AGRIS - 

2017

Zagorskaya, A.A. | Sidorchuk, Yu.V. | Dejneko, E.V., Russian Academy of Sciences. Siberian Branch, Novosibirsk (Russian Federation). Institute of Cytology and Genetics

Seven species of dicotyledonous plants selected for their higher ability to accumulate of total soluble protein in vegetative tissues were introduced into in vitro culture. To obtain an intensively growing loose callus, suitable for the preparation of a suspension culture, nutrient media compositions were optimized and the morphogenetic reactions of various types of explants were evaluated. After screening for the ability of callus formation of seven species of dicotyledonous plants, it was established that fast-growing suspension lines can be obtained for the cells of three plant species – Nicotiana tabacum, Daucus сarota, Amaranthus hypochondriacus, using the developed protocols of media and explant types. Based on the evaluation of the growth characteristics of the suspension cultures obtained from the calli of the three isolated plant species, it was established that all of them were characterized by high viability and intensive biomass increment. The cell density increased most quickly in the suspension culture of A. hypochondriacus. Using the reporter gfp-gene, the selected cell lines were evaluated for their ability to accumulate a recombinant protein. A direct correlation was observed between the accumulation of total soluble and recombinant proteins in the cells of the suspension culture. Cell cultures obtained on the basis of these plant species are of interest for biotechnology and will be used to create production lines for recombinant proteins, including medicinal products. | Введены в культуру in vitro семь видов двудольных растений, отобранных по повышенной способности к накоплению в вегетативных тканях общего растворимого белка. Для получения интенсивно растущего рыхлого каллуса, пригодного для получения суспензионной культуры, оптимизированы составы питательных сред и проведена оценка морфогенетических реакций различных типов эксплантов. При скрининге по способности к каллусообразованию семи видов двудольных растений установлено, что быстрорастущие суспензионные линии могут быть получены для клеток трех видов растений – Nicotiana tabacum, Daucus сarota, Amaranthus hypochondriacus с применением разработанных протоколов сред и типов эксплантов. На основании оценки ростовых характеристик суспензионных культур, полученных из каллусов трех выделенных видов растений, установлено, что все они характеризовались высокими показателями жизнеспособности и интенсивным приростом биомассы. Быстрее всего плотность клеток возрастала в суспензионной культуре A. hypochondriacus. С применением репортерного gfp-гена отобранные клеточные линии оценены по способности к накоплению рекомбинантного белка. Отмечена прямая корреляция между накоплением общего растворимого и рекомбинантного белков в клетках суспензионной культуры. Клеточные культуры, полученные на основе указанных трех видов растений, представляют интерес для биотехнологии и будут использованы при создании линий-продуцентов рекомбинантных белков, в том числе и медицинского назначения.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

2016

Vetokh, A.N. | Volkova, N.A. | Mennibaeva, Eh.R. | Tomgorova, E.K. | Fomin, I.K. | Beloglazov, D.V. | Zinov'eva, N.A., The L.K. Ehrnst All-Russia Research and Development Inst. of Animal Husbandry, Moscow Region

The aim of the research was to study the influence of regulatory sequences in the composition of lentiviral vectors on development of chick embryos and efficiency of transgenesis. The studies were carried out on the chicken embryo of Shaver Braun cross (n = 519) in 2015-2016. pWpxl lentiviral vector was used in the study. Eight lentiviral vectors were obtained on its base, containing the reporter gene eGFP (green fluorescent protein) under the control of constitutive (pWCAG and pWRSV vectors) and tissue-specific (pW2.8, pW1.2, pWS1, pWS2, pWM1 and pWM2 vectors) regulatory elements. Viral preparation was injected into chicken embryos at the 24th and 60th hours of incubation. Dynamics of embryo development and efficiency of poultry obtaining were studied depending on introduction method for lentiviral vectors and regulatory sequences in their composition. The expression of the recombinant protein in the embryonic cells was determined at the sixth day of incubation using flow cytofluorometry. A relatively high percentage of embryonic cells that expressed recombinant protein eGFP were established at the transfection of embryonic cells at the 24th hour of incubation – 34.3%, which was higher by 4.3% compared with the administration of lentiviral vectors in the dorsal aorta of embryos at the 60th hours of incubation. The least effect on the embryogenesis was observed using lentiviral vectors with regulatory elements that provide tissue specific expression of recombinant genes. The percentage of embryos that developed, when lentiviral vectors with a constitutive expression of the structural gene was used, was lower on average (62.1% vs 68.4%). | Изучали влияние регуляторных последовательностей в составе лентивирусных векторов (ЛВ) на развитие эмбрионов кур и результативность трансгенеза. Исследования проводили в 2015-2016 гг. на эмбрионах кур кросса Шейвер Браун (n=519). Использовали ЛВ pWpxl, на основе которого получили 8 ЛВ, содержащих репортерный ген eGFP (зелёный флюоресцирующий белок) под контролем конститутивных (векторы pWCAG и pWRSV) и тканеспецифичных (векторы pW2.8, pW1.2, pWС1, pWС2, pWМ1 и pWМ2) регуляторных элементов. Вирусный препарат вводили в эмбрионы кур на 24 и 60 ч инкубации. Изучали динамику развития эмбрионов и результативность получения птицы в зависимости от способа введения ЛВ и используемых в их составе регуляторных последовательностей. Экспрессию рекомбинантного белка в эмбриональных клетках определяли на 6 день инкубации с использованием проточной цитофлуориметрии. Относительно высокая доля клеток эмбриона, экспрессирующих рекомбинантных белок eGFP, была установлена при трансфекции эмбриональных клеток на 24 ч инкубации – 34,3%, что на 4,3% выше, чем при введении ЛВ в дорсальную аорту эмбрионов на 60 ч инкубации. Наименьшее влияние на эмбриогенез выявлено при использовании ЛВ с регуляторными элементами, обеспечивающими тканеспецифическую экспрессию рекомбинантных генов. При использовании ЛВ с конститутивной экспрессией структурного гена доля развившихся эмбрионов была в среднем ниже (62,1% против 68,4%).

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

2012

Miroshnichenko, D.N., Russian Academy of Sciences, Moscow

While introducing gene-modified crops in agricultural practice a problem of vertical gene transfer from gene-modified to conventional varieties as a consequence of pollen application, intercross and transgenic hybrid seed production. The investigations by evaluating the frequency of vertical transfer were conducted for 2 years. As pollen donors the transgenic homozygous line of spring wheat variety Andros comprising heterological sequences of gene bar imparting resistance to phosphinotricin-based herbicides and green fluorescent protein gene gfp. The transgenic variety was sown inside a circle having a diameter of 1 m, and the non-transgenic analog – in the distance of 1, 2 and 3 m from the outside perimeter. The relationship of the transgenic transfer frequency and prevailing wind direction has been discovered. In the field sector located in this direction 81 and 84% of the total amount of detected transgenic seeds have been found. When removing non-transgenic plants from transgenic ones 1 m the transfer frequency was 0.134%, 2 m – 0.035%, 3 m – 0.002%. In general, the frequency of a transgenic vertical drift to seeds of non-transgenic plants in the field areas varied from 0.000 to 0.797%. The transgenic status of hybrid seeds was confirmed by the resistance to the applied herbicides, tissue fluorescence, and the presence of transgenic sequences in the plant genome (the data of PCR and reverse transcription PCR, as well as typical inheritance of transgenes in the following seed generation. | При внедрении генно-модифицированных культур в с.-х. практику может возникнуть проблема вертикального переноса генов от генно-модифицированных к обычным сортам вследствие переноса пыльцы, переопыления и образования семян, гибридных по трансгенам. Исследования по оценке частоты вертикального переноса проводились в течение 2 лет. В качестве доноров пыльцы использовали трансгенную гомозиготную линию яровой пшеницы сорта Андрос, которая содержит гетерологичные последовательности гена bar, придающего устойчивость к гербицидам на основе фосфинотрицина, и гена зеленого флуоресцентного белка gfp. Трансгенный сорт высевали внутри круга диаметром 1 м, а нетрансгенный аналог - на расстоянии 1, 2 и 3 м от внешнего периметра. Выявлена зависимость частоты переноса трансгенов от направления господствующих ветров. В секторе поля, расположенному по этому направлению, найдено 81 и 84% от общего количества обнаруженных трансгенных семян. При удалении нетрансгенных растений от трансгенных на 1 м частота переноса составила 0,134%, на 2 м – 0,035%, на 3 м – 0,002%. В целом же частота вертикального дрейфа трансгенов в семена нетрансгенных растений на полевых участках варьировала от 0,000 до 0,797%. Трансгенный статус гибридных семян был подтвержден устойчивостью к примененному гербициду, флуоресценцией тканей, наличием последовательности трансгенов в геноме растений (данные ПЦР и ПЦР с обратной транскрипцией), а также характерным наследованием трансгенов в следующем семенном поколении.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

2009

Mikhajlov, R.V., Russian Academy of Sciences, Moscow

The leaves from rooted shoots of plum cultivar Startovaya maintained in vitro were used as a source of plant matter. The influence of 2 antibiotics as selective agents on callus formation and adventitious shoot regeneration of explants has been investigated. The selective strength of kanamycin and hygromicin was estimated without explants inoculation by Agrobacterium. The optimal antibiotics concentrations were defined. It is 8 milli g/l for and 30 milli g/l for hygromicin. Various schemes for selection were compared. The delayed scheme (selection in 13 days after treatment) was most effective. Agrobacterium-mediated transformation of somatic tissues was performed, and transgenic plum cultivar containing selective marker genes nptII, hpt and reporter gene gfp were obtained. The efficiency of negative selection using kanamycin was about 0.5%. It is comparable to efficiency of postive selection on mannose. More effective system for delayed selection using hygromicin was worked out. It permit to increase the frequency of transformation up to 2.2%. The trancgenic plum varieties resistant to plum pox virus are under selection on base of this protocol.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

1994

Ehrnst, L.K.

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

1994

Rosokhatskij, S. | Smirnov, A.F. | Efimov, A.F. | Zverkhovskij, L. | Kazakov, V.K. | Dvoryanchikov, G.A. | Smaragdov, M.G.

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation