Почвенные актиномицеты как потенциальные биофунгициды

ЭКОЛОГИЯ

УДК 632.4:635.64

ПОЧВЕННЫЕ АКТИНОМИЦЕТЫ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ БИОФУНГИЦИДЫ

Е.А. Дегтярева, К.А. Виноградова, А.В. Александрова, В.А. Филоненко, П.А. Кожевин

Показана принципиальная возможность биоконтроля фитопатогенных грибов в почве и ризосфере с помощью почвенных стрептомицетов. Из 279 выделенных из дерново-подзолистых почв популяций стрептомицетов были отобраны объекты с выраженной антигрибной активностью по отношению к различным фитопатогенным грибам. Один из наиболее активных стрептомицетов (изолят K 49) на основе фенотипического и генотипического анализов отнесен к виду Streptomyces hygroscopicus.

Ключевые слова: биологический контроль, биофунгициды, Streptomyces hygroscopicus, Fusarium spp.

Введение

Контроль за популяциями фитопатогенных грибов, вызывающих различные заболевания растений, остается злободневной проблемой, решение которой может сократить существенные потери урожая. Широкомасштабное применение химических препаратов (фунгициды) не всегда позволяет решить данную задачу и ведет к дополнительным рискам в результате химического загрязнения сельскохозяйственной продукции и окружающей среды. Поэтому возрастает интерес к биофунгицидам — микробным популяциям, выделенным из природной среды и способным подавлять и уничтожать нежелательную популяцию. В частности, актуальность их применения очевидна в «экологическом земледелии», которое нацелено на получение продуктов высокого качества. Для решения указанных задач предлагаются коммерческие биопрепараты на основе различных микроорганизмов [13, 14], однако лишь некоторые из них включают популяции актиномицетов-антагонистов («Алирин-С», «Mycostop», «Actinovate») .

Между тем почвенные актиномицеты являются поставщиками многих антибиотических веществ с противогрибной активностью. Они также продуцируют различные экзоферменты, в том числе и хи-тиназы, субстратом для которых является клеточная стенка грибов [10]. Известно, что способность к образованию антибиотиков и ферментов проявляется актиномицетами-продуцентами не только в лабораторных, «искусственных», условиях, но и в естественной почве in situ [8].

Экологические ниши почвенных грибов и акти-номицетов частично перекрываются, что связано с особенностями их жизненных форм в почве (мице-лиальный рост, образование спор). Представленные в почвенной микробиологии многочисленные данные прямой микроскопии, включая микробные «пейзажи» на стеклах обрастания, свидетельствуют об активном развитии актиномицетов на отмирающих грибных

гифах [2]. Таким образом, потенциал почвенных акти-номицетов как агентов биоконтроля фитопатогенных грибов не вызывает сомнений. Кроме того, в последнее время показана значимая роль актиномицетов в формировании локальной и общей резистентности растений по отношению к фитопатогенным грибам (хитиназная и пероксидазная активность корней и др.). Поэтому почвенные актиномицеты представляют особый интерес в качестве источника эффективных биофунгицидов.

Цель настоящей работы — поиск актиномицетов-антагонистов фитопатогенных грибов и изучение принципиальной возможности их применения как биофунгицидов.

Объекты и методы исследования

Для анализа использовали коллекцию актиномице-тов, выделенных нами ранее из образцов подзолистых почв, взятых на территории Звенигородской биостанции биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, а также из образцов подзолистой почвы под кольцевой колонией агарикоидного базидиомицета Clitocybe geotropa [3, 4]. Образцы отбирали в разные годы и сезоны на участках, резко различающихся по степени стрессового воздействия (после лесного пожара, восстанавливающийся лес, сплошная вырубка, осветленный лес, нетронутый лес). В модельных лабораторных условиях актиномицеты выделяли на разных этапах микробной сукцессии.

В качестве тест-организмов использовали фито-патогенные грибы из коллекции кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ, выделенные нами популяции из образцов больных растений (тыква, огурцы, картофель, томаты), сапрофитные аборигенные грибы из изучаемых почвенных образцов. В работе по биофунгицидам необходимо учитывать вероятное действие агента биоконтроля не только на популяцию-мишень, но и на представителей аборигенной микрофлоры для оценки

возможного «вмешательства» в жизнедеятельность микробного сообщества [1]. Поэтому в ряде случаев в качестве тест-объектов брали бактерии из коллекций кафедры биологии почв факультета почвоведения и кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Список включал следующие популяции:

• фитопатогенные грибы Fusarium aquaeductuum (Rabenh et Radhlk) Lagerh, F. heterosporum Nees.Fries, F. merismoides Corda, F. oxysporum Schlechtendahl:Fries, F. poae (Peck) Wollenweber, F. solani (Martius) Sac-cardo, Macrosporium solani (Ell et Mart), Phoma exigua Desmazieres, Verticillium luteoalbum (Link) Subramanian, V. nubilum Pethybridge;

• сапрофитные аборигенные грибы, состав которых менялся в зависимости от почвенного образца;

• бактерии (почвенные и лабораторные тесты) Staphylococcus aureus 209, Bacillus megatherium, B. sub-tilis, Micrococcus luteus 2665, M. roseus, Rhodococcus erythropolis 283, Rh. luteus 371, Arthrobacter globiformis 281, Cellulomonas sp, Escherichia coli C 600, Pseudomonas fluorescens var. lemonniere, смешанная культура Micrococcus + Spirillum, Aquaspirillum sp.;

• дрожжи Saccharomyces serevisiae 230 и Candida guilliermondii 217.

Актиномицеты выделяли стандартным методом посева почвенной суспензии на плотную казеин-глицериновую среду (КГС) с нистатином [7]. Выращивание с целью отбора потенциальных антагонистов проводили на среде с соевой мукой, рекомендуемой при массовых поисках активных продуцентов [15]. Для первоначальной характеристики биологической активности выделенных штаммов использовали стандартный метод агаровых блоков [6].

Широкоспектровыми считались актиномицеты, способные подавлять три и более популяций фито-патогенных грибов. Степень активности определяли по зоне ингибирования фитопатогенов. Если зона подавления составляла 5 мм и менее, считали, что антагонисты мало активны.

Таксономическую принадлежность актиноми-цетов определяли по совокупности общепринятых морфолого-культуральных и хемотаксономических показателей [5, 9, 11, 12]. Видовую принадлежность стрептомицетов проводили с помощью полифазных таксономических исследований, основанных на использовании набора фенотипических признаков и молекулярно-генетических методов (нуклеотидная последовательность гена 16S рибосомальной РНК). Поверхность оболочки спор стрептомицетов изучали с помощью просвечивающего и сканирующего электронных микроскопов Jeol 100 CX.

Проверяли принципиальную возможность применения выбранных стрептомицетов в качестве биофунгицидов в модельных опытах с растениями пшеницы и кресс-салата, инфицированными фитопатогенными грибами Fusarium culmorum и F. oxysporum. В качестве дополнительного контроля относительной эффективности использовали аборигенный штамм гриба

Trichoderma citrinoviride. Эксперименты проводили в лабораторных условиях и фитотроне.

Лабораторные опыты с кресс-салатом ставили следующим образом: в чашки Петри с нестерильной и частично стерилизованной с помощью микроволнового облучения (СВЧ-обработка, 800 Дж/г) дерново-подзолистой почвой вносили суспензии спор 5-суточной культуры гриба F. oxysporum (6х106 спор/г) и 7-суточной культуры стрептомицетов (1х108 спор/г). Сразу же производили посев семян кресс-салата. Через 14 дней определяли процент всхожести семян и гидролитическую активность микробного сообщества почвы методом гидролиза флюоресцеина диацетата (ФДА). Поскольку гидролиз ФДА осуществляется активными клетками с действующим комплексом ферментов, то его скорость может служить индексом активной микробной биомассы. Известно, что грибы в данной почве доминируют по биомассе, обладая при этом мощным энзиматическим комплексом. Можно предположить, что скорость гидролиза ФДА существенно зависит от уровня активности почвенных грибов.

Независимая проверка биофунгицидного потенциала выделенных нами антагонистов проведена на фитотроне НИИФитопатологии (Голицино, Московская обл.) с растениями пшеницы. В качестве фитопатогенов использованы культуры агрессивных фитопатогенных грибов F. oxysporum и F. culmorum. Анализировали следующие показатели: процент всхожести семян пшеницы, длину корней растений в фазе кущения и число растений с больными корнями.

Результаты и обсуждение

Выделенная коллекция почвенных актиномицетов состоит преимущественно из представителей рода Streptomyces, что, по всей видимости, связано как с процедурой учета на благоприятной для них среде КГС, так и с их обилием в изучаемых почвах. Из 279 проверенных изолятов были отобраны те, которые показали выраженную антигрибную активность по отношению к фитопатогенным грибам, включая Fusarium aquaeductuum (Rabenh et Radhlk) Lagerh, F. heterosporum Nees.Fries, F. merismoides Corda, F. oxysporum Schlechtendahl:Fries, F. poae (Peck) Wollenweber, F. solani (Martius) Saccardo, Macrosporium solani (Ell et Mart), Phoma exigua Desmazieres, Verticillium luteoalbum (Link) Subramanian, V. nubilum Pethybridge.

Анализ показал, что активность аборигенных стрептомицетов, так или иначе действующих на аборигенные грибы (состав этих тест-культур менялся в зависимости от исследуемого образца), существенно выше, чем активность по отношению к фитопатогенным грибам, нетипичным для данных местообитаний. Так, примерно 14% стрептомицетов, выделенных из образцов разных зон кольцевой колонии агарикоидного гриба Clitocybe geotropa, угнетают рост аборигенных грибов, но не более 8% из них в

той или иной степени подавляют фитопатогенные грибы [3]. Широкоспектровых «сильных» антагонистов, угнетающих рост двух-трех видов рода Fusarium и Verticillium luteoalbum, выявлено менее 3% от общего числа активных изолятов.

Среди стрептомицетов, выделенных из сильноподзолистой почвы Звенигородской биостанции, доля таковых с выраженной активностью по отношению к фитопатогенам была существенного выше — примерно треть проверенных изолятов способна угнетать фитопатогенные грибы, но среди них в основном преобладают популяции с узким спектром антигрибного действия (подавление роста от одного до трех тест-грибов). Всего из 279 штаммов актиномицетов выявлено 35, обладающих широким спектром действия. Из них наибольшую активность проявили только 22 штамма.

Для экспериментов по биологическому контролю в качестве потенциальных биофунгицидов были отобраны 17 популяций стрептомицетов с выраженной активностью in vitro по отношению к тестируемым видам фитопатогенных грибов рода Fusarium, в том числе F. heterosporum, F. merismoides, F. oxysporum, F. solani, а также к Verticillium luteoalbum, Phoma exigua. Они различаются по спектру действия (угнетают от одного объекта до всего изучаемого комплекса фито-патогенов). На основе детальной морфолого-культу-ральной характеристики популяции стрептомицетов были отнесены к определенным фенокластерам согласно имеющейся классификации [9].

В результате Streptomyces sp. K 182 отнесен к фенокластеру 10 категории 3 — Str. bambergiensis Wallhausser, Nesemann, Prave and Steigler 1966, 734^; Streptomyces sp. K 193 — к фенокластеру 8 категории 2 — Str. chattanoogensis Burns and Holtman 1959, 398^; Streptomyces sp. 36 входит в состав фенокластера 8 категории 2 — Str. xanthocidicus Asahi, Nagatsu and Suzuki 1966, 196al; Streptomyces sp. A 10 — в состав фенокластера 3 категории 1 — Str. halstedii (Waksman and Curtis 1916) Waksman and Henrici 1948, 953AL и может быть отнесен к виду Str. griseolus (Waksman 1923) Waksman and Henrici 938AL.

Один из наиболее активных стрептомицетов Streptomyces sp. K 49, отнесенный к виду Str. hygroscopicus (Jensen 1931) Waksman and Henrici 1948, 953AL, входит в состав таксономической группы Str. violaceusniger clade, включающей виды с морщинистой оболочкой спор в спиральных цепочках (рис. 1). Видовая принадлежность этого штамма в составе данной таксономической группы подтверждена с помощью генотипического метода (ПЦР) по последовательности гена 16s RNA.

Эксперименты показали, что стрептомицеты с антигрибной активностью могут угнетать также и различные бактерии, в том числе и те, которые обычно относят к типичным обитателям почвы. Например, штаммы стрептомицетов К 49 и К 193 обладают широким спектром антимикробного дей-

Рис. 1. Спиральные цепочки спор популяции Streptomyces hygroscopicus

ствия и подавляют рост бактерий (Bacillus megatherium, B. subtilis, Micrococcus luteus 2665, M. roseus, Rhodococcus erythropolis 283, Rh. luteus 371, Arthrobacter globiformis 281, Cellulomonas sp. lau 1), двух видов дрожжей (Saccharomyces serevisiae 230 и Candida guilliermondii 217), но не действуют на бактерии Escherichia coli C 600, Pseudomonasfluorescens var. lemonniere, смешанную культуру Micsococcus + Spirillum, Aquaspirillum sp. Активный антагонист грибов штамм К 182 не угнетает многие изученные почвенные бактерии и дрожжи, но угнетает рост Staphylococcus aureus, Bacillus megaterium, B. subtilis, Micrococcus luteus. Популяция стрептомицета А 10 (высокая активность к Fusarium) не подавляла рост всех тестируемых бактерий, в том числе и выделенных из почв. Полученная предварительная информация показывает возможность применения биофунгицидов не только для контроля грибов, но и для решения дополнительных задач по регуляции структуры и активности почвенного микробного сообщества.

Анализ возможности биоконтроля фузариоза популяцией Streptomyces hygroscopicus проведен в модельных экспериментах с помощью компьютерной системы их планирования (STATGRAPHICS Plus for Windows). В лабораторных опытах с почвой и семенами кресс-салата в чашках Петри на фоне фузари-озного инфицирования установлено, что наиболее существенными и статистически значимыми являются факторы интродукции стрептомицета-антагониста и состояния микробного сообщества в момент посева, а также взаимодействие этих факторов (рис. 2).

Основные эффекты для отдельных факторов представлены на рис. 3. Интродукция антагониста Streptomyces hygroscopicus существенно улучшает условия для развития растений. Положительным фактором является также ненарушенное почвенное микробное сообщество, которое имеет заведомо более высокое биоразнообразие («зрелая» система) по сравнению с сообществом после частичной стерилизации («молодая» система). Популяция Trichoderma citrino-viride в условиях эксперимента не проявила присущих грибам данного рода функциональных особенностей,

Факторы

О 10 20 30 40

Эффект

Рис. 2. Относительная значимость влияния исследуемых факторов на развитие растений на диаграмме Парето: фактор А — почвенная микробная система, фактор B — популяция Streptomyces hygroscopicus, фактор С — популяция Trichoderma citrinoviride

Эффект, % 60 F

50 :

40 :

30 1

20 L

частичная без нет есть нет есть

стерилизация обработки

Почва Streptomyces Trichoderma

hygroscopicus citrinoviride

Рис. 3. Основные эффекты по показателю всхожести растений для трех исследуемых факторов: состояния почвенного микробного сообщества, интродукции стрептомицетов, интродукции триходермы

что скорее всего связано со свойствами данной аборигенной популяции.

Как и следовало ожидать, в нестерильной почве индекс гидролиза ФДА существенно превышает таковой в почве после ее частичной стерилизации. Внесение популяции гриба Trichoderma citrinoviride закономерно повышает индекс гидролиза ФДА, однако после интродукции стрептомицетов он существенно падает, что указывает на сильное подавление комплекса грибных популяций. Возможно, столь выраженное снижение индекса активной биомассы свидетельствует об эффективности регуляции по типу некротрофной микофагии (рис. 4).

Поверхность отклика для двух ключевых факторов наглядно подтверждает возможность биоконтроля фу-зариоза с помощью популяции Streptomyces hygroscopicus

Индекс гидролиза ФДА 5,5 F /

5,3 /

5,1 1 /

4,9 : /

4,7 : /

4,5 Ь

частичная без нет есть нет есть

стерилизация обработки

Почва вКерЮтусез Trichodermа

Ьудговсорюив сИппоуШе

Рис. 4. Влияние исследуемых факторов на индекс гидролиза ФДА

Микробная система о внесения

популяции

«молодая» «зрелая»

Рис. 5. Поверхность отклика для растений в зависимости от интродукции стрептомицетов и состояния почвенного микробного сообщества

(рис. 5). Очевидно также, что для прогноза событий и управления процессами необходима информация о состоянии почвенной микробной системы в момент интродукции антагониста и посева растений.

Независимая проверка с растениями пшеницы (заражение F. oxysporum и F. culmorum) подтвердила возможность применения популяции Streptomyces hygroscopicus в качестве биофунгицида. Стрептоми-цеты при внесении в почву на фоне фитопатогенных грибов ослабляли их негативное влияние на растения: длина корней увеличивалась на 20%, число растений с больными корнями уменьшалось на 36%, а показатель всхожести возрастал на 48%.

Таким образом, показана принципиальная возможность биоконтроля над фитопатогенными грибами рода Fusarium с помощью популяций стрептомицетов. Это позволяет осуществить переход к более широкой проверке возможности применения отобранных стрептомицетных популяций в качестве биофунгицидов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Александрова А.В, Великанов Л.Л., Сидорова И.И., венные микромицеты // Микология и фитопатология. 2000. Сизова Т.П. Влияние гриба ТпеНойвгта Натанит на поч- Т. 34, вып. 3.

2. Аристовская Т.В. Микробиология подзолистых почв. М.; Л., 1965.

3. Виноградова К.А., Александрова А.В., Сидорова И.И., Воронина Е.Ю. Распределение почвенных актиномицетов в кольцевой колонии Clitocybe geotropa (Bull.) Quel. и их антагонистическая активность в отношении микромицетов // Микология и фитопатология. 2009. Т. 43, вып. 5.

4. Виноградова К.А., Мовчан Д.Д., Александрова А.В., Кожевин П.А. Характеристика межпопуляционных взаимодействий аборигенных грибов и актиномицетов подзолистой почвы // Микология и фитопатология. 2007. Т. 41, вып. 4.

5. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов. М., 1983.

6. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М., 2004.

7. Зенова Г.М. Почвенные актиномицеты редких родов. М., 2000.

8. Кожевин П.А. Экология почвенных микроорганизмов // Экология микроорганизмов / Под ред. А.А. Нетру-сова. М., 2004.

9. Bergey's Manual of systematic Bacteriology / Ed. S.T. Williams, M. Sharpe, J.A. Holt. Baltimore ets. 9th Edition, 1989. Vol. 4.

Сведения об авторах

10. Gomes R..C., Semedo L.T.A.S., Soares R.M.A., Alvia-no C.S., Linhares L.F., Coelho R.R.R. Chitinolytic actinomycetes from a Brazilian tropical soil active against phytopathogenic fungi // Word J. Microbiol. and Biotechnol. 2000. Vol. 16.

11. Goodfellow M., Kumar Y., Labeda D.P., Sembiring L. The Streptomyces violaceusniger clade: a home for streptomycetes with rugose ornamented spores. Antonie van Leeuwenhoek. 2007. Vol. 92.

12. Kampfer P. The family Streptomycetaceae. Part 1: Taxonomy // The Procariotes. Ed. M. Dworkin et al. 3th ed. N.Y., 2004.

13. McSpadden Gardener B.B., FravelD.R. Biological control of plant pathogens: Research, commercialization, and application in the USA // APS net Feature: Biological control of plant pathogens. 2002.

14. Nourozian J., Etebarian H.R., Khodakaramian G. Biological control of Fusarium graminearum on wheat by antagonistic bacteria // Songklanakarin J. Sci. Technol. 2006. Vol. 28 (Suppl. 1).

15. Warren H.B. Non-synthetic media for antibiotic producing actinomycetes // Antibiotic and Chemoterapy. 1955. Vol 5, N 10.

Поступила в редакцию 18.04.08

Дегтярева Е.А., студентка, кафедра биологии почв. Виноградова К.А., канд. биол. наук, кафедра микробиологии биологического ф-та. Александрова А.В., канд. биол. наук, кафедра микробиологии биологического ф-та. Филоненко В.А., генеральный директор НПО «ЭМ-Кооперация». Кожевин П.А., докт. биол. наук, кафедра биологии почв.

SOIL STREPTOMYCETES AS POTENTIAL BIOFUNGICIDES

E.A. Degtyareva, K.A. Vinogradova, A.V. Alexandrova, V.A. Filonenko, P.A. Kozhevin

Biological control of fungal diseases of plants may be an effective and environmentally friendly alternative or supplement to fungicides. Soil antagonistic streptomycetes are particularly suitable for biological control, proving to be highly effective in reducing the incidence of fungal pathogens. Streptomycetes isolated from podzolic soils were evaluated for biosuppression of fungal populations. Of 279 isolates, 17 strains of streptomycetes were found to be strongly antagonistic to fungal pathogens in vitro and were selected for further experiment in situ. Total protection plants against Fusarium spp. was obtained with the strain K49 of Streptomyces hygroscopicus.

Key words: biological control, biofungicides, Streptomyces hygroscopicus, Fusarium spp.