Влияние блокады p2y-пуринорецепторов на инотропную функцию сердца в онтогенезе

ВЕСТНИК ТГГПУ. 2011. №3

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

УДК 612.17

ВЛИЯНИЕ БЛОКАДЫ Р2У-ПУРИНОРЕЦЕПТОРОВ НА ИНОТРОПНУЮ ФУНКЦИЮ СЕРДЦА В ОНТОГЕНЕЗЕ

© И.Н.Анисимова, Т.А.Аникина, Ф.Г.Ситдиков

В статье рассмотрено влияние блокаторов Р2У-рецепторов на силу сокращения миокарда крыс в онтогенезе. Использование РРЛЭ8 и реактива голубого-2, блокаторов разных подтипов Р2У-рецепторов выявило возрастные особенности влияния антагонистов на сократительную активность миокарда. У 21-суточных крысят сила сокращения миокарда предсердий на РРЛЭ8 и реактив голубой-2 выше, чем у 100-суточных, что возможно связано с возрастными особенностями регуляторных влияний на сердце и этапами биологического созревания организма.

Ключевые слова: Р2У-пуринорецепторы, сердце, РРЛЭ8, реактив голубой 2, онтогенез.

В целом в сердце, на сердечных миофиброб-ластах [1; 2; 3], отдельных кардиомиоцитах [1; 2; 4], эндотелиальных и гладкомышечных клетках сосудов [5] показано присутствие Р2У1,2,4,6,11,12,13 подтипов рецепторов.

Иммуногистохимический анализ показал наличие возрастных особенностей локализации Р2У-рецепторов в сердце крыс. Выраженность этих рецепторов у взрослых животных имеет следующий порядок: Р2У6>Р2У1 >Р2У2=Р2У4 [6]. Следует отметить, что многие аспекты функционирования Р2У-рецепторов на важнейших этапах раннего постнатального онтогенеза остаются мало изученными и затрагивают только неонатальный период развития.

Задача разделения подтипов Р2У рецепторов является сложной, поскольку пока не существует селективных антагонистов для выделения разных подтипов рецепторов. К настоящему времени описаны различные по структуре блокаторы P2-пуринорецепторов, но ни один из них не может полностью удовлетворить фармакологов.

Классическими блокаторами для Р2У-пури-норецепторов являются PPADS, сурамин и реактив голубой-2 [7].

Динатриевая соль пиродоксальфосфат-6-

азофенил-2',4'-дисульфоновой кислоты (PPADS) (pyridoxal-phosphate-6-azophenyl-2',4'-disulfonic acid) был описан вначале как эффективный антагонист Р2-рецепторов с существенно большей тропностью к Р2Х рецепторам [8]. В последующем было установлено его антагонистическое действие по отношению к некоторым подтипам Р2У рецепторов, клонированных на ооцитах лягушек [9]. В настоящее время установлено, что PPADS является антагонистом всех рецепторов семейства Р2Х, кроме Р2Х4 и Р2Х6 подтипов, а также блокирует Р2У1 и возможно P2Y6 подтип рецепторов [2; 10; 11].

Также показано отсутствие влияния PPADS на P2Y2 и P2Y4 подтипы Р2-рецепторов [2; 12; 13; 10].

Реактив голубой-2 (RB2) (производное ан-трахинонсульфаниловой кислоты) - антагонист с преимущественным действием на Р2Y-пурино-рецепторы. Антагонистическое действие препарата проявляется в очень узком диапазоне концентраций и коротком времени инкубации (не более 60 мин), за пределами которых существенными становятся его неспецифические эффекты [14; 15; 16]. В 1987 году А.М.Hopwood на сердце крысы, изолированном по Лангендорфу, подтвердил существование эффективной блокады Р2Y-рецепторов, осуществляемой реактивом голубым-2.

По мнению других авторов, PPADS, сурамин и реактив голубой-2 проявляют слабую антагонистическую деятельность для P2Y4, P2Y6, и P2Yn подтипов рецепторов [17; 18; 19; 20].

Целью настоящего исследования являлось изучение влияния PPADS и реактива голубого-2, блокаторов P2Y2,4,6- подтипов пуринорецепторов на силу сокращения миокарда крыс в постна-тальном онтогенезе.

Методика исследования

Сократительную активность миокарда в эксперименте in vitro изучали на полосках миокарда белых лабораторных крыс 21- и 100-суточного возраста. Определение реакции сократительной функции миокарда на антагонисты P2Y-рецепторов проводили на установке "PowerLab" ("ADInstruments") с датчиком силы "MLT 050/D" ("ADInstruments").

Все эксперименты на изолированных полосках миокарда проводились с соблюдением био-этических правил. У наркотизированных животных сердце быстро извлекали и помещали в чашку Петри с оксигенированным рабочим раство-

ром при подключенном стимуляторе "ЭСЛ-2". Далее препарировали полоски миокарда. Препарат фиксировали вертикально одним концом к датчику силы, другим - к точке опоры, затем каждый препарат погружали в отдельный резервуар, в который подавался рабочий раствор (мкмоль/л: NaCl - 119,8, КС1 - 5,4, СаСОз - 1,8, MgC12 - 1,05, NaHPO4 - 0,42, глюкоза - 5,05) с кислородом (95% О2 и 5% СО2). Для поддержания рН в пределах 7,3-7,4 в раствор добавляли основной и кислотный буферы Trizma ("Sigma"). Полоски стимулировались через платиновые электроды с частотой 6 и 10 стимулов для 21- и 100-суточных животных соответственно, длительностью 5 мс.

Запись кривой регистрировали на персональном компьютере при помощи программного обеспечения "Chart 5.0". После погружения препаратов в резервуары следовал "период приработки" в течение 40-60 мин. По окончании приработки 10 мин регистрировали исходные параметры сокращения, затем в течение 20 мин с добавлением в рабочий раствор антагонист P2Y-рецепторов ("Sigma"). По окончании стимуляции блокатора препараты трехкратно отмывали рабочим раствором в течение 10 мин и регистрировали исходные показатели для каждой последующей дозы. Рассчитывали реакцию силы сокращения в ответ на блокатор в процентах от исходной, которые принимали за 100%. Достоверность различий рассчитывали по параметрическому парному и непарному t критерию Стью-дента, достоверными считались результаты при р<0,05.

Результаты исследования

Изучали влияние блокатора PPADS на сократительную активность миокарда предсердий и желудочков крыс 21- и 100-суточного возраста. После добавления в раствор блокатора PPADS наблюдалось увеличение амплитуды сокращения миокарда желудочков у 21-суточных крыс на 47% (p<0,05) по сравнению с исходной. В предсердиях PPADS снижает амплитуду сокращения на 5%.

У взрослых крыс блокатор вызывает уменьшение силы сокращения предсердий на 8% (p<0,05) и желудочков на 9,6% по сравнению с исходной (рис.1).

Далее изучали возрастные особенности влияния блокатора P2Y-рецепторов реактива голубого-2 на сократимость миокарда крыс, который использовали в концентрации 1,5 цМ [1, 20].

Реактив голубой-2 вызывает положительный инотропный эффект на миокард предсердий и желудочков во всех изученных возрастах. Стабилизация силы сокращения изолированных по-

лосок миокарда на действие препарата наблюдается к 15-20 минуте.

60 -, % *

50

40

30

20 -

-10

-20

21 день  предсердие

100 дней  желудочек

возраст

Рис.1. Влияние РРЛЭ8 на силу сокращения миокарда предсердий и желудочков крыс 21- и 100-суточного возраста.

У 21-суточных животных увеличение сократимости миокарда предсердий и желудочков составило 18% и 25% соответственно (р<0,05).

У взрослых крыс антагонист также увеличивает силу сокращения миокарда предсердий и желудочков на 6,5% и 6% соответственно (р<0,05) по сравнению с исходной (рис.2).

Таким образом, РРЛБ8 в концентрации 3*10"5М оказывает положительный инотропный эффект на миокард желудочков только у 21-суточных животных и не оказывает влияния на инотропию миокарда взрослых крыс.

35 -, % 30 -25 -20 -15 -10 -5 -

0

100 дней возраст желудочки

21 день

предсердия

Рис.2. Влияние реактива голубого 2 на силу сокращения миокарда предсердий и желудочков крыс 21- и 100-суточного возраста.

Изучение реактива голубого-2, блокатора Р2У4-подтипа рецепторов на сократимость миокарда выявило возрастные особенности влияния антагониста на сократительную активность миокарда. Так, у 21-суточных крысят сила сокращения полосок миокарда предсердий и желудочков нам действие блокатора достоверно выше, чем у 100-суточных животных (р<0,05).

И.Н.АНИСИМОВА, Т.А.АНИКИНА, Ф.Г.СИТДИКОВ

Возможно, это связано с возрастными особенностями регуляторных влияний на сердце и этапами биологического созревания 21-суточных крысят Известно, что животные этого возраста относятся к среднемолочному периоду, когда происходит повышение активности симпатической нервной системы и зафиксированы максимальные значения частоты сердечных сокращений [21].

1. Burnstock G. Purines and Purinoceptors: Molecular Biology Overview // Squire L.R Encyclopedia of Neuroscience. - 2009. - Vol.7. - Р.1253-1262.

2. Von fogelgen I. Pharmacological profiles of cloned mammalian P2Y-receptor subtypes // Pharmacol Ther. - 2006. - Vol.110. - P.415-432.

3. Зиганшин А. У. Роль рецепторов АТФ (^-рецепторов) в нервной системе // Неврологический вестник. - 2005. - T.XXXVII. - Вып.1-2. - С.45-53.

4. Webb T.E., BoluytM.O., BarnardE.A. Molecular biology of P2Y purinoceptors: Expression in heart // J. Auton. Pharmacol. - 1996. - Vol.16. - P.303-307.

5. Zheng J.S., O' Neill L., Long X., Webb T.E., Barnard E.A., Lakatta E.G. Stimulation of P2Y receptors activates c-fos gene expression and inhibits DNA synthesis in cultured cardiac fibroblasts // Cardiovasc Res. - 1998. - Vol.37. - P.718-728.

6. Hou M., Malmsjo M., Moller S., Pantev E.,

Bergdahl A., Zhao X.H., Sun X.Y., Hedner T., Edvins-son L., Erlinge D. Increase in cardiac P2X1- and

P2Y2-receptor mRNA levels in congestive heart fail-

ure // Life Sci . - 1999. - Р.65: 1195-1206.

7. Yitzhakia S., Shneyvaysa V., Jacobsonb K A. and

Shainberga A. Involvement of uracil nucleotides in protection of cardiomyocytes from hypoxic stress // Biochemical Pharmacology. - 2005. - Vol.69. -P.1215-1223.

8. Ziganshin A.U., Hoyle, C.H.V., Lambrecht G.,

Mutschler E., Baumert H.G., Burnstock G. Selective antagonism by PPADS at P2Xpurinoceptors in rabbit isolated blood vessels // Br. J. Pharmacol. - 1994. -Vol.111. - Р.923-929.

9. Boyer J.L., Zohn I.E., Jacobson K.A., Harden T.K. Differential effects of P2-purinoceptor antagonists on phospholipase C- and adenylyl cyclase-coupled P2Y-purinoceptors // Br. J. Pharmacol. - 1994. - Vol.113.

- Р.614-620.

10. Von Kugelgen I, Wetter A. Molecular pharmacology of P2Y-receptors // Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. - 2000. - №362(4-5). - Р.310-323.

11. Wee S., Peart J.N., Headrick J.P. P2 purinoceptor-mediated cardioprotection in ischemic-reperfused mouse heart // J Pharmacol Exp Ther. - 2007. -Vo1.323(3). - P.861-867.

12. Collo G., North R.A., Kawashima E., Merlo-Pich E., Neidhart S., Surprenant A., Buell G.J. Cloning of P2X5 and P2X6 receptors and the distribution and properties of an extended family of ATP-gated ion channels // Neurosci. - 1996. - Р.2495-2507.

13. Townsend-Nicholson A., King B.F., Wildman S.S., Burnstock G. Molecular cloning, functional characterization and possible cooperativity between the murine P2X4 and P2X4a receptors // Brain Res. -1999. - Vol.64. - Р.246-254.

14. Зиганшин А. У., Зиганшина Л.Е. Фармакология рецепторов АТФ. - М.: Гэотар медицина, 1999. -209 с.

15. Burnstock G., Warland J.J.I. P2-purinoceptors of two subtypes in the rabbit mesenteric artery: reactive blue 2 selectively inhibits responses mediated via the P2y-but not P2x-purinoceptor // Br. J. Pharmacol. - 1987.

- Vol.90. - P.383-391.

16. Hopwood A.M., Burnstock G. ATP mediates coronary vasoconstriction via P2X-purinoceptors and coronary vasodilatation via P2Y- purinoceptors in the isolated perfused rat heart // Eur. J. Pharmacol. -1987. - Vol.136(1). - P.49-54.

17. Robaye B., Boeynaems J.M., Communi D. Slow desensitization of the human P2Y6 receptor // Eur J Pharmacol. - 1997. - Vol.329. - Р.231-236.

18. Bogdanov Y., Rubino A., Burnstock G. Characterization of subtypes of the P2X and P2Y families of ATP receptors in the foetal human heart // Life Sci. -1998. - Vol.62. - Р.697-703.

19. Lazarowski E.R., Rochelle L.G., O’Neal W.K., Ribeiro C.M., Grubb B.R., Zhang V. Cloning and functional characterization of two murine uridine nucleotide receptors reveal a potential target for correcting ion transport deficiency in cystic fibrosis gallbladder // J Pharmacol. - 2001. - Exp Ther 297. -Р.43-49.

20. King B.F., Burnstock G., Boyer J.L., Boeynaems J.M., Weisman G.A., Kennedy C. Nucleotide receptors: P2Y receptors // The IUPHAR Compendium of Receptor Characterization and Classification.

- 2001. - №2: IUPHAR Media Publications.

21. Ситдиков Ф.Г., Зефиров Т.Л. Лекции по возрастной физиологии сердца: учеб. пособ. - Казань: ТГГПУ, 2006. - 102 с.

THE INFLUENCE OF BLOCKADE P2Y - PURINORECEPTORS ON THE INOTROPIC HEART FUNCTION IN ONTOGENY

I.N.Anisimova, T.A.Anikina, F.G.Sitdikov

The authors of the article studied the influence of blockers of P2Y-receptors on force of reduction of the myocardium of rats in ontogeny. Using PPADS and a reactive blue-2, blockers of different subtypes P2Y-

receptors has revealed age features of influence of antagonists on the contractility activity of a myocardium. At 21-daily allowances of infant rats the force of reduction of the myocardium of auricles on PPADS and reactive blue 2 above is higher than at 100-daily allowances. Probably it is connected with the age features regulation influence on the heart and biological stages of maturing organism.

Key words: P2Y-purinoreceptors, heart, PPADS, reactive blue 2, ontogeny.

Анисимова Ирина Николаевна - аспирант кафедры анатомии, физиологии и охраны здоровья человека Института физической культуры и восстановительной медицины Казанского (Приволжского) федерального университета.

E-mail: irina171185@rambler.ru

Аникина Татьяна Андреевна - доктор биологических наук, доцент кафедры анатомии, физиологии и охраны здоровья человека Института физической культуры и восстановительной медицины Казанского (Приволжского) федерального университета.

E-mail: Tania57vg1@rambler.ru

Ситдиков Фарит Габдулхакович - доктор биологических наук, профессор кафедры анатомии, физиологии и охраны здоровья человека Института физической культуры и восстановительной медицины Казанского (Приволжского) федерального университета.

E-mail: fgsitdikov@mail.ru

Поступила в редакцию 18.05.2011