Экотоксикологическая оценка влияния фторидов на динамику линейного роста почвенных микроорганизмов

УДК 631.4

ЭКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ФТОРИДОВ НА ДИНАМИКУ ЛИНЕЙНОГО РОСТА ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

О. А. Берсенева

Иркутский государственный университет, г. Иркутск

ECOTOXICOLOGICAL ASSESSMENT OF THE IMPACT OF FLUORIDES ON THE DYNAMICS OF THE LINEAR GROWTH OF SOIL MICROORGANISMS

О. A. Berseneva

Irkutsk State University, Irkutsk

В статье дана оценка степени токсического действия фторида натрия на почвенную микробиоту. Определен уровень чувствительности микроорганизмов к фторид-иону по наличию и отсутствию роста на агаризованной среде LB, а также по диаметру колоний. Показана возможность применения синэкологических показателей (линейный рост микроорганизмов, диаметр колоний) для оценки степени загрязнения почв фторидом натрия. Методом накопления частот проведена количественная оценки устойчивости микроорганизмов к фторидам, на основании вычисления которого подсчитан эффект от каждой дозы в процентах. Определена концентрации фторидов, вызывающая снижение диаметра колоний микроорганизмов на 50 % (LD 50). Изучение влияния фторид иона в модельных экспериментах на почвенное микробное сообщество показало, что по отношению к фторид-иону исследуемые микроорганизмы можно разделить на 4 группы: абсолютно не резистентные виды, среднечувствительные резистентные и высокорезистентные виды с пределом резистентности 25; 100; 250 и 500 мг/кг соответственно. Самыми устойчивыми из выявленных культур оказались Pénicillium sp., Bacillus sp., Bacillus megaterium, линейный рост колоний которых снижается на 50 % при концентрации фторида, равной 350; 400 и 430 мг/кг соответственно. Установлено, что минимально действующей концентрацией фторид-иона для серой лесной почвы, до которой не происходит нарушений видовой структуры микробного сообщества является концентрация F" 10 мг/кг Дальнейшее повышение уровня загрязнения фторидами серой лесной почвы ведет к обеднению видового разнообразия и замедлению линейного роста колоний.

Ключевые слова: почва, микроорганизмы, диаметр колоний, фторид натрия, LD 50, метод накопления частот.

The article assesses the degree of the toxic effect of sodium fluoride on soil microbiota. The level of sensitivity of the microorganisms to fluoride ion depending on the presence and absence of growth on an agar medium LB, as well as the diameter of the colonies, is determined. The article shows the possibility of using synecological performance (linear growth of microorganisms, the diameter of the colonies) to assess the degree of contamination of soils with sodium fluoride. Quantification of microbial resistance to fluorides was held through the frequency accumulation method. Based on this method, the effect of each dose is calculated in percentage. The concentration of fluoride, causing a reduction in the diameter of microbial colonies on 50 % (LD 50) is detected. The study of the effect of fluoride ion on soil microbial community in the model experiments showed that bacteria in the study can be divided into 4 groups with respect to the fluoride ion: totally resistant species of medium-sensitive, resistant and highly resistant species to limit resistance 25; 100; 250 and 500 mg/kg, respectively. The most stable of the identified crops were Penicillium sp, Bacillus sp, Bacillus mega-terium, linear growth of the colonies is reduced by 50 % with a fluoride concentration of 350; 400 and 430 mg/kg, respectively. It was found that the minimum concentration of fluoride ion current for gray forest soil, to which there is no violation of the species structure of the microbial community is the concentration of F" 10 mg/kg. A further increase in the level of contamination by fluorides gray forest soil leads to the impoverishment of species diversity and slowing linear growth of the colonies.

Keywords: soil, microorganisms, diameter of the colonies, sodium fluoride, LD 50, method of frequency accumulation.

Ежегодно в связи с мощным развитием химического производства происходит техногенное загрязнение почв, что непосредственно отражается на качестве и безопасности сельхозпродукции,

представляя серьезную опасность здоровью людей. Из существующих загрязняющих веществ химического производства, аккумулирующихся в почве, особую опасность представляют соединения

© Берсенева О. А., 2017

Вестник Марийского государственного университета Серия «Сельскохозяйственные науки. Экономические науки». 2017. Т. 3. № 1

фтора. Известно, что плодородие почвы и продуктивность сельскохозяйственных культур напрямую зависит от деятельности почвенных микробных сообществ [1].

В связи с этим остро ощущается потребность в постановке модельных лабораторных опытов для определения степени токсического воздействия фторидов на почвенные микроорганизмы [1; 2].

Материалы и методы

В лабораторных экспериментах по исследованию токсичности фторид-иона на почвенные микроорганизмы использовали серую лесную почву с естественным содержанием фторидов из разреза, заложенного в 25 км от ОАО «ИркАЗ-РУСАЛ» (Иркутская область) по факелу выброса [1; 2; 3; 4].

Отбор образцов почвы был проведен в середине вегетационного периода (конец июня), поскольку именно в этот период отмечается наибольшая активность почвенной микробиоты. Пробы отбирали методом конверта из верхнего слоя почвы до глубины 10 см при соблюдении условий максимальной стерильности [1; 2; 3].

Почва опытов имела следующие химические характеристики: Гумус - 3,41±0,26; рН Н20 -7,1±1,37; К2О - 197,5±12,6 мг/кг; Р2О5 -433,8±17,8 мг/кг; содержание валовых форм 2п -15,8±1,78 мг/кг; Cd - 0,18±0,05 мг/кг; № -10,5±1,88 мг/кг; РЬ - 8,66±0,48 мг/кг; содержание водорастворимых фторидов - 9,8±1,5 мг/кг [1; 3]. При предельно допустимой концентрации фторидов для почв 10 мг/кг [9].

Предназначенную для исследования почву высушивали до воздушно-сухого состояния, предварительно отделяли от крупных частиц и просеивали через сито диаметром 1 мм [1; 2; 7].

Для определения предельной концентрации фторида использовали ряд последовательно возрастающих концентраций токсиканта, который вносили в почвенные образцы [1; 2]:

№ образца 1 2 3 4 5 6 7 8

Концентрация NaF, мг/кг серой лесной почвы конт роль 10 25 50 100 250 500 1000

Контролем служила серая лесная почва с естественным содержанием фторидов. Каждый образец анализировали в трех повторностях. Минимальное количество вносимого фторида натрия соответствовало предельно допустимой концентрации для почв - 10 мг/кг [9].

Подготовленные таким образом образцы почвы (каждый весом 25 г) инкубировали в чашках

Петри при температуре 30 °С и влажности 60 % от полной влагоемкости [1].

Через четырнадцать суток экспонирования готовили почвенное разведение, характерное для каждой группы микроорганизмов с последующим высевом почвенной суспензии на среду LB следующего состава г/л: пептон - 10; дрожжевой экстракт - 5; NaCl - 10; агар-агар - 15. Культивирование микромицетов и актиномицетов осуществляли 14 суток, бактерий 4 суток [1; 2]. Определение культур бактерий и актиномицетов проводили, руководствуясь определителем Бер-джи [1; 2; 6]. Видовое разнообразие микромице-тов определяли, используя принятые в микологии определители [1; 2; 4; 10].

Уровень чувствительности микроорганизмов к фторид-иону оценивали по наличию или отсутствию роста на данной агаризованной среде, а также по диаметру колоний.

Для количественной оценки устойчивости микроорганизмов к фторидам использовали метод накопления частот [5; 8], на основании вычисления которого подсчитывали эффект от каждой дозы в процентах и строили характеристическую кривую в координатах:

N = f([F-]) и D = f([F-]),

где N - численность почвенных микроорганизмов (КОЕ/г а. с. п.);

D - средний диаметр колоний (мм);

[F-] - концентрация фторида натрия в почве (мг/кг).

Определение концентрации фторидов, вызывающей снижение числа колоний (или их диаметра) на 50 %, проводили по характеристической кривой [1; 2].

Все опыты проводили в трех повторностях. Для полученных данных рассчитывалось стандартное отклонение с помощью пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2007».

Результаты и обсуждение

В ходе исследований из контрольной почвы было выделено несколько таксономических групп микроорганизмов:

• 8 видов микромицетов, относящихся к родам Mucor, Alternaria, Pénicillium, Trichoderma, Rhizopus;

• актиномицеты рода Streptomyces;

• бактерии родов Bacillus и Pseudomonas [1; 2; 4].

Результаты, полученные при исследовании

влияния поллютанта на видовую структуру микроценоза, которая анализировалась по динамике линейного роста видов при разных концентрациях фторида, приведены в таблице 1 [1; 2].

Во всех вариантах опыта с увеличением концентрации фторид-иона отмечается достоверное уменьшение диаметра колоний, что является результатом торможения скорости роста микроорганизмов [1; 2].

Из таблицы видно, что различия в антропото-лерантности представителей почвенной микро-

При концентрации фторида натрия 50 мг/кг не выявляются микромицеты видов: Trichoderma viride, Mucor sp., Rhizopus sp., Alternaria sp. Почвенные микромицеты, устойчивые к содержанию токсиканта в концентрации 100 мг/кг почвы, представлены родом Penicillium и видом Trichoderma koningii.

В составе микробного комплекса почвы, загрязненной фторидом натрия в количестве 100 мг/кг почвы, появляются виды микроскопических грибов р.Aspergillus (Aspergillus niger и Aspergillus fla-vus), не обнаруженные в контрольной почве (рис. 1).

Очевидно, что данная концентрация фторида вызвала адаптивную перегруппировку структуры микросообщества с появлением видов толерантных к высоким концентрациям данного токсиканта. Такие изменения развития популяций микро-

биоты (микромицеты, бактерии, актиномицеты) привели к нарушению структуры микробного сообщества почвы. Гомеостаз структуры микробного сообщества в серой лесной почве нарушается уже при концентрации фторид иона 25 мг/кг почвы. Из состава почвенного микробоценоза выпадают актиномицеты.

организмов в почве отражают появление зоны резистентности почвенной микробиоты [1; 2].

Обработка почвы фторидом натрия в концентрации 250 мг/кг сопровождается снижением разнообразия микромицетов: в ней обнаруживаются только виды РешсШшт sp. и РешсШшт &шси^ит [1; 2].

В бактериальной флоре преобладают палочковидные формы, как образующие споры, так и ас-порогенные. Спорообразующие бактерии проявляют большую устойчивость к загрязнению почвы фторидом натрия по сравнению с аспорогенны-ми. При концентрации 500 мг/кг F- на четвертые сутки роста из бактериальной флоры обнаружены только споры бактерий (рис. 2), вегетативные клетки не обнаружены, что объясняется токсическим действием фторид-иона на вегетативные

Влияние фторид-иона на динамику линейного роста почвенных микроорганизмов [1; 2]

Микросообщество Концентрация NaF, мг/кг

0 10 25 50 100 250 500 1000

Диаметр колоний на среде LB, мм

Penicillium sp. 10,2+1,6 9,6+2,8 9,4+1,3 8,7+1,8 8,4+2,6 8,1+4,6 5,2+0,7 -

Penicillium funiculosum 12,5+0,6 12,2+2,6 10,1+0,7 8,5+0,6 6,6+1,4 6,1+0,7 5,2+0,94 -

Trichoderma koningii 13,5+2,6 10,7+1,9 9,4+2,6 9,2+1,56 7,7+2,7 6,8+2,9 - -

Penicillium velutinum 9,8+1,91 9,5+1,64 7,3+1,84 6,9+2,2 4,7+0,7 - - -

Trichoderma viride 14,4+2,7 11,3+4,0 8,7+2,2 - - - - -

Rhizopus sp. 12,6+1,6 11,5+0,8 9,3+0,4 - - - - -

Mucor sp. 12,3+2,9 11,5+0,8 8,6+1,35 - - - - -

Alternaria sp. 7,8+1,4 6,9+1,9 6,3+2,6 - - - - -

Streptomyces sp. 7,1+0,24 2,9+1,3 - - - - - -

Bacillus sp. 10,7+2,4 10,5+2,0 9,8+1,4 9,4+3,3 8,8+0,7 8,5+1,7 7,6+1,7 -

Bacillus megaterium 10,2+1,8 9,7+2,1 9,0+1,3 8,4+2,3 8,0+0,9 7,3+1,4 6,2+1,3 -

Pseudomonas sp. 9,3+1,9 9,1+2,9 7,9+1,7 7,3+0,7 6,8+2,1 - - -

Aspergillus niger - - - - 18,1+2,0 10,2+1,6 - -

Aspergillus flavus - - - - 15,2+1,4 8,4+2,7 - -

Примечание: «-» - рост не обнаружен.

Вестник Марийского государственного университета Серия «Сельскохозяйственные науки. Экономические науки». 2017. Т. 3. № 1

клетки бактерий и сохранением спор бацилл, устойчивых к неблагоприятным условиям [1; 2].

Методом накопления частот была определена токсичность фторида натрия (по LD 50), в качестве критерия токсичности использовали линейный рост микроорганизмов (рис. 3) [1; 2].

Данные рисунка 3 свидетельствуют о различной экологической валентности к фториду почвенных микроорганизмов. По отношению к фторид-иону, выделенные культуры можно разделить на 4 группы: абсолютно не резистентные виды, виды с низкой чувствительностью, среднечувствительные и устойчивые (резистентные) виды [1; 2].

х 600

х 600

Рис. 2. Bacillus sp. на 24 сутки роста х 1350 [1; 2]

Рис. 1. Микроскопические грибы: А - А. mger; B - А. йа'уш, выделенные из серой лесной почвы, при концентрации фторид-иона 100 мг/кг [1; 2]

Рис. 3. Токсичность NaF (LD 50) по динамике линейного роста микроорганизмов [1; 2]

К первой группе можно отнести актиномице-ты вида Streptomyces sp. и гриб Trichoderma viride предел их экологической валентности от 0 до 25 мг/кг F".

У грибов Alternaría sp., Rhizopus sp. и Mucor sp. выявлена низкая чувствительность к воздействию фторидов. Линейный рост колоний данных видов замедляется на 50 % при концентрации фторида натрия 30 мг/кг. Среднюю чувствительность к действию фторид-иона проявляют виды Trichoderma koningii, Penicillium velutinum, Penicillium funicu-losum и Pseudomonas sp. Порог их толерантности к фториду составляет от 100-150 мг/кг F". Самыми устойчивыми из выявленных культур оказались

Penicillium sp., Bacillus sp., Bacillus megaterium, линейный рост колоний, которых снижается на 50 % при концентрации фторида, равной 350; 400 и 430 мг/кг соответственно [1; 2].

По результатам модельного эксперимента установлено, что минимально действующей концентрацией фторид-иона для серой лесной почвы, до которой не происходит нарушений видовой структуры микробного сообщества, является концентрация F" 10 мг/кг [1; 2]. Последующее увеличение концентрации фторида натрия в серой лесной почве способствует снижению числа видов в микробном сообществе и замедлению роста колоний.

A

Литература

1. Берсенева О. А. Эколого-микробиологическая характеристика наземных экосистем в районе предприятий алюминиевой промышленности: дис. ... канд. биол. наук. Улан-Удэ, 2010. 148 с.

2. Берсенева О. А. Эколого-микробиологическая характеристика наземных экосистем в районе предприятий алюминиевой промышленности: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Улан-Удэ, 2010. 27 с.

3. Берсенева О. А., Саловарова В. П. О некоторых экологических направлениях диагностики почв в зоне влияния химических производств // Известия Иркутского государственного университета. Серия: Биология. Экология. 2014. № 10. С. 58-63.

4. Берсенева О. А., Саловарова В. П. Воздействие выбросов металлургических производств на почвенные микробиоценозы // Известия иркутского государственного университета. Серия: Биология. Экология. 2011. № 4. С. 18-24.

5. Биодиагностика и оценка качества природной среды: подходы, методы, критерии и эталоны сравнения в экотоксико-логии // Материалы международного симпозиума и школы, МГУ, 25-28 октября 2016 г. М.: ГЕОС, 2016. 434 c.

6. Берджи. Определитель бактерий: в 2 т. М.: Мир, 1997. 432 с.

7. Муха В. Д., Муха Д. В., Ачкасов А. Л. Практикум по агрономическому почвоведению: учебное пособие. СПб.: Лань, 2013. 448 с.

8. Рекомендации по статистической обработке результатов экспериментально-токсикологических исследований. М.: Институт гигиены труда и проф. заболеваний АМН СССР, 1965. 80 с.

9. Санпин 2.1.7.573-96. Почва. Очистка населенных мест. Бытовые и промышленные отходы. Санитарная охрана почвы. Гигиенические требования к использованию сточных вод и их осадков для орошения и удобрения.

10. Watanabe T. Pictorial atlas of soil and seed fungi: Morphologies of cultured fungi and key to species. Florida, 2000. рр. 411-415.

References

1. Berseneva O. A. Jekologo-mikrobiologicheskaja harakteristika nazemnyh jekosistem v rajone predprijatij aljuminievoj promyshlennosti [Ecological and microbiological characteristics of terrestrial ecosystems in the vicinity of the aluminum industry enterprises]: dis. ... kand. biol. nauk, Ulan-Udje, 2010, 148 p.

2. Berseneva O. A. Jekologo-mikrobiologicheskaja harakteristika nazemnyh jekosistem v rajone predprijatij aljuminievoj promyshlennosti [Ecological and microbiological characteristics of terrestrial ecosystems in the vicinity of the aluminum industry enterprises]: avtoref. dis. ... kand. biol. nauk, Ulan-Udje, 2010, 27 p.

3. Berseneva O. A., Salovarova V. P. O nekotoryh jekologicheskih napravlenijah diagnostiki pochv v zone vlijanija himicheskih proizvodstv [Some environmental soil diagnostic areas in the zone of chemical production], Izvestija irkutskogo gosudarstvennogo universiteta. Serija: Biologija. Jekologija = Proceedings of the Irkutsk State University. Series: Biology Ecology, 2014, по. 10, рр. 58-63.

4. Berseneva O. A., Salovarova V. P. Vozdejstvie vybrosov metallurgicheskih proizvodstv na pochvennye mikrobiocenozy [Influence of metallurgical industry emissions on soil microbiocenoses], Izvestija irkutskogo gosudarstvennogo universiteta. Serija: Biologija. Jekologija = Proceedings of the Irkutsk State University. Series: Biology. Ecology, 2011, по. 4, рр. 18-24.

5. Biodiagnostika i ocenka kachestva prirodnoj sredy: podhody, metody, kriterii i jetalony sravnenija v jekotoksikologii [Biodiagnostics and environmental quality assessment: approaches, methods, criteria and reference standards in ecotoxicology], Moscow, 2016. 434 p.

6. Berdzhi. Opredelitel' bakterij v 2 tomah [Determinant of bacteria in 2 volumes], Moscow: Mir, 1997, 432 p.

7. Muha V. D., Muha D. V., Achkasov A. L. Praktikum po agronomicheskomu pochvovedeniju [Workshop on agronomic soil science]: ucheb. posobie, St. Petersburg: Lan', 2013, 448 p.

8. Rekomendacii po statisticheskoj obrabotke rezul'tatov jeksperimental'no-toksikologicheskih issledovanij [Recommendations for statistical processing of experimental toxicology studies], Moscow: Institut gigieny truda i prof. zabolevanij AMN SSSR, 1965, 80 p.

9. Sanpin 2.1.7.573-96. Pochva. Ochistka naselennyh mest. Bytovye i promyshlennye othody. Sanitarnaja ohrana pochvy. Gigienicheskie trebovanija k ispol'zovaniju stochnyh vod i ih osadkov dlja oroshenija i udobrenija [SanPiN 2.1.7.573-96. Soil. Cleaning of populated areas. Household and industrial waste. Sanitary protection of soil. Hygiene requirements for the use of wastewater and rainfall for irrigation and fertilization].

10. Watanabe T. Pictorial atlas of soil and seed fungi: Morphologies of cultured fungi and key to species. Florida, 2000, pp. 411-415.

Статья поступила в редакцию 25.12.2016 г.

Submitted 25.12.2016.

Для цитирования: Берсенева О. А. Экотоксикологическая оценка влияния фторидов на динамику линейного роста почвенных микроорганизмов // Вестник Марийского государственного университета. Серия «Сельскохозяйственные науки. Экономические науки». 2017. Т. 3. № 1 (9). С. 13-17.

Citation for an article: Berseneva O. А. Ecotoxicological assessment of the impact of fluorides on the dynamics of the linear growth of soil microorganisms. Vestnik of the Mari State University. Chapter "Agriculture. Economics ". 2017, vol. 3, no. 1 (9), pp. 13-17.

Берсенева Оксана Андреевна, старший преподаватель, Иркутский государственный университет, г. Иркутск, berseneva-oksana@rambler. ги

Berseneva Оksana A., senior teacher, Irkutsk State University, Irkutsk, berseneva-oksana@rambler.ru