Использование иммуноблоттинга для изучения эпитопной направленности моноклональных антител к антигену 200 kDa возбудителя мелиоидоза

БИОТЕХНОЛОГИЯ, ИММУНОЛОГИЯ

УДК 616.98:579.841.1

И.И.Корсакова12, Н.П.Храпова12, Т.В.Замарина1, Е.В.Пименова1, Н.С.Макаров2, Ю.А.Голосеев1

использование иммуноблоттинга для изучения эпитопной направленности моноклональных антител к антигену 200 kda возбудителя мелиоидоза

'ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт», Волгоград, Российская Федерация; 2ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава РФ,

Волгоград, Российская Федерация

Целью работы являлось изучение с помощью иммуноблоттинга эпитопной направленности моноклональных антител к антигену 200 kDa Burkholderia pseudomallei, синтезируемых гибридомами-продуцентами из двух коллекций, полученных в лаборатории иммунодиагностики и биотехнологии ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт».

В работе использовали 8 типичных штаммов возбудителя мелиоидоза с полноценной антигенной структурой. Антигенные препараты разделяли вертикальным электрофорезом в денатурирующих условиях в 12 % полиакри-ламидном геле с 0,1 % додецилсульфата натрия. При тиражировании клеток 12 гибридом-продуцентов получали препаративные количества моноклональных антител к гликопротеину 200 kDa B. pseudomallei, на основе которых приготовили иммунопероксидазные конъюгаты. Эпитопную направленность моноклональных антител изучали методом иммуноблоттинга.

В составе антигенных комплексов водно-солевых и формамидных экстрактов B. pseudomallei методом вертикального электрофореза установлено наличие нескольких обязательных мажорных компонентов. С помощью дифференциального окрашивания доказана гликопротеиновая природа отдельных компонентов исследованных антигенов. В иммуноблоттинге с применением названных антигенных препаратов определена эпитопная направленность ряда моноклональных антител к антигену 200 kDa возбудителя мелиоидоза, показаны отличия в картине их специфического взаимодействия с биополимерами, входящими в антигенный спектр, характерные как для гибридом-продуцентов, принадлежащих к разным коллекциям, так и для отдельных штаммов B. pseudomallei.

Ключевые слова: мелиоидоз, Burkholderia pseudomallei, антигены, моноклональные антитела, эпитопная направленность, иммуноблоттинг.

LLKorsakova1,2, N.P.Khrapova1,2, T.V.Zamarina1, E.V.Pimenova1, N.S.Makarov2, Yu.A.Goloseev1

Utilization of Immunoblotting in studies of Epitope Targeting in Monoclonal Antibodies to Melioidosis Agent Antigen 200 kda

'VolgogradResearch Anti-Plague Institute, Volgograd, Russian Federation; 2Volgograd State Medical University, Volgograd, Russian Federation

Objective of the research was to use immunoblotting for studies of epitope targeting in monoclonal antibodies to 200 kDa Burkholderia pseudomallei antigen, which are synthesized by hybridomas-producers from the two collections in the laboratory of immunodiagnostics and biotechnology at the premises of Volgograd Research Anti-Plague Institute. Employed were 8 typical strains of melioidosis agent with the complete antigenic structure. Antigen preparations were separated by means of denaturating vertical electrophoresis in 12 % polyacrylamide gel with 0.1 % sodium dodecylsulfate. During the process of cell-replication, 12 hybridomas-producers were given preparative amounts of monoclonal antibodies to 200 kDa Burkholderia pseudomallei glycoprotein. Following that, immunoperoxidase conjugates were manufactured. Epitope targeting of monoclonal antibodies was evaluated using immunoblotting. With the help of vertical electrophoresis identified was the presence of several mandatory major components contained in the antigen complexes of the salt-water and formamid B. pseudomallei extracts. Differential staining substantiated glycoprotein origin of certain antigen components. Immunoblotting with the stated above antigen preparations revealed epitope targeting of a number of monoclonal antibodies to 200 kDa antigen of melioidosis agent; demonstrated were the differences in their specific interaction with biopolymers which form part of the antigen specter. Those differences were characteristic of hybridomas-producers belonging to different collections, as well as of particular strains of B. pseudomallei.

Key words: melioidosis, Burkholderia pseudomallei, antigens, monoclonal antibodies, epitope targeting, immunoblotting.

Эпитоп является очень небольшим участком на поверхности антигенного комплекса, вступающим во взаимодействие с комплементарным ему активным центром моноклональных антител (МКА) и встречающимся в составе антигена с различной частотой [5, 6]. После электрофореза в денатурирующих условиях эти участки можно выявить в составе отдельных антигенных фракций методом иммуноблоттинга.

мкА нашли широкое применение для дифференциации и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза, изучения свойств и локализации антиге-

нов, входящих в состав микробных клеток, установления внутривидовых различий между отдельными штаммами [1, 4, 7]. Чтобы определить целевое назначение каждого типа мкА, необходимо подробно охарактеризовать их свойства, в том числе эпитоп-ную направленность, отражающую индивидуальные свойства каждого моноклонального иммуноглобулина. Ее изучение важно для последующего создания диагностических тестов на основе мкА, а также для выбора методов очистки антигенов.

Целью работы являлось изучение с помощью

Проблемы особо опасных инфекций, вып. 4, 2014

иммуноблоттинга эпитопной направленности МКА к антигену 200 kDa Burkholderia pseudomallei, синтезируемых гибридомами-продуцентами из двух полученных в лаборатории иммунодиагностики и биотехнологии ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» коллекций.

материалы и методы

В работе использовали 8 типичных штаммов возбудителя мелиоидоза с полноценной антигенной структурой из коллекции ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт».

Методики культивирования микроорганизмов, накопления и обеззараживания микробных взвесей, получения водно-солевых (ВСЭ) и формамид-ных (ФЭ) экстрактов описаны ранее [3]. Клетки 12 гибридом-продуцентов мКА к гликопротеину 200 kDa B. pseudomallei 100 тиражировали для получения препаративных количеств МКА. Из мышиной асцитической жидкости выделяли моноклональные иммуноглобулины, на их основе готовили иммуно-пероксидазные конъюгаты (ИПК) по методу [2].

Антигенные препараты разделяли вертикальным электрофорезом в денатурирующих условиях в 12 % полиакриламидном геле с 0,1 % додецил-сульфата натрия (ПААГ-ДСН) на приборе «Mini-PROTEAN 3» («Bio-Rad Laboratories, inc.», США) [8]. В качестве стандартов молекулярных масс (м.м.) использовали набор маркерных белков 14,4-97 kDa (ООО «Хеликон», Москва). Последующий перенос исследуемых образцов на нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,45 мкм проводили в ячейке прибора «Mini-Trans-Blot» («Bio-Rad Laboratories, inc.», сША) в жидкой среде в течение ночи при 4 °С, 90 мА и 30 В [8] в модификации, которая заключалась в использовании в качестве блокирующего реагента 0,03 % раствора твин-20. Детекцию антигенных препаратов проводили с использованием полученных моноклональных ипК после проверки их на специфичность. Рабочее разведение ИПК составило 1:20. Обработку мембраны иммунофермент-ным конъюгатом и последующую визуализацию антигенных фракций осуществляли по общепринятой методике c использованием хромогена диами-нобензидина (DAB), активированного 0,1 мл 3,5 % H2O2 [8]. Электрофореграммы и блоттограммы сканировали на приборе «Epson expression™ 10000 XL» («Epson», Япония). Полученные изображения анализировали с помощью компьютерной программы «TotalLab TL120»© («TotalLab Ltd.») с установлением м.м. биополимерных фракций и их математическим выравниванием.

результаты и обсуждение

При комбинированной окраске электрофо-реграмм кумасси синим R-250 и нитратом серебра в диапазоне м.м. 203-17,7 kDa в составе ВСЭ B. pseudomallei было выявлено от 16 до 35 антиген-

ных фракций, а в ФЭ - 4-13 компонентов. Следует отметить наличие в составе ВСЭ всех исследованных штаммов возбудителя мелиоидоза мажорных антигенов с м.м. около 203, 177, 70, 34, 30, 26 и 17,7 kDa. Для ФЭ характерными оказались фракции с м.м. 203, 68, 65 и 58 kDa. В результате использования специфического окрашивания полиакриламидного геля на гликопротеиды и полисахариды алциановым синим и реактивом Шиффа с йодной кислотой показано, что значительная часть изучаемых антигенов является гликопротеинами.

Иммуноблоттинг с ВСЭ штаммов B. pseudomallei и различными сериями ФЭ B. pseudomallei 100 позволил установить подробную картину специфического взаимодействия биополимеров различных м.м., входящих в их антигенные спектры, с экспериментальными ИПК, а также получить представление об эпитопной плотности и направленности использованных в работе МКА (таблица).

Следует отметить, что эпитопная направленность МКА, принадлежащих к двум полученным в разное время коллекциям, существенно отличается. Так, ИПК 2H7 и 2A6 II из первой коллекции способны связываться с антигеном 203 kDa, входящим в состав как ВСЭ, так и ФЭ. Кроме того, эти МКА взаимодействуют с отдельными антигенными компонентами, имеющими м.м. от 44 до 40 kDa. ИПК 2H7 в силу своей специфичности обнаруживал две фракции, характерные по результатам электрофореза для всех исследованных штаммов возбудителя мелиоидоза -203 и 17,7 kDa.

Остальные МКА относятся ко второй коллекции и имеют во многом сходную, но не идентичную эпитопную направленность. Наибольшее количество эпитопов в составе всех использованных в иммуно-блоттинге образцов ВСЭ и серий ФЭ выявлено с помощью ИПК 5С2, который суммарно связался с 14 биополимерами с м.м. в диапазоне от 37 до 18,4 kDa. Эпитопный профиль МКА 6B7, 6A11 и 3C6 практически одинаков: он представлен шестью антигенными фракциями в составе всех исследованных ВСЭ и

сводные данные по эпитопной направленности мкА к антигенам исследованных ВсЭ и фЭ штаммов B. pseudomallei

Наименование МКА Выявленные эпитопы на биополимерах с м.м. (kDa) в составе:

ВСЭ ФЭ

5С2 37, 36, 35, 34, 30, 26, 24, 21, 18,4

4А10 37, 35, 34, 18,4

6F9 37, 36, 35, 34, 26, 18,4

6А11 37, 36, 35, 34, 26, 21

6B7 37, 36, 35, 34, 26, 21

6B7 I 52, 35, 34, 30

6B7 II 52, 35, 34, 30

6E7 37, 36, 35, 34, 26

7А8 37, 35, 34, 18,4

2H7 203, 44, 41, 40, 34, 17,7

2A II 203, 40

37, 33, 22, 18,6 33, 22, 18,6 33, 22, 18,6 33, 22, 18,6 37, 33, 22, 18,6

33, 22, 18,6 33, 22, 18,6 203, 17,7 203

БИОТЕХНОЛОГИЯ, ИММУНОЛОГИЯ

тремя - у ФЭ, за исключением входящего в состав 22 серии ФЭ B. pseudomallei 100 дополнительного компонента с м.м. 37 kDa для МКА 6B7 и антигена 18,4 kDa, обнаруженного в ВСЭ штамма B. pseudo-mallei 100 с помощью МКА 3C6 (рисунок).

Исследованный ИПК 6E7 не взаимодействовал с низкомолекулярными антигенами ВСЭ B. pseudo-mallei 100, которые располагаются в области м.м. 2118,4 kDa. В остальном этот образец МКА повторяет картину эпитопного взаимодействия ИПК 6B7, 6A и 3C6 с биополимерами изученных образцов ВСЭ и ФЭ.

ИПК 4A10 и 7A8 связывались лишь с 4 антигенами в составе ВСЭ штаммов B. pseudomallei, а результаты их реакции с эпитопами ФЭ аналогичны большинству МКА из второй коллекции. Специфичность ИПК 6F9 оказалась такой же, как и у 3C6, только он не реагировал с антигеном 21 kDa в составе ВСЭ.

Ни одно из изученных МКА не вступило в связь с антигенами 5-й серии ФЭ B. pseudomallei 100, что связано, по всей видимости, с ранее выявленным низким содержанием гликопротеинов в его составе.

В целом, картина эпитопного профиля для каждого из исследованных ИПК варьировала в зависимости от штамма B. pseudomallei, из которого получали антигенные препараты. Однако у большинства штаммов были обнаружены компоненты с м.м. 35, 34 и 17-18 kDa.

Таким образом, в составе антигенных комплексов ВСЭ и ФЭ B. pseudomallei методом вертикального электрофореза в ПААГ-ДСН установлено наличие нескольких обязательных мажорных компонентов. С помощью дифференциального окрашивания доказана гликопротеиновая природа отдельных компонентов исследованных антигенов. Определение эпитоп-ной направленности ряда МКА к антигену 200 kDa возбудителя мелиоидоза позволило осуществлять отбор МКА к пространственно разобщенным детерминантам, не конкурирующих за центры связывания на молекуле антигена, с целью дальнейшего использования их комбинаций для создания иммунодиагно-стических препаратов.

Блоттограммы взаимодействия антигенов ВСЭ B. pseudomallei 100 с панелью исследованных ИПК:

а - м.м. биополимеров на блоттограмме (kDa); б - суммарный антигенный профиль ВСЭ B. pseudomallei 100; 1—8 - блоттограммы соответствующих ИПК

список ЛИТЕРАТУРЫ

1. Антонов В.А., Илюхин В.И., Храпова Н.П., Прохватилова Е.В., Викторов Д.В., Сенина Т.В., Будченко А.А., Ткаченко Г.А., Алексеева В.В., Захарова И.Б., Савченко С.С., Зинченко О.В., Сорокина Ю.И., Алексеев В.В. Современные подходы к диагностике сапа и мелиоидоза. Идентификация и типирование Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei. Пробл. особо опасных инф. 2012; 112:46-50.

2. Булатова Т.В., Храпова Н.П., Барышева А.Ю. Разработка экспериментальной тест-системы иммуноферментной монокло-нальной для обнаружения антигена 200 kDa возбудителя мелиоидоза. Медицинский академический журн. 2012; Приложение: 307-9.

3. Корсакова И.И., Храпова Н.П., Напалкова Г.М., Ломова Л.В., Дрефс Н.М., Голосеев Ю.А., Булатова Т.В. Сравнительный анализ иммунохимических методов исследования антигенов патогенных буркхольдерий. Пробл. особо опасных инф. 2012; 113:82-5.

4. Храпова Н.П., Алексеев В.В., Корсакова И.И., Дрефс Н.М., Ломова Л.В., Булатова Т.В., Напалкова Г.М. Применение сапных и мелиоидозных моноклональных антител различной эпитопной направленности для обнаружения и идентификации патогенных буркхольдерий. Пробл. особо опасных инф. 2011; 107:66-9.

5. Gaseitsiwe S., Valentini D., Mahdavifar S., Reilly M., Ehmst A., Maeurer M. Peptide microarray-based identification of Mycobacterium tuberculosis epitope binding to HLA-DRB1*0101, DRB1*1501 and DRB1*0401. Clin. Vaccine Immunol. 2010; 17(1):168-75.

6. Linnebacher M., Lorenz P., Koy C., Jahnke A., Born N., Steinbeck F., Wollbold J., Latzkow T., Thiesen H.-J., Glocker M. Clonality characterization of natural epitope-specific antibodies against the tumor-related antigen topoisomerase IIa by peptide chip and proteome analysis: a pilot study with colorectal carcinoma patient samples. Analyt. Bioanalyt. Chem. 2012; 403(1):227-38.

7. Ma G.Q., Shao F., Xie X.M., Cui H.F., Wan H.J. Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method for reliable detection Burkholderia pseudomallei in soil samples. African J. Microbiol. Res. 2014; 8(5):452-7.

8. Westermeier R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. 4th ed. Weinheim: WILEY-VCH Verlag; 2005. 406 p.

References

Ilyukhin V.I., Khrapova N.P., Prokhvatilova E.V., Senina T.V, Budchenko A.A., Tkachenko G.A., Alekseeva

1. Antonov V.A.. Viktorov D.V.

V.V., Zakharova I.B., Savchenko S.S., Zinchenko O.V., Sorokina Yu.I., Alekseev V.V. [Modern approaches for detection of glanders and melioidosis. Identification and typing of Burkholderia mallei and Burkholderia Pseudomallei]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2012; 112:46-50.

2. Bulatova T.V., Khrapova N.P, Barysheva A.Yu. [Development of experimental immuno-enzyme monoclonal test-system for 200 kDa antigen detection]. Meditsinskii Akadem. Zh. 2012; Appendix: 307-9.

3. Korsakova I.I., Khrapova N.P., Napalkova G.M., Lomova L.V., Drefs N.M., Goloseev Yu.A., Bulatova T.V. [Comparative analysis of immu-nochemical methods applied for studies of pathogenic Burkholderia antigens]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2012; 113:82-5.

4. Khrapova N.P., Alekseev V.V., Korsakova I.I., Drefs N.M., Lomova L.V., Bulatova T.V., Napalkova G.M. [Application of glanders and melioidosis monoclonal antibodies of different epitope specificity for pathogenic Burkholderia detection and identification]. Probl. Osobo Opasn. In 107:66-9.

5. Gaseitsiwe S., Valentini D., Mahdavifar S., Reilly M., Ehrnst A., Maeurer M. Peptide microarray-based identification of Mycobacterium tuberculosis epitope binding to HLA-DRB1*0101, DRB1*1501 and DRB1*0401. Clin. Vaccine Immunol. 2010 '

6. Linnebacher M., Lorenz F., Wollbold J., Latzkow T., Thiesen H

17(1):168-75 enz P., Koy C

Jahnke A., Born N., Steinbeck Glocker M. Clonality character-

ization of natural epitope-specific antibodies against the tumor-related antigen topoisomerase Ila by peptide chip and proteome analysis: a pilot study with colorectal carcinoma patient samples. Analyt. Bioanalyt. Chem. 2012; 403(1):227-38.

7. Ma G.Q., Shao F., Xie X.M., Cui H.F., Wan H.J. Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method for reliable detection

Burkholderia pseudomallei in soil samples. African J. Microbiol. Res. 2014; 8(5):452-7.

8. Westermeier R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. 4th ed. Weinheim: WILEY-VCH Verlag; 2005. 406 p.

Authors:

Korsakova I.I., Khrapova N.P., Zamarina T.V., Pimenova E.V., Goloseev Yu.A. Volgograd Research Anti-Plague Institute. 7, Golubinskaya St., Volgograd, 400131, Russian Federation. E-mail: vari2@sprint-v.com.ru

Korsakova I.I., Khrapova N.P., Makarov N.S. Volgograd State Medical University, Volgograd, Russian Federation.

Об авторах:

Корсакова И.И., Храпова Н.П., Замарина Т.В., Пименова Е.В., Голосеев Ю.А. Волгоградскийнаучно-исследовательский противочумный институт. Российская Федерация, 400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7. E-mail: vari2@sprint-v.com.ru

Корсакова И.И., Храпова Н.П., Макаров Н.С. Волгоградский государственный медицинский университет. Волгоград, российская Федерация.

Поступила 15.04.14.