СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА С ИММУНОГЛОБУЛИНАМИ ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ
METHOD FOR OBTAINING COLLOIDAL GOLD CONJUGATES WITH IMMUNOGLOBULINS IN THE MANUFACTURE OF IMMUNOCHROMATOGRAPHIC TEST SYSTEMS

Предлагаемое изобретение относится к области иммунохимии и иммунологии и может быть использовано при изготовлении иммунохроматографических тест-систем.
Общая схема иммунохроматографического анализа заключается в следующем: проба под действием капиллярных сил перемещается вдоль тест-полоски, поочередно проникая из подложки образца в подложку конъюгата, где образуется комплекс антиген-конъюгат. Затем фронт жидкости преодолевает аналитическую (тестовую) зону, которая представляет собой участок мембраны с иммобилизованными антителами, специфичными в отношении антигена. Далее, проходя контрольную зону, конъюгат связывается с иммобилизованными антителами, специфичными в отношении иммуноглобулинов в составе конъюгата. В случае наличия в пробе антигена наблюдается две окрашенных линии: в аналитической и контрольной зонах. В случае отсутствия такового формируется одна линия в контрольной зоне [Raphael С. Wong, Harley Y. Lateral Flow Immunoassay // Humana Press. - 2009].
Основной характеристикой любой тест-системы является чувствительность (специфическая активность) - минимальная выявляемая концентрация антигена в пробе, при которой наблюдается положительный результат. В иммунохроматографическом анализе этот параметр напрямую связан с качеством используемого конъюгата. В настоящее время наиболее распространенной меткой, включаемой в состав конъюгата, являются наночастицы коллоидного золота. Такие конъюгаты готовят на основе коллоидных растворов (золей) золота, методики приготовления которых отработаны и при соблюдении всех условий позволяют получать стабильные золи с размерами частиц от 2 нм и более [Дымкан Л.А., Богатырев В.А., Щеголев С.Ю., Хлебцов Н.Г. Золотые наночастицы: синтез, свойства, биомедицинское применение // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т. 10. - №3]. Для иммунохроматографии, как правило, используют золи со средним размером частиц от 15 до 40 нм. В то же время, свойства конъюгатов и, как следствие чувствительность тест-систем, определяются в первую очередь методикой их получения.
Для приготовления конъюгатов коллоидного золота с иммуноглобулинами в настоящее время используют несколько методических подходов, различающихся по некоторым параметрам. В общем случае методика включает себя следующие основные этапы: подготовка иммуноглобулинов и золя золота, определение оптимального соотношения коллоидного золота и иммуноглобулинов, сорбция антител на поверхности частиц золота, вторичная стабилизация конъюгата нейтральным белком или высокомолекулярным химическим веществом, отделение неадсорбированных молекул путем осаждения частиц конъюгата центрифугированием, перевод частиц конъюгата в стабилизирующий раствор. Ключевыми в данном случае являются этапы сорбции антител на поверхности частиц, вторичной стабилизации, отделения неадсорбированных молекул, перевода частиц конъюгата в стабилизирующий раствор (среду высушивания).
Сорбция, как правило, производится путем смешивания золя золота с предварительно подготовленным препаратом антител, с последующей экспозицией реакционной смеси при непрерывном перемешивании в течение 15 мин и более. При этом рН золя золота и рН раствора антител должны совпадать, а молярность раствора, в котором находятся иммуноглобулины, должна быть минимальной.
Частицы золя золота имеют отрицательный поверхностный заряд, что делает его стабильным, однако малейшее увеличение ионной силы приводит к необратимой агрегации частиц. При внесении в раствор коллоидного золота достаточного количества иммуноглобулинов их молекулы равномерно покрывают отрицательно-заряженную поверхность частиц золота, связываясь с ней положительно-заряженными участками, тем самым стабилизируя золь.
Однако пространственно молекулы иммуноглобулинов могут располагаться таким образом, что даже при их избытке могут оставаться свободные участки поверхности. Кроме того, молекулы иммуноглобулинов при дальнейших манипуляциях (изменение рН, повышение молярности и т.д.) могут менять пространственную ориентацию и тем самым вызвать полную или частичную агрегацию. В этом случае внешний вид конъюгата может не изменится, однако его иммунохимические свойства существенно ухудшатся. Чтобы этого избежать, конъюгат дополнительно стабилизируют внесением в реакционную среду вторичного стабилизатора. Для этого, как правило, используется нейтральный белок (альбумин) либо высокомолекулярное вещество, например полиэтиленгликоль (ПЭГ). После данного этапа в реакционной смеси присутствует комплекс частица-иммуноглобулин-стабилизатор, а также не связавшиеся антитела и стабилизатор.
Поскольку наличие в препарате свободных антител недопустимо, так как это вызовет конкуренцию с конъюгатом, их необходимо отделить. С этой целью используют продолжительное (не менее 30 мин) центрифугирование при высоких значениях центробежного ускорения (g) с последующим удалением надосадочной жидкости и ресуспендированием конъюгата в отмывочной буфере. В классическом варианте операцию повторяют минимум два раза. После заключительного центрифугирования конъюгат ресуспендируют в среде высушивания, наносят на специальные мембраны и сушат.
2
3
Известен метод, предусматривающий следующие этапы: диализ антител против 0,005 М карбонатного буфера с рН 8,2; коррекция рН коллоидного золота до необходимого значения с помощью свежеприготовленного 0,2 М раствора КСО; внесение необходимого объема моноклональных антител в 10,0 мл золя золота; ресуспендирование в течение 30 мин при комнатной температуре; добавление 0,5 мл 10% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) с последующим инкубированием еще 30 мин; центрифугирование смеси при 18100 g в течение 30 мин; двукратная отмывка осадка центрифугированием в 0,01 М фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,4), содержащем 0,3% БСА; перевод осадка после последней отмывки в 1,5 мл буферного раствора, содержащего 0,02 М трис (рН 8,2), 1% сахарозы, 1% БСА, 0,02% твина-20 и 0,01% азида натрия [Федюкина Г.Н., Ветчинин С.С., Баранова Е.В., Рудницкий С.Ю., Соловьев П.В., Колосова Н.В., Бикетов С.Ф. Получение компонентов иммунохроматографического теста для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза // Биотехнология. - 2015. - №1. - С. 85-92].
Основным недостатком данного метода является трехкратное центрифугирование с двукратной отмывкой, во время которых неизбежны потери иммунологической активности конъюгата при каждом цикле. Это связано с частичной агрегацией конъюгата, а также с разрушением комплексов иммуноглобулин-коллоидное золото, что в свою очередь приводит к снижению чувствительности тест-системы.
Наиболее близким к предлагаемому нами способу получения конъюгатов является способ, по которому после этапа инкубации частиц коллоидного золота и иммуноглобулинов класса G к конъюгату добавляют БСА до конечной концентрации 0,01%, сахарозу до 10% и азид натрия до 0,01%, после чего однократно центрифугируют (30 мин при 11000 g с охлаждением до 4°С). Супернатант декантируют, осадок ресуспендируют в калий-калий фосфатном буфере с рН 7,4, содержащем 0,1 М NaCl, 0,1% БСА, 10% сахарозы и 0,01% азида натрия [Боровиков С.Н., Жумалин А.Х., Джангулова А.Б. Определение оптимальных параметров конструирования экспресс-теста для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота // Вестник Науки Казахского агротехнического университета имени С. Сейфуллина. - 2016. - №2 (89). - С. 12-18].
Недостатком данного метода является невозможность полного удаления реакционной смеси, содержащей свободные иммуноглобулины и вторичный стабилизатор. Это связано с тем, что стабилизированный конъюгат не формирует плотного осадка даже при длительном центрифугировании при средних значениях g. Центрифугирование в данном случае не позволяет разделить жидкую и твердую фазы, а лишь концентрирует частицы на дне пробирки с образованием так называемой «пуговки». Образование плотного «трудноразбиваемого» осадка свидетельствует об агрегации частиц конъюгата. Следует отметить, что этот недостаток частично нивелируется при трехкратном центрифугировании, поэтому методики с использованием многократной отмывки наиболее распространены.
Задачей изобретения является уменьшение общего времени приготовления конъюгатов коллоидного золота с иммуноглобулинами за счет сокращения количества центрифугирований до одного при одновременной минимизации попадания свободных иммуноглобулинов и вторичного стабилизатора в конечный раствор конъюгата.
Представленная задача решается благодаря тому, что в способе с однократным центрифугированием предусмотрены следующие отличия: приготовленный и стабилизированный конъюгат в центрифужной пробирке наслаивают на раствор с высокой плотностью, который одновременно является средой высушивания. После этого смесь центрифугируют, используя бакетный ротор, при значениях g от 7500 до 15000 в течение 30 мин, удаляют надосадочную жидкость, оставляя необходимый объем среды высушивания, в котором ресуспендируют конъюгат для последующего нанесения на мембрану.
Сущность предложенного способа заключается в следующем: в процессе центрифугирования частицы конъюгата, обладая большой массой, за счет центробежных сил легко преодолевают границу раствора с высокой плотностью, концентрируясь на дне пробирки. В то же время молекулы иммуноглобулинов и вторичного стабилизатора, находясь в истинно растворенном состоянии, медленно диффундируют в раствор с высокой плотностью. Таким образом, достигается максимальное разделение не связавшихся антител и вторичного стабилизатора с конъюгатом при однократном центрифугировании.
2
3
2
4
7
Пример. Доводят рН золя коллоидного золота до значения 9,0, добавляя свежеприготовленный 0,1 М раствор КСО. Смешивают 2,0 мл моноклональных антител 272F7A10, специфичных в отношении спорового антигена возбудителя сибирской язвы (с концентрацией белка 40 мкг/мл, предварительно диализованных против 0,02 М раствора NaBO с рН 9,2), с 2,0 мл коллоидного золота, получая конечную концентрацию по белку 20 мкг/мл. Смесь инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая каждые 10 мин. По окончании инкубации в конъюгат для стабилизации вносят 0,25 мл 4% раствора ПЭГ-40000, перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Полученные 4,0 мл конъюгата аккуратно наслаивают в центрифужных пробирках на 5,0 мл раствора с высокой плотностью, который является одновременно средой высушивания, и центрифугируют (7500 g в течение 30 мин с охлаждением до 4°С). Надосадочную жидкость, содержащую сводобные антитела и ПЭГ-40000, декантируют, оставляя 1,0 мл, в котором ресуспендируют конъюгат. Состав раствора с высокой плотностью (среда высушивания): 0,025 М трис-буфер (рН 8,5), содержащий 0,1 М NaCl, 10% сахарозы, 0,2% БСА.
Полученный конъюгат используют при конструировании иммунохроматографической тест-системы для выявления спорового антигена возбудителя сибирской язвы.