AGRIS - 

2022

Dolgov, S.V. | Mikhajlov, R.V. | Serova, T.А. | Shul'ga, O.A. | Firsov, A.P.

Plum pox virus (PPV), the causative agent of plum Sharka disease, is considered the most dangerous pathogen of apricots, plums and peaches. The transformation of plum with viral genes, such as viral coat protein, can provide novel virus resistant forms or gene resources for breeding new resistant varieties. For improving the plants resistance to plum pox virus (PPV) 2 technologies were used. One based on co-suppression and another on RNA-silencing (RNAi). Binary vector pCamPPVcp that contained the selective hpt gene and ppv-cp gene of the Sharka disease virus coat in sense-orientation (manipulated by double 35S promoter) was used for realization of post-transcriptional gene silencing. Vector pCamPPVRNAi contained self-complementary fragments of gene ppv-cp (698bp) manipulated by double 35S promoter and the hpt and gus genes. The fragments of ppv-cp gene were separated by pdk-intron to produce a "hairpin" RNA structure in antisense-sense orientation. 7n independent transgenic lines with ppv-cp gene and 5 transgenic lines with a 2 inverted repeats of ppv-cp gene fragment were produced. Stable integration of genes into genome of plants was confirmed by PCR analyses. The accumulation of coat protein was evaluated by Western blot assay in 5 from 6 analyzed lines. The transgenic shoots were rooted and acclimatized to the greenhouse. After grafting by PPV infected buds in all control and ppv-cp transformed plants strips corresponding to the PPV coat protein were detected by Western blot analysis, whereas no any spots corresponding to the PPV coat protein were observed in samples from plants transformed by the "hairpin" construct. These preliminary results confirmed the efficiency of the RNAi strategy for plant protection from virus attack in general, and stone fruits from PPV in particular. | Наиболее опасным патогеном абрикосов, слив и персиков считается вирус оспы сливы (PPV), возбудитель болезни шарки сливы. Трансформация сливы вирусными генами, такими как белок оболочки, может обеспечить получение устойчивых к вирусам сортов и исходных форм для использования в селекционном процессе. Для повышения устойчивости растений к вирусу шарки сливы (PPV) использовали 2 технологии. Одна основана на совместном подавлении, а другая – на РНК-сайленсинге (RNAi). Бинарный вектор pCamPPVcp, который содержал селективный ген hpt и ген белка оболочки вируса шарки сливы ppv-cp в смысловой ориентации (управляемый двойным промотором 35S), был использован для реализации посттранскрипционного сайленсинга гена. Вектор pCamPPVRNAi содержал самокомплементарные фрагменты гена ppv-cp (698 пар оснований), управляемые двойным промотором 35S и генами hpt и gus. Фрагменты гена ppv-cp были разделены pdk-интроном для получения структуры РНК "шпильки" в антисмысловой ориентации. Получены 7 независимых трансгенных линий с геном ppv-cp и 5 трансгенных линий с 2 инвертированными повторами фрагмента гена ppv-cp. Стабильная интеграция генов в геном растений подтверждена ПЦР-анализами. Накопление белка оболочки оценивали методом вестерн-блоттинга в 5 из 6 проанализированных линий. Трансгенные побеги были укоренены и акклиматизированы в теплице. После прививки инфицированными PPV почками у всех контрольных и трансформированных ppv-cp растений с помощью вестерн-блоттинга обнаруживались полосы, соответствующие белку оболочки PPV, тогда как в образцах от растений, трансформированных конструкцией "шпилька", не наблюдалось никаких пятен, соответствующих белку оболочки PPV. Эти предварительные результаты подтвердили эффективность стратегии RNAi для защиты растений от вирусной атаки в целом и плодов косточковых культур и от PPV, в частности.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

2022

Kulikov, I.M. | Burmenko, Yu.V. | Sidorova, T.N. | Pushin, A.S. | Miroshnichenko, D.N. | Dolgov, S.V.

The use of Prunus rootstocks that are resistant to plum pox virus (PPV) is an important agronomic strategy to control the Sharka disease spreading in nurseries and orchards. Despite remarkable progress in developing stone fruit rootstocks to adapt to various stresses, breeding that ensures durable virus resistance has not yet been achieved. For this reason, the engineering of PPV resistant plants through genetic transformation is a very promising approach to control sharka disease. The aim of the present study is to produce transgenic plants of the clonal rootstock 'Elita', which is resistant to PPV using ribonucleic acid interference (RNAi) technology. The genetic construct containing the self-complementary fragments of the Plum pox virus coat protein (PPV-CP) gene sequence were used to induce the mechanism of post-transcriptional gene silencing to ensure virus resistance. Transgenic plants have been produced after agrobacterium-mediated leaf transformation in vitro. The results of polymerase chain reaction (PCR) and Southern blotting analyses confirmed the stable genomic integration of the PPV-CP sense and antisense intronhairpin-RNA sequence. The functionality of the introduced expression cassette was confirmed by the activity of including the uidA gene into the transferring T-DNA. To our knowledge, this is the first interspecific plum rootstock produced by genetic engineering to achieve PPV resistance. The technique applied ensures absence of foreign DNA introducing in the plum genome. | Использование подвоев сливы, устойчивых к потивирусу шарки сливы (PPV), является важной стратегией борьбы с распространением заболевания в питомниках и садах. Несмотря на значительный прогресс в разработки подвоев косточковых плодовых культур для адаптации к различным стрессам, долговременная устойчивость к вирусам традиционными методами селекции до сих пор безуспешна. По этой причине создание устойчивых к PPV растений биоинженерными методами остается актуальной в противодействии распространению этого заболевания. Целью настоящего исследования является получение трансгенных растений клонового подвоя косточковых культур 'Элита', устойчивого к PPV, с использованием технологии интерференции рибонуклеиновых кислот (RNAi). Для индуцирования механизма посттранскрипционного замалчивания экспрессии генов, обеспечивающего устойчивость к вирусу, была использована генетическая конструкция, содержащая самокомплементарные фрагменты последовательности гена белка оболочки вируса шарки сливы (PPV-CP). Трансгенные растения были получены после опосредованной агробактериями трансформации листьев in vitro. Результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) и Саузерн-блоттинга подтвердили стабильную геномную интеграцию последовательности PPV-CP смысловой и антисмысловой интрон-РНК-шпильки последовательности. Функциональность введенной экспрессионной кассеты была подтверждена активностью включения гена uidA в переносящую Т-ДНК. Насколько нам известно, это первый межвидовой подвой сливы, полученный с помощью генной инженерии для достижения устойчивости к PPV вирусам, Примененная методика исключает введение чужеродных последовательностей в геном сливы.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

2022

Sidorova, T.N. | Mikhajlov, R.V. | Pushin, A.S. | Miroshnichenko, D.N. | Dolgov, S.V.

Для получения устойчивых к вирусу шарки сливы (PPV) растений клонового подвоя 146-2 и промышленного сорта Стартовая использовался метод РНК-интерференционного сайленсинга генов. Для этого был создан вектор с самокомплементарными последовательностями фрагмента генов eIF (iso)4G и eIF(iso)E длиной 578 п.н. Гены eIF (iso)4G и eIF(iso)E кодируют факторы инициации трансляции, участвующие в жизненном цикле вируса шарки сливы. Для управления экспрессией шпильки был выбран сильный промотор гена рибулозо1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (RuBisCo) в полном и укороченном вариантах. Успешная генетическая трансформация была проведена штаммом A. tumefaciens CBE21. В качестве источника эксплантата использовали целые листья побегов, культивируемых in vitro. Гены nptII и hpt, кодирующие неомицин II и гигромицин фосфотрансферазы, были использованы в качестве селектируемых маркеров растений. В наших экспериментах получено 5 независимых трансгенных линий подвоя 146-2 и сорта Стартовая, акклиматизированных в тепличных условиях. Их статус подтвержден ПЦР и Саузерн-блоттингом. Эффективность трансформации составила 0,3-0,4%. Полученные растения были инфицированные PPV методом окулировки зараженных почек, устойчивость полученных растений оценивалась методом ELISA. Использование полноразмерного промотора гена малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы (RBCS) при трансформации растений сорта Стартовая приводило к понижению жизнеспособности растений в случае супрессии гена eIF(iso)4E и обеспечивало устойчивость по крайней мере в первый год после инокуляции в случае супрессии гена eIF(iso)4G. | The method of RNA interference gene expression silencing was used to obtain Plum pox virus (PPV) resistant rootstock and commercial variety Startovaya.For this purpose, a vector with self- complementary sequences of the 578 bp eIF(iso)4G and eIF(iso)E genes fragment was created. The eIF(iso)4G and eIF(iso)E genes encodes factors of initiation of translation involved in the life cycle of a Plum pox virus. A strong promoter of the ribulose-1.5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCo) gene was chosen to drive the expression of RNA interference hairpin in full and truncated variants. Successful genetic transformation of the 146-2 rootstock and variety Startovaya were carried out by A. tumefaciens CBE21 strain. Whole leaves from in vitro cultured shoots were used as an explant source. The nptII and hpt genes coding for neomycin II and hygromycin phosphotransferase were used as a plant-selectable markers. In our experiments, 5 independent transgenic lines of the clonal rootstock and the variety were obtained and acclimatized to greenhouse conditions. Their status was confirmed by PCR and Southern blot analyses. The transformation efficiency was 0.3-0.4%. One of these lines was grafted with PPV-infected plum buds and its resistance was verified by ELISA. The use of a full-length gene promoter of the small subunit of ribulosobiephosphate carboxylase (RBCS) in the transformation of plants of the Starter variety led to a decrease in plant viability in the case of suppression of the eIF(iso)4E gene and ensured stability at least in the first year after inoculation in the case of suppression of the eIF(iso)4G gene.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

2022

Dolgov, S.V. | Kulikov, I.M. | Burmenko, Yu.V.

The plum pox virus (PPV) causing the Sharka disease has become a major threat to the cultivation of stone fruit threes. This virus has caused enormous economic damage and caused a significant decrease in production areas in Eastern Europe and the Mediterranean. The pathogen has spread around the world, and is classified by plant quarantine services as the most dangerous pathogen for apricots, plums and peaches. At present, science cannot offer any ways to treat viral plant diseases, and the only way to control viruses is removal of infected trees. Given the seriousness of the disease, the difficulty of its spread control, the lack of disease-resistant varieties, the need to create commercial varieties of increased resistance to this pathogen is obvious. Modern methods of genetic engineering make it possible to significantly accelerate the processes of creating highly productive plum varieties with increased or complete resistance to viruses, unattainable by traditional breeding methods. However, most of the work on the genome modifications in stone fruit crops was carried out using juvenile material of zygotic origin, which has a higher morphogenetic potential compared to varieties. The use of modern bioengineering techniques in stone fruit crop breeding is hampered by the lack of reliable techniques that can provide a sufficiently high frequency of regeneration of shoots from somatic tissues. These and other reasons call for the development of an effective genotype-independent system for regenerating and modifying the genomes of commercial plum varieties. Given the rapid development of plant genome editing techniques, targeted mutation of host genes involved in replication and widespread PPV in infected tissues may be a promising approach for engineering resistance to viruses that exclude the introduction of foreign DNA sequences into a plum genome. | Вирус оспы сливы (PPV), вызывающий болезнь Шарки сливы, стал главной угрозой для выращивания косточковых культур. Этот вирус нанес огромный экономический ущерб и вызвал значительное снижение производственных площадей в странах Восточной Европы и Средиземноморья. Патоген распространился по всему миру и классифицирован карантинными службами растений как наиболее опасный для косточковых культур. В настоящее время наука не может предложить способы лечения вирусных заболеваний растений, поэтому единственным способом сдерживания их распространения остается уничтожение зараженных деревьев. Учитывая серьезность заболевания, трудность контроля над его распространением, отсутствие устойчивых к нему существующих сортов, очевидна необходимость создания гибридов с повышенной устойчивостью к этому патогену. Современные методы генной инженерии дают возможность значительно ускорить процессы создания высокопродуктивных сортов сливы с повышенной или полной устойчивостью к вирусам, недостижимые методами традиционной селекции. Большинство известных работ по модификации геномов косточковых плодовых культур выполнено с использованием ювенильного материала зиготического происхождения, имеющего более высокий морфогенетический потенциал по сравнению с сортами. Применение современных биоинженерных приемов в селекции косточковых культур тормозится отсутствием отработанных методик, способных обеспечить достаточно высокую частоту регенерации побегов из соматических тканей. Эти и другие причины вызывают необходимость разработки эффективной генотип-независимой системы регенерации и модификации геномов коммерческих сортов сливы. Принимая во внимание быстрое развитие методов редактирования генома растений, целевая мутация генов-хозяев, вовлеченных в репликацию и широкое распространение PPV в инфицированных тканях, может быть многообещающим подходом для инженерии устойчивости к вирусам, исключающим введение чужеродных последовательностей в геном сливы.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

2022

Sidorova, T.N. | Miroshnichenko, D.N. | Kirov, I.V. | Pushin, A.S. | Dolgov, S.V.

У косточковых плодовых культур устойчивость к вирусу шарки сливы (PPV) может быть достигнута за счет специфической деградации вирусной РНК по механизму РНК-интерференции (RNAi). Исследование решает следующий вопрос: в какой степени сигналы сайленсинга малые интерферирующие РНК (siRNA) передаются из трансгенного подвоя в прививку коммерческого сорта и насколько это влияет на его устойчивость к PPV? Были изучены две комбинации, NT:GM и GM:NT (привой:подвой), с акцентом на первую комбинацию. Инокуляцию вирусом проводили либо на привое, либо на подвое. Форму клонового подвоя косточковых культур 'Элита' [(Prunus pumila L.xP. salicina Lindl.)x(P. cerasifera Ehrh.)] использовали как подвой для домашней сливы сорта Стартовая (Prunus domestica L.). Трансгенные формы подвоя и привоя экспрессировали конструкцию РНК-шпильки, генерирующую малые интерферирующие РНК (siRNA) комплементарные гену белка оболочки PPV (CP), и демонстрировали высокую вирусную устойчивость. Данные о последовательностях пулов малых РНК (sRNA) показали, что накопление специфичной для конструкции малой интерферирующей (siRNA) в трансгенном подвое сливы достигло более 2% от общего количества. Повышенный уровень siRNA обеспечивал устойчивость к PPV и блокировал перемещение вируса через GM-ткани к NT-партнеру при инокуляции трансгенных тканей. Сигнал мобильной siRNA не перемещался от GM-подвоя к целевой NT-ткани привоя до уровня, достаточного для запуска сайленсинга транскриптов PPV и обеспечения надежной вирусной устойчивости. Отсутствие подвижности молекул siRNA, полученных из трансгена, сопровождалось переносом различных эндогенных специфичных для подвоя siRNA в NT-привой, что указывает на исключительное нарушение транзитивности исследуемого сигнала РНК интерференции. Представленные данные показывают, что результаты трансплантация косточковых плодовых культур пока непредсказуемы, транспорт siRNA в комбинации подвой/привой требует дальнейшего изучения на молекулярном уровне. | In stone fruit trees, resistance to Plum pox virus (PPV) can be achieved through the specific degradation of viral RNA by the mechanism of RNA interference (RNAi). Transgenic virus-resistant plants, however, raise serious biosafety concerns. The present study was aimed at answering the following question: To what extent are molecular RNAi silencing signals transmitted across graft junctions in transgrafted plum trees and how much does it affect PPV resistance in genetically modified (GM)/non-transgenic (NT) counterparts? Two combinations, NT:GM and GM:NT (scion:rootstock), were studied, with an emphasis on the first transgrafting scenario. Viral inoculation was carried out on either the scion or the rootstock. The interspecific rootstock 'Elita' [(Prunus pumila L.x.P. salicina Lindl.)x(P. cerasifera Ehrh.)] was combined with cv. 'Startovaya' (Prunus domestica L.) as a scion. Transgenic plum lines of both cultivars were transformed with a PPV-coat protein (CP)-derived intron-separate hairpin-RNA construct and displayed substantial viral resistance. High-throughput sequence data of small RNA (sRNA) pools indicated that the accumulation of construct-specific small interfering RNA (siRNA) in transgenic plum rootstock reached over 2%. The elevated siRNA level enabled the resistance to PPV and blocked the movement of the virus through the GM tissues into the NT partner when the transgenic tissues were inoculated. At the same time, the mobile siRNA signal was not moved from the GM rootstock to the target NT tissue to a level sufficient to trigger silencing of PPV transcripts and provide reliable viral resistance. The lack of mobility of transgene derived siRNA molecules was accompanied by the transfer of various endogenous rootstock-specific siRNAs into the NT scion, indicating the exceptional transitivity failure of the studied RNAi signal. The data presented indicate that transgrafting in woody fruit trees remains unpredictable, it needs further in-depth examination to deliver molecular silencing signals.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

2022

Fedorovich, S.V. | Suprun, I.I. | Stepanov, I.V.

Fruit crop virus has a negative effect on the timing of ripening and quality of fruit-bearing of plants. Virus free plants should be used for orchard set-up. Plum virus pox disease is a serious threat to horticulture because it has a wide range of host plants and able to spread in orchards in a short time. Methods for effective diagnosis of this virus are of high importance for the production of virus-free planting material. There are presented the results of testing and optimization of the method of plum virus pox disease diagnosis using reverse transcription PCR method, as well as the evaluation of its effectiveness in comparison with commercial kit using. Various tissues of PKSK 1, AI 1, VSL 1, and Gizela 5 rootstocks obtained in apical meristem culture and plum plants of Stanley cultivar ere used as the material. The concentration in the ratio of Oligo dT (Oligo(dT)15-primer) and Random (Random (dN)10-primer) primers added was optimized (1:2), in order to increase the yield of specific viral cDNA fragments. The primer pair of the amplification control was matched to the region of the gene encoding the small subunit of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase. For comparative evaluation, cDNA samples from plants obtained in vitro apical meristem culture and samples from symptomatic plants were used. After obtaining the preparation of total RNA, reverse transcription and amplification of the obtained cDNA were performed, followed by analysing the products on an agarose gel. No nonspecific amplification products and single-stranded DNA were observed in the samples. Amplification products of positive controls were observed in all samples examined. The studied method showed high efficiency compared to the standard method. | Вирус плодовых культур оказывает негативное влияние на сроки созревания и качество плодоношения растений. Для закладки садов необходимо использовать растения, свободные от вирусов. Вирус шарки сливы является серьёзной угрозой для садоводства, так как имеет широкий спектр растений – носителей и способен в короткие сроки распространяться в садовых насаждениях. Методы эффективной диагностики данного вируса имеют высокое значение для производства безвирусного посадочного материала. Представлены результаты апробации и оптимизации методики диагностики вируса шарки сливы с применением метода ПЦР с обратной транскрипцией, а также оценка его эффективности в сравнении с коммерческим набором. В качестве материала выступали различные ткани подвоев ПКСК 1, АИ 1, ВСЛ 1и Гизела 5, полученных в культуре апикальных меристем и растения сливы сорта Стенлей. Была оптимизирована концентрация в соотношении добавленных Oligo dT (Oligo(dT)15-primer) и Random (Random (dN)10–primer) праймеров (1:2), с целью увеличения выхода специфических фрагментов вирусной кДНК. Праймерная пара контроля амплификации подобрана к участку гена, кодирующего малую субъединицу рибулоза 1,5 – бисфосфат карбоксилазы/ оксигеназы. Для сравнительной оценки использовали пробы кДНК растений, полученных в культуре апикальных меристем in vitro и пробы симптомированных растений. После получения препарата тотальной РНК проводили обратную транскрипцию и амплификацию полученной кДНК с последующим анализом продуктов на агарозном геле. В образцах не наблюдались продукты неспецифической амплификации и одноцепочечной ДНК. Продукты амплификации положительного контроля наблюдались во всех исследованных образцах. Исследованный метод показал высокую эффективность в сравнении с контрольным.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation