Изучение роли полиморфизмов Y113H и H139R гена микросомальной эпоксидгидролазы в детерминации идиопатического бесплодия и нарушений сперматогенеза у мужчин

Сравнение обсеменённости слизистой передних отделов полости носа у пациентов в обеих группах изменений не выявило. При сравнении результатов обследования слизистой зева выявлены различия в частоте встречаемости микроорганизмов (табл. 1).

В группе с острой формой заболевания у 3 пациентов (15%) определялся нормоценоз, в группе с обострением хронического процесса у 1 пациента (8%).

Оценивая частоту встречаемости микроорганизмов, формирующих дисбиоз данного биотопа, следует отметить, что она имеет общие тенденции в обеих группах. В группе пациентов с острой формой заболевания Streptococcus группы D высевался в половине проб, в каждой четвертой — энтеробактерии, E. faecium, C. albicans. Перечисленные микроорганизмы в группе с обострением хронического процесса встречались в 2-3 раза чаще и концентрации выше на 1-2 разведения.

Выделенные микроорганизмы со слизистой конъюнктивы у пациентов с острой формой заболевания и при обострении хронического процесса не различались ни по частоте встречаемости, ни по перечню видов.

Сравнительный анализ иммунологических показателей по группам выявил достоверные различия, как в гуморальном, так и в клеточном звеньях иммунитета (табл. 2).

В группе больных с острым процессом заболевания выявлены достоверно (р< 0,05) более высокие уровни IgG, повышение которого более свойственно для хронизации процесса. Данный факт объясняется тем, что обследо-

ваны пациенты, средний возраст которых составил 70-80 лет, и которые за эти годы сформировали определенный пул клеток памяти. Наиболее существенные нарушения определялись в группе с обострением хронического процесса и характеризовались отсутствием реакции лейкоцитов на воспаление, выражающееся в нормальной величине общего количества лейкоцитов и значительном снижении индекса переваривания. Данный факт коррелирует с высокими показателями средних ЦИК.

Определение антител к вирусам в ИФА показало, что в 100% случаев выявляется ВПГ-G, у 80% больных ВЭБ-NA-G и у 60% ВГ-6-G. Антитела к перечисленным вирусам определялись в анамнестических титрах. Достоверных различий по изучаемым группам не выявлено.

На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:

1. В 88% случаев на слизистой глотки

определяется дисбиоз, сформированный в монокультуре КНС и Streptococcus группы viridands в концентрации менее 103

КОЕ/тамп, и Enterococcus faecium, Escherichia coli, Streptococcus группы D, Candida albicans, энтеробактериями в концентрации 104-105 КОЕ/тамп. как в монокультуре, так и в составе ассоциаций.

2. Микроорганизмы, определяющие дисбиоз слизистой глотки в группе с обострением хронического процесса, встречаются в 2-3 раза чаще, и концентрации выше на 1 -2 разведения.

Таблица 1

Микрофлора слизистой глотки у больных с экссудативными воспалительными реакциями при

артифакии

Острый процесс Обострение хронического процесса

Частота встречаемости

S. haemolyticus 25 102-104

S. группы viridands 23 102-104 50 0 4 1 0 и-

S. группы D 50 105 63 104-105

Enterococcus faecium 10 103-104 20 105

Neisseriae spp. 38 103-105 50 104-105

Escherichia coli 5 103 15 104

Enterobacter spp. — — 5 104

Candida albicans 5 103 10 104

Средняя обсеменённость 177 220

Таблица 2

Иммунологические показатели у больных с экссудативными воспалительными реакциями

при артифакии

Показатели Острый процесс Хронический Норма

Результат Результат

X±SD max-min X±SD max-min

1§0 (мг/мл) 20,2±1,1 27,4-15,7 * 16,7±0,5 19,1-14,5 13,03±0,13

1§Л (мг/мл) 3,0±0,3 5,1-2,1 2,8±0,1 3,0-2,2 2,21±0,03

1§М (мг/мл) 2,6±0,1 3,2-1,7 2,3±0,1 3,0-1,б 1,3±0,03

СН50 (ед) 42,1±6,6 100-33 49,3±7,8 100-2б 41,3±2,0

Лизоцим (мкг/мл) 14,0±3,0 20-12 9,0±0,9 10-7 12-16

ЦИК крупные (3%) (опт. ед) 34,7±13,9 150-5 33,0±б,2 50-5 30-37

ЦИК средние (4%) (опт. ед.) б7,3±1б,5 200-40 90,2±12,4 180-75 40-50

ЦИК мелкие (10%) (опт. ед.) б19,0±80,7 1000-115 512,5±82 750-85 320-400

Лейкоциты 9,9±0,8 13,0-б,0 6,7±0,6 7,8-4,5 4-9*109 /л

РМ№ 66,1±1,9 7б-б0 63,8±4,4 80-55 41-75%

ФА30' 53,9±1,4 б2-49 54,8±1,7 б0-48 76,0±2,5

ФА120' 2,4±1,5 58-44 60,3±1,8 б5-53 6,5±0,4

ФИ30' 4,б±0,2 5,5-3,5 4,7±0,1 5,0-4,2 1/3 от незавершённого фагоцитоза

ФИ120' 4,б±0,3 5,7-3,1 5,0±0,2 б,0-4,4 1/3 от незавершённого фагоцитоза

ИП +13 -12-+30 -15* -33-+2 +75±3,1

Примечание: СН50 — система комплемента (50% гемолиз); ЦИК — циркулирующие иммунные комплексы; РММЪ — сегментоядерные нейтрофилы; ФА30' — фагоцитарная активность нейтрофилов через 30 минут инкубации; ФА120' — фагоцитарная активность нейтрофилов через 120 минут инкубации; ФИ — фагоцитарный индекс; ИП — индекс переваривания, р<0,05.

2. Венчиков А.И., Венчиков В.А. Основные приемы статистической обработки результатов наблюдений в области физиологии. - М.: Медицина, 1974. - 152 с.

3. Константинова Н.А., Лихванцева В.Г., Егорова Э.В., Анжелов В.Д. Роль циркулирующих иммунных комплексов в развитии послеоперационных осложнений у больных при ЭЭК // Вестник офтальмологии. - 1992. - Т. 108, № 2. - С. 34-36.

4. Правила и техника работы с материалом, поступающим для исследования в микробиологическую лабораторию // Методические указания. - Москва 1999. - 87 с.

5. Петруня А.М., Пантелеев Г.В. Иммунные механизмы развития экссудативных реакций на ИОЛ и их коррекция у больных с возрастными катарактами // Офтальмохирургия. -1995.- № 3.- С. 53-57.

6. Стукалов С.Е., Судовская Т.В. Иммуно-микробиологические аспекты экссудативных иридоциклитов и эндофтальмитов при арти-

3. Со слизистой конъюнктивы в 95% случаев независимо от стороны поражения высевается Staphylococcus haemolyticus.

Несмотря на активный воспалительный процесс в иммунных показателях наблюдается снижение уровня сывороточного лизоци-ма, комплемента, фагоцитарной функции нейтрофилов, при этом наиболее выраженное снижение у больных с обострением хронического процесса.

ЛИТЕРАТУРА

1. Архипова Л.Т., Леванова О.Г., Чупров А.Д., Зайцева Г.А. Клинико-иммунологические факторы прогнозирования ранней экссудативной реакции после экстракции сенильной катаракты с имплантацией эластичных интраокулярных линз // Вестник офтальмологии. -1999. - № 2. - С. 25-27.

9б

факии // Вестник офтальмологии. - 1993. -Т. 109, № 3. - С. 12-15.

7. Сергиенко Н.М. Профилактика послеоперационного эндофтальмита // Офтальмологический журнал. - 2006. -№ 3. - С. 151-152.

8. Colleaux K.M., Hamilton W.K. Effect of prophylactic antibiotics and incision type on the incidence of endophthalmitis after cataract surgery // Can. J. Ophthalmology. - 2000. - Vol. 35. -P. 373-378.

9. Diestelhorst M., Dinslage S., Konen W., Krieg-lstein G.K. Effect of 3.0 mm tunnel and 6.0 mm corneoscleral incisions on the blood-aqueous barrier // J. Cataract. Refract. Surg. - 1996. - Vol. 22. -Suppl. 1. - P. 1465-1470.

10. Fishkind W.J. Complications in phacoemulsification: avoidance, recognition, and management // Complications in Phacoemulsification. - New York, 2002. - 386 p.

11. Nagaki Y., Hayasaka S., Kadoi C. et al. Bacterial endophthalmitis after smallincision cataract surgery: effect of incision placement and intraocular lens type // J. Cataract Refract. Surg. - 2003. -Vol. 29. -P. 20-26.

12. Osato M.S. Normal ocular flora. - In: Pepose J., Holland G.N., Wihelmus K.R. - Mosby, St. Louis, 1995. - 876 p.

УДК 575.174.015.3:616.697:616.69-008.6

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ПОЛИМОРФИЗМОВ Y113H И H139R ГЕНА МИКРОСОМАЛЬНОЙ ЭПОКСИДГИДРОЛАЗЫ В ДЕТЕРМИНАЦИИ ИДИОПАТИЧЕСКОГО БЕСПЛОДИЯ И НАРУШЕНИЙ СПЕРМАТОГЕНЕЗА У МУЖЧИН

©Полоников А.В., Ярош С.Л., Кохтенко Е.В., Стародубова Н.И., Пахомов С.П., Орлова В.С.

Кафедра биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета, Курск;

Центр планирования семьи и репродукции, Курск; кафедра зоологии и теории эволюции Курского государственного университета, Курск; кафедра акушерства и гинекологии медицинского факультета Белгородского государственного университета, Белгород E-mail: polonikov@rambler.ru

Впервые было проведено исследование влияния полиморфизмов Y113H и H139R гена EPHX1 на развитие идиопатического мужского бесплодия (ИМБ). Обследовано 203 больных ИМБ и 227 здоровых мужчин. Различий в частотах аллелей и генотипов изученных полиморфизмов между группами не наблюдалось. Было установлено влияние полиморфизма H139R гена EPHX1 на количество сперматозоидов с патологией шейки у больных ИМБ, курящих и избыточно употребляющих жареное и копченое мясо. Полиморфизм Y113H гена EPHX1 ассоциировался с количеством плохо подвижных сперматозоидов у больных ИМБ с избыточным употреблением алкоголя. Кислые значения рН спермы были связаны с носительством вариантных генотипов полиморфизма Y113H гена EPHX1 у больных, избыточно потребляющих копченое и жареное мясо. Полиморфизм H139R был ассоциирован со снижением объема спермы у больных ИМБ на фоне избыточного потребления копченого мяса. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что фенотипические эффекты гена EPHX1 могут иметь патогенетическое значение в развитии ИМБ и, по-видимому, реализуются через нарушения сперматогенеза при участии средовых факторов токсической природы.

Ключевые слова: идиопатическое мужское бесплодие, сперматогенез, ферменты биотрансформации ксенобиотиков, микросомальная эпоксидгидролаза, ДНК-полиморфизм, взаимодействия генотип-среда.

THE CONTRIBUTION OF POLYMORPHISMS Y113H AND H139R OF MICROSOMAL EPOXIDE HYDROLASE GENE TO IDIOPATHIC MALE INFERTILITY AND SPERM ABNORMALITIES

IN MEN

Polonikov A.V., Yarosh S.L., Kokhtenko E.V., Starodubova N.I., Pakhomov S.P., Orlova V.S. Department of Biology, Medical Genetics and Ecology of the Kursk State Medical University, Kursk;

Centre for Planning of the Family and Reproduction, Kursk;

Department of Zoology and Theory of Evolution of the Kursk State University, Kursk;

Obstetrics & Gynecology Department of the Medical Faculty of the Belgorod State University, Belgorod The present study investigated for the first time the impact of polymorphisms Y113H and H139R of the EPHX1 gene on the development of idiopathic male infertility (IMI). 203 patients with IMI and 227 healthy men were recruited for the study. No differences in both allele and genotype frequencies of the EPHX1 gene polymorphisms were found between the groups. Polymorphism H139R in IMI patients who were tobacco smokers and over-consumers of fried or smoked red meat was found to be associated with quantity of spermatozoa having cervical abnormalities. Polymorphism Y113H in IMI patients who over-drunk alcohol was associated with quantity of spermatozoa having slow motility characteristics. Sperm pH parameter was associated with carriage of variant Y113H genotypes in IMI patients who over-consumed fried or smoked red meat. The impact of polymorphism H139R of the EPHX1 gene on sperm volume was observed in patients who over-consumed smoked red meat. The present findings suggest that phenotypic effects of EPHX1 gene could play pathogenetic role in the development of IMI through the abnormalities of spermatogenesis and upon exposure to the environmental toxicants.

Keywords: idiopathic male infertility, spermatogenesis, biotransformation enzymes, microsomal epoxide hydrolase, DNA polymorphism, gene-environment interactions.

По данным ВОЗ, за последние 50 лет на планете создалась сложная демографическая ситуация, обусловленная резким увеличением численности населения за счет лиц пожилого возраста и прогрессирующим снижением уровня рождаемости и ростом частоты бесплодных браков. В странах Западной Европы бесплодие в браке регистрируется примерно у 15% супружеских пар [12, 30], при этом мужской фактор в таких браках выявляется более чем в половине случаев [12]. Демографические показатели России и многих стран мира свидетельствуют о существенном увеличении за последние десятилетия частоты инфертильных состояний мужчин [3, 5]. В последнее время накапливается все больше эпидемиологических и экспериментальных доказательств того, что наиболее вероятными причинами негативных тенденций в состоянии репродуктивной функции мужчин может быть существенное ухудшение экологической обстановки в мире, связанной с накоплением в высоких концентрациях в окружающей среде (воздух, вода, почва, пищевые продукты) разнообразных токсичных химических веществ - продуктов современной техногенной цивилизации [13, 22]. В частности, установлена связь химически загрязненного воздуха в экологически неблагополучных промышленных районах со снижением количества морфологически нормальных сперматозоидов, увеличением числа патологических форм сперматозоидов и спермиев с хромосомными аберрациями [24]. Кроме того, установлено негативное влияние продуктов промышленной и сельскохозяйственной индустрии на сперматогенез не только посредством прямого токсического влияния на репродуктивные органы мужчин, но и через нарушение эндокринной регуляции половых функций [17, 18, 27]. Хорошо известны негативные влияния на сперматогенез мужчин вредных привычек [14, 16, 20, 28]. Представленные выше данные наглядно демонстрируют возможную этиологическую роль токсикантов внешней среды в формировании идиопатическонго мужского бесплодия (ИМБ).

Несмотря на возрастающий в андрологии интерес исследователей к токсикологическим проблемам мужского бесплодия, по-прежнему остаются невыясненными вопросы

индивидуальной чувствительности организма мужчин к токсическим веществам, вызывающим нарушения сперматогенеза и ответственным за развитие инфертильности. Известно, что в зависимости от генотипических особенностей ферментативной системы биотрансформации ксенобиотиков различные люди могут сохранять устойчивость или, наоборот, обнаруживать повышенную чувствительность к повреждающим агентам внешней среды химической природы [1]. Однако из медицинских публикаций известно несколько исследований по изучению вовлеченности полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) -CYP1A1 [8] и GSTM1 [4] в формирование предрасположенности к идиопатическому мужскому бесплодию. Вовлеченность других ФБК в развитие идиопатического мужского бесплодия до настоящего времени не изучалась.

Одним из ключевых ФБК является микро-сомальная эпоксидгидролаза (EPHX1), осуществляющая гидролиз разнообразных токсикантов внешней среды: эпоксидов, арено-вых и алкеновых оксидов, образующихся в ходе их метаболической активации монокси-геназной системой цитохромов Р-450 [19]. Главными субстратами для EPHX1 являются эпоксидные производные ПАУ (бен-зо^пирен 4,5-оксид) и 1,3-бутадиена, бензин, афлотоксин B1, кризен, нитропирен, нафталин и антрацен [7, 15]. EPHX1 экспрессируется во многих тканях, но наиболее высокие уровни экспрессии фермента обнаруживаются в яичках [19], тем самым демонстрируя важную роль фермента в детоксикации ксенобиотиков в репродуктивных органах у мужчин. В европеоидных популяциях установлены почти 50-кратные межиндиви-дуальные различия в активности фермента, связанные с наличием функционально неравноценных аллельных вариантов в структуре гена EPHX1 [10]. Saito S. с соавт. [23] было проведено полное секвенирование гена ЕРНХ1 и обнаружено 33 полиморфизма, 6 из которых были расположены в 5'-фланкирующей части гена, 17 - в интронах, 8 - в экзонах и 3 - в 3'-фланкирующей области гена. Однако наиболее распространенными и функционально значимыми полиморфизмами в гене EPHX1 является две точковые мута-

ции: 337Т>С в третьей экзоне, сопровожда-

113 •

ющаяся аминокислотной заменой Туг —»His (Y113H), а также 416A>G в четвертой экзоне, характеризующаяся аминокислотной заменой

139

His —>Arg (H139R) в полипептид ной цепи фермента. [9]. В общей популяции указанные полиморфизмы гена EPHX1 фактически определяют большую часть межиндивиду-альных различий в активности фермента [9, 10]. В рамках настоящей работы впервые было проведено исследование влияния полиморфизмов Y113H и H139R гена EPHX1 на развитие идиопатического мужского бесплодия, а также качественные и количественные характеристики сперматогенеза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования послужила выборка неродственных мужчин русской национальности (n=430), включающая 203 больных идиопатическим мужским бесплодием и 227 здоровых мужчин. Сбор материала и клиническое обследование больных ИМБ и здоровых мужчин проводились на базе Центра планировании семьи и репродукции Курской области за период с 2006-го по 2008 гг. Все обследованные мужчины дали письменное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования был одобрен региональным этическим комитетом Курского государственного медицинского университета. Диагноз ИМБ устанавливался на основании анамнестических данных (отсутствие беременности в браке более 1 года), исключения женского фактора в бесплодном браке и комплексного клинико-лабораторного исследования мужчин. Программа исследований включала: анализ спермограммы, диагностику инфекций, передающихся половым путем (методами ПЦР и ИФА), определение антис-пермальных антител (МАР-тест), гормонов сыворотки крови (тестостерон, пролактин, лютеинезирующий гормон, фолликулостимулирующий гормон), а также микроскопическое исследование секрета предстательной железы. К больным ИМБ относили мужчин с нарушением показателей спермограммы (олигоспермия, астеноспермия, патоспермия), с нормальным уровнем антиспермальных антител и исследованных гормонов сыворотки

крови, при исключении патологии предстательной железы (по данным микроскопического исследования) и инфекций, передающихся половым путем. Контрольную группу составили мужчины с нормальными показателями спермограммы, имеющие здоровых детей. Здоровые мужчины (средний возраст 32,4 лет ±10,6) были несколько старше (р=0,001) мужчин больных ИМБ (средний возраст 29,2 лет ± 4,1). Все обследуемые были персонально протестированы с помощью специально разработанных анкет, включающих сбор сведений об образе жизни, профессиональной деятельности, вредных привычках и особенностях питания с целью выявления возможных факторов риска возникновения мужского бесплодия. Для изучения взаимодействий генотип-среда (влияние генотипов гена EPHX1 на показатели сперматогенеза в зависимости от различных условий среды) были выбраны средовые факторы, воздействие которых на организм (в том числе и на репродуктивные органы мужчин) характеризуется токсическим и/или прооксидантным повреждением биоструктур [2, 29], а именно: курение, злоупотребление алкоголем, регулярное употребление жареного и копченого мяса. Последние факторы рассматривались в связи с тем, что в мясной пище, прошедшей интенсивную температурную обработку (жарение, запекание, горячее копчение) в результате пиролиза органических веществ образуются в высоких концентрациях химические вещества, такие как ПАУ (2-200 мкг/кг мяса) и гетероциклические соединения [6, 21], высокотоксичные для различных тканей и органов, в том числе и для мужской репродуктивной системы. Данные по указанным факторам выкопировывались из анкет здоровых и больных ИМБ мужчин и кодировались в электронной базе данных в виде бинарных значений (да, нет).

У всех обследуемых проводился забор венозной крови в количестве 5 мл в пластиковые пробирки с 0,5М раствором ЭДТА. После этого кровь замораживали и хранили при -20°С. Выделение геномной ДНК осуществляли из размороженной крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Генотипирование полиморфизмов У113Н и Н139Я гена EPHX1 проводили ме-

тодами ПЦР-ПДРФ согласно протоколам, описанным в литературе [9, 26]. Продукты

гидролиза фракционировали с помощью электрофореза в 3% агарозном геле, приготовленном на основе ТВЕ буфера (0,089М Трис-НО, 2мМ ЭДТА, 0,089М борная кислота). На рис. 1 представлены результаты электрофоретического разделения фрагментов ДНК, полученных после рестрикции продуктов ПЦР, содержащих полиморфизмы Y113H и H139R гена EPHX1. После электрофореза гели документировали на трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете с помощью системы GDS-8000 ("UVP", США) и программного аналитического пакета LabWorks™ v4.5 (США).

Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ) и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборках больных ИМБ и здоровых мужчин использовали критерий %2 Пирсона с поправкой Йетса на непрерывность.

Частоты гаплотипов исследованных полиморфизмов рассчитывали с помощью программы EH (Rockefeller University, США). Проверку распределений количественных признаков (показатели спермограммы) на нормальность проводили с помощью крите-

рия Колмогорова-Смирнова. Оценка влияния исследуемых полиморфизмов на показатели сперматогенеза осуществлялась непараметрическим методом Краскела-Уоллиса. Различия в показателях спермограммы между группами здоровых и больных ИМБ оценивали непараметрическим методом Вальда-Вольфовица. Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием программных пакетов Statistica 6.0 ("StatSoft") и MS Excel 2002.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Частоты генотипов полиморфизма H139R гена EPHX1 находились в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга (p>0.05) в обеих исследованных группах. Для генотипов полиморфизма Y113H установлено статистически значимое отклонение частот генотипов от РХВ как в группе больных ИМБ, так и в контроле (p<0,01), которое было связано со снижением уровня наблюдаемой гетерози-готности (H0) в обеих группах. Тем не менее для изученных полиморфизмов наблюдался

113YY 113YH \ \ 113НН i. .

139НН

139HR

139RR

^ ^ fc&i lj^ Ц

•шштфштштШШШ ш

• I » - * « ШшФ тт» tmt вЯЯ *вма

. ~ я

Рис. 1. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК, полученных после рестрикции продуктов ПЦР, содержащих полиморфизмы У113Н (рис. 1, А) и Н139Я (рис. 1, Б) гена EPHX1.

достаточно высокий уровень аллельного разнообразия: для У113Н (Но=0,374 в группе ИМБ и Н0=0,383 в контроле), так и для Н139Я (Н0=0,301 в группе ИМБ и Н0=0,348 в контроле). В табл. 1 представлены распределения частот аллелей и генотипов исследованных полиморфизмов гена EPHX1 в группах здоровых мужчин и больных идиопати-ческим бесплодием. Как видно из представленных данных, различий в частотах аллелей и генотипов полиморфизмов У113Н и Н139Я гена EPHX1 между группами здоровых мужчин и больных ИМБ не установлено. Сравнительный анализ частот парных сочетаний генотипов исследуемых полиморфизмов между группами здоровых мужчин и больных ИМБ также не выявил статистически значимых различий. Всего было обнаружено 9 парных сочетаний генотипов, однако наиболее частыми из них были следующие: 113УУх139НН (32,0% - у больных ИМБ, 27,8% - у здоровых мужчин), 113УНх139НН (23,2% - у больных ИМБ, 22,5% - у здоровых мужчин), 113УУх139НЕ1 (12,3% - у больных ИМБ, 12,3% - у здоровых мужчин),

113УНх139НЕ1 (13,3% - у больных ИМБ,

14,1% - у здоровых мужчин). С помощью программы ЕН было установлено 4 гаплотипа гена EPHX1 и рассчитаны их частоты в обеих исследованных группах (табл. 2). Как видно из таблицы 2, наиболее частыми гаплотипами гена EPHX1 были: 113У/139Н (53% - у больных ИМБ, 49% - у здоровых мужчин) и 113Н/139Н (28% - у больных ИМБ, 28% - у здоровых мужчин). Анализ неравновесия по сцеплению позволил выявить полное независимое наследование полиморфных вариантов У113Н и Н139Я гена EPHX1 (р>0,05) как у больных ИМБ, так и у здоровых мужчин.

В связи с тем, что идиопатическое мужское бесплодие само по себе является комплексным патологическим фенотипом, в основе которого лежат структурные и функциональные характеристики сперматогенеза, представлялось крайне необходимым исследовать влияние полиморфизмов У113Н и Н139Я гена EPHX1 на основные показатели спермограммы у больных ИМБ. В табл. 3 представлена характеристика основных показателей сперматогенеза у здоровых мужчин и больных идиопатическим бесплодием. Все проанализированные показатели спермо-

Таблица 1

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизмов Y113H и H139R гена EPHX1 в группах больных идиопатическим бесплодием и здоровых мужчин

Распределение частот аллелей полиморфизмов гена ЕРНХ1

Исследуемые группы У113Н ЕРНХ1 Н139Я ЕРНХ1

113У 113Н 139Н 139Я

Больные ИБ (п=203) 0,645 0,355 0,815 0,185

Здоровые (п=227) 0,615 0,385 0,773 0,227

Критерий различий, %

Распределение частот генотипов полиморфизмов гена ЕРНХ1

Исследуемые группы У113Н ЕРНХ1 Н139Я ЕРНХ1

113УУ 113УН 113НН 139НН 139НЯ 139ЯЯ

Больные ИБ

Здоровые

Критерий различий, %

Таблица 2

Распределение частот гаплотипов полиморфизмов Y113H и H139R гена EPHX1 в группах больных идиопатическим бесплодием и здоровых мужчин

Гаплотипы гена EPHX1 Частоты гаплотипов Критерий различий, х2

Больные ИМБ

Н1 113У/139Н 0.534922 0.494820 3,22 (0,36) 4/=3

Н2 113У/139Я 0.110398 0.119717

Н3 113Н/139Н 0.280349 0.278308

Н4 113Н/139Я 0.074331 0.107155

Таблица 3

Характеристика основных показателей спермограммы у здоровых мужчин и больных

идиопатическим бесплодием

Показатели спермо-граммы Больные ИМБ (п=203) Здоровые (п=227) р*

Me Интерквартильный интервал Me Интерквартильный интервал

25-й квартиль 75-й квартиль 25-й квартиль 75-й квартиль

Количество сперматозоидов (млн.) в 1 мл 40 23 62 71 51 88 0,00001

Количество подвижных сперматозоидов (%) 23 16 27 55 51 58 0,00000

Количество плохо подвижных сперматозоидов (%) 18 14 23 14 10 20 0,01

Количество неподвижных сперматозоидов (%) 57 52 63 29 24 36 0,00000

Количество патологических сперматозоидов (%) 55 49 63 45 42 47 0,00000

Количество сперматозоидов с патологией головки (%) 23 17 30 15 12 19 0,00000

Количество сперматозоидов с патологией шейки(%) 32 28 36 30 22 32 0,01

Объем спермы (мл) 2,6 2 3,6 4 3,2 4,5 0,001

рН спермы 7,2 7,2 7,8 7,8 7,8 7,8 0,001

* - уровень значимости различий между группами для критерия Вальда-Вольфовица

граммы имели отличное от нормального распределение, в связи с чем значения в таблице были представлены в виде медиан (Ме) и 25-75% интерквартильных размахов. Неудивительно, что группа больных ИМБ отличалась от контроля по всем представленным показателям, так как последние являлись определяющими при диагностике бесплодия и дифференцировке обследуемых мужчин на больных и здоровых. Различий в исследованных средовых факторах риска, а именно курении, избыточном потреблении алкоголя, жареного и копченого мяса между группами здоровых мужчин и больных ИМБ не установлено (данные не представлены). Результаты анализа влияния генотипов исследуемых полиморфизмов гена EPHX1 на показатели спермограммы представлены в таблице 4. Было установлено статистически значимое (р=0,04) влияние полиморфизма Н139Я гена EPHX1 на количество сперматозоидов с патологией шейки у больных ИМБ. Причем связь указанного полиморфизма с патологией шейки обнаружена исключительно у курящих больных ИМБ (р=0,05) и избыточно употребляющих жареное (р=0,03) и копченое (р=0,06) мясо, хотя и последняя ассоциация не достигала статистического уровня значимости. У больных ИМБ, избыточно употребляющих копченое мясо, наблюдалась отчетливая тенденция в ассоциации полиморфизма Н139Я с количеством неподвижных сперматозоидов (р=0,08). Полиморфизм У113Н гена EPHX1 был ассоциирован с количеством плохо подвижных сперматозоидов у больных ИМБ, которые избыточно употребляли алкоголь (р=0,05). Кроме того, были обнаружены влияния полиморфизмов У113Н и Н139Я гена EPHX1 на объем и рН спермы. В частности, кислые значения рН спермы были ассоциированы с носительством вариантных генотипов полиморфизма У113Н гена EPHX1 у больных, избыточно потребляющих копченое и жареное мясо (р<0,04). Кроме того, вариантные генотипы полиморфизма Н139Я гена EPHX1 были ассоциированы со снижением объема спермы у больных ИМБ на фоне избыточного потребления копченого мяса. У курящих больных имело место влияние полиморфизма У113Н гена EPHX1 на снижение количества сперматозоидов, однако указанная ассоциация не достигала уровня стати-

стической значимости (р=0,07). На рис. 2 представлены примеры гистограмм, демонстрирующих влияние полиморфных вариантов У113Н и Н139Я гена EPHX1 на отдельные показатели спермограммы у больных ИМБ.

В рамках настоящего исследования была впервые изучена связь двух распространенных полиморфных вариантов гена У113Н и Н139Я гена EPHX1 с предрасположенностью к мужскому идиопатическому бесплодию. Хотя нами не было установлено прямой статистически значимой взаимосвязи изученных полиморфизмов с предрасположенностью к ИМБ, исследованные генотипы гена EPHX1 оказывали существенное влияние на основные показатели сперматогенеза, которые определяют развитие инфертильных состояний у мужчин. При этом негативный эффект исследованных полиморфизмов проявлялся при определенных условиях внешней среды, демонстрирующих важную роль взаимодействий генотип-среда в формировании предрасположенности к ИМБ. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что фенотипические эффекты гена микросомаль-ной эпоксидгидролазы могут иметь патогенетическое значение в развитии бесплодия у мужчин и, несмотря на отсутствие связи с фенотипом болезни, по-видимому, реализуются через нарушения в созревании мужских половых клеток при участии токсигенных средовых факторов. Так, патологические эффекты генотипов исследованных полиморфизмов проявлялись главным образом снижением объема спермы и значением ее рН, а также увеличением количества патологических форм спермиев - патоспермией. При этом каждый из изученных полиморфизмов гена EPHX1 ассоциировался с определенными нарушениями сперматогенеза, то есть патологические эффекты полиморфных вариантов гена EPHX1 на различные показатели спермограммы оказались неравнозначными. Принимая во внимание доступные в литературе данные по функциональной значимости аллельных вариантов гена EPHX1 [9, 10, 11], следует отметить, что, по всей видимости, патологические эффекты обоих полиморфизмов У113Н и Н139Я не взаимосвязаны друг с другом. В пользу этого предположения может