerular filtration and tubular secretion while cycloplatam had no such effects. These findings suggest that cycloplatam produces no negative effect on renal functioning [8]. However, cycloplatam preclinical safety study and phase I-II clinical study discovered serum urea, creatinine and transaminase increase in some cases. Therefore, it is interesting to assess the drug toxic effect on kidneys and liver basing on complex study of serum and urine biochemistry in rats receiving different doses of cycloplatam in order to define laboratory nephro- and hepatotoxicity tests.

Conventional laboratory renal toxicity tests including general urinalysis and assay of serum nitrogen-containing compounds (urea and creatinine) are not informative enough. Urinary protein and enzyme testing that discovers location and degree of renal lesion are used increasingly in diagnosis of renal damage [4,12].

The purpose of this study was to evaluate renal and hepatic toxicity of different doses of cycloplatam in rats basing on complex study of serum and urine biochemistry as well as histological study of kidneys and liver.

Materials and Methods. Cycloplatam renal and hepatic toxicity was studied in 45 Vistar male rats. All the animals were kept under equal conditions and received cycloplatam as a single intravenous injection at 40, 60 and 80 mg/kg body weight, i.e. at an MTD, a median lethal and a lethal doses [3,5].

Biochemical study of animal serum and urine was performed before and on days 3, 6 and 9 after cycloplatam administration. The tested parameters were serum urea, creatinine, total protein, albumin concentrations and activity of enzymes including alkaline phosphatase (AP), lactate dehydrogenase (LDH), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), glutamate dehydrogenase (GLDH). The following urinary enzymes with different subcel-lular location in proximal tubular epithelium were studied: lisosomal enzyme, N-acetyl-p-D-hexosaminidase (NAG) and nephrothelium brush border membrane-bound enzyme, y-glutamyl transferase (y-GT). All the serum and urine tests were performed by optimized spectrophotometry using a Hitachi-911 analyzer with standard kits supplied by Boehringer Mannheim (Germany).

Another 18 rats were used as control, received no cycloplatam treatment and were kept in the same conditions as the test group. The control demonstrated low variability of test parameters as detected by numerous serum and urine biochemical tests. Mean urinary enzyme activity values were: NAG 3.2±0.14 U/mmol creatinine, y-GT 153.3±14.4 U/mmol creatinine. Mean serum concentrations were: urea 5.3+0.3 mmol/1, creatinine 54.0±2.1 mcmol/1, ALT 48.8±1.9 U/l, AST S6.2±5.8 U/l, total protein 69.1+0.6 g/1, albumin 34.5±0.4 g/1. It should be noted that there was no considerable difference in the biochemical tests under study between the control and test groups before cycloplatam treatment start.

Histological study was performed by light and electron microscopy.

Statistical significance of differences in mean values was evaluated by Student's t-test. Correlation analysis was made by Pearson Moment-Product Correlation methodology. All calculations were made with a personal computer using Statistica for Windows, Release 5.0, Starsoft Inc. and Microsoft Excel 97. The differences were considered significant at /><0.05 in all cases.

Results and Discussion. Urinary enzyme activity study in test groups demonstrated that cycloplatam at all tested doses

фермента 1Ч-ацетил-р-Р-гексозаминидазы (НАГ) и мембранно-связанного фермента щеточной каемки нефротелия—у-глутамилтрансферазы (у-ГТ). Все исследовании сыворотки крови и мочи выполнены при использовании оптимизированных спекгрофотометрических методов на автоматическом анализаторе «Hitachi-911» с использованием стандартных наборов фирмы «Boehringer Mannheim» (Германия).

Дополнительно в качестве контрольной группы были использованы 18 крыс, не получавших циклоплатам и содержавшихся в одинаковых условиях с опытной группой. При многократном определении биохимических показателей сыворотки крови и мочи животных контрольной труппы их вариабельность была незначительной. Средние значения активности ферментов мочи составили: НАГ — 3,2±0,14 Ед/ммоль креатинина, у-ГТ — 153,3+14,4 Ед/ммоль креа-тинина. Сред ние уровни биохимических показателей сыворотки крови соответствовали: мочевина — 5,3+0,3 ммоль/л, креатинин — 54,0±2,1 мкмоль/л, AJIT — 48,8+1,9 Еп/л, АСТ — 86,2±5,8 Еп/л, общий белок — 69,1+0,6 г/л, альбумин — 34,5±0,4 г/л. Необходимо отметить, что значения всех исследованных биохимических показателей контрольной группы достоверно не отличались от соответствующих показателей сыворотки крови и мочи крыс опытных групп до введения циклоплатама.

Гистологический анализ проводили с использованием световой и электронной микроскопии.

Достоверность различий средних значений оценивали по t-критерию Стыодента. Корреляционный анализ выполнен методом Pearson Moment-Product Correlation. Все расчеты проводили на персональном компьютере с использованием пакетов программ: Statistica for Windows, Release 5.0, STAR-SOFT Inc. и Microsoft Excel 97. Во всех случаях различия считали достоверными при /><0,05.

Результаты и обсуждение. При исследовании активности ферментов мочи в опытных группах было установлено, что введение циклоплатама крысам во всех исследованных дозах вызывало гиперферментурию по сравнению с исходными уровнями, а также показателями контрольной группы. При этом наиболее выраженными были изменения активности лизосомальной НАГ, являющейся, по мнению многих авторов [4,12], одним из наиболее чувствительных маркеров поражения почек. Достоверное повышение активности НАГ в моче крыс всех исследованных групп наблюдалось уже на 3-й день после введения препарата и ее активность оставалась высокой на протяжении всего исследования (табл.1). Исключение составила группа крыс, получавших циклоплатам в МПД (40 мг/кг), у которых после подъема на 3—6-й дни активность фермента снижалась до исходного значения на 9-й день после введения препарата (см. табл. 1).

В отличие от лизосомальной НАГ изменение активности мембранносвязанной у-ГТ носило несколько иной характер. Среди общих закономерностей следует отметить, что введение циклоплатама во всех исследуемых дозах вызывало увеличение активности фермента на 3-й день после введения препарата (см. табл. 1). Затем в отличие от НАГ на б—9-й день после введения препарата во всех изученных дозах активность фермента снижалась, опускаясь даже ниже соответствующих исходных уровней (см. табл. 1). Такое снижение активности фермента, повидимому, может быть объяснено особенностями его субклеточной локализации.

Более выраженное изменение экскреции НАГ с мочой во всех исследованных группах по сравнению с мембранносвязанной у-ГТ говорит о высокой чувствительности НАГ как критерия токсического поражения почек, что соответствует данным, полученным R. Y. Price (1992) [12], Н. В. Любимовой и соавт. [12] при исследовании ферменту-рии у больных, получавших препараты платины.

При анализе выраженности ферментурии в трех группах крыс нами была установлена зависимость экскреции ферментов с мочой от вводимой дозы циклоплатама (рис. 1).

increased urinary enzyme concentrations in test rats as compared to baseline values and to the control. The highest changes were discovered in NAG lisosomal activity which in the opinion of many authors [4,12] was the most sensitive marker of renal pathology. Urinary NAG concentration demonstrated a significant rise in all test groups already on day 3 after drug administration and remained high throughout the study (table 1). One exception was the rat group receiving cycloplatam at MTD (40 mg/kg) and showing a decrease in the enzyme concentration by day 9 following the rise on days 3 through 6 after drug administration (see table 1).

Changes in y-GT concentration were different from those of NAG. Cycloplatam at all doses increased enzyme activity on day 3 after administration (see table 1). But unlike NAG the y-GT activity fell by day 3 through 6 below the baseline levels (see table 1). This fall may be due to the enzyme sub-cellular location.

The greater urinary excretion of NAG as compared with membrane-bound y-GT in all test groups is evidence of NAG high sensitivity as a renal toxicity test which corresponds with data reported by R.Y.Price (1992) [12], N.V.Lyubimova et al. [12] and those obtained in study of urinary enzyme excretion in patients on platinum therapy.

Analysis of degree of enzymuria in three groups of rats discovered dose dependence of urinary enzyme excretion (fig. 1). Cycloplatam MTD induced a rather small rise in enzymuria (1.7-fold for NAG and 1.4-fold y-GT) as compared to baseline (see fig. 1). Mean rise in enzyme activity at median lethal dose was about 2-fold greater than after MTD. The highest hyperenzymuria (3-fold as high as after 40 mg/kg) was detected in animals receiving cycloplatam lethal dose (see fig. 1).

Analysis of concentrations of nitrogen-containing compounds demonstrated that serum urea and creatinine contents in rats receiving 40 mg/kg changed slightly and the differences against the baseline values were not significant. However, after administration of cycloplatam at 60 mg/kg there was a significant rise in serum urea and creatinine on days 3 through 6 followed by a fall to baseline by day 9 (table 2). After lethal doses serum creatinine and urea contents continued to rise to reach a 6- and 11.7-fold elevations by day 9, respectively, as compared to baseline which suggested deeper glomerular changes.

The serum creatinine and urea contents increased in a dose dependent manner (fig.2). After MTD mean degrees of rise in creatinine and urea levels were rather small; after median lethal dosage the urea and creatinine levels rosel.6-and 1.8-fold, respectively. The rise was the highest (4.2-fold for urea and 6.7-fold for creatinine) after 60 mg/kg (see fig.2).

Note that the increase in serum urea and cretinine after administration of median lethal and lethal cycloplatam doses correlated with the rise in urinary enzyme activity (/=0.58-0.68; /K0.001). The increase in serum urea and especially in serum creatinine after the 60 and 80 mg/kg dosage in parallel with the elevation of urinaiy enzyme activity in the laboratory animals suggests that cycloplatam has a toxic effect on both tubules and glomerules.

The discovered regularities in changes of urinary enzyme activity and serum urea and creatinine concentrations demonstrate that cycloplatam toxic effect on renal parenchyma

Таблица 1 ТаЫе1

Активность ферментов ( в Ед/ммоль креатинина) в моче крыс при введении различных доз циклоплатама Urinary enzyme (U/mol creatinine) activity in rats receiving cycloplatam at different doses

Биохимический До введения День после введения Достоверность*

показатель 3-й 6-й 9-й

Терапевтическая доза

НАГ / NAG 2,7±0,4 6,2+0,7 4,9±0,5 2,8+0,2 p,<0,001 p2<0,01 p3> 0,05

у-ГТ / y-GT 157,0+21,0 (23,8—267,5) 432,7±69,7 (195,6—882,2) 131,5±12,5 (84,5—200,7) 102,2+46,1 (4,5—396,3) p,<0,002 p2>0,05 p3>0,05

Токсическая доза

НАГ/NAG 3,1+0,3 (1,4—5,6) 14,2+1,5 (6,9—20,6) 12,4+1,7 (6,0—22,1) 9,1 ±2,2 (1,9—20,2) p,<0,001 p2<0,001 p3<0,02

у-ГТ/ y-GT 133,1+17,5 (40,8-267,6) 990,4+150,2 (255,6-1674,2) 260,7+45,4 (39,8—445,6) 98,0+17,9 (43,7—192,1) p,<0,001 p2<0,05 p3>0,05

Высокотоксическая доза

НАГ / NAG 3,1±0,3 16,6±1,9 18,0±3,2 13,3±1,7 pr<0,001 p2<0,001 p3<0,001

у-ГТ / y-GT 133,8+16,6 (64,1—219,2) 980,4+120,8 (221,0—1609,2) 241,6+37,8 (102,4-322,0) 61,6+8,4 (43,5—84,5) p,<0,001 p2< 0,02 p3< 0,002

Biochemical Before 3 6 9 Significance of

parameter administration Day following administration differences*

Примечание.* — достоверность различий рассчитана между активностью ферментов на 3-й (р у), 6-й (р2), 9-й (р3) дни после введения циклоплатама по отношению к исходным уровням. Здесь и в табл. 3 в скобках — интервалы активности ферментов. Note.*, significance of differences was calculated between enzyme activity values on days 3 (p,), 6 (p2) and 9 (p3) following cycloplatam administration against respective baseline values. Here and in tables 2, 3 numbers in parentheses are ranges.

При МПД средние степени их повышения были сравнительно невелики по сравнению с исходными значениями и составили 1,7 раза для НАГ и 1,4 раза — для у-ГТ (см. рис. 1). Средние степени повышения активности ферментов при среднесмертельной дозе препарата были в 2 раза выше, чем при МПД. Наиболее высокая гиперферментурия наблюдалась в группе животных, получивших смертельную дозу препарата, которая более чем в 3 раза превышала фермен-турию при введении 40 мг/кг циклоплатама (см. рис. 1).

Анализ результатов определения концентрации азотсодержащих соединений сыворотки крови лабораторных животных показал, что в группе крыс, получивших 40 мг/кг препарата, все изменения концентрации мочевины и креатинина сыворотки крови были незначительными и достоверно не отличались от исходных значений и показателей контрольной группы. Однако уже при введении циклоплатама в дозе 60 мг/кг на 3—6-й дни наблюдалось достоверное увеличение уровней азотсодержащих соединений сыворотки крови, которые на 9-й день после введения препарата снижались, возвращаясь к исходным значениям (табл. 2).

depends directly upon the drug dose. The drug dose-dependent manner of action was also confirmed by correlation analysis establishing a relationship between serum and urinary biochemical parameters and cycloplatam doses. The highest correlation coefficients were found for NAG (r=0.68-0.93; p<0.0001) which was indicative of the test high sensitivity as to renal toxicity. The correlation for y-GT was lower (r=0.52-0.76) though still highly statistically significant (p<0.001-0.006). Coefficients of correlation for urea and creatinine were also rather high (r=0.73-0.79; /»<0.0001) which suggests that these parameters may be used as cycloplatam renal toxicity tests.

These findings were confirmed by histological study of renal tissue. Cycloplatam at 40 mg/kg induced but minimal changes as discovered both by light (granular dystrophy, vacuolization, convoluted tubular cell desquamation) and electron microscopy (accumulation of lipid vacuoles in tubular proximal segment cytoplasm with uneven distribution of microvilli in some of them). The 60 mg/kg dose induced more marked changes in tubular (especially proximal) epithelium. Light microscopy discovered marked changes in convoluted tubules

В то же время при смертельной дозе препарата концентрации мочевины и креатинина продолжали нарастать, увеличиваясь к 9-му дню в 6 и 11,7 раза соответственно по сравнению с исходными значениями, что, вероятно, свидетельствует о более глубоких изменениях, происходящих в почечных клубочках.

При анализе выраженности азотемии также была установлена зависимость увеличения концентрации креатинина и мочевины сыворотки крови крыс от вводимой дозы циклоплатама (рис. 2). При МПД средние степени повышения концентрации мочевины и креатинина были сравнительно невелики, тогда как при среднесмертельной дозе препарата были более высокими, превышая исходные значения в 1,6 и 1,8 раза для мочевины и креатинина соответственно. Наиболее высокими средние степени повышения уровня азотсодержащих соединений в сыворотке крови были при дозе 80 мг/кг, составив для мочевины и креатинина 4,2 и 6,7 раза соответственно (см. рис. 2).

Необходимо отметить, что увеличение концентрации мочевины и креатинина в сыворотке крови при среднесмертельной и смертельной дозах циклоплатама коррелировало с увеличением активности ферментов мочи (/=0,58—0,68; р<0,001). Увеличение концентрации мочевины и особенно креатинина в сыворотке крови при введении циклоплатама в дозах 60 и 80 мг/кг, сочетающееся с одновременным увеличением активности ферментов в моче лабораторных животных, позволяет предположить, что токсическому действию препарата подвергается как канальцевый, так и клубочковый аппарат почки.

Выявленные закономерности изменения активности ферментов мочи и азотсодержащих соединений сыворотки крови показывают, что токсическое действие циклоплатама на паренхиму почек непосредственно зависит от вводимой дозы препарата. Дозозависимое токсическое действие препарата также подтверждалось данными корреляционного анализа, в результате которого была установлена корреляционная зависимость между биохимическими показателями сыворотки крови и мочи и дозой циклоплатама. Наиболее высокие коэффициенты корреляции, рассчитанные в исследуемые сроки, были характерны для НАГ (/=0,68—0,93; /КО,0001), что подтверждает высокую чувствительность фермента как критерия токсического поражения почек. Для мембранно-связанной у-ГТ корреляционная зависимость была более низкой (/=0,52—0,76), но также высокодостоверной (/КО,001—0,006). Коэффициенты корреляции для мочевины и креатинина также были достаточно высокими (/=0,73—0,79; /КО,0001), что позволяет говорить о возможности их использования как критериев токсического действия циклоплатама на почки.

Следует подчеркнуть, что полученные нами данные подтверждались результатами гистологического анализа ткани почек. При введении препарата в дозе 40 мг/кг отмечались минимальные изменения как на световом (зернистая дистрофия, вакуолизация, десквамация клеток извитых канальцев), так и на электронно-микроскопическом (накопление липидных вакуолей в цитоплазме клеток проксимального сегмента канальцев и в некоторых из них—неравномерное распределение микроворсинок) уровне. При увеличении дозы до 60 мг/кг наблюдались более выраженные изменения в эпителии канальцев, особенно проксимальных. В соответствии сданными

а Ь с а Ь с

НАГ/NAG у-ГТ/у-GT

Рис. 1. Выраженность гиперферментурии в группах крыс, получивших различные дозы циклоплатама.

Здесь и на рис. 2. : а — доза 40 мг/кг; 6 — 60 мг/кг; с — 80 мг/кг. По осям ординат — кратность повышения.

Fig.1. Hyperenzymuria in rats receiving different doses of cycloplatam

Here and in fig.2: a, dose 40 mg/kg; b, 60 mg/kg; c, 80 mg/kg. Numbers on the у axis are multiplicities of increase.

of rats. Epithelial segments with signs of granular dystrophy in proximal tubules alternated with cell areas demonstrating evidence of vacuolization, desquamation and lysis of some cells. Some convoluted tubular segments looked like thin-wall cysts free from epithelium. Interstitial space in vicinity of convoluted tubules contained connective-tissue cells with evidence of degeneration as markedly enlarged and roughly structured nuclei and hyperbasophilic cytoplasm. Electron microscopy discovered the most marked changes in microvilli as edema, uneven size and distribution, merging. Other changes included mitochondrial swelling, increase in lipid vacuoles and lysosomes, as well as changes in renal corpuscles as altered podocyte shape (polymorphism, merging) and loss of basement membrane homogeneity. Cycloplatam at 80 mg/kg induced the greatest destruction in proximal tubules as lipid vacuolization and accumulation, mitochondrial disintegration, sharp changes in microvilli structure, cell necrosis. Glomerules presented with changes in podocytes and basement membranes (uneven thickening and non-homogeneous matrix).

Thus, the general trend of changes in kidneys with cycloplatam dose escalation was increasing damage of the tubular system (first of all in proximal segments). While changes in glomerules and distal tubules were less marked.

Evaluation of the changes as to cycloplatam renal toxicity tests demonstrated that urinary enzyme activity was changing more readily in response to the drug at all tested doses than serum urea and creatinine concentrations. Urinary enzyme (especially NAG) elevation in parallel with normal serum urea and creatinine levels is evidence of a greater sensitivity of urinary enzymes as cycloplatam nephrotoxicity tests. These findings concerning cycloplatam are in agreement with other authors' data on serum and urine biochemistry after administration of other platinum complexes [4,12].

Таблица 2 Table 2

Концентрация мочевины (ммоль/л) и креатинина (мкмоль/л) в сыворотке крови крыс при введении различных доз циклоплатама Serum urea (mmol/l) and creatinine (mcmoi/l) in rats receiving cycloplatam at different doses

Биохимический До введения День после введения Достоверность*

показатель 3-й 6-й 9-й

Терапевтическая доза

Мочевина 7,0+0,7 (5,2—12,9) 6,1+0,7 (3,0-11,0) 8,6±1,7 (3,9—17,5) 5,7±0,5 (3,7—9,6) р,> 0,05 р2> 0,05 р3> 0,05

Креатинин 54,0+7,6 (35,0—108,0) 59,7+4,8 (41,0—99,0) 62,5+4,9 (42,0—90,0) 50,5+3,2 (37,0—81,0) р(> 0,05 р2> 0,05 р3>0,05

Токсическая доза

Мочевина 6,4±0,3 (4,9—8,6) 11,4+1,5 (4,2—21,7) 10,2±2,1 (3,0—23,2) 9,9+1,5 (4,9—20,5) Р,<0,01 р2< 0,05 р3<0,05

Креатинин 49,4+3,6 (36,0—78,0) 119,8+21,1 (58,0—297,0) 71,6+7,4 (43,0—150,0) 66,4+8,9 (45,0-129,0) р(<0,01 р2<0,02 р3>0,05

Высокотоксическая доза

Мочевина 8,5±0,4 (6,5—10,9) 34,2+3,5 (17,5—58,7) 42,4+5,0 (29,9—59,2) 51,3+2,8 (45,9-55,4) р,<0,001 р2<0,001 р3<0,001

Креатинин 67,6+3,4 (55,0—89,0) 270,5±33,9 (72,0—547,0) 489,0+72,6 (310,0—802,0) 789,7±167,0 (597,0—1123,0) р,<0,001 р2<0,002 р3<0,001

Biochemical Before 3 6 9 Significance of

parameter administration Day following administration differences*

Примечание.* — достоверность различий рассчитана между концентрацией мочевины и креатинина на 3-й (ру), 6-й (р2), 9-й (р3) дни после введения циклоплатама по отношению к исходным уровням. В скобках — интервалы концентрации азотсодержащих соединений сыворотки крови.

Note.*, significance of differences was calculated between urea and creatinine concentrations on days 3 (p/), 6 (p2) and 9 (p3) following cycloplatam administration against respective baseline values.

световой микроскопии, в почках крыс отмечены отчетливые изменения в извитых канальцах. В проксимальных канальцах участки эпителия с признаками зернистой дистрофии чередовались с участками клеток с признаками вакуолизации, деск-вамации и лизиса отдельных клеток. Обнаруживались участки извитых канальцев, лишенные эпителия и имевшие вид тонкостенных кист. В интерстиции вблизи извитых канальцев обнаруживались соединительнотканные клетки с признаками дегенерации—резко увеличенными грубо структурированными ядрами и гипербазофильной цитоплазмой. Согласно данным электронно-микроскопического исследования, наиболее заметные изменения проксимальных канальцев наблюдались в микроворсинках (отек, неравномерная величина и распределение, слияние). Отмечались также набухание митохондрий, увеличение числа липидных вакуолей и лизосом, а также нарушения в почечном тельце в ввде изменения формы подоцитов (полиморфизм, слияние) и потери гомогенности базальных мембран. При введении циклоплатама в дозе 80 мг/кг

Tests of serum enzymes and proteins reflecting liver functioning demonstrated the drug to affect liver to a lesser degree as compared to kidneys in rats. Study of serum transaminases in all three animal groups showed a significant increase in AST activity against the baseline, the hyperenzymemia effect being dose dependent (table 3). Administration of the drug at 40 mg/kg led to a lower increase in AST than the 60 and 80 mg/kg doses and the enzyme activity reduced by day 9 against the day 3 and 6 values. There was no such a reduction after median lethal and lethal doses. The dependence of AST activity upon the drug dose is also confirmed by a high dose-activity correlation (/=0.569; jKO.OOl). Meanwhile changes in activity of ALT and LDH were mild and did not differ in a statistically significant manner from respective baseline values, except for the LDH increase by day 6 after administration of 80 mg/kg cycloplatam (p<0.01). These findings may be due to different subcellular location of the enzymes (hepatocytic cytoplasm for ALT and LDH, cytoplasm and mitochondria for AST) and

наибольшие разрушения наблюдались в проксимальных канальцах в виде вакуолизации и накопления липидов, дезинтеграции митохондрий, разрушения и резкого изменения структуры микроворсинок, некроза клеток. В гломерулах были выражены изменения подоцитов и базальных мембран (неравномерное утолщение и негомогенный матрикс).

Таким образом, общая тенденция изменений в почках при увеличении дозы вводимого препарата заключается в нарастании поражения прежде всего в канальцевой системе (в первую очередь в проксимальном сегменте). Изменения в гломерулах и собирательных трубочках выражены в меньшей степени.

При сравнительном анализе значимости исследованных; показателей в качестве критериев токсического действия цик-лоплатама на почки было установлено, что изменения активности ферментов мочи, наблюдавшиеся при введении препарата во всех исследованных дозах, были более выражены, чем изменение концентрации азотсодержащих соединений сыворотки крови. Увеличение активности ферментов в моче (особенно НАГ) при нормальных значениях азотсодержащих показателей сыворотки крови свидетельствует о большей чувствительности ферментов мочи как критериев нефротоксич-ности циклоплатама. Эти данные, полученные относительно циклоплатама, согласуются с данными авторов, исследовавших значимость биохимических показателей сыворотки крови и мочи при использовании других препаратов платины [4,12].

Анализ результатов определения ферментов и белков сыворотки крови, отражающих состояние функции печени, показал, что в целом влияние препарата на клетки печени крыс было менее выраженным, чем на почечную ткань. При исследовании активности трансаминаз сыворотки крови во всех трех исследованных группах животных отмечалось достоверное увеличение активности ACT по сравнению с исходными значениями, при этом степень гиперферментемии напрямую зависела от вводимой дозы препарата (табл. 3). Так, при введении циклоплатама в дозе 40 мг/кг степень повышения активности ACT была меньше, чем при введении 60 и 80 мг/кг препарата, при этом активность фермента несколько снижалась на 9-й день после его введения по сравнению с 3-м и 6-м днями. При среднесмертельной и смертельной дозах препарата подобного снижения не наблюдалось. Зависимость активности ACT от вводимой дозы циклоплатама также подтверждается наличием высокой корреляционной зависимости между дозой препарата и активностью фермента (/=0,569; /КО,001). В то же время изменения активности цитоплазматических ферментов АЛТ и ДЦГ были незначительными и достоверно не отличались от исходных значений, за исключением повышения активности ДЦГ на 6-й день после введения 80 мг/кг циклоплатама (р<0,01). Обнаруженные закономерности, вероятно, можно объяснить различной субклеточной локализацией исследованных ферментов (АЛТиЛДГ —цитоплазма гепатоцитов, ACT— цитоплазма и митохондрии) и видовой специфичностью их распределения в органах и тканях, а также особенностями повреждающего действия циклоплатама на клетки печени.

Следует отметить, что изменения активности мембранно-связанных ферментов (ЩФ и у-ГТ) в сыворотке крови лабораторных животных при всех трех дозах препарата были незначительными и достоверно не отличались от исходных значений и значений контрольной группы. Изменения

а b с Мочевина / Urea

а Ь с Креатинин / Creatinine

Рис. 2. Степень повышения концентрации мочевины и кре-атинина в сыворотке крови крыс при различных дозах циклоплатама.

Fig.2. Increase in serum urea and creatinine in rats receiving different doses of cycloplatam.

species-specific distribution in organs and tissues, as well as to particulars of cycloplatam negative effect on liver cells.

Note that changes in activity of serum membrane-bound enzymes such as AP and y-GT as a result of administration of all three doses were mild and did not demonstrate statistical significance from baseline and control values. Changes in activity of another membrane-bound enzyme, GLDH, after the MTD and lethal dose were also mild and demonstrated no statistical significance from baseline and control values. However, after the drug lethal dose GLDH activity was increasing rapidly (up to 24.6-fold) which was evidence in favor of dose dependency of the drug liver toxicity as well as of selective action of the drug on intracellular membranes.

So, AST demonstrated the greatest changes in response to cycloplatam among other enzymes reflecting hepatic toxicity. Taking into account the enzyme subcellular location (mitochondria) a deeper damage of hepatocytes under the effect of cycloplatam at high doses (60 and 80 mg/kg) maybe supposed as well as the usefulness of AST as a liver toxicity test.

Serum concentrations of total protein and albumin that are indicative of protein synthesis by the liver did not demonstrate considerable changes. Cycloplatam administration at 40 mg/kg resulted in a slight (10-12%) fall in serum total protein and albumin of rats on day 6 as compared to baseline, the difference being statistically significant (/><0.05-0.01). The median lethal and lethal doses induced a more marked (20-26%) and significant (/K0.05-0.001) hypoproteinemia. As a whole onset of the changes in serum total protein and albumin was detected later than changes in enzyme activity and were less marked.

The above-mentioned biochemical findings were confirmed by histological data. Liver changes of rats receiving 40 mg/kg cycloplatam as found by light microscopy were mild and consisted of emerging of areas of balloon dystrophy in hepatocytes. Electron microscopy of liver in this group of animals discovered many lipid vacuoles and mild destructive changes in hepatocytic mitochondria. Focal absence of

Таблица 3 Table 3

Активность трансаминаз (Ед/л) в сыворотке крови крыс при введении различных доз циклоплатама Serum transaminase activity (U/i) in rats receiving cycloplatam at different doses

Биохимический До введения День после введения Достоверность*

показатель 3-й 6-й 9-й

Терапевтическая доза

АЛТ / ALT 51,1+4,9 (5,9—73,8) 44,3±2,4 (32,8—59,8) 45,3+5,1 (27,1—89,9) 48,3±2,9 (37,9—73,3) p,> 0,05 p2>0,05 p3> 0,05

ACT / AST 73,5±3,4 (35,0—108,0) 94,2+4,4 (72,8—115,9) 107,9±12,9 (81,3—195,7) 94,5+6,2 (71,1—135,3) P,<0,01 p2< 0,05 p3< 0,02

Токсическая доза

АЛТ/ALT 56,5±3,2 (34,6—70,6) 58,7±4,1 (38,3—92,7) 55,7+3,4 (43,0—88,5) 58,2±3,8 (41,3—74,6) pt> 0,05 p2> 0,05 p3>0,05

ACT/AST 88,3±6,0 (60,0—124,6) 128,3+11,9 (94,2—199,7) 118,5±9,1 (86,9—182,7) 114,8+9,0 (81,5-167,5) P,<0,01 p2<0,02 p3<0,05

Высокотоксическая доза

АЛТ / ALT 49,8+3,1 (35,1-68,9) 70,9+11,1 (43,9-186,6) 51,6±1,9 (48,1-58,1) 36,4±10,3 (23,6-56,7) p(>0,05 p2>0,05 p3> 0,05

ACT/AST 72,3+2,8 (55,8—87,5) 172,0+25,3 (115,6—439,2) 261,1+20,6 (192,2—334,5) 264,7±13,0 (217,3—306,9) p,<0,001 p2<0,001 p3<0,001

Biochemical Before 3 6 9 Significance of differences*

parameter administration Day following administration

Примечание.* — достоверность различий рассчитана между активностью ферментов на 3-й ( р7), 6-й (р2 ), 9-й (р3 ) дни после введения циклоплатама по отношению к исходным уровням

Note. *, significance of differences was calculated between enzyme activity values on days 3 ( p*), 6 (p2) and 9 (p3) following cycloplatam administration against respective baseline values.

активности другого мембранно-связанного фермента — ГЛДГ при МПД и смертельной дозе препарата были также слабо выражены и его значения достоверно не отличались от исходных значений и показателей контрольной группы. Однако при введении животным смертельной дозы препарата активность ГЛДГ резко возрастала (до 24,6 раза), что отражает зависимость биохимических изменений, происходящих в печени, от вводимой дозы циклоплатама, а также избирательность действия препарата на внутриклеточные мембраны.

Таким образом, среди ферментов, изменение активности которых в той или иной мере отражает токсическое действие циклоплатама на печень, наиболее выраженными были изменения активности ACT. Учитывая специфику субклеточной локализации фермента (митохондрии), можно сделать предположение о более глубоком повреждающем эффекте высоких (60 и 80 мг/кг) доз циклоплатама на гепатоциты и возможности использования ACT в качестве критерия токсического поражения печени.

microvilli was found in Disse spaces in some cells. Rats receiving cycloplatam at 60 mg/kg demonstrated more marked changes. Light microscopy discovered balloon dystrophy and enlarged nuclei with roughly structured chromatin in most hepatocytes. Electron microscopy found enlarged nuclei and destructive changes in microvilli and cytoplasm as a result of administration of cycloplatam at 60 mg/kg alongside with increasing mitochondrial destruction, cytoplasm vacuolization and numerous lipid formations in hepatocytes. Biliary capillary structure was preserved though fragmentary loss and edema of microvilli was also seen. Unstructured necrotic masses were found among preserved cellular elements. The greatest toxic changes (necrosis of all liver structures) were found in rats receiving 80 mg/kg on day 3 and especially on day 9 following drug administration.

In summary, our findings suggest that cycloplatam produced a dose-dependent toxic effect of renal and hepatic parenchyma in laboratory animals. The calculated coefficients of correlation between drug dosage and activities of urinary (NAG and y-GT) and serum (AST) enzymes, as well

При исследовании концентрации общего белка и альбумина в сыворотке крови, отражающих белково-синтетическую функцию печени, существенных изменений обнаружено не было. При введении 40 мг/кг циклоплатама незначительное (на 10—12%) снижение концентрации общего белка и альбумина сыворотки крови лабораторных животных по сравнению с исходными значениями наблюдалось на 6-й день после введения препарата, и это снижение было достовер-. ным (р<0,05—0,01). При среднесмертельной и особенно I смертельной дозах гипопротеинемия была более выражен-: ной и достоверной (р<0,05—0,001), достигая снижения показателей на 20—26%. В целом при всех исследованных : дозах изменения концентрации общего белка и альбумина в сыворотке крови наблюдались позднее, чем изменения ак-[ тивности ферментов, и были выражены в меньшей степени.

(Следует отметить, что закономерности, полученные при исследовании биохимических показателей сыворотки крови, подтверждались данными гистологического анализа. По данным световой микроскопии, изменения в печени крыс, получивших препарат в дозе 40 мг на 1кг массы тела, были выражены слабо и заключались в наличии участков гепатоцитов с признаками баллонной дистрофии. Электронно-микроскопическое исследование печени крыс этой группы показало, что в гепатоцитах появляется много липидных вакуолей, отмечаются слабые деструктивные изменения митохондрий. В пространствах Диссе в отдельных клетках обнаруживалось очаговое отсутствие микроворсинок. Более выраженные изменения отмечены в печени крыс, получивших циклоплатам в дозе 60 мг на 1 кг массы тела. В соответствии с данными световой микроскопии, для большинства гепатоцитов была характерна баллонная дистрофия, обнаруживались ядра увеличенных размеров с грубоструктурированным хроматином. Согласно данным электронно-микроскопического исследования, увеличение дозы до 60 мг/кг сопровождалось увеличением размеров ядер и деструктивными изменениями микроворсинок и цитоплазмы. В гепатоцитах происходило нарастание процесса разрушения митохондрий, вакуолизации цитоплазмы и увеличения числа липидных включений. Структура желчных капилляров в целом была сохранена, однако отмечались фрагментарное отсутствие и отек микроворсинок. Среди сохранных клеточных элементов встречались бесструктурные некротические массы. Наиболее выраженные токсические изменения (некротические процессы всех печеночных структур) наблюдались при воздействии препарата в дозе 80 мг на 1кг массы тела на 3-й и особенно 9-й день после его введения.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что циклоплатам оказывает дозозависимое токсическое воздействие на паренхиму почек и печени лабораторных животных. Рассчитанные коэффициенты корреляции между дозой препарата и активностью ферментов мочи (НАГ и у-ГТ) и сыворотки крови (ACT), а также концентрацией азотсодержащих соединений сыворотки крови (мочевина и креатинин) свидетельствуют о наличии зависимости между биохимическими показателями сыворотки крови и мочи и вводимой дозой препарата. Установленная зависимость подтверждает возможность использования

as serum urea and creatinine demonstrated a relationship between serum and urinary biochemistry and drug doses. The discovered relationship suggests that the mentioned tests may be used to evaluate renal and hepatic toxicity of cycloplatam.

Conclusions. While demonstrating similar antitumor activity with cisplatin [3] cycloplatam at MTD induced lower changes in serum and urinary tests as compared to those after cisplatin administration [1,9,11]. However, at doses greater than MTD cycloplatam produced increasing hepatic and renal toxic effects compatible with those of cisplatin [1,9-11]. The animal toxicity manifestations reflect to a certain extent the mechanism of cycloplatam toxicity for renal and hepatic parenchyma and may be a basis for establishing biochemical tests for cycloplatam toxicity to be used in the clinical practice.

данных показателей в качестве критериев токсического воздействия циклоплатама на почки и печень.

Выводы. При сравнительно одинаковой противо-опухо-левой активности циклоплатама и цисплатина [3] изменения показателей сыворотки крови и мочи, наблюдаемые при введении циклоплатама в МПД, выражены слабее, чем биохимические нарушения, описываемые для цисплатина [1,9,11]. Однако эффекты токсического действия препарата на печень и почки при введении его в дозах, превышающих МПД, усиливаются и становятся сопоставимыми с эффектами, вызываемыми цисплатином [1, 9—11]. Установленные на лабораторных животных закономерности в определенной мере отражают механизм токсического действия циклоплатама на паренхиму почек и печени и могут служить основой для разработки биохимических критериев токсического действия циклоплатама в целях их практического использования в клинической практике.

ЛИТЕР АТУ PA/REFERENCES

1. Бахтеева В. Т., Фок Е. М., Лаврова Т. А. // Вопр. мед. химии

- 1996. - Т. 42, №4. - С. 301-306.

2. Горбунова В. А. Новые цитостатики в лечении злокачествен-

ных опухолей. —М., 1998. — С. 20—22.

3. Коновалова А. Л. Противоопухолевая активность нового

препарата циклоплатам. — М., 1993. — С. 3—15.

4. Любимова Н. В., Кумыкова Ж. X., Кушлинский Н. Е. и др. //

Бюл. экспер. биол. — 1997. — №10. — С. 446—450.

5. Михайлова Л. М., Членова Е. Л., Коняева О. И., Ермакова

Н. П. Токсические свойства отечественного противоопухолевого препарата циклоплатам. — М., 1993. — С. 16—25.

6. Переводчикова Н. И. Противоопухолевая химиотерапия

(справочник). — М., 1996. — С. 3.

7. Принципы и методы оценки нефротоксичности. Издано

программой ООН по охране окружающей среды. — Женева, 1994. - С. 58-59.

8. Сыркин А. Б., Трещалин И. Д. // Химиотерапия злокачест-

венных опухолей. — Алма-Ата, 1986. — С. 79—81.

9. FjeldborgP., Sorensen J., HelkjaerP. E. // Cancer. — 1986. —

Vol. 58. - P. 2214- 2217.

10. Jones R,. Bhalla, J., MladekN. etal. // Clin. Pharmacol. Ther.

- 1980. - Vol. 27. - P. 557-562.

11. MeijerS., SleijferD., Mulder N. etal. // Cancer. — 1983. —

Vol. 51. - P. 2035- 2040.

12. Price R. G. // Toxicology. — 1992. — Vol. 23. — P. 99—134.

Поступила 29.11.99/Submitted 29.11.99