AGRIS - 

2016

Imatdinov, A.R. | Sereda, A.D. | Imatdinov, I.R. | Kazakova, A.S. | Dubrovskaya, O.A. | Kolbasov, D.V., All-Russia Research and Development Inst. of Veterinary Virology and Microbiology, Vladimir region

Control of African swine fever (ASF) is complicated by the lack of specific prevention medications. In view to develop a DNA vaccine against ASFV seroimmunotype 3 we have constructed a set of hybrid plasmids containing fragments of ASFV genes CP204L, E183L and EP402R from attenuated strain MK-200 (pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 and pCI-neo/ASFV/CD2v). To study expression of the antigenically active polypeptide products for recombinant proteins rp30, rp54 and rCD2v in the eukaryotic cells, we transfected human embryonic kidney cells HEK293T, which stably express the SV40 large T antigen, with recombinant plasmids pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 and pCI-neo/ASFV/CD2v. By immunoblotting, the polypeptides of the expressed recombinant proteins were identified in the HEK293T cell lysates and characterized for their molecular weights. Regarding size, some antigenically active recombinant polypeptides were as calculated, whereas the other ones apparently resulted from post translational modification. We identified a 21.6 kDa polypeptide after pCI-neo/ASFV/p30 transfection, a major (20.9 kDa) and a minor (36.3 kDa) polypeptides after pCI-neo/ASFV/p54 transfection, and, finally, major polypeptides of 39.8 kDa and 63.1 kDa, together with minor polypeptides of 28.8 kDa and 104.7 kDa when pCI-neo/ASFV/CD2v transfected. These genetic constructions will be helpful to investigate antigenic, immunogenic and protective properties of ASFV recombinant proteins rp30, rp54 and rCD2v. | Контроль за африканской чумой свиней (АЧС) осложняется отсутствием средств специфической профилактики. В представляемой работе впервые созданы гибридные плазмиды, пригодные для протеомных исследований и разработки ДНК-вакцины против вируса АЧС III сероиммунотипа. Исследование выполнено с целью получения ДНК-конструкций, содержащих фрагменты генов CP204L, E183L, EP402R вируса АЧС аттенуированного штамма МК-200, и идентификации в трансфицированных ими эукариотических клетках соответствующих антигенно активных продуктов трансляции рекомбинантных белков rp30, rp54, rCD2v. Рекомбинантными плазмидами pCI-neo/ASFV/p30, pCI-neo/ASFV/p54 и pCI-neo/ASFV/CD2v трансфицировали культуру человеческих эмбриональных клеток почек, трансформированных геном Т-антигена вируса SV40 (HEK293T). Методом иммуноблоттинга в лизатах трансфицированных клеток определены и охарактеризованы по молекулярной массе экспрессированные рекомбинантные полипептиды. Среди полученных антигенно активных полипептидов одни по размеру соответствовали теоретически рассчитанным, другие - продуктам посттрансляционной модификации рекомбинантных белков. В лизатах клеток HEK293T, трансфицированных pCI-neo/ASFV/p30, выявлен полипептид с молекулярной массой 21,6 кДа, в содержащих pCI-neo/ASFV/p54 - мажорный полипептид 20,9 кДа и минорный 36,3 кДа, в клетках с pCI-neo/ASFV/CD2v - мажорные полипептиды с молекулярной массой 39,8 и 63,1 кДа, а также минорные массой 28,8 и 104,7 кДа. Полученные модели позволят исследовать иммуногенные и протективные свойства созданных ДНК-конструкций.

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation

2016

Vetokh, A.N. | Volkova, N.A. | Mennibaeva, Eh.R. | Tomgorova, E.K. | Fomin, I.K. | Beloglazov, D.V. | Zinov'eva, N.A., The L.K. Ehrnst All-Russia Research and Development Inst. of Animal Husbandry, Moscow Region

The aim of the research was to study the influence of regulatory sequences in the composition of lentiviral vectors on development of chick embryos and efficiency of transgenesis. The studies were carried out on the chicken embryo of Shaver Braun cross (n = 519) in 2015-2016. pWpxl lentiviral vector was used in the study. Eight lentiviral vectors were obtained on its base, containing the reporter gene eGFP (green fluorescent protein) under the control of constitutive (pWCAG and pWRSV vectors) and tissue-specific (pW2.8, pW1.2, pWS1, pWS2, pWM1 and pWM2 vectors) regulatory elements. Viral preparation was injected into chicken embryos at the 24th and 60th hours of incubation. Dynamics of embryo development and efficiency of poultry obtaining were studied depending on introduction method for lentiviral vectors and regulatory sequences in their composition. The expression of the recombinant protein in the embryonic cells was determined at the sixth day of incubation using flow cytofluorometry. A relatively high percentage of embryonic cells that expressed recombinant protein eGFP were established at the transfection of embryonic cells at the 24th hour of incubation – 34.3%, which was higher by 4.3% compared with the administration of lentiviral vectors in the dorsal aorta of embryos at the 60th hours of incubation. The least effect on the embryogenesis was observed using lentiviral vectors with regulatory elements that provide tissue specific expression of recombinant genes. The percentage of embryos that developed, when lentiviral vectors with a constitutive expression of the structural gene was used, was lower on average (62.1% vs 68.4%). | Изучали влияние регуляторных последовательностей в составе лентивирусных векторов (ЛВ) на развитие эмбрионов кур и результативность трансгенеза. Исследования проводили в 2015-2016 гг. на эмбрионах кур кросса Шейвер Браун (n=519). Использовали ЛВ pWpxl, на основе которого получили 8 ЛВ, содержащих репортерный ген eGFP (зелёный флюоресцирующий белок) под контролем конститутивных (векторы pWCAG и pWRSV) и тканеспецифичных (векторы pW2.8, pW1.2, pWС1, pWС2, pWМ1 и pWМ2) регуляторных элементов. Вирусный препарат вводили в эмбрионы кур на 24 и 60 ч инкубации. Изучали динамику развития эмбрионов и результативность получения птицы в зависимости от способа введения ЛВ и используемых в их составе регуляторных последовательностей. Экспрессию рекомбинантного белка в эмбриональных клетках определяли на 6 день инкубации с использованием проточной цитофлуориметрии. Относительно высокая доля клеток эмбриона, экспрессирующих рекомбинантных белок eGFP, была установлена при трансфекции эмбриональных клеток на 24 ч инкубации – 34,3%, что на 4,3% выше, чем при введении ЛВ в дорсальную аорту эмбрионов на 60 ч инкубации. Наименьшее влияние на эмбриогенез выявлено при использовании ЛВ с регуляторными элементами, обеспечивающими тканеспецифическую экспрессию рекомбинантных генов. При использовании ЛВ с конститутивной экспрессией структурного гена доля развившихся эмбрионов была в среднем ниже (62,1% против 68,4%).

Show more [+]

Less [-]

Central Scientific Agricultural Library - Russian Federation