Обратимые эпителио-мезенхимальные трансформации клеток в эмбриогенезе и постнатальном обновлении тканей

ДИСКУССИОННЫЕ И ОБЩЕТЕОРЕТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

Обратимые эпителио-мезенхимальные трансформации клеток в эмбриогенезе и постнатальном обновлении тканей

B.C. Репин, И.Н. Сабурина

НП Институт клеточных технологий и регенерационной медицины им. А.Я. Фриденштейна, Москва

V.S. Repin, I.N. Saburina

Reversible epithelio-mesenchymal transformations of cells in embryogenesis and postnatal tissue regenaration

A.Ya. Friedenshtein Research Institute of cellular technologies and regenerative medicine

Представлены современные данные о чередовании экспрессии генов, характеризующих проявления эпителиальных и мезодер-мальных (мезенхимальных) клеток на этапах раннего эмбриогенеза. Согласно собственным данным, полученным с помощью метода иммуноцитохимии (антитела к CD34, CD45, CD14, CD44, CD54, CD56, CD90, CD105) авторы характеризуют часть культур мезенхимальных стволовых клеток, как эпителиальных. Высказывается положение о том, что чередование эпительиальных и мезенхимальных признаков фенотипа является общей биологической закономерностью в онтогенезе.

Ключевые слова: стволовая клетка, мезенхима, эмбриональная индукция, Е-кадгерин.

Стволовые клетки, эмбриональная индукция и обратимые взаимопревращения эпителий-мезенхима-эпителий составляют три главные силы раннего эмбриогенеза и органогенеза.

Ооцит, зигота млекопитающих являются Е-кадгерин-оодержащими клетками [1]. Первые раунды деления зиготы сопровождаются утратой Е-кадгерина, полярности цитоскелета с образованием примитивных сфероидных клеток эмбриобласта. У мышей новые Е-кадгерин-содержащие клетки, участвующие в формировании трофэктодермы и других провизорных эпителиальных пластов, были обнаружены с 32-клеточной стадии. У человека новые Е-кадгерин+ клетки эмбриобласта возникают на 16-клеточной стадии [2, 3, 4]. Верхний слой эмбриобласта формирует первый эпителий трофэктодермы. Вторая волна эпителизации связана с реорганизацией эмбриобласта в высокий плотный поляризованный мини-пласт эпибласта из 650 клеток, сформированных на базальной мембране с мощными межклеточными контактами [tight junctions]. Третья волна, преобразующая остатки эмбриобласта в примитивную экстра-эмбриональ-ную энтодерму [гипобласт] (ЭЭ), запускает образование висцеральной и париетальной энтодермы зародыша.

Исследование процесса кавитации в культуре эмбриоид-ных телец человека и мыши позволило расшифровать многие важные детали, контролирующие образование эпибласта, гипобласта, экстра-эмбриональной энтодермы в простых условиях культуры.

Оказалось, что эмбриоидные агрегаты не формируют фрагментов эпибласта без присутствия в культуре ЭЭ [5]. Образование эпибласта - первичной эктодермы и первоисточника эмбриональных стволовых клеток-происхо-дит механизмом эмбриональной индукции.

Коротко-цепочечные Rho-ГТФ-азы Rac1 и Cdc42 играют ключевую роль в формировании эпибласта за счет стимуляции

The modern findings on gene expression interchanging that characterize manifestation of epithelial and mesodermal (mesenchymal) cells within early embryogenesis are presented. Based on our data obtained while using immunocytochemisrty method (CD43, CD45, CD14, CD44, CD54, CD56, CD90, CD105 antibodies) the authors consider the part of mesenchymal stem cells to be epithelial ones. It is suggested that interchanging of epithelial and mesenchymal phenotype features are general biologic natural phenomenon in ontogenesis.

Key words: stem cell, mesenchyma, embryonal induction, E-kadherin.

синтеза Е-кадгерина, окклюдина и межклеточных белков JAM-комплекса [6]. Характерно, что Rac1 /Cdc42 одновременно контролируют образование ЭЭ из эмбриобласта [7]. Антагонистом Rac1/Cdc42 в клетках эпибласта является ГТФ-аза Rho-A.

Спонтанное образование примитивной энтодермы по периферии агрегатов эмбриональных стволовых клеток [ЭСК] связано с локальным торможением экспрессии гена плюрипотентности Nanog и автоматическим появлением рецептора для bFGF. Активная сигнализация через FGF-R приводит к лавинообразной активации генов энтодермы: GATA- 6, GATA-4, Sox-17, FOG1, HNF-Зр. Синтез ламини-на, коллагена IV и других компонентов базальной мембраны невозможен без предварительной активации GATA-4/ GATA-6 в клетках энтодермы [8]. SU5402 - селективный ингибитор сигнализации через FGF-рецептор^ - полностью блокирует образование энтодермы и экспрессию ключевых генов энтодермы: GATA-6, GATA-4, Sox-17, FOG1, HNF3P в агрегатах ЭСК.

Гаструла - 3-й-дериват эпибласта

Появление клеток первичной полоски связано с необратимой утерей пласта эпибласта за счет:

1] исчезновения Е-кадгерина с поверхности клеток и разрушения tight junctions;

2] возрастания р-катенина в цитоплазме и LEF-1 в ядре;

3] исчезновения цитокератина 8 и 18 в клетках;

4] нарастания экспрессии кадгерин-11 и N-кадгерина в клетках;

5] апикально-базальный полярный каркас эпителия замещался на передне-заднюю функциональную ось, которая формировала новую миграционную активность клеток. Процесс реорганизации цитоскелета начинался с разрушения базальной мембраны региональными протеазами (9, 10].

lililí

I I I

Эпителио-мезенхимальная трансформация [ЭМТ] эпибласта сопровождается глобальной селекцией основных программ эмбриогенеза:

1 ] выключением экспрессии Oct4, Sox2, Nanog, сети генов плюрипотентности и замену ЭСК на клетки зародышевых листков;

2] удаление Е-кадгерина запускает экспрессию начальных генов мезодермы [Brachyury, goosecoid, Tbx-6, Cer] и автоматически блокирует возможность экспрессии нейроэктодермы или других провизорных зачатков;

3] появление рецептора для bFGF происходит синхронно с появлением Wnt-beta-catenin-LEF1 сигнального каскада;

4] под влиянием Rho-ГТФ-аз происходит быстрая реорганизация планарного цитоскелета в 3-0-цитоскелет с новыми осями клеточной миграции и межклеточных взаимодействий.

Клетки зародышевых листков, реагирующие на локальные градиенты морфогенов, наделены компетентностью в реализации 3-0-программ эмбриогенеза [аксиальный паттернинг]. Набор генов и сигналов, обеспечивающих ЭМТ/мезенхим-но-эпителиальныую трансформацию [МЭТ], сохранился практически неизменным в эмбриогенезе разных видов. Эпителио-мезенхимальные перестройки зародышевых клеток - безотходный способ наращивания новых резервов клеток для провизорных органов в зародыше. Если мезенхима обеспечивала реализацию 30-программ [включая работу Нох-генов], то краевой эпителий обеспечивал информационную сегрегацию зародыша на независимые отсеки развития.

В эволюции многоклеточных организмов мезенхима возникла около 500 млн лет назад как резервная плюрипотентная строма, наделенная способностью к структурно-информационной реорганизации [2, 3].

Эпибласт до стадии формирования первичной полоски был поделен с помощью founder cells на будущие территории и структуры зародыша. Самая передняя часть эпиблас-та сохраняла статус эпителиального пласта, развиваясь в нейроэктодерму, нервную пластинку и нервную трубку. Эти клетки не принимали участия в ЭМТ в составе первичной полоски генерировали ЭЭ, аллантоис, амнион, желточный мешок. Передняя часть первичной полоски продуцировала главную часть клеток в составе кардиогенной, краниальной, параксиальной и аксиальной мезодермы. Наконец, поздние порции мезодермы передней первичной полоски давали дефинитивную мезодерму.

В ходе гаструляции решаются две стратегические задачи: 1] возникает первичный 30-план зародыша на базе эпибласта 2] на бывшей территории эпибласта возникают 4 «инфо-центра»: узелок [node], ЭЭ-эктодерма, передняя висцеральная энтодерма и задний эпибласт. Эти структуры запускают осевое развитие экто-мезо- и энтодермы.

Генный контроль ЭМТ эпибласта

У зародышей мыши с двойной гомоделецией Snail-/-полностью блокирована гаструляция на стадии ЭМТ клеток эпибласта [11]. Схожим образом блокирована гаструляция у зародышей мыши без Е-кадгерина [12]. Зародыши мыши без рецептора для bFGF [FGF1-R-/-] погибали во время гаструляции из-за блока ЭМТ эпибласта. Выключение рецептора FGFR1 блокировало экспрессию гена Snail и гена Tbx6 - второго ключевого гена гаструляции [13]. У насекомых и низших животных ЭМ перестройка контролировалась одним геном Snail. У млекопитающих обратимое формирование мезенхимы из эпителия поставлено под двойной контроль генов Snail и его деривата Slug [14]. Зародыши мыши на стадии эпибласта синтезировали FGF-4 и FGF-8 [12]. Гибель зародышей мыши FGF4-/- или FGF8-/- наступала на стадии гаструлы.

TGFB1 и TGFB3 признаны ключевыми триггерами ЭМТ эпибласта. У зародышей с генетически удаленным рецептором Smad4-/- развитие останавливалось между 6.5 - 8.5 днем развития из-за блока ЭМТ эпибласта [15). Зародыши мыши без рецептора для ВМР-4 также погибали из-за полного отсутствия мезодермы [16, 17, 18). Nodal в комплексе с ко-фактором Cripto контролировали два эффекта:

1) в мезенхиме гаструлы исчезала экспрессия генов плюрипотентности (Oct4, Nanog, Rex-1);

2) активировалась сигнальная сеть Wnt-3 и генов мезодермы [goosecoid, FoxA2, Cerebrus).

У зародышей мыши Wnt3a-/- отсутствие мезодермы совпадало с отсутствием экспрессии всего сигнального каскада Wnt3a - р-катенин - LEF1 [19, 20, 21). HGF, bFGF в синергизме с TGFp усиливали темп ЭМТ эпибласта (22).

В эмбриобласте не было выявлено никакой активности Wnt-каскада и свободного бета-катенина. По-видимому, активация Wnt-beta-catenin-LEF1 была напрямую связана с ЭМТ эпибласта (23). Особую роль в формировании динамичного фенотипа одиночно мигрирующих мезенхимальных клеток гаструлы играли Rho-ГТФ-азы. Т ри сигнальных ГТФ-азы (RhoA, Cdc42, Rac1) через комплекс белков WASP, Arp2/3, LIMK, PAK полностью реорганизовывали актино-вую сеть в мобильный цитоскелет активно мигрирующих мезенхимальных клеток, формирующих ламеллоподии (24). Комплекс SRF-RhoA-ГТФ—aза играет ключевую роль в удержании цитоскелета незрелых мезодермальных клеток и защищает их от преждевременной дифференцировки (25). Одновременно SRF ускоряет рецепторную интернализацию и лизосомальную деградацию Е-кадгерина в мезодермальных клетках (26). Выключение гена SRF-/- ведет к полному исчезновению незрелых мезодермальных клеток за счет их ускоренной дифференцировки. Активин А + bFGF стимулировали пролиферацию незрелых мезодермальных прогениторов, которых удавалось идентифицировать по экспрессии мРНК Рах-3, Рах-6 и Msx-1 (Hox-7) (27, 28). LIF совместно с инги-бином снимали стимулирующие эффекты активина А + bFGF.

Мезодермальные клетки гаструлы мигрировали каудально двумя организованными потоками (крыльями) в экстраэм-бриональное пространство вдоль матрикса висцеральной энтодермы из ламинина, коллагена IV типа, фибронектина и протеогликанов (29). Теряя Е-кадгерин, мезодермальные прогениторы экспонировали a-6, р-1 интегрин - рецептор ламинина. В отличие от эпителия эпибласта, мезодермальные клетки быстро прикреплялись к ламинину и коллагену

IV типа. Набор молекулярных маркеров позволяет идентифицировать МСК и ранние мезодермальные прогениторы (таб. 1).

Таблица 1. Сопоставление главных молекулярных

маркеров ранней мезодермы и МСК

МСК Мезодерма

Brachyury-негативные Brachyury+

Desmin-негативные Desmin+

Flkl-негативные Flk-1+

PDGFR-alpha-негативные PDGFRA+

Mixl1 + Mixll-негативные

Runx1+ Runxl-негативные

Рах-2+ Рах-2-негативные

Adiponectin+ Adiponectin-негативные

Apolipoprotein E+ Apolipoprotein E-негативные

Apolipoprotein A+ Apolipoprotein A-негативные

Таким образом, мезенхимальный статус - это лишь текущий морфологический паспорт мезодермальных клеток, который никак не предопределяет их будущую судьбу. Судьба мезодермы, как и других зародышевых клеток, зависит от постоянного диалога генома клеток с эпигеномным окружением. Мезенхимальные клетки не только способны агрессивно мигрировать, синтезировать уникальный трехмерный матрикс, но и формировать плотные агрегаты МСК в ходе органогенеза. Причем, в разных агрегатах ведущую роль играют разные рецепторы: кадгерин-11, N-кадгерин или Е-кадгерин. Поэтому морфо-статус мезенхимальных клеток - это лишь средство для решения разных задач эмбриогенеза здесь и сегодня. Последние данные указывают, что значительное число клеток мезодермы сохраняет промежуточный фенотип, сохраняя молекулярные маркеры эпителия и мезенхимы. Внимание также уделяется эпителиальным клеткам амниона человека и млекопитающих, поскольку они являются прямыми дериватами эпибласта [30, 31). Часть клеток амниона в культуре экспрессировали 0^4, SSEA4, Rex-1, Nanog. Одновременно эти клетки содержали Е-кад-герин, виментин, a-актин гладкомышечных клеток, а также маркеры эндотелиальных клеток.

Изучать гаструляцию и формирование первичной полоски в культуре агрегатов ЭСК затруднительно, потому что Е-кадгерин - позитивные клетки представлены в основном одиночными рассеянными эпителиальными клетками. В ходе спонтанной или индуцированной дифференцировки агрегатов ЭСК удавалось наблюдать лишь формирование фрагментов эпибласта in vitro. В случае добавления индукторов первичной полоски [Nodal-Cripto, TGFP) замечено формирование многочисленных центров эпителио-мезензимальной трансформации [ЭМТ) в культуре агрегатов ЭСК in vitro [32). Доля мезодермы при добавлении ВМР-4 или TGFp в бессы-вороточной среде возрастала до 30-40% [33, 34, 35).

Сокультивирование мышиного эпибласта с передней висцеральной энтодермой приводило к образованию наиболее ранних примитивных мезодермальных [Brachyury+/flk1+/ PDGFR-/alpha+) клеток [36). Комбинация ВМР-4/активина А индуцировала образование мезодермальных линий желточного мешка - Goosecoid+/Flk1 +/PDGFR-alpha+ ангиоп-рогениторов [34, 37). Более поздние линии миогенной мезодермы выделялись как Flk1 + PDGFR-alpha-минус субпопуляции [38). PDGFR-alpha+ Flk1-негативные прогенито-ры параксиальной мезодермы давали соединительную ткань. Flk1 + N-cadherin+ мезодермальные линии латеральной пластинки через временный пул примитивной мезодермы [Brachyury+/Flk1+/ PDGFR-alpha+) генерировали все линии «гемато-васкулярной системы» [включая перициты) [39).

Активин А в комбинации с 0,2% сывороткой индуцировал экспрессию CXCR4 рецептора [маркера ранней энтодермы) среди N-кадгерин-позитивных клеток. Дальнейшая инкубация CXCR4+ клеток с 100 нг/мл активина А/2% сыворотки вела к экспрессии FoxA2, Sox-17, Cas в N-кадгерин клетках. Экспрессия FoxA2 запускала реэпителизацию N-кадгерин-позитивных клеток - в первую очередь, через ресинтез Е-кадгерина [39).

Эпителизация миотомов идет по общим эволюционно неизменным правилам у всех видов [43].

У человека в начале 3-й недели гестации параксиальная мезодерма начинает сегментироваться в сомиты. Процесс начинается с головной части зародыша и двигается в каудальном направлении со средней скоростью 3 сомита в сутки. Образование сомитов в культуре из параксиальной мезодермы пока не удается воспроизвести. Вентральная часть сомитов из мезенхимальных клеток формирует скле-ротом. Мезенхимо-эпителиальная реорганизация цитоскелета клеток миотомов идет с помощью тех же ГТФ-аз Rac1, Cdc42, A-ГТ Ф-азы [24]. Синхронная активация Rac1 -Paraxis и торможение Cdc42 воссоздавали планарный цитоскелет неоэпителиальных клеток вместе с форсированной экспрессией Е-кадгерина. Реэпителизация бурно происходила всегда по периферии сомитов. Электропорация высокой дозы гена Rac1 за несколько дней превращала неорганизованный агрегат МСК в классический эпителиальный пласт клеток [44]. Изменяя баланс короткоцепочечных ГТФ-аз, удавалось не только возвращать мезенхимальный статус миобластам, но и получать заново «канонические» культуры МСК с высокой клоногенной активностью [45].

В ходе сомитогенеза не все клетки гаструлы приобретали фенотип мигрирующих мезодермальных/мезенхимальных клеток. Клоногенные стволовые клетки с соединительнотканной мезенхимой пассивно мигрировали в новообразованные сомиты. В каждом сомите зародышей мыши определяли от 10 до 60 клоногенных мезодермальных стволовых клеток [46].

Коронарный васкулогенез

Формирование коронарных артерий начиналось с образования пласта мезотелиальных клеток вблизи sinus venosum. Эта часть пласта получила название проэпикард. Вторая часть пласта уходит на формирование зачатка печени. Пласт проэпикарда мигрировал к миокардиальной трубке. Первичный контакт проэпикарда с миокардом происходил в районе атриовентрикулярной борозды на 8,5-9-е сутки развития зародышей мыши. После контакта с миокардом клетки проэпикарда подвергались ЭМТ. Один поток мезенхимальных клеток мигрировал по поверхности миокарда, формируя эпикард. Большая часть мезенхимальных клеток мигрировала в толщу миокарда и затем синхронно трансформировалась в пласт ангиобластов. Васкулогенез проэпикарда контролировался генами bves [blood vessel epicardial substance], Wt-1, FOG-2, GATA-6. У зародышей мыши FOG-2-/- полностью блокировано образование коронарных артерий за счет блока ЭМТ проэпикарда [47, 48]. Пересадки нормальных мезенхимальных клеток - дериватов эпикарда- полностью восстанавливали сборку коронарных артерий у FOG-2-/- зародышей мыши. Ангиобласты с экспонированным Ephr2 рецептором формировали артерии, а прогениторы с экспонированным Ephr4 рецептором формировали венозные сети. С помощью нокаут-мутаций выявлено более 20 факторов генетической транскрипции, контролирующих васкулогенез и ангиогенез из клеток эпикарда [47, 49, 50].

Реэпителизация мезодермы в сомитах

Важно подчеркнуть, что в клетках мезодермы не обнаружено генов, обеспечивающих возможность прямой реэпителизации мезодермы в эпибласт. Такой вариант превращения мезодермы не предусмотрен эволюцией. Почему реэпителизация мезодермы происходит в сомитах, но не в гаструле?

Концепция динамической организации морфологического статуса клеток зародышевых листков была сформулирована Elsabeth Hay [40, 41, 42) на примере сомитогенеза.

Образование клеток нервного гребня (НГ) и их реэпителизация

В ходе нейруляции у позвоночных и млекопитающих по всему длиннику зародыша формировался уникальный провизорный зачаток в виде двух тяжей нейромезенхимальных плюрипотентных клеток. В результате индуктивных взаимодействий между презумптивной эктодермой и складкой нервной трубки пласт нейромезенхимы отшнуровывался от нейроэпителия. Внешними триггерами ЭМТ нейроэпителия служили Wnt3/Wnt6, ВМР-4 и ТОЕр [51, 52).

Т рансформацию эксплантата нервной трубки в клетки НГ наблюдали в культуре при инкубации с эпидермисом зародыша. Клетки НГ образовывались в обеих тканях [53]. Эпите-лио-мезенхимальной трансформации подвергались только 1\1-кадгерин+ клетки [хотя ткань нервной складки содержала значительное число Е-кадгерин+ прогениторных клеток] [54].

Образование нейромезенхимы непременно происходило под контролем генов Snail/Slug. В одиночных мигрирующих клетках НГ сохранялся высокий уровень экспрессии генов Fox D3, Sox-9, Sox-10, Twist, Msx2. Первые три гена ответственны за сохранение плюрипотентности генома незрелых клеток. Два последних гена ответственны за блокаду преждевременной дифференцировки прикрепленных нейромезенхимальных клеток [55].

В условиях in situ Wnt1 /Wnt3a - р-катенин LEF1 оставались главным сигнальным путем, запускавшим ЭМТ клеток НГ [51, 52]. В условиях культуры ВМР-4, Wnt 6 были способны индуцировать образование эктомезенхимы из клеток нейроэпителия [56]. Эпителиальный фенотип клеток НГ маркировался \-кадгерином, кадгерином-6. Мезенхимальный фенотип клеток НГ отличался экспрессией кадгерина 7, рецептором альфа для PDGF, рецептором р75 для \T3. Упомянутые ранее Rho-ГТФ-азы принимали участие в ЭМТ клеток [53].

Мигрирующие предшественники НГ сохраняли альтернативную дифференцировку с помощью набора специальных генов. Например, эспрессия Sox-9, Sox-10 в хондропрог-ниторных клетках, возникавших из зачатков жаберных дуг, выключала экспрессию гена Msx2. В свою очередь, плюри-потентный статус нейропрогениторов периферической нервной системы, черепно-мозговых нервов, симпатических и парасимпатических ганглиев находился под контролем гена Msx2. Его экспрессия исключала активный статус «хон-дрогенных» регуляторов Sox-9/Sox-10 [57].

Возникновение НГ в эмбриогенезе позвоночных и млекопитающих позволило создать новые линии специализированных клеток для зубов, гортани, роговицы и сетчатки глаза, всех органов чувств. Появление НГ увеличило потоки афферентной информации от органов чувств и периферии. На базе плюрипотентных клеток НГ возникла периферическая симпатическая/парасимпатическая нервная система, чувствительные нейроны спинного мозга, хромаффинная часть надпочечников, меланоциты кожи.

Пластичность дифференцировки плюрипотентных клеток НГ основана на автоматике ре-эпителизации: в ДОПА-нейроны симпатических ганглиев с помощью генов HAND2, Mash1, Phox2B, Phox2A [58]. Эндотелин 3-зависимая диф-ференцировка прогениторов НГ вела к общим предшественникам меланоцитов или шванновских клеток [59]. Лишняя доза Wnt1 гена в мигрирующих прогениторах НГ приводила к гипер-пигментации кожи [60]. Гомоделеция Рах-3-/-[Splotch мутация у зародышей мыши] позволила выявить роль гена Рах-3 в направленной миграции миогенных про-гениторов в почке конечности [61]. Эта же мутация приводила к 5-кратному снижению количества периферических нейронов, возникающих из клеток НГ [23]. BMP-4 или цАМФ стимулировали дифференцировку нейронов симпато-адре-наловой системы [62]. У зародышей мыши с гомоделецией рецептора р75-/-, лиганда \T3-/- или сигнальной рецепторной тирозинкиназы С-/- возникали множественные аномалии перегородок и тяжелые дефекты септации выходных магистральных сосудов сердца [63].

Эпителиальная индукция в смешанных

культурах МСК

Сокультивирование МСК с эксплантатaми легкого или первичной культурой альвеолоцитов привело к открытию индуцированного эпителиогенеза in vitro. Большинство

экспериментаторов склонно считать, что моделируется не дифференцировка одиночных клеток, а кооперативный клеточный процесс сборки эпителиального пласта с мощными боковыми межклетными контактами [tight junctions] [64, 65, 66, 67]. Сокультивируя МСК и альвеолобласты на одной подложке, получали химерный пласт альвеолярного эпителия, собранного из донорских и реципиентных клеток. Эпиморфин, секретируемый МСК, стимулировал сборку миофиб-робластов в пласт энтероцитов [68]. Без проблем удавалось моделировать эпителиальную перестройку женских XX-МСК и их встраивание в тубулы мужских ХУ - нефронов [69]. Дифференцировку МСК в гепатоциты удалось индуцировать совместным культивированием с изолированными гепато-цитами мыши [крысы] или с эксплантатами цирротически измененной печени [70, 71, 72].

В данном обзоре мы намеренно не обсуждаем вопрос о терапевтическом использовании МСК для репарации поврежденной паренхимы почек, печени, легких из-за необходимости анализировать гигантские объемы накопленной информации.

Приходится констатировать, что трансформация МСК invitro под влиянием индукционной эпителиальной ткани [клеток] осуществляется двумя независимыми путями: 1 ] путем дифференцировки одиночных МСК [не имеющей ничего общего с мезенхимо-эпителиальной трансформацией]; 2] путем кооперативной реэпителизации множества клеток с формированием классического пласта на базальной мембране и сборки монослоя через прочные боковые межклеточные контакты.

Т олько в случае малигнизации ЭМТ имела необратимый характер [73]. Малигнизация зародышевых клеток была связана с избыточной экспрессией гена Twist. По-видимому, дисбаланс экспрессии генов Twist, Snail и Sip-1, необратимо блокировал экспрессию Е-кадгерина. Метастазирующие клетки приобретали способность активно инвазироватся в дифференцированные ткани с автономной системой васкуляризации.

Динамический ЭМ-статус изолированных культур

и линий МСК

Изолированные линии МСК содержат огромные библиотеки мРНК для дифференцировки разных линий соматических клеток в обход органогенеза, включая полный резерв мРНК, обеспечивающий эпителиальный фенотип клеток [74]. Экспериментально установлено, что изолированные линии и культуры МСК из костного мозга способны дифференцироваться в нейроны, гепатоциты, альвеолярный эпителий, миоциты и кардиомиоциты - дериваты всех трех зародышевых листков. Однако первоисточник эпителиальных клеток и механизм дифференцировки остается недостаточно изученным. Мы попытались более детально охарактеризовать фенотип МСК, выделяемых общепринятым методом из костного мозга, жировой ткани, скелетных мышц взрослых здоровых доноров. Мононуклеарную фракцию из аспирата костного мозга выделяли общепринятым способом в градиенте фиколла [Ficoll-Pague, «Pharmacia»] с последующим добавлением лизирующего раствора для удаления эритроцитов [75, 76] и высевом клеток в плотности 5*105/см2. Через 24 часа неприкрепленные клетки удаляли и дальнейшее культивирование вели до получения предконфлуентной культуры [10-14-й день] в ростовой среде следующего состава: среда 0MEM/F12 [«HyClone»] c добавлением 2 мМ глютамина, 10% FBS [«HyClone»] и стандартного раствора антибиотика-антимикотина. Полученные гетерогенные культуры всегда содержали Е-кадгерин, альфа-актин ГМК, нестин, виментин, но не содержали С045 клеток, С034 экспрессировали отдельные клетки, составляя менее 1% от общего числа прикрепившихся клеток.

Рис.1. Морфология культуры клеток костного мозга человека (объектив х20 ):

А — эпителиоидная колония; Б - фибробластоподобная колония

Ф 9

✓ ' # * t * _

• * • %

% % г 9 А • Б N •/ %• • • '*1*

* У

Ч / - * и'

в % • (• • i ' *

в ч.

Рис. 2. Иммуногистохимический анализ эпителиоидных клеточных колоний из костного мозга:

А - экспрессия нестина (объектив *20);

Б - экспрессия Е-кадгерина (объектив *20);

В - коэкспрессия нестина и виментина (объектив *10);

Г- экспрессия a-актин ГМК

Докраска ядер - Hoechst

Рис. 3.

Иммуногистохимический

анализ

фибробластоподобных клеточных колоний из костного мозга:

А - экспрессия Е-кадгерина (объектив *20);

Б - экспрессия нестина (объектив *20);

В - экспрессия a-актина ГМК (объектив *40) Докраска ядер - Hoechst

Рис. 4. Экспрессия в культуре ПМСК, изолированной из костного мозга:

А - фактора

фон Виллибранда (VWF);

Б - CD105 (объектив *40) Докраска ядер - Hoechst

в

0 %% 0 ф М

А W

*

» '• jj; “i i 1 л ^

• у ,'•/ *ï;

¿.»Л- f *v ¿4 -• •

Рис. 5. Иммуногистохимический анализ постнатальных прогениторных клеток из жировой ткани человека:

А - экспрессия Е-кадгерина (объектив *20);

Б - коэкспрессия нестина и виментина (объектив *10);

В - экспрессия a-актина ГМК

Докраска ядер - Hoechst

Для получения эпителиальных и мезенхимальных колоний накопленные первичные клетки высевали на чашки Петри с плотностью 5-6 клеток/см2. Через 2-3 недели наблюдали образование как эпителиальных колоний, состоящих из мелких полигональных клеток, так и мезенхимальных колоний, состоящих из фибробластоподобных клеток [рис. 1 А, Б). Для иммунофенотипирования клеточных колоний использовали первичные моноклональные мышиные и кроличьи антитела к антигенам человека («Chemicon», «BD Pharmingen») и вторичные антитела козы к IgG кролика, конъюгированных флуорохромом Texas Red («Jackson»] и мыши, конъюгированных флуорохромом Cy-2 («Jackson»]. Для двойной иммуногистохимической окраски проводили одновременное инкубирование с первичными антителами и вторичными антителами, меченными флуорохромами. Ядра клеток докрашивали люминесцентным красителем Hoechst 33342 («Sigma»]. Для цитофлюориметрического анализа под контролем микроскопа выделяли отдельно эпителиальные и фибробластоподобные колонии и анализировали на проточном цитофлюориметре «FACS Calibur» («BD Biosciences»], используя следующие моноклональные антитела: CD34, CD45, CD14, CD44, CD54, CD56, CD90, CD105.

Каждая эпителиоидная колония из полигональных, хорошо распластанных клеток содержала 40-50% Е-кадгерин+ клеток, 90-100% нестин+ клеток. Доля виментин+ и альфа-актин ГМК+ клеток колебалась от 0 до 5% [рис. 2]. Доля других молекулярных маркеров МСК колебалась в эпителиальных колониях следующим образом: С054 - 5-10%, С056 - 5-10%, р-1-^едпп - 5-10%, С014 и С0105 - менее 10%, С044 - 40- 50%, С090 - 40-50 %.

Фибробластоподобные колонии содержали менее 20 % Е-кадгерин+ клеток, тогда как концентрация а-актин ГМК + клеток возрастала до 50%. Количество нестин+ клеток в фибробласто-подобных колониях оставалось на уровне 80-90% [рис. 3]. Количество Е-кадгерин-позитивных клеток резко убывало при пассировании клеток. Доля виментин+ клеток колебалась на уровне 5%. Появлялись субпопуляции С034+ [эндотелиальных] клеток, часть из которых прокрашивалась антителами к фактору фон Виллибранда [рис. 4]. В колониях удавалось идентифицировать одиночные С0133+, С0105+ клетки [рис. 5].

Характерно, что первичная преконфлуентная культура МСК, изолированная из взрослой жировой ткани по общепринятой методике [77], содержала значительно меньше

А

Дискуссионные и общетеоретические работы

Е-кадгерин+ клеток, представляющих собой небольшие скопления. Менее 20% клеток прокрашивались на Е-кадгерин, хотя преобладающей популяцией оставались нестин+/ви-ментин+ клетки [до 80%]. Количество С034+ клеток колебалась на уровне 5-10 %, доля а-актин-ГМК+ клеток сохранялась на уровне 40-50 % [Рис. 5.]. При пассировании количество Е-кадгерин клеток резко уменьшалось, и через 3-4 пассажа они исчезали.

В культурах постнатальных миобластов, полученных из ткани мышц [операционный материал], также наблюдались Е-кадгерин клетки, но в гораздо меньшем количестве, даже в сравнении с полипотентными мезенхимальными стро-мальными клетками из жировой ткани. Их доля составляла всего 3-5%. Привлекает внимание иммунофенотипическая гетерогенность и вариабельность маркеров клеток - потомков одной колонии в процессе культивирования.

fMTEPATyPA

1. Kadokawa Y., Fuketa I., Nose A. et al. Expression pattern of E- and P-cadherin in mouse embryos and uteri during the preimplantation period. Develop. Growth Differ. 1989; 31: 23-30.

2. Thiery J.P. Epithelio-mesenchymal transformation and cancer. Nat. Rev. Cancer. 2002; 2: 442-54.

3 . Thiery J.P. Epithelio-mesenchymal transitions in development and pathologies. Curr. Opin. Cell Biol. 2003; 15: 740-46.

4. Thiery J.P., Sleeman J.P. Complex networks orchestrate epithelialmesenchymal transitions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006; 7: 131 -41.

5. Li L., Arman E., Ekholm P. et al. Distinct GATA6- and laminin-dependent mechanisms regulate endodermal and ectodermal ESC fates. Development. 2004; 131: 5277-86.

6. Braga V.M., Machesky L.M., Hall A. et al. The small GTP-ase Rho A and Rac1 are required for the establishment of cadherin-dependent cell-cell contacts. J. Cell Biol. 1997; 137:1421-31.

7. Kim K., Lu Z., Hay E.D. Direct evidence for a role of beta-catenin/LEF-1 signaling pathway in induction of EMT. Cell Biol. Int. 2002; 26: 463-76.

8. Chen, Y., Li X., Eswarakumar V.P. et al. FGF signaling through PI 3-kinase and Akt/PkB is required for embryoid body differentiation. Oncogene. 2000; 19: 3750-56.

9. Kemler R., Hierholzer A., Kanzler B. et al. Stabilization of beta-catenin in the mouse zygote leads to premature epithelial-mesenchymal transition in the epiblast. Development 2004; 131: 5817-24.

10. Kim K., Lu Z., Hay E.D. Direct evidence for a role of beta-catenin/LEF-1 signaling pathway in induction of EMT. Cell Biol. Int. 2002; 26: 463-76.

11. Artas A.M. Epithelial - mesenchymal interactions in cancer and development. Cell 2001; 105: 425-31.

12. Ciruna B., Rossant J. FGF signaling regulates mesoderm cell fate specification and morphogenetic movement at the primitive streak. Dev. Cell. 2001; 1: 37-49.

13. DeCraene B., van Roy F., Berx G. Unraveling signaling cascade from the Snail family of transcription factors. Cell Signalling 2005; 17: 535-47.

14. Hemavathy K., Ashraf S.I., Ip Y.T. Snail/slug family of repressors: slowly going into the fast lane of development and cancer. Gene 2000; 257: 1 -12.

15. Yang X., Li C., Xu X. et al. Tumor suppressor SMAD4/DPC4 is essential for epiblast proliferation and mesoderm induction in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. 95. 3667 - 72

16. Fehling H.J., Lacaud G., Kubo A. et al. Tracking mesoderm induction and its specialization to the hemangioblasts during ESC differentiation. Differentiation. 2003; 130: 4217-27.

17. Gadue P., Huber T.L., Nostro C. et al. Germ layer induction from ESC. Exp. Hematol. 2005; 33: 955-64.

18. Bertochini F., Skromne I., Wolpert L. et al. Determination of embryonic polarity in a regulative system: evidence for endogenous inhibitors acting sequentially during primitive streak formation in the chick embryo. Development 2004; 131: 3381-90.

19. Arnold S.J., Stappert J., Bauer A. et al. Brachyury is a target gene of the Wnt/beta-catenin signaling pathway. Mech. Dev. 2000; 91: 249-58.

20. Yamaguchi T.P., Takada S., Yoshikawa Y. e al. Brachyury is a direct target of Wnt3a during paraxial mesoderm specification. Genes. Dev. 1999; 13: 3185-90.

21. Galceran J., Hsu S.C., Grosschedl R. Rescue of a Wnt 3a mutation by an activated form of LEF-1: regulation of maintenance but not initiation of Brachyury expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98: 8668-73.

22. Beck S., Le Good A., Guzman M. et al. Extraembryonic proteases regulate Nodal signaling during gastrulation. Nat. Cell Biol. 2002; 4: 981-87.

23. Koblar S.A., Murphy M., Barrett G.L. et al. Pax-3 regulates neurogenesis in neural crest-derived precursor cells J. Neurosci. Res. 1999; 56: 518-30.

24. Van Aelst L., Symons M. Role of Rho family of GTP-ases in epithelial morphogenesis. Genes. Dev. 2002; 16: 1032-54.

25. Schratt G., Philippar U., Berger J. et al. Serum response factor is crucial for actin cytoskeletal organization and focal adhesion assembly in ESC. J. Cell Biol. 2002; 156: 737-50.

26. Palacious F., Tushir J.S., Fujita Y. et al. Lysosomal targeting of E-cadherin: a unique mechanism for down-regulation of cell-cell adhesion during epithelial-to-mesenchymal transition. Mol. Cell Biol. 2005; 25: 389-99.

27. Pourquie O. Vertebrate somitogenesis. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 2001; 17: 311-50.

28. Houselstein D., Auda-Boucher G., Cheraud V. et al. Hox-gene Msx1 is expressed in a subset of somites and in muscle progenitor cells migrating into limbs. Development 1999; 126: 2689-701.

29. Burdsal C.A., Damsky C.H., Pedersen R.A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development 1993; 118: 829-44.

30. Prusa A.R., Marton E., Rosner M. et al. Oct-4-expressing cells in human amniotic fluid: a new source for stem cell research? Hum. Reprod. 2003; 18: 1489-93.

31. Miki T., Lehmann T., Cai H. et al. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells 2005; 23: 1549-59.

32. Behr R., Heneweer C., Viebahn C. et al. Epithelial-mesenchymal transitions in colonies of rhesus monkey ESC: a model for processes involved in gastrulation. Stem Cells 2005; 23: 805-16.

33. Green J.B., Dominiguez I., Davidson L.A. Self-organization of vertebrate mesoderm based on simple boundary conditions. Dev. Dyn. 2004; 231: 576-81.

34. James R.G., Schulteiss T.M. BMP signaling promotes intermediate mesoderm gene expression in a dose-dependent, cell-autonomous and translation-dependent manner. Dev. Biol. 2005; 288: 113-25.

35. Tada S., Era T., Furusawa C. et al. Characterization of mesendoderm: a diverging point of the definitive endoderm and mesoderm in ESC culture. Development 2005; 132: 4363-74.

36. Belaoussoff M., Farrington S.M., Baron M.H. Hemopoietic induction and re-specification of A-P identity by visceral endoderm signaling in the mouse embryo. Development 1998; 125: 5009-18.

37. Huber T.L., Kouskoff V., Fehling H.J. et al. Haemangioblast commitment is initiated in the primitive streak of the mouse embryo. Nature 2004; 432: 625-30.

38. Rossant E.M. Cell fate decisions in early blood vessel formation. Trends Cardiovasc. Med. 2003; 13: 254-59.

39. Sakurai H., Era T., Jakt L.M. et al. In vitro modeling of paraxial and lateral mesoderm differentiation reveals early reversibility. Stem Cells 2006; 24: 575-86.

40. Hay E.D. An overview of epithelio-mesenchymal transformation. Acta Anat. 1995; 154: 8-20.

41. Hay E.D. The mesenchymal cell, its role in the embryo, and the remarkable signaling mechanisms that create it. Dev. Dyn. 2005; 233: 706-20.

42. Hay E.D., Zuk A. Transformation between epithelium and mesenchyme: normal, pathological and experimentally induced. Am. J. Kidney Dis. 1995; 26: 678-90.

43. Shook D., Keller R. Mechanism, mechanics and function of epithelialmesenchymal transition in the early development. Mech. Dev. 2003; 120: 13511383.

44. Nakaya Y., Kuroda S., Kataquri Y.T. et al. Mesenchymal-epithelial transition during somatic segmentation is regulated by differential roles of Cdc42 and Rac1. Dev. Cell. 2004; 7: 425-38.

45. Meriane M., Charrasse S., Comunale F. et al. Participation of small GTF-ase Rac1 and Cdc42Hs in myoblast transformation. Oncogene 2002; 21: 2901-07.

46. Eloy-Trinquet S., Nicolas J.F. Cell coherence during production of presomitic mesoderm and somitogenesis in the mouse embryo. Development 2002; 129: 3609-19.

47. Репин B.C. Стволовые клетки сердечно-сосудистой системы и атеросклероз. Патогенез 2004; 1: 9-20.

48. Tevosian S.G., Deconinck A.E., Tanaka M. et al. FOG-2 is essential for heart morphogenesis and development of coronary vessels from epicardium. Cell 2000; 101: 729-39.

49. Wada A.M., Willet S.D., Bader D.M. et al. Coronary vessel development. Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol. 2003; 23: 2138-45.

50. Reese D.E., Mikawa T., Bader D.M. et al. Development of the coronary vessel system. Circ. Res. 2002; 91: 751 -68.

51. Dorsky R.I., Moon R.T., Raible D.W. Control of neural crest cell fate by the Wnt signaling pathway. Nature 1998; 396: 370-75.

52. Dorsky R.I., Moon R.T., Raible D.W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Bioessays 2000; 22: 708-16.

53. LaBonne C., Bonner-Fraser M. Molecular mechanism of neural crest formation. Ann. Rev. Cell Biol. 1999; 15: 81-112.

54. Weston J.A., Yoshida H., Robinson V. et al. Neural crest and the origin of the ectomesenchyme: neural fold heterogeneity suggests an alternative hypothesis. Dev. Dyn. 2004; 229: 118-30.

55. Cheung M., Chaboissier M.C., Mynett A. et al. The transcriptional control of trunk neural crest induction, survival and delamination. Development 2005; 8: 179-92.

56. T rainor P., Krumlauf R. Riding the crest of the Wnt signaling wave. Science 2002; 292: 781-84.

57. Takahashi K., Nuckolls G.H., Takahashi Y. et al. Msx2 is a repressor of chondrogenic differentiation in migratory cranial neural crest. Dev. Dyn. 2001; 222: 252-62.

58. Xu H., Firulli A.B., Zhang X. et al. HAND2 synergistically enhances transcription of dopamine-B-hydroxylase in the presense of Phox2a. Dev. Biol. 2003; 114: 66-77.

59. Dupin E., Glavieux C., Vaigot P. et al. Endothelin 3 induce the reversion of melanocytes to glia through neural crest derived glial-melanocyte progenitor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: 7882-87.

60. Dunn K.J., Wlliams B.O., Pavan W.J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 2000; 97: 10050-55.

61. Репин B.C., Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. 1998. Из-во БЭБМ: РАМН, Москва.

62. Bilodeau M.L., Boulineau T., Hullinger R.L. et al. cAMP signaling functions as a bimodal switch in sympathoadrenal cell development in cultured primary neural crest cells. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 3004-14.

63. Youn Y.H., Feng J., T essarollo L. et al. Neural crest stem cells and cardiac endothelium defects in the Trk C null mutants. Mol. Cell. Neurosci. 2003; 124: 1333-9.

64. Spees J.L., Olson S.D., Ylostalo J. et al. Differentiation, cell fusion and nuclear fusion during ex vivo repair of epithelium by human adult stem cells from bone marrow stroma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100: 2397-402.

65. Prockop S.J., Gregory C.A., Spees J.L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100: 11917-23.

66. Wang G., Bunnell B., Painter R.G. et al. Potential of BM-MSC for cystic fibrosis therapy. Mol. Therapy 2004; 9: Suppl. 1: 195-205.

67. Wang G., Bunnell B.A., Painter R.G. et al. Adult stem cells from bone marrow stroma differentiate into airway epithelial cells: potential therapy for cystic fibrosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2o0s; 102: 188-91.

BB. Fritsch C., Swietlicki E.A., Lefebvre O. et al. Epimorphin expression in intestinal myofibroblasts induces epithelial morphogenesis. J. Clin. Invest. 2002; 110: 1B29-41.

B9. Poulsom R., Forbes S.J., Hodivala-Dilke K. et al. Bone marrow contributes to renal parenchymal turnover and regeneration. J. Pathol. 2003; 19S: 229-35.

У0. Luk J.M., Wang P.P., Lee C.K. et al. Hepatic potential of bone marrow stromal cells: development of in vitro co-culture and intra-portal transplantation models. J. Immunol. Methods 2005; 30S: З9-4У.

У1. Okumoto K., Saito T., Hattori E. et al. Differentiation of bone marrow cells into cells that express liver-specific genes in vitro: implication of the Notch signals in differentiation. Biochem. Biophys. Res. Comms. 2O03; 304: B91-9S.

У2. Inderbitzin M.D., Avital I., Keogh A. et al. Interleukin3 induces hepatocyte-specific metabolic activity in bone marrow-derived liver stem cells. J. Gastrointest. Surg. 200S. 9. B9 - УЗ. Kang Y., Massague J. Epithelio-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis. Cell 2004; 118: 2УУ-У9.

У4. Seshi B., Kumar S., King D. et al. Multilineage gene expression in human bone marrow stromal cells as evidenced by single-cell microarray analysis. Blood Cells Mol. Dis. 2003; 31: 2BB-BS.

75. DiGirolamo C.M., Stokes D., Colter D. et al. Propagation and senescence of human bone marrow stromal cells in culture: a simple colony-forming assay identifies samples with the greatest potential to propagate and differentiate. Br. J. Hematol. 1999; 10У: 275-81.

76. Baddoo M., Hill K., Wilkinson R. et al. Characterization of MSC isolated from murine bone marrow by negative selection. J. Cell Biochem. 2003; 89: 1235-49.

А