Применение сканнирующей электронной микроскопии и биореактора для оценки эрадикации микробной биопленки корневых каналов при эндодонтическом лечении

МИКРОБИОЛОГИЯ

10. Методические указания МУК 4.2.1890—04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. М.; 2004.

REFERENCES

1. Kharseeva G.G., Voronina N.A., Mironov A.Yu., Kharisova A.R. Antibiotic susceptibility strains of Corynebacterium non diphtheriae, circulating in Rostov-on-Don and the Rostov region. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2012;

2. Funke G., von Graevenitz A., Clarridge J.E., Bernard K.A. Clinical microbiology of coryneform bacteria. Clin. Microbiol. Rev. 1997; 10(1): 125—59.

3. Kostyukova N.N. The causative agent of diphtheria and opportunistic Corynebacterium. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2001;

4. Kaufman D., Ott P., Rueqq C. Laryngopharyngitis by Corynebacterium ulcerans. Infection. 2002; 30(3): 168—70.

5. Knox K., Holmes A.H. Nosocomial endocarditis caused by Corynebacterium amycolatum and other nondiphtheriae Corynebacterium. Emerg. Infect. Dis. 2002; 8(1): 97—9.

6. Izurieta H.S., Strebel P.M., Youngblood T., Hollis D.G., Popovic T. Exudative pharyngitis possibly due to Corynebacterium pseudodiphtheriti-

cum, a new challenge in the differential diagnosis of diphtheria: report of a case and review. Emerg. Infect. Dis. 1997; 3(1): 65—8.

7. Ferrer I., Marne C., Revillo M.J., López A.I., Velasco J.J., García-Moya J.B. et al. Infección urinaria por Corynebacterium riegelii. Enferm. In-fecc. Microbiol. Clin. 2001; 19

8. Reddy B.S., Chaudhury A., Kalawat U., Jayaprada R., Reddy G., Ramana B.V. Isolation, speciation, and antibiogram of clinically relevant non-diphtherial Corynebacteria (Diphtheroids). Indian J. Med. Microbiol. 2012; 30(1): 52—7.

9. Guidelines MUK 4.2.3065—13. Control methods. Biological and microbiological factors. Laboratory diagnosis of diphtheria infection. [Metody kontrolua. Biologicheskie i microbiologicheskie factory. Laboratornaya diagnostika difteriynoy infektsii]. Moscow; 2013.

10. Guidelines MUK 4.2.1890—04. Determination of the sensitivity of microorganisms to antibiotics. [Opredelenie chuvstvitel'nosti mocroorga-nizmov kantibakterial'nympraparatam]. Moscow; 2004.

11. NCCLS. Performanse standards for antimicrobial susceptibility testing; ninth informational supplement M100-S25. 2015; 35(3): 1—231.

12. EUCAST Definitive document. Methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents. Clin. Microbiol. Infect. 1998; 4(5): 291—6.

Поступила 15.12.16 Принята к печати 15.01.17

КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017

УДК 616.314.17-002.2-085.837.3.015.2:615.831]-078-076.4

Царев В.Н., Подпорин М.С., Ипполитов Е.В.

ПРИМЕНЕНИЕ СКАННИРУЮЩЕЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ И БИОРЕАКТОРА ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭРАДИКАЦИИ МИКРОБНОЙ БИОПЛЕНКИ КОРНЕВЫХ КАНАЛОВ ПРИ ЭНДОДОНТИЧЕСКОМ ЛЕЧЕНИИ

ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава РФ, 127473, Москва

Частота осложнений по результатам эндодонтического лечения хронических форм пульпита и периодонтита остается высокой — от 32 до 50%, что связывают со свойствами микробной биопленки. Исследования этого объекта в корневых каналах и методов эрадикации биопленок находятся в начальной фазе исследования.

Цель — лабораторное обоснование и оценка эффективности комплексного воздействия ультразвуковой обработки и фотоактивируемой дезинфекции корня зуба при хронических формах пульпита и периодонтита, а также оценка эффективности эндодонтического лечения с применением сканирующей электронной микроскопии.

Микрофлору корневых каналов изучали бактериологическим методом (4 бактериальных и 2 грибковых клинических изо-лята). Влияние ультразвуковой обработки в комплексе с системой, фотоактивируемой дезинфекцией, на микрофлору корневого канала оценивали с использованием биореактора. Исследование биопленок системы корневых каналов зуба у больных хроническими формами пульпита (52 человека) и периодонтита (16 человек) проведены с использованием сканирующей электронной микроскопии.

Установлены наличие обильной микробной биопленки в устьях дентинных канальцев и обтурация дентинных канальцев в отдельных случаях. Описаны особенности формирования кривых роста популяций бактерий оральной микрофлоры (Por-phyromonas gingivalis; Fusobacterium nucleatum; Streptococcus sanguinis; Streptococcus mutans; Candida albicans; Candida krusei) в результате комплексного воздействия фотодинамической активации и ультразвука по сравнению с контролем без такового. Комплексное воздействие угнетает рост микробных популяций оральных бактерий и грибов рода Candida.

Ключевые слова: корневые каналы; микробная биопленка; сканирующая электронная микроскопия; эндодонти-ческое лечение; ультразвуковая ирригация; фотодинамическая терапия; биореактор; антимикробная активность in vitro.

Для цитирования: Царев В.Н., Подпорин М.С., Ипполитов Е.В. Применение сканирующей электронной микроскопии и биореактора для оценки эрадикации микробной биопленки корневых каналов при эндодонтическом лечении. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62 (8): 506-512. DOI:http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-8-506-512 Tsarev V.N., PodporinM.S., IppolitovE.V.

THE APPLICATION OF SCANNING ELECTRONIC MICROSCOPY AND BIO-REACTOR FOR EVALUATING ERADICATION OF MICROBIAL BIOFILM OF ROOT CHANNELS UNDER ENDODONTIC TREATMENT

The A.E. Evdokimov Moscow state medical stomatological university, 127473 Moscow, Russia

Для корреспонденции: Царев Виктор Николаевич, д-р мед. наук, проф., дир. НИМСИ, зав. каф. микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава РФ, e-mail: nikola777@rambler.ru

Russian clinical laboratory diagnostics. 2017; 62

DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-8-506-512

MICROBIOLOGY

According to the results of endodontic treatment ofchronic forms of odontotis and periodontitis the rate of complications continues to be high - from 32% to 50% that os related to characteristics of microbial bio-film. The studies of this object in root canals and methods of eradication of bio-films are at their initial .stage.

The purpose ofstudy is to provide a laboratory substantiation and evaluation of efficacy of complex effect of ultrasound processing and photo-activating disinfection of root of tooth in case of chronic forms of odontotis and periodontitis and also evaluation of endodontic treatment using scanning electronic microscopy.

The micro-flora of root canals was examined using bacteriological method (4 bacterial and 2 fungous clinical isolates). The effect of ultrasound processing in complex with the system, photo-activating disinfection on micro-flora of root canal was evaluated using a bio-reactor. The analysis of bio-films of system of root canals of tooth in patients with chronic forms of odontotis (52 patients) and periodontitis (16 patients) are implemented using scanning electronic microscopy.

The established availability of abundant microbial bio-film in orifices of dentinal tubules and obturation of dentinal tubules in particular cases. The features of formation of curves of growth of population of bacteria of oral micro-flora (Porphyromonas gingivalis; Fusobacterium nucleatum; Streptococcus sanguinis; Streptococcus mutans; Candida albicans; Candida krusei) as a result of complex effect ofphoto-dynamic activation and ultrasound as compared with control without such. The complex effect inhibits growth of microbial populations of oral bacteria and fungi species Candida.

Keywords: root canals; microbial bio-film; scanning electronic microscopy; endodontic treatment; ultrasound irrigation; photo-dynamic therapy; bio-reactor; anti-microbial activity in vitro

For citation: Tsarev V.N., PodporinM.S., IppolitovE.V. The application of scanning electronic microscopy and bio-reactor for evaluating eradication of microbial bio-film of root channels under endodontic treatment. Klinicheskaya Laboratornaya Diag-nostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2017; 62 (8): 506-512. (in Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-8-506-512

For correspondence: Tsarev V.N., doctor of medical sciences, professor,, director; head of the chair of microbiology, virology, immunology. e-mail: nikola777@rambler.ru

Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Acknowledgment. The study had no sponsor support.

Received 07.10.2016 Accepted 21.10.2016

Эндодонтическое лечение осложнений кариеса (пульпитов и апикальных периодонтитов) — один из самых востребованных методов оказания медицинской помощи как в Российской Федерации, так и во многих других странах. По данным Е.В. Боровского и П.А. Леуса (1998), обращаемость населения по поводу лечения пульпита и периодонтита в странах СНГ составила более 35% всех посещений стоматологических поликлиник [1]. В России обращения в стоматологические поликлиники по поводу лечения осложнений кариеса — наиболее частый случай, который в структуре оказания стоматологической помощи, по данным Митронина А.В. и соавт. (2009), составляет от 20 до 30% [2]. Причиной возникновения некроза пульпы и его прогрессирования служит бактериальная инфекция. Причем, по данным литературы, отличительной особенностью некроза пульпы зуба становится выраженное преобладание стрептококковой флоры над стафилококковой [3].

В стремительно развивающихся технологиях аэробной и анаэробной культивации исследователи высказывают единодушное мнение, что осложнения кариеса имеют полибактериальный характер. Среди патогенов, колонизирующих корневые каналы, выделяют грамотрицательные облигатно-анаэробные палочки группы Bacteroides, Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus micros, Peptostreptococcus anaerobius, Eubacterium alactolyticum, Eubacterium lentium, Wolinella recta, Campylobacter sputorum (составляют 85% общего числа возбудителей). Существенное место занимают также микроаэро-фильные стрептококки групп sanguinis и mutans [4].

Эндодонтическая обработка каналов остается основным этапом в комплексной терапии заболеваний пульпы. Оттого, как проведен этот этап, напрямую зависят отдаленные результаты лечения. Зачастую определяющую роль в недопущении дальнейших осложнений эндодонтического лечения играет эффективная и качественная инструментальная обработка при пульпите. Основной протокол лечения может быть дополнен физиотерапевтическими методами воздействия на область корневых каналов, в частности использованием физических факторов: ультразвука, медицинского озона и фотохимической реакции [1].

В последние годы установлено, что сохранение жизнеспособных бактерий в системе дентинных канальцев может быть связано с формированием микробных биопленок на уровне так называемого «смазанного слоя», которые препятствуют или нейтрализуют действие антисептических препаратов [5].

В связи с остротой этой проблемы предложено использование дополнительных физических воздействий, которые, по мнению авторов, способствуют разрушению биопленки. Один из наиболее популярных в настоящее время — метод фотоактивируемой дезинфекции. Он основан на использовании различных фотобиологических эффектов, вызываемых посредством сочетанного применения светового излучения, кислорода и фотосенсибилизатора [6].

Особое значение приобретает также качественная ирригация корневых каналов с активацией ирриганта с помощью ультразвукового файла пьезоэлектрической группы, что, возможно, повышает эффективность эндодонтического лечения с точки зрения очистки стенок дентинных канальцев, особенно, в области апекса [7]. Вместе с тем четких клинико-лабораторных доказательств формирования биопленок в системе дентинных канальцев и их разрушения в процессе указанных видов воздействия в зарубежной литературе не много [8], а в отечественной — и вовсе нет.

Цель нашего исследования — лабораторное обоснование применения комплексного воздействия ультразвуковой обработки и фотоактивируемой дезинфекции в экспериментах in vitro с использованием штаммов микроорганизмов, выделенных у пациентов с хроническими формами пульпита и периодонтита.

Материал и методы. Всего обследованы 52 пациента с диагнозом «хронический пульпит», в том числе: 26 с диагнозом «хронический фиброзный пульпит» (ХФП) и 26 с хроническим гангренозным пульпитом (ХГП); 16 пациентов с диагнозом «хронический периодонтит в фазе обострения». Возраст пациентов составил от 25 до 45 лет (для чистоты эксперимента, так как у пациентов более старшего возраста была выявлена общесоматическая патология); мужчин и женщин — 35 и 32 человек соответственно.

МИКРОБИОЛОГИЯ

Всем пациентам проводили традиционную методику эн-додонтического лечения, которая сопровождалась взятием материала для проведения сканирующей электронной микроскопии системы дентинных канальцев (СЭМ).

Этапы эндодонтического лечения в соответствии с протоколом Европейского общества эндодонтистов: обезболивание и установка коффердама; иссечение и удаление инфицированных твердых тканей зуба, формирование доступа к пульпарной камере; вскрытие и раскрытие пульпарной камеры; расширение устья корневых каналов, создание в верхней трети воронкообразной формы; экстирпация корневой пульпы; определение рабочей длины зубы; механическая и медикаментозная обработка корневого канала; высушивание корневых каналов; пломбирование корневых каналов.

В экспериментальной части исследования для оценки воздействия ультразвуковой активацией ирриганта на штаммы микроорганизмов использовали аппарат пьезоэлектрической группы Ultrasonic DTE-D5, а для проведения фотоактивируе-мой дезинфекции — аппарат Fotosan 360 с применением в качестве фотосенсибилизатора толуидинового синего.

Структуру биопленки корневых каналов изучали с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с использованием двулучевого микроскопа Quanta 200 3D (FEI Company, USA) в режиме высокого вакуума, при ускоряющих напряжениях 5 и ЮкУ, с предварительным напылением золотом (999) в установке SPI-Module Sputter/Carbon Coater System (SPI Inc., USA).

Микробиологическое изучение патологического содержимого корневых каналов осуществляли с помощью бактериологического метода исследования, включавшего в обязательном порядке анаэробное культивирование, путем количественных высевов на питательную среду М144 (Hi-media, Индия) с добавлением крови (для культивирования грамотрицательных анаэробных и грамположительных ми-кроаэрофильных бактерий) и М1297А (Himedia, Индия) для грибов рода Candida.

Посевы помещали в термостат при температуре 37°C на 48 ч (для анаэробных культур — в анаэростат на 7 сут), после чего использовали автоматическую систему по подсчету количества колоний Scan 500 (Interscience, Франция).

Из числа выделенных штаммов для экспериментальной части исследования были отобраны наиболее часто встречавшиеся у наших пациентов (4 бактериальных и 2 грибковых клинических изолята): Porphyromonas gingivalis; Fusobacterium nucleatum; Streptococcus sanguinis; Streptococcus mutans; Candida albicans; Candida krusei.

В экспериментальной части исследования проводили оценку влияния ультразвуковой обработки в комплексе с системой фотоактивируемой дезинфекции на микрофлору корневого канала с использованием биореактора «Реверс-Спиннер RTS-1» (BioSan, Латвия). В настоящем исследовании данная система, предназначенная для культивирования микроорганизмов и оценки их роста в режиме реального времени, использована нами впервые в отечественной практике для культивирования анаэробных бактерий пародонтопатогенной группы, стрептококков и грибов рода Candida (рис. 1).

Интерпретацию результатов проводили по изменению оптической плотности при длине волны X = 850 нм.

Для определения чувствительности выделенных штаммов применяли собственную модификацию метода серийных разведений, разработанную на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова.

В стерильные пластиковые пробирки Eppendorf помещали в равном соотношении взвесь испытуемого штамма и фотосенсибилизатор (по 0,20 мл соответственно), что в конечном количестве равнялось 106 КОЕ (колониеобразующих единиц) (в логарифмическом выражении 6 соответственно). Концентрация ФС — средняя (med), экспозиций ультразвуковой обработки — 10 с.

Рис. 1. Система культивирования микроорганизмов «Реверс-Спиннер RTS-1» (BioSan, Латвия).

При проведении эксперимента первоначально помещали наконечник ультразвукового аппарата непосредственно в бактериальную взвесь, включали на необходимый период времени, а затем добавляли ФС и помещали наконечник диодного аппарата и световое излучение на 30 с (в соответствии с инструкцией). В качестве контроля использовали бактериальную взвесь без последующей дальнейшей ее обработки.

Для культивирования микроорганизмов в биореакторе использовали два типа пробирок: 50 мл с мембранным фильтром (TubeSpin) для аэробов и 50 мл по типу Falcon с крышкой без мембраны. В каждую пробирку добавляли 15 мл питательной среды и вносили заранее подготовленную бактериальную взвесь с помощью биохимической пипетки.

Пробирки помещали в биореактор и с помощью программного обеспечения задавали необходимые параметры культивирования в соответствии с разработанными рекомендациями.

Для каждого вида микроорганизмов использовали свои настройки биореактора:

• Porphyromonas gingivalis (Temperature: 37°С; RPM: 1200 min-1; Measurement freq.: 3 h-1; Rev. Spin period: 1 sec; Volume: 15 ml X: 850 nm);

• Fusobacterium nucleatum (Temperature: 37°C; RPM: 1200 min-1; Measurement freq.: 2 h-1; Rev. Spin period: 2 sec; Volume: 15 ml X: 850 nm);

• Streptococcus sanguis (Temperature: 37°C; RPM: 1500 min-1; Measurement freq.: 3 h-1; Rev. Spin period: 2 sec; Volume: 15 ml X: 850 nm);

• Streptococcus mutans (Temperature: 37°C; RPM: 1700 min-1; Measurement freq.: 3 h-1; Rev. Spin period: 2 sec; Volume: 15 ml X: 850 nm);

• Candida albicans (Temperature: 37°C; RPM: 1300 min-1; Measurement freq.: 3 h-1; Rev. Spin period: 3 sec; Volume: 15 ml X: 850 nm);

• Candida krusei (Temperature: 37°C; RPM: 1300 min-1; Measurement freq.: 3 h-1; Rev. Spin period: 3 sec; Volume: 15 ml X: 850 nm).

Культивирование проводили для грибов в течение 2 сут, для пародонтопатогенных видов бактерий и стрептококков — в течение 5 сут. Регистрацию точек кривой роста — каждые 4 ч.

Результаты эксперимента отображали в графике динамики изменения оптической плотности на протяжении всего периода культивирования. По ключевым точкам кривых роста микробных популяций проводили статистическую обработку данных в

RUSSIAN CLINICAL LABORATORY DIAGNOSTICS. 2017; 62(8) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-8-506-512

MICROBIOLOGY

Porphyromonas gingivalis

0 —I—r~i—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—г

0,3 4 12 20 28 36 44 52 60 68 76 84 92 1 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 Время, ч

Fusobacterium nucleatum

0,3 4 12 20 28 36 44 52 60 68 76 84 92 1 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96

Рис. 2. Оценка чувствительности штаммов грамотрица-тельных бактерий к комплексному физиотерапевтическому воздействию: ультразвуковая (УЗ) + фотодинамическая (FDT) обработка in vitro (а — Porphyromonas gingivalis; б — Fusobacterium nucleatum). Кривая 1 — контроль; кривая 2 — УЗ + FDT.

5 повторах и обрабатывали методом параметрической статистики для малой выборки по Манну—Уитни (p < 0,05).

Результаты. Оценка чувствительности к ультразвуковой обработке в комплексе с фотоактивируемой дезинфекцией грамотрицательных анаэробных бактерий с использованием собственного модифицированного метода разведений показала следующее (рис. 2).

На представленных графиках видно, что лаг-фаза, охватывающая промежуток от момента посева бактерий до видимого начала их роста, продолжалась в среднем одинаково у всех исследуемых штаммов — в пределах суток. Так, для Porphyromonas gingivalis начало роста отмечалось на 16-й час культивирования, а для Fusobacterium nucleatum на 20-й час — как в контрольной, так и исследуемой пробе. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза, характеризующаяся прогрессирующим нарастанием скорости деления клеток, имела достоверные отличия как по достижению максимума биомассы (определяемой при данной методике по оптической плотности — OD), так и по скорости прироста клеток. Показатели пикового максимума оптической плотности контрольной пробы составили: Porphyromonas gingivalis — 2,37 OD (40 h); Fusobacterium nucleatum — 2,45 OD (48 h). Задержка логарифмической фазы и переход в стационарную фазу в исследуемых пробах наблюдали еще через 20—28 ч культивирования. Показатели пикового максимума оптической плотности исследуемой пробы составили: Porphyromonas gingivalis — 1,47 OD (88 h); Fusobacterium nucleatum — 1,46 OD (44 h) соответственно.

Оценка чувствительности к ультразвуковой обработке в комплексе с фотоактивируемой дезинфекцией штаммов грамположительных бактерий показала следующее (рис. 3).

На графиках видно, что лаг-фаза, продолжалась немного

дольше, чем у грамотрицательных бактерий, и отмечалась на 24-й час культивирования в контрольной и исследуемой пробе. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза также имела достоверные отличия: как по достижению максимума биомассы, так и по скорости прироста клеток. Показатели пикового максимума оптической плотности контрольной пробы составили: Streptococcus sanguis — 2,39 OD (40 h); Streptococcus mutans

— 2,49 OD (48 h). Задержка логарифмической фазы и переход к стационарной фазе в исследуемых пробах наблюдали в промежутке от 32 до 40 ч культивирования. Наиболее чувствительным к УЗ и ФД обработке оказался Streptococcus sanguinis

— максимум отмечен на 36-й час и составил 1,58 OD; более устойчивым оказался Streptococcus mutans — 2,01 OD (44 h).

Оценка чувствительности к ультразвуковой обработке в комплексе с фотоактивируемой дезинфекцией штаммов грибов Candida показала следующее (рис. 4).

В экспериментах с грибами рода Candida видно, что лаг-фаза, продолжалась не более 6 ч как в контрольной, так и в исследуемой пробе. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза была для разных видов различна, особенно в скорости прироста клеток. Показатели пикового максимума оптической плотности в контрольной пробе составили: Candida albicans — 7,81 OD (58 h); Candida krusei — 8,5 OD (62 h). Задержку логарифмической фазы в исследуемых пробах наблюдали на промежутке от 14 до 34 ч культивирования, причем у Candida krusei к 14 ч существенно снизилась скорость прироста клеток, а задержка лог-фазы отмечалась только на 34-й час. Наиболее чувствительным к УЗ и ФД обработке оказался Candida albicans — максимум был отмечен на 22-й час и составил 5,61 OD; более устойчивым оказался Candida krusei — 6,56 OD (42 h).

Streptococcus sanguinis

0-Ч-г

0,3 4 12 20 28 36 44 52 60 68 76 84 92 1 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 Время, ч

б

Streptococcus mutans

0,3 4 12 20 28 36 44 52 60 68 76 84 92 1 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 Время, ч

Рис. 3. Оценка чувствительности штаммов грамположитель-ных бактерий к комплексному физиотерапевтическому воздействию: ультразвуковая (УЗ) + фотодинамическая (FDT) обработка in vitro(а — Streptococcus sanguinis; б — Streptococcus mutans). Кривая 1 — контроль; кривая 2 — УЗ + FDT.

МИКРОБИОЛОГИЯ

а

Candida albicans

1- J

0 i i i-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-г

0,3 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66

Время, Ч б

Candida krusei

Время, ч

Рис. 4. Оценка чувствительности штаммов дрожжевых грибов рода Candida к комплексному физиотерапевтическому воздействию: ультразвуковая (УЗ) + фотодинамическая (FDT) обработка in vitro (а — Candida albicans; б — Candida krusei). Кривая 1 — контроль; кривая 2 — УЗ + FDT.

Сравнительная оценка чувствительности исследуемых штаммов в эксперименте in vitro к ультразвуковой обработке (УЗ) в комплексе с фотоактивируемой дезинфекцией (ФД) представлена в таблице.

При проведении сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) установлено наличие высокого уровня микробной контаминации зоны корневого канала и дентинных канальцев. На микрофотографии при увеличении в 1500 раз видны устья дентинных канальцев, которые обтурированы скоплениями микроорганизмов, формирующих биопленку (рис. 5). При увеличении в 5000 раз хорошо различимы палочковидные (бактероидные) микробные клетки и округлые дрожжевые элементы грибов (рис. 6).

При хемомеханической эндодонтической обработке формируется «смазанный слой», содержащий остатки разрушенной биопленки и микроорганизмы, что подтверждается сканирующей электронной, проведенной после эндодонти-ческой обработки (рис. 7). Очевидно, что смазанный слой служит своего рода питательной средой для микроорганизмов, поэтому легко восстанавливается без дополнительной эндодонтической дезинфекции. Смазанный слой также может нарушать адгезию пломбировочных материалов к стенкам корневых каналов.

Обсуждение. Как известно, система корневого канала зуба часто имеет сложную морфологию, особенно жевательной группы зубов. От основного канала на разных уровнях отходит множество латеральных канальцев. Основной канал в апикальной части образует дельту и открывается на верхушке корня не одним, а несколькими апикальными отверстиями [9].

Согласно современной концепции, ассоциации микроорганизмов полости рта колонизируют экосистему корневых каналов в виде биопленки, что существенно изменяет их свойства и затрудняет их удаление из системы корневых каналов [8]. Биопленка представляет собой сообщество микроорганизмов, окруженных внеклеточным полисахарид-ным матриксом и прикрепленных к влажной поверхности. Плотное прикрепление биопленки защищает присутствующие в ней микроорганизмы от воздействия неблагоприятных факторов, тем самым создавая благоприятные условия для размножения микроорганизмов. Полисахаридный матрикс служит специфическим барьером для проникновения внутрь биопленки антибактериальных агентов, в связи с чем повышается резистентность микробов к антисептикам и антибиотикам [10].

Штамм P.gingivalis F. nucleatum S.sanguinis S.mutans C.albicans C.krusei

Группы Контроль ФД + УЗ Контроль ФД + УЗ Контроль ФД + УЗ Контроль ФД + УЗ Контроль ФД + УЗ Контроль ФД + УЗ

Начало 0,19 ± 0,04 0,09* ± 0,03 0,19 ± 0,04 0,09* ± 0,03 0,24 ± 0,04 0,15* ± 0,04 0,30 ± 0,04 0,27 ± 0,04 0,12 ± 0,04 0,05 ± 0,02 0,12 ± 0,04 0,07 ± 0,03

подъема лаг-фазы

Сере- 0,32 ± 0,04 0,21* ± 0,04 0,29 ± 0,04 0,15* ± 0,02 0,67 ± 0,04 0,57* ± 0,04 0,54 ± 0,04 0,61 ± 0,04 0,85 ± 0,04 0,53* ± 0,04 0,8 ± 0,05 0,46* ± 0,04

дина лаг-фазы

роста

Начало 2,13 ± 0,05 0,93* ± 0,04 2,37 ± 0,05 1,34* ± 0,04 2,37 ± 0,05 1,56* ± 0,04 2,37 ± 0,05 1,8* ± 0,03 6,69 ± 0,05 5,28* ± 0,05 6,1 ± 0,05 5,89* ± 0,05

подъема

стацио-

нарной фазы

роста

Средний 2,26 ± 0,05 1,22* ± 0,03 2,28 ± 0,05 1,37* ± 0,03 2,23 ± 0,05 1,51* ± 0,03 2,42 ± 0,05 1,79* ± 0,04 7,38 ± 0,05 5,24* ± 0,05 7,23 ± 0,05 6,27* ± 0,05

пока-

затель

стацио-

нарной фазы

Примечание. * — достоверное снижение показателя при исследуемом физическом воздействии ^ < 0,05).

Сравнительная характеристика количественных параметров (по оптической плотности) роста микробных популяций с учетом узловых точек кривой роста

Russian clinical laboratory diagnostics. 2017; 62

DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-8-506-512

Рис. 5. Микробная обтурация дентинных канальцев. Сканирующая электронная микроскопия. Видны обтурированные устья трех канальцев (ув. х1500).

Полученные в нашем исследовании результаты позволяют предположить, что любой из представителей микробио-ты, колонизирующей поверхность зуба, может контаминиро-вать кариозную полость и проникнуть в пульпу зуба и далее

— в систему дентинных канальцев, что становится причиной воспалительного процесса.

По данным наших предыдущих исследований, из системы дентинных каналов могут выделяться с высокой частотой (от 50 до 90%) представители облигатно-анаэробных видов

— Peptostreptococcus anaerobius, Peptococcus niger, Porphy-romonas spp., Prevotella spp., Fusobacterium spp., Tannerella forsythia, но с меньшей (от 25 до 40%) — представители преимущественно микроаэрофильных видов — Streptococcus sanguinis, Propionibacterium spp., Corynebacterium spp., Actinomyces spp., а также некоторых облигатно-анаэробных

— Streptococcus intermedius, Treponema denticola, Eubacte-rium spp. При этом частота выделения стафилококка составляла всего лишь 6,2%, энтерококка — 24,1%, а грибов рода Candida — 13,8% [5].

Считается доказанным, что применение ультразвуковой

Рис. 6. Микробная обтурация дентинных канальцев. Сканирующая электронная микроскопия. Видно обтурированное устье одного из канальцев (ув. *5000).

microbiology

Рис. 7. «Смазанный слой» корневого канала с микробной биопленкой. Сканирующая электронная микроскопия (ув. х10 000).

активации ирриганта в процессе обработки корневых каналов служит более эффективной методикой по сравнению с традиционным ручным методом обработки [11]. В эндодон-тии ультразвук стали применять благодаря эффекту кавитации (в жидкой среде — формирование пузырьков пара, сопровождающееся шумом и гидравлическими ударами) и акустическим вихревым потокам, возникающим вокруг эн-додонтического файла в процессе работы. Вихревые потоки разбивают детрит корневого канала на опилки и нагревают дезинфицирующий раствор, что значительно повышает качество эндодонтического лечения и создает условия для герметичной обтурации корневого канала пломбировочными материалами [5, 12].

Заключение. При проведении сканирующей электронной микроскопии подтверждено наличие обильной микробной колонизации смазанного слоя в области устьев дентинных канальцев корня зуба, имеющей признаки микробной биопленки, представленной ассоциацией бактероидных и дрожжевых клеток. Установлена обтурация пролиферирующей микробной биопленкой устьев дентинных канальцев, что служит показанием для применения физических методов воздействия для более полноценной эрадикации микробной флоры дентинных канальцев.

Как показали наши исследования in vitro, фотоактиви-руемая дезинфекция в комплексе с ультразвуковой активацией ирриганта по-разному влияет на процесс размножения микробных клеток штаммов — представителей нормальной микрофлоры полости рта и пародонтопатогенной группы бактерий, а также на размножение грибов рода Candida. Но во всех случаях имеет место бактериостатический эффект, выражающийся в торможении размножения бактерий или грибов по сравнению с контрольными образцами.

При анализе динамики роста популяций бактерий и грибов у них были установлены различия в наступлении основных фаз кривой роста популяции, максимума размножения (стимуляции роста) и перехода к стационарной фазе. Кривые роста бактериальных популяций in vitro во всех случаях (со всеми использованными штаммами бактерий и дрожжевых грибов) после фотодинамической и ультразвуковой обработки демонстрировали явное снижение по сравнению с контрольными образцами.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

МИКРОБИОЛОГИЯ

ЛИТЕРАТУРА

1. Боровский Е.В., Макеева И.М., Жохова Н.С. Рабочая длина зуба и методы ее определения. Клиническая стоматология. 1998; (2): 8—11.

2. Митронин А.В., Чунихин А.А. Важные аспекты применения диодного лазера при эндодонтическом лечении хронического пульпита. Анализ клинико-лабораторного исследования. Российская стоматология. 2011; 4(4): 34—40.

3. Бир Р., Бауман М., Ким С. Эндонтология. Перевод с английского. М.: МЕДпрессинформ; 2004.

4. Олейник И.И. Микрофлора полости рта в норме и при развитии патологических процессов. В кн.: Боровский Е.В., Леонтьев В.К. Биология полости рта. Нижний Новгород: Медицинская книга; 2001: 226—61.

5. Царев В.Н., Дмитриева Л.А., Ипполитов Е.В., Нисанова С.Е. Последовательное применение антибактериальных и детокси-цирующих препаратов при эндодонтическом лечении хронического апикального периодонтита (Клинико-экспериментальное исследование). Эндодонтия Today. 2013; (1): 8—14.

6. Царев В.Н., Митронин А.В., Ипполитов Е.В., Малазония Т.Т., Подпорин М.С., Манучарян Л.А. Оценка антимикробного действия фотодинамической терапии на возбудителей неклостриди-альной анаэробной инфекции полости рта и грибы рода Candida в экспериментальных и клинических исследованиях. Эндодон-тия Today. 2015; (3): 15—20.

7. Бородина Н.Б., Петрова Т.Г. Пути повышения эффективности ирригации корневых каналов с использованием аппарата Р5 Newtron XS фирмы Satelec. Новое в стоматологии. 2009; (1): 2.

8. Ушаков Р.В., Царев В.Н. Микрофлора и иммунные процессы при одонтогенной инфекции. В кн.: Царев В.Н., ред. Микробиология, вирусология и иммунология полости рта. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2013: 455—500.

9. Роудз Д.С. Повторное эндодонтическое лечение. Консервативные и хирургические методы. Перевод с английского. М.: МЕД-прессинформ; 2009.

10. Ипполитов Е.В., Диденко Л.В., Царев В.Н. Особенности морфологии биопленки пародонта при воспалительных заболеваниях десен (хронический катаральный гингивит, хронический пародонтит, кандида-ассоциированный пародонтит) по данным электронной микроскопии. Клиническая лабораторная диагностика. 2015; 60(12): 59—64.

12. Хольгер Д. Ультразвук в эндодонтии. Медицинский алфавит. 2014; (1): 10—3.

REFERENCES

1. Borovskiy E.V., Makeeva I.M., Zhokhova N.S. The working length of the tooth and methods of its determination. Klinicheskaya stomatologiya. 1998;

2. Mitronin A.V., Chunikhin A.A. Important aspects of the diode laser in endodontic treatment of chronic pulpitis. Analysis of clinical and laboratory research. Rossiyskaya .stomatologiya. 2011; 4

3. Beer R., Baumann M.A., Kim S. Endodontology. Stuttgart,New York: Thieme; 2000.

4. Oleynik I.I. Oral microflora in health and development of pathological processes. In: Borovskiy E.V., Leont'ev V.K. Oral Biology [Biologiya polosti rta]. Nizhniy Novgorod: Meditsinskaya kniga; 2001: 226— 61.

5. Tsarev V.N., Dmitrieva L.A., Ippolitov E.V., Nisanova S.E. Consistent application of antibacterial and detoxifying drugs in endodontic therapy of chronic apical periodontitis

6. Tsarev V.N., Mitronin A.V., Ippolitov E.V., Malazoniya T.T., Podporin M.S., Manucharyan L.A. Evaluation of antimicrobial effect of photodynamic therapy agents non-clostridial anaerobic infection of the mouth and Candida species in experimental and clinical studies. Endodontiya Today. 2015;

7. Borodina N.B., Petrova T.G. Ways to improve the effectiveness of root canal irrigation using a device P5 Newtron XS company Satelec. Novoe v stomatologii. 2009;

8. Ushakov R.V., Tsarev V.N. Microflora and immune processes in odontogenic infection. In: Tsarev V.N., ed. Microbiology, Virology and Immunology of the Oral Cavity [Mikrobiologiya, virusologiya i immunologiyapolosti rta]. Moscow: GEOTAR-Media; 2013: 455— 500.

9. Rhodes J.S. Advanced Endodontics Clinical Retreatment and Surgery. London: Taylor and Francis Group; 2006.

10. Ippolitov E.V., Didenko L.V., Tsarev V.N. The morphology of periodontal biofilm in inflammatory diseases of the gums

11. Plotino G., Pameijer C.H., Grande N.M., Somma F. Ultrasonic in endodontics: a review of the literature. J. Endod. 2007; 33(2): 81—95.

12. Khol'ger D. Ultrasound in endodontics. Meditsinskiy alfavit. 2014;

Поступила 07.10.16 Принята к печати 21.10.16

Уважаемые авторы и читатели журнала!

Обращаем ваше внимание на то, что мы обновили сайт нашего журнала, новый адрес сайта: www.medlit.ru/journalsview/lab

Теперь вы можете подписаться через наш сайт на электронную версию журнала или купить отдельные статьи по издательской цене. Для этого нужно пройти регистрацию на сайте.