СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ РУБЦОВОГО ПИЩЕВАРЕНИЯ У ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
METHOD FOR INCREASING CICATRIC DIGESTION IN RUMINANT CATTLE ANIMALS

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в отрасли животноводства.
Ввиду развития новых взглядов на использование одних и тех же антибиотических препаратов, как в медицине, так и в животноводстве и последующее негативное воздействие через продукты питания животного происхождения на организм человека, заставляет по новому относиться к бесконтрольному их применению.
Понимание складывающейся ситуации побуждает ведущих мировых производителей к созданию альтернативы антибиотикам в кормлении животных [1]. Одним из перспективных направлений подобного поиска является разработка новых решений по управлению чувством кворума у бактерий [2]. При этом ожидаемыми преимуществами новых решений являются минимизация влияния на нормофлору рубца крупного рогатого скота, а также малая вероятность развития устойчивости к ним у патогенных микроорганизмов.
Кворумные ингибирующие (QSI) соединения были идентифицированы из широкого спектра природных ресурсов, в частности лекарственных растений, съедобных трав, фруктов и овощей [3], а также специй [4]. Такие антипатогенные соединения, в отличие от противомикробных средств, не являются ни бактерицидными, ни бактериостатическими и не уменьшают риск развития резистентности [5].
Бактериальные популяции рубца КРС жвачных координируют общинное поведение посредством процесса передачи сигналов опосредованного молекулами диффундирующего сигнала [6]. Этот процесс контролирует экспрессию генов, ответственную за различные физиологические функции, включая вирулентность, производство антибиотиков и образование биопленки [7].
За последние несколько лет проблема поиска решений ингибирования QS получила широкое развитие в исследованиях на эукариотах [8]. Это позволило выделить несколько групп веществ специфически ингибирующих QS в репортерных штаммах, в том числе аджоен из чеснока, результат был описан в патенте WO 2012076016, Process for the manufacture of ajoene derivatives, однако, лучший результат был достигнут при совместном введении с антибиотиками.
Экстракт Quercus cortex, широко использовали в животноводстве, в том числе для частичной замены антибиотиков, он подавляет микрофлору кишечника, эти эффекты обусловлены высокими анти-QS эффектами экстракта [9].
В свиноводстве рекомендовано применение орегано, корицы, мексиканского перца, тимьяна для подавления патогенной микрофлоры в кишечнике [10] сангровит, экстракт чеснока, содержащий аллицин способны увеличить прирост массы тела [11] тимьян, гвоздика, эвгенол и карвакрол способны улучшать продуктивность свиней [12]. Известен способ улучшения ферментации в рубце и подавления условно-патогенных микроорганизмов при введении в рацион композиции на основе экстракта горького апельсина [13]. Недостаток способа заключается в препятствии применения экстракта - нестабильный химический состав, зависящий от условий окружающий среды, произрастания, ареала. Поэтому были использованы малые молекулы растительного происхождения, выделенные из экстракта и синтезированные искусственно. В опыте при включении в рацион малых молекул растительного происхождения при выращивании цыплят-бройлеров, у опытных групп отсутствует патогенная и условно-патогенная микрофлора, происходит прирост живой массы на 20,3% [16].
Применение молекул растительного происхождения, а именно гамма-окталактона показало ингибирующие действие на систему «кворум сенсинг» бактерий [14].
Применение кумарина, скополетина в опытах приводит к подавлению кворум зависимого образования биопленок LuxI/LuxR типа у бактерий [15].
Анализируя вышеизложенное можно сказать, что малые молекулы природного происхождения, воздействуют на чувство кворума микроорганизмов, поэтому они могут применяться в кормлении крупного рогатого скота, для коррекции рубцового пищеварения, тем самым способствуя оптимальному перевариванию питательных веществ рационов.
В этой связи задачей является применение малых молекул растительного происхождения на повышение рубцового пищеварения, за счет регулирования микробиологического состава.
Исследования проводились на базе отдела кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов им. профессора С.Г. Леушина Федерального государственного научного учреждение «Федеральный научный центр биологических систем и агротехнологий Российской академии наук» (ФНЦ БСТ РАН).
Для решения поставленных задач была произведена серия исследований в несколько этапов. Для лабораторных исследований были использованы базы: Испытательный Центр, лаборатория «Агроэкология техногенных наноматериалов» и Центр коллективного пользования ФНЦ БСТ РАН. Научно-хозяйственные опыты проведены на производственном участке «Покровский сельскохозяйственный колледж-филиал» ФГБОУ ВО «Оренбургский ГАУ».
В экспериментальных исследованиях в качестве веществ «anti-quorum» была использована композиция малых молекул растительного происхождения в виде белого порошка состоящая из: антиарол - 20%, пропилрезорцин - 15,5%, ванилин - 5,9%, конифериловый спирт - 50%, кумарин - 5,3%, скополетин - 3,3% [16, 17].
Получение препарата: точные навески ММ РП диспергировали в изотоническом растворе путем ультразвуковой обработки в течение 15 минут частотой 35 кГц (f-35 кГц, N-300 Вт, А-10 мкА) в 1 мл дистиллированной воды.
Для изучения влияния малых молекул растительного происхождения на пищеварительные процессы были сформированы 2 группы бычков (n=3) в возрасте 13 месяцев, I группа получала основной рацион, II - основной рацион + композицию малых молекул растительного происхождения в дозе 4,2 мг/ сухого вещества рациона, подготовительный период 10 суток, далее были переведены на условия основного учетного периода (8 суток). Содержание на момент исследования - привязное, индивидуальное кормление [18]. Отбор рубцовой жидкости проводился через хроническую фистулу рубца через 3 и 6 часов после кормления метод in situ.
Определение амилолитической активности происходит по средствам расщепления крахмала ферментом бактерий и определении плотности на фо-тоэлектроколориметре (КФК-2). Анализ проводили в два этапа. Первый до инкубации: рубцовую жидкость, крахмал и фосфатный буфер, температурой 40°С, встряхивали, добавляли HCI для прекращения фермент-реакции. Окрашивали калием йодистым. Второй этап определения после часовой инкубации, проделывали те же манипуляции, но при условии инкубирования при температуре 40±2°С.
Образцы проб смотрели на фотоколориметре против дистиллированной воды в кюветах размером 5,0 мм, длина волны 590 нм. Количество крахмала находится по калибровочному графику. Амилолитическую активность находили по формуле
X=(А-В)⋅20,
где X - количество крахмала, расщепленного 1 мл содержимого рубца за 1 ч, мг;
А - количество крахмала в растворе до инкубации, мг;
В - количество крахмала после инкубации, мг;
20 - коэффициент перерасчета на 1 мл содержимого рубца.
Целлюлозолитическую активность определяли по методике В.И. Георгиевского (1976). Рубцовую жидкость (РЖ) отфильтрованную через марлю в количестве 250 мл, температурой 40±2°С. Отбираем в пробирки с целлофановыми полосками, высушенными до постоянной массы - 30 мл РЖ. Пробирки помещали в термостатируемую водяную баню температурой 39°С на 24 часа, по завершению времени полоски ополаскиваются и сушатся.
Целлелюлозолитическую активность определяли по формуле
Х=А-В/А⋅100,
где X - Целлелюлозолитическая активность;
А - Вес целлофановой полоски до инкубирования;
В - Вес целлофановой полоски после инкубирования.
Определение таксономического разнообразия микроорганизмов проводили в Центре коллективного пользования «Персистентность микроорганизмов» Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (Оренбург, Россия). Для этого отбирали рубцовую жидкость в количестве 300 мл через 3 часа после кормления. Пробы фильтровали через 4 слоя марли, образцы содержимого рубца помещали в стерильные пробирки, убирали в криокамеру типа: ARKTIKO t=-80°С с последующим выделением очищенных препаратов ДНК.
Выделения ДНК простейших. После разморозки брали 400 мкл суспензии добавляли смесь стеклянных шариков d=0,1 и 0,5 мм в объеме равном примерно 1/3 от объема жидкости в пробирке. Смесь гомогенизировали при помощи гомогенизатора Tissue Lyser по 3 мин на максимальной скорости. Суспензию инкубировали при 95°С в течение 10 мин, встряхивали на вортексе и центрифугировали 10 мин при 14500 об/мин. Супернатант переносили в новую пробирку, добавляли 200 мкл раствора Binding Matrix в чистые 2,0 мл конические пробирки. Переносили колонку SPIN Filter в чистую 1,9 мл Catch пробирку. Добавляли 50 мкл TES. Перемешивали смесь для ресуспендирования матрикса, образцы центрифугировали при 14000 об/мин в течение 2 минут, чтобы элюировать очищенную ДНК в чистую Catch пробирку. Таксономический состав содержимого рубца определялся методом NGS секвенирования на приборе MiSeq (Illumina, США), классификация микроорганизмов определена при помощи последовательностей с использованием VAMPS и справочной базы SILVA (Huse 2014).
Полученные результаты обрабатывали программного комплекса «Microsoft Office» с применением программы «Excel» («Microsoft», США) и в программе «Statistica 10.0» («Stat Soft Inc.», США). Достоверными считали результаты при Р≤0,05.
При введении в рацион ММ РП происходит увеличение ферментативной активности по сравнению с контрольной группой.
Целлюлозолитическая активность возросла во II группе на 8,03% (Р≤0,001) после 3-х часов кормления и на 8,23% (Р≤0,001) после 6-ти часов кормления относительно контроля (табл. 1).
Амилолитическая активность во II опытной группе была выше чем в I группе на 7,1% (Р≤0,001) через 3 часа и на 6,8% (Р≤0,01) через 6 часов после кормления по отношению к контролю (табл. 2).
Внесение в рацион животных ММ РП сдвигало устоявшееся равновесие микроорганизмов в сторону тех, которые отвечают за лучшую перевариваемость кормов, в частности, повышение численности Proteobacteria и Firmicutes.
ММ РП способствуют уменьшению численности условно-патогенных микроорганизмов, так в опытных группах число Streptococcaceae уменьшается относительно контроля, что говорит об ингибирующем эффекте опытной добавки. Во II опытной группе патогенные микроорганизмы отсутствуют, а в контрольной группе уровень патогенных микроорганизмов не превышает 0,1% от общего числа бактерий. Микроорганизмы рубца играют важную роль в обеспечении энергетических потребностей животного путем трансформации органических соединений в корме с получением полезной энергии (табл. 3).
Таким образом, введение препарата в рацион в виде малых молекул растительного происхождения сопровождается повышением интенсивности процессов целлюлозолитической и амилолитической активности, увеличением численности микроорганизмов, участвующих в перевариваемости кормов, что позволяет рекомендовать их в качестве кормовой добавки для жвачных животных крупного рогатого скота.
Литература
1. Yang С., Chowdhury М.K., Huo Y., Gong J. Phytogenic Compounds as Alternatives to In-Feed Antibiotics: Potentials and Challenges in Application // Pathogens. 2015. 4(1). P. 137-156.
2. Kalia V. C., Wood, Т. K., Kumar P. Evolution of resistance to quorum-sensing inhibitors. // Microbial ecology. 2014. №68(1). P. 13-23. doi:10.1007/s00248-013-0316-y
3. Husain F.M., Ahmad, I., Khan F.I., Al-Shabib N.A., Baig, M.H., Hussain A., Lobb K.A. Seed Extract of Psoralea corylifolia and Its Constituent Bakuchiol Impairs AFEL-Based Quorum Sensing and Biofilm Formation in Food- and Human-Related Pathogens. // Frontiers in cellular and infection microbiology. 2018. №8. P. 351. doi:10.3389/fcimb.2018.00351
4. Chenia H.Y. Anti-quorum sensing potential of crude Kigelia africana fruit extracts. // Sensors (Basel, Switzerland). 2013. №13 (3). P. 2802-2817. doi:10.3390/s130302802
5. Truchado P.,  F.A., Larrosa M.A. Allende Food phyto-chemicals act as quorum sensing inhibitors reducing production and or degrading autoinducers of Yersinia enterocolitica and Erwinia carotovora II Food Control. 2012. №24. P. 78-85.
6. Schauder S., Bassler B.L. The languages of bacteria Genes Dev // Department of Molecular Biology, Princeton University, Princeton. 2001. №15. P. 1468-1480.
7. Rutherford S.T., Bassler B.L. Bacterial quorum sensing: its role in virulence and possibilities for its control // Cold Spring Harb Perspect Med. - 2012. T. 11. №2. P. 235-242.
8. Gonzalez J.E., Keshavan N.D. Messing with bacterial quorum sensing // Microbiol Mol Biol Rev. 2006. T. 70. №4. P. 859-875.
9. Дускаев Г.К., Дроздова E.A., Алешина E.C., Безрядина А.С. Оценка воздействия на кишечную микрофлору птицы веществ, обладающих антибиотическим, пробиотическим и анти-quorum sensing эффектами // Вестник Оренбургского государственного университета. 2017. №11 (211) С. 84-87.
10. Namkung Н., Li, М., Gong J., Yu, Н., Cottrill М., De Lange С.F. M. Impact of feeding blends of organic acids and herbal extracts on growth performance, gut microbiota and digestive function in newly weaned pigs // Can. J. Anim. Sci. 2004. №84. P. 697-704.
11. Tatara M.R., Sliwa E., Dudek K., Gawron A., Piersiak Т., Dobrowolski P., Aged garlic extract and allicin improve performance and gastrointestinal tract development of piglets reared in artificial sow // Ann. Agric. Environ. Med. 2008. №15. P. 63-69.
12. Costa L.B., Panhoza Tse M.L., Miyada V.S. Herbal extracts as alternatives to antimicrobial growth for weanling pigs // Braz. J. Anim. Sci. 2007. T. 36. P. 589-595.
13. Патент РФ №2457851. Средство для улучшения ферментации в рубце жвачных животных / Бальсельс X., Кресло Ф.К., Серра Мария дель Map, Эредия Фернандо. Опубликовано 10.08.2012.
14. Патент РФ №2691634. Способ применения гамма-окталактона в качестве ингибитора системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий / Дерябин Д.Г., Галаджиева А.А., Инчагова К.С., Дускаев Г.К. Опубликовано: 17.06.2019.
15. Патент РФ №2616237. Применение кумарина и его производных в качестве ингибиторов «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий / Дерябин Д.Г., Толмачева А.А., Инчагова К.С. Опубликовано: 13.04.2017.
16. Патент РФ №2649812. Способ экстракции из твердого растительного сырья композиции химических соединений для подавления зоопатоген-ных бактерий / Дерябин Д.Г., Галаджиева А.А., Мирошников С.А., Дускаев Г.К., Рогачев Б.Г., Павлов Л.Н. Опубликовано: 04.04.2018.
17. Acros Organics, США. Сайт https://www.acros.com/
18. Пособие для проведения научно-исследовательских работ в зоотехнии: уч.-методич. пособие / В.И. Левахин, Н.А. Балакирев, А.В. Харламов, Г.И. Левахин, Г.К. Дускаев, М.А. Кизаев, И.А. Бабичева, С.И. Мироненко. - Москва-Оренбург: Изд-во ВНИИМС, 2016. - 227 с.