ЗОНД СО СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ К НЕСКОЛЬКИМ ЦЕЛЕВЫМ ОБЛАСТЯМ, СОСТОЯЩИЙ ИЗ ТРЕХ ЧАСТЕЙ

1. Зонд на основе нуклеиновой кислоты, содержащий первую последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты; вторую последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты; и линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, соединяющую первую и вторую последовательности нуклеиновой кислоты; где указанный линкер разделяет две первые и вторые последовательности, таким образом, что температура плавления первой последовательности, отожженной с первой целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, и второй последовательности, отожженной со второй целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, различаются.
2. Зонд по п. 1, где указанный линкер содержит полидезоксирибонуклеотид.
3. Зонд по п. 1 или 2, где указанный линкер содержит полидезоксиинозин или состоит из него.
4. Зонд по п. 1, где указанный линкер имеет длину до 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 нуклеотидов.
5. Зонд по п. 1, где по меньшей мере одна из первой и второй последовательностей нуклеиновой кислоты представляет собой репортерную область, содержащую меченую часть; предпочтительно, флуоресцентную метку.
6. Зонд по п. 1, где указанный зонд не содержит фрагмент гасителя флуоресценции.
7. Зонд по п. 5, где указанная репортерная область имеет длину предпочтительно 15-200 нуклеотидов, более предпочтительно 15-150, еще более предпочтительно 15-100 или 20-100, 30-80, 40-60, или примерно 50 нуклеотидов.
8. Зонд по п. 5, где указанная репортерная область разработана таким образом, чтобы иметь первую Tm в отношении полностью комплементарной целевой последовательности и измененную, предпочтительно более низкую, Tm в отношении вариантой целевой последовательности.
9. Зонд по п. 1, дополнительно содержащий блокирующую область, которая блокирует удлинение цепи нуклеиновой кислоты ДНК-полимеразой.
10. Зонд по п. 1, где как первая, так и вторая последовательности нуклеиновой кислоты представляют собой репортерные области.
11. Зонд по п. 10, где обе репортерные области выбраны так, чтобы иметь сходные значения Tm в случае связывания с целевой последовательностью дикого типа, и пониженные значения Tm в случае связывания с мутантной целевой последовательностью; предпочтительно, пониженная Tm для первой репортерной области отличается от таковой для второй репортерной области.
12. Зонд по п. 1, где вторая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой репортерную область, а первая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой якорную область, где температура плавления указанной якорной области, отожженной с первой целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, выше, чем таковая для второй последовательности, отожженной со второй целевой последовательностью нуклеиновой кислоты.
13. Зонд по п. 12, где Tm дуплекса «якорная область:целевая последовательность» значительно выше (по меньшей мере на 0,5, 1, 1,5, но более обычно до 5-20 градусов Цельсия выше), чем Tm репортерной области в отношении целевой последовательности.
14. Зонд по п. 12, где указанная якорная область имеет длину по меньшей мере 50 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150 нуклеотидов.
15. Зонд по п. 12, где указанная якорная область имеет длину не более 200 нуклеотидов.
16. Зонд по п. 12, где указанная репортерная область содержит последовательности тандемных повторов.
17. Зонд по п. 12, где указанная якорная область содержит последовательности тандемных повторов и уникальные последовательности.
18. Зонд по п. 1, где указанные первая и вторая целевые последовательности нуклеиновой кислоты присутствуют в геноме M tuberculosis.
19. Зонд по п. 1, где указанные первая и вторая целевые последовательности нуклеиновой кислоты присутствуют в геноме поксвируса осповакцины.
20. Зонд по п. 1, где указанные первая и вторая целевые последовательности находятся в пределах 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 нуклеотидов друг от друга в геномной последовательности.
21. Зонд на основе нуклеиновой кислоты, содержащий первую якорную последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты; вторую репортерную последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты; и линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, соединяющую указанные первую и вторую последовательности нуклеиновой кислоты; где указанный линкер разделяет первую и вторую последовательности так, что температуры плавления первой и второй последовательностей, гибридизованных с соответствующими им целевыми последовательностями, различаются, и где температура плавления якорной последовательности, отожженной с первой целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, выше, чем таковая для репортерной последовательности, отожженной со второй целевой последовательностью нуклеиновой кислоты; и где каждая репортерная последовательность содержит по меньшей мере одну детектируемую метку.
22. Зонд на основе нуклеиновой кислоты, содержащий первую репортерную последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты; вторую репортерную последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты; и линкерную последовательность нуклеиновой кислоты, соединяющую указанные первую и вторую последовательности нуклеиновой кислоты; где температура плавления первой репортерной последовательности, отожженной с первой целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, является сходной с или равной таковой для второй репортерной последовательности, отожженной со второй целевой последовательностью нуклеиновой кислоты; и где каждая репортерная последовательность содержит по меньшей мере одну детектируемую метку.
23. Зонд на основе нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1, 21 и 22, дополнительно содержащий одну или более других линкерных последовательностей и одну или более других последовательностей нуклеиновой кислоты для гибридизации с одной или более другими целевыми последовательностями.
24. Способ обнаружения одного или более полиморфизмов в целевой последовательности нуклеиновой кислоты, включающий:
получение зонда по любому из пп. 1-23;
приведение зонда в контакт с тестовой последовательностью нуклеиновой кислоты, где указанная тестовая последовательность содержит первую целевую последовательность нуклеиновой кислоты и вторую целевую последовательность нуклеиновой кислоты;
создание возможности для гибридизации первой последовательности нуклеиновой кислоты зонда с первой целевой последовательностью нуклеиновой кислоты; и гибридизации второй последовательности нуклеиновой кислоты зонда со второй целевой последовательностью нуклеиновой кислоты; и
определение Tm первой последовательности зонда, гибридизованной с первой целевой последовательностью; и определение Tm второй последовательности зонда, гибридизованной со второй целевой последовательностью;
где Tm указывает на присутствие последовательности дикого типа или вариантной последовательности.
25. Способ обнаружения тандемных повторов в целевой последовательности нуклеиновой кислоты, включающий:
получение зонда по любому из пп. 12-17, содержащего репортерную последовательность, содержащую ряд тандемных повторяющихся единиц;
приведение указанного зонда в контакт с тестовой последовательностью нуклеиновой кислоты, при этом тестовая последовательность содержит первую целевую последовательность нуклеиновой кислоты и вторую целевую последовательность нуклеиновой кислоты, причем первая целевая последовательность комплементарна якорной последовательности зонда, а вторая целевая последовательность содержит ряд тандемных повторов, комплементарных тандемным повторяющимся единицам репортерной последовательности;
создание возможности для гибридизации якорной последовательности нуклеиновой кислоты зонда с первой целевой последовательностью нуклеиновой кислоты; и гибридизации второй последовательности нуклеиновой кислоты зонда со второй целевой последовательностью нуклеиновой кислоты; и
обнаружение связывания или не связывания репортерной последовательности с тестовой последовательностью нуклеиновой кислоты.
26. Способ обнаружения одного или более полиморфизмов в целевой последовательности нуклеиновой кислоты, включающий:
получение зонда по любому из пп. 1-23;
приведение указанного зонда в контакт с тестовой последовательностью нуклеиновой кислоты, где указанная тестовая последовательность содержит первую целевую последовательность нуклеиновой кислоты и вторую целевую последовательность нуклеиновой кислоты;
создание возможности для гибридизации первой последовательности нуклеиновой кислоты зонда с первой целевой последовательностью нуклеиновой кислоты; и гибридизации второй последовательности нуклеиновой кислоты зонда со второй целевой последовательностью нуклеиновой кислоты; и
определение Tm первой последовательности зонда, гибридизованной с первой целевой последовательностью; и определение Tm второй последовательности зонда, гибридизованной со второй целевой последовательностью;
сравнение определенной Tm первой последовательности зонда с ожидаемой Tm первой последовательности зонда;
нормирование определенной Tm второй последовательности зонда на основании разницы между определенной и ожидаемой Tm первой последовательности зонда;
где нормированная Tm второй последовательности зонда указывает на присутствие последовательности дикого типа или вариантной последовательности.
27. Способ по п. 24 или 26, отличающийся тем, что указанная вариантная последовательность содержит делецию, повтор, ОНП или вставку.