GENETIC MODIFICATION OF ROOSTERS’ GERM CELLS USING VARIOUS METHODOLOGICAL APPROACHES | Генетическая модификация половых клеток петухов с использованием различных методических подходов

GENETIC MODIFICATION OF ROOSTERS’ GERM CELLS USING VARIOUS METHODOLOGICAL APPROACHES | Генетическая модификация половых клеток петухов с использованием различных методических подходов

2020

Vetokh, A.N. | Iolchiev, B.S. | Tomgorova, E.K. | Volkova, N.A.

Russian. Gonad germ cells of male farm birds are considered as promising target cells for introducing recombinant DNA. Our aim was to evaluate the effectiveness of the genetic transformation in roosters’ germ cells using various methodological approaches. The study was carried out with poultry of the Russian White breed. Primordial germ cells were isolated from 6-day-old embryos. The resulting culture of PGCs was transformed by electroporation using the Neon system. For transfection, the ZsGreen1-N1 plasmid with the ZsGreen gene under the CMV promoter was used. Transformed cells in the amount of 400, 700 and 1000 were introduced into the dorsal aorta of 2.5-day-old embryos. To transform spermatogenic cells in vivo, a viral preparation was used, which was injected directly into the testes of roosters by multiple injection. The introduction of the viral drugs was carried out once at the age of 3 or 4 months and twice at the age of 3 and 4 months. The viral preparation at a concentration of 1x10E7 CFU/ml was introduced at the rate of 0.5 ml per testis. The chicken embryonic cell culture obtained in the first stage of the experiment consisted of the several types of cells. The proportion of PGCs did not exceed 3%. The percentage of PGCs in the cell suspension increased to 81% after separating the different types of embryonic cells by adhesion. The cell culture transformation efficiency of PGCs was 12%. With the introduction of donor PGCs at a concentration of 400, 700 and 1000 cells per embryo, the percentage of chickens with transformed germ cells was 16%, 23% and 26%, respectively. With the twofold introduction of the viral drug into the testes at the age of 3 and 4 months, the highest transformation efficiency of spermatogenic testicular cells in vivo was established, which amounted to 10%. With a single injection of the viral drug, this indicator was 2 times lower. The efficiency of obtaining transgenic embryos is 6-10%./Половые клетки гонад самцов с.-х. птицы рассматриваются в качестве перспективных клеток-мишеней для введения рекомбинантной ДНК. Цель работы - оценка эффективности генетической трансформации половых клеток петухов с использованием различных методических подходов. Исследования выполняли на курах породы русская белая. Примордиальные зародышевые клетки (ПЗК) выделяли из 6-суточных эмбрионов. Трансформацию полученной культуры ПЗК осуществляли посредством электропорации с применением системы Neon (Thermo Fisher Scientific, США). Для трансфекции использовали плазмиду ZsGreen1-N1 (Addgene, США) с геном ZsGreen под CMV промотором. Трансформированные клетки в количестве 400, 700 и 1000 вводили в дорсальную аорту 2,5-суточных эмбрионов. Трансформацию сперматогенных клеток петухов in vivo осуществляли посредством введения лентивирусного вектора непосредственно в семенники однократно в возрасте 3 или 4 мес и двукратно - в 3 и 4 мес. Вирусный препарат в концентрации 1x10Е7 КОЕ/мл вводили из расчета 0,5 мл на семенник. Лентивирусный вектор содержал репортерный ген ZsGreen под CMV промотором. Культура эмбриональных клеток кур, полученная на первом этапе эксперимента, состояла из нескольких типов клеток. Доля ПЗК не превышала 3%. Посредством разделения разных типов эмбриональных клеток по адгезии удалось повысить количество ПЗК в клеточной суспензии до 81%. Эффективность трансформации клеточной культуры ПЗК составила 12%. При введении донорских ПЗК в концентрации 400, 700 и 1000 клеток на эмбрион доля цыплят с трансформированными половыми клетками составила соответственно 16, 23 и 26%. Наибольшая результативность трансформации сперматогенных клеток семенников in vivo была установлена при двукратном введении вирусного препарата в возрасте 3 и 4 мес - 10%. Результативность получения трансгенного потомства от особей с трансформированными половыми клетками составила 6-10%.

Show more [+]

Less [-]

Bibliographic information

sel'skokhozyaistvennaya Biologiya

Volume

55

Issue

2

ISSN

0131-6397