МОЛЕКУЛЫ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ НЕВИРУСНОЙ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

1. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая первый инвертированный концевой повтор (ITR) и второй ITR, фланкирующие генную кассету, содержащую гетерологичную полинуклеотидную последовательность, где первый ITR и/или второй ITR содержат нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 или 188, или ее функциональное производное.
2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где первый ITR содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 180, и второй ITR содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 181.
3. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где первый ITR содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 183, и второй ITR содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 184.
4. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где первый ITR содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 185, и второй ITR содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 186.
5. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где первый ITR содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 187, и второй ITR содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 188.
6. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где первый ITR и/или второй ITR состоят из нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 или 188.
7. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где первый ITR и второй ITR представляют собой последовательности, обратно комплементарные друг другу.
8. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7, дополнительно содержащая промотор.
9. Молекула нуклеиновой кислоты по п.8, где промотор представляет собой тканеспецифический промотор.
10. Молекула нуклеиновой кислоты по п.8 или 9, где промотор управляет экспрессией гетерологичной полинуклеотидной последовательности в органе, выбранном из мышцы, центральной нервной системы (ЦНС), глаза, печени, сердца, почки, поджелудочной железы, легких, кожи, мочевого пузыря, мочевыводящих путей или любой их комбинации.
11. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-10, где промотор управляет экспрессией гетерологичной полинуклеотидной последовательности в гепатоцитах, эндотелиальных клетках, клетках сердечной мышцы, клетках скелетных мышц, синусоидальных клетках, афферентных нейронах, эфферентных нейронах, вставочных нейронах, глиальных клетках, астроцитах, олигодендроцитах, микроглии, эпендимальных клетках, эпителиальных клетках легкого, шванновских клетках, сателлитных клетках, фоторецепторных клетках, ганглиозных клетках сетчатки или любой их комбинации.
12. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11, где промотор расположен в направлении 5'-конца относительно гетерологичной полинуклеотидной последовательности.
13. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-12, где промотор выбран из группы, состоящей из промотора тиретина мыши (mTTR), эндогенного промотора фактора VIII человека (F8), промотора альфа-1-антитрипсина человека (hAAT), минимального промотора альбумина человека, промотора альбумина мыши, промотора тристетрапролина (TTP), промотора CASI, промотора CAG, промотора цитомегаловируса (CMV), промотора α1-антитрипсина (AAT), мышечной креатинкиназы (MCK), тяжелой цепи миозина альфа (αMHC), миоглобина (MB), десмина (DES), SPc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK, tMCK и фосфоглицераткиназы (PGK).
14. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-13, где гетерологичная полинуклеотидная последовательность дополнительно содержит интронную последовательность.
15. Молекула нуклеиновой кислоты по п.14, где интронная последовательность расположена в направлении 5'-конца относительно гетерологичной полинуклеотидной последовательности.
16. Молекула нуклеиновой кислоты по п.14 или 15, где интронная последовательность расположена в направлении 3'-конца относительно промотора.
17. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.14-16, где интронная последовательность содержит синтетическую интронную последовательность.
18. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.14-17, где интронная последовательность содержит SEQ ID NO: 115 или 192.
19. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-18, где генная кассета дополнительно содержит посттранскрипционный регуляторный элемент.
20. Молекула нуклеиновой кислоты по п.19, где посттранскрипционный регуляторный элемент расположен в направлении 3'-конца относительно гетерологичной полинуклеотидной последовательности.
21. Молекула нуклеиновой кислоты по п.19 или 20, где посттранскрипционный регуляторный элемент содержит мутантный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE), сайт связывания микроРНК, последовательность, направляющую ДНК к ядру, или любую их комбинацию.
22. Молекула нуклеиновой кислоты по п.21, где сайт связывания микроРНК содержит сайт связывания с miR142-3p.
23. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-22, где генная кассета дополнительно содержит 3'-UTR-последовательность поли(А)-хвоста.
24. Молекула нуклеиновой кислоты по п.23, где 3'-UTR-последовательность поли(A)-хвоста выбрана из группы, состоящей из поли(A) bGH, поли(A) актина, поли(A) гемоглобина и любой их комбинации.
25. Молекула нуклеиновой кислоты по п.23 или 24, где 3'-UTR-последовательность поли(А)-хвоста содержит поли(A) bGH.
26. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-25, где генная кассета дополнительно содержит энхансерную последовательность.
27. Молекула нуклеиновой кислоты по п.26, где энхансерная последовательность расположена между первым ITR и вторым ITR.
28. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-27, где молекула нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' до 3': первый ITR, генную кассету и второй ITR; где генная кассета содержит тканеспецифическую промоторную последовательность, интронную последовательность, гетерологичную полинуклеотидную последовательность, посттранскрипционный регуляторный элемент и 3'-UTR-последовательность поли(А)-хвоста.
29. Молекула нуклеиновой кислоты по п.28, где генная кассета содержит в направлении от 5' до 3': тканеспецифическую промоторную последовательность, интронную последовательность, гетерологичную полинуклеотидную последовательность, посттранскрипционный регуляторный элемент и 3'-UTR-последовательность поли(А)-хвоста.
30. Молекула нуклеиновой кислоты по п.28 или 29, где
(a) тканеспецифическая промоторная последовательность содержит промотор TTT;
(b) интрон представляет собой синтетический интрон;
(c) посттранскрипционный регуляторный элемент содержит WPRE; и
(d) 3'-UTR-последовательность поли(A)-хвоста содержит bGHpA.
31. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-30, где генная кассета содержит однонитевую нуклеиновую кислоту.
32. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-30, где генная кассета содержит двухнитевую нуклеиновую кислоту.
33. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-32, где гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует фактор свертывания крови, фактор роста, гормон, цитокин, антитело, его фрагмент или любую их комбинацию.
34. Молекула нуклеиновой кислоты по п.33, где гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует фактор роста, выбранный из группы, состоящей из адреномедуллина (AM), ангиопоэтина (Ang), аутокринного фактора подвижности, костного морфогенетического белка (BMP) (например,BMP2, BMP4, BMP5, BMP7), представителя семейства цилиарных нейротрофических факторов (например,цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), фактора ингибирования лейкоза (LIF), интерлейкина-6 (IL-6)), колониестимулирующего фактора (например,макрофагального колониестимулирующего фактора (m-CSF), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF)), эпидермального фактора роста (EGF), эфрина (например,эфрина A1, эфрина A2, эфрина A3, эфрина A4, эфрина A5, эфрина B1, эфрина B2, эфрина B3), эритропоэтина (EPO), фактора роста фибробластов (FGF) (например,FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23), фетального бычьего соматотропина (FBS), представителя семейства GDNF (например,нейротрофического фактора линии глиальных клеток (GDNF), нейротурина, персефина и артемина), фактора роста и дифференцировки-9 (GDF9), фактора роста гепатоцитов (HGF), фактора роста, происходящего из гепатомы (HDGF), инсулина, инсулиноподобных факторов роста (например,инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1) или IGF-2, интерлейкина (IL) (например,IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7), фактора роста кератиноцитов (KGF), фактора, стимулирующего миграцию (MSF), белка, стимулирующего макрофаги (MSP или белка, подобного фактору роста гепатоцитов (HGFLP)), миостатина (GDF-8), нейрегулина (например,нейрегулина 1 (NRG1), NRG2, NRG3, NRG4), нейротрофина (например,нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), фактора роста нервов (NGF), нейротрофина-3 (NT-3), NT-4, плацентарного фактора роста (PGF), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), реналазы (RNLS), фактора роста Т-клеток (TCGF), тромбопоэтина (TPO), трансформирующего фактора роста (например,трансформирующего фактора роста-альфа (TGF-α), TGF-β, фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и любой их комбинации.
35. Молекула нуклеиновой кислоты по п.33, где гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует гормон.
36. Молекула нуклеиновой кислоты по п.33, где гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует цитокин.
37. Молекула нуклеиновой кислоты по п.33, где гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует антитело или его фрагмент.
38. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-32, где гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует ген, выбранный из X-сцепленного дистрофина, MTM1 (миотубулярина), тирозингидроксилазы, AADC, циклогидролазы, SMN1, FXN (фратаксина), GUCY2D, RS1, CFH, HTRA, ARMS, CFB/CC2, CNGA/CNGB, Prf65, ARSA, PSAP, IDUA (MPS I), IDS (MPS II), PAH, GAA (кислой альфа-глюкозидазы) и любой их комбинации.
39. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-32, где гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует микроРНК (miRNA).
40. Молекула нуклеиновой кислоты по п.39, где miRNA понижает экспрессию целевого гена, выбранного из SOD1, HTT, RHO и любой их комбинации.
41. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-32, где гетерологичная полинуклеотидная последовательность кодирует фактор свертывания крови, выбранный из группы, состоящей из фактора I (FI), фактора II (FII), фактора III (FIII), фактора IV (FVI), фактора V (FV), фактора VI (FVI), фактора VII (FVII), фактора VIII (FVIII), фактора IX (FIX), фактора X (FX), фактора XI (FXI), фактора XII (FXII), фактора XIII (FVIII), фактора фон Виллебранда (VWF), прекалликреина, высокомолекулярного кининогена, фибронектина, антитромбина III, кофактора II гепарина, белка C, белка S, белка Z, ингибитора протеазы, связанного с белком Z (ZPI), плазминогена, альфа-2-антиплазмина, тканевого активатора плазминогена (tPA), урокиназы, ингибитора-1 активатора плазминогена (PAI-1), ингибитора-2 активатора плазминогена (PAI2) и любой их комбинации.
42. Молекула нуклеиновой кислоты по п.41, где фактор свертывания крови представляет собой FVIII.
43. Молекула нуклеиновой кислоты по п.42, где FVIII содержит полноразмерный зрелый FVIII.
44. Молекула нуклеиновой кислоты по п.43, где FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, имеющей SEQ ID NO: 106.
45. Молекула нуклеиновой кислоты по п.42, где FVIII содержит домен A1, домен A2, домен A3, домен C1, домен C2 и частичный домен B или вообще не содержит его.
46. Молекула нуклеиновой кислоты по п.45, где FVIII содержит аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:109.
47. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.41-46, где фактор свертывания крови содержит гетерологичный компонент.
48. Молекула нуклеиновой кислоты по п.47, где гетерологичный компонент выбран из группы, состоящей из альбумина или его фрагмента, Fc-области иммуноглобулина, C-концевого пептида (CTP) β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, последовательности PAS, последовательности HAP, трансферрина или его фрагмента, альбумин-связывающего компонента, их производного или любой их комбинации.
49. Молекула нуклеиновой кислоты по п.47 или 48, где гетерологичный компонент связан с N-концом или C-концом FVIII или вставлен между двумя аминокислотами в FVIII.
50. Молекула нуклеиновой кислоты по п.49, где гетерологичный компонент вставлен между двумя аминокислотами в одном или нескольких сайтах вставки, выбранных из сайтов вставки, перечисленных в таблице 4.
51. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.42-50, где FVIII дополнительно содержит домен A1, домен A2, домен C1, домен C2, необязательный домен B и гетерологичный компонент, где гетерологичный компонент вставлен непосредственно ниже аминокислоты 745, соответствующей зрелому FVIII (SEQ ID NO:106).
52. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.49-51, где FVIII дополнительно содержит партнера по связыванию FcRn.
53. Молекула нуклеиновой кислоты по п.52, где партнер по связыванию FcRn содержит Fc-область константного домена иммуноглобулина.
54. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.42-53, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая FVIII, является кодон-оптимизированной.
55. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.42-54, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая FVIII, является кодон-оптимизированной для экспрессии у человека.
56. Молекула нуклеиновой кислоты по п.55, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая FVIII, содержит нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 107.
57. Молекула нуклеиновой кислоты по п.55, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая FVIII, содержит нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 71.
58. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-53, где гетерологичная полинуклеотидная последовательность является кодон-оптимизированной.
59. Молекула нуклеиновой кислоты по п.58, где гетерологичная полинуклеотидная последовательность является кодон-оптимизированной для экспрессии у человека.
60. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-59, где молекула нуклеиновой кислоты составлена со средством доставки.
61. Молекула нуклеиновой кислоты по п.60, где средство доставки содержит липидную наночастицу.
62. Молекула нуклеиновой кислоты по п.60, где средство доставки выбрано из группы, состоящей из липосом, нелипидных полимерных молекул и эндосом и любой их комбинации.
63. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-62, где молекула нуклеиновой кислоты составлена для внутривенной, чрескожной, внутрикожной, подкожной, легочной или пероральной доставки или любой их комбинации.
64. Молекула нуклеиновой кислоты по п.63, где молекула нуклеиновой кислоты составлена для внутривенной доставки.
65. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-59.
66. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-59.
67. Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-59 или вектор по п.65 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
68. Фармацевтическая композиция, содержащая клетку-хозяина по п.66 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
69. Набор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-59 и инструкции для введения молекулы нуклеиновой кислоты нуждающемуся в этом субъекту.
70. Бакуловирусная система для продуцирования молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-59.
71. Бакуловирусная система по п.70, где молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-59 продуцируется в клетках насекомых.
72. Система доставки на основе наночастиц, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-59.
73. Способ получения полипептида, включающий культивирование клетки-хозяина по п.66 в подходящих условиях и извлечение полипептида.
74. Способ получения полипептида со свертывающей активностью, включающий культивирование клетки-хозяина по п.66 в подходящих условиях и извлечение полипептида со свертывающей активностью.
75. Способ обеспечения экспрессии гетерологичной полинуклеотидной последовательности у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-59, вектора по п.65 или фармацевтической композиции по п.67.
76. Способ обеспечения экспрессии фактора свертывания крови у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.41-57, вектора по п.65, полипептида по п.74 или фармацевтической композиции по п.67.
77. Способ лечения заболевания или нарушения у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-59, вектора по п.65 или фармацевтической композиции по п.67.
78. Способ лечения субъекта, имеющего дефицит фактора свертывания крови, включающий введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.41-57, вектора по п.65, полипептида по п.74 или фармацевтической композиции по п.67.
79. Способ лечения дефицита фактора свертывания крови у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.41-57, вектора по п.65, полипептида по п.74 или фармацевтической композиции по п.67.
80. Способ по п.78 или 79, где молекулу нуклеиновой кислоты вводят внутривенно, чрескожно, внутрикожно, подкожно, перорально, посредством легочного пути или с помощью любой их комбинации.
81. Способ по п.80, где молекулу нуклеиновой кислоты вводят внутривенно.
82. Способ по любому из пп.78-81, дополнительно включающий введение субъекту второго средства.
83. Способ по любому из пп.78-82, где субъект является млекопитающим.
84. Способ по любому из пп.78-83, где субъект является человеком.
85. Способ по любому из пп.78-84, где введение молекулы нуклеиновой кислоты субъекту приводит к увеличению активности FVIII относительно активности FVIII у субъекта до введения, где активность FVIII увеличивается в по меньшей мере приблизительно 2 раза, по меньшей мере приблизительно 3 раза, по меньшей мере приблизительно 4 раза, по меньшей мере приблизительно 5 раз, по меньшей мере приблизительно 6 раз, по меньшей мере приблизительно 7 раз, по меньшей мере приблизительно 8 раз, по меньшей мере приблизительно 9 раз, по меньшей мере приблизительно 10 раз, по меньшей мере приблизительно 11 раз, по меньшей мере приблизительно 12 раз, по меньшей мере приблизительно 13 раз, по меньшей мере приблизительно 14 раз, по меньшей мере приблизительно 15 раз, по меньшей мере приблизительно 20 раз, по меньшей мере приблизительно 25 раз, по меньшей мере приблизительно 30 раз, по меньшей мере приблизительно 35 раз, по меньшей мере приблизительно 40 раз, по меньшей мере приблизительно 50 раз, по меньшей мере приблизительно 60 раз, по меньшей мере приблизительно 70 раз, по меньшей мере приблизительно 80 раз, по меньшей мере приблизительно 90 раз или по меньшей мере приблизительно 100 раз.
86. Способ по любому из пп.78-85, где у субъекта имеется нарушение свертываемости крови.
87. Способ по п.86, где нарушение свертываемости крови представляет собой гемофилию.
88. Способ по п.86 или 87, где нарушение свертываемости крови представляет собой гемофилию A.
89. Способ лечения нарушения свертываемости крови у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей первый инвертированный концевой повтор (ITR) и второй ITR, фланкирующие генную кассету, содержащую гетерологичную полинуклеотидную последовательность, кодирующую фактор свертывания крови, где первый ITR и/или второй ITR содержат нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 или 188, или ее функциональное производное.
90. Способ лечения гемофилии А у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей первый инвертированный концевой повтор (ITR) и второй ITR, фланкирующие генную кассету, содержащую гетерологичную полинуклеотидную последовательность, кодирующую фактор VIII (FVIII), где первый ITR и/или второй ITR содержат нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 или 188, или ее функциональное производное.
91. Способ лечения метаболического нарушения печени у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей первый инвертированный концевой повтор (ITR) и второй ITR, фланкирующие генную кассету, содержащую гетерологичную полинуклеотидную последовательность, кодирующую ассоциированный с печенью метаболический фермент, дефицит которого наблюдается у субъекта, где первый ITR и/или второй ITR представляют собой ITR вируса, отличного от аденоассоциированного вируса (вируса, отличного от AAV).
92. Способ по п.91, где первый ITR и/или второй ITR содержат нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 или 188, или ее функциональное производное.
93. Способ лечения метаболического нарушения печени у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей первый инвертированный концевой повтор (ITR) и второй ITR, фланкирующие генную кассету, содержащую гетерологичную полинуклеотидную последовательность, кодирующую ассоциированный с печенью метаболический фермент, дефицит которого наблюдается у субъекта, где первый ITR и/или второй ITR содержат нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 или 188, или ее функциональное производное.
94. Способ по любому из пп.91-93, где генная кассета содержит однонитевую нуклеиновую кислоту.
95. Способ по любому из пп.91-93, где генная кассета содержит двухнитевую нуклеиновую кислоту.
96. Способ по любому из пп.91-95, где метаболическое нарушение печени выбрано из группы, состоящей из фенилкетонурии (PKU), заболевания, связанного с циклом мочевины, лизосомной болезни накопления и болезни накопления гликогена.
97. Способ по п.96, где метаболическое нарушение печени представляет собой фенилкетонурию (PKU).
98. Способ по любому из пп.91-97, где молекулу нуклеиновой кислоты вводят внутривенно, чрескожно, внутрикожно, подкожно, перорально, посредством легочного пути или любой их комбинацией.
99. Способ по п.98, где молекулу нуклеиновой кислоты вводят внутривенно.
100. Способ по любому из пп.91-99, дополнительно включающий введение субъекту второго средства.
101. Способ по любому из пп.91-100, где субъект является млекопитающим.
102. Способ по любому из пп.91-101, где субъект является человеком.
103. Способ лечения фенилкетонурии (PKU) у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей первый инвертированный концевой повтор (ITR) и второй ITR, фланкирующие генную кассету, содержащую гетерологичную полинуклеотидную последовательность, кодирующую фенилаланингидроксилазу, где первый ITR и/или второй ITR содержат нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 или 188, или ее функциональное производное.
104. Способ по п.103, где генная кассета содержит однонитевую нуклеиновую кислоту.
105. Способ по п.103, где генная кассета содержит двухнитевую нуклеиновую кислоту.
106. Способ по любому из пп.103-105, где молекула нуклеиновой кислоты составлена со средством доставки.
107. Способ по п.106, где средство доставки содержит липидную наночастицу.
108. Способ клонирования молекулы нуклеиновой кислоты, включающий вставку молекулы нуклеиновой кислоты, способной к образованию сложных вторичных структур, в подходящий вектор и введение полученного вектора в штамм бактерии-хозяина, характеризующийся нарушением в комплексе SbcCD.
109. Способ по п.108, где нарушение в комплексе SbcCD включает генетическое нарушение в гене SbcC и/или гене SbcD.
110. Способ по п.108 или 109, где нарушение в комплексе SbcCD включает генетическое нарушение в гене SbcC.
111. Способ по п.108 или 109, где нарушение в комплексе SbcCD включает генетическое нарушение в гене SbcD.
112. Способ по любому из пп.108-111, где молекула нуклеиновой кислоты содержит первый инвертированный концевой повтор (ITR) и второй ITR, где первый и/или второй ITR представляют собой ITR вируса, отличного от аденоассоциированного вируса (вируса, отличного от AAV).
113. Способ по любому из пп.108-112, где первый ITR и/или второй ITR содержат нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 или 188, или ее функциональное производное.
114. Способ по любому из пп.108-113, где молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит генную кассету, где генная кассета фланкирована первым ITR и вторым ITR.
115. Способ по п.114, где генная кассета содержит гетерологичную полинуклеотидную последовательность.
116. Способ по любому из пп.108-115, где подходящий вектор представляет собой низкокопийный вектор.
117. Способ по любому из пп.108-115, где подходящий вектор представляет собой pBR322.
118. Способ по любому из пп.108-117, где штамм бактерии-хозяина не способен к расщеплению крестообразных структур ДНК.
sbcC, recD, mcrA, ΔmcrBCF
119. Способ по любому из пп.108-117, где штамм бактерии-хозяина представляет собой PMC103, содержащий генотип .
recBC, recJ, sbcBC, mcrA, ΔmcrBCF
120. Способ по любому из пп.108-117, где штамм бактерии-хозяина представляет собой PMC107, содержащий генотип .
recB, recJ, sbcC, mcrA, ΔmcrBCF, umuC, uvrC
121. Способ по любому из пп.108-117, где штамм бактерии-хозяина представляет собой SURE, содержащий генотип .
122. Способ клонирования молекулы нуклеиновой кислоты, включающий вставку молекулы нуклеиновой кислоты, способной к образованию сложных вторичных структур, в подходящий вектор и введение полученного вектора в штамм бактерии-хозяина, содержащий нарушение в комплексе SbcCD, где молекула нуклеиновой кислоты содержит первый инвертированный концевой повтор (ITR) и второй ITR, где первый ITR и/или второй ITR содержат нуклеотидную последовательность, которая на по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или 100% идентична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187 или 188, или ее функциональное производное.