Изготовление и хранение липосомальных РНК-составов, подходящих для терапии

1. Способ получения липосомного коллоида, включающий инжектирование липидного раствора в этаноле в водную фазу с получением липосомного коллоида, где концентрация по меньшей мере одного из липидов в липидном растворе соответствует равновесной растворимости по меньшей мере одного липида в этаноле или превышает ее.
2. Способ по п. 1, где липидный раствор представляет собой раствор смеси двух или более различных липидов.
3. Способ по п. 1 или 2, где концентрация одного липида в липидном растворе соответствует равновесной растворимости липида в этаноле при комнатной температуре или превышает ее.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где общая концентрация липидов в липидном растворе составляет от около 180 мМ до около 600 мМ, от около 300 мМ до около 600 мМ или около 330 мМ.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где липидный раствор содержит по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
6. Способ по п. 5, где концентрация дополнительного липида в липидном растворе соответствует равновесной растворимости дополнительного липида в этаноле при комнатной температуре или превышает ее.
7. Способ по п. 5 или 6, где по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP).
8. Способ по любому из пп. 5-7, где по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
9. Способ по любому из пп. 5-8, где по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
10. Способ по любому из пп. 5-9, где молярное соотношение по меньшей мере одного катионного липида и по меньшей мере одного дополнительного липида составляет от около 10:0 до около 1:9, от около 4:1 до около 1:2, от около 3:1 до около 1:1 или около 2:1.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где липидный раствор содержит DOTMA и DOPE в молярном соотношении от около 10:0 до около 1:9, от около 4:1 до около 1:2, от около 3:1 до 1:1 или около 2:1.
12. Способ по любому из пп. 8-11, где концентрация DOPE в липидном растворе составляет по меньшей мере около 60 мМ или по меньшей мере около 90 мМ.
13. Способ по любому из пп. 1-12, где липидный раствор инжектируется в водную фазу со скоростью перемешивания водной фазы от около 50 оборотов в минуту до около 150 оборотов в минуту.
14. Способ по любому из пп. 1-13, где водная фаза представляет собой воду.
15. Способ по любому из пп. 1-14, где способ дополнительно включает перемешивание липосомного коллоида.
16. Способ по любому из пп. 1-15, где липосомный коллоид перемешивается в течение от около 15 минут до около 60 минут или в течение около 30 минут.
17. Способ получения липосомного коллоида, включающий инжектирование липидного раствора, содержащего DOTMA и DOPE в молярном соотношении около 2:1 в этаноле, в воду, перемешиваемую при скорости перемешивания около 150 оборотов в минуту для получения липосомного коллоида, причем концентрация DOTMA и DOPE в липидном растворе составляет около 330 мМ.
18. Липосомный коллоид, получаемый способом по любому из пп. 1-17.
19. Липосомный коллоид по п. 18, где липосомы имеют средний диаметр по меньшей мере около 250 нм.
20. Липосомный коллоид по п. 18 или 19, где липосомы имеют средний диаметр, который находится в диапазоне от около 250 нм до около 800 нм.
21. Липосомный коллоид по любому из пп. 18-20, где липосомы представляют собой катионные липосомы.
22. Липосомный коллоид по любому из пп. 18-21, где липосомы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
23. Липосомный коллоид по п. 22, где по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP).
24. Липосомный коллоид по п. 22 или 23, где по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
25. Липосомный коллоид по любому из пп. 22-24, где по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
26. Липосомный коллоид по любому из пп. 22-25, где молярное соотношение по меньшей мере одного катионного липида и по меньшей мере одного дополнительного липида составляет от около 10:0 до 1:9, от около 4:1 до около 1:2, от около 3:1 до около 1:1 или около 2:1.
27. Липосомный коллоид по любому из пп. 18-26, где липосомы содержат DOTMA и DOPE в молярном соотношении от около 10:0 до около 1:9, от около 4:1 до около 1:2, от от около 3:1 до 1:1 или около 2:1.
28. Способ получения РНК-липоплексных частиц, включающий добавление липосомного коллоида по любому из пп. 18-27 к раствору, содержащему РНК.
29. Способ непрерывного поточного изготовления РНК-липоплексных частиц, включающий смешивание раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы, в контролируемых условиях смешивания РНК и катионных липосом.
30. Способ по п. 29, в котором раствор, содержащий катионные липосомы, представляет собой липосомный коллоид по любому из пп. 18-27.
31. Способ по п. 29 или 30, в котором раствор, содержащий РНК, и раствор, содержащий катионные липосомы, являются водными растворами.
32. Способ по любому из пп. 29-31, в котором применяется скорость потока, которая позволяет смешивать раствор, содержащий РНК, и раствор, содержащий катионные липосомы.
33. Способ по любому из предыдущих пунктов 29-32, в котором поток характеризуется числом Рейнольдса более 300 или от около 500 до около 2100.
34. Способ по любому из пп. 29-33, в котором контролируемые условия смешивания включают контроль за соотношением компонентов при смешивании раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы.
35. Способ по любому из пп. 29-34, в котором контролируемые условия смешивания включают контроль относительных объемов раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы, которые должны быть смешаны.
36. Способ по любому из пп. 29-35, в котором соотношение компонентов при смешивании РНК и катионных липосом контролируется путем использования идентичных смешиваемых объемов (об./об.) раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего катионные липосомы, и коректировка концентраций РНК и катионных липосом в соответствующих растворах.
37. Способ по любому из пп. 29-36, в котором контролируемые условия смешивания выбраны для поддержания характеристик РНК-липоплексных частиц, избегая при этом закупоривания.
38. Способ по любому из пп. 29-37, где способ включает использование смесительного элемента Y-типа или Т-типа.
39. Способ по любому из пп. 29-38, в котором смесительный элемент Y-типа или Т-типа имеет диаметр от около 1,2 мм до около 50 мм.
40. Способ по любому из пп. 29-39, где способ включает использование шприцевого насоса, в котором два шприца, причем один содержит раствор, содержащий катионные липосомы, и другой содержит раствор, содержащий РНК, вставлены параллельно в один и тот же насос.
41. Способ по любому из пп. 29-40, где способ включает использование герметичного сосуда, мембранного насоса, шестеренного насоса, насоса с магнитной левитацией или перистальтического насоса в сочетании с датчиками скорости потока, необязательно с петлей обратной связи для контроля в режиме онлайн и регулирования скорости потока в реальном времени.
42. Способ по любому из пп. 29-41, в котором смесь раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего липосомы, содержит хлорид натрия в концентрации от около 45 мМ до около 300 мМ или имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от около 45 мМ до около 300 мМ.
43. Способ по любому из пп. 29-42, в котором смесь раствора, содержащего РНК, и раствора, содержащего липосомы, имеет ионную силу, составляющую по меньшей мере около 50 мМ.
-1
-1
44. Способ по любому из пп. 28-43, в котором в паттерне рассеяния рентгеновских лучей РНК-липоплексы характеризуются одним брегговским пиком при около 1 нм, причем ширина пика составляет менее чем 0,2 нм.
45. Способ по любому из пп. 28-44, в котором РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, который находится в диапазоне от около 200 до около 800 нм, от около 250 до около 700 нм, от около 400 до около 600 нм, от около 300 нм до около 500 нм или от около 350 нм до около 400 нм.
46. Способ получения замороженной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, включающий (i) получение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, и (ii) замораживание композиции.
47. Способ по п. 46, в котором замораживание происходит при температуре от около -15°С до около -40°С или при температуре около -30°С.
48. Способ по п. 47, в котором стабилизатор представляет собой углевод, выбранный из моносахарида, дисахарида, трисахарида, сахарного спирта, олигосахарида или его соответствующего сахарного спирта и полиспирта с линейной цепью.
49. Способ по любому из пп. 46-48, в котором получение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, включает получение водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, и добавление стабилизатора к водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы.
50. Способ по любому из пп. 46-49, в котором добавление стабилизатора к водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, уменьшает ионную силу водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы.
51. Способ по любому из пп. 46-50, в котором концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы и стабилизатор, выше, чем значение, требуемое для физиологической осмоляльности.
52. Способ по любому из пп. 46-51, в котором концентрация стабилизатора в водной композиции, содержащей РНК-липоплексы и стабилизатор, является достаточной для поддержания качества РНК-липоплексных частиц и, в частности, чтобы избежать существенной потери активности РНК после хранения композиции при температуре от около -15°С до около -40°С в течение по меньшей мере одного месяца, в течение по меньшей мере 6 месяцев, в течение по меньшей мере 12 месяцев, в течение по меньшей мере 24 месяцев или в течение по меньшей мере 36 месяцев.
53. Способ по любому из пп. 46-52, в котором рН водной композиции, содержащей РНК-липоплексы и стабилизатор, ниже, чем обычный рН-оптимум для хранения РНК.
54. Способ по любому из пп. 46-53, в котором водная композиция, содержащая РНК-липоплексы и стабилизатор, содержит хлорид натрия в концентрации от около 10 мМ до около 50 мМ или имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации от около 10 мМ до около 50 мМ.
55. Способ по любому из пп. 46-54, в котором водная композиция, содержащая РНК-липоплексы и стабилизатор, имеет ионную силу, соответствующую хлориду натрия в концентрации около 20 мМ.
56. Способ по любому из пп. 46-55, в котором РНК-липоплексные частицы могут быть получены способом по любому из пп. 28-44.
57. Композиция, содержащая РНК-липоплексные частицы, которые получены способом по любому из пп. 28-45.
58. Композиция по п. 57, где РНК-липоплексные частицы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
59. Композиция по п. 57 или 58, где РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, причем соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет от около 1:2 до около 1,9:2 или около 1,3:2,0.
-1
-1
60. Композиция, содержащая РНК-липоплексные частицы, содержащие РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, и по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид, где соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет от около 1:2 до около 1,9:2 или около 1,3:2,0 и где РНК-липоплексные частицы характеризуются одним брегговским пиком при около 1 нм, причем ширина пика составляет менее чем 0,2 нм.
61. Композиция по любому из пп. 57-60, которая дополнительно содержит хлорид натрия в концентрации от около 10 мМ до около 300 мМ, от около 45 мМ до около 300 мМ, от около 10 мМ до около 50 мМ или от около 80 мМ до около 150 мМ.
62. Композиция по любому из пп. 57-61, где композиция дополнительно содержит буфер.
63. Композиция по любому из пп. 57-62, где композиция дополнительно содержит хелатирующий агент.
64. Композиция, содержащая РНК-липоплексные частицы, которая получена способом по любому из пп. 46-56.
65. Композиция по п. 64, где РНК-липоплексные частицы содержат по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид.
66. Композиция по п. 64 или 65, где РНК кодирует пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, причем соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет от около 1:2 до около 1,9:2 или около 1,3:2,0.
67. Композиция по любому из пп. 64-66, где композиция дополнительно содержит хлорид натрия в концентрации от около 10 мМ до около 50 мМ.
68. Композиция, содержащая РНК-липоплексные частицы, содержащие РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, по меньшей мере один катионный липид и по меньшей мере один дополнительный липид, где соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет от около 1:2 до около 1,9:2 или около 1,3:2,0, хлорид натрия в концентрации от 0 мМ до около 40 мМ и стабилизатор.
69. Композиция по любому из пп. 66-68, которая дополнительно содержит буфер.
70. Композиция по любому из пп. 64-69, где количество РНК в композиции составляет от около 0,01 мг/мл до около 1 мг/мл, от около 0,05 мг/мл до около 0,5 мг/мл или около 0,05 мг/мл.
71. Композиция по любому из пп. 67-70, где хлорид натрия имеет концентрацию от около 20 мМ до около 30 мМ.
72. Композиция по любому из пп. 67-71, где хлорид натрия имеет концентрацию около 20 мМ.
73. Композиция по любому из пп. 67-71, где хлорид натрия имеет концентрацию около 30 мМ.
74. Композиция по любому из пп. 64-73, где концентрация стабилизатора в композиции выше, чем значение, требуемое для физиологической осмоляльности.
75. Композиция по любому из пп. 64-74, где концентрация стабилизатора в композиции составляет от около 5 до около 35 массовых процентов по объему (% мас./об.) или от около 12,5 до около 25 массовых процентов по объему (% мас./об.).
76. Композиция по любому из пп. 64-75, где стабилизатор представляет собой углевод, выбранный из моносахарида, дисахарида, трисахарида, сахарного спирта, олигосахарида или его соответствующего сахарного спирта и полиспирта с линейной цепью.
77. Композиция по любому из пп. 64-76, где стабилизатор представляет собой сахарозу в концентрации от около 5 до около 25 массовых процентов по объему (% мас./об.).
78. Композиция по п. 77, где сахароза имеет концентрацию от около 15% (мас./об.) до около 25% (масс./об.).
79. Композиция по п. 77, где сахароза имеет концентрацию от около 20% (масс./об.) до около 25% (масс./об.).
80. Композиция по п. 77, где сахароза имеет концентрацию около 22% (мас./об.).
81. Композиция по п. 77, где сахароза имеет концентрацию около 20% (мас./об.).
82. Композиция по любому из пп. 64-81, где композиция имеет рН, который ниже, чем обычный рН-оптимум для хранения РНК.
83. Композиция по любому из пп. 64-82, где композиция имеет рН от около 5,7 до около 6,7, или около 6,2.
84. Композиция по любому из пп. 68-83, где буфер представляет собой 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновую кислоту (HEPES).
85. Композиция по п. 84, где HEPES имеет концентрацию от около 2,5 мМ до около 10 мМ, или около 7,5 мМ.
86. Композиция по любому из пп. 64-85, где композиция дополнительно содержит хелатирующий агент.
87. Композиция, содержащая РНК-липоплексные частицы, содержащие РНК, кодирующую пептид или белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп, в концентрации около 0,05 мг/мл, и DOTMA и DOPE в молярном соотношении около 2:1, где соотношение положительных зарядов и отрицательных зарядов в РНК-липоплексных частицах составляет около 1,3:2,0, хлорид натрия в концентрации около 20 мМ, сахарозу в концентрации около 22% (мас./об.), HEPES в концентрации около 7,5 мМ с рН около 6,2 и EDTA в концентрации около 2,5 мМ.
88. Композиция по любому из пп. 64-87, где композиция находится в жидком или замороженном состоянии.
89. Замороженная композиция по п. 88, где композиция является стабильной при температуре от около -15°С до около -40°С в течение по меньшей мере одного месяца.
90. Замороженная композиция по п. 88, где композиция является стабильной при температуре около -15°С в течение по меньшей мере одного месяца.
91. Замороженная композиция по п. 88, где композиция является стабильной при температуре около -15°С в течение по меньшей мере двух месяцев.
92. Замороженная композиция по п. 88, где композиция является стабильной при температуре около -20°С в течение по меньшей мере одного месяца.
93. Замороженная композиция по п. 88, где композиция является стабильной при температуре около -20°С в течение по меньшей мере двух месяцев.
94. Замороженная композиция по п. 88, где композиция является стабильной при температуре около -30°С в течение по меньшей мере одного месяца.
95. Замороженная композиция по п. 88, где композиция является стабильной при температуре около -30°С в течение по меньшей мере двух месяцев.
96. Водная композиция, содержащая РНК-липоплексные частицы, получаемые путем оттаивания замороженной композиции по любому из пп. 88-95 и при необходимости коректировки осмотического давления и ионной силы путем добавления водной жидкости.
97. Композиция по п. 96, где осмоляльность композиции составляет от около 200 мОсмол до около 450 мОсмол.
98. Композиция по п. 96 или 97, где композиция содержит хлорид натрия в концентрации от около 80 мМ до около 150 мМ.
99. Композиция по любому из пп. 64-98, где РНК-липоплексные частицы могут быть получены способом по любому из пп. 28-45.
-1
-1
100. Композиция по любому из пп. 64-99, где РНК-липоплексные частицы характеризуются одним брегговским пиком при около 1 нм, причем ширина пика составляет менее чем 0,2 нм.
101. Композиция по любому из пп. 57-100, где РНК-липоплексные частицы имеют средний диаметр, который находится в диапазоне от около 200 до около 800 нм, от около 250 до около 700 нм, от около 400 до около 600 нм, от около 300 нм до около 500 нм или от около 350 нм до около 400 нм.
102. Композиция по любому из пп. 58-63, 65-86 и 88-101, где по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и/или 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан (DOTAP).
103. Композиция по любому из пп. 58-63, 65-86 и 88-102, где по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(9Z-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE), холестерин (Chol) и/или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC).
104. Композиция по любому из пп. 58-63, 65-86 и 88-103, где по меньшей мере один катионный липид содержит 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний-пропан (DOTMA) и по меньшей мере один дополнительный липид содержит 1,2-ди-(92-октадеценоил)-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE).
105. Композиция по любому из пп. 58-63, 65-86 и 88-104, где молярное соотношение по меньшей мере одного катионного липида и по меньшей мере одного дополнительного липида составляет от около 10:0 до 1:9, от около 4:1 до около 1:2, от около 3:1 до около 1:1 или около 2:1.
106. Композиция по любому из пп. 58-63, 65-86 и 88-105, где РНК-липоплексные частицы содержат DOTMA и DOPE в молярном соотношении от около 10:0 до 1:9, от около 4:1 до 1:2, от около 3:1 до около 1:1 или около 2:1, причем соотношение зарядов для положительных зарядов в DOTMA и отрицательных зарядов в РНК составляет от около 1:2 до 1,9:2.
107. Композиция по любому из пп. 63, 86, и 88-106, где хелатирующий агент представляет собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).
108. Композиция по п. 107, где EDTA имеет концентрацию от около 0,25 мМ до около 5 мМ, или около 2,5 мМ.
109. Композиция по любому из пп. 57-108, дополнительно содержащая адъювант.
110. Композиция по любому из пп. 57-109, которая сформирована для системного введения.
111. Композиция по п. 110, где системное введение осуществляется путем внутривенного введения.
112. Композиция по любому из пп. 57-111 для терапевтического применения.
113. Способ получения водной композиции, содержащей РНК-липоплексные частицы, включающий оттаивание замороженной композиции по любому из пп. 88-112 и необязательно корректировка осмоляльности и ионной силы путем добавления водной жидкости.
114. Способ по п. 113, где водная жидкость добавляется для получения осмоляльности композиции от около 200 мОсмол до около 450 мОсмол.
115. Способ по п. 113 или 114, где водная жидкость добавляется для получения хлорида натрия в концентрации от около 80 мМ до около 150 мМ.