СПОСОБЫ И МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ОТВЕТА НА ТЕРАПИЮ ПРОТИВ ПЛАЗМОБЛАСТОВ И ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
METHODS AND MATERIALS FOR ASSESSMENT OF RESPONSE TO THERAPY AGAINST PLASMA-BLASTS AND PLASMA CELLS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка в соответствии с 119 (e) 35 Кодекса США испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США 62/362963, поданной 15 июля 2016 года, все описание которой включено в настоящий документ посредством отсылки.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ОТСЫЛКИ МАТЕРИАЛА, ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОЙ ФОРМЕ
[0002] Посредством отсылки полностью включен машиночитаемый список нуклеотидных/аминокислотных последовательностей, поданный одновременно с настоящей заявкой и обозначенный следующим образом: файл "266608SeqListing.txt" в формате ACII (текстовый) размером 56 килобайт, созданный 14 июля 2017 года.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0003] Настоящее изобретение относится к антителам против CD38 и их применению в качестве терапевтических и диагностических средств. Настоящее изобретение также относится к способам лечения аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка и ревматоидный артрит. Настоящее изобретение также относится к способам диагностического исследования для определения пациентов, имеющих аутоиммунные заболевания, подлежащие лечению.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Плазматические клетки и плазмобласты представляют собой антителосекретирующие клетки (АСК), которые важны для патогенных процессов, ассоциированных с системной красной волчанкой (СКВ) и ревматоидным артритом (РА). Они вовлечены в патогенез многих опосредованных антителами аутоиммунных заболеваний, включающих миастению, синдром Шегрена, рассеянный склероз (РС) и аутоиммунный тиреоидит. См. Jacobi AM, Mei H, Hoyer BF, et al., Ann Rheum Dis (2010) 69 (1): 305-8; Dorner T, Isenberg D, Jayne D, et al., International Roundtable on B cells as Therapeutic Target for Intervention, Autoimmun Rev (2009) 9 (2): 82-9; Tipton CM, Fucile CF, Darce J, et al., Nat Immunol (2015) 16 (7): 755-65; и Cepok S, Rosche B, Grummel V, et al., Brain (2005) 128 (Pt 7): 1667-76. Плазмобласты представляют собой терминально дифференцированные B-клетки, которые быстро образуются, при этом большая часть из них становятся короткоживущими эффекторными клетками, а меньшая часть становятся долгоживущими плазматическими клетками.
[0005] Большинство B-клеток экспрессируют CD20 и подвергаются эффективной и стойкой элиминации с помощью терапевтических препаратов антител, направленных против этого белка клеточной поверхности. См. Silverman GJ, Arthritis Rheum (2006) 54 (8): 2356-67. Однако некоторые клетки B-клеточной линии дифференцировки, такие как плазмобласты и плазматические клетки, не экспрессируют значительных количеств CD20 и не поддаются эффективному снижению путем прямой CD20-направленной элиминации. См. Silverman 2006. Таким образом, способность CD20-направленных лекарственных средств влиять на эту популяцию клеток ограничена элиминацией популяции CD20+ B-клеток, которые, в конечном счете, могут дифференцироваться в плазмобласты, с небольшим воздействием на уже образовавшиеся плазмобласты и плазматические клетки. См. Silverman GJ and Boyle DL, Immunol Rev (2008) 223: 175-85.
[0006] Клинические исследования с участием больных СКВ показали, что высокий уровень плазмобластов до лечения препаратами против CD20 коррелирует с неэффективной элиминацией B-клеток в крови. Кроме того, неполная элиминация плазмобластов в крови может иметь клинические последствия, включающие ускоренное наступление рецидива и сниженную выживаемость. См. Vital EM, Rawstron AC, Dass S, et al., Arthritis Rheum (2011) 63 (3): 603-8. Подобные результаты были продемонстрированы у больных РА, получавших моноклональные антитела против CD20. См. Dass S, Rawstron AC, Vital EM, et al., Arthritis Rheum (2008) 58 (10): 2993-9; и Owczarczyk K, Lal P, Abbas AR, et al., Sci Transl Med (2011) 3 (101): 101ra92.
[0007] Для решения этих проблем были разработаны способы непрямого мониторирования уровней плазмобластов и плазматических клеток в крови путем оценки мРНК транскриптов, экспрессируемых, прежде всего, в этих типах клеток. См. Vital EM, Dass S, Buch MH, et al., Arthritis Rheum (2011) 63 (10): 3038-47; Streicher K, Morehouse CA, Groves CJ, et al., Arthritis Rheumatol (2014) 66 (1): 173-84; и Owczarczyk, 2011. С помощью этого способа CD20 нереспондеры были ретроспективно идентифицированы как пациенты с высоким уровнем богатых IgJ (J-цепью иммуноглобулина) плазмобластов и плазматических клеток и низкими уровнями FCRL5 (Fc-рецептор подобного белка 5), который экспрессируется в CD20+ неплазмобластах.
[0008] Этот непрямой подход прост и может применяться в большинстве клинических ситуаций. Образцы крови, которые собирают при использовании обычных пробирок для забора образцов (например, пробирок PAXgene), при надлежащем хранении имеют долговременную стабильность. Однако анализы транскриптов в цельной крови не позволяют легко выполнить прямое определение количества плазмобластов и плазматических клеток, и, в зависимости от уникальности транскриптов, оцениваемых в данной популяции клеток, на результаты могут влиять изменения в других типах клеток.
[0009] Прямое измерение уровней плазмобластов и плазматических клеток до или в ответ на терапию, которая воздействует на B-клетки, должно способствовать решению этой проблемы. Однако жизнеспособность плазмобластов быстро снижается после забора из вены. При использовании современных методик мониторинг уровней плазмобластов требует обработки в день забора, что сложно стандартизировать в различных клинических центрах.
[0010] Хотя плазмобласты и плазматические клетки не экспрессируют значительных количеств CD20, эти клетки, наряду с NK-клетками, конститутивно экспрессируют высокие уровни CD38, как B-клетки и T-клетки, в которых экспрессия CD38 повышается при активации. См. Malavasi F, Deaglio S, Funaro A, et al., Physiol Rev (2008) 88 (3): 841-86. CD38, также известный как циклическая АДФ-рибозогидролаза, является трансмембранный гликопротеином II типа с длинным C-концевым внеклеточным доменом и коротким N-концевым эндоплазматическим доменом. CD38 является членом группы родственных мембраносвязанных или растворимых ферментов, включающей CD157 и АДФР-циклазу аплизии. Это семейство ферментов обладает уникальной способностью превращать НАД в циклическую АДФ-рибозу или никотинамидадениндинуклеотид-фосфат.
[0011] Недавние исследования у людей показывают, что мАт против CD38 могут элиминировать множество типов клеток крови, включая плазмобласты и плазматические клетки.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0012] Антитела против CD38 в комбинации с измерением плазмобластов и/или плазматических клеток до или во время лечения могут применяться для лечения пациентов, страдающих ревматоидным артритом, системной красной волчанкой или другим аутоиммунным заболеванием, которые не могут достичь ремиссии заболевания с помощью терапии на основе CD20 или других терапий, которые не обеспечивают стойкую элиминацию плазмобластов и/или плазматических клеток.
[0013] В одном из аспектов изобретения предложен способ лечения заболевания у пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела против CD38 пациенту, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и у пациента до лечения антителом против CD38 было показано наличие повышенного уровня CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом.
[0014] В другом аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания у пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела против CD38 пациенту, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и у пациента после лечения антителом против CD20 было показано наличие повышенного уровня CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом.
[0015] В дополнительном аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD38, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента до лечения антителом против CD38, было показано наличие повышенного уровня CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом.
[0016] В другом аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD38, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента после лечения антителом против CD20, было показано наличие повышенного уровня CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом.
[0017] В еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD38, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента до лечения антителом против CD38, было показано наличие повышенного уровня плазматических клеток и плазмобластов по сравнению с контрольным индивидом при анализе свободных легких цепей Ig.
[0018] В дополнительном аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD38, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента после лечения антителом против CD20, было показано наличие повышенного уровня плазматических клеток и плазмобластов по сравнению с контрольным индивидом при анализе свободных легких цепей Ig.
[0019] В еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD38, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента до лечения антителом против CD38, было показано наличие повышенного уровня специфической мРНК или группы мРНК CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом.
[0020] В другом аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD38, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента после лечения антителом против CD20, было показано наличие повышенного уровня суммарной мРНК CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом.
[0021] В дополнительном аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества первого антитела против CD38, где первое антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента до лечения антителом против CD38, было показано наличие повышенного уровня CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом с помощью проточной цитометрии.
[0022] В еще одном аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества первого антитела против CD38, где первое антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента после лечения антителом против CD20, было показано наличие повышенного уровня CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом с помощью проточной цитометрии.
[0023] В другом аспекте изобретения предложен способ анализа CD38-экспрессирующих клеток в цельной крови, включающий:
a) получение образца цельной крови у индивида, где образец включает эритроциты, лейкоциты и антикоагулянт;
b) лизис эритроцитов с получением обработанного образца;
c) замораживание обработанного образца при температуре приблизительно -20°C или ниже в течение приблизительно 24 часов после получения образца, с получением замороженного образца;
d) измерение количества CD38-экспрессирующих клеток в образце в течение приблизительно 72 часов после получения образца, где замороженный образец нагревают до комнатной температуры перед измерением объема CD38-экспрессирующих клеток.
[0024] В настоящей заявке предложены реактивы и способы связывания с CD38, а также способы лечения ассоциированных с CD38 заболеваний и обнаружения CD38 с применением CD38-специфичных связывающих средств, включающих антитела против CD38.
[0025] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления выделенное антитело, специфичное в отношении CD38 человека (SEQ ID NO: 1) и CD38 яванского макака (SEQ ID NO: 2), описано для применения в сочетании с различными аспектами изобретения. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела, описанные в настоящем документе, могут состоять из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи включает три определяющих комплементарность области (CDR-области), описанные в настоящем документе как HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и где вариабельная область легкой цепи включает три CDR-области, описанные в настоящем документе как LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Последовательности CDR-областей представлены следующим: HCDR1 (SEQ ID NO: 3), HCDR2 (SEQ ID NO: 4), HCDR3 (SEQ ID NO: 5), LCDR1 (SEQ ID NO: 6), LCDR2 (SEQ ID NO: 7) и LCDR3 (SEQ ID NO: 8).
[0026] В других вариантах осуществления выделенное антитело может включать вариабельную область тяжелой цепи, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 9. В других вариантах осуществления выделенное антитело может включать вариабельную область легкой цепи, где последовательность вариабельной области легкой цепи включает SEQ ID NO: 10. В других вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 9, и вариабельная область легкой цепи включает SEQ ID NO: 10.
[0027] В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело может включать вариабельную область тяжелой цепи, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 21. В других вариантах осуществления выделенное антитело может включать вариабельную область легкой цепи, где последовательность вариабельной области легкой цепи включает SEQ ID NO: 22. В других вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 21, и вариабельная область легкой цепи включает SEQ ID NO: 22. Такая комбинация вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи именуется Ab79. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело включает Fc-домен. В других вариантах осуществления Fc-домен является Fc-доменом человека. В других вариантах осуществления Fc-домен является вариантом Fc-домена.
[0028] В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело, специфичное в отношении CD38 человека (SEQ ID NO: 1) и CD38 яванского макака (SEQ ID NO: 2), описано для применения в сочетании с различными аспектами изобретения. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитела, описанные в настоящем документе, могут состоять из шести CDR-областей, где каждая CDR-область этого антитела может отличаться от SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 0, 1 или 2 аминокислотными заменами.
[0029] В других вариантах осуществления выделенное антитело, специфичное в отношении CD38 человека (SEQ ID NO: 1) и CD38 яванского макака (SEQ ID NO: 2), описано для применения в сочетании с различными аспектами изобретения. Выделенные антитела, описанные в настоящем документе, могут состоять из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи включает три определяющих комплементарность области (CDR-области), описанные в настоящем документе как HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и где вариабельная область легкой цепи включает три CDR-области, описанные в настоящем документе как LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Последовательности CDR-областей представлены следующим: HCDR1 (SEQ ID NO: 13), HCDR2 (SEQ ID NO: 14), HCDR3 (SEQ ID NO: 15), LCDR1 (SEQ ID NO: 16), LCDR2 (SEQ ID NO: 17) и LCDR3 (SEQ ID NO: 18).
[0030] В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело может включать вариабельную область тяжелой цепи, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 11. В других вариантах осуществления выделенное антитело может включать вариабельную область легкой цепи, где последовательность вариабельной области легкой цепи включает SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело может включить тяжелую цепь и легкую цепь, где последовательность тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 11, и легкая цепь включает SEQ ID NO: 12.
[0031] В других вариантах осуществления выделенное антитело может включать вариабельную область тяжелой цепи, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 19. В других вариантах осуществления выделенное антитело может включать вариабельную область легкой цепи, где последовательность вариабельной области легкой цепи включает SEQ ID NO: 20. В других вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 19, и вариабельная область легкой цепи включает SEQ ID NO: 20. Эта комбинация вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи именуется Ab19.
[0032] В других вариантах осуществления выделенное антитело, специфичное в отношении CD38 человека (SEQ ID NO: 1) и CD38 яванского макака (SEQ ID NO: 2), описано для применения в сочетании с различными аспектами изобретения. Выделенные антитела, описанные в настоящем документе, могут состоять из шести CDR-областей, где каждая CDR-область данного антитела может отличаться от SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 0, 1 или 2 аминокислотными заменами.
-6
-7
-8
-9
-6
-7
-8
-9
[0033] В некоторых вариантах осуществления предложено выделенное антитело против CD38, которое специфично связывается с CD38 человека (SEQ ID NO: 1) и CD38 яванского макака (SEQ ID NO: 2), где антитело связывается с CD38 человека с KD приблизительно 10, 10, 10, 10 или больше и связывает CD38 яванского макака с KD приблизительно 10, 10, 10, 10 или больше.
[0034] В некоторых вариантах осуществления предложены антитела, которые конкурируют с Ab79 и/или Ab19 за связывание с CD38 человека и/или CD38 яванского макака.
[0035] Способы настоящего изобретения могут быть описаны как варианты осуществления в любом из следующих перечисленных пунктов. Следует понимать, что любой из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, может применяться в сочетании с любым другим вариантом(ами) осуществления, описанным в настоящем документе, в той степени, в которой комбинированные варианты осуществления не противоречат друг другу.
[0036] 1. Способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD38, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и у пациента до лечения антителом против CD38 было показано наличие повышенного уровня CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом.
[0037] 2. Способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD38, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и у пациента после лечения антителом против CD20 было показано наличие повышенного уровня CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом.
[0038] 3. Способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD38, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента до лечения антителом против CD38, было показано наличие повышенного уровня CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом.
[0039] 4. Способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD38, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента после лечения антителом против CD20, было показано наличие повышенного уровня CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом.
[0040] 5. Способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD38, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента до лечения антителом против CD38, было показано наличие повышенного уровня CD38-экспрессирующих плазмобластов и плазматических клеток по сравнению с контрольным индивидом при анализе свободных легких цепей Ig.
[0041] 6. Способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD38, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента после лечения антителом против CD20, было показано наличие повышенного уровня CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом при анализе свободных легких цепей Ig.
[0042] 7. Способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD38, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента до лечения антителом против CD38, было показано наличие повышенного уровня по меньшей мере одного гена, повышенного в CD38-экспрессирующих клетках, по сравнению с контрольным индивидом.
[0043] 8. Способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD38, где антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента после лечения антителом против CD20, было показано наличие повышенного уровня по меньшей мере одного гена, повышенного в CD38-экспрессирующих клетках, по сравнению с контрольным индивидом.
[0044] 9. Способ согласно любому из предыдущих пунктов, где антитело против CD38 включает:
[0045] a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую:
[0046] i) первую CDR-область, включающую SEQ ID NO: 3;
[0047] ii) вторую CDR-область, включающую SEQ ID NO: 4;
[0048] iii) третью CDR-область, включающую SEQ ID NO: 5; и
[0049] b) вариабельную область легкой цепи, включающую:
[0050] i) первую CDR-область, включающую SEQ ID NO: 6;
[0051] ii) вторую CDR-область, включающую SEQ ID NO: 7;
[0052] iii) третью CDR-область, включающую SEQ ID NO: 8.
[0053] 10. Способ согласно пункту 9, где вариабельная область тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 9.
[0054] 11. Способ согласно пункту 9, где вариабельная область легкой цепи включает SEQ ID NO: 10.
[0055] 12. Способ согласно любому из пунктов 9-11, где вариабельная область тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 9, и вариабельная область легкой цепи включает SEQ ID NO: 10.
[0056] 13. Способ согласно любому из пунктов 9-11, где тяжелая цепь включает SEQ ID NO: 21, и легкая цепь включает SEQ ID NO: 22.
[0057] 14. Способ согласно любому из пунктов 1-8, где антитело против CD38 включает:
[0058] a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую:
[0059] i) первую CDR-область, включающую SEQ ID NO: 13;
[0060] ii) вторую CDR-область, включающую SEQ ID NO: 14;
[0061] iii) третью CDR-область, включающую SEQ ID NO: 15; и
[0062] b) вариабельную область легкой цепи, включающую:
[0063] i) первую CDR-область, включающую SEQ ID NO: 16;
[0064] ii) вторую CDR-область, включающую SEQ ID NO: 17;
[0065] iii) третью CDR-область, включающую SEQ ID NO: 18.
[0066] 15. Способ согласно пункту 14, где вариабельная область тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 11.
[0067] 16. Способ согласно пункту 14, где вариабельная область легкой цепи включает SEQ ID NO: 12.
[0068] 17. Способ согласно любому из пунктов 14-16, где вариабельная область тяжелой цепи включает SEQ ID NO: 19, и вариабельная область легкой цепи включает SEQ ID NO: 20.
[0069] 18. Способ согласно любому из пунктов 14-16, где тяжелая цепь включает SEQ ID NO: 34, и легкая цепь включает SEQ ID NO: 35.
[0070] 19. Способ согласно любому из пунктов 9 и 14, где антитело против CD38 дополнительно включает Fc-домен.
[0071] 20. Способ согласно пункту 19, где Fc-домен является человеческим.
[0072] 21. Способ согласно пункту 19, где Fc-домен является вариантом Fc-домена.
[0073] 22. Способ согласно любому из пунктов 1-8, где антитело против CD38 взаимодействует, по меньшей мере, с K121, F135, Q139, D141, E239, W241, C275, K276, F284, P291 и E292 SEQ ID NO: 1.
[0074] 23. Способ лечения заболевания у пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества первого антитела против CD38 к пациенту, где первое антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента до лечения антителом против CD38, было показано наличие повышенного уровня CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом с помощью проточной цитометрии.
[0075] 24. Способ лечения заболевания у пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества первого антитела против CD38 к пациенту, где первое антитело против CD38 является выделенным антителом, которое специфично связывает CD38 человека (SEQ ID NO: 1), заболевание является аутоиммунным заболеванием, и в биологическом образце, полученном у пациента после лечения антителом против CD20, было показано наличие повышенного уровня CD38-экспрессирующих клеток по сравнению с контрольным индивидом с помощью проточной цитометрии.
[0076] 25. Способ согласно любому из пунктов 23 и 24, где CD38-экспрессирующие клетки были окрашены вторым антителом против CD38, конъюгированным с флуорохромом.
[0077] 26. Способ согласно пункту 25, где второе антитело против CD38 является антителом, определенным в любом из пунктов 14-18.
[0078] 27. Способ согласно любому из пунктов 21-24, где первое антитело против CD38 является антителом, определенным в любом из пунктов 9-13.
[0079] 28. Способ согласно любому из пунктов 1-27, где аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, системной красной волчанки, воспалительного заболевания кишечника, неспецифического язвенного колита, реакции "трансплантат против хозяина", миастении, синдрома Шегрена, рассеянного склероза и аутоиммунного тиреоидита.
[0080] 29. Способ согласно любому из пунктов 1-27, где аутоиммунным заболеванием является ревматоидный артрит.
[0081] 30. Способ согласно любому из пунктов 1-27, где аутоиммунным заболеванием является системная красная волчанка.
[0082] 31. Способ анализа CD38-экспрессирующих клеток в цельной крови, включающий:
[0083] a) получение образца цельной крови у индивида, где образец включает эритроциты, лейкоциты и антикоагулянт;
[0084] b) лизис эритроцитов с получением обработанного образца;
[0085] c) замораживание обработанного образца с получением замороженного образца, где замораживание происходит в течение приблизительно 24 часов после получения образца цельной крови у индивида;
[0086] d) измерение количества CD38-экспрессирующих клеток в образце в течение приблизительно 72 часов после получения образца, где замороженный образец нагревают до комнатной температуры перед измерением количества CD38-экспрессирующих клеток.
[0087] 32. Способ согласно пункту 31, где замороженный образец выдерживают при температуре приблизительно -20°C или меньше перед измерением количества CD38-экспрессирующих клеток.
[0088] 33. Способ согласно любому из пунктов 1-32, где CD38-экспрессирующие клетки являются плазматическими клетками и/или плазмобластами.
[0089] 34. Способ согласно любому из пунктов 1-32, где CD38-экспрессирующие клетки являются плазматическими клетками.
[0090] 35. Способ согласно любому из пунктов 1-32, где CD38-экспрессирующие клетки крови являются плазмобластами.
[0091] Эти и другие варианты осуществления, признаки и потенциальные преимущества станут очевидными со ссылкой на следующее описание и чертежи.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
+
+
-
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
[0092] На ФИГ. 1 показан профиль экспрессии CD38 на клетках лимфоидной линии дифференцировки, звездочка обозначает высокую экспрессию CD38. Экспрессию CD38 определяли на про-B-клетках (CD34CD19CD20), активированных B-клетках (CD19CD20), плазматических клетках (CD138CD19CD20), активированных CD4и CD8T-клетках, NKT-клетках (CD3CD56) и NK-клетках (CD56CD16). Кроме того, экспрессию CD38 обнаруживали на лимфоидных клетках-предшественниках (CD34CD45RACD10CD19), но не на лимфоидной стволовой клетке. Кроме того, повышенную экспрессию CD38 наблюдали на зрелых ДК и активированных моноцитах.
[0093] На ФИГ. 2 показаны последовательности тяжелой и легкой цепи Ab79 и Ab19.
[0094] На ФИГ. 3 показаны последовательности CD38 человека и яванского макака.
[0095] На ФИГ. 4 показаны эпитопы CD38 человека, которые связывает каждое из антител Контроль 1 и 2, Ab19 и Ab79.
[0096] На ФИГ. 5 показана повышенная экспрессия CD38 в МКПК больных СКВ при использовании коммерческого антитела к CD38 человека.
[0097] На ФИГ. 6 показано процентное изменение количества клеток у обезьян циномолгус через 24 часа после введения дозы.
[0098] На ФИГ. 7 показано восстановление после элиминации после введения однократной дозы Ab79.
[0099] На ФИГ. 8 показаны результаты у одной мыши HuSCID в отношении значимого снижения всех изотипов Ig после введения однократной дозы Ab79.
[00100] ФИГ. 9 аналогична ФИГ. 8 в отношении элиминирующей активности Ab79 у мышей HuSCID, как описано в Примерах.
[00101] На ФИГ. 10 показано значимое снижение противостолбнячного ответа в модели HuSCID после лечения Ab79.
[00102] На ФИГ. 11, снова в модели HuSCID, показано значимое увеличение выживаемости после лечения Ab79, по существу в одном из типов модели реакции трансплантата против хозяина.
[00103] На ФИГ. 12 показаны различия в экспрессии антигена CD38 у человеческих и мышиных МКПК при использовании коммерческих антител к каждому из них.
[00104] На ФИГ. 13 показан терапевтический эффект в условиях воспаления при элиминировании иммунных клеток из периферической крови суррогатным мышиным антителом против CD38.
[00105] На ФИГ. 14 показано, что Ab79 элиминирует плазмобласты крови (CD38+, CD27+), плазматические клетки (CD138+, CD27+) и (CD138+, IRF4+).
[00106] На ФИГ. 15 показано, что Ab79 элиминирует костномозговые долгоживущие плазматические клетки (CD19-, CD38+, CD138+).
[00107] На ФИГ. 16 показан сбор образцов, культивирование и конечные показатели эксперимента.
[00108] На ФИГ. 17 показана чувствительность АСК к Ab79 в крови здоровых добровольцев (ФИГ. 17A) и индивидов с СКВ (ФИГ. 17B) при измерении с помощью ELISpot.
[00109] На ФИГ. 18 показано, что Ab79 снижает АСК, которые продуцируют аутоантитела 9G4 (ФИГ. 18A) и Ro (ФИГ. 18B).
[00110] На ФИГ. 19 показано, что плазмобласты и плазматические клетки (CD45+, CD3-, CD19+, CD27+, CD38+) могут быть обнаружены в цельной крови с помощью проточной цитометрии с применением способов, описанных в настоящем документе.
[00111] На ФИГ. 20 показана проточная цитометрия клеток крови, консервированных с помощью способа фиксации/замораживания, описанного в настоящей заявке, после введения Ab79 здоровым добровольцам, и показано, что Ab79 элиминирует плазмобласты и плазматические клетки. (о) Плацебо; (•) Ab79 (0,03 мг/кг; () Ab79 (0,1 мг/кг); () Ab79 (0,3 мг/кг); () Ab79 (0,6 мг/кг).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[00112] ОБЗОР
+
[00113] Внеклеточный домен CD38, как было показано, обладает бифункциональной ферментной активностью, так как имеет и АДФ-рибозилциклазную, так и АДФ-рибозилгидролазную активности. Таким образом, CD38 может катализировать превращение НАД в цАДФР (циклаза) и может затем гидролизировать ее в АДФ-рибозу (гидролаза). цАДФР участвует в мобилизации кальция из внутриклеточного депо и является вторым посредником, важным для клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза.
[00114] Повышенная экспрессия CD38 была зарегистрирована при различных заболеваниях гемопоэтического происхождения и была описана как негативный прогностический маркер при хроническом лимфообластном лейкозе. Такие заболевания включают, без ограничения перечисленными, множественную миелому (Jackson et al. (1988)), хронический лимфообластный лейкоз (Moribito et al. (2001), Jelinek et al. (2001), Chevalier et al. (2002), Durig et al. (2002)), B-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз, острый лимфообластный лейкоз (Keyhani et al. (2000)), в том числе B-клеточный острый лимфоцитарный лейкоз, макроглобулинемию Вальденстрема, первичный системный амилоидоз, мантийно-клеточную лимфому, про-лимфоцитарный/миелоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз (Keyhani et al. (1993)), хронический миелоидный лейкоз (Marinov et al. (1993)), фолликулярную лимфому, NK-клеточный лейкоз и плазмоклеточный лейкоз. Таким образом, CD38 представляет полезную мишень при лечении заболеваний гемопоэтический системы.
[00115] Несколько антител против CD38 проходят клинические исследования для лечения CD38-ассоциированных форм рака. Таким образом, антитела к CD38 с терапевтическим эффектом и/или диагностическими применениями являются полезными. В изобретении предложены два разных набора CDR-областей против CD38, которые связываются с различными эпитопами CD38, и которые связывают как CD38 человека, так и CD38 яванского макака, а также антитела, которые содержат эти CDR-области.
[00116] Кроме того, в настоящем изобретении показано, что антитела против CD38 находят применение в диагностике и/или лечении воспаления и/или иммунологических нарушений, связанных с активированными лимфоцитами, включающих, в частности, аутоиммунные заболевания. Как показано в настоящем документе, CD38 экспрессируется в незрелых гемопоэтических клетках, снижается в зрелых клетках и снова экспрессируется с высоким уровнем в активированных лимфоцитах и плазматических клетках. Например, высокая экспрессия CD38 наблюдается в активированных B-клетках, плазматических клетках, активированных CD4+ T-клетках, активированных CD8+ T-клетках, NK-клетках, NKT-клетках, зрелых дендритных клетках (ДК) и активированных моноцитах.
[00117] Результаты, представленные в настоящем документе, неожиданны тем, что присутствие аутоантител к CD38 связывали с диабетом, хроническим аутоиммунным тиреоидитом и болезнью Грейвса (см. Antonelli et al, Clin. Exp.Immunol. 2001 126: 426-431; Mallone et al., Diabetes 50: 752 (2001) и Antonelli et al., J. Endocrinol. Invest. 27: 695-707 (2004), которые включены посредством отсылки.
[00118] Таким образом, антитела согласно изобретению находят применение в диагностике и/или лечении многих заболеваний, включающих, без ограничения перечисленным, аутоиммунные заболевания, как обсуждается ниже, включающие, без ограничения перечисленными, системную красную волчанку (СКВ), ревматоидный артрит (РА), воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и неспецифический язвенный колит.
[00119] Таким образом, например, могут быть отобраны пациенты с высоким содержанием плазматических клеток, такие как больные СКВ, которые демонстрируют высокие уровни плазматических клеток, а также больные РА, которые, как было показано, не поддаются лечению с применением терапии на основе CD20.
[00120] Терапевтические антитела против CD38 согласно настоящему изобретению связываются с CD38-положительными клетками, что приводит к истощению этих клеток, таких как активированные лимфоциты, посредством множества механизмов действия, включающих, без ограничения перечисленными, CDC, ADCC и пути апоптоза, как предусмотрено в настоящем документе, что ведет к лечению и/или уменьшению тяжести аутоиммунных заболеваний.
[00121] Одним из преимуществ, не наблюдаемых у некоторых антител против CD38 в клинических исследованиях их применения для лечения онкологических заболеваний, является способность связываться с CD38 яванского макака, поскольку этих приматов используют в доклинических исследованиях, что может привести к ранней оценке доз, токсичности, эффективности и т.д.
[00122] БЕЛКИ CD38
[00123] Таким образом, в настоящем изобретении предложены выделенные антитела против CD38, которые специфично связывают человеческий белок CD38 (и, как описано ниже, дополнительно и предпочтительно специфично связывают белок CD38 примата). Как известно из уровня техники, белки CD38 обнаружены в организмах многих видов. Особое применение в настоящем изобретении находят антитела, которые связываются как с человеческим белком CD38, так и с белками CD38 приматов, особенно приматов, используемых в клинических исследованиях, таких как яванский макак (Macaca fascicularis, макак-крабоед, иногда именуемый в настоящем документе как обезьяны "циномолгус"). "CD38 человека" или "человеческий антиген CD38" относится к белку SEQ ID NO: 1 или его функциональному фрагменту, такому как эпитоп, как определено в настоящем документе. Как правило, CD38 обладает коротким внутрицитоплазматическим хвостом, трансмембранным доменом и внеклеточным доменом, в некоторых вариантах осуществления антитела согласно изобретения связываются с внеклеточной частью белка CD38. Под "CD38 яванского макака" в настоящем документе подразумевается SEQ ID NO: 2, которая на 92% идентична CD38 человека.
[00124] Синонимы CD38 включают АДФ-рибозилциклазу 1, цАДФР-гидролазу 1, Cd38-rs1, гидролазу 1 циклической АДФ-рибозы, 1-19 и антиген NIM-R5.
[00125] В некоторых вариантах осуществления антитела против CD38 Ab79 согласно изобретению взаимодействуют с CD38 по ряду аминокислотных остатков, включающих K121, F135, Q139, D141, M142, D202, V203, H205, Q236, E239, W241, S274, C275, K276, F284, C287, V288, K289, N290, P291, E292, D293. Как предусмотрено в настоящем документе, другие антитела, которые взаимодействуют с этими остатками, также находят применение в терапевтических и диагностических целях.
[00126] В некоторых вариантах осуществления антитела против CD38 согласно настоящему изобретению необязательно (и в некоторых случаях предпочтительно) не связываются с другими членами семейства CD38, такими как CD157. Например, предпочтительные варианты осуществления в настоящем документе не связываются с CD157 человека SEQ ID NO: 23 (регистрационный номер в GenBank NP_004325).
[00127] АНТИТЕЛА
[00128] В настоящем изобретении предложены антитела против CD38, как правило, терапевтические и/или диагностические антитела, как описано в настоящем документе. Антитела, которые находят применение в настоящем изобретении, могут иметь множество форматов, как описано в настоящем документе, включая традиционные антитела, а также производные, фрагменты и миметики антител, описанные ниже. По существу в изобретении предложены структуры антител, которые содержат набор из 6 CDR-областей, как определено в настоящем документе (включающих небольшое количество аминокислотных изменений, как описано ниже).
[00129] Традиционные структурные единицы антител обычно включают тетрамер. Каждый тетрамер обычно состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара имеет одну "легкую" (как правило, имеющую молекулярную массу приблизительно 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (как правило, имеющую молекулярную массу приблизительно 50-70 кДа). Человеческие легкие цепи подразделяются на каппа и лямбда легкие цепи. Тяжелые цепи подразделяются на мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела: IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. IgG имеет несколько субклассов, в том числе, но не ограничиваясь IgG1, IgG2a, IgG3 и IgG4. IgM имеет подклассы, в том числе, без ограничения, IGM1 и IgM2. Таким образом, "изотип" при использовании в настоящем документе означает любой из субклассов иммуноглобулинов, определяемых химическими и антигенными свойствами их константных областей. Известными изотипами иммуноглобулина человека являются IgG1, IgG2a, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IGM1, IgM2, IgD и IgE. Следует понимать, что терапевтические антитела также могут включать гибриды изотипов и/или субклассов.
[00130] N-концевая часть каждой цепи включает вариабельную область, состоящую из приблизительно 100-110 или более аминокислот, которая в первую очередь ответственна за распознавание антигена. В вариабельной области три петли собираются в каждом из V-доменов тяжелой цепи и легкой цепи с образованием антигенсвязывающего участка. Каждая из петель называется определяющей комплементарность областью (далее именуемой "CDR-областью"), в которой вариация аминокислотной последовательности является наиболее значительной. "Вариабельный" относится к тому факту, что некоторые сегменты вариабельной области сильно отличаются по последовательности в различных антителах. Вариабельность в пределах вариабельной области распределена неравномерно. Вместо этого V-области состоят из относительно постоянных фрагментов, называемых каркасными областями (FR) из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими областями высокой вариабельности, называемыми "гипервариабельными областями", каждая из которых имеет длину 9-15 аминокислот или больше.
[00131] Каждая VH и VL состоит из трех гипервариабельных областей ("определяющих комплементарность областей", "CDR-областей") и четырех FR-областей, расположенных от N-конца к C-концу в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
[00132] Гипервариабельная область обычно охватывает аминокислотные остатки примерно от аминокислотных остатков 24-34 (LCDR1; "L" обозначает легкую цепь), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) в вариабельной области легкой цепи и остатки примерно вблизи 31-35B (HCDR1; "H" обозначает тяжелую цепь), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в вариабельной области тяжелой цепи; Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), и/или остатки, формирующие гиперпеременную петлю (например, остатки 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3) в вариабельной области легкой цепи и 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) и 96-101 (HCDR3) в вариабельной области тяжелой цепи; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917. Конкретные CDR-области согласно изобретению описаны ниже.
[00133] По всему тексту настоящего описания система нумерации Кэбата обычно используется для обозначения остатка в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 вариабельной области легкой цепи и остатки 1-113 вариабельной области тяжелой цепи) (например, Kabat et al., выше (1991)), с системой нумерации EU, используемой для Fc-области.
[00134] CDR-области способствуют образованию антигенсвязывающего или, более конкретно, эпитоп-связывающего участка антител. "Эпитоп" относится к детерминанте, которая взаимодействует со специфическим антигенсвязывающим участком в вариабельной области молекулы антитела, известным как паратоп.Эпитопы представляют собой группы молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и обычно также обладают специфическими структурными свойствами, а также специфическими зарядовыми свойствами. Один антиген может иметь больше одного эпитопа. Например, как показано в настоящем документе, два разных антитела, указанные в настоящем документе как "Ab19" и "Ab79", связываются с разными эпитопами на молекуле CD38.
[00135] Эпитоп может включать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании (также называемые иммунодоминантным компонентом эпитопа) и другие аминокислотные остатки, которые не участвуют в связывании непосредственно, такие как аминокислотные остатки, которые эффективно блокированы специфичным антигенсвязывающим пептидом; другими словами, аминокислотный остаток присутствует в распознаваемой области специфичного антигенсвязывающего пептида.
[00136] Эпитопы могут быть конформационными или линейными. Конформационный эпитоп образуется в результате пространственного сближения аминокислот из разных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, образованный смежными аминокислотными остатками в полипептидной цепи. Конформационные и неконформационные эпитопы можно различать благодаря тому, что связывание с первыми, но не последними, теряется в присутствии денатурирующих растворителей.
[00137] Эпитоп, как правило, включает по меньшей мере 3, а чаще по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот, в уникальной пространственной структуре. Антитела, которые распознают один и тот же эпитоп, можно проверять в простом иммунологическом анализе, который показывает способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью, например "биннинге", как описано в Примерах. Исследования методом рентгеновской кристаллографии, как показано в Примерах, позволили определить аминокислотные остатки, которые связывают как антитела согласно изобретению (включая Ab19 и Ab79), так и предшествующего уровня техники (Контроль 1 и Контроль 2), как показано на ФИГ. 4.
[00138] В настоящем изобретении, Ab79, как описано в Примерах, взаимодействует с некоторыми аминокислотными остатками CD38, включающими K121, F135, Q139, D141, M142, E239, W241, S274, C275, K276, F284, V288, K289, N290, P291, E292 и D293. Следует отметить, что эти остатки у человека и у обезьян циномолгус идентичны, за исключением того, что S274 фактически является F274 у циномолгус. Эти остатки могут представлять иммунодоминантный эпитоп и/или остатки в распознаваемой области специфичного антигенсвязывающего пептида.
[00139] В настоящем изобретении Ab19 связывается с другим эпитопом, включающим G91, E103, E1034, D105, Q107, M110, K111, T114, Q115, T148, V192, R194, R195, F196, A199, H228, N229, Q231, E233 и K234. Следует отметить, что эти остатки у человека и у обезьян циномолгус идентичны, за исключением того, что M110 является V110 у циномолгус, и A199 является T199 у циномолгус.
[00140] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитела, которые конкурируют с Ab79 и Ab19 при связывании на любом из этих эпитопов, могут применяться для лечения аутоиммунных заболеваний. Следует отметить, что у Ab79 и Контроля 1 (BM1) имеется некоторое перекрывание; таким образом, антитела, которые конкурируют с Ab79 и не являются BM1, находят применение в настоящем изобретении.
[00141] Таким образом, в настоящем изобретении предложены антитела, которые связываются с CD38 человека и яванского макака и взаимодействуют по меньшей мере с 80%, 90%, 95% или 98% этих остатков. Другими словами, площадь зоны взаимодействия не превышает площадь этих остатков.
[00142] C-концевая часть каждой цепи определяет константную область, которая в первую очередь ответственна за эффекторную функцию. Кэбат с соавт.собрали множество первичных последовательностей вариабельных областей тяжелых цепей и легких цепей. На основе степени консервативности последовательностей они классифицировали отдельные первичные последовательности в CDR и каркасной области и сделали их список (см. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, публикацию NIH, No. 91-3242, E.A. Kabat et al., полностью включенную посредством отсылки).
[00143] В IgG субклассе иммуноглобулинов в тяжелой цепи присутствуют несколько иммуноглобулиновых доменов. Под "иммуноглобулиновым (Ig) доменом" в настоящем документе подразумевается область иммуноглобулина, имеющая определенную третичную структуру. В рамках настоящего изобретения интерес представляют домены тяжелой цепи, включающие константные домены тяжелой цепи (CH) и шарнирные домены. В отношении IgG антител, каждый изотип IgG содержит три CH-области. Таким образом, "CH" домены в рамках IgG являются следующими: "CH1" относится к положениям 118-220 в соответствии с EU-индексом согласно Кэбату. "CH2" относится к положениям 237-340 в соответствии с EU-индексом согласно Кэбату, и "CH3" относится к положениям 341-447 в соответствии с EU-индексом согласно Кэбату.
[00144] Другим типом Ig домена тяжелой цепи является шарнирная область. Под "шарниром" или "шарнирной областью", или "шарнирной областью антитела", или "шарнирной областью иммуноглобулина" в настоящем документе подразумевается гибкий полипептид, включающий аминокислоты между первым и вторым константными доменами антитела. Структурно CH1 домен IgG заканчивается в положении 220 EU, а CH2 домен IgG начинается на остатке в положении 237 EU. Таким образом, в случае IgG шарнир антитела в настоящем документе определен как включающий положения от 221 (D221 в IgG1) до 236 (G236 в IgG1), где нумерация соответствует EU-индексу согласно Кэбату. В некоторые варианты осуществления, например в случае Fc-области, включена нижняя часть шарнира, где "нижняя часть шарнира" обычно соответствует положениям 226 или 230.
[00145] Особый интерес в рамках настоящего изобретения представляют Fc-области. Под "Fc" или "Fc-областью", или "Fc-доменом" при использовании в настоящем документе понимается полипептид, включающий константную область антитела за исключением первого домена константной области иммуноглобулина и, в некоторых случаях, части шарнира. Таким образом, Fc относится к двум последним доменам константной области иммуноглобулинов IgA, IgD и IgG, последним трем доменам константной области иммуноглобулинов IgE и IgM и гибкому шарниру на N-конце по отношению к указанным доменам. В случае IgA и IgM, Fc может включать J-цепь. В случае IgG, Fc-домен включает домены иммуноглобулина Cγ2 и Cγ3 (Cγ2 и Cγ3) и нижнюю шарнирную область между Cγ1 (Cγ1) и Cγ2 (Cγ2). Хотя границы Fc-области могут изменяться, Fc-область тяжелой цепи IgG человека обычно определяют как включающую остатки C226 или P230 на ее C-конце, где нумерация соответствует EU-индексу согласно Кэбату. В некоторых вариантах осуществления, как более подробно описано ниже, в Fc-область введены аминокислотные модификации, например, для изменения связывания с одним или более FcγR-рецепторами или с FcRn-рецептором.
[00146] В некоторых вариантах осуществления антитела являются полноразмерными. Под "полноразмерным антителом" в настоящем документе подразумевается структура, которая составляет природную биологическую форму антитела, включающую вариабельные и константные области, включающие одну или более модификаций, как описано в настоящем документе.
[00147] В альтернативе антитела могут быть раличными структурами, включающими, без ограничения перечисленными, фрагменты антител, моноклональные антитела, биспецифичные антитела, минитела, доменные антитела, синтетические антитела (иногда именуемые в настоящем документе "миметиками антител"), химерные антитела, гуманизированные антитела, слитые конструкции антител (иногда именуемые "конъгатами антител") и фрагменты каждого из них, соответственно. Структуры, которые также основаны
[00148] В одном варианте осуществления антитело является фрагментом антитела. Конкретные фрагменты антитела включают, без ограничения перечисленными: (i) Fab-фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и CH1 доменов, (ii) Fd-фрагмент, состоящий из VH и CH1 доменов, (iii) Fv-фрагмент, состоящий из VL и VH доменов одного антитела; (iv) dAb-фрагмент (публикация Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546, полностью включенная посредством отсылки), который состоит из одной вариабельной, (v) выделенные CDR-области, (vi) F(ab')2-фрагменты, бивалентный фрагмент, включающий два связанных Fab-фрагмента, (vii) молекулы одноцепочечного Fv (scFv), где VH-домен и VL-домен связаны пептидным линкером, который позволяет этим двум доменам ассоциировать с образованием антигенсвязывающего участка (Bird et al., 1988, Science 242: 423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5879-5883, полностью включенные посредством отсылки), (viii) биспецифичный одноцепочечный Fv (WO 03/11161, настоящим включенная посредством отсылки) и (ix) "диатела" или "триатела", мультивалентные или мультиспецифичные фрагменты, сконструированные путем слияния генов (Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326: 461-479; WO 94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-6448, полностью включенные посредством отсылки).
[00149] ХИМЕРНЫЕ И ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА
[00150] В некоторых вариантах осуществления антитело может быть смесью из различных видов, например, химерным антителом и/или гуманизированным антителом. Таким образом, в настоящем изобретении наборы CDR-областей могут использоваться с каркасными и константными областями, которые отличаются от тех, которые конкретно описаны последовательностью в настоящем документе.
[00151] Как правило, "химерные антитела" и "гуманизированные антитела" относятся к антителам, которые объединяют в себе области из организмов больше чем одного вида. Например, "химерные антитела" обычно включают вариабельную область(и) мыши (или крысы, в некоторых случаях) и константную область(и) человека. "Гуманизированные антитела" обычно относятся к нечеловеческим антителам, в которых каркасные области вариабельного домена были заменены последовательностями, присутствующими в человеческих антителах. Обычно в гуманизированном антителе все антитело, кроме CDR-областей, кодируется полинуклеотидом человеческого происхождения или идентично такому антителу, за исключением его CDR-областей. CDR-области, часть или все из которых кодируются нуклеиновыми кислотами, происходящими из не относящегося к человеку организма, перевивают на бета-складчатый каркас вариабельной области человеческого антитела с получением антитела, специфичность которого определют перевитые CDR-области. Получение таких антител описано, например, в WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321: 522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536, которые полностью включены посредством отсылки. "Обратная мутация" выбранных акцепторных остатков каркасной области с заменой на соответствующие донорные остатки часто требуется для восстановления аффинности, которая теряется в первоначальной перевитой конструкции (US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213, которые полностью включены посредством отсылки). Гуманизированное антитело в оптимальном варианте также будет включать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина, как правило, из человеческого иммуноглобулина, и, таким образом, будет, как правило, включать человеческую Fc-область. Гуманизированные антитела также могут быть получены при использовании мышей с генетически модифицированной иммунной системой. См. публикацию Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639-654, полностью включенную посредством отсылки. В уровне техники известны различные методы и способы гуманизации и реконструирования нечеловеческих антител (см. Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), а также источники, процитированные в них, которые полностью включены посредством отсылки). Способы гуманизации включают, без ограничения перечисленными, способы, описанные в Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al.,1988; Nature 332: 323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86: 10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89: 4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57 (20): 4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4181-4185;  et al., 1998, Protein Eng 11: 321-8, полностью включенные посредством отсылки. Гуманизация или другие способы снижения иммуногенности вариабельных участков нечеловеческих антител могут включать способы переукладки, как описано, например, в публикации Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969-973, полностью включенной посредством отсылки. В одном варианте осуществления исходное антитело было подвергнуто созреванию аффинности, как известено в уровне техники. Способы на основе структуры могут использоваться для гуманизации и созревания аффинности, например, как описано в USSN 11/004,590. Способы на основе отбора могут использоваться для гуманизации и/или созревания аффинности вариабельных участков антитела, в том числе, без ограничения перечисленными, способы, описанные в Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294: 151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272 (16): 10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 (37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16 (10): 753-759, полностью включенные посредством отсылки. Другие способы гуманизации могут включать перевивание только частей CDR-областей, в том числе, без ограничения перечисленными, способы, описанные в USSN 09/810,510; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169: 1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169: 3076-3084, полностью включенных посредством отсылки.
[00152] В одном варианте осуществления антитела согласно изобретению могут представлять собой мультиспецифичные антитела, и, в частности, биспецифичные антитела, также иногда называемые "диателами". Эти антитела связываются с двумя (или более) разными антигенами или разными эпитопами на одном и том же антигене. Диатела могут быть получены различными способами, известными в уровне техники (Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4: 446-449, полностью включенная посредством отсылки), например, получены химически или из гибридных гибридом.
[00153] В одном варианте осуществления антитело является минителом. Минитела минимальные антителоподобные белки, включающие scFv, соединенный с CH3 доменом. См. публикацию Hu et al., 1996, Cancer Res. 56: 3055-3061, полностью включенную посредством отсылки. В некоторых случаях scFv может быть соединен с Fc-областью и может включать часть или всю шарнирную область.
[00154] Антитела согласно настоящему изобретению обычно являются выделенными или рекомбинантными. "Выделенный" при использовании для описания различных полипептидов, раскрытых в настоящем документе, означает полипептид, который был идентифицирован и отделен от и/или извлечен из клетки или культуры клеток, в которой он был экспрессирован. Обычно выделенный полипептид получают по меньшей мере в одной стадии очистки. "Выделенное антитело" относится к антителу, которое по существу не содержит других антител, обладающих другой антигенной специфичностью. Например, выделенное антитело, которое специфически связывается с CD38, по существу не содержит антител, которые специфически связывают другие антигены кроме CD38.
[00155] Выделенное антитело, которое специфично связывается с эпитопом, изоформой или вариантом CD38 человека или CD38 яванского макака, может, впрочем, обладать перекрестной реактивностью по отношению к другим родственным антигенам, например из других видов, таким как видовые гомологи CD38. Кроме того, выделенное антитело может по существу не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ.
[00156] Выделенные моноклональные антитела, обладающие другой специфичностью, могут быть объединены в хорошо определенной композиции. Таким образом, например, Ab79 и Ab19 при необходимости могут быть объединены в одной композиции.
[00157] Антитела против CD38 согласно настоящему изобретению специфично связывают лиганды CD38 (например, белки CD38 человека и яванского макака SEQ ID NO: 1 и 2. "Специфичное связывание" или "специфично связывается с", или является "специфичным в отношении" конкретного антигена или эпитопа означает связывание, которое измеримо отличается от неспецифичного взаимодействия. Специфичное связывание может быть измерено, например, при определении связывания молекулы в сравнении со связыванием контрольной молекулы, которая обычно является молекулой с подобной структурой, которая не имеет связывающей активности. Например, специфичное связывание может быть определено при конкуренции с контрольной молекулой, которая подобна мишени.
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-11
-12
[00158] Специфичное связывание в отношении конкретного антигена или эпитопа может демонстрировать, например, антитело, имеющее KD в отношении антигена или эпитопа по меньшей мере приблизительно 10 М, по меньшей мере приблизительно 10 М, по меньшей мере приблизительно 10 М, по меньшей мере приблизительно 10 М, по меньшей мере приблизительно 10 М, по меньшей мере приблизительно 10 М, в альтернативе по меньшей мере приблизительно 10 М, по меньшей мере приблизительно 10 М, по меньшей мере приблизительно 10 М или больше, где KD относится к скорости диссоциации взаимодействия конкретного антитела-антигена. Как правило, антитело, которое специфично связывает антиген, будет иметь KD, которая в 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 или более раз больше в отношении контрольной молекулы по сравнению с антигеном или эпитопом.
[0100] Кроме того, специфичное связывание в отношении конкретного антигена или эпитопа может демонстрировать, например, антитело, имеющее KA или Ka в отношении антигена или эпитопа по меньшей мере в 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 или более раз больше в отношении эпитопа по сравнению с контролем, где KA или Ka относятся к скорости ассоциации взаимодействия конкретного антитела-антигена.
[0101] МОДИФИКАЦИИ АНТИТЕЛ
[0102] В настоящем изобретении также предложены различные антитела. Таким образом, существует множество модификаций, которые могут быть введены в антитела согласно изобретению, включающие, без ограничения перечисленными, модификации аминокислот в CDR-областях (созревание аффинности), модификации аминокислот в Fc-области, варианты гликозилирования, ковалентные модификации других типов и т.д.
[0103] Под "вариантом" в настоящем документе понимается полипептидная последовательность, которая отличается от последовательности исходного полипептида в результате модификации по меньшей мере одной аминокислоты. Модификации аминокислот могут включать замены, вставки и делеции, наиболее предпочтительными из которых во многих случаях являются первые.
[0104] Как правило, варианты могут включать любое количество модификаций при условии сохранения функции белка, как описано в настоящем документе. Таким образом, в случае аминокислотных вариантов, полученных, например, с CDR-областями Ab79 или Ab19, антитело должно все еще специфично связываться с CD38 человека и яванского макака. Аналогичным образом, если аминокислотные варианты получены с Fc-областью, например, варианты антител должны сохранять необходимые функции связывания рецептора для конкретного применения или показания антитела.
[0105] Впрочем, как правило, обычно используют от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен, так как часто цель состоит в том, чтобы изменить функцию с минимальным количеством модификаций. В некоторых случаях присутствует от 1 до 5 модификаций, при этом во многих вариантах осуществления также применяют от 1-2, 1-3 и 1-4.
[0106] Следует отметить, что такое количество аминокислотных модификаций может присутствовать в функциональных доменах: например, может быть желательным наличие от 1-5 модификаций в Fc-области белков дикого типа или рекомбинантных белков, а также от 1 до 5 модификаций в Fv-области, например. Вариант полипептидной последовательности предпочтительно будет обладать по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или до 98 или 99% идентичностью по отношению к исходным последовательностям (например, вариабельным областям, константным областям и/или последовательностям тяжелой и легкой цепи Ab79 и/или Ab19). Следует отметить, что в зависимости от размера последовательности процент идентичности будет зависеть от количества аминокислот.
[0107] Под "аминокислотной заменой" или "заменой" в настоящем документе подразумевается замена аминокислоты в определенном положении исходной полипептидной последовательности другой аминокислотой. Например, замена S100A относится к варианту полипептида, в котором серин в положении 100 заменен аланином. Под "аминокислотной вставкой" или "вставкой" при использовании в настоящем документе подразумевается введение аминокислоты в определенное положение исходной полипептидной последовательности. Под "аминокислотной делецией" или "делецией" при использовании в настоящем документе подразумевается удаление аминокислоты в определенном положении исходной полипептидной последовательности.
[0108] Под "исходным полипептидом", "исходным белком", "полипептидом-предшественником" или "белком-предшественником" в настоящем документе подразумевается немодифицированный полипептид, который впоследствии подвергается модификации с получением варианта. Как правило, исходными полипептидами в настоящем документе являются Ab79 и Ab19. Исходный полипептид может относиться к самому полипептиду, композициям, которые включают исходный полипептид, или к аминокислотной последовательности, которая кодирует его. Таким образом, "исходный Fc полипептид" при использовании в настоящем документе означает Fc полипептид, который модифицирован с получением варианта, а под "исходным антителом", используемым в настоящем документе, подразумевается антитело, которое модифицировано с получением варианта антитела.
[0109] Под "диким типом" или "WT", или "нативным" в настоящем документе подразумевается аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность, которая существует в природе, включая аллельные варианты. Белок, полипептид, антитело, иммуноглобулин, IgG WT и т.д. имеет аминокислотную последовательность или нуклеотидную последовательность, которая не была преднамеренно модифицирована.
[0110] Под "вариантом Fc-области" в настоящем документе подразумевается Fc-последовательность, которая отличается от такой Fc-последовательности дикого типа в результате модификации по меньшей мере одной аминокислоты. Fc вариант может относиться к самому полипептиду Fc, композициям, включающим полипептид Fc варианта, или аминокислотной последовательности.
[0111] В некоторых вариантах осуществления одна или более аминокислотных модификаций сделаны в одной или более CDR-областях антитела (Ab79 или Ab19). Как правило, только 1 или 2, или 3 аминокислоты заменены в какой-либо одной CDR-области, и обычно не больше 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 изменений сделаны в наборе CDR-областей. Однако следует понимать, что любая комбинация 0, 1, 2 или 3 замен в любой CDR-области может быть независимо и необязательно объединена с любой другой заменой.
[0112] В некоторых случаях аминокислотные модификации в CDR-областях именуются "созреванием аффинности". Подвергнутое "созреванию аффинности" антитело является антителом, имеющим одно или более изменений в одной или более CDR-областях, что приводит к улучшению аффинности антитела в отношении антигена по сравнению с исходным антителом, которое не обладает таким изменением(ями). В некоторых случаях, хотя и редко, может быть желательным уменьшение аффинности антитела по отношению к его антигену, но обычно это не является предпочтительным.
[0113] Созревание аффинности может быть выполнено для увеличения аффинности связывания антитела к антигену по меньшей мере приблизительно на 10% до 50-100-150% или больше, или от 1 до 5 раз по сравнению с "исходным" антителом. Предпочтительные антитела с созревшей аффинностью будут иметь наномолярные или даже пикомолярные аффинности в отношении антигена-мишени. Антитела с созревшей аффинностью получают с помощью известных методик. См., например, публикацию Marks et al., 1992, Biotechnology 10: 779-783, в которой описано созревание аффинности с помощью шаффлинга вариабельных доменов тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL). Случайный мутагенез остатков в CDR-области и/или каркасной области описан, например, в Barbas, et al. 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169: 147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154 (7): 3310-9; и Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol. 226: 889-896.
[0114] В альтернативе в одной или более CDR-областях антител согласно изобретению могут быть сделаны модификации аминокислот, которые являются "молчащими", например, которые не приводят к значительному изменению аффинности антитела к антигену. Они могут быть сделаны по ряду причин, включая оптимизацию экспрессии (как может быть сделано для нуклеиновых кислот, кодирующих антитела согласно изобретению).
[0115] Таким образом, в рамки определения CDR-областей и антител согласно изобретению включены варианты CDR-областей и антител; то есть антитела согласно изобретению могут включать аминокислотные модификации в одной или более CDR-областях Ab79 и Ab19. Кроме того, как предусмотрено ниже, аминокислотные модификации также могут быть независимо и необязательно сделаны в любой области вне CDR-областей, включая каркасные и константные области.
[0116] В некоторых вариантах осуществления описаны варианты антител Ab79 и Ab19, специфичные к CD38 человека (SEQ ID NO: 1) и CD38 циномолгус (SEQ ID NO: 2). Это антитело состоит из шести CDR, где каждая CDR данного антитела может отличаться от SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 заменой 0, 1 или 2 аминокислот.В других вариантах вариант антитела против CD38 состоит из шести CDR, где каждая CDR данного антитела может отличаться от SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 заменой 0, 1 или 2 аминокислот.
[0117] В некоторых вариантах осуществления антитела против CD38 согласно изобретению состоят из варианта Fc-домена. Как известно из уровня техники, Fc-область антитела взаимодействует с рядом Fc-рецепторов и лигандов, сообщая ряд важных функциональных свойств, называемых эффекторными функциями. Эти Fc-рецепторы включают (без ограничения перечисленными) (у человека) Fc-RI (CD64), в том числе изоформы Fc-RIA, Fc-RIB и Fc-RIC; FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIa (в том числе аллотипы H131 и R131), FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2) и FcγRIIc; и FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIa (в том числе аллотипы V158 и F158, коррелирующие с антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC)) и FcγRIIIb (в том числе аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2), FcRn (неонатальный рецептор), C1q (белок комплемента, участвующий в комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC)) и FcRn (неонатальный рецептор, влияющий на полупериод существования в сыворотке). Подходящие модификации могут быть сделаны в одном или более положениях, как в общем описано, например, в заявке на патент США 11/841,654 и истониках, цитируемых в ней, US 2004/013210, US 2005/0054832, US 2006/0024298, US 2006/0121032, US 2006/0235208, US 2007/0148170, USSN 12/341769, патенте США 6,737,056, патенте США 7,670,600, патенте США 6,086,875, каждый из которых полностью включен посредством отсылки и, в частности, в отношении конкретных аминокислотных замен, которые увеличивают связывание с Fc-рецепторами.
[0118] В дополнение к модификациям, описанным выше, могут быть сделаны другие модификации. Например, молекулы могут быть стабилизированы путем включения дисульфидных мостиков, соединяющих VH и VL домены (Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14: 1239-1245, полностью включенная посредством отсылки). Кроме того, существует множество ковалентных модификаций антител, которые могут быть сделаны, как описано ниже.
[0119] Ковалентные модификации антител включены в объем настоящего изобретения, и обычно, но не всегда, их проводят посттрансляционно. Например, несколько типов ковалентных модификаций антитела вводят в молекулу при реакции определенных аминокислотных остатков антитела с органическим дериватизирующим агентом, который способен к взаимодействию с выбранными боковыми цепями или N-или C-концевыми остатками.
[0120] Цистеинильные остатки обычно реагируют с α-галогенацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид, с получением карбоксиметил или карбоксиамидометил производных. Цистеинильные остатки также могут быть дериватизированы в реакции с бромтрифторацетоном, α-бром-β-(5-имидазоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, N-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридил-дисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, п-хлормеркурбензоатом, 2-хлормеркур-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом и т.п.
[0121] Гистидильные остатки дериватизируют в реакции с диэтилпирокарбонатом при pH 5,5-7,0, поскольку данный агент является относительно специфичным в отношении гистидильной боковой цепи. Также можно применять пара-бромфенацилбромид; реакцию предпочтительно проводят в 0,1 М какодилате натрия при pH 6,0.
[0122] Лизинильные и N-концевые остатки подвергают реакции с ангидридами янтарной или других карбоновых кислот.Дериватизация указанными агентами вызывает изменение заряда лизинильных остатков. Другие подходящие реагенты для дериватизации содержащих альфа-аминогруппу остатков включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлорборогидрид; тринитробензолсульфоновую кислоту; O-метилизомочевину; 2,4-пентандион и катализируемую трансаминазой реакцию с глиоксилатом.
[0123] Аргинильные остатки модифицируют в реакции с одним или несколькими стандартными реагентами, которые включают фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Дериватизация остатков аргинина требует, что реакцию проводили в щелочных условиях из-за высокого значения pKa гуанидиновой функциональной группы. Кроме того, указанные реагенты могут взаимодействовать с группами лизина, а также эпсилон-аминогруппой аргинина.
[0124] Специфическая модификация тирозильных остатков может быть выполнена, с особым интересом введения спектральных меток в тирозильные остатки, в реакции с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Чаще всего N-ацетилимидазол и тетранитрометан используют для получения O-ацетилтирозильных соединений и 3-нитропроизводных, соответственно. Тирозильные остатки иодируют при использовании 125I или 131I с получением меченых белков для применения в радиоиммуноанализе, при этом подходящим является вышеописанный метод с хлорамином T.
[0125] Карбоксильные боковые группы (аспартильные или глутамильные) селективно модифицируют в реакции с карбодиимидами (R'-N=C=N-R'), где R и R' необязательно являются разными алкильными группами, такими как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азоний-4,4-диметилпентил)-карбодиимид. Кроме того, аспартильные и глутамильные остатки превращают в аспарагинильные и глутаминильные остатки в реакции с ионами аммония.
[0126] Дериватизация бифункциональными агентами подходит для сшивания антител с нерастворимой в воде несущей матрицей или поверхностью для применения в различных способах в дополнение к способам, описанным ниже. Часто применяемые сшивающие агенты включают, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, N-гидроксисукцинимидные эфиры, например, эфиры 4-азидосалициловой кислоты, гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидильные эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан. Дериватизирующие агенты, такие как метил-3-[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат, дают фотоактивируемые промежуточные продукты, которые могут образовывать поперечные связи в присутствии света. В альтернативе реакционноспособные нерастворимые в воде матрицы, такие как бромциан-активированные углеводы и реакционноспособные субстраты, описанные в патентах США 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 и 4,330,440, которые полностью включены в настоящее описание посредством отсылки, применяются для иммобилизации белков.
[0127] Глутаминильные и аспарагинильные остатки часто дезамидируют с образованием соответствующих глутамильных и аспартильных остатков, соответственно. В альтернативе эти остатки дезамидируют в умеренно кислой среде. Любая форма указанных остатков входит в объем настоящего изобретения.
[0128] Другие модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп серильных или треонильных остатков, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (Т.Е. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983], полностью включенная в настоящее описание посредством отсылки), ацетилирование N-концевого амина и амидирование любой С-концевой карбоксильной группы.
[0129] Кроме того, как будет очевидно специалистам в данной области, метки (в том числе флуоресцентные, ферментативные, магнитные, радиоактивные и т.д., могут быть введены в антитела (а также другие композиции согласно изобретению)).
[0130] ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ
[0131] Другим типом ковалентной модификации являются изменения гликозилирования. В другом варианте осуществления антитела, раскрытые в настоящем документе, могут быть модифицированы путем включения одной или более модифицированных гликоформ. Под "модифицированной гликоформой» при использовании в настоящем документе подразумевается углеводная композиция, которая ковалентно присоединена к антителу, где указанная углеводная композиция химически отличается от углеводной композиции исходного антитела. Модифицированные гликоформы могут применяться в различных целях, включающих, без ограничения перечисленными, усиление или ослабление эффекторной функции. Предпочтительной формой модифицированной гликоформы является афукозилирование, которое, как было показано, коррелировало с усилением функции ADCC, по-видимому, в результате более прочного связывания с FcγRIIIa рецептором. В этом контексте "афукозилирование" означает, что большая часть антитела, продуцируемого в клетках-хозяевах, по существу не имеет фукозы, например, 90-95-98% продуцируемых антител не имеет значимого количества фукозы в качестве компонента углеводной группы антитела (обычно присоединенной к N297 в Fc-области). Определенные в функциональном отношении, афукозилированные антитела обычно демонстрируют по меньшей мере 50% или более высокую аффинность в отношении FcγRIIIa рецептора.
[0132] Модифицированные гликоформы могут быть получены различными способами, известными в уровне техники (Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17: 176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473; US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1, полностью включенные в настоящее описание посредством отсылки; (технология Potelligent [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; технология инженерии гликозилирования GlycoMAb [Glycart Biotechnology AG, Zurich, Switzerland]). Многие из таких технологий основаны на контроле уровня фукозилированных и/или разветвленных олигосахаридов, ковалентно присоединенных к Fc-области, например, путем экспрессии IgG в различных организмах или линиях клеток, созданных или полученных иным образом (например, клетки CHO Lec-13 или клетки гибридомы крысы YB2/0), путем регуляции ферментов, участвующих в пути гликозилирования (например, FUT8 [α1,6-фукозилтрансферазы] и/или β1-4-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III [GnTIII]), или путем модификации углевода(ов) после экспрессии IgG. Например, "антитело с модифицированным сахаром" или "технология SEA", разработанная Seattle Genetics, заключается в добавлении модифицированных сахаридов, которые ингибируют фукозилирование в процессе синтеза; см., например, 20090317869, полностью включенный посредством отсылки. Модифицированная гликоформа, как правило, относится к другому углеводу или олигосахариду; таким образом, антитело может включать модифицированную гликоформу.
[0133] В альтернативе модифицированная гликоформа может относиться к варианту IgG, который включает другой углевод или олигосахарид. Как известно в уровне техники, профили гликозилирования могут зависеть от последовательности белка (например, от присутствия или отсутствия конкретных гликозилированных аминокислотных остатков, обсуждаемых ниже) или клетки-хозяина или организма, в котором проходит синтез белка. Конкретные системы экспрессии обсуждаются ниже.
[0134] Гликозилирование пептидов, как правило, является либо N-связанным, либо O-связанным. N-связанный относится к присоединению углеводной группы к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где Х является любой аминокислотой кроме пролина, являются последовательностями узнавания ферментативного присоединения углеводной молекулы к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из таких трипептидных последовательностей в полипептиде создает возможный сайт гликозилирования. O-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров, N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы, к гидроксиаминокислоте, обычно серину или треонину, хотя также могут использоваться 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
[0135] Добавление сайтов гликозилирования в антитело удобным способом осуществляют путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы она содержала одну или более вышеописанных трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Указанное изменение также может быть сделано путем добавления или замены одного или более остатков серина или треонина в исходной последовательности (для O-связанных сайтов гликозилирования). Для удобства аминокислотную последовательность антитела предпочтительно изменяют посредством изменений на уровне ДНК, в частности путем мутации ДНК, кодирующей целевой полипептид, по предварительно выбранных основаниям, в результате чего образуются кодоны, которые будут транслироваться в требуемые аминокислоты.
[0136] Другим способом увеличения количества углеводных групп антитела является химическое или ферментативное соединение гликозидов с белком. Данные процедуры обладают преимуществом, которое обусловлено тем, что они не требуют продукции белка в клетке-хозяине, которая обладает способностью к N- и O-связанному гликозилированию. В зависимости от используемого способа соединения, сахар(а) может быть присоединен к (а) аргинину и гистидину, (b) свободным карбоксильным группам, (с) свободным сульфгидрильным группам, таким как сульфгидрильные группы цистеина, (d) свободным гидроксильным группам, таким как гидроксильные группы серина, треонина или гидроксипролина, (е) ароматическим остаткам, таким как ароматические остатки фенилаланина, тирозина или триптофана, или (f) амидной группе глутамина. Эти способы описаны в WO 87/05330 и в Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306, которые полностью включены посредством отсылки.
[0137] Удаление углеводных групп, присутствующих в исходном антителе (например, посттрансляционно), может быть осуществлено химически или ферментативно. Химическое дегликозилирование требует воздействия на белок соединения трифторметансульфоновой кислоты или эквивалентного соединения. Данное воздействие приводит к отщеплению большей части или всех сахаров за исключением связывающего сахара (N-ацетилглюкозамина или N-ацетилгалактозамина), при этом полипептид остается интактным. Химическое дегликозилирование описано в публикациях Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 и Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118: 131, которые полностью включены посредством отсылки. Ферментативное отщепление углеводных групп в полипептидах может быть выполнено при использовании различных эндо- и экзогликозидаз, как описано в публикации Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138: 350, которая полностью включена посредством отсылки. Гликозилирование на потенциальных сайтах гликозилирования может быть предотвращено при использовании соединения туникамицина, как описано в публикации Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 3105, которая полностью включена посредством отсылки. Туникамицин блокирует образование белок-N-гликозидных связей.
[0138] Другой тип ковалентной модификации антитела включает связывание антитела с различными небелковыми полимерами, включающими, без ограничения, различные полиолы, такие как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль или полиоксиалкилены, как описано, например, в Каталоге ПЭГ 2005-2006 Nektar Therapeutics (доступном на веб-сайте Nektar), патентах США 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 или 4,179,337, которые полностью включены посредством отсылки. Кроме того, как известно в уровне техники, аминокислотные замены могут быть сделаны в разных положениях антитела для облегчения присоединия таких полимеров, как ПЭГ. См., например, публикацию U.S. 2005/0114037 А1, которая полностью включена посредством отсылки.
[0139] ОПРЕДЕЛЕННЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ CDR И ВАРИАБЕЛЬНОЙ ОБЛАСТИ
[0140] В настоящем изобретении предложен ряд антител, каждое из которых имеет определенный набор CDR-областей (включающих, как описано выше, некоторые аминокислотные замены). Как описано выше, антитела могут быть определены наборами из 6 CDR-областей, вариабельными областями или полноразмерными тяжелыми и легкими цепями, включающими константные области. Кроме того, как описано выше, также могут быть сделаны аминокислотные замены. Как правило, в контексте изменений в CDR-областях, из-за относительно короткой длины CDR-областей, аминокислотные модификации обычно описываются количеством аминокислотных модификаций, которые могут быть сделаны. Хотя это также применимо к обсуждению количества аминокислотных модификаций, которые могут быть введены в вариабельные, константные или полноразмерные последовательности, в дополнение к количеству изменений, также можно определить эти изменения в "% идентичности". Таким образом, как описано в настоящем документе, антитела, включенные в изобретение, на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичны SEQ ID NO, перечисленным в настоящем документе.
[0141] В отношении антитела Ab79, набор CDR-областей является следующим: три CDR-области тяжелой цепи включают SEQ ID NO: 3 (HCDR1) HCDR1, SEQ ID NO: 4 (HCDR2) и SEQ ID NO: 5 (HCDR3), и три CDR-области легкой цепи включают SEQ ID NO: 6 (LCDR1), SEQ ID NO: 7 (LCDR2) и SEQ ID NO: 8 (LCDR3).
[0142] В отношении Ab19, набор CDR-областей является следующим: HCDR1 (SEQ ID NO: 13), HCDR2 (SEQ ID NO: 14) и HCDR3 (SEQ ID NO: 15), и LCDR1 (SEQ ID NO: 16), LCDR2 (SEQ ID NO: 17) и LCDR3 (SEQ ID NO: 18).
[0143] Прямо исключены из настоящего изобретения антитела SEQ ID NO: 24 и 25 (тяжелая и легкая цепи Контроля 1) и SEQ ID NO: 26 и 27 (тяжелая и легкая цепи Контроля 2). Следует отметить, что эти антитела не обладают перекрестной реактивностью с CD38 яванского макака, как обсуждается ниже.
[0144] Антитела согласно изобретению обладают перекрестной реактивностью с CD38 человека и яванского макака и, таким образом, являются антителами с межвидовой перекрестной реактивностью. "Антитело с межвидовой перекрестной реактивностью" представляет собой антитело, которое обладает аффинностью связывания с антигеном млекопитающего первого вида, которая является почти такой же, как аффинность связывания с гомологом этого антигена из млекопитающего второго вида. Межвидовая перекрестная реактивность может быть выражена, например, как отношение KD антитела к антигену млекопитающего первого вида к KD того же антитела к гомологу этого антигена из млекопитающего второго вида, где отношение составляет 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 5, 10, 15, до 20. В альтернативе или дополнительно, антитело обладает "межвидовой перекрестной реактивностью", когда оно проявляет терапевтическую или диагностическую эффективность при введении второму виду. Таким образом, в данном случае антитела согласно изобретению обладают перекрестной реактивностью с CD38 яванского макака, демонстрируют доклиническую эффективность при введении приматам циномолгус и, таким образом, считаются перекрестно-реактивными.
[0145] В некоторых вариантах осуществления предложены антитела, которые конкурируют с антителами изобретения (например, с Ab79 и/или Ab19) за связывание с CD38 человека и/или CD38 яванского макака, но не включают или BM1 или BM2. Конкуренция за связывание с CD38 или частью CD38 между двумя или более антителами против CD38 может быть определена с помощью любой подходящей методики, как известно в уровне техники.
[0146] Конкуренция в рамках настоящего изобретения относится к любому обнаружимо значимому снижению способности антитела согласно изобретению (например, Ab79 или Ab19) связываться с его конкретным партнером по связыванию, например, CD38, в присутствии тестируемого соединения. Как правило, конкуренция означает по меньшей мере приблизительно 10-100% снижение связывания антитела согласно изобретению с CD38 в присутствии конкурента, как измеряют с помощью стандартных методов, такими как ИФА или анализ Biacore. Таким образом, например, можно установить критерии способности к конкуренции, при которых обнаруживается по меньшей мере приблизительно 10% относительное ингибирование; по меньшей мере приблизительно 15% относительное ингибирование; или по меньшей мере приблизительно 20% относительное ингибирование, прежде чем антитело считают достаточно конкурентным. В случаях, когда эпитопы, принадлежащие конкурирующим антителам, близко расположены в антигене, конкуренция может быть отмечена более чем приблизительно 40% относительным ингибированием связывания CD38 (например, по меньшей мере приблизительно 45% ингибированием, таким как по меньшей мере приблизительно 50% ингибирование, например по меньшей мере приблизительно 55% ингибирование, такое как по меньшей мере приблизительно 60% ингибирование, например, по меньшей мере приблизительно 65% ингибирование, такое как по меньшей мере приблизительно 70% ингибирование, например, по меньшей мере приблизительно 75% ингибирование, такое как по меньшей мере приблизительно 80% ингибирование, например, по меньшей мере приблизительно 85% ингибирование, такое как по меньшей мере приблизительно 90% ингибирование, например, по меньшей мере приблизительно 95% ингибирование или более высокий уровень относительного ингибирования).
[0147] В некоторых случаях, один или больше компонентов анализов конкурентного связывания помечены, как обсуждается ниже в контексте диагностических применений.
[0148] Также может существовать конкуренция между антителами против CD38 в отношении более чем одного эпитопа CD38 и/или части CD38, например, в условиях, когда связывающие свойства антитела по отношению к конкретной области CD38 сохраняются в его фрагментах, например, в случае хорошо представленного линейного эпитопа, расположенного в различных тестируемых фрагментах, или конформационного эпитопа, который присутствует в достаточно крупных фрагментах CD38, как и в CD38.
[0149] Оценка конкуренции, как правило, включает оценку относительного ингибирующего связывания при использовании антитела согласно изобретению, CD38 (человека и/или яванского макака) и тестируемой молекулы. Тестируемые молекулы могут включать любую молекулу, в том числе другие антитела, малые молекулы, пептиды и т.д. Соединения смешивают в количествах, которые являются достаточными для проведения сравнения, которое дает информацию о селективности и/или специфичности исследуемых молекул по сравнению с другими присутствующими молекулами.
[0150] Количества тестируемого соединения, CD38 и антител согласно изобретению могут быть различными. Например, для оценок в ИФА требуется приблизительно 5-50 мкг (например, приблизительно 10-50 мкг, приблизительно 20-50 мкг, приблизительно 5-20 мкг, приблизительно 10-20 мкг и т.д.) антитела против CD38 и/или мишеней CD38, чтобы оценить, существует ли конкуренция. Условия также должны подходить для связывания. Как правило, физиологические или почти физиологические условия (например, температуры приблизительно 20-40°C, pH приблизительно 7-8 и т.д.) подходят для связывания антитела против CD38:CD38.
[0151] Часто конкуренция характеризуется значительно более высоким относительным ингибированием, чем приблизительно 5%, что определяется с помощью ИФА и/или FACS анализа. Может быть желательно установить более высокий порог относительного ингибирования в качестве критерия/детерминанты того, что является подходящим уровнем конкуренции в конкретном контексте (например, когда конкурентный анализ используется для отбора или скрининга новых антител, созданных с предполагаемой функцией блокирования связывания другого пептида или молекулы, связывающей CD38 (например, природные партнеры CD38 по связыванию, такие как CD31, также называемый антигеном CD31, EndoCAM, GPIIA, PECAM-1, молекула адгезии тромбоцитов/эндотелиальных клеток или существующие в природе антитела против CD38).
[0152] В некоторых вариантах осуществления антитело против CD38 согласно настоящему изобретению специфично связывается с одним или более остатками или областями в CD38, но также не обладает перекрестной реактивностью с другими белками с гомологией к CD38, такими как BST-1 (антиген стромальных клеток костного мозга 1) и Mo5, также называемый CD157.
[0153] Как правило, отсутствие перекрестной реактивности означает меньше чем приблизительно 5% относительное конкурентное ингибирование между молекулами при оценке с помощью ИФА и/или FACS анализа с использованием достаточных количеств молекул при подходящих условиях анализа.
[0154] ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ CD38
[0155] Раскрытые антитела могут найти применение при блокировании взаимодействия лиганда-рецептора или ингибировании взаимодействия компонента рецептора. Антитела против CD38 согласно изобретению могут быть "блокирующими" или "нейтрализующими". "Нейтрализующее антитело" служит для обозначения антитела, связывание которого с CD38 приводит к ингибированию биологической активности CD38, например, его способности взаимодействовать с лигандами, ферментативной активности, сигнальной способности и, в частности, способности вызывать активацию лимфоцитов. Ингибирование биологической активности CD38 может быть оценено с помощью одного или более из нескольких стандартных анализов in vitro или in vivo, известных в уровне техники (см. Примеры ниже).
[0156] "Ингибирует связывание" или "блокирует связывание" (например, при указании ингибирования/блокирования связывания партнера по связыванию CD38 с CD38) включает как частичное, так и полное ингибирование/блокирование. Ингибирование/блокирование связывания партнера по связыванию CD38 с CD38 может уменьшать или изменять нормальный уровень или тип клеточной сигнализации, который присутствует при связывании партнера по связыванию CD38 с CD38 без ингибирования или блокирования. Предполагается, что ингибирование и блокирование также включают любое поддающееся измерению снижение аффинности связывания партнера по связыванию CD38 с CD38 в контакте с антителом против CD38 по сравнению с лигандом, не находящимся в контакте с антителом против CD38, например, блокирование связывания партнера по связыванию CD38 с CD38 по меньшей мере приблизительно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% или 100%.
[0157] Раскрытые антитела против CD38 также могут ингибировать рост клеток. "Ингибирует рост" включает любое поддающееся измерению уменьшение роста клеток при контакте с антителом против CD38 по сравнению с ростом таких же клеток, не находящихся в контакте с антителом против CD38, например ингибирование роста культуры клеток по меньшей мере на приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% или 100%.
[0158] В некоторых вариантах осуществления раскрытые антитела против CD38 способны элиминировать активированные лимфоциты, плазмобласты и плазматические клетки. "Элиминация" в данном контексте означает поддающееся измерению уменьшение уровней в крови (например, при анализе у яванских макаков) активированных лимфоцитов и/или плазматических клеток по сравнению с необработанными животными. Как правило, наблюдают элиминацию по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% или 100%. Как показано ниже в Примерах, помимо этого одним конкретным преимуществом, которое демонстрируют антитела согласно настоящему изобретению, является восстанавливаемость этих клеток после введения дозы; то есть, как известено для некоторых терапий (например, с применением антител против CD20), элиминация клеток может продолжаться в течение длительных периодов времени, вызывая нежелательные побочные эффекты. Как показано в настоящем документе, воздействие на активированные лимфоциты и/или плазматические клетки является обратимым.
[0159] СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0160] В настоящем изобретении также предложены способы получения раскрытых антител против CD38. Эти способы включают культивирование клетки-хозяина, содержащей выделенную нуклеиновую кислоту(ы), кодирующую антитела согласно изобретению. Как будет очевидно специалистам в данной области, это может быть выполнено множеством путей, в зависимости от природы антитела. В некоторых вариантах осуществления, в случае, когда антитела согласно изобретению являются полноразмерными традиционными антителами, например, вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи при условиях, при которых антитело продуцируется и может быть выделено.
[0161] В общем, предложены нуклеиновые кислоты, которые кодируют антитела согласно изобретению. Такие полинуклеотиды кодируют вариабельный и константные области каждой тяжелой и легкой цепей, хотя в настоящем изобретении также предусмотрены другие комбинации в соответствии с композициями, описанными в настоящем документе. В настоящем изобретении также предусмотрены олигонуклеотидные фрагменты, полученные из раскрытых полинуклеотидов и последовательностей нуклеиновых кислот, комплементарных этим полинуклеотидам.
[0162] Полинуклеотиды могут находиться в форме РНК или ДНК. Полинуклеотиды в форме ДНК, кДНК, геномной ДНК, аналогов нуклеиновых кислот и синтетической ДНК включены в объем настоящего изобретения. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и в случае, если ДНК является одноцепочечной, может быть кодирующей (смысловой) цепью или некодирующей (антисмысловой) цепью. Кодирующая последовательность, которая кодирует полипептид, может быть идентична кодирующей последовательности, представленной в настоящем документе, или может быть другой кодирующей последовательностью, которая вследствие избыточности или вырожденности генетического кода кодирует те же полипептиды, как и ДНК, представленная в настоящем документе.
[0163] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота(ы), кодирующая антитела согласно изобретению, включена в векторы экспрессии, которые могут быть внехромосомными или созданными для интеграции в геном клетки-хозяина, в которую их вводят.Векторы экспрессии могут содержать любое количество подходящих регуляторных последовательностей (включающих, без ограничения перечисленными, последовательности контроля транскрипции и трансляции, промоторы, участки связывания рибосомы, энхансеры, точки начала репликации и т.д.) или других компонентов (генов селекции и т.д.), которые функционально связаны, как известно в уровне техники. В некоторых случаях используют две нуклеиновых кислоты, и каждая помещена в отдельный вектор экспрессии (например, тяжелая цепь в первый вектор экспрессии, легкая цепь во второй вектор экспрессии) или, в альтернативе, они могут быть помещены в один вектор экспрессии. Специалистам в данной области будет очевидно, что конструкция вектора(ов) экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов как выбор клетки-хозяина, уровень экспрессии целевого белка и т.д.
[0164] Как правило, нуклеиновые кислоты и/или экспрессия могут быть введены в подходящую клетку-хозяина с получением рекомбинантной клетки-хозяина при использовании любого способа, подходящего для выбранной клетки-хозяина (например, трансформации, трансфекции, электропорации, инфекции), при этом молекула(ы) нуклеиновой кислоты функционально связана с одним или более элементами контроля экспрессии (например, в векторе, в конструкции, созданной процессами в клетке, интегрированной в геном клетки-хозяина). Полученная рекомбинантная клетка-хозяин может поддерживаться при условиях, подходящих для экспрессии (например, в присутствии индуктора, у подходящего животного, не являющегося человеком, в подходящей культуральной среде с добавками подходящих солей, факторов роста, антибиотиков, пищевых добавок и т.д.), в результате которой продуцируется полипептид(ы). В некоторых случаях тяжелые цепи продуцируются в одной клетке, а легкие цепи - в другой.
[0165] Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, известны в уровне техники и включают множество иммортализованных клеточных линий, доступных в Американской коллекции типовых культур (ATCC), Manassas, VA, включающих, без ограничения перечисленными, клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HEK 293, клетки NSO, клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомяка (BHK), клетки почки обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), а также многие другие клеточные линии. Клетки, полученные не из млекопитающих, включающие, без ограничения перечисленными, клетки бактерий, дрожжей, насекомых и растений, также могут использоваться для экспрессии рекомбинантных антител. В некоторых вариантах осуществления антитела могут быть получены в трансгенных животных, таких как коровы или куры.
[0166] Общие методы молекулярной биологии для экспрессии, очистки и скрининга антител описаны, например, в Antibody Engineering, edited by Kontermann & Dubel, Springer, Heidelberg, 2001 and 2010 Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5: 683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2: 339-76; и Morrison, S. (1985) Science 229: 1202.
[0167] ПРИМЕНЕНИЯ И ПОКАЗАНИЯ
[0168] После получения, антитела согласно изобретению находят применение во множестве областей, включая диагностику связанных с CD38 заболеваний и их лечение.
[0169] СВЯЗАННЫЕ С CD38 СОСТОЯНИЯ
[0170] В одном из аспектов изобретения предложены способы диагностики и лечения состояния, связанного с воспалением и иммунопатологическими заболеваниями, в частности, заболеваниями, связанными с активированными лимфоцитами. Как показано в настоящем документе, CD38 экспрессируется в незрелых гемопоэтических клетках, понижен в зрелых клетках и снова экспрессируется на высоком уровне в активированных лимфоцитах и плазматических клетках. Например, высокая экспрессия CD38 отмечена в активированных B-клетках, плазматических клетках, активированных CD4+ T-клетках, активированных CD8+ T-клетках, NK-клетках, NKT-клетках, зрелых дендритных клетках (ДК) и активированных моноцитах.
[0171] Терапевтические антитела против CD38 согласно настоящему изобретению связываются с CD38-положительными клетками, что приводит к элиминации этих клеток, таких как активированные лимфоциты, посредством различных механизмов действия, включающих CDC и ADCC пути.
[0172] Таким образом, любое аутоиммунное заболевание, при котором наблюдается либо повышенная экспрессия CD38, либо повышенное количество клеток, экспрессирующих CD38, в качестве компонента заболевания, можно лечить с применением антител согласно изобретению. Они включают, без ограничения перечисленными, отторжение аллогенных островковых трансплантатов, гнездную алопецию, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунную болезнь Аддисона, антинейтрофильные цитоплазматические аутоантитела (ANCA), аутоиммунные заболевания надпочечников, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный миокардит, аутоиммунную нейтропению, аутоиммунный оофорит и орхит, аутоиммунную тромбоцитопению, аутоиммунную крапивницу, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатию, синдром Кастлемана, целиакия-дерматит, синдром хронической усталости с иммунной дисфункцией, хроническую воспалительную димиелинизирующую полиневропатию, синдром Черджа-Стросс, синдром CREST, болезнь холодовых агглютининов, болезнь Крона, дерматомиозит, дискоидную волчанку, эссенциальную смешанную криоглобулинемию, дефицит фактора VIII, фибромиалгию-фибромиозит, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, синдром Гудпасчера, реакцию трансплантат против хозяина (GVHD), тиреоидит Хашимото, гемофилию A, идиопатический легочный фиброз, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ИТП), IgA невропатию, IgM полиневропатии, иммуноопосредованную тромбоцитопению, ювенильный артрит, болезнь Кавасаки, красный плоский лишай, красную волчанку, болезнь Меньера, смешанное заболевание соединительной ткани, рассеянный склероз, сахарный диабет 1-го типа, миастению, вульгарную пузырчатку, пернициозную анемию, узелковый полиартериит, полихондрит, полигландулярный синдром, ревматическую полимиалгию, полимиозит и дерматомиозит, первичную агаммаглобулинемию, первичный билиарный цирроз печени, псориаз, псориатический артрит, феномен Рейно, синдром Рейтера, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермию, синдром Шегрена, отторжение трансплантата паренхиматозного органа, синдром мышечной скованности, системную красную волчанку, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру, язвенный колит, увеит, васкулиты, такие как васкулит при герпетиформном дерматите, витилиго и гранулематоз Вегенера.
[0173] В некоторых вариантах осуществления конкретным применением настоящих антител является применение при диагностике и/или лечении ряда заболеваний, включающих, без ограничения, аутоиммунные заболевания, в том числе, без ограничения перечисленными, системную красную волчанку (СКВ), ревматоидный артрит (РА), воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), язвенный колит и реакцию трансплантат против хозяина.
[0174] Таким образом, например, могут быть отобраны пациенты с высоким уровнем плазматических клеток, такие как больные СКВ, у которых наблюдается высокий уровень плазматических клеток, а также больные РА, которые, как было показано, не поддаются лечению с применением терапии на основе CD20.
[0175] Из уровня техники известно, что некоторые состояния связаны с клетками, которые экспрессируют CD38, и что некоторые состояния связаны с оверэкспрессией, высокой плотностью экспрессии или повышенной экспрессией CD38 на поверхностях клеток. Экспрессирует популяция клеток CD38 или нет, можно определить с помощью способов, известных в уровне техники, например, проточной цитометрии для определения процента клеток в данной популяции, которые помечены антителом, которое специфически связывает CD38, или иммуногистохимических анализов, как в общем виде описано ниже, для диагностических применений. Например, популяция клеток, в которой экспрессию CD38 обнаруживают приблизительно в 10-30% клеток, может считаться слабоположительной на CD38; и популяция клеток, в которых экспрессию CD38 обнаруживают более чем в приблизительно 30% клеток, может считаться определенно положительной на CD38 (как в Jackson et al. (1988), Clin. Exp.Immunol. 72: 351-356), хотя другие критерии могут использоваться для определения того, экспрессирует ли популяция клеток CD38. Плотность экспрессии на поверхности клеток можно определить при использовании способов, известных в уровне техники, таких как, например, измерение с помощью проточной цитометрии средней интенсивности флуоресценции клеток, которые были флуоресцентно помечены при использовании антител, которые специфично связывают CD38.
[0176] КОМПОЗИЦИИ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ IN VIVO
[0177] Препараты антител, применяемых в соответствии с настоящим изобретением, подготавливают к хранению путем смешивания антитела, имеющего требуемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]), в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, в том числе аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; пирокатехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярный (меньше чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильньные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразователи, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахарозу, маннит, трегалозу или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
[0178] Лекарственная форма в настоящем документе также может содержать больше одного активного соединения, которое необходимо для конкретного показания, подвергаемого лечению, предпочтительно такие, которые обладают дополнительными активностями, которые не оказывают нежелательного воздействия друг на друга. Например, может быть желательным получить антитела с другими специфичностями. В альтернативе или дополнительно композиция может содержать цитотоксическое средство, цитокин, ингибитор роста и/или низкомолекулярный антагонист.Такие молекулы предпочтительно присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для предполагаемой цели.
[0179] Действующие вещества также могут быть заключены в микрокапсулы, изготовленные, например, методами коацервации или межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методики раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
[0180] Лекарственные формы, которые будут использоваться для введения in vivo, должны быть стерильными или почти стерильными. Это с легкостью достигается путем фильтрации через стерилизующие фильтрующие мембраны.
[0181] Могут быть изготовлены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем эти матрицы имеют форму формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США 3,773,919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата, неразлагаемый этилен-винилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и лейпролида ацетата), и поли-D-(-)-3-гидрокси-масляную кислоту. Хотя такие полимеры, как этилен-винилацетат и молочная кислота-гликолевая кислота, обеспечивают высвобождение молекул в течение более 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени.
[0182] Когда капсулированные антитела остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия влаги при 37°С, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям иммуногенности. Рациональные стратегии могут быть разработаны для стабилизации в зависимости от используемого механизма. Например, если обнаружено, что механизм агрегации заключается в образовании межмолекулярных S-S связей в результате тиодисульфидного обмена, стабилизация может быть обеспечена путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислотных растворов, контроля содержания влаги, использования соответствующих добавок и разработки специальных композиций полимерных матриц.
[0183] МЕТОДЫ ВВЕДЕНИЯ
[0184] Антитела согласно изобретению вводят индивиду в соответствии с известными методами, такими как внутривенное введение в виде болюса или при непрерывной инфузии в течение некоторого периода времени, внутримышечный, внутрибрюшинный, интрацереброспинальный, подкожный, внутрисуставной, интрасиновиальный, интратекальный, пероральный, местный или ингаляционный пути. Внутривенное или подкожное введение антитела является предпочтительным.
[0185] МЕТОДЫ ЛЕЧЕНИЯ
[0186] В способах изобретения терапия используется для обеспечения положительного терапевтического ответа по отношению к заболеванию или состоянию. Под "положительным терапевтическим ответом" подразумевается улучшение при заболевании или состоянии, и/или уменьшение симптомов, связанных с заболеванием или состоянием. Например, положительный терапевтический ответ может относиться к одному или более следующим улучшениям при заболевании: (1) снижение количества неопластических клеток; (2) увеличение гибели неопластических клеток; (3) ингибирование выживания неопластических клеток; (5) ингибирование (т.е. замедление в некоторой степени, предпочтительно остановку) роста опухоли; (6) увеличение выживаемости пациента; и (7) некоторое облегчение одного или более симптомов, связанных с заболеванием или состоянием.
[0187] Положительные терапевтические ответы при каком-либо заболевании или состоянии могут быть определены согласно стандартизированным критериям ответа, установленным для данного заболевания или состояния. Ответ опухоли можно оценивать по изменениям морфологии опухоли (т.е. общей массе опухоли, размеру опухоли и т.п.) при использовании таких методов скрининга, как исследование методом магнитно-резонансной томографии (МРТ), рентгеновская визуализация, исследование методом компьютерной томографии (КТ), остеосцинтиграфия, эндоскопия и забор образцов биопсии опухоли, включая аспирацию костного мозга (АКМ), и подсчет опухолевых клеток в кровотоке.
[0188] В дополнение к этим положительным терапевтическим ответам индивид, проходящий терапию, может испытывать положительный эффект при улучшении симптомов, связанных с заболеванием.
[0189] Таким образом, в случае B-клеточных опухолей индивид может испытывать уменьшение так называемых B-симптомов, т.е. ночной потливости, лихорадки, потери веса и/или крапивницы. В случае предраковых состояний терапия с применением терапевтического средства против CD38 может блокировать развитие и/или увеличивать время до развития связанного злокачественного состояния, например, развития множественной миеломы, у индивидов, страдающих моноклональной гаммапатией неустановленной этиологии (MGUS).
[0190] Улучшение заболевания может быть охарактеризовано как полный ответ.Под "полным ответом" подразумевается отсутствие клинически обнаруживаемого заболевания с нормализацией любых, ранее отклоняющихся от нормы, результатов рентгенологических исследований, костного мозга и спинномозговой жидкости (СМЖ) или патологического моноклонального белка в случае миеломы.
[0191] Такой ответ может сохраняться в течение по меньшей мере 4-8 недель, или иногда 6-8 недель, после лечения в соответствии со способами изобретения. В альтернативе, улучшение заболевания можно отнести к категориии частичного ответа. Под "частичным ответом" подразумевается по меньшей мере приблизительно 50% уменьшение всей поддающейся измерению массы опухоли (т.е. количества злокачественных клеток, присутствующих в организме индивида, или измеренной массы опухолей или количества патологического моноклонального белка) в отсутствие новых очагов, которое может сохраняться в течение 4-8 недель или 6-8 недель.
[0192] Лечение согласно настоящему изобретению включает "терапевтически эффективное количество" применяемых лекарственных препаратов. "Терапевтически эффективное количество" относится к эффективному количеству, в дозах и в течение периодов времени, требуемых для достижения желаемого терапевтического результата.
[0193] Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как патологическое состояние, возраст, пол и вес пациента, а также от способности лекарственных препаратов вызывать требуемый ответ у пациента. Терапевтически эффективное количество также является таким количеством, в котором любое токсическое или нежелательное воздействие антитела или фрагмента антитела скомпенсировано терапевтически благоприятным воздействием.
[0194] "Терапевтически эффективное количество" в противоопухолевой терапии может быть также измерено по его способности стабилизировать развитие заболевания. Способность соединения элиминировать B-клетки может быть оценена в модельной системе на животных, позволяющей прогнозировать эффективность при аутоиммунных заболеваниях у человека.
[0195] В альтернативе, это свойство композиции может быть оценено путем исследования способности соединения истощать популяции B-клеток с помощью анализов in vitro, известных специалисту в данной области. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может истощать популяции B-клеток или иным образом ослаблять симптомы у индивида. Специалист в данной области сумеет определить такие количества на основе таких факторов, как размер индивида, тяжесть симптомов индивида и конкретная композиция или выбранный путь введения.
[0196] Схемы применения подбирают так, чтобы обеспечить оптимальный требуемый ответ (например, терапевтический ответ). Например, может быть введен один болюс, могут быть введены несколько раздельных доз в течение некоторого периода времени, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в соответствии с показаниями в зависимости от терапевтической ситуации. Композиции для парентерального введения могут быть изготовлены в единичной лекарственной форме для удобства введения и единообразия дозы. Единичная лекарственная форма при использовании в настоящем документе относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве стандартных доз для индивидов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения требуемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем.
[0197] Спецификация для стандартных лекарственных форм согласно настоящему изобретению продиктована и напрямую зависит от: (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который необходимо достичь, и (б) ограничений, обычных в области изготовления композиций активного соединения для лечения чувствительности у пациентов.
[0198] Эффективные дозы и схемы введения антител против CD38, применяемых в настоящем изобретении, зависят от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и могут быть определены специалистами в данной области.
[0199] Примерный, неограничивающий диапазон для терапевтически эффективного количества антитела против CD38, применяемого в настоящем изобретении, составляет приблизительно 0,1-100 мг/кг, такой как приблизительно 0,1-50 мг/кг, например, приблизительно 0,1-20 мг/кг, такой как приблизительно 0,1-10 мг/кг, например, приблизительно 0,5, такой как приблизительно 0,3, приблизительно 1 или приблизительно 3 мг/кг.В другом варианте осуществления антитело вводят в дозе 1 мг/кг или больше, такой как доза от 1 до 20 мг/кг, например, доза от 5 до 20 мг/кг, например, доза 8 мг/кг.
[0200] Медицинский работник средней квалификации может с легкостью определить и назначить требуемое эффективное количество фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар могут начать вводить дозы лекарственного средства, используемого в фармацевтической композиции, на уровнях, которые ниже требуемых для достижения нужного терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозу, пока не будет достигнут нужный эффект.
[0201] В одном варианте осуществления антитело против CD38 вводят путем инфузии в еженедельной дозе от 10 до 500 мг/кг, такой как от 200 до 400 мг/кг.Такое введение могут повторять, например, 1-8 раз, например, 3-5 раз. Введение может быть выполнено путем непрерывной инфузии в течение периода от 2 до 24 часов, такого как от 2 до 12 часов.
[0202] В одном варианте осуществления антитело против CD38 вводят путем медленной непрерывной инфузии в течение длительного периода, такого как более 24 часов, при необходимости, для уменьшения побочных эффектов, в том числе токсичности.
[0203] В одном варианте осуществления антитело против CD38 вводят в еженедельной дозе от 250 мг до 2000 мг, такой как, например, 300 мг, 500 мг, 700 мг, 1000 мг, 1500 мг или 2000 мг, до 8 раз, например, от 4 до 6 раз. Введение может быть выполнено путем непрерывной инфузии в течение периода от 2 до 24 часов, такого как от 2 до 12 часов. Такую схему могут повторять один или более раз при необходимости, например, через 6 месяцев или 12 месяцев. Дозу можно определять или корректировать путем измерения количества соединения согласно настоящему изобретению в крови при введении, например, путем забора биологического образца и использования антиидиотипических антител, которые направленно взаимодействуют с антигенсвязывающей областью антитела против CD38.
[0204] В другом варианте осуществления антитело против CD38 вводят один раз в неделю в течение 2-12 недель, например, в течение 3-10 недель, например, в течение 4-8 недель.
[0205] В одном варианте осуществления антитело против CD38 вводят поддерживающей терапией, такой как, например, один раз в неделю в течение периода продолжительностью 6 месяцев или больше.
[0206] В одном варианте осуществления антитело против CD38 вводят согласно схеме, включающей одну инфузию антитела против CD38, с последующей инфузией антитела против CD38, конъюгированного с радиоизотопом. Схему могут повторять, например, через 7-9 дней.
[0207] В качестве неограничивающих примеров, лечение согласно данному изобретению могут обеспечивать в виде ежедневного введения дозы антитела в количестве приблизительно 0,1-100 мг/кг, такой как 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг в день, по меньшей мере в один из дня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40, или, в альтернативе, по меньшей мере в одну из недели 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 после начала лечения, или их любой комбинации, при использовании однократных или раздельных доз каждые 24, 12, 8, 6, 4 или 2 часа, или их любой комбинации.
[0208] ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
[0209] Предложенные антитела против CD38 также находят применение в in vitro или in vivo визуализации опухолей или аутоиммунных патологических состояний, связанных с CD38. В некоторых вариантах осуществления антитела, описанные в настоящем документе, применяют как для диагностики, так и для лечения, или только для диагностики. В случае, когда антитела против CD38 применяют для диагностики и для лечения, некоторые варианты осуществления основаны на двух различных антителах против CD38 к двум разным эпитопам, при этом диагностическое антитело не конкурирует с терапевтическим антителом за связывание, хотя в некоторых случаях одно и то же антитело могут применять для того и для другого. Например, в некоторых случаях антитело Ab19 применяют диагностически (обычно меченое, как обсуждается ниже), тогда как Ab79 применяют терапевтически, или наоборот.Таким образом, в изобретение включены композиции, включающие диагностическое антитело и терапевтическое антитело, и, в некоторых вариантах осуществления, диагностическое антитело помечено, как описано в настоящем документе. Кроме того, композицию терапевтического и диагностического антител можно также вводить совместно с другими лекарственными средствами, как предусмотрено в настоящем документе.
[0210] Во многих вариантах осуществления диагностическое антитело помечено. Под "помеченным" в настоящем описании подразумевается, что к антителам, раскрытым в настоящем документе, присоединены один или более элементов, изотопов или химических соединений для обеспечения обнаружения в ходе процедуры скрининга или диагностики. Как правило, метки подразделяются на несколько классов: а) иммунные метки, которые могут быть эпитопом, включенным в качестве партнера по слиянию, который распознается антителом, б) изотопные метки, которые могут быть радиоактивными или тяжелыми изотопами, в) метки с малыми молекулами, которые могут включать флуоресцентные и колориметрические красители (такие как флуоресцеинизотиоцианат, также известный как ФИТЦ) или молекулы, такие как биотин, которые обеспечивают другие методы мечения, и d) метки, такие как частицы (включая пузырьки для ультразвукового мечения) или парамагнитные метки, которые обеспечивают визуализацию тела. Метки могут быть введены в антитела в любое положение и могут быть введены in vitro или in vivo в ходе экспрессии белка, как известно в уровне техники.
[0211] Диагностика может быть проведена либо in vivo, путем введения диагностического антитела, которое позволяет получать изображения всего тела, как описано ниже, или in vitro, на образце или биологическом образце, полученном от пациента. "Образец" или "биологический образец" в данном контексте включает любое количество материалов, в том числе, без ограничения перечисленным, физиологические жидкости (включающие, без ограничения, цельную кровь, плазму крови, мочу, сыворотку, лимфу, слюну, анальный и вагинальный секрет, пот и сперму), а также образцы тканей, полученные в результате биопсии соответствующих тканей. В некоторых вариантах осуществления биологический образец является образцом цельной крови.
[0212] В некоторых вариантах осуществления выполняют in vivo визуализацию, включающую, без ограничения перечисленными, ультразвук, КТ-сканы, рентген, МРТ и ПЭТ-сканы, а также оптические методы, в которых используют оптические метки для опухолей около поверхности тела.
99
[0213] In vivo визуализация заболеваний, связанных с CD38, может быть выполнена с помощью любой подходящей методики. Например, Tc-мечение или мечение другим изотопом, испускающим β-излучение, можно использовать для мечения антител против CD38. Вариации данной методики могут включать использование магнитно-резонансной томографии (МРТ) для улучшения визуализации в сравнении с методами, в которых применяют гамма-камеру. Подобные методы и принципы иммуносцинтиграфии описаны, например, в Srivastava (ed.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging And Therapy (Plenum Press 1988), Chase, "Medical Applications of Radioisotopes", в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Gennaro et al., (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990), и Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies", в Biotechnology And Pharmacy 227-49, Pezzuto et al., (eds.) (Chapman & Hall 1993).
[0214] В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ in vivo визуализации, в котором антитело против CD38 конъюгировано со способствующим обнаружению средством, конъюгированное антитело вводят реципиенту, например, путем инъекции в кровоток, и определяют присутствие и местоположение меченого антитела в организме реципиента. С помощью этой методики и любого другого способа диагностики, представленного в настоящем документе, в настоящем изобретении предложен способ скрининга на присутствие связанных с заболеванием клеток у пациента или в биологическом образце, полученном у пациента.
[0215] Для диагностической визуализации радиоизотопы могут быть связаны с антителом против CD38 либо напрямую, либо опосредованно, при помощи промежуточной функциональной группы. Полезные промежуточные функциональные группы включают хелатообразователи, такие как этилендиаминтетрауксусную кислоту и диэтилентриаминпентауксусную кислоту (см., например, патент США 5,057,313). В таких диагностических анализах, включающих конъюгированные с радиоизотопом антитела против CD38, дозу конъюгированного антитела против CD38, доставляемого пациенту, как правило, поддерживают на максимально низком уровне посредством выбора изотопа с наилучшей комбинацией минимального периода полураспада, минимального времени удерживания в организме и минимального количества изотопа, которое обеспечивает обнаружение и точное измерение.
[0216] В дополнение к радиоизотопам и рентгеноконтрастным веществам, диагностические методы могут быть выполнены при использовании антител против CD38, которые конъюгированы с красителями (такими как комплекс биотина-стрептавидина), контрастными веществами, флуоресцентными соединениями (такими как флуоресцеинизотиоцианат, также известный как ФИТЦ) или молекулами и контрастирующими веществами (например, парамагнитными ионами) для магнитно-резонансной томографии (МРТ) (см., например, патент США 6,331,175, в котором описаны методы МРТ и получение антител, конъюгированных с МРТ-контрастирующими веществами). Такие диагностические вещества/детектирующие вещества могут быть выбраны из веществ, используемых в магнитно-резонансной томографии, и флуоресцентных соединений.
[0217] Для нагрузки антитела против CD38 радиоактивными металлами или парамагнитными ионами, может потребоваться подвергнуть его реакции с реагентом, имеющим длинный хвост, к которому присоединены различные хелатирующие группы для связывания ионов. Такой хвост может быть полимером, таким как полилизин, полисахарид или другая дериватизированная или дериватизируемая цепь, имеющая боковые группы, с которыми могут быть связаны хелатирующие группы, такие как, например, порфирины, полиамины, краун-эфиры, бистиосемикарбазоны, полиоксимы и подобные группы, которые, как известно, могут применяться с этой целью.
[0218] Хелаты может быть соединены с антителами против CD38 при использвании стандартных химических способов. Хелат обычно соединяют с антителом против CD38 с помощью группы, которая обеспечивает образование связи с молекулой с минимальной потерей иммунореактивности и минимальной агрегацией и/или внутренним перекрестным сшиванием.
125
123
124
62
64
18
111
67
99
94
11
13
15
76
[0219] Примеры потенциально полезных комбинаций металл-хелатов включают 2-бензил-DTPA и его монометил и циклогексил аналоги, используемые с диагностическими изотопами в общем диапазоне энергии 60-4000 кэВ, такими как I, I, I, Cu, Cu, F, In, Ga, Tc, Tc, C, N, O и Br, для радиоизотопной визуализации.
110
111
177
18
52
62
64
67
67
68
86
90
89
94
94
99
120
123
124
125
131
154-158
32
11
13
15
186
188
51
52
55
72
75
76
82
83
[0220] Метки включают радионуклид, рентгеноконтрастное вещество, парамагнитный ион, металл, флуоресцентную метку, хемилюминесцентную метку, эхоконтрастное средство и светочувствительное вещество. Такие диагностические вещества известны, и любое такое известное диагностическое вещество может использоваться. Неограничивающие примеры диагностических веществ могут включать радионуклид, такой как In, In, Lu, F, Fe, Cu, Cu, Cu, Ga, Ga, Y, Y, Zr, mTc, Tc, mTc, I, I, I, I, I, Gd, P, C, N, O, Re, Re, Mn, mMn, Co, As, Br, Br, mRb, Sr или другие источники γ-, β-излучения или позитронов.
[0221] Подходящие парамагнитные ионы могут включать хром (III), марганец (II), железо (III), железо (II), кобальт (II), никель (II), медь (II), неодим (III), самарий (III), иттербий (III), гадолиний (III), ванадий (II), тербий (III), диспрозий (III), гольмий (III) или эрбий (III). Контрастные вещества на основе металлов могут включать лантан (III), золото (III), свинец (II) или висмут (III).
[0222] Эхоконтрастные средства могут включать липосомы, такие как газонаполненные липосомы. Рентгеноконтрастные диагностические вещества могут быть выбраны из соединений, соединений бария, соединений галлия и соединений таллия.
223
[0223] Эти и подобные хелаты, в комплексе с нерадиоактивными металлами, такими как марганец, железо и гадолиний, могут применяться в МРТ-диагностических методах в сочетании с антителами против CD38. Макроциклические хелаты, такие как NOTA, DOTA и TETA, могут применяться с различными металлами и радиометаллами, наиболее предпочтительно с радионуклидами галлия, иттрия и меди, соответственно. Такие металлохелатные комплексы могут быть сделаны очень стабильными путем подбора размер кольца для целевого металла. Другие хелаты кольцевого типа, такие как макроциклические полиэфиры, которые представляют интерес для стабильного связывания радионуклидов, таких как Ra, также могут применяться в диагностических методах.
[0224] Антитела против CD38 также могут применяться, например, для обнаружения экспрессии представляющего интерес антигена в специфических CD38-экспрессирующих клетках, таких как плазмобласты и плазматические клетки, ткани или сыворотка. В некоторых вариантах осуществления антитела против CD38, описанные в настоящем документе, могут применяться при обнаружении экспрессии представляющего интерес антигена в CD38-экспрессирующих плазмобластах и плазматических клетках. Для диагностических применений антитело, как правило, будет помечено детектируемой группой для анализов in vitro. Как будет очевидно специалистам в данной области, существует целый ряд меток, подходящих для использования в исследованиях in vitro. Подходящие красители для применения в данном аспекте изобретения включают, без ограничения перечисленным, флуоресцентные комплексы лантаноидов, в том числе комплексы европия и тербия, флуоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин, эритрозин, кумарин, метил-кумарины, квантовые точки (также именуемые "нанокристаллами"; см. заявку на патент США 09/315,584, включенную в настоящее описание посредством отсылки), пирен, малахитовый зеленый, стильбен, люциферовый желтый, Cascade Blue™, техасский красный, красители Cy (Cy3, Cy5 и т.д.), красители alexa (в том числе Alexa, фикоэритин, BODIPY и другие, описанные в 6-ом издании справочника Molecular Probes Handbook, Richard P. Haugland, настоящим прямо включенного посредством отсылки.
[0225] Таким образом, в настоящем изобретении предложены конъюгаты диагностического антитела против CD38, где конъюгат антитела против CD38 конъюгирован с контрастным веществом (таким как для магнитно-резонансной томографии, компьютерной томографии, или с эхоконтрастным средством) или радионуклидом, который может быть, например, испускающим γ-, β-, α-, электроны Оже или позитроны изотопом или детектируемой молекулой (такой как флуоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин, эритрозин, кумарин и т.п.). В некоторых вариантах осуществления конъюгат диагностического антитела против CD38 в связи с настоящим изобретением может быть антителом против CD38, конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом, также известным как ФИТЦ. В некоторых вариантах осуществления конъюгированное антитело против CD38 может именоваться конъюгатом флуоресцеина-антитела против CD38. Специалисту в данной области будет очевидно, что другие реактивы, известные в уровне техники, могут использоваться для конъюгирования флуоресцеина с антителом против CD38, и что в каждом таком случае получаемый конъюгат может именоваться конъюгатом флуоресцеина-антитела против CD38. Такие конъюгаты флуоресцеина-антитела против CD38, как описано в настоящем документе, могут применяться в анализах in vitro, таких как проточная цитометрия.
[0226] СПОСОБЫ АНАЛИЗА
[0227] Подходящие способы анализа для применения в связи с настоящим изобретением включают, без ограничения перечисленными, проточную цитометрию, анализы на свободные легкие цепи "Ig", анализ мРНК транскриптов и т.п.Следует понимать, что любые известные в уровне техники стандартные методы проведения таких способов анализа могут применяться в связи с настоящим изобретением.
+
+
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
[00159] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, могут быть выполнены при использовании проточной цитометрии в качестве средства для определения количества CD38-экспрессирующих клеток в биологическом образце, полученном от пациента. Следует понимать, что при использовании в настоящем документе биологический образец, полученный от пациента, может быть образцом цельной крови, образцом сыворотки или образцом обработанной крови. В некоторых вариантах осуществления биологический образец, полученный от пациента, является образцом цельной крови. Следует понимать, что биологический образец, полученный от пациента, может включать один или более типов клеток, в том числе, без ограничения перечисленным, эритроциты и любые типы клеток, показанных на ФИГ. 1. При использовании в настоящем документе "CD38-экспрессирующие клетки" означают любые клетки, который, как было показано, экспрессируют CD38, включающие, без ограничения, про-B-клетки (CD34CD19CD20), активированные B-клетки (CD19CD20), плазмобласты (CD19CD27), долгоживущие плазматические клетки (CD138CD19CD20), короткоживущие плазматические клетки (CD138CD19CD20), активированные CD4и CD8T-клетки, NKT-клетки (CD3CD56) и NK-клетки (CD56CD16). Кроме того, экспрессия CD38 обнаружена на лимфоидных клетках-предшественниках (CD34CD45RACD10CD19), но не на лимфоидной стволовой клетке. Кроме того, повышенная экспрессия CD38 отмечена на зрелых ДК и активированных моноцитах.
[0228] Следует понимать, что проточная цитометрия может быть выполнена любым способом, известным в уровне техники, при использовании любого подходящего прибора для проточной цитометрии. Такие способы включают стандартные методы подготовки образцов, широко известные в данной области в связи с проточной цитометрией. В некоторых вариантах осуществления способы проточной цитометрии проводят с помощью способов окрашивания, способствующих сортировке клеток в биологическом образце. Следует понимать, что может использоваться любой способ окрашивания, общеизвестный в данной области для использования в связи с проточной цитометрией. В некоторых вариантах осуществления, одно или более меченых антител или конъюгатов антитело подвергают контакту с образцом цельной крови, как описано в настоящем документе. В уровне техники хорошо известно, что множественные клеточные мишени можно подсчитывать при использовании многоцветной проточной цитометрии. См., например, Baumgarth, N and Roeder, M, J Immun Methods (2000) 243: 77-97. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно меченое антитело или конъюгат антитела могут применяться в сочетании с методами проточной цитометрии, описанными в настоящем документе, для определения клеток, содержащихся в биологическом образце, полученном от пациента. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно меченое антитело или конъюгат антитела для применения в сочетании с методами проточной цитометрии, описанными в настоящем документе, является конъюгатом флуоресцеина-антитела против CD38. В некоторых вариантах осуществления конъюгатом флуоресцеина-антитела против CD38 является Ab19-флуоресцеин или Ab79-флуоресцеин.
[0229] В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ проведения анализа методом проточной цитометрии, включающий контакт биологического образца, полученного от пациента, с лизирующим/фиксирующим раствором (также называемым ресуспендирующим), таким как раствор FACS™ Lyse, включающий по меньшей мере один компонент, способный вызывать лизис некоторых клеток, таких как эритроциты, и по меньшей мере один компонент, способный обеспечивать фиксацию образца, такой как альдегид или спирт.Подходящие компоненты в лизирующем/фиксирующем растворе, способном фиксировать клетки, которые могут применяться в связи с настоящим изобретением, включают спирты, такие как метанол или этанол, которые известны специалистам в данной области как осаждающие или денатурирующие фиксаторы, способные коагулировать белки, или альдегиды, такие как формальдегид или глутаровый альдегид. Следует понимать, что формальдегид может полимеризоваться в параформальдегид (ПФА), а в присутствии метанола формальдегид может не полимеризоваться в параформальдегид. Также следует понимать, что для применений, в которых не содержащий спирта формальдегид используется в качестве компонента в лизирующем/фиксирующем растворе, лизирующий/фиксирующий раствор необязательно может содержать буфер, такой как PBS буфер. В некоторых вариантах осуществления биологическим образцом является цельная кровь. В некоторых вариантах осуществления образец цельной крови пациента может быть подвергнут контакту с лизирующим/фиксирующим раствором, таким как раствор FACS™ Lyse, для лизиса эритроцитов, содержащихся в образце цельной крови (см. публикации Einwallner, E, Subbasic, A, Strasser, A, et al., J Immun Methods (2013) 390: 127-132 and Tiirikainen, M. Cytometry (1995) 20: 341-348, которые включены в настоящее описание посредством отсылки). В некоторых вариантах осуществления биологический образец, полученный от пациента, подвергают контакту с раствором FACS™ Lyse с получением обработанного образца перед замораживанием образца для хранения. В некоторых вариантах осуществления биологический образец, полученный от пациента, подвергают контакту с раствором FACS™ Lyse с получением обработанного образца непосредственно перед анализом методом проточной цитометрии, без замораживания обработанного образца для хранения. В некоторых вариантах осуществления биологический образец, полученный от пациента, могут подвергать контакту с раствором FACS™ Lyse в течение от приблизительно 2 минут до приблизительно 30 минут.В некоторых вариантах осуществления биологический образец могут подвергать контакту с раствором FACS™ Lyse в течение от приблизительно 4 минут до приблизительно 20 минут или от приблизительно 5 минут до приблизительно 10 минут.
[0230] В некоторых вариантах осуществления обработанный образец, полученный после контакта биологического образца, полученного от пациента, с лизирующим/фиксирующим раствором, таким как раствор FACS™ Lyse, охлаждают до температуры приблизительно -20°C или меньше с получением замороженного образца. В некоторых вариантах осуществления обработанный образец охлаждают до приблизительно -80°C. В некоторых вариантах осуществления обработанный образец охлаждают до приблизительно -78°C. В некоторых вариантах осуществления обработанный образец охлаждают до приблизительно -70°C. В некоторых вариантах осуществления обработанный образец охлаждают до приблизительно -60°C. В некоторых вариантах осуществления обработанный образец охлаждают до приблизительно -50°C. В некоторых вариантах осуществления обработанный образец охлаждают до приблизительно -40°C. В некоторых вариантах осуществления обработанный образец охлаждают до приблизительно -30°C. В некоторых вариантах осуществления обработанный образец охлаждают до приблизительно -20°C. В некоторых вариантах осуществления обработанный образец охлаждают до температуры от приблизительно -80°C до -20°C. В некоторых вариантах осуществления обработанный образец, полученный после контакта биологического образца, полученного от пациента, с лизирующим/фиксирующим раствором, таким как раствор FACS™ Lyse, охлаждают в течение приблизительно 24 часов или меньше после контакта. В некоторых вариантах осуществления обработанный образец охлаждают в течение приблизительно 12 часов или меньше после лизиса. В некоторых вариантах осуществления обработанный образец охлаждают в течение приблизительно 6 часов или меньше.
[0231] После замораживания обработанного образца, в некоторых вариантах осуществления замороженный образец может быть нагрет приблизительно до комнатной температуры перед подсчетом клеток в биологическом образце с помощью проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления замороженный образец могут нагревать приблизительно до комнатной температуры в течение приблизительно 78 часов или меньше после охлаждения. В некоторых вариантах осуществления замороженный образец могут нагревать приблизительно до комнатной температуры в течение приблизительно 72 часов или меньше после охлаждения. В некоторых вариантах осуществления замороженный образец могут нагревать приблизительно до комнатной температуры в течение приблизительно 54 часов или меньше после охлаждения. В некоторых вариантах осуществления замороженный образец могут нагревать приблизительно до комнатной температуры в течение приблизительно 48 часов или меньше после охлаждения. В некоторых вариантах осуществления замороженный образец могут нагревать приблизительно до комнатной температуры в течение приблизительно 30 часов или меньше после охлаждения. В некоторых вариантах осуществления замороженный образец могут нагревать приблизительно до комнатной температуры в течение приблизительно 24 часов или меньше после охлаждения. В некоторых вариантах осуществления замороженный образец могут нагревать приблизительно до комнатной температуры в течение от приблизительно 72 часов до приблизительно 78 часов после охлаждения. В некоторых вариантах осуществления замороженный образец могут нагревать приблизительно до комнатной температуры в течение от приблизительно 48 часов до приблизительно 54 часов после охлаждения. В некоторых вариантах осуществления замороженный образец могут нагревать приблизительно до комнатной температуры в течение от приблизительно 24 часов до приблизительно 30 часов после охлаждения.
[0232] В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ анализа CD38-экспрессирующих клеток в цельной крови, включающий: получение образца цельной крови у индивида, где образец включает эритроциты и антикоагулянт; лизис эритроцитов с получением обработанного образца; охлаждение обработанного образца до температуры приблизительно -20°C или меньше в течение приблизительно 24 часов после получения образца, с получением замороженного образца; и измерение количества CD38-экспрессирующих клеток в образце в течение приблизительно 72 часов после получения образца, где замороженный образец нагревают до комнатной температуры перед измерением количества CD38-экспрессирующих клеток.
[0233] Следует понимать, что изменения количества плазмобластов или плазматических клеток, присутствующих в биологическом образце, полученном от пациента, можно отслеживать с помощью анализа на свободные легкие цепи Ig (FLC). Для измерения свободных легких цепей Ig может использоваться любой анализ на свободные легкие цепи Ig, известный специалисту, такой как анализ FREELIGHT (BindingSite, UK). См., например, Fassbinder T, Saunders U, Mickholz E, et al., Arthritis Res Ther (2015); Draborg AH, Lydolph MC, Westergaard M, et al., PLoS One (2015) 10 (9): e0138753. doi: 10.1371/journal.pone.0138753. eCollection 2015. СКВ приводит к поликлональной активации плазматических клеток, у больных повышен уровень каппа и лямбда легких цепей по сравнению со здоровыми индивидами, и такое повышение антител и плазматических клеток считают частью патогенеза болезни (Draborg, 2015). Присутствие FLC в сыворотке указывали в качестве маркера СКВ, а FLC в моче - в качестве маркера волчаночного нефрита III/IV класса. Уровни FLC в сыворотке изменяются при лечении ритуксимабом или микофенолата мофетилом (MMF) и коррелирует с другими маркерами плазмобластов и плазматических клеток в крови (Fassbinder, 2015; Draborg, 2015).
[0234] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу измерения биомаркера повышенного уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, обогащенного в CD38-экспрессирующих клетках, в биологическом образце, полученном от пациента, по сравнению с уровнем экспрессии гена, обогащенного в CD38-экспрессирующих клетках, в биологическом образце, полученном от контрольного индивида. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу измерения биомаркера повышенного уровня экспрессии гена, обогащенного в CD38-экспрессирующих клетках, в биологическом образце, полученном от пациента, по сравнению с пороговым значением гена, обогащенного в CD38-экспрессирующих клетках. В некоторых вариантах осуществления геном, обогащенным в CD38-экспрессирующих клетках, является IgJ. В некоторых вариантах осуществления геном, обогащенным в CD38-экспрессирующих клетках, является CD38. В некоторых вариантах осуществления биомаркер включает мРНК. В некоторых вариантах осуществления биологическим образцом является цельная кровь. В некоторых вариантах осуществления пациент проходил по меньшей мере одно предыдущее лечение. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно предыдущее лечение включает лечение антителом против CD20.
[0235] В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ прогноза ответа пациента на терапию, включающую измерение в биологическом образце, полученном от пациента, экспрессии биомаркера повышенного уровня экспрессии по меньшей мере одного одного гена, обогащенного в CD38-экспрессирующих клетках, и сравнение экспрессии по меньшей мере одного гена, обогащенного в CD38-экспрессирующих клетках, в биологическом образце пациента с экспрессией того же по меньшей мере одного гена, обогащенного в CD38-экспрессирующих клетках, в биологическом образце, полученном у контрольного индивида или с пороговым значением по меньшей мере одного гена, обогащенного в CD38-экспрессирующих клетках, где повышенная экспрессия по меньшей мере одного гена, обогащенного в CD38-экспрессирующих клетках, в биологическом образце пациента по сравнению с экспрессией в биологическом образце контрольного индивида или с пороговым значением позволяет прогнозировать ответ пациента на терапию. В некоторых вариантах осуществления геном, обогащенным в плазматической клетке/плазмобласте, является IgJ. В некоторых вариантах осуществления измерение экспрессии по меньшей мере одного гена включает измерение мРНК. В другом варианте осуществления измерение мРНК включает метод ПЦР, секвенирование РНК (RNAseq) или микроматричный чип.В некоторых вариантах осуществления биологический образец включает цельную кровь. В некоторых вариантах осуществления пациент прошел по меньшей мере одно предыдущее лечение. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно предыдущее лечение включает лечение антителом против CD20.
[0236] Следует понимать, что измерение уровня экспрессии гена, обогащенного в CD38-экспрессирующих клетках, может быть выполнено с помощью любых стандартных методов, известных в уровне техники. Например, уровень мРНК можно измерить с помощью микроматрицы. В другом аспекте экспрессию гена измеряют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), RNAseq или количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР). В другом аспекте экспрессию гена измеряют с помощью мультиплексной ПЦР. Согласно другому варианту осуществления экспрессию представляющего интерес гена в биологическом образце пациента считают повышенной при сравнении с экспрессий данного гена в биологическом образце контрольного индивида, если относительный уровень мРНК представляющего интерес гена в образце пациента больше чем в 2 раза выше уровня мРНК у контрольного объекта. Согласно другому варианту осуществления, относительный уровень мРНК представляющего интерес гена в образце пациента больше чем в 3 раза, 5 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 25 раз или 30 раз выше по сравнению с уровнем в образце контрольного объекта. В другом варианте осуществления экспрессию представляющего интерес гена в биологическом образце пациента считают низкой по сравнению с экспрессией данного гена в биологическом образце контрольного объекта, если относительный уровень мРНК представляющего интерес гена в образце пациента меньше чем в 2 раза выше уровня мРНК у контрольного объекта. Согласно другому варианту осуществления экспрессию представляющего интерес гена в биологическом образце пациента считают низкой по сравнению с экспрессией данного гена в биологическом образце контрольного объекта, если относительный уровень мРНК представляющего интерес гена в образце пациента меньше чем в 3 раза, 5 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 25 раз или 30 раз выше по сравнению с уровнем в образце контрольного объекта.
[0237] Уровни мРНК могут быть измерены и определены количественно с помощью различных методов, известных специалистам в данной области, включая применение коммерческих наборов и реактивов. Одним таким методом является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Другим методом для применения в количественном анализе является количественная ПЦР в реальном времени или кПЦР. См., например, Innis MA et al., eds., Academic Press, Inc. (1990); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); и "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994). Другим методом для применения в количественном анализе является RNAseq. См. Wang, Zhong; Gerstein, Mark; Snyder, Michael. "RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics". Nature Reviews Genetics 10 (1): 57-63.
[0238] В другом аспекте уровень экспрессии гена измеряют с помощью метода ПЦР или микроматричного метода. В одном варианте осуществления микроматричный метод включает применение микроматричного чипа с одной или более молекулами нуклеиновых кислот, которые могут гибридизоваться в строгих условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей ген, указанный выше. В одном варианте осуществления метод ПЦР представляет собой кПЦР. В одном варианте осуществления метод ПЦР является мультиплексной ПЦР. Микроматричный анализ представляет собой мультиплексную технологию, в которой обычно используют набор упорядоченно расположенных на чипе тысяч нуклеотидных зондов для гибридизации, например, с образцом кДНК или кРНК в условиях высокой строгости. Гибридизацию зонда-мишени обычно обнаруживают и количественно определяют при обнаружении меченных флуорофором, серебром или хемилюминесцентной меткой мишеней для определения относительного содержания последовательностей нуклеиновых кислот в мишени. В обычных микрочипах зонды прикреплены к твердой поверхности посредством ковалентной связи с химической матрицей (с помощью эпоксисилана, аминосилана, лизина, полиакриламида или других). Твердая поверхность является, например, стеклом, кремниевым чипом или микроскопическими сферами. В продаже доступны различные микрочипы, в том числе производства, например, Affymetrix и Illumina.
[0239] ИЗДЕЛИЯ
[0240] В других вариантах осуществления предложено изделие, содержащее материалы, подходящие для лечения нарушений, описанных выше. Изделие включает контейнер и этикетку. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая эффективна для лечения состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций). Действующим веществом в композиции является антитело. Этикетка на контейнере или связанная с контейнером указывает, что композиция применяется для лечения выбранного состояния. Изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может дополнительно включать другие материалы, требуемые с коммерческой и пользовательской позиции, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.
ПРИМЕРЫ
[0241] Следующие примеры представлены для иллюстрации, но не ограничения, изобретения.
[0242] ПРИМЕР 1: Конструкция векторов экспрессии, включающих полинуклеотиды, кодирующие CD38 человека, яванского макака и мыши
[0243] Для конструирования вектора, экспрессирующего CD38 человека (huCD38), полинуклеотид, кодирующий huCD38, выделяли из кДНК, полученной из коллекции кДНК человека Origene Technologies Trueclone. Выделенный huCD38 клонировали в стабильный вектор экспрессии (XOMA, Inc.), содержащий ген устойчивости к неомицину (neoR), который позволял проводить отбор устойчивых к G418 (генетицину) трансфектантов. Ген huCD38, присутствующий в отобраных трансфектантах, секвенировали для обнаружения любых возможных ошибок в последовательности. Ошибки в последовательности, которые не соответствовали образцу в GenBank NM_001775, исправляли с помощью сайт-направленного ПЦР мутагенеза. Конечную векторную ДНК подтверждали с помощью 5' секвенирования.
[0244] Для конструирования вектора, экспрессирующего CD38 обезьяны циномолгус (cyCD38), полинуклеотид, кодирующий cyCD38, выделяли из ДНК, полученной из кДНК BioCain-Institute из ткани нормальной селезенки обезьяны (яванского макака). Выделенный cyCD38 клонировали в стабильный вектор экспрессии (XOMA, Inc.), содержащий ген neoR, который позволял проводить отбор устойчивых к G418 (генетицину) трансфектантов. Ген cyCD38, присутствующий в отобранных трансфектантах, секвенировали для обнаружения любых возможных ошибок в последовательности. Ошибки в последовательности, которые не соответствовали образцу в Genbank AY555148, исправляли с помощью сайт-направленного ПЦР мутагенеза. Конечный вектор ДНК подтверждали с помощью секвенирования.
[0245] Для конструирования вектора, экспрессирующего CD38 мыши (moCD38), полинуклеотид, кодирующий moCD38, выделяли из ДНК, полученной из коллекции Origen's TrueORF. Выделенный moCD38 клонировали в стабильный вектор экспрессии (XOMA, Inc.), содержащий ген neoR, который позволял проводить отбор устойчивых к G418 (генетицину) трансфектантов. Ген moCD38, присутствующий в отобранных трансфектантах, секвенировали для определения любых возможных ошибок в последовательности. Ошибки в последовательности, которые не соответствовали образцу в GenBank NM_007646, исправляли с помощью сайт-направленного ПЦР мутагенеза. Конечную векторую ДНК подтверждали с помощью секвенирования.
[0246] ПРИМЕР 2: Создание экспрессирующих CD38 клеток яичника китайского хомячка (CHO)
[0247] Для создания клеток CHO, экспрессирующих huCD38, muCD38 и cyCD38, клетки CHO трансфицировали линеаризованной ДНК. Через одну неделю в условиях селекции, клетки сортировали с помощью проточной цитометрии и клетки с наиболее высокой экспрессией huCD38, muCD38 или cyCD38 (лучшие 15%) сеяли в 96-луночные планшеты с получением одиночных колоний. Остальные клетки также сеяли с селекцией для получения резервных колоний. Приблизительно через 12-14 дней после посева, одиночные колонии идентифицировали и переносили в 96-луночные планшеты с глубокими лунками. Клоны подвергали скринингу с помощью FACS анализа после второго пассажа. Лучшие клоны-продуценты пересевали и размножали во встряхиваемых колбах. Лучшие 2 клона замораживали и/или культивировали для исследования на занесенный микоплазменный агент и для масштабирования.
[0248] Для конструирования репортера люциферазы для диссеминированных ксенотрансплантатных моделей, коммерческий вектор, содержащий CMV промотор/ген люциферазы/селективный маркер устойчивости к неомицину (Promega, Madison, WI), использовали для получения стабильной линии трансфектантов в клетках лимфомы Беркитта Daudi.
[0249] ПРИМЕР 3: Библиотеки фагового дисплея и скрининг средств, которые связывают CD38
[0250] Отбор мишень-специфичного антитела из библиотеки фагового дисплея проводили согласно методам, описанным в Marks et al. (2004, Methods Mol. Biol. 248: 161-76). Коротко, библиотеку фагового дисплея инкубировали с 100 пмоль биотинилированного CD38 при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем образовавшийся комплекс захватывали при использовании 100 мкл суспензии стрептавидиновых гранул (DYNABEADS M-280 Streptavidin, Invitrogen). Неспецифичные фаги удаляли при промывке гранул промывочным буфером (5% молоко в PBS). Связанные фаги элюировали 0,5 мл 100 нМ триэтиламина (ТЭА) и сразу нейтрализовали добавлением равного объема 1M Трис-Cl, pH 7,4. Элюированный фаговый пул использовали для заражения клеток E.coli TG1 в логарифмической фазе роста и выделяли фагмиду, как описано в Marks et al., Id. Отбор повторяли в общей сложности три раунда.
[0251] В альтернативе, библиотеки фагового дисплея подвергали пэннингу с иммобилизированным CD38 (R&D systems) для определения панели фрагментов антитела, обладающих способностью связывать CD38. Пэннинг проводили при использовании стандартных методик (см., например, Methods in Molecular Biology, vol. 178: Antibody Phage Display: Methods and Protocols Edited by: P.M.  and R. Aitken, Humana Press; "Panning of Antibody Phage-Display Libraries", Coomber, D.W.J., pp. 133-145, и "Selection of Antibodies Against Biotinylated Antigens", Chames et al., pp. 147-157). Коротко, три лунки планшета NUNC(MAXISORP покрывали 50 мкл рекомбинантного CD38 (R&D systems) при концентрации 10 мкг/мл в PBS. После инкубирования в течение ночи при 4°C, свободные связывающие сайты блокировали 5% молоком в PBS в течение одного часа при комнатной температуре. Затем приблизительно 200 мкл фаговой библиотеки в 5% молоке/PBS добавляли в блокированные лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение приблизительно одного-двух часов. Лунки промывали, и связанный фаг элюировали при использовании стандартных методов (см., например, Sambrook and Russell, Molecule Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Элюированный фаг амплифицировали путем заражения клеток-хозяев E.coli TG 1 в логарифмической фазе роста. Зараженные клетки TG 1 собирали с помощью центрифугирования при 2500 об/мин в течение пяти минут, сеяли на 15 см чашки с агаром с 2YT-ампициллин-2% глюкозы и инкубировали при 30°C в течение ночи. Процесс пэннинга затем повторяли при использовании амплифицированного фага. Цикл пэннинга, элюции и амплификации повторяли три раунда.
[0252] После завершения пэннинга одиночные колонии посеянных клеток TG1 использовали для инокуляции сред в 96-луночных планшетах. Микрокультуры выращивали до OD600 0,6, и в этой точке экспрессию растворимого scFv индуцировали добавлением 1 мМ IPTG с последующим ночным инкубированием в шейкере при 30°C. Бактерии осаждали с помощью центрифугирования, и периплазматический экстракт использовали для проверки связывания scFv с иммобилизованным CD38 при использовании стандартного ИФА и анализа FACS-связывания.
6
3
[0253] Для скрининга методом FACS-связывания, клетки CHO, стабильно экспрессирующие CD38, использовали для скрининга scFv-фрагментов в периплазматическом экстракте (PPE) на их способность связывать нативный мембраносвязанный CD38. Исходные и CHO трансфектанты (линии клеток, экспрессирующих CD38 человека или CD38 циномолгус или CD38 мыши) ресуспендировали отдельно до 2×10 клеток/мл в PBS (Life Technologies), 0,5% BSA (Sigma-Aldrich), и 0,1% NaN (Sigma-Aldrich) (FACS буфер). Исходные клетки CHO, не экспрессирующие CD38, использовали в качестве отрицательного контроля. Аликвоты по двадцать пять мкл клеток сеяли в 96-луночные планшеты с V-образным дном (кат.Costar 3897) и к клеткам добавляли 25 мкл периплазматического экстракта, содержащего myc-меченный scFv-фрагмент антитела, после чего смесь инкубировали при 4°C в течение 30 минут. Клетки затем два раза промывали, после чего осадок ресуспендировали в 25 мкл мышиного антитела против c-myc (1/1000 в буфере FACS) (Roche) и снова инкубировали при 4°C в течение 30 минут.Затем клетки два раза промывали и ресуспендировали в 25 мкл 1/200 разведения IgG-PE против антител мыши в буфере FACS (Jackson labs) и снова инкубировали при 4°C в течение 30 минут.Затем клетки два раза промывали для удаления избытка несвязавшегося антитела, ресуспендировали в 70 мкл FACS буфера и исследовали на BD FACScan. Полученные данные оценивали при использовании программы FlowJo (TreeStar, Inc.). Положительные образцы определяли при сравнении средней интенсивности флуоресценции CD38 трансфицированной клетки CHO и медианной интенсивности флуоресценции исходной клеточной линии CHO (CD38-).
[0254] Клоны антитела, которые связали CD38 человека, секвенировали для идентификации уникальных клонов. Затем уникальные клоны scFV оценивали по скорости диссоциации, определяемой с помощью анализа Biacore. От 200RU до 500RU человеческого рекомбинантного CD38 (кат.R&D systems 2404-AC или эквивалентного) иммобилизировали при использовании стандартной химии сочетания аминов (Biacore) на CM5 или эквивалентном чипе. Также подготавливали контрольную точку, которую активировали и затем блокировали без иммобилизации белка. Это выполняли путем разведения антигена до 1-3 мкг/мл в ацетатном буфере, pH 5,0, и пропускания над активированной поверхностью, пока не был получен требуемый уровень иммобилизации (3-5) минут.Затем поверхность блокировали этаноламином. Периплазматические экстракты разводили один к одному с буфером для анализа (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) и 0,05% полисорбата 20, pH 7,4, с 2 мг/мл BSA (бычьего сывороточного альбумина)). Разбавленный периплазматический экстракт пропускали над поверхностями поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на 30 минуте в течение 300 секунд с дополнительными 900 секундами для мониторинга времени диссоциации. Регенерацию выполняли одной 8-секундной инъекцией 100 мМ HCl. Данные контрольных точек вычитали из данных активной поверхности, после чего кривые диссоциации аппроксимировали при использовании модели диссоциации 1:1 в программе Biacore T100.
[0255] Лучшие клоны scFV превращали в IgG1 антитела. Скрининг FACS связывания повторяли на переформатированных клонах IgG1 при использовании исходных клеток CHO и клеток CHO, экспрессирующих CD38 человека, мыши и яванского макака для гарантии сохранения связывающих свойств и оценки межвидовой перекрестной реактивности. Анализ FACS переформатированных IgG клонов проводили, как описано выше, но этапы, состоящие из добавления антитела против c-myc и IgG-PE против мышиных антител, заменяли одним этапом, в котором связывание полноразмерного человеческого IgG обнаруживали при добавлении конъюгированного с фикоэритрином антитела против человеческого IgG (Jackson Labs).
[0256] ПРИМЕР 4: Клеточные in vitro анализы переформатированных IgG клонов
[0257] Примерно 150 клонов переформатировали в человеческие IgG1 антитела и пять из них (Ab19, Ab43, Ab72, Ab79 и Ab110) полностью оценивали при использовании панели анализов, как описано ниже. Эффективность переформатированных IgG клонов в анализах in vitro и in vivo сравнивали с двумя антителами, BMTK4-1 (также называемым контроль-1, BM-1 или BMTK-1) (SEQ ID NO: 24 и 25; вариабельные области тяжелой и легкой цепей) и BMTK4-2 (также называемым контроль-2, BM-2 или BMTK-2) (SEQ ID NO: 26 и 27; вариабельные области тяжелой и легкой цепей), аминокислотные последовательности которых были получены из последовательностей известных антител против CD38, даратумумаба (также называемого HuMax-CD38, раскрытого в публикации международной заявки WO 06/099875) и SAR650984 (раскрытого в публикации международной заявки WO 08/047242), соответственно. Паливизумаб (Синагис) (MedImmune), клинически одобренное антитело, которое распознает респираторно-синцитиальный вирус, служил в качестве отрицательного контроля при связывании CD38.
[0258] ПРИМЕР 5: Обнаружение связывания Ab79 с помощью иммунофлуоресценции
[0259] Ab79, меченное красителем Alexa Fluor-488, наносили на замороженные срезы нормальной человеческой колоректальной ткани, предстательной железы и лимфатического узла. Меченный красителем Alexa Fluor-488 паливизумаб (Синагис) служил в качестве отрицательного контроля окрашивания. Полученные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания показаны на ФИГ. 4. Структура окрашивания, наблюдаемая для Ab79, была идентична наблюдаемой при использовании коммерческого поликлонального антитела против CD38 на нормальной человеческой колоректальной ткани, предстательной железе и лимфатическом узле (данные не показаны).
[0260] Меченное красителем Alexa Fluor-488 Ab79 также наносили на нормальные и пораженные множественной миеломой образцы костного мозга (данные не показаны). Поскольку Ab79 связывалось с ~10% клеток нормального костного мозга, >90% клеток костного мозга, пораженных множественной миеломой, связывание Ab79 было показано в 4 из 4 протестированных образцов.
[0261] Также исследовали способность Ab79 связываться с различными клеточными линиями (MOLP-8, DAUDI, RPMI и MCF7). Все клетки MOLP-8 (множественная миелома человека), DAUDI (лимфобласт, полученный от пациента с лимфомой Беркитта) и RPMI (линия клеток, полученная от пациента с хроническим миелогенным лейкозом) показали связывание Ab79. Линия рака молочной железы, MCF7, оказалась в целом отрицательной на связывание с Ab79 (данные не показаны).
[0262] Антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 488, окрашивали на замороженных в криостате 8 мкм срезах, которые фиксировали в смеси этанола/ацетона в течение 5 мин, после чего инкубировали с антителами в течение 1 часа при комнатной температуре в камере с регулируемой влажностью. Затем срезы промывали, добавляли содержащую DAPI среду для заливки срезов (Vector Laboratories, кат. H1500) и накладывали покровное стекло.
[0263] ПРИМЕР 6: Оценка экспрессии Ab79 на множественной миеломе (ММ) и хроническом лимфоцитарном лейкозе (ХЛЛ)
[0264] Связывание Ab79 с образцами костного мозга больных множественной миеломой исследовали с помощью проточной цитометрии либо после обогащения CD138+клетками, либо путем гейтирования на клетках CD138+CD45-/1o (ФИГ. 7A). Как было обнаружено, Ab79 экспрессировалось на >95% клеток из четырех из шести образцов множественной миеломы. Профиль связывания Ab79 оказался в целом подобен профилю связывания антитела против CD38, используемого в клинических лабораториях. Кроме того, Ab79 связывало клетки больных хроническим лимфоцитарный лейкозом (ФИГ. 7B).
6
[0265] Для измерения связывания Ab79 с ММ и ХЛЛ с помощью FACS, образцы пациента обрабатывали в течение 24 часов. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли в Ficoll-Paque™ (GE Healthcare) согласно инструкциям производителя. Анализ экспрессии выполняли при использовании следующих панелей антител, клоны которых указаны в скобках. Панель ММ: Ab79-Alexa Fluor-488, CD45-PerCP (2D1), CD138-APC (MI15). Панель ХЛЛ: Ab79-Alexa Fluor-488; CD5-PE (UCHT2), CD45-PerCP (2D1), CD19-APC (SJ25C1). По 5 мкл меченного PE, PerCP или APC антитела или 10 мкл меченного Alexa Fluor-488 антитела или изотипического контроля добавляли в каждую лунку или пробирку, содержащую 100 мкл 0,2×10 МКПК или обогащенных CD138 клеток из аспирата костного мозга. Образцы инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего эритроциты лизировали при использовании BD Pharmlyse согласно инструкциям производителя. Все образцы три раза промывали в буфере FACS. Образцы фиксировали в 1% параформальдегиде и исследовали на BD FACSCanto™ II или BD FACSCalibur™.
[0266] ПРИМЕР 7: Анализы CDC, индуцированной антителами против CD38
[0267] Перекрестно-реактивные клоны циномолгус тестировали на способность индуцировать комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC). Клетки MOLP-8 сеяли при плотности 10000 клеток в лунке в черный 96-луночный плоскодонный планшет для культур тканей в 50 мкл полной среды (RPMI с добавкой 10% эмбриональной бычьей сыворотки). В каждую лунку добавляли 50 мкл 2× антитела против CD38, контрольного IgG антитела или только среду и оставляли для инкубирования при комнатной температуре на 10 мин. Различные количества (2-15 мкл) очищенного комплемента кролика (кат. #CL 3441 Cedarlane Laboratories, Canada), в зависимости от линии клеток, добавляли в каждую лунку кроме контрольных лунок. После одного часа инкубирования при 37°C, планшеты доводили до комнатной температуры, в лунки добавляли по 100 мкл реактива для подсчета титра клеток CytoTox Glo™ (Promega G7571/G7573), планшет встряхивали в течение 5-7 минут и считывали люминесценцию на планшетном анализаторе EnVision (Perkin Elmer). Условия теста: только клетки; клетки+комплемент; клетки+IgG контроль+комплемент; клетки+антитело+комплемент.% CDC вычисляли при использовании следующего уравнения:
T
C
100-(RLU/RLU)×100),
T
C
50
[0268] где RLU - относительные единицы люминесценции тестируемого образца, и RLU - относительные единицы люминесценции образца только с комплементом. Статистический анализ проводили при использовании программы PRISM. Значения EC, определенные из кривых зависимости % CDC от концентрации антитела, показаны в Таблице 1.
[0269] ПРИМЕР 8: Анализы ADCC, индуцированной антителами против CD38
6
6
[0270] Антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) оценивали при использовании линий клеток Daudi, MOLP-8 и RPMI-8226 в качестве клеток-мишеней. МКПК выделяли в качестве эффекторных клеток при разделении в Ficoll-Plaque™ из слоя лейкоцитов или с помощью LRS, которую получали из Stanford Blood Center (Palo Alto, CA). Образцы разводили 1:3 2% FBS в PBS, 15 мл Ficoll-Plaque™ (GE Healthcare) осторожно наслаивали на 35 мл разведенного образца и центрифугировали при 1800 об/мин (без ускоренного торможения) в течение 25 мин. Мутную промежуточную фазу, содержащую МКПК, собирали, 3 раза промывали 2% FBS в PBS и замораживали в аликвотах по 50×10 клеток/мл в 10% ДМСО/FBS. Замороженные аликвоты МКПК размораживали и культивировали в течение ночи в 10% FBS/RPMI+5 нг/мл рекомбинантного человеческого IL2 (R&D systems #202-IL) в 2×10 на мл, при необходимости.
[0271] При анализе ADCC все этапы выполняли в полных средах. По 5000 клеток-мишеней сеяли в лунку 96-луночного планшета, в который добавляли 50 мкл 3× антитела против CD38, IgG контроля или только среды, с последующим добавлением 50 мкл человеческих эффекторных МКПК при отношении мишеней:эффекторных клеток (T:E) 1:25-1:50. Планшеты быстро центрифугировали в течение ~30 секунд при 800 об/мин для объединения всех клеток в непосредственной близости. Через 4 ч при 37°C планшеты центрифугировали при 1100 об/мин в течение 5 мин и 100 мкл супернатанта переносили в белый планшет. К супернатанту добавляли 100 мкл реактива CytoTox Glo™ (кат. Promega #G9292) и оставляли планшеты с встряхиванием на 20-30 мин при КТ. Люминесценцию считывали на планшетном анализаторе EnVision (Perkin Elmer) и вычисляли процент специфического лизиса при использовании следующего уравнения:
T
E/T
L
E/T
(RLU/RLU)/(RLU/RLU)×100
T
E/T
L
[0272] где RLU - относительные единицы люминесценции тестируемого образца, и RLU - относительные единицы люминесценции образца, содержащего клетки-мишени и только эффекторные клетки, и RLU - относительные единицы люминесценции для клеток после лизиса Triton X-100. Статистический анализ выполняли при использовании программы PRISM. Значения EC50, определенные из кривых зависимости % специфического лизиса от концентрации антитела, показаны в Таблице 1.
ТАБЛИЦА 1. CDC, ADCC и агонистическая активность IgG-переформатированных антител
Антитело
CDC EC50 нМ (MOLP-8)
ADCC EC50 нМ (DAUDI)
ADCC EC50 нМ (MOLP-8)
ADCC EC50 нМ (RPMI-8226)
Апоптоз EC50 нМ (DAUDI)
BM-1
0,48±0,16
0,03±0,02
0,036±0,013
0,13±0,03
0,057
BM-2
0,65±0,18
0,04±0,02
0,024±0,005
0,15±0,04
0,062
Ab19
0,98±0,26
0,08±0,03
0,038±0,008
0,46±0,15
0,032
Ab43
2,2
0,12±0,09
0,027±0,018
3,84+1,34
1,56
Ab72
0,66±0,49
0,14±0,12
0,193±0,037
2,35±0,99
0,35
Ab79
1,1±0,39
0,03+0,02
0,047±0,012
0,46±0,19
0,048
Ab110
1,99±0,71
0,24±0,17
0,874±0,804
2,98±0,91
0,40
Ab164
2,00±0,83
ND
0,165±0,154
1,2±0,24
0,31
[0273] ПРИМЕР 9: Определение аффинности с помощью FACS
[0274] Клетки MOLP-8, экспрессирующие CD38, суспендировали в 1% FBS буфере при концентрации жизнеспособных клеток приблизительно 2 миллиона клеток/мл. Тестируемые тАт последовательно разводили (в 2 раза) в лунках двух 96-луночных планшетов в 1(PBS. Последняя лунка каждого титрования содержала только буфер. Дополнительное количество PBS и суспензии клеток добавляли в каждую лунку так, чтобы конечный объем составил 300 мкл/лунка, при этом каждая лунка содержала приблизительно 100000 клеток. МАт перечислены ниже с соответствующим диапазоном конечных концентраций связывающего участка мАт (2× молекулярная концентрация), используемым для титрования:
Контроль 1, [мАт] связывающий участок=50,8 нМ -49,7 пМ;
Контроль 2, [мАт] связывающий участок=49,5 нМ -48,3 пМ;
Ab 43, [мАт] связывающий участок=49,3 нм -48,2 пМ;
Ab 110, [мАт] связывающий участок=204 нм -49,9 пМ;
Ab 79, [мАт] связывающий участок=103 нм -25,3 пМ;
Ab 72, [мАт] связывающий участок=103 нм -25,2 пМ;
Ab 19, [мАт] связывающий участок=100 нм -12,2 пМ;
[0275] Планшеты помещали в шейкер для планшетов на 5 часов при 4°C, после чего планшеты 3 раза промывали при 4°C 1× PBS. Затем в каждую лунку добавляли по 200 мкл 99 нМ специфичного поликлонального Cy5 антитела козы против Fc IgG человека (Jackson ImmunoResearch Laboratories, 109-175-008) и встряхивали планшеты в течение 30 минут при 4°C. Планшеты снова 2× промывали при 4°C 1(PBS, затем проточный цитометр FACSCanto™ II HTS использовали для регистрации средней интенсивности флуоресценции (MFI) 5000 событий для каждой лунки, содержащей уникальную концентрацию связывающего участка мАт. Кривую зависимости средней интенсивности флуоресценции от концентрации связывающего участка антитела нелинейно аппроксимировали с помощью программы Scientist 3.0 при использовании уравнения, представленного ниже, для оценки KD:
F=p[(KD+LT+n(M))-{(KD+LT+n(M))2-4n(М)(LT)}1/2]/2+B
[0276] где F (средняя интенсивность флуоресценции), LT (общая концентрация связывающего участка мАт), p (константа пропорциональности, которая связывает условные единицы флуоресценции со связанным мАт), M (концентрация клеток в молях; 0,553 фМ на основе 100000 клеток в 300 мкл), n (количество рецепторов на клетке), B (фоновый сигнал) и KD=равновесная константа диссоциации.
[0277] Для каждой кривой титрования антитела оценку KD получали при свободном колебании P, n, B и KD в нелинейном анализе. Подробный вывод приведенного выше уравнения см. в публикации Drake and Klakamp (2007), "A rigorous multiple independent binding site model for determining cell-based equilibrium dissociation constants", J. Immunol. Methods 318: 157-62, которая включена в настоящее описание посредством отсылки. В таблице 3 приведены полученные значения KD для всех антител в порядке уменьшения аффинности, а также 95% доверительный интервал для каждого приближения в скобках. Концентрацию связывающего участка антител (2× молекулярная концентрация) использовали для нелинейной аппроксимации кривой.
[0278] ПРИМЕР 10: Определение аффинности с помощью Biacore
[0279] Аффинность антител IgG к растворимому эктодомену CD38 (ECD) определяли с помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса (SPR) Biacore™ A100 при 22°C. Поликлональное антитело козы против IgG человека (Caltag H10500) иммобилизировали на чипе биосенсора CM5 при использовании стандартного сочетания аминов для точек 1, 2, 4 и 5 во всех четырех проточных ячейках чипа. Уровни иммобилизации на каждой точке колебались от 5865 RU до 6899 RU. Человеческий CD38 приобретали в R&D systems (кат. 2404-AC, партия #PEH020812A). Стоковую концентрацию CD38 определяли при использовании методов, подробно описанных в публикациях Pace et al. (1995) "How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein", Protein Science 4 (11): 2411-23 и Pace and Grimsley (2004) "Spectrophotometric determination of protein concentration", в Current Protocols in Protein Science, Chapter 3: Unit 3.1, содержание которых включено в настоящее описание посредством отсылки.
[0280] Рабочий буфер приготавливали путем дегазации HEPES-буферного солевого раствора, 0,005% полисорбата 20 и добавления фильтрованного BSA до конечной концентрации 100 мкг/мл. Все восемь очищенных мАт разводили до приблизительно 2 мкг/мл рабочим буфером. Предварительные эксперименты, в которых оценивали количество каждого захватываемого мАт для поддержания поверхностной емкости (Rmax), показали не больше ~100 RU. Для каждого цикла захвата мАт/инъекции антигена, мАт захватывали на точках 1 и 5 в каждой проточной ячейке, при этом расположенные рядом точки 2 и 4 служили в качестве соответствующих референсных поверхностей. Каждое разведенное мАт захватывали в течение 1 минуты при скорости потока 10 мкл/мин, после чего рабочий буфер три минуты пропускали для стабилизации поверхности. HuCD38 пропускали над всеми четырьмя проточными ячейками в течение 120 секунд при 30 мкл/мин в диапазоне концентраций 193,7 нМ-3,0 нМ (2× серийное разведение) с последующей фазой диссоциации в течение 15 минут.Все образцы приготавливали в рабочем буфере и рандомизированно вводили в трех повторностях с семью промежуточными инъекциями буфера для двойного контроля. Поверхности регенерировали двумя 20-секундными импульсами 10 мМ глицина, pH 1,7.
[0281] Все данные сенсограммы обрабатывали с помощью программы Scrubber 2.0c с глобальной аппроксимацией при использовании модели взаимодействия 1:1 в Scrubber 2.0c. Полученные константы связывания показаны в Таблице 2.
ТАБЛИЦА 2
Антитело
FACS KD (нМ)MOLP-8
FACS KD (пМ)RPMI-8226
Biacore Ka(M<sup>-1 с-1</sup>)
Biacore Kd (с<sup>-1</sup>)
Biacore KD (нМ)
BM-1
1,1 (0,9)
802
4,49×10<sup>4</sup>
2,46×10<sup>-3</sup>
54,8
BM-2
1,6 (0,6)
428
4,24×10<sup>5</sup>
2,27×10<sup>-3</sup>
5,4
Ab19
0,4 (0,3)
-
1,54×10<sup>5</sup>
8,10×10<sup>-4</sup>
5,3
Ab79
1,2 (1,1)
508
1,22×10<sup>5</sup>
6,75×10<sup>-4</sup>
5,5
Ab72
0,6 (0,4)
-
1,44×10<sup>4</sup>
1,82×10<sup>-3</sup>
126
Ab110
1,0 (0,1)
-
1,22×10<sup>5</sup>
1,71×10<sup>-1</sup>
1400
Ab43
1,1 (0,3)
-
2,72×10<sup>5</sup>
1,46×10<sup>-1</sup>
537
Ab164
1,4 (0,7)
-
1,99×10<sup>5</sup>
7,15×10<sup>-2</sup>
359
[0282] ПРИМЕР 11: пробы интернализации иммунофлуоресценции
6
6
[0283] Методы иммунофлуоресценции использовали для оценки интернализации антител против CD38 в клетки MOLP-8. Клетки MOLP-8 собирали и 5×10 клеток окрашивали в течение 10 мин при 4°C в RPMI-1640 с использованием 1 мкг каждого антитела против CD38, напрямую конъюгированного с Alexa Fluor 488. Клетки промывали в PBS, содержащем 1% BSA, и 1×10 клеток инкубировали в течение 3 или 6 часов при 4°C или 37°C. Поверхностное окрашивание тушили в течение 30 мин при 4°C с использованием 2 мкг кроличьего антитела против Alexa Fluor-488 (Invitrogen). Клетки промывали и фиксировали в PBS с 1% ПФУ, переносили в 96-луночный планшет для микроанализа (BD Biosciences) и оценивали с помощью проточной цитометрии при использовании проточного цитометра FACSCanto™ II (BD Biosciences) или визуализировали при использовании ImageXpress(Micro (Molecular Devices) при 20(увеличении.
[0284] ПРИМЕР 12: Биннинг эпитопов с помощью Biacore
[0285] Систему Biacore A100 использовали для биннинга двух контрольных антител, а также Ab 19 и Ab 79. Антитела сначала иммобилизировали с высокой и низкой плотностью на чипе CM5 при использовании химии сочетания NHS/EDC. Для каждого цикла эксперимента по биннингу эпитопов сначала над этими поверхностями пропускали CD38. Аналогично сэндвич-анализу в формате ИФА, после этого уникальное антитело (взятое из набора иммобилизованных антител) пропускали над поверхностями, содержащими комплексы CD38/антитела. Поверхности регенерировали при использовании импульсов фосфорной кислоты в конце каждого цикла. Данные регистрировали при 22°C с использованием HBS-P (10 мМ 10 HEPES, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 0,005% P-20) с добавкой BSA. Полученные сенсограммы обрабатывали при использовании модуля "Картирования эпитопов" в пакете программ Biacore(A100 Evaluation, а также пробной версии Scrubber для наборов данных A100. Дублированные данные использовали для построения бинарной матрицы 4×4 для вышеуказанных 4 мАт из двух отдельных экспериментов, как показано в Таблице 3.
ТАБЛИЦА 3
Ab79
BM1
Ab19
BM2
Ab79
0
0
1
1
BM1
0
0
1
0
Ab19
1
1
0
0
BM2
1
0
0
0
[0286] ПРИМЕР 13: Анализ in vivo в онкологии
6
[0287] Эффективность Ab19 и Ab79 in vivo исследовали в диссеминированной Daudi-люциферазной модели лимфомы человека. Самкам мышей CB.17 SCID возрастом 6-8 недель из Taconic Laboratories внутривенно вводили 1×10 опухолевых клеток Daudi-Luc. В день исследования 7 мышам внутрибрюшинно вводили: паливизумаб, Ab 79, Ab19, Контроль 1 и Контроль 2. Биолюминесцентную визуализацию проводили еженедельно, начиная со дня 21, при использовании системы IVIS Xenogen (Caliper Life Sciences) для контроля опухолевой массы. Для визуализации животным в/б вводили субстрат люциферазы (150 мг/кг) за 10 мин перед визуализацией, после чего животным делали анестезию изофлураном и получали изображения. Результаты показаны на ФИГ. 8 и ФИГ. 9.
[0288] ПРИМЕР 14: Корреляция воспалительного и иммунологического заболевания
[0289] Было показано, что CD38 сильно повышен в МКПК клетках после активации. В покоящихся МКПК, полученных от здоровых доноров, меньше 20% покоящихся клеток экспрессируют CD38, при этом вычисленное количество рецепторов составляет приблизительно 10000-20000 на клетку. Активированные МКПК, полученные снова от здоровых доноров, показали 60-75% клеток, экспрессирующих CD38, при этом количество рецепторов составляло 110000-160000 на клетку.
[0290] Кроме того, как показано на ФИГ. 5, CD38 показал повышенную экспрессию в МКПК пациентов с СКВ.
[0291] Образцы иммуногистологически исследовали на оверэкспрессию CD38. Исследовали 19 образцов, полученных у больных СКВ, что показало повышенную экспрессию CD38 на B и T-клетках памяти и пДК. Анализ у 3 пациентов с РА показал инфильтрацию CD38 плазматических клеток в синовиальную ткань всех трех пациентов, а также сильное окрашивание синовиальных тканей антителом Ab79. Анализ у 7 пациентов с болезнью Крона и 6 пациентов с язвенным колитом показал инфильтрацию CD38-экспрессирующих плазматических клеток в гладкую мышцу толстой кишки (исследование проводили на двух образцах первичных клеток пациентов). Следует отметить, что исследовали такое же количество здоровых пациентов, результаты которых не были показаны.
[0292] ПРИМЕР 15: Элиминация при использовании антител против CD38
[0293] Введение доз Ab79 обезьянам циномолгус показывает значительное снижение лимфоцитов, B и T-клеток и NK-клеток. Антитело вводили путем 30-минутной в/в инфузии в дозах, показанных на ФИГ. 6, данные регистрировали через 24 часа. Подобные данные были показаны в день 4, 7, 11 и 18.
[0294] Впрочем, данные pK/pD показывают восстановление животных после введения доз. Как показано на ФИГ. 7, количество лимфоцитов возвратилось к уровню, аналогичному контрольным количествам, через несколько дней после введения однократной дозы путем в/в 30-минутной инфузии, даже после введения наиболее высокой дозы, что указывает на отсутствие каких-либо проблем с лимфоидными клетками-предшественниками.
[0295] ПРИМЕР 16: Модели аутоиммунных заболеваний
[0296] ИСПОЛЬЗОВАЛИ ТРИ РАЗНЫХ МОДЕЛИ
[0297] Модель на мышах HuScid служила моделью псевдореакции "трансплантат против хозяина", а также моделью противостолбнячной реакции, истощения IgG и общей выживаемости. Мышам CB17/HuSCID вводили ASGM1 для элиминации NK-клеток, а затем на следующий день вводили человеческие МКПК. Приживление проводили 7-10 дней с забором сыворотки для рандомизации Ig человека. На следующий день мышам вводили Ab79 в дозе 10 мг/кг, после чего вводили TTd, с введением второй дозы через 4 дня, третьей дозы через три дня после этого, собирали сыворотку для подсчета Ig человека и обнаружения противостолбнячных антител через 3 дня после этого (всего 10 дней после введения первой дозы). На ФИГ. 8 показаны результаты одной мыши-донора, которые указывают на значимое снижение всех Ig изотипов при лечении. На ФИГ. 9 показаны результаты средних уровней Ig для каждой группы реципиентов, при этом каждая точка данных соответствует среднему значению в каждой группе (от n=5 до n=10). На ФИГ. 10 показано значимое снижение противостолбнячного ответа при лечении Ab79. Наконец, на ФИГ. 11 показано общая значимая выживаемость с применением лечения Ab79.
[0298] СУРРОГАТНЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ НА МЫШАХ
[0299] Поскольку Ab79 не реагирует перекрестно с CD38 грызунов, было создано суррогатное антитело. В качестве предварительной меры при использовании коммерческого антитела к CD38 человека и коммерческого антитела к CD38 мыши показали значительные различия в уровнях экспрессии CD38 в разных типах клеток у человека и мыши (см. Фигуру 12), демонстрирующие, что биология заболевания различна. Таким образом, применение антител, перекрестно реагирующих с CD38 обезьяны, в моделях на обезьянах может дать значительно более высокие результаты.
[0300] Было создано суррогатное антитело, демонстрирующее сходное истощение CD38+ клеток, полученных из селезенки, крови и костного мозга (данные не показаны), а также из периферической крови (см. ФИГ. 13). Кроме того, на ФИГ. 14 показана кинетика истощения в селезенке, крови и костном мозге, собранных в дни 1, 2 или 3 после введения однократной дозы 10 мг/кг суррогатной мыши. Быстрое истощение B-клеток в крови было показано в течение 24 часов, причем более медленное истощение показано в селезенке и костном мозге.
[0301] МОДЕЛЬ СКВ НА МЫШАХ
[0302] Суррогатное мышиное антитело к CD38 тестировали в модели MRL/1pr при использовании следующих промежуточных исследуемых показателей (например, каждые две недели) в крови: аутоантитела к дцДНК, общий анализ крови, FACS для истощения T/B клеток, альбумин в моче и воспаление кожи. Конечные показатели в крови включали, без ограничения перечисленным: аутоантитела к дцДНК, общий анализ крови, FACS для истощения T/B клеток, в селезенке, лимфатических узлах и костном мозге: вес органов, количество иммунных клеток, FACS для Т/В лимфоцитов, в почках: вес органов, гистопатология (г/э и PAS), расположение в клетках, воспалительные клетки и воспаление кожи (гистопатология).
[0303] МОДЕЛЬ КОЛЛАГЕН-ИНДУЦИРОВАННОГО АРТРИТА (CIA)
[0304] Использовали модель CIA на мышах при использовании суррогатного мышиного антитела, с 7 группами мышей для оценки про-профилактической, профилактической и терапевтической эффективности. Всех мышей иммунизировали CII/CFA в день 0, с бустерной инъекцией CII/CFA в день 21, как правило, приводившей к прогрессированию заболевания со дня 21 по 42 (окончание исследования). Группе 1 (10 мышей) в/б вводили 10 мг/кг суррогатного антитела два раза в неделю, начиная со дня 0 (про-профилактически). Группе 2 (n=10) вводили такую же дозу, но начиная со дня 21. Группе 3 (n=10) вводили такую же дозу с начала заболевания (день 25-28). Группе 4 (n=10) вводили такую же дозу, но с hIgG1 (например, изотип) в день 0. Группе 5 (n=10) вводили такую же дозу hIgG1, но начиная со дня 21. Группе 6 (n=10) в день 21 вводили 0,5 мг/л дексаметазона в воде и Группу 7 (n=5) лечению не подвергали.
[0304] Исследование CIA на обезьянах циномолгус проводили при использовании n=3 в каждой группе, группа 1 - наивные животные, только растворитель. Группе 2 вводили однократную дозу Ab79 в дозе 3 мг/кг или 10 мг/кг, q1w (профилактическое лечение начинали в день 7 после иммунизации коллагеном). Группе 3 вводили Ab79 в дозе 3 мг/кг или 10 мг/кг q1w, для терапевтического лечения, начиная с начала заболевания, в день 21 или день 28. Группе 4 вводили 0,1 мг/кг q1d дексаметазона, также в начале заболевания.
[0306] ПРИМЕР 17: Ab79 элиминирует человеческие плазматические клетки/плазмобласты in vitro
[0307] В системе культур in vitro, при использовании человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) или мононуклеарных клеток костного мозга (МККМ), добавление Ab79 истощает популяции PB/PC, которые характеризуются поверхностной экспрессией CD27, CD38 и CD138 и внутриклеточными маркерами плазматических клеток IRF4 (ФИГ. 14). Ab79 истощает как короткоживущие плазматические клетки (CD19+плазматические клетки), так и долгоживущие плазматические клетки (CD19-плазматические клетки) из костного мозга (ФИГ. 15). Плазматические клетки и плазмобласты являются основным антителосекретирующими клетками (АСК) в организме. См. Hibi T and Dosch HM. Eur J Immunol (1986) 16 (2): 139-145. АСК, измеренные непосредственно с помощью ELISpot (ФИГ. 16), снижены в образцах здорового пациента и больного СКВ (ФИГ. 17). В образцах здоровых пациентов на верхней панели, лечение Ab79 приводит к 70% снижению количества IgG-продуцирующих клеток из крови и костного мозга. Подобное истощение наблюдается в образцах больных СКВ. Кроме того, снижено количество клеток, продуцирующих аутоантиген-специфичные антитела VH4-34 9G4+и антитела против Ro (ФИГ. 18). Эти результаты подчеркивают потенциал моноклонального антитела Ab79 в качестве терапевтического средства для лечения СКВ посредством элиминации PB/PC. При направленном воздействии на CD38, молекулу, экспрессирующуюся на высоком уровне на всех PB/PC клетках, Ab79 эффективно истощает и короткоживущие и долгоживущие АСК.
[0308] ПРИМЕР 18: Обнаружение PB/PC в цельной крови с помощью способа, подходящего для применения в клинических условиях и у индивидов, проходящих лечение Ab79
[0309] Анализы цельной крови здорового добровольца методом проточной цитометрии показывают, что CD38 экспрессируется на высоком уровне на PB/PC, и что окрашивание при использовании метода фиксации/замораживания, описанного ниже, с использованием мАт Ab19 позволяет четко сортировать CD45+, CD3-, CD19+, CD38+, CD27+субпопуляцию B-клеток, которая содержит PB и PC (ФИГ. 19A-D).
[0310] Цельную кровь, собранную у здорового добровольца, окрашивали CD3-PE); CD27-APC; CD45-AF700 CD19-V450; CD38-FITC. Для проточной цитометрии клетки гейтировали для определения одиночных клеток, затем прямое (FSC) и боковое (SSC) светорассеяние использовали для сравнения относительно размера и гранулярности клеток крови (A), и на этой основе определяли CD45+ окрашивание лимфоцитов мононуклеарных клеток (B). B-клетки, в этой популяции идентифицировали как CD3-CD19+ клетки (C). Плазмобласты и плазматические клетки идентифицировали как CD27+CD38 яркие клетки (панель D).
6
6
[0311] Для окрашивания образцов цельной крови пробирки, содержащие аликвоты образцов доноров, центрифугировали при 500 RCF в течение 5 минут, удаляли супернатант и наклоняли пробирки в штативе для диспергирования осадка клеток. Клетки промывали 2 мл PBS с 1% BSA, центрифугировали при 500 RCF в течение 5 минут, удаляли супернатант и наклоняли пробирки в штативе для диспергирования осадка клеток. Количество клеток определяли для каждого образца и доводили количество клеток до уровня от 20×10 клеток/мл до 40×10 клеток/мл PBS с 1% BSA при необходимости. По 200 мкл отбирали пипеткой в пробирку с соответствующей маркировкой. Требуемое количество человеческой сыворотки добавляли в каждую пробирку, встряхивали и помещали в темноту для инкубирования на 10 минут.В каждую пробирку добавляли соответствующее количество антител. Все образцы тщательно встряхивали и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубирования клетки промывали 2 мл PBS с 1% BSA. Пробирки центрифугировали при 500 RCF в течение 5 минут, удаляли супернатант и наклоняли пробирки в штативе для диспергирования осадка клеток. После центрифугирования клетки восстанавливали в 500 мкл 1% параформальдегида. Образцы анализировали на проточном цитометре BD FACSCantoII. Регистрацию проводили до приблизительно 1000000 событий или до истечения 240 секунд. Для окрашивания использовали следующие реактивы:
[0312] CD3 PE (Клон: SK7) -BD, номер по каталогу 347347;
CD27 APC (Клон: M-T271) -BD Pharmingen, номер по каталогу 558664;
CD45 AF700 (Клон: HI30) -Biolegend, номер по каталогу 304024;
CD19 V450 (Клон: HIB19) -BD Horizon, номер по каталогу 560353;
CD38 (Ab19);
1X FACSLyse;
PBS с 1% BSA;
1% раствор параформальдегида;
Сферы Quantum MESF FITC Calibration Beads (LabCorp Analytical Systems);
Сферы Quantum MESF APC Calibration Beads (LabCorp Analytical Systems);
[0313] ПРИМЕР 19: Сравнение стабильности PB/PC в цельной крови без фиксатора или после обработки FACSLyse и замораживания
[0314] Стандартный способ хранения и проточная цитометрия
[0315] Пять образцов цельной крови здоровых доноров собирали в пробирки, содержащие антикоагулянт гепарин натрия. Образцы исследовали в трех посторностях два независимых оператора в День 0 (<2 часов после забора). Затем образцы выдерживали при температуре окружающей среды и исследовали по одному в День 1 (24-30 часов), День 2 (48-54 часа) и День 3 (72-48) часов после забора. После этого проводили окрашивание, как описано в Примере 18.
[0316] Результаты показаны в Таблице 4.
Таблица 4
Донор
Дней после забора
Общее число зарегистрированных событий
% CD19+B-клеток, которые являются CD38++/CD27++
Донор 1
0
1104419
0,85
1
226287
0,14
2
1066353
0,13
3
1094968
0,17
Донор 2
0
885060
0,64
1
232424
0,40
2
615546
0,16
3
500499
0,20
Донор 3
0
241812
0,58
1
830574
0,14
2
853470
0,15
3
528522
0,07
Донор 4
0
754839
2,23
1
1046385
0,64
2
964089
0,29
3
577233
0,27
Донор 5
0
1112831
3,80
1
1098387
0,99
2
1129494
0,61
3
625239
0,42
[0317] c. Способ хранения с фиксацией/замораживанием и проточная цитометрия
[0318] Собирали пять образцов цельной крови здоровых доноров (антикоагулянт гепарин натрия) и делили образцы на четыре аликвоты. Первую аликвоту исслодовали в свежем виде согласно методу FACSLyse без этапа замораживания, чтобы установить исходное количество плазмобластов. Свежезабранные образцы исследовали в трех повторностях два независимых оператора в День 0 (<2 часов после забора). Три остальных аликвоты замораживали при -80°C после инкубирования с FACSLyse в течение 10 минут.Вторую аликвоту размораживали при 38°C на водяной бане и обрабатывали в День 1 (24-30 часов). Третью аликвоту размораживали в День 2 (48-54 часа) и четвертую аликвоту - в День 3 (72-78 часов) после забора. Обработку в Дни 1-3 выполняли по одному.
6
6
[0319] Замороженные аликвоты размораживали в водяной бане при 38°C, пока образец не становился жидким в конической части, затем помещали в шейкер для завершения процесса размораживания. Пробирки центрифугировали при 500 RCF в течение 5 минут, супернатант удаляли и наклоняли пробирки в штативе для диспергирования осадка клеток. Клетки промывали 2 мл PBS с 1% BSA, центрифугировали при 500 RCF в течение 5 минут, удаляли супернатант и наклоняли пробирки в штативе для диспергирования осадка клеток. Количество клеток определяли для каждого образца и доводили количество клеток до уровня от 20×10 клеток/мл до 40×10 клеток/мл PBS с 1% BSA при необходимости. По 200 мкл отбирали пипеткой в пробирку с соответствующей маркировкой. Требуемое количество человеческой сыворотки добавляли в каждую пробирку, встряхивали и помещали в темноту для инкубирования на 10 минут. В каждую пробирку добавляли соответствующее количество антител. Все образцы тщательно встряхивали и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубирования клетки промывали 2 мл PBS с 1% BSA. Пробирки центрифугировали при 500 RCF в течение 5 минут, удаляли супернатант и наклоняли пробирки в штативе для диспергирования осадка клеток. После центрифугирования клетки восстанавливали в 500 мкл 1% параформальдегида. Образцы исследовали на проточном цитометре BD FACSCantoII. В общей сложности регистрировали примерно 1000000 событий или продолжали анализ до истечения 240 секунд. Результаты показаны в таблице 5.
Таблица 5
Донор
Дней после забора
Общее число зарегистрированных событий
% CD19+ B-клеток, которые являются CD38++/CD27++
Донор 1
0
1000000
0,14
1
830650
0,10
2
908750
0,09
3
737475
0,12
Донор 2
0
230400
0,94
1
794125
1,03
2
662925
1,05
3
714550
1,08
Донор 3
0
248500
0,17
1
934225
0,21
2
315400
0,24
3
842975
0,20
Донор 4
0
892050
0,32
1
1000000
0,49
2
528175
0,32
3
600675
0,24
Донор 5
0
257450
0,48
1
1000000
0,49
2
962875
0,43
3
1000000
0,47
ПРИМЕР 20: Ab79 не ингибирует окрашивание CD38-специфичным мАт Ab19
[0320] Пять образцов цельной крови здоровых доноров (антикоагулянт гепарин натрия) собирали и вводили Ab79 (10 мкг/мл и ноль) в течение одного часа при 37°C. После инкубирования образцы делили на четыре аликвоты. Первую аликвоту исследовали в свежем виде согласно методу FACSLyse без этапа замораживания, чтобы установить исходный уровень плазмобластов. Свежезабранные образцы исследовали в трех повторностях два независимых оператора в День 0 (<2 часов после забора). Другие три аликвоты замораживали при -80°C после инкубирования с FACSLyse в течение 10 минут.Вторую аликвоту размораживали в водяной бане при 38°C и обрабатывали в День 1 (24-30 часов). Третью аликвоту размораживали в День 2 (48-54 часа) и четвертую аликвоту - в День 3 (72-78 часов) после забора. Обработка в Дни 1-3 выполняли по одному.
6
6
[0321] Замороженные аликвоты размораживали в водяной бане при 38°C, пока образец не становился жидким в конической части, затем помещали в шейкер для завершения процесса размораживания. Пробирки центрифугировали при 500 RCF в течение 5 минут, супернатант удаляли и наклоняли пробирки в штативе для диспергирования осадка клеток. Клетки промывали 2 мл PBS с 1% BSA, центрифугировали при 500 RCF в течение 5 минут, удаляли супернатант и наклоняли пробирки в штативе для диспергирования осадка клеток. Количество клеток определяли для каждого образца и доводили количество клеток до уровня от 20×10 клеток/мл и 40×10 клеток/мл PBS с 1%-м BSA при необходимости. По 200 мкл отбирали пипеткой в пробирку с соответствующей маркировкой. Требуемое количество человеческой сыворотки добавляли в каждую пробирку, встряхивали на вортексе и помещали в темноту для инкубирования на 10 минут.В каждую пробирку добавляли соответствующее количество антител. Все образцы тщательно встряхивали на вортексе и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубирования клетки промывали 2 мл PBS с 1% BSA. Пробирки центрифугировани при 500 RCF в течение 5 минут, удаляли супернатант и наклоняли пробирки в штативе для диспергирования осадка клеток. После центрифугирования клетки восстанавливали в 500 мкл 1% параформальдегида. Образцы исследовали на проточном цитометре BD FACSCantoII. Регистрировали в общей сложности приблизительно 1000000 событий или продолжали анализ до истечения 240 секунд. Результаты показаны в Таблице 6.
Таблица 6
Здоровые доноры крови
Общее число зарегистрированных событий
% CD19+B-клеток, которые являются CD38++/CD27++
Общее число зарегистрированных событий
% CD19+ B-клеток, которые являются CD38++/CD27++
В присутствии 10микрограммов/мл Ab79
Без добавления Ab79
Донор 1
1000000
0,14
1000000
0,14
Донор 2
818625
0,86
230400
0,94
Донор 3
247425
0,18
248500
0,17
Донор 4
255675
0,28
892050
0,32
Донор 5
255400
0,48
257450
0,48
[0322] ПРИМЕР 21: Здоровые индивиды, получавшие Ab79, демонстрируют дозозависимое снижение PB/PC согласно измерению с помощью способа фиксации/замораживания и анализов методом проточной цитометрии
[0323] Уровни PB/PC оценивали в когортах с наивысшими дозами в рандомизированном, двойном слепом, плацебо-контролируемом исследовании Ab79 с однократными дозами у здоровых индивидов. Ab79 или плацебо вводили либо путем 2-часовой инфузии внутривенно, либо путем п/к введения в дозах различной величины. Цельную кровь забирали на клиническом центре. Образцы, собранные перед обработкой (2 скрининга, День -1 и День 1 до введения дозы), использовали для определения исходного уровня. Образцы после обработки собирали в 14 точках времени в течение периода времени от 1 часа до 78 дней в зависимости от пути введения. Большую часть данных PB/PC собирали у индивидов, получавших лечение п/к. Все образцы консервировали с применением способа фиксации/замораживания, описанного выше, и исследовали с помощью анализов методом многоцветной проточной цитометрии.
[0324] Сравнение медианного количества PB/PC клеток в крови индивидов, получавших п/к лечение, показало, что после введения плацебо наблюдались различия в уровнях PB/PC в динамике, однако лечение Ab79 приводило к последовательному снижению PB/PC в группе лечения Ab79, которое сохранялось до 20 дней. Результаты показаны на ФИГ. 20.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO: 1 (CD38 Homo sapiens; NP_001766.2)
MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQLCLGVSILVLILVVVLAVVVPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI
SEQ ID NO: 2 (CD38 Macaca fascicularis; AAT36330.1)
MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQVCLGVCLLVLLILVVVVAVVLPRWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFTQVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI
SEQ ID NO: 3 (HCDR1 Ab79)
GFTFDDYG
SEQ ID NO: 4 (HCDR2 Ab79)
ISWNGGKT
SEQ ID NO: 5 (HCDR3 Ab79)
ARGSLFHDSSGFYFGH
SEQ ID NO: 6 (LCDR1 Ab79)
SSNIGDNY
SEQ ID NO: 7 (LCDR2 Ab79)
RDS
SEQ ID NO: 8 (LCDR3 Ab79)
QSYDSSLSGS
SEQ ID NO: 9 (Тяжелая цепь Ab79)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSDISWNGGKTHYVDSVKGQFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSLFHDSSGFYFGHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA
SEQ ID NO: 10 (Легкая цепь Ab79)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGDNYVSWYQQLPGTAPKLLIYRDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEEL
SEQ ID NO: 11 (Тяжелая цепь Ab19)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYDMTWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSDKDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVYYYGFSGPSMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA
SEQ ID NO: 12 (Легкая цепь Ab19)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSNSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSDSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSRVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEEL
SEQ ID NO: 13 (HCDR1 Ab19)
GFTFNNYD
SEQ ID NO: 14 (HCDR2 Ab19)
ISYDGSDK
SEQ ID NO: 15 (HCDR3 Ab19)
ARVYYYGFSGPSMDV
SEQ ID NO: 16 (LCDR1 Ab19)
NSNIGSNT
SEQ ID NO: 17 (LCDR2 Ab19)
SDS
SEQ ID NO: 18 (LCDR3 Ab19)
QSYDSSLSGSR
SEQ ID NO: 19 (Тяжелая цепь Ab19) с константной областью
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYDMTWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSDKDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVYYYGFSGPSMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 20 (Легкая цепь Ab19) с константной областью
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSNSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSDSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSRVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 21 (Тяжелая цепь Ab79)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSDISWNGGKTHYVDSVKGQFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSLFHDSSGFYFGHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 22 (Легкая цепь Ab79)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGDNYVSWYQQLPGTAPKLLIYRDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 23 (CD157 Homo sapiens; NP_004325)
MAAQGCAASRLLQLLLQLLLLLLLLAAGGARARWRGEGTSAHLRDIFLGRCAEYRALLSPEQRNKNCTAIWEAFKVALDKDPCSVLPSDYDLFINLSRHSIPRDKSLFWENSHLLVNSFADNTRRFMPLSDVLYGRVADFLSWCRQKNDSGLDYQSCPTS EDCENNPVDSFWKRASIQYSKDSSGVIHVMLNGSEPTGAYPIKGFFADYEIPNLQKEKITRIEIWVMHEIGGPNVESCGEGSMKVLEKRLKDMGFQYSCINDYRPVKLLQCVDHSTHPDCALKSAAAATQRKAPSLYTEQRAGLIIPLFLVLASRTQL
SEQ ID NO: 24 (Контроль 1; Вариабельная область тяжелой цепи)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 25 (Контроль 1; Вариабельная область легкой цепи)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO: 26 (Контроль 2; Вариабельная область тяжелой цепи)
QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSCKASGYTFTDYWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDGDTGYAQKFQGKATLTADKSSKTVYMHLSSLASEDSAVYYCARGDYYGSNSLDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO: 27 (Контроль 2; Вариабельная область легкой цепи)
DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVSTVVAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIGVPDRFTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO: 28 (Тяжелая цепь Ab43)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSRINSDGSSTSYADSMKGQFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYYYYAMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 29 (Легкая цепь Ab43)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGGSSNIGYKTVNWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLNGLVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 30 (Тяжелая цепь Ab72)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDSNYDFWSGYYYGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 31 (Легкая цепь Ab72)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSKTVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSSYAARSTNIIFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 32 (Тяжелая цепь Ab110)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSIIYSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRATWGGATHDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 33 (Легкая цепь Ab110)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDDSLNGVLFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO: 34 (Тяжелая цепь Ab19) с константной областью
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYDMTWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSDKDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVYYYGFSGPSMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 35 (Легкая цепь Ab19) с константной областью
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSNSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSDSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSRVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
[0325] После подробного описания изобретения и со ссылкой на конкретные варианты его осуществления, будет очевидно, что возможны модификации и варианты без отступления от объема изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения. Более конкретно, хотя некоторые аспекты настоящего изобретения определены в настоящем документе как особенно выгодные, предполагается, что настоящее изобретение не должно быть обязательно ограничено этими конкретными аспектами изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ТАКЕДА ФАРМАСЬЮТИКАЛ КОМПАНИ ЛИМИТЕД
СМИТСОН, Гленнда
ЭСТЕВАМ, Хосе
ДЖОУНЗ, Николас
<120>  СПОСОБЫ И МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ОТВЕТА НА ТЕРАПИЮ ПРОТИВ ПЛАЗМОБЛАСТОВ
И ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
<130>  67376-266608
<140>  Номер патентной заявки PCT
<141>  2017-07-14
<150>  62/362.963
<151>  2016-07-15
<160>  35
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  300
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys
1               5                   10                  15
Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Leu Cys Leu Gly Val Ser Ile Leu Val
20                  25                  30
Leu Ile Leu Val Val Val Leu Ala Val Val Val Pro Arg Trp Arg Gln
35                  40                  45
Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro Glu Thr Val Leu
50                  55                  60
Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu Met Arg His Val
65                  70                  75                  80
Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser Lys
85                  90                  95
His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Met Lys Leu
100                 105                 110
Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu Trp Ser Arg Ile
115                 120                 125
Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe Thr
130                 135                 140
Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp Cys
145                 150                 155                 160
Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp Trp
165                 170                 175
Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr Val
180                 185                 190
Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val His Val Met Leu
195                 200                 205
Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly Ser
210                 215                 220
Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Thr Leu Glu Ala
225                 230                 235                 240
Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln Asp
245                 250                 255
Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile Gln
260                 265                 270
Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys Val
275                 280                 285
Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile
290                 295                 300
<210>  2
<211>  301
<212>  Белок
<213>  Macaca fascicularis
<400>  2
Met Ala Asn Cys Glu Phe Ser Pro Val Ser Gly Asp Lys Pro Cys Cys
1               5                   10                  15
Arg Leu Ser Arg Arg Ala Gln Val Cys Leu Gly Val Cys Leu Leu Val
20                  25                  30
Leu Leu Ile Leu Val Val Val Val Ala Val Val Leu Pro Arg Trp Arg
35                  40                  45
Gln Gln Trp Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Arg Phe Pro Glu Thr Val
50                  55                  60
Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Val His Pro Glu Met Arg His
65                  70                  75                  80
Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala Phe Ile Ser
85                  90                  95
Lys Tyr Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro Leu Val Lys
100                 105                 110
Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Thr Leu Leu Trp Ser Arg
115                 120                 125
Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg Asp Met Phe
130                 135                 140
Thr Leu Glu Asp Met Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp Leu Thr Trp
145                 150                 155                 160
Cys Gly Glu Phe Asn Thr Phe Glu Ile Asn Tyr Gln Ser Cys Pro Asp
165                 170                 175
Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe Trp Lys Thr
180                 185                 190
Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Thr Ala Cys Gly Val Val His Val Met
195                 200                 205
Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser Thr Phe Gly
210                 215                 220
Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln Ala Leu Glu
225                 230                 235                 240
Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp Leu Cys Gln
245                 250                 255
Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys Arg Asn Ile
260                 265                 270
Arg Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe Leu Gln Cys
275                 280                 285
Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Leu Ser Gly Ile
290                 295                 300
<210>  3
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 тяжелой цепи Ab79
<400>  3
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly
1               5
<210>  4
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 тяжелой цепи Ab79
<400>  4
Ile Ser Trp Asn Gly Gly Lys Thr
1               5
<210>  5
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 тяжелой цепи Ab79
<400>  5
Ala Arg Gly Ser Leu Phe His Asp Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Gly His
1               5                   10                  15
<210>  6
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 легкой цепи Ab79
<400>  6
Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn Tyr
1               5
<210>  7
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 легкой цепи Ab79
<400>  7
Arg Asp Ser
1
<210>  8
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 легкой цепи Ab79
<400>  8
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser
1               5                   10
<210>  9
<211>  135
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи Ab79
<400>  9
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Asp Ile Ser Trp Asn Gly Gly Lys Thr His Tyr Val Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Ser Leu Phe His Asp Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Gly His
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
130                 135
<210>  10
<211>  129
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариабельная область легкой цепи Ab79
<400>  10
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn
20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Arg Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
85                  90                  95
Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115                 120                 125
Leu
<210>  11
<211>  134
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь Ab19
<400>  11
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20                  25                  30
Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Val Tyr Tyr Tyr Gly Phe Ser Gly Pro Ser Met Asp Val Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala
130
<210>  12
<211>  130
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь Ab19
<400>  12
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Ser Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
85                  90                  95
Ser Gly Ser Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100                 105                 110
Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115                 120                 125
Glu Leu
130
<210>  13
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 тяжелой цепи Ab19
<400>  13
Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Asp
1               5
<210>  14
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 тяжелой цепи Ab19
<400>  14
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys
1               5
<210>  15
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 тяжелой цепи Ab19
<400>  15
Ala Arg Val Tyr Tyr Tyr Gly Phe Ser Gly Pro Ser Met Asp Val
1               5                   10                  15
<210>  16
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 легкой цепи Ab19
<400>  16
Asn Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr
1               5
<210>  17
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 легкой цепи Ab19
<400>  17
Ser Asp Ser
1
<210>  18
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 легкой цепи Ab19
<400>  18
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Arg
1               5                   10
<210>  19
<211>  452
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь Ab19
<400>  19
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20                  25                  30
Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Val Tyr Tyr Tyr Gly Phe Ser Gly Pro Ser Met Asp Val Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210>  20
<211>  217
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь Ab19
<400>  20
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Ser Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
85                  90                  95
Ser Gly Ser Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100                 105                 110
Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115                 120                 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165                 170                 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180                 185                 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195                 200                 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  21
<211>  453
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь Ab79
<400>  21
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Asp Ile Ser Trp Asn Gly Gly Lys Thr His Tyr Val Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Ser Leu Phe His Asp Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Gly His
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195                 200                 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210                 215                 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225                 230                 235                 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260                 265                 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275                 280                 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290                 295                 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305                 310                 315                 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325                 330                 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340                 345                 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355                 360                 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370                 375                 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385                 390                 395                 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405                 410                 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420                 425                 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435                 440                 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210>  22
<211>  216
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь Ab79
<400>  22
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn
20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Arg Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
85                  90                  95
Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115                 120                 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165                 170                 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180                 185                 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195                 200                 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  23
<211>  318
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  23
Met Ala Ala Gln Gly Cys Ala Ala Ser Arg Leu Leu Gln Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
Gln Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Gly Ala Arg Ala
20                  25                  30
Arg Trp Arg Gly Glu Gly Thr Ser Ala His Leu Arg Asp Ile Phe Leu
35                  40                  45
Gly Arg Cys Ala Glu Tyr Arg Ala Leu Leu Ser Pro Glu Gln Arg Asn
50                  55                  60
Lys Asn Cys Thr Ala Ile Trp Glu Ala Phe Lys Val Ala Leu Asp Lys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Cys Ser Val Leu Pro Ser Asp Tyr Asp Leu Phe Ile Asn Leu
85                  90                  95
Ser Arg His Ser Ile Pro Arg Asp Lys Ser Leu Phe Trp Glu Asn Ser
100                 105                 110
His Leu Leu Val Asn Ser Phe Ala Asp Asn Thr Arg Arg Phe Met Pro
115                 120                 125
Leu Ser Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Ala Asp Phe Leu Ser Trp Cys
130                 135                 140
Arg Gln Lys Asn Asp Ser Gly Leu Asp Tyr Gln Ser Cys Pro Thr Ser
145                 150                 155                 160
Glu Asp Cys Glu Asn Asn Pro Val Asp Ser Phe Trp Lys Arg Ala Ser
165                 170                 175
Ile Gln Tyr Ser Lys Asp Ser Ser Gly Val Ile His Val Met Leu Asn
180                 185                 190
Gly Ser Glu Pro Thr Gly Ala Tyr Pro Ile Lys Gly Phe Phe Ala Asp
195                 200                 205
Tyr Glu Ile Pro Asn Leu Gln Lys Glu Lys Ile Thr Arg Ile Glu Ile
210                 215                 220
Trp Val Met His Glu Ile Gly Gly Pro Asn Val Glu Ser Cys Gly Glu
225                 230                 235                 240
Gly Ser Met Lys Val Leu Glu Lys Arg Leu Lys Asp Met Gly Phe Gln
245                 250                 255
Tyr Ser Cys Ile Asn Asp Tyr Arg Pro Val Lys Leu Leu Gln Cys Val
260                 265                 270
Asp His Ser Thr His Pro Asp Cys Ala Leu Lys Ser Ala Ala Ala Ala
275                 280                 285
Thr Gln Arg Lys Ala Pro Ser Leu Tyr Thr Glu Gln Arg Ala Gly Leu
290                 295                 300
Ile Ile Pro Leu Phe Leu Val Leu Ala Ser Arg Thr Gln Leu
305                 310                 315
<210>  24
<211>  122
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь Контроля 1
<400>  24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  25
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь Контроля 1
<400>  25
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  26
<211>  120
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь Контроля 2
<400>  26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  27
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь Контроля 2
<400>  27
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  28
<211>  449
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь Ab43
<400>  28
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Met
50                  55                  60
Lys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
Lys
<210>  29
<211>  216
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь Ab43
<400>  29
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Tyr Lys
20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85                  90                  95
Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115                 120                 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165                 170                 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180                 185                 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195                 200                 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  30
<211>  455
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь Ab72
<400>  30
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Asp Ser Asn Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met
100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115                 120                 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130                 135                 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165                 170                 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180                 185                 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195                 200                 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210                 215                 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245                 250                 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260                 265                 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290                 295                 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305                 310                 315                 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325                 330                 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340                 345                 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
355                 360                 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370                 375                 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405                 410                 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420                 425                 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435                 440                 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450                 455
<210>  31
<211>  216
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь Ab72
<400>  31
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Lys
20                  25                  30
Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Ala Arg Ser
85                  90                  95
Thr Asn Ile Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115                 120                 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165                 170                 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180                 185                 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195                 200                 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  32
<211>  449
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь Ab110
<400>  32
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ile Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Arg Ala Thr Trp Gly Gly Ala Thr His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
Lys
<210>  33
<211>  216
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь Ab110
<400>  33
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
85                  90                  95
Asn Gly Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115                 120                 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165                 170                 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180                 185                 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195                 200                 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  34
<211>  452
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь Ab119
<400>  34
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20                  25                  30
Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Val Tyr Tyr Tyr Gly Phe Ser Gly Pro Ser Met Asp Val Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210                 215                 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435                 440                 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210>  35
<211>  217
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь Ab19
<400>  35
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20                  25                  30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Ser Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu
85                  90                  95
Ser Gly Ser Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100                 105                 110
Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115                 120                 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165                 170                 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180                 185                 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195                 200                 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<---