Генетическая конструкция для повышения радиационной устойчивости культуры клеток насекомого P. vanderplanki
GENETIC STRUCTURE FOR INCREASING RADIATION RESISTANCE OF INSECT CELL CULTURE P. VANDERPLANKI

Изобретение относится к области молекулярной биологии, сравнительной геномики или радиобиологии. Более детально, предполагаемое изобретение относится к области получения генетической конструкции с последовательностью гена, обуславливающей радиационную устойчивость клеток насекомого Polypedilum vanderplanki, которая в составе разрабатываемой биотехнологии может быть использована для получения и хранения биотехнологических продуктов в условиях повышенного радиационного фона.
Разработанное техническое решение в целом нацелено на создание радиационной устойчивости генетической конструкции с использованием известных как таковых технологий, т.е. известными методами модификации механизмов абиотической толерантности клеток насекомого Polypedilum vanderplanki посредством повышенной экспрессии белка данного насекомого, обуславливающего радиоустойчивость. Разрабатываемая биотехнология предполагает модификацию метода получения биоматериалов в клетках Polypedilum vanderplanki и их последующего безводного хранения для возможности использования в условиях повышенного радиационного фона. Сущностью предлагаемого подхода является разработка генетической конструкции, содержащей в своем составе ген, кодирующий белок HSP20 насекомого Polypedilum vanderplanki.
В настоящее время существует насущная необходимость в области хранения биоматериалов – существующие технологии, например, криохранение, использование консервантов на дату подачи заявленного технического решения исчерпали возможности улучшения и не удовлетворяют потребностей общества по ряду причин, например – по сложности, дороговизне и низкой эффективности хранения биоматериалов, применяемых для широкого круга решения проблем здравоохранения и биотехнологий.
Разработанное техническое решение в целом нацелено на создание нового метода хранения биоматериала посредством сохранения рекомбинантных белков в составе культуры клеток насекомого Polypedilum vanderplanki, способных к выживанию без воды (ангидробиозу). Разрабатываемая на указанном явлении ангидробиоза биотехнология предполагает резкое удешевление хранения биоматериала (например, белков) и независимость от глубокой заморозки.
Из исследованного уровня техники известно, что способность личинок Polypedilum vanderplanki (Chironomidae) выдерживать полное высыхание – естественный пример адаптации к экстремальным условиям среды. При ангидробиозе личинки теряют до 99,2% воды и остаются в сухом виде, сохраняя способность восстанавливать активность вскоре после регидратации [Gusev O. et al. Comparative genome sequencing reveals genomic signature of extreme desiccation tolerance in the anhydrobiotic midge // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 5. P. 4784] [1]. В обезвоженном состоянии личинки переносят самые разные абиотические стрессы, в том числе высокие радиационные воздействия (гамма-лучи 60Co 7000Гр) [Watanabe M. et al. Biological effects  of anhydrobiosis  in  an  African  chironomid,  Polypedilum
vanderplanki on radiation tolerance // Int. J. Radiat. Biol. 2006. Vol. 82. P. 587–592] [2]. Способность противостоять радиационному излучению важна для исследования молекулярного механизма повреждения ДНК и содействует развитию ДНК-технологий, а также может применяться в области защиты окружающей среды и здоровья человека.
Культура клеток Pv11 (хранится в лаборатории проф. Кикавады, Национальный Институт Агробиологических наук, Цукуба, Япония), выделенных из P. vanderplanki, является менее устойчивой к радиации, по сравнению с личинкой P. vanderplanki. Данное свойство культуры ограничивает применимость технологии безводного хранения биоматериалов, основанной на использовании клеток Pv11. Указанная биотехнология предполагает получение биоматериалов в клетках Pv11 с использованием ранее разработанной генетической конструкции [патент RU 2626590] [3] и последующее их хранение в высушенных клетках Pv11, которые обладают способностью переносить полное обезвоживание и сохранять свойства находящихся в них биомолекул, например – белков и ДНК.
Известно изобретение по патенту CN103911318 «Radiation resistant Rhodobacter shamoensis W402, and applications thereof» (Радиационно-стойкая Rhodobacter shamoensis W402 и ее применение) [4]. Сущностью  является штамм красной бактерии (Rhodobacter shamoensis) – регистрационный номер депозита - CGMCC № 8817. Изобретение относится к технической области микробиологии и описывает новый штамм, выделенный из почвы ризосферы Красной ивы в пустыне Таклимакан в Сицзянь-Уйгурском автономном регионе Китая. Данный штамм демонстрирует радиорезистентность и может быть использован для модификации (ремедиации) окружающей среды, а также для конструирования генетически модифицированных организмов. В описании приведены основные свойства штамма,  представляющего собой палочковидные бактерии с лимонно-желтыми рельефными, влажными колониями, аккуратно окаймленными, без внеклеточных выделений на агаризованной среде LB. По отношению к кислороду штамм строго аэробный, грамотрицательный, неподвижный, неавтотрофный. Может утилизировать глюкозу, лактозу, галактозу, фруктозу, L-рамнозу, L-аланин, D-маннозу в качестве источников углерода, но не L-трегалозу, сахарозу, D-целлобиозу, D-мед Дисахариды и α-циклодекстрин. Оптимальная температура роста составляет 30 °С. Филогенетический анализ, проведенный на основании секвенирования 16S РНК радиационно-устойчивого штамма, описываемого в настоящем изобретении, продемонстрировал значительные отличия от других видов того же рода (сходство <96%).
Недостатком известного технического решения является неприменимость для условий повышенного воздействия ионизирующего излучения, поскольку в изобретении рассмотрена устойчивость к ультрафиолетовому излучению.
Известно изобретение по патенту KR101556508B1 «Escherichia coli with enhanced stress tolerance by introducing protein of radiation resistance microorganism» (Escherichia coli с повышенной стрессоустойчивостью за счет введения белка радиационно-устойчивого микроорганизма) [5]. Сущностью является рекомбинантная Escherichia coli, видоизмененная кислотоустойчивым и устойчивым к высоким температурам геном, трансформированная путем введения гена, полученного из Deinococcus Radiodurans R1, кодирующего аминокислотную последовательность белка DR_1558, показанного в SEQ ID NO. Настоящее изобретение относится к экологически устойчивой E.  coli, трансформированной геном белка, полученного из устойчивого к радиации микроорганизма, Deinococcus radiodurans R1, и к способу его получения. Кроме того в изобретении говорится о возможности получить экологически устойчивый штамм, применяя метод к другим промышленным штаммам микроорганизмов, кроме Escherichia coli.
Недостатком известного технического решения является неприменимость штамма для использования  в условиях повышенного радиационного фона, поскольку в изобретении в качестве сфер применимости метода указаны только кислотный, окислительный, солевой и тепловой стрессы.
Известно изобретение по патенту CN101481672B «Radiation resistant microbacterium and use thereof» (Радиационно-стойкие микробактерии и их применение) [6]. Сущностью  является радиационно-стойкая микробактерия (Microbacterium radiodurans) GIMN1.002 - регистрационный номер депозита - CCTCC No.M208212. Изобретение раскрывает радиорезистентную бактерию Microbacterium radiodurans и ее способность противостоять ультрафиолетовому излучению.
Недостатком известного технического решения является неприменимость для повышения радиационной  устойчивости иных клеток, поскольку в изобретении описаны лишь штаммы микроорганизма Microbacterium radiodurans  и не описаны способы увеличения радиационной устойчивости иных клеток.
Известно изобретение по патенту CN101696414B «Gene capable of improving radiation resistance of organisms and application thereofs» (Ген, способный повышать радиационную стойкость организмов, и его применение) по совокупности совпадающих признаков наиболее близкое к заявляемому техническому решению и принятое в качестве прототипа [7]. Сущностью  прототипа является ген, который улучшает устойчивость к ионизирующим лучам и к ультрафиолетовому излучению, его последовательность ДНК показана в SEQ ID: 1.  Согласно прототипу,  реконструированный носитель содержит нуклеотидную последовательность, способную улучшить способность организмов противостоять ионизирующему излучению и ультрафиолетовому излучению. В результате исследования заявителем реконструированного штамма выявлена повышенная стойкость к ионизирующему излучению и ультрафиолетовому излучению.
Недостатком прототипа является невозможность применения гена, выделенного из прокариотического  организма, для повышения радиационной устойчивости клеточной культуры хирономиды P. vanderplanki (клеток Pv11).
Целью и техническим результатом заявленного технического решения
является создание генетической конструкции, обеспечивающей повышение радиационной устойчивости клеточной культуры хирономиды P. vanderplanki (клеток Pv11).
Сущностью заявленного технического решения
является генетическая конструкция для повышения радиационной устойчивости культуры клеток насекомого P. vanderplanki, включающая выделенный из последовательности ДНК Polypedilum vanderplanki ген, кодирующий белок HSP20, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID: 1, встроенный в генетическую конструкцию pcDNA5/FRT
Заявленная цель достигается тем, что в клетки Pv11 вводят белок HSP20 с указанной аминокислотной последовательности путём экспрессии содержащей ген HSP20 насекомого Polypedilum vanderplanki генетической конструкции.
Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг. 1 – Фиг. 5.
Фиг. 1 – Нуклеотидная последовательность гена белка HSP20.
Фиг. 2 – Нуклеотидные последовательности праймеров (коротких фрагментов ДНК) для получения кодирующего белок HSP20 гена.
Фиг. 3 – Физическая карта генетической  конструкции pcDNA5/FRT- HSP20, где: 1 – промотор CMV;  2 – промотор T7; 3 – распознаваемый ферментом BamHI участок;   4 – ген HSP20;  5 –распознаваемый ферментом XhoI участок,;  6 – участок полиаденилирования;  7 – ген устойчивости к антибиотику гигромицин; 8 – участок полиаденилирования; 9 – точка начала репликации PUC;    10 – ген устойчивости к антибиотику ампициллин.
Фиг. 4 – Нуклеотидные последовательности праймеров, используемых для ПЦР клонов E.coli.
Фиг. 5 – Кривая выживаемости культур клеток, где:
– по оси ординат приведена доля γ излучения (Гр),
– по оси абсцисс приведена доля выживаемости,
– кривая 5-1 – культуры клеток Pv11 с конструкцией pcDNA5/FRT-HSP20),
– кривая 5-2 – культуры клеток Pv11 с конструкцией pcDNA5/FRT.
Далее заявителем приведено осуществление заявленного технического решения
, которое  демонстрируется следующим примером.
ПРИМЕР, демонстрирующий технологию  получения генетической конструкции, включающей аминокислотную последовательность белка HSP20.
1 - Берут белок теплового шока HSP20 Polypedilum vanderplanki, выбранный из уровня техники [Gusev O. et al. Expression of heat shock protein-coding genes associated with anhydrobiosis in an African chironomid Polypedilum vanderplanki. Cell Stress Chaperones. 2011;16:81–90. doi: 10.1007/s12192-010-0223-9] [8], как активно участвующий белок в долгосрочной адаптации беспозвоночных к условиям абиотического стресса, в том числе дефицита воды, окислительного стресса и высоких  доз ионизирующего излучения.
2 - Получают экземпляры насекомого Polypedilum vanderplanki, например – путем культивирования в лабораторных условиях.
3 - Из P. vanderplanki выделяют общую ДНК, например – с использованием коммерческого набора Nucleospin tissue kit (производства фирмы Macherey Nagel, Германия). Нуклеотидная последовательность белка HSP20 приведена на Фиг. 1.
4 - Получают Специфический фрагмент ДНК c гéном, кодирующим белок HSP20 (гéном HSP20), например, в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием общей ДНК P. vanderplanki в качестве матрицы. Для ПЦР (здесь и далее в тексте) используют высокоточную полимеразу, например – полимеразу Q5 производства фирмы New England Biolabs, США, и праймеры (короткие фрагменты ДНК), например – с последовательностью по  Фиг. 2 (I, II).
5 - Фрагмент ДНК с гéном HSP20 встраивают в генетическую конструкцию, обеспечивающую экспрессию генов в соответствующих живых клетках. Например, фрагмент ДНК с гéном HSP20 встраивают в генетическую конструкцию pcDNA5/FRT (производства фирмы Invitrogen, США) с использованием ферментов BamHI, XhoI и T4 лигазы (производства фирмы New England Biolabs, США) в стандартных условиях  в  соответствии  с   рекомендациями  производителей.  По  завершении встраивания получают генетическую конструкцию pcDNA5/FRT-HSP20,  Фиг. 3.
6 - Полученную генетическую конструкцию с геном HSP20, например –  конструкцию pcDNA5/FRT-HSP20 используют для трансфекции (введения ДНК в клетки) ранее выделенной из насекомого Polypedilum vanderplanki [Nakahara Y. et al. Cells from an anhydrobiotic chironomid survive almost complete desiccation // Cryobiology. Elsevier Inc., 2010. Vol. 60, № 2. P. 138–146] [9] культуры клеток Pv11.  Жизнеспособность культуры клеток Pv11 должна составлять не менее 90% при определении окраской трипановым синим – это условие обеспечивают использованием культуры клеток Pv11 в логарифмической фазе роста.
7 - Осуществляют трансфекцию, например, с использованием прибора NEPA21 (фирмы NepaGene, Япония) стандартным методом электропорации [Cohen S.N. et al. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1973. Vol. 70, № 11. P. 3240–3244] [10], основанном на подаче импульсов электрического тока на суспензию клеток с внесённой генетической конструкцией.
8 - Далее выявляют оптимальную плотность суспензии клеток Pv11 – при трансфекции составляет   10 млн. клеток/мл, концентрация генетической конструкции в суспензии клеток 1 мкг/мл.  Параметры импульсов электрического тока устанавливают, например, в соответствии с Таблицей. Работу с прибором осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя.
Таблица.
Параметры импульсов  электрического тока для трансфекции культуры клеток  Pv11 конструкцией  pcDNA5/FRT-HSP20
Этапы трансфекции
Напряжение импульсов электрического тока, В
Длительность импульсов электрического тока, с
Интервал между импульсами электрического тока, с
Число импульсов электрического тока
Этап 1
25
0,04
0,05
6
Этап 2
20
0,05
0,05
5
В контрольном варианте трансфекцию культуры клеток Pv11 осуществляют с использованием стандартной генетической конструкции pcDNA5/FRT – вместо используемой в заявляемом техническом решении конструкции pcDNA5/FRT-HSP20. Конструкция pcDNA5/FRT содержит все элементы генетической конструкции pcDNA5/FRT-HSP20, за исключением гена HSP20.
9 - Полученную генетическую конструкцию pcDNA5/FRT-HSP20 вводят в клетки E.coli (выполняют трансфекцию), например – с использованием известного способа теплового шока, например – при температуре плюс  42°C, в течение 45 сек.
10 - После завершения трансфекции клетки E.coli рассевают на чашке Петри, например – с известной питательной средой LB, с добавлением агара и антибиотика, например – канамицина (50 мкг/мл).
11 - Посев культивируют, например – в течение 24 ч при температуре  плюс 37 °C.
12 - После культивации отбирают и сохраняют несколько клонов E.coli.
13 - Убеждаются в наличии конструкции  pcDNA5/FRT-HSP20 в клонах E.coli.
14 - Для этого проводят ПЦР отобранных клонов E.coli,  используя праймеры в соответствии с  Фиг. 4, на которой представлены нуклеотидные последовательности праймеров, используемых для ПЦР клонов E.coli.
15 - Наличие конструкции  pcDNA5/FRT-HSP20 в клоне E.coli определяют по наличию продуктов ПЦР, визуально подтверждённому при электрофорезе в агарозном геле с окрашиванием ДНК специфическим красителем, например – красителем этидиум бромид.
16 - Берут один из содержащих конструкцию pcDNA5/FRT-HSP20 клонов E.coli  (любой) вносят в 50 мл известной жидкой питательной среды LB и культивируют 10 часов на качалке, например – при температуре плюс 37,0 °C.
17 - Далее культура используется для измерения выживаемости под воздействием ионизирующих лучей.
18 - Получают бактериальную жидкость, центрифугируют, дважды промывают фосфорно-кислотным буфером (10 мМ, pH 7,0), ресуспендируют в фосфорно-кислотном буфере, суспензию клеток помещают в  установку и-гамма-излучения, проводят ионизирующее излучение, доза облучения составляет 50Гр и 100Гр.
19 - В контрольном варианте осуществляют аналогичную процедуру с использованием стандартной генетической конструкции pcDNA5/FRT.
20 - Выполняют проверку того, что конструкция pcDNA5/FRT содержит все элементы генетической конструкции pcDNA5/FRT-HSP20, за исключением гена HSP20.
21 - Далее наблюдают уровень выживаемости клеток у культуры с конструкцией pcDNA5/FRT-HSP20 с устойчивостью к ионизирующим лучам и контрольной культурой. Результат приведен на Фиг. 5., где по оси ординат приведена доля γ излучения (Гр), а на оси абсцисс приведена доля выживаемости. Анализ данных, представленных на Фиг.5,  позволяет сделать вывод о том, что по сравнению с кривой 5-1 (культуры клеток Pv11 с конструкцией pcDNA5/FRT-HSP20) кривая 5-2 (культуры клеток Pv11 с конструкцией pcDNA5/FRT) более крутая, из чего следует, что заявленная генетическая конструкция является в 4 раза более устойчивой к радиации по сравнению с прототипом.
Таким образом, использование заявленная генетическая конструкция, полученной описанным выше способом, позволяет достичь повышения радиационной устойчивости клеток Pv11. Клетки Pv11, экспрессирующие белок HSP-20.  Заявленная генетическая конструкция может быть использована для получения и/или применения биотехнологических продуктов (например, ферментов) в условиях повышенного радиационного фона. Повышение радиационной устойчивости обеспечивает более эффективный синтез биотехнологических продуктов и/или продление срока их действия за счёт увеличения выживаемости клеток Pv11.
Приведенный пример осуществления заявленного изобретения показывает его более высокую радиционную устойчивость, что продемонстрировано на Фиг.5 с использованием стандартного оборудования и материалов,  полезность для применения в биотехнологиях, например – для получения используемых в аналитической деятельности и диагностике инактивируемых обезвоживанием ферментов.
достигнуты поставленные цели и заявленный технический результат
На основании изложенного выше можно сделать вывод, что заявителем , а именно - создана генетическая конструкция, обеспечивающая повышение радиационной устойчивости клеточной культуры хирономиды P. vanderplanki (клеток Pv11).
Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как при определении уровня техники не выявлены средства, которым присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле предполагаемого изобретения, включая характеристику назначения.
Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», т.к. не является очевидным для специалиста в данной области техники и из исследованного уровня техники заявителем не выявлены технические решения, совпадающие по технической сущности с предлагаемым решением, и не установлена известность влияния отличительных признаков на полученный технический результат.
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ
[1] Gusev O. et al. Comparative genome sequencing reveals genomic signature of extreme desiccation tolerance in the anhydrobiotic midge // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 5. P. 4784.
[2] Watanabe M. et al. Biological effects of anhydrobiosis in an African chironomid, Polypedilum vanderplanki on radiation tolerance // Int. J. Radiat. Biol. 2006. Vol. 82. P. 587–592.
[3] Патент RU 2626590 С2 МПК-2015.01 C12N 15/00 C12N 15/79 C12N 15/63. Приоритет от 18.12.2015. Опубл. 22.06.2017. Описание изобретения.
[4] Патент CN 103911318 A 2006.01 C12N 1/20 A01H 5/00 C12R 1/01. Приоритет от 07.03.2014. Опубл. 13.01.2016. Описание изобретения.
[5] Патент KR 101556508 B1 2006.01 C12N 1/21 C12N 1/19 C12N 15/31. Приоритет от 05.12.2013. Опубл. 02.10.2015. Описание изобретения.
[6] Патент CN 101481672 B 2006.01 C12N 1/20 C12R 1/01. Приоритет от 22.01.2009. Опубл. 01.12.2010. Описание изобретения.
[7] Патент CN 101696414 B 2006.01 C12N 15/31 C07K 14/195 C12N 15/63 C12N 1/21 C12R 1/19 C12R 1/01. Приоритет от 10.11.2009. Опубл. 25.01.2012. Описание изобретения.
[8] Gusev O. et al. Expression of heat shock protein-coding genes associated with anhydrobiosis in an African chironomid Polypedilum vanderplanki. Cell Stress Chaperones. 2011;16:81–90. doi: 10.1007/s12192-010-0223-9.
[9] Nakahara Y. et al. Cells from an anhydrobiotic chironomid survive almost complete desiccation // Cryobiology. Elsevier Inc., 2010. Vol. 60, № 2. P. 138–146.
[10] Cohen S.N. et al. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1973. Vol. 70, № 11. P. 3240–3244.
--->
SEQUENCE LISTING
<110> Казанский (Приволжский) федеральный университет
<120> Генетическая конструкция для повышения радиационной устойчивости
культуры клеток насекомого P. vanderplanki
<130> 2021107502/10(016259)
<160> 5
<210> 1
<211> 835
<212> DNA
<213> Polypedilum vanderplanki
<400> 1
cttgcacatt tggtcagtaa tattgaaaac gcaaaagaag aaaattcaaa gcaaagaaaa      60
actctaagtg aaaattttta agacaaacta aaaaaaagtg aaacttgaag agcgaataat     120
tttaaagtta gaaaaaaaat atatcaaaaa atgtcaagca tagttcgtgc acttcttaga     180
gatccatatt ttgcttatga attaagacca agatttggaa tgattccaaa tgactttttc     240
tatccaataa catattatcg tccatggcaa atggctcgtc aagcaatgtc tgaattaaat     300
gaagatcaaa gttcaattaa attaaccaaa gaaggattcc aagctagtgt ggatgtccag     360
caatttaaac caaatgaaat ctctgtcaaa gttcaagatc acactgtcat aattgaagga     420
aagcatgaag aacgagatga tgcacatgga accattgaaa gaagttttgt tcgcaaatat     480
gtgttgccac aagaatatga catgaataca gttcaatcga ctttgtcaag tgatggagtt     540
ttgactatca aggcaccacc accagcgcaa gctattgaag gaactaaaga aagaaatatt     600
gaaatcactc atacaaatgc accagctcgt gaaagtgtta aggataaatc accgaatgat     660
gataaaaaat aaaattgcta tttgaattat tttaaaatgt ttatgttcta taagatttta     720
aatttgtaaa tacaaaaatt gcaattattt attaaataaa atttgttttt gattttctaa     780
taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa          835
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер I для получения гена, кодирующего белок HSP20
<400> 2
ggatccatgg aactcaataa taaaccg     27
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер II для получения гена, кодирующего белок HSP20
<400> 3
ctcgagttac atcatattcg cgact       25
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер I для ПЦР клонов E.coli
<400> 4
acttatagga gggccaccat gattgaacaa gatggattg   39
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Праймер II для ПЦР клонов E.coli
<400> 5
gttggtcggc gtcggtcaga agaactcgtc aagaaggcga  40
<---