Изучение лечебно-профилактического действия препарата «Реаферон-ЕС липинт®» на мышах, инфицированных вирусом гриппа птиц (субтип H5N1)

e

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Изучение лечебно-профилактического действия препарата «Реаферон-ЕС липинт» на мышах, инфицированных вирусом гриппа птиц

О. К. ДЕМИНА, А. А. СЕРГЕЕВ, А. П. АГАФОНОВ, А. Н. ШИКОВ,

А. О. СЕМЕНЦОВА, АЛ. А. СЕРГЕЕВ, А. Н. СЕРГЕЕВ, И. Г. ДРОЗДОВ

ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», пос. Кольцово, Новосибирская область, Россия

Investigation of Therapeutic and Protective Action of Reaferon-ES Lipint on Mice Infected with Avian Influenza Virus

O. K. DEMINA, A. A. SERGEEV, A. P. AGAFONOV, A. N. SHIKOV,

A. O. SEMENTSOVA, AL. A. SERGEEV, A. N. SERGEEV, I. G. DROZDOV

State Scientific Centre of Virology and Biotechnology Vektor, Koltsovo, Novosibirsk Region

Проведено изучение эффективности лечебной, профилактической и экстренно-профилактической схем применения препарата Реаферон-ЕС липинт (липосомальная форма человеческого а-интерферона рекомбинантного для перорального применения) при инфекции у мышей, вызванной вирусом гриппа птиц. Показано, что штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 (субтип H5N1) вируса гриппа птиц обладает высокой вирулентностью для мышей линии ICR. На основе теоретически обоснованных расчётов предложена оптимальная для мышей лечебно-профилактическая доза препарата Реаферон-ЕС липинт, которая составляла 1000 ед/животное. Установлено, что только при профилактическом введении препарат Ре-аферон-ЕС липинт эффективно защищает мышей ICR, инфицированных дозой 10 ЛД50 вируса гриппа птиц [штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)] (коэффициент защиты — 0,35). В этом случае эффективность данного препарата сравнима с таковой у препарата «Тамифлю». Таким образом, препарата Реаферон-ЕС липинт может быть рекомендован для профилактики заболевания, вызванного не только сезонными штаммами гриппа, но и штаммами вируса гриппа птиц.

Ключевые слова: вирус гриппа птиц (субтип H5N1), экспериментальная инфекция, мыши, Реаферон-ЕС липинт, профилактика, лечение.

The efficacy of the therapeutic, prophylactic and urgent prophylactic schemes for the use of Reaferon-ES lipint, a liposomal human recombinant a-interferon for oral use, was studied on mice infected with the avian influenza virus. Strain A/Chicken/Kurgan /05/2005 (subtype H5N1) of the avian influenza virus showed high virulence with respect to mice ICR. Theoretically-based calculations allowed to design an optimal therapeutic and prophylactic dose of the drug for the mice (1000 units/animal). It was observed that only after prophylactic use of Reaferon-ES lipint it was effective in protection of the mice infected with 10 LD50 of the avian influenza virus (A/Chicken/Kurgan/05/2005, H5N1). The protection coefficient was 0.35. Under such conditions the drug efficacy was comparable with that of Tamiflu. Therefore, Reaferon-ES lipint could be recommended for prophylaxis of the infection due not only to the season strains of the influenza virus, but also to the strains of the avian influenza virus.

Key words: avian influenza virus (H5N1), experimental infection, mice, prophylaxis, Reaferon-ES lipint, therapy.

Введение

Грипп птиц — высококонтагиозное заболевание вирусной этиологии, выиыгаающее массовую гибель дикой и домашней птицы, нанося тем самым огромный ущерб сельскому хозяйству. Возбудителем этого заболевания является вирус гриппа птиц (ВГП), который принадлежит к семейству ОНкотухоутйаг. Среди наиболее патогенных для птиц антигенных вариантов ВГП выделяют субтипы Н7Ш (вирус «куриной чумы») и

© Коллектив авторов, 2009

Адрес для корреспонденции: 630559 р.п. Кольцово Новосибирского района Новосибирской области. ГНЦ ВБ «Вектор»

H5N1. Высокопатогенные варианты ВГП H7N7 вызвали в 2003 году повсеместное поражение фермерских куриных хозяйств в Нидерландах, а ВГП H5N1 явился причиной гибели миллионов кур в странах Юго-Восточной Азии начиная с 1997 года [1]. Кроме того, установлено, что ВГП (H5N1) вызывает чрезвычайно тяжёлую форму заболевания у людей (по данным ВОЗ на 30 апреля 2008 года — 382 человека), которая более чем в 60% случаев заканчивается летальным исходом [2]. Для лечения заболевания ВОЗ рекомендует использовать специфический ингибитор нейра-минидазы осельтамивир («Тамифлю»). Другим

Є

классом соединений, обладающих выраженной антивирусной активностью, являются интерфе-роны (ИФН). Препараты ИФН могут оказаться перспективными в решении проблемы лечения заболевания, вызванного вирусами гриппа птиц, еще и по причине появления данных о резистентности вновь выделяемых штаммов этого вируса к препарату «Тамифлю» [3, 4].

Для профилактики и лечения гриппа часто используют препараты ИФН, однако инъекционный способ введения данных препаратов имеет ряд существенных недостатков: низкая производительность при проведении массовых профилактических и лечебных мероприятий, риск попутного инфицирования вирусными агентами (ВИЧ, вирус Т-клеточного лейкоза, вирус гепатита С и др.), выраженная реактогенность при многократном введении. В этом смысле липосомаль-ная форма ИФН для перорального применения лишена вышеперечисленных недостатков и, кроме того, способствует более длительному нахождению ИФН в крови [5, 6].

Цель работы — изучение эффективности профилактической, экстренно-профилактической и лечебной схем применения препарата «Реафе-рон-ЕС липинт» у мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц.

Материал и методы

Вирус. В работе использовали вирус гриппа птиц (ВГП) штамм А/СЫскеп/Кш^ап/05/2005 (субтип Н5К1), полученный из коллекции микроорганизмов ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Биоконцентрация штамма ВГП составляла 8,5+0,0 ^ 50% эмбриональных инфицирующих доз в 1 мл (ЭИД5о/мл). ВГП хранили при температуре -70°С.

Препарат. Использовали препарат «Реаферон-ЕС липинт» — человеческий а-интерферон рекомбинантный, заключённый в липосомы и лиофильно высушенный. Препарат предоставлен производителем ЗАО «ВЕКТОР-МЕДИКА».

Животные. В исследованиях использовали интактных беспородных разнополых белых мышей ІСИ. массой 14—16 г., полученных из питомника ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Интраназальное инфицирование животных проводили с применением седативных средств. Животных содержали на стандартном рационе с достаточным количеством воды согласно ветеринарному законодательству и в соответствии с требованиями по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях [7].

В работе использовали 9-суточные развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ) кросса Хайсекс Браун генетической линии Род-айленд.

Схема эксперимента. При проведении исследований использовали три схемы применения препарата Реаферон-ЕС липинт.

1. Профилактическая схема: вводили ежедневно 2 раза в сутки в течение 4 дней до заражения ВГП, последнее введение - перорально в дозе 1000 ед/животное в объёме 0,2 мл за 1 час до заражения ВГП.

2. Экстренно-профилактическая схема: вводили сразу после заражения ВГП, затем — через 4 часа после заражения, а далее - ежедневно перорально 2 раза в сутки в течение 6 дней в дозе 1000 ед/животное в объёме 0,2 мл.

3. Лечебная схема: вводили через 3 сут после заражения мышей ВГП и далее — ежедневно перорально дваж-

ды в сутки в течение 6 дней в дозе 1000 ед/животное в объёме 0,2 мл.

В качестве контрольных были использованы две группы животных:

• положительный контроль — группе животных за 1 час до заражения мышей ВГП и через 4 часа после заражения, а далее дважды в день в течение 6 суток вводили перорально препарат «Тамифлю» в дозе 0,1 мг/животное в объёме 0,2 мл; дозу для мышей определили с учётом рекомендованной дозы для человека в пересчёте на площадь поверхности тела и массу тела мышей [8].

• отрицательный контроль — группе интактных животных за 4 суток до заражения ВГП и в течение 10 суток после заражения ежедневно вводили перорально 2 раза в сутки изонический раствор хлорида натрия в объёме 0,2 мл.

Каждая группа животных состояла из 20 мышей. Доза заражение для мышей — 10 мышиных ЛД50/животное интрана-зально в объёме 30 мкл. Учёт гибели инфицированных животных проводили ежедневно в течение 15 дней, отмечая количество погибших и живых мышей. Данные по гибели животных использовали для оценки параметров средней продолжительности жизни (СПЖ), процента выживших животных и коэффициента защиты. Для определения СПЖ оценивали среднее значение времени гибели мышей с момента заражения среди павших мышей в каждой из пяти групп. Для определения коэффициента защиты использовали формулу:

коэффициент защиты животных = количество выживших мышей/общее количество мышей в опытной группе — количество выживших мышей/общее количество мышей в группе отрицательного контроля.

Статистическая обработка результатов. При определении параметра СПЖ в качестве ошибки использовали стандартное отклонение [9]. Статистическое сравнение % выживших животных в группах проводили с помощью непараметрического анализа (таблица 2x2 в программе 8ТА-ТКТ1СА версия 6.0). Был оценен уровень значимости (р) отличий % выживших животных в опытных группах (группы 1— 4) в сравнении с контрольной (группа 5) с учётом поправки Йетса. Достоверность отличия % выживших животных относительно отрицательного контроля в группах подтверждалась, если уровень значимости — /><0,05.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследований по изучению эффективности препарата Реаферон-ЕС липинт для профилактики и лечения гриппозной инфекции у мышей необходимо было определить инфекционную активность штамма вируса при интраназальном инфицировании мышей. Мышам вводили интраназально разведения штамма А/СЫскеп/Кш^ап/05/2005 (субтип Н5Ш) и на 16-е сутки после инфицирования определяли ЛД50. В результате проведённых исследований было установлено, что штамм А/СЫскеп/Кш^ап/05/2005 вируса гриппа обладает высокой вирулентностью в отношении мышей: доза 10 ЛД50 составляет 2,2±0,4 ^ЭИД50. При инфицировании мышей данной дозой наблюдалась летальность около 90% животных.

При расчёте дозы изучаемого препарата мы руководствовались ранее опубликованными сведениями [10, 11], в которых научно обосновано использование повышенных доз в пересчёте на единицу массы для мелких лабораторных живот-

е

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Определение эффективности лечебно-профилактического действия препарата Реаферон-ЕС липинт при различных схемах применения у мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц (ВГП) в дозе 10 ЛД50

Группы животных

Профилактическая схема 20 9 9,3+1,7 45* 0,034

Экстренно-профилактическая схема 20 6 8,7+1,3 30 0,236

Лечебная схема 20 2 8,3+1,2 10 0,598

Группа положительного контроля 20 14 8,5+1,6 * 5 6 0,001

Группа отрицательного контроля 20 2 8,3+1,1 10

Примечание. СПЖ - средняя продолжительность жизни среди погибших животных; р — уровень значимости отличий (при р<0,05 — значения % выживших животных достоверно отличаются от отрицательного контроля); * — значение % выживших животных достоверно отличается от отрицательного контроля.

ных в связи с более интенсивным их метаболизмом. Pаcчёт основан на том, что коэффициент отношения площади тела к массе тела (S/m) для человека в 4 раза ниже, чем у мыши. По этой причине вводимая доза препарата для мыши на единицу массы тела должна быть в 4 раза выше, чем у человека. Peкомeндованная лечебная доза препарата Peафeрон EC липинт для человека составляет 1 млн ед в сутки. В результате пересчёта оптимальная суточная доза для мыши со средней массой тела 15 г (с учётом скорости метаболизма и гомологии интерферонов человека и мыши) составила 2000 ед/мышь.

Определение антигриппозной активности препарата Peафeрон-EC липинт проводили на мышах при их инфицировании вирусом гриппа птиц (штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 субтипа H5N1) в дозе 10 ЛД50. Peзультаты исследований представлены в таблице.

Было установлено, что препарат Peафeрон-EC липинт обладал способностью защищать мышей при введении летальных доз вируса гриппа птиц при профилактической и экстренно-профилактической схеме применения. Только при использовании профилактической схемы наблюдается достоверное повышение процента выжив-

ших животных по сравнению с отрицательным контролем: коэффициент защиты для этой группы животных составлял 0,35 (см. таблицу). В этой же группе животных наблюдалась тенденция к увеличению СПЖ. При использовании препарата Тамифлю (группа положительного контроля) у мышей наблюдали более высокое значение коэффициента защиты (0,55), но, следует подчеркнуть, достоверно не отличающееся от такового для препарата Реаферон-ЕС липинт при профилактической схеме применения.

Заключение

Установлено, что при профилактическом введении препарат Реаферон-ЕС липинт достоверно эффективно защищает мышей ICR, инфицированных дозой 10 ЛД50 вируса гриппа птиц [штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)], коэффициент защиты составляет 0,35. В этом случае эффективность данного препарата сравнима с таковой у препарата Тамифлю. В связи с этим препарат Реаферон-ЕС липинт может быть рекомендован для профилактики заболевания, вызванного не только сезонными штаммами вируса гриппа, но и штаммами вируса гриппа птиц.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кузнецов О. К. Анализ основных этапов и механизмов возможного появления пандемического вируса из возбудителя птичьего гриппа. Эпидемиол вакцинопрофилакг 2006; 5: 8—13.

2. World Health Organization. Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO. [serial online] 2008 Apr 30 [cited 2008 May 6]. Available from URL: http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table _2008_04_30/en/index.html

3. Маркова Т. П., Чувиров Г. H. Противовирусная терапия в лечении гриппа. РМЖ. Болезни дыхательных путей 2004; 12: 21: 12—16.

4. McKimm-Breschkin J. L., Selleck P. W., Usman T. B., Johnson M. A. Reduced sensitivity of influenza A (H5N1) to oseltamivir. Emerg Infect Dis 2007; 13: 9: 1354—1357.

5. Бажутин H. Б., Золин В. В., Колоколъцов А. А., Таргонский С. Н. Перспективы применения липосомальных препаратов в медицинской практике. Terra medica 2003; 3: 31: 3—6.

10.

11.

Epoфeeвa М. К., MaKcaKo^a В. Л., no3d^Ko^a М. Г., KoA}^i^ano^a И. Л. Возможность применения липосомального альфа^ интерферона для профилактики гриппа и других OPВИ. Вопр совр педиатр 2007; 6: 1: 42—46.

Национальный научно-исследовательский совет. Pуководcтво по содержанию и использованию лабораторных животных. Вашингтон: Национальная Академия; 1996.

Tpaxmeнбepг И. М., Coea P. E., Шeфmeлъ В. О., OnuKueHKo Ф. А. Проблема нормы в токсикологии. 2 изд. M.: 1991.

Aшмapuн И. П., Bopoбъeв А. А. Cтатиcтичecкиe методы в микробиологических исследованиях. Л.: 1962.

Kleiber M. The Fire of Life. New York: London, John Wiley and Sons; 1961.

Schmid R. F., Thews G. Физиология человека. M.: 1986.