СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ЕЁ ПРИМЕНЕНИЕ
THERAPEUTIC CARBOHYDRATES FOR TREATING RESPIRATORY DISEASES

Область изобретения
Данное изобретение относится к новому способу и группе углеводов формулы (1) и/или (2) и их композициям для лечения кашля и связанных респираторных состояний, в том числе поствирусных/бактериальных инфекций, острых/хронических бронхитов, COPD (хронического обструктивного легочного заболевания) и воспалительных процессов.
Предшествующий уровень техники
У людей дыхательные пути, площадью с футбольное поле, представляют собой наибольшую поверхность соединения тела с внешним миром, требуемую для достаточного воздухообмена; в то же время дыхательные пути поражаются многими физическими, химическими и биологическими веществами, находящимися в воздухе, которые вызывают нарушения, в том числе астму, хроническое обструктивное легочное заболевание, воспалительные процессы легких и дыхательных путей. Также некоторые генетические нарушения, такие как кистозный фиброз, зависят от связи дыхательных путей с внешним миром. Вирусы и бактерии могут проникать в организм и вызывать появление инфекций в дыхательных путях.
Кашель является одним из распространенных заболеваний, которые нуждаются в лечении. Однако существующие в настоящее время способы лечения ограничены только облегчением симптомов, оставляя организм восстанавливаться самостоятельно, и во многих случаях восстановление является медленным.
В Австралии продажа сиропа от кашля составляет более 20 миллионов долларов в год. Установлено, что мировой рынок сиропа от кашля превышает 1 миллиард долларов в год.
Непрекращающийся кашель, иногда с периодом нормального состояния продолжительностью нескольких месяцев или даже лет, приписывается бронхиальной астме, рефлексу неизвестного происхождения или поствирусным/бактериальным инфекциям и курению, заставляющими дыхательные пути становиться гиперчувствительными/гиперреактивными. Таким образом, существует необходимость в эффективном лечении, которое может помочь организму восстановиться после того, как он был поражен многими физическими, химическими и биологическими веществами, находящимися в воздухе, которые могут вызывать нарушения в дыхательной системе.
Рассмотрение документов, актов, материалов, устройств, статей и т.п. включено в данное описание исключительно в целях обеспечения контекста данного изобретения. Не предполагается или не представляется, что некоторые или все из этих предметов, входящих в состав известного уровня техники, были основой или широко распространенными общедоступными сведениями в области, родственной данному изобретению, поскольку они существовали до даты приоритета каждой формулы данной заявки на патент.
Краткое изложение изобретения
Данное изобретение обеспечивает в одном аспекте способ активации восстановления сиалилированных гликоконъюгатов (сиалил-гликоконъюгатов) на поверхности пораженной респираторной клетки субъекта для лечения респираторного состояния у субъекта, в том числе способ введения субъекту по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого соединения, способного ускорять биосинтез сиалилированных гликоконъюгатов.
В одном варианте осуществления данного изобретения способ обеспечивает восстановление жизнеспособности клетки, при котором клетка находится в лучшем состоянии для нормальной биологической функции в ответ на факторы, которые могут поражать респираторную поверхность, что приводит к респираторным заболеваниям, таким как, но без ограничения, кашель, поствирусные или бактериальные инфекции, острый/хронический бронхит, хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD), кистозный фиброз и другие респираторные воспалительные процессы.
В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает применение соединения, выбранного из группы, состоящей из соединений формулы (1) и формулы (2), и их фармацевтически приемлемых солей и производных и их комбинаций. Применение означает для лечения или предупреждения респираторного состояния, как описано здесь.
В других аспектах изобретения обеспечиваются составы и фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое соединение, способное ускорять биосинтез сиалилированных гликоконъюгатов для применения в лечении и предупреждении респираторных состояний.
Еще в другом аспекте изобретения обеспечивается способ скрининга для выявления соединения для лечения респираторного состояния, содержащий:
действие на клетки, имеющие пониженное содержание сиалилированных гликоконъюгатов на поверхности клетки, тестируемого соединения и
измерение восстановления сиалилированных гликоконъюгатов на поверхности клетки после действия тестируемого соединения на клетку.
Измерение восстановления сиалилированных гликоконъюгатов на поверхности клетки может быть определено путем измерения жизнеспособности клетки.
Еще в другом аспекте данного изобретения обеспечивается способ лечения или предупреждения респираторного состояния у субъекта, способ, включающий в себя стадию введения субъекту по меньшей мере одного соединения, идентифицированного методом скрининга.
Краткое описание графического материала
Фиг.1 демонстрирует путь биосинтеза сиалилированных гликоконъюгатов в живой клетке.
Подробное описание изобретения
С точки зрения биологии клетки и молекулярной биологии гиперчувствительность/гиперреактивность пораженных дыхательных путей может быть вызвана их пораженной клеточной поверхностью, которая затем будет чувствительна к активации раздражителями. Например, заявители обнаружили, что клетки дыхательных путей после вирусной или бактериальной инфекции часто теряли концевые сиаловые кислоты сиалилированных гликоконъюгатов на поверхности клеток дыхательных путей. Вследствие этого жизнеспособность "голой" клетки была снижена. Потеря концевых сиаловых кислот затем и запускала воспалительный ответ, приводя к бронхиту и кашлю. Не будучи ограниченными теорией, постулируется, что восстановление сиаловых кислот на клеточной поверхности может восстанавливать дыхательные пути, пораженные инфекцией или другими физическими, химическими, биологическими факторами, в конечном счете для выявления бронхита и остановки кашля.
В данной заявке заявители показали эксперименты на культурах клеток, проведенные на двух линиях клеток дыхательных путей: небольших эпителиальных клетках дыхательных путей (SAEC) и человеческих нормальных эпителиальных бронхиальных/трахеальных клетках (NHBE). Вначале клетки обрабатывали нейраминидазами (NAs) вируса гриппа или бактерии. NAs отщепляют сиаловые кислоты от поверхностных клеточных сиалилированных гликоконъюгатов, в результате чего снижали жизнеспособность "голых (лысых)" клеток. Например, SAEC теряли жизнеспособность более чем на 25% при обработке NA (нейраминидазой) С. perfringens в конечной концентрации 0,01 Ед/мл или NA (нейраминидазой) вируса гриппа NWS/G70C в конечной концентрации 0,17 мкг/лунку. Аналогичные результаты также получали на линии клеток NHBE. После того как клетки обрабатывали NA, клетки промывали для удаления NA, затем инкубировали с соединениями формулы (1) и/или (2) в течение 24 часов. В конечном счете, определяли жизнеспособность клеток. Результаты (примеры 7-36) показали, что группа углеводов формулы (1) и/или (2) могла бы помочь восстановлению жизнеспособности пораженных клеток дыхательных путей путем восстановления сиалилированных гликоконъюгатов на их поверхности.
Таким образом, данное изобретение обеспечивает в одном аспекте изобретения способ активации восстановления сиалилированного гликоконъюгата на поверхности пораженной респираторной клетки субъекта для лечения респираторного состояния у субъекта, способ, включающий в себя стадию введения субъекту по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого соединения, способного ускорять биосинтез сиалилированных гликоконъюгатов.
Данное изобретение обеспечивает в другом аспекте изобретения способ активации жизнеспособности пораженной респираторной клетки субъекта для лечения респираторного состояния у субъекта, способ, включающий в себя стадию введения субъекту по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого соединения, способного ускорять биосинтез сиалилированных гликоконъюгатов.
Активация восстановления сиалилированных гликоконъюгатов на поверхности респираторной клетки также может указывать на возврат клетки к жизнеспособному состоянию, такому, при котором клетка оказывается в лучшем состоянии для нормальной биологической функции в ответ на факторы, которые могут влиять на дыхательную поверхность, что приводит к распираторным состояниям, таким как, но без ограничения, кашель, поствирусные или бактериальные инфекции, острый/хронический бронхит, хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD), кистозный фиброз и другие респираторные воспалительные процессы.
В другом варианте воплощения данного изобретения по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое соединение выбрано из группы, состоящей из углеводов, способных участвовать в виде промежуточных продуктов в биосинтезе сиалилированных гликоконъюгатов, их предшественников и их пролекарств и их фармацевтически приемлемых солей и производных и их комбинаций.
Указанные выше соединения могут быть использованы для приема внутрь, путем ингаляционного или инъекционного введения для лечения респираторных состояний, выбранных из группы, содержащей кашель, поствирусные или бактериальные инфекции, острый/хронический бронхит, хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD), кистозный фиброз и другие респираторные воспалительные процессы.
На всем протяжении описания и формулы данного изобретения слово "содержать" и вариации слова, такие как "содержащий" и "содержит", не предполагают исключения других добавок, компонентов, целых чисел или стадий.
В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает применение соединения, выбранного из группы, состоящей из;
соединений формулы (1):
3
2
2
3
2
2
в  которойпри В=Н А может быть NHCOCH, NH, ОН, NH·HX или при А=Н В может быть NHCOCH, NH, NH·HX, НХ может быть фармацевтически приемлемыми неорганическими или органическими кислотами, такими как соляная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, уксусная кислота, лимонная кислота и т.д.;
1
2
3
4
5
6
7
3
2
n
3
2
R, R, R, R могут быть одинаковыми или различными. Они могут быть Н, СН, (СН)СН (n=1~20), CHPh, COCRRR, СО-активными сложными эфирами, такими как пивалоксиметиловый сложный эфир (pivaloyloxymethyl ester) (piva ester), индениловый сложный эфир;
5
6
7
3
2
n
3
6
5
2
3
2
2
2
m
3
R, R, R могут быть одинаковыми или различными. Они могут быть Н, СН, (СН)СН (n=1~20), СН, CHPh, CHCH(OCHCH)CH (m=1~200); и
R4 может быть
;
5′
6′
5′
6′
3
2
n
3
3
2
2
2
m
3
R, R могут быть одинаковыми или различными. Они могут быть Н или фармацевтически приемлемой неорганической или органической солью, такой как, Na, К, Са, Mg, Zn, NH, триэтиламин и т.д., или R, R могут быть фармацевтически приемлемым сложным эфиром, таким как (СН)СН (n=1~20) или СНСН(ОСНСН)СН (m=1~200), или активным сложным эфиром, таким как пивалоксиметиловый сложный эфир, индениловый сложный эфир;
и соединений формулы (2)
в которой
8
14
15
16
14
15
16
3
2
n
3
2
2
,
3
2
n
3
6
5
2
2
2
2
2
m
3
R может быть Н, СН, (СН)СН (n=1~20), CHPh, COCHPh, СО-активным сложным эфиром, таким как пивалоксиметил сложный эфир (piva ester), индениловый сложный эфир, COCRRR  где R, R, R могут быть одинаковыми или различными. Они могут быть Н, СН, (CH)CH (n=1~20), СН, CHPh, CHCH(OCHCH)CH (m=1~200);
8
R может быть цитидином, цитидинмонофосфатом, цитидиндифосфатом, цитидинтрифосфатом, аденозином, аденозинмонофосфатом, аденозиндифосфатом, аденозинтрифосфатом;
9
17
18
19
17
18
19
3
3
2
3
2
n
3
2
2
2
2
m
3
6
5
2
R может быть Н, СН, фармацевтически приемлемой неорганической или органической солью, такой как Na, К, Са, Mg, Zn, NH, триэтиламин и т.д., или фармацевтически приемлемым активным сложным эфиром, таким как пивалоксиметиловый сложный эфир, индениловый сложный эфир и т.д., или CHCRRR, в котором R, R, R могут быть одинаковыми или различными. Они могут быть Н, СН, (СН)СН (n=1~20), CHCH(OCHCH)CH (m=1~200), СН, CHPh;
10
11
12
13
20
21
22
20
21
22
3
2
n
3
2
3
2
n
3
6
5
2
2
2
2
2
m
3
R, R, R, R могут быть одинаковыми или различными. Они могут быть Н, СН, (СН)СН (n=1~20), СНPh, активным сложным эфиром, таким как пивалоксиметиловый сложный эфир, или COCRRR, в  котором R, R ,R могут быть одинаковыми или различными. Они могут быть Н, СН, (CH)CH (n=~20), СН, CHPh, CHCH(OCHCH)CH (m=1~200);
13
R может быть
23
24
25
26
27
25
26
27
3
2
3
2
2
2
2
m
3
2
2
3
3
2
n
3
6
5
2
R, R могут быть одинаковыми или различными. Они могут быть Н, СН, (СН)nСН (n=1~20), СНСН(ОСНСН)СН (m=1~200), CHPh или активным сложным эфиром, таким как пивалоксиметиловый сложный эфир, индениловый сложный эфир или CHCRRR, или фармацевтически приемлемой неорганической или органической солью, такой как Na, К, Са, Mg, Zn, NH, триэтиламин и т.д., и R, R, R могут быть одинаковыми или различными. Они могут быть Н, СН, (CH)CH (n=1~20), СН, CHPh.
3
1
2
3
4
В одном варианте воплощения в формуле (1) при A=NHCOCH, В=Н, R, R, R, R=H соединение представляет собой N-ацетил-D-маннозамин. N-ацетил-D-маннозамин будут называть соединением (1) на всем протяжении данного описания изобретения.
8
10
11
12
13
9
В другом варианте воплощения в формуле (2) при R, R, R, R, R=H, R=Na соединение представляет собой натриевую соль N-ацетилнейраминовой кислоты (Натриевая соль сиаловой кислоты). Натриевую соль N-ацетилнейраминовой кислоты будут называть соединением (2) на всем протяжении данного описания изобретения.
8
9
10
11
12
13
В том случае, когда R представляет собой цитидинмонофосфат и R, R, R, R, R=H, соединение представляет собой ЦМФ-сиаловую кислоту.
[1]
[2][3]
[4]
[5]
Сиаловые кислоты в виде терминальных (концевых) сахаров на олигосахаридных цепях гликоконъюгата на поверхности клетки хорошо изучены в виде молекулярных детерминант специфических биологических процессов, таких как клеточная адгезия, образование или маскировка распознающих детерминант и стабилизация структуры гликопротеинов. Путь биосинтеза сиалилированных гликоконъюгатов в живой клетке показан ниже на фиг.1.
[6]
[7]
[8]
[8b][8с]
2
Сообщалось, что N-ацетилнейраминовая кислота, но не лактоза, в зависимости от дозы защищала от нарушения мукоциллиарного транспорта . Кроме того, предварительная обработка повторными введениями (ингаляциями) N-ацетилнейраминовой кислоты заметно предотвращала воспалительные изменения, вызванные продолжительным воздействием SO у кроликов. Также сообщалось, что пероральное введение N-ацетил-D-маннозамина млекопитающему быстро метаболизировалось в глюкозу . Также сообщалось, что способы введения N-ацетилманнозамина или его производного (для получения сиаловой кислоты у пациентов, которые испытывают дефицит молекулы сахара) для лечения мышечной атрофии, в том числе наследственной миопатии с включением телец (HIMB) и дистальной миопатии Нонака с вакуолями с ободком (rimmed vacuoles) (миопатия Нонака). Также некоторые состояния почек, например, состояния, возникающие из-за недостаточного сиалирования почечных мембран, могут быть подвергнуты лечению данным способом.
Однако ни один из этих способов лечения, связанных с использованием данных промежуточных продуктов, не применялось для лечения респираторных состояний.
Соединения формулы (1) и/или (2) были проанализированы заявителями на безопасность. Например, соединения (1) и (2) использовали в анализе на толерантность и подострую токсичность мышей Balb-C (код подтверждения в АЕС (Комиссии по атомной энергии): ВАМ / В / 2005 / 16). Результаты анализа толерантности показали, что оба соединения при 5 г/кг для пероральной дозы или 2 г/кг для внутрибрюшинной дозы были хорошо переносимы. В анализе подострой токсичности результаты показали, что оба соединения при 1 г/кг/день х 30 дней для пероральной дозы или 0,5 г/кг/день х 30 дней для интраперитонеальной дозы были нетоксичны.
Также заявителями признана модель кашля у морских свинок. На этой модели анализировали соединения (1) и (2). При пероральной дозе 500 мг/кг/день х 3 дня оба соединения могли восстанавливать поражения дыхательных путей, вызываемые нейраминидазой у морских свинок. Эти результаты in vivo находятся в соответствии с данными in vitro. Таким образом, данные как эффективности, так и безопасности подтверждают, что соединения формулы (1) и/или (2) и, в частности, соединения (1) и (2) могут быть применимы для медицинских применений.
Заявителями было обнаружено, что соединения формулы (1) и/или (2) могут ускорять восстановление жизнеспособности пораженных клеток дыхательных путей путем восстановления сиалилированных гликоконъюгатов на поверхности клеток.
Соединения формулы (1) и/или (2) усиливают продуцирование сиалилированных гликоконъюгатов после проникновения в клетку. Таким образом, один аспект данного изобретения относится к применению соединений формулы (1) и/или (2) и их фармацевтически приемлемых солей и производных и их комбинаций или их смесей в виде активных терапевтических агентов для лечения кашля и родственных респираторных состояний, в том числе поствирусных/бактериальных инфекций, острого/хронического бронхита, хронического обструктивного легочного заболевания (COPD), кистозного фиброза и воспалительных процессов.
Фармацевтически приемлемые композиции соединений формулы (1) и/или (2) и их смеси также могут быть образованы комбинированием их с одним или несколькими другими активными ингредиентами для лечения респираторных состояний. Например, такими как: холин теофиллинат (бронходилататор), теофиллин (бронходилататор), сальбутамол и тербуталина сульфат (купирование бронхоспазма, связанного с астмой и другими респираторными состояниями), бромгексин (отхаркивающее, муколитическое), кодеин, фолкодеин (анальгезирующее, противокашлевое (средство)), клофеданол (противокашлевое), пентоксиверин (противокашлевое), диметоксанат, глауцин (противокашлевое), промдат, талоксимин, ацетилпиперацетамид (acetyl piperacetamide), эвкалиптовое масло, хлорид аммония и лекарственные травы, такие как Fritillariae cirrhosa (Рябчик усатый) (противокашлевое растение). Такими как ингибиторы синтеза муцина, такими как талнифлюмат, 2-аминофенилуксусные кислоты или комбинирование с некоторыми глюкокортикоидами, такими как флунизолид (противоастматический), или комбинирование с фармацевтически совместимыми сиропами от кашля, ослабляющими симптом, или комбинирование с ингибитором фосфодиэстеразы-4, таким как циломиласт (Ariflo) для лечения хронического обструктивного легочного заболевания (COPD).
Кроме того, фармацевтически приемлемые композиции соединений формулы (1) и/или (2) и их фармацевтически приемлемые соли и производные и их комбинации и их смеси также могут быть образованы путем их комбинирования с одним или несколькими другими активными ингредиентами, например, противовирусными средствами, такими как занамивир и/или осельтамивир (агенты против вируса гриппа), плеконарил и/или энвироксим (противориновирусные агенты), антимикробными агентами, такими как антибиотики, например, эритромицин, тетрациклин, рифамицин, пенициллин, цефалоспорин; хинолоны, фторхинолоны; сульфаниламиды и триметоприм; противогрибковыми препаратами, такими как амфотерицин, клотримазол, эконазол, флюконазол, флуцитозин и т.д..
Ссылки на соединения формулы (1) и/или (2) здесь включают в себя соединения формулы (1) и/или (2) и их фармацевтически приемлемые производные и их соли.
В дополнительном или альтернативном варианте осуществления данного изобретения обеспечивается способ лечения или предупреждения респираторных состояний, в том числе поствирусных/бактериальных инфекций, острого/хронического бронхита, COPD, кистозного фиброза и воспалительных процессов у животных, в том числе людей, содержащий введение эффективного количества соединений формулы (1) и/или (2).
В дополнительном или альтернативном аспекте обеспечивается также применение соединений формулы (1) и/или (2) в производстве лекарственного средства для лечения респираторных состояний, в том числе поствирусных/бактериальных инфекций, острого/хронического бронхита, COPD, кистозного фиброза и воспалительных процессов у животных, в том числе людей.
Количество соединений формулы (1) и/или (2), необходимое для применения в лечении, будет изменяться вместе со способом введения, природой состояния, подлежащего лечению, и возрастом и состоянием животного (в том числе людей) и, в конечном счете, будет на усмотрении обслуживающего ветеринара или врача.
В целом, подходящая доза будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мг до 500 мг/кг массы тела в день, предпочтительно в диапазоне от 0,1 мг до 50 мг/кг/день.
В целом, дозировка для перорального введения будет составлять от 1 мг/кг/день до 500 мг/кг/день, доза для инъекции будет от 1 мг/кг/день до 100 мг/кг/день. Доза для ингаляции будет составлять от 0,01 мг/кг/день до 5 мг/кг/день. Предпочтительно доза будет от 5 мг до 50 мг/кг для перорального или инъекционного введения, от двух до трех раз в день в течение от 5 до 10 дней; доза будет от 0,1 до 0,5 мг/кг для ингаляции, от одного до пяти раз в день в течение периода от 5 до 10 дней.
Лечение предпочтительно начинают после или во время появления кашля или родственных состояний и продолжают до прекращения кашля или родственных заболеваний. Подходящее лечение предоставляют от 1 до 4 раз ежедневно и продолжают в течение от 3 до 30 дней.
Желаемая доза может быть представлена в виде разовой дозы или разделенных доз, вводимых через определенные промежутки времени, например, в виде двух, трех, четырех или нескольких суб-доз в день.
Соединения формулы (1) и/или (2) удобно вводить в виде дозированной лекарственной формы, например, содержащей от 0,1 до 500 мг активного ингредиента на дозированную лекарственную форму. В применении здесь термин "дозированная лекарственная форма" включает в себя не только индивидуально упакованные дозированные лекарственные формы, такие как флаконы, но также аликвоты, распределенные из флаконов в шприцы, и композиции для инфузии, содержащиеся в контейнерах для инфузионных растворов.
Хотя вполне возможно, что для использования в терапии соединения формулы (1) и/или (2) могут быть введены в виде химического соединения как такового, но предпочтительно представить активный ингредиент в виде фармацевтической композиции.
Таким образом, данное изобретение дополнительно обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую соединения формулы (1) и/или (2) или их фармацевтически приемлемое производное вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и необязательно другими терапевтическими и/или профилактическими ингредиентами. Причем носитель (носители) должен быть ′приемлемым′(и) в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции и не вредным для их реципиента.
Фармацевтические композиции включают в себя композиции, подходящие для перорального, ректального, назального или парентерального (в том числе внутримышечного, интрадермального, подкожного и внутривенного) введения или в форме, подходящей для введения в желудочно-кишечный тракт, или в форме, подходящей для введения в дыхательные пути (в том числе носовые проходы), например, ингаляцией или инсуффляцией, или для интрадермальной или подкожной имплантации, или для трансдермального пластыря. Композиции, в случае необходимости, могут быть удобно представлены в дискретных дозирующих устройствах и могут быть получены любым из способов, хорошо известных в области фармацевтики. Все способы включают в себя стадию ассоциации активного соединения с жидкостными носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями или обоими и затем, в случае необходимости, формование продукта в желаемую композицию.
Фармацевтические композиции, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки или таблетки, каждая содержащая предопределенное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора, суспензии или в виде эмульсии. Активный ингредиент также может быть представлен в виде болюса, электуария или пасты. Таблетки и капсулы для перорального введения могут содержать традиционные наполнители, такие как связующие вещества, заполнители, смазки, разрыхлители или смачивающие агенты. Таблетки могут быть покрыты в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Жидкие средства для перорального применения могут быть, например, в форме водных масляных суспензий, растворов, эмульсий, сиропов или эликсиров или могут быть представлены в виде сухого продукта для разбавления водой или другим подходящим носителем перед применением. Такие жидкие препараты могут содержать традиционные добавки, такие как суспендирующие вещества, эмульгирующие агенты, неводную основу (которая может включать в себя пищевое масло) или консерванты.
Соединения формулы (1) и/или (2) также могут быть приготовлены для парентерального введения (например, инъекцией, например, болюсной инъекцией или непрерывной инфузией) и могут быть представлены в дозированной лекарственной форме в ампулах, предварительно заполненных шприцев, инфузии небольшого объема или в многодозовых контейнерах с добавленным консервантом. Композиции могут принимать такие формы в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях и могут содержать агенты для приготовления композиции, такие как суспендирующие агенты, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, активный ингредиент может быть в порошкообразной форме, полученной путем асептического выделения стерильного сухого вещества или лиофилизацией из раствора для формирования с подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой перед применением.
Для ректального введения предпочтительными являются суппозитории с разовой дозой, у которых носителем является твердое вещество. Подходящий носитель включает в себя масло какао и другие вещества, традиционно используемые в данной области техники, и данные суппозитории могут быть традиционно образованы путем смешивания активного соединения с размягченным или расплавленным носителем (носителями) с последующим охлаждением и формованием в формах.
Для введения в дыхательные пути (в том числе для интраназального введения) соединения формулы (1) и/или (2) могут быть введены любыми из способов и (в форме) композиций, применяемых в данной области для введения в дыхательные пути.
Таким образом, в целом соединения формулы (1) и/или (2) могут быть введены в форме раствора или суспензии или в виде сухого порошка.
Растворы и суспензии предпочтительно будут водными, например, приготовленными из воды в чистом виде (например, стерильной или апирогенной воды), или воды и физиологически приемлемого сорастворителя (например, этанола, пропиленгликоля, полиэтиленгликолей, таких как ПЭГ 400).

Такие растворы или суспензии могут дополнительно содержать другие вспомогательные вещества, например, консерванты (такие как бензалкония хлорид), солюбилизаторы/поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (например, Tween 80, Span 80, бензалкония хлорид), буферы, агенты, регулирующие изотоничность (например, хлорид натрия), усилители абсорбции и усилители вязкости. Суспензии могут дополнительно содержать суспендирующие агенты (например, микрокристаллическую целлюлозу, натрий-карбоксиметилцеллюлозу).
Растворы или суспензии применяются непосредственно в носовой полости традиционными способами, например, с помощью капельницы, пипетки или распылителя. Композиции могут быть обеспечены в виде одноразовой или многоразовой формы. В последнем случае желательно обеспечение дозиметрическим средством. В случае капельницы или пипетки дозирование может быть осуществлено пациентом, вводящим подходящий, предварительно определенный, объем раствора или суспензии. В случае распыляемого раствора дозирование может быть достигнуто, например, посредством измерения распыления насосом для опрыскивания.
Аэрозольная композиция также может быть использована для введения в дыхательные пути, в которой соединения формулы (1) и/или (2) обеспечивают в аэрозольном баллоне с подходящим пропеллентом, таким как хлорофторуглерод (CFC), например, дихлордифторметан, трихлорфторметан или дихлортетрафторэтан, углекислый газ или другой подходящий газ. Также аэрозоль может удобно содержать поверхностно-активное вещество, такое как лецитин. Доза лекарственного средства может быть контролируема обеспечением дозирующего клапана.
Альтернативно соединения формулы (1) и/или (2) могут быть обеспечены в форме сухого порошка, например, смеси порошка соединения в подходящей основе для порошка, такой как лактоза, крахмал, производные крахмала, такие как гидроксипропилметил целлюлоза и поливинилпирролидин (PVP). Удобно, что порошковый носитель будет образовывать гель в носовой полости. Композиция в форме порошка может быть представлена в виде дозированной лекарственной формы; представленной в дозированной лекарственной форме, например, в капсулах или патронах, например, желатина или блистерной упаковке, из которых порошок может быть введен с помощью ингалятора.
В композициях, предназначенных для введения в дыхательные пути, в том числе интраназальных композициях, соединение обычно будет иметь частицы небольшого размера, например, порядка 5 микрон или меньше. Такой размер частиц может быть получен способами, известными в данной области, например, при помощи очень тонкого измельчения.
При желании могут быть использованы композиции, адаптированные для обеспечения замедленного высвобождения активного ингредиента.
Соединения формулы (1) и/или (2) также могут быть использованы в сочетании с другими терапевтическими агентами, например, антибактериальными средствами, такими как антибиотики, противовирусные средства и агенты для лечения респираторных состояний. Таким образом, изобретение обеспечивает в дополнительном аспекте комбинацию, содержащую соединения формулы (1) и/или (2) или их фармацевтически приемлемого производного, вместе с другим терапевтически активным агентом.
Указанные выше комбинации могут быть удобно представлены для применения в форме фармацевтической композиции, и, таким образом, такие композиции, содержащие комбинацию, как определено выше, вместе с фармацевтически приемлемым носителем, следовательно, составляют дополнительный аспект изобретения.
Отдельные компоненты таких комбинаций могут быть введены или последовательно, или одновременно в отдельных или комбинированных фармацевтических композициях.
При применении соединений формулы (1) и/или (2) вместе со вторым эффективным в лечении терапевтическим агентом, доза каждого соединения может быть или такой же, или отличаться от дозы, при которой каждое соединение используется отдельно. Подходящие дозы будут легко определены специалистами в данной области.
Соединения формулы (1) и/или (2) и их фармацевтически приемлемые производные могут быть приготовлены любыми способами, известными специалистам в данной области получения соединений аналогичной структуры.
В другом аспекте изобретения обеспечивается способ скрининга для выявления соединения для лечения респираторного заболевания, содержащий следующее клетки, имеющие пониженное количество сиалил-гликоконъюгатов на поверхности клетки, подвергают действию тестируемого соединения; и
проводят измерение восстановления жизнеспособности клетки после воздействия тестируемого соединения на клетку.
На основе данного изобретения другие соединения могут быть использованы для стимуляции восстановления сиалилированных гликоконъюгатов на поверхности респираторной клетки; или для активизации восстановления жизнеспособности клетки за счет способности клетки ускорять биосинтез сиалилированных гликоконъюгатов. Следовательно, восстановление клеток  лучшего состояния для нормальной биологической функции в ответ на факторы, которые могут влиять на дыхательную поверхность, что приводит к респираторным состояниям, может быть достигнуто обеспечением сиалилированных гликоконъюгатов, которые восстанавливаются на поверхности клетки.
Способ включает в себя получение клетки, предпочтительно респираторной клетки, которая имеет пониженные сиалилированные гликоконъюгаты на поверхности. Данная клетка называется "голой клеткой", которая является восприимчивой к факторам, которые могут влиять на ее способность нормально функционировать.
Данная клетка может быть получена путем подвергания нормальной клетки, такой как респираторная клетка, действию нейраминидазы для удаления сиаловой кислоты из сиалилированных гликоконъюгатов на поверхности клетки. Затем эту клетку измеряют по способности тестируемого соединения восстанавливать сиалилированные гликоконъюгаты на поверхности. Тестируемое соединение может восстанавливать сиалилированные гликоконъюгаты путем ускорения биосинтеза сиалилированных гликоконъюгатов или другими способами, которые приводят к восстановлению сиалилированных гликоконъюгатов на поверхности клетки.
3
Способность восстанавливать сиалилированные гликоконъюгаты на поверхности клеток может быть измерена путем восстановления жизнеспособности клетки. Жизнеспособность клетки может быть измерена любыми способами, доступными квалифицированному специалисту в данной области. Однако жизнеспособность может быть определена способностью клетки к клеточной пролиферации. Клеточная пролиферация может быть измерена путем применения стандартных наборов для клеточной пролиферации, таких как, но не ограничиваются ими, набор для определения клеточной пролиферации методом ELISA (Cell Proliferation ELISA kit) для измерения бромдезоксиуридина (BrdU), включенного во вновь синтезированную ДНК реплицирующихся клеток, или путем применения анализов клеточной пролиферации на основе [Н]-тимидина.
Способность также может быть измерена определением числа сиалилированных гликоконъюгатов, восстановленных на клетке в результате воздействия на клетку тестируемого соединения. Она может быть измерена способами, доступными специалистам, которым адресовано данное изобретение, такими как, но не ограничиваясь ими, применение антител к сиалилированным гликоконъюгатам.
Еще в другом варианте осуществления данного изобретения обеспечивается способ лечения или предупреждения респираторного состояния у субъекта, способ, включающий в себя стадию введения субъекту, по меньшей мере одного соединения, идентифицированного методом скрининга.
В заключение, поскольку данное изобретение, как описано выше, является восприимчивым к изменениям, модификациям и/или дополнениям, кроме тех, которые конкретно описаны, и понятно, что изобретение включает в себя все такие изменения, модификации и/или дополнения, которые могут быть сделаны, должно быть понятно, что различные другие модификации и/или дополнения подпадают в описание, как описано выше. Следующие примеры существуют только в качестве иллюстрации и не должны быть истолкованы в виде ограничения данного изобретения.
Примеры
Основные методы, используемые в примерах:
- ЯМР (ядерный магнитный резонанс) регистрировали на спектрометре Bruker Avance 300, Xwin-NMR (пер., компьютерная программа для накопления и обработки спектров), версия 3,5 на DPX 300А.
- MS (масс-спектр) регистрировали на масс-спектрометре Waters Micromass модели ZMD, с использованием ESI (ионизации распылением в электрическом поле). Систему эксплуатировали с использованием программного обеспечения Water Mass Lynx NT.
245
- Колоночную флэш-хроматографию проводили на колонках с силикагелем 60 F (Е. Merck).
- Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинах, предварительно покрытых силикагелем (Е. Merck).
- ВЭЖХ (высокоэффективную жидкостную хроматографию) проводили на модуле для разделения Waters alliance 2690, детектировали с использованием двухволнового ультрафиолетового (УФ) детектора Waters 2487, программное обеспечение Waters Millenium 32.
- Культура клеток и анализ жизнеспособности клеток:
Способ 1
Используемые клетки: Небольшие эпителиальные клетки дыхательных путей (SAEC)
Среда: Набор SAGM Bullet kit (SABM + ростовая добавка)
И/или
Используемые клетки: Нормальные человеческие клетки бронхиального эпителия (NHBE)
Среда: Набор BEGM Bullet kit (ВЕВМ + ростовая добавка)
Подробное описание экспериментов
6
2
Криозамороженные клетки (1×10 клеток в 1 мл) размораживали и культивировали в 175 см чашках Петри на полной среде. Среду удаляли на следующий день и меняли на свежую среду. Клетки культивировали приблизительно в течение 5-6 дней для получения 70-80% конфлюентности. Во время фазы роста среду меняли через день.
4
При достижении подходящей конфлюентности среду удаляли. Монослой клеток промывали 1×PBS (пер., фосфатно-солевым буферным раствором). После удаления PBS добавляли 2 мл (смеси) трипсин + ЭДТА. Клетки осторожно покачивали при комнатной температуре в течение 2 минут. Клетки собирали вместе с 1×PBS, центрифугировали при 200d в течение 10 минут. Осадок ресуспендировали до 5×10 /мл. В 96-луночном планшете клетки делили на аликвоты по 100 мкл/лунку (приблизительно 5000 клеток/лунку). Клетки инкубировали при 37°С в течение 24 часов.
В каждую лунку добавляли по 10 мкл бактериальной нейраминидазы (из Clostridium perfringens) до конечной концентрации 0,01 Ед/мл для SAEC и 0,008 Ед/мл для NHBE. Затем клетки инкубировали в течение 6 часов при 37°С.
Центрифугирование планшета выполняли при 1000 об/мин в течение 10 минут, среду отсасывали и добавляли 200 мкл свежей среды. Планшет центрифугировали снова, среду заменяли 100 микролитрами свежей среды.
Соединения для анализа готовили в 6-кратной желаемой концентрации; 20 мкл соединения добавляли в каждую лунку в трехкратной повторности. Затем клетки инкубировали при 37°С в течение 24 часов.
Клетки метили в течение ночи (приблизительно 16 часов) при 37°С с использованием 10 микролитров бромдезоксиуридиновой (BrdU) метки (набор для анализа пролиферации клеток методом ИФА, Cell Proliferation ELISA kit-Roche).
Среду для мечения удаляли и клетки фиксировали и денатурировали в течение 30 минут при комнатной температуре в фиксирующем растворе, поставляемом производителем.
После удаления фиксирующего раствора в каждую лунку добавляли по 100 мкл анти-BrdU-POD (пер., конъюгированного с пероксидазой антитела анти-BrdU) (в подходящей концентрации, предлагаемой производителем). Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 90 минут.
2
4
Конъюгат антител удаляли и лунки промывали три раза 200 микролитрами промывочного раствора (поставляемого). После удаления промывочного раствора добавляли 100 мкл раствора субстрата (поставляемого) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Взаимодействие останавливали добавлением 50 мкл 1М HSO. Поглощение проб измеряли при 450 нм (ссылочная длина волны 690 нм).
Мелкие эпителиальные клетки дыхательных путей (SAEC), обработанные 0,01 ЕД/мл нейраминидазы (NA) из Clostridium perfringens.
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=20)
Контроль (нормальная клетка)
100%
Контроль, обработанный NA
72,82% ± 7,26
Клетки нормального человеческого бронхиального эпителия (NHBE), обработанные 0,008 ЕД/мл нейраминидазы (NA) из Clostridium perfringens.
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=20)
Контроль (нормальная клетка)
100%
Контроль, обработанный NA
73,30%±7,12
Анализ жизнеспособности клеток дал операционное отклонение ± 10%. Таким образом, только результаты, которые показали жизнеспособность клеток ≥ 120% относительно жизнеспособности клеток контроля (обработанного нейраминидазой), считают как значимые. Отмечается, что соединения с положительными результатами могут восстанавливать жизнеспособность клеток в течение 48 часов. Среди соединений формулы (1) и/или (2) наиболее активными соединениями с низкой цитотоксичностью были N-ацетилманнозамин (соединение 1) и N-ацетилнейраминовая кислота (соединение 2).
Способ 2
Используемые клетки: Небольшие эпителиальные клетки дыхательных путей (SAEC)
Среда: Набор SAGM Bullet kit (SABM + ростовая добавка)
И/или
Используемые клетки: Нормальные человеческие клетки
бронхиального эпителия (NHBE)
Среда: Набор BEGM Bullet kit (ВЕВМ + ростовая добавка)
Подробное описание экспериментов
6
2
Криозамороженные клетки (1×10 клеток в 1 мл) размораживали и культивировали в 175 см чашках Петри на полной среде. Среду удаляли на следующий день и меняли на свежую среду. Клетки культивировали приблизительно в течение 5-6 дней для получения 70-80% конфлюентности. Во время фазы роста среду меняли через день.
4
При достижении подходящей конфлюентности среду удаляли. Монослой клеток промывали 1×PBS (пер., фосфатно-солевым буферным раствором). После удаления PBS добавляли 2 мл (смеси) трипсин + ЭДТА. Клетки осторожно покачивали при комнатной температуре в течение 2 минут. Клетки собирали вместе с 1×PBS, центрифугировали при 200d в течение 10 минут. Осадок ресуспендировали до 5×10/мл. В 96-луночном планшете клетки делили на аликвоты по 100 мкл/лунку (приблизительно 5000 клеток/лунку). Клетки инкубировали при 37°С в течение 24 часов.
В каждую лунку добавляли по 10 мкл вирусной нейраминидазы (вируса гриппа NWS/G70C) до конечной концентрации 0,017 мкг/мл. Затем клетки инкубировали в течение 6 часов при 37°С.
Центрифугирование планшета выполняли при 1000 об/мин в течение 10 минут, среду отсасывали и добавляли 200 мкл свежей среды. Планшет центрифугировали снова, среду заменяли 100 микролитрами свежей среды.
Соединения для анализа готовили в 6-кратной желаемой концентрации; 20 мкл соединения добавляли в каждую лунку в трехкратной повторности. Затем клетки инкубировали при 37°С в течение 24 часов.
Клетки метили в течение ночи (приблизительно 16 часов) при 37°С с использованием 10 микролитров бромдезоксиуридиновой (BrdU) метки (набор для анализа пролиферации клеток методом ИФА, Cell Proliferation ELISA kit-Roche).
Среду для мечения удаляли и клетки фиксировали и денатурировали в течение 30 минут при комнатной температуре в фиксирующем растворе, поставляемом производителем.
После удаления фиксирующего раствора в каждую лунку добавляли по 100 мкл анти-BrdU-POD (пер., конъюгированного с пероксидазой антитела анти-BrdU) (в подходящей концентрации, предлагаемой производителем). Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 90 минут.
2
4
Конъюгат антител удаляли и лунки промывали три раза 200 микролитрами промывочного раствора (поставляемого). После удаления промывочного раствора добавляли 100 мкл раствора субстрата (поставляемого) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут.Взаимодействие останавливали добавлением 50 мкл 1М HSO. Поглощение проб измеряли при 450 нм (ссылочная длина волны 690 нм).
Пример 1. Получение N-ацетил-D-маннозамина (1)
1
2
3
4
1
2
4
[Соединение (1), формула (1), В=Н, A=NHCOCH3, R=R=R=R=H] 1 г М-ацетил-D-глюкозамина, полученного гидролизом хитина, растворяли в 3 мл воды, затем доводили до рН>11 с использованием 30% раствора NaOH. Смеси давали выстояться при 20°С~40°С в течение 48 часов. Полученный в результате раствор нейтрализовали до рН 6,5~7,0 с помощью 5N HSO, затем упаривали досуха при пониженном давлении. Твердое вещество кипятили с обратным холодильником в этаноле в течение 10 минут, охлаждали до комнатной температуры и фильтровали. Фильтрат упаривали досуха в вакууме до получения белого твердого вещества, которое содержит 85% N-ацетил-О-маннозамина и 15% H-ацетил-D-глюкозамина, как определено путем 1Н-ЯМР. Твердое вещество дробно перекристаллизовывали из смеси этанол/изопропанол/этилацетат (ЕА) до получения указанного соединения в виде белого твердого вещества (125 мг, 62,5% на основе 20% скорости конверсии N-ацетил-D-маннозамина). Непрореагировавший N-ацетил-D-глюкозамин (0,8 г) может быть повторно использован для следующей серии взаимодействия.
1
2
Н-ЯМР(DO) δ (ppm)
5,15 (d, 0,7Н), 3,85-3,32 (m, 6,3H), 1,99 (s, 3Н).
MS 222 (M+1)
Пример 2. Получение натриевой соли N-ацетилнейраминовой кислоты (2)
8
10
11
12
13
9
[Соединение (2), формула (2), R=R=R=R=R=H, R=Na]
-
К раствору N-ацетилманнозамина рН 7,0~7,5 (2,7 г, 12,2 ммоль) и пирувата натрия (2,7 г, 24,5 ммоль) в воде (15 мл) добавляли диализный мешок (с пределом отсечения по молекулярной массе (MW) 20000), содержащий N-ацетилнейраминат-лиазу [ЕС 4.1.3.3] (25 единиц) в реакционной смеси N-ацетилманнозамина (0,54 г) и пирувата натрия (0,54 г) в воде (3 мл) при рН 7,0-7,5. Реакционную смесь встряхивали при 60 об/мин при 30°С в течение 5 дней. Мешок с ферментом удаляли и повторно использовали при новой партии взаимодействия. Реакционную смесь разбавляли водой (15 мл), затем пропускали через колонку с амберлитом Amberlite IRA-400 (НСОО - форма) (150 мл). Затем смолу промывали водой (300 мл), элюировали раствором 0,5 М НСООН. Элюат собирали и упаривали досуха в вакууме. Осадок растворяли в воде (2 мл), затем разбавляли ледяной уксусной кислотой (10 мл) при 4°С в течение ночи, отфильтровывали кристаллы, промывали EtOH (этанолом), высушивали до получения N-ацетилнейраминовой кислоты в виде белого кристаллического порошка (1,5 г, 39,8%).
1
2
Н-ЯМР (DO) δ (ppm)
z
z
4,00 (m, 1Н), 3,97 (m, 1Н), 3.87 (d, 1Н), 3,77 (dd, 1Н), 3,67 (m, 1Н), 3,55 (dd, 1Н), 3,48 (d, 1Н), 2,24 (dd, 1Н, J=13,2 Hz, 5.1 H), 1,98 (s, 3Н), 1,83 (dd, 1H, J=13,2 H, 11,5 Hz). MS 310 (M+1)
3
N-ацетилнейраминовую кислоту (1 г, 3,23 ммоль) растворяли в воде (20 мл), затем перемешивали с NaHCO (0,26 г, 3,09 ммоль до рН 6~6.5), затем высушивали замораживанием до получения указанного продукта в виде белого порошка (1,05 г, 98%).
Пример 3. Получение этил-N-ацетилнейрамината (ethyl N-acetyl-neuraminate) (3)
К суспензии N-ацетилнейраминовой кислоты (1 г, 3,23 ммоль) в безводном этаноле (75 мл) добавляли 1,5 мл ацетилхлорида. Смесь плотно закрывали и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов до образования прозрачного раствора.
Образовавшийся раствор упаривали досуха в вакууме. Белое твердое вещество промывали этилацетатом и высушивали в вакууме до получения указанного соединения в виде твердого вещества белого цвета (1 г, 91,7%).
1
2
Н-ЯМР (DO) δ(ppm)
4,27 (q, 2Н), 4,04 (m, 2Н), 3,91 (d, 1Н), 3,78 (dd, 1Н), 3,68 (dd, 1Н), 3,57 (dd, 1Н), 3,52 (d, 1Н), 2,28 (dd, 1Н), 2.01 (s, 3Н), 1,88 (dd, 1Н), 1,28 (t, 3Н). MS 338 (M+1), 360 (M+23)
Пример 4. Получение этил-5-ацетамидо-4,7,8,9,-тетра-о-ацетил-3,5-дидезокси-β-D-глицеро-D-галакто-2-нонулопиранозоната (этил-5-ацетамидо-4,7,8,9-тетра-о-ацетилнейрамината) (4)
3
4
К перемешиваемому раствору ангидрида уксусной кислоты (0,72 г) и 60% водному раствору хлорной кислоты (5 мкл) при 40°С добавляли по частям на протяжении 30 минут этил-5-ацетамидонейраминат (230 мг, 0,68 ммоль). Образовавшуюся смесь перемешивали при 40°С в течение 2 часов. Затем раствор охлаждали до комнатной температуры, разбавляли холодной водой (10 мл), насыщали сульфатом аммония, экстрагировали этилацетатом (40 мл × 3). Органические экстракты объединяли и промывали насыщенным раствором NaHCO и водой последовательно. Органический слой сушили над MgSO и выпаривали в вакууме досуха. Осадок растворяли в этилацетате, разбавляли гексаном для получения указанного соединения в виде белого кристаллического вещества (223 мг, 65%).
1
3
Н-ЯМР (CDCI) δ (ppm)
z
z
z
z
z
z
z
z
z
z
z
5,71 (m, 1Н), 5,36 (dd, 1Н, J=1,5H, 5,6 H), 5,25 (ddd, 1Н, J=2,4 H, 7,5H), 5,22 (ddd, 1H, J=11,4 H, 5,4 H, 9,5 H), 4,51 (dd, 1H, J=12,4 H), 4,47 (d, 1H, J=0,8 H), 4,21~4,13 (m, 4H), 4,03 (dd, 1H), 2,26 (ddd, 1H, 12,8 H), 2,19 (dd, 1H), 2,15, 2,11, 2,03, 2,02 и 1,91 (5s, 15H), 1,29 (t, 3H, J=7,2 H).
MS 506 (M+1)
Пример 5. Получение цитидин-5′-монофосфо-5-ацетамидо-3,5,-дидезокси-β-D-глицеро-D-галакто-2-нонулопиранозоновой кислоты (ЦМФ-сиаловой кислоты) (5)
2
4
3
N-ацетилнейраминовую кислоту (100 мг, 0,32 ммоль) и натриевую соль цитидин-5-трифосфата (156,3 мг, 0,32 ммоль) растворяли в 32 мл буфера Tris-HCl (100 мМ, рН 8,8), содержащего MgCl (20 мМ). К этому раствору добавляли синтетазу CMP-Neu5Ac (5 мг из N. meningitidis). Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 2~3 часов наряду с исследованием путем ТСХ (тонкослойной хроматографии) (на силикагеле, EtOH: 1М NHHCO = 7:3). Реакционную смесь разбавляли метанолом (50 мл) и отфильтровывали. Фильтрат выпаривали при пониженном давлении досуха. Осадок хроматографировали на смоле Bio Gel P-2 (50ml), затем лиофилизировали для получения указанного соединения в виде белого кристаллического порошка (147 мг, 75%).
Анализ ВЭЖХ:
- Колонка С-18.
- Подвижная фаза: буфер А (0,1М буфер фосфата. С добавлением 8 мМ тетрабутиламмония гидросульфата, рН 5,3) и буфер В (70% буфер А плюс 30% метанол, рН 5,9)
- Условия градиента:
100% буфер А в течение 2,5 минут, 0-40% буфер В в течение 7,5 минут, 40~100% буфер В в течение 1 минуты, 100% буфер В в течение 4 минут, 100~0% буфер В в течение 1 минуты, с последующей фазой уравновешивания 100% буфер А в течение 4 минут.
- Скорость потока: 1 мл/мин.
- УФ-детектирование при 270 нм
1
2
Н-ЯМР (DO) δ (ppm)
z
z
z
z
z
7,87 (d, 1Н, J=7,6 H), 6,25 (d, 1H, J=7,6 H), 5,91 (d, 1H, J=4,4H), 4,26~4,20 (m, 2H), 4,17-4,10 (m, 3H), 4,09-3,98 (m, 2H), 3,90~3,80 (m, 3H), 3,59-3,40 (m, 2H), 2,42 (dd, 1H, J=4,8, 13,2 H), 1,98 (s, 3H), 1,60 (dt, 1H, J=5,6, 12,6 H)
2-
+
MS 635(M+Na)
Пример 6. Получение этил-5-ацетамидо-8,9-O-изопропилидиннейрамината (ethyl 5-acetamido-8,9-O-isopropylidine-neuraminate) (6).
К раствору этил-5-ацетамидонейрамината (150 мг, 0,445 ммоль) в безводном ДМФА (2 мл) добавляли 2,2-диметоксипропан (1 мл, 8 ммоль) и Амберлист 15 (50 мг). Смесь перемешивали при 60°С в течение 7 часов, затем охлаждали до комнатной температуры и фильтровали. Фильтрат выпаривали при пониженном давлении досуха. ТСХ (на силикагеле, ЕА/МеОН = 10:4) показывала окончание взаимодействия. Осадок повторно растворяли в ЕА/МеОН = 10/1 (1 мл), затем проводили колоночную флэш-хроматографию. Требуемые фракции объединяли и выпаривали в вакууме досуха до получения указанного соединения в виде (вещества) белого цвета (135 мг, 75%).
1
2
Н-ЯМР (DO) δ (ppm)
4,28~4,23 (m, 2Н), 4,23~4,11 (m, 2Н), 4,08~3,92 (m, 2Н), 3,96~3,52 (m, 3Н), 2,31 (dd, 1/3Н), 2,23 (dd, 2/3Н), 1,99 (s, 3Н), 1,82 (dd, 2/3Н), 1,70 (dd, 1/3Н), 1,36 (s, 3Н), 1,32 (s, 3Н), 1,25 (t, 3Н).
MS 428 (M+Na)
Пример 7. Активность соединения (1) на восстановление жизнеспособности небольших эпителиальных клеток дыхательных путей (SAEC)
Соединение (1) [формула (1), В=Н, A=NHCOCH<sub>3</sub>, R<sup>1</sup>=R<sup>2</sup>=R<sup>3</sup>=R<sup>4</sup>=H]
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (1) 50 мкг/мл
171%±6,33
12,5 мкг/мл
175%±2,33
3,1 мкг/мл
146%±7,10
0,77 мкг/мл
139%±3,46
0,19 мкг/мл
157%±4,47
Пример 8. Активность соединения (1) на восстановление жизнеспособности человеческих нормальных эпителиальных бронхиальных/трахеальных клеток (NHBE)
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (1) 50 мкг/мл
125%±3,20
12,5 мкг/мл
124%±2,21
3,1 мкг/мл
120%±0,79
0,77 мкг/мл
119%±2,23
0,19 мкг/мл
116%±1,42
Пример 9. Активность соединения (2) на восстановление жизнеспособности SAEC
Соединение (2) [Формула (2), R<sup>8</sup>=R<sup>10</sup>=R<sup>11</sup>=R<sup>12</sup>=R<sup>13</sup>=H, R<sup>9</sup>=Na]
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (2) 50 мкг/мл
129%±3,96
12,5 мкг/мл
127%±2,51
3,1 мкг/мл
115%±1,56
0,77 мкг/мл
130%±2,18
0,19 мкг/мл
129%±3,22
0,05 мкг/мл
138%±0,50
0,012 мкг/мл
140%±2,15
0,003 мкг/мл
124%±1,91
Пример . Активность соединения (2) на восстановление жизнеспособности NHBE
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (2) 50 мкг/мл
137%±1,00
12,5 мкг/мл
127%±4,02
3,1 мкг/мл
117%±3,22
0,77 мкг/мл
117%±0,68
0,19 мкг/мл
126%±0,21
Пример 11. Активность соединения (3) на восстановление жизнеспособности SAEC
Соединение (3) [Формула (2), R<sup>8</sup>=R<sup>10</sup>=R<sup>11</sup>=R<sup>12</sup>=R<sup>13</sup>=H, R<sup>9</sup>=C<sub>2</sub>H<sub>5</sub>]
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (3) 50 мкг/мл
104%±1,66
12,5 мкг/мл
107%±0,41
3,1 мкг/мл
109%±1,41
0,77 мкг/мл
103%±3,43
0,05 мкг/мл
104%±1,46
Пример 12. Активность соединения (3) на восстановление жизнеспособности NHBE
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (3) 50 мкг/мл
106%±1,35
12,5 мкг/мл
100%±0,88
3,1 мкг/мл
113%±0,84
0,77 мкг/мл
111%±4,73
0,19 мкг/мл
114%±5,14
0,05 мкг/мл
130%±5,19
0,012 мкг/мл
130%±6,11
0,003 мкг/мл
154%±4,91
Пример . Активность соединения (4) на восстановление жизнеспособности SAEC
Соединение (4) [Формула (2), R<sup>8</sup>=H, R<sup>9</sup>=C<sub>2</sub>H<sub>5</sub>, R<sup>10</sup>=R<sup>11</sup>=R<sup>12</sup>=R<sup>13</sup>=CH<sub>3</sub>CO]
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (4) 50 мкг/мл
99%±4,00
12,5 мкг/мл
97%±3,00
3,1 мкг/мл
100%±1,80
0,77 мкг/мл
115%±4,40
0,19 мкг/мл
121%±1,80
0,05 мкг/мл
106%±6,09
0,012 мкг/мл
116%±0,10
0,003 мкг/мл
110%±1,09
Пример 14. Активность соединения (4) на восстановление жизнеспособности NHBE
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (4) 50 мкг/мл
110%±1,02
12,5 мкг/мл
117%±0,29
3,1 мкг/мл
111%±4,54
0,77 мкг/мл
110%±3,77
0,19 мкг/мл
125%±1,46
0,05 мкг/мл
115%±5,22
0,012 мкг/мл
113%±6,85
0,003 мкг/мл
83%±0,88
Пример 15. Активность соединения (5) на восстановление жизнеспособности SAEC
Соединение (5) [Формула (2), R<sup>8</sup>=цитидинмонофосфат, R<sup>9</sup>=R<sup>10</sup>=R<sup>11</sup>=R<sup>12</sup>=R<sup>13</sup>=H]
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (5) 50 мкг/мл
116%±5,30
12,5 мкг/мл
108%±1,20
3,1 мкг/мл
141%±1,70
0,77 мкг/мл
141%±1,09
0,19 мкг/мл
145%±4,89
Пример . Активность соединения (5) на восстановление жизнеспособности NHBE
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (5) 50 мкг/мл
116%±0,93
12,5 мкг/мл
109%±3,60
3,1 мкг/мл
112%±2,59
0,77 мкг/мл
109%±1,92
0,19 мкг/мл
89%±0,79
Пример 17. Активность соединения (6) на восстановление жизнеспособности SAEC
Соединение (6) [Формула (2), R<sup>8</sup>=H, R<sup>9</sup>=C<sub>2</sub>H<sub>5</sub>, R<sup>10</sup>=R<sup>11</sup>=H, R<sup>12</sup>n R<sup>13</sup>=>C (CH<sub>3</sub>)<sub>2</sub>]
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (6) 50 мкг/мл
119%±3,17
12,5 мкг/мл
125%±1,13
3,1 мкг/мл
123%±5,02
0,77 мкг/мл
135%±3,27
0,19 мкг/мл
140%±1,92
Пример 18. Активность соединения (6) на восстановление жизнеспособности NHBE
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (6) 50 мкг/мл
90%±8,36
12,5 мкг/мл
99%±3,17
3,1 мкг/мл
121%±2,10
0,77 мкг/мл
128%±3,60
0,19 мкг/мл
133%±0,88
0,05 мкг/мл
127%±1,81
0,012 мкг/мл
122%±3,33
0,003 мкг/мл
141%±4,70
Пример 19. Активность соединения (7) на восстановление жизнеспособности SAEC
Соединение (7) [Формула (1), В=Н, A=NHCOCH<sub>3</sub>, R<sup>1</sup>=R<sup>2</sup>=R<sup>3</sup>=R<sup>4</sup>=COCH<sub>3</sub>]
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (7) 50 мкг/мл
73%±2,18
12,5 мкг/мл
134%±0,81
3,1 мкг/мл
103%±1,14
0,77 мкг/мл
112%±1,29
0,19 мкг/мл
105%±2,01
0,05 мкг/мл
128%±1,98
0,012 мкг/мл
105%±1,83
0,003 мкг/мл
102%±0,62
Пример 20. Активность соединения (7) на восстановление жизнеспособности NHBE
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (7) 50 мкг/мл
54%±0,98
12,5 мкг/мл
117%±4,12
3,1 мкг/мл
98%±5,65
0,77 мкг/мл
99%±1,93
0,19 мкг/мл
100%±0,66
0,05 мкг/мл
104%±5,85
0,012 мкг/мл
103%±4,70
0,003 мкг/мл
85%±2,71
Пример 21. Активность соединения (8) на восстановление жизнеспособности SAEC
Соединение (8) [Формула (1), В=Н, A=NHCOCH<sub>3</sub>, R<sup>1</sup>=H, R<sup>2</sup>=R<sup>3</sup>=R<sup>4</sup>=COCH<sub>3</sub>]
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (8) мкг/мл
91%±3,36
12,5 мкг/мл
104%±1,95
3,1 мкг/мл
109%±2,79
0,77 мкг/мл
103%±3,21
0,19 мкг/мл
115%±3,52
0,05 мкг/мл
109%±1,16
0,012 мкг/мл
Не определена
0,003 мкг/мл
125%±8,51
Пример . Активность соединения (8) на восстановление жизнеспособности NHBE
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (8) 50 мкг/мл
42%±1,55
12,5 мкг/мл
81%±0,60
3,1 мкг/мл
111%±2,44
0,77 мкг/мл
133%±2,09
0,19 мкг/мл
96%±1,21
0,05 мкг/мл
93%±1,38
0,012 мкг/мл
118%±3,19
0,003 мкг/мл
129%±1,70
Пример 23. Активность соединения (9) на восстановление жизнеспособности SAEC
Соединение (9) [Формула (1), А=Н, B=NHCOCH<sub>3</sub>, R<sup>1</sup>=R<sup>2</sup>=R<sup>3</sup>=R<sup>4</sup>=H]
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (9) 50 мкг/мл
122%±3,21
12,5 мкг/мл
119%±3,04
3,1 мкг/мл
115%±3,17
0,77 мкг/мл
120%±3,14
0,19 мкг/мл
121%±2,42
Пример 24. Активность соединения (9) на восстановление жизнеспособности NHBE
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (9) 50 мкг/мл
106%±2,52
12,5 мкг/мл
106%±3,49
3,1 мкг/мл
108%±3,24
0,77 мкг/мл
107%±1,26
0,19 мкг/мл
107%±3,41
Пример . Активность D-глюкозы на восстановление жизнеспособности SAEC
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
D-глюкоза 50 мкг/мл
94%±3,04
12,5 мкг/мл
103%±1,05
3,1 мкг/мл
101%±2,30
Пример 26. Активность D-глюкозы на восстановление жизнеспособности NHBE
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
D-глюкоза 50 мкг/мл
106%±2,76
12,5 мкг/мл
104%±2,13
3,1 мкг/мл
107%±3,05
0,77 мкг/мл
99%±3,15
0,19 мкг/мл
104%±2,96
Пример 27. Активность соединения (1) в высокой концентрации на восстановление жизнеспособности SAEC
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (1) 5 мг/мл
118%±2,15
1,25 мг/мл
121%±3,02
312,5 мкг/мл
115%±1,51
78,1 мкг/мл
127%±2,30
Пример 28. Активность соединения (1) в высокой концентрации на восстановление жизнеспособности NHBE
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (1) 5 мг/мл
116%±2,11
1,25 мг/мл
125%±2,02
312,5 мкг/мл
131%±3,04
78,1 мкг/мл
128%±1,85
Пример 29. Активность соединения (2) в высокой концентрации на восстановление жизнеспособности SAEC
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (2) 5 мг/мл
129%±1,76
1,25 мг/мл
115%±1,38
312,5 мкг/мл
118%±1,95
78,1 мкг/мл
135%±2,06
Пример 30. Активность соединения (2) в высокой концентрации на восстановление жизнеспособности NHBE
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (2) 5 мг/мл
122%±2,05
1,25 мг/мл
129%±3,13
312,5 мкг/мл
118%±2,17
78,1 мкг/мл
107%±1,38
Пример 31. Активность соединения (9) в высокой концентрации на восстановление жизнеспособности SAEC
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (9) 5 мг/мл
83%±2,85
1,25 мг/мл
96%±3,16
312,5 мкг/мл
90%±3,28
78,1 мкг/мл
100%±2,92
Пример 32. Активность соединения (9) в высокой концентрации на восстановление жизнеспособности NHBE
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Соединение (9) 5 мг/мл
76%±2,71
1,25 мг/мл
96%±2,42
312,5 мкг/мл
95%±2,85
78,1 мкг/мл
125%±3,23
Пример 33. Активность смеси соединения (1) (85%) и соединения (9) (15%) в высокой концентрации на восстановление жизнеспособности SAEC
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Смесь соединения (1) и (9) 5 мг/мл
88%±1,82
1,25 мг/мл
91%±2,03
312,5 мкг/мл
87%±2,52
78,1 мкг/мл
94%±1,91
Пример 34. Активность смеси соединения (1) (85%) и соединения (9) (15%) в высокой концентрации на восстановление жизнеспособности NHBE
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Смесь соединения (1) и (9) 5 мг/мл
89%±2,31
1,25 мг/мл
107%±2,48
312,5 мкг/мл
105%±2,02
78,1 мкг/мл
95%±3,12
Пример 35. Активность смеси соединения (1) (85%) и соединения (9) (15%) на восстановление жизнеспособности SAEC
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Смесь соединения (1) и (9) 50 мкг/мл
101%±3,41
12,5 мкг/мл
107%±3,91
3,1 мкг/мл
121%±4,82
0,77 мкг/мл
120%±4,11
0,19 мкг/мл
115%±4,02
0,05 мкг/мл
113%±4,30
0,01 мкг/мл
107%±4,12
0,003 мкг/мл
108%±4,20
Пример 36. Активность смеси соединения (1) (85%) и соединения (9) (15%) на восстановление жизнеспособности NHBE
Жизнеспособность клеток (среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), n=3)
Контроль (обработанный нейраминидазой)
100%
Смесь соединения (1) и (9) 50 мкг/мл
121%±2,05
12,5 мкг/мл
109%±1,98
3,1 мкг/мл
115%±1,76
[9][10]
Пример 37. Экспериментальные исследования кашля на морских свинках
Самцов морских свинок содержали в загонах и обеспечивали избыток воды и корма ad libitum (вволю). Данное исследование было одобрено комитетом по этическому обращению с животными Института Bio21.
Двадцать четыре бодрствующих самца морских свинок Hartley (500~550 г) делили на три группы А, В, С (по 8 животных в каждой группе) и предварительно обрабатывали или раствором нейраминидазы, 5 единиц/мл, (Sigma N2133, лиофилизированный порошок, Type X, 150~400 единиц/мг белка) в воде (группа В и С), или физиологическим раствором в чистом виде (группа А) с использованием аэрозоля в течение 5 минут в первый день. Затем, в первый, второй и третий день морским свинкам перорально вводили или 500 мг/кг соединения (1) (группа С), или воду в чистом виде (группа А и В). На четвертый день всех животных сенсибилизировали 0,5 М раствором лимонной кислоты (распыленной, 10-минутное воздействие). Затем регистрировали частоту кашля, время до первого, второго и третьего кашля, время до 1-го вытирания носа в течение 15 минутного периода.
Результаты показали тенденцию, что соединение (1) помогло восстановить поражения, вызванные нейраминидазой.
Частота кашля (в течение 15 минут)
Группа А (Физиологический раствор в чистом виде, контроль)
13±2,5
Группа В (обработанные нейраминидазой, отрицательный контроль)
19±2,5
Группа С (первоначально обработанные нейраминидазой, затем соединением (1) в течение 3 дней)
16±2,2
Время (в секундах) до:
1-го кашля
2-го кашля
3-го кашля
Группа А (вода в чистом виде, контроль)
87±10
157±23
200±25
Группа В (обработанные нейраминидазой, отрицательный контроль)
70±11
109±6
150±20
Группа С(первоначально обработанные нейраминидазой, затем обработанные соединением (1) в течение 3 дней)
85±15
137±31
220±10
Время (в секундах) до 1-го вытирания носа
Группа А (вода в чистом виде, контроль)
50±4,3
Группа В (обработанные нейраминидазой, отрицательный контроль)
27,7±3,6
Группа С (первоначально обработанные нейраминидазой, затем обработанные соединением (1) в течение 3 дней)
49±6,5
С использованием соединения (2) вместо соединения (1), при помощи того же самого экспериментального протокола, получали сходные результаты.
Ссылки
[1] Edelman, G.M. and Crossin, K.L. Cell adhesion molecules: Implications for a molecular histology. Annu. Rev. Biochem. 60, 155~190 (1991).
[2] Varki A. Divesity in the sialic acids. Glycobiology 2, 25~40 (1992).
[3] Schauer, R., et al. Biochemistry and role of sialic acids. In: Biology of the sialic acids. A. Rosenberg, ed. New York, USA. Pp 7~67 (1995).
[4] Rens-Domiano, S. and Reisine, T. Structural analysis and functional role of the carbohydrate component of somatostatin receptors. J. Biol. Chem. 266, 20094~20102 (1991).
[5] Keppler, О. Т., et al. Science 284(5418), 1372~1376 (1999).
[6] Miyata, Т., et al. Archives internationales de pharmacodynamie et de therapie, 296, 202~9 (1988).
[7] Miyata, Т., et al. Archives internationales de pharmacodynamie et de therapie, 304, 277~89 (1990).
[8] Amir, S.M., et al. Nature, 211(5052), 976~7(1966).
[8b] B. Galeano et al. Mutation in the key enzyme of sialic acid biosynthesis causes severe glomerular proteinuria and is rescued by N-acetylmannosamine. J. Clin. Invest. 2007 117 (6) 1585~1594.
[8c] Предварительная заявка США №60/932,451, зарегистрированная 31 мая 2007. [9] Laude, Е.А. et al, "A comparative study of the effects of Citric acid, Capsaicin and Resiniferatoxin on the Cough challenge in Guinea-pig and Man". Pulmonary Pharmacology 6, 171~175 (1993).
[10] Tanaka, M. et al, "Mechanisms of Capsaicin- and Citric-acid-induced Cough Reflexes in Guinea pig". J. Pharmacol. Sci., 99, 77~82 (2005).
Будущие патентные заявки могут быть поданы на основе данной заявки на патент или заявления на приоритет данной заявки на патент. Должно быть понятно, что следующую формулу изобретения обеспечивают только в качестве примера, и она не предназначена для ограничения объема того, что может быть заявлено в любой такой будущей заявке на патент. Впоследствии характерные черты могут быть добавлены в формулу изобретения или исключены из формулы изобретения позднее, с тем чтобы более четко определить или переопределить объем изобретения или изобретений.
В заключение должно быть понятно, что различные другие модификации и/или изменения могут быть сделаны, не выходя за пределы существа и объема данного изобретения, как указано здесь.