СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И РАКА ЯИЧНИКОВ ПО УРОВНЮ мРНК ММР-9 В ПЛАЗМЕ КРОВИ
METHOD FOR DIAGNOSING BREAST CANCER AND OVARIAN CANCER BY MMP-9 MRNA LEVEL IN BLOOD PLASMA

Область техники, к которой относится изобретение:
Изобретение относится к области медицины, онкологии, молекулярной биологии и клинико-лабораторной диагностики и может быть использовано для ранней диагностики рака молочной железы и рака яичников. Способ основан на измерении в плазме крови уровня мРНК ММР-9 и сравнении уровня представленности мРНК ММР-9 с уровнем представленности референсных транскриптов. Для осуществления способа используют обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию в «реальном времени». В качестве референсных транскриптов используют мРНК B2m и/или GUSB. Результат исследования считают положительным при разнице уровней представленности мРНК целевого гена и референсного более десяти раз. Изобретение может быть использовано для выявления ранних стадий рака молочной железы. Использование заявленного способа обеспечивает высокочувствительную и объективную количественную характеристику уровня экспрессии мРНК ММР-9, что позволяет провести раннюю малоинвазивную диагностику рака молочной железы и рака яичников.
Уровень техники:
Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным онкологическим заболеванием среди женщин. В 2018 году в мире от рака молочной железы умерло 627000 женщин - это примерно 15% всех случаев смерти от рака среди женщин [1].
Рак яичников (РЯ) также является ведущей причиной смерти среди гинекологических онкологических заболеваний у женщин во всем мире. Уровни заболеваемости значительно различаются, но самые высокие в промышленно развитых странах, за исключением Японии. Рак яичников встречается в десять раз чаще, чем рак груди, но в три раза смертельнее. Высокий уровень смертности, как правило, объясняется его скрытым развитием, в результате чего на момент постановки диагноза у 75% женщин возникает запущенное и широко распространенное заболевание [2].
Учитывая растущее число случаев заболеваний РМЖ и РЯ, ранняя диагностика жизненно важна, особенно на начальных стадиях опухоли. Существенный прогресс в этой области был достигнут с помощью методов скрининга, которые включают ультразвуковое исследование, компьютерную томографию или магнитно-резонансную томографию. Однако в случае небольших злокачественных новообразований эти методы не очень эффективны. Поэтому поиск новых диагностических методов, которые могут помочь в раннем выявлении рака, в настоящее время является актуальной задачей. Онкомаркеры особенно полезны при мониторинге лечения и при обнаружении, локализации или идентификации метастатической стадии рака и раннем обнаружении его рецидива.
Во многих научных работах получены данные, демонстрирующие увеличение концентрации внеклеточных молекул рибонуклеиновых кислот (внРНК) благодаря гибели значительного числа клеток при опухолевом процессе [3-5].
мРНК циркулируют в плазме крови (внеклеточная фракция, внРНК) как здоровых, так и больных людей, таким образом, предоставляя возможность для выявления различий в уровне экспрессии генов у разных групп пациентов [6-8].
В настоящее время больше исследований проведено в отношении уровня внРНК в сыворотке и опухолевых тканях, чем в плазме. При этом качественный и количественный анализ внРНК в плазме крови в настоящее время можно считать наиболее перспективным диагностическим методом, поскольку он является сравнительно недорогим и малоинвазивным, а правильный выбор исследуемых генов позволит в ближайшем будущем использовать эти гены как маркеры развития РМЖ на разных стадиях этого заболевания.
Известно, что цитокины, а также гены роста и пролиферации участвуют в процессе опухолеобразования [9-11]. Поэтому анализ экспрессии внРНК генов цитокинов и факторов роста при РМЖ актуален не только для фундаментальных исследований, но и для клинических, одним из которых является диагностика заболевания на ранних стадиях.
Цитокины являются высокоиндуцируемыми секреторными белками, обеспечивающими межклеточную связь в иммунной системе. Они сгруппированы в несколько белковых семейств: факторы некроза опухоли, интерлейкины, интерфероны и колониестимулирующие факторы [9]. Согласно литературным данным, цитокины непосредственно вовлечены в патогенез РМЖ, они играют важную роль в регуляции как индукции, так и защиты при РМЖ [12, 13].
Патологический ангиогенез является отличительной чертой онкологических и различных ишемических и воспалительных заболеваний, его развитие устанавливает сосудистую сеть для роста опухоли и гематогенного метастазирования [14]. Следовательно, гены, вовлеченные в этот процесс, активно изучаются для разработки диагностических систем и терапевтических подходов к лечению рака и других заболеваний [15]. Цитокины и факторы роста, продуцируемые множеством типов клеток, присутствующих в микросреде солидных опухолей, образуют сложную динамическую сеть, в которой они индуцируют другие цитокины, изменяют экспрессию растворимых и связанных с поверхностью клетки рецепторов цитокинов, стимулируют пролиферацию эндотелиальных клеток [16].
Доступные онкомаркеры обладают низкой чувствительностью и специфичностью, и, таким образом, рак не обнаруживается на ранних стадиях. Одним из новых кандидатов в онкомаркеры, может быть ММР-9 - матриксная металлопротеиназа-9 (также известная как желатиназа В), продуцируется кератиноцитами, моноцитами, лейкоцитами и множеством злокачественных клеток и играет важную роль в прогрессировании РМЖ. Участвует в деградации внеклеточного матрикса, что повышает метастазирование груди. В опухоли, ММР-9 разрушает коллаген (тип IV) в сосудистой базальной мембране вблизи опухолевых клеток, которые проникают в окружающие ткани и способствуют метастазированию. Результаты исследования [17] указывают на полезность ММР-9 в диагностике пациентов с РМЖ, демонстрируя статистически значимое увеличение уровня ММР-9 в плазме в общей группе пациентов с РМЖ по сравнению со здоровыми женщинами. Согласно другому исследованию [18], было показано значительное увеличение экспрессии ММР-9 в клетках ткани карциномы по сравнению с нормальной тканью молочной железы. Авторы исследования [18] также утверждают, что дифференциальная экспрессия ММР-9 отражает степень клеточной дифференцировки в клетках рака груди и тесно связана с наиболее агрессивными подтипами рака груди. ММР-9 в сыворотке был значительно выше у пациентов с метастазами, чем у пациентов с неметастазами, указывая на его прогностическую ценность [19]. Кроме того, исследуя сывороточный уровень ММР-9, было показано, что экспрессия ММР-9 была значительно высокой у пациентов с распространенным раком яичников и коррелировала с плохим прогнозом [20]. Также в исследовании [21] ММР-9 в тканях показал более высокую экспрессию при карциноме эндометрия, чем при эндометриозе.
Таким образом, уровень экспрессии мРНК ММР-9 представляет диагностическую и прогностическую ценность у пациентов с диагнозом рак молочной железы и рак яичников.
Наиболее близким аналогом данного изобретения является патент РФ №2451937 «Способ диагностики рака молочной железы по уровню РНК интерлейкинов IL8 и/или IL18 в плазме крови», где для диагностики рака молочной железы используют измерения уровня мРНК интерлейкинов IL-8 и IL-18 в плазме крови.
Изобретение относится к области медицины, онкологии и молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики рака молочной железы. Отличительным признаком изобретения является использование соотношения уровня РНК интерлейкинов IL-8 и/или IL-18 в сравнении с уровнем референсного транскрипта в плазме крови для диагностики рака молочной железы. Диагностическим маркером является соотношение представленности в плазме крови пациента РНК IL-8 и/или РНК IL-18 и любого другого транскрипта (или группы транскриптов), не меняющих уровень представленности в плазме крови при опухолеобразовании, например, ABL, HPRT или IL 1b. Для осуществления способа используют обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию в «реальном времени». Результат исследования считают положительным при разнице уровней представленности РНК IL8 и HPRT более десяти раз. Использование заявленного способа позволяет осуществлять раннюю диагностику рака молочной железы. Патент не описывает применения ПНР в реальном времени для диагностики рака молочной железы путем соотношения уровня мРНК ММР-9 с уровнем референсных генов, таких как B2m и/или GUSB, не содержит описания метода определения мРНК ММР-9 и последовательностей праймеров и зондов. Таким образом, заявляемое изобретение не нарушает прав интеллектуальной собственности, описанной в патенте РФ №2451937.
Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок известен также способ выявления опухоли молочной железы и дифференцировки злокачественных и доброкачественных образований путем измерения 18S рРНК, RASSF8 и Ki-67 методом метилспецифичной ПЦР [22].
Известен патент №CN 101346629 «Метод оценки риска рака молочной железы». Данное изобретение использует металлопротеиназы мочи, в частности ММР-9 и ММР-2 (ADAM 12) для оценки риска развития рака молочной железы. При этом показано, что эти показатели значительно повышены у женщин с высоким риском развития рака молочной железы и что мониторинг отсутствия или присутствия как ММР 9, так и ADAM 12 представляет собой новое средство для лечения рака молочной железы. Кроме того, показано, что уровни ММР 9 и ADAM 12 служат независимыми предикторами риска рака молочной железы.
Известен патент №RU 2430371 «Способ дифференциальной диагностики и прогноза миомы и рака эндометрия». Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Предложен способ дифференциальной диагностики злокачественной опухоли и миомы эндометрия. В материале опухоли матки пациента, полученном во время операции, определяют содержание цинка и уровень экспрессии металлопротеаз (ММР). При увеличении количества цинка в опухолевой ткани с 105 до 160 ppm и наличии экспрессии ММР 3, 9 делают прогноз о наличии злокачественной опухоли с тенденцией к метастазированию, при уменьшении содержания цинка от 153 до 75 ppm в опухолевой ткани по сравнению с нетрансформированной и наличии экспрессии ММР 2 делается вывод о наличии миомы матки. При этом активность металлопротеиназ определяют непосредственно в ткани методом мультиплексной ОТ-ПЦР. Из анализа распределения злокачественных опухолей матки по экспрессии ММР и содержанию ионов Zn можно заключить, что в большинстве случаев повышение экспрессии ММР 3 и 9 совпадает с повышенным содержанием Zn в сравнении с нетрансформированной тканью. Это может быть связано с неблагоприятным прогнозом рака эндометрия.
Известен патент №WO 2002053018 «Способ выявления полиморфизмов, связанных с карциномой молочной железы в генах МНС» (Major Histocompatibility Complex - главный комплекс гистосовместимости). Данное изобретение относится к диагностическим способам, основанным на полиморфизме у индивидуумов, указывающих на повышенный риск рака молочной железы. Более конкретно, данное изобретение относится к способу диагностики повышенного риска рака молочной железы путем скрининга на наличие генетических полиморфизмов у индивидуумов, в частности генов TNF-α и HSP70-2. Также предложен способ прогнозирования вероятной выживаемости пациента с полиморфизмом, связанным с карциномой молочной железы. Изобретение также обеспечивает скрининговые анализы и профилактические и терапевтические методы, обнаруженные с использованием таких скрининговых анализов.
Известен патент №RU 2403575 «Определение снижения уровня мРНК генов itga9, hyall и hyal2 как способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления». Изобретение относится к области медицины, в частности к методам диагностики в онкологии. Предложено в качестве маркеров для диагностики плоскоклеточнго рака легкого (ПКРЛ) и аденокарциномы легкого (АК) использовать уровень мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2. Сниженный уровень мРНК данных генов в предположительно пораженной раком ткани человека по сравнению с ее уровнем в здоровой ткани служит диагностическим признаком немелкоклеточного рака легкого. Предложенное изобретение позволяет с высокой достоверностью диагностировать немелкоклеточный рак легкого типа АК и ПКРЛ, в том числе на самой ранней клинической стадии опухолевого заболевания.
Известен патент № «Способ скрининга рака молочной железы и предрасположенности к нему». Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для скрининга рака молочной железы и предрасположенности к нему. Проводят маммографию и УЗИ. Дополнительно проводят радиотермометрическое исследование молочных желез и выделяют панель микро-РНК из биологических жидкостей, включающую miR-199а, miR-222, let-7a, miR-196а, miR-106а, miR-21, miR-137, miR-155. Способ обеспечивает возможность выделить из массы дисгормональных заболеваний молочных желез группу патологий молочной железы, которая в обозримом будущем перейдет в рак, за счет совместного использования радиотермометрии и панели микро-РНК.
Известен патент №WO 2011120984 «Способ предсказания рецидива рака молочной железы при эндокринном лечении» Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу предсказания исхода рака молочной железы в положительной по рецептору эстрогена и отрицательной по HER2 опухоли у пациента с раком молочной железы, предусматривающему определение в образце опухоли от указанного пациента величины уровня экспрессии РНК генов UBE2C, BIRC5, DHCR7, STC2, AZGP1, RBBP8, EL6ST и MGP или генов UBE2C, RACGAP1, DHCR7, STC2, AZGP1, RBBP8, IL6ST и MGP, математическое комбинирование величин уровней экспрессии, где более высокий комбинированный показатель указывает на более худший прогноз у указанного пациента по сравнению с более низким комбинированным показателем. Изобретение позволяет эффективно предсказывать исход рака молочной железы.
Известен патент №RU 2517082 «Метод прогноза эффективности иммунотерапии на основании оценки уровня экспрессии мРНК цитокинов в ткани рака почки». Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения чувствительности рака почки к иммунотерапии после проведения нефрэктомии, включающий верификацию диагноза, проведение нефрэктомии рака почки, забор опухолевой и нормальной ткани почки для определения уровня экспрессии цитокинов IL-4, IL-6, IL-10, TGFβ и расчет соотношения уровня экспрессии цитокинов в опухолевой и нормальной ткани почки. При превышении уровня экспрессии цитокинов в опухолевой ткани почки над нормальной терапию считают показанной. Изобретение позволяет эффективно определять чувствительность рака почки к иммунотерапии на основании данных экспрессии цитокинов в опухолевой ткани.
Известен патент №RU 2473555 «Новые способы функционального анализа большого количества экспериментальных данных и групп генов, идентифицированных из указанных данных», который раскрывает способ оценки клинического прогноза для индивида, страдающего раком молочной железы, основанный на измерении экспрессии генов в образце рака молочной железы в следующих дескрипторных группах: (1) ERBB2, STAED3, GRB7, THRAP4, PPARBP; (2) ESR1, GATA3, ХВР1, TFF3, ACADSB; (3) KRT5, KRT17, TRIM29, GABRP; (4) KRT18, KRT8, РРР2СА, KRT8L2; (5) PLAU, COL5A2, FAP, THY1; (6) STAT1, UBE2L6, ТАР1, LAP3 и (7) SEACAM5, SEACAM6, SEACAM7. При этом сверхэкспрессия большинства генов в дескрипторной группе по сравнению с образцом нормальной ткани молочной железы указывает на то, что образец ткани является положительным для данной группы, а отсутствие сверхэкспрессии большинства генов в дескрипторной группе по сравнению с образцом нормальной ткани молочной железы указывает на то, что образец ткани является отрицательным для данной группы.
2
2
Известен патент №RU 2699561 «Способ прогнозирования исхода распространенного рака яичников после адъювантной химиотерапии по схеме АР». Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования исхода распространенного рака яичников после адъюватной химиотерапии по схеме АР (цисплатин 75 мг/м + доксорубицин 50 мг/м). Для этого проводят одномоментное определение уровней матричной РНК (мРНК) васкулоэндотелиального фактора роста (Vascular endothelial growth factor (VEGF-A)) и кросс-комплементирующих генов эксцизионной репарации (ERCC - excision repair cross complementing (ERCC1)). Определение уровней матричной РНК проводят в опухолевой ткани первичной больной, полученной интраоперационно, с последующим расчетом интегрального показателя I по предложенной формуле, и при значении I<2 прогноз считается положительным с вероятностью 81%, а при значении I>2 прогноз считается неблагоприятным в 75% случаев. Изобретение обеспечивает прогнозирование исхода рака яичников после адъювантной химиотерапии по схеме АР для индивидуализации тактики и улучшения результатов лечения больных.
Таким образом, в настоящее время в РФ нет действующих аналогов заявляемого изобретения.
Описание (раскрытие) изобретения
Предложен способ диагностики опухолей человека путем оценки уровня представленности отдельных мРНК в плазме крови (внеклеточной фракции).
Техническим результатом изобретения является ранняя диагностика рака молочной железы и рака яичников на основе оценки и сопоставления уровня представленности мРНК ММР-9 с уровнем мРНК B2m и/или GUSB в плазме периферической крови.
В плазме крови больных РМЖ и РЯ (даже на ранних стадиях заболевания, например, на стадии T1N0M0) существенно возрастает относительное количество мРНК ММР-9. Так, относительное количество мРНК ММР-9 существенно превышает относительное количество мРНК этих цитокинов в плазме крови здоровых индивидов при нормировке по уровню мРНК стабильно представленных транскриптов. Кроме того, у больных с метастазирующим раком уровень мРНК ММР-9 в плазме периферической крови выше, чем у больных с ранним раком молочной железы (стадия T1N0M0).
Уровень представленности внеклеточных РНК цитокинов при развитии РМЖ и РЯ может служить дополнительно исследуемым параметром при диагностике и оценке степени прогрессии заболевания. В частности, уровень мРНК ММР-9 позволяет проводить раннюю диагностику РМЖ и РЯ, делая ее малоинвазивной, а также позволяет осуществлять мониторинг течения заболевания.
Для оценки уровня представленности исследуемых мРНК в плазме периферической крови можно использовать биохимические, генетические, молекулярно-биологические и иные методы, а также их сочетания.
В частности, для оценки уровня представленности исследуемых РНК в плазме периферической крови можно использовать методы обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) и полимеразной цепной реакции (ПЦР). В том числе метод полимеразной цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции в режиме «реального времени».
Для клинической диагностики можно использовать определение уровня представленности в плазме крови пациента мРНК ММР-9 относительно любого другого мРНК гена (или группы мРНК генов), не меняющих уровень представленности в плазме крови при опухолеобразовании.
В частности, можно использовать определение уровня представленности в плазме крови пациента мРНК генов ММР-9 относительно уровня представленности мРНК одного из генов «домашнего хозяйства» (например, B2m и/или GUSB)
На основании экспериментальных данных при сравнении пациентов с РМЖ / РЯ и условно-здоровых пациентов без признаков воспалительных заболеваний методами ОТ-ПЦР и ПЦР «в реальном времени» могут быть получены и проанализированы результаты определения уровня представленности мРНК генов ММР-9 относительно референсных мРНК генов β2-микроглобулина (B2m) человека и/или β-глюкуронидаза (GUSB).
Уровень экспрессии мРНК следует измерять в относительных единицах, определяемых методом ΔΔ Ct с применением нормировочных генов [23].
Осуществление (реализация) изобретения:
Образцы венозной крови необходимо забирать в пробирки с ЭДТА. Процедуру экстракции нуклеиновых кислот желательно начинать не позднее, чем через 2 часа с момента забора крови. Для получения плазмы пробирки с кровью центрифугируют при 3000 g в течение 20 мин). После центрифугирования верхнюю фракцию переносят в новую пробирку. Выделение РНК проводят согласно прилагающейся инструкции, используя коммерческий набор реагентов «ПРОБА-НК» производства ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия), затем выделенную РНК в объеме 16,5 мкл немедленно используют для постановки обратной транскрипции.
Метод обратной транскрипции использовали для получения препарата кДНК. Ингредиенты набора «ОТ-буфер», «Смесь праймеров ОТ и dNTP» и «Ревертазу» - реакционную смесь для проведения обратной транскрипции готовили согласно инструкции производителя по следующей прописи в стерильной пробирке объемом 1,5 мл:
1. ОТ-буфер - 2×(N+1) мкл;
2. «Праймеры+dNTP» - (N+1) мкл;
3. Ревертаза MuMLV 2 ед./мкл - 0,5×(N+1) мкл,
где N - количество анализируемых образцов с учетом отрицательного контроля. Капли со стенок пробирок собирали центрифугированием в течение 3-5 сек.
В пробирки, содержащие по 16,5 мкл препарата подготовленной РНК, добавляли по 3,5 мкл смеси для обратной транскрипции. При постановке отрицательного контроля использовали пробирку, содержащую 16,5 мкл очищенной воды. Перемешивали реакционные смеси 5-7-кратным пипетированием. Пробирки инкубировали при 40°С в течение 30 мин, затем останавливали реакцию прогреванием при 95°С в течение 5 мин. Капли со стенок пробирок собирали центрифугированием в течение 3-5 сек. Полученный препарат кДНК можно хранить при -20°С, либо можно использовать в качестве матрицы сразу для постановки ПЦР-РВ. В качестве матрицы для проведения одной ПЦР-реакции использовали 5 мкл полученного препарата, разбавленного в 2 раза.
Для определения уровня представленности исследуемых мРНК (например, ММР-9) используют метод ПЦР «в реальном времени» в стандартных условиях с праймерами, специфичными к последовательности определяемых РНК. Для исключения коамплификации геномной ДНК желательно расположить праймеры на стыках зкзонов. Желательно, чтобы длины продуктов амплификации всех анализируемых генов отличались друг от друга незначительно и находились в диапазоне 100-300 п. н. Проявку накопления продуктов реакции можно вести как с помощью интеркалирующих красителей, так и с использованием флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов (зондов). Нормированные значения, соответствующие уровню представленности транскриптов каждого гена, можно рассчитывать с помощью метода ΔΔCt или аналогичного.
Для проведения ПЦР использовали следующие олигонуклеотидные праймеры и зонды:
где BHQ1 означает присоединенный к 3'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FAM - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду С на 5'-конце пробы; на основании полученных пороговых циклов (Ct) вычисляют уровень экспрессии генов.
Пробирки (приготовленные как описано выше) устанавливали в детектирующий термоциклер ДТ-прайм (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва) и проводили реакцию со следующими параметрами циклирования:
Программа амплификации:
Для каждой реакции программное обеспечение термоциклера автоматически вычисляло величину порогового цикла Ct (Фигура 1, 2).
В частности, при сравнении уровня экспрессии в плазме крови пациента мРНК ММР-9 относительно уровня экспрессии мРНК B2m и/или GUSB результат исследования считают положительным (развитие опухоли зарегистрировано) при достоверной разнице (р<0.01) уровней экспрессии мРНК ММР-9 в группе больных относительно группы здоровых людей. Результат исследования считают отрицательным (развитие опухоли не зарегистрировано) при отсутствии достоверной разницы (р<0.01) экспрессии мРНК ММР-9 в группе больных относительно группы здоровых людей. Конкретные показатели разницы полученных значений для исследуемых мРНК (например, ММР-9) могут отличаться от приведенных в примере вследствие различий в методиках и для каждой конкретной методики должны быть подобраны экспериментально.
Фигура 1. Типичный вид результатов количественного измерения мРНК ММР-9 и B2m в плазме крови контрольной группы (контроль).
Фигура 2. Типичный вид результатов количественного измерения мРНК ММР-9 и B2m в плазме крови больных (эксперимент).
Список использованных источников
1. WHO. Breast cancer. WHO (2018). // https://www.who.int/cancer/prevention/diagnosis-screening/breast-cancer/en/
2. Bray F., Ferlay J., Soerjomataram I., Siegel R.L., Torre L.A., Jemal A. Global Cancer Statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin, in press. The online GLOBOCAN 2018 database is accessible at http://gco.iarc.fr/. as part of IARC's Global Cancer Observatory.
3. Seiden M.V., Kantoff P.W., Krithivas K., Propert K. et al. Detection of circulating tumor cells in men with localized prostate cancer. // J Clin Oncol. - 1994. - Vol 12. - №12. - P. 2634-2639.
4. Silva J.M. et al. Detection of epithelial messenger RNA in the plasma of breast cancer patients is associated with poor prognosis tumor characteristics. // Clin. Cancer Res. - 2001. - Vol 7. - №9. - P. 2821-2825.
5. Rykova E.Y., Skvortsova Т.E., Hoffmannet A.L. et al. Breast cancer diagnostics based on extracellular DNA and RNA circulating in blood. // Biochem. Suppl. Ser. В Biomed. Chem. - 2008 - Vol 2. - №2. - P. 208-213.
6. Турчанинова M.А., Ребриков Д.В. Профиль РНК цитокинов в плазме крови при нормальном физиологическом состоянии организма. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2009. - Т. 24. -№2. - С. 68-71. [Turchaninova MA Rebrikov DV Profil RNK tsitokinov v plazme krovi pri normalnom fiziologicheskom sostoianii organizma. // Molekuliarnaia genetika mikrobio-logiia i virusologiia 2009. - Vol 24. - №2. -P. 68-71.(InRuss.)].
7. Турчанинова M.А., Мещеряков А.А., Рахманкулова З.П., Ребриков Д.В. Внеклеточные РНК плазмы крови как диагностический маркер опухолей молочной железы. // Биоорг. химия. - 2011 - Т. 37. - №3 - С. 393-398. [Turchaninova MA, Meshcheriakov АА, Rakhmankulova ZP, Rebrikov DV. Vnekletochnye RNK plazmy krovi kak diagnosticheskii marker opukholei molochnoi zhelezy. // Bioorg khimiia. - 2011. - Vol 37 - №3. - P. 393-398.(InRuss.)]
8. Тыщик E.А., Кометова В.В., Родионов В.В., Ребриков Д.В. Оценка представленности внеклеточных РНК изоформ VEGF в плазме крови пациенток с раком молочной железы. // Вестник РГМУ. - 2017. - №4. - С. 26-30. [Tyshchik ЕА. Kometova W, Rodionov W, Rebrikov DV. Otsenka predstavlennosti vnekletochnykh RNK izoform VEGF v plazme krovi patsientok s rakom molochnoi zhelezy. // Vestnik RGMU. - 2017 - №4 - P. 26-30. (In Russ.)].
9. Esquivel-Velazquez M. et al. The role of cytokines in breast cancer development and progression. // J. Interf. Cytokine Res. - 2015. - Vol 35 - №1. - P. 1-16.
10. Ma Y., Ren Y., Dai Z.J., Wu C.J., Ji Y.H., Xu J. IL-6, IL-8 and TNF-α levels correlate with disease stage in breast cancer patients. // Adv Clin Exp Med. - 2017. - Vol 26 - №3. - P. 421-426.
11. Nicolini A, Carpi A, Rossi G. Cytokines in breast cancer. // Cytokine Growth Factor Rev. - 2006. - Vol 17 - №5. - P. 325-337.
12. Bertazza L, Mocellin S. The dual role of tumor necrosis factor (TNF) in cancer biology. // Curr. Med. Chem. - 2010. - Vol 17 - №29. - P. 3337-3352.
13. Jones VS, et al. Cytokines in cancer drug resistance: cues to new therapeutic strategies. // Biochim. biophys. acta-rev. cancer. - 2016. - Vol 1865 - №2. - P. 255-265.
14. Carmeliet P., Jain R.K., Angiogenesis in cancer and other diseases. // Nature. - 2000 - Vol 407 - №6801. - P. 249-257.
15. Welti J, Loges S, Dimmeler S, Carmeliet P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. // J. Clin. Invest. - 2013. - Vol 123 - №8. - P. 3190-3200.
16. Leek R.D., Harris A.L., Lewis С.E. Cytokine networks in solid human tumors: regulation of angiogenesis. // J. Leukoc. Biol. - 1994. - Vol 56 - №4 - Р. 423-435.
17.  S., Zajkowska M.,  E.K.,  G.E., Szmitkowski M. Plasma levels and diagnostic utility of VEGF, MMP-9, and TIMP-1 in the diagnosis of patients with breast cancer. // Onco Targets Ther. - 2016. - Vol 9: P. 911-919. doi: 10.2147/OTT.S99959
18. Yousef E.M., Tahir M.R., St-Pierre Y., Gaboury L.A. MMP-9 expression varies according to molecular subtypes of breast cancer. // BMC Cancer. - 2014. - Vol 14: 609. doi: 10.1186/1471-2407-14-609.
19. Rashad Y.A., Elkhodary T.R., El-Gayar A.M., Eissa L.A. Evaluation of serum levels of HER2, MMP-9, nitric oxide, and total antioxidant capacity in egyptian breast cancer patients: correlation with clinico-pamological parameters. // Sci Pharm. - 2013. - Vol 82, №1. - P. 129-145. doi: 10.3797/scipharm. 1306-18.
20. Hu X., Li D., Zhang W., Zhou J., Tang В., Li L. Matrix metalloproteinase-9 expression correlates with prognosis and involved in ovarian cancer cell invasion. // Arch Gynecol Obstet. - 2012. - Vol 286, №6. - P. 1537-1543. doi: 10.1007/s00404-012-2456-6.
21. Weigel M.Т.,  J., Schem C., Wenners A., Alkatout I., Jonat W., et al. Differential expression of MMP-2, MMP-9 and PCNA in endometriosis and endometrial carcinoma. // Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. - 2012. - Vol 160, №1. - P. 74-78. doi: 10.1016/j.ejogrb.2011.09.040.
22. Рытова E.Ю. Циркулирующие внеклеточные ДНК и РНК крови в диагностике опухолей молочной железы. // Биоорганическая химия. - 2008 - Т.54 - №1. - С. 94-103. [Rytova Е. Yu. Circulating extracellular DNA and RNA of blood in the diagnosis of breast tumors. // Bioorg kriimiia. - 2008. - Vol 54 - №1. - P. 94-103. (In Russ.)].
23. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 22DDCT Method. // Methods. - 2001. - Vol 25 - №4. - P. 402-408.