AGRIS - 

2021

Alexandrov, O.S. | Karlov, G.I., All-Russia Research and Development Inst. of Agricultural Biotechnology, Moscow

Клещевина - важная с.-х. культура, которую выращивают во многих странах мира и используют в основном для получения касторового масла. Цель исследования - изучение промоторов гена U6 клещевины с помощью биоинформационных и молекулярно-генетических подходов. В работе использовали растения клещевины (Ricinus communis L.) сортов Занзибар Грин и Гибзонская. ДНК выделяли из молодых листьев. Обработку последовательностей, выравнивание и определение степени гомологии проводили в программе GenDoc. Праймеры для амплификации промоторов гена U6 клещевины подбирали с помощью программы Primer3. ПЦР проводили на амплификаторе C-100 ('Bio-Rad Laboratories, Inc.', США). Продукты ПЦР разделяли в 1,5% агарозном геле при 6 В/см в камере для горизонтального электрофореза Sub-Cell GT ('Bio-Rad Laboratories, Inc.', США). Ампликоны очищали с помощью набора GeneJET PCR Purification Kit ('Thermo Fisher Scientific, Inc.', США). Очищенные ампликоны клонировали с помощью вектора pAL2-T ('Евроген', Россия). При конструировании CRISPR/Cas9 векторов использовали плазмиду pRGE31, эндонуклеазы рестрикции HindIII и SbfI ('Сибэнзим', Россия) и необходимые олигонуклеотиды. Был проведен биоинформационный поиск в базе генетических данных GenBank и обнаружено 12 скаффолдов, содержащих последовательность гена U6 клещевины. Шесть промоторов, включающих неповрежденные регуляторные элементы USE и ТАТА-бокс, были использованы при подборе праймеров для амплификации на матрице ДНК клещевины сортов Занзибар Грин и Гибзонская. Продукты ПЦР, состоящие из единичных фрагментов, были клонированы и секвенированы. Промоторные области полностью совпадали между сортами. Степень идентичности промоторов из разных ампликонов варьировала в пределах 51-77%. При сравнении этих же промоторов с промоторами гена U6 других растений степень гомологии составляла 42-64%. Последовательности промоторов, содержащие неповрежденные мотивы USE и ТАТА-бокс, были использованы для конструирования CRISPR/Cas9 векторов. | Castor bean is an important crop in many countries. It is mainly used to obtain the castor oil, which is widely applied in various industries. The research aim was to study castor bean gene U6 promoters with help by bioinformatics and molecular genetic approaches. Zanzibar Green and Gibzonskaya varieties of castor bean plants were used in this work. DNA was isolated from young leaves. The preparation of sequences, alignments and homology level calculation were carried out by GenDoc program. Primers for amplification of castor bean U6 promoters were designed by Primer3 program. PCR was performed using a C-100 PCR machine (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). PCR products were separated in 1.5% agarose gel at 6 B/cm in the Sub-Cell GT electrophoresis camera (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). The amplicons were purified with the GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA). The purified amplicons were cloned into the pAL2-T vector (Evrogen, Russia). In the CRISPR/Cas9 vector construction, the pRGE31, HindIII and SbfI restriction enzymes (Sibenzyme, Russia) and nucleotides were used. Purification of the digested products was carried out with the GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc., USA). Bioinformatic search were conducted in the GenBank base, and 12 scaffolds with the castor bean U6 gene were found. Six promoters with intact USE and TATA-box elements of regulation were used in the primer design for amplification with cv. Zanzibar Green and cv. Gibzonskaya DNA matrices. One fragment PCR products were cloned and sequenced. The analysis of the obtained amplicon sequences reveled that promoter regions of two studied varieties were similar. The level of promoter identity from different amplicons ranged within 51-77%. When comparing the same promoters with the U6 gene promoters of other plants the homology degree was 42-64%. The promoter sequences with intact USE and TATA-box motifs were used in construction of the CRISPR/Cas9 vectors.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

2013

Ivlev, A.A. | Tarakanov, I.G., Russian State Agrarian Univ., Moscow

Within a conceptional framework based on carbon metabolism oscillatory model diurnal variations of d13С values of water-soluble organic matter (WSOM), and water-insoluble organic matter (IOM) in leaves, stem and phloem sap of castor beans plants (Ricinus communis L.) are discussed. It is shown that carbon for the synthesis of the IOM fraction components is provided by carbohydrate pool formed in carboxylase phase of photosynthetic oscillations and is enriched with 12С due to carbon isotope effect in ribulose bisphosphate carboxylation. Carbon source for the synthesis of the WSOM fraction components is predominantly linked with carbohydrate pool formed in oxygenase phase of photosynthetic oscillations. They are enriched with 13С due to carbon isotope effect in glycine dehydrogenase reaction. As a result, IOM fraction is always more enriched in 12С in comparison with WSOM fraction. IOM fraction appears to be the main source of organic matter for the phloem sap. The organic substances of the sap are mainly used by plants to synthesize heterotrophic organ biomass thus determining the 13С enrichment of heterotrophic organs (roots, seeds, wood) of plants in relation to autotrophic (leaves, needles) ones. During the light period a part of low-molecular intermediates, synthesized in carboxylase phase of oscillations and characterized by "light" carbon isotope composition, gets into the water-soluble fraction of a leaf. They mix with other components of water-soluble fraction enriched with 13С, which results in the "lightening" of the total carbon of this fraction. The higher the photosynthetic rate, the larger the "lightening" degree. The peculiarities of diurnal variations of carbon isotope composition in water-soluble fraction affect the carbon isotope composition of phloem that forms due to emigration of a part of the water-soluble fraction from leaves. As a consequence, isotopic composition of organic matter in phloem sap is characterized by distinct diurnal variations. The variations of d13С values of WSOM and IOM fractions could be used for photosynthesis and assimilate transport and partitioning studies in the real time mode. | В рамках осцилляционной концепции фотосинтеза анализируется суточная динамика величин 13С углерода фракции водорастворимого органического вещества (ВОВ) и фракции водонерастворимого органического вещества (ВНОВ) листа клещевины, общего углерода стебля и органического вещества сока флоэмы (ОВСФ). Источником углерода для синтеза ВНОВ является углеводный фонд, возникший в карбоксилазной фазе фотосинтетических осцилляций и обогащенный изотопом 12С благодаря изотопному эффекту углерода в реакции карбоксилирования рибулозобисфофата. Преимущественным источником углерода для синтеза ВОВ является углеводный фонд, образовавшийся в оксигеназной фазе фотосинтетических осцилляций и обогащенный 13С благодаря изотопному эффекту глициндегидрогеназной реакции. В итоге фракция ВНОВ всегда обогащена изотопом 12С относительно фракции ВОВ. Фракция ВОВ является главным источником ОВСФ. Эти вещества используются растением для синтеза биомассы нефотосинтезирующих (гетеротрофных) органов. В этом главная причина наблюдаемой обогащенности гетеротрофных органов растений (корней, семян, древесины) изотопом 13С по сравнению с автотрофными (лист, хвоя). В световой период в водорастворимую фракцию листа попадает часть низкомолекулярных интермедиатов, синтез которых происходит в карбоксилазную фазу осцилляций, имеющих «легкий» изотопный состав углерода. Смешиваясь с другими компонентами ВОВ, обогащенными 13С, они вызывают "облегчение" общего углерода этой фракции, которая будет тем выше, чем выше интенсивность фотосинтеза. Особенности суточных изменений изотопного состава углерода ВОВ отражаются на изотопном составе углерода флоэмы, которая образуется за счет эмиграции части ВОВ листьев. В результате изотопный состав ОВСФ также испытывает отчетливые суточные колебания. Различия изотопного состава углерода фракции ВОВ и флоэмы могут быть использованы для изучения фотосинтеза и транспорта ассимилятов в режиме реального времени.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

1994

Dmitrieva, M.I. | Sobolev, A.M.

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation