СПОСОБ ИНДУКЦИИ СЕКРЕЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ У РАПАНЫ RAPANA VENOSA VAL.
METHOD FOR INDUCING THE SECRETION OF BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS IN SEA SNAIL RAPANA VENOSA VAL.

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для получения натурального продукта для фармакологических целей.
-1
Известно, что у всех моллюсков, принадлежащих к надсемейству Muricoidea, очень высокое содержание сложных эфиров, строго локализованных в средней области гипобранхиальной железы, секретирующей краситель [Andrews, 1991]. Сложные эфиры холина представлены мурексином, дигидромурексином и сенсиоилхолином. Так, у R. bezaor (Linn.), близкого вида R. venosa, содержание мурексина и сенсиоилхолина составило соответственно 400 и 100 мг·г свежих мягких тканей [Roseghini et al., 1996]. Авторами установлено, что все соединения обладали сильным нервно-мышечным блокирующим действием, вызывая паралич мускулатуры беспозвоночных, в том числе паралич замыкательных мышц двустворчатых моллюсков.
Хищный брюхоногий моллюск рапана Rapana venosa питается двустворчатыми моллюсками, но основным пищевым объектом являются мидии (Чухчин, 1984). Взрослые особи при нападении парализуют жертву, выделяя биотоксин сложного биохимического состава (Cesari, Mizzan, 1993). Биотоксин вырабатывается в гипобранхиальной железе, которая разделяется на три отдела: два боковых, выделяющих слизь, и средний, окрашенный в молочно-белый цвет, секретирующий краситель пурпур (Чухчин, 1970; Ponte, Modica, 2017). Известно, что фиолетовый тириан образуется из секрета гипобранхиальных желез брюхоногих моллюсков из соли-предшественника холинового эфира тириндоксилсульфата после серии ферментативных, окислительных и фотохимических реакций [Benkendorff et al., 2001]. Эти биоактивные вторичные метаболиты относятся к химическому классу индоловых алкалоидов, которые являются натуральными продуктами для производства лекарств [Grabley, Sattler, 2003]. Установлено, что производные индирубина эффективно ингибируют пролиферацию раковых клеток [Leclerc et al., 2001; Meijer et al., 2003; Kim et al., 2007], а также вызывают апоптоз в клетках рака молочной железы и простаты человека [Brown, Wouters, 1999; Nam et al., 2005; Kim et al., 2007]. Широко признано, что гибель клеток после повреждения ДНК противоопухолевыми агентами является, главным образом, результатом апоптоза [Brown, Wouters, 1999].
Известно, что для получения веществ, содержащихся в гипобранхиальной железе брюхоногих моллюсков (Nucella lapillus, Murex brandaris, M. trunculus, Purpura capillus, P. patula, Dicathais orbita) ее иссекают, при этом высвобождается фермент (пурпураза), который удаляет сульфатную группу с образованием тириндоксила. Тириндоксилсульфат выделяют из желез экстракцией этанола [Cooksey, 2001].
-1
-1
Известен способ стимуляции выделения биологически активных соединений у брюхоногого моллюска Dicathais orbita Gmelin, 1781 -эндемика южной части Австралии и прибрежных вод Новой Зеландии. [Warwick James Noble. Aspects of life history and ecology of Dicathais orbita Gmelin, 1781 related to potential aquaculture for bioactive compound recovery // A thesis submitted to the Flinders University, in candidature for the degree Doctorate of Philosophy. School of Biological Sciences Flinders University. - 2014. - 156 p.https://flex.flinders.edu.au/file/20844afe-ccb6-4112-bb2a-6d3784d3ed73/l/Thesis-Noble-2014.pdf]. Для индукции секреции биологически активных соединений у моллюсков D. orbita трех размерных классов (23-33 мм, 33,5-53 мм и > 53,5 мм) были протестированы четыре химических вещества, растворенные в морской воде: 5% этанол; бензокаин, 200 мг·л; пентабарбитал натрия, концентрации 1 мг·л и 0,5 М магния хлорид. В качестве контроля была свежая морская вода. Моллюсков погружали на один час в раствор стимулятора, причем каждый моллюск подвергался воздействию только одного вещества. Установлено, что только растворы этанола и бензокаина стимулировали выделение биологически активных соединений. Как утверждает автор, это связано с эффектом нарушения контроля нервной системой за расслаблением мышцы ноги и стрессовой реакцией у D. orbita, что приводит к изгнанию слизи, содержащей биоактивные предшественники пурпурного тириана. После воздействия указанными веществами на животных, за их питанием наблюдали еще в течение 5 дней. Однако, как утверждает автор, нельзя исключить возможность долгосрочных сублетальных последствий.
Задачей изобретения является разработка способа прижизненной многократной стимуляции выделения биологически активных соединений (БАС) у рапаны R. venosa.
Технический результат от решения поставленной задачи заключается в том, что разработана технология прижизненного получения биологически активных соединений у хищного брюхоногого моллюска рапаны R. venosa - сырья для производства медицинских препаратов. Такая технология разработана впервые и позволяет получать значительное количество БАС. Кроме того, дополнительным техническим результатом является возможность прижизненного определения пола моллюсков, что имеет значение и для научных целей при изучении популяционной структуры моллюсков.
4
14
19
5
2
2
4
Заявленный технический результат достигается благодаря тому, что в Способе индукции секреции биологически активных соединений у рапаны Rapana venosa Val., включающем стимуляцию выделения биологически активных соединений, в соответствии с изобретением моллюсков отбирают из естественной среды обитания при температуре морской воды от 17,2°С до 8,2°С. Для стимуляции используют комбинированный стимулирующий раствор, состоящий из 25%-го сульфата магния (MgSO) и 0,04% раствора серотонина (CHNO·HSO), который вводят голодным рапанам шприцем в хобот или мышцу ноги. Для моллюсков с высотой раковины 46,30÷59,27 мм объем комбинированного стимулирующего раствора составляет 0,5 мл; для моллюсков с высотой раковины 60÷77 мм - 1 мл; для моллюсков с высотой раковины 114,14 мм - 1,5 мл. Комбинированный стимулирующий раствор готовят путем растворения 4 мг серотонина в 10 мл дистиллированной воды и 10 мл 25% магния сульфата, объемы которых соединяют в соотношении 1:1. Кроме того, для стимуляции выделения биологически активных соединений отбирают моллюсков с высотой раковины больше 60 мм и общим весом больше 30 г. Помимо этого, после введения комбинированного стимулирующего раствора проводят прижизненное определение пола рапаны.
Заявляемый способ соответствует критериям: новизна и изобретательский уровень, т.к. впервые предложены условия для индукции секреции биологически активных соединений у рапаны Rapana venosa, не требующие сложного и дорогостоящего оборудования или привлечения дорогостоящих химических реактивов. Проведенные патентные исследования, а также изучение доступных научных публикаций, относящихся к теме изобретения, не обнаружили решений, имеющих признаки, сходные с заявляемым техническим решением, что подтверждает выводы о соответствии критериям патентоспособности.
Изобретение поясняется иллюстрациями, где:
Фиг. 1 - А - садок с рапанами; Б - рапаны в лаборатории перед стимуляцией выделения биологически активных соединений;
Фиг. 2 - Места введения стимулирующего раствора: 1 - хобот, 2 - мышца ноги;
Фиг. 3 - Процесс выделения биологически активных соединений рапанами после стимуляции: А - свежевыделенный секрет гипобранхиальной железы желтого цвета; Б - секрет гипобранхиальной железы после окислительных и фотохимических реакций - розового и пурпурного цвета;
Фиг. 4 - Выделение биологически активных соединений рапанами после стимуляции (Таблица);
Фиг. 5 - Зависимость доли (в %) особей рапаны, выделивших биологически активные соединения, от температуры воды в море;
Фиг. 6 - Самец рапаны. Стрелкой обозначен половой орган - penis.
Заявляемый способ является результатом научных исследований. Материалом для исследований послужили рапаны R. venosa с высотой раковины от 46,30 до 114,1 мм, возрастом от 2+ до 4+ лет. Моллюски были собраны в ноябре 2019 г в бухте Севастопольская на глубине от 9 до 15 м под "мидийной фермой (внешний рейд Севастопольской бухты). В дальнейшем содержание моллюсков проходило пластмассовом садке (сверху обшитом делью для предотвращения их выползания), (Фиг. 1А) и подвешенном в море на глубине 2,5 м (соленость 18%). Кормом для рапан были живые мидии размерами от 60 до 79 мм (среднее значение длины -70 мм), выращенные на мидийной ферме.
Перед началом стимуляции определяли общий вес моллюсков (весы OHAUS, с точностью до 0,01 г). Массу мягких тканей мидий, потребленных рапанами, рассчитывали по формуле (Пиркова и др., 2019):
4
14
19
5
2
2
4
В течение 28.10.19 - 10.03.20 года с интервалом в 2-3 недели в лабораторных условиях стимулировали выделение биологически активных соединений у рапан, используя комбинированный раствор: сульфата магния (MgSO - 12,5%) с раствором серотонина (CHNO·HSO - 0,02%). Стимулирующий раствор готовили следующим способом: 4 мг серотонина растворяли в 10 мл дистиллированной воды и добавляли 10 мл 25% магния сульфата. Состав стимулирующего раствора выбран авторами на основании сведений о синергическом действии серотонина и сульфата магния на физиологические функции моллюсков, связанные с питанием. Доказано, что серотонин является нейромодулятором, контролирующим питание у беспозвоночных животных (Dayan, Huys, 2009). Таким образом, увеличение - концентрации серотонина в гемолимфе моллюска после введения его в мышцу ноги или через хобот - в пищеварительную систему, является сигналом для стимуляции синтеза БАС. А сульфат магния (магнезия), вызывая расслабление гладкой мускулатуры и расширение сосудов (https://apteka.103.by/magnija-sulfat-instruktsiya/#3 - 02.06.2020), способствует беспрепятственному его выделению. Таким образом, комбинированный раствор серотонина и сульфата магния является эффективным стимулятором выделения биологически активных соединений у рапаны, не оказывая отрицательного влияния на жизнеспособность моллюсков,
При помощи шприца раствор вводили в хобот или в мышцу ноги рапаны (Фиг. 2). Затем моллюсков раскладывали на поддон устьем вверх (Фиг. 1Б). После появления в устье мутно-желтой жидкости, рапаны устанавливали на бюксы или мерные стаканы вниз сифональным каналом (Фиг. 3). За период с 28.10.2019 г. по 10.03.2020 г. с интервалом в 2-3 недели было проведено 10 стимуляций выделения БАС у рапан (табл. 1).
Экспериментально был определен оптимальный объем вводимого стимулирующего раствора в зависимости от размера моллюсков. Для моллюсков с высотой раковины от 46,30 до 59,27 мм он составил 0,5 мл; для рапан размерами от 60 до 77 мм - 1 мл; с высотой раковины 114,14 мм - 1,5 мл (№20). После введения стимулирующего раствора в мышцу ноги выделение БАС начиналось через 2-3 мин; при введении его в хобот начало выделения у разных особей было отмечено в интервале от 3 до 11 мин.
Установлены зависимости среднего объема, выделенного БАС от высоты раковины (1) и от общего веса (2) моллюсков:
где: V - средний объем БАС, мл; е - основание натурального логарифма (2,71828), Н - высота раковины рапаны, мм.
где: W - общий вес рапаны, г.
Выявлено, чем больше размер или общий вес рапаны, тем больший объем биологически активных соединений он может выделить после стимуляции. Так, максимальный объем БАС (8,5 мл) был выделен рапаной высотой раковины 114,1 мм и общим весом 81,31 г; а минимальный объем (0,4 мл) был выделен рапаной с размерно-весовыми характеристиками: Н=50,32 мм и W=20,71 г
Исследована тенденция зависимости доли особей, выделивших БАС, от температуры воды в море: максимальная доля особей, выделивших БАС, была отмечена при температуре воды 16°С, минимальная - при 8,2°С (Фиг. 5).
Рапана - раздельнополый моллюск. Половую принадлежность рапаны ранее определяли, разрушая раковину рапаны (Чухчин, 1984; Savini et all., 2004; Saglam et all., 2009; Saglam et all., 2015; Бондарев, 2016). Авторами изобретения установлено, что после введения стимулирующего раствора, когда тело моллюска расслаблено и легко отодвигается крышечка ноги, можно прижизненно определить пол у рапаны, как показано на Фиг. 6. В исследуемой выборке соотношение полов равное и составило:  За период наблюдения среднее количество положительных откликов на стимуляцию выделения биотоксина у самок и самцов рапаны достоверно не отличалось (соответственно 4,1 и 4,2).
Сигналом для выделения биотоксина (или биологически активных соединений) рапаной является физиологическая потребность в пище и наличие корма. По данным В.Д. Чухчина (1984), интенсивность питания зависит от размера рапаны и температуры воды. Перерыв между потреблением пищи может составлять около 4 дней. По данным автора при температуре воды ниже 10°С моллюски прекращали питаться (Чухчин, 1984).
-1
-1
-1
-1
В течение опыта температура воды в море изменялась в осенне-зимний период от 17,2 до 8,2°С. Количество потребленных рапанами мидий не зависело от температуры воды в пределах указанных значений. Так, при температуре 9,8°С, количество мидий, потребленных за две недели 20 рапанами, составило 10 экз. (при среднем значении рациона - 0,22 г·экз·сут), а при температуре 16,0; 8,2 и 10,4°С за аналогичный период наблюдений - 1 мидия (или 0,02 г·экз·сут). Известно, что при температуре воды 10,0°С происходит остановка линейного роста рапаны (Чухчин, 1984). По разнице между смежными значениями общего веса, можно определить моллюсков, которые недавно питались. Такие особи, как правило, не выделяли БАС после стимуляции. Следовательно, индукцию БАС рекомендуется выполнять у голодных рапан.
После введения стимулирующего раствора, рапаны выделяют биологически активные соединения в виде мутно-желтоватого вещества (см. Фиг. 3А). В зависимости от интенсивности света и продолжительности контакта с воздухом, желтый цвет БАС, превращается в розовый или красный, а затем в пурпурный (см. Фиг. 3). Образование пурпура сопровождалось выделением летучего вещества с резким запахом, как указывал В.Д. Чухчин (1970) - меркаптана.
В течение всего периода исследования выживаемость моллюсков составила 100%.
Пример реализации способа.
Рапаны R. venosa были собраны в ноябре 2019 г в бухте Севастопольская в количестве 20 экз. на глубине от 9 до 15 м под мидийной фермой (внешний рейд Севастопольской бухты). Размеры раковин - моллюсков составили от 46,30 до 114,1 мм, а возраст - от 2+ до 4+ лет.
4
14
19
5
2
2
4
В течение 28.10.19 - 10.03.20 года с интервалом в 2-3 недели в лабораторных условиях стимулировали выделение биологически активных соединений у рапан (всего проведено 10 стимуляций). Для индукции секреции биологически активных соединений (БАС) использовали комбинированный раствор: сульфата магния (MgSO - 12,5%) с раствором серотонина (CHNO·HSO - 0,02%). Стимулирующий раствор готовили непосредственно перед проведением стимуляции следующим способом: 4 мг серотонина растворяли в 10 мл дистиллированной воды и добавляли 10 мл 25% сульфата магния. При помощи шприца раствор вводили в хобот или в мышцу ноги рапаны. Объем вводимого раствора зависел от размера моллюсков: с высотой раковины от 46,30 до 59,27 мм он составил 0,5 мл; с высотой раковины 114,14 мм - 1,5 мл (№20); для рапан размерами от 60 до 77 мм - 1 мл. После введения стимулирующего раствора в мышцу ноги выделение БАС начиналось через 2-3 мин; при введении его в хобот начало выделения у разных особей было отмечено в интервале от 3 до 11 минут в виде мутно-желтой жидкости, заполняющей устье моллюска. После чего рапан устанавливали на бюксы или мерные стаканы вниз сифональным каналом для сбора БАС. Положительно на стимуляцию отвечали голодные моллюски.
Объем БАС зависел от размера (общего живого веса) рапаны: максимальный объем - 8,5 мл одноразово был выделен рапаной с высотой раковины 114,1 мм и общим весом 81,31 г; а минимальный - 0,4 мл был выделен рапаной с высотой раковины 50,32 мм и общим весом 20,71 г. В результате 10 стимуляций индукции биологически активных соединений от 20 экз. рапан получено 137,45 мл БАС.
Источники литературы, принятые во внимание:
1. Бондарев И.П. Структура популяций Rapana venosa (Gastropoda, Muricidae) Севастопольских бухт (Черное море) // Морской биологический журнал. 2016. Т. 1, №3. С. 14-21.
2. Голиков А.Н., Старобогатов Я.И. Класс брюхоногие моллюски - Gastropoda // В сб.: Определитель фауны Черного и Азовского морей / Отв. ред. Водяницкий В.А. Киев: «Наукова думка», 1972. С. 65-167.
3. Пиркова А.В., Ладыгина Л.В., Щуров С.В. Формирование поселений мидий Mytilus galloprovincialis (Lamarck, 1819) на коллекторах фермы в бухте Ласпи в зависимости от экологических факторов // Ученые записки Крымского федерального университета им. В.И. Вернадского. Биология. Химия. 2019. Т. 5 (71), №1. С. 92-106.
4. Чухчин В.Д. Функциональная морфология рапаны. Киев: Наукова думка, 1970. 138 с.
5. Чухчин В.Д. Экология брюхоногих моллюсков Черного моря. Киев: Наукова думка, 1984. 176 с.
6. Andrews Е.В. The fine structure and function of fhe salivary glands of Nucella lapillus (Gastropoda: Muricidae) // Journal of Molluscan Studies. 1991. Vol. 57, is. LP. 111-126.
7. Benkendorff K, Bremner J.В., Davis A.R. Indole derivatives from the egg masses of muricid molluscs. Molecules, 2001, 6, 70-78.
8. Brown J.M., Wouters B.G. Apoptosis, p53, and tumor cell sensitivity to anticancer agents. Cancer Research. 1999. vol. 59, no. 7, pp. 1391-1399.
9. Dayan P., Huys Q.J.M. Serotonin in affective control. Annual Review Neuroscience 2009, vol. 32. pp. 95-126.
10. Cesari P., Mizzan. L. Osservazioni su Rapana venosa (Valenciennes, 1846) in cattivita (Gastropoda: Muricidae, Thaidinae // Bollettino del Museo Civico di Storia Naturalea di Venezia. 1993. №42. P. 9-21.
11. Cooksey C.J. Tyrian Purple: 6,6'-Dibromoindigo and Related Compounds. Molecules 2001, 6(9), 736-769; https://doi.org/10.3390/60900736
12. Grabley S., Sattler I. Natural products for lead identification: Nature is a valuable resource for providing tools. Modern Methods of Drug Discovery. 2003. vol. 93. pp 87-107.
13. Kim S.-A., Kim Y.-C, Kim S.-W., Lee S.-H, Min J.-J., Ahn S.-G., Yoon J.-H. Antitumor activity of novel indirubin derivatives in rat tumor model. Clinical Cancer Research. 2007. vol. 13, no. 1, pp. 253-259.)
14. Leclerc S., Garnier M., Garnier M. Indirubins inhibit glycogen synthase kinase-3β and CDK5/P25, two protein kinases involved in abnormal tau phosphorylation in Alzheimer's disease. A property common to most cyclin-dependent kinase inhibitors? Journal of Biological Chemistry. 2001. vol. 276, no. 1, pp. 251-260.
15. Meijer L., Skaltsounis A.-L.; Skaltsounis A.-L. GSK-3-selective inhibitors derived from tyrian purple indirubins. Chemistry and Biology. 2003. vol. 10, no. 12, pp. 1255-1266.
16. Michel R.H., Lazar J, McGovem P.E. The chemical composition of the indigoid dyes derived from the hypobranchial glandular secretions of Murex molluscs. J. Soc. Dyers and Colourists 1992. 108. 145-150.
17. Nam S., Buettner R., Buettner R. Indirubin derivatives inhibit Stat3 signaling and induce apoptosis in human cancer cells," Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005. vol. 102, no. 17, pp.5998-6003.
18. Ponte G., Modica M.V. Glands in Predatory Mollusks: Evolutionary Considerations // Frontiers in Physiology. 2017. Vol.8. P. 1-8.
19. Roseghini M., Severini C, Erspamer G.F., Erspamer V. Choline esters and biogenic amines in the hypobranchial gland of 55 molluscan species of the neogastropod Muricoidea superfamily // Toxicon. 1996. 34(1). P. 33-55.
20. Saglam H., Duzgunes E., Ogut H. Reproductive ecology of the invasive whelk Rapana venosa Valenciennes, 1846, in the southeastern Black Sea (Gastropoda: Muricidae) // ICES Journal of Marine Science. 2009. Vol.66. №9. P. 1865-1867.
21. Saglam H., Kutlu S., Dagtekin M. Population biology of Rapana venosa (Valenciennes, 1846) (Gastropoda: Neogastropoda) in the south-eastern Black Sea of Turkey // Cahiers De Biologie Marine. 2015. Vol. 56. №4. P. 363-368.
22. Savini D.M., Castellazzi M.F., Ambrogi A.O. The alien mollusk Rapana venosa (Valenciennes, 1846; Gastropoda, Muricidae) in the northern Adriatic Sea: population structure and shell morphology. // Chem. Ecol. 2004. Vol.20. P. 411-424.