AGRIS - 

2022

Likhovskoj, V.V. | Zlenko, V.A. | Khvatkov, P.A. | Maletich, G.K. | Spotar', G.Yu. | Lushchaj, Е.А. | Klimenko, V.P.

Вследствие большой гетерогенности сортов винограда методики регенерации растений из проэмбриогенного каллуса путем соматического эмбриогенеза разработаны для незначительного количества генотипов. В результате исследований с применением культур колхицинированных проэмбриогенных клеточных суспензий и соматических глобулярных эмбриоидов гибридной формы Е-342 в вариантах жидких сред разработана универсальная методология развития глобулярных, сердцевидных и торпедовидных эмбриоидов у различных генотипов винограда. Методология позволяет эффективно улучшать протоколы эмбриогенеза и индукции полиплоидии. Универсальность разработанной методологии индукции полиплоидии и соматического эмбриогенеза у винограда обеспечивается снижением концентрации неорганического азота и витаминов в средах NN и PG в 4 раза и добавлением органического азота и других биологических активных веществ на этапах развития проэмбриогенного каллуса, колхицинирования и развития соматических эмбриоидов в жидких средах. Изучены и освоены методы косвенного анализа плоидности по свойствам эпидермиса листьев винограда. По комплексу 4 признаков предварительно выделено 9 перспективных сомаклонов. Только способ трансформации, предполагающий получение из листового экспланта эмбриогенного каллуса, пассаж его в жидкую культуру с получением жидкой эмбриокультуры и трансформацию этой культуры позволяет получить полноценные трансгенные растения винограда. Трансформации подвергнуто 300 листовых эксплантов сорта Ливия и 1 100 глобулярных эмбриоидов сорта Подарок Магарача. В результате экспериментов отселектированы 3 каллусных канамицинустойчивых линий сорта Ливия и 6 линий трансгенных растений сорта Подарок Магарача. По результатам генотипирования по 9 ядерным микросателлитным локусам идентифицированы 7 неизвестных форм с бессемянным фенотипом. При помощи маркеров бессемянности MAS-селекции VMC7f2 и p3_VvAGL11 в популяции гибридных сеянцев выявлены гибриды, имеющие аллели, сцепленные с признаком бессемянности. | Due to the high heterogeneity of grape varieties, techniques for regenerating plants from pro-embryogenic callus by somatic embryogenesis have been developed only for a small number of genotypes. As a result of studies using cultures of colchicinated proembryogenic cell suspensions and somatic globular embryoids of hybrid form E-342 in liquid media variants, a universal methodology for the development of globular, heart-shaped and torpedo-shaped embryoids in various genotypes of grapes has been developed. The methodology makes it possible to effectively improve the protocols of embryogenesis and polyploidy induction. The universality of the developed methodology for the induction of polyploidy and somatic embryogenesis in grapes is ensured by a 4-fold decrease in the concentration of inorganic nitrogen and vitamins in NN and PG media and the addition of organic nitrogen and other biologically active substances at the stages of development of pro-embryogenic callus, colchicination and development of somatic embryoids in liquid media. The methods of indirect ploidy determination by the properties of the grape leaf epidermis were studied and implemented. 9 promising somaclones were preliminary selected based on a set of 4 features. Only the method of transformation, involving the production of embryogenic callus from a leaf explant, its passage into a liquid culture with the production of liquid embryoculture and the transformation of this culture allows obtaining full-fledged transgenic grape plants. 300 leaf explants of the 'Livia' variety and 1100 globular embryoids of the 'Podarok Magaracha' variety were transformed. As a result of experiments, 3 callus kanamycin resistant lines of the Livia variety and 6 lines of transgenic plants of the Podarok Magaracha variety were selected. Following genotyping based on 9 nuclear microsatellite loci, 7 unknown forms with a seedless phenotype were identified. Using MAS-selection seedlessness markers VMC7f2 and p3_VvAGL11, hybrids bearing alleles linked to the seedlessness trait were identified in a population of hybrid seedlings.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

2022

Dolgov, S.V. | Mikhajlov, R.V. | Serova, T.А. | Shul'ga, O.A. | Firsov, A.P.

Plum pox virus (PPV), the causative agent of plum Sharka disease, is considered the most dangerous pathogen of apricots, plums and peaches. The transformation of plum with viral genes, such as viral coat protein, can provide novel virus resistant forms or gene resources for breeding new resistant varieties. For improving the plants resistance to plum pox virus (PPV) 2 technologies were used. One based on co-suppression and another on RNA-silencing (RNAi). Binary vector pCamPPVcp that contained the selective hpt gene and ppv-cp gene of the Sharka disease virus coat in sense-orientation (manipulated by double 35S promoter) was used for realization of post-transcriptional gene silencing. Vector pCamPPVRNAi contained self-complementary fragments of gene ppv-cp (698bp) manipulated by double 35S promoter and the hpt and gus genes. The fragments of ppv-cp gene were separated by pdk-intron to produce a "hairpin" RNA structure in antisense-sense orientation. 7n independent transgenic lines with ppv-cp gene and 5 transgenic lines with a 2 inverted repeats of ppv-cp gene fragment were produced. Stable integration of genes into genome of plants was confirmed by PCR analyses. The accumulation of coat protein was evaluated by Western blot assay in 5 from 6 analyzed lines. The transgenic shoots were rooted and acclimatized to the greenhouse. After grafting by PPV infected buds in all control and ppv-cp transformed plants strips corresponding to the PPV coat protein were detected by Western blot analysis, whereas no any spots corresponding to the PPV coat protein were observed in samples from plants transformed by the "hairpin" construct. These preliminary results confirmed the efficiency of the RNAi strategy for plant protection from virus attack in general, and stone fruits from PPV in particular. | Наиболее опасным патогеном абрикосов, слив и персиков считается вирус оспы сливы (PPV), возбудитель болезни шарки сливы. Трансформация сливы вирусными генами, такими как белок оболочки, может обеспечить получение устойчивых к вирусам сортов и исходных форм для использования в селекционном процессе. Для повышения устойчивости растений к вирусу шарки сливы (PPV) использовали 2 технологии. Одна основана на совместном подавлении, а другая – на РНК-сайленсинге (RNAi). Бинарный вектор pCamPPVcp, который содержал селективный ген hpt и ген белка оболочки вируса шарки сливы ppv-cp в смысловой ориентации (управляемый двойным промотором 35S), был использован для реализации посттранскрипционного сайленсинга гена. Вектор pCamPPVRNAi содержал самокомплементарные фрагменты гена ppv-cp (698 пар оснований), управляемые двойным промотором 35S и генами hpt и gus. Фрагменты гена ppv-cp были разделены pdk-интроном для получения структуры РНК "шпильки" в антисмысловой ориентации. Получены 7 независимых трансгенных линий с геном ppv-cp и 5 трансгенных линий с 2 инвертированными повторами фрагмента гена ppv-cp. Стабильная интеграция генов в геном растений подтверждена ПЦР-анализами. Накопление белка оболочки оценивали методом вестерн-блоттинга в 5 из 6 проанализированных линий. Трансгенные побеги были укоренены и акклиматизированы в теплице. После прививки инфицированными PPV почками у всех контрольных и трансформированных ppv-cp растений с помощью вестерн-блоттинга обнаруживались полосы, соответствующие белку оболочки PPV, тогда как в образцах от растений, трансформированных конструкцией "шпилька", не наблюдалось никаких пятен, соответствующих белку оболочки PPV. Эти предварительные результаты подтвердили эффективность стратегии RNAi для защиты растений от вирусной атаки в целом и плодов косточковых культур и от PPV, в частности.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

2022

Kulikov, I.M. | Burmenko, Yu.V. | Sidorova, T.N. | Pushin, A.S. | Miroshnichenko, D.N. | Dolgov, S.V.

The use of Prunus rootstocks that are resistant to plum pox virus (PPV) is an important agronomic strategy to control the Sharka disease spreading in nurseries and orchards. Despite remarkable progress in developing stone fruit rootstocks to adapt to various stresses, breeding that ensures durable virus resistance has not yet been achieved. For this reason, the engineering of PPV resistant plants through genetic transformation is a very promising approach to control sharka disease. The aim of the present study is to produce transgenic plants of the clonal rootstock 'Elita', which is resistant to PPV using ribonucleic acid interference (RNAi) technology. The genetic construct containing the self-complementary fragments of the Plum pox virus coat protein (PPV-CP) gene sequence were used to induce the mechanism of post-transcriptional gene silencing to ensure virus resistance. Transgenic plants have been produced after agrobacterium-mediated leaf transformation in vitro. The results of polymerase chain reaction (PCR) and Southern blotting analyses confirmed the stable genomic integration of the PPV-CP sense and antisense intronhairpin-RNA sequence. The functionality of the introduced expression cassette was confirmed by the activity of including the uidA gene into the transferring T-DNA. To our knowledge, this is the first interspecific plum rootstock produced by genetic engineering to achieve PPV resistance. The technique applied ensures absence of foreign DNA introducing in the plum genome. | Использование подвоев сливы, устойчивых к потивирусу шарки сливы (PPV), является важной стратегией борьбы с распространением заболевания в питомниках и садах. Несмотря на значительный прогресс в разработки подвоев косточковых плодовых культур для адаптации к различным стрессам, долговременная устойчивость к вирусам традиционными методами селекции до сих пор безуспешна. По этой причине создание устойчивых к PPV растений биоинженерными методами остается актуальной в противодействии распространению этого заболевания. Целью настоящего исследования является получение трансгенных растений клонового подвоя косточковых культур 'Элита', устойчивого к PPV, с использованием технологии интерференции рибонуклеиновых кислот (RNAi). Для индуцирования механизма посттранскрипционного замалчивания экспрессии генов, обеспечивающего устойчивость к вирусу, была использована генетическая конструкция, содержащая самокомплементарные фрагменты последовательности гена белка оболочки вируса шарки сливы (PPV-CP). Трансгенные растения были получены после опосредованной агробактериями трансформации листьев in vitro. Результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) и Саузерн-блоттинга подтвердили стабильную геномную интеграцию последовательности PPV-CP смысловой и антисмысловой интрон-РНК-шпильки последовательности. Функциональность введенной экспрессионной кассеты была подтверждена активностью включения гена uidA в переносящую Т-ДНК. Насколько нам известно, это первый межвидовой подвой сливы, полученный с помощью генной инженерии для достижения устойчивости к PPV вирусам, Примененная методика исключает введение чужеродных последовательностей в геном сливы.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

2022

Sidorova, T.N. | Miroshnichenko, D.N. | Kirov, I.V. | Pushin, A.S. | Dolgov, S.V.

У косточковых плодовых культур устойчивость к вирусу шарки сливы (PPV) может быть достигнута за счет специфической деградации вирусной РНК по механизму РНК-интерференции (RNAi). Исследование решает следующий вопрос: в какой степени сигналы сайленсинга малые интерферирующие РНК (siRNA) передаются из трансгенного подвоя в прививку коммерческого сорта и насколько это влияет на его устойчивость к PPV? Были изучены две комбинации, NT:GM и GM:NT (привой:подвой), с акцентом на первую комбинацию. Инокуляцию вирусом проводили либо на привое, либо на подвое. Форму клонового подвоя косточковых культур 'Элита' [(Prunus pumila L.xP. salicina Lindl.)x(P. cerasifera Ehrh.)] использовали как подвой для домашней сливы сорта Стартовая (Prunus domestica L.). Трансгенные формы подвоя и привоя экспрессировали конструкцию РНК-шпильки, генерирующую малые интерферирующие РНК (siRNA) комплементарные гену белка оболочки PPV (CP), и демонстрировали высокую вирусную устойчивость. Данные о последовательностях пулов малых РНК (sRNA) показали, что накопление специфичной для конструкции малой интерферирующей (siRNA) в трансгенном подвое сливы достигло более 2% от общего количества. Повышенный уровень siRNA обеспечивал устойчивость к PPV и блокировал перемещение вируса через GM-ткани к NT-партнеру при инокуляции трансгенных тканей. Сигнал мобильной siRNA не перемещался от GM-подвоя к целевой NT-ткани привоя до уровня, достаточного для запуска сайленсинга транскриптов PPV и обеспечения надежной вирусной устойчивости. Отсутствие подвижности молекул siRNA, полученных из трансгена, сопровождалось переносом различных эндогенных специфичных для подвоя siRNA в NT-привой, что указывает на исключительное нарушение транзитивности исследуемого сигнала РНК интерференции. Представленные данные показывают, что результаты трансплантация косточковых плодовых культур пока непредсказуемы, транспорт siRNA в комбинации подвой/привой требует дальнейшего изучения на молекулярном уровне. | In stone fruit trees, resistance to Plum pox virus (PPV) can be achieved through the specific degradation of viral RNA by the mechanism of RNA interference (RNAi). Transgenic virus-resistant plants, however, raise serious biosafety concerns. The present study was aimed at answering the following question: To what extent are molecular RNAi silencing signals transmitted across graft junctions in transgrafted plum trees and how much does it affect PPV resistance in genetically modified (GM)/non-transgenic (NT) counterparts? Two combinations, NT:GM and GM:NT (scion:rootstock), were studied, with an emphasis on the first transgrafting scenario. Viral inoculation was carried out on either the scion or the rootstock. The interspecific rootstock 'Elita' [(Prunus pumila L.x.P. salicina Lindl.)x(P. cerasifera Ehrh.)] was combined with cv. 'Startovaya' (Prunus domestica L.) as a scion. Transgenic plum lines of both cultivars were transformed with a PPV-coat protein (CP)-derived intron-separate hairpin-RNA construct and displayed substantial viral resistance. High-throughput sequence data of small RNA (sRNA) pools indicated that the accumulation of construct-specific small interfering RNA (siRNA) in transgenic plum rootstock reached over 2%. The elevated siRNA level enabled the resistance to PPV and blocked the movement of the virus through the GM tissues into the NT partner when the transgenic tissues were inoculated. At the same time, the mobile siRNA signal was not moved from the GM rootstock to the target NT tissue to a level sufficient to trigger silencing of PPV transcripts and provide reliable viral resistance. The lack of mobility of transgene derived siRNA molecules was accompanied by the transfer of various endogenous rootstock-specific siRNAs into the NT scion, indicating the exceptional transitivity failure of the studied RNAi signal. The data presented indicate that transgrafting in woody fruit trees remains unpredictable, it needs further in-depth examination to deliver molecular silencing signals.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation