Формирование нисходящих градиентов pH внутри катионообменных карбоксильных колонок

УДК 543.544

ФОРМИРОВАНИЕ НИСХОДЯЩИХ ГРАДИЕНТОВ pH ВНУТРИ КАТИОНООБМЕННЫХ КАРБОКСИЛЬНЫХ КОЛОНОК

А.В. Иванов, М.С. Бакштейн, П.Н. Нестеренко

Показана возможность формирования нисходящих градиентов рН с использованием техники хроматофокусирования в колонках, заполненных карбоксильными катионооб-менниками. В качестве элюента, формирующего градиент рН, использован 1:20 раствор Полибуфера-96. Линейность профиля градиента рН в катионообменной системе достигается за счет варьирования ионной силы стартового раствора и элюента.

Хроматофокусирование - метод ионообменной хроматографии, использующий в качестве инструмента разделения градиент рН, формируемый в слое сорбента внутри колонки. Метод успешно применяют для разделения цвит-тер-ионных биологических макромолекул [1-3]. Предложен вариант хроматофокусирования переходных металлов, сочетающий принципы комплексообразовательной хроматографии с формированием нисходящего градиента рН внутри колонки, заполненной сорбентом с привитыми олигоэтиленаминами. В основе этого варианта лежит образование аминных комплексов ионов металлов (например, Cu2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Cd2+, Fe3+, Cr3+, Mn2+, Pb2+) при начальном значении рН 7,0-7,5 и их последующая диссоциация при линейном снижении рН до 3. Возможности метода продемонстрированы на примере концентрирования и разделения 4-5 ионов металлов из изученного ряда в вариантах хроматографии низкого давления и ВЭЖХ [4, 5]. Однако комплексообразование ионов металлов с олигоэтиленаминами является многоступенчатым процессом с медленной кинетикой [5], в связи с чем целесообразен переход к катионообменным карбоксильным сорбентам. В этом случае, вероятно, удастся расширить круг ионов металлов, разделяемых в условиях формирования нисходящего градиента рН, включив в него щелочноземельные металлы. Отметим, что ранее в хрома-тофокусировании нисходящие градиенты рН внутри кати-онообменных колонок не получали.

Экспериментальная часть

Реагенты. В качестве стартового буферного раствора использовали 0,010 М Трис [трис(гидроксиметил)амино-метан], приготовленный из сухого препарата квалификации «ч.д.а» фирмы «Serva» (Германия); в качестве элюента - 1:20 Полибуфер-96 (Polybuffer-96), приготовленный разбавлением препарата фирмы «Pharmacia» (Швеция). Кислотность растворов создавали добавлением конц. HCl, ионную силу - добавлением рассчитанного количества 2 М раствора NaCl.

Сорбент. Использовали катионообменник СМ-52 на основе микрогранулированной целлюлозы с карбоксиме-тильными группами (Whatman, Великобритания), рабочий интервал рН 3-10, ионообменная емкость 0,90-1,15 ммоль/г сухого сорбента, плотность упаковки - 0,18 г/мл.

Аппаратура. Работу проводили в хроматографической системе низкого давления, состоящей из насоса ХПЖ-1 (г. Дзержинск, Россия), стеклянной хроматографической ко-

лонки К9/30 (300x9 мм), заполненной катионообменным сорбентом СМ-52, проточной ячейки для измерения рН [6], цифрового рН-метра «НМ20Б» фирмы «ТОА-Е\ес1тотс8» (Япония) с комбинированным электродом GS-5211С и перистальтического насоса «Multiperpex 2115» («LKB-Bromma», Швеция) для удаления эффлюента из ячейки. Сигнал рН-метра контролировали с помощью самописца LKB (Швеция). Кислотность растворов контролировали на цифровом рН-метре «НМ20Б».

Методика эксперимента. Хроматографическую колонку уравновешивали стартовым буферным раствором до рН 7,5, что соответствует начальной точке градиента, затем пропускали буферный элюент при рН 3,0, непрерывно контролируя рН эффлюента. Объемная скорость подвижных фаз составила 0,85 мл/мин.

Обсуждение результатов

Выбор подвижных фаз основан на имеющихся у нас данных по нисходящим градиентам рН для анионообмен-ных сорбентов. При формировании нисходящих градиентов в области рН 7,5-3,0 внутри анионообменных колонок в качестве стартовых обычно используют растворы Трис или гистидина. Отметим, что для разделения переходных металлов предпочтительнее уравновешивать колонку раствором Трис, поскольку гистидин более склонен к связыванию ионов металлов в комплексы, что осложняет механизм разделения. Поскольку 10 мМ раствор Трис имеет рН ~10, то требуется подкислить его конц. HCl до рН 7,5. При этом часть молекул Трис (обозначенного как RNH2) протонируется, одновременно связывая противоион СГ

RNH2 + HCl О RNHj+Cl-.

В качестве буферного элюента, обеспечивающего плавное снижение рН в анионообменной колонке, в хро-матофокусировании традиционно применяют специально синтезированные Полибуфер-74 или Полибуфер -96, представляющие высокомолекулярные соединения с набором первичных и вторичных аминогрупп и карбоксильных групп [2].

Раствор Полибуфера-96 (1:20) имеет рН 8,0, поэтому для создания оптимальной кислотности элюента необходимо добавление конц. HCl до рН 3. Вероятно, исходно макромолекулы полиамфолитного Полибуфера находятся в свернутом состоянии, а при подкислении конц. HCl приобретают суммарный положительный заряд и в результате разворачиваются в линейную конформацию из-за

pH 9

0 100 200 300 400 500

V, мл

Влияние ионной силы стартового раствора и элюента на профиль нисходящего градиента рН в катионообменной системе. Колонка: 300x9мм, СМ-52; стартовый раствор: 10 мМ Трис-НС1, рН 7,5, I = 0,1 (1, 4), 0,01 (2), 0,025 (3); элюент: 1:20 Полибуфер-96, рН 3,0, I = 0 (1, 2), 0,025 (3), 0,1 (4), скорость расхода элюента 0,85 мл/мин

С х е м а 1

Процессы, происходящие с макромолекулой

nh2

COO-

nH2

COOH

НС1

-COOH

-COOH

взаимного отталкивания одноименно заряженных звеньев (схема 1). Поскольку ранее было показано, что присутствие сильного электролита (№С1) в подвижных фазах существенно влияет на профиль градиента рН, формируемого внутри анионообменной колонки, заполненной сорбентом с привитыми олигоэтиленаминами [7, 8], то в настоящей работе исследовали аналогичное влияние сильного электролита в катионообменной системе.

Увеличение концентрации сильного электролита в элю-енте приводит к подавлению дополнительного разворачивания макромолекул Полибуфера при рН, сильно отличающемся от изоэлектрической точки (ИЭТ) Полибуфера, вследствие экранирования электростатических взаимодействий и, напротив, к увеличению их разворачивания при значениях рН, близких к ИЭТ [9].

Формирование градиентов рН. Влияние различия в ионной силе подвижных фаз на профиль градиента рН. При уравновешивании катионообменной карбоксильной колонки 10 мМ раствором Трис-НС1 (рН 7,5,I = 0,1) возможна частичная сорбция протонированной формы Трис на депротонированных карбоксильных группах кати-онообменника (схема 2). После уравновешивания колонки до рН 7,5 меняли стартовый раствор на элюент - 1:20 По-либуфер-96 (рН 3,0, I ~ 0). На профиле градиента (рисунок, кривая 1) сначала наблюдали небольшое плато в области рН 7,5, а затем заметный подъем рН до 8,1-8,2, появление которого можно объяснить тем, что при уменьшении ионной силы раствора условные константы диссоциации карбоксильных групп сорбента уменьшаются, вследствие чего часть групп депротонируется. При этом происходит десорбция нейтральных молекул Трис, приводящая к значительному (до 0,7 ед.) повышению рН эффлюента (схема 2). Затем возможна сорбция положительно заряженных макромолекул Полибуфера-96, сопровождающаяся вытеснением Трис в подвижную фазу, что также способствует повышению рН на выходе из колонки; содержание макромолекул Полибуфера в подвижной фазе при прохождении через колонку снижается до тех пор, пока сорбент не будет насыщен ими. После насыщения карбоксильного катионообменника полиамфолитными макромолекулами рН эффлюента резко снижается от 8,2 до 4,5-4,7. Для разделения методом хроматофокусирова-ния полученный градиент не подходит из-за протяженного начального участка и последующего резкого снижения рН. В хроматофокусировании предпочтительнее получать линейные плавные градиенты рН, поэтому требуется сократить начальный участок, избежать подъема на нем, а участок снижения рН сделать более пологим, протяженным в единицах объема эффлюента.

Уменьшение ионной силы стартового раствора от 0,1 до 0,01 при сохранении остальных условий эксперимента привело к уменьшению подъема рН (до 7,8 по сравнению с 8,2) на начальном участке градиента (рисунок, кривая 2), однако основные особенности профиля сохранились, что также делает этот градиент непригодным для использования в анализе. На следующем этапе эксперимента исследовали влияние ионной силы элюента на профиль градиента рН. При ионной силе стартового раствора и элюента, равной 0,025, подъема на начальном участке градиента рН не наблюдали (рисунок, кривая 3). Это связано, по-видимому, с тем, что условные константы протонирования карбок-

4

NH+Cl

3

NH+Cl

С х е м а 2

Процессы на поверхности сорбента, приводящие к начальному увеличению рН эффлюента

сильных групп сорбента не изменяются и, соответственно, того, в присутствии сильного электролита макромолекулы

не происходит их допротонирования с вытеснением Полибуфера приобретают свернутую конформацию, что

Трис. Снижение рН (от 7,3 до 4,6) на профиле градиента также снижает их способность сорбироваться на карбок-

происходит более плавно, чем при отсутствии сильного сильных группах сорбента. В результате Полибуфер-96

электролита в элюенте, однако остается довольно протяжен- при прохождении через колонку практически полностью

н^1й начальный участок медленного снижения рН от 7,5 до остается в подвижной фазе. Протонирование катионооб-

7,3. Этот градиент также не удовлетворяет требованиям ус- менника протекает медленно, что хорошо согласуется с

пешного разделения методом хроматофокусирования, но, полученным градиентом.

несомненно, приближается к ним. Таким образом, впервые получены нисходящие гра-Необходимого эффекта удалось добиться при повы- диенты рН внутри катионообменных карбоксильных кошении ионной силы подвижных фаз до 0,1 (рисунок, лонок при использовании Полибуфера в качестве элюен-кривая 4). Протяженный начальный участок практически та. Наиболее плавный линейный градиент в такой катио-исчез, а участок градиента со снижением рН от 7,5 до нообменной системе может быть получен при достаточ-4,5 стал гораздо более плавным, протяженным в едини- но высокой (—0,1) концентрации электролита, одинаковой цах объема эффлюента. в стартовом растворе и элюенте. В дальнейшем плани-При высокой ионной силе элюента большая концент- руется исследовать возможность использования раство-рация ионов приводит к уменьшению сорбции Поли- ров слабых органических кислот в качестве элюентов в буфера за счет конкуренции в ионном обмене, кроме катионообменных системах.

Работа выполнена при финансовой поддержке ИНТАС, грант № 00-00782.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Sluyterman L.A. AE., Elgersma O. // J.Chromatogr. 1978. 150.

P. 17.

2. Хроматофокусирование Полибуфером на ПБИ (russian

translation). Stockholm-Uppsala, 1981.

3. Sluyterman L.A.AE., Kooistra C. // J.Chromatogr. 1989. 470.

P. 317.

4. Nesterenko P.N., Ivanov A. V. // Mendeleev Commun. 1994. №5.

P. 174.

5. Иванов А.В. Хроматофокусирование переходных металлов.

Дис ... канд. хим. наук. М., 1997.

6. Иванов А.В., Тессман А.Б. // Вестн. Моск. ун-та. Серия 2. Хи-

мия. 1999. 40. №4. С. 241.

7. Тессман А.Б., Иванов А.В., Вакштейн М.С., Нестерен-

ко П.Н. // ЖФХ. 2001. 75. №2. С. 342.

8. Иванов А.В., Тессман А.Б., Нестеренко П.Н. и др. // Вестн.

Моск. ун-та. Серия 2. Химия. 2001. 42. №2. С. 109.

9. Tanford C. Physical chemistry of macromolecules. N.Y., 1961.

Поступила в редакцию 31.01.02