Полиморфный локус rs11568818 гена mmр7 ассоциирован с развитием артериальной гипертонии у женщин

Полиморфный локус РБ11568818 гена ММР7 ассоциирован с развитием артериальной

гипертонии у женщин

1 12 1 Москаленко М. И., Пономаренко И. В., Полоников А. В. , Чурносов М. И.

Цель. Изучить вовлеченность полиморфных локусов rs1799750 MMP1, rs3025058 MMP3, rs11568818 MMP7, rs1320632 MMP8 и rs11225395 MMP8 в развитие артериальной гипертонии (АГ) у женщин Центрально-Черноземного региона России.

Материал и методы. Обследованы 584 женщины: 375 пациенток с АГ и 209 — контрольной группы. Анализ полиморфных локусов металлопротеиназ осуществляли с помощью real-time ПЦР методом TagMan зондов. Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе "STATISTICA for Windows 10.0'.. Регуляторный потенциал полиморфных локусов анализировали с помощью программного обеспечения HaploReg (v4.1). Оценку воздействия однонуклеотидных полиморфизмов на генную экспрессию (cis-eQTL) проводили по данным проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx). Результаты. Установлено, что полиморфный аллель G (ОШ =1,49, 95% ДИ 1,161,92, р=0,002) и генотип GG (ОШ =1,64, 95% ДИ 112-2,40, р=0,010) по локусу rs1 1568818 гена MMP7 ассоциированы с высоким риском развития АГ у женщин. Выявлено, что полиморфный маркер rs1 1568818 MMP7 имеет значимые эпигенетические эффекты: располагается в области гистонов, маркирующих промоторы и энхансеры, в регионе сайтов связывания с факторами транскрипции Foxa known1, PLZF, Pou5f1 known2 и GR known4, в области связывания регуляторных белков TBP, c-FOS, c-Jun. Найдено, что полиморфный вариант G rs1 1568818 MMP7 ассоциирован с пониженным уровнем экспрессии гена ММР7.

Заключение. Полиморфный локус rs11568818 гена MMP7 вовлечен в развитие АГ у женщин Центрально-Черноземного региона России.

Российский кардиологический журнал. 2018;23(10):14-17

http://dx.doi.org/1015829/1560-4071-2018-10-14-17

Ключевые слова: артериальная гипертония, матриксные металлопротеи-назы, однонуклеотидный полиморфизм.

Конфликт интересов: не заявлен.

'ФГАОУ ВО Белгородский государственный национальный исследовательский университет, Белгород; 2фГБОУ ВО Курский государственный медицинский университет Минздрава России, Курск, Россия.

Москаленко М. И.* — к.б.н., ст. преподаватель кафедры медико-биологических дисциплин медицинского института, ORCID: 0000-0003-0769-4095, Пономаренко И. В. — к.м.н., доцент кафедры медико-биологических дисциплин медицинского института, ORCID: 0000-0002-5652-0166, Полоников А. В. — д.м.н., профессор, профессор кафедры биологии, медицинской генетики и экологии, директор НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии, ORCID: 0000-0001-6280-247X, Чурносов М. И. — д.м.н., профессор, зав. кафедрой медико-биологических дисциплин медицинского института, ORCID: 00000003-1254-6134.

*Автор, ответственный за переписку (Corresponding author): mariam31011989@yandex.ru

АГ — артериальная гипертония, ДИ — доверительный интервал, ММР — матриксные металлопротеиназы, ОНП — однонуклеотидный полиморфизм, ОШ — отношение шансов.

Рукопись получена 19.07.2018 Рецензия получена 05.09.2018 Принята к публикации 12.09.2018

Polymorphic locus RS11568818 of the MMP7 gene is associated with the development of essential

hypertension in women

1 12 1 Moskalenko M. I., Ponomarenko I. V., Polonikov A. V. , Churnosov M. I.

Aim. To study the involvement of polymorphic loci rs1799750 MMR1, rs3025058 MMR3, rs 11568818 MMR7, rs1320632 MMR8 and rs1 1225395 MMR8 in the development of arterial hypertension (AH) in women of the Central Chernozemny Region of Russia.

Material and methods. During the study 584 women were examined: 375 patients with AH and 209 control subjects. Analysis of metalloproteinases' polymorphic loci was performed using real-time PCR (TagMan probes). Statistical processing of the results was performed using the STATISTICA for Windows 10.0. The regulatory potential of polymorphic loci was analyzed using the HaploReg software (v4.1). Assessment of the effects of single nucleotide polymorphisms on gene expression (cis-eQTL) was performed according to the Genotype-Tissue Expression (GTEx) project.

Results. We established that the polymorphic allele G (OR=1,49, 95% CI=1,16-1,92, p=0,002) and the GG genotype (OR=1,64, 95% CI=112-2,40, p=0,010) in the rs1 1568818 locus of MMP7 gene is associated with a high risk of AH in women. Polymorphic marker rs11568818 MMP7 has significant epigenetic effects: located in the region of histones, labeling promoters and enhancers, in the region of binding sites with transcription factors Foxa known1, PLZF, Pou5f1 known2 and GR known4, in binding niche of regulatory proteins TBP, c-FOS, c-Jun. It was found that the polymorphic variant G rs1 1568818 of MMP7 is associated with a reduced level of expression of the MMP7 gene.

Conclusion. The polymorphic locus rs11568818 of the MMP7 gene is involved in the development of AH in women of the Central Chernozemny Region of Russia.

Russian Journal of Cardiology. 2018;23(10):14-17

http://dx.doi.org/10.15829/1560-4071-2018-10-14-17

Key words: arterial hypertension, matrix metalloproteinases, single nucleotide polymorphism.

Conflicts of Interest: nothing to declare.

'Medical Institute of Belgorod State University, Belgorod; 2Medical Genetics and Ecology of Kursk State Medical University, Kursk, Russia.

Moskalenko M. I. ORCID: 0000-0003-0769-4095, Ponomarenko I. V. ORCID: 00000002-5652-0166, Polonikov A. V. ORCID: 0000-0001-6280-247X, Churnosov M. I . ORCID: 0000-0003-1254-6134.

Received: 19.072018 Revision Received: 05.09.2018 Accepted: 12.09.2018

В Российской Федерации в структуре общей смертности на долю заболеваний сердечно-сосудистой системы (ССЗ) приходится 55,9% всех случаев, что 1,19 раза выше, чем в европейских странах [1]. Наиболее распространенным заболеванием сердечно-сосудистой системы является артериальная гипертония (АГ) — она регистрируется у 43,5% взрослого населения РФ, среди которого большую часть составляют женщины [2, 3]. Последние данные свидетельствуют о вовлеченности в этиопатогенез АГ процессов артериального ремоделирования [4]. Реорганизация компонентов сосудистой стенки сопровождается деградацией экстрацеллюлярного матрикса протеолитическими ферментами — матриксными металлопротеиназами (ММР) [5]. Показано, что изменение уровней ММР в плазме крови ведет к аномальному артериальному ремоделированию, снижению эластичности сосудов и развитию гипертензии [6]. Ранее проведенные исследования демонстрируют ассоциации полиморфных локусов генов ММР с развитием АГ и ее осложнений [7], однако этот вопрос требует дальнейшего изучения.

Цель: изучить вовлеченность полиморфных локусов ^1799750 ММР1, ^3025058 ЫЫР3, ^11568818 ММР7, ^1320632 ММР8 и ^11225395 ММР8 в развитие АГ у женщин Центрально-Черноземного региона России.

Материал и методы

Выборку для настоящего исследования составили 584 женщины: 375 пациенток с АГ и 209 — группы контроля. Женщины включались в исследование после подтверждения диагноза "АГ" при помощи лабораторных, инструментальных и клинических методов обследования в соответствии с диагностическими рекомендациями [3]. Критериями включения в группу пациентов с АГ были систолическое артериальное давление (САД) >140 мм рт.ст. и/или диастолическое артериальное давление (ДАД) >90 мм рт.ст.; отсутствие у пациентки симптоматических и вторичных гипертензий, печеночной и почечной недостаточности. Критериями включения в контрольную группу были САД <140 мм рт.ст. и ДАД <90 мм рт.ст., отсутствие у женщины метаболического синдрома, аутоиммунных, онкологических заболеваний. В ис-следование включались женщины русской национальности, уроженки Центрально-Черноземного региона РФ, не состоящие между собой в родстве. Группы больных и контроля формировались с 2013г по 2016г на базе кардиологического отделения ОГБУЗ Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. Средний возраст пациенток с АГ (58,80+9,64 лет) и женщин контрольной группы (58,17+9,30 лет) был сопоставим по и-критерию Манна-Уитни (р=0,43). Исследование было выполнено в соответствии

со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской Декларации. Исследование проводилось под контролем этического комитета медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета. Информированное согласие на проведение исследования получено от всех участников.

Всем индивидуумам, включенным в исследование, проводилась оценка генотипов по пяти локу-сам - rs 1799750 MMP1, rs3025058 MMP3, rs11568818 MMP7, rs1320632 MMP8 и rs11225395 MMP8. Эти однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП) выбраны для анализа в соответствии с описанными ранее критериями [8] в связи с их существенным регуляторным потенциалом и влиянием на уровень экспрессии генов (согласно данным, представленным в базе HaploReg (v.4.1.) http://archive.broadinstitute.org).

Геномную ДНК выделяли стандартным методом фенол-хлороформной экстракции из лейкоцитов периферической крови, взятой из локтевой вены пациента. Анализ полиморфных маркеров металло-протеиназ осуществляли при помощи полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на термоциклере CFX-96 Real-Time System (Bio-Rad). В работе использовали олигонуклеотидные праймеры и зонды, синтезированные ООО "Синтол". Последовательности прай-меров и зондов приведены в исследованиях A. Lievre (2006) [9] и P. P. Pratikshya (2012) [10]. Повторное генотипирование 5% образцов, рандомным образом выбранных из исследуемых выборок больных и контроля, дало 100% воспроизводимость. Соответствие распределения частот генотипов и аллелей уравнению Харди-Вайнберга оценивали при помощи X -критерия. Анализ частот генотипов и аллелей в обследуемых группах проводили в таблицах сопряженности 2х2 с использованием критерия X2 с учетом поправки Йетса на непрерывность. Статистическую обработку полученных результатов производили в программе "STATISTICA for Windows 10.0". Для коррекции количества анализируемых ОНП вводили поправку Бонферрони, равную 5, после чего статистически значимым считали р<0,01. Характер ассоциаций полиморфных вариантов с формированием АГ оценивали, используя показатель отношения шансов (ОШ) и его 95% доверительный интервал (95% ДИ).

Анализ регуляторного потенциала изучаемых ОНП проводили в программе HaploReg (v4.1) (http:// archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg. php). Влияние полиморфного локуса на уровень экспрессии генов (cis-eQTL) изучали по данным проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx). Характер связи аллельных вариантов ОНП с уровнем транскрипции генов оценивали по ß-коэффициенту линейной регрессии, который определяет изменение нормализованного показателя экспрессии гена на один поли-

Таблица 1

Частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров ММР у женщин в зависимости от наличия АГ

Локус Аллели/генотипы Женщины с АГ (n=375)n(%) Женщины без АГ (n=209) n (%) ОШ (95% ДИ) p

rs1799750 1G 364 (48,53%) 221 (53,12%) 0,83 (0,65-1,06) 0,15

MMP1 2G 386

1G/1G 103 (2747%) 60 (28,85%) 0,93 (0,63-1,38) 0,80

1G/2G 180 (48,00%) 101 (48,56%) 0,98 (0,69-1,39) 0,97

2G2G 92 (24,53%) 47 (22,59%) 111 (0,73-1,70) 0,67

rs3025058 5A 342 (45,72%) 192 (4615%) 0,98 (0,77-1,26) 0,94

MMP3 6A 406

5A/5A 75 (20,05%) 48 (23,08%) 0,83 (0,54-1,29) 0,45

5A/6A 192 (51,34%) 96 (4615%) 1,23 (0,86-1,75) 0,27

6A/6A 107 (28,61%) 64 (30,77%) 0,90 (0,61-1,33) 0,65

rs1 1568818 A 265 (35,81%) 189 (45,43%) 0,67 (0,52-0,86) 0,002

MMP7 G 475

AА 45 (1216%) 42 (2019%) 0,55 (0,33-0,89) 0,014

AG 175 (47,30%) 105 (50,48%) 0,88 (0,62-1,25) 0,52

GG 150 (40,54%) 61 (29,33%) 1,64 (112-2,40) 0,010

rs1320632 A 672 (91,80%) 366 (89,27%) 1,35 (0,88-2,07) 019

MMP8 G 60

AA 308 (8415%) 162 (79,02%) 1,41 (0,89-2,23) 015

AG 56 (15,30%) 42 (20,49%) 0,70 (0,44-112) 014

GG 2 (0,55%) 1 (0,49%) 0,89 (0,03-2,61) 0,99

rs11225395 C 418 (55,88%) 203 (48,80%) 1,33 (1,04-1,70) 0,024

MMP8 T 330

CC 118 (31,55%) 50 (24,04%) 1,46 (0,97-218) 0,07

CT 182 (48,66%) 103 (49,52%) 0,97 (0,68-1,38) 0,91

TT 74 (19,79%) 55 (26,44%) 0,68 (0,45-1,04) 0,08

морфный вариант (http://www.gtexportal.org/), в анализ включались результаты с р<8*10- , р <0,05.

Результаты и обсуждение

Для всех изученных полиморфных локусов наблюдаемое распределение генотипов соответствовало ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (р>0,05). Частоты аллелей и генотипов по изученным ОНП у пациенток с АГ и в контрольной группе представлены в таблице 1, значимые различия установлены для г>11568818 ММР7.

Обнаружено, что частота аллеля О и генотипа ОО по локусу ^11568818 ММР7 в группе пациенток с гипер-тензией достоверно выше (в 1,18 и 1,38 раза, соответственно) по сравнению с женщинами контрольной группы (р<0,010). Данный полиморфный вариант является фактором риска развития заболевания у его носителей (отношение шансов составляет 1,49 для аллеля и 1,64 — для генотипа). Установлены различия в частотах аллелей по локусу ге11225395 ММР8 между больными и контролем (р=0,024), однако они не оставались значимыми после коррекции на множественные сравнения (р>0,010). Анализ связи локусов

rs1799750 MMP1, rs3025058 MMP3, rs1320632 MMP8 с АГ у женщин ассоциаций не показал.

Итак, нами обнаружены ассоциации однонуклео-тидного полиморфизма rs11568818 ММР7 с восприимчивостью к АГ у женщин. Следует отметить, что в ранее проведенных исследованиях также демонстрируется половой диморфизм в связях генов-кандидатов с развитием АГ [11] и ее осложнений [12].

При помощи программного обеспечения HaploReg (v4.1) получено, что полиморфный маркер rs11568818 гена MMP7 локализован в регионе гиперчувствительности к ДНКазе-1 в эндотелиальных, лимфобластоид-ных и гемопоэтических стволовых клетках, а также в клетках головного мозга, поджелудочной и молочной железы. Данный ОНП располагается в регионе модифицированных гистонов (H3K4me1 и H3K4me3), которые маркируют энхансеры и промоторы в 11 различных органах и тканях, в том числе, в клетках периферической крови, эндотелиоцитах, мезенхимальных стволовых клетках и др. Выявлено, что rs11568818 находится в сайтах связывания регуляторных белков TBP (TATA-binding protein), c-FOS, c-Jun и в регионах регуляторных ДНК-мотивов, в которых происходит связы-

вание с 4 факторами транскрипции. При этом аллель G, являющийся фактором риска развития гипертен-зии, повышает аффинность к транкрипционным факторам Foxa known 1 (различие между ALOD scores аллелей G (alt) и А (ref) составляет -3,1), PLZF (ALOD scores=-1,5), Pou5f1 known2 (ALOD scores=-3,2) и снижает аффинность к транскрипционному фактору GR known4 (LOD scores=0,8) (http://archive.broadinstitute. org/mammals/haploreg/haploreg.php).

In silico проведен анализ ассоциаций ОНП rs11568818 ММР7 с уровнем экспрессии генов (http:// www.gtexportal.org/). Установлено, что полиморфный вариант G rs11568818 связан с пониженным уровнем экспрессии гена ММР7 в клетках поджелудочной железы (Р=-0,31, р=5,1*10-11, FDR <0,05), легких (Р—0,35, р=8,1*10-14, FDR <0,05), кожи (р—0,23, р=3,9*10-8, FDR <0,05), желудка (р—0,32, р=1,9*10-6, FDR <0,05), печени (Р=-0,46, р=1,2*10-5, FDR <0,05).

По данным базы GeneCards, ген ММР7 является частью кластера генов на 11 хромосоме и кодирует одноименный фермент, который характеризуется отсутствием консервативного C-концевого гемопек-синового домена. Матриксная металлопротеиназа 7 отвечает за протеолитическое расщепление эластина, желатинов I, III, IV, V типов, фибронектина, казеина, протеогликанов и вовлечена в процессы регенерации после повреждений, ремоделирования внеклеточного матрикса, а также модулирует миграцию, пролиферацию и апоптоз клеток (http://www.genecards.org/). Показанные эпигенетические эффекты rs11568818 и общебиологические функции гена MMP7 могут служить медико-биологической основой установленных ассоциаций с развитием АГ.

Литература/References

1. Piepoli MF, Hoes AW, Agewall S, et al. 2016 European Guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice: The Sixth Joint Task Force of the European Society of Cardiology and Other Societies on Cardiovascular Disease Prevention in Clinical Practice (constituted by representatives of 10 societies and by invited experts) Developed with the special contribution of the European Association for Cardiovascular Prevention & Rehabilitation (EACPR). European Heart Journal. 2016;37(29):2315-81. doi:10.1093/eurheartj/ehw106.

2. NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC). Worldwide trends in blood pressure from 1975 to 2015: a pooled analysis of 1479 population-based measurement studies with 19-1 million participants. Lancet (London, England). 2017;389(10064):37-55. doi:101016/ S0140-6736(16)31919-5.

3. Britov AN, Pozdnyakov YM. Cardiovascular prevention. National recommendations. VNOK. Cardiovascular Therapy Prevention. 2011;10(6):57. (In Russ.) Бритов А. Н., Поздняков Ю. М. Кардиоваскулярная профилактика. Национальные рекомендации. ВНОК. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2011;10(6):57.

4. Intengan HD, Schiffrin EL. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 2001;38:581-7. doi:10/l161/hy09t1.096249.

5. Chen Q, Jin M, Yang F, et al. Matrix Metalloproteinases: Inflammatory Regulators of Cell Behaviors in Vascular Formation and Remodeling. Mediators of Inflammation. 2013;2013:928315. doi:101155/2013/928315.

6. Dhingra R, Pencina MJ, Schrader P, et al. Relations of Matrix Remodeling Biomarkers to Blood Pressure Progression and Incidence of Hypertension in the Community. Circulation. 2009;119(8):1101-7. doi:1011161/CIRCULATI0NAHA1108.821769.

7. Moskalenko MI. The involvement of genes of matrix metalloproteinases in the development of arteial hypertension and its complication (review). Research Result. Medicine and Pharmacy. 2018;4(1 ):53-69. (In Russ.) Москаленко М. И. Вовлеченность генов мат-риксных металлопротеиназ в формирование артериальной гипертензии и ее осложнений (обзор). Научный результат. Медицина и фармация. 2018;4(1):53-69. doi:1018413/2313-8955-2018-4-1-53-69.

Данные ассоциативных исследований, посвященных выявлению связи ^11568818 гена ММР7 с сердечно-сосудистыми заболеваниями, противоречивы. Так, в работе Jormsjо (2001) установлено, что у носительство генотипа ОО по локусу ге11568818 ММР7 коррелирует с высоким риском развития сердечно-сосудистой патологии у шведского населения (р<0,01) [13], что согласуется с результатами настоящего исследования. Однако не установлено ассоциаций ^11568818 с развитием осложнений АГ — инфаркта миокарда у мексиканского [14] и турецкого населения [15].

Заключение

Таким образом, нами проведен анализ вовлеченности полиморфизма генов ММР в развитие АГ у женщин и установлены значимые ассоциации с АГ локуса ^11568818 ММР7. Получено, что аллель О и генотип ОО являются рисковыми в отношении развития заболевания (ОШ =1,49 и ОШ =1,64, соответственно). Однонуклеотидный полиморфизм ММР7 характеризуется значимым регуляторным потенциалом: располагается в области гистонов, которые маркируют промоторы и энхансеры, в регионе ДНК-мотивов, являющихся сайтами связывания с 4 факторами транскрипции, в области связывания 3 регуляторных белков. Полиморфный вариант О ^11568818 снижает уровень экспрессии (ск-ерТЬ) гена ММР7 в различных органах.

Конфликт интересов: все авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

8. Ponomarenko IV. Selection of polymorphic locuses for analysis of associations in genetic-epidemiological researches. Research Result. Medicine and Pharmacy. 2018;4(2):40-54. (In Russ.) Пономаренко И. В. Отбор полиморфных локусов для анализа ассоциаций при генетико-эпидемиологических исследованиях. Научный результат. Медицина и фармация. 2018;4(2):40-54. doi:1018413/2313-8955-2018-4-2-0-5.

9. Liеvre A, Milet J, Carayol J. Genetic polymorphisms of MMP1, MMP3 and MMP7 gene promoter and risk of colorectal adenoma. BMC Cancer. 2006;6:270. doi:101186/1471-2407-6-270.

10. Pradhan-Palikhe P, Pussinen PJ, Vikatmaa P, et al. Single nucleotide polymorphism -799C/T in matrix metalloproteinase-8 promoter region in arterial disease. Innate Immun. 2012;18(3):511-7. doi:101177/1753425911423852.

11. Giannakos E, Vardali E, Bartekova M, et al. Changes in Activities of Circulating MMP-2 and MMP-9 in Patients Suffering From Heart Failure in Relation to Gender, Hypertension and Treatment: a Cross-Sectional Study. Physiol Res. 2016;19(65):149-52. ISSN 1802-9973.

12. Gammelmark A, Nielsen MS, Lundbye-Christensen S, et al. Common Polymorphisms in the 5-Lipoxygenase Pathway and Risk of Incident Myocardial Infarction: A Danish Case-Cohort Study. PLoS ONE. 2016;11(11):e0167217. doi:1011371/journal.pone.0167217.

13. Jonm^ S, Whatling C, Walter DH, et al. Allele-Specific Regulation of Matrix Metalloproteinase-7 Promoter Activity Is Associated With Coronary Artery Luminal Dimensions Among Hypercholesterolemic Patients. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 2001;21:1834-9. doi:101161/hq1101.098229.

14. Pеrez-Hernаndez N, Vargas-Alarran G, Martinez-Rodriguez N, et al. The matrix metalloproteinase 2-1575 gene polymorphism is associated with the risk of developing myocardial infarction in Mexican patients. J Atheroscler Thromb. 2012;19(8):718-27. doi:10.5551/jat11817.

15. Alp E, Yilmaz A, Tulmac M, et al. Analysis of MMP-7 and TIMP-2 gene polymorphisms in coronary artery disease and myocardial infarction: A Turkish case-control study. Kaohsiung J Med Sci. 2017;33(2):78-85. doi:10/1016/j.kjms.2016112.002.