ประกาศกระทรวงเกษตรและสหกรณ์

เรื่อง กำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร : การชันสูตรโรคบรูเซลลา
ตามพระราชบัญญัติมาตรฐานสินค้าเกษตร พ.ศ. ๒๕๕๑

ด้วยคณะกรรมการมาตรฐานสินค้าเกษตร เห็นสมควรกำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร
เรื่อง การชันสูตรโรคบรูเซลลา เป็นมาตรฐานทั่วไป ตามพระราชบัญญัติมาตรฐานสินค้าเกษตร
พ.ศ. ๒๕๕๑ เพื่อส่งเสริมสินค้าเกษตรให้ได้คุณภาพ มาตรฐาน และปลอดภัย

อาชีพอำนาจตามความในมาตรา ๕ มาตรา ๑๕ และมาตรา ๑๖ แห่งพระราชบัญญัติ
มาตรฐานสินค้าเกษตร พ.ศ. ๒๕๕๑ ประกอบมติคณะกรรมการมาตรฐานสินค้าเกษตร ในการประชุม
ครั้งที่ ๔/๒๕๖๑ เมื่อวันที่ ๒๕ กันยายน ๒๕๖๑ รัฐมนตรีว่าการกระทรวงเกษตรและสหกรณ์
จึงออกประกาศกำหนดมาตรฐานสินค้าเกษตร : การชันสูตรโรคบรูเซลลา มาตรฐานเลขที่
มกษ. 10402-2561 ไว้เป็นมาตรฐานทั่วไป ดังมีรายละเอียดแนบท้ายประกาศนี้

ทั้งนี้ ให้ใช้บังคับตั้งแต่วันถัดจากวันประกาศในราชกิจจานุเบกษาเป็นต้นไป

ประกาศ ณ วันที่ ๑๙ ตุลาคม พ.ศ. ๒๕๖๑

ลักษณ์ วงนานวัช
รัฐมนตรีช่วยว่าการกระทรวงเกษตรและสหกรณ์ ปฏิบัติราชการแทน
รัฐมนตรีว่าการกระทรวงเกษตรและสหกรณ์

# มาตรฐานสินค้าเกษตร
## การชันสูตรโรคบรูเซลลา
### 1. ขอบข่าย
- มาตรฐานสินค้าเกษตรนี้กำหนดการชันสูตรโรคบรูเซลลาในโค กระบือ แพะ แกะ และสุกร ครอบคลุมตั้งแต่ตัวอย่างเพื่อการชันสูตร การตรวจโรคร้อน การเผาแยกและตรวจจำแนกเชื้อแบคทีเรีย การตรวจหาสารพันธุกรรมและการตรวจสอบทางกฎหมายก็มี

### 2. นิยาม
- ความหมายของคำที่ใช้ในมาตรฐานสินค้าเกษตรนี้ มีดังต่อไปนี้

#### 2.1 โรคบรูเซลลา (Brucellosis)
- Brucellosis) เป็นโรคในสัตว์และคนที่มีสาเหตุจากการติดเชื้อแบคทีเรีย Brucella spp.
- เชิงในมาตรฐานนี้ครอบคลุมเชื้อ B. abortus, B. melitensis และ B. suis

#### 2.2 โคและกระบือ (cattle and buffalo)
- มายถึง สัตว์เคี้ยวเอื้องขนาดใหญ่ (large ruminant) ในวงศ์ Bovidae

#### 2.3 แพะและแกะ (goat and sheep)
- มายถึง สัตว์เคี้ยวเอื้องขนาดเล็ก (small ruminant) ในวงศ์ Bovidae
- พวงศ์ย่อย Caprinae

#### 2.4 สุกร (pig)
- มายถึง สัตว์ในวงศ์ Suidae

#### 2.5 การชันสูตรโรค (diagnosis)
- มายถึง การตรวจสอบเพื่อหาสาเหตุหรือหลักฐานข้อเท็จจริงประกอบการวินิจฉัยโรค

#### 2.6 ตัวอย่างควบคุมผลบวก (positive control sample)
- มายถึง ตัวอย่างที่มีเชื้อ ส่วนประกอบของเชื้อหรือแอนติบอดิต่อเชื้อ ซึ่งเมื่อนำไปผ่านกระบวนการทดสอบตามขั้นตอนต่าง ๆ เชนเดียวกับตัวอย่างที่ต้องการทดสอบแล้วให้ผลบวก

#### 2.7 ตัวอย่างควบคุมผลลบ (negative control sample)
- มายถึง ตัวอย่างที่ไม่มีเชื้อ ส่วนประกอบของเชื้อหรือแอนติบอดิต่อเชื้อ ซึ่งเมื่อนำไปผ่านกระบวนการทดสอบตามขั้นตอนต่าง ๆ เชนเดียวกับตัวอย่างที่ต้องการทดสอบแล้วให้ผลลบ

#### 2.8 รอยโรค (lesion)
- มายถึง พยาธิสภาพหรือลักษณะผิดปกติที่ปรากฏในเนื้อเยื่อหรืออวัยวะ

# 3. ข้อกำหนด

การชันสูตรโรคบรูเซลลา ให้เป็นไปตามตารางที่ 1 สำหรับรายละเอียดขั้นตอนการปฏิบัติของแต่ละวิธี
อาจแตกต่างกันในห้องปฏิบัติการแต่ละแห่ง และต้องเป็นวิธีชันสูตรที่ประกาศโดยองค์การโรคระบาดสัตว์
ระหว่างประเทศ (World Organisation for Animal Health; OIE) หรือเผยแพร่ในวารสารทางวิชาการ
ที่เป็นที่ยอมรับระหว่างประเทศ หรือมีการประเมินความเชื่อมั่น (validation) แล้วว่ามีความไว (sensitivity)
และความจำเป็น (specificity) ในระดับที่ยอมรับได้

## ตารางที่ 1 วิธีการชันสูตรโรคบรูเซลลา
<table>
<thead>
<tr>
<th>รายการ</th>
<th>วิธีการชันสูตร</th>
</tr>
</thead>
<tbody>
<tr>
<td>1. ตัวอย่างเพื่อการชันสูตร</td>
<td>ตรวจสอบและบันทึกข้อมูลของตัวอย่างที่ได้รับ ดังนี้
1.1 ตัวอย่างที่ใช้ในการชันสูตรโรคบรูเซลลา
1.1.1 โคและกระบือ ให้เก็บตัวอย่างอย่างใดอย่างหนึ่ง หรือหลายอย่างร่วมกัน
ดังต่อไปนี้
1) อวัยวะ เช่น ต่อมน้ำเหลือง ม้าม เตาหม มดลูก อัณฑะ
2) เยื่อหุ้มตัวอ่อน (fetal membranes)
3) สุกสัตว์ที่แท้ง หรือ ของเหลวในกระเพาะอาหาร ปอด ม้าม จากลูกสัตว์ที่แท้ง
4) สารคัดหลั่งจากช่องคลอด (vaginal discharge)
5) น้ำนม
6) ธัญพืช
7) น้ำเชื้อ
8) ของเหลวหรือนอกจากข้ออักเสบ
9) พลิตภัณฑ์จากน้ำนม
1.1.2 เพาะและแกะ ให้เก็บตัวอย่างตามข้อ 1.1.1
1.1.3 สุกร ให้เก็บตัวอย่างตามข้อ 1.1.1
1.2 การเก็บตัวอย่างต้องป้องกันการปนเปื้อนจากเชื้อจุลซีพยากสิ่งแวดล้อม
1.3 เก็บรักษาตัวอย่างที่อุณหภูมิ -4-10°C หากไม่สามารถส่งตัวอย่างภายในเวลาที่เก็บตัวอย่างได้ จะแช่แข็งตัวอย่างในน้ำแข็งแห้ง หรือตู้แช่ที่อุณหภูมิ -20°C หากเกินกว่าว่าแล้วนำส่งห้องปฏิบัติการในวันถัดไป</td>
</tr>
</tbody>
</table>

# วิธีการชันสูตร

## 2. การตรวจโรคร้อน
- **2.1** ตรวจสอบสภาพของสัตว์เพื่อดูโรคร้อน อย่างใดอย่างหนึ่ง หรือหลายอย่างร่วมกัน ดังต่อไปนี้

1) อัณฑะอักเสบ
2) มดลูกอักเสบ
3) ซ้ออักเสบ
4) ต่อมน้ำเหลืองบวมโต
5) เตาผมอักเสบ กรุณาที่สงสัยการติดเชื้อบรูเซลลาในแพะและแกะ และบ้านทึกผล เพื่อใช้ประกอบการยืนยันผลการชันสูตรโรค

- **2.2** ผู้ปฏิบัติการชันสูตรชาก ควรมัดระวังสุขอนามัยและใช้อุปกรณ์ป้องกัน การติดเชื้อบรูเซลลาที่เหมาะสมขณะปฏิบัติงาน

## 3. การตรวจหาและจำแนกเชื้อบรูเซลลา (agent identification)
- ด้วยวิธีการย้อมสี (staining methods)

- **3.1** นำตัวอย่างอวัยวะหรือตัวอย่างที่เป็นของเหลว เช่น รก สารคัดหลั่งจากช่องคลอด หรือของเหลวในกระเพาะอาหารของลูกสัตว์ที่แท้ง ป้ายบนแผ่นสลิด
- **3.2** ตรึงตัวอย่างด้วยความร้อน
- **3.3** ย้อมสีแผ่นสลิดด้วยวิธี Stamp's modification of the Ziehl–Neelsen’s method
- **3.4** ตรวจตัวอย่างด้วยกล้องจุลทรรศน์แสงสว่าง จะพบเชื้อบรูเซลลามีลักษณะเป็น coccobacilli หรือแท่งสั้น ๆ (short rods) อาจพบอยู่เป็นเซลล์เดียว หรือเซลล์คู่ หรือเป็นกลุ่ม และติดสีบนเย็น

## 4. การตรวจหาและจำแนกเชื้อบรูเซลลาด้วยวิธีการเพาะแยกเชื้อ (culture)
- **4.1** นำตัวอย่างไปเพาะบนอาหารเลี้ยงเชื้อจำเพาะชนิดแข็ง 2 เพลต และ/หรือ อาหารเลี้ยงเชื้อ selective biphasic 2 ขวด
- **4.2** สังเกตลักษณะโคโลนีบนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแข็ง ตั้งแต่ 4-10 วัน หากเชื้อเร็วก็จะมีลักษณะโคโลนีบนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดเหลว ในระหว่างเวลาที่กำหนด หากไม่มีลักษณะโคโลนีบนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดเหลวนำแล้วใส่เข้าเครื่องจักรสำหรับการทำโคโลนีใหม่ๆ (convex) มีเสียงฉาบประมาณจะทำให้มีโคโลนีขนาดใหญ่ขึ้นและมีเสียงฉาบประมาณ

| รายการ | วิธีการชันสูตร |
| --- | --- |
| 5. การตรวจหาและจำแนกเชื้อบรูเซลลาด้วยวิธีการตรวจระบุและจำแนกชนิดรวมทั้ง typing (identification and typing) | 5.1 การตรวจระบุและจำแนกเชื้อบรูเซลลาโดยการทดสอบร่วมกันหลายอย่าง เช่น ดูลักซณะโคโลนี การเจริญเติบโต ลักษณะของเชื้อหลังการย้อมสีแกรมหรือ Stamp’s staining การทดสอบทางชีวเคมี (urease และ oxidase tests) และการทดสอบ slide agglutination test กับ polyclonal anti-Brucella serum
5.2 การตรวจระบุและจำแนกชนิด (species) และ biovar ของเชื้อบรูเซลลาด้วยการทำ phage sensitivity หรือ phage lysis และการทดสอบ agglutination กับ anti-A, -M หรือ -R monospecific sera รวมทั้งการแสดงความต้องการ CO₂ ในการเจริญเติบโต การสร้าง H2S และการเจริญเติบโตบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีสี basic fuchsine และ thionin
5.3 การ typing ให้ส่งเชื้อบรูเซลลาชนิดเรียบไปยังห้องปฏิบัติการอ้างอิง เช่น สถาบันสุขภาพสัตว์แห่งชาติ กรุงปศุสัตว์ |
6. การตรวจหาและจำแนกเชื้อบรูเซลลาด้วยวิธี polymerase chain reaction (PCR) | 6.1 วิธี PCR มีขั้นตอนดังนี้
- สกัดดีเอ็นเอ
- เพิ่มจำนวนดีเอ็นเอเป้าหมายแบบทวีคูณโดยใช้ไพรเมอร์เฉพาะให้มีจำนวนมากพอที่จะตรวจพบได้
- เแยกแถบดีเอ็นเอด้วยวิธีอิเล็กโทรโฟเรซิส (electrophoresis)
- ตรวจหาลำดับสารพันธุกรรมเพื่อยืนยันความจำเป็นของแถบดีเอ็นเอ |
7. การตรวจหาและจำแนกเชื้อบรูเซลลาสายพันธุ์วัคซีน (identification of vaccine strains) | ใช้วิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์เฉพาะต่อเชื้อสายพันธุ์วัคซีน หรือดูการเจริญเติบโตหลังจากการเพาะแยกเชื้อ เพื่อแยกสายพันธุ์วัคซีน B. abortus S19, B. melitensis Rev.1 และ B. abortus RB51 |
8. การตรวจหาการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน (detection of immune response) ด้วยวิธี rose bengal test (RBT) | 8.1 วิธี RBT เป็น buffered Brucella antigen tests โดยมีหลักการของการทดสอบคือ อานติตับอดในตัวอย่างซึ่งรับจับกับแอนติเจนของเชื้อปรูเซลลาในภาวะที่เป็นกรด
8.2 นำตัวอย่างซึ่งรับมาผสมกับแอนติเจนของเชื้อปรูเซลลาที่ย้อมสี rose bengal ในอัตราส่วนที่เท่ากัน คนให้อาแก่นบนผล
8.3 อ่านผลจากปฏิกิริยาการเกกะกลุ่ม (agglutination) ที่ 4 min ซึ่งมีลักษณะคล้ายตะกอนเลือด/หยาบ หากสามารถมองเห็นได้ง่ายเด่นชัดแล้ว |

| รายการ | วิธีการชันสูตร |
| --- | --- |
| 9. การตรวจหาการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันด้วยวิธี fluorescence polarisation assay (FPA) | 9.1 FPA มีหลักการของการทดสอบ คือ การตรวจหาแอนติบอดีในตัวอย่างซีรัม โดยใช้อานติเจนของเชื้อบรูเซลลาที่เคลือบด้วยสารเรืองแสง (fluorescein isothiocyanate; FITC) และตรวจวัดระดับการเรืองแสงโดยใช้เครื่อง fluorescence polarisation analyser
8.2 นำตัวอย่างซีรัมมาเจือจางในระดับความเข้มข้นต่าง ๆ และอ่านค่าการกระจายของแสง (light scatter) ของตัวอย่างซีรัมด้วยเครื่อง fluorescence polarization analyzer ครั้งที่ 1
9.3 ผสมแอนติเจนของเชื้อบรูเซลลากับตัวอย่างซีรัม (จากข้อ 9.2) ทิ้งไว้ 2 min และอ่านค่าการกระจายของแสงของตัวอย่างซีรัมด้วยเครื่อง fluorescence polarization analyzer ครั้งที่ 2
9.4 เปลี่ยนผลจากการนำผลต่างระหว่างค่าการกระจายของแสง ครั้งที่ 2 และครั้งที่ 1 เปรียบเทียบกับค่า threshold level ที่ห้องปฏิบัติการได้ทดสอบความใช้งาน (validation)แล้ว
|
| 10. การตรวจหาการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันด้วยวิธี complement fixation test (CFT) | 10.1 CFT มีหลักการของการทดสอบ คือ การตรวจหาแอนติบอดีในตัวอย่างซีรัม โดยแอนติบอดีที่จำเป็นจะจับกับแอนติเจนของเชื้อบรูเซลลา เกิดเป็นแอนติบอดี-แอนติเจนเซ็ปซ่อน (antibody–antigen complex) และคอมพลีเมนต์ (complement) ที่เติมลงไปจะจับกับแอนติบอดี-แอนติเจนเซ็ปซ้อน ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นจะมองเห็นได้ด้วยการเติมเม็ดเลือดแดงที่ผ่านกระบวนการทำให้ไวต่อการกระตุ้น (sensitised red blood cell) ส่วนคอมพลีเมนต์ที่ไม่ได้ทำปฏิกิริยาจะจับกับเม็ดเลือดแดง หากไม่มีเม็ดเลือดแดงแตก ทำให้มีเม็ดเลือดแดงแตกมากขึ้น การแตกของเม็ดเลือดแดง(hemolysis) จะได้จากสื่อของฮโมโกลบินในของเหลวส่วนบนและตะกอนของเม็ดเลือดแดง เม็ดเลือดแดงเสียหายเป็นสัดส่วนกับระดับของแอนติบอดีที่จำเป็นในตัวอย่างซีรัม
10.2 อ่านผลการให้คะแนนตามรอยละของการแตกของเม็ดเลือดแดงในการทดสอบและเปลี่ยนคะแนนลงเป็นหน่วยของ international complement fixation test units per milliliter (ICFTU/ml)
|
| 11. การตรวจหาการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันด้วยวิธี indirect enzyme-linked immunosorbent assay (I-ELISA) | 11.1 I-ELISA มีหลักการของการทดสอบ คือ การตรวจหาแอนติบอดีในตัวอย่างซีรัมที่จับกับแอนติเจนของเชื้อบรูเซลลา S-LPS และบางชาระหว่างปฏิกิริยาโดยใส่ antoglobulin-enzyme conjugates
11.2 อ่านผลการฉุดกลืนแสงเครื่องอ่านผล ELISA reader |

## Table
| รายการ | วิธีการชันสูตร |
| --- | --- |
| 12. การตรวจหาการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันด้วยวิธี competitive enzyme-linked immunosorbent assay (C-ELISA) | 12.1 วิธี C-ELISA มีหลักการของการทดสอบ คือ การตรวจหาแอนติบอดีในตัวอย่างซีรัม โดยการที่แอนติบอดีกับแอนติบอดีโคลนเดียว (monoclonal antibody; MAb) ที่ติดฉลากด้วยเอ็นไซม์ แล้วจับกับแอนติเจนของเชื้อบรูเซลลา <br> 12.2 วัดค่าการดูดกลืนแสงด้วยเครื่องอ่านผลอีไลซา (ELISA reader) |
| 13. การตรวจหาการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันด้วยวิธี serum agglutination test (SAT) | 13.1 วิธี SAT มีหลักการของการทดสอบ คือ การตรวจหาแอนติบอดีในตัวอย่างซีรัมที่เกาะกลุ่มกันกับแอนติเจนของเชื้อบรูเซลลา และเกิดปฏิกิริยาการเกาะกลุ่ม <br> 13.2 นำตัวอย่างซีรัมมาผสมกับแอนติเจนของเชื้อบรูเซลลา โดยมีการเจือจางตัวอย่างซีรัมแบบอนุกรม คนให้เข้ากันในหลอดหรือเพลง <br> 13.3 อ่านผลจากปฏิกิริยาการเกาะกลุ่ม |
| 14. การตรวจหาการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันด้วยวิธี milk I-ELISA | วิธี milk I-ELISA มีหลักการเหมือนกับการทดสอบตัวอย่างซีรัมด้วยวิธี I-ELISA |
| 15. การตรวจหาการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันด้วยวิธี milk ring test (MRT) | 15.1 วิธี milk ring test ใช้ตรวจสอบในโคเนมและกระบือนมเท่านั้น และมีหลักการของการทดสอบ คือ การตรวจหาแอนติบอดีในตัวอย่างน้ำนม โดยใช้อแอมติเจนของเชื้อบรูเซลลาที่ย้อมสี haematoxylin แอนติบอดีที่จำเพาะในตัวอย่างน้ำนมจะจับกับแอนติเจนของเชื้อบรูเซลลา <br> 15.2 เตียมตัวอย่างน้ำนมในหลอด และเตียมอแอมติเจนของเชื้อบรูเซลลา ผมให้เข้ากัน <br> 15.3 อ่านผล โดยตัวอย่างที่ให้ผลบวกจะพบวงแหวนสีขาวในส่วนบนของน้ำนม |