Влияние аналогов эстрогенов на перекисное окисление липидов в головном мозге и печени

УДК: 577.334.17

О. В. Галкина, Н. Д. Ещенко, Ф. Е. Путилина, В. А. Вилкова, Л. И. Захарова

ВЛИЯНИЕ АНАЛОГОВ ЭСТРОГЕНОВ НА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ И ПЕЧЕНИ

Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра биохимии биолого-почвенного факультета

Введение. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) является одним из важнейшим факторов в развитии многих заболеваний и патологических состояний организма. Интенсификация ПОЛ обнаруживается при различного рода токсикозах, травматизме, ишемии, стрессе, старении и др. Особое внимание исследователей привлекает изучение ПОЛ при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезни Паркинсона и Альцгеймера [4, 6]. В большинстве случаев течение болезней осложняется интенсификацией ПОЛ в организме. Причиной повышения продукции активных форм кислорода (АКФ) и, как следствие, — активации ПОЛ чаще всего служит нарушение равновесия между про-и антиоксидантной системами из-за истощения последней. Несмотря на существование целого ряда эндогенных и огромного количества экзогенных антиоксидантов, продолжается поиск, выделение и синтез все новых и новых веществ, обладающих антиокси-дантными свойствами.

В настоящее время активно изучается участие гормонов в регуляции свободнорадикальных процессов (СРО). При исследовании механизма действия стероидных гормонов установлено, что некоторые эффекты проявляются через несколько минут или даже секунд после их введения, в то время как классическое гормональное действие обнаруживается спустя часы или даже дни. Эти быстрые эффекты стероидов часто называют негеномными, в отличие от геномных эффектов, которые чувствительны к ингибиторам синтеза белка [12]. К числу таких быстрых негеномных эффектов, возможно, относится и способность этих гормонов регулировать интенсивность СРО. Установлено, что большинство гормонов проявляют антиоксидантные эффекты. Например, способность регулировать СРО продемонстрирована для тиреоидных гормонов [3, 11], для катехоламинов [1] и др. К числу гормонов-антиоксидантов можно также отнести и стероидные гормоны (кортикостероиды, половые стероиды). Так, в наших предыдущих исследованиях установлено, что однократное введение гидрокортизона крысам снижает интенсивность ПОЛ в головном мозге; напротив, блокада гипофизарно-адренокортикальной системы приводила к активации этого процесса [2]. Другими исследователями обнаружено замедление продукции супероксидного аниона гранулоцитами человека при действии in vitro целого ряда стероидов [8].

В последнее время широкое распространение получило применение в клинике различных производных и аналогов стероидных гормонов, как обладающих, так и не обладающих гормональной активностью. Такие препараты используются в качестве противовоспалительных средств, ингибиторов роста опухолей, контрацептивов и т. д. Однако

© О. В. Галкина, Н. Д. Ещенко, Ф. Е. Путилина, В. А. Вилкова, Л. И. Захарова, 2009

Г о

compound 2

-І

estradiol

Строение эстрадиола и его синтетических аналогов

не всегда учитывается все свойства данных препаратов, в том числе и их роль в интенсификации или подавлении СРО.

Цель данной работы — исследование возможных антиоксидантных свойств двух производных эстрогенов, синтезированных на кафедре химии природных соединений химического факультета СПбГУ под руководством профессора А. Г. Шаввы.

Постановка опытов и методы исследования. Опыты ставили на крысах самцах линии Wistar массой 200-220 г. Животные были разделены на три группы: контрольные (1-я группа), получавшие препарат N° 1 (2-я группа) или препарат N° 2 (3-я группа). Оба эти синтетические соединения являются производными стероидов, а именно D-гомо-б-окса-8aэстра — аналогами эстрогенов. Препарат № 1: 17aP-ацeтoкси-7P-мeтил-3мeтoкси-D-гoмo-6-oкса-8a-эстра-1,3,5(10)-триeн. Препарат № 2: диацeтил-7a,18-димeтил-6-oксаэстра-1,3,5(10),8(9)-тетраен-3,17Р-диол. На рисунке приведены структурные формулы этих синтетических соединений и для сравнения формула эстрадиола. Можно заметить, что препарат № 2 более сходен по структуре с эстрадиолом.

Синтетические препараты вводили крысам однократно per os в дозе 5 мг на 1 кг массы тела в объеме 0,3 мл оливкового масла. Контрольные животные получали 0,3 мл чистого оливкового масла. Животных забивали через 2 ч после введения препаратов. Эксперименты проводились с соблюдением всех правил по гуманному обращению с животными, утвержденных ВОЗ.

Для оценки СРО в тканях головного мозга и печени исследовали интенсивность перекисного окисления липидов по следующим показателям: содержанию начальных продуктов ПОЛ — диеновые (ДК) и триеновые (ТК) конъюгаты, конечных продуктов — малоновый диальдегид (МДА), основания Шиффа (ОШ), а также по уровню окисленности липидов — индекс Клейна и антирадикальную активность исследуемых синтетических аналогов эстрогенов. Кроме того, определяли общее содержание липидов и фосфолипидов. Все методические приемы, использованные в работе, описаны в пособии [5].

Результаты и обсуждение. В работе исследовали влияние двух синтетических аналогов эстрадиола на перекисное окисление липидов в головном мозге и печени крыс. Предварительные исследования показали, что препарат № 1 оказывает гипохолестерине -мический эффект и не обладает утерогенной активностью [7].

Главным отличием обоих исследованных препаратов от эстрадиола является наличие атома кислорода в кольце В в положении 6. Это значительно меняет электронную плотность в кольце А [10], что должно привести к изменению биологических свойств соединений, использованных в данной работе. Поэтому можно ожидать у таких аналогов наличия выраженной антиоксидантной активности. Это предположение послужило основанием для исследования интенсивности ПОЛ при действии препаратов № 1 и 2.

Результаты проведенных исследований представлены в табл.1. Установлено, что оба исследуемых синтетических аналога эстрагенов обладают антиоксидантным эффектом в головном мозге, причем действие препарата № 2 более выражено, чем действие препарата № 1. В мозге крыс, получавших препарат № 2, была меньше степень окисленности общих липидов (величина коэффициента Клейна) и снижено содержание начальных продуктов ПОЛ (ДК и ТК) по сравнению с контролем. Кроме того, на 25 % уменьшался уровень малонового диальдегида. Напротив, после введения препарата № 1 изменений в степени окисленнности липидов и в количестве малонового диальдегида не обнаружено.

Таблица 1

Результаты исследования действия препаратов 1 и 2 на перекисное окисление липидов

в мозге и печени крыс

Условия опыта Основания Шиффа, у. е./мг ФЛ Диеновые конъюгаты, нмоль/мг ФЛ Триеновые конъюгаты, у. е./мг ФЛ Коэффициент Клейна Малоновый диальдегид нмоль/мг белка

Головной мозг

Контроль 129 ± 10 12,2 ± 0,7 0,209 ± 0,022 0,70 ± 0,01 1,65 ± 0,14

Препарат 1 96 ± 6 Р < 0,05 9,5 ± 1,0 Р < 0,05 0,152 ± 0,022 Р < 0,05 0,71 ± 0,05 Р > 0,05 1,80 ± 0,18 Р > 0,05

Препарат 2 136 ± 25 Р > 0,05 8,9 ± 0,8 Р < 0,05 0,142 ± 0,013 Р < 0,05 0,63 ± 0,01 Р < 0,05 1,38 ± 0,04 Р < 0,05

Печень

Контроль 381 ± 36 28,6 ± 3,0 0,833 ± 0,031 1,04 ± 0,04 1,16 ± 0,12

Препарат 1 345 ± 27 Р > 0,05 27,2 ± 1,5 Р > 0,05 0,853 ± 0,054 Р > 0,05 1,04 ± 0,04 Р > 0,05 0,98 ± 0,09 Р > 0,05

Препарат 2 342 ± 28 Р > 0,05 25,4 ± 1,4 Р > 0,05 0,848 ± 0,63 Р > 0,05 1,07 ± 0,05 Р > 0,05 1,22 ± 0,08 Р > 0,05

Как известно, эстрагены, в том числе и эстрадиол, обладают некоторым нейропротек-торными и нейротрофическими свойствами. Ряд авторов считают, что нейропротекторный эффект эстрадиола является следствием его антиоксидантной активности, которая связана с наличием гидроксильной группы в положении 3 ароматического кольца А. Метилирование в этом положении снижает антиоксидантную активность эстрогенов. Возможно, что несколько менее выраженный антиоксидантный эффект препарата N° 1 связан именно с наличием метильного остатка у гидроксигруппы. Было показано [13, 14], что при достаточно

высоких микромолярных концентрациях эстрадиола кольцо А может являться эффективным донором электронов или скавенджером свободных радикалов. Чтобы проверить, могут ли исследованные нами препараты быть ловушкой для радикалов, мы провели определение антирадикальной активности этих соединений в модельной системе in vitro с использованием в качестве стабильного радикала а,адифенил-Р-пикрил-гидрозила (ДФПГ). Полученные данные представлены в табл. 2. Для сравнения в таблице представлены также результаты определения антирадикальной активности гидрокортизона и йодированных производных тиронина (тироксин и его изомеры). Видно, что оба исследованных нами препарата, как и гидрокортизон в концентрации 10-7 М, выраженной антирадикальной активностью не обладали, в отличие от йодированных тиронинов. Учитывая то, что при повышении концентрации гидрокортизона в пробе на два порядка (до 10-5 М), удалось зарегистрировать слабую антирадикальную активность, авторы попытались поступить подобным образом и с исследуемыми аналогами эстрогенов. Однако даже в концентрации 10-3 М антирадикального эффекта не было. Другими словами, использованные нами синтетические аналоги эстрагенов, по-видимому, не могут выполнять функцию ловушки свободных радикалов.

Таблица 2

Сравнение антирадикальной активности синтетических аналогов эстрагенов, йодированных тиронинов и гидрокортизона

Исследованные препараты Концентрация 10-5 М Концентрация 10-7 М

Препарат № 1 Нет эффекта Нет эффекта

Препарат № 2 « «

D-тироксин Зб % 5,3 %

L-тироксин 37 % б,б %

DL-тироксин 8,9 % Нет эффекта

Гидрокортизон 7,2 % «

Примечание. Результаты выражены в процентах от активности классического антиоксиданта — ио-нола, антирадикальная активность которого принималась за 100 %.

Антирадикальная активность эстрадиола и его аналогов зависит от различных заместителей и наличия боковых цепей, а также от растворимости препаратов в липидной фазе мембраны. Полярные группировки могут иметь значение для ориентации молекулы стероида в мембране. Известно, что введение метильной группы в положение 4 или 7в может привести к значительному снижению сродства синтезированных стероидов к рецептору, поскольку связывание таких аналогов требует сильной деформации кольца В [7, 9].

Полученные нами результаты показывают, что использованные в работе синтетические аналоги эстрогенов в данных условиях эксперимента не оказывали влияния на ПОЛ в печени в отличие от головного мозга (см. табл.1). Для объяснения этого факта можно сделать два предположения. Во-первых, печень может быть менее чувствительна, чем головной мозг к действию этих соединений, в частности, из-за различия в плотности специфических рецепторов эстрогенов. Во-вторых, возможно, что за 2 ч, которые проходят с момента введения препаратов per os, нарушенный баланс в системе свободнорадикального окисления в этом органе успевает нормализоваться. Оба предположения требуют более детального исследования.

Приносим глубокую благодарность профессору кафедры химии природных соединений химического факультета СПбГУ А. Г. Шавве и сотрудникам кафедры за любезно предоставленные препараты.

Литература

1. Барабой В. А. Спонтанная хемилюминисценция сыворотки крови как биологический тест // Хе-милюминесцентный метод в биологии и медицине. Киев., 1978. С. 64-66.

2. Галкина О. В., Вилкова В. А., Ещенко Н. Д., Захарова Л. И., Путилина Ф. Е. Влияние гидрокортизона на интенсивность перекисного окисления липидов головного мозга крыс// Нейрохимия. 2000. Т. 17. № 1. С. 32-35.

3. Галкина О. В., Путилина Ф. Е., Ещенко Н. Д., Белова Н. Е., Давыдова Д. С. Участие некоторых гормонов в регуляции свободно-радикального окисления // Известия высших учебных заведений. СевероКавказский регион. Сер. Естественные науки. Спец. выпуск. 2005. С. 25-27

4. Ещенко Н. Д. Биохимия психических и нервных болезней. СПб., 2004.

5. Практикум по свободнорадикальному окислению // Под ред. Н. Д. Ещенко, М. Н. Масловой. СПб., 2006.

6. Путилина Ф. Е., Галкина О. В., Ещенко Н. Д. Свободнорадикальное окисление. СПб., 2008.

7. Шавва А. Г., Морозкина С. Н., Ищенко И. В., Елисеев И. И., Селиванов С. И., Абусалимов Ш. Н., Селиванов С. С., Каменева И. Ю., Ещенко Н. Д. Синтез и биологические свойства 6-оксо-Б-гомо-8а-аналогов стероидных эстрогенов // Биоорганич. химия. 2007. Т. 35. № 3.С. 310-314.

8. BekescG., Kakucs R., Varbiro S., Racz K., Sprintz D., Feher J., Szekacs B. In vitro effects of different steroid hormones on superoxide anione production of human neurotrophic granulocytes // Steroids. 1996.Vol.65. P. 889-894.

9. Belov V. N., Dudkin V. Yu., UrusovaE. A., Starova G. L., Selivanov S. I., Nikolaev S. V., Eshchenko N. D., Morozkina S. N., Shavva A. G. Synthesis, structure and biological properties of some 8a analogues estrogens with fluorine in position 2 // Rus. J. Bioorganic Chem. 2007. Vol. 33. P. 293-301.

10. CaoL.,LiL. J. G. Total synthesis of 3-hydroxy-6-oxaestra-1,3,5(10)-trien-17-one // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1996. Vol. 1. P 841-844.

11. Guerrero A. R., Pamplona R., Portero-Otin M. Effect of thyroid status on lipid composition and peroxidation in the mouse liver // Free Rad. Biol. Med. 1999. Vol. 26. P. 73-80.

12. Losel L., Wehling M. Nongenomic action of steroid hormones // Nature Rev. Mol. Cell. Diol. 2003. Vol. 4. P. 46-55.

13. Picazo O., Azcoitia J., Garcia-Segura L. M. Neuroprotective and neurotoxic effects of estro-genes // Brain Res. 2003. Vol. 990. Iss. 1-2. N 14. P 20-27.

14. Wise P. M., Dubae D. B., Wilson M. E., Rose A. Neuroprotective effects of estrogen. New Insights mechanisms of action // Endocrinol. 2001. Vol. 142. N 3. P. 969-973.