Т-КЛЕТКИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ РЕКОМБИНАНТНЫЙ РЕЦЕПТОР, СООТВЕТСТВУЮЩИЕ ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ И СПОСОБЫ

1. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, содержащая модифицированный константный альфа локус Т-клеточного рецептора локус Т-клеточного рецептора (TRAC), где указанный модифицированный локус TRAC включает нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный TCR или часть такового, причем указанный рекомбинантный TCR или часть такового содержит: (i) альфа-цепь TCR (TCRα), содержащую вариабельный альфа (Vα) домен и костантный альфа (Cα) домен, и (ii) бета-цепь TCR (TCRβ), содержащую вариабельный бета (Vβ) домен и костантный бета (Cβ) домен, где последовательность нуклеиновой кислоты включает (а) последовательность трансгена, кодирующую TCRβ и домен Vα, и (b) открытую рамку считывания эндогенного локуса TRAC или частичную последовательность таковой, где открытая рамка считывания кодирует по меньшей мере часть домена Cα рекомбинантного TCR.
2. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, содержащая модифицированный константный альфа локус Т-клеточного рецептора (TRAC), где указанный модифицированный локус TRAC содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный TCR или часть такового, и где указанный рекомбинантный TCR или часть такового содержит: (i) TCR альфа (TCRα) цепь, содержащую вариабельный альфа (Vα) домен и константный альфа (Cα) домен, и (ii) бета-цепь TCR (TCRβ), содержащую вариабельный бета (Vβ) домен и константный бета (Cβ) домен, где последовательность нуклеиновой кислоты включает (а) последовательность трансгена, кодирующую TCRβ и домен Vα, и (b) открытую рамку считывания эндогенного локуса TRAC или частичную последовательность таковой, где открытая рамка считывания кодирует по меньшей мере часть домена Cα рекомбинантного TCR, где:
часть Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или частичной последовательностью таковой, а дополнительная часть Cα кодируется последовательностью трансгена, где указанная длина дополнительной части Cα меньше полной длины нативного Cα; а также
дополнительная часть области Cα и/или Cβ, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты (a), содержит одну или более модификаций по сравнению с нативной областью Cα и/или нативной областью Cβ, причем указанная одна или более модификаций вводят один или более остатков цистеина, способных образовывать один или более ненативных дисульфидных мостиков между альфа-цепью и бета-цепью, и/или где Cα и/или Cβ рекомбинантного TCR содержат один или более ненативных цистеинов.
3. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, содержащая модифицированный модифицированный константный альфа локус Т-клеточного рецептора (TRAC), где указанный модифицированный локус TRAC содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный TCR или часть такового, причем указанный рекомбинантный TCR или часть такового содержит: (i) TCR альфа (TCRα) цепь, содержащую вариабельный альфа (Vα) домен и константный альфа (Cα) домен, и (ii) бета-цепь TCR (TCRβ), содержащую вариабельный бета (Vβ) домен и константный бета (Cβ) домен, где последовательность нуклеиновой кислоты включает (а) последовательность трансгена, кодирующую TCRβ и домен Vα, и (b) открытую рамку считывания эндогенного локуса TRAC или его частичную последовательность, где открытая рамка считывания кодирует по меньшей мере часть домена Cα рекомбинантного TCR, и где последовательность трансгена включает один или более гетерологичных или регуляторных контролирующих элементов, содержащих гетерологичный промотор, функционально связанный для контроля экспрессии TCR при экспрессии из клетки, являющейся сконструированной Т-клеткой, в которую введен полинуклеотид.
4. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-3, где последовательность трансгена интегрирована посредством гомологически направленной репарации (HDR).
5. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-4, где модифицированный локус TRAC содержит слияние в рамке считывания (i) трансгенной последовательности и (ii) открытой рамки считывания эндогенного локуса TRAC или частичной последовательности таковой, где последовательность трансгена необязательно находится в рамке считывания с одним или несколькими экзонами открытой рамки считывания эндогенного локуса TRAC или частичной последовательности таковой.
6. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-5, где последовательность трансгена не содержит последовательность, кодирующую 3’ нетранслируемую область (3’ UTR) или интрон.
7. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1 и 3-6, где часть Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или частичной последовательностью таковой, а дополнительная часть Cα кодируется последовательностью трансгена, где указанная дополнительная часть Cα меньше полноразмерного нативного Cα.
8. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-7, где открытая рамка считывания или частичная последовательность таковой содержит по меньшей мере один интрон и по меньшей мере один экзон эндогенного локуса TRAC.
9. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 2, 7 и 8, в которой дополнительная часть Cα кодируется последовательностью нуклеотидов, включающей менее четырех экзонов, менее трех экзонов, менее двух экзонов, один экзон или менее одного полного экзона открытой рамки считывания локуса TRAC.
10. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 2 и 7-9, где дополнительная часть Cα кодируется последовательностью нуклеотидов, длина которой меньше 400, меньше 300, меньше 250, меньше 200 или меньше 150 пар оснований.
11. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 2 и 7-10, где дополнительная часть Cα кодируется частью экзона 1 локуса TRAC, причем длина части экзона 1 открытой рамки считывания локуса TRAC меньше полной длины экзона 1 открытой рамки считывания локуса TRAC.
12. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-11, где последовательность трансгена интегрирована ниже по течению крайнего 5'-нуклеотида экзона 1 и выше по течению крайнего 3'-нуклеотида экзона 1 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRAC.
13. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-2, где по меньшей мере часть Cα кодируется по меньшей мере частью экзона 1 и экзонами 2-4 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRAC.
14. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-13, где кодируемая цепь TCRα способна димеризоваться с цепью TCRβ.
15. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-14, где кодируемая Cα содержит любую последовательность, выбранную из списка: SEQ ID NO: 14, 15, 19 и 24, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательностей с любой из списка: SEQ ID NOS: 14, 15, 19 и 24 или с частичной последовательностью таковых.
16. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-14, где кодируемая Cα содержит любую последовательность, выбранную из списка: SEQ ID NO: 19, 24 и 243-252, или последовательность, имеющую, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности с любой последовательности из списка: SEQ ID NOS: 19, 24 и 243-252 или с частичной последовательностью таковых.
17. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 2 и 7-16, где по меньшей мере часть Cα, начиная с остатка 3 и до остатка 3155, кодируется последовательностью нуклеотидов, указанной в SEQ ID NO. :1 или одним или несколькими экзонами таковой или последовательностью, имеющей по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности, начиная с остатка 3 и до остатка 3155, с последовательностью нуклеотидов, указанной в SEQ ID NO: 1, или с одним или несколькими экзонами таковой, или с частичной последовательностью таковой.
18. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 2 и 7-17, где дополнительная часть Cα содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 142, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 142 или с частичной последовательностью таковой.
19. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 7-18, где дополнительная часть области Cα и/или Cβ, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты (а), содержит одну или более модификаций, необязательно замену, делецию, или инсерцию одной или нескольких аминокислот по сравнению с нативной областью Cα и/или нативной областью Cβ, и где необязательно указанные одна или более модификаций вводят один или более остатков цистеина, способных образовывать один или более ненативных дисульфидных мостиков между альфа-цепью и бета-цепью, и/или где Cα и/или Cβ рекомбинантного TCR содержат один или более ненативных цистеинов.
20. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по п.2 или 19, где введение одного или более остатков цистеина включает замену нецистеинового остатка на цистеиновый остаток.
21. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 2, 19 и 20, где кодируемая область Cα содержит цистеин в позиции, соответствующем позиции 48, с нумерацией, указанной в любой из SEQ ID NO: 24; и/или кодируемая область Cβ содержит цистеин в положении, соответствующем положению 57, с нумерацией, указанной в SEQ ID NO: 20.
22. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 2 и 19-21, в которой кодируемая Cα содержит любую последовательность, выбранную из списка: SEQ ID NO: 248-252, или частичную последовательность таковой.
23. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-22, где сконструированная Т-клетка дополнительно содержит генетическое нарушение в локусе TRBC.
24. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, содержащая модифицированный константный бета локус Т-клеточного рецептора (TRBC), где указанный модифицированный локус TRBC содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный TCR или часть такового, и где указанный рекомбинантный TCR или часть такового содержит: (i) TCR бета-цепь (TCRβ), содержащую вариабельный бета-домен (Vβ) и константный бета-домен (Cβ), и (ii) альфа-цепь TCR (TCRα), содержащую вариабельный альфа-домен (Vα) и константный альфа-домен (Cα), где последовательность нуклеиновой кислоты включает (а) последовательность трансгена, кодирующую TCRα и домен Vβ, и (b) открытую рамку считывания эндогенного локуса TRBC или частичную последовательность таковой, где открытая рамка считывания кодирует по меньшей мере часть домена Cβ рекомбинантного TCR.
25. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, содержащая модифицированный константный бета локус Т-клеточного рецептора (TRBC), где указанный модифицированный локус TRBC содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный TCR или часть такового, и где указанный рекомбинантный TCR или часть такового содержит: (i) TCR бета-цепь (TCRβ), содержащую вариабельный бета-домен (Vβ) и константный бета-домен (Cβ), и (ii) TCR-альфа-цепь (TCRα), содержащую вариабельный альфа-домен (Vα) и константный альфа-домен (Cα), причем последовательность нуклеиновой кислоты включает (а) последовательность трансгена, кодирующую TCRα и домен Vβ, и (b) открытую рамку считывания эндогенного локуса TRBC или частичную последовательность таковой, при этом открытая рамка считывания кодирует по меньшей мере часть Cβ домена рекомбинантного TCR, где:
часть Cβ кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRBC или частичной последовательностью такового, а дополнительная часть Cβ кодируется последовательностью трансгена, где указанная дополнительная часть Cβ меньше полноразмерного нативного Cβ; а также
дополнительная часть области Cβ и/или Cα, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты (a), включает одну или более модификаций, необязательно, замену, делецию или инсерцию одной или нескольких аминокислот по сравнению с нативной областью Cβ и/или нативной областью Cα, где необязательно указанная одна или более модификаций вводят один или более остатков цистеина, способных образовывать один или более ненативных дисульфидных мостиков между альфа-цепью и бета-цепью.
26. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по п.24 или 25, в которой последовательность трансгена интегрирована посредством гомологически направленной репарации (HDR).
27. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 24-26, в которой локус TRBC представляет собой локус TRBC1 и/или локус TRBC2.
28. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 24-27, где модифицированный локус TRBC содержит слияние в рамке считывания (i) последовательности трансгена и (ii) открытой рамки считывания эндогенного TRBC локуса или частичной последовательности таковой, где последовательность трансгена необязательно находится в рамке считывания с одним или несколькими экзонами открытой рамки считывания эндогенного локуса TRBC или частичной последовательностью таковой.
29. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 24-28, где последовательность трансгена не включает последовательность, кодирующую 3’-нетранслируемую область (3’ UTR) или интрон.
30. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 24 и 26-29, в которой часть Cβ кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRBC или частичной последовательностью таковой, а дополнительная часть Cβ кодируется последовательностью трансгена, где длина указанной дополнительной части Cβ меньше полной длины нативного Cβ.
31. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 24-30, в которой открытая рамка считывания или частичная последовательность таковой содержит по меньшей мере один интрон и по меньшей мере один экзон эндогенного локуса TRBC.
32. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 25, 30 и 31, где дополнительная часть Cβ кодируется последовательностью нуклеотидов, которая включает менее четырех экзонов, менее трех экзонов, менее двух экзонов, один экзон, или менее одного полного экзона в открытой рамке считывания локуса TRBC.
33. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 25 и 30-32, в которой дополнительная часть Cβ кодируется последовательностью нуклеотидов, которая меньше 400, меньше 300, меньше 250, меньше 200 или меньше 150 пар оснований в длину.
34. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 25 и 30-33, где дополнительная часть Cβ кодируется частью экзона 1 локуса TRBC, причем длина части экзона 1 меньше полной длины экзона 1 открытой рамки считывания локуса TRBC.
35. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 24-34, где последовательность трансгена интегрирована ниже по течению крайнего 5'-нуклеотида экзона 1 и выше по течению крайнего 3'-нуклеотида экзона 1 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRBC.
36. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 24-35, где по меньшей мере часть Cβ кодируется по меньшей мере частью экзона 1 и экзонов 2-4 открытой рамки считывания эндогенного локуса TRBC.
37. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 24-36, где кодируемая цепь TCRβ способна димеризоваться с цепью TCRα.
38. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 24-37, в которой кодируемый Cβ содержит любую последовательность, выбранную из списка: SEQ ID NO: 16, 17, 21 и 25, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с любой одной из SEQ ID NO: 16, 17, 21 и 25 или с частичной последовательностью таковых.
39. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 24-38, в которой кодируемый Cβ содержит последовательность, выбранную из списка SEQ ID NO: 20, 21, 25 и 253-258, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 20, 21, 25 и 253-258 или с частичной последовательностью таковых.
40. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 25 и 30-39, где по меньшей мере часть Cβ кодируется:
последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 1445, указанной в SEQ ID NO: 2, или одним или несколькими экзонами таковой, или последовательностью, имеющей не менее 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности, начиная с остатка 3 и до остатка 1445, с последовательностью нуклеотидов, указанной в SEQ ID NO: 2, или с одним или несколькими экзонам таковой, или с частичной последовательностью таковой; или
последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 1486, указанной в SEQ ID NO: 3, или одним или несколькими экзонами таковой, или последовательностью, имеющей по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности, начиная с остатка 3 и до остатка 1486, с последовательностью нуклеотидов, указанной в SEQ ID NO: 3, или с одним или несколькими экзонами таковой, или с частичной последовательностью таковой.
41. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 25 и 30-39, где дополнительная часть области Cβ и/или Cα, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты (а), содержит одну или более модификаций, необязательно замену, делецию или инсерцию одной или нескольких аминокислот по сравнению с нативной областью Cβ и/или нативной областью Cα, где необязательно указанная одна или более модификаций вводят один или более остатков цистеина, способных образовывать один или более ненативных дисульфидных мостиков между альфа-цепью и бета-цепью.
42. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по пп. 25 и 41, где введение одного или более остатков цистеина включает замену нецистеинового остатка на остаток цистеина.
43. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 25, 41 и 42, в которой кодируемая область Cα включает цистеин в позиции, соответствующей позиции 48, в соответствии с нумерацией, указанной в любой из SEQ ID NO: 24; и/или кодируемая область Cβ содержит цистеин в позиции, соответствующей позиции 57, в соответствии с нумерацией, указанной в SEQ ID NO: 20.
44. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 25 и 41-43, в которой кодируемый Cβ содержит любую последовательность, выбранную из списка SEQ ID NO: 253 и 256-258, или частичную последовательность таковой.
45. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 24-44, где сконструированная Т-клетка дополнительно содержит генетическое нарушение в локусе TRAC.
46. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-45, где последовательность трансгена содержит один или более мультицистронных элементов.
47. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по п.46, где мультицистронный(ые) элемент(ы) расположен(ы) между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей TCRα или часть такового, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей TCRβ или часть такового, и/или выше по течению последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR или часть TCR.
48. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по п.46 или 47, где мультицистронный элемент представляет собой или содержит последовательность пропуска рибосомы, необязательно T2A, P2A, E2A или F2A.
49. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-48, где трансгенная последовательность включает один или более гетерологичных или регуляторных контролирующих элементов, функционально связанных для обеспечения контроля экспрессии TCR при экспрессии из клетки, являющейся сконструированной клеткой, в которую введен нуклеотид.
50. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по п.49, где гетерологичный регуляторный или контролирующий элемент содержит гетерологичный промотор.
51. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по п.50, где гетерологичный промотор выбран из конститутивного промотора, индуцибельного промотора, репрессируемого промотора и/или тканеспецифического промотора.
52. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по п.50 или 51, где гетерологичный промотор представляет собой или содержит промотор фактора элонгации 1 альфа (EF1α), или промотор MND, или варианты таковых.
53. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-52, где рекомбинантный TCR способен связываться с антигеном, который ассоциирован, специфичен и/или экспрессируется на клетке или ткани, ассоциированной с заболеванием, нарушением или состоянием.
54. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по п.53, где заболевание, нарушение или состояние представляет собой инфекционное заболевание или нарушение, аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание, опухоль или рак.
55. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-54, где Т-клетка является первичной Т-клеткой, полученной от субъекта, где субъектом необязательно является человек.
56. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп. 1-55, где Т-клетка представляет собой CD8+ Т-клетку или подтипы таковой.
57. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, по любому из пп.1-55, где Т-клетка представляет собой CD4+ Т-клетку или подтипы таковой.
58. Т-клетка, сконструированная методами генной инженерии, из пп. 1-57, где Т-клетка получена из мультипотентной или плюрипотентной клетки, которая необязательно представляет собой iPSC.
59. Композиция, содержащая множество Т-клеток, сконструированных методами генной инженерии, по любому из пп. 1-58.
60. Композиция, содержащая множество Т-клеток, сконструированных методами генной инженерии, содержащих модифицированный константный локус альфа Т-клеточного рецептора (TRAC), где указанный модифицированный локус TRAC содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный TCR или часть такового, причем указанный рекомбинантный TCR или часть такового содержит: (i) цепь TCR альфа (TCRα), содержащую вариабельный альфа (Vα) домен и константный альфа домен(Cα), и (ii) цепь TCR бета (TCRβ), содержащую вариабельный бета домен (Vβ) и константный бета домен (Cβ), и где последовательность нуклеиновой кислоты включает: (a) последовательность трансгена, кодирующую TCRβ и домен Vα, и (b) открытую рамку считывания эндогенного локуса TRAC или частичную последовательность таковой, при этом открытая рамка считывания кодирует по меньшей мере часть Cα-домена рекомбинантного TCR, где указанный рекомбинантный TCR способен связываться с антигеном, который ассоциирован, специфичен и/или экспрессируется на клетке или ткани, которая связана с заболеванием, нарушением, или состоянием; в которой:
по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сконструированных клеток композиции содержат генетическое нарушение в константной области гена альфа эндогенного Т-клеточного рецептора (TRAC) и/или в константной области гена бета Т-клеточного рецептора (TRBC);
по меньшей мере 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сконструированных клеток композиции не экспрессируют вообще или не экспрессируют на поддающимся обнаружению уровне продукты эндогенного гена TRAC или TRBC; и/или
по меньшей мере, или более 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 90% клеток в композиции экспрессируют рекомбинантный TCR и/или демонстрируют связывание с антигеном.
61. Композиция, содержащая множество Т-клеток, сконструированных методами генной инженерии, содержащих модифицированный константный локус альфа Т-клеточного рецептора (TRAC), где указанный модифицированный локус TRAC содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный TCR или часть такового, причем указанный рекомбинантный TCR или часть такового содержит: (i) цепь TCR альфа (TCRα), содержащую вариабельный альфа (Vα) домен и константный альфа (Cα) домен, и (ii) цепь TCR beta (TCRβ), содержащую вариабельный бета (Vβ) домен и константный бета (Cβ) домен, где последовательность нуклеиновой кислоты включает (a) последовательность трансгена, кодирующую TCRβ и домен Vα, и (b) открытую рамку считывания эндогенного локуса TRAC или частичную последовательность таковой, при этом открытая рамка считывания кодирует, по крайней мере, часть домена Cα рекомбинантного TCR; где
часть Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или частичной последовательностью таковой, а дополнительная часть Cα кодируется последовательностью трансгена, и где указанная дополнительная часть Cα меньше полноразмерного нативного Cα; а также
дополнительная часть области Cα и/или Cβ, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты (a), содержит одну или более модификаций по сравнению с нативной областью Cα и/или нативной областью Cβ, где указанная одна или более модификаций вводят один или более остатков цистеина, способных образовывать один или более ненативных дисульфидных мостиков между альфа-цепью и бета-цепью.
62. Композиция, содержащая множество Т-клеток, сконструированных методами генной инженерии, содержащих модифицированный константный локус бета Т-клеточного рецептора (TRBC), где указанный модифицированный локус TRBC содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный TCR или часть такового, и где указанный рекомбинантный TCR или часть такового содержит: (i) цепь TCR-бета (TCRβ), содержащую вариабельный бета-домен (Vβ) и константный бета-домен (Cβ), и (ii) цепь TCR-альфа (TCRα), содержащую вариабельный альфа-домен (Vα) и константный альфа-домен (Cα), где последовательность нуклеиновой кислоты включает (a) последовательность трансгена, кодирующую TCRα и домен Vβ, и (b) открытую рамку считывания эндогенного локуса TRBC или частичную последовательность таковой, при этом открытая рамка считывания кодирует, по крайней мере, часть домена Cβ рекомбинантного TCR, где указанный рекомбинантный TCR способен связываться с антигеном, который ассоциирован, специфичен и/или экспрессируется на клетке или ткани, которая связана с заболеванием, нарушением, или состоянием; в которой:
по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сконструированных клеток композиции содержат генетическое нарушение в константной области гена альфа эндогенного Т-клеточного рецептора (TRAC) и/или в константной области гена бета Т-клеточного рецептора (TRBC);
по меньшей мере 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сконструированных клеток композиции не экспрессируют вообще или не экспрессируют на поддающемся обнаружению уровне продукты эндогенных генов TRAC или TRBC; и/или
по меньшей мере или более 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 90% клеток в композиции экспрессируют рекомбинантный TCR и/или демонстрируют связывание с антигеном.
63. Композиция, содержащая множество Т-клеток, сконструированных методами генной инженерии, содержащих модифицированный константный локус бета Т-клеточного рецептора (TRBC), где указанный модифицированный локус TRBC содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный TCR или часть такового, при этом указанный рекомбинантный TCR или часть такового содержит: (i) цепь TCR-бета (TCRβ), содержащую вариабельный бета-домен (Vβ) и константный бета-домен (Cβ), и (ii) цепь TCR-альфа (TCRα), содержащую вариабельный альфа-домен (Vα) и константный альфа-домен (Cα), где последовательность нуклеиновой кислоты включает (a) последовательность трансгена, кодирующую TCRα и домен Vβ, и (b) открытую рамку считывания эндогенного локуса TRBC или частичную последовательность таковой, при этом открытая рамка считывания кодирует по крайней мере, часть домена Cβ рекомбинантного TCR; в которой:
часть Cβ кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRBC или частичной последовательностью такового, а дополнительная часть Cβ кодируется последовательностью трансгена, где указанная дополнительная часть Cβ меньше полноразмерного нативного Cβ; а также
дополнительная часть области Cβ и/или Cα, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты (a), включает одну или более модификаций, необязательно, замену, делецию или инсерцию одной или нескольких аминокислот по сравнению с нативной областью Cβ и/или нативной областью Cα, где необязательно указанная одна или более модификаций вводят один или более остатков цистеина, способных образовывать один или более ненативных дисульфидных мостиков между альфа-цепью и бета-цепью.
64. Композиция по п.61 или 63, где рекомбинантный TCR способен связываться с антигеном, который ассоциирован, специфичен и/или экспрессируется на клетке или ткани, ассоциированными с заболеванием, нарушением или состоянием.
65. Композиция по любому из пп. 59-64, где композиция содержит CD4+ и/или CD8+ Т-клетки.
66. Композиция по любому из пп. 59-65, где композиция содержит CD4+ и CD8+ Т-клетки, а соотношение CD4+ к CD8+ Т-клеткам составляет от или приблизительно от 1:3 до 3:1, необязательно 1:1.
67. Композиция по любому из пп. 59, 61 и 63-66, в которой:
по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сконструированных клеток композиции содержат генетическое нарушение в константной области гена альфа эндогенного Т-клеточного рецептора (TRAC) и/или в константной области гена бета Т-клеточного рецептора (TRBC); и/или
по меньшей мере 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сконструированных клеток композиции не экспрессируют вообще или не экспрессируют поддающиеся обнаружению уровни продукты эндогенных генов TRAC или TRBC.
68. Композиция по любому из пп. 59, 61 и 63-67, где по меньшей мере или более 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 90% клеток композиции экспрессируют рекомбинантный TCR и/или демонстрируют связывание с антигеном.
69. Полинуклеотид, содержащий:
(a) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую часть рекомбинантного Т-клеточного рецептора (TCR), где указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует (i) цепь бета Т-клеточного рецептора (TCRβ), содержащую вариабельный бета-домен (Vβ) и константный бета-домен (Cβ); и (ii) часть цепи альфа Т-клеточного рецептора (TCRα), где длина части цепи TCRα меньше полной длины нативной цепи TCRα, и
(b) одно или более плеч гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, где одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или нескольким областям открытой рамки считывания локуса TRAC; и где полинуклеотид содержится в вирусном векторе.
70. Полинуклеотид, содержащий:
(a) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей часть рекомбинантного Т-клеточного рецептора (TCR), где указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует (i) цепь бета Т-клеточного рецептора (TCRβ), содержащую вариабельный бета-домен (Vβ) и константный бета-домен (Cβ); и (ii) часть цепи альфа Т-клеточного рецептора (TCRα), где длина части цепи TCRα меньше полной длины нативной цепи TCRα, и
(b) одно или более плеч гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, где одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или нескольким областям открытой рамки считывания локуса TRAC; и где, если TCR или антигенсвязывающий фрагмент такового экспрессируется из клетки, являющейся сконструированной клеткой, в которую введен полинуклеотид:
часть Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или частичной последовательностью таковой, а дополнительная часть Cα кодируется последовательностью трансгена, где указанная дополнительная часть Cα меньше полноразмерного нативного Cα; а также
дополнительная часть области Cα и/или Cβ, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты (a), содержит одну или более модификаций по сравнению с нативной областью Cα и/или нативной областью Cβ, при этом указанная одна или более модификаций вводят один или более остатков цистеина, способных образовывать один или более ненативных дисульфидных мостиков между альфа-цепью и бета-цепью и/или где Cα и/или Cβ рекомбинантного TCR содержат один или более ненативных цистеинов.
71. Полинуклеотид, содержащий:
(a) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую часть рекомбинантного Т-клеточного рецептора (TCR), где указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует (i) цепь бета Т-клеточного рецептора (TCRβ), содержащую вариабельный бета-домен (Vβ) и константный бета-домен (Cβ); и (ii) часть цепи альфа-Т-клеточного рецептора (TCRα), где длина части цепи TCRα меньше полной длины нативной цепи TCRα, и
(b) одно или более плеч гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, где одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или нескольким областям открытой рамки считывания локуса TRAC; где трансгенная последовательность включает один или более гетерологичных или регуляторных контролирующих элементов, содержащих гетерологичный промотор, функционально связанный для контроля экспрессии TCR при экспрессии из клетки, являющейся сконструированной Т-клеткой, в которую введен полинуклеотид.
72. Полинуклеотид по любому из пп. 69-71, где цепь TCRα содержит константный домен альфа (Cα), где по меньшей мере часть указанного Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или частичной последовательностью таковой, если TCR или антигенсвязывающий фрагмент такового экспрессируется из клетки, являющейся сконструированной Т-клеткой, в которую введен полинуклеотид; и/или
последовательность нуклеиновой кислоты (a) и одно из одного или более плеч гомологии вместе содержат последовательность нуклеотидов, кодирующих Cα, длина которого меньше полной длины нативного Cα, где по крайней мере часть Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или частичной последовательностью таковой, если TCR или антигенсвязывающий фрагмент такового экспрессируется из клетки, являющейся сконструированной Т-клеткой, в которую введен полинуклеотид.
73. Полинуклеотид по любому из пп. 69-72, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая цепь TCRβ, расположена выше по течению от последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей часть цепи TCRα.
74. Полинуклеотид по любому из пп. 69-73, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) не включает последовательность, кодирующую 3’ нетранслируемую область (3’ UTR) или интрон.
75. Полинуклеотид по любому из пп. 69-74, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) находится в рамке считывания с одним или несколькими экзонами открытой рамки считывания локуса TRAC или частичной последовательности таковой, содержащимися в одном или нескольких плечах гомологии.
76. Полинуклеотид по любому из пп. 69 и 71-75, где часть Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или частичной последовательностью таковой, а дополнительная часть Cα кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (а), где указанная дополнительная часть Cα меньше полноразмерного нативного Cα.
77. Полинуклеотид по любому из пп. 69-76, где открытая рамка считывания или частичная последовательность таковой содержит по меньшей мере один интрон и по меньшей мере один экзон эндогенного локуса TRAC.
78. Полинуклеотид по любому из пп. 70, 76 и 77, где дополнительная часть Cα кодируется последовательностью нуклеотидов, включающей менее четырех экзонов, менее трех экзонов, менее двух экзонов, один экзон или менее одного полного экзона открытой рамки считывания локуса TRAC.
79. Полинуклеотид по любому из пп. 70 и 76-78, где дополнительная часть Cα кодируется последовательностью нуклеотидов, составляющей менее 400, менее 300, менее 250, менее 200 или менее 150 пар оснований в длину.
80. Полинуклеотид по любому из пп. 70 и 76-79, где дополнительная часть Cα кодируется частью экзона 1 локуса TRAC, причем длина части экзона 1 меньше полной длины экзона 1 открытой рамки считывания локуса TRAC.
81. Полинуклеотид по любому из пп. 69-80, где цепь TCRα способна димеризоваться с цепью TCRβ, если продуцируется из клетки, в которую введен полинуклеотид.
82. Полинуклеотид по любому из пп. 69-81, где кодируемый Cα содержит любую последовательность, выбранную из списка: SEQ ID NO: 19, 24 и 243-252, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87. %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с любой из списка: SEQ ID NO: 19, 24 и 243-252, или с частичной последовательностью таковых, если он продуцирется из клетки, в которую введен полинуклеотид.
83. Полинуклеотид по любому из пп. 70 и 76-82, где по меньшей мере часть Cα, начиная с остатка 3 и заканчивая остатком 3155, кодируется последовательностью нуклеотидов, указанной в SEQ ID NO: 1 или одним или несколькими экзонами таковой или последовательностью, имеющей по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% или более идентичности последовательности, начиная с остатка 3 и до остатка 3155, с последовательностью нуклеотидов, указанной в SEQ ID NO: 1, или с одним или несколькими экзонами таковой, или с частичной последовательностью таковой.
84. Полинуклеотид по любому из пп. 70 и 76-83, где дополнительная часть Cα содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 142, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с SEQ ID NO: 142 или с частичной последовательностью таковой.
85. Полинуклеотид по любому из пп. 76-84, где дополнительная часть области Cα и/или Cβ, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты (a), включает одну или более модификаций, необязательно замену, делецию или инсерцию одной или нескольких аминокислот по сравнению с нативной областью Cα и/или нативной областью Cβ, где необязательно указанная одна или более модификаций вводят один или более остатков цистеина, способных образовывать один или более ненативных дисульфидных мостиков между альфа-цепью и бета-цепью.
86. Полинуклеотид по п.70 и п.85, где введение одного или более остатков цистеина включает замену нецистеинового остатка на остаток цистеина.
87. Полинуклеотид по любому из пп. 70, 85 и 86, где кодируемая область Cα содержит цистеин в положении, соответствующем положению 48, с нумерацией, указанной в любой из SEQ ID NO: 24; и/или кодируемая область Cβ содержит цистеин в положении, соответствующем положению 57, с нумерацией, указанной в SEQ ID NO: 20, если он продуцируется из клетки, в которую введен полинуклеотид.
88. Полинуклеотид по любому из пп. 70 и 85-87, где кодируемый Cα содержит любую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 248-252, или частичную последовательность таковых, если он продуцируется из клетки, в которую введен полинуклеотид.
89. Полинуклеотид по любому из пп. 69-88, где часть цепи TCRα содержит вариабельный альфа-домен (Vα).
90. Полинуклеотид по любому из пп. 69-89, где одно или более плеч гомологии включает 5’-плечо гомологии и/или 3’-плечо гомологии.
91. Полинуклеотид по п.90, где 5’-плечо гомологии и 3’-плечо гомологии включают последовательности нуклеиновой кислоты, гомологичные последовательностям нуклеиновой кислоты, окружающим целевой сайт, причем целевой сайт находится в локусе TRAC.
92. Полинуклеотид по п.91, где целевой сайт находится в экзоне 1 локуса TRAC.
93. Полинуклеотид по любому из пп. 90-92, где 5’-плечо -гомологии включает:
a) последовательность, содержащую или по меньшей мере приблизительно содержащую 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 смежных нуклеотидов с последовательностью, имеющей по меньшей мере 85%, 86%, 87% , 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 124;
b) последовательность, содержащую или по меньшей мере приблизительно содержащую 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 смежных нуклеотидов последовательности, указанной в SEQ ID NO: 124; или
c) последовательность, указанную в SEQ ID NO: 124.
94. Полинуклеотид по любому из пп. 90-93, где 3’-плечо -гомологии включает:
a) последовательность, содержащую или по меньшей мере приблизительно содержащую 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 смежных нуклеотидов с последовательностью, которая имеет по меньшей мере 85%, 86%, 87% , 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 125;
b) последовательность, содержащую или по меньшей мере приблизительно содержащую 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 смежных нуклеотидов последовательности, указанной в SEQ ID NO: 125; или
c) последовательность, указанную в SEQ ID NO: 125.
95. Полинуклеотид, содержащий:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую часть рекомбинантного Т-клеточного рецептора (TCR), где указанная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует (i) цепь альфа Т-клеточного рецептора (TCRα), содержащую вариабельный альфа-домен (Vα) и константный альфа-домен (Cα) домен; и (ii) часть цепи бета Т-клеточного рецептора (TCRβ), где часть цепи TCRβ меньше, чем полноразмерная нативная цепь TCRβ, и
(b) одно или более плеч гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, где одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или нескольким областям открытой рамки считывания локуса TRBC.
96. Полинуклеотид по п.95, где цепь TCRβ содержит константный бета (Cβ), причем по меньшей мере часть указанного Cβ кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или частичной последовательностью таковой, если TCR или антиген-связывающий фрагмент такового экспрессируется из клетки, в которую введен полинуклеотид и/или последовательностью нуклеиновой кислоты (а), и одним из одного или более плеч гомологии вместе содержащих последовательность нуклеотидов, кодирующих Cβ, длина которого меньше полной длины нативного Cβ, и где по меньшей мере часть Cβ кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRBC или частичной последовательностью таковой, если TCR или антигенсвязывающий фрагмент такового экспрессируется из клетки, в которую введен полинуклеотид.
97. Полинуклеотид по п.95 или 96, где локус TRBC представляет собой один или более из TRBC1 или TRBC2.
98. Полинуклеотид по любому из пп. 95-97, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующий цепь TCRα, находится выше по течению от последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей часть цепи TCRβ.
99. Полинуклеотид по любому из пп. 95-98, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) не включает последовательность, кодирующую 3’ нетранслируемую область (3’ UTR) или интрон.
100. Полинуклеотид по любому из пп. 95-99, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) находится в рамке считывания с одним или несколькими экзонами или частичной последовательностью таковых открытой рамки считывания локуса TRAC, содержащимися в одном или нескольких плеч гомологии.
101. Полинуклеотид по любому из пп. 95-100, в котором часть Cβ кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRBC или частичной последовательностью такового, а дополнительная часть Cβ кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты (а), где указанная дополнительная часть Cβ меньше полноразмерного нативного Cβ.
102. Полинуклеотид по любому из пп. 95-101, где открытая рамка считывания или частичная последовательность таковой содержит по меньшей мере один интрон и по меньшей мере один экзон эндогенного локуса TRBC.
103. Полинуклеотид по п.101 или п.102, где дополнительная часть Cβ кодируется последовательностью нуклеотидов, кодирующей менее четырех экзонов, менее трех экзонов, менее двух экзонов, один экзон или менее одного полного экзона открытой рамки считывания локуса TRBC.
104. Полинуклеотид по любому из пп. 101-103, где дополнительная часть Cβ кодируется последовательностью нуклеотидов, составляющей менее 400, менее 300, менее 250, менее 200 или менее 150 пар оснований в длину.
105. Полинуклеотид по любому из пп. 101-104, где дополнительная часть Cβ кодируется частью экзона 1 локуса TRBC, причем длина части экзона 1 меньше полной длины экзона 1 открытой рамки считывания локуса TRBC.
106. Полинуклеотид по любому из пп. 95-105, где цепь TCRβ способна димеризоваться с цепью TCRα, если она продуцируется из клетки, в которую был введен полинуклеотид.
107. Полинуклеотид по любому из пп. 69-106, где кодируемый Cβ включает любую последовательность, выбранную из списка: SEQ ID NO: 20, 21, 25 и 253-258, или последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 20, 21, 25 и 253-258 или частичной последовательностью таковых, если они получены из клетки, в которую введен полинуклеотид.
108. Полинуклеотид по любому из пп. 101-107, где по меньшей мере часть Cβ кодируется:
последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 1445 последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2, или одним или несколькими экзонами таковой, или последовательностью, имеющей по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности, начиная с остатка 3 и до остатка 1445, с последовательностью нуклеотидов, указанной в SEQ ID NO: 2, или с одним или несколькими экзонами таковой, или с частичной последовательностью таковой; или
последовательностью нуклеотидов, начиная с остатка 3 и до остатка 1486, указанной в SEQ ID NO: 3, или одним или несколькими экзонами таковой, или последовательностью, имеющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности, начиная с остатка 3 и до остатка 1486, с последовательностью нуклеотидов, указанной в SEQ ID NO: 3, или одним или несколькими экзонами таковой, или с частичную последовательностью таковой.
109. Полинуклеотид по любому из пп. 101-108, где дополнительная часть области Cβ и/или Cα, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты (а), включает одну или более модификаций, необязательно замену, делецию или инсерцию одной или нескольких аминокислот по сравнению с нативной областью Cβ и/или нативной областью Cα, где необязательно указанная одна или более модификаций вводят один или более остатков цистеина, способных образовывать один или более ненативных дисульфидных мостиков между альфа-цепью и бета-цепью.
110. Полинуклеотид по п.109, где введение одного или более остатков цистеина включает замену нецистеинового остатка на остаток цистеина.
111. Полинуклеотид по п. 109 или 110, где кодируемая область Cα содержит цистеин в положении, соответствующем положению 48, с нумерацией, указанной в любой из SEQ ID NO: 24; и/или кодируемая область Cβ содержит цистеин в положении, соответствующем положению 57, с нумерацией, указанной в SEQ ID NO: 20.
112. Полинуклеотид по любому из пп. 109-111, где кодируемый Cβ содержит любую последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 253 и 256-258, или частичную последовательность таковых.
113. Полинуклеотид по любому из пп. 95-112, где часть цепи TCRβ содержит вариабельный бета-домен (Vβ).
114. Полинуклеотид по любому из пп. 95-113, где одно или более плеч гомологии содержат 5’-плечо гомологии и/или 3’-плечо гомологии.
115. Полинуклеотид по п. 114, где последовательности нуклеиновой кислоты 5’-плеча гомологии и 3’-плеча гомологии гомологичны последовательностям нуклеиновой кислоты, окружающим целевой сайт, и где целевой сайт находится в пределах открытой рамки считывания локуса TRBC.
116. Полинуклеотид по п. 115, где целевой сайт находится в пределах экзона 1 открытой рамки считывания локуса TRBC.
117. Полинуклеотид по любому из пп. 69-116, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) представляет собой последовательность, которая является экзогенной или гетерологичной по отношению к открытой рамке считывания эндогенного геномного локуса TRAC Т-клетки, необязательно Т-клетки человека.
118. Полинуклеотид по любому из пп. 90-94 и 114-117, где 5'-плечо гомологии и 3'-плечо независимо друг от друга составляют от или приблизительно от 50 до или приблизительно до 100 нуклеотидов в длину, от или приблизительно от 100 до или приблизительно до 250 нуклеотидов в длину, от или приблизительно от 250 до или приблизительно до 500 нуклеотидов в длину, от или приблизительно от 500 до или приблизительно до 750 нуклеотидов в длину, от или приблизительно от 750 до или приблизительно до 1000 нуклеотидов в длину, или от или приблизительно от 1000 до или приблизительно до 2000 нуклеотидов в длину.
119. Полинуклеотид по любому из пп. 90-94 и 114-118, где 5’-плечо гомологии и 3'-плечо гомологии независимо составляют от или приблизительно от 100 до или приблизительно до 1000 нуклеотидов, от 100 до 750 нуклеотидов, от 100 до 600 нуклеотидов, от 100 до 400 нуклеотидов, от 100 до 300 нуклеотидов, от 100 до 200 нуклеотидов, от 200 до 1000 нуклеотидов, от 200 до 750 нуклеотидов, от 200 до 600 нуклеотидов, от 200 до 400 нуклеотидов, от 200 до 300 нуклеотидов, от 300 до 1000 нуклеотидов, от 300 до 750 нуклеотидов, От 300 до 600 нуклеотидов, от 300 до 400 нуклеотидов, от 400 до 1000 нуклеотидов, от 400 до 750 нуклеотидов, от 400 до 600 нуклеотидов, от 600 до 1000 нуклеотидов, от 600 до 750 нуклеотидов или от 750 до 1000 нуклеотидов в длину.
120. Полинуклеотид по любому из пп. 90-94 и 114-119, где 5’-плечо гомологии и 3'-плечо гомологии независимо составляют приблизительно 200, 300, 400, 500, 600, 700 или 800 нуклеотидов в длину, или любое значение между любыми из вышеперечисленных.
121. Полинуклеотид по любому из пп. 90-94 и 114-120, где 5'-плечо гомологии и 3'-плечо независимо имеют длину более чем или приблизительно более чем 300 нуклеотидов, где, необязательно, 5'-плечо гомологии и 3'-плечо гомологии независимо друг от друга состаавляют в длину приблизительно 400, 500 или 600 нуклеотидов или любое значение между любыми из вышеперечисленных.
122. Полинуклеотид по любому из пп. 90-94 и 114-121, где длина плеча 5’-гомологии и 3’-гомологии независимо составляет, приблизительно составляет или меньше, чем приблизительно 600 нуклеотидов.
123. Полинуклеотид по любому из пп. 90-94 и 114-122, где независимо длина 5’-плеча гомологии и 3’-плеча гомологии больше, чем 300 или приблизительно 300 нуклеотидов.
124. Полинуклеотид по любому из пп. 69-123, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) содержит один или более мультицистронных элементов.
125. Полинуклеотид по п. 124, где мультицистронный(ые) элемент(ы) расположены между последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей TCRα или часть такового, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей TCRβ или часть такового, и/или расположены выше по течению последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей TCR или часть TCR.
126. Полинуклеотид по п. 124 или 125, где мультицистронный элемент представляет собой или содержит последовательность пропуска рибосомы, необязательно T2A, P2A, E2A или F2A.
127. Полинуклеотид по любому из пп. 69-126, где последовательность нуклеиновой кислоты (а) содержит один или более гетерологичных или регуляторных контролирующих элементов, функционально связанных для контроля экспрессии TCR при экспрессии из клетки, в которую введен полинуклеотид.
128. Полинуклеотид по п. 127, где гетерологичный регуляторный или контролирующий элемент содержит гетерологичный промотор.
129. Полинуклеотид по п. 128, где гетерологичный промотор выбран из конститутивного промотора, индуцибельного промотора, репрессируемого промотора и/или тканеспецифического промотора.
130. Полинуклеотид по п. 128 или 129, где гетерологичный промотор представляет собой или содержит промотор фактора элонгации 1 альфа (EF1α), или промотор MND, или варианты таковых.
131. Полинуклеотид по любому из пп. 69-130, где полинуклеотид содержится в вирусном векторе.
132. Полинуклеотид по п.131, где вирусный вектор представляет собой вектор AAV, необязательно выбранный из векторов AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 или AAV8.
133. Полинуклеотид по п.132, где вектор AAV представляет собой вектор AAV2 или AAV6.
134. Полинуклеотид по любому из пп. 69-133, где полинуклеотид имеет структуру: [5- плечо гомологии] - [последовательность нуклеиновой кислоты (а)] - [3’-плечо гомологии].
135. Полинуклеотид по любому из пп. 124-134, где полинуклеотид содержит структуру: [5’-плечо гомологии] - [мультицистронный элемент] - [последовательность нуклеиновой кислоты (а)] - [3’- плечо гомологии].
136. Полинуклеотид по любому из пп. 128-134, где полинуклеотид содержит структуру: [5’-плечо гомологии] - [гетерологичный промотор] - [последовательность нуклеиновой кислоты (а)] - [3’-плечо гомологии].
137. Полинуклеотид по любому из пп. 69-136, где кодируемый рекомбинантный TCR способен связываться с антигеном, который ассоциирован, специфичен и/или экспрессируется на клетке или ткани, связанными с заболеванием, нарушением, или состоянием.
138. Полинуклеотид по п. 137, где заболевание, нарушение или состояние представляет собой инфекционное заболевание или нарушение, аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание, опухоль или рак.
139. Полинуклеотид по любому из пп. 69-138, где полинуклеотид составляет или приблизительно составляет 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4760, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000 7000, 7500, 8000, 9000 или 10000 нуклеотидов в длину или принимает любое значение между любыми из вышеперечисленных.
140. Полинуклеотид по любому из пп. 69-139, где полинуклеотид составляет от или приблизительно от 2500 до или приблизительно до 5000 нуклеотидов, от или приблизительно от 3500 до или приблизительно до 4500 нуклеотидов, или от или приблизительно от 3750 нуклеотидов до или приблизительно до 4250 нуклеотидов в длину.
141. Способ получения Т-клетки, сконструированной методами генной инженерии, содержащей модифицированный локус TRAC, включающий введение полинуклеотида по любому из пп. 69-94 или 117-140 в Т-клетку, содержащую генетическое нарушение в локусе TRAC.
142. Способ получения Т-клетки, сконструированной методами генной инженерии, содержащей модифицированный константный локус альфа Т-клеточного рецептора (TRAC), и включающий:
(а) введение в Т-клетку одного или более агентов, способных вызывать генетическое нарушение в целевом сайте в эндогенном локусе TRAC Т-клетки; а также
(b) введение в Т-клетку полинуклеотида, содержащего последовательность трансгена, кодирующую цепь бета Т-клеточного рецептора (TCRβ), и часть цепи альфа Т-клеточного рецептора (TCRα), причем эта часть меньше полноразмерного нативного TCRα цепь, при этом:
введение матричного полинуклеотида проводят после введения одного или более агентов, способных вызвать генетическое нарушение; а также
трансген нацелен на интеграцию в эндогенный локус TRAC посредством гомологически направленной репарации (HDR), в результате чего получают Т-клетки, сконструированные методами генной инженерии, содержащие модифицированный локус TRAC.
143. Способ получения Т-клетки, сконструированной методами генной инженерии, содержащей модифицированный константный локус альфа Т-клеточного рецептора (TRAC), где способ включает введение в Т-клетку полинуклеотида, содержащего последовательность трансгена, кодирующую цепь бета (TCRβ) Т-клеточного рецептора и часть цепи альфа (TCRα) Т-клеточного рецептора, где указанная Т-клетка имеет генетическое нарушение в эндогенном локусе TRAC Т-клетки, и где трансген нацелен на интеграцию в эндогенный локус TRAC посредством гомологически направленной репарации (HDR), создавая таким образом клетки, сконструированные методами генной инженерии, содержащие модифицированный локус TRAC.
144. Способ получения Т-клетки, сконструированной методами генной инженерии, содержащей модифицированный константный локус альфа Т-клеточного рецептора (TRAC), включающий:
(а) введение в Т-клетку одного или более агентов, способных вызывать генетическое нарушение в целевом сайте в эндогенном локусе TRAC Т-клетки; а также
(b) введение в Т-клетку полинуклеотида, содержащего последовательность трансгена, кодирующего цепь бета Т-клеточного рецептора (TCRβ), и часть цепи альфа Т-клеточного рецептора (TCRα), причем эта часть меньше полноразмерной нативной цепи TCRα; где трансген нацелен на интеграцию в эндогенный локус TRAC посредством гомологически направленной репарации (HDR), тем самым продуцируя сконструированную клетку, содержащую модифицированный локус TRAC, при этом при целевой интеграции трансгена:
часть Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или частичной последовательностью таковой, а дополнительная часть Cα кодируется последовательностью трансгена, где указанная дополнительная часть Cα меньше полноразмерного нативного Cα; а также
дополнительная часть области Cα и/или Cβ, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты (a), содержит одну или более модификаций по сравнению с нативной областью Cα и/или нативной областью Cβ, где указанная одна или более модификаций вводят один или более остатков цистеина, способных образовывать один или более ненативных дисульфидных мостиков между альфа-цепью и бета-цепью, и/или где Cα и/или Cβ рекомбинантного TCR содержат один или более ненативных цистеинов.
145. Способ получения Т-клетки, сконструированной методами генной инженерии, содержащей модифицированный константный локус альфа Т-клеточного рецептора (TRAC), включающий введение в Т-клетку полинуклеотида, содержащего последовательность трансгена, кодирующую цепь бета Т-клеточного рецептора (TCRβ) и часть цепи альфа Т-клеточного рецептора (TCRα), где указанная Т-клетка имеет генетическое нарушение в эндогенном локусе TRAC Т-клетки; и где трансген нацелен на интеграцию в эндогенный локус TRAC посредством гомологически направленной репарации (HDR), создавая таким образом сконструированные клетки, содержащие модифицированный локус TRAC, при этом при целевой интеграции трансгена:
часть Cα кодируется открытой рамкой считывания эндогенного локуса TRAC или частичной последовательностью таковой, а дополнительная часть Cα кодируется последовательностью трансгена, где указанная дополнительная часть Cα меньше полноразмерного нативного Cα; а также
дополнительная часть области Cα и/или Cβ, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты (a), содержит одну или более модификаций по сравнению с нативной областью Cα и/или нативной областью Cβ, где указанная одна или более модификаций вводят одну или более остатки цистеина, способных образовывать один или более ненативных дисульфидных мостиков между альфа-цепью и бета-цепью, и/или где Cα и/или Cβ рекомбинантного TCR содержат один или более ненативных цистеинов.
146. Способ по любому из пп. 141, 143 и 145, в котором генетическое нарушение вызвано одним или несколькими агентами, способными вызывать генетическое нарушение одного или более целевых сайтов в эндогенном локусе TRAC.
147. Способ по любому из пп. 141-146, где полинуклеотид представляет собой полинуклеотид по любому из пп. 69-94 или 117-140.
148. Способ по любому из пп. 141-147, где модифицированный локус TRAC включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный TCR или часть такового, причем последовательность нуклеиновой кислоты включает слияние в рамке считывания (i) последовательности трансгена и (ii) открытой рамки считывания эндогенного локуса TRAC или частичной последовательности таковой, где, необязательно, последовательность трансгена находится в рамке считывания с одним или несколькими экзонами открытой рамки считывания эндогенного локуса TRAC или частичной последовательности таковой.
149. Способ по любому из пп. 141-148, где сконструированная Т-клетка дополнительно включает индукцию генетического нарушения в локусе TRBC.
150. Способ получения Т-клетки, сконструированной методами генной инженерии, содержащей модифицированный локус TRBC, включающий введение полинуклеотида по любому из пп. 95-140 в Т-клетку, содержащую генетическое нарушение в локусе TRBC.
151. Способ получения Т-клетки, сконструированной методами генной инженерии, содержащей модифицированный константный локус бета Т-клеточного рецептора (TRBC), включающий:
(а) введение в Т-клетку одного или более агентов, способных вызывать генетическое нарушение в целевом сайте в эндогенном локусе TRBC Т-клетки; а также
(b) введение в Т-клетку полинуклеотида, содержащего последовательность трансгена, кодирующую альфа-цепь Т-клеточного рецептора (TCRα) и часть цепи бета Т-клеточного рецептора (TCRβ), причем эта часть меньше полноразмерной нативной цепи TCRβ, и где трансген нацелен на интеграцию в эндогенный локус TRBC посредством гомологически направленной репарации (HDR), создавая таким образом генно-инженерные сконструированные клетки, содержащие модифицированный локус TRBC.
152. Способ получения Т-клетки, сконструированной методами генной инженерии, содержащей модифицированный константный локус бета Т-клеточного рецептора (TRBC), включающий введение в Т-клетку полинуклеотида, содержащего последовательность трансгена, кодирующую альфа-цепь Т-клеточного рецептора (TCRα) и часть цепи бета Т-клеточного рецептора (TCRβ), где указанная Т-клетка имеет генетическое нарушение в эндогенном локусе TRBC Т-клетки, при этом трансген нацелен на интеграцию в эндогенный локус TRBC посредством гомологически направленной репарации (HDR), создавая таким образом генно-инженерные сконструированные клетки, содержащие модифицированный локус TRBC.
153. Способ по пп. 150 и 152, где генетическое нарушение вызвано одним или несколькими агентами, способными вызывать генетическое нарушение одного или более целевых сайтов в эндогенном локусе TRBC.
154. Способ по любому из пп. 150-153, где локус TRBC представляет собой локус TRBC1 и/или локус TRBC2.
155. Способ по любому из пп. 151-154, где полинуклеотид представляет собой полинуклеотид по любому из пп. 95-140.
156. Способ по любому из пп. 151-155, где модифицированный локус TRBC включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую рекомбинантный TCR или часть такового, причем данная последовательность нуклеиновой кислоты включает слияние в рамке считывания (i) последовательности трансгена и (ii) открытой рамки считывания эндогенного локуса TRBC или частичной последовательности таковой, где, необязательно, последовательность трансгена находится в рамке считывания с одним или несколькими экзонами открытой рамки считывания эндогенного локуса TRBC или частичной последовательности таковой.
157. Способ по любому из пп. 151-156, где сконструированная Т-клетка дополнительно включает индукцию генетического нарушения в локусе TRAC.
158. Способ по любому из пп. 142 и 144-157, где один или более агентов, способных вызывать генетическое нарушение, включают ДНК-связывающий белок или ДНК-связывающую нуклеиновую кислоту, которая специфически связывается с целевым сайтом или гибридизуется с ним.
159. Способ по любому из пп. 142 и 144-158, в котором один или более агентов включают белок цинкового пальца (ZFP), белок TAL или нуклеазу (Cas), ассоциированную с кластеризованными регулярными короткими палиндромными повторами нуклеиновой кислоты (CRISPR), специфичную для целевого сайта.
160. Способ по любому из пп. 142 и 144-159, в котором один или более агентов содержат комбинацию CRISPR-Cas9 и комбинацию CRISPR-Cas9 и направляющую РНК (gRNA), имеющую нацеливающий домен, который комплементарен по меньшей мере одному целевому сайту.
161. Способ по п.160, где один или более агентов вводят в виде комплекса рибонуклеопротеина (РНП), содержащего gRNA и белок Cas9.
162. Способ по п.161, в котором концентрация RNP составляет или составляет от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 5 мкМ, где, необязательно, концентрация RNP составляет или приблизительно составляет 2 мкМ.
163. Способ по п. 161 или 162, в котором RNP вводят посредством электропорации.
164. Способ по любому из пп. 160-163, где gRNA имеет нацеливающий домен, комплементарный целевому сайту в локусе TRAC и содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из UCUCUCAGCUGGUACACGGC (SEQ ID NO:28), UGGAUUUAGAGUCUCUCAGC (SEQ ID NO:29), ACACGGCAGGGUCAGGGUUC (SEQ ID NO:30), GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (SEQ ID NO:31), GCUGGUACACGGCAGGGUCA (SEQ ID NO:32), CUCAGCUGGUACACGGC (SEQ ID NO:33), UGGUACACGGCAGGGUC (SEQ ID NO:34), GCUAGACAUGAGGUCUA (SEQ ID NO:35), GUCAGAUUUGUUGCUCC (SEQ ID NO:36), UCAGCUGGUACACGGCA (SEQ ID NO:37), GCAGACAGACUUGUCAC (SEQ ID NO:38), GGUACACGGCAGGGUCA (SEQ ID NO:39), CUUCAAGAGCAACAGUGCUG (SEQ ID NO:40), AGAGCAACAGUGCUGUGGCC (SEQ ID NO:41), AAAGUCAGAUUUGUUGCUCC (SEQ ID NO:42), ACAAAACUGUGCUAGACAUG (SEQ ID NO:43), AAACUGUGCUAGACAUG (SEQ ID NO:44), UGUGCUAGACAUGAGGUCUA (SEQ ID NO:45), GGCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC (SEQ ID NO:46), GCUGGGGAAGAAGGUGUCUUC (SEQ ID NO:47), GGGGAAGAAGGUGUCUUC (SEQ ID NO:48), GUUUUGUCUGUGAUAUACACAU (SEQ ID NO:49), GGCAGACAGACUUGUCACUGGAUU (SEQ ID NO:50), GCAGACAGACUUGUCACUGGAUU (SEQ ID NO:51), GACAGACUUGUCACUGGAUU (SEQ ID NO:52), GUGAAUAGGCAGACAGACUUGUCA (SEQ ID NO:53), GAAUAGGCAGACAGACUUGUCA (SEQ ID NO:54), GAGUCUCUCAGCUGGUACACGG (SEQ ID NO:55), GUCUCUCAGCUGGUACACGG (SEQ ID NO:56), GGUACACGGCAGGGUCAGGGUU (SEQ ID NO:57) и GUACACGGCAGGGUCAGGGUU (SEQ ID NO:58).
165. Способ по п. 164, где gRNA имеет нацеливающий домен, содержащий последовательность GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (SEQ ID NO: 31).
166. Способ по любому из пп. 160-163, где gRNA имеет нацеливающий домен, комплементарный целевому сайту в одном или обоих генах TRBC1 и TRBC2, и содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из CACCCAGAUCGUCAGCGCCG (SEQ ID NO:59), CAAACACAGCGACCUCGGGU (SEQ ID NO:60), UGACGAGUGGACCCAGGAUA (SEQ ID NO:61), GGCUCUCGGAGAAUGACGAG (SEQ ID NO:62), GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (SEQ ID NO:63), GAAAAACGUGUUCCCACCCG (SEQ ID NO:64), AUGACGAGUGGACCCAGGAU (SEQ ID NO:65), AGUCCAGUUCUACGGGCUCU (SEQ ID NO:66), CGCUGUCAAGUCCAGUUCUA (SEQ ID NO:67), AUCGUCAGCGCCGAGGCCUG (SEQ ID NO:68), UCAAACACAGCGACCUCGGG (SEQ ID NO:69), CGUAGAACUGGACUUGACAG (SEQ ID NO:70), AGGCCUCGGCGCUGACGAUC (SEQ ID NO:71), UGACAGCGGAAGUGGUUGCG (SEQ ID NO:72), UUGACAGCGGAAGUGGUUGC (SEQ ID NO:73), UCUCCGAGAGCCCGUAGAAC (SEQ ID NO:74), CGGGUGGGAACACGUUUUUC (SEQ ID NO:75), GACAGGUUUGGCCCUAUCCU (SEQ ID NO:76), GAUCGUCAGCGCCGAGGCCU (SEQ ID NO:77), GGCUCAAACACAGCGACCUC (SEQ ID NO:78), UGAGGGUCUCGGCCACCUUC (SEQ ID NO:79), AGGCUUCUACCCCGACCACG (SEQ ID NO:80), CCGACCACGUGGAGCUGAGC (SEQ ID NO:81), UGACAGGUUUGGCCCUAUCC (SEQ ID NO:82), CUUGACAGCGGAAGUGGUUG (SEQ ID NO:83), AGAUCGUCAGCGCCGAGGCC (SEQ ID NO:84), GCGCUGACGAUCUGGGUGAC (SEQ ID NO:85), UGAGGGCGGGCUGCUCCUUG (SEQ ID NO:86), GUUGCGGGGGUUCUGCCAGA (SEQ ID NO:87), AGCUCAGCUCCACGUGGUCG (SEQ ID NO:88), GCGGCUGCUCAGGCAGUAUC (SEQ ID NO:89), GCGGGGGUUCUGCCAGAAGG (SEQ ID NO:90), UGGCUCAAACACAGCGACCU (SEQ ID NO:91), ACUGGACUUGACAGCGGAAG (SEQ ID NO:92), GACAGCGGAAGUGGUUGCGG (SEQ ID NO:93), GCUGUCAAGUCCAGUUCUAC (SEQ ID NO:94), GUAUCUGGAGUCAUUGAGGG (SEQ ID NO:95), CUCGGCGCUGACGAUCU (SEQ ID NO:96), CCUCGGCGCUGACGAUC (SEQ ID NO:97), CCGAGAGCCCGUAGAAC (SEQ ID NO:98), CCAGAUCGUCAGCGCCG (SEQ ID NO:99), GAAUGACGAGUGGACCC (SEQ ID NO:100), GGGUGACAGGUUUGGCCCUAUC (SEQ ID NO:101), GGUGACAGGUUUGGCCCUAUC (SEQ ID NO:102), GUGACAGGUUUGGCCCUAUC (SEQ ID NO:103), GACAGGUUUGGCCCUAUC (SEQ ID NO:104), GAUACUGCCUGAGCAGCCGCCU (SEQ ID NO:105), GACCACGUGGAGCUGAGCUGGUGG (SEQ ID NO:106), GUGGAGCUGAGCUGGUGG (SEQ ID NO:107), GGGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (SEQ ID NO:108), GGCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (SEQ ID NO:109), GCGGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (SEQ ID NO:110), GGGCUGCUCCUUGAGGGGCU (SEQ ID NO:111), GGCUGCUCCUUGAGGGGCU (SEQ ID NO:112), GCUGCUCCUUGAGGGGCU (SEQ ID NO:113), GGUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (SEQ ID NO:114), GUGAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (SEQ ID NO:115) и GAAUGGGAAGGAGGUGCACAG (SEQ ID NO:116).
167. Способ по п. 166, где gRNA имеет нацеливающий домен, содержащий последовательность GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (SEQ ID NO: 63).
168. Способ по любому из пп. 141-167, в котором Т-клетка представляет собой первичную Т-клетку, полученную от субъекта.
169. Способ по п. 168, в котором субъект страдает заболеванием или расстройством или таковое подозревается.
170. Способ по п. 168, в котором субъект здоров или предполагается, что он здоров.
171. Способ по любому из пп. 141-170, где Т-клетка представляет собой CD8+ Т-клетку или подтипы таковой.
172. Способ по любому из пп. 141-170, где Т-клетка представляет собой CD4+ Т-клетку или подтипы таковой.
173. Способ по любому из пп. 141-167, где Т-клетка получена из мультипотентной или плюрипотентной клетки, которая необязательно является iPSC.
174. Способ по любому из пп. 168-173, где Т-клетка содержит Т-клетку, которая является аутологичной по отношению к субъекту.
175. Способ по любому из пп. 168-173, где Т-клетка включает Т-клетку, которая является аллогенной по отношению к субъекту.
176. Способ по любому из пп. 141-175, где полинуклеотид содержится в вирусном векторе.
177. Способ по п.176, в котором вектор представляет собой вектор AAV, необязательно выбранный из векторов AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 или AAV8.
178. Способ по п.177, в котором вектор AAV представляет собой вектор AAV2 или AAV6.
179. Способ по любому из пп. 141-178, где рекомбинантный TCR способен связываться с антигеном, который ассоциирован, специфичен и/или экспрессируется на клетке или ткани, связанными с заболеванием, нарушением или состояние.
180. Способ по любому из пп. 144-179, где введение одного или более агентов, способных вызывать генетическое нарушение, и введение матричного полинуклеотида осуществляют одновременно или последовательно в любом порядке.
181. Способ по любому из пп. 144-180, где введение матричного полинуклеотида проводят после введения одного или более агентов, способных вызывать генетическое нарушение.
182. Способ по п.181, где матричный полинуклеотид вводят сразу после введения одного или более агентов, способных вызвать генетическое нарушение, или в течение приблизительно 30 секунд, 1 минуты, 2 минут, 3 минут, 4 минуты, 5 минут, 6 минут, 6 минут, 8 минут, 9. минут, 10 минут, 15 минут, 20 минут, 30 минут, 40 минут, 50 минут, 60 минут, 90 минут, 2 часа, 3 часа или 4 часа, необязательно приблизительно через 2 часа после введения одного или более агентов.
183. Способ по любому из пп. 141-182, в котором способ осуществляют на множестве Т-клеток.
184. Способ по п.183, где множество Т-клеток включает CD4+ Т-клетки, CD8+ Т-клетки или комбинацию CD4+ и CD8+ Т-клеток.
185. Способ по п.183 или 184, в котором множество Т-клеток включает CD4+ и CD8+ Т-клетки, а соотношение CD4+ к CD8+ Т-клеткам составляет от или приблизительно от 1:3 до или приблизительно до 3:1, необязательно от или приблизительно от 1:2 до или приблизительно до 2:1, необязательно 1:1 или около того.
in vitro
186. Способ по любому из пп. 142 и 144-185, где, перед введением одного или более агентов, способ включает инкубацию клеток  со стимулирующим агентом(ами) в условиях, необходимых для стимуляции или активации одной или более Т-клеток.
187. Способ по п.186, где стимулирующий агент(ы) содержит анти-CD3 и/или анти-CD28 антитела, необязательно в виде анти-CD3 и/или анти-CD28 гранул, где, необязательно, соотношение гранул к клеткам составляет или приблизительно составляет 1:1.
188. Способ по п.186 или 187, включающий удаление стимулирующего(их) агента(ов) из одной или нескольких иммунных клеток перед введением одного или более агентов.
189. Способ по любому из пп. 142 и 144-185, где способ дополнительно включает инкубацию клеток до, во время или после введения одного или более агентов и/или введения матричного полинуклеотида с одним или более рекомбинантным цитокином, где, необязательно, один или более рекомбинантных цитокинов выбраны из группы, состоящей из IL-2, IL-7 и IL-15.
190. Способ по п. 189, где один или более рекомбинантных цитокинов добавляют в концентрации, выбранной из концентрации IL-2 от или приблизительно от 10 Ед/мл до или приблизительно до 200 Ед/мл, необязательно, от или приблизительно от 50 Ед/мл до или приблизительно до 100 Ед/мл; IL-7 в концентрации от 0,5 нг/мл до 50 нг/мл, необязательно, от или приблизительно от 5 нг/мл до или приблизительно до 10 нг/мл и/или IL-15 в концентрации от 0,1 нг/мл до 20 нг/мл, необязательно, от или приблизительно от 0,5 нг/мл до или приблизительно до 5 нг/мл.
191. Способ по п. 189 или 190, где инкубацию проводят после введения одного или более агентов и введения матричного полинуклеотида в течение приблизительно 24 часов, 36 часов, 48 часов, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 дня, необязательно в течение до или приблизительно до 7 дней.
192. Способ по любому из пп. 141-191, где полинуклеотид составляет по меньшей мере или приблизительно 2500, 2750, 3000, 3250, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4760, 5000, 5250, 5500, 5750, 6000, 7000, 7500, 8000, 9000 или 10000 нуклеотидов в длину или любое значение между любыми из вышеперечисленных.
193. Способ по любому из пп. 141-192, где полинуклеотид составляет от или приблизительно от 2500 до или приблизительно до 5000 нуклеотидов, или от или приблизительно от 3500 до или приблизительно до 4500 нуклеотидов, или от или приблизительно от 3750 нуклеотидов и до или приблизительно до 4250 нуклеотидов в длину.
194. Сконструированная Т-клетка или множество сконструированных Т-клеток, полученные с использованием способа по любому из пп. 141-193.
195. Композиция, содержащая сконструированные Т-клетки или множество сконструированных клеток по п.194.
196. Композиция по п.95, содержащая CD4+ и/или CD8+ Т-клетки.
197. Композиция по п.95 или 196, где композиция содержит CD4+ и CD8+ Т-клетки, и где соотношение CD4+ к CD8+ Т-клеткам составляет от или приблизительно от 1:3 до 3:1, необязательно 1:1.
198. Композиция по любому из пп. 195-197, в которой:
по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сконструированных клеток композиции содержат генетическое нарушение в константной области гена альфа эндогенного Т-клеточного рецептора (TRAC) и/или в константной области гена бета Т-клеточного рецептора (TRBC); и/или
по меньшей мере 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% сконструированных клеток композиции не экспрессируют вообще или не экспрессируют поддающиеся обнаружению уровни продукта эндогенного гена TRAC или TRBC.
199. Композиция по любому из пп. 195-198, где не менее 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 90% клеток композиции экспрессируют рекомбинантный TCR и/или демонстрируют связывание с антигеном.
200. Способ лечения, включающий введение субъекту сконструированной клетки, множества сконструированных клеток или композиции по любому из пп. 194-199.
201. Применение сконструированной клетки, множества сконструированных клеток или композиции по любому из пп. 194-199 для лечения заболевания или нарушения.
202. Применение сконструированной клетки, множества сконструированных клеток или композиции по любому из пп. 194-199 в получении лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения.
203. Сконструированная клетка, множество сконструированных клеток или композиция по любому из пп. 194-199 для применения в лечении заболевания или нарушения.
204. Изделие , содержащее:
полинуклеотид по любому из пп. 69-94 или 117-140, и
один или более агентов, способных вызывать генетическое нарушение в целевом сайте в локусе TRAC.
205. Изделие, содержащее:
полинуклеотид, содержащий (а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую бета-цепь Т-клеточного рецептора (TCRβ), и часть альфа-цепи Т-клеточного рецептора (TCRα), причем эта часть меньше полноразмерной нативной цепи TCRα и (b) одно или более плеч гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, где одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или нескольким областям открытой рамки считывания локуса TRAC, где указанная открытая рамка считывания кодирует цепь TCRα; а также
один или более агентов, способных вызывать генетическое нарушение в целевом сайте в пределах локуса TRAC.
206. Изделие по п.05, где полинуклеотид содержит полинуклеотид по любому из пп. 69-94 или 117-140.
207. Изделие, содержащее:
полинуклеотид по любому из пп. 95-140, и
один или более агентов, способных вызывать генетическое нарушение в целевом сайте в пределах локуса TRBC.
208. Изделие, содержащее:
полинуклеотид, содержащий (а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую альфа-цепь Т-клеточного рецептора (TCRα) и часть цепи бета Т-клеточного рецептора (TCRβ), причем эта часть меньше, чем полноразмерная нативная цепь TCRβ, и (b) одно или более плеч гомологии, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, причем одно или более плеч гомологии содержат последовательность, гомологичную одной или нескольким областям открытой рамки считывания локуса TRBC, где указанная открытая рамка считывания кодирует цепь TCRβ; а также
один или более агентов, способных вызывать генетическое нарушение в целевом сайте в пределах локуса TRAC.
209. Изделие по п.207 или 208, где полинуклеотид содержит полинуклеотид по любому из пп. 95-140.
210. Набор, содержащий изделие по любому из пп. 204-209 и инструкции по применению.