ประกาศกระทรวงเกษตรและสหกรณ์

เรื่อง กำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร :
การชันสูตรโรคแคมพิโลแบกเตอร์ในสัตว์ปีก
ตามพระราชบัญญัติมาตรฐานสินค้าเกษตร พ.ศ. ๒๕๕๑

ด้วยคณะกรรมการมาตรฐานสินค้าเกษตร เห็นสมควรกำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร
เรื่อง การชันสูตรโรคแคมพิโลแบกเตอร์ในสัตว์ปีก เป็นมาตรฐานทั่วไป ตามพระราชบัญญัติมาตรฐาน
สินค้าเกษตร พ.ศ. ๒๕๕๑ เพื่อส่งเสริมสินค้าเกษตรให้ได้คุณภาพ มาตรฐาน และปลอดภัย

อาศัยอำนาจตามความในมาตรา ๕ มาตรา ๑๕ และมาตรา ๑๖ แห่งพระราชบัญญัติ
มาตรฐานสินค้าเกษตร พ.ศ. ๒๕๕๑ ประกอบมติคณะกรรมการมาตรฐานสินค้าเกษตร ในการประชุม
ครั้งที่ ๒/๒๕๖๒ เมื่อวันที่ ๑๑ กันยายน ๒๕๖๒ รัฐมนตรีว่าการกระทรวงเกษตรและสหกรณ์
จึงออกประกาศกำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร : การชันสูตรโรคแคมพิโลแบกเตอร์ในสัตว์ปีก มาตรฐาน
เลขที่ มกษ. 10302-2562 ไว้เป็นมาตรฐานทั่วไป ดังมีรายละเอียดแนบท้ายประกาศนี้

ทั้งนี้ ให้ใช้บังคับตั้งแต่วันถัดจากวันประกาศในราชกิจจานุเบกษาเป็นต้นไป

ประกาศ ณ วันที่ ๓๑ พฤษภาคม พ.ศ. ๒๕๖๒
ประภัทร โพธสุธน
รัฐมนตรีช่วยว่าการกระทรวงเกษตรและสหกรณ์ ปฏิบัติราชการแทน
รัฐมนตรีว่าการกระทรวงเกษตรและสหกรณ์

# มาตรฐานสินค้าเกษตร
## การชันสูตรโรคแคมพิโลแบกเตอร์ในสัตว์ปีก
### 1. ขอบข่าย
- มาตรฐานสินค้าเกษตรนี้กำหนดการชันสูตรโรคแคมพิโลแบกเตอร์ในสัตว์ปีกทางห้องปฏิบัติการครอบคลุมทั้งหมดของกระบวนการผลิตสินค้าเกษตร โดยเฉพาะ แยกและจำแนกแบบที่เรียกว่า การทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมี และการตรวจยืนยันสารพันธุกรรมของเชื้อ

### 2. นิยาม
- ความหมายของคำว่า "มาตรฐานสินค้าเกษตร" มีดังต่อไปนี้

#### 2.1 โรคแคมพิโลแบกเตอร์ (Campylobacteriosis) หมายถึง โรคนี้มีสาเหตุจากการติดแคมพิโลแบกเตอร์ (Campylo bacter spp.) โดยสัตว์ปีกเป็นแหล่งรังโรคหลักของแคมพิโลแบกเตอร์
#### 2.2 สัตว์ปีก (poultry) หมายถึง สัตว์ในวงศ์ Phasianidae โดยในมาตรฐานฉบับนี้ครอบคลุมเฉพาะสัตว์ปีกที่เลี้ยงไว้เพื่อผลิตเนื้อหรือไข่ เช่น ไก่ เป็ด ห่าน นกกระทา
#### 2.3 การชันสูตรโรค (diagnosis) หมายถึง การตรวจสอบเพื่อหาสาเหตุหรือหลักฐานข้อเท็จจริงประกอบการวินิจฉัยโรค
#### 2.4 ตัวอย่างควบคุมผลบวก (positive control sample) หมายถึง ตัวอย่างที่มีเชื้อ หรือส่วนประกอบของเชื้อ ซึ่งเมื่อนำไปผ่านกระบวนการทดสอบตามขั้นตอนต่าง ๆ เช่นเดียวกับตัวอย่างที่ต้องการทดสอบแล้วให้ผลบวก
#### 2.5 ตัวอย่างควบคุมผลลบ (negative control sample) หมายถึง ตัวอย่างที่ไม่มีเชื้อ หรือส่วนประกอบของเชื้อ ซึ่งเมื่อนำไปผ่านกระบวนการทดสอบตามขั้นตอนต่าง ๆ เช่นเดียวกับตัวอย่างที่ต้องการทดสอบแล้วให้ผลลบ

# การกำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร: การชันสูตรโรคแคมพิโลแบกเตอร์ในสัตว์ปีก

## ข้อกำหนด
- การชันสูตรโรคแคมพิโลแบกเตอร์ในสัตว์ปีก ให้เป็นไปตามตารางที่ 1 สำหรับรายละเอียดของขั้นตอนการปฏิบัติของแต่ละวิธีอาจแตกต่างกันในห้องปฏิบัติการแต่ละแห่ง และต้องเป็นวิธีช้านสูตรที่ประกาศโดยองค์การสุขภาพสัตว์โลก (World Organisation for Animal Health; OIE) หรือเผยแพร่ในวารสารทางวิชาการซึ่งเป็นที่ยอมรับระดับระหว่างประเทศ หรือมีการประเมินความเชื่อมั่นได้ (validation) เลย มีความจำเป็น (sensitivity) และความจำเพาะ (specificity) ในระดับที่ยอมรับได้

### ตารางที่ 1 รายการข้อกำหนดการชันสูตรโรคแคมพิโลแบกเตอร์ในสัตว์ปีก
| รายการ | ข้อกำหนด |
| --- | --- |
| **1. ตัวอย่างเพื่อการชันสูตร** | ตรวจสอบและบันทึกข้อมูลของการเก็บตัวอย่าง และรายละเอียดตัวอย่างที่ได้รับ |
| | 1.1 ตัวอย่างที่ใช้ในการชันสูตรโรคแคมพิโลแบกเตอร์ในสัตว์ปีก |
| | 1.1.1 ตัวอย่างจากฟาร์มสัตว์ปีก |
| | 1.) มูลจากทวารร่วมที่ได้จากการสว็อบ (cloacal swab) |
| | 2.) สิ่งปลูกเปื้อนจากวัสดุรองพื้นที่ได้จากบูตสว็อบ (boot-swab) |
| | 1.1.2 ตัวอย่างจากโรงฆ่าสัตว์ปีก |
| | 1.) กากอาหารในลำไส้ส่วนใส่เนื้อ (caecal content) |
| | 2.) หนังส่วนคอและอก (neck/breast skin) |
| | 3.) น้ำล้างซาก (carcass rinse) |
| | 1.2 การเก็บตัวอย่างต้องป้องกันการปนเปื้อนเชื้อจุลินทรีย์จากสิ่งแวดล้อม |
| | 1.3 เก็บรักษาตัวอย่างที่อุณหภูมิ 2 °C ถึง 8 °C นำตัวอย่างกล่องห้องปฏิบัติการภายใน 24 ชั่วโมง หากไม่สามารถส่งตัวอย่างในวันที่เก็บตัวอย่างได้ จะนำส่งห้องปฏิบัติการภายในวันถัดไป |
| **2. การเผาแยกและ** | **2.1 การเผาแยกเชื้อจากตัวอย่างโดยตรงบนอาหารเลี้ยงเชื้อ (direct plating)** |
| | **1**) มาทำอย่างที่ได้จากการป้อนมูลจากทวารร่วมหรือเสียงเป็นเสียงจากวัสดุรองพื้นหรือหากอาหารในลำไส้มีเนื้อมาเผาลงในจานแล้วเชื่อที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อชนิด modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate agar (mCCDA) |

# การกำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร: การชันสูตรโรคแคมพิโลแบกเตอร์ในสัตว์ปีก

## ข้อกำหนด
- นำอาหารเลี้ยงเชื้อไปปั่นที่อุณหภูมิ 41.5 °C ในสภาพอากาศเจนต่ำ (5% O₂, 10% CO₂ และ 85% N₂) เป็นเวลา 40 ชั่วโมง ถึง 48 ชั่วโมง

2.2 การเพาะแยกเชื้อจากตัวอย่างในจานเลี้ยงเชื้อที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยเพิ่มจำนวนแบคทีเรียใน selective enrichment media ก่อน

1) นำตัวอย่างที่ได้จากหนังส่วนคอและอก หรือตัวอย่างเนื้อล้างซาก มาเพาะลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Preston broth

2) นำอาหารเลี้ยงเชื้อไปปั่นที่อุณหภูมิ 41.5 °C ในสภาพอากาศเจนต่ำ (5% O₂, 10% CO₂ และ 85% N₂) เป็นเวลา 22 ชั่วโมง ถึง 26 ชั่วโมง

3) นำตัวอย่างในอาหารเลี้ยงเชื้อ Preston broth มาเพาะลงในจานเลี้ยงเชื้อที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อนิด mCCDA

4) นำอาหารเลี้ยงเชื้อไปปั่นที่อุณหภูมิ 41.5 °C ในสภาพอากาศเจนต่ำ (5% O₂, 10% CO₂ และ 85% N₂) เป็นเวลา 40 ชั่วโมง ถึง 48 ชั่วโมง

2.3 การเพาะแยกเชื้อจากตัวอย่างในจานเลี้ยงเชื้อที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยให้เชื้อเคลื่อนที่ผ่านแผ่นกรอง (passive filtration) ก่อน

1) นำตัวอย่างที่ได้จากการป้ายฉลากทวารร่วม หรือตัวอย่างส่งบนเป็น จากวัสดุรองพื้นหรือภาชนะอาหารในลำไส้ส่วนใส่ต้นมาผสมกับ PBS ในอัตราส่วนตัวอย่าง 1 ส่วนต่อ PBS 9 ส่วน

2) เด็ดสารละลายปริมาตรประมาณ 100 ml หยดลงบนแผ่นกรองขนาด 0.45 µm orizoransdiameter μm that will remove solid particles.

3) Take the remaining liquid from step and put it on a shaker at room temperature (37°C) for about one hour to remove any solid impurities.

4) After removing the supernatant, add it back into the original container and mix well.

2.4 เจาะแน่นของเชื้อแค็คเทลอโดยการฉีดจากลักษณะรูปร่างโคโลนีของแค็คเทลอร์บนอาหารเลี้ยงเช้อนิด mCCDA จะพบโคโลนีเสียหายท้องเงาโลก (metallic sheen) จากบริเวณและแบบ

# การทดสอบคุณสมบัติต่างๆของเชื้อ

## ข้อกำหนด
- **3. การทดสอบคุณสมบัติตทางชีวเคมี**
  - 3.1 นำโคโลนีบริสุทธิ์ (pure colony) ของแบคทีเรียที่สงสัยมาทดสอบ
  - 3.2 ทดสอบคุณสมบัติตทางชีวเคมีดังนี้
    - 3.2.1 ทดสอบออกซิดาเซน (oxidase test) เชื้อแค็ปิโลแบคเทอร์จะให้ผลบวก
    - 3.2.2 ทดสอบคาตาล่าเซน (catalase test) เชื้อแค็ปิโลแบคเทอร์จะให้ผลบวก
    - 3.2.3 ทดสอบฮิปฟูเรตไฮโดรไลซิส (hippurate hydrolysis test) เชื้อ *C. jejuni* จะให้ผลบวก ทั้งนี้บางสายพันธุ์ (strain) อาจให้ผลลบ และเชื้อ *C. coli* ให้ผลลบ

- **4. การตรวจยืนยันสารพันธุกรรมของเชื้อ**
  - 4.1 วิธี multiplex PCR มีขั้นตอนดังนี้
    - 1) นำโคโลนีบริสุทธิ์ (pure colony) ของแบคทีเรียที่สงสัยว่าเป็นแค็ปิโลแบคเทอร์ มาเพาะลงบน non-selective blood agar
    - 2) สกัดเอ็นเอของแบคทีเรีย
    - 3) เพิ่มจำนวนดีเอ็นเอเข้าหมายแบบทวีคูณโดยใช้ไพรเมอร์จำเพราให้มีจำนวนมากพอที่จะตรวจพบได้
    - 4) อ่านและแปลผลดีเอ็นเอด้วยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซิส (electrophoresis)