СИСТЕМА МАРКЕРОВ НА ОСНОВЕ ГРУППЫ ГЕНОВ МИКРОРНК ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО, ВКЛЮЧАЯ ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫЙ РАК И АДЕНОКАРЦИНОМУ
SYSTEM OF MARKERS BASED ON GROUP OF MICRORNA GENES FOR DIAGNOSTICS OF NON-SMALL-CELL LUNG CANCER INCLUDING EPIDERMOID CANCER AND ADENOCARCINOMA

Система маркеров на основе группы генов микроРНК для диагностики немелкоклеточного рака легкого, включая плоскоклеточный рак и аденокарциному.
Настоящее изобретение относится к области биомедицины, в частности молекулярной и клинической онкологии и молекулярной биологии, и касается системы маркеров для диагностики немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), путем оценки статуса метилирования генов микроРНК: miR-129-2, miR-125bl, miR-137 и miR-375. Выявление метилирования, по крайней мере, одного гена из заявленной системы маркеров в предположительно пораженной раком ткани человека, по сравнению со здоровой тканью легкого служит диагностическим признаком НМРЛ. Заявленная система маркеров на основе генов микроРНК позволяет с высокой частотой и специфичностью диагностировать НМРЛ, а именно плоскоклеточный рак легкого (ПРЛ) и аденокарциному легкого (АК), в том числе на ранних стадиях.
Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) - самый распространенный вид рака среди онкопатологий человека. Тяжесть заболевания и низкая выживаемость при раке легкого связаны, прежде всего, с поздним выявлением заболевания. При обнаружении опухолей легкого на 1-ой клинической стадии, уровень 5-летней выживаемости пациентов поднимается от 15% до 70%.
Отбор системы генов микроРНК, связанных с развитием опухолей и ассоциированных с CpG-островками, проводили с привлечением следующих баз данных: UCSC Genome Browser (hg 18 (http://genome.ucsc.edu/)), miRBase (http://www.mirbase.org/), MicroRNAdb (http://bioinfo.au.tsinghua.edu.cn/micrornadb/), miRDB (http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi), miRGen (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html), TargetScan (http://www.targetscan.org/), miR2Disease Base (http://www.mir2disease.org/), miRWalk (http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/), CpGcluster (http://bioinfo2.ugr.es/CpGcluster/). Отобранные микроРНК находятся на участках хромосом, часто вовлеченных в онкогенез, или связанных с генами, вовлеченными в онкогенез. Оценка статуса метилирования генов miR-129-2, miR-125b, miR-137 и miR-375 при НМРЛ позволила на их основе составить систему маркеров для диагностики этого заболевания. Сведений о выявлении метилирования этих генов при НМРЛ в источниках информации не обнаружено.
В качестве ближайшего аналога заявляемой системы маркеров рассмотрим систему маркеров на основе группы генов микроРНК: miR-34, miR-148 и miR-9 (WO 2010020787). Диагностика рака легкого осуществляется путем выявления метилирования или снижения экспрессии хотя бы в одном маркере этой системы. Значения клинической чувствительности и специфичности для данной системы не приведены.
Известные значения клинической чувствительности и специфичности для диагностики НМРЛ составляют 82% и 77% соответственно (WO 2011146937), которые достигаются путем анализа уровней экспрессии системы маркеров на основе группы генов микроРНК: miR-1254 и miR-574-5p.
Задача заявляемого изобретения - расширить арсенал маркеров на основе генов микроРНК для диагностики немелкоклеточного рака легкого, включая плоскоклеточный рак и аденокарциному. Задача решена путем:
- разработки системы маркеров на основе группы генов микроРНК: miR-129-2, miR-125b1, miR-137 и miR-375 - для диагностики немелкоклеточного рака легкого, включая плоскоклеточный рак и аденокарциному, путем выявления метилирования, по крайней мере, у одного гена из этой группы.
Диагностику НМРЛ осуществляют по следующему методу.
Берут образцы ткани легкого у лиц, обследуемых для выявления онкологического заболевания или с установленным диагнозом. Выделение и очистку ДНК из образцов ткани легкого проводят методом фенол-хлороформенной экстракции. Качество и точную концентрацию ДНК определяют спектрофотометрически по соотношению оптической плотности при длинах волн 260 и 280 нм. Далее проводят бисульфитную конверсию ДНК с последующей метилспецифичной ПЦР (МС-ПЦР) [4]. Для анализа метилирования каждой микроРНК методом МС-ПЦР используют две пары праймеров,  специфичных как к метилированному, так и  к неметилированному аллелю (Таблица 1). Продукты МС-ПЦР разделяют электрофорезом в 2% агарозном геле либо в 10% полиакриламидном геле (при длине продукта ПЦР менее 160 н.п.). Далее анализируют на наличие или отсутствие продуктов МС-ПЦР для праймеров, специфичных к метилированному и неметилированному аллелю. В качестве контролей для неметилированных аллелей используют образцы ДНК из лейкоцитов крови здоровых доноров. В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования используют препараты ДНК из лейкоцитов, обработанные метилтрансферазой SssI («СибЭнзим», Новосибирск). Соответствие фрагментов МС-ПЦР исследуемым генам проверяют прямым секвенированием обеих цепей продуктов МС-ПЦР. Диагностику НМРЛ осуществляют по наличию метилирования, по крайней мере, у одного маркера системы.
Пример 1. Определение набора праймеров для гена микроРНК miR-375.
Подбор праймеров для МС-ПЦР гена микроРНК miR-375 осуществляют с помощью программы Methyl Primer Express v.1.0 (Applied Biosystems, USA) со следующими параметрами: размер ампликонов 100-200 пар оснований, от 4 до 7 CpG-динуклеотидов на пару праймеров, от 4 до 10 цитозиновых остатков, не входящих в CpG-динуклеотиды, разница в температурах плавления праймеров в паре не более 5 градусов. Первоначальные варианты пар праймеров проверены на образование димеров и вторичных структур с помощью программы Vector NTI v.10.0 (Invitrogen, USA). В результате получен заявляемый набор праймеров для гена микроРНК miR-375, который приведен в таблице 1.
Пример 2. Диагностика НМРЛ, включая ПРЛ и АК.
Для 39 пациентов с морфологически установленным диагнозом - НМРЛ, включая 26 пациентов с ПРЛ и 13 с АК, и 20-ти доноров, онкологически здоровых в анамнезе, проведен анализ метилирования заявляемой системы маркеров (таблица 2, 3). В случае ПРЛ диагноз подтвержден у 24 из 26 пациентов, что соответствует 92% случаев. В случае АК диагноз подтверждается для 11 из 13 пациентов, что соответствует 85% случаев (таблица 4). Причем заявляемая система маркеров позволяет диагностировать АК и ПРЛ на самых ранних клинических стадиях. Так, на I и II клинических стадиях АК выявляют в 78% случаев, а ПРЛ - в 89% случаев. На поздних клинических стадиях (III и IV) использование заявляемой системы маркеров позволяет выявить АК и ПРЛ в 100% случаев (таблица 4). Для 20 доноров заявляемая система выявляет метилирование в двух образцах хотя бы по одному маркеру, что соответствует 10% (таблица 3). На основании этих данных можно утверждать о возможности использовать заявляемую систему маркеров для диагностики НМРЛ, включая ПРЛ и АК.
Пример 3. Оценка чувствительности и специфичности заявляемой системы маркеров.
Важным свойством заявляемой системы маркеров является высокая клиническая чувствительность и специфичность при диагностике НМРЛ. Наличие метилирования, по крайней мере, у одного маркера системы генов  микроРНК  выявлена у 35 из 39 пациентов с НМРЛ (90% случаев) и у двух из 20 доноров, онкологически здоровых в анамнезе (10% случаев). На основании этих данных клиническая чувствительность и специфичность заявляемой системы маркеров, рассчитанная методом ROC-анализа, составляют 90% и 90% соответственно. Таким образом, заявляемая система маркеров позволяет диагностировать НМРЛ у пациентов истинно больных данным онкозаболеванием с высокой (в 90% случаев) клинической чувствительностью.
Заявляемая система маркеров для диагностики НМРЛ характеризуется следующим.
1. Обладает клинической чувствительностью 90% и специфичностью 90%, что превосходит известные значения: 82% и 77% (WO 2011146937).
2. Позволяет диагностировать два наиболее распространенных вида НМРЛ - плоскоклеточный рак и аденокарциному на самых ранних клинических стадиях с высокой клинической чувствительностью (до 90%) и специфичностью (до 90%).
3. Позволяет осуществить диагностику в стандартизованных условиях (таблица 1) с использованием недорогих приборов отечественного производства.
Таблица 1.
Характеристика праймеров, условий<sup>5</sup> и продуктов МС-ПЦР
Название гена и источник праймеров
Структура праймеров
Продукт ПЦР, п.н.
miR-129-2<sup>1</sup>
MF1:GATTTTAGTTCGTATTAATGAGTTGGCGGTTTCMR1:AACCCCGACTACAAAATCGCG
210
UF1:TGATTTTAGTTTGTATTAATGAGTTGGTGGTTTTG UR1:АССААССССААСТАСААААТСАСА
210
miR-125b1<sup>2</sup>
MF2:TGGTGTATCGTTTTTTGTTTTC MR2:ACCCATTCGAAACGAAAC
190
UF2:ATTTGGTGTATTGTTTTTTGTTTTTUR2:СТСАСССАТТСААААСААААС
190
miR-137<sup>3</sup>
MF3:TTTTGATTTTTTTCGGTGAC MR3:TACCGCTAATACTCTCCTCG
98
UF3:TTTTTTGATTTTTTTTGGTGAT UR3:CTACCACTAATACTCTCCTCAA
98
miR-375<sup>4</sup>
MF4:TCGTTATCGTTATTTTAATCGTACGMR4:AAAAATTTCTATTCTAAACCACGAC
200
UF4:TGTTATTGTTATTTTAATTGTATGGUR4:AAAAATTTCTATTCTAAACCACAAC
199
Примечания:
<sup>1</sup>[1]
<sup>2</sup>[2]
<sup>3</sup>[3]
<sup>4</sup>Подобраны авторами с использованием известных программ (Methyl Primer Express v.1.0, Vector NTI v.10.0 и т.п.)
Таблица 2.
Сопоставление данных по метилированию генов, входящих в заявляемую систему маркеров, с клинико-гистологическими характеристиками образцов от 39 пациентов с НМРЛ
№ образца
Ген микроРНК
Клиническая стадия
Степень анаплазии
Возраст/Пол
Стадия по классификации TNM
miR-129-2
miR-125b1
miR-137
miR-375
Аденокарцинома легкого
842
+
+
-
+
IV
md
72/M
T2N2M1
882
+
-
-
-
III
Id
36/M
T4N2M0
791
+
+
+
+
III
Id
54/Ж
T3N1M0
850
+
+
+
+
III
md
61/Ж
T2N2M0
895
-
-
-
+
II
md
50/Ж
T2N0M0
848
+
+
+
-
I
md
54/М
T2N0M0
835
+
-
-
-
I
md
55/М
T2N0M0
806
-
-
-
-
I
md
59/М
T2N0M0
854
-
+
+
+
I
md
61/Ж
T2N0M0
776
+
-
+
+
I
md
58/Ж
T1N0M0
804
-
+
-
+
I
md
68/Ж
T1N0M0
883
-
+
-
-
I
hd
47/Ж
T1N0M0
838
-
-
-
-
I
hd
70/Ж
T1N0M0
Таблица 2.
(продолжение)
№ образца
Ген микроРНК
Клиническая стадия
Степень анаплазии
Возраст/Пол
Стадия по классификации TNM
miR-129-2
miR-125b1
miR-137
miR-375
Плоскоклеточный рак легкого
852
+
+
+
+
III
Id
77/M
T4N2M0
384
-
-
+
+
III
Id
67/M
T3N0M0
815
-
+
-
-
III
md
56/М
T3N2M0
831
+
+
+
+
III
md
65/М
T3N2M0
851
-
+
-
+
III
md
59/М
T2N2M0
391
+
+
+
+
III
md
67/М
T3N0M0
534
+
+
-
+
III
md
40/М
T3N1M0
833
+
+
+
-
III
md
59/М
T1N2M0
844
-
+
+
+
II
Id
62/М
T3N0M0
817
+
+
-
+
II
Id
58/М
T3N0M0
709
-
+
-
+
II
Id
39/М
T2N1M0
808
+
-
-
+
II
Id
63/М
T2N1M0
816
-
+
-
+
II
md
71/М
T2N1M0
830
-
+
+
+
II
md
47/Ж
T2N1M0
832
-
-
-
+
II
md
58/М
T2N1M0
378
+
+
-
+
II
md
64/М
T1N1M0
№ образца
Ген микроРНК
Клиническая стадия
Степень анаплазии
Возраст/Пол
Стадия по классификации TNM
miR-129-2
miR-125b1
miR-137
miR-375
Плоскоклеточный рак легкого
587
-
-
-
-
II
md
45/Ж
T2N1M0
840
-
+
-
-
II
md
51/Ж
T3N0M0
847
+
-
-
-
I
md-Id
51/М
T2N0M0
856
-
+
-
+
I
Id
69/М
T2N0M0
819
-
-
+
+
I
md
67/Ж
T2N0M0
843
+
+
+
-
I
md
807М
T2N0M0
934
-
-
+
-
I
md
57/М
T2N0M0
855
-
+
+
-
I
md
69/М
T2N0M0
778
-
-
-
-
I
hd
67/М
T2N0M0
513
<sup>+</sup>
+
-
+
I
hd
62/М
T2N0M0
Таблица 3.
Данные по метилированию генов, входящих в заявляемую систему маркеров в образцах, выделенных из ткани легкого 20-ти доноров, онкологически здоровых в анамнезе
№ образца
Ген микроРНК
miR-129-2
miR-125b1
miR-137
miR-375
Онкологически здоровые в анамнезе доноры (нормальная ткань легкого)
1
-
-
-
-
2
-
-
-
-
3
-
-
-
-
4
-
-
-
-
5
-
-
-
-
6
-
-
-
-
7
-
-
-
-
8
-
-
-
-
9
-
-
-
-
10
-
-
-
-
11
-
-
-
-
12
-
-
-
-
13
-
-
-
-
14
-
-
-
-
15
-
-
-
-
16
-
-
-
-
17
-
-
-
-
18
-
-
-
-
19
-
+
-
+
20
-
-
-
+
Таблица 4.
Частота метилирования, чувствительность и специфичность заявляемой системы маркеров на разных клинических стадиях НМРЛ.
Пациенты с НМРЛ
Аденокарцинома легкого (АК)
Плоскоклеточный рак легкого (ПРЛ)
НМРЛ (АК + ПРЛ)
Тотально (I, II, III, IV клинические стадии)
85% (11/13)
92% (24/26)
90% (35/39)
Только ранние клинические стадии (I, II)
78% (7/9)
89% (16/18)
85% (23/27)
Только поздние клинические стадии (III, IV)
100% (4/4)
100% (8/8)
100% (12/12)
Чувствительность
85%
92%
90%
Специфичность
90%
90%
90%
Цитированные источники научно-технической информации
1. Bandres Е., Agirre X., Bitarte N., Ramirez N., Zarate R., Roman-Gomez J., Prosper F., Garcia-Foncillas J. 2009. Epigenetic regulation of microRNA expression in colorectal cancer. Int J Cancer. 125, 2737-2743.
2. Ernesto Soto-Reyes, Rodrigo Gonzblez-Barrios, Fernanda Cisneros-Soberanis, Roberto Herrera-Goepfert, Vyctor Perez, David Cant, Diddier Prada, Clementina Castro, Felix Recillas-Targa and Luis A Herrera. Disruption of CTCF at the miR-125b1 locus in gynecological cancers. BMC Cancer. 2012-12:40.
3. Balaguer F., Link A., Lozano J.J., Cuatrecasas M., Nagasaka T., Boland R.C. and Goel A. Epigenetic silencing of miR-137 is an early event in colorectal carcinogenesis. Cancer Res. 2010 August 15; 70(16)-6609-6618.
4. Ходырев Д.С., Пронина И.В., Рыков С.В., Береснева Е.В., Фридман М.В., Казубская Т.П., Логинов В.И., Брага Э.А. 2012. Метилирование группы генов микроРНК вовлечено в регуляцию экспрессии генов-мишеней RAR-beta2 и NKIRAS1 при раке легкого. Молекулярная биология 46, 773-785.