«Мы нашли способ переписать законы жизни»: как появилась технология CRISPR-Cas

«Мы нашли способ переписать законы жизни»: как появилась технология CRISPR-Cas

Технология редактирования генома удостоилась Нобелевской премии по химии 2020 года. А с чего всё начиналось?

Технология CRISPR-Cas когда-нибудь, возможно, станет известной настолько, что мы будем называть ее просто: «криспер». Так, например, входит в наш язык слово «ковид». Но если «ковид» проникает в языковую практику агрессивно и безжалостно, то «криспер» это по-настоящему заслужил. Решение Нобелевского комитета в эту среду — первый шаг к признанию.

О том, что это за технология и как она влияет на человека и человечества, среди прочего рассказывает в своей книге «Она смеется, как мать. Могущество и причуды наследственности» американский научно-популярный писатель Карл Циммер. Книга на русском языке вышла в издательстве «Альпина нон-фикшн» в 2020 году. Проект Здоровье Mail.ru с разрешения правообладателей публикует фрагмент одной главы из нее — «Дерзнув на великое».

В один из дней 2006 г. Дженнифер Дудна сидела в своем кабинете Калифорнийского университета в Беркли, когда ей неожиданно позвонили. Микробиолог из того же университета Джиллиан Бэнфилд хотела обсудить с ней какой-то криспер.

Дудна не поняла, о чем речь и чего от нее хотела собеседница. Однако Бэнфилд, занимавшаяся поиском новых видов бактерий на вершинах гор и океанском дне, была ученым, с которым без сомнения имело смысл поговорить. В то время Дудна занималась молекулами РНК, которые были синтезированы бактериями, человеком и другими организмами. Бóльшая часть ее работы проходила в тишине и покое, защищенных стенками лабораторной пробирки. Бэнфилд могла поделиться с ней информацией о мире за пределами пробирки.

На следующей неделе Дудна и Бэнфилд встретились в кафе. Бэнфилд рассказала Дудне о системе CRISPR — по крайней мере, все то, что было известно к 2006 г. Она нарисовала для Дудны в блокноте схему, где показала повторяющиеся последовательности ДНК с различающимися ДНК-вставками между ними, которые можно увидеть у некоторых бактерий.

В то время Бэнфилд описывала участки CRISPR у одного вида за другим. И она заметила, что некоторые из этих ДНК-вставок имеют вирусное происхождение. Другие ученые начали проверять предположение, что CRISPR — это своего рода защитная система, которую бактерии используют против вирусов и которая может передаваться по наследству. Но никто не знал, как она работает. Была версия, что для поиска вирусов бактерии синтезируют молекулы РНК. А поскольку Дудна была опытным специалистом по бактериальной РНК, Бэнфилд решила узнать, не захочет ли та помочь разобраться.

Дудна приняла это предложение. Она пригласила постдока Блейка Виденхефта для работы конкретно по CRISPR, но затем постепенно и вся ее лаборатория переключилась на эту тему. CRISPR в то время изучали также в нескольких других исследовательских учреждениях. В 2011 г. Дудна объединила усилия с французским биологом Эммануэль Шарпентье, и вместе они обнаружили, что система CRISPR, как и рестриктазы [группа ферментов, способных расщепить нуклеиновые кислоты], разрушает вирусную ДНК.

Однако между этими двумя способами защиты существовала заметная разница. Форма рестриктаз была такова, что они умели распознавать только одну небольшую последовательность ДНК, которая могла встречаться в геноме много раз. Чтобы рестриктазы не нападали на собственную ДНК, бактерии защищали ее с помощью метилирования [модификация молекулы ДНК без изменения самой нуклеотидной последовательности ДНК]. Вирусы же не умели прикреплять метильные группы на свою ДНК и поэтому оказывались уязвимы.

Фермент Cas9, который входит в систему CRISPR, работает более хитро. Бактерия синтезирует направляющую РНК, которая может привести фермент к одному и только одному участку ДНК. Сохраняя в своем геноме участки, соответствующие разным направляющим РНК, бактерия способна точно идентифицировать несколько различных видов вирусов.

Поскольку Дудна была молекулярным биологом, она отлично знала, что рестриктазы поспособствовали созданию индустрии биотехнологии. Она задумалась, а нельзя ли применить сходным образом систему CRISPR. Если система может распознавать любой участок ДНК вируса, то, вероятно, Дудне и ее коллегам удастся создать направляющие РНК для определенного участка в ДНК огурца. Или морской звезды. Или человека.

Чтобы проверить эту идею, Дудна и ее сотрудники попытались вырезать фрагмент одного гена из участка ДНК медузы. (Этот ген часто используется молекулярными биологами, поскольку кодирует светящийся белок, который под микроскопом превращает клетку в зажженный фонарик.) Для своих целей Дудна с коллегами выбрала фрагмент в 20 оснований. Далее исследователи синтезировали подходящие к этому фрагменту молекулы РНК и смешали все в пробирке. Направляющая РНК и фермент Cas9 соединились и отыскали нужные гены медузы. Когда Дудна и ее коллеги проанализировали оставшуюся ДНК, то обнаружили, что разрез был нанесен точно в том месте, для которого они синтезировали РНК. Ученые провели еще четыре эксперимента, используя направляющую РНК для разных мест, и всякий раз все срабатывало как надо.

«Мы нашли способ переписать законы жизни», — позже вспоминала исследовательница.

После публикации в 2012 г. Дудной с коллегами всех деталей этого эксперимента начался взлет системы CRISPR. И группа Дудны, и другие исследователи продолжали внедрять молекулы CRISPR в живые клетки. Ученые уже могли не только вырезать фрагменты из ДНК, но и чинить ее.

В одном из таких экспериментов Фэн Чжан со своими коллегами из Института Броада, расположенного в массачусетском Кембридже, доставил пару систем CRISPR в клетки человека. Молекулы прикрепились к двум соседним целям в пределах одного гена и вырезали короткий участок ДНК между ними. Собственные ферменты клетки, занимающиеся восстановлением ДНК, схватили эти два обрезанных конца и соединили их. Другими словами, данная процедура позволила хирургически удалить кусок ДНК, не оставив ни единого шрама. А когда клетка поделилась, ее потомки унаследовали это изменение.

20 интересных фактов о человеческом теле — в нашей галерее:

Вскоре исследователи начали с помощью CRISPR заменять участки в генах новыми последовательностями. Вместе с ферментами Cas9 и направляющей РНК ученые доставляли в клетку маленькие фрагменты ДНК. После того как ферменты вырезали из ДНК фрагмент, клетка заполняла разрыв внесенными кусочками ДНК.

Система CRISPR стала радикальным шагом вперед по сравнению с рестриктазами и мутагенезом под действием рентгеновского излучения. Она не давала случайных мутаций — в отличие от мутагенеза. Кроме того, отсутствовали ограничения на введение гена от одного организма в другой. Поскольку ученые уже умели синтезировать короткие фрагменты ДНК с нуля, система CRISPR потенциально позволяла вносить любое желаемое изменение в гены любого организма.

В далеких 1970-х гг. биолог Рудольф Йениш из Массачусетского технологического института впервые использовал рестриктазы, чтобы создавать генно-инженерных мышей. Когда появились CRISPR-повторы, ученый заинтересовался, нельзя ли применить эту систему для создания новых линий мышей. Совместно с Фэн Чжаном и его аспирантами и сотрудниками он начал манипулировать с CRISPR, пока не подобрал химический протокол, обеспечивающий проникновение этих молекул в зиготы мыши. Исследователи смогли изменить примерно пять генов, доставив в клетку пять различных направляющих РНК. Затем Йениш с коллегами имплантировал модифицированные зиготы в самку мыши, где они развились в нормальных детенышей. В 80% случаев исследовательская группа успешно получала именно те изменения, которые планировала.

Новые поколения аспирантов ежедневно мысленно благодарят Йениша за то, что он облегчил им жизнь. Множество диссертаций начинаются с моделирования на мышах какого-либо заболевания или работы какого-нибудь гена. Раньше для получения линии мышей обычным способом требовалось полтора года, к тому же часто приходилось предпринимать несколько попыток, чтобы добиться нужного результата. Сейчас же, с помощью CRISPR, Йенишу требуется для этого всего лишь пять месяцев.

***

Будучи в то горячее время журналистом, я делал все возможное, чтобы следить за открытиями, связанными с CRISPR. Но очень скоро процессия животных, модифицированных системой CRISPR, превратилась в столпотворение. Ученые изменяли ДНК у рыбок данио и бабочек, биглей и свиней. К 2014 г. мне стало ясно, что на моих глазах зарождается нечто поистине грандиозное. Биологи начали говорить о своей жизни до и после CRISPR. Но полностью я осознал значение для ученых системы CRISPR, когда одним весенним деньком отправился в Колд-Спринг-Харбор, чтобы провести его в гигантской оранжерее со стеклянными потолками той же формы, что и в кафедральном соборе.

Ботаник Закари Липпман повел меня по узкому проходу между рядами горшков, в каждом из которых торчало растеньице, обвивающееся вокруг колышка. Хотя мой собеседник был еще молод, в его черной бороде просвечивала пара прядей седых волос. Я подумал, что так на него могло повлиять наличие шестерых детей, которыми они с женой к этому времени уже успели обзавестись. Липпман шутил: «Говорят, что я занимаюсь генетикой на работе, а потом возвращаюсь домой и продолжаю заниматься генетикой там».

Липпману не впервой гордиться своими растениями. На ферме в Коннектикуте, где рос будущий исследователь, он научился выращивать гигантские тыквы. В период интенсивного набора веса они прибавляли по 5–7 кг в день. «Меня интересовало, как эта штука, чтоб ее черти взяли, вырастает такой огромной и как можно сделать ее еще огромнее», — говорил он.

Поступив в Корнеллский университет, Липпман специализировался по растениеводству и генетике. Там он обнаружил, что ученых уже давно занимает его детский вопрос, причем применительно не только к тыквам, но и к другим овощам и фруктам. Одним из главных изменений, полученных в ходе аграрной революции, было увеличение размера растительных культур: коротенькие початки теосинте превратились в длинные кукурузные, а бледные корешки дикой моркови разбухли до толстых оранжевых корнеплодов.

С помощью классических методов генетики ученые нашли некоторые мутации, обеспечившие возможность таких изменений. Липпман обнаружил, что значительная часть этих работ была выполнена на томатах, так как они хорошо подходят для генетических экспериментов. Липпман пошел по научным стопам своих предшественников и тоже занялся изучением томатов.

«Посмотрите-ка на эти крошечные ягодки», — сказал мне Липпман. Он остановился под нависающим над ним растением. Ухватив стебель, он бережно взял плоды. «Это растение — ближайший известный родственник первой одомашненной формы томатов», — пояснил он.

Одомашнивание томатов земледельцами-аборигенами Перу превратило ягоды размером с чернику в крупные плоды, которые мы видим на прилавках супермаркетов и на сельскохозяйственных выставках. Исследования Липпмана помогли разобраться, каким образом первым селекционерам удалось увеличить размер плодов. Оказывается, им пришлось изменить форму цветка.

Когда почка развивается в цветок, в ней сначала образуются клинья, которые называются «локулы». Из этих локул формируются части цветка томата. Из них же выходят и камеры плода. Есть ген, который определяет, сколько локул будет у данного растения. Мутация в этом гене заставляет растение производить больше локул. А увеличение их числа дает более крупный плод.

В процессе одомашнивания мутировал не только ген, контролирующий развитие локул. Липпман выяснил, что по мере распространения томатов в разные широты изменялась их реакция на определенную продолжительность светового дня.

Липпман с коллегами обнаружил, что дикие томаты, растущие в экваториальной области Южной Америки, приспособлены к тому, что световой день в тех краях круглый год длится по 12 часов. Когда же исследователи привезли дикие томаты с Галапагосских островов в Колд-Спринг-Харбор, оказалось, что тут растениям плохо — из-за длинного нью-йоркского летнего дня. Томаты реагировали на дополнительное солнечное освещение тем, что синтезировали белки, подавляющие цветение и задерживающие рост плодов до окончания этого периода. Однако сортовые томаты, которые произрастают в Европе и Северной Америке, приобрели мутации, снижающие выработку этих белков в летний период.

В 2013 г. Липпману стало известно, что исследователи догадались, как использовать CRISPR для редактирования генов растений. Он получил нужные молекулы и проверил их работу на томатах. Из всех генетических технологий, которые он когда-либо использовал, эта сильнее всего приблизила его к решению задачи.

«Все было очень четко, — рассказывал Липпман. — Мы просто сели и провели мозговой штурм на тему “Что именно мы можем сделать?”».

Одним из первых пунктов в списке была необходимость добиться, чтобы томаты не вырабатывали белки, подавляющие цветение в ответ на длинный световой день. С помощью CRISPR ученые вырезали ген-переключатель этого ответа у одомашненных томатов. И когда Липпман с коллегами прорастил измененные семена, растения зацвели и дали плоды на две недели раньше срока. Это означало, что отныне их можно использовать в районах с более коротким летом. Липпман говорит, что «теперь неплохо бы задуматься о выращивании наших лучших сортов томатов в еще более северных широтах, например в Канаде».

Липпман фактически создал новый сельскохозяйственный сорт за один шаг. В отличие от Лютера Бёрбанка [знаменитого американского селекционера, 1849–1926 гг.], ему больше не нужно осматривать тысячи растений в поисках одного перспективного мутанта. Ему не требуется и пересаживать в томат гены другого организма, чтобы создать генетически модифицированный сорт. Он непосредственно изменил гены растения, пользуясь своими знаниями о физиологии томатов.

12 полезных продуктов, столь же вкусных, что и вредные, — в нашей галерее:

Это достижение побудило команду Липпмана поставить более масштабную цель. Исследователи решили одомашнить дикое растение. И для своих экспериментов выбрали физалис.

Ученый уверял меня, что я не смогу оценить по достоинству то, что он сделал, пока не отведаю эту ягоду. Он принес пластиковый контейнер, который был заполнен плодами золотого цвета, формой и размером напоминающими небольшие стеклянные шарики. Надкусив физалис, я почувствовал насыщенный вкус, нечто промежуточное между апельсином и ананасом. Ягоды были насколько вкусными и оригинальными, что я даже удивился, почему никогда не пробовал их раньше. Причина крылась в том, как объяснил мне Липпман, что эти растения не были одомашнены.

Физалисы широко распространены в Северной и Южной Америке. Они вырастают в маленькие кустики и формируют плод внутри сухой оболочки, похожей на фонарик. Коренные американцы собирали физалисы для приготовления соусов, а европейские переселенцы последовали их примеру. Кто-то собирал семена этого растения и выращивал их в своих садах. И сегодня можно купить пакетик семян физалиса, а их плоды продаются на фермерских рынках и в магазинах для гурманов. Поскольку физалисы — дикорастущие растения, они продолжают считаться чем-то необычным по сравнению с сельскохозяйственными культурами. Плоды созревают в течение длительного времени, к тому же по очереди, поэтому садоводы должны ждать, пока все ягоды не упадут на землю, прежде чем собрать их. Иногда физалис называют земляной клюквой.

Липпман давно интересовался физалисом, поскольку это растение относится к тому же семейству, что и томаты. Их эволюционная близость означает, что у них много общего в биологии. Например, цветок как у физалисов, так и у томатов образуется из локул, и родственные гены регулируют этот процесс. Липпмана удивляло, что томаты одомашнены, а их близкие родственники физалисы — нет.

Одна из причин таких различий может крыться в том, что ДНК физалиса не так легко поддается «одомашниванию». У томатов, как и у человека, каждая хромосома присутствует в двух копиях. Но физалис располагает четырьмя! Чтобы закрепить определенную черту у физалиса, надо добиться, чтобы соответствующая мутация была во всех четырех копиях. Липпману пришло в голову, что вместо этого он мог бы отредактировать мутации напрямую в генах физалиса с помощью CRISPR.

Ботаник скользнул в проход, задевая плечами листья, и подошел к физалису, измененному с помощью CRISPR. Несколько дней назад растение отцвело, и его лепестки опали. Чашелистики разрослись, чтобы сформировать фонарик, который будет окружать развивающийся плод.

У обычного физалиса этот фонарик состоит из пяти чашелистиков. Липпман начал обрывать чашелистики на своем отредактированном растении, параллельно считая: «Один, два, три, четыре, пять, шесть, семь».

Как только он снял все чашелистики, показалась маленькая ягодка физалиса. В ней было семь локул вместо обычных пяти.

«Мы никогда бы не смогли сделать этого традиционной селекцией, — сказал Липпман. — А теперь — пожалуйста, — он прищелкнул пальцами, — за одно поколение. Мутация во всех четырех копиях гена».

В ближайшее время Липпман собирается опробовать и другие изменения. Он планирует отредактировать ген, контролирующий, когда именно плоды будут опадать, чтобы фермерам в их поисках не приходилось многократно обшаривать всю поверхность земли под кустами. Он хочет скорректировать скорость созревания плодов так, чтобы все ягоды поспевали одновременно, а не порциями, как сейчас, — равно как и изменить реакцию физалиса на освещение, чтобы плоды начинали образовываться пораньше. А еще исследователь планирует получить растения одинаковой высоты, чтобы фермеры могли использовать для сбора урожая машины.

20 фактов о работе вашего организма  — смотрите в галерее:

Липпман хочет начать с изменения одного признака за раз. Если это получится, то потом он собирается создать набор направляющих РНК, которые смогут изменить все черты сразу в одном растении. Когда такие физалисы начнут размножаться, их потомки получат все необходимые гены, превращающие их из диких растений в культурные.

«Я знаю, что это звучит немного нелепо, — признался Липпман, — но я считаю, что он станет еще одной ягодной культурой». Выслушав его план, я подумал, что это вовсе не нелепо. Я посчитал, что Липпман скромничает. Он пытается повторить аграрную революцию ускоренными темпами. Вместо тысячи лет ему нужен всего один вегетационный период.

***

Для CRISPR почти нет разницы между физалисом и человеком: их ДНК разрезается одинаково легко.

Ученые довольно оперативно начали использовать CRISPR для редакции генов в человеческих клетках, чтобы найти ответы на вопросы, которые когда-то казались неразрешимыми. У каждого из нас примерно 20 000 белок-кодирующих генов и тысячи генов, кодирующих молекулы РНК. Но какое их количество нам действительно нужно? Если мутация выключает некоторые гены, это приводит к смертельным наследственным заболеваниям. Тем не менее, несмотря на полученные сломанные гены, у многих из нас хорошее здоровье. Ученые давно задавались вопросом, сколько генов абсолютно необходимы человеку для выживания. При этом они понимали, что такой каталог составить не удастся.

Система CRISPR сделала это возможным. В 2015 г. три независимые исследовательские группы использовали CRISPR для выключения всех белок-кодирующих генов по очереди, чтобы понять, может ли клетка выжить без определенного гена. В итоге получились почти одинаковые списки. Незаменимыми оказались около 2000 генов, т. е. примерно 10% белок-кодирующих генов человеческого генома. Эксперименты показали, что многим генам можно и испортиться, поскольку у них есть запасные варианты. Если одни выйдут из строя, то другие возьмут на себя их функции.

Еще ряд ученых начал эксперименты с CRISPR и человеческими клетками, чтобы создать новый тип медицины. В декабре 2013 г. группа голландских исследователей продемонстрировала, как может работать CRISPR-медицина. Они взяли клетки больных муковисцидозом и вырастили колонию таких клеток в лаборатории. У всех у них была одна и та же мутация в гене cftr. Ученые собрали систему CRISPR так, чтобы она вырезала эту мутацию, а затем встроили в нужное место рабочую версию гена.

Вскоре стало ясно, что способности CRISPR не ограничиваются изменением соматических клеток. Эта система может вносить изменения и в клетки зародышевой линии.

В том же декабре группа ученых из Шанхайского института биологических наук в Китае опубликовала результаты эксперимента, выполненного на мышах с наследственной катарактой. Исследователи ввели в зиготу молекулы CRISPR, которые исправили мутантный ген. Измененные мыши развились в плодовитых взрослых особей, и их потомки смотрели на мир ясными глазами.

Первоначальный восторг Дженнифер Дудны понемногу стал сменяться тревогой. Система CRISPR оказалась более мощным инструментом, чем она ожидала. Генетик из китайского Центра исследования модельных животных при Нанкинском университете Синсюй Хуан с коллегами при помощи CRISPR изменил три гена у эмбрионов обезьян. Исследователи имплантировали эмбрионы в организм самки, и через положенное время она родила здоровую двойню. Если у этих животных будут свои дети, то они унаследуют и гены, измененные с помощью CRISPR.

Некий журналист в январе 2014 г. отправил Дудне предварительный вариант статьи об обезьянах и попросил ее дать комментарий. Прочитав текст, она не смогла не подумать о том, когда же пройдут первые эксперименты на человеческих эмбрионах. И именно тогда исследовательницу начали преследовать кошмарные сны.

Иногда Дудне снилось, как она стоит одна на пляже на Гавайях (она там выросла). Вдалеке она видит низкую волну, идущую прямо на нее, и через некоторое время понимает, что на самом деле это цунами. После первого испуга она находит доску для серфинга и идет прямо на волну. В другом повторяющемся сне коллега-ученый просил ее встретиться с кем-то могущественным. Она заходит в комнату. Могущественный человек оказывается Гитлером. Во сне Дудны вместо лица у него свиное рыло. Он стоит к ней спиной и быстро что-то пишет. «Я хочу разобраться в возможностях и последствиях этой потрясающей технологии», — говорит ей Гитлер с пятачком.

Дудна просыпалась с колотящимся сердцем. «Что же мы наделали?» — спрашивала она себя.

Обнаружили ошибку? Выделите ее и нажмите Ctrl+Enter.