СПОСОБ УСТРАНЕНИЯ ВАЗОПАТИИ У НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛЯТ С ЖЕЛЕЗОДЕФИЦИТНОЙ АНЕМИЕЙ
METHOD FOR ELIMINATING ANGIOPATHY IN NEWBORN CALVES SUFFERING IRON-DEFICIENCY ANEMIA

Изобретение относится к ветеринарии и биологии, а именно к гематологии и ангиологии.
Ближайшим аналогом предлагаемого способа коррекции вазопатии у новорожденных телят с анемией можно считать способ RU 2401103 «Способ коррекции начинающейся вазопатии при анемии у новорожденных телят и поросят». В прототипе также применяется ферроглюкин, но в виде двоекратного введения, разнесенного на 2 инъекции с интервалом 10 суток, что удлиняет сроки коррекции и не позволяет индивидуализировать количество железа, вводимого в организм теленка. Применяемые в прототипе в сочетании с ферроглюкином 2 метаболически активные препараты делают способ «громоздким» и сложным в исполнении в условиях промышленного животноводства. При этом заявленный способ отличается простотой и легкостью при его применении на практике с достижением полной коррекции вазопатии у новорожденных телят с железодефицитной анемией через 6 суток против 10 суток в прототипе. Кроме того, у гликопина (N-ацетилглюкозаминил-N-ацетил-мурамил-аланил-Д-изоглутамин), (Андронова Т.М., Пинегин Б.В., Козлов И.Г., Устинова Г.И. Применение иммуномодулятора гликопина для профилактики и лечения заболеваний животных. Методические рекомендации. - М., 2009. - 12с.) ранее ни при изолированном его применении, ни при сочетании с какими-либо средствами не обнаруживалась способность влиять на сосудистую активность у новорожденных телят с железодефицитной анемией. Техническим результатом заявленного способа является полное устранение вазопатии у новорожденных телят с железодефицитной анемией на следующие сутки после окончания курса лечения, что позволяет существенно оздоровить стадо, сократить падеж, увеличить привесы и получать от этих животных здоровое потомство.
Целью изобретения является полное быстрое устранение вазопатии у новорожденных телят с железодефицитной анемией.
Сущность заявляемого способа заключается в том, что для коррекции вазопатии всем новорожденным телятам с железодефицитной анемией назначается ферроглюкин-75, содержащий 75 мг железа в 1 мл раствора, из расчета 15 мг железа на 1 кг живой массы теленка внутримышечно, однократно и выпаивание разведенного в небольшом количестве (100,0-150,0 мл) воды или молока или молозива гликопина по 6,0 мг/сутки утром в течение 6 суток, начиная одновременно с инъекцией ферроглюкина.
Способ позволяет полностью устранять вазопатию у новорожденных телят с железодефицитной анемией на следующие сутки после окончания курса лечения, что позволит существенно оздоровить стадо, сократить падеж, увеличить привесы и получать от этих животных здоровое потомство.
Заявляемый способ осуществляется следующим образом.
Для диагностики вазопатии новорожденным телятам проводится следующее обследование.
Антиагрегационная активность сосудистой стенки определяется по методу (Балуда В. П., Лукьянова Т.П., Балуда М.В. Метод определения антиагрегационной активности стенки сосудов. // Лабор. дело, 1983. - №6. - с.17-20). В основе этого метода лежит вычисление степени торможения агрегации тромбоцитов в плазме, полученной из крови после временной венозной окклюзии.
На сосуд, из которого еще не производился забор крови, накладывается манжетка сфигмоманометра и создается давление на 10 мм рт.ст. выше систолического. Через 3 минуты производится взятие 9 мл крови в 1 мл 3,8% раствора цитрата натрия. Ее немедленно центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин для получения богатой тромбоцитами плазмы (БТП). Плазму отсасывают пипеткой и сразу же помещают в тающий лед, где хранят до начала исследований. Повторно пробу центрифугируют 20 минут при 3000 об/мин для получения бестромбоцитной плазмы. После подсчета количества тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме, полученной до венозного застоя (подробно описано ниже), ее разводят бедной тромбоцитами плазмой (БеТП), взятой до (1 проба) и после (2 проба) венозного застоя до концентрации 200 000 тромбоцитов/мкл. Полученную смесь встряхивают и инкубируют 10 минут при 20-22°С. Затем проводят агрегацию тромбоцитов (AT) с коллагеном (разведение 1:2 основной суспензии) на стекле следующим способом (Шитикова А.С. Визульный микрометод исследования агрегации тромбоцитов. В кн.: Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Под ред. Н.Н.Петрищева, Л.П.Папаян. СПб.: 1999. С.49-52).
9
БТП стандартизируют по числу тромбоцитов путем разбавления исходной БТП аутологичным образцом БеТП (полученной до венозного застоя - 1-я проба или после него - 2-я проба) до 200·10/л. Концентрация кровяных пластинок в исходной БТП подсчитывается в камере Горяева (в 50 больших квадратах). Объемы смешиваемых БТП и БеТП определяют по формуле:
БeТп
БТП
V=V·[(N/200000)-1],
БeТп
где V - объем бедной тромбоцитами плазмы,
БТП
V - объем богатой тромбоцитами плазмы,
N - счетная концентрация тромбоцитов в исходной БТП (клеток/мкл).
Из отобранного объема стандартизированной плазмы на предметное стекло наносят 0,02 мл плазмы и другой пипеткой 0,02 мл р-ра индуктора коллагена в стандартной концентрации (разведение 1:2 основной суспензии). Стеклянной палочкой смешивают плазму с индукторами и включают секундомер. Смесь перемешивают так, чтобы жидкость занимала окружность диаметром около 2 см.
Покачивая стекло круговыми движениями в проходящем свете осветителя, на черном фоне следят через лупу за возникновением агрегатов. При появлении отчетливых агрегатов, просветлении раствора и прилипании части агрегатов к стеклу секундомер отключают, фиксируя время агрегации тромбоцитов.
Реакцию повторяют по 2-3 раза в 1-й и 2-й пробе, находя для каждой из них среднее арифметическое значение.
По степени торможения агрегации тромбоцитов после венозного застоя судят об антиагрегационной активности плазмы крови, обусловленной поступлением в кровоток простациклина из сосудистой стенки. Индекс антиагрегационной активности сосудистой стенки (ИААСС) при исследовании AT на стекле рассчитывали по формуле:
Нормальными значениями для коллагена можно считать ИААСС 1,45-1,50.
Определение противосвертывающей способности сосудистой стенки, зависящей от продукции в ней антитромбина III, можно осуществить, оценивая его базальный уровень до и после временной дозированной ишемии стенки вены, и приведено в (Баркаган З.С., Момот А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза. - М.: 1999 - с.109-112).
Принцип метода основан на выявлении снижения активности (в отсутствие гепарина) в плазме антитромбина III (AT III), которую определяют по способности исследуемой плазмы инактивировать тромбин, для чего ее предварительно обрабатывают сорбентом гепарина, затем подвергают тепловой дефибринации и смешивают со стандартным количеством тромбина. После инкубации смеси в ней определяют остаточную коагуляционную активность тромбина. По уровню снижения активности тромбина в процентах от нормы оценивают активность AT III в исследуемой плазме.
Используются следующие реактивы. 1. Трис-HCl буфер 0,05 М, рН 7,4. 2. Раствор тромбина в буфере: 0,2 мл раствора должны свертывать 0,3 мл 0,4% раствора фибриногена за 15-16 сек. Рабочий раствор тромбина готовят в пластиковой или силиконированной пробирке, хранят при комнатной температуре и используют в тесте в день исследования. 3. Сорбент гепарина Гепасорб-1 (фирма "Технология-Стандарт"). 4. Свежеприготовленный раствор фибриногена в концентрации 3,5-4,0 г/л, который применяют для тестирования остаточной активности тромбина. Допускается замена раствора фибриногена нормальной бедной тромбоцитами цитратной плазмой, разведенной буфером в 2 раза; 5. Свежая цитратная бедная тромбоцитами плазма, полученная от 6-8 здоровых телят, или лиофилизированная фирменная, с известной активностью AT III, которую используют для построения калибровочного графика.
Материалом для исследования служит цитратная бедная тромбоцитами плазма.
Для приготовления сорбированной и дефибринированной плазмы в пробирке смешивают 10 мг сорбента гепарина с 1,0 мл исследуемой плазмы. Постоянно встряхивая пробирку, перемешивают ее содержимое при комнатной температуре в течение 8 мин, исключая образование пены и осадка на ее дне. После этого смесь центрифугируют в течение 2 мин при 1000-1500 об/мин. Плазму в надосадке переносят в чистую пробирку и дефибринируют на водяной бане при +56°С в течение 6 мин, после чего вновь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, снимают надосадочную часть и исследуют в течение первых 2 ч.
Ход определения. В пробирку вносят 0,4 мл рабочего раствора тромбина и прогревают его на водяной бане при +37°С в течение 2 мин. Затем добавляют 0,1 мл исследуемой адсорбированной и дефибринированной плазмы, включают секундомер. Через 2 мин (точно!) 0,2 мл смеси переносят в пробирку с 0,3 мл раствора фибриногена (или разведенной нормальной плазмы), предварительно подогретой до +37°С. Немедленно включают секундомер и регистрируют время свертывания.
По калибровочной кривой находят активность AT III в процентах.
Построение калибровочной кривой проводят следующим образом. Плазму здоровых телят подвергают дефибринированию, как указано выше. Затем из нее готовят разведения для построения калибровочной кривой в соответствии с табл.1.
Таблица 1
Схема приготовления разведений плазмы для построения калибро- вочной кривой при определении активности AT III
Номер разведения
Плазма+буфер
Активность AT III, %
1
Плазма без буфера
100
2
0,2 мл+0,2 мл
50
3
0,1 мл+0,3 мл
25
С каждым из разведений определяют время свертывания по указанной выше методике. Все измерения проводят трижды, рассчитывают средний результат. При построении калибровочной кривой по логарифмической оси ординат откладывают время свертывания в секундах, по оси абсцисс - активность AT III в % в соответствии с указанными выше разведениями. Примерная калибровочная кривая приведена на фигуре 1.
Калибровочную кривую для одного типа и одной серии тромбина и буфера строят однократно. Периодически контролируют лишь активность рабочего раствора тромбина.
В норме без венозной окклюзии активность AT III составляет 85-115%. При взятии крови после временной венозной окклюзии, как описано в методе по оценке антиагрегационной активности сосудов, и определении в ней AT III возможно косвенно оценить уровень синтеза в стенке сосуда тканевых активаторов AT III. На фоне временной венозной окклюзии активность AT III повышается и находится в границах 120-143%. Рассчитывается индекс синтеза AT III в стенке сосуда (ИСАСС) путем деления величины активности AT III на фоне венозной окклюзии на величину AT III без нее. В норме он равен 1,20-1,40.
О фибринолитической активности сосудистой стенки судят по состоянию синтеза в ней тканевых активаторов плазминогена, определяемых по времени лизиса эуглобулинового сгустка до - и после временной венозной окклюзии.
2
Принцип метода заключается в осаждении эуглобулиновой фракции плазмы, при этом основные ингибиторы фибринолиза, в частоности α-антиплазмином, остаются в надосадочной части и удаляются. Поэтому эуглобулиновый лизис отражает активность фибринолиза в условиях исключения ингибирующего действия антиплазминов. Его скорость отражает, в основном, количество плазминогена в плазме и степень его активации. Определяют время спонтанного лизиса сгустка, получаемого из эуглобулиновой фракции плазмы при добавлении к ней раствора хлорида кальция (З.С. Баркаган, А.П.Момот. Основы диагностики нарушений гемостаза. М., 1999, издательство «Нью-диамед-АО».-с.124-125).
Используются следующие реактивы 1. 1% раствор уксусной кислоты. 2. 0,277% раствор хлорида кальция. 3. Буфер Михаэлиса или трис-HCl буфер, 0.05М, рН 7,3-7,4.
Материалом для исследования служит цитратная бедная тромбоцитами плазма до и после временной венозной окклюзии.
Ход определения. Для получения эуглобулиновой фракции к 8,0 мл дистиллированной воды добавляют 0,15 мл 1% уксусной кислоты и 0,5 мл исследуемой плазмы. После 30-минутного охлаждения смеси в холодильнике при +2-8°С эуглобулины осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 7 мин. Надосадочную жидкость сливают, пробирку осушают опрокидыванием на фильтровальную бумагу. Осадок эуглобулинов разводят в 0,5 мл буфера и помещают на водяную баню (+37°С). Затем, не вынимая пробирку из бани, добавляют 0,5 мл раствора хлорида кальция, осторожно перемешивают покачиванием пробирки (не встряхивая!), включают секундомер и инкубируют на водяной бане при +37°С. Регистрируют время с момента добавления хлорида кальция до полного растворения сгустка.
Результат выражают в минутах. В норме время спонтанного лизиса эуглобулинового сгустка составляет 175-230 мин. После временной венозной окклюзии время лизиса снижается, находясь в границах 126-170 мин. При делении величины длительности спонтанного лизиса эуглобулинового сгустка до окклюзии на величину после рассчитывается индекс фибринолитической активности сосудистой стенки (ИФАСС), в норме равный 1,35-1,45.
Наличие у теленка снижения либо антиагрегационной, либо противосвертывающей, либо фибринолитической активности способности сосудистой стенки, устанавливаемого по снижению ниже нормативных значений величин ИААСС, ИСАСС и ИФАСС соответственно, либо наличие одновременного снижения двух или всех 3-х показателей является основанием для постановки у теленка с железодефицитной анемией диагноза вазопатия.
Выявление в новорожденного теленка вазопатии является основанием для назначения теленку лечебного комплекса из раствора ферроглюкина-75, содержащего 75 мг железа в 1 мл раствора, из расчета 15 мг железа на 1 кг живой массы теленка внутримышечно, однократно и выпаивание разведенного в небольшом количестве (100,0-150,0 мл) воды или молока или молозива гликопина по 6,0 мг/сутки утром в течение 6 суток, начиная одновременно с инъекцией ферроглюкина.
Внедрение данного способа коррекции вазопатии у новорожденных телят с железодефицитной анемией в практику ветеринарных учреждений позволит решить ряд насущных биологических, ветеринарных и экономических проблем современного скотоводства. Эффективная коррекция вазопатии у новорожденных телят с железодефицитной анемией позволит оздоровить стадо, получать у этих животных высокие привесы, а в последующем от них здоровое потомство.
12
Пример 1. У новорожденного теленка №17 с железодефицитной анемией, первые сутки жизни с массой тела 32 кг было выявлено нарушение эритропоэза с признаками снижения уровня содержания железа в его организме (сывороточное железо 12,6 мкмоль/л, сидероциты 1,2%, при количестве гемоглобина у него 86,7 г/л, эритроцитов - 3,94×10/л).
Теленок обследован в условиях телятника по поводу клиники анемии. У теленка была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме. У теленка были выявлены выраженные признаки угнетения антитромботической функции сосудистой стенки: ИААСС составлял -1,40, ИСАСС 1,18 и ИФАСС 1,15, что позволило установить у него вазопатию.
Теленку было назначено лечение: раствор ферроглюкина-75 в количестве 6,4 мл внутримышечно, однократно и выпаивание разведенного в 100,0 мл молока гликопина по 6,0 мг/сутки утром в течение 6 суток, начиная одновременно с инъекцией ферроглюкина.
12
На следующие сутки после завершения лечения признаков анемии и вазопатии не обнаружено - сывороточное железо 19,3 мкмоль/л, сидероциты 7,5%, при количестве гемоглобина у него 118,1 г/л, эритроцитов - 4,71×10/л), ИААСС составлял 1,48, ИСАСС 1,34, ИФАСС 1,38. Дальнейшее наблюдение за данным теленком не выявило нарушений параметров антитромботической активности сосудов (признаков вазопатии).
12
Пример 2. У новорожденного теленка №36 с железодефицитной анемией, 3-й сутки жизни с массой тела 30 кг было выявлено нарушение эритропоэза с признаками снижения уровня содержания железа в его организме (сывороточное железо 12,2 мкмоль/л, сидероциты 1,1%, при количестве гемоглобина у него 86,0 г/л, эритроцитов - 3,88×10/л).
Теленок обследован в условиях телятника по поводу клиники анемии. У теленка была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме.
У теленка были выявлены выраженные признаки угнетения антитромботической функции сосудистой стенки: ИААСС составлял 1,38, ИСАСС 1,17, ИФАСС 1,14, что позволило установить у него вазопатию.
Теленку было назначено лечение: ферроглюкин-75 в количестве 6,0 мл внутримышечно, однократно и выпаивание разведенного в 150,0 мл молозива гликопина по 6,0 мг/сутки утром в течение 6 суток, начиная одновременно с инъекцией ферроглюкина.
12
На следующие сутки после завершения лечения признаков анемии и вазопатии не обнаружено - сывороточное железо 19,3 мкмоль/л, сидероциты 7,6%, при количестве гемоглобина у него 119,7 г/л, эритроцитов - 4,89×10/л), ИААСС составлял 1,49, ИСАСС 1,35 и ИФАСС 1,39. Дальнейшее наблюдение за данным теленком не выявило нарушений параметров антитромботической активности сосудов (признаков вазопатии).
Использование предлагаемого способа коррекции вазопатии в ветеринарии поможет избежать нарушений трофики тканей телят за счет исключения сосудистых осложнений у новорожденных телят с железодефицитной анемией. Это уменьшит у них падеж, оздоровит стадо, увеличит количество и качество получаемой мясной и молочной продукции и здоровое потомство от пролеченных животных.