МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ С ИЗБЕЖАНИЕМ ОБРАЗОВАНИЯ ДИМЕРОВ ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ МНОЖЕСТВЕННЫХ ЦЕЛЕВЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

1. Способ, включающий следующие стадии:
осуществление обратной транскрипции по меньшей мере одной первой цепи кДНК (комплементарная ДНК) с мРНК (матричная РНК), содержащей по меньшей мере одну целевую последовательность, с использованием смеси обратных праймеров, с образованием по меньшей мере одной одноцепочечной кДНК;
где смесь обратных праймеров содержит по меньшей мере один обратный праймер с конфигурацией для включения сайта связывания с обратным общим праймером в каждую первую цепь кДНК;
осуществление селекции каждой одноцепочечной кДНК;
синтезирование по меньшей мере одной второй цепи кДНК с каждой из по меньшей мере одной первой цепи кДНК с использованием смеси прямых праймеров, с образованием по меньшей мере одного комплекса первая цепь : вторая цепь;
где смесь прямых праймеров содержит по меньшей мере один прямой праймер, причем каждый прямой праймер имеет конфигурацию для связывания с конкретной первой цепью кДНК и для включения сайта связывания с прямым общим праймером в каждую вторую цепь кДНК;
осуществление селекции каждого комплекса первая цепь : вторая цепь;
осуществление амплификации цепей кДНК с использованием обратного общего праймера, который связывается с по меньшей мере одним сайтом связывания с обратным общим праймером, и с использованием прямого общего праймера, который связывается с по меньшей мере одним сайтом связывания с прямым общим праймером; и
осуществление селекции амплифицированных цепей кДНК.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию амплификации амплифицированных цепей кДНК с использованием обратного общего праймера, который связывается с по меньшей мере одним сайтом связывания с обратным общим праймером, и с использованием прямого общего праймера, который связывается с по меньшей мере одним сайтом связывания с прямым общим праймером.
3. Способ по п. 1, в котором смесь обратных праймеров содержит по меньшей мере один обратный праймер, где данный по меньшей мере один обратный праймер содержит дополнительные нуклеотиды, которые включаются в каждую первую цепь кДНК в качестве идентифицирующего маркера.
4. Способ по п. 1, в котором смесь прямых праймеров содержит по меньшей мере один прямой праймер, где данный по меньшей мере один прямой праймер содержит дополнительные нуклеотиды, которые включаются в каждую вторую цепь кДНК в качестве идентифицирующего маркера.
5. Способ по п. 1, в котором каждая селекция включает отделение цепей кДНК от смеси праймеров с использованием магнитных шариков.
6. Способ по п. 1, в котором каждая селекция включает отделение цепей кДНК от смеси праймеров посредством очистки на колонке.
7. Способ по п. 1, в котором каждая селекция включает ферментативное расщепление смеси праймеров.
8. Способ по п. 1, в котором одноцепочечная кДНК содержит комплекс одноцепочечная кДНК : РНК.
9. Способ диагностирования наличия заболевания у субъекта, включающий:
предоставление образца от субъекта с подозрением на содержание возбудителя заболевания, где возбудитель заболевания характеризуется целевой последовательностью;
осуществление способа по п. 1 на нуклеиновых кислотах в образце;
секвенирование амплифицированных цепей ДНК; и
выявление целевой последовательности от возбудителя заболевания.
10. Способ получения профиля иммунного статуса для субъекта, включающий:
осуществление способа по п. 1 на нуклеиновых кислотах из образца лейкоцитов от субъекта;
секвенирование амплифицированных цепей ДНК; и
идентификацию и количественную оценку одной или более последовательностей ДНК, представляющих Т-клеточный рецептор, антитело и перестройки ГКГС (главный комплекс гистосовместимости), с созданием профиля иммунного статуса субъекта.
11. Способ по п. 1, в котором мРНК получают из одной клетки.
12. Способ, включающий следующие стадии:
осуществление синтеза по меньшей мере одной первой цепи ДНК с геномной ДНК, содержащей по меньшей мере одну целевую последовательность, с использованием смеси первых праймеров, с образованием комплекса первая цепь: ДНК;
где смесь первых праймеров содержит по меньшей мере один первый праймер, причем каждый первый праймер имеет конфигурацию для связывания с конкретной целевой последовательностью и для включения в каждую первую цепь ДНК сайта связывания с первым общим праймером;
осуществление селекции каждого комплекса первая цепь : ДНК;
осуществление синтеза по меньшей мере одной второй цепи ДНК с каждой из по меньшей мере одной первой цепи ДНК с использованием смеси вторых праймеров, с образованием комплекса первая цепь : вторая цепь;
где смесь вторых праймеров содержит по меньшей мере один второй праймер, причем каждый второй праймер имеет конфигурацию для связывания с конкретной первой цепью ДНК и для включения в каждую вторую цепь ДНК сайта связывания со вторым общим праймером;
осуществление селекции каждого комплекса первая цепь: вторая цепь;
осуществление амплификации цепей ДНК с использованием первого общего праймера, который связывается с по меньшей мере одним сайтом связывания с первым общим праймером, и с использованием второго общего праймера, который связывается с по меньшей мере одним сайтом связывания со вторым общим праймером; и
осуществление селекции амплифицированных цепей ДНК.
13. Способ по п. 12,
в котором смесь первых праймеров представляет собой смесь обратных праймеров, где каждый первый праймер представляет собой обратный праймер, где каждый первый общий праймер представляет собой обратный общий праймер и где каждый сайт связывания с первым общим праймером представляет собой сайт связывания с обратным общим праймером; и
при этом смесь вторых праймеров представляет собой смесь прямых праймеров, где каждый второй праймер представляет собой прямой праймер, где каждый второй общий праймер представляет собой прямой общий праймер и где каждый сайт связывания со вторым общим праймером представляет собой сайт связывания с прямым общим праймером.
14. Способ по п. 12,
в котором смесь первых праймеров представляет собой смесь прямых праймеров, где каждый первый праймер представляет собой прямой праймер, где каждый первый общий праймер представляет собой прямой общий праймер и где каждый сайт связывания с первым общим праймером представляет собой сайт связывания с прямым общим праймером; и
при этом смесь вторых праймеров представляет собой смесь обратных праймеров, где каждый второй праймер представляет собой обратный праймер, где каждый второй общий праймер представляет собой обратный общий праймер и где каждый сайт связывания со вторым общим праймером представляет собой сайт связывания с обратным общим праймером.
15. Способ по п. 12,
в котором смесь первых праймеров представляет собой смесь праймеров, содержащую по меньшей мере один прямой и по меньшей мере один обратный праймер, при этом каждый первый праймер представляет собой прямой или обратный праймер, каждый первый общий праймер представляет собой прямой или обратный общий праймер и каждый сайт связывания с первым общим праймером представляет собой сайт связывания с прямым или обратным общим праймером; и
при этом смесь вторых праймеров содержит по меньшей мере один прямой и по меньшей мере один обратный праймер, где ни прямой, ни обратный праймер в смеси вторых праймеров не включен в смесь первых праймеров, при этом каждый второй общий праймер представляет собой прямой или обратный общий праймер и каждый сайт связывания со вторым общим праймером представляет собой сайт связывания с прямым или обратным общим праймером.
16. Способ по п. 12, дополнительно включающий стадию амплификации амплифицированных цепей ДНК с использованием обратного общего праймера, который связывается по меньшей мере с одним сайтом связывания с обратным общим праймером, и с использованием прямого общего праймера, который связывается с по меньшей мере одним сайтом связывания с прямым общим праймером.
17. Способ по п. 12, в котором праймеры в смеси первых праймеров содержат дополнительные нуклеотиды, которые включаются в каждую первую цепь ДНК в качестве идентифицирующего маркера.
18. Способ по п. 12, в котором праймеры в смеси вторых праймеров содержат дополнительные нуклеотиды, которые включаются в каждую вторую цепь ДНК в качестве идентифицирующего маркера.
19. Способ по п. 12, в котором каждая селекция включает отделение цепей ДНК от смеси праймеров с использованием магнитных шариков.
20. Способ по п. 12, в котором каждая селекция включает отделение цепей ДНК от смеси праймеров посредством очистки на колонке.
21. Способ по п. 12, в котором каждая селекция включает ферментативное расщепление смеси праймеров.
22. Способ по п. 12, в котором геномную ДНК получают из одной клетки.
23. Способ диагностирования наличия заболевания у субъекта, включающий:
предоставление образца от субъекта с подозрением на содержание возбудителя заболевания, где возбудитель заболевания характеризуется целевой последовательностью;
осуществление способа по п. 12 на нуклеиновых кислотах в образце;
осуществление секвенирования амплифицированных цепей ДНК; и
выявление целевой последовательности от возбудителя заболевания.
24. Способ получения профиля иммунного статуса для субъекта, включающий:
осуществление способа по п. 12 на нуклеиновых кислотах из образца лейкоцитов от субъекта;
секвенирование амплифицированных цепей ДНК; и
идентификацию и количественную оценку одной или более последовательностей ДНК, представляющих Т-клеточный рецептор, антитело и перестройки ГКГС, с созданием профиля иммунного статуса субъекта.