НАБОР ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК АДЕНОВИРУСА СЕРОТИПОВ 3,4,7,14,21 МЕТОДОМ ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
SET OF OLIGODEOXYRIBONUCLEOTIDE PRIMERS AND FLUORESCENTLY LABELLED PROBE FOR IDENTIFICATION OF DNA OF ADENOVIRUSES OF SEROTYPES 3, 4, 7, 14, 21 BY METHOD OF HYBRIDISATION-FLUORESCENCE POLYMERASE CHAIN REACTION

Изобретение относится к наборам для выявления генетического материала (ДНК) аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21 в клинических образцах и секционных пробах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач по мониторингу и изучению свойств аденовируса, созданию диагностических, профилактических и лечебных препаратов и может быть использовано в медицине, биотехнологии и эпидемиологии.
Adenoviridae
Mastadenovirus
Аденовирусы человека - это ДНК-содержащие вирусы, принадлежащие семейству , роду  [International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), доступно по ссылке: http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2009&bhcp=1]. В настоящее время выделяют 7 подгрупп (А-G) аденовируса человека, которые в свою очередь включают в себя 51 серотип. Манифестные формы заболевания вызывают главным образом эпидемические серотипы (3, 4, 7, 14, 21) подгрупп В и Е.
Так как аденовирус проявляет выраженную эпителиотропность и токсичность, он в первую очередь поражает эпителий респираторного тракта, кишечника, конъюнктивы, а также лимфоидную ткань, вызывая целый ряд заболеваний человека.
Аденовирус способен вызывает широкий спектр заболеваний человека с самыми разнообразными клиническими проявлениями, а также учитывая возможность применения в ближайшем будущем вирусспецифических препаратов разработка эффективных методов диагностики аденовирусов становится актуальной задачей.
В настоящее время в Российской Федерации разработано несколько наборов для детекции ДНК аденовирусов методом ПЦР. Находящиеся в них праймеры можно рассматривать в качестве прототипов:
1. «АмплиСенс Adenovirus-EPh» (ИнтерЛабСервис) - набор реагентов для амплификации ДНК аденовирусов из клинического материала методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле;
2.  «Аденовирус» (ЗАО «БиоХимМак») - ПЦР-тест-система для амплификации ДНК аденовируса с последующей детекцией методом электрофореза.
Однако в сравнении с заявляемым к патентованию набором перечисленные выше разработки имеют ряд существенных недостатков, к самым существенным из которых следует отнести то, что наборы «АмплиСенс Adenovirus-EPh» (ИнтерЛабСервис) и «Аденовирус» (ЗАО «БиоХимМак») предназначены для выявления ДНК аденовируса методом ПЦР с электрофоретической детекцией.
В качестве аналога также можно рассматривать праймеры и зонд из ПЦР-тест-системы «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL» (ИнтерЛабСервис), которая представляет собой набор реагентов для идентификации возбудителей ОРВИ человека, в том числе ДНК аденовирусов групп B, C и E методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации.
Однако в связи с видовой вариабельностью генома аденовируса можно предполагать значительную вырожденность используемых в наборе праймеров и зонда, что, несомненно, сказывается на чувствительности и специфичности набора.
Известен патент Японии японских исследователей (JP2004305092, МПК  C12Q1/68, опубл. 04.11.2004 г.) для выявления ДНК аденовируса методом количественной ПЦР.
Наиболее близким аналогом (прототипом) являются  олигонуклеотиды, праймеры и зонды, предназначенные для осуществления способа детекции и количественного определения нуклеиновых кислот аденовируса (патент РФ  №2272845, МПК С121/68, опубл. 27.03.2006 г. ). Заявлены олигонуклеотиды для осуществления способа детекции и/или количественного определения нуклеиновых кислот аденовирусов в биологическом образце, имеющий следующую идентифицированную последовательность №1: 5'-YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT-3', в которой Y означает С или Т и М означает А или С, или последовательность, комплементарную указанной последовательности. Последовательность №2: 5'-GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC-3', в которой S означает G или С и В означает С, G или Т, или последовательность, комплементарную указанной последовательности. Последовательность №3: 5'-GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC-3', в которой S означает G или С и В означает С, G или Т, или последовательность, комплементарную указанной последовательности. Праймеры НЕХ1 и НЕХ2 для осуществления способа детекции и/или количественного определения нуклеиновых кислот аденовирусов в биологическом образце, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере два олигонуклеотида по меньшей мере из 10 последовательных нуклеотидов нижеследующей идентифицированной последовательности №1 или последовательности, обладающей гомологией последовательности по меньшей мере на 80% с вышеуказанной последовательностью 5'-YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT-3', в которой Y означает С или Т и М означает А или С. Зонд HEX включает олигонуклеотид для осуществления способа детекции и/или количественного определения нуклеиновых кислот аденовирусов в биологическом образце, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидов нижеследующей идентифицированной последовательности №3 или последовательности, обладающей гомологией последовательности по меньшей мере на 80% с вышеуказанной последовательностью 5'-САС CAG ССА САС CGC GGC GTC АТС GA-3'.
Однако вышеуказанные патенты-аналоги, в том числе и прототип, разработаны  в начале 2000-х  годов. За последние десять лет были выделены и секвенированы новые последовательности геномов аденовируса человека. В связи с выше изложенным аналоги и прототип не обладают достаточной гомологией к циркулирующим в настоящее время аденовирусам, что в свою очередь снижает чувствительность набора диагностических праймеров и зондов.
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание такого набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченного зонда для идентификации ДНК аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21, который обладал бы более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время аденовирусам, что повышает чувствительность заявляемого набора .
Указанный технический результат достигается тем, что набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченного зонда для идентификации ДНК аденовируса человека серотипов 3, 4, 7, 14 21 методом гибридизационно-флуоресцентно полимеразной цепной реакции включает олигодезоксирибонуклеотиды, обладающие специфической активностью прямого и обратного праймеров, и флуоресцентно меченный зонд, имеющие следующую структуру:
внешний праймер 5'→3'
5'-AATGTARTTGGGTCTGTTRGGCAT-3'
внутренние праймеры 5'→3'
5'-CCCWTCGATGMTGCCCC-3'
5'-TCMACGGGYACRAAGCGCA-3'
зонд 5'→3'
ROX-CCTGTCCGGCGATGTGCAT-BHQ2
Таким образом, рассчитанные и представляемые к патентованию олигодезоксинуклеотидные праймеры и ДНК-зонд обладают минимальной вырожденностью, а созданный на их основе набор обладает повышенной чувствительностью и специфичностью. Праймеры и зонд позволяют проводить ПЦР в два раунда, что также увеличивает чувствительность ПЦР-анализа. Кроме того, с помощью олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченного зонда можно проводить исследование клинического материала методом «полувложенной» ПЦР. Наличие одного «внешнего» праймера позволяет кроме этого сократить стоимость проведения одного анализа. Представляемые к патентованию олигодезоксинуклеотидные праймеры и ДНК-зонд позволяют выявить в образце ДНК аденовирусов серотипов 3, 4, 7, 14, 21 в режиме реального времени, амплифицировать фрагмент ДНК аденовируса, который может быть использован для секвенирования и определения генетических свойств аденовируса, а также для проведения молекулярно-биологических работ.
585/610 нм)
Изобретение поясняется следующими графическими материалами: на фиг. 1 приведен результат ПЦР-анализа в режиме реального времени, полученный с использованием зашифрованной вирусной панели, содержащей аденовирусы человека.  В образце № 5 (AdV 7) обнаружен аденовирус 7-го серотипа (канал ROX(. На фиг.2 представлена электрофореграмма продуктов ПЦР в 2% агарозном геле. На фиг.3 приведены выравненные последовательности гена гексона аденовирусов человека серотипов 3, 4, 7, 14 и 21.
Расчет и конструирование набора диагностических праймеров и флуоресцентно меченного зонда на консервативную область гена гексона аденовируса человека серотипов 3, 4, 7, 14, 21
Используемые для расчета праймеров и зонда последовательности геномов аденовируса были получены из международной базы данных GenBank. Для построения элайнментов, анализа и расчетов праймеров и зондов, изучения их специфичности использовали семейство компьютерных программ Vector NTI 9.0.0 (Informax, США) и онлайн интернет-ресурсы базы данных Национального центра биотехнологической информации США (Blast NCBI).
В таблице 1 приведен заявляемый набор праймеров и зонда для детекции аденовируса человека серотипов 3, 4, 7, 14, 21.
Таблица 1. Праймеры и зонд для детекции аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21
Позиция в геноме аденовируса<sup>*</sup>
Структура олигонуклеотидной последовательности праймеров и зонда
Т отжига (°С)
Размер ампликона
18426-18442
CCCWTCGATGMTGCCCC
53.2
206 п.о.
18472-18449
ROX-CCTGTCCGGCGATGTGCAT-BHQ2
58.9
18614-18632
TCMACGGGYACRAAGCGCA
51.8
19377-19354
AATGTARTTGGGTCTGTTRGGCAT
52.9
951 п.о.
США
Примечание. (*) - референс-последовательность базы данных Национального центра биотехнологической информации  (Blast NCBI) - Human adenovirus 3 type, complete genome (DQ086466.1).
В ходе работы было проанализировано 1393 нуклеотидные последовательности генома аденовируса человека серотипов 3, 4, 7, 14, 21, инфицирование которыми наиболее часто приводит к респираторным заболеваниям человека [American cademy of Pediatrics, 2003; Metzgar, 2005; Rubin, 1993; Ryan, 2002; Washington, 2010].
hexon gene
Праймеры и зонд для детекции аденовируса были подобраны внутри гена, кодирующего белок гексона (). Заявляемый набор праймеров и флуоресцентных зондов был получен при выравнивании как полных, так и фрагментов геномов всех доступных в международной базе данных аденовирусов
серотипов 3, 4, 7, 14 и 21 (фиг.3). Выравненные последовательности обладают гомологичными участками для всех 5 серотипов вируса, что позволяет рассчитать диагностические олигонуклеотиды для этой группы вирусов в этом регионе генома.
Проведенный глубокий анализ полученных выравненных последовательностей показал, что в гене белка гексона (hexon gene) присутствуют участки с единичными нуклеотидными заменами. Выявленные участки были использованы для дизайна олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов. В местах единичных нуклеотидных отличий геномов пяти серотипов аденовирусов человека были введены вырожденные нуклеотиды, что исключает возможность отсутствия гибридизации полученных олигонуклеотидов с целевой ДНК в ПЦР.
США
Streptococcus
Mycoplasma pneumoniae
Chlamydophila pneumonia
Haemophilus influenzae
Legionella pneumophila
На этапе расчетов с использованием онлайн интернет-ресурсов базы данных Национального центра биотехнологической информации  (Blast NCBI) была оценена специфичность выбранных олигонуклеотидов. Выбранные праймеры и зонд не обнаруживают гомологии к человеческой ДНК, а также вирусным и бактериальным патогенами, которые встречаются в клинических образцах, исследуемых на наличие агентов ОРВИ (коронавирусы человека видов 229E, NL63, OC43, HKU1, коронавирусом, ассоциированным с тяжелым острым респираторным синдромом, вирусом герпеса человека типов 1 и 2, цитомегаловирусом, вирусом парагриппа человека типов 1-4, метапневмовирусом человека, риновирусом человека видов A-C, энтеровирусом человека видов A-D, бактериями рода , бактериями вида , , , ).
Конструирование положительных контролей и оценка специфичности праймеров и зондов в реакции ПЦР
E. coli
Положительные контрольные образцы были получены методом ТОРО-Т/А клонирования вирусспецифического ДНК-дуплекса в плазмиду pCR2.1 (Invitrogen, США). Затем полученными плазмидными конструкциями, несущими вирусспецифическую вставку, трансформировали компетентные клетки  линии TOP 10 (Invitrogen, США). Наличие вирусспецифической к гену гексона аденовируса ДНК-вставки подтверждали секвенированием. В ходе проделанной работы была получена рекомбинантная плазмида - pHAdV.
2+
2+
2
Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния (Mg), концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, температуре отжига праймеров. С использованием полученной плазмидной конструкции были подобраны оптимальные концентрации ионов Mg (2.5 мМ MgCl), прямого и обратного праймеров (300 нМ), флуоресцентного ДНК-зонда (100 нМ). Важно отметить, что все этапы оптимизации проведения ОТ-ПЦР были осуществлены с использованием коммерческих реагентов и приборов для амплификации, являясь коммерчески доступными, они предназначены для массового применения в диагностических лабораториях России. Это позволяет широко применять данное изобретение в лабораторной практике.
ПЦР проводили в 30 мкл смеси, содержащей:
§ 1×Taq буфер для амплификации (ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»);
2
§ 2,5 мМ MgCl (ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»);
§ 0,17 мМ каждого из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»);
Smart Taq
§ 1,5 активные единицы ДНК-полимеразы (ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»).
§ 300 нМ прямого и обратного праймеров;
§ 100 нМ флуоресцентно меченного ДНК-зонда.
30 мкл смеси для ПЦР имеет следующий состав (из расчета на одну пробирку):
<b>Компонент смеси</b>
<b>Объем, мкл</b>
ПЦР-буфер×10
3,0
дНТФ (5 мМ)
1,0
MgCl<sub>2</sub> (50 мМ)
1,5
Hot Start Taq ДНК-полимераза
0,3
Праймер F-HAdV (0.15 мМ)
2,0
Праймер R-HAdV (0.15 мМ)
2,0
ДНК-зонд Z-HAdV (0.2 мМ)
0,5
Образец
3,0
H<sub>2</sub>O
16,7
ПЦРпроводили согласно температурно-временному профилю:
1
Предварительный прогрев
95 °C - 5 минут
2
Параметры циклов ПЦР(10 циклов)
95 °C - 20 секунд51 °C - 20 секунд72 °C - 20 секунд
3
Параметры циклов ПЦР(30 циклов)
95 °C - 20 секунд51 °C - 20 секунд (детекция)72 °C - 20 секунд
4
Остановка реакции
72 °C - 5 минут
Детекцию интенсивности флуоресценции проводили по каналу Orange 585/610 нм (краситель ROX).
Измерение интенсивности флюоресценции проводили на приборах “Rotor Gene 6000” (Corbet Research, Австралия) и iQ5 (BioRad, США). Результаты оценивали по наличию флюоресценции до 30 цикла (фиг. 1).
агарозном геле
Дополнительно проводили электрофорез продуктов ПЦР в 2%  в присутствии бромистого этидия. Результаты оценивали по наличию флуоресцирующих полос, соответствующих фрагментам ДНК в 720 п.о. (К+), 951 п.о. (Ι раунд ПЦР), 206 п.о. (ΙΙ раунд ПЦР) (фиг. 2).
Полосы флуоресценции в геле соответствовали полученным в реакции амплификации участкам плазмидной и вирусной ДНК.
2
3
2
Для определения аналитической чувствительности метода были приготовлены последовательные 10-кратные разведения плазмидной ДНК (pHCoV). Концентрацию плазмидной ДНК определяли при помощи коммерческого набора реагентов Quant-iT DNA HS (Invitrogen, США) и флуориметра QUBIT (Invitrogen, США). Аналитическая чувствительность разработанного метода с использованием внутренних праймеров для аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21 составила 1010 геномных эквивалентов (ГЭ). При постановке ПЦР в два раунда аналитическая чувствительность составила 10-10 ГЭ.
В таблице 1 представлено сравнение разработанной лабораторной ПЦР-РВ (заявляемое техническое решение) с «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL» для детекции аденовируса человека в образцах от 164 больных ОРВИ, собранные в эпидемический сезон 2011-2012 гг. в г.Новосибирске и Новосибирской области.
Таблица 1
Сравнительные данные разработанной лабораторной ПЦР-РВ (заявляемое техническое решение) с «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL»
Агент
«АмплиСенс»
Лабораторная ПЦР-РВ
Соотношение
Абсолютное число
%
Абсолютное число
%
Абсолютное число
%
Аденовирусы
1
0,6
6
3,7
-5
-3
У амплифицированных фрагментов ДНК аденовируса, полученных при исследовании клинических образцов от больных ОРВИ, были определены нуклеотидные последовательности. При последующем исследовании полученных нуклеотидных последовательностей было установлено наличие:
- 3 серотипа аденовируса человека в одном образце;
- 7 серотипов - в двух образцах;
- 14 серотипов - в 1 образце;
- 21 серотип аденовируса человека в двух образцах.
Сравнительные данные показали, что ПЦР-РВ (заявленное решение) по чувствительности превосходит «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL» на 3%.
Кроме того, с помощью олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченного зонда можно проводить исследование клинического материала методом «полувложенной» ПЦР. Наличие одного «внешнего» праймера позволяет кроме этого сократить стоимость проведения одного анализа. Представляемые к патентованию олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд позволяют выявить в образце ДНК аденовирусов серотипов 3, 4, 7, 14, 21 в режиме реального времени, а также амплифицировать фрагмент ДНК длиной в 951 пару оснований (п.о.), что позволяет секвенировать полученный ампликон, с которым можно проводить молекулярно-биологические работы, а следовательно, и более глубокое изучение свойства аденовируса.
Таким образом, рассчитанные и представляемые к патентованию олигодезоксинуклеотидные праймеры и ДНК-зонд обладают минимальной вырожденностью, а созданный на их основе набор обладает повышенной чувствительностью и специфичностью. Повышению чувствительности способствует и то, что предлагаемые к патентованию праймеры позволяют проводить двухраундовый ПЦР.
Разработанный набор позволяет выявить до 1000 копий молекулы ДНК при постановке ПЦР в один раунд и до 100 копий молекулы ДНК при постановке ПЦР в два раунда.