СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭКСПЛАНТОВ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШЕК ex vivo
METHOD OF CULTIVATING ATHEROSCLEROTIC PLAQUE EXPLANTS ex vivo

Изобретение относится к области медицины, а именно к биотехнологии, и может быть использовано в медицинских исследованиях в кардиологии для культивирования бляшек ex vivo с целью изучения их формирования и разрыва, позволит изучать эти процессы в контролируемых лабораторных условиях, а также наблюдать за жизнедеятельностью различных клеток в бляшке в заданных условиях и провести сравнение ех vivo и in vivo.
Долгое время атеросклероз рассматривался как болезнь накопления, вызываемая отложением липидов в стенке сосудов. Однако простое накопление липидов не могло объяснить сложность строения атеросклеротической бляшки. Между тем сложность строения бляшек известна со времен Вирхова, когда было выяснено, что в их состав входят различные клеточные компоненты, в том числе большое количество гладкомышечных клеток, была сформулирована альтернативная гипотеза R.Ross и L.Harker [Faggiotto A, Ross R, Harker L. Studies of hypercholesterolemia in the nonhuman primate. I. Changes that lead to fatty streak formation. Arteriosclerosis. - 1984. - №4.- P.323-340; Ross R, Harker L Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. - 1976. - Vol.193. - P.1094-1100] о том, что пусковым фактором атеросклероза является повреждение эндотелия с последующей активацией тромбоцитов.
Обе теории удалось объединить после того, как в последние 10 -15 лет были получены многочисленные данные о ключевой роли иммунных факторов, в частности воспаления, в возникновении и развитии атеросклероза.
В целом развитие атеросклеротической бляшки обычно рассматривается как реакция организма на отложение в сосудистой стенке инородной субстанции - модифицированных липопротеинов [Kruth HS Sequestration of aggregated low-density lipoproteins by macrophages. Curr Opin Lipidol. - 2002. - №13. - P. 483-488; Geng YJ, Libby P (2002) Progression of atheroma: A struggle between death and procreation. Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2002. - №22. - P.1370-1380].
Причины дестабилизации и разрушения бляшки, несмотря на их важность, остаются в значительной степени неизвестными. Одним из таких факторов является расщепление коллагена металлопротеазами, выделяемыми из макрофагов. Однако причины активации самих макрофагов также малоизвестны.
Другие известные процессы, как местные, так и системные, коррелируют с нестабильностью бляшек [Libby Р Inflammation in atherosclerosis. Nature. - 2002. - Vol.420. - P.868-874; Dollery CM, Libby P. Atherosclerosis and proteinase activation. Cardiovasc Res. - 2006. - Vol.69. - Р.625-635].
Концепция о ведущей роли иммунных процессов в развитии атеросклероза хотя и является общепринятой и основывается на довольно большом количестве клинических и экспериментальных данных, не отвечает на многие принципиальные вопросы. С ответами на эти вопросы связаны не только понимание фундаментальных вопросов развития атеросклероза, но и разработка профилактических и терапевтических подходов к лечению атеросклероза.
К важнейшим невыясненным вопросам относятся следующие:
1. Практически не изучен клеточный состав атеросклеротических бляшек на разных стадиях их развития. Использовавшиеся до настоящего времени для этой цели методы иммуногистохимического анализа имеют крайне скудную информацию, так как позволяют одновременно определить не более 2-х клеточных маркеров.
2. Очень мало сведений о наиболее важном моменте в развитии атеросклеротической бляшки - формировании некротического ядра. Не ясно, почему происходит гибель макрофагов в бляшке.
3. Не ясно, связана ли активация цитокинов и появление в крови малодифференцированных форм лимфоцитов с изменениями клеточного состава бляшек у тех же пациентов.
Целью исследования, проведенного авторами, является разработка экспериментальной модели атеросклеротической бляшки для изучения процесса ее формирования, в которой бляшка поддерживалась бы и созревала в лабораторных условиях вне организма. Такая система кардинально продвинет наше понимание механизмов атеросклероза. В настоящее время экспериментальная трехмерная модель для изучения атеросклероза отсутствует. Между тем в смежных областях медико-биологической науки, таких как онкология, иммунология, вирусология, именно разработка лабораторных экспериментальных моделей позволила применить современные методы молекулярной биологии к исследованию механизмов патогенеза. Напротив, в кардиологии современные исследования бляшек ограничены однократным анализом данной ткани, извлеченной из тела при хирургических вмешательствах или при аутопсии.
2
Известно исследование, в котором проводилось культивирование участков атеросклеротически не измененных почечных артерий человека [Voisard, R. HCMV-infection in a human arterial organ culture model: effects on cell proliferation and neointimal hyperplasia / Voisard, R., Krugers, Т., Reinhardt, B. et al. // BMC microbiology. - 2007. - Vol.7. - P.68-74]. В данном исследовании для получения материала использовались участки почечных артерий, полученные при операциях нефрэктомии. Участки почечных артерий помещались в питательную среду для транспортировки DMEM, содержащую HEPES, в которой они доставлялись в лабораторию. Среда для культивирования образцов почечных артерий приготавливалась с использованием среды для культур Ham F12 и Waymouth's MB 752/1, эмбриональной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием, раствора гентомицина, ванкомицина и амфотерицина В. Участки артерий для культивирования нарезались на крупные кольцевидные блоки перпендикулярно просвету сосуда толщиной 3-5 мм и культивировались в чашках Петри со средой описанного выше состава в течение 56 дней в инкубаторе с 5% CO при 37°С. Каждые два-три дня проводилась смена питательной среды для культивирования. На 3-й, 7-й, 14-й, 21-й, 28-й, 35-й и 56-й дни образцы тканей промывались в фосфатно-солевом буфере PBS и фиксировались в 4% параформальдегиде. Сохранение жизнеспособности тканей в процессе культивирования было подтверждено с помощью гистологии при иммуногистохимическом окрашивании с использованием антигена PCNA, определяющего пролиферирующие клетки. Недостатки способа: культивировались участки интактных, неизмененных артерий человека, имеющие четкую структуру и высокую устойчивость к процессам культивирования, а атеросклеротически измененные участки артерий человека обладают более выраженной гетерогенностью и значительно более низкой жизнеспособностью по сравнению с интактными артериями; при культивировании образцы помещались в среду для культивирования без дополнительных плотов, что значительно ухудшало бы аэрацию культивируемой ткани, и соответственно, уменьшало выживаемость гетерогенной ткани атеросклеротических бляшек; в составе среды отсутствовали заменимые аминокислоты, пируват натрия, использовались иные среды для культур, что недостаточно для культивирования атеросклеротических бляшек; изучение жизнеспособности культивируемых тканей проводилось значительно реже, чем каждые 3 дня, что могло внести погрешность в результаты эксперимента.
2
В ходе проведения исследования (кафедра кардиологии ФПДО МГМСУ им. А.И. Евдокимова по теме «Роль герпес-вирусов в формировании атеросклеротических бляшек») был взят за основу известный способ культивирования эксплантов лимфоидной ткани человека [Grivel J-C. Use of human tissue explants to study human infectious agents / Grivel J-C., Margolis L. // Nat Protoc. - 2009. - Vol.4. - P.256-269.]. Важно отметить, что на всех стадиях развития атеросклеротические бляшки содержат большое количество лимфоидных клеток. Более того, некоторые авторы считают, что на начальном этапе в области бляшки развивается подобие вторичных лимфоидных органов, схожих с лимфатическими узлами. В дальнейшем в интиме артерий происходит накопление липидов, моноциты и гладкомышечных клеток, которые способствуют развитию атеросклеротических бляшек. Способ культивирования эксплантов лимфоидной ткани человека заключается в том, что для получения эксплантов использовались участки миндалин, полученные при операциях тонзилэктомии не позднее, чем через 3-5 часов с момента операции; участки цервиковагинальной и ректосигмовидной ткани, полученные при операциях или при аутопсии пациентов не позднее, чем через 24 часа с момента операции или наступления смерти пациентов. Участки ткани помещались в питательную среду для транспортировки RPMI 1640, в которой они доставлялись в лабораторию без охлаждения и хранились при температуре 15-22°С вплоть до их обработки. В процессе подготовки к культивированию участки ткани экстрагировались с помощью хирургических стерильных скальпелей со съемными лезвиями и стерильных анатомических пинцетов в ламинарном шкафу. При обработке из образцов удалялись все участки ткани с макроскопическими признаками кровоизлияния и некроза ткани. Среда для культивирования лимфоидной ткани приготавливалась с использованием среды для культур RPMI 1640, эмбриональной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием, пирувата натрия, раствора тиментина, гентомицина и амфотерицина В и модифицированной среды Modified Eagle's, содержащей заменимые аминокислоты. Обработанные участки ткани нарезались на кубические блоки размерами 2 мм на 2 мм на 1 мм и культировались в среде описанного выше состава. Для этого блоки ткани помещались в чашки Петри с питательной средой для культивирования на плоты из коллагеновых губок Gelfoam на границе раздела воздух/среда. Ткань культивировались в инкубаторе с 5-7% CO при 37°С в течение 15 дней, каждые 3-4 дня проводилась смена питательной среды для культивирования. Выживаемость участков ткани оценивалась с помощью анализа скорости репликации вирусов, определяемой по концентрации вирусных компонентов и цитокинов в среде для культивирования каждые 3 дня. Размер культивируемых блоков тканей очень маленький, что не давало возможности оценивать структурные изменения в тканях с помощью гистологии. Этот способ выбран за прототип.
Однако в процессе проведения исследования было выявлено следующее: размер культивируемых блоков тканей очень маленький, что не давало возможности оценивать структурные изменения в образцах атеросклеротических бляшек с помощью гистологии; выживаемость ткани атеросклеротических бляшек не могла быть оценена по определению концентрации РНК находящихся в тканях вирусов и концентрации выделяемых клетками цитокинов в культивационной среде, так как ткань атеросклеротических бляшек гетерогенна и изначально содержит участки некроза; перед культивированием из образцов удалялись все участки ткани с макроскопическими признаками кровоизлияния и некроза. Культивировались только гомогенные участки ткани, а ткань атеросклеротических бляшек изначально является гетерогенным, сложно структурированным образованием, в ней содержатся некротические ядра и области кровоизлияний, удаление которых привело бы к полной деструктуризации образцов.
Задачей изобретения является культивирование эксплантов атеросклеротических бляшек.
Технический результат заключается в сохранении жизнеспособности эксплантов атеросклеротических бляшек при культивировании для дальнейшего изучения механизмов патогенеза атеросклероза.
Это достигается за счет того, что в качестве материала эксплантов используют участки сонных артерий, полученных при операциях по поводу стенозирующего атеросклероза сонных артерий, которые хранят в лаборатории в течение не более 2 часов после операции, после экстрагирования полученный материал отмывают в фосфатно-солевом буфере, после чего материал для культивирования нарезают на кольцевидные блоки толщиной 2-3 мм перпендикулярно просвету сосуда, затем 2 блока фиксируют в 2% параформальдегиде и заключают в парафин, а остальные блоки помещают в среду для культивирования, при этом ткань культивируют не менее 20-22 дней, каждые три дня образцы тканей фиксируют в 2% параформальдегиде, затем заключают в парафин, а в последний день культивирования оставшиеся образцы также фиксируют в 2% параформальдегиде, заключают в парафин и исследуют гистологически.
В качестве материала эксплантов используют участки сонных артерий, так как в организме человека описанные артерии являются наиболее доступными для получения развивающихся в них атеросклеротических бляшек. При этом бляшки в сонных артериях по строению максимально схожи с также интересующими нас бляшками, развивающимися в коронарных артериях.
Как показали проведенные исследования, для сохранения жизнеспособности эксплантов для культивирования образцы хранят в лаборатории в течение не более 2 часов после операции вплоть до обработки, так как клетки в атеросклеротических бляшках очень быстро подвергаются апоптозу и некрозу при неподходящих условиях внешней среды.
После экстрагирования полученный материал отмывают в фосфатно-солевом буфере для удаления мононуклеарных клеток периферической крови.
Материал для культивирования нарезают на кольцевидные блоки толщиной 2-3 мм, так как при проведении исследований было выявлено, что выживаемость тканей при культивировании эксплантов размерами 2×2×2 мм значительно снижается уже к 12 дню культивирования. В связи с этим для того, чтобы длительнее сохранялась жизнеспособность и архитектоника эксплантов в процессе культивирования, необходимо культивирование кольцевидных блоков толщиной 2-3 мм.
Материал для культивирования нарезают перпендикулярно просвету сосуда для того, чтобы сделать возможной гистологическую оценку всех слоев сосудистой стенки и атеросклеротической бляшки.
В параформальдегиде фиксируют 2 блока для того, чтобы минимизировать ошибку при расчетах площади некроза по гистологическим срезам, возникающую из-за гетерогенности исследуемых блоков атеросклеротических бляшек.
Блоки ткани фиксируют в 2% параформальдегиде, так как размеры эксплантов позволяют проводить быструю фиксацию менее концентрированным раствором формалина.
Блоки ткани заключают в парафин для дальнейшего проведения гистологического исследования.
Остальные блоки, помещенные в среду для культивирования, культивируют не менее 20-22 дней, так как более краткий срок культивирования не позволит изучить изменения, возникающие в эксплантах атеросклеротических бляшек, а также отсроченный эффект препаратов и вирусов на изменение структуры атеросклеротических бляшек.
Образцы тканей фиксируют в 2% параформальдегиде, затем заключают в парафин каждые три дня для того, чтобы четко отслеживать изменения структуры бляшек с течением культивирования.
В последний день культивирования оставшиеся образцы также фиксируют в 2% параформальдегиде, заключают в парафин и исследуют гистологически для оценки изменений, возникших в атеросклеротических бляшках в процессе культивирования.
Воспроизводимость методики мы оценивали с помощью гистологии. Для этого мы проводили окрашивание кольцевидных блоков с помощью гематоксилина и эозина, сканировали их с помощью сканера для гистологических срезов и оценивали морфологию участков с помощью программы для обработки фотографий микропрепаратов ImageScope S. Мы сравнивали площадь участков некроза в последовательных образцах культивируемых тканей на 1-й, 4-й, 7-й, 10-й, 13-й, 16-й, 19-й и 22-й дни. Также мы оценивали целостность эндотелиального слоя и внутренней эластической мембраны по сравнению с первым днем культивации. Участки некроза и апоптоза мы определяли по наличию признаков кариопикноза, кариорексиса и кариолизиса в клетках интимы, высокой ацидофильности цитоплазмы клеток, гомогенизации и базофильности коллагеновых и эластических волокон, а также по обнаружению формирующихся апоптотических телец с эозинофильной цитоплазмой.
Выживаемость ткани мы дополнительно оценивали по косвенным параметрам - по изменению концентрации находящихся в клетках культивируемых образцов вирусов, что определялось при проведении полимеразной цепной реакции с клетками, выделенными из культивируемых образцов на 1-й, 4-й, 7-й, 10-й, 13-й, 16-й, 19-й и 22-й дни.
Способ осуществляется следующим образом:
Для получения материала используют участки сонных артерий, полученные при операциях по поводу стенозирующего атеросклероза сонных артерий.
Участки сосудов с атеросклеротическими бляшками помещают в питательную среду для транспортировки (например, RPMI 1640), в которой их доставляют в лабораторию и хранят при комнатной температуре вплоть до их обработки в течение не более 2 часов после операции.
2
Затем участки артерий с атеросклеротическими бляшками экстрагируют с помощью хирургических стерильных одноразовых скальпелей, скальпелей со съемными лезвиями и стерильных анатомических пинцетов в ламинарном шкафу (например, ламинарном шкафу с вертикальным потоком Nuaire Labgard Nu-603); отмывают в фосфатно-солевом буфере (например, PBS), после чего материал для культивирования нарезают на кольцевидные блоки толщиной 2-3 мм перпендикулярно просвету сосуда, затем 2 блока фиксируют в 2% параформальдегиде и заключают в парафин, а остальные блоки помещают в среду для культивирования атеросклеротических бляшек, содержащую стандартную среду для культур (например, RPMI 1640), эмбриональную телячью сыворотку (например, FBS-heat inactivated), пируват натрия, раствор антибиотика/антимикотика (например, пенициллина, стрептомицина и амфотерицина B), и среду, содержащую заменимые аминокислоты (например, модифицированной среды Modified Eagle's), для этого блоки ткани помещают в чашки Петри с питательной средой описанного выше состава на плоты из коллагеновых губок на границе раздела среда/воздух; ткань культивируют в инкубаторе с 5% CO при 37°С в течение не менее 20-22 дней, каждые три дня образцы тканей фиксируют в 2% параформальдегиде, затем заключают в парафин. Также каждые 3-4 дня проводят смену питательной среды для культивирования. В последний день культивирования оставшиеся образцы также фиксируют в 2% параформальдегиде, заключают в парафин и исследуют гистологически.
Пример №1.
В качестве источника материала была взята атеросклеротическая бляшка, полученная при операции по поводу стенозирующего атеросклероза правой внутренней сонной артерии у пациентки 69 лет.
2
Макроскопически выделенный эксплант бляшки имел неосложненную форму, с участками кальциноза, размерами 32×5×7 мм, цилиндрической формы, его поместили в питательную среду для транспортировки RPMI1640, в которой доставили в лабораторию и хранили при комнатной температуре вплоть до обработки в течение 1 часа 40 минут после операции: экстрагировали с помощью хирургических стерильных одноразовых скальпелей, скальпелей со съемными лезвиями и стерильных анатомических пинцетов в ламинарном шкафу с вертикальным потоком Nuaire Labgard Nu-603; затем материал был промыт в фосфатно-солевом буфере и разделен на 14 кольцевидных блоков толщиной 2-3 мм перпендикулярно просвету сосуда, 2 блока были фиксированы в 2% парафармальдегиде и заключены в парафин для проведения гистологии, а остальные 12 блоков поместили на плоты из коллагеновых губкок в чашки Петри 18x18 мм на границе раздела среда/воздух с 2 мл среды для культивирования, содержащей стандартную среду для культур RPMI 1640, эмбриональную телячью сыворотку FBS-heat inactivated, пируват натрия, раствор антибиотика/антимикотика, содержащий пенициллин, стрептомицин и амфотерицин В, и среду, содержащую заменимые аминокислоты - модифицированная среда Modified Eagle's, ткань культивировали в инкубаторе с 5% CO при 37°С в течение 22 дней, каждые 3-4 дня проводилась смена среды, каждые три дня (включая 22-й день) образцы тканей фиксировали в 2% параформальдегиде, затем заключали в парафин. В последний день культивирования оставшиеся образцы также фиксируют в 2% параформальдегиде, заключали в парафин и исследовали гистологически.
Для осуществления контроля над жизнеспособностью клеток мы приготовили гистологические препараты и провели их окрашивание гематоксилином и эозином. Затем мы сканировали их с помощью сканера для гистологических срезов и оценили морфологию участков с помощью программы для обработки фотографий микропрепаратов ImageScope S. Мы показали, что площадь участков некроза в последовательных образцах культивируемых тканей на 1-й, 4-й, 7-й, 10-й, 13-й, 16-й, 19-й и 22-й дни статистически значимо не увеличивается. Также мы определили, что эндотелиальный слой и внутренняя эластическая мембрана сохраняют свою целостность по сравнению с первым днем культивации. Участки некроза и апоптоза мы определяли по наличию признаков кариопикноза, кариорексиса и кариолизиса в клетках интимы, высокой ацидофильности цитоплазмы клеток, гомогенизации и базофильности коллагеновых и эластических волокон, а также по обнаружению формирующихся апоптотических телец с эозинофильной цитоплазмой.
Выживаемость ткани мы дополнительно оценили по косвенным параметрам - по продолжающейся репликации находящихся в клетках культивируемых образцов герпес-вирусов. Это определялось при проведении полимеразной цепной реакции с клетками, выделенными из культивируемых образцов на 1-й, 4-й, 7-й, 10-й, 13-й, 16-й, 19-й и 22-й дни.