НОВЫЕ ВИДЫ ЛЕЧЕНИЯ
NEW TYPES OF TREATMENT

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к агентам на основе полипептидов для применения в лечении или профилактике микробных инфекций у субъекта, страдающего иммунодефицитом или восприимчивого к иммунодефициту.
Предшествующий уровень техники
Первичные иммунодефициты (ПИД) являются разнообразной группой из более чем 300 генетических расстройств, которые в корне влияют на развитие и/или функциональность иммунной системы. Большинство из них являются редкими моногенными нарушениями, но спектр ПИД постоянно расширяется с идентификацией новых синдромов иммунодефицита с технологиями секвенирования следующего поколения и улучшением клинических знаний. Обычно пациенты имеют высокую восприимчивость к инфекциям или инфицированию необычными организмами, и у них могут также развиваться аутоиммунные или аутовоспалительные заболевания и лимфоретикулярные злокачественные новообразования. Хотя минимальные или поддерживающие виды терапии эффективны для многих таких состояний, для тяжелых состояний требуется раннее эффективное лечение для предотвращения хронической заболеваемости и ранней смертности.
Частота большинства первичных иммунодефицитов не установлена из-за отсутствия национального регистра или отчетности правительственных исследований в области здравоохранения. В Соединенных Штатах примерно у 500,000 лиц имеется один из известных первичных иммунодефицитов, при этом примерно 50,000 случаев диагностируется каждый год. Первичным иммунодефицитам, как кажется, примерно в равной степени подвержены и мужчины и женщины.
ПИД также являются неизученной проблемой в Европе, где установлено, что два миллиона детей и взрослых страдают рекуррентными инфекциями в странах - членах Сообщества, без диагноза, и таким образом, не получая лечения.
Разработан ряд различных стратегий лечения для контроля первичных иммунодефицитов, включая:
(а) Внутривенный иммуноглобулин (ввИГ)
В течение последних 20 лет внутривенно вводимый иммуноглобулин (ввИГ) применяется для лечения агаммаглобулинемии. Этот агент в настоящее время является стандартным лечением для большинства дефицитов антител. Чаще всего ВВИГ применяют у пациентов с X-сцепленной агаммаглобулинемией, вариабельным неклассифицируемым иммунодефицитом, X-сцепленным иммунодефицитом с гиперпродукцией IgM, тяжелым комбинированным иммунодефицитом, синдромом Вискотта-Олдрича, и избирательной недостаточностью иммуноглобулинов класса IgG.
ВВИГ также применяется или рассматривается для применения при широком ряде других заболеваний. Соответственно, его ограниченная доступность является проблемой.
(b) Трансплантация костного мозга
Трансплантаты костного мозга от HLA-идентичных доноров могут применяться в лечении пациентов с клеточными иммунодефицитами, такими как тяжелый комбинированный иммунодефицит, синдром Вискотта-Олдрича и синдром Ди Джорджи, и могут быть благоприятны для пациентов с хроническим грануломатозом. Трансплантация костного мозга в настоящее время не применяется в лечении дефицитов антител.
HLA-идентичные доноры не всегда доступны. Долговременное выживание может быть ниже с трансплантатами костного мозга от гаплоидентичных доноров. Таким образом, исследования альтернативных стратегий, таких как генная терапия, могут принести пользу для лечения пациентов с первичными иммунодефицитами, которым в ином случае необходима трансплантация костного мозга.
(c) Антибиотики и другие виды лечения
Когда проблемой являются рекуррентные инфекции, у многих пациентов с первичными иммунодефицитами применяют антибиотики, по отдельности или в комбинации с ВВИГ. Например, у пациентов с хроническим грануломатозом профилактическая терапия триметоприм-сульфаметоксазолом (Bactrim, Septra) снижает частоту тяжелых инфекций на 50%. Подобным образом, лечение дефицитов комплемента направлено на профилактику инфекции, и состоит из профилактики антибиотиками и иммунизации инкапсулированными бактериями (например, гептовалентной пневмококковой вакциной, конъюгатной вакциной Haemophilus В, менингококковой полисахаридной вакциной).
Другие виды лечения первичных иммунодефицитов включают замену ферментов у пациентов с дефицитом аденозин-дезаминазы (подтипа тяжелого комбинированного иммунодефицита) и терапию цитокинами у пациентов с хроническим грануломатозом.
Недавно также были достигнуты успехи в генной терапии первичных иммунодефицитов (например, см. Rivat et ah, 2012, Hum. Gene Ther. 23(7): 668-675).
Однако остается потребность в усовершенствованных способах лечения для контроля микробных инфекций у субъектов с иммунодефицитом, таким как первичный иммунодефицит или индуцированный лекарствами иммунодефицит, или для улучшения качества жизни таких пациентов.
Изложение сущности изобретения
Первый аспект изобретения обеспечивает полипептид, обладающий протеазной активностью, для применения в лечении или профилактике микробных инфекций у субъекта, страдающего иммунодефицитом или восприимчивого к иммунодефициту.
Термин «протеаза» включает любой фермент, способный катализировать протеолиз in vivo в организме млекопитающего (например, человека). Таким образом, любой тип протеаз может применяться в настоящем изобретении, включая сериновые протеазы (такие как трипсин/химотрипсин), треониновые протеазы, цистеиновые протеазы, аспартатные протеазы, глутаминовые протеазы и металлопротеазы, но не ограничиваясь ими.
Термин «иммунодефицит» означает состояние, при котором иммунитет субъекта нарушен целиком или частично. Иммунодефицит может быть приобретенным или вторичным, например, после применения иммуносупрессивной терапии, или может быть первичным, например, натуральным расстройством, при котором часть иммунной системы организма отсутствует или не функционирует нормально. Таким образом, в одном варианте осуществления иммунодефицит является вторичным или приобретенным иммунодефицитом.
Например, иммунодефицит у субъекта может возникать при применении иммуносупрессивной терапии (такой, как глюкокортикоиды, цитостатики, антитела; лекарства, действующие на иммунофилины; интерфероны, опиоиды, ФНО-связывающие белки, микофенолат и радиотерапия).
Виды иммуносупрессивной терапии общеизвестны в медицине, например:
(a) для профилактики отторжения трансплантированных органов и тканей (например, костного мозга, сердца, почек, печени);
(b) для лечения аутоиммунных заболеваний, или заболеваний аутоиммунного происхождения (например, ревматоидного артрита, рассеянного склероза, миастении гравис, системной красной волчанки, саркоидоза, фокального сегментарного гломерулосклероза, болезни Крона, болезни Бехчета, вульгарной пузырчатки, и язвенного колита); и
(c) для лечения неаутоиммунньгх воспалительных заболеваний (например, для долговременного контроля аллергической астмы).
В другом варианте осуществления иммунодефицит является натуральным иммунодефицитом. Например, иммунодефицит может быть обусловлен первичным иммунодефицитом (см. ниже), онкологическим заболеванием (таким как лейкоз, лимфома, множественная миелома), хронической инфекцией (такой как синдром приобретенного иммунодефицита или СПИД), плохим питанием и/или старением.
Первичные иммунодефициты включают ряд заболеваний, которые делают пациентов более восприимчивыми к инфекциям. При отсутствии лечения эти инфекции могут быть фатальными. Обычные первичны иммунодефициты включают нарушения гуморального иммунитета (влияющие на B-клеточную дифференцировку или выработку антител), T-клеточные дефекты и комбинированные B- и T-клеточные дефекты, фагоцитарные нарушения, и дефициты комплемента. Главные осложнения этих нарушений включают множество инфекций, несмотря на интенсивное лечение, инфекции необычными или оппортунистическими организмами, задержку в развитии или плохой рост, и отягощенный семейный анамнез. Раннее распознавание и диагностика могут значительно изменить курс первичных иммунодефицитов, и оказывают положительное влияние на результат лечения пациента.
В одном варианте осуществления пациент имеет первичный иммунодефицит, выбранный из группы, состоящей из заболеваний, перечисленных в таблицах I-VIII.
Таблица I
Комбинированные T- и B-клеточные иммунодефициты
При этих нарушениях как T-лимфоциты, так и B-лимфоциты являются дисфункциональными, либо их число снижено. Основными членами являются различные типы тяжелых комбинированных иммунодефицитов (ТКИД).
1. T-/В+ТКИД (T-клетки преимущественно отсутствуют): дефицит γс, дефицит JAK3, дефицит α-цепи ИЛ-7-рецептора, дефицит CD45, дефицит CD3δ/CD3ε.
2. T-/B- ТКИД (и Т, и B-клетки отсутствуют): дефицит RAG , дефицит DCLRE1C, дефицит аденозин-дезаминазы (ADA), ретикулярный дисгенез.
3. Синдром Оменна.
4. Дефицит ДНК-лигазы IV типа
5. Дефицит Cernunnos
6. Дефицит CD40 лиганда
7. Дефицит CD40
8. Дефицит пурин-нуклеотзид-фосфорилазы
9. Дефицит CD3γ
10. Дефицит CD8
11. Дефицит ZAP-70
2+
12. Дефицит Са каналов
13. Дефицит I класса МНС
14. Дефицит II класса МНС
15. Дефицит мотива «крылатая спираль»
16. Дефицит CD25
17. Дефицит STAT5b
18. Дефицит Itk
19. Дефицит DOCK8
Таблица II
Преимущественные дефициты антител
При первичных дефицитах антител снижено содержание одного или нескольких изотипов антител, или они не функционируют надлежащим образом.
1. Отсутствие B-клеток, приводящее к тяжелому снижению всех типов антител: X-сцепленная агаммаглобулинемия (дефицит btk, или агаммаглобулинемия Брутона), дефицит μ-тяжелой цепи, дефицит 15, дефицит Igα, дефицит BLNK, тимома с иммунодефицитом.
2. B-клетки присутствуют в низком или нормальном количестве, но со снижением 2 или более изотипов (обычно IgG и IgA, иногда IgM): вариабельный неклассифицируемый иммунодефицит (ВНКИД), дефицит ICOS, дефицит CD19, дефицит TACI (TNFRSF13B), дефицит BAFF рецептора.
3. Нормальное количество B-клеток со снижением IgG и IgA и повышением IgM: гипер-IgM синдромы.
4. Нормальное количество B-клеток с дефицитами изотипов или легких цепей: делеции тяжелых цепей, дефицит каппа-цепи, изолированный дефицит подклассов IgG, дефицит подклассов IgA и IgG, избирательный дефицит иммуноглобулина А.
5. Дефицит специфических антител к специфическим антигенам с нормальными концентрациями B-клеток и иммуноглобулинов.
6. Транзиторная гипогаммаглобулинемия новорожденных (ТГН).
Таблица III
Другие хорошо изученные синдромы иммунодефицита
Ряд синдромов, не относящихся к формальной классификации, но в ином отношении распознаваемых по конкретным клиническим или иммунологическим характеристикам.
1. Синдром Вискотта-Олдрича
2. Дефекты восстановления ДНК, не вызывающие изолированный ТКИД: атаксия-телеангиэктазия, атаксия-подобный синдром, синдром повреждения Неймегена, синдром Блума
3. Синдром Ди Джорджи (когда связан с дефектами тимуса)
4. Различные иммуно-костные дисплазии (аномальное развитие скелета с иммунными нарушениями): хрящево-волосяная дисплазия, синдром Шимке
5. Хержманского-Пудлака синдром 2 типа
6. Гипер-IgE синдром
7. Хронический кожно-слизистый кандидоз
8. Веноокклюзионная болезнь печени с иммунодефицитом (VODI)
9. XL-врожденный дискератоз (синдром Хойераала-Хрейдарссона)
Таблица IV
Заболевания дисрегуляпии иммунитета
При определенных состояниях преимущественной проблемой является скорее регуляция, чем собственно активность частей иммунной системы.
1. Иммунодефицит с гипопигментацией или альбинизмом: синдром Чедиака-Хигаси, синдром Грисцелли 2 типа.
2. Семейный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз: дефицит перфорина, дефицит MUNC13D, дефицит синтаксина 11
3. X-сцепленный лимфопролиферативный синдром
4. Синдромы с аутоиммунной реакцией:
(a) Аутоиммунный лимфопролиферативный синдром: типа 1а (дефекты CD95), типа 1b (дефекты Fas лиганда), типа 2а (дефекты CASP10), типа 2b (дефекты CASP8)
(b) APECED (аутоиммунная полиэндокринопатия с кандидозом и эктодермальной дистрофией)
(c) IPEX (иммунодисрегуляции, полиэндокринопатии и энтеропатии X-сцепленный синдром)
(d) Дефицит CD25
Таблица V
Врожденные нарушения числа, функции фагоцитов, или того и другого При некоторых состояниях снижается число фагоцитов или их функциональная способность.
1. Тяжелая врожденная нейтропения: из-за дефицита ELA2 (с миелодисплазией)
2. Тяжелая врожденная нейтропения: из-за дефицита GFI1 (с Т/В лимфопенией)
3. Синдром Костманна
4. Нейтропения с сердечными и урогенитальными пороками развития
5. Болезнь накопления гликогена типа 1b
6. Циклическая нейтропения
7. X-сцепленная нейтропения/миелодисплазия
8. Дефицит Р14
9. Дефицит адгезии лейкоцитов 1 типа
10. Дефицит адгезии лейкоцитов 2 типа
11. Дефицит адгезии лейкоцитов 3 типа
12. Дефицит RAC2 (синдром иммунодефицита нейтрофилов)
13. Дефицит бета-актина
14. Локализованный ювенильный периодонтит
15. Синдром Папийона-Лефевра
16. Дефицит специфических гранул
17. Синдром Швахмана-Даймонда
18. Хронический грануломатоз: X-сцепленный
19. Хронический грануломатоз: аутосомный (CYBA)
20. Хронический грануломатоз: аутосомный (NCF1)
21. Хронический грануломатоз: аутосомный (NCF2)
22. Дефицит ИЛ-12 и ИЛ-23 бета-1 цепи
23. Дефицит ИЛ-12р40
24. Дефицит рецептора-1 интерферона-гамма
25. Дефицит рецептора-2 интерферона-гамма
26. Дефицит STAT1 (2 формы)
27. AD гипер-IgE
28. AR гипер-IgE
29. Легочный альвеолярный протеиноз
Таблица VI
Нарушения врожденного иммунитета
Некоторые редкие состояния обусловлены дефектами врожденной иммунной системы. Многие из этих состояний связаны с кожными проблемами.
1. Гипогидротическая эктодермальная дисплазия
(a) Дефицит NEMO
(b) Дефицит IKBA
2. EDA-ID
3. Дефицит IRAK-4
4. Дефицит MyD88
5. Синдром WHIM (бородавки, гипогаммаглобулинемия, инфекции, миелокатексис)
6. Бородавчатая эпидермодисплазия
7. Герпетический энцефалит
8. Хронический кожно-слизистый кандидоз
9. Трипаносомоз
Таблица VII
Аутовоспалительные заболевания
Большинство аутовоспалительных нарушений ведет скорее не к предрасположенности к инфекциям, а к избыточному воспалению. Большинство из них проявляется в виде синдромов периодической лихорадки.
1. Семейная средиземноморская лихорадка
2. Периодический синдром, ассоциированный с рецептором ФНО (TRAPS)
3. Гипер-IgD синдром (HTDS)
4. Заболевания, связанные с CIAS1:
(a) Синдром Макла-Уэльса
(b) Семейный холодовой аутовоспалительный синдром
(c) Мультисистемное воспалительное заболевание неонатального возраста
5. Синдром PAPA (пиогенный стерильный артрит, гангренозная пиодермия, акне)
6. Синдром Блау
7. Хронический рекуррентный мультифокальный остеомиелит и врожденная дисэритропоэтическая анемия (синдром Majeed)
8. DIRA (дефицит антагониста рецептора ИЛ-1)
Таблица VIII
Дефициты комплемента
Дефициты комплемента предрасполагают к инфекциям, а также к аутоиммунным состояниям.
1. Дефицит C1q (волчаночноподобный синдром, ревматоидное заболевание, инфекции)
2. Дефицит C1r (то же)
3. Дефицитен C1s
4. Дефицит С4 (то же)
5. Дефицит С2 (волчаночноподобный синдром, васкулит, полимиозит, пиогенные инфекции)
6. Дефицит С3 (рекуррентные пиогенные инфекции)
7. Дефицит С5 (нейссериальные инфекции, СКВ)
8. Дефицит С6 (то же)
9. Дефицит С7 (то же, васкулит)
10. Дефицит С8а
11. Дефицит C8b
12. Дефицит С9 (нейссериальные инфекции)
13. Дефицит С1-ингибитора (наследственный ангионевротический отек)
14. Дефицит фактора I (пиогенные инфекции)
15. Дефицит фактора Н (гемолитическо-уремический синдром, мембранопролиферативный гломерулонефрит)
16. Дефицит фактора D ((нейссериальные инфекции)
17. Дефицит пропердина (нейссериальные инфекции)
18. Дефицит МВР (пиогенные инфекции)
19. Дефицит MASP2
20. Дефицит рецептора комплемента 3 (CR3)
21. Дефицит мембранного кофакторного белка (CD46)
22. Дефицит ингибитора мембраноатакующего комплекса (CD59)
23. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия
24. Иммунодефицит, ассоциированный с дефицитом фиколина 3
Специалисту в данной области техники понятно, что полипептиды из настоящего изобретения не обеспечивают лечения первичных иммунодефицитов как таковых. Скорее, полипептиды направлены на облегчение или предотвращение одного или нескольких симптомов микробных инфекций, связанных с такими нарушениями.
Таким образом, под «лечением» мы подразумеваем облегчение, частично или в целом, симптомов микробных инфекций, включая бактериальные, вирусные и грибковые инфекции, но не ограничиваясь ими, у пациентов с первичным иммунодефицитом.
Под «профилактикой» мы подразумеваем снижение риска развития микробной инфекции у пациентов с первичным иммунодефицитом. Однако подразумевается, что такая профилактика может не быть абсолютной, т.е. может не предотвращать развитие микробных инфекций у всех таких пациентов. В связи с этим, термины «предотвращение» и «профилактика» могут применяться взаимозаменяемо.
В одном варианте осуществления микробная инфекция выбрана из группы, состоящей из бактериальных инфекций, вирусных инфекций, грибковых инфекций и дрожжевых инфекций.
В частности, полипептиды из настоящего изобретения предназначены для применения в лечении или профилактике вторичных инфекций полости рта и/или глотки (например, ротоглотки). Например, полипептиды можно применять для лечения или профилактики насморка и/или грибковой инфекции полости рта и/или воспаления десен.
Полипептиды из настоящего изобретения особенно пригодны в лечении или профилактике микробных инфекций у PI пациентов, страдающих регулярными эпизодами инфекции (например, переносящих по меньшей мере пять микробных инфекций в год, например, по меньшей мере десять, пятнадцать, двадцать, тридцать или больше микробных инфекций в год).
Полипептиды из настоящего изобретения могут проявлять трипсиновую активностью. Под «трипсиновой активностью» мы подразумеваем, что полипептиды проявляют пептидазную активность трипсинового фермента (ЕС 3.4.21.4) или родственной пептидазы (такой, как химотрипсиновые ферменты, ЕС 3.4.21.1).
Полипептиды из настоящего изобретения могут быть натуральными или ненатуральными.
В одном варианте осуществления полипептид получен, напрямую или опосредованно, из рыбы, такой как атлантическая треска (Gadus morhua), атлантический и тихоокеанский лосось (например, Salmo salar и виды Oncorhynchus) и минтай (Theragra chalcogramma).
Три основных изозима трипсина охарактеризованы из атлантической трески, обозначены как трипсин I, II и III (см. Ásgeirsson et al, 1989, Eur. J. Biochem. 180: 85-94, раскрытия которых включены посредством ссылки). Например, см. номер доступа GenBank № ACO90397.
Кроме того, у атлантической трески экспрессируются два основных изозима химотрипсина, обозначенные как химотрипсин А и В (см. . Ásgeirsson & Bjarnason, 1991, Comp. Biochem. Physiol. В 998: 327-335, раскрытие которого включено посредством ссылки). Например, см. номер доступа GenBank № САА55242.1.
В одном варианте осуществления полипептид включает или состоит из аминокислотной последовательности трипсина I из атлантической трески (Gadus morhua), т.е. SEQ ID NO: 1:
или ее фрагмента, варианта, производного или гибрида (или гибрида указанного фрагмента, варианта или производного), сохраняющего трипсиновую активность указанной аминокислотной последовательности.
В предпочтительном варианте осуществления полипептид включает или состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1. Такой полипептид может быть очищен из атлантической трески, например, как описано в . Ásgeirsson et al., 1989, Eur. J. Biochem. 180: 85-94 (раскрытие включено посредством ссылки).
Подходящие примерные полипептиды из настоящего изобретения и способы их получения также описаны в Европейском патенте №12027743 В (раскрытие включено посредством ссылки).
Термин «аминокислота», как применяется в настоящей заявке, включает стандартные двадцать генетически кодированных аминокислот и их соответствующие стереоизомеры в «D» форме (по сравнению с натуральной «L» формой), омега-аминокислоты и другие натуральные аминокислоты, нестандартные аминокислоты (например, α,α-двухзамещенные аминокислоты, N-алкил-аминокислоты, и т.д.), и химически дериватизированные аминокислоты (см. ниже).
Когда аминокислота имеет специфическое обозначение, такое как «аланин» или «Ала» или «А», термин относится как к L-аланину, так и к D-аланину, если ясно не указано противоположное. Другие нестандартные аминокислоты могут также быть подходящими компонентами для полипептидов из настоящего изобретения, если полипептид сохраняет необходимое функциональное свойство. Для показанных пептидов каждый кодированный аминокислотный остаток, если необходимо, представлен обозначением в виде одной буквы, что соответствует тривиальному наименованию обычной аминокислоты.
В соответствии с традицией, аминокислотные последовательности, раскрытые в настоящей заявке, обеспечиваются в направлении от N-конца к C-концу.
В одном варианте осуществления полипептиды из настоящего изобретения содержат или состоят из L-аминокислот.
Когда полипептид содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1, он может содержать дополнительные аминокислоты на своем N- и/или С-конце, помимо аминокислот из SEQ ID NO: 1, например, полипептид может содержать дополнительные аминокислоты на своем С-конце. Подобным образом, когда полипептид содержит фрагмент, вариант или производное аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1, он может содержать дополнительные аминокислоты на своем N- и/или С-конце.
Специалисту в данной области техники понятно, что полипептид из настоящего изобретения не обязательно должен соответствовать полноразмерному натуральному трипсиновому белку. Вместо этого полипептид может соответствовать фрагменту такого трипсина дикого типа, с тем условием, что указанный фрагмент сохраняет (по меньшей мере отчасти) активность натурального трипсинового белка, из которого он получен.
Трипсиновую активность можно определить с применением способов, хорошо известных в данной области техники. Например, коммерческие наборы для определения активности трипсина поставляются Abeam, Кембридж, Соединенное Королевство (см. Кат. № ab102531) и другими поставщиками. В одном варианте осуществления трипсиновую активность определяют с применением Cbz-Гли-Про-Арг-п-нитроанилида (Cbz-GPR-pNA) в качестве субстрата, с получением удельной активности по меньшей мере 10 Ед./мг, например, по меньшей мере 50 Ед./мг, или по меньшей мере 100 Ед./мг (см. ЕР 202743 В).
Так, в одном варианте осуществления полипептид включает или состоит из фрагмента аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1.
Таким образом, полипептид может содержать или состоять по меньшей мере из 15 смежных аминокислот из SEQ ID NO: 1, например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230 или 240 смежных аминокислот из SEQ ID NO: 1.
Например, фрагмент может содержать или состоять из аминокислотных остатков 61-77 из SEQ ID NO: 1.
Альтернативно или в дополнение, фрагмент может содержать или состоять из аминокислотных остатков 225-241 из SEQ ID NO: 1.
Для специалиста в данной области техники понятно, что полипептид из настоящего изобретения может альтернативно содержать или состоять из варианта аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 1 (или ее фрагментом). Такой вариант может быть ненатуральным вариантом.
Под «вариантами» полипептида мы подразумевает вставки, делеции и замены, консервативные или не консервативные. В частности, мы включаем варианты полипептида, где такие изменения сохраняют, по меньшей мере отчасти, трипсиновую активность указанного полипептида.
Такие варианты могут быть получены с применением способов белковой инженерии и сайт-специфического мутагенеза, хорошо известных в данной области техники, с применением рекомбинантных полинуклеотидов (см., например, «Molecular Cloning: a Laboratory Manual», 3rd edition, Sambrook & Russell, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press («Молекулярное клонирование: лабораторное руководство», 3-е издание), включенное в настоящей заявке посредством ссылки).
В одном варианте осуществления вариант имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50-процентную идентичность с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 1 или ее фрагментом, например, по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95, 96, 97, 98-процентную, или по меньшей мере 99-процентную идентичность.
Процент идентичности последовательности между двумя полипептидами можно определить с применением подходящих компьютерных программ, например, программы GAP Группы генетических расчетов Университета Висконсина, и необходимо понять, что процент идентичности рассчитывается по отношению к полипептидам, чьи последовательности оптимально выровнены.
Выравнивание может быть альтернативно проведено с применением программы Clustal W (как описано в Thompson et al., 1994, Nuc. Acid Res. 22: 4673-4680, включенной в настоящей заявке посредством ссылки).
Можно использовать следующие параметры:
Параметры быстрого попарного выравнивания: размер участка максимального совпадения; 1, размер окна; 5, штраф за пропуск в последовательности; 3, количество верхних диагоналей; 5. Способ подсчета: х процентов.
Параметры множественного выравнивания: штраф за внесение пропуска; 10, штраф за продолжение делеции; 0,05.
Матрица замен: BLOSUM.
Альтернативно, можно применять программу BESTFIT для определения выравниваний локальных последовательностей.
В одном варианте осуществления полипептид, имеющий протеазную активность, является вариантом SEQ ID NO: 1, включающим одну или несколько мутантных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислотных положений:
Е21, Н25, Н29, V47, К49, D50, L63, Н71, Н72, R74, N76, Т79, Y82, S85, S87, S89, N98, 199, V121, М135, V138, М145, V148, D150, K154, L160, М175, S179, А183, L185, V212, Y217, Р225, А229, V233, L234, V238, N240, Y241 и/или М242;
(где аминокислотная последовательность и нумерация приведены в соответствии с вводом в базу данных белков Protein Data Bank [PDB] '2EEK!', с исходным изолейцином из SEQ ID NO: 1, пронумерованным как положение 1-16).
Таким образом, полипептид, имеющий протеазную активность, может быть вариантом SEQ ID NO: 1, включающим одну или несколько аминокислотных мутаций, выбранных из группы, состоящей из:
Е21Т, H25Y, H29(Y/N), V47I, K49E, D50Q, L63I, H71D, H72N, R74(K/E), N76(T/L), T79(S/N), Y82F, S85A, S87(K/R), S89R, N98T, I99L, V121I, M135Q, V138I, M145(T/L/V/E/K), V148G, D150S, K154(T/V), L160(I/A), M175(K/Q), S179N, A183V, L185G, V212I, Y217(D/H/S), P225Y, A229V, V233N, L234Y, V238I, N240S, Y241N и/или M242I.
Например, полипептид, имеющий протеазную активность, может содержать или состоять из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1 с одной из следующих определенных мутаций (или их комбинаций):
(а) N240S, Y241N, S87K ("EZA-002");
(b) K154T ("EZA-003");
(с) K154L ("EZA-004");
(d) K154V ("EZA-005");
(е) K154E ("EZA-006");
(f) N98T ("EZA-007");
(g) I99L ("EZA-008");
(h) L185G, P225Y ("EZA-009");
(i) V212I ("EZA-0010");
(j) Y217D, M175K ("EZA-011");
(k) Y217H ("EZA-012");
(l) Y217S ("EZA-013");
(m) A229V ("EZA-014");
(n) H25Y("EZA-015");
(о) H25N ("EZA-016");
(p) H29Y("EZA-017");
(q) H71D ("EZA-018");
(r) H72N ("EZA-019");
(s) R74K ("EZA-020");
(t) R74E("EZA-021");
(u) N76T ("EZA-022");
(v) N76L, Y82F ("EZA-023");
(w) T79S ("EZA-0024");
(x) T79N ("EZA-025");
(y) K49E, D50Q ("EZA-026");
(z) S87R ("EZA-027");
(aa) E21T, H71D, D150S, K154V ("EZA-028");
(bb) S179N, V233N ("EZA-029");
(cc) M135Q ("EZA-030");
(dd) M145K, V148G ("EZA-031");
(ее) M175Q ("EZA-032");
(ff) L63I, S85A ("EZA-033");
(gg) L160I ("EZA-034");
(hh) V138I, L160A, A183V ("EZA-035");
(ii) V121I ("EZA-036");
(jj) V47I, V238I, M242I ("EZA-037");
(kk) V238I ("EZA-038"); и
(ll) L234Y ("EZA-039")
Подобным образом, полипептид, имеющий протеазную активность, может содержать или состоять из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1 с одной из следующих определенных мутаций (или их комбинаций):
(a) H25N, N76T
(b) H25N, H29Y
(c) H25N, M135Q
(d) H29Y, T79N, M135Q
(e) I99L, V121I, L160I, Y217H
(f) V121I, L160I
(g) H72N, R74E, S87K
(h) H25N, M135Q, Y217H
(i) T79N, V121I, V212I
(j) H29Y, N76T, I99L, M135Q
(k) K49E, D50Q, N76L, Y82F, S179N, V233N
(l) M145K, V148G, N76L, Y82F, S179N, V233N
(m) H25N, N76T, S87K, K154T
(n) H25Q
(o) H25D
(p) H25S
(q) K24E, H25N
(r) Y97N
(s) N100D
(t) A120S, A122S
(u) M135E
(v) V204Q, A122S
(w) T79D
(x) R74D
(у) K49E
(z) K49S, D50Q
(aa) D50Q
(bb) Q178D
(cc) S87R
В одном предпочтительном варианте осуществления полипептид, имеющий протеазную активность, является вариантом аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1, которая не содержит гистидин в положении 25.
Например, полипептид, имеющий протеазную активность, может содержать или состоять из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 2 (включающей мутацию H25N; см. рамку в последовательности ниже):
В альтернативном предпочтительном варианте осуществления полипептид, имеющий протеазную активность, является вариантом аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 1, который не содержит лизин в положении 160.
Например, полипептид, имеющий протеазную активность, может содержать или состоять из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 3 (включающей мутацию L160I; см. рамку в последовательности ниже):
Специалисту в данной области техники понятно, что вышеуказанные мутации (определенные ссылкой на аминокислотную последовательность трипсина I атлантической трески, SEQ ID NO: 1), могут также быть получены в трипсинах из других видов. Например, специфические мутации, выделенные в SEQ ID №№: 2 и 3 (H25N и L1601, соответственно), могут быть получены в трипсине из минтая (см., например, GenBank: ВАН70476.3, где аминокислотная последовательность активного трипсина начинается в положении 120, так что Н25 соответствует Н29 в ВАН70476.3, и т.д.).
В альтернативном варианте осуществления полипептид, имеющий протеазную активность, включает или состоит из аминокислотной последовательности натуральной сериновой протеазы. Так, полипептид, имеющий активность сериновой протеазы, может состоять из аминокислотной последовательности натурального трипсина эукариотического или прокариотического происхождения. Специально включены холодоадаптированные трипсины, такие как трипсин из атлантической трески (Gadus morhua), атлантического и тихоокеанского лосося (например, Salmo salar и виды Oncorhynchus) и минтая (Theragra chalcogramma).
В другом варианте осуществления первого аспекта изобретения полипептид содержит или состоит из гибридного белка.
Под «гибридизацией» пептида мы подразумеваем аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1 (или ее фрагменту или варианту), гибридизированную с любым другим полипептидом. Например, указанный полипептид может быть гибридизирован с таким полипептидом, как глутатион-S-трансфераза (ГСТ) или белок А, для облегчения очистки указанного полипептида. Примеры таких гибридизаций хорошо известны специалистам в данной области техники. Подобным образом, указанный полипептид может быть гибридизирован с олиго-гистидиновой меткой, такой как Гисб, или с эпитопом, распознаваемым антителом, таким как хорошо известный Мус tag эпитоп. Гибридизации с любым вариантом или производным указанного полипептида также включены в объем настоящего изобретения.
Гибридизация может включать дополнительную часть, которая придает необходимую характеристику указанному полипептиду из настоящего изобретения; например, часть может быть пригодна для усиления или увеличения продолжительности терапевтического эффекта. Например, в одном варианте осуществления гибридизация включает человеческий сывороточный альбумин или схожий белок.
Альтернативно, гибридизируемой частью может быть, например, биотиновый компонент, радиоактивный компонент, флуоресцентный компонент, например, малый флуорофор или зеленый флуоресцентный белковый (ЗФБ) флуорофор, как хорошо известно специалисту в данной области техники. Компонент может быть иммуногенной меткой, например, Мус меткой, как хорошо известно специалисту в данной области техники, или может быть липофильной молекулой или полипептидным доменом, способным к стимуляции поглощения пептида клеткой, как известно специалистам в данной области техники.
В другом варианте осуществления первого аспекта изобретения полипептид содержит или состоит из одной или нескольких аминокислот, которые модифицированы или дериватизированы.
Химические производные одной или нескольких аминокислот могут быть получены путем реакции с функциональной боковой группой. Такие дериватизированные молекулы включают, например, те молекулы, в которых свободные аминогруппы дериватизированы до формирования амин-гидрохлоридов, п-толуол-сульфонильных групп, карбоксибензокси групп, трет-бутилоксикарбонильных групп, хлорацетильных групп или формильных групп. Свободные карбоксильные группы могут быть дериватизированы до получения солей, метиловых или этиловых сложных эфиров, или других типов сложных эфиров и гидразидов. Свободные гидроксильные группы могут быть дериватизированы до образования O-ацильных или O-алкильных производных. Также в качестве химических производных включены те пептиды, которые содержат натуральные аминокислотные производные двадцати стандартных аминокислот. Например, 4-гидроксипролин может быть заменен пролином; 5-гидроксилизин может быть заменен лизином; 3-метилгистидин может быть заменен гистидином; гомосерин может быть замещен серином, а орнитин - лизином. Производные также включают пептиды, содержащие одну или несколько вставок или делеций, с тем условием, что сохраняется необходимая активность. Другими включенными модификациями являются амидирование, амино-концевое ацилирование (например, ацетилирование или амидирование тиогликолевой кислотой), терминальное карбоксиламидирование (например, с аммиаком или метиламином), и подобные терминальные модификации.
Кроме того, специалист в данной области техники должен понять, что также можно применять пептидомиметические соединения. Так, термином «полипептид» мы также обозначаем пептидомиметические соединения, которые обладают противовоспалительной активностью полипептида из SEQ ID NO: 1. Термин «пептидомиметический» означает соединение, которое имитирует конформацию и необходимые характеристики конкретного пептида в качестве терапевтического агента.
2
Например, полипептиды из настоящего изобретения включают не только молекулы, в которых аминокислотные остатки соединены пептидными (-CO-NH-) связями, но также молекулы, в которых пептидная связь обращена. Такие ретроинверсо пептидомиметики могут быть получены с применением способов, известных в данной области техники, например, как описано в Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, включенной посредством ссылки. Этот подход включает получение псевдопептидов, содержащих изменения, затрагивающие каркас, а не ориентацию боковых цепей. Ретроинверсные пептиды, которые содержат NH-CO связи вместо CO-NH пептидных связей, являются более устойчивыми к протеолизу. Альтернативно, полипептид из настоящего изобретения может быть пептидомиметическим соединением, где один или несколько аминокислотных остатков связаны -y(CHNH)- связью вместо обычной амидной связи.
В другой альтернативе можно вообще обойтись без пептидной связи, с тем условием, что используется подходящий линкерный компонент, который сохраняет пространство между атомами углерода аминокислотных остатков; может быть предпочтительно, чтобы линкерный компонент имел по существу то же самое распределение заряда, и по существу ту же самую планарность, как пептидная связь.
Необходимо понять, что полипептид в целях удобства может быть блокирован на своих N- или С-концах, чтобы способствовать снижению восприимчивости к экзопротеолитическому разрушению.
Ряд не кодированных или модифицированных аминокислот, таких как D-аминокислоты и N-метил-аминокислоты, также применяется для модификации полипептидов. Кроме того, предполагаемая биоактивная конформация может быть стабилизирована путем ковалентной модификации, такой как циклизация, или путем встраивания лактама или других типов мостиков, например, см. Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2636 and Thursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166, включенные посредством ссылки.
Однако в одном предпочтительном варианте осуществления полипептид из настоящего изобретения включает одну или несколько аминокислот, модифицированных или дериватизированных путем ПЭГилирования, амидирования, этерификации, ацилирования, ацетилирования и/или алкилирования.
Специалистам в данной области техники понятно, что полипептиды из настоящего изобретения могут иметь любую подходящую длину. Предпочтительно, полипептиды имеют длину от 10 до 30 аминокислот, например, от 10 до 20, от 12 до 18, от 12 до 16, или от 15 до 20 аминокислот. Альтернативно, полипептид может иметь длину от 150 до 250 аминокислот, например, от 200 до 250, от 210 до 240, от 220 до 230, или от 220 до 225 аминокислот.
В одном варианте осуществления полипептид является линейным. В другом варианте осуществления полипептид является рекомбинантным полипептидом.
Предпочтительно, полипептид обеспечивается в форме, пригодной для доставки через слизистую оболочку полости рта и/или глотки (например, ротоглотки). Например, полипептид может быть обеспечен в виде спрея для полости рта, спрея для носа, леденца, пастилки, жевательной резинки или жидкости.
Второй, родственный аспект настоящего изобретения обеспечивает полипептид, как определено выше, для приготовления медикамента для лечения или профилактики микробных инфекций у субъекта, страдающего или восприимчивого к иммунодефициту.
Примерные варианты осуществления второго аспекта изобретения описаны выше в связи с первым аспектом изобретения.
Полипептиды из настоящего изобретения, также как и молекулы нуклеиновых кислот, векторы и клетки-хозяева для их получения, могут быть получены с применением способов, хорошо известных в данной области техники (например, см. Sambrook & Russell, 2000, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк; соответствующие раскрытия в документе включены посредством ссылки).
Альтернативно, полипептиды из настоящего изобретения могут быть синтезированы известными способами, как жидкофазный и твердофазный синтез (например, t-Boc твердофазный пептидный синтез и BOP-SPPS).
Специалистам в данной области техники понятно, что настоящее изобретение также включает фармацевтически пригодные соли добавления кислот или оснований для вышеуказанных полипептидов. Кислоты, которые применяются для приготовления фармацевтически пригодных солей добавления кислот для вышеупомянутых основных соединений, пригодных для настоящего изобретения, являются кислотами, которые образуют нетоксичные соли добавления кислот, т.е. соли, содержащие фармацевтически пригодные анионы, такие соли, как гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, нитрат, сульфат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, ацетат, лактат, цитрат, кислый цитрат, тартрат, битартрат, сукцинат, малеат, фумарат, глюконат, сахарат, бензоат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат и памоат [т.е. 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтоат)], среди прочего.
Фармацевтически пригодные соли добавления оснований также можно применять для получения фармацевтически пригодных солевых форм полипептидов. Химические основания, которые можно применять в качестве реагентов для приготовления фармацевтически пригодных основных солей из представленных соединений, которые являются кислыми по природе, являются основаниями, которые образуют нетоксичные основные соли с такими соединениями. Такие нетоксичные основные соли включают, но не ограничиваются солями, полученными из таких фармакологически пригодных катионов, таких как катионы щелочных металлов (например, калия и натрия) и катионы щелочноземельных металлов (например, кальция и магния), аммония или водорастворимые соли добавления аминов, такие как N-метилглюкамин-(меглумин), и низшие алканоламмонийные и другие основные соли фармацевтически пригодных органических аминов, среди прочего.
Кроме того, необходимо понять, что полипептиды из настоящего изобретения могут быть лиофилизированы для хранения, и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Можно применять любой подходящий способ лиофилизации (например, распылительную сушку, сушку с пресс-фильтром) и/или методики восстановления. Специалистам в данной области техники понятно, что лиофилизация и восстановление могут приводить к различной степени потери активности, что уровни применения необходимо повышать для компенсации. Предпочтительно, лиофилизированный (подвергнутый сушке с замораживанием) полипептид теряет не больше примерно 20%, или не больше примерно 25%, или не больше примерно 30%, или не больше примерно 35%, или не больше примерно 40%, или не больше 45%, или не больше примерно 50% от своей активности (перед лиофилизацией) после регидратации.
Полипептиды из настоящего изобретения, как правило, обеспечиваются в форме терапевтической композиции, в которой полипептид находится вместе с фармацевтически пригодным буфером, разбавителем, носителем, адъювантом или наполнителем. Дополнительные соединения, которые могут быть добавлены в композиции, включают хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, цитрат, ЭГТА или глутатион. Антимикробные/терапевтические композиции могут быть приготовлены способом, известным в данной области техники, обеспечивающим достаточную стабильность при хранении, и пригодным для применения у людей и животных. Терапевтические композиции могут быть высушены, например, посредством лиофилизации, распылительной сушки, распыления с охлаждением, или с применением образования частиц при сверхкритическом образовании частиц.
Термином «фармацевтически пригодный» мы обозначаем нетоксичный материал, который не снижает эффективность трипсиновой активности полипептида из настоящего изобретения. Такие фармацевтически пригодные буферы, носители или наполнители хорошо известны в данной области техники (см. «Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition», A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) («Фармацевтические науки, 18-е изд.») и «Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition)), A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000) («Учебник по фармацевтическим вспомогательным веществам»), раскрытия которых включены посредством ссылки).
Термин «буфер» предназначен для обозначения водного раствора, содержащего смесь кислоты-основания с целью стабилизации pH. Примерами буферов являются Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, фосфат, карбонат, ацетат, цитрат, гликолят, лактат, борат, ACES, ADA, тартарт, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, какодилат, CHES, DIPSO, EPPS, этаноламин, глицин, HEPPSO, имидазол, имидазол-молочную кислоту, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO и TES.
Термин «разбавитель» предназначен для обозначения водного или неводного раствора для разбавления пептида в терапевтическом препарате. Разбавитель может быть одним или несколькими из солевого раствора, воды, полиэтиленгликоля, пропиленгликоля, этанола или масел (таких, как сафлоровое масло, кукурузное масло, арахисовое масло, хлопковое масло или кунжутное масло).
Термин «адъювант» предназначен для обозначения любого соединения, добавленного в композицию для повышения биологического эффекта полипептида из настоящего изобретения. Адъювант может быть одним или несколькими из солей цинка, меди или серебра с различными анионами, например, фторидом, хлоридом, бромидом, йодидом, тиоцианатом, сульфитом, гидроксидом, фосфатом, карбонатом, лактатом, гликолятом, цитратом, боратом, тартратом, и ацетатами различного ацильного состава, но не ограничиваясь ими. Адъювант может также быть катионными полимерами, такими как катионные простые эфиры целлюлозы, катионные сложные эфиры целлюлозы, деацетилированная гиалуроновая кислота, хитозан, катионные дендримеры; катионными синтетическими полимерами, такими как поли(винилимидазол), и катионными полипептидами, такими как полигистидин, полилизин, полиаргинин, и пептиды, содержащие эти аминокислоты.
Наполнитель может быть одним или более из углеводов, полимеров, липидов и минералов. Примеры углеводов включают лактозу, глюкозы, сахарозу, маннитол и циклодекстрины, которые добавляют в композицию, например, для облегчения лиофилизации. Примерами полимеров являются крахмал, простые эфиры целлюлозы, целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, этилгидроксиэтилцеллюлоза, альгинаты, каррагенины, гиалуроновая кислота и ее производные, полиакриловая кислота, полисульфонат, полиэтиленгликоль/полиэтиленоксид, сополимеры полиэтиленоксида/пропиленоксида, поливиниловый спирт/поливинил ацетат различной степени гидролиза, и поливинилпирролидон; все с разной молекулярной массой, которые добавляют в композицию, например, для контроля вязкости, для достижения биоадгезии или для защиты липидов от химической и протеолитической деградации. Примерами липидов являются жирные кислоты, фосфолипиды, моно-, ди- и триглицериды, церамиды, сфинголипиды и гликолипиды; все с разной длиной и насыщением ацильной цепи; яичный лецитин, соевый лецитин, гидрогенизированный яичный и соевый лецитин, которые добавляют в композицию по таким же причинам, как для полимеров. Примерами минералов являются тальк, магния оксид, цинка оксид и титана оксид, которые добавляют в композицию для достижения полезных эффектов, таких как снижение накопления липидов или предпочтительные пигментирующие свойства.
В одном варианте осуществления полипептид может быть обеспечен вместе со стабилизатором, таким как хлорид кальция.
Полипептиды из настоящего изобретения могут быть представлены в виде любого типа терапевтической композиции, известной в данной области техники, пригодной для доставки полипептидных агентов.
В одном варианте осуществления полипептиды могут быть просто растворены в воде, солевом растворе, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле или маслах (таких, как сафлоровое масло, кукурузное масло, арахисовое масло, хлопковое масло или кунжутное масло), камеди трагаканта и/или различных буферах. Например, если полипептид приготовлен для перорального применения (такого, как посредством спрея для полости рта), терапевтическая композиция может содержать полипептид, растворенный в воде, глицерин и ментол. Примерная композиция спрея для полости рта выпускается в Скандинавии как ColdZyme (Enzymatica АВ, Лунд, Швеция).
В предпочтительном варианте осуществления изобретение обеспечивает протеазный полипептид, как описано выше, в осмотически активном растворе. Например, полипептид может быть приготовлен в глицерине. Не желая углубляться в теорию, считается, что такие осмотически активные растворы облегчают продвижение жидкости от внутренней части микробных клеток в экстраклеточную среду. Считается, что это, в свою очередь, облегчает терапевтический эффект полипептидов из настоящего изобретения путем создания тонкого активного барьера, который ингибирует (по меньшей мере отчасти) поглощение микробных клеток, таких как бактерии и вирусы, эпителиальными клетками-носителями, например, в ротоглотке.
В другом варианте осуществления терапевтические композиции из настоящего изобретения могут быть в форме липосомы, в которой полипептид объединен, в дополнение с другими фармацевтически пригодными носителями, с амфифильными агентами, такими как липиды, которые существуют в агрегированных формах, таких как мицеллы, нерастворимые монослои и жидкие кристаллы. Подходящие липиды для липосомальной композиции включают моноглицериды, диглицериды, сульфатиды, лизолецитин, фосфолипиды, сапонин, желчные кислоты, и тому подобное, но не ограничиваются ими. Подходящие липиды также включают вышеуказанные липиды, модифицированные поли(этиленгликолем) в полярной головной группе для пролонгирования времени циркуляции в кровотоке. Приготовление таких липосомальных композиций можно найти, например, в US 4,235,871, раскрытие которого включено посредством ссылки.
Терапевтические композиции из настоящего изобретения могут также быть в форме биодеградируемых микросфер. Алифатические полиэфиры, такие как поли(молочная кислота) (ПМК), поли(гликолевая кислота) (ПГК), сополимеры ПМК и ПГК (ПМГК) или поли(капролактон) (ПКЛ) и полиангидриды широко применяются в качестве биодеградируемых полимеров при получении микросфер. Приготовление таких микросфер можно найти в US 5,851,451 и в ЕР 0213303, раскрытия которых включены посредством ссылки.
В другом варианте осуществления терапевтические композиции из настоящего изобретения обеспечиваются в форме полимерных гелей, где такие полимеры, как крахмал, простые эфиры целлюлозы, целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гадроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, этилгидроксиэтилцеллюлоза, альгинаты, каррагенины, гиалуроновая кислота и ее производные, полиакриловая кислота, поливинилимидазол, полисульфонат, полиэтиленгликоль/полиэтиленоксид, сополимеры полиэтиленоксида/пропиленоксида, поливиниловый спирт/поливинилацетат различной степени гидролиза и поливинилпирролидон, используются для загущения раствора, содержащего пептид. Полимеры могут также содержать желатин или коллаген.
Необходимо понять, что терапевтические композиции из настоящего изобретения могут включать ионы и иметь определенное значение pH для усиления действия полипептидов. Кроме того, композиции могут подвергаться обычным терапевтическим операциям, таким как стерилизация, и/или могут содержать обычные добавки, такие как консерванты, стабилизаторы, увлажнители, эмульгаторы, буферы, наполнители, и т.д.
В одном предпочтительном варианте осуществления терапевтическая композиция содержит полипептид в Трис или фосфатном буфере, вместе с одним или более из ЭДТУК, ксилита, сорбита, пропиленгликоля и глицерина.
Особо предпочтительная терапевтическая композиция из настоящего изобретения описана в Примере А ниже.
Терапевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением можно применять любым подходящим способом, известным специалистам в данной области техники. Так, возможные способы применения включают пероральное, буккальное, парентеральное (внутривенное, подкожное и внутримышечное), местное, окулярное, назальное, легочное, вагинальное и ректальное применение. Также возможно применение с помощью имплантатов.
В одном предпочтительном варианте осуществления терапевтические композиции применяют перорально. Например, полипептид может быть выполнен в виде спрея для полости рта, спрея для носа, леденца, пастилки, жевательной резинки, или обычной жидкости для перорального применения.
В альтернативном варианте осуществления терапевтические композиции применяют парентерально, например, внутривенно, интрацеребровентрикулярно, интраартикулярно, интраартериально, интраперитонеально, интратекально, интравентрикулярно, интрастернально. интракраниально, внутримышечно или подкожно, или их можно применять посредством инфузии. Их обычно применяют в форме стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, достаточное количество солей или глюкозы, для приготовления раствора, изотоничного с кровью. Водные растворы должны быть подходящим образом забуферены (предпочтительно до pH от 3 до 9), если необходимо. Приготовление подходящих парентеральных композиций в стерильных условиях легко осуществляется посредством стандартных фармацевтических методик, известных специалистам в данной области техники.
Композиции, пригодные для парентерального применения, включают водные и неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, которые придают композиции изотоничность с кровью предполагаемого реципиента; и водные или неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители. Композиции могут присутствовать в однодозовых и многодозовых контейнерах, например, герметичных ампулах и флаконах, и могут храниться в лиофилизированном (высушенном после замораживания) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, немедленно перед использованием. Растворы и суспензии для инъекций, которые готовят немедленно перед применением, могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток вида, описанного ранее.
Альтернативно, терапевтические композиции могут применяться интраназально или путем ингаляции (например, в форме аэрозольного спрея, находящегося в контейнере под давлением, насосе, распылителе или атомизаторе, с применением подходящего пропеллента, такого как дихлородифторометан, трихлорофторометан, дихлоротетрафтороэтан, гидрофторалкан, такой как 1,1,1,2-тетрафторэтан (HFA 134А3 или 1,1,1,2,3,3,3-гептафторопропан (UFA 227ЕА3), диоксид углерода или другой подходящий газ). В случае аэрозоля под давлением лекарственная форма может быть дозирована путем обеспечения клапана для доставки определенного количества. Контейнер под давлением, насос, распылитель или атомизатор может содержать раствор или суспензию активного полипептида, например, с применением смеси этанола и пропеллента в качестве растворителя, который может дополнительно содержать любрикант, например, сорбитан триолеат. Капсулы и картриджи (например, изготовленные из желатина) для применения в ингаляторе или инсуфляторе могут быть изготовлены для вмещения порошковой смеси соединения из настоящего изобретения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.
Терапевтические композиции применяют у пациента в фармацевтически эффективной дозе. «Терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество», или «терапевтически эффективное», как применяется в настоящей заявке, означает количество, которое обеспечивает терапевтический эффект для определенного состояния и режима применения. Это предварительно заданное количество активного материала рассчитывают для получения необходимого терапевтического эффекта в сочетании с необходимой добавкой и разбавителем, т.е. носителем или растворителем для применения. Далее, термин предназначен для обозначения количества, достаточного для снижения, и наиболее предпочтительно, для предотвращения клинически значимого дефицита активности, функции и ответа хозяина. Альтернативно, терапевтически эффективное количество достаточно для индукции улучшения клинически значимого состояния хозяина. Как понятно для специалиста в данной области техники, количество соединения может варьировать в зависимости от его специфической активности. Подходящие дозировки могут содержать предварительно определенное количество активной композиции, рассчитанное для получения необходимого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым разбавителем. В способах и применении для производства композиций из настоящего изобретения обеспечивается терапевтически эффективное количество активного компонента. Терапевтически эффективное количество может определить рядовой специалист в области медицины или ветеринарии на основе характеристик пациента, таких как возраст, масса тела, пол, состояние, осложнения, другие заболевания, и т.д., как хорошо известно в данной области техники. Применение фармацевтически эффективной дозы можно осуществлять путем единственного применения в форме индивидуальной дозы, или также в виде нескольких меньших доз, а также путем множества применений разделенных доз со специфическими интервалами. Альтернативно, доза может быть обеспечена в виде непрерывной инфузии в течение длительного периода.
Полипептиды могут быть предоставлены в различных концентрациях, в зависимости от эффективности/токсичности используемого соединения. Предпочтительно, композиция содержит активный агент в концентрации от 0,1 мкМ до 1 мМ, более предпочтительно от 1 мкМ до 500 мкМ, от 500 мкМ до 1 мМ, от 300 мкМ до 700 мкМ, от 1 мкМ до 100 мкМ, от 100 мкМ до 200 мкМ, от 200 мкМ до 300 мкМ, от 300 мкМ до 400 мкМ, от 400 мкМ до 500 мкМ, и наиболее предпочтительно, около 500 мкМ.
Таким образом, терапевтическая композиция может содержать количество полипептида или фрагмента, варианта, гибрида или производного, достаточного для уничтожения или замедления роста микроорганизмов, таких как вирусы, бактерии и дрожжи, в полости рта и/или глотке (например, ротоглотке).
В третьем аспекте изобретение обеспечивает способ лечения или профилактики микробных инфекций у субъекта, страдающего или восприимчивого к иммунодефициту, где способ включает применение у субъекта терапевтически эффективного количества полипептида, как определено выше в связи с первым аспектом изобретения.
Примерные варианты осуществления третьего аспекта изобретения описаны выше в связи с первым аспектом изобретения.
В одном варианте осуществления микробная инфекция выбрана из группы, состоящей из бактериальных инфекций, вирусных инфекций, грибковых инфекций и дрожжевых инфекций.
В одном варианте осуществления полипептиды из изобретения предназначены для применения в лечении или профилактике вторичных инфекций полости рта и/или глотки (например, ротоглотки).
Например, полипептиды можно применять в лечении или профилактике насморка и/или грибковой инфекции полости рта и/или воспаления десен.
Такие микробные инфекции можно при необходимости лечить/предотвращать путем применения полипептида из настоящего изобретения в форме спрея для полости рта, спрея для носа, леденца или тому подобного. Такие композиции позволяют применять полипептид из настоящего изобретения на слизистых оболочках полости рта и/или глотки (например, ротоглотки) в течение длительного периода, где трипсиновая активность полипептида воздействует на инфильтрующие организмы.
Как правило, полипептид из изобретения применяют повторно на протяжении периода нескольких суток, недель или дольше.
Специалисту в данной области техники понятно, что полипептиды из настоящего изобретения можно применять в комбинации с одним или несколькими дополнительными агентами.
Например, полипептиды из настоящего изобретения можно применять в комбинации с:
(a) обычными антибиотиками (такими как цефалоспорины, тетрациклины, аминогликозиды и пенициллины);
(b) противовирусными агентами (такими как осельтамивир и занамивир), и/или
(c) противогрибковыми агентами (такими как нистатин, клотримазол и флуконазол).
Кроме того, полипептиды из настоящего изобретения можно применять в комбинации с безрецептурными средствами от простуды и гриппа, например, анальгетиками, такими как парацетамол и ибупрофен, и деконгестантами, такими как фенилэфрин.
Специалистам в данной области техники также понятно, что применения и способы из настоящего изобретения пригодны как в области медицины, так и ветеринарии. Так, полипептидные медикаменты можно применять в лечении людей и животных, не являющихся человеком (таких как лошади, собаки и кошки).
Однако предпочтительно пациентом является человек.
Далее описаны не ограничивающие примеры, воплощающие некоторые аспекты изобретения.
Фигура 1. Процентное количество различных симптомов инфекции в неделю для 12-летнего мальчика с диагнозом ВНИД, леченного еженедельно подкожными инъекциями Hizentra (человеческого IgG). Базовые данные собраны за 2012 и с января по сентябрь 2013. Лечение ColdZyme проводили в течение 9 недель с октября по ноябрь 2013.
Фигура 12. Среднее число дней в неделю, проведенных дома вне школы для 12-летнего пациента с диагнозом ВНИД, леченного еженедельно подкожными инъекциями Hizentra (человеческого IgG). Базовые данные собраны за 2012 и с января по сентябрь 2013. Лечение ColdZyme проводили в течение 9 недель с октября по ноябрь 2013.
Примеры
Пример А. Примерная терапевтическая композиция
Примерный маточный раствор полипептида из настоящего изобретения, трипсина I из атлантической трески (SEQ ID NO: 1), можно сделать, как показано в таблице 1.
Значение pH доводили до 7,5.
Подходящая терапевтическая композиция из трипсина I из атлантической трески (SEQ ID NO: 1) также поставляется в виде ColdZyme (Enzymatica АВ, Лунд, Швеция).
Пример В. Пример применения
Пациент:
12-летний мальчик
Диагноз:
ВНИД (вариабельный неклассифицируемый иммунодефицит)
История лечения:
Hizentra, подкожный иммуноглобулин (человеческий)
Амоксициллин, пероральный
Лечение:
ColdZyme, 1 Ед. на дозу, 2 дозы в сутки.
С 2003 пациент получал еженедельно подкожные инъекции человеческого иммуноглобулина (Hizentra, 4 г в неделю). Однако перед лечением полипептидом из настоящего изобретения в конце 2013 пациент страдал от рекуррентных микробных инфекций ушей, синусов, носа, бронхов и легких. У пациента часто проявлялся постоянный насморк, рост грибков в полости рта и гингивит с повреждениями десен. В результате качество жизни пациента было существенно снижено, и обычно ему требовалось оставаться дома, не посещая школу, в течение по меньшей мере одного дня каждую неделю. Месяц ноябрь часто был особо проблемным для пациента, поскольку рекуррентные инфекции часто приводили к пневмонии.
Период профилактического лечения амоксициллином с августа 2012 по май 2012 оказал незначительное влияние на рекуррентные симптомы пациента.
Пациент получал лечение два раза в день (утром и вечером) спреем для полости рта ColdZyme в октябре 2013; в этот период проводилось еженедельное применение Hizentra.
Уже в первые три дня применения лечения ColdZyme у пациента отмечалось заметное улучшение симптомов и качества жизни (см. таблицу 2).
Эффект лечения ColdZyme можно также ясно видеть на фигурах 1 и 2.
На фигуре 1 (А) показано процентное количество различных симптомов инфекции в неделю у пациента в течение трех периодов времени:
(a) за весь 2012 год (лечение: Hizentra и амоксициллин);
(b) с января по сентябрь 2013 (лечение: Hizentra и амоксициллин); и
(c) с октября 2013 до ноябрь 2013 (лечение: Hizentra и ColdZyme).
Немедленно отмечалось резкое снижение симптомов инфекции в период лечения ColdZyme.
На фигуре 1(В) показано процентное количество различных симптомов инфекции в неделю у того же пациента во время длительного периода исследования 58 недель.
На фигуре 2(A) показано среднее число дней в неделю у субъекта, когда он пропускал школу из-за тяжелых симптомов инфекции в те периоды времени, которые показаны на фигуре 1. Вновь, явно видно резкое улучшение после применения лечения ColdZyme.
Такое начало действия и почти полное исчезновение симптомов инфекции у пациента при лечении полипептидом из настоящего изобретения было полностью неожиданным, в частности, с учетом того, что начальный период лечения (октябрь-ноябрь) совпал со временем года, когда у пациента обычно проявлялись наиболее тяжелые инфекции. Понятно, что и пациент, и его мать были рады улучшению качества жизни после более десяти лет ослабляющих рекуррентных инфекций.
На фигуре 2(B) показано среднее число дней в неделю, когда пациент не посещал школу из-за тяжести симптомов инфекции во время того же самого продолжительного периода исследования, который указан на фигуре 1(B).
Пример С. Получение рекомбинантных полипептидов сериновой протеазы.
Клонинг
Синтезированный ген, кодирующий интересующий полипептид сериновой протеазы, клонировали в Е. coli, вектор экспрессии Е3 (GenScript), без какой-либо метки. Нуклеиновая кислота, кодирующая трипсин I дикого типа из атлантической трески, показана ниже в SEQ ID NO: 4 (в pUC57).
Ряд молекул нуклеиновых кислот, кодирующих мутантные варианты трипсина I из атлантической трески, синтезировали обычными методиками, т.е. направленным мутагенезом путем ПЦР.
Рефолдинг и очистка трипсина
Клетки химически компетентной Е. coli BL21 (DE3) трансформировали с вектором Е3, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую интересующий полипептид сериновой протеазы (трипсина) с помощью стандартных процедур, например, трансформации тепловым шоком.
Зимогенный полипептид (трипсиноген) подвергали сверхэкспрессии, и формировали тельца-включения в цитоплазме клеток-носителей.
Клетки после индукции собирали и лизировали с помощью ультразвука. После центрифугирования тельца-включения промывали буфером (50 мМ Трис, 10 мМ ЭДТУК, 2% Тритон X-100, 300 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ, pH 8,0) и растворяли в 50 мМ Трис, 8 М мочевине, pH 8,0, а затем диализовали 1 раз в ФБР, 10% глицерине, pH 7,4 при 4°C в течение ночи.
Чистота экспрессированного зимогенного полипептида при рефолдинге составила более 90%, и не требовалось дополнительной очистки.
Затем рекомбинантный зимогенный полипептид активировали путем добавления трипсина I дикого типа, очищенного из атлантической трески (0,2 Ед/мл), и инкубации при комнатной температуре в течение 24 часов (см. Пример D).
Примерные полипептиды
Получали или производили следующие полипептиды:
(a) Трипсин I дикого типа, очищенный из атлантической трески («WT-Tryp» или «дикого типа»);
(b) Рекомбинантный трипсин дикого типа из атлантической трески (SEQ ID NO: 1, «R-Tryp»); и
(с) Тридцать восемь различных мутантных вариантов трипсина I из атлантической трески (т.е. мутантных последовательностей SEQ ID NO: 1).
Мутации последовательностей тридцати восьми различных мутантных версий трипсина I трески показаны в таблице 3 ниже.
Примерные трипсиновые полипептиды исходно экспрессировали в виде зимогенного полипептида с активационным пептидом MEEDK (SEQ ID NO: 5), гибридизированным с N-концом.
Пример D. Стабильность дикого типа и мутантных форм трипсина I атлантической трески, экспрессированных рекомбинантно.
В этом примере обобщены результаты активации 39 рекомбинантных трипсиновых мутантов, экспрессированных в Е. coli. Рекомбинантные трипсиновые полипептиды (R-Tryp) активировали трипсином I дикого типа, очищенным из атлантической трески (WT-Tryp), спустя 24 часа инкубации.
Материалы и методы
Экспрессия рекомбинантных трипсинов
См. Пример С.
Оценка стабильности
Эксперимент, предназначенный для анализов активации и стабильности рекомбинантных образцов, проводили следующим образом.
День 1. Активация рекомбинантного трипсина
2
Рекомбинантные ферменты (0,2 Ед./мл) активировали трипсином дикого типа (0,2 Ед./мл) при комнатной температуре в течение 24 часов в планшете для микротитрования. Образцы смешивали с 20 мМ Трис-HCl, 1 мМ CaCl, 50% глицерином, pH 7,6, до итогового объема 200 мкл.
День 2. Определение активности и стабильности.
Активированные рекомбинантные ферменты переносили в новый планшет для микротитрования (II) и хранили на льду для обеспечения стабильности ферментов и остановки процесса активации.
(a) Определение исходной активности А0
Активность активированного фермента (А0) определяли в новом планшете для микротитрования (III) путем смешивания 245 мкл Гли-Про-Арг в буфере для анализа с 5 мкл рекомбинантного фермента из планшета для микротитрования (II). Определяли поглощение при 410 нм, и рассчитывали активность по следующей формуле:
-1
-1
3
где «наклон» является тангенсом угла наклона линейной регрессии при кинетическом анализе активности трипсина при 30°C в течение 200 секунд; df является фактором разбавления, 60 является переводом секунд в минуты, ε является коэффициентом расширения, равным 8800 М см, 1 является длиной светового пути, равной 0,7109 см, 10 является переводом моль/л в мкмоль/мл.
(b) Температурная активация
100 мкл активированного фермента переносили из планшета для микротитрования (II) в новый планшет для микротитрования (IV), и разбавляли до 200 мкл до итоговой концентрации 50% глицерина, pH 7,6. Планшет (IV) инкубировали при 60°C в течение 3,5 часов (WT-Tryp терял 90% от исходной активности). Оставшуюся активность определяли в соответствии с (а).
День 3. Аутокатализ
A
100 мкл активированного фермента переносили из планшета для микротитрования (II) в новый планшет для микротитрования (V), содержащий 100 мкл 0,1 Ед./мл трипсина в 25% глицерине и буфере для анализа, pH 7,6. Планшет инкубировали при 25°C в течение 8 часов (WT-Tryp терял 90% от исходной активности). Активность (AX) определяли, как описано в (а).
Результат
Активность, термостабильность и аутокатализ 39 примерных полипептидов сериновой протеазы отмечены в таблице 4 (для рекомбинантного трипсина трески дикого типа, EZA-001, и его 38 мутантов). Отмечается существенная разница активности среди мутантов. Несколько мутантов проявляли улучшенную термостабильность, по сравнению с трипсином дикого типа, у которого оставалось только 5% активности, и несколько мутантов показали существенно улучшенную устойчивость к аутокатализу, по сравнению с трипсином дикого типа.
Пример Е: Определение активности рекомбинантных мутантных форм трипсина I трески.
Материалы и методы
Экспрессия рекомбинантных полипептидов
Полипептиды, соответствующие аминокислотной последовательности дикого типа трипсина I из атлантической трески и ее тридцати восьми мутантным вариантам, получали с применением способов, описанных в Примере С.
Активация
2
Активацию рекомбинантных ферментов (примерно 0,01 мг/мл) осуществляли путем добавления трипсина дикого типа (0,2 Ед./мл) при комнатной температуре, и инкубации в течение 24 часов. Смесь готовили в 20 мМ Трис-HCl, 1 мМ CaCl, 50% глицерине, pH 8,0, до конечного объема 200 мкл.
Анализ активности для определения констант скорости реакции
Субстрат (Гли-Про-Арг) использовали в концентрациях 0,005-0,15 мМ в буфере для анализа, содержащем 1% ДМСО. 245 мкл растворов субстрата вносили пипеткой в 96-луночный планшет. Реакцию начинали путем добавления 5 мкл смеси образца (выше), и контролировали при 410 нм на ридере микропланшетов SpectraMax. Измерения кинетики проводили каждую минуту при постоянном определении в течение 15 минут.
Результаты
Результаты показаны в таблице 5 ниже.
--->
SEQUENCE LISTING
<110> Enzymatica AB
<120> NOVEL TREATMENTS
<130> ENZBA/P57543PC
<140> GBPCT/GB2015/050212
<141> 2015-01-29
<150> GB1401480.7
<151> 2014-01-29
<150> GB1405784.8
<151> 2014-03-31
<160> 4
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1
<211> 222
<212> PRT
<213> Gadus morhua
<400> 1
Ile Val Gly Gly Tyr Glu Cys Thr Lys His Ser Gln Ala His Gln Val
1               5                   10                  15
Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Val Ser Lys
20                  25                  30
Asp Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Val Leu Arg Val
35                  40                  45
Arg Leu Gly Glu His His Ile Arg Val Asn Glu Gly Thr Glu Gln Tyr
50                  55                  60
Ile Ser Ser Ser Ser Val Ile Arg His Pro Asn Tyr Ser Ser Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Ile Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Thr Lys Pro Ala Thr Leu
85                  90                  95
Asn Gln Tyr Val His Ala Val Ala Leu Pro Thr Glu Cys Ala Ala Asp
100                 105                 110
Ala Thr Met Cys Thr Val Ser Gly Trp Gly Asn Thr Met Ser Ser Val
115                 120                 125
Ala Asp Gly Asp Lys Leu Gln Cys Leu Ser Leu Pro Ile Leu Ser His
130                 135                 140
Ala Asp Cys Ala Asn Ser Tyr Pro Gly Met Ile Thr Gln Ser Met Phe
145                 150                 155                 160
Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser
165                 170                 175
Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Val Val Ser Trp
180                 185                 190
Gly Tyr Gly Cys Ala Glu Arg Asp His Pro Gly Val Tyr Ala Lys Val
195                 200                 205
Cys Val Leu Ser Gly Trp Val Arg Asp Thr Met Ala Asn Tyr
210                 215                 220
<210> 2
<211> 221
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated amino acid sequence of trypsin I from Gadus morhua
<400> 2
Ile Val Gly Gly Tyr Glu Cys Thr Lys Asn Ser Gln Ala His Gln Val
1               5                   10                  15
Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Val Ser Lys
20                  25                  30
Asp Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Val Leu Arg Val
35                  40                  45
Arg Leu Gly Glu His His Ile Arg Val Asn Glu Gly Thr Glu Gln Tyr
50                  55                  60
Ile Ser Ser Ser Ser Val Ile Arg His Pro Asn Tyr Ser Ser Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Ile Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Thr Lys Pro Ala Thr Leu
85                  90                  95
Asn Gln Tyr Val His Ala Val Ala Leu Pro Thr Glu Cys Ala Ala Asp
100                 105                 110
Ala Met Cys Thr Val Ser Gly Trp Gly Asn Thr Met Ser Ser Val Ala
115                 120                 125
Asp Gly Asp Lys Leu Gln Cys Leu Ser Leu Pro Ile Leu Ser His Ala
130                 135                 140
Asp Cys Ala Asn Ser Tyr Pro Gly Met Ile Thr Gln Ser Met Phe Cys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly
165                 170                 175
Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Val Val Ser Trp Gly
180                 185                 190
Tyr Gly Cys Ala Glu Arg Asp His Pro Gly Val Tyr Ala Lys Val Cys
195                 200                 205
Val Leu Ser Gly Trp Val Arg Asp Thr Met Ala Asn Tyr
210                 215                 220
<210> 3
<211> 221
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutated amino acid sequence of trypsin I from Gadus morhua
<400> 3
Ile Val Gly Gly Tyr Glu Cys Thr Lys His Ser Gln Ala His Gln Val
1               5                   10                  15
Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Val Ser Lys
20                  25                  30
Asp Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr Lys Ser Val Leu Arg Val
35                  40                  45
Arg Leu Gly Glu His His Ile Arg Val Asn Glu Gly Thr Glu Gln Tyr
50                  55                  60
Ile Ser Ser Ser Ser Val Ile Arg His Pro Asn Tyr Ser Ser Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Ile Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu Thr Lys Pro Ala Thr Leu
85                  90                  95
Asn Gln Tyr Val His Ala Val Ala Leu Pro Thr Glu Cys Ala Ala Asp
100                 105                 110
Ala Met Cys Thr Val Ser Gly Trp Gly Asn Thr Met Ser Ser Val Ala
115                 120                 125
Asp Gly Asp Lys Leu Gln Cys Leu Ser Ile Pro Ile Leu Ser His Ala
130                 135                 140
Asp Cys Ala Asn Ser Tyr Pro Gly Met Ile Thr Gln Ser Met Phe Cys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly
165                 170                 175
Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Val Val Ser Trp Gly
180                 185                 190
Tyr Gly Cys Ala Glu Arg Asp His Pro Gly Val Tyr Ala Lys Val Cys
195                 200                 205
Val Leu Ser Gly Trp Val Arg Asp Thr Met Ala Asn Tyr
210                 215                 220
<210> 4
<211> 678
<212> DNA
<213> Gadus morhua
<220>
<221> source
<222> 1..678
<223> /mol_type="unassigned DNA"
/organism="Gadus morhua"
<400> 4
gaagaagata aaatcgttgg cggctatgaa tgcacgaaac actcgcaggc acaccaggtc      60
tcactgaaca gcggttacca cttttgcggc ggtagtctgg ttagcaaaga ttgggttgtt     120
agtgcggccc attgctataa aagcgtgctg cgtgttcgcc tgggcgaaca tcacattcgt     180
gtgaatgaag gcaccgaaca gtacattagc tctagtagcg ttatccgcca tccgaactac     240
tctagttaca acatcaacaa cgatatcatg ctgatcaaac tgaccaaacc ggcgacgctg     300
aaccagtatg tgcacgccgt tgcactgccg accgaatgcg cagcggatgc aaccatgtgt     360
accgtgagcg gctggggtaa tacgatgagc tctgttgcgg atggcgataa actgcagtgc     420
ctgtctctgc cgattctgag tcatgcggat tgtgccaact cttatccggg catgatcacg     480
cagagcatgt tttgcgccgg ttacctggaa ggcggtaaag atagctgcca gggtgattct     540
ggcggtccgg tggtttgtaa cggcgttctg cagggtgtgg ttagctgggg ctacggttgt     600
gcagaacgtg atcacccggg tgtctatgct aaagtctgtg tgctgtcggg ctgggtccgt     660
gatacgatgg cgaactat                                                   678
<---