СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕТАНОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ
METHOD FOR CULTIVATION OF METHANE-OXIDISING BACTERIA

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологической отработке ферментационных процессов, протекающих на жидких питательных средах с использованием углеводородов, в две стадии: получения посевной культуры и получения целевого продукта - биомассы метанокисляющих бактерий.
Изобретение может быть использовано в пищевой, медицинской, аграрной отраслях народного хозяйства и в исследовательской практике, в том числе в целях последующего масштабирования экспериментально отработанных технологических процессов.
Бактерии-метанотрофы по физиологическим и биохимическим свойствам представляют собой уникальную группу микроорганизмов, потребляющих метан природного газа в качестве источника углерода, что делает потенциальным использование биомассы бактерий для производства кормового белка.
Известен сайт: «Способы культивирования микроорганизмов», на котором опубликованы способы культивирования микроорганизмов. Высокая эффективность способов достигается оптимизацией питательных сред или селекционным отбором продуктивных штаммов бактерий, что может быть использовано в качестве обзорных аналогов к предлагаемому изобретению.
Известна публикация «Особенности биологии метанотрофньгх бактерий» (https://studexpo.ru/928906/…biologii-metanotrofnyh bakteriy), в которой дана характеристика метанотрофов, обладающих различными структурными, физиолого-биохимическими и генетическими особенностями.
Приведенные в этой публикации свойства: морфологическая изменчивость, секреция вторичных метаболитов и др., возникающие в определенных условиях культивирования бактерий в ферментерах, приводящие к вспениванию бактериальной суспензии, осаждению биомассы бактерий на стенках рабочей полости ферментеров и, как следствие к ингибированию роста, автолизу биомассы, снижают производительность и технологическую устойчивость ферментационных процессов.
Наиболее близким аналогом является «Способ каскадно-проточного культивирования микроорганизмов», патент RU 2193594 С1.
Известный способ осуществляется с использованием цепи ферментеров, в первом из которых выращивают посевную культуру бактерий методом порционного замещения части рабочей суспензии свежей питательной средой. Далее, вытесняемые из первого ферментера порции рабочей суспензии в каскадном протоке перемещают через цепь ферментеров в условиях полного замещения рабочей суспензии. Управление каскадным протоком осуществляют заданием времени культивирования в ферментерах и временной паузы между циклами каскадного протока.
Целевое назначение известного способа - применение в научно-исследовательской практике с использованием малых объемов культуральной жидкости (КЖ), что позволяет экономно использовать компоненты питательной среды, повысить качество синтезируемых продуктов и управляемость исследуемых процессов.
Недостатком известного способа является низкая производительность, значительная металлоемкость и перенасыщенность ферментерами и устройствами управления установкой, используемой для реализации способа, что приводит к образованию высокой цены ферментационного оборудования и сужает сферу применения способа в народном хозяйстве.
Технический результат заявленного изобретения состоит в оптимизации технологии проведения непрерывных процессов, повышающей устойчивость управления, производительность и применимость способа в народном хозяйстве при последующем масштабировании экспериментально отработанных процессов с использованием установленных количеств питательных веществ и минеральных солей в питательной среде для конкретных бактерий.
Указанная цель достигается тем, что способ культивирования метанокисляющих бактерий, осуществляемый в условиях каскадно-проточного культивирования микроорганизмов в ферментерах на жидкой питательной среде, обогащенной кислородом воздуха, отличается тем, что культивирование осуществляют на питательной среде, дополнительно обогащенной метаном и источниками азота, фосфора и минеральных солей следующего состава: калий азотнокислый, магний сернокислый, кальций хлористый, натрий фосфорнокислый однозамещенный, раствор микроэлементов, железо сернокислое, цинк сернокислый, медь сернокислая, марганец хлористый, кобальт хлористый, никель хлористый, натрий молибденовокислый, ЭДТК, а культивирование бактерий проводят при регуляции рН (7,0-6,5 ед.) в бактериальной суспензии одновременно в двух ферментерах - «посевном», работу которого осуществляют в условиях «объемно - доливного» процесса, доведенного до экспоненциальной фазы роста бактерий, при соотношении сливаемого объема к остаточному объему бактериальной суспензии в диапазоне (1,5-2,5):1, и в «маточном» ферментере, процесс в котором проводят до стационарной фазы роста бактерий, с периодическим порционным внесением в «маточный» ферментер бактериальной суспензии из «посевного» ферментера, при этом управление каскадным протоком осуществляют по заданному числу циклов подкисления бактериальной суспензии водным раствором ортофосфорной кислоты.
На рисунке показана блок-схема установки, позволяющая реализовать способ культивирования метанокисляющих бактерий. Согласно схеме, установка содержит емкость (1) с питательной средой, «посевной» (2) ферментер, патрубок (3) слива бактериальной суспензии по заданному уровню, «маточный» (4) ферментер, приемную емкость (5).
Эксперименты проводили в ферментерах, обеспечивающих заданные параметры перемешивания рабочей суспензии, аэрации, регулирования температуры и транспорта метана в рабочую жидкость, осуществляемого через стенку трубчатой газопроницаемой мембраны.
Характеристика используемых ферментеров: Рабочий объем «посевного» ферментера: 4,0 л. Рабочий объем «маточного» ферментера: 30 л.
Расход аэрирующего воздуха, продуваемого через «посевной» ферментер: 6 л/мин.
Расход аэрирующего воздуха продуваемого через «маточный» ферментер: 30 л/мин.
2
Давление метана в трубчатых мембранах: 0,9 кг/см.
Рабочая температура бактериальной суспензии в ферментерах: 32°С.
Объем единичной дозы 3%-й ортофосфорной кислоты: 0,2 мл.
Объем бактериальной суспензии, остающийся в «посевном» ферментере после отлива в «маточный» ферментер: 1,5 л.
Объем питательной среды, подаваемый в «посевной» ферментер после отлива избыточного объема бактериальной суспензии из «посевного» ферментера в «маточный» ферментер: 2,5 л.
Объем питательной среды, подаваемый в «маточный» ферментер после слива бактериальной суспензии в приемную емкость: 20 л.
Соотношение сливаемого объема к остаточному объему бактериальной суспензии составляет (1,5-2,5):1, однако экспериментальным путем для данной культуры было установлено оптимальное соотношение 2:1.
Размножение бактерий контролировали измерением оптической плотности бактериальной суспензии в отбираемых пробах с помощью прибора «Денситометр den - 1b».
В качестве биологического продуцента использовали изолят метанотрофной бактерии Methylomonas albus.
Питательную среду стерилизовали острым паром при 1 атм с выдержкой 30 мин. Питательная среда после стерилизации имела рН (6,5 ед.).
Для получения посевной культуры в колбу с отростком внесли 200 мл дистиллированной воды, в которую из 3-х пробирок смыли культуру метанотрофной бактерии Methylomonas albus, инкубированной на агаризованной питательной среде в течение 8 суток с двумя продувками метаном.
Культивирование бактерии Methylomonas albus в «посевном» и «маточном» ферментерах проводили на питательной среде следующего состава в (г/л):
Калий азотнокислый - 1,2; магний сернокислый - 0,2; кальций хлористый - 0,02; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,0; калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,0; раствор микроэлементов - 1 мл/л. Раствор микроэлементов в (мг/л): железо сернокислое - 2,0; цинк сернокислый - 0,1; медь сернокислая - 0,1; марганец хлористый - 0,03; кобальт хлористый - 0,2; никель хлористый - 0,02; натрий молибденовокислый - 0,03; ЭДТК -5,0.
Использование нитратной формы азота в питательной среде в процессе размножения бактерий приводило к подщелачиванию бактериальной суспензии, которое ограничивали значением рН 7,0 ед., что позволило обеспечить оптимальные условия протекания ферментативных реакций в продуцирующей культуре и поддержание заданной концентрации фосфатов в бактериальной суспензии.
В процессе культивирования бактерий, каждый раз, при значении рН (7,0 ед.), в «посевной» (2) ферментер вносили 3% раствор ортофосфорной кислоты, воздействием которой подкисляли бактериальную суспензию до исходного значения рН (6,5 ед.), и вели подсчет циклов восстановления рН до очередного подкисления.
Управление сливами бактериальной суспензии из «посевного» (2) и «маточного» (4) ферментеров осуществляли заданием числа циклов подкисления бактериальной суспензии.
Примеры реализации способа:
Пример 1. Реализация первой стадии культивирования бактерии Methylomonas albus в «посевном» ферментере. На приборе управления задали:
- верхнее значение рН в бактериальной суспензии - 7,0 ед.;
- число циклов подкисления рН в бактериальной суспензии - 5 циклов.
(В данном случае, 5 циклов подкисления рН в бактериальной суспензии соответствовали «экспоненциальной» фазе роста бактерий с ОД = 3 ед. оптической плотности).
Перед началом эксперимента, из емкости (1), в «посевной» (2) ферментер, внесли 4,0 л питательной среды, состава в (г/л):
Калий азотнокислый - 1,2; магний сернокислый - 0,2; кальций хлористый - 0,02; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1,0; калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,0; раствор микроэлементов - 1 мл/л. Раствор микроэлементов в (мг/л): железо сернокислое - 2,0; цинк сернокислый - 0,1; медь сернокислая - 0,1; марганец хлористый - 0,03; кобальт хлористый - 0,2; никель хлористый - 0,02; натрий молибденовокислый - 0,03; ЭДТК - 5,0.
2
Питательную среду в «посевном» (2) ферментере засеяли культурой метанокисляющих бактерий и культивировали при температуре 32°С, при расходе аэрирующего воздуха 6 л/мин и давлении метана в трубчатой мембране 0,9 кг/см.
Процесс культивирования бактерий сопровождался подщелачиванием бактериальной суспензии до рН (7,0 ед.), при достижении значения которого в «посевной» ферментер (2), вносили 0,2 мл 3%-й ортофосфорной кислоты, воздействием которой бактериальную суспензию подкисляли до рН (6,5 ед.), и вели подсчет циклов подкисления рН в бактериальной суспензии.
Через каждые 5 циклов подкисления рН в бактериальной суспензии из «посевного» (2) ферментера через патрубок (3, в емкость (5) сливали 2,5 л бактериальной суспензии, а в «посевной» (2) ферментер из емкости (1) вносили 2,5 л питательной среды. Культивирование в указанных условиях проводили в течение 45 суток. В результате проведенного эксперимента выявлена общая устойчивость работы «посевного» (2) ферментера в условиях продолжительного «отьемно-доливного» процесса, высокая асептическая надежность процесса и эффективность управления по расходу ортофосфорной кислоты.
Пример 2. Реализация второй стадии культивирования бактерии Methylomonas albus в «посевном» и «маточном» ферментерах. На приборе управления задали:
- верхнее значение рН в бактериальной суспензии - 7 ед.;
- число циклов подкисления рН в бактериальной суспензии - 12 циклов.
(В данном случае, 12 циклов подкисления рН в бактериальной суспензии соответствовали «стационарной» фазе роста бактерий с ОД = 8 ед. оптической плотности).
Перед началом эксперимента сливной патрубок (3) «посевного» (2) ферментера, посредством трубопровода, соединили с «маточным» (4) ферментером.
Из емкости (1), в «маточный» (4) ферментер, внесли 20 л питательной среды того же состава, что и в примере 1.
Культивирование бактерии Methylomonas albus проводили одновременно в «посевном» и «маточном» ферментерах.
2
При каждом значении ОД = 3,0 ед. оптической плотности из «посевного» (2) ферментера, через патрубок (3), в «маточный» (4) ферментер, сливали 2,5 л бактериальной суспензии, и вели процесс культивирования бактерий в «маточном» (4) ферментере до стационарной фазы роста бактерий при температуре 32°С; расходе аэрирующего воздуха 30 л/мин; давлении метана в трубчатой мембране 0,9 кг/см, а в «посевном» (2) ферментере восстанавливали рабочий объем бактериальной суспензии внесением 2,5 л питательной среды из емкости (1) и продолжали процесс культивирования бактерий в «посевном» (2) ферментере до прохождения следующих 5 циклов дозирования 3%-й ортофосфорной кислоты в бактериальную суспензию.
Стационарная фаза роста бактерий в «маточном» (4) ферментере определялась прохождением 12 циклов подкисления рН в бактериальной суспензии, с контрольным измерением оптической плотности в отбираемых пробах, после чего производили полный слив бактериальной суспензии из «маточного» (4) ферментера в емкость (5). Слитую бактериальную суспензию передавали на стадию концентрирования и сушки биомассы, а в «маточный» (4) ферментер, из емкости (1), вносили очередные 20 л питательной среды и продолжали процесс культивирования бактерий до следующего слива.
Технический результат изобретения достигается в совмещении процесса получения активной посевной культуры метанокисляющих бактерий с процессом получения целевого продукта - биомассы бактерий, что позволяет существенно сократить время культивирования бактерий до стационарной фазы роста в «маточном» (4) ферментере и расширить сферу применения способа до внедрения в производство. Предлагаемый способ позволяет создать устойчивую, непрерывно работающую систему культивирования микроорганизмов за счет селективной минимизации вторичных метаболитов - побочных продуктов при культивировании в экспоненциальной фазе роста бактерий в «посевном» ферментере, а также повысить производительность совмещенного процесса за счет увеличения числа клеток в бактериальной суспензии, доведенной до стационарной фазы роста в «маточном» ферментере.
Поддержание рН (7,0-6,5 ед.) воздействием 3%-го раствора ортофосфорной кислоты обеспечило оптимальные условия протекания ферментативных реакций, управление концентрацией фосфатов в бактериальной суспензии, и исключило вспенивание бактериальной суспензии, обычно приводящее к осаждению биомассы бактерий на трубчатой мембране и рабочей поверхности ферментеров.
Процесс в «маточном» (4) ферментере осуществляют в условиях периодических добавок активной посевной культуры, снятой с экспоненциальной фазы роста «посевного» (2) ферментера, что интенсифицирует ферментативные реакции, протекающие в бактериальной суспензии, и, как следствие, повышает производительность маточного ферментера.
Приведенные в вышеописанных примерах значения содержания питательных веществ и минеральных солей являются оптимальными для данной культуры и обеспечивают ее нормальное развитие при отсутствии голодания в процессе культивирования и предотвращение попадания в готовый продукт количеств этих веществ и минеральных солей, превышающих допустимые.
Предложенный способ применим ко всем видам микроорганизмов, растущих в ферментерах на жидких питательных средах, по которым способ согласно изобретению обеспечивает экспериментальное установление оптимальных количеств питательных веществ и минеральных солей по каждой культуре, ориентируясь на приведенные в этих примерах величины.