ENPP1 ПОЛИПЕПТИДЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Слияние ENPP1 полипептида, содержащее ENPP1 полипептид, слитый с Fc областью иммуноглобулина, отличающийся тем, что ENPP1 полипептид содержит мутацию I256T относительно SEQ ID NO: 7.
2. Слияние полипептида по п. 1, отличающееся тем, что
(i) Fc область содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из M883Y, S885N, S885T, T887E, H1064K и N1065F относительно SEQ ID NO: 7,
(ii) Fc область содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из S885N, M883Y, M883Y/S885T/T887E и H1064K/N1065F относительно SEQ ID NO: 7,
(iii) ENPP1 полипептид дополнительно содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из C25N, K27T и V29N относительно SEQ ID NO: 7, предпочтительно,
ENPP1 полипептид содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из C25N/K27T и V29N относительно SEQ ID NO: 7,
(iv) ENPP1 полипептид дополнительно содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из K369N и I371T относительно SEQ ID NO: 7, предпочтительно,
ENPP1 полипептид содержит мутацию K369N/I371T относительно SEQ ID NO: 7,
(v) ENPP1 полипептид дополнительно содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из P534N, V536T, R545T, P554L, E592N, R741D и S766N относительно SEQ ID NO: 7, предпочтительно,
ENPP1 полипептид содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из P534N/V536T, P554L/R545T, E592N, E592N/R741D и S766N относительно SEQ ID. NO: 7,
(vi) ENPP1 полипептид дополнительно содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из E864N и L866T относительно SEQ ID NO: 7, предпочтительно,
ENPP1 полипептид содержит, по меньшей мере, мутацию E864N/L866T относительно SEQ ID NO: 7,
(vii) слияние полипептида содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из C25N, K27T, V29N, C25N/K27T, K369N, I371T, K369N/I371T, P534N, V536T, R545T, P554L, E592N, R741D, S766N, P534N/V536T, P554L/R545T, E592N/R741D, E864N, L866T, E864N/L866T, M883Y, S885N, S885T, T887E, H1064K, N1065F, M883Y/S885T/T887E, H1064K/N1065F относительно SEQ ID NO:7,
(viii) Fc область принадлежит IgG,
(ix) слияние полипептида содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из P534N, V536T, R545T, P554L, S766N и E592N относительно SEQ ID NO: 7,
(x) слияние полипептида содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из S766N, P534N/Y536T, P554L/R545T и E592N относительно SEQ ID NO: 7, или
(xi) слияние полипептида содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из S885N, S766N, M883Y/S885T/T887E, E864N/L866T, P534N/V536T/H1064K/N1065F, P554L/R545T, S766N/H1064K/N1065F, E592N/H1064K/N1065F и P534N/V536T/M883Y/S885T/T887E относительно SEQ ID NO:7.
3. Слияние ENPP1 полипептида, содержащее ENPP1 полипептид и Fc область иммуноглобулина, отличающееся тем, что
(i) слияние полипептида содержит мутации I256T, M883Y, S885T и T887E относительно SEQ ID NO: 7,
(ii) слияние полипептида содержит мутации I256T, P534N, V536T, M883Y, S885T и T887E относительно SEQ ID NO: 7,
(iii) слияние полипептида содержит мутации I256T, E592N, H1064K и N1065F относительно SEQ ID NO: 7.
4. Мутантный ENPP1 полипептид, содержащий аминокислоты 23-849 из SEQ ID NO: 7, отличающийся тем, что мутантный полипептид содержит мутацию I256T и дополнительно содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из S766N, P534N, V536T, P554L, R545T и E592N относительно SEQ ID NO: 7.
5. Мутантный полипептид по п. 4, который
(i) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7,
(ii) не содержит сигнальную пептидную последовательность,
(iii) отличающийся тем, что мутантный полипептид содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из S766N, P534N/V536T, P554L/R545T и E592N относительно SEQ ID NO: 7,
(iv) где мутантный полипептид содержит мутацию S766N, относительно SEQ ID NO: 7, или
(v) где мутантный полипептид содержит мутацию P554L и R545T, относительно SEQ ID NO: 7.
6. Мутантный полипептид по п. 5(i), содержащий
(i) мутации, выбранные из группы, состоящей из: S885N, S766N, M883Y/S885T/T887E, P534N/V536T/H1064K/N1065F, P554L/R545T, S766N/H1064K/N1065F, E592N/H1064K/N1065F и P534N/V536T/M883Y/S885T/T887E относительно SEQ ID NO:7,
(ii) мутацию S885N относительно SEQ ID NO: 7.
(iii) мутации M883Y, S885T и T887E относительно SEQ ID NO: 7,
(iv) мутации P534N, V536T, H1064K и N1065F относительно SEQ ID NO: 7,
(v) мутации S766N, H1064K и N1065F относительно SEQ ID NO: 7,
(vi) мутации E592N, H1064K и N1065F относительно SEQ ID NO: 7, или
(vii) мутации P534N, V536T, M883Y, S885T и T887E относительно SEQ ID NO: 7.
7. Слияние полипептида по п. 1 или 3 или мутантный полипептид по п. 4, который
(i) экспрессируется из линии клеток СНО, стабильно трансфицированных ST6 бета-галактозид альфа-2,6-сиалилтрансферазой человека (также известной как ST6GAL1), или
(ii) выращивают в культуре клеток с добавлением сиаловой кислоты и/или N-ацетилманнозамина (также известного как 1,3,4‐O‐Bu3ManNAc).
8. Терапевтически эффективное количество слияния полипептида по п. 1 или 3 или мутантного полипептида по п. 4 для применения в:
(i) способе уменьшения или профилактики прогрессирования патологической кальцификации у субъекта, нуждающегося в этом, предпочтительно, где патологическую кальцификацию выбирают из группы, состоящей из идиопатического детского кальциноза артерий (IIAC) и кальфификации атеросклеротических бляшек,
(ii) способе уменьшения или профилактики прогрессирования патологического окостенения у субъекта, нуждающегося в этом, предпочтительно, где патологическое окостенение выбирают из группы, состоящей из окостенения задней продольной связки (OPLL), гипофосфатемического рахита и остеоартрита,
(iii) способе уменьшения или профилактики прогрессирования эктопической кальцификации мягких тканей у субъекта, нуждающегося в этом, предпочтительно, где кальцификацию мягких тканей выбирают из группы, состоящей из IIAC и отеоартрита, или кальцификацию мягких тканей выбирают из группы, состоящей из атеросклеротических бляшек, мышечных артерий, сустава, позвоночника, суставного хряща, хряща позвоночного диска, сосудов и соединительной ткани,
(iv) способе лечения, реверсии или профилактики прогрессирования окостенения задней продольной связки (OPLL) у субъекта, нуждающегося в этом,
(v) способе лечения, реверсии или профилактики прогрессирования гипофосфатемического рахита у субъекта, нуждающегося в этом,
(vi) способе уменьшения или профилактики прогрессирования, по меньшей мере, одного заболевания, выбранного из группы, состоящей из хронической болезни почек (CKD), терминальной стадии почечной недостаточности (ESRD), кальцифицирующей уремической артериолопатии (CUA), кальцифилаксии, окостенения задней продольной связки (OPLL), гипофосфатемического рахита, остеоартрита, связанного со старением затвердевания артерий, идиопатической артериальной кальцификации у младенцев (IIAC), генерализованной артериальной кальцификации у младенцев (GACI) и кальцификации атеросклеротических бляшек у субъекта, у которого диагностировано, по меньшей мере, одно заболевание, или
(vii) способе уменьшения или профилактики прогрессирования связанного со старением затвердевания артерий у субъекта, нуждающегося в этом.
9. Терапевтически эффективное количество полипептида слияния по п. 1 или 3 или мутантного полипептида по п. 4 для применения в способе повышения уровней пирофосфата (PPi) у субъекта, имеющего уровень PPi ниже нормального уровня PPi, отличающееся тем, что способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества полипептида слияния полипептида п. 1 или 3 или мутантного полипептида по п. 4, также тем, что при введении уровень PPi у субъекта повышается до нормального уровня, составляющего, по меньшей мере, 2 мкМ, и поддерживается примерно на том же уровне.
10. Терапевтически эффективное количество слияния полипептида по п. 1 или 3 или мутантного полипептида по п. 4 для применения в:
(i) способе уменьшения или профилактики прогрессирования патологической кальцификации или окостенения у субъекта, имеющего уровень пирофосфата (PPi) ниже нормального уровня PPi, или
(ii) способе лечения дефицита ENPP1, проявляющегося снижением концентрации внеклеточного пирофосфата (PPi) у субъекта, нуждающегося в этом, отличающийся тем, что способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества слияния полипептида по п. 1 или 3 или мутантного полипептида по п. 4, в результате чего уровень PPi у субъекта повышается.
11. Терапевтически эффективное количество cлияния полипептида или мутантного полипептида для применения по любому из пп. 8-10,
(i) где слияние полипептида или мутантный полипептид является секретированным продуктом белка-предшественника ENPP1, экспрессированного в клетке млекопитающего, отличающийся тем, что белок-предшественник ENPP1 содержит последовательность сигнального пептида и ENPP1 полипептид, отличающийся тем, что белок-предшественник ENPP1 подвергается протеолитическому процессингу с образованием ENPP1 полипептида, предпочтительно,
в белке-предшественнике ENPP1 последовательность сигнального пептида конъюгирована с N-концом ENPP1 полипептида или, предпочтительно,
последовательность сигнального пептида выбрана из группы, состоящей из последовательности сигнального пептида ENPP1, последовательности сигнального пептида ENPP2, последовательности сигнального пептида ENPP7 и последовательности сигнального пептида ENPP5,
(ii) где слияние полипептида или мутантный полипептид вводят субъекту разово или постоянно,
(iii) где слияние полипептида или мутантный полипептид вводят субъекту локально, регионарно, парентерально или системно,
(iv) где слияние полипептида или мутантный полипептид вводят субъекту, по меньшей мере, одним путем, выбранным из группы, состоящей из подкожного, перорального, аэрозольного, ингаляционного, ректального, вагинального, трансдермального, подкожного, интраназального, буккального, сублингвального, парентерального, интратекального, внутрижелудочного, офтальмологического, легочного и местного,
(v) где слияние полипептида или мутантный полипептид вводят субъекту в виде фармацевтической композиции, дополнительно содержащей, по меньшей мере, один фармацевтически приемлемый носитель, или
(vi) где субъектом является млекопитающее, предпочтительно, млекопитающим является человек.
12. Мутантный ENPP1 полипептид, содержащий одну или несколько аминокислотных замен относительно SEQ ID NO: 7, отличающийся тем, что полипептид содержит аминокислотную замену в положении 256 относительно SEQ ID NO: 7, предпочтительно, аминокислотная последовательность мутантного ENPP1 полипептида, по меньшей мере, на 90% идентична аминокислотам 23-849 из SEQ ID NO: 7.
13. Мутантный ENPP1 полипептид, содержащий аминокислоты 23-849 из SEQ ID NO: 7, отличающийся тем, что
присутствует не более десяти (10) аминокислотных замен относительно аминокислот 23-849 из SEQ ID NO: 7,
мутантный ENPP1 полипептид содержит аминокислотную замену в положении 256 относительно SEQ ID NO: 7.
14. Мутантный ENPP1 полипептид по п. 12 или 13, отличающийся тем, что
(i) аминокислотной заменой является замена изолейцина (I) на треонин (Т) в положении 256 относительно SEQ ID NO: 7,
(ii) мутантный полипептид содержит аминокислотную последовательность SWQ ID NO: 11, или
(iii) аминокислотной заменой является замена изолейцина (I) на серин (S) в положении 256 относительно SEQ ID NO: 7.
15. Мутантный ENPP1 полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90% идентична аминокислотам 23-849 из SEQ ID NO: 7, отличающийся тем, что
мутантный полипептид содержит мутацию I256T относительно SEQ ID NO: 7, и
мутантный полипептид дополнительно содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из S766N, P534N, V536T, P554L, R545T и E592N относительно SEQ ID NO: 7,
предпочтительно,
мутантный полипептид содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из S766N, P534N/V536T, P554L/R545T и E592N относительно SEQ ID NO: 7, или, предпочтительно,
мутантный полипептид содержит аминокислотную замену V29N.
16. Слияние мутантного ENPP1 полипептида, содержащее мутантный ENPP1 полипептид по любому из пп. 12-15 и гетерологичный белок.
17. Слияние мутантного ENPP1 полипептида по п. 16, отличающееся тем, что гетерологичным белком является FcRn связывающий домен, предпочтительно,
гетерологичный белок является карбокси-концевым по отношению к мутантному ENPP1 полипептиду слияния, или, предпочтительно,
гетерологичный белок является амино-концевым по отношению к мутантному ENPP1 полипептиду слияния.
18. Слияние мутантного ENPP1 полипептида по п. 17, отличающееся тем, что
(i) FcRn связывающим доменом является полипептид альбумина, или
(ii) FcRn связывающим доменом является Fc часть молекулы иммуноглобулина, предпочтительно, молекулой иммуноглобулина является IgG1, и/или
(iii) FcRn связывающий домен содержит еще одну аминокислотную замену относительно FcRn связывающего домена дикого типа.
19. Слияние мутантного ENPP1 полипептида по любому из пп. 17 и 18(ii)-(iii), отличающееся тем, что
(i) FcRn связывающим доменом является Fc часть молекулы IgG1 человека и содержит следующие аминокислотные замены: M883Y, S885T и T887E, каждая относительно SEQ ID NO: 7,
(ii) слияние содержит одну или несколько из следующих замен: S885N, S766N, M883Y/S885T/T887E, P534N/V536T/H1064K/N1065F, P554L/R545T, S766N/H1064K/N1065F, E592N/H1064K/N1065F или P534N/V536T/M883Y/S885T/T887E, каждая относительно SEQ ID NO: 7,
(iii) слияние содержит мутацию S885N относительно SEQ ID NO: 7,
(iv) слияние содержит мутацию S766N относительно SEQ ID NO: 7,
(v) слияние содержит мутации M883Y, S885T и T887E относительно SEQ ID NO: 7,
(vi) слияние содержит мутации P534N, V536T, H1064K и N1065F относительно SEQ ID NO: 7,
(vii) слияние содержит мутации P554L и R545T относительно SEQ ID NO: 7,
(viii) слияние содержит мутации S766N, H1064K и N1065F относительно SEQ ID NO: 7,
(ix) слияние содержит мутации E592N, H1064K и N1065F относительно SEQ ID NO: 7,
(x) слияние содержит мутации P534N, V536T, M883Y, S885T и T887E относительно SEQ ID NO: 7
(xi) Fc область содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из M883Y, S885N, S885T, T887E, H1064K и N1065F относительно SEQ ID NO: 7, и/или
(xii) Fc область содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из S885N, M883Y, M883Y/S885T/T887E и H1064K/N1065F относительно SEQ ID NO: 7.
20. Слияние мутантного ENPP1 полипептида по любому из пп. 17 и 18(ii)-19 или мутантный ENPP1 полипептид по любому из пп. 12, 13, 14(i), 14(iii), и 15, отличающееся тем, что слияние или мутантный ENPP1 полипептид содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из C25N, K27T и V29N относительно SEQ ID NO: 7.
21. Слияние мутантного ENPP1 полипептида по любому из пп. 17 и 18(ii)-20 или мутантный ENPP1 полипептид по любому из пп. 12, 13, 14(i), 14(iii), 15 и 19(xi), где слияние или мутантный ENPP1 полипептид содержат по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из C25N/K27T и V29N относительно SEQ ID NO: 7.
22. Слияние мутантного ENPP1 полипептида по любому из пп. 17 и 18(ii)-21 или мутантный ENPP1 полипептид по любому из пп. 12, 13, 14(i), 14(iii), 15 и 20-21,
(i) где слияние или мутантный ENPP1 полипептид содержит одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из K369N и I371T относительно SEQ ID NO: 7, и/или
(ii) где слияние полипептида или мутантный ENPP1 полипептид содержит мутацию K369N/I371T относительно SEQ ID NO: 7, и/или
(iii) где слияние полипептида или мутантный ENPP1 полипептид содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из P534N, V536T, R545T, P554L, E592N, R741D и S766N относительно SEQ ID NO: 7, и/или
(iv) где слияние полипептида или мутантный ENPP1 полипептид содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из P534N/V536T, P554L/R545T, E592N, E592N/R741D и S766N относительно SEQ ID NO: 7, и/или
(v) где слияние полипептида или мутантный ENPP1 полипептид содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из C25N, K27T, V29N, C25N/K27T, K369N, I371T, K369N/I371T, P534N, V536T, R545T, P554L, E592N, R741D, S766N, P534N/V536T, P554L/R545T, E592N/R741D, E864N, L866T, E864N/L866T, M883Y, S885N, S885T, T887E, H1064K, N1065F, M883Y/S885T/T887E, H1064K/N1065F относительно SEQ ID NO: 7, и/или
(vi) слияние полипептида или мутантный ENPP1 полипептид содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из P534N, V536T, R545T, P554L, S766N и E592N относительно SEQ ID NO: 7, и/или
(vii) где слияние полипептида или мутантный ENPP1 полипептид содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из S766N, P534N/Y536T, P554L/R545T и E592N относительно SEQ ID NO: 7, и/или
(viii) где слияние полипептида или мутантный ENPP1 полипептид содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из S885N, S766N, M883Y/S885T/T887E, E864N/L866T, P534N/V536T/H1064K/N1065F, P554L/R545T, S766N/H1064K/N1065F, E592N/H1064K/N1065F и P534N/V536T/M883Y/S885T/T887E относительно SEQ ID NO: 7.
23. Слияние мутантного ENPP1 полипептида по любому из пп. 17 и 18(ii)-22, отличающееся тем, что
(i) слияние содержит мутации I256T, M883Y, S885T и T887E относительно SEQ ID NO: 7,
(ii) слияние содержит мутации I256T, P534N, V536T, M883Y, S885T и T887E относительно SEQ ID NO: 7,или
(iii) слияние содержит мутации I256T, E592N, H1064K и N1065F относительно SEQ ID NO: 7.
24. Слияние по любому из пп. 16-23, содержащее линкерную аминокислотную последовательность, предпочтительно,
линкерная аминокислотная последовательность соединяет часть мутантного ENPP1 полипептида слияния и гетерологичный белок и/или, предпочтительно,
линкерная аминокислотная последовательность содержит SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9.
25. Нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный ENPP1 полипептид по любому из пп. 12-15 или слияние по любому из пп. 16-24.
26. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 25, предпочтительно, вектором является вектор экспрессии.
27. Клетка или множество клеток, каждая из которых содержит нуклеиновую кислоту по п. 25, и/или вектор по п. 26, предпочтительно,
клетками являются клетки CHO и/или клетки NS0, более предпочтительно,
клетка СНО стабильно трансфицирована ST6 бета-галактозид альфа-2,6-сиалилтрансферазой человека.
28. Способ получения мутантного ENPP1 полипептида или его слияния, отличающийся тем, что способ включает культивирование клетки или множества клеток по п. 27 в условиях, подходящих для экспрессии мутантного ENPP1 полипептида или его слияния клеткой или клетками.
29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что
(i) клетки культивируют в среде с добавлением сиаловой кислоты и/или N-ацетилманнозамина и/или
(ii) способ дополнительно включает очистку мутантного ENPP1 полипептида или слияния из клетки, множества клеток или среды, в которой культивировали клетку или множество клеток.
30. Мутантный ENPP1 полипептид или его слияние, очищенные способом по п. 28(ii).
31. Конъюгат, содержащий (i) мутантный ENPP1 полипептид по любому из пп. 12-15, 20-22 и 30 и/или слияние мутантного ENPP1 полипептида по любому из пп. 16-24 и 30 и (ii) гетерологичную группу, предпочтительно, гетерологичной группой является полиэтиленгликоль.
32. Фармацевтическая композиция, содержащая мутантный ENPP1 полипептид по любому из пп. 12-15, 20-22 и 30, слияние по любому из пп. 16-24 и 30, нуклеиновую кислоту по п. 25, вектор по п. 26, и/или конъюгат по п. 31 и фармацевтически приемлемый носитель.
33. Терапевтически эффективное количество:
(a) мутантного ENPP1 полипептида по любому из пп. 12-15, 20-22 и 30;
(b) слияния по любому из пп. 16-24 и 30;
(c) конъюгата по п. 31; и/или
(d) фармацевтической композиции по п. 32,
(i) для применения в способе снижения или профилактики патологической кальцификации у субъекта, нуждающегося в этом,
(ii) для применения в способе уменьшения или профилактики прогрессирования патологического окостенения у субъекта, нуждающегося в этом,
(iii) для применения в способе уменьшения или профилактики прогрессирования эктопической кальцификации мягких тканей у субъекта, нуждающегося в этом,
(iv) для применения в способе лечения, реверсии или профилактики прогрессирования окостенения задней продольной связки (OPLL) у субъекта, нуждающегося в этом,
(v) для применения в способе лечения, реверсии или профилактики прогрессирования гипофосфатемического рахита у субъекта, нуждающегося в этом,
(vi) для применения в способе уменьшения или профилактики прогрессирования, по меньшей мере, одного заболевания, выбранного из группы, состоящей из хронической болезни почек (CKD), терминальной стадии почечной недостаточности (ESRD), кальцифицирующей уремической артериолопатии (CUA), кальцифилаксии, окостенения задней продольной связки (OPLL), гипофосфатемического рахита, остеоартрита, связанного со старением затвердевания артерий, идиопатической артериальной кальцификациии у младенцев (IIAC), генерализованной артериальной кальцификации у младенцев (GACI) и кальцификации атеросклеротических бляшек у субъекта, у которого диагностировано, по меньшей мере, одно заболевание,
(vii) для применения в способе уменьшения или профилактики прогрессирования связанного со старением затвердевания артерий у субъекта, нуждающегося в этом,
(viii) для применения в способе повышения уровней пирофосфата (PPi) у субъекта, имеющего уровень PPi ниже, чем нормальный уровень PPi, отличающийся тем, что способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества (a), (b), (c) и (d),
в результате чего после введения уровень PPi у субъекта повышается до нормального уровня, составляющего по меньшей мере, 2 мкМ, и поддерживается примерно на том же уровне,
(ix) для применения в способе уменьшения или профилактики прогрессирования патологической кальцификации или окостенения у субъекта, имеющего уровень пирофосфата (PPi) ниже нормального уровня PPi,
(x) для применения в способе лечения дефицита ENPP1, проявляющегося снижением концентрации внеклеточного пирофосфата (PPi) у субъекта, нуждающегося в этом, отличающийся тем, что способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества(a), (b), (c) и (d),
в результате чего уровень PPi у субъекта повышается.
34. Терапевтически эффективное количество (a), (b), (c), (d) для применения по п. 33, отличающееся тем, что
(i) мутантный полипептид, слияние, конъюгат или фармацевтическую композицию вводят субъекту разово или постоянно,
(ii) мутантный полипептид, слияние, конъюгат или фармацевтическую композицию вводят субъекту локально, регионарно, парентерально или системно, и/или
(iii) субъектом является человек.