СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ
METHOD OF CRYOPRESERVATION OF HEMATOPOIETIC STEM CELLS OF UMBILICAL BLOOD

Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови относится к области медицины, в частности к трансфузиологии.
+
-
+
Клеточные технологии на основе применения стволовых клеток развиваются во всем мире достаточно интенсивно. Медицинские центры различных стран все чаще используют аутологичные и аллогенные гемопоэтические и мезенхимальные стволовые клетки в практическом здравоохранении. Пуповинная кровь является одним из четырех основных источников получения стволовых клеток. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови развивается наиболее быстрыми темпами. Только в одном американском Регистре (National Marrow Donor Program) на 2008 г. хранится 50000 образцов стволовых клеток, полученных из пуповинной крови. Медицинские научные центры специально изучают и исследуют возможности оптимальной транспортировки и криоконсервации клеток, полученных из пуповинной крови. Теоретически с момента замораживания стволовые клетки и клетки-предшественники находятся в жидком азоте при температуре -196°С и могут оставаться в этом состоянии достаточно долго. После 15 лет хранения размороженные гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) восстанавливались в среднем на 84%. Сохранность функциональности этих размороженных клеток - предшественников доказывается пролиферативной способностью гемопоэтических стволовых клеток. Клетки CD34CD38, изолированные из размороженных единиц пуповинной крови, после 15 летней заморозки способны к более чем 250 - кратному размножению и более того, приживление происходит с такой же частотой, как клетки CD34 из свежевыделенной пуповинной крови. Итак, установлено, что гемопоэтические стволовые клетки, полученные из пуповинной крови, приживаются при трансплантации у людей-реципиентов.
В технологии консервирования гемопоэтических стволовых клеток известны способы их криоконсервирования, например, см. п. РФ №2233589, A01N 1/02, дата публикации патента 10.08.2004 г. «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток человека», который включает добавление в суспензию клеток криопротектора диметилсульфоксид (ДМСО), трехэтапное замораживание суспензии с последующим оттаиванием. На первом этапе осуществляют замораживание до температур (-8,5)-(-10,5)°С со скоростью 0,7-1,2°С с применением сидинга (кристаллизации) при температурах (-3,5)-(-4)°С с концентрацией криопротектора 0,4-1,45 моль/л; на втором этапе охлаждают до температур (-30)-(-40)°С со скоростью 1,0-4,5°С; после второго этапа осуществляют температурную остановку при температурах (-30)-(-40)°С в течение 3-5 минут, а на третьем этапе охлаждают со скоростью 10-12°С/мин до (-130)-(196)°С. Подбор значений температур и скоростей охлаждений подобраны эмпирическим лабораторным путем. Гемопоэтические стволовые клетки получены из разных материалов: кордовой крови, эмбриональной печени, периферической крови, костного мозга.
Недостатками такого решения способа криоконсервирования ГСК являются: способ не технологичен, проведен в лаборатории на стадии эксперимента, т.к. пробирки из-за малого объема годятся только для лабораторных исследований, концентрация криопротектора - ДМСО через проценты составляет 3,12-11,3%, согласно современным источникам наиболее эффективная концентрация раствора ДМСО для обеспечения жизнеспособности стволовых клеток составляет 10%, поэтому 3,12 слишком мало, а диапазон концентраций слишком неопределенный, одного криопротектора - ДМСО недостаточно, он токсичен, кроме того, используется нестерильный раствор ДМСО, его надо разводить, но для клинического использования нельзя увеличивать из-за контаминации, градации и скорости охлаждения неэффективны, недостаточная стерилизация, т.к. на этапах замораживания вносится дополнительный лед для кристаллизации (сидинг), не указан как получена клеточная взвесь и что она собой представляет, разброс температур (-130)-(-196)°С в конечной точке охлаждения увеличивает время заморозки.
Наиболее близким техническим решением осуществления криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток, полученных из пуповинной крови, является способ, указанный в статье авторов: Абдулкадыров К.М., Романенко НА., Старков Н.Н., Сельцер А.В. «Заготовка и хранение пуповинной крови». Материал научно-практической конференции, Санкт-Петербург 2000 г., http.www.gemabank.ru/pub/n1/html/. Способ криоконсервации ГСК пуповинной крови заключается в следующем. Клеточную взвесь ядросодержащих стволовых клеток получали путем седиментации эритроцитов пуповинной крови с использованием желатина с последующим отмыванием. Потом клеточную взвесь разливали по пробиркам для криоконсервирования по 1,5 мл в каждую и охлаждали до температуры +4°С. Приготавливали ограждающий раствор - криопротектор 10% ДМСО и охлаждали в ледяной бане до температуры +4°С. Замораживание проводили в аппарате замораживания по 3-х этапной программе. На первом этапе клеточную взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками и с криопротектором охлаждали с температуры +4°С до -20°С со скоростью 1°С/мин; на втором этапе - снижение температур с -20°С до -40°С со скоростью 2°С/мин. И на третьем этапе осуществляли снижение температур с -40°С до -80°С со скоростью 4°С/мин с последующим погружением пробирок с клеточной взвесью в жидкий азот (t=-196°C).
Недостатками такого способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови являются: способ для промышленного производства неотработан, нетехнологичен, пробирками можно пользоваться только при лабораторных исследованиях, отнимает много времени сам технологический процесс в подготовке к замораживанию, получение ядросодержащих клеток получено лабораторным путем, на данное время от желатина в качестве седиментирующего средства отказались, в программе глубокого криогенного замораживания отсутствует обход точки кристаллизации, что увеличивает жизнеспособность стволовых клеток, использование в качестве криопротектора раствора RPM1 в крупносерийном производстве при получении гемопоэтических стволовых клеток и при криогенном их замораживании неэффективно.
Техническим результатом предложенного решения является: повышение технологичности криоконсервирования с использованием современного промышленного оборудования, повышение стерильности гемопоэтических стволовых клеток в процессе замораживания, повышения сохранности и, следовательно, жизнеспособности ГСК.
Этот результат достигается тем, что в способе криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, включающем добавление ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксид в концентрацию взвеси ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками, подготовку к замораживанию, включающую охлаждение взвеси со стволовыми клетками в камере охлаждения до температуры +4°С и многоэтапное замораживание взвеси со стволовыми клетками, при этом в качестве криопротектора используют раствор 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40, который вносят во взвесь лейкоцитарного концентрата со стволовыми клетками, размещенными в криопакете, механически перемешивают в аппарате для перемешивания и добавления криоконсерванта Coolmix AS-210 при температуре +4°С, выпускают воздух из криопакета и часть концентрата взвеси, закрывают пакет, запаивают и помещают его в термоусадочный пакет и осуществляют программное многоэтапное замораживание, на первом этапе которого смесь концентрата взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания выдерживают 10' при температуре +4°С, затем охлаждают со скоростью 1°С/мин до температуры -12°С, далее охлаждают со скоростью -15°С/мин до температуры -60°С, после оттаивания образца со скоростью 15°С/мин до температуры -18°С, охлаждают образец со скоростью 1°С/мин до -60°С и в конце программы замораживания образец охлаждают со скоростью -3°С до температуры -100°С, после окончания программы замораживания образец, помещенный в криокоробку, размещают в карантинный дьюар с жидким азотом до определения результатов тестов на наличие или отсутствие инфекционных агентов и бактериологической и грибковой контаминации, по истечении карантинного срока хранения образец с гемопоэтическими стволовыми клетками, полученными из пуповинной крови, переносят на длительное хранение при температуре не менее
-150°С в дьюар с жидким азотом при условии отрицательных результатов тестирования, в случае положительных результатов тестов на инфекции, бактериальную и/или грибковую контаминацию образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносят в дьюар для инфекционного материала длительного хранения.
Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.
Существенными признаками предложенного способа, совпадающими с известными признаками, являются: А - добавление ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксид в концентрацию взвеси ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками; Б - подготовка к замораживанию, включающая охлаждение взвеси со стволовыми клетками в камере охлаждения до температуры +4°С; В - многоэтапное замораживание взвеси со стволовыми клетками.
Существенными отличительными признаками способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови являются: Г - в качестве криопротектора используют раствор 55% диметилсульфоксида с 5% декстран 40, который вносят во взвесь лейкоцитарного концентрата со стволовыми клетками, размещенными в криопакете; Д - смесь в криопакете механически перемешивают в аппарате для перемешивания и добавления криоконсерванта Coolmix AS-210 при температуре +4°С, выпускают воздух из криопакета и часть концентрата взвеси, закрывают пакет, запаивают и помещают его в термоусадочный пакет; Е - осуществляют программное замораживание, на первом этапе которого смесь концентрата взвеси со стволовыми клетками и криопротектором - образец замораживания выдерживают 10' при температуре +4°С, затем охлаждают со скоростью 1°С/мин до температуры -12°С, далее охлаждают со скоростью -15°С/мин до температуры -60°С, после оттаивания образца со скоростью 15°С/мин до температуры -18°С, охлажадают образец со скоростью 1°С/мин до температуры -100°С; Ж - после окончания программы замораживания образец, помещенный в криокоробку, размещают в карантинный дьюар с жидким азотом до определения результатов тестов на наличие или отсутствие инфекционных агентов и бактериологической и грибковой контаминации; И - по истечении карантинного срока хранения образец с гемопоэтическими стволовыми клетками, полученными из пуповинной крови, переносят на длительное хранение при температуре не менее -150°С в дьюар с жидким азотом при условии отрицательных результатов тестирования, в случае положительных результатов тестов на инфекции, бактериальную и/или грибковую контаминацию образец с гемопоэтическими стволовыми клетками переносят в дьюар для инфекционного материала длительного хранения.
Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови заключается в следующем. Перед замораживанием проводят подготовку клеточной взвеси, являющейся лейкоцитарным концентратом (ядросодержащими клетками) с гемопоэтическими стволовыми клетками пуповинной крови, полученными в результате сепарации по схеме Sepax S100 (Швейцария) с использованием седементирующего средства гидроксиэтилкрахмала (ГЭК). Для сохранения максимального количества ГСК при замораживании в фазе кристаллизации используют протектор, обладающий ограждающей способностью, диметилсульфоксид. Для уменьшения токсичности этого раствора в него добавляют раствор декстран 40. В качестве криопротектора взят раствор 55% демитилсульфоксида с 5% декстран 40, которые вводят в клеточную взвесь с гемопоэтическими стволовыми клетками, механически перемешивают в аппарате для перемешивания CoolMix AS-210 (Швейцария) и охлаждают его до температуры +4°С. По окончании перемешивания из криопакета с содержимым выпускают воздух и часть клеточной взвеси, закрывают его и запаивают в нескольких местах трубку, идущую к нему, через 1 см, создавая спутники.
Криопакет с клеточной взвесью, стволовыми клетками и криопротектором маркируют индивидуальным штрих-кодом с указанной концентрацией содержимого, условием хранения, состава криопротектора, даты криозамораживания и названия банка, осуществляющего и сохраняющего стволовые клетки.
Затем криопакет с содержимым упаковывают в специальный термоусадочный пакет - «CryoFlex», (Nunc, Дания), помещают его с криопакетом в кассету для программного замораживания и размещают в программный замораживатель - Planer Kryo 560-16 («Planer Plc.», Великобритания). Замораживание осуществляют по специальной схеме для работы с программным замораживателем Planer Kryo 560-16. Стартовую температуру в замораживателе устанавливают равной +4°С и удерживают в течение 10 минут. На первом этапе замораживания лейкоцитарный концентрат со стволовыми клетками и криопротекторами, называемый образцом, охлаждают до температуры -12°С со скоростью 1°С/мин. На втором этапе охлаждения образец охлаждают до -60°С со скоростью -15°С/мин. В этот период происходит выброс латентного тепла, что приводит к кратковременному повышению температуры - процесс оттаивания, до температуры -18°С со скоростью 15°С/мин. Это дает возможность обойти точку кристаллизации для увеличения жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток, как в процессе замораживания, так и после их размораживания (окончательного оттаивания). На третьем этапе после оттаивания образец охлаждается со скоростью 1°С/мин до температуры -60°С и в конце процесса замораживания на 4-м этапе образец охлаждается со скоростью -3°С/мин до температуры охлаждения -100°С. Данные по процедуре замораживания регистрируют в протоколе программного замораживания образца со стволовыми клетками. После замораживания в программном замораживателе криопакет с образцом помещают в криокоробку и размещают последнюю в карантинный дьюар с жидким азотом до определения результатов тестов на наличие или отсутствие инфекционных агентов, бактериологической и грибковой контаминации. По истечении карантинного срока хранения образец со стволовыми клетками помещают на длительное хранение в дьюар с жидким азотом при температуре не менее -150°С при условии отрицательных результатов тестирования; в случае положительных результатов тестов на инфекции и бактериальную и/или грибковую контаминацию образец со стволовыми клетками переносят в специальный дьюар для инфекционного материала длительного хранения.
Результаты всех исследований, характеризующие образец, заготовленной клеточной взвеси с гемопоэтическими стволовыми клетками пуповинной крови, а также все действия, осуществляемые с образцом, т.е. изъятие образца, изменение локализации образца, вносят в базу данных предприятия «ООО Покровский Банк Стволовых клеток» под единым идентификационным номером образца, а также в базу данных Freezer Work.
Использование технического решения «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови» по сравнению с прототипом позволяет повысить стерильность гемопоэтических стволовых клеток при замораживании, повысить сохранность стволовых клеток и их жизнеспособность при криоконсервировании благодаря тому, что в качестве криопротектора используют раствор 55% ДМСО с 5% декстран 40, что позволяет снизить токсичность ограждающего раствора, внесенные во взвесь лейкоцитарного концентрата с гемопоэтическими стволовыми клетками с тщательным механическим перемешиванием, а также благодаря тому, что в многоэтапном замораживании осуществляют термическую ступеньку - оттаивание, что позволяет обойти точку кристаллизации образца замораживания. При получении лейкоцитарного концентрата со стволовыми клетками использование седементирующего средства гидроксиэтилкрахмала (заменителя крови) позволяет более качественно отделить лейкоциты от эритроцитов и плазмы. Использование современного лицензионного технического промышленного оборудования иностранного производства: США, Швейцарии, Великобритании, Японии, Германии, Швеции, Дании и т.д. позволяет повысить технологичность процесса криоконсервирования, затратить меньше времени, повысить в конечном итоге получение более качественного конечного продукта. Например, аппарат для перемешивания и добавления криоконсерванта - Coolmix AS-210 (Швейцария) позволяет равномерно охлаждать стволовые клетки в процессе добавления криопротектора с одновременным осуществлением постоянного перемешивания лейкоцитарного концентрата со стволовыми клетками в криопакете при постоянной температуре и капельном добавлении ограждающего раствора смеси ДМСО с декстраном 40. Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови был многократно осуществлен (более 400 раз) на активно развивающемся предприятии «ООО Покровский банк стволовых клеток» и показал качественные результаты.