Аналитические методы определения аминокислоты l-селеноцистина

УДК 543.61, 543.64

DOI: 10.21685/2307-9150-2017-2-4

П. А. Полубояринов, И. Я. Моисеева, Н. Н. Глебова, О. А. Чумакова

АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТЫ l-СЕЛЕНОЦИСТИНА

Аннотация.

Актуальность и цели. L-селеноцистеин (окисленная форма - l-селеноцис-тин) - 21-я протеиногенная аминокислота, самое значимое природное соединение селена и перспективное вещество для коррекции его дефицита в питании человека. Важным этапом работы над l-селеноцистином является разработка аналитических методов идентификации и количественного определения аминокислоты.

Материалы и методы. Для аналитического детектирования l-селеноцисти-на использовался метод восходящей ТСХ и метод капиллярного электрофореза на приборе Капель 105М. Элементный анализ проводился методом высокотемпературного сжигания на приборе vario El cube производства Elementar Analysensysteme (Германия). Спектры ЯМР 1Н и 13С аминокислоты записаны на спектрометре Varian 400, с рабочими частотами 400 и 100 МГц соответственно.

Результаты. Разработаны методы аналитического детектирования аминокислоты l-селеноцистина. Также исследована идентичность l-селеноцистина методами элементного анализа и 1Н, 13С ЯМР-спектроскопией.

Выводы. В результате проведенных исследований разработаны методики аналитического определения аминокислоты l-селеноцистина методами восходящей ТСХ и капиллярного электрофореза. Определена идентичность аминокислоты элементным анализом и 1Н, С ЯМР-спектроскопией.

Ключевые слова: селеноцистин, тонкослойная хроматография, ТСХ, капиллярный электрофорез.

P. A. Poluboyarinov, I. Ya. Moiseeva, N. N. Glebova, O. A. Chymakova

ANALYTICAL METHODS OF l-SELENOCYSTINE DETERMINATION

Abstract.

Background. L-selenocystein (oxidized form of selenocystine) - the 21st protei-nogenic aminoacid, the most significant natural selenium compound and a promising substance for correction of human selenium deficiency. An important stage of operations with l-selenocystine is the development of analytical methods of l-selenocystine identification and quantitative determination.

Materials and methods. TLC, capillary electrophoresis (Kapel 105 M) were used for detection of l-selenocystine. An elemental analysis was carried out on a vatio El cube Elementar Analysensysteme (Germany). NMR1H and 13C spectra were obtained on a Varian 400 spectrophotometer with operating frequencies of 400 and 100 MHz accordingly.

Results. The purity of l-selenocystine was evaluated using thin layer chromato-graphy (TLC) and capillary electrophoresis. The structure of l-selenocystine was proved via the elemental analysis and 1H and 13C NMR methods.

Conclusions. As a result of the research carried out there have been developed analytical methods of l-selenocystine determination using TLC and capillary elect-rophoresis. The chemical structure of l-selenocystibe has proved via the elemental analysis and 1Н, 13С NMR spectrometry.

Key words: l-selenocystine, thin layer chromatography (TLC), capillary electrophoresis.

Селеноцистеин (Sec) (окисленная форма - селеноцистин (Sec-Sec)) -21-я протеиногенная аминокислота, которую на матричной РНК кодирует терминирующий кодон UGA при условии, что за ним следует особая стимулирующая последовательность нуклеотидов [1]. Это самое значимое природное соединение селена, а все остальные, найденные в природных источниках, либо лежат на пути его биосинтеза (интермедиаты), либо являются его метаболитами [2].

На кафедре «Физики и химии» Пензенского государственного университета архитектуры и строительства (автор - П. А. Полубояринов) был разработан и проведен синтез селенсодержащей аминокислоты l-селеноцистина и получен патент № 2537166 (РФ).

По совокупности таких признаков, как доступность, стабильность, широкий ассортимент исходных соединений и низкая стоимость реагентов; простота выделения (фильтрация), высокие выходы, стабильность и низкая токсичность целевого продукта (l-селеноцистин), несложное аппаратное оформление процесса, позволяют оценить разработанный метод как отвечающий требованиям промышленного производства.

Целью данной работы является разработка аналитического контроля l-селеноцистина методом тонкослойной хроматографии и капиллярного электрофореза, а также определение идентичности аминокислоты методом элементного анализа и 1Н, 13С ЯМР-спектроскопией.

Материалы и методы

Для анализов использовались образцы l-селеноцистина фирмы «Сигма Элдридж» (Sigma-Aldrich) и l-селеноцистин, синтезированный на кафедре «Физики и химии» ПГУАС.

Хроматографические тесты проводили на пластинах Сорбфил методом восходящей ТСХ.

Пробы наносили на пластины с помощью микрошприца вместимостью 10 мкл.

После элюирования в системе растворителей изопропиловый спирт-раствор аммиака 25 % (7 : 3) и высушивания пластины пятна l-селеноцистина проявляли опрыскиванием 0,5 %-м раствором нингидрина в изопропиловом спирте.

Также анализ l-селеноцистина проводили методом капиллярного электрофореза на приборе Капель 105М фирмы «Люмекс». Пробоподготовку и анализ проводили по методике [3]. Для приготовления запасного раствора селеноцистина, массовой концентрации 2 г/дм в стеклянный бюкс помещали навеску 0,020 (± 0,001) г селеноцистина, приливали 0,5 мл 1М соляной кислоты, тщательно перемешивали и добавляли 4,5 мл дистиллированной воды. Для приготовления рабочего раствора в стеклянную емкость вводили 0,15 см3 раствора селеноцистина и 1,85 дистиллированной воды. Увеличение массовой концентрации селеноцистина в рабочем растворе в 3 раза по сравнению со стандартной методикой связано с его высокой молекулярной массой, превосходящей большинство аминокислот в 2-3 раза, по этой причине при одной и той же концентрации уровень аналитического сигнала l-селеноцистина существенно ниже (табл. 1).

Таблица 1

Рабочие градуировочные и контрольные растворы 1-селеноцистина

Обозначение раствора Объем смеси 3 аминокислоты, см Массовая концентрация аминокислоты в растворе, мг/дм3

№ 1 0,1 60

№ 2 0,2 120

№ 3 0,3 180

Контрольный раствор 0,15 90

Для получения фенилтиокарбамильного производного (ФТК-производ-ное) аминокислоты 0,1-0,3 см3 раствора l-селеноцистина выпаривали досуха в струе горячего воздуха, затем добавляли 0,15 мл 0,1 молярного раствора карбоната натрия и 0,3 мл раствора фенилизотиоционата (ФИТЦ). Тщательно перемешивали и оставляли на 35 мин. Затем растворы выпаривали и сухой остаток растворяли в 0,5 мл дистиллированной воды. Пробу центрифугировали (5000 об. мин). Анализ проводили на приборе Капель 105 М в стандартном фосфатном буфере (pH = 7,8, фосфат-ионов 30 ммоль/дм3) с ß-цикло-декстрином (4 ммоль/л) при длине волны 254 нм и напряжении 25 кВ.

Элементный анализ l-селеноцистина проводился на приборе vario El cube производства Elementar Analysensysteme (Германия).

Спектры ЯМР 'Н и С l-селеноцистина записаны на спектрометре Varian 400, с рабочими частотами 400 и 100 МГц соответственно. L-селено-цистин растворяли в D2O + 60 мкл 50 % ортофосфорной кислоты.

Результаты и обсуждение

Анализ методом тонкослойной хроматографии l-селеноцистина фирмы «Сигма Элдридж» как визуально, так и на денситометре «Сорбфил» показал наличие двух нингидрин-положительных пиков: l-селеноцистин (Rf = 0,27) и примесь (Rf = 0,21) (рис. 1).

ft¡ )

И

ь

i

1

h : J

\ !\

i - Г\ ¡¿т.

Rf

Рис. 1. Денситограмма l-селеноцистина

Анализ хроматограммы синтезированного 1-селеноцистина показал наличие одного пика (^ = 0,25), соответствующего данной аминокислоте (рис. 2). Это говорит о большей химической чистоте 1-селеноцистина, синтезированного в ПГУАС.

Рис. 2. Денситограмма l-селеноцистина (I), синтезированного на кафедре «Физики и химии» ПГУАС

Дальнейшее исследование аминокислоты l-селеноцистина проводили методом капиллярного электрофореза. Время выхода пиков l-селеноцистина обоих образцов аминокислоты совпадали и проходили на 16,577 и 16,770 мин, что говорит об их полной идентичности.

Добавление l-селеноцистина в различных концентрациях к стандартному раствору из 14 аминокислот, используемых в методике [3], показало возможность определения l-селеноцистина в данной смеси, так как выход пика аминокислоты проходил на 16 мин и не мешал определению остальных аминокислот (рис. 3).

При анализе биологических объектов серосодержащую аминокислоту цистин из-за слабой устойчивости при кислотном гидролизе окисляют окислительной смесью до цистеиновой кислоты и анализируют в такой форме. По литературным данным [4] и нашим исследованиям [5], l-селеноцистин в результате такой обработки разрушается полностью и для его анализа в биологических объектах требуется его перевод в другие производные, что требует дальнейших исследований.

Элементный анализ проводился на приборе vario El cube производства Elementar Analysensysteme (Германия) (табл. 2).

Элементный анализ показал соответствие содержания азота, водорода и углерода в молекуле l-селеноцистина, синтезированного на кафедре «Физики и химии» ПГУАС, расчетным данным и данным более ранних исследований.

Спектр ЯМР 1H l-селеноцистина: группы СН2 3.18 м.д., 2Н д.д. J=14 Гц, 8 Гц и 3.32 м.д., д.д., J=14 Гц, 5 Гц; CH группы 4.18 м.д., 1Н, д.д., J=8 Гц, 5 Гц. Из-за дейтерообмена сигналы карбоксильной и аминогрупп не различимы. Спектр ЯМР 13С l-селеноцистина: 26.6 (СН2), 52.9 (СН), 170.5 (СООН).

uoißaj oßjo/\ sßujpaaDOjd Ä;isj3Aiup

PS

Homad ппяэжиоэоц 'ппнаравое хпндэиА хптэпа нпшэээеи

Таблица 2

Данные элементного анализа l-селеноцистина

Название/формула вещества

l-селеноцистин/ Mr (C6Hi2N2Se2O4) = 334,09 г/моль

Определяемый элемент С Н N

Вычислено, % 21,58 3,59 8,38

Найдено (данная работа), % 22,29 3,61 8,63

Данные фирмы «Сигма-Элдриж», % 20,30-22,70 - 7,90-8,80

Данные работы [6],% 21,19 3,70 8,37

Таким образом, в результате проведенных исследований разработаны

методы аналитического контроля аминокислоты l-селеноцистина - восходящей ТСХ и капиллярным электрофорезом. Определена идентичность аминокислоты элементным анализом и :Н, 13С ЯМР-спектроскопией.

Библиографический список

1. Berry, M. J. Functional characterization of the eukaryotic secis elements which direct selenocysteine insertion at UGA codons / M. J. Berry, L. Banu, J. W. Harney, P. R. Larsen // The EMBO Journal. - 1993. - Vol. 12 (8). - P. 3315-3322.

2. Селен в организме человека: метаболизм, антиоксидантные свойства, роль в канцерогенезе / В. А. Тутельян, В. А. Княжев, Н. А. Голубкина, Н. Е. Кушлинский, С. А. Хотимченко, Я. А. Соколов. - М. : Изд-во РАМН, 2002. - 224 с.

3. Методика измерений массовой доли аминокислот методом капиллярного электрофореза с использованием системы капиллярного электрофореза «Капель» / ООО «Люмэкс-маркетинг». - СПб., 2014. - 49 с. - (Корма, комбикорма и сырье для их производства).

4. Turlo, J. Relationship between the selenium, selenomethionine, and selenocysteine content of submerged cultivated mycelium of Lentinula edodes (Berk.) / J. Turlo, B. Gutkowska, E. Malinowska // Acta chromatographica. - 2007. - № 18. - P. 36-48.

5. Poluboyarinov, P. A. Selenocystine synthesis and prospects of its utilization in correction of selenium deficiency / P. A. Poluboyarinov // Микроэлементы в медицине. - 2015. - Т. 16 (4). - С. 45-50.

6. Chocat, P. Synthesis of l-selenodjenkolate and its degradation with methionine y-lyas / P. Chocat, N. Esaki, H. Tanaka, K. Soda // Analytical Biochemistry. - 1985. - № 148. -P. 485-489.

References

1. Berry M. J., Banu L., Harney J. W., Larsen P. R. The EMBO Journal. 1993, vol. 12 (8), pp. 3315-3322.

2. Tutel'yan V. A., Knyazhev V. A., Golubkina N. A., Kushlinskiy N. E., Khotimchen-ko S. A., Sokolov Ya. A. Selen v organizme cheloveka: metabolizm, antioksidantnye svoystva, rol' v kantserogeneze [Selenium in human organism: metabolism, antioxidant properties, the role in carcinogenesis]. Moscow: Izd-vo RAMN, 2002, 224 p.

3. Metodika izmereniy massovoy doli aminokislot metodom kapillyarnogo elektroforeza s ispol'zovaniem sistemy kapillyarnogo elektroforeza «Kapel'» [The technique of measuring amino acid mass fractions by means of capillary electrophoresis using the "Kapel" capillary electrophoresis system]. OOO «Lyumeks-marketing». Saint-Petersburg, 2014, 49 p.

4. Turlo J., Gutkowska B., Malinowska E. Acta chromatographica. 2007, no. 18, pp. 36-48.

5. Poluboyarinov P. A. Mikroelementy v meditsine [Microelements in medicine]. 2015, vol. 16 (4), pp. 45-50.

6. Chocat P., Esaki N., Tanaka H., Soda K. Analytical Biochemistry. 1985, no. 148, pp. 485-489.

Полубояринов Павел Аркадьевич

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, и. о. заведующего кафедрой инженерной экологии, Пензенский государственный университет архитектуры и строительства

E-mail: poluboyarinovpavel@yandex.ru

Моисеева Инесса Яковлевна доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой общей и клинической фармакологии, декан лечебного факультета, Пензенский государственный университет

E-mail: moiseeva_pharm@mail.ru

Глебова Наталья Николаевна старший преподаватель, кафедра общей и клинической фармакологии, Пензенский государственный университет

E-mail: natali.glebova@gmail.com

Чумакова Ольга Александровна старший преподаватель, кафедра инженерной экологии, Пензенский государственный университет архитектуры и строительства

E-mail: ie@pguas.ru

Poluboyarinov Pavel Arkadyevich Candidate of agricultural sciences, associate professor, acting head of sub-department of engineering ecology, Penza State University of Architecture and Construction

Moiseeva Inessa Yakovlevna

Doctor of medical scienses, professor, head

of sub-department of general and clinical

pharmacology, dean of the faculty

of general medicine, Penza State

University (40 Krasnaya street,

Penza, Russia)

Glebova Natali Nikolaevna Senior lecturer, sub-department of general and clinical pharmacology, Penza State University

Chymakova Olga Aleksandrovna Senior lecturer, sub-department of engineering ecology, Penza State University of Architecture and Construction

УДК 543.61, 543.64 Полубояринов, П. А.

Аналитические методы определения аминокислоты 1-селеноцисти-

на / П. А. Полубояринов, И. Я. Моисеева, Н. Н. Глебова, О. А. Чумакова // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. - 2017. - № 2 (18). - С. 30-36. БОТ: 10.21685/2307-9150-2017-2-4