СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ, КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ ПОПУЛЯЦИЙ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ АДОПТИВНОЙ ТЕРАПИИ

1. Способ обогащения CD4+- и CD8+-T-клеток, где способ включает:
(a) проведение в замкнутой системе первого отбора, где указанный первый отбор включает обогащение одного типа из (i) CD4+-клеток и (ii) CD8+-клеток из образца, содержащего первичные T-клетки человека, где обогащение, таким образом, позволяет получать первую популяцию отобранных клеток и популяцию неотобранных клеток; и
(b) проведение в замкнутой системе второго отбора, где указанный второй отбор включает обогащение другого типа из (i) CD4+-клеток и (ii) CD8+-клеток из популяции неотобранных клеток, где обогащение, таким образом, позволяет получать вторую популяцию отобранных клеток.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий инкубацию клеток первой и второй популяции отобранных клеток в стимулирующих условиях.
3. Способ по п. 1 или 2, дополнительно включающий инкубацию генетически сконструированного антигенного рецептора в клетках первой и второй популяции отобранных клеток.
4. Способ по п. 3, где инкубацию клеток первой и второй популяции отобранных клеток проводят до, в течение или после введения генетически сконструированного антигенного рецептора.
5. Способ получения генетически сконструированных T-клеток, где способ включает:
(a) проведение в замкнутой системе первого отбора, где указанный первый отбор включает обогащение одного типа из (i) CD4+-клеток и (ii) CD8+-клеток из образца, содержащего первичные T-клетки человека, где обогащение, таким образом, позволяет получать первую популяцию отобранных клеток и популяцию неотобранных клеток; и
(b) проведение в замкнутой системе второго отбора, где указанный второй отбор включает обогащение другого типа из (i) CD4+-клеток и (ii) CD8+-клеток из популяции неотобранных клеток, где обогащение, таким образом, позволяет получать вторую популяцию отобранных клеток;
(c) инкубацию первой и второй популяции отобранных клеток в емкости для культивирования в стимулирующих условиях, получая, таким образом, стимулированные клетки; и
(d) введение в стимулированные клетки генетически сконструированного антигенного рецептора,
где способ, таким образом, позволяет получать результирующую композицию, содержащую CD4+-T-клетки и CD8+-T-клетки, экспрессирующие генетически сконструированный антигенный рецептор.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где одну или более стадий проводят в автоматизированном режиме, или где закрытая система является автоматизированной.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где обогащение клеток в первом и/или втором отборах включает проведение положительного отбора или отрицательного отбора на основе экспрессии поверхностного клеточного маркера.
8. Способ по п. 7, где обогащение клеток в первом и/или втором отборах включает отрицательный отбор, который включает обеднение клеток, экспрессирующих не принадлежащий T-клеткам поверхностный маркер.
9. Способ по п. 8, где не принадлежащий T-клеткам маркер включает CD14.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где обогащение клеток в первом или втором отборах включает проведение ряда этапов положительного или отрицательного отбора на основе экспрессии поверхностного клеточного маркера или маркеров с обогащением CD4+- или CD8+-клеток.
11. Способ по п. 10, где обогащение клеток включает основанный на аффинности отбор.
12. Способ по п. 11, где основанный на аффинности отбор включает контакт клеток с антителом, способным к специфическому связыванию с поверхностным клеточным маркером, и:
(i) выделения клеток, связанных с антителом, таким образом, проводя положительный отбор, или
(ii) выделение клеток, не связанных с антителом, таким образом, проводя отрицательный отбор, где выделенные клетки обогащены CD4+-клетками или CD8+-клетками.
13. Способ по п. 12, где антитело иммобилизовано на магнитной частице.
14. Способ по п. 12, где антитело иммобилизовано на или прикреплено к аффинному хроматографическому матриксу.
15. Способ по любому из пп. 1-14, где первый отбор и второй отбор проводят в раздельных емкостях для разделения, которые функционально связаны.
16. Способ по п. 15, где емкости для разделения функционально связаны посредством трубок.
17. Способ по любому из пп. 12-16, где антитело представляет собой Fab.
18. Способ по любому из пп. 12-17, где:
антитело дополнительно содержит одного или нескольких партнеров по связыванию, способных к формированию обратимой связи со связывающим реагентом, иммобилизованном на аффинном хроматографическом матриксе, в соответствии с чем антитело в течение указанного контакта обратимо связывается с указанным аффинным хроматографическим матриксом; и
клетки, экспрессирующие поверхностный клеточный маркер, специфически связанные антителом на указанном аффинном хроматографическом матриксе, можно выделять из аффинного хроматографического матрикса посредством разрушения обратимого связывания между связывающим реагентом и партнером по связыванию.
19. Способ по п. 18, где:
партнер по связыванию выбран из числа биотина, аналога биотина и пептида, способного к связыванию со связывающим реагентом; и
связывающий реагент выбран из числа стрептавидина, аналога или мутеина стрептавидина, авидина и аналога или мутеина авидина.
20. Способ по п. 19, где партнер по связыванию содержит последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:6.
21. Способ по п. 19 или п. 20, где связывающий реагент представляет собой мутеин стрептавидина, содержащий последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15 или SEQ ID NO:16.
22. Способ по любому из пп. 14-21, дополнительно включающий после контакта клеток с антителом, иммобилизованном на или прикрепленному к аффинному хроматографическому матриксу, применение конкурирующего реагента для разрушения связи между партнером по связыванию и связывающим реагентом, таким образом, выделяя выбранные клетки из матрикса.
23. Способ по п. 22, где конкурирующий реагент представляет собой биотин или аналог биотина.
-5
-1
24. Способ по любому из пп. 12-23, где константа скорости диссоциации (koff) антитела для связывания к поверхностному клеточному маркеру составляет более или приблизительно более 3×10 сек.
d
-3
-7
-7
-10
25. Способ по любому из пп. 12-24, где антитело обладает аффинностью к поверхностному клеточному маркеру с константой диссоциации (K) в диапазоне приблизительно от 10 до 10 или в диапазоне приблизительно от 10 до приблизительно 10.
26. Способ по любому из пп. 14-25, где аффинный хроматографический матрикс упакован в емкости для разделения, которая представляет собой колонку.
6
6
6
6
27. Способ по любому из пп. 14-26, где аффинный хроматографический матрикс адсорбирует или способен к отбору по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 50×10 клеток/мл, 100×10 клеток/мл, 200×10 клеток/мл или 400×10 клеток/мл.
28. Способ по любому из пп. 1-27, где обогащение CD4+-клеток включает положительный отбор на основе поверхностной экспрессии CD4.
29. Способ по любому из пп. 1-28, где обогащение CD8+-клеток включает положительный отбор на основе поверхностной экспрессии CD8.
CM
30. Способ по любому из пп. 1-29, где отбор, который включает обогащение CD8+-клеток, дополнительно включает обогащение центральных T-клеток памяти (T).
31. Способ по любому из пп. 1-30, где отбор, который включает обогащение CD8+-клеток, дополнительно включает обогащение клеток, экспрессирующих маркер, выбранных из числа CD28, CD62L, CCR7, CD127 и CD27.
32. Способ по любому из пп. 1-31, где первый отбор включает обогащение CD8+-клеток, а второй отбор включает обогащение CD4+-клеток.
33. Способ по любому из пп. 30-32, где обогащение центральных T-клеток памяти (TCM) или обогащение клеток, экспрессирующих маркер, включает:
отбор из популяции выбранных клеток, которая обогащена CD8+-клетками, клеток, экспрессирующих CD62L;
отбор из популяции выбранных клеток, которая обогащена CD8+-клетками, клеток, экспрессирующих CD27;
отбор из популяции выбранных клеток, которая обогащена CD8+-клетками, клеток, экспрессирующих CCR7;
отбор из популяции выбранных клеток, которая обогащена CD8+-клетками, клеток, экспрессирующих CD28; или
отбор из популяции выбранных клеток, которая обогащена CD8+-клетками, клеток, экспрессирующих CD127.
34. Способ по любому из пп.1-31 и 33, где первый отбор включает обогащение CD4+-клеток, а второй отбор включает обогащение CD8+-клеток.
35. Способ по п. 34, где:
(i) первый отбор включает обогащение CD4+-клеток посредством положительного отбора на основе поверхностной экспрессии CD4, получая, таким образом, первую отобранную популяцию, которая обогащена первичными CD4+-T-клетками человека, и образец с неотобранными клетками;
(ii) второй отбор включает обогащение CD8+-клеток и дополнительно включает обогащение второго выбранного образца центральными T-клетками памяти (TCM), где обогащение центральных T-клеток памяти (TCM) включает:
отрицательный отбор для обеднения клеток, экспрессирующих поверхностный маркер, присутствующий на наивных T-клетках, и положительный отбор клеток, экспрессирующих поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти (TCM) и не присутствующий в другой субпопуляции T-клеток памяти; или
положительный отбор клеток, экспрессирующих поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти и не присутствующий на наивных T-клетках, и положительный отбор клеток, экспрессирующих поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти (TCM) и не присутствующий в другой субпопуляции T-клеток памяти;
получая, таким образом, первичные CD8+-T-клетки человека, обогащенные клетками TCM.
36. Способ по п. 35, где:
маркер, присутствующий на наивных T-клетках, включает CD45RA; и
CM
CM
обогащение центральных T-клеток памяти (T) включает отрицательный отбор с обеднением клеток, экспрессирующих CD45RA, и положительный отбор клеток, экспрессирующих поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти (T) и не присутствующий в другой субпопуляции T-клеток памяти.
37. Способ по п. 36, где:
поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти и не присутствующий на наивных T-клетках, включает CD45RO;
обогащение центральных T-клеток памяти (TCM) включает положительный отбор клеток, экспрессирующих CD45RO и положительный отбор клеток, экспрессирующих поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти (TCM) и не присутствующий в другой субпопуляции T-клеток памяти.
38. Способ по любому из пп. 35-37, где поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти (TCM) и не присутствующий в другой субпопуляции T-клеток памяти, выбран из группы, состоящей из CD62L, CCR7, CD27, CD127 и CD44.
39. Способ по п. 38, где поверхностный маркер, присутствующий на центральных T-клетках памяти (TCM) и не присутствующий в другой субпопуляции T-клеток памяти, представляет собой CD62L.
40. Способ по любому из пп. 30-39, где популяция CD8+-клеток в обогащенной композиции содержит по меньшей мере 50% центральных T-клеток памяти (TCM) или содержит менее 20% наивных T-клеток (TN) или содержит по меньшей мере 80% CD62+-клеток.
41. Способ по любому из пп. 1-40, где способ приводит к результирующей композиции, содержащей соотношение CD4+- и CD8+-клеток, которое составляет от или приблизительно от 2:1 до или приблизительно до 1:5.
42. Способ по п. 41, где соотношение CD4+- и CD8+-клеток в результирующей композиции составляет 1:1 или приблизительно составляет 1:1.
43. Способ по любому из пп. 1-42, где образец получают у индивидуума.
44. Способ по п. 43, где индивидуум страдает злокачественную опухоль.
45. Способ по п. 44, где злокачественная опухоль представляет собой лейкоз или лимфому.
46. Способ по любому из пп. 43-45, где индивидуум представляет собой индивидуума, которому вводят подвергнутые генетической инженерии клетки.
47. Способ по п. 43, где индивидуум представляет собой индивидуума, отличного от индивидуума, которому введут.
48. Способ по любому из пп. 1-47, где образец представляет собой кровь или получаемый из крови образец.
49. Способ по любому из пп. 1-48, где образец представляет собой образец лейкоцитов.
50. Способ по любому из пп. 1-49, где образец представляет собой образец после афереза, образец мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) или образец после лейкафереза.
51. Способ по любому из пп. 1-50, где образец представляет собой образец после лейкафереза.
52. Способ по любому из пп. 2-51, где стимулирующие условия включают условия, в которых пролиферируют T-клетки.
53. Способ по любому из пп. 2-52, где стимулирующие условия включают средство, способное к активации одного или нескольких доменов внутриклеточной сигнализации одного или нескольких компонентов комплекса TCR.
54. Способ по п. 53, где один или несколько компонентов комплекса TCR содержат дзета-цепь CD3.
55. Способ по любому из пп. 2-54, где стимулирующие условия включают присутствие антитела к CD3 и антитела к CD28, антитела к 4-1BB, цитокина или их комбинации.
56. Способ по п. 55, где антитело к CD3 или антитело к CD28 находятся на поверхности твердой подложки.
57. Способ по п. 55 или 56, где цитокин включает IL-2, IL-15, IL-7, IL-21 или их комбинацию.
58. Способ по любому из пп. 3-57, где генетически сконструированный антигенный рецептор включает T-клеточный рецептор (TCR) или функциональный не являющийся TCR антигенный рецептор.
59. Способ по п. 58, где рецептор специфически связывается с антигеном, экспрессируемым клетками подлежащего лечению заболевания или состояния.
60. Способ по любому из пп. 58 или 59, где генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR).
61. Способ по п. 60, где CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен и домен внутриклеточной сигнализации, содержащий содержащую ITAM последовательность и домен внутриклеточной сигнализации T-клеточной костимулирующей молекулы.