The study of factors affected the gene transfer efficiency in chicken embryonic cells by application of lentiviral vectors | Изучение условий эффективного введения трансгенов в эмбриональные клетки кур с использованием лентивирусной векторной системы

The study of factors affected the gene transfer efficiency in chicken embryonic cells by application of lentiviral vectors | Изучение условий эффективного введения трансгенов в эмбриональные клетки кур с использованием лентивирусной векторной системы

2015

Volkova, N.A. | Fomin, I.K. | Tomgorova, E.K. | Vetokh, A.N. | Mennibaeva, Eh.R., All-Russia Research and Development Inst. of Livestock Husbandry, Moscow Region

Russian. Получали лентивирусный вектор (ЛВ) и определяли оптимальные условия использования ЛВдля трансгенеза эмбрионов кур (ЭК). В состав векторной системы входили 3 плазмиды: psPAX2, содержащая гены gag-pol; pLPG, кодирующая поверхностный гликопротеин G вируса везикулярного стоматита (VVS-G), и pWPXL - самоинактивирующийся ЛВ, несущий ген eGFP под контролем промотора гена фактора элонгации 1 РНК-полимеразы II человека (hEF1альфа). Для получения рекомбинантного вируса и определения титров использовали линию клеток человека 293T. Введение вирусного препарата (ВП) в ЭК проводили через 20-24 ч (I гр.) и через 50-55 ч (II гр.) после начала инкубации. Эффективность трансформации и число интегрированных копий трансгена оценивали методом RT-PCR анализа ДНК, выделенной из ЭК на 7-е сут инкубации, на наличие eGFP. Максимальные титры ВП были получены при соотношении плазмид psPAX2, pLPG и pWCAG 1:1:3 и составили 2,4*107 КОЕ/мл до ультрацентрифугирования и 6,2*108 КОЕ/мл - после него. Изменение соотношения между компонентами векторной системы позволяет значительно увеличить титр получаемого ВП. Биологические титры ВП порядка 10E8 КОЕ/мл достаточны для инфицирования до 78% клеток на ранних этапах развития ЭК. Доля трансформированных клеток в I и II гр. составила 78,0 и 31,0% соответственно. Вероятно, на более ранних стадиях клетки ЭК инфицировались большим количеством вирусных частиц, чем объясняется разница в числе копий вектора в составе клеточного генома в I и II гр. Средняя эффективность переноса генов с помощью ЛВ составляла 30,0-34,3% и слабо варьировала при изменении времени введения после начала инкубации ЭК. Значит, только часть клеток ЭК доступна для инфицирования вирусом. Инфицирование ЭК ВП с одинаковыми титрами в разные сроки позволяет получать популяции эмбриональных клеток с разным числом копий вектора в составе генома клетки. Итак, эффективность переноса генов в ЭК с использованием ЛВ не зависит от стадии развития ЭК в течение первых 55 ч инкубации.

Show more [+]

Less [-]

English. Lentiviral vector (LV) was obtained and optimal LV using condition for chicken embryos (CE) transgenesis were determined. Vector system consisted of 3 plasmids: psPAX2, containing gag-pol genes; pLPG, coding surface glycoprotein G of vesicular stomatitis virus (VVC-G) and pWPXL, self-inactivated LV, carrying eGFP gene under control of promoter of human elongation factor 1 RNA-polymerase (hEF1alpha) gene. To produce recombinant virus and to determine virus titers human cell line 293T was used. Virus preparations (VP) injections into CE were performed after 20-24 hours (group 1) and after 50-55 hours (group 2) from starting incubation. Transgenesis efficiency and transgene integrated copies number was estimated by DNA analysis RT-PCR that was isolated from CE on day 7 of incubation for specific eGFP presence. VP maximal titers were produced in psPAX2, pLPG and pWCAG plasmids ratio equal to 1:1:3 and were 2.4*107 CFU/ml before ultracentrifugation and 6.2*108 CFU/ml after it. Changing ratios between vector system components allows significantly increasing produced VP titers. The biological titers of the VP of 108 CFU/ml are sufficient to infect up to 78% of cells at the earlier stages of CE development. Probably, at earlier embryogenesis the CE cells were infected with a more number of viral particles than the differenceof a number of the transgenevector copies integrated into cell genome in groups 1 and 2 is explained. The average efficiency of transgenesis by means of the LV was 30.0-34.3% and varied slightly with changing the introduction time after the CE incubation began. It means that only a part of CE cells is available for viral infection. Injection of CE with VP havinf identical titers at different terms allows producing the populations of embryonic cells with different number of vector copies within the cell genome. So the efficiency of CE thransgenesis using LV does not depend on the stage of its development for first 55 h of incubnation.

Show more [+]

Less [-]

Bibliographic information

Agricultural Biology. Animal Biology Section.

Issue

4

ISSN

0131-6397

Other Subjects

Animal transgenique; Federacion de rusia; Clonage moleculaire; Vecteur genetique; Celulas; Clonacion molecular; Vectores geneticos; Federation de russie; Transfeccion; Animales transgenicos