ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА
VACCINE AGAINST INFECTIOUS BRONCHITIS

[0001] Ринотрахеит индюков (TRT) представляет собой инфекционное заболевание верхних дыхательных путей индюков и курей, вызванное пневмовирусом. Это высококантегиозное, острое заболевание, которым страдают индюки любого возраста. Клинические симптомы инфекции TRT включают выраженные, часто пенообразные назальные выделения, хрипы, резкие хрипы, чихание, и трясение головой. У инфицированных индюков, также могут наблюдаться глазные выделения или отек подглазничных пазух. Антитела к вирусу TRT (TRTV) были обнаружены в некоторых куриных стадах (как бройлеров и бройлеров/племенной птицы), страдающих синдромом отека головы (SHS). Предполагается, что TRTV играет роль в этиологии SHS и связанного с ним респираторного дистресс-синдрома. [0002] Инфекционный бронхит (IB) представляет собой коронавирус, вызывающий заболевание только у курей, хотя некоторые другие птицы могут быть субклинически инфицированы. Некоторые серотипы являются географически ограниченными, но несколько серотипов обычно социркулируют в одном географическом регионе. В последние года новый генотип IBV, штамм QX, стал более распространенным в Азии и Европе. Заболеваемость обычно приближается к 100%. Цыплята могут кашлять, чихать, и иметь хрипы в трахеи на протяжении 10-14 дней. Могут наблюдаться конъюнктивит и одышка, иногда отек лица, особенно при одновременной бактериальной инфекции пазух. Цыплята могут выглядеть подавленными и скапливаться под лампами накаливания. Потребление корма и увеличение массы уменьшаются. Инфекция с нефропатогенными штаммами может вызывать начальные респираторные признаки, и затем приводить к депрессии, раздражительности, диарее, большому потреблению воды и смерти. У несушек, производство яиц может уменьшиться на целых 70%, и яйца часто являются деформированными, с тонкой, мягкой, шероховатой, и/или бледной скорлупой, и могут быть меньше и иметь жидкий белок. В большинстве случаев производство яиц и качество яиц возвращаются к нормальному, но это может занять до 8 недель. В большинстве вспышек, смертность составляет 5%, однако, уровень смертности выше, когда заболевание осложняется одновременной бактериальной инфекцией. Нефропатогенные штаммы могут вызывать интерстициальный нефрит с высокой смертностью (до 60%) у молодых цыплят. Инфекция у молодых цыплят может вызвать необратимое повреждение яйцевода, что в результате приводит к тому, что несушки или племенная птица никогда не достигают нормальных уровней производства.
[0003] Известные вакцинные штаммы IB вирусов оказались недостаточными для защиты от инфекционного бронхита, вызванного IB-QX и IB-QX-подобными вирусами. Смотрите WO 2010017440.
[0004] Инфекционный бурсит (IBD, Гамборо) представляет собой высококантегиозное иммуносупрессивное заболевание курей, которое встречается во всем мире и вызывает значительное экономическое воздействие на производство яиц и мяса. Вакцины IBD являются важной частью стратегии контроля Гамборо. Выбор вакцины, предназначенной для введения, зависит от типа курицы, которую будут вакцинировать, и преобладающей ситуации заражения.
[0005] Как правило, инактивированные антигены используются в вакцинах для птицы. Однако, производство инактивированных вирусов является относительно дорогостоящим и поэтому, желательными были бы эффективные вакцины, содержащие более низкий уровень антигена.
[0006] Другая потребность в вакцинации домашней птицы тесно связана со стоимостью самой вакцинации. Экономически выгодным является создание поливалентной вакцины, назначенной для предупреждения нескольких заболеваний. Такие поливалентные вакцины уменьшают стоимость введения вакцины. Однако, из-за хорошо известного феномена антигенной интерференции, простое смешивание антигенов в таких же дозированных формах часто представляет собой не эффективный подход к созданию поливалентных вакцин.
[0007] Соответственно, существует потребность в вакцинах для птицы с пониженным количеством антигена и/или поливалентных вакцинах.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Представленное изобретение предусматривает в одном аспекте иммуногенную композицию, содержащую антигенный компонент и иммунологически эффективное количество адъювантного компонента, причем антигенный компонент содержит, по меньшей мере, один антиген TRT и, по меньшей мере, один IB антиген, и адъювантный компонент содержит иммуностимулирующий олигонуклеотид, масляную эмульсию, и необязательно, стерин.
[0009] В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один антиген TRT представляет собой TRT штамм K.
[0010] В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один IB антиген представляет собой, по меньшей мере, один из IB D1466 и IB QX антигена.
[0011] В некоторых вариантах осуществления, иммуногенная композиция по изобретению является нелипосомальной и/или фактически не содержит сапонина.
[0012] В некоторых вариантах осуществления, необязательно присутствующий стерин смешивают с иммуностимулирующим олигонуклеотидом.
[0013] Изобретение также предусматривает вакцину, содержащую антигенный компонент и эффективное количество адъювантного компонента, причем адъювантный компонент содержит иммуностимулирующий олигонуклеотид и масляную эмульсию, и причем антигенный компонент содержит IBD антиген.
7,5
8
50
[0014] В некоторых вариантах осуществления, указанный IBD антиген представляет собой инактивированный антиген штамма Лукерта, который может присутствовать в количестве 10-10 TCID.
[0015] В некоторых вариантах осуществления, вакцина представляет собой поливалентную вакцину, содержащую, по меньшей мере, один из: антигена, полученного из штамма не Лукерта IBD; антигена инфекционного бронхита; реовирусного антигена; антигена заболевания Ньюкасла; антигена ринотрахеита индеек.
[0016] В другом аспекте, изобретение предусматривает вакцину, содержащую антигенный компонент и эффективное количество адъювантного компонента, причем адъювантный компонент содержит иммуностимулирующий олигонуклеотид и масляную эмульсию, и причем антигенный компонент содержит: антиген TRT; антиген Ньюкасла; антиген синдрома снижения яйценоскости (EDS); IBK антиген; и антиген насморка.
[0017] В некоторых вариантах осуществления, антиген TRT содержит инактивированный вирус ринотрахеита индеек, антиген Ньюкасла содержит инактивированный вирус Ньюкасла, EDS антиген содержит инактивированный EDS вирус, IBK антиген содержит инактивированный IBK вирус, и антиген насморка содержит смесь из бактеринов насморка М, насморка 221 и насморка S.
6,00
6,50
50
50
[0018] В некоторых вариантах осуществления, антиген TRT присутствует в количестве от 10TCID до 10TCID на дозу.
[0019] В некоторых вариантах осуществления, указанная масляная эмульсия представляет собой В/М (вода/масло) эмульсию.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ
[0020] Определения:
[0021] Термины «около» или «приблизительно» когда используются в связи с измеряемой числовой переменной, относятся к указанному значению переменной и ко всем значениям переменной, которые находятся в пределах экспериментальной погрешности указанного значения (например, в пределах 95% доверительного интервала для среднего значения) или в пределах 10 процентов от указанного значения, в зависимости от того, что является большим, за исключением тех случаев, когда «приблизительно» используется по отношению к временным интервалам в неделях, когда «приблизительно 3 недели» составляет от 17 до 25 дней, и приблизительно от 2 до приблизительно 4 недель составляет от 10 до 40 дней.
[0022] Термин «который фактически состоит из» и подобный, когда применяется к адъювантным препаратам по представленному изобретению, касается композиций, которые не содержат дополнительных адъювантных или иммуномодулирующих агентов в количествах, в которых указанный агент вызывает измеряемые адъювантные или иммуномодулирующие эффекты.
[0023] Термины «фактически не содержит сапонина», «по существу не содержит сапонина» и подобные касаются композиции, которая не содержит сапонин в количествах, в которых сапонин вызывает измеряемые адъювантные или иммуномодулирующие эффекты. В некоторых вариантах осуществления, композиции, которые фактически не содержат сапонин, содержат сапонин в количестве, недостаточном для того, чтобы вызывать системный иммунный ответ, такой как лихорадка. В некоторых вариантах осуществления, композиции, которые фактически не содержат сапонин, не содержат никакого сапонина или содержат сапонин в пределах или ниже предела детектирования.
[0024] Термин «иммуностимулирующая молекула» касается молекулы, которая генерирует иммунный ответ.
[0025] Термин «парентеральное введение» означает введение вещества, такого как вакцина, в организм субъекта через или путем, который не включает пищеварительный тракт. Парентеральное введение включает подкожное, внутримышечное, транскутанное, внутрикожное, внутрибрюшное, внутриглазной и внутривенное введение.
[0026] Процент чистоты или «X процентная чистота», как используется относительно иммуностимулирующего олигонуклеотидного препарата, касается популяции олигонуклеотидных молекул, которые содержат Х% названного олигонуклеотида (например, SEQ ID NO: 1, SEQ ID: NO: 5, SEQ ID NO: 8, и тому подобное), и остаток (то есть, 100% минус Х%) содержит более короткие фрагменты названного олигонуклеотида, присутствуют в качестве примеси в процессе производства названной последовательности. Таким образом, если последовательность производится путем 3'-5' секвенирования, 5'-отсечения будут включать остаток. В качестве неограничивающего примера, препарат из 100 мкг 80% чистой SEQ ID NO: 8 содержит 80 мкг SEQ ID NO: 8 и оставшаяся часть 20 мкг представляет собой более короткие фрагменты SEQ ID NO: 8, присутствующие в препарате.
[0027] Термины «терапевтически эффективное количество», «иммунологически эффективное количество» и «эффективное количество» касаются количества антигена, или адъюванта, или вакцины, которые будут индуцировать иммунный ответ у субъекта, который получает антиген, или адъювант, или вакцину, которая является достаточной для предотвращения или уменьшения признаков или симптомов заболевания, включая неблагоприятные последствия для здоровья или их осложнения, вызванные инфицированием возбудителя, таким как вирус или бактерия. Индуцированными могут быть гуморальный иммунитет или клеточно-опосредованный иммунитет, или как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунитет.Иммуногенность и эффективность вакцины у животного может быть оценена, например, опосредованно путем измерения титров антител, используя анализы пролиферации лимфоцитов, или непосредственно через наблюдения за признаками и симптомами после заражения штаммом немутантного типа. Защитный иммунитет, который предоставляется вакциной, может быть оценен за счет измерения, например, уменьшение таких клинических признаков, как смертность, заболеваемость, температурный показатель, общее физическое состояние и общее состояние здоровья и работоспособность субъекта. Количество вакцины, которое является терапевтически эффективным, может варьировать в зависимости от конкретного адъюванта, который используется, конкретного антигена, который используется, или состояния субъекта, и может быть определено квалифицированным специалистом в данной области техники.
[0028] В течение своей жизни коммерческих курей-несушек и племенную птицу вакцинируют широким разнообразием различных вакцин. Данные вакцины в основном представляют собой ослабленные живые вакцины. До того времени, когда куры готовы начать откладывать яйца, их вакцинируют инактивированными комбинированными вакцинами, чтобы стимулировать иммунитет против инфекционных агентов, против которых они уже получили вакцину, и чтобы индуцировать иммунитет против других агентов, которые могут вызвать снижение при продуцировании яиц или другие повреждения в период откладывания яиц. Важным является то, что данные вакцины являются способными индуцировать высокие титры антител, и что продолжительность иммунитета является долгой, поскольку вакцины должны защищать в течение всего периода откладывания яиц, который продолжается с возраста от приблизительно 20 недель до 70 недель. Для того, чтобы достичь длительную продолжительность иммунитета необходимо сформулировать антигены в адъювант, например, эмульсия вода-в-масле (В/М).
[0029] Таким образом, как правило, изобретение предусматривает иммуногенную композицию, которая содержит антигенный компонент и адъювантный компонент, причем антигенный компонент содержит, по меньшей мере, один антиген TRT и, по меньшей мере, один IB антиген, и адъювантный компонент содержит (или, в некоторых вариантах осуществления, состоит фактически из, или в других вариантах осуществления, состоит из) иммуностимулирующего олигонуклеотида, масляной эмульсии, и необязательно, стерина.
Антигенный компонент
3
10
4
5
6
7
5
8
[0030] Различные IB QX антигены являются приемлемыми для представленного изобретения. В определенных вариантах осуществления IB QX антиген представляет собой цельный инактивированный вирус. В других вариантах осуществления, вирус представляет собой модифицированный живой вирус. В еще других вариантах осуществления, могут использоваться субъединичные вакцины. Например, приемлемыми могут быть протеины, присутствующие на поверхности вируса, включая, без ограничений, S протеин, М протеин Е-протеин, или какие-либо их комбинации. В вариантах осуществления, которые предусматривают использование инактивированного цельного вируса, антиген может использоваться в количествах от 10 до 10 инфекционных единиц на дозу, например, 10, 10, 10, 10 инфекционных единиц на дозу. В определенных вариантах осуществления, количество инактивированного вируса IB QX на дозу составляет от приблизительно 10 до приблизительно 10 инфекционных единиц на дозу.
[0031] В дальнейших вариантах осуществления антигенный компонент содержит IBD антиген, который, в определенных вариантах осуществления, представляет собой инактивированный вирус IBD Лукерта.
7
8
7,1
7,2
7,3
7,4
7,5
7,6
7,7
7,8
7,9
50
[0032] В определенных вариантах осуществления, количество инактивированного вируса IBD Лукерта составляет от 10 и 10 TCID50 на дозу, например, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10TCID на дозу.
[0033] В определенных вариантах осуществления, в дополнение к инактивированному вирусу IBD Лукерта, антигенный компонент вакцины содержит другие антигены. Например, использоваться могут различные штаммы вируса инфекционного бронхита, например, IB М41, и/или IB D1466, и/или IB D274. Альтернативно или дополнительно, вакцина по представленному изобретению также может содержать антигены TRT, заболевание Ньюкасла (например, штамм LaSota), EDS (синдром снижения яйценоскости), реовирусов, и вируса инфекционного бурсита птицы, птичьего гриппа.
[0034] В других аспектах, изобретение предусматривает поливалентную вакцину, которая содержит антиген TRT; антиген Ньюкасла; антиген синдрома снижения яйценоскости (EDS); антиген IBK (вирусов инфекционного бронхита); и антиген насморка.
6,0
6,50
6,00
6,10
6,20
6,30
6,40
6,50
50
50
50
50
50
50
50
50
[0035] В определенных вариантах осуществления изобретения, антиген TRT присутствует в количестве от 10 TCID до 10 TCID на дозу, например, 10 TCID, или 10TCID, или 10TCID, или 10 TCID, или 10 TCID, или 10 TCID.
[0036] Вирусы, которые используются в вакцинах по данному изобретению, могут быть ослабленными или инактивированными. Способы инактивации и ослабления вируса являются хорошо известными в данной области. Например, вирус может быть инактивирован путем пассирования культуры. Способы, когда инактивация включает, без ограничений, влияние вируса на эффективное количество инактивации химическим веществом, выбранным из формалина, бета-пропиолактона (BPL), бинарного этиленимина (BEI) или фенола.
[0037] Насморк вызывается различными штаммами Haemophilus paragallinarum. Таким образом, в определенных вариантах осуществления, антиген насморка содержит один или несколько штаммов Haemophilus paragallinarum, например, штамм М, штамм Z, штамм 221, и подобные. В других вариантах осуществления, используется смесь штаммов, которые представляют собой серовары А, В, и С. Таким образом, штамм 221 (Насморк 221) может использоваться в качестве штамма серовара А, штамм Spross (насморк S) может использоваться в качестве штамма серовара В, и штамм Modesto (насморк М) может использоваться в качестве штамма серовара С.
6,40
6,20
6,60
6,00
6,50
5,80
6,70
50
50
50
50
50
50
50
[0038] Квалифицированный специалист в данной области может понять, что титр вируса может варьировать в зависимости от методологии титрования вируса, иногда вплоть до приблизительно 30%. В данном раскрытии, где дозы измеряются в качестве показателя степени 10, показатель степени может изменяться на 0,2. Таким образом, например, титр 10 TCID может охватывать значения от 10 TCID до 10 TCID. Такая же концепция применяется к диапазонам титров. Например, титр 10 TCID-10TCTD охватывает диапазон от 10 TCID до 10TCTD.
[0039] В других вариантах осуществления, иные антигены могут использоваться в дополнении к антигенам указанным выше, например, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Mycoplasma gallisepticum, Salmonella gallinarum, Pasteurella multocida. Подобно инактивации вируса, бактерии также могут быть инактивированы, например, путем влияния эффективного количества инактивирующего химического вещества, выбранного из формалина, бета-пропиолактона (BPL), бинарного этиленимина (BEI) или фенола.
Адъювантный компонент
[0040] Как правило, адъювантный компонент, который используется в иммуногенной композиции по изобретению, содержит иммуностимулирующий олигонуклеотид, масло, и необязательно, поверхностно-активное(ые) вещество(а). В определенных вариантах осуществления, адъювантный компонент не содержит или фактически не содержит сапонины и/или ISCOM.
[0041] В определенных вариантах осуществления, адъювантный компонент фактически состоящий из иммуностимулирующего олигонуклеотида, масла, и необязательно, поверхностно-активного(ых) вещества(в). В определенных вариантах осуществления, адъювантный компонент состоит из иммуностимулирующего олигонуклеотида, масла, и необязательно, поверхностно-активного(ых) вещества(в).
[0042] Приемлемые иммуностимулирующие олигонуклеотиды включают ODN (на основе ДНК), ORN (на основе РНК) олигонуклеотиды, или химерные ODN-ORN структуры, которые могут иметь модифицированный скелет включая, без ограничений, модификации фосфоротиоата, галогенирование, алкилирование (например, этил- или метил- модификации), и фосфодисложноэфирные модификации. В некоторых вариантах осуществления, могут использоваться поли инозиновая - цитидиловая кислота или их производная (поли I:C).
[0043] CpG олигонуклеотиды характеризуются присутствием неметилированного CG динуклеотида в конкретных контекстах основание-последовательность (CpG мотив). (Hansel ТТ, Barnes PJ (eds): New Drugs for Asthma, Allergy и COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232, которая включена в данный документ в виде ссылки). Данные CpG мотивы не наблюдаются в эукариотической ДНК, в которой подавляются CG динуклеотиды и, если присутствуют, как правило, метилированы, но присутствуют в бактериальной ДНК, в которой они предоставляют иммуностимулирующие свойства.
[0044] В выбранных вариантах осуществления, адъюванты по представленному изобретению используют так называемый иммуностимулирующий олигонуклеотид Р-класса, более предпочтительно модифицированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р- класса, еще более предпочтительно, Е-модифицированные олигонуклеотиды Р-класса. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса представляют собой CpG олигонуклеотиды, которые характеризуются присутствием палиндромов, как правило, 6-20 нуклеотидов длиной. Олигонуклеотиды Р-класса имеют способность спонтанно самособираться в конкатемеры или in vitro и/или in vivo. Данные олигонуклеотиды являются, в буквальном смысле, одноцепочечными, но присутствие палиндромов позволяет создавать конкатемеры или, возможно, стволовые-и-петлевые структуры. Общая длина Р-класс иммуностимулирующих олигонуклеотидов составляет от 19 и 100 нуклеотидов, например, 19-30 нуклеотидов, 30-40 нуклеотидов, 40-50 нуклеотидов, 50-60 нуклеотидов, 60-70 нуклеотидов, 70-80 нуклеотидов, 80-90 нуклеотидов, 90-100 нуклеотидов.
[0045] В одном аспекте изобретения иммуностимулирующий олигонуклеотид содержит 5' TLR активационный домен и, по меньшей мере, два пиландромных участка, причем один пиландромный участок представляет собой 5' пиландромный участок из, по меньшей мере, 6 нуклеотидов длиной и соединенный с 3' пиландромным участком из, по меньшей мере, 8 нуклеотидов длиной или непосредственно, или через спейсер.
[0046] Иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса могут быть модифицированы согласно методикам, известным в данной области. Например, J-модификация касается йод-модифицированных нуклеотидов. Е-модификация касается этил-модифицированного(ых) нуклеотида(ов). Таким образом, Е-модифицированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса представляют собой иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса, в которых, по меньшей мере, один нуклеотид (преимущественно 5' нуклеотид) является этилированным. Дополнительные модификации включают присоединение 6-нитробензимидазола, О-метилирование, модификацию с проинил-dU, инозиновую модификацию, присоединение 2-бромвинила (преимущественно к уридину). [0047] Иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса также могут содержать модифицированную интернуклеотидную связь включая, без ограничений, фосфодисложноэфирные связи фосфоротиоатные связи. Олигонуклеотиды по представленному изобретению могут быть синтезированы или получены из коммерческих источников.
[0048] Олигонуклеотиды Р-класса и модифицированные олигонуклеотиды Р-класса являются, кроме того, раскрытыми в опубликованной РСТ заявке № WO 2008/068638, опубликованной 12 июня 2008 года. Приемлемые не ограничивающие примеры модифицированных иммуностимулирующих олигонуклеотидов Р-класса представлены ниже (в SEQ ID NO 1-10, "*" касается фосфоротиоатной связи и "-" касается фосфодисложноэфирной связи). В SEQ ID NO 11-14, все связи представляют собой фосфодисложноэфирные связи.
[0049] Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по представленному изобретению могут быть химически синтезированными. Кроме того, иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут использоваться с чистотой приблизительно 60% (однородности) или более (например, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98%, или 100% чистоты).
[0050] Количество иммуностимулирующего олигонуклеотида Р-класса для применения в адъювантных композициях зависит от природы иммуностимулирующего олигонуклеотида Р-класса, который используется, и назначенного вида.
[0051] Стерины имеют общее химическое ядро, которое представляет собой стероидную(ые) кольцевую(ые) структуру(ы), которые имеют гидроксильную (ОН) группу, как правило, присоединенную к углероду-3. Углеводородная цепь жирнокислотного заместителя изменяется длиной, как правило, от 16 до 20 атомов углерода, и может быть насыщенным или ненасыщенным. Стерины обычно содержат одну или несколько двойных связей в кольцевой структуре и также различные заместители, присоединенные к кольцам. Стерины и их жирнокислотные сложные эфиры являются фактически не растворимыми в воде. С учетом данных химических сходств, таким образом, вероятность того, что стерины, имеющие данное химическое ядро будут иметь аналогичные свойства, когда используются в вакцинных композициях по представленному изобретению. Стерины являются хорошо известными в данной области и могут быть приобретены коммерчески. Например, холестерин является раскрытым в Merck Index, 12th Ed., p.369. Приемлемые стерины включают, без ограничений, β-ситостерин, стигмастерин, эргостерин, эргокальциферол, холестерин, и их производные, такие как, например DC-Холестерин (3β-[N-(диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин).
[0052] Многие масла и их комбинации являются приемлемыми для применения по представленному изобретению. Данные масла включают, без ограничений, животные масла, растительные масла, а также неметаболизируемые масла. Не ограничивающие примеры растительных масел, приемлемых в представленном изобретении, включают кукурузное масло, арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло, оливковое масло, и фитосквалан. Не ограничивающим примером животных масел является сквалан. Приемлемые не ограничивающие примеры неметаболизируемых масел включают легкое минеральное масло, насыщенные масла с линейной или разветвленной цепью, разветвленные масла, и подобные.
[0053] В наборе вариантов осуществления, масло, используемое в адъювантных препаратах по представленному изобретению, представляет собой легкое минеральное масло. Как используется в данном документе, термин «минеральное масло» касается смеси жидких углеводородов, полученных из жидкого парафина методом дистилляции. Данный термин является синонимом «разжиженного парафина», «разжиженного жидкого вазелина» и «белого минерального масла». Термины также предназначены включать «легкое минеральное масло», то есть, масло аналогично получают путем дистилляции жидкого парафина, но которое имеет несколько меньшую удельную массу, чем белое минеральное масло. Смотрите, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990, at pages 788 и 1323). Минеральное масло может быть получено из различных коммерческих источников, например, J. Т. Baker (Phillipsburg, Pa.), USB Corporation (Cleveland, Ohio). Предпочтительное минеральное масло представляет собой легкое минеральное масло коммерчески доступное под названием DRAKEOL. В другом варианте осуществления, приемлемое масло содержит минеральное масло MARCOL™ 52. MARCOL™ 52 представляет собой очищенную смесь жидких насыщенных углеводородов. Это является кристально чистым, водно-белым продуктом, который не содержит никаких токсичных примесей. Его получают из нефти путем вакуумной дистилляции с последующими стадиями очистки, включая окончательную очистку путем каталитической гидрогенизации.
[0054] Эмульгаторы, приемлемые для применения в представленных эмульсиях включают естественные биологически совместимые эмульгаторы и неестественные синтетические поверхностно-активные вещества. Биологически совместимые эмульгаторы включают фосфолипидные соединения или смесь фосфолипидов. Предпочтительные фосфолипиды представляют собой фосфатидилхолины (лецитин), такие как соевый или яичный лецитин. Лецитин может быть получен в виде смеси из фосфатидов и триглицеридов путем промывания водой сырых растительных масел, и разделения и высушивания полученных в результате гидратированных смол. Очищенный продукт может быть получен путем фракционирования смеси из нерастворимых в ацетоне фосфолипидов и гликолипидов, которые остаются после удаления триглицеридов и растительного масла путем промывания ацетоном. Альтернативно, лецитин может быть получен из различных коммерческих источников. Другие приемлемые фосфолипиды включают фосфатидилглицерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, фосфатидную кислоту, кардиолипин, фосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилсерин, лизофосфатидилинозитол, и лизофосфатидилэтаноламин. Фосфолипиды могут быть выделены из естественных источников или традиционно синтезированы.
[0055] В дополнительных вариантах осуществления, эмульгаторы, которые используются в данном документе, не включают лецитин, или применяют лецитин в количестве, которое не является иммунологически эффективным.
[0056] Неестественные, синтетические эмульгаторы, приемлемые для применения в адъювантных препаратах по представленному изобретению включают неионные поверхностно-активные вещества на основе сорбитана, например, поверхностно-активные вещества на основе сорбитана, замещенного жирными кислотами (коммерчески доступные под названием SPAN или ARLACEL), сложные эфиры жирной кислоты полиэтоксилированного сорбита (TWEEN), сложные эфиры полиэтиленгликоля жирных кислот из источников, таких как рициновое масло (EMULFOR); полиэтоксилированная жирная кислота (например, стеариновая кислота, доступная под названием SIMULSOL М-53), полиэтоксилированный изооктилфенол/формальдегидный полимер (TYLOXAPOL), простые эфиры полиоксиэтиленового жирного спирта (BRIJ); полиоксиэтиленовые нефениловые простые эфиры (TRITON N), полиоксиэтиленовые изооктилфениловые простые эфиры (TRITON X). Предпочтительные синтетические поверхностно-активные вещества представляют собой поверхностно-активные вещества, доступные под названием SPAN и 'TWEEN, такие как TWEEN-80 (полиоксиэтиленовый (20) сорбитана моноолеат) и ARLACEL™ 83V (сорбитана сесквиолеат)).
[0057] В общем говоря, эмульгатор(ы) может/могут присутствовать в вакцинной композиции в количестве от 0,01% до 40% по объему, предпочтительно, от 0,1% до 15%, более предпочтительно от 2% до 10%.
[0058] В подгруппе вариантов осуществления, объемный процент масла и растворимого в масле эмульгатора вместе составляет, по меньшей мере, 50%, например, от 50% до 95% по объему; предпочтительно, количества большего, чем от 50% до 85%; более предпочтительно, количества от 50% до 60%, и более предпочтительно в количестве от 55 до 65% об./об. вакцинной композиции. Таким образом, например, и без ограничений, масло может присутствовать в количестве 45% и растворимый в липиде эмульгатор будет присутствовать в количестве большем, чем 5% об./об. Таким образом, объемный процент масла и растворимого в масле эмульгатора вместе будет составлять, по меньшей мере, 50%.
[0059] В еще другой подгруппе, приемлемой для всех вакцин по изобретению, объемный процент масла составляет более 40%, например, от 40% до 90% по объему; от 40% до 85%; от 43% до 60%, от 44 до 50% об./об. вакцинной композиции. В определенных вариантах осуществления, эмульсии содержат, по меньшей мере 60% об./об. масляной фазы и 40% об./об. водной фазы.
[0060] Иногда, невозможным или неосуществленным является концентрировать антиген, особенно в масштабируемом коммерческом применении, и приходится использовать растворы с низкими концентрациями антигена. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, вакцинные композиции по представленному изобретению содержат адъювантные препараты, как описано выше, где содержание масляной фазы в данных адъювантных препаратах является разбавленным, и где вакцинная композиция представляет собой эмульсию вода-в-масле.
[0061] На практике, возможным является создать эмульсию вода-в-масле, причем масляная фаза составляет менее, чем 50% об./об.
[0062] Коротко, во-первых, адъювантный препарат по представленному изобретению получают, как описано выше. В указанном адъювантном препарате, масляная фаза содержит более 50% об./об. адъювантного препарата. Количество других ингредиентов, чем масло и эмульгатор(ы) масштабируется соответственно, на основе конечной целевой концентрации и желаемого разбавления. Например, если одной целью является получение вакцинной композиции, в которой адъювантный препарат составляет 80% об./об., количество других ингредиентов, чем масло, масштабируется по коэффициенту 1,25 (1/0,8). Количество эмульгаторов, если какие-либо (например, TWEEN80 и/или SPAN80) необязательно нужно масштабировать, но преимущественно, объемное соотношение между маслом и эмульгатором(ами) сохраняется таким же образом в адъювантном препарате и в конечной вакцинной композиции.
[0063] Затем раствор антигена добавляют в адъювантный препарат.
st
[0064] Целостность эмульсии вода-в-масле может сохраняться при условии, что диспергированные сферические капли воды не присутствуют в более концентрированном виде, чем максимальная фракция для случайной упаковки монодисперсных капель, то есть: 0,64. Смотрите Tadros, Emulsion Formation, Stability and Rheology, 1 ed. 2013, Wiley-VCH GmbH & Co KGaA. Главным является то, что общая фракция объема, занята водными каплями, не превышает 0,64, то есть: 64% об./об. И наоборот, это означает, что масляная фаза не должна падать ниже 36% об./об.
[0065] В некоторых вариантах осуществления приемлемым является то, что одна доза адъюванта будет содержать от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мкг (например, 1-20 мкг, или 5-15 мкг, или 8-12 мкг или 10 мкг) иммуностимулирующего олигонуклеотида, вплоть до приблизительно 50 мкг (например, 0,5-20 мкг, или 1-10 мкг) стерина, такого как холестерин.
[0066] В определенных вариантах осуществления, адъювантный компонент получают следующим образом:
а) Сорбитана сесквиолеат и холестерин, если такие есть, растворяют в легком минеральном масле. Полученный в результате масляный раствор стерильно фильтруется;
b) Иммуностимулирующий олигонуклеотид и полиоксиэтиленовый (20) сорбитана моноолеат растворяют в водной фазе, таким образом, получая водный раствор;
c) Водный раствор добавляют в масляный раствор во время непрерывной гомогенизации.
[0067] Иммуногенная композиция по представленному изобретению может быть получена путем добавления антигенного компонента в водную фазу с последующим сочетанием водной фазы с масляной фазой. В других вариантах осуществления, антигенный компонент может добавляться в адъювантный компонент после того, как получают адъювантный компонент.
[0068] Иммуногенная композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Как используется в данном документе, «фармацевтически приемлемый носитель» включает какие-либо и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, адъюванты, стабилизирующие агенты, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, которые замедляют адсорбцию, и подобные. Носитель(и) должны быть «приемлемые» в смысле совместимости с другими компонентами композиций и не являться вредными для субъекта. Как правило, носители будут стерильными и не будут содержать пирогенов, и выбираются в зависимости от способа введения, который будет использоваться. Квалифицированным специалистам в данной области хорошо известно, что предпочтительные композиции для фармацевтически приемлемого носителя, который содержится в композиции, представляют собой такие фармацевтические носители утвержденные в соответствии с нормативными актами, обнародованными Министерством сельского хозяйства Соединенных Штатов (США) (United States (US) Department of Agriculture) или Администрацией США по пищевым продуктам и медикаментам (US Food и Drug Administration), или аналогичным государственным агентством в государстве не США. Поэтому, фармацевтически приемлемый носитель для коммерческого производства композиций представляет собой носитель, который уже является утвержденным или будет утвержден соответствующим государственным агентством США или иностранного государства.
[0069] Другие компоненты композиций могут включать фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как носители, растворители, и разбавители, изотонические агенты, буферные агенты, стабилизаторы, консерванты, Типичные носители, растворители и разбавители включают воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин, масло и подобные. Иллюстративные изотонические агенты включают хлорид натрия, декстрозу, манит, сорбит, лактозу и подобные. Используемые стабилизаторы включают желатин, альбумин и подобные.
Введение вакцины
[0070] Как правило, вакцины по представленному изобретению могут быть введены несколькими путями. Такие пути являются известными квалифицированным специалистам в данной области и включают, без ограничений, внутримышечные и подкожные инъекции.
[0071] В определенных вариантах осуществления, вакцины вводят приблизительно за 3-7 недель (например, приблизительно за 4-6 недель) перед ожидаемой яйцекладкой. Данный режим гарантирует, что иммунитет к IB QX развивается до момента яйцекладки и сохраняется в течение всего периода яйцекладки вакцинированных кур.

[0072] В дополнительных вариантах осуществления, вакцина по представленному изобретению вводится как бустерная вакцина курам, которые получили первичную вакцинацию. Несколько IB первичных вакцин являются известными в данной области. Например, POULVAC IB первичная вакцина содержит высушенный при замораживании, массачусетского типа, живой вирус инфекционного бронхита. Nobilis IB Н120 представляет собой живую высушенную при замораживании вакцину, предназначенную для применения, в качестве первичной вакцинации птицы от инфекционного бронхита. Данная вакцина содержит штамм Н120 типа Массачусетс. Другие IB первичные вакцины также могут использоваться с вакциной по представленному изобретению.
[0073] Далее изобретение будет описано в следующих не ограничивающих примерах.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение вакцины
[0074] Иллюстративная эмульсия вода-в-масле представлена в таблице 1. Антигены разбавляют в водной фазе, в которую также добавляют CpG. Водная фаза содержит антигены, CpG и тимеросал. Она смешивается с масляной фазой. После тщательного перемешивания, образуется стабильная эмульсия В/М.
Пример 2. Анализы эффективности для IB или TRT
7,2
5,3
50
50
[0075] Авторы изобретения изготовили эмульсии В/М, которые содержат инактивированный IB М41 антиген (10 EID перед инактивацией на дозу) или инактивированный антиген TRT (10 TCID перед инактивацией на дозу). Данные эмульсии содержали разные количества CpG или не CpG (SEQ ID NO: 8, 65% чистота). Эмульсии исследовали в анализе на эффективность у курей. Куры были вакцинированы в возрасте 4 недель. Через 5 недель после вакцинации образцы крови собирали и исследовали относительно титров антител против антигенов, используя ELISA.
2
2
[0076] Титры антител против вируса ринотрахеита индеек (TRT) определяли, используя фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA), в котором антиген наносили на лунки 96 луночных микро ELISA планшетов. После нанесения в лунки добавляли стандартную отрицательную и стандартную положительную сыворотки и сыворотки, которые необходимо исследовать. Все сыворотки исследовали в двух повторах. В качестве контроля все сыворотки исследовали также в двух повторах в лунках без антигена. Несвязанные антитела были удалены, и реактивность антител к антигену была визуализирована путем добавления антител против сывороточных антител, к которым конъюгировалась пероксидаза. После удаления несвязанных конъюгированных антител, добавляли субстрат пероксидазы ортофенилендиамино + НО. Присутствие пероксидазы было продемонстрировано развитием цветной реакции.
[0077] Результаты исследования эффективности антигена TRT представлены в таблице 2. В целом титры антител были удовлетворительными, и в одной из групп не было таких, которые не проявили ответ. Существовал положительный эффект CpG на титры антител. Наилучшие результаты были получены из 10 мкг CpG на дозу, но также 1 мкг CpG на дозу имел положительный эффект.
[0078] Кроме того, положительный эффект CpG был определен относительно антительного ответа против IB М41, смотрите таблицу 3. Доза 1 мкг CpG на дозу уже была достаточной, чтобы существенно стимулировать антительный ответ. Без CpG, 7 из 15 курей имели антительный ответ ниже порогового значения 2,60, тогда как все куры продемонстрировали ответ, когда исследовали 1 мкг CpG на дозу. Дальнейшее увеличение было получено из 10 мкг CpG на дозу.
10
*Титры выше, чем 396 (LogТитр=2,60) рассматриваются положительными по набору. Пример 3. Анализы эффективности для IB, ND, EDS
[0079] Группы из 10 курей SPF были вакцинированы 0,5 мл на дозу внутримышечно в возрасте 4 недель. Образцы крови для серологического исследования собирали через 5 недель после вакцинации. Для измерения титров антител против IB, ND и EDS, использовали ELISA (набор антител Idexx FlockCheck IBV; Idexx, Maine, USA), исследования ингибирования гемагглютинации и ELISA (набор антител Idexx FlockCheck NCD; Idexx, Maine, USA), соответственно.
[0080] Вакцины содержали:
в эмульсиях вода-в-масле, которая содержит разные количества CpG.
[0081] Группы из 10 курей SPF были вакцинированы 0,5 мл на дозу внутримышечно в возрасте 4 недель. Образцы крови для серологического исследования собирали через 5 недель после вакцинации. Для измерения титров антител против IB, ND и EDS, использовали ELISA (набор антител Idexx FlockCheck IBV; Idexx, Maine, USA), исследование ингибирования гемагглютинации и ELISA (набор антител Idexx FlockCheck NCD; Idexx, Maine, USA), соответственно.
[0082] Результаты относительно IB, ND, и EDS представлены в таблицах 4-6, соответственно.
• Различные буквы в верхнем индексе означают, что различия являются статистически значимыми.
[0083] Результаты и выводы
[0084] Для IB М41 и ND существуют значительные отличия между препаратами без CpG и препаратом с 5 мкг CpG на дозу. Для ND 2,5 мкг CpG на дозу титры антител также значительно улучшились. Для EDS не существовало никаких существенных отличий между препаратами без CpG и препаратами с CpG, но в количественном соотношении 5 мкг CpG на дозу было лучше, чем без CpG.
[0085] CpG имеет стимулирующий эффект на антительные ответы IB М41, ND и EDS, если добавляют в количестве 5 мкг на дозу. Эффект от 2,5 мкг CpG на дозу является ограниченным.
Пример 4. Исследование эффективности
[0086] Получали комбинированные вакцины, которые содержат разные количества инактивированного IB QX, инактивированного IB D1466 и инактивированных антигенов TRT в эмульсии В/М, которая содержит 10 мкг на дозу CpG. Данные эмульсии использовались для вакцинации SPF несушек в возрасте 14 недель. Половина различных вакцинных групп была вакцинирована в возрасте 10 недель живыми вакцинами IB. В возрасте 26 недель куры были контрольно заражены вирулентным QX-подобным IB вирусом или вирулентным IB D1466 вирусом. Между 2 неделями перед контрольным заражением и через 4 недели после контрольного заражения определяли продуцирование яиц. Кроме того, титры антител измеряли через 7 недель после вакцинации с исследованием нейтрализации сыворотки.
[0087] Как видно из данных, представленных в таблице 4 после живой первичной вакцинации, четкий антительный ответ мог быть детектирован с использованием ELISA. После вакцинации инактивированными вакцинами, также определяли титры антител против IB с использованием SN исследований. Исследование SN специально выявляет антитела против IB QX и IB D1466. Не наблюдалось никакой перекрестной реактивности, тогда как никакой разницы не может быть сделано между антителами против IB QX и IB D1466, используя ELISA.
[0088] Данные в таблице 7 также показывают, что после контрольного заражения существует очень четкое снижение производства яиц у курей, зараженных вирулентным вирусом IB QX, которые не были вакцинированы. Вакцинация только живыми вакцинами, только инактивированной вакциной или обеими в результате приводила к защитному иммунитету против уменьшения яиц, вызванного заражением вирусом IB QX.
[0089] Кроме того, ранее считалось, что инактивированный антиген IB QX навряд ли способен индуцировать титры антител у курей после вакцинации, в отличие от штаммов IB, которые не являются QX. Например, в данное время продукты, которые представлены на рынке, содержащие антигены из других штаммов, которые не являются QX, инфекционного бронхита (например, IB М41, или IB D274, или IB D1466) являются дополненными адъювантом масляной эмульсии без CpG и, тем не менее, обеспечивают достаточную защиту. В отличие от этого, как продемонстрировано в таблице 8, масляная эмульсия без CpG является недостаточной для выявления нейтрализующих антител, тогда как добавление CpG в результате приводит к надежному антительному ответу.
[0090] В то же время, как указано выше, известные вакцинные штаммы вирусов IB были признаны недостаточными для защиты против инфекционного бронхита, вызванного IB-QX и IB-QX-подобными вирусами. Смотрите WO 2010017440. Неожиданно, вакцины по представленному изобретению вызвали четкий антительный ответ против инактивированных IB QX антигенов.
Пример 5. Вакцина против инфекционного бронхита, заболевания Ньюкасла, TRT, инфекционного бурсита птиц, и реовируса
[0091] В данном эксперименте использовались смешанные по полу новорожденные цыплята SPF Leghorn. Цыплят кормили стандартной диетой с водой в неограниченном количестве.
[0092] На 0 день, птицы были вакцинированы против инфекционного бронхита вакциной, содержащей штамм Массачусетс 1 путем глазного введения. На 28 день эксперимента, птице вводили вакцины POULVAC REO и POULVAC TRT в дозах, рекомендованных производителем при введении птице в крылья и глаза, соответственно. На 49 день эксперимента, птице вводили экспериментальные вакцины. Группы Т01, Т02, Т04, и Т05 включали по 32 птицы на группу. Группы Т03, Т06, и Т07 включали по 13 птиц на группу.
Коммерческое наименование вакцины MSD: NobilisRT+IBmulti+G+ND
[0093] Все антигены, которые использовались в Т01, Т02, Т04, и Т05 были инактивированы формальдегидом.
[0094] Группы Т01-Т05 получали 0,5 мл внутримышечной инъекции в грудную область. Группы Т06 и Т07 обрабатывались согласно протоколам производителей.
[0095] Кровь была взята у птиц на 70 и 77 день для проведения серологического анализа. Анализ проводили с использованием исследования нейтрализации сыворотки (IB, IBDV, Reo), HAI (Ньюкасла), и ELISA (TRT). Серологические данные для T01, T02, T04 и Т05 были проанализированы, используя общую линейную смешанную модель с повторными измерениями. Применяли соответствующее log преобразование. Модель включала фиксированные эффекты обработки, временные точки и обработку по временным точкам взаимодействия, и случайные эффекты блока, и животное в пределах блока, и обработку (животный термин).
[0096] (Обратное преобразование) среднее значение, полученное методом наименьших квадратов, и 90% доверительные интервалы докладывались вместе с диапазоном исходных данных. Если основной эффект обработки или обработки за счет временных взаимодействий были значимыми (Р≤0,10), то проводились и докладывались сравнения между всеми группами обработки в каждой временной точке. Группы обработки Т03, Т06 и Т07 были обобщены с использованием средних геометрических значений, стандартных погрешностей, и диапазонов.
[0097] Результаты представлены в таблице 10.
Статистический анализ проводили для сравнения титров, выявленных путем обработки Т01, Т02, Т04 и Т05. Различные буквы указывают на значительную разницу (р≤0,1).
TRT* указывает на то, что титр был получен, используя ELISA. Все другие результаты были получены, используя сыворотки нейтрализации (IB, IBDV, Reo) или исследования HAI (Ньюкасл)
8
7,5
50
50
[0098] Данные результаты демонстрируют, что добавление CpG в эмульсию В/М в результате приводило к почти 3-кратному увеличению иммунного ответа на IBDV. Смотря на результаты с разных точек зрения, данные результаты демонстрируют, что уменьшение дозы IBD Лукерта с 10TCID до 10TCID (приблизительно трехкратное уменьшение) и добавление CpG (сравнить Т01 и Т05) в препарат в результате привело к увеличению ответов на IBD. Ответы на Ньюкасл, реовирус, и TRT также увеличивались, и ответы на IB статистически не уменьшались.
[0099] Кроме того, ответы на все вирусы в результате привели к защитным титрам (защитный титр для IB 20, защитный титр на Ньюкасл составляет 16, защитный титр для IBD составляет 32, защитный титр для реовируса составляет 16). Эффективность вакцины TRT измеряется путем сероконверсии. Сероконверсия более 70% указывала на то, что вакцина была эффективной.
[00100] В экспериментах, приведенных выше, препараты, которые содержат CpG (группы Т01 и Т02) были оба эффективными против TRT (более 90% сероконверсия). В отличие от этого, препараты, которые не содержат CpG (группы Т04 и Т05) не были эффективными против TRT (сероконверсия 62,5% и ниже).
[00101] Группа Т06 использовалась в качестве положительного контроля для IBDV. Как показано в таблице 10, титры, вызванные вакциной Т02, были сопоставимы с титрами, вызванными положительным контролем. Группа Т07 использовалось в качестве положительного контроля для TRT. Как показано в таблице 10, экспериментальные вакцины Т01 и Т02 вызывали более высокие TRT титры, чем Т07.
[00102] В итоге, добавление CpG в эмульсию В/М позволило создать пятивалентную вакцину, эффективную против бронхита, заболевания Ньюкасла, TRT, инфекционного бурсита птиц (IBD или Гамборо) и реовируса. Препараты без CpG не были эффективными против TRT. Кроме того, титры против Ньюкасла, реовируса и IBD были меньше в препаратах без CpG, чем в препаратах с CpG.
Пример 6. Вакцина против инфекционного бронхита, насморка, синдрома снижения яйценоскости, заболевания Ньюкасла и TRT
[00103] В данном эксперименте использовались смешанные по полу новорожденные цыплята SPF Leghorn. Цыплят кормили стандартной диетой с водой в неограниченном количестве.

[00104] На 0 день, птицы были вакцинированы против инфекционного бронхита вакциной, содержащей штамм Массачусетс 1 путем глазного введения. На 14 день эксперимента, птицам вводили вакцины POULVAC TRT в дозировках, рекомендованных производителем при внутриглазном введении. На 35 день эксперимента, экспериментальные вакцины вводили путем внутримышечных инъекций.
[00105] Таблица 11 иллюстрирует экспериментальные и контрольные вакцинные композиции, которые используются в данных экспериментах. Каждая из этих групп содержала по 56 птиц.
*EDS касается синдрома снижения яйценоскости, IBK касается инфекционного бронхита
[00106] Все антигены, которые используются в Т01, Т02, Т04, и Т05, были инактивированы в формальдегиде.
[00107] Кровь брали у птиц на 56 и 70 день для проведения серологического анализа. В анализе использовали десятипроцентный двусторонний уровень значимости.
[00108] Серологические данные для Т01, Т03, Т04, Т05 и Т06 были проанализированы, используя общую линейную смешанную модель с повторными измерениями. Применяли соответствующее log преобразование. Модель включала фиксированные эффекты обработки, временные точки и обработку по временным точкам взаимодействия, и случайные эффекты блока, и животное в пределах блока, и обработку (животный термин).
[00109] (Обратное преобразование) среднее значение, полученное методом наименьших квадратов, и 90% доверительные интервалы докладывались вместе с диапазоном исходных данных. Если основной эффект обработки или обработки за счет временных взаимодействий были значимыми (Р≤0,10), то проводились и докладывались сравнения между всеми группами обработки в каждой временной точке. Серология для Т02 была обобщена с использованием средних геометрических значений, стандартных погрешностей, и диапазонов.
[00110] Результаты для экспериментальных групп (Т03-Т06) представлены в таблице 12.
Различные буквы указывают на значительную разницу (р≤0,1).
[00111] Данные результаты демонстрируют, что добавление CpG в эмульсию В/М в результате привело к 2-3-кратного увеличения иммунного ответа на TRT, измеренного с использованием ELISA. Смотря на результаты перспективы сероконверсии, группы, обработанные препаратами без CpG (обработки Т03 и Т05) не демонстрировали эффективный TRT сероконверсионный ответ (57% или менее). В отличии от этого, группы, обработанные препаратами Т04 и Т06 оба из которых содержали CpG, демонстрировали эффективную сероконверсию (75% и выше). Даже если доза антигена TRT была уменьшена приблизительно втрое, добавление больше CpG компенсировалось более низкой дозой антигена (сравните Т04 и Т05).
[00112] Кроме того, ответы на все вирусы в результате приводили к защитным титрам (защитный титр для IB составляет 20, защитный титр для Ньюкасла составляет 16, защитный титр для насморка составляет 5, защитный титр для EDS составляет 18). SN титры или HAI титры, вызванные препаратами Т04 и Т06 (которые содержат CpG) как правило, были приблизительно вдвое большими, чем титры, вызванные препаратами Т03 и Т05 (без CpG).
[00113] Все публикации, приведенные в описании, как патентные публикации, так и непатентные публикации, полностью включены в данный документ путем ссылки на такой же объем, как если бы каждая отдельная публикация была конкретно и индивидуально указана, как включена путем ссылки.
[00114] Несмотря на то, что изобретение в данном документе описано с ссылкой на конкретные варианты осуществления, следует понимать, что данные варианты осуществления являются лишь иллюстрацией принципов и применений представленного изобретения. Поэтому следует понимать, что многочисленные модификации могут быть сделаны для иллюстративных вариантов осуществления, и что другие положения могут быть разработаны без отступления от сущности и объема представленного изобретения как определено в следующей формуле изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ZOETIS LLC
DOMINOWSKI, Paul Joseph
DOS SANTOS, Maria Carolina Ferreira
FREITAS, Carla Maria
GEERLIGS, Harmen Jacob
<120>  ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА
<130>  ZP000154A
<150>  62/344598
<151>  2016-06-02
<150>  62/365419
<151>  2016-07-22
<160>  14
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CpG олигонуклеотид
<400>  1
tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg                                               23
<210>  2
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CpG олигонуклеотид
<400>  2
tcgacgtcga tcggcgcgcg ccg                                               23
<210>  3
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CpG олигонуклеотид
<400>  3
tcgacgtcga tcggcgcgcg ccgt                                              24
<210>  4
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CpG олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (1)..(1)
<223>  5'-Йод-2'-дезоксиуридин
<400>  4
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg                                               23
<210>  5
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CpG олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (1)..(1)
<223>  5'-Йод-2'-дезоксиуридин
<400>  5
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccgt                                              24
<210>  6
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CpG олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (1)..(1)
<223>  5'-Йод-2'-дезоксиуридин
<400>  6
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccgt                                              24
<210>  7
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CpG олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (1)..(1)
<223>  5'-Ethyl-2'-дезоксиуридин
<400>  7
ncgacgtcga tcggcgcgcg ccg                                               23
<210>  8
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CpG олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (1)..(1)
<223>  5'-Йод-2'-дезоксиуридин
<400>  8
ncgtcgacga tcggcggccg ccgt                                              24
<210>  9
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CpG олигонуклеотид
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (1)..(1)
<223>  5'-Йод-2'-дезоксиуридин
<400>  9
ncgtcgacga tcggcggccg ccgt                                              24
<210>  10
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CpG олигонуклеотид
<400>  10
tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg                                               23
<210>  11
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  РНК олигонуклеотид
<400>  11
uuguuguugu uguuguuguu                                                   20
<210>  12
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  РНК олигонуклеотид
<400>  12
uuauuauuau uauuauuauu                                                   20
<210>  13
<211>  19
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  РНК олигонуклеотид
<400>  13
aaacgcucag ccaaagcag                                                    19
<210>  14
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ДНК/РНК олигонуклеотид
<220>
<221>  иной_признак
<222>  (11)..(17)
<223>  рибонуклеотиды
<400>  14
tcgtcgtttt guuguguttt t                                                 21
<---