Способ определения алкалоидов в экстракте термопсиса
METHOD FOR DETERMINATION OF ALKALOIDS IN THERMOPSIS EXTRACT

Настоящее техническое решение относится к области химии, фармации, медицине, и может быть использовано в фармацевтической промышленности и в смежных отраслях, для определения активных биологических веществ в лекарственных растительном сырье и/или в лекарственных растительных препаратах, биологически активных добавках, с использованием высокоэффективной тонкослойной хроматографии - денситометрии (ВЭТСХ - денситометрии).
Уровень техники
Высокоэффективная тонкослойная хроматография - денситометрия (ВЭТСХ - денситометрия) в настоящее время активно используется в фармацевтической промышленности и научно-исследовательской деятельности. ВЭТСХ - денситометрия основана на измерении поглощения электромагнитного излучения зоной адсорбции определяемого вещества на хроматографической пластинке после разделения компонентов пробы с использованием дериватизации или без нее.
ВЭТСХ - денситометрия обладает высокой эффективностью разделения, низким пределом обнаружения анализируемых веществ (до 1 пикограмма на зону адсорбции), высокой воспроизводимостью (стандартное отклонение меньше 3%), но при этом способ прост в исполнении, на сегодняшний момент высоко автоматизирован, занимает небольшое количество времени, в отличие от высокоэффективной жидкостной хроматографии или газовой хроматографии, так как позволяет проводить хроматографирование до 40 треков на одной хроматографической пластинке с последующим сканированием.
ВЭТСХ - денситометрия может быть использована в анализе различных биологических активных веществ растительного происхождения, таких как алкалоиды, фенольные соединения, стероидные соединения, терпеноиды, витамины и многие другие вещества. ВЭТСХ - денситометрия позволяет определить содержание отдельного биологически активного вещества либо группы биологически активных веществ в растительном сырье или лекарственных препаратах/биологически активных добавках на их основе, при этом минимизировано влияние балластных веществ, которые являются серьезной проблемой в анализе лекарственных препаратов растительного происхождения, так как химический состав таких препаратов чрезвычайно сложен и может включать множество различных веществ.
Для лекарственных препаратов растительного происхождения существует острая потребность в чувствительных, селективных и точных методах анализа, так как в настоящее время для анализа используются способы, не обладающие вышеперечисленными характеристиками, либо очень сложные и длительные способы анализа.
В качестве объектов исследования выбраны: экстракт термопсиса сухой, стандартизированный по сумме алкалоидов в пересчете на термопсин и листья толокнянки обыкновенной, стандартизированные по содержанию фенолгликозида - арбутина.
Из уровня техники известен способ количественного определения суммы алкалоидов в пересчете на термопсин методом титриметрии [1]. Недостатками данного способа являются: низкая селективность. Способ позволяет определить содержание суммы оснований в извлечении из препарата, к которым относятся не только алкалоиды, но и ряд аминокислот, некоторые витамины, декарбоксилированные производные аминокислот и другие органические, а так же неорганические основания. Данный способ не позволяет определить содержание отдельных алкалоидов термопсиса ланцетного, а так же их соотношение. Вероятность ошибки из-за высокой субъективности определения конечной точки титрования. Испытуемый раствор имеет различную окраску: от бледно-желтой до коричневато-желтой, при этом интервал перехода окраски индикатора от зеленого до сине-фиолетового.
Из уровня техники известен другой способ определения алкалоидов в термопсисе ланцетном методом ВЭЖХ. Данный способ обладает высокой точностью, чувствительностью и селективностью, но при этом имеет недостатки: требует наличия очень дорого оборудования, занимает много времени, не позволяет определить сумму алкалоидов, поскольку на хроматограмме испытуемого раствора можно идентифицировать только пик термопсина по сравнению со стандартным раствором термопсина, идентификацию остальных пиков провести невозможно из-за отсутствия стандартных образцов других алкалоидов термопсиса [2].
Способ количественного определения суммы алкалоидов методом гравиметрии описан в работе [3] и обладает очень низкой селективностью и точностью, так как в извлечение из лекарственного растительного препарата попадает большое количество балластных веществ.
Способ количественного определения суммы алкалоидов Маклейи сердцевидной методом денситометрии описан в работе [4]. Данный способ обладает высокой чувствительностью и селективностью. Однако данный способ не позволяет определить содержание конкретных алкалоидов и их соотношение и имеет высокую погрешность измерений.
Из уровня техники известен способ количественного определения арбутина методом спектрофотометрии с использованием стандартного образца арбутина или с использованием удельного показателя поглощения [5]. Однако данный способ обладает низкой селективностью и степенью точности, результаты количественного определения арбутина при использовании этого способа могут достигать более 25% в пересчете на сухое сырье.
В монографии Европейской Фармакопеи «BEARBERRY LEAF», 07/2013:1054 [6] для количественного определения арбутина в листьях толокнянки обыкновенной используется метод ВЭЖХ, который обладает высокой селективностью и точностью. К недостаткам можно отнести высокую длительность и стоимость анализа, недостаточное разрешение между пиком арбутина и пиками сопутствующих веществ при использовании хроматографических колонок отдельных производителей.
Способ количественного определения арбутина с использованием ВЭТСХ - денситометрии был описан в источнике [7]. Однако представленный способ имеет недостатки: из-за отсутствия очистки испытуемого раствора наблюдается сильный шум базовой линии при сканировании, не указаны условия экстракции, пики арбутина несимметричны, что не позволяет дать достоверную оценку результатов.
В способе ТСХ - денситометрии, раскрытом в источнике [8] используются ТСХ пластинки, что ведет к увеличению времени анализа, используется однократная экстракция, которая не может гарантировать полное извлечение арбутина из лекарственного растительного препарата; очистка метанольного извлечения из лекарственного растительного препарата от дубильных веществ производится ацетатом свинца, являющимся токсичным, канцерогенным соединением (3 класс опасности по стандарту NFPA 704), при этом образующийся аморфный осадок сложно отфильтровать, предпочтительно использовать центрифугирование; использование метода внутреннего стандарта усложняет расчет содержания арбутина.
Технической задачей является разработка способа определения биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье и/или лекарственных растительных препаратах, с применением ВЭТСХ - денситометрии, обладающего чувствительностью, селективностью и точностью, а также, позволяющего определить его подлинность и содержание основных биологически активных веществ в лекарственных препаратах растительного происхождения или в биологически активных добавках.
Раскрытие сущности изобретения
Технической задачей является разработка способа определения биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах с применением ВЭТСХ - денситометрии: в одном случае способа определения суммы алкалоидов в экстракте термопсиса, в другом случае способа определения арбутина в листьях толокнянки обыкновенной. Разработанный способ, характеризуется чувствительностью, селективностью, точностью и позволяют определить его подлинность и содержание основных активных веществ в лекарственном препарате растительного происхождения.
Техническим результатом является разработка технического решения, в виде способа, характеризующегося селективностью, чувствительностью и точностью.
В одном случае, определение алкалоидов, технический результат заявленного технического решения достигается за счет:
1) экстракции композицией (смесью растворов), состоящей из хлороформа, аммиака раствора 32%, воды, с последующим промыванием хлороформом;
2) стандартных образцов цитизина и термопсина;
3) метода абсолютной градуировки;
4) высокоэффективных хроматографических пластинок со слоем силикагеля и подвижной фазы, состоящей из хлороформа, метанола, аммиака раствора 32%;
5) раствора для обработки пластинки, включающим композицию из раствора висмута нитрата основного в кислоте уксусной ледяной и водного раствора калия йодида и добавленным к ней метанолом.
В другом случае, определение арбутина, технический результат заявленного технического решения достигается за счет:
1) трехкратной экстракции (извлечении) этанолом 70% при нагревании на кипящей водяной бане;
2) элюирования полученного фильтра (извлечения) этанолом 70% на препаративной хроматографической колонке с алюминия оксидом основным;
3) стандартного образца арбутина;
4) метода абсолютной градуировки;
5) высокоэффективных хроматографических пластинок со слоем силикагеля с флуоресцентным индикатором и подвижной фазы, состоящей из хлороформа, метанола и уксусной кислоты ледяной;
6) использования для обработки хроматографической пластинки композиции (раствора), состоящей из концентрированной серной кислоты и этанола 96% в соотношении 2:8.
Используемые термины и определения
Базовая линия - участок хроматограммы, соответствующий сигналу детектора от подвижной фазы, не содержащей разделяемых веществ.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (далее - ВЭЖХ).
Высокоэффективная тонкослойная хроматография - денситометрия (далее - ВЭТСХ - денситометрия).
х
у
n-й
x
x
y
Полиномиальная регрессия в статистике - это форма регрессионного анализа, в которой взаимосвязь между независимой переменной  и зависимой переменной  моделируется как многочлен  степени в . Полиномиальная регрессия соответствует нелинейной зависимости между значением  и соответствующим условным средним значением , обозначаемым E(y|x). Хотя полиномиальная регрессия соответствует нелинейной модели для данных, как задача статистической оценки, она линейна в том смысле, что функция регрессии E (y|x) линейна по неизвестным параметрам, которые оцениваются по данным. По этой причине полиномиальная регрессия считается частным случаем множественной линейной регрессии [10].
Метод абсолютной калибровки для количественного определения содержания компонентов в анализируемой пробе заключается в построении калибровочной кривой зависимости площади или высоты хроматографического пика от содержания этого вещества в анализируемой пробе [11].
Осуществление изобретения
В области обеспечения качества лекарственных средств, полученных из лекарственного растительного сырья, актуальной задачей является разработка современных, высокоточных методов анализа, способных достоверно определять содержание действующих веществ Высокоэффективная тонкослойная хроматография - денситометрия (ВЭТСХ - денситометрия) зарекомендовала себя как быстрый и эффективный способ количественного определения действующих веществ в лекарственном растительном сырье.
В отличие от реактива Драгендорфа и реактива Драгендорфа модифицированного используемых в ВЭТСХ - денситометрии, для растительного сырья содержащего алкалоиды, были разработаны растворы, с улучшенными реологическими характеристиками, обеспечивающие быстрое испарение с поверхности пластинки, отсутствие разводов, подтеков и прочих дефектов на хроматографической пластинке, при этом, равномерно окрашивающие силикагель. Обработку хроматографических пластинок проводили детектированием, путем погружения их в раствор для обработки пластинки.
В одном случае в качестве объекта исследований для определения алкалоидов в лекарственном растительном сырье был использован экстракт термопсиса сухой.
Известно [9], что основными алкалоидами, содержащимися в траве термопсиса ланцетного, являются:
термопсин, имеющий следующую структурную формулу:
;
цитизин, имеющий следующую структурную формулу:
;
N-метилцитизин, имеющий следующую структурную формулу:
;
Спартеин (Пахикарпин), имеющий следующую структурную формулу:
Все алкалоиды термопсиса ланцетного имеют третичную аминогруппу, при этом цитизин имеет третичную и вторичную аминогруппу, ответственную за ионизацию молекулы алкалоида.
Способ определения алкалоидов термопсиса ланцетного, характеризующийся тем, что используют высокоэффективную тонкослойную хроматографию - денситометрию (ВЭТСХ-денситометрию), проводят экстракцию композицией, состоящей из хлороформа, воды, 32% раствора аммиака в соотношении 20:1:1, прибавляют натрия сульфат безводный, перемешивают и фильтруют, извлечение еще два раза экстрагируют хлороформом и фильтруют, упаривают до сухого остатка, который растворяют в метаноле, далее разделяют на хроматографической пластинке со слоем силикагеля с флуоресцентным индикатором в камере с подвижной фазой, состоящей из хлороформа, метанола, аммиака раствора 35 % об./об. в соотношении 20:3:0,5, затем пластинку обрабатывают раствором, включающим композицию из 0,48% раствора висмута нитрата основного в уксусной кислоте ледяной и 60% водного раствора калия йодида в соотношении 25:5, с прибавленным к ней метанолом в соотношении 1:7,33, сканируют на спектроденситометре при длине волны 520 нм.
Способ, дополнительно характеризующийся, тем, что алкалоиды термопсиса, представляют собой цитизин и термопсин.
Способ, дополнительно характеризующийся, тем, что подвижной фазой насыщали камеру в течение 1 часа.
Способ, дополнительно характеризующийся, тем, что на пластинку наносили стандартный раствор по 2 мкл, 4 мкл, 8 мкл, 12 мкл, 16 мкл, 20 мкл в виде полос шириной 8 мм на расстоянии 1 см от нижнего края пластинки.
Способ, дополнительно характеризующийся, тем, что на пластинку наносили 15 мкл испытуемого раствора в трех параллелях по два нанесения в виде полос шириной 8 мм на расстоянии 1 см от нижнего края пластинки.
Способ, дополнительно характеризующийся, тем, что стандартный раствор, представляющий собой раствор цитизина 0,05% и термопсина 0,025% в метаноле.
Способ, дополнительно характеризующийся, тем, что фильтруют через предварительно промытый хлороформом бумажный фильтр, с помещенным на нем натрия сульфатом безводным.
Способ, дополнительно характеризующийся, тем, что длина прохождения подвижной фазы 4 см от линии старта.
Способ, дополнительно характеризующийся, тем, что хроматографическая пластинка является высокоэффективной.
Проведение пробоподготовки.
Из экстракта термопсиса сухого, извлекают алкалоиды, в виде оснований, композицией (смесью растворов), состоящей из хлороформа, аммиака раствора 32% и воды, взятых в соотношении 20:1:1, соответственно, и перемешивают. К полученному извлечению (экстракту) прибавляют натрия сульфат безводный, перемешивают и фильтруют.
Далее, к извлечению с натрием сульфата безводного добавляют хлороформ, экстрагируют и затем фильтруют. Повторяют два раза.
Фильтрование проводят через предварительно промытый хлороформом бумажный фильтр с помещенным на него натрия сульфатом безводным.
Полученный фильтрат упаривают при температуре 40°С до сухого остатка, который затем растворяют в метаноле. Наносят испытуемые растворы на высокоэффективную хроматографическую пластинку.
В качестве стандартного раствора используют раствор цитизина 0,05% и термопсина 0,025% в метаноле.
В заявленном способе используют мерную емкость или любую другую известную специалисту из данной области техники лабораторную мерную посуду.
Восходящее элюирование проводят в камере, предварительно насыщенной подвижной фазой следующего состава: хлороформ, метанол и аммиака раствор 32% в соотношении 20:3:0,5, соответственно.
Расстояние прохождения фронта подвижной фазы от линии старта составляет 4 см при нанесении растворов образцов на высоту 1 см от нижнего края пластинки.
В качестве раствора для обработки хроматографической пластинки используют раствор, включающий композицию из 0,48% раствора висмута нитрата основного в уксусной кислоте ледяной и 60% водного раствора калия йодида в соотношении 25:5, с прибавленным к ней метанолом в соотношении 1:7,33.
Хроматографическую пластинку погружают на 1 секунду в раствор для обработки хроматографической пластинки.
Проводят хроматографирование при следующих условиях:
- абсолютная градуировка, где на пластинку наносят стандартный раствор по 2 мкл, 4 мкл, 8 мкл, 12 мкл, 16 мкл, 20 мкл, в виде полосы шириной 8 мм на расстоянии 1 см от нижнего края; 15 мкл испытуемого раствора в трех параллелях по два нанесения;
- насыщают камеру подвижной фазой 1 час;
-прохождение фронта подвижной фазы длинной 4 см от линии старта;
- сканирование на спектроденситометре при длине волны 520 отражение, щель микро 6×0,1.
В другом случае, в качестве объекта исследований использовали листья толокнянки обыкновенной. Основным действующим веществом листьев толокнянки обыкновенной является фенолгликозид - арбутин, представляющий собой β-D-глюкопиранозид гидрохинона, характеризующийся структурной формулой:
Способ определения арбутина в листьях толокнянки, характеризующийся тем, что используют высокоэффективную тонкослойную хроматографию - денситометрию (ВЭТСХ-денситометрию), проводят пробоподготовку, где экстрагируют 70% этанолом на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждают, фильтруют, экстрагирование повторяют два раза по 10 минут, затем фильтрат помещают на препаративную колонку и элюируют этанолом 70%, далее разделяют на высокоэффективной хроматографической пластинке со слоем силикагеля с флуоресцентным индикатором с использованием подвижной фазы, состоящей из хлороформа, метанола, уксусной кислоты ледяной в соотношении 11:3,5:1 и затем пластинку обрабатывают композицией, состоящей из концентрированной серной кислоты и этанола 96% в соотношении 2:8, высушивают, сканируют на спектроденситометре при длине волны 285 нм.
Способ, дополнительно характеризуется, тем, что подвижной фазой насыщали камеру 30 минут.
Способ, дополнительно характеризуется, тем, что на пластинку наносят стандартный раствор по 1 мкл, 2 мкл, 4 мкл, 6 мкл, 8 мкл, 10 мкл в виде полосы шириной 8 мм на расстоянии 1 см от нижнего края.
Способ, дополнительно характеризуется, тем, что на пластинку наносят 5 мкл испытуемого раствора в трех параллелях по два нанесения на расстоянии 1 см от нижнего края.
Способ, дополнительно характеризуется, тем, что используют стандартный раствор арбутина 0,1% в этаноле 70%.
Способ, дополнительно характеризуется, тем, что длина прохождения подвижной фазы 4 см от линии старта.
Способ, дополнительно характеризующийся, тем, что используются листья толокнянки обыкновенной, измельченные в виде порошка.
К измельченным листьям толокнянки обыкновенной прибавляют этанол 70 % и экстрагируют на кипящей водяной бане 15 минут. Полученный экстракт охлаждают до комнатной температуры, фильтруют. Процедуру экстрагирования на кипящей водяной бане с последующим фильтрованием повторяют, где повторную экстракцию осуществляют в течение 10 минут. Фильтрат помещают на препаративную колонку и элюируют этанолом 70%, доводят до метки раствором этанола 70 % и перемешивают.
Фильтрование проводят через бумажный фильтр, предварительно промытый этанолом 70 %.
В качестве стандартного раствора используют 0,1% стандартный раствор арбутина в этаноле 70%.
Разделение проводят на высокоэффективной хроматографической пластинке с использованием подвижной фазы (композиции) следующего состава: хлороформ, метанол, уксусная кислота ледяная (не менее 98,8%) в соотношении 11:3,5:1, соответственно.
Расстояние прохождения фронта подвижной фазы - 4 см, при нанесении растворов образцов на высоту 1 см от нижнего края пластинки.
В качестве раствора для обработки хроматографической пластинки используют композицию, состоящую из серной кислоты концентрированной (93,56-95,68%) и этанола 96% в соотношении 2:8, соответственно.
Используют препаративную колонку (высота 20 см и диаметр 1,5 см), промытую этанолом 70% и заполненную алюминием оксидом основным.
Хроматографическую пластинку погружают на 1 секунду в раствор для обработки хроматографической пластинки.
Проводят хроматографирование при условии:
- подготовки высокоэффективной хроматографической пластинки со слоем силикагеля с флуоресцентным индикатором путем хроматографирования в подвижной фазе этанол 96% на высоту 5 см от нижнего края пластинки, нагреванием до 103±2°С, и затем охлаждением до комнатной температуры;
- абсолютной градуировки, где на пластинку наносят раствор стандартного образца арбутина по 1 мкл, 2 мкл, 4 мкл, 6 мкл, 8 мкл, 10 мкл в виде полосы шириной 8 мм на расстоянии 1 см от нижнего края; 5 мкл испытуемого раствора в трех параллелях по два нанесения;
- насыщения камеры подвижной фазой 30 минут;
- длине прохождения фронта подвижной фазы 4 см от линии старта;
- сканировании на спектроденситометре при длине волны 285 нм, щель микро 6×0,1.
Краткое описание чертежей и иных материалов (Приложения 1-12).
Фиг. 1. Хроматограмма в видимом свете после проявления раствором для обработки пластинки. 1.1 - раствор СО Цитизина и Термопсина, 2 мкл; 1.2 - раствор СО Цитизина и Термопсина 4, мкл; 1.3 - раствор СО Цитизина и Термопсина, 8 мкл; 1.4 - раствор СО Цитизина и Термопсина, 12 мкл; 1.5 - раствор СО Цитизина и Термопсина, 16 мкл; 1.6 - раствор СО Цитизина и Термопсина, 20 мкл; 1.7-1.8 - испытуемый раствор №1, 15 мкл; 1.9-1.10 - испытуемый раствор №2, 15 мкл; 1.11-1.12 - испытуемый раствор №3, 15 мкл.
Фиг. 2. Хроматограмма испытуемого раствора при сканировании при длине волны 520 нм.
Фиг. 3. Хроматограмма стандартных растворов (нанесение 8 мкл) при сканировании при длине волны 520 нм.
Фиг. 4. Спектры зон адсорбции цитизина (вверху спектр стандартного раствора, внизу испытуемого раствора).
Фиг. 5. Спектры зон адсорбции термопсина (вверху спектр стандартного раствора, внизу испытуемого раствора).
Фиг. 6. Калибровочная кривая стандартных растворов цитизина.
Фиг. 7. Калибровочная кривая стандартных растворов термопсина.
Фиг. 8. Хроматограмма проявления раствором для обработки пластинки при 254 нм:
2.1 - раствор СО арбутина, 1 мкл; 2.2 - раствор СО арбутина, 2 мкл; 2.3 - раствор СО арбутина, 4 мкл; 2.4 - раствор СО арбутина, 6 мкл; 2.5 - раствор СО арбутина, 8 мкл; 2.6 - раствор СО арбутина, 10 мкл, 2.7-2.8 - испытуемый раствор №1, 5 мкл; 2.9-2.10 - испытуемый раствор №2, 5 мкл; 2.11-2.12 - испытуемый раствор №3, 5 мкл.
Фиг. 9. Хроматограмма испытуемого раствора при сканировании при длине волны 285 нм.
Фиг. 10. Спектр зоны адсорбции арбутина стандартного раствора арбутина 1 мг/мл (сверху), спектр зоны адсорбции арбутина раствора испытуемого образца (снизу).
Фиг. 11. Хроматограмма в видимом свете после проявления раствором для обработки пластинки: 2.1 - раствор СО арбутина, 1 мкл; 2.2 - раствор СО арбутина, 2 мкл; 2.3 - раствор СО арбутина, 4 мкл; 2.4 - раствор СО арбутина, 6 мкл; 2.5 - раствор СО арбутина, 8 мкл; 2.6 - раствор СО арбутина, 10 мкл, 2.7-2.8 - испытуемый раствор №1, 5 мкл; 2.9-2.10 - испытуемый раствор №2, 5 мкл; 2.11-2.12 - испытуемый раствор №3, 5 мкл.
Фиг. 12. Зависимость площади пика (S) арбутина от концентрации (С) арбутина в стандартном растворе.
Возможность реализации заявленного способа раскрыта в следующих примерах.
Пример 1. Определение подлинности и количественного содержания суммы алкалоидов в пересчете на термопсин в экстракте термопсиса сухом.
К экстракту термопсиса сухого (1 г) прибавляют хлороформ, раствор аммиака 32%, воду, в соотношении 20:1:1, соответственно. Полученное извлечение перемешивают на орбитальном шейкере 20 минут. Затем к извлечению добавляют натрия сульфат безводный (2 г), снова перемешивают, а затем фильтруют.
Далее, к извлечению с натрием сульфатом безводным прибавляют 10 мл хлороформа, экстрагируют и затем фильтруют. Повторяют два раза.
Фильтрование проводят через зольный фильтр «черная лента» с помещенным на него натрия сульфатом безводным (3 г), предварительно промытый хлороформом.
Полученный фильтрат упаривают досуха на ротационном испарителе при 40°С, а далее остаток растворяют в метаноле (10 мл).
В качестве стандартного раствора используют раствор цитизина 0,05% и термопсина 0,025% в метаноле.
В заявленном способе используют мерную емкость со шлифом с плотно прилегающей пробкой/крышкой или любую другую известную специалисту из данной области техники емкость или тару, позволяющую провести экстракцию/извлечение.
На высокоэффективную хроматографическую пластинку со слоем силикагеля размером 20×10 см на 1 см от нижнего края пластинки наносят стандартный раствор в виде полосы длиной 8 мм по 2 мкл, 4 мкл, 8 мкл, 12 мкл, 16 мкл, 20 мкл, 15 мкл испытуемого раствора в трех параллелях по две аппликации.
Пластинку помещают в камеру для хроматографии, предварительно насыщенную подвижной фазой в течение часа.
Подвижная фаза представляет собой смесь растворов (композицию) хлороформа, метанола, аммиака раствора 32% (об./об) в соотношении 20:3:0,5, соответственно.
После прохождения 4 см фронтом подвижной фазы от линии старта, пластинку вынимают из хроматографической камеры и высушивают в вытяжном шкафу до исчезновения следов растворителей. Пластинку погружают на 1 секунду в раствор для обработки хроматографической пластинки. Пластинку высушивают в потоке горячего воздуха в течение 2-3 минут и затем сканируют на спектроденситометре.
В качестве композиции (раствора) для обработки хроматографической пластинки используют раствор, полученный смешиванием 0,48% раствора висмута нитрата основного в кислоте уксусной ледяной (не менее 98,8%) и водного раствора калия йодида 60%, взятых в соотношении 25:5, соответственно, где к полученной композиции (смеси растворов) прибавляют метанол в соотношении 1:7,33, соответственно.
Условия сканирования:
Длина волны: 520 нм;
Режим: поглощение/отражение.
Щель: микро 6×0,1 мм
По результатам испытаний, на хроматограммах испытуемого раствора обнаруживают 7 зон адсорбции алкалоидов. Зона адсорбции с Rf≈0,45 соответствует цитизину, зона адсорбции с Rf≈0,8 - термопсину (Фиг. 1, 2). На хроматограммах стандартного раствора обнаруживают две зоны адсорбции, соответствующие термопсину и цитизину (Фиг. 1,3).
Длина волны сканирования 520 нм соответствует максимуму поглощения спектров термопсина и цитизина (Фиг. 4,5).
Строят калибровочные кривые для стандартных образцов цитизина и термопсина по площади пика. Для формулы кривой используется метод полиномиальной регрессии.
Расчет содержания цитизина и проводится методом абсолютной градуировки по результатам анализа шести различных концентраций стандарта цитизина (по площади пика).
Расчет содержания термопсина проводился методом абсолютной градуировки по результатам анализа шести различных концентраций стандарта термопсина (по площади пика).
Расчет проводят по формуле (1):
,
где А содержание определяемого вещества в мг, (рассчитанное);
а - навеска препарата, мг;
W - содержание влаги в препарате, %.
Содержание суммы алкалоидов в пересчете на термопсин рассчитывают по формуле (2):
,
где C - содержание цитизина в мг в навеске препарата.
Т - содержание термопсина в мг в навеске препарата.
- сумма площадей всех пиков;
SC - площадь пика цитизина;
ST - площадь пика термопсина;
а - навеска препарата, мг;
W - содержание влаги в препарате, %.
В ходе анализа установлено, что термопсин, цитизин и неидентифицированный алкалоид с Rf≈0,25 являются доминирующими алкалоидами, сумма площадей их пиков составляет около 80% суммы площадей всех пиков алкалоидов (табл. 1).
<b>Таблица 1</b>. Площади пиков на хроматограмме испытуемого раствора.
Пик №
Rf
Площадь, A
Площадь, %
Наименование образца
1
0,1086
0,0022
9,17
Неидентифицирован
2
0,2505
0,00704
29,05
Неидентифицирован
3
0,355
0,00085
3,49
Неидентифицирован
4
0,555
0,00521
21,51
Цитизин
5
0,716
0,00037
1,51
Неидентифицирован
6
0,763
0,00131
2,10
Неидентифицирован
7
0,830
0,00724
29,87
Термопсин
Площадь пика термопсина составляет 29,9 % от суммы площадей всех пиков, площадь пика цитизина составляет 21,5 % от суммы площадей всех пиков.
<b>Таблица 2.</b> результаты анализов содержания суммы алкалоидов в термопсиса экстракте сухом для серии 1
Проба
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Влажность, % - 3,7Сумма алкалоидов в пересчете на термопсин методом титрования, % - 0,98±0,061 RSD=3,59%
Содержание термопсина, %
0,157±0,009
0,147±0,018
0,146±0,023
0,143±0,012
0,149±0,019
0,142±0,012
0,149±0,005
0,145±0,005
0,149±0,006
Хср.%=0,147±0,034 RSD %=3,00
Содержание цитизина, %
0,232±0,012
0,230±0,016
0,222±0,027
0,224±0,020
0,234±0,020
0,240±0,027
0,235±0,016
0,227±0,004
0,239±0,011
Хср.%=0,230±0,0045 RSD %=2,54
Сумма алкалоидов в пересчете натермопсин, %
0,666±0,146
0,670±0,032
0,690±0,133
0,655±0,011
0,697±0,019
0,676±0,045
0,697±0,143
0,716±0,111
0,699±0,098
Хср.%=0,685±0,015 RSD %=2,89
<b>Таблица 3.</b> Результаты анализов содержания суммы алкалоидов в термопсиса экстракте сухом для серии 2
Проба
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Влажность, % - 2,1Сумма алкалоидов в пересчете на термопсин методом титрования, % - 0,98±0,056 RSD=3,15%
Содержание термопсина, %
0,180±0,031
0,173±0,009
0,170±0,002
0,168±0,036
0,169±0,013
0,168±0,023
0,168±0,011
0,171±0,025
0,179±0,033
Хср.%=0,171±0,030 RSD %=2,73
Содержание цитизина, %
0,253±0,022
0,244±0,002
0,248±0,014
0,240±0,038
0,235±0,050
0,246±0,012
0,240±0,021
0,238±0,005
0,253±0,004
Хср.%=0,244±0,005 RSD %=2,63
Сумма алкалоидов в пересчете натермопсин, %
0,748±0,060
0,723±0,085
0,719±0,055
0,740±0,074
0,695±0,074
0,750±0,043
0,745±0,035
0,715±0,010
0,696±0,055
Хср.%=0,726±0,016 RSD %=2,95
Содержание алкалоидов определяли при помощи известного специалисту в данной техники устройства - спектроденситометра.
Содержание цитизина в экстракте термопсиса сухого больше приблизительно в 1,5 раза, чем термопсина (табл. 2, 3).
Расчет неидентифицированных алкалоидов экстракта термопсиса сухого рассчитывали на термопсин.[6].
Проведена валидация разработанной методики, подтверждающая ее пригодность для количественного определения суммы алкалоидов в пересчете на термопсин в термопсиса экстракте сухом. Результаты валидации представлены в таблице 4. Для подтверждения специфичности методики использовалась модельная смесь, состоящая из 23,46 мг цитизина, 15,06 мг термопсина и 9,98 г сахарозы. 1 грамм модельной смеси подвергали анализу по вышеуказанной методике. Подлинность препарата подтверждается путем визуального осмотра пластинки на основании соответствия окраски и величин Rf зон адсорбции на хроматограмме испытуемого раствора зонам адсорбции цитизина и термопсина на хроматограмме стандартного раствора.
<b>Таблица 4.</b> Результаты валидации методики определения суммы алкалоидов в пересчете на термопсин
<b>Характеристика</b>
<b>Требования</b>
<b>Результат</b>
<b>Специфичность</b>
Присутствие сопутствующих компонентов не влияет непредусмотренным образом на результат анализа
1) Спектр зоны адсорбции цитизина испытуемого раствора полностью совпадает по положению максимумов и минимумов поглощения с спектром зоны адсорбции цитизина стандартного раствора. Спектр зоны адсорбции термопсина испытуемого раствора полностью совпадает по положению максимумов и минимумов поглощения с спектром зоны адсорбции термопсина стандартного раствора.2) Истинные значения содержания цитизина (<b>0,234 мг/г</b>) и термопсина (<b>0,151 мг/г</b>) в модельной смеси лежат в пределах границ доверительных интервалов результатов анализа содержания цитизина и термопсина в модельной смеси.
<b>Линейность</b>
Результаты измерений аналитических сигналов 6 проб с различным содержанием цитизина обработаны методом наименьших квадратов с использованием линейной модели <b>Коэффициент корреляции</b>r =0,9903
Уравнение прямой: <i>Y</i>=0,0015<i>x</i> + 0,001Коэффициент корреляции: r =0,9903
Результаты измерений аналитических сигналов 6 проб с различным содержанием термопсина обработаны методом наименьших квадратов с использованием линейной модели
<b>Коэффициент корреляции </b>r =0,9939
Уравнение прямой: <i>Y </i>= 0,0039<i>x</i> - 0,0008Коэффициент корреляции: r =0,9939
<b>Аналитическая область</b>
Методика применима в интервале от 80% до 120% от номинального значения содержания цитизина и термопсина.
Соответствует на основании данных по изучению линейности
<b>Правильность </b>
Свободный член уравнения меньше своего доверительного интервалаΔ<i>a</i> = <i>t</i>(0,05, <i>n</i> - 2) × <i>s</i><sub>a</sub><i>a</i> ≤ Δ<i>a</i>
На основании данных по изучению линейностиРасчет для цитизина:
<i>a</i> = 0,001
<i>s</i><sub>a</sub>= 0,00461
<i>t</i>(0,05, <i>n</i> - 2) = 2,78Δ<i>a</i> = 2,78 × 0,00461 = 0,01282
<i>a</i> < Δ<i>a</i>
Расчет для термопсина:
<i>a</i> = 0,0008
<i>s</i><sub>a</sub>= 0,00038
<i>t</i>(0,05, <i>n</i> - 2) = 2,78Δ<i>a</i> = 2,78 × 0,00038 = 0,00106
<i>a</i> < Δ<i>a</i>
<b>Прецизионность Повторяемость </b>
<i>RSD</i> результатов 9 определений количественного содержания суммы алкалоидов в пересчете на термопсин должно быть не более 3,0%
<i>Х</i><sub>серия 1 </sub>= 0,685±0,015%
<i>RSD</i> = 2,89%
<i>Х</i><sub>серия 2 </sub>= 0,726±0,016%
<i>RSD</i> = 2,95%
<b>Внутри</b><b>лабораторная прецизионность</b>
Полученное значение критерия Фишера, вычисленное по результатам проведения испытаний разными исполнителями на разном оборудовании, должно быть меньше табличного значения <i>F</i><sub>pract</sub> = <i>s</i>1 2 / <i>s</i>2 2 ≤ <i>F</i><sub>teor</sub>
<i>F</i><sub>pract</sub> = 0,00030 / 0,00003 = 1,11
<i>F</i><sub>teor</sub>(0,05; 2; 2) = 19,00 <i>F</i><sub>pract</sub> < <i>F</i><sub>teor</sub>
<b>Примечание. </b>t(0,95; n - 2) - коэффициент Стьюдента, где 0,95 - вероятность, f - число степеней свободы; F<sub>pract</sub>, F<sub>teor</sub> (0,05; 2; 2) - полученный и табличный критерии Фишера соответственно, где 0,05 - уровень значимости, 2 и 2 - число степеней свободы; s - стандартное отклонение; s1, s2 - большее и меньшее стандартные отклонения полученных результатов соответственно; a - свободный член линейной зависимости, sa - стандартное отклонение свободного члена линейной зависимости, RSD - относительное стандартное отклонение (%).
,
В серии 1 содержание термопсина в %, составило 0,147 % ±0,034 (RSD %=3,00), содержание цитизина в % составило 0,230±0,0045 (RSD %=2,54)содержаниесуммы алкалоидов в пересчете на термопсин, % составило 0,685±0,015 (RSD %=2,89).
,
В серии 2 содержание термопсина в %, составило 0,171±0,030 (RSD %=2,73), содержание цитизина в % составило 0,244±0,005 (RSD %=2,63)содержаниесуммы алкалоидов в пересчете на термопсин составило 0,726±0,016 (RSD %=2,95) (табл. 2, 3). Данный пример подтверждает возможность определения подлинности и содержания суммы алкалоидов заявленным способом.
Заявленный способ обладает селективностью, чувствительностью, точностью определения содержания цитизина, термопсина и неидентифицированных алкалоидов в лекарственном растительном сырье и/или лекарственных препаратах на их основе.
Пример 2.
Линейность способа в аналитической области подтверждается линейной зависимостью площади пика исследуемого вещества от его концентрации в растворе. В разработанном способе аналитическая область содержания цитизина соответствует диапазону значений их концентраций от 1 мкг до 8 мкг, аналитическая область содержания термопсина соответствует диапазону значений их концентраций от 0,5 мкг до 4 мкг. Полученные данные обрабатывали методом полиномиальной регрессии.
В результате расчетов коэффициенты корреляции составили 0,999 для калибровочной кривой цитизина (Фиг. 6) и 0,996 для калибровочной кривой термопсина (Фиг. 7), что свидетельствует о высокой корреляции между оцениваемыми параметрами.
Пример 3.
Определение подлинности и содержания арбутина листьях толокнянки обыкновенной.
К измельченным листьям толокнянки обыкновенной (1,0 г), прибавляют этанол 70 % (20 мл) и извлекают (экстрагируют) на кипящей водяной бане в течение 15 минут. Полученное извлечение (экстракт) охлаждают до комнатной температуры, фильтруют.
Процедуру экстрагирования на кипящей водяной бане с последующим фильтрованием повторяют, где повторную экстракцию осуществляют 10 минут. Полученный фильтрат доводят до метки этанолом 70 % и перемешивают.
Фильтрование проводят через бумажный фильтр, предварительно промытый раствором этанола 70 %.
В заявленном способе используют мерную емкость со шлифом с плотно прилегающей пробкой/крышкой или любую другую известную специалисту из данной области техники емкость или тару, позволяющую провести экстракцию/извлечение.
Стандартный раствор представляет собой арбутина раствор 0,1% в этаноле 70%.
Используют препаративную колонку (высота 20 см и диаметр 1,5 см), промытую этанолом 70% и заполненную алюминием оксидом основным.
На препаративную колонку переносят полученный экстракт (10,0 мл) и элюируют со скоростью 1-2 кап/сек. В колонку прибавляют этанола 70% (5 мл) и так же элюируют. Операцию повторяют. Доводят объём раствора тем же растворителем (этанол 70%) до метки и перемешивают (испытуемый раствор).
Композиция (раствор) для обработки пластинки, состоящая из серной кислоты концентрированной и этанола 96%, взятыми в соотношении 2:8, соответственно, охлажденая до комнатной температуры.
Подготовка хроматографической пластинки: высокоэффективную хроматографическую пластинку со слоем силикагеля с флуоресцентным индикатором помещают в камеру с этанолом 96% и хроматографируют на высоту 5 см от нижнего края пластинки, затем нагревают до (103±2)°С в течение пяти минут и затем охлаждают до комнатной температуры.
На линию старта (10 мм от нижнего края) подготовленной высокоэффективной хроматографической пластинки последовательно наносят раствор стандартного образца арбутина: по 1 мкл, 2 мкл, 4 мкл, 6 мкл, 8 мкл, 10 мкл полосой 8 мм. Два раза по 5 мкл испытуемого раствора. Оставляют до удаления следов растворителя. Помещают пластинку в хроматографическую камеру, насыщенную в течение 30 минут подвижной фазой (композицией) состоящей из: хлороформа, метанола, уксусной кислоты ледяной в соотношении 11:3,5:1, соответственно, и хроматографируют восходящим способом.
Когда фронт растворителей пройдет 4 см от линии старта, пластинку вынимают из камеры, сушат в потоке теплого воздуха под тягой до исчезновения следов растворителя. Пластинку сканируют на спектроденситометре при длине волны 285 нм, размер щели 6×0,1 микро, расчет по площади пика, тип кривой - полиномиальная регрессия.
Затем пластинку обрабатывают раствором для обработки пластинки и нагревают на устройстве для нагрева пластинок в течение 2-3 мин при (103±2)°С. На хроматограммах испытуемого раствора должны обнаруживаться зоны адсорбции от оранжево-коричневого до темно-коричневого цвета с Rf около 0,4 (арбутин).
По результатам испытаний, на хроматограммах стандартных и испытуемых растворов в ультрафиолетовом свете при 254 нм обнаруживается зона адсорбции арбутина с Rf около 0,4 (Фиг. 8).
На хроматограммах испытуемых растворов после сканирования при длине волны 285 нм обнаруживается четкий, симметричный пик арбутина, отделенный от остальных пиков. Шум базовой линии не мешает обработке хроматограммы (фиг. 9).
Содержание арбутина по данным фармакопейных статей должно составлять не менее 6,0% в соответствии с Государственной Фармакопеи РФ, не менее 7,0 % - в соответствии с Фармакопеей Евросоюза.
Содержание арбутина в толокнянке обыкновенной листьях вычисляют по формуле:
С - содержание арбутина в навеске, мг;
а - навеска препарата, мг;
W - влажность лекарственного растительного препарата, %.
Данные результатов количественного определения и валидации разработанной методики, подтверждающие ее пригодность для количественного определения арбутина в листьях толокнянки обыкновенной, приведены в таблицах 5 и 6.
<b>Таблица 5</b> -<b></b>Результаты количественного определения арбутина в листьях толокнянки обыкновенной методом ВЭТСХ
Проба
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Результат, %
7,64
7,69
7,64
7,67
7,82
7,93
7,88
7,90
7,98
7,83
Статистические данные
n=10t(p, f)=2,26 среднее значение=7,79%S ст.откл.= 0,09155 RSD % =1,64Доверительный интервал (Р=95%, α=0,05) ±0,09155верхняя граница ДИ 7,88863нижняя граница ДИ 7,70554
<b>Таблица 6</b> - Результаты валидации методики определения арбутина в листьях толокнянки обыкновенной методом ВЭТСХ
<b>Характеристика</b>
<b>Требования</b>
<b>Результат</b>
<b>Специфичность</b>
Присутствие сопутствующих компонентов не влияет непредусмотренным образом на результат анализа
УФ-спектр зоны адсорбции арбутина полностью совпадает по положению максимумов и минимумов поглощения с УФ-спектром зоны адсорбции стандартного образца арбутина.
<b>Линейность</b>
Данные экспериментальных измерений аналитических сигналов 6 проб с различным содержанием арбутина обработаны методом наименьших квадратов с использованием линейной моделиКоэффициент корреляции r ≥ 0,99
Уравнение прямой: Y=0.0029х+0,0046Коэффициент корреляции: R=0.9964
<b>Аналитическая область</b>
Методика применима в интервале от 80% до 120% от номинального значения содержания арбутина
Соответствует на основании данных по изучению линейности
<b>Правильность</b>
Значение, принимаемое за истинное, лежит внутри доверительного интервала средних результатов анализа, полученных экспериментально по данной методике
Соответствует на основании сравнения результатов полученных с использованием валидируемой методики и образцовой методики Европейской Фармакопеи
<b>Прецизионность Повторяемость</b>
RSD результатов 10 определений количественного содержания арбутина должно быть менее 3,0%
среднее значение содержания арбутина=7,74 %RSD % = 2,04
<b>Межлабораторная прецизионность</b>
Полученное значение критерия Фишера, вычисленное по результатам проведения испытаний разными исполнителями на разном оборудовании, должно быть меньше табличного значения Fpract. = s1 2 /s2 2 ≤ Fteor
Fpract.= 0,00910 /0,00252= 3,61 Fteor.(0,05; 2; 2) = 19,00 Fpract. < Fteor<b>.</b>
Примечание. t(0,95; n-2) - коэффициент Стьюдента, где 0,95 - вероятность, n-2 - число степеней свободы; Fpract. , Fteor. (0,05; 2; 2) - полученный и табличный критерии Фишера соответственно, где 0,05 - уровень значимости, 2 и 2 - число степеней свободы; s - стандартное отклонение; s1 , s2 - большее и меньшее стандартные отклонения полученных результатов соответственно; sa - стандартное отклонение свободного члена, RSD - относительное стандартное отклонение (%)
Спектры зоны адсорбции арбутина испытуемого раствора и зоны адсорбции стандартного раствора арбутина идентичны и имеют максимумы при 224 нм и 286 нм (Фиг. 10).
Подлинность лекарственного растительного препарата подтверждают детекцией, обрабатывая хроматографическую пластинку композицией (раствором) состоящей из серной кислоты концентрированной и этанола 96%, взятые в соотношении 2:8, соответственно.
К недостаткам существующих аналогов относится более низкая чувствительность (4 мкг арбутина для раствора натрия фосфорномолибдата 10% в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации); трудоемкость приготовления реактива натрия карбоната безводного и раствор 2,6-дихлорхинон-4-хлоримида в метаноле в соответствии с Европейской Фармакопеей; недостаточная специфичность детектирования в УФ - свете при длине волны 254 нм (Фиг. 11).
Данный пример демонстрирует возможность определения подлинности и содержания арбутина заявленным способом. Содержание арбутина составило 7,8%, что удовлетворяет требованиям фармакопейных документов.
Пример 4.
Линейность способа в аналитической области подтверждается линейной зависимостью площади пика исследуемого вещества от его концентрации в растворе (Фиг. 12). В разработанном способе, аналитическая область содержания арбутина соответствует диапазону значений его концентраций 1-6 мкг.
Полученные данные обрабатывали методом наименьших квадратов, который заключается в нахождении коэффициентов а, b и коэффициента корреляции r линейной модели:
Y=b*х+а,
где коэффициент х - обозначает концентрацию арбутина, у - площадь пика арбутина, b - угловой коэффициент модели, а - свободный член.
В результате расчетов коэффициент корреляции составил величину 0,996, что доказывает линейность заявленной методики по фармакопейной статье.
Пример 5. Для подтверждения возможности промышленного применения предлагаемого изобретения была доказана его правильность путем сравнения полученных результатов с методикой ВЭЖХ монографии 07/2013:1054 Европейской Фармакопеи (табл. 7), ранее прошедшей процесс валидации.
<b>Таблица 7. </b>Результаты испытаний количественного определения арбутина в толокнянки обыкновенной листьях, полученные методом ВЭЖХ и ВЭТСХ для пяти различных серий лекарственного растительного препарата «Толокнянки обыкновенной листья».
Серия
1
2
3
4
5
Содержание арбутина %, метод ВЭЖХ
7,79±0,09
7,61±0,17
7,14±0,21
8,02±0,11
7,94±0,20
Содержание арбутина %, метод ВЭТСХ
7,74±0,26
7,53±0,23
6,99±0,34
7,94±0,28
7,98±0,35
Результаты, полученные с использование ВЭТСХ - денситометрии, сопоставимы с результатами, полученными при использовании ВЭЖХ (табл. 7). Полученные результаты демонстрируют возможность идентификации арбутина в листьях толокнянки обыкновенной с последующим его количественным определением.
Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры, подтверждают селективность, чувствительность, точность заявленного способа.
Таким образом, поставленная техническая задача, а именно, разработка селективность и чувствительность, заявленного способа достигнута, что подтверждается приведенными примерами.
Применение заявленного способа возможно в фармации, медицине, химии и смежных отраслях, что подтверждается соответствующими примерами.
Список литературы:
1. Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV издания Том 4 / Министерство здравоохранения Российской Федерации. URL https://femb.ru/femb/pharmacopea.php
2. Пат. CN102349940A. Способ получения алкалоидов термопсиса ланцетного и ряда высокочистых лекарственных веществ.
3. М.Т. Курбанова, И.Ж. Жалолов. Динамика накопления алкалоидов и элементов в разных органах растения glaucium elegans. Science and innovation international scientific journal, 2022. N 1. C. 192-200. https://doi.org/10.5281/zenodo.6496948
4. А.А.Погоцкая, Г.Н. Бузук. Применение сканера и компьютерных программ цифровой обработки изображений для количественного определения алкалоидов в листьях Маклейи сердцевидной. Вестник фармации, 2009. № 4 (46). С. 32-38.
5. Государственная Фармакопея Российской Федерации XIV издания Том 3 / Министерство здравоохранения Российской Федерации. URL https://femb.ru/femb/pharmacopea.php (дата обращения 15.12.2022).
6. European Pharmacopoeia. 11th ed. URL https://www.edqm.eu/en/european-pharmacopoeia.
7. P. Alamab, S.I. Alqasoumia, F. Shakeelc and others. HPTLC densitometric analysis of arbutin in bulk drug and methanolic extracts of Arctostaphylos uva-ursi. Natural Product Research. 2011, 25(17). P. 1671-1675. .http://dx.doi.org/10.1080/14786419.2010.529447.
8. A. Pyka, K. Bober, A. Stolarczyk. Densitometrick determination of arbutine cowberry leaves. Acta Poloniae Pharmaceutica - Drug Research. 2007. 63(5). P.395-400.
9. И.П. Цыпышева, Е.Г. Галкин, А.С. Ерастов. О.А. Каримова, И.П. Байкова., А.В. Ковальская, И.У. Халилова, Л.М. Абрамова, Л.С. Юнусов. Растительные источники хинолизидиновых алкалоидов на территории Республики Башкортостан. I. алкалоиды Thermopsis schischkinii и Thermopsis lanceolata ssp. Sibirica (Fabaceae) в условиях интродукции. Химия растительного сырья, 2014. №4. С. 181-186.
10. ГОСТ ISO/TS 28038-2021 Статистические методы определение и использование полиномиальных функций при калибровке.
11. Вяхирев Д. А., Шушунова А. Ф. Руководство по газовой хроматографии: Учебное пособие. - Высшая школа, 1987.