БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИОФАГОВ PHAGUM SALMONELLA TYPHIMURIUM И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В БОРЬБЕ С САЛЬМОНЕЛЛЕЗОМ ПТИЦ.

И.В Чиркова, Н.В. Пименов

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИОФАГОВ PHAGUM SALMONELLA TYPHIMURIUM И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В БОРЬБЕ С САЛЬМОНЕЛЛЕЗОМ ПТИЦ.

Бактериофаги, биологические специфичные вирусоподобные объекты, были открыты еще в 1915 году английским бактериологом F Twort и в 1917 году канадским ученым Fd'Herlle. Незаслуженно забытые с наступлением эры антибиотиков, в настоящее время они заслуживают внимание. Рассвет антибиотикотерапии привел к проблемам, вызванным появлением лекарственно-устойчивых патогенных и условно-патогенных бактерий, а борьба со многими бактериальными заболеваниями, опасными для человека и животных, сопровождается многочисленными трудностями при применении только химиоте-рапевтических средств.

В связи с этим в настоящее время растет актуальность применения безопасных биологических объектов для лечения заболеваний и повышается интерес к изучению их действия.

Бактериофаги лизируют бактериальные клетки, к которым специфичны, обеспечивая бактерицидный эффект. Механизм действия фагов состоит в проникновении и взаимодействии их с геномом клетки бактерии, что приводит к лизогенному или литическому эффекту. При литичес-ком типе инфекции бактериофаги в бактерии сразу начинают размножаться, быстро разрушая клетку. При лизогенном взаимодействии геном фага внедряется в геном бактерии и передается из поколения в поколение. При этом, время от времени в бактериальных клетках синтезируются вирионы, лизирующие эти клетки и выходящие затем во внешнюю среду [1,2].

Бактериофаги подразделяются на вирулентные и умеренные, в зависимости от характера взаимодействия с микробной клеткой. Вирулентные фаги вызывают литический эффект, а умеренные - лизогенный. При взаимодействии вирулентных фагов с бактерией выделяют несколько стадий — адсорбцию, проникновение, биосинтез нуклеиновой кислоты и белков, сборку и выход из клетки с ее разрушением. Взаимодействие вирулентных фагов завершается лизисом бактериальной клетки и выходом из нее новых фаговых частиц. В результате такого цик-

ла размножения, длящегося 30-40 минут может образоваться до 200 фаговых частиц. Литические формы фагов есть основной элемент биологической борьбы с бактериальной инфекцией. Их поиск и изучение свойств представляют большой интерес [1, 2].

Умеренные бактериофаги, в свою очередь, инфицируют клетку, но не вызывают ее лизиса. ДНК бактериофага, попавшая в клетку, интегрирует с ее генетическим аппаратом (профаг) и передается по наследству от клетки к клетке. Под действием различных факторов может происходить превращение профага в вегетативную форму, сопровождающуюся размножением бактериофага, лизисом клетки и выходом фагов [1, 2].

Целью наших исследований являлся поиск, выделение и изучение биологических свойств, а также селекция высокоактивных вирулентных бактериофагов против Salmonella typhimurium.

S. typhimurium - один из основных се-ровариантов сальмонелл, патогенных для молодняка крупного рогатого скота, свиней, пушных зверей, гусей, уток, фазанов, голубей, других животных и птиц. Кроме того, S. typhimurium является одним из основных возбудителей пищевых токсико-инфекций человека. Для голубеводства S. typhimurium - доминирующий возбудитель сальмонеллеза (более 90%) [3, 4].

За последние годы возросла эпизоотическая роль S. typhimurium в птицеводстве. На долю S. typhimurium среди всех зарегистрированных случаев сальмонеллеза у птиц приходится около 6-18% (по данным за 2004-2007 гг. ФГУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»).

Все чаще выделяются высокоактивные штаммы сальмонелл. Например, LD50 штамма S. typhimurium М 2-ф t , выделенного из трупа голубя в г. Москва в 2003 г., составил 5011 микробных клеток.

При исследованиях, проводившихся с 2005 г. по 2008 г., на первом этапе нами было проведено по методу Адамса [5] фаго-выделение из пометных и сточных вод голубятен Москвы, Тулы, Московской об-

ласти.

Выделены 10 бактериофагов. Из них отобраны и селекционированы три наиболее литически активных бактериофага - Phagum Salmonella typhimurium № 5 ТЗ - ДЕП, Phagum Salmonella typhimurium № 8 МЕ - ДЕП, Phagum Salmonella typhimurium № 9 ММ - ДЕП, депонированные в коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».

Литическая активность, определенная методом Аппельмана [6, 8], составила для Ph. S. typhimurium № 5 ТЗ -ДЕП - 10"10, № 8 МЁ-ДЕП - 10-8, № 9 ММ-ДЕП - 10-10. Лити-ческая активность определенная по методу Грациа [7, 8] составила: Ph. S. typhimurium №5 ТЗ -ДЕП - 3,6 х108 БОЕ/см3 , № 8 МЁ-ДЕП - 1,0 х107 БОЕ/см3, № 9 ММ-ДЕП - 1,4 х108 БОЕ/см30.

Бактериофаги при посеве на штамме-хозяине в течение 18 ч культивирования при 37° С формировали на бактериальном газоне негативные колонии: № 5 ТЗ -ДЕП и № 9 ММ - ДЕП - круглые, прозрачные с ровными краями колонии диаметром 1,5-2,5 мм, № 8 МЁ - ДЕП - крупные, прозрачные колонии диаметром 2,53,5 мм с вторичным ростом индикаторной культуры.

Изучение морфологии фагов проводили при помощи электронно-микроскопических исследований на электронном микроскопе JEoL-100 методом негативного контрастирования с 2%-ным водным раствором уранил-ацетата при инструментальном увеличении в 53018 раз и фотографическом 25-80 раз. В процессе электронного фотографирования были изучены фазы взаимодействия бактерий, запечатленные нами на электронных фотографиях, которые подтверждают характерные свойства литически активных бактериофагов.

По классификации А.С. Тихоненко [9] все три бактериофага по морфологии ви-рионов были относены к четвертой группе. Это фаги с длинным, несокращающим-ся отростком и изометрическими головками размером от 50 до 100 нм, содержащими внутри двутяжевую ДНК, входят в семейство Siphoviridae - общей чертой всех представителей которого является длинный, тонкий, несокращающийся отросток с периодической исчерченностью, напоминающий гофрированную трубку, длиной 1215-5450 А шириной 75-350 А; голо-

вка - в форме многогранника икосаэдри-ческой формы [9].

Изучена биологическая активность выделенных штаммов к различным изо-лятам бактерий. Штаммы обладают широким спектром литического действия по отношению к изолятам Salmonella typhimurium, выделенным в неблагополучных по сальмонеллезу голубятнях, лизи-руют более 80-90% из 32 изолятов сальмонелл. Кроме того, выделенные бактериофаги лизируют S. enteritidis (было испытано действие на 10 штаммах - 80-90%), S. gallinarum-pullorum (на 7 штаммах - 75100%), S. dublin (из 4 штаммах - 85-100%), S. newlends (на 3 штаммах - 20-60%), но не лизируют другие энтеробактерии - Esheri-hia coli, Klebciella pneumoniae, Proteus mirabilis и другие, что подтверждает специфичность их действия.

Большой спектр и высокая степень литической активности бактериофагов по Аппельману 10"7-10"8 (в то время как у сальмонеллезных бактериофагов, используемых в медицинских препаратах, активность 10"4-10"5) позволили нам на базе данных бактериофагов создать лечебно-профилактический препарат Бактериофаг тифимуриум для борьбы с сальмонелле-зом, вызванным S. typhimurium, в первую очередь птиц: голубей, а также лебедей, гусей, уток, фазанов, перепелов.

Бактериофаг тифимуриум обладает лечебным и профилактическим эффектом, санирует организм от сальмонелло-носительства. Биологические свойства компонентов препарата позволяют, избегая антибиотикотерапию, предупреждать осложнения и выдерживать требования к качеству животноводческой продукции. При необходиморсти лечение возможно сочетать с пробиотиками и антибиотиками.

Лабораторное испытание препарата Бактериофаг тифимуриум в остром опыте проводили на 30 цыплятах 14-дневного возраста в сентябре 2007 г. Для этого были созданы три группы: две опытные (по 10 цыплят) и контрольная (10 цыплят), которых кормили и содержали по принципу аналогов.

Заражение цыплят проводили смесью из 2 изолятов S. typhimurium (с вирулентностью для белых мышей при подкожном инъецировании 5011 тыс. микробных клеток) в одинаковом количестве каждого изолята, орально в общей дозе 2 млн. микробных клеток (дозу определяли по опти-

ческому стандарту мутности энтеробакте-рий ВГНКИ).

После появления клинических признаков заболевания: потеря аппетита, одышка, угнетение, взъерошенность оперения, иногда - диарея (6-12 часов) цыплятам первой опытной группы орально вводили бактериофаг тифимуриум из расчета 0,5 мл при помощи автоматической пипетки-дозатора. Обработку проводили трижды с интервалом 12 часов, а затем с интервалом 48 часов еще 2 раза. За три часа до выпойки бактериофага тифимуриум цыплят выдерживали без поения. Цыплятам второй опытной группы использовали стандартный метод лечения с использованием эн-рофлоксацина - энрофлон 10%-ный раствор в дозе 0,5 мл на 1 л воды 5 дней согласно временному наставлению. Цыплят контрольной группы бактериофагом тифимуриум не обрабатывали и инфицировали в таких же дозах смесью культур 8. 1урЫтигшт.

За птицей наблюдали 15 дней, после чего проводили убой. Бактериологическое исследование трупов павших и убитых цыплят проводили по схеме: посевы из паренхиматозных органов, крови сердца и красного костного мозга на МПА, МПБ, агар Эндо, висмут-сульфитный агар, окраска мазков-отпечатков и мазков растущих культур по Граму, реакция агглютинации с О-комплексными и О- и Н-агглю-тинирующими монорецепторными саль-монеллезными сыворотками.

Проведенные исследования показали, что в контрольной группе летальность составила 90%. Все павшие цыплята имели характерные клинические признаки и па-тологоанатомические изменения: одышку, потерю аппетита, диарею, энтерит, ринит и др. При бактериологическом исследовании у цыплят выделили 8. 1урЫтигшт, обладающую характерными свойствами. По результатам опытов, сохранность цыплят в первой опытной группе составила 100%, сроки выздоровления составили 3-5 дней, сальмонеллоносительства на 15 сутки не было установлено, из патологоанатоми-ческого материала 8 1урЫтигшт не выделялась.

Традиционная схема лечения энро-флоксацином, оказалась менее эффективной, по сравнению с нашим способом лечения, так как во второй опытной группе летальность составила 30%, скрытое но-сительство - 20%.

Действие препарата бактериофаг ти-

фимуриум было проверено и в практических испытаниях - на голубятнях в Подольском и Домодедовском районах Московской области. Клиническая картина саль-монеллеза у голубей проявлялась взъеро-шенностью оперения, угнетением, одышкой, потерей координации движения, потерей способности к полету, иногда - «вертячкой», отказом от корма; помет становился жидким серого и зеленого цвета с примесью крови и слизи; у некоторых голубей отмечали ринит. Диагноз был подтвержден бактериологическими исследованиями и методом молекулярной диагностики (ПЦР). Летальность составляла 65% на голубятне в Домодедово (при заболеваемости 80%) и 1,7% на голубятне в Подольском районе при заболеваемости 14,3% (на фоне антибиотикотерапии).

Проведенный курс терапии бактериофагом тифимуриум в дозе 0,5 мл на голубя при групповой выпойке с водой трижды с интервалом 48 часов в течение месяца уже со вторых суток применения остановили развитие заболеваемости, проявление клинических признаков заболевания и случаи гибели птицы. Через 14 суток при бактериологическом исследовании смывов из клоаки больных и других голубей из исследуемых голубятен бактерии рода Salmonella не выделялись. При контрольных исследованиях в ПЦР через 30 дней положительных результатов не было в выборочных 40 пробах крови из оздоровленных голубятен. За период наблюдения - 6 месяцев рецидивов сальмонеллеза не отмечали.

Терапевтическая эффективность препарата была исследована в передвижном частном зоопарке «Ташир», где в ноябре 2005 г наблюдали заболеваемость уток, фазанов и других птиц сальмонел-лезом. Клиническая картина заболевания проявлялась преимущественно у молодых фазанов (из 28 фазанов разных пород типичную клинику заболевания отмечали у 6 (21%)), 2 фазана 3-х месячного возраста пали.

У утят инфекция отмечалась в 25-40-дневном возрасте с гибелью 5 из 8 птиц Все утки и фазаны положительно реагировали в ПЦР на сальмонеллез. При бактериологическом исследовании в 100% случаев из смывов клоаки всех птиц выделена S. typhimurium.

Выпойку Бактериофага тифимуриум против сальмонеллеза проводили групповым способом (1:20 с водой) всей пти-

Таблица.

Свойства резервных бактериофагов

11-фч

13- вг

п-14 1 15-S 16-фз гол 18 бел-19 бир-21 праж-22 тула-23

10-ю

10-ю

10-9

10-10

10-9

10-9

10-9

10-8

10-8

10-10

ке а

х

2

х

V)

(N

X

0

X

0 4

X

0

X <N

X

0

X

2

0 1

X

X

2

х

ы

н

в

и

т

а

г й

е и

н н

я о

и л

г о

о к

л

о

ф

р

о

£

и

S

S s

н я Ä

о

ft оо

О-vt"

в °

И со

ло 2-

о

2 2

0 ^ 5 2

ft S « 2 ои

И м

в °

М со

ло 2-

о

ы В са гл

уг р

ыа ни

в н й «

ри

о g

ра в л

а в Й S

гы рун рв W О

р

ыа ни

в Sä й «

ри

о g

ра В ft

а в Й S

гы рун рв W О

р

ыт не я S оа ри

нв

° £ В S в 3 н0

§

М со

3 и

к S

5 5 рр

£

к

м

с м

и ,0

и н -3,

о ,0-

л 2,

о к р т

е е

ы м

н а

ч и

а д

р з и,

о м

р я

п а

р

,е к

ы и

л г м

у ы

р н

« в о

р

ре о S

н

с и ы

S 3 ра 6

зо

о Н

ри

0 «

1 & у

р

ы В S

в о ^ fto

О t—"

но <Я

5 тр

е

S

а и н

ы н я S О s р0

ta

О Р„

2

ы н ч

а р

з о

& н

О «

а

ыи и

к

£ S

^ п зо о к

ри в §

ы

л

г у

р

ы

л

г у

р

ы н в

ои

в к

, са ера

ык

л

г у

р

ы н ч

а р

з

о р

п

<u

ы

л

г у

р

(N

це зоопарка из расчета: перепелам - по 0,5 мл препарата, фазанам, уткам - по 1 мл, селезням, павлинам - по 3 мл, гусям, лебедям - по 5 мл трижды с интервалом 12 часов, четвертую и пятую выпойки - через 48 часов.

На 3 сутки после начала лечения состояние птицы улучшилось, температура тела нормализовалась, восстановился аппетит, помет оформился, приобрел серо-коричневую окраску. Гибель птицы больше не отмечали. Через 15 суток при бактериологическом анализе смывов из клоаки у всех птиц зоопарка, бактерий рода Salmonella не выделяли.

Проведенные исследования показали биологическую активность фагов в отношении вирулентных сальмонелл in vivo, что доказывает возможность применения их для терапии и борьбы с сальмонелле-зом птиц, вызванным S. typhimurium.

Но, параллельно встает вопрос о возможности длительного использования та-

кого метода лечения. Существует мнение, что к бактериофагам так же, как к антибиотикам, развивается устойчивость бактерий - достаточно одной мутации в рецепторах бактерии, чтобы вирус потерял способность в нее проникнуть [10, 11] Для исследования возможности и быстроты возникновения устойчивости бактерий к препарату бактериофаг тифимуриум нами были проведены исследования взаимодействия фаг-бактерия на примере вирулентного штамма 8 ХурЫтигшт М-5в X и бактериофага, входящего в препарат, в течение 30 месяцев на 15 голубях, которые содержались (с осени 2005 до весны 2008 г) в изолированном помещении.

Опытных голубей заражали выделенным штаммом сальмонелл 8 ХурЫтигшт М-5в X орально в дозе 2 LD50 1290 микробных клеток. Через 12 часов однократно голубям вводили фаг Е 8. ХурЫтигшт № 9 ММ - ДЕП - в дозе 0,5 мл с питьевой водой. Эти же опытные группы голубей че-

рез каждые 10 месяцев были подвергнуты очередному заражению штаммом S. ty-phimurium М-5в t и обработкой бактериофагом № 9 ММ - ДЕП.

Для контроля создана группа птиц (по 2 птицы), не обрабатываемых бактериофагом, но зараженных бактериями.

За время опыта у голубей опытной группы клинических признаков сальмо-неллеза выявлено не было, у голубей контрольной группы отмечали потерю аппетита, угнетение, гибель на 6-12 сутки после заражения. Через 14 дней проводили контроль реакцией ПЦР с кровью и бактериологическое исследование помета. У голубей контрольной группы из помета и из патологического материала выделена S. typhimurium. У птицы опытной группы сальмонеллу не выделяли, в ПЦР все реагировали отрицательно.

Опыт еще продолжается, за период наблюдения возникновения резистентности сальмонеллы к действию фага установлено не было.

Для изучения развития фагоустойчи-вости у сальмонелл каждые 2 месяца проводился опыт in vitro на чашках Петри.

На три чашки Петри были засеяны штаммы сальмонелл: S. typhimurium Д-1 в^ М-2 ф t, M-5 вt. Чашки были разделены на два сектора, в которые вносили по капле фагов: Phagum Salmonella typhimurium № 5 ТЗ- ДЕП, № 8 МЕ - ДЕП, № 9 ММ - ДЕП. Через сутки инкубирования проводили учет реакции по образованию зоны негативного роста, после чего культуры сальмонелл с каждого сектора агара вблизи границы с негативным ростом фа-

га высевали на полужидкий агар и ставили на 2 месяца в холодильник. По истечению двух месяцев проводили аналогичную реакцию - на отдельные чашки с полужидкого агара высевали штаммы сальмонелл, при этом на каждый штамм сальмонелл капали тот же бактериофаг, что и в предыдущий раз. Данный опыт повторяли через каждые 2 месяца в течение 2,5 лет. Активность бактериофагов на изоляты сальмонелл оставалась неизменной - постоянно возникали очаги лизиса примерно одинаковые по размеру. При этом изменений в структуре колоний сальмонелл и биологических свойств бактерий выявлено не было. Из этого можно сделать вывод о том, что в период исследований возникновения фагоустойчивости не наблюдалось.

На длительную перспективу применения препарата нами были продолжены выделение, селекция и изучение биологических свойств бактериофагов к Salmonella typhimurium. Выделили дополнительно 24 бактериофага, из них 10 высокоактивных с активностью от 10-8 до 10-10 и 4 с активностью 10-5 до 10-7, которые могут быть использованы для резерва и перспективного совершенствования препарата. Свойства выделенных высокоактивных бактериофагов представлены в таблице.

Резервные фаги, изученные при помощи электронной микроскопии, обладали длинным, несокращающимся отростком и изометрическими головками размером от 50 до 100 нм, содержащими внутри дву-тяжевую ДНК, были отнесены по классификации А. С. Тихоненко [9] к четвертой классификационной группе.

РЕЗЮМЕ

Проблема возросшей антибиотикоустойчивости сальмонелл и повысившиеся требования к экологической безопасности и качеству продукции птицеводства требуют эффективных и безопасных средств. Выделены и изучены бактериофаги Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ- ДЕП, №8 МЕ - ДЕП, №9 ММ - ДЕП, отвечающие этим требованиям. На основе трех высокоактивных фагов изготовлен препарат бактериофаг тифимуриум. Препарат апробирован с положительным результатом на цыплятах, голубях, на фазанах, утках и другой птице. Селекционированы высокоактивные резервные штаммы фагов к Salmonella typhimurium, изучены их биологические свойства.

Литература

1. Стейниер P., Эдельберг Э. и Ингрэм Дж. Мир микробов, пер. с англ., т. 2, М., 1979. - 165 с.

2. Шлегель Г Общая микробиология, пер. с нем., М., 1987. - 142 с.

3. 1усев В.В. Сальмонеллезная инфекция у голубей/ Гусев Вал. В., Гусев Вик. // «Птицеводство» № 5; 2003. - С.48-53

4. Куриленко А. Н., Пименов Н. В., Ленев С. В. и др. Рекомендации по дианостике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур. М., МГАВМиБ., 2002 г. -35с

5. Adams М.М. Bakteriophages. New-York-London, 1961. - 528 р.

6. Brashear D.A., Ward R. Comparisonof methods for recovering indigenous viruses from raw wasteswater

slugle: Appl. And Environ. Microbiol. - 1982. - Vol. 43, № 6. - Р. 1413-1418

7. Gratia A. Des relation numerigues entre bacterins lysogenes et particules de bacteriophage. Ann. Instit. Pasteur. - 1936. - V 57, № 6. - Р 652-676

8. Ганюшкин В.Л. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. - Ульяновск, 1988. - 84 с.

9. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. - М., 1968. - 89 с.

10. Кузьмин В. А. Сальмонеллез птиц остается проблемой/ Архив вет. наук ., 2003 г. - С.58-69.

11. А.А.Белкина/Научная Сеть. Nature News, "From Russia with gloves" Америке Россия подарила бактериофаг.23.04.2002.