Chromatografia

[thumb|300px|Znázornenie Cvetovho pokusu. '''1''' – extrakt rastlinných farbív v petroléteri; '''2''' – čistý petroléter; '''3''' – stacionárna fáza ([uhličitan vápenatý); **4** – sklená kolóna; **A**, **B**, **C** – zložky separovanej zmesi]]

**Chromatografia** je fyzikálno-chemická separačná metóda. Názov je odvodený z gréčtiny: *chroma* = farba, *graphein =* písať). Jej podstatou je rozdeľovanie zložiek zmesi medzi dvoma fázami: **stacionárnou fázou** (nepohyblivou) a **mobilnou fázou** (pohyblivou). Separácia zložiek zmesi je dôsledkom rozdielnej afinity jednotlivých zložiek ku týmto dvom fázam.Stacionárna fáza má schopnosť pútať na svojom povrchu (adsorbovať) delené látky rozpustené v mobilnej fáze rôznymi nekovalentnými interakciami (van der Waalsove sily, elektrostatické interakcie monopólov, dipólov a kvadrupólov, vodíkové väzby). Ak je vo vzorke nanášanej na kolónu viac látok (ide o homogénnu zmes látok, i.e. roztok), ktoré majú rôznu afinitu ku stacionárnej a mobilnej fáze, putujú jednotlivé látky zmesi **rozličnou rýchlosťou,** čím dochádza ku ich vzájomnému rozdeľovaniu. 
náhľad|359x359bod|Schéma kvapalinovej chromatografie (LC, ''liquid chromatography'') na chromatografickej kolóne naplnenej stacionárnou fázou. Vľavo: na povrch kolóny sa opatrne nanesie vzorka obsahujúca zmes látok (zmes krížikov a trojuholníkov) vo forme homogénnej zmesi (roztoku). Druhý vľavo: na kolónu sa privádza mobilná fáza (kvapalné rozpúšťadlo alebo zmes rozpúšťadiel), zmes látok sa začne pohybovať v kolóne v smere toku mobilnej fázy. Stredný obrázok: vplyvom absorpcie chemických látok (krížikov a trojuholníkov) na stacionárnu fázu, dochádza ku spomaľovaniu pohybu látky, ktorá má vyššiu afinitu ku stacionárnej fáze (krížiky). Látka s nižšou afinitou k stacionárnej fáze (trojuholníky) sa pohybuje v kolóne rýchlejšie a teda je nižšie – ďalej od štartu, kde bola nanesená). Druhý obrázok sprava: jednotlivé látky na kolóne sa od seba vzďaľujú, teda budú čistejšie. Obrázok napravo: Rýchlejšie pohybujúca sa látka (trojuholníky, látka s nižšou afinitou k stacionárnej fáze) vytiekla z kolóny do pripravenej banky/skúmavky. Ide o čistú látku rozpustenú v mobilnej fáze. Chromatografia postupuje ďalej (pridávaním ďalšieho elučného činidla (mobilnej fázy)), kým vytečie posledná látka (najpomalšie sa pohybujúca na kolóne: krížiky), ktorá bude zachytená do osobitnej banky/skúmavky. Po skončení chomatografie kolónu premývame polárnym rozpúšťadlom, u silikagélu najčastejšie metanolom, resp. destilovanou/deionizovanou vodou. Následne vykonáme prefúknutie kolóny vzduchom (''air purge'') na odtránenie kvapaliny z kolóny a použitú stacionárnu fázu (silikagél) vyhodíme do osobitnej nádoby na použitý silikagél. Získané roztoky separovaných látok (roztok trojuholníkov a roztok krížikov) analyzujeme pomocou TLC alebo NMR. Tieto roztoky následne destilujeme na rotačnej vákuovej odparke za zisku čistých pevných látok, ktoré presušíme na hlbokom vákuu cez noc (na vákuovej olejovej pumpe), nakoniec látky charakterizujeme pomocou NMR a HRMS.
Stacionárna a mobilná fáza sa od seba odlišujú niektorou základnými fyzikálno-chemickými vlastnosťami, napr. polaritou a skupenstvom, t. j. ku stacionárnej fáze v pevnom skupenstve (silikagél, alumina: oxid hlinitý, mikrokryštalická celulóza, amylóza) volíme kvapalnú mobilnú fázu (čisté rozpúšťadlo, resp. zmes dvoch alebo viacerých rozpúšťadiel). Z hľadiska polarity delíme stacionárne fázy na polárne stacionárne fázy (silikagél, i.e. hydratovaný oxid kremičitý, alumina, i.e. hydratovaný oxid hlinitý) a nepolárne stacionárne fázy (C18-silikagél).

Z hľadiska polarity delíme mobilné fázy na polárne mobilné fázy (typicky voda, metanol, etanol, acetonitril). Mobilné fázy používané v chromatografii sa členia podľa polarity pomocou makroskopickej veličiny: relatívnej permitivity a s ňou súvisiacou relatívnou dielektrickou konštantou *ε*r: *ε*r (voda) = 80; *ε*r (benzén) = 2,3. Rozpúšťadlá používané v chromatografii sa delenia podľa vzrastajúcej sily, ktorou vytesňujú organické látky zo stacionárnej fázy silikagélu (sila eluentu *ε*0)  do **[[Eluotropický rad|eluotropického radu]]** (mixotropný rad): pentán 3). Mobilnou fázou bol už spomenutý petroléter.

Cvet najprv zhotovil sklenú kolónu, ktorú naplnil adsorbentom. Na čelo tejto kolóny postupne privádzal extrakt farbív (vzorku) a súčasne privádzal aj čistý petroléter. Po určitom čase sa jednotlivé zložky v kolóne oddelili a ďalším premývaním boli postupne eluované (opúšťali kolónu). Cvet takto získal oddelené petroléterové roztoky všetkých farbív (eluáty), ktoré boli predtým v zmesi.

## Rozdelenie chromatografických techník
Chromatografické metódy sa dajú klasifikovať z rôznych hľadísk:

### Z hľadiska skupenstva fáz
* plynová chromatografia (GC, *gas chromatography*) pracuje v systéme plyn-pevná látka alebo plyn-kvapalina. 
* kvapalinová chromatografia (LC, *liquid chromatography*) pracuje v systéme kvapalina-kvapalina alebo kvapalina-pevná látka.

### Z hľadiska mechanizmu separácie
Delenie chromatografických metód podľa separačného mechanizmu je založené na charaktere interakcie delenej látky so stacionárnou fázou:
* adsorpčná chromatografia – látky sa delia na základe rôznej adsorpcie na stacionárnu fázu, ktorá závisí od zvolenej mobilnej a stacionárnej fázy. Adsorpcia látok je dôsledkom polárnch síl pôsobiacich medzi povrchom adsorbentu a separovanou látkou a polárnych síl, pôsobiacich medzi povrchom adsorbentu a mobilnou fázou. O jedno väzobné miesto na povrchu adsorbentu teda medzi sebou bojujú molekuly separovanej látky a molekuly rozpúšťadla (mobilnej fázy). Adsorpčná chromatografia sa používa v organickej chémii na získanie produktu chemickej reakcie z komplikovaných reakčných zmesí, ktoré obsahujú nezreagované reaktanty, činidlá, katalyzátory a vedľajšie produkty.
* rozdeľovacia chromatografia – je založená na rozdeľovaní látok v systéme dvoch vzájomne nemiešateľných kvapalín, z ktorých jedna kvapalina je zakotvená na inertnom pevnom nosiči (stacionárna kvapalná fáza) a druhá kvapalná fáza preteká (mobilná kvapalná fáza). Rôzne látky sa delia na základe ich rozdeľovacej konštanty K, ktorá je charakteristická pre každú látku a závisí od voľby kvapalných fáz. 
* ionexová chromatografia – (nazývaná tiež chromatografia na meničoch iónov) stacionárnu fázu tvorí ionex (menič iónov) s nabitými funkčnými skupinami. Analyt obsahuje látky nabité opačným nábojom.  Ak má stacionárna fáza záporne nabité funkčné skupiny (kyslé skupiny ako -SO3H, -CO2H), hovoríme o **katiónovom iónomeniči** (katexe), pretože vymieňa katióny. Ak má stacionárna fáza kladne nabité funkčné skupiny (bázické skupiny ako terciárne amíny -NR2 alebo kvartérne amóniové soli -NR3+, hovoríme o **aniónovom iónomeniči** (anexe), pretože vymieňa anióny.   Ionexová chromatografia sa používa v biochémii (nukleotidy, nukleoziddifosfáty, nukleozidtrifosfáty, oligonukleotidy) a organickej chémii na separáciu elektricky nabitých produktov (amóniové soli, organické kyseliny, organické soli) z komplikovaných reakčných zmesí, ktoré obsahujú nezreagované reaktanty, činidlá, katalyzátory a vedľajšie produkty. Na úvod ionexovej chromatografie je potrebné katex previezť do tzv. H+-formy, resp. anex do OH--formy. Následne naniesť vzorku na ionex a eluovať vodou, resp. vhodným pufrom. V priebehu chromatografie sa na ionexe zachytí žiadaný produkt elektrostatickými interakciami (katiónový produkt sa zachytáva na katexe, aniónový produkt sa zachytáva na anexe). Látky z reakčnej zmesi, ktoré nemajú charakter soli (nie sú tvorené katiónmi a aniónmi), pretečú kolónou bez zachytenia na stacionárnej fáze ionexu. Žiadaný produkt je následne nutné uvoľniť z ionexu. To sa realizuje premývaním ionexu: katex sa premýva zriedenou kyselinou chlorovodíkovou, čím sa uvoľní žiadaný organický katión (ktorý sa uvoľní vo forme chloridovej soli) z ionexu (ktorý prejde do H+-formy). Anex sa premýva tiež zriedenou kyselinou chlorovodíkovou, čím sa uvoľní žiadaný organický anión (ktorý sa uvoľní v protonizovanej forme: vo forme kyseliny) z ionexu (ktorý prejde do Cl--formy). Anex je vhodné skladovať v Cl--forme, v prípade potreby je možné previezť z Cl--formy do OH--formy  roztokom hydroxidu sodného. Anex nie je vhodné skladovať v OH--forme, pretože pri dlhodobom státí sa v tejto forme anex degraduje. Je nutné dávať pozor, aby ionex "nepodtiekol" – aby hladina mobilnej fázy nepoklesla po výšku ionexu v kolóne – v takomto prípade sa ionex zhehodnotí tým, že nabobtnný polymér popraská a zničia sa jednotlivé zrniečka ionexu. 
* gélová chromatografia – stacionárnu fázu tvorí pórovitý gél, používa sa v biochémii na separáciu proteínov pokrytých tenzidom SDS, nukleových kyselín naštiepených restrikčnými nukleázami.
* afinitná chromatografia – využíva látky vyskytujúce sa v prírode, na ktoré sa špecificky viažu určité molekuly, na stacionárnu fázu sú často naviazané protilátky a v mobilnej fáze sú rozpustené antigény.
* chirálna chromatografia – využíva chirálnu látku (jeden enantiomér, resp. diastereoizomér) ako stacionárnu fázu (napríklad amylózu), umožňuje od seba odseparovať enantioméry, resp. diastereoizoméry líšiace na jednom chirálnom centre (epiméry): v eluáte potom zachytávame a charakterizujeme (nepriamymi metódami ako cirkulárny dichroizmus) **rýchlo eluujúci epimér** (FEE: *fast eluting epimer -* má nižšiu afinitu ku stacionárnej fáze, vyjde z kolóny skôr, má nižší elučný objem) a **pomaly eluujúci epimér** (SEE: *slow eluting epimer -* má vyššiu afinitu ku stacionárnej fáze, vyjde z kolóny neskôr, má vyšší elučný objem). Ide o tak zvanú **chirálnu rezolúciu epimérov**, resp. **enantiomérov.**

### Z hľadiska usporiadania stacionárnej fázy
Delenie chromatografických metód podľa techniky vykonania samotnej chromatografie:
* chromatografia v plošnom usporiadaní: sorbent má podobu tenkej vrstvy, ktorý môže byť nanesený na inertnom nosiči:
** papierová chromatografia (PC, *paper chromatography) -* stacionárnu fázu tvorí chromatografický papier, mobilná fáza musí byť vodná, papierovou chromatografiou je možné deliť len látky rozpustné vo vode. Ak je potrebné deliť látky, ktoré sú hydrofóbne, prípadne čiastočne nerozpustné vo vode, je nutné chromatografický papier hydrofobizovať (chemicky acetyláciou papiera za vzniku acetylcelulózy, resp.hydrofobizácia pomocou impregnácie (rastlinnými alebo minerálnymi olejmi, silikónom, formamidom atď.).
** chromatografia na tenkej vrstve (TLC, *thin layer chromatography*) sorbent má podobu tenkej vrstvy, ktorý je nanesený (nalepený pomocou dextránu, sadrou) na inertnom nosiči: hliníková fólia, plast, sklo). Ako sorbent sa používa silikagel, alumina, mikrokryštalická celulóza (TLC s polárnou stacionárnou fázou), resp. C-18 silikagel (TLC s reverznou (nepolárnou) fázou).
*** Analytická chromatografia na tenkej vrstve (aTLC, *analytical thin layer chromatography*) – využíva sa na monitorovanie priebehu chemických reakcií, resp. monitorovanie priebehu kolónovej chromatografie, na určenie čistoty chemických látok (pred reakciou) Z veľkej komerčne dostupnej dosky ( x ) sa nožnicami (v prípade hliníkových fólii) odstrihne pásik s výškou 6 cm až 10 cm a šírkou v závislosti od počtu vzoriek. Na chromatografickú doštičku sa okrem vzorky vždy nanášajú aj štandardy (reaktant reakcie, všetky činidlá a aj rozpúšťadlo použité v reakcii/chromatografii). Na dolnú časť chromatografickej doštičky sa mäkkou ceruzkou (**B**) jemne nanesie línia (**štart**) vo výške presahujúcej hladinu mobilnej fázy (typicky výška štartu 1 cm, výška hladiny mobilnej fázy: 0,5 cm až 0,7 cm, nanesené škvrny na štarte nesmú byť utopené v mobilnej fáze). Vzorka a štandardy sa nanášajú sklenou kapilárou alebo plastovými špičkami používanými na automatických pipetách za vzniku malej kruhovej škvrny (priemeru maximálne 0,5 cm). Vzdialenosť jednotlivých škvŕn závisí od ich veľkosti, typicky 0,7 cm až 1 cm od seba. Podobnú vzdialenosť treba dodržať aj po krajov chromatografickej doštičky ku prvej a poslednej škvrne. Nanášanie bezfarebných vzoriek (škvŕn) sledujeme pod ultrafialovým svetlom. Pokiaľ nie je škvrnu pod UV vidieť (vzorka je málo koncentrovaná), škvrnu usušíme a nanášanie opakujeme na rovnaké miesto. Analytická chromatografia na tenkej vrstve sa realizuje vo vyvíjacích celách (vyvíjacích komôrkach, vyvíjačoch), resp. v kadičkách prikrytých Petriho miskami alebo hodinovými sklíčkami. Chromatografickú doštičku s nanesenými a usušenými škvrnami vložíme do vyvíjacej komôrky, ktorú vhodne prekryjeme, aby nedochádzalo ku odparovaniu rozpúšťadla mobilnej fázy. Sledujeme priebeh chromatografie (trvá len niekoľko desiatok sekúnd v závislosti od použitých rozpúšťadiel), vyvíjanie (priebeh chromatografie, vzlýnanie mobilnej fázy) ukončíme, keď je **čelo** 0,5 cm až 1 cm od hornej hrany chromatografickej doštičky; nikdy nenechávame vyvzlýnať čelo až na hornú hranu: nebolo by možné odčítať vzdialenosť škvřn od štartu, pretože by všetky vystúpili až na hornú hranu chromatografickej doštičky. V prípade takejto nehody je potrebné TLC opakovať. Po vyňatí doštičky z vyvíjacej komôrky označíme čelo (výšku, ktorú dosiahla mobilná fáza na doštičke), doštičku okamžite jemne usušíme horúcovzdušnou pištoľou, čím odparíme mobilnú fázu a zastavíme priebeh chromatografie. Na doštičke sa nachádza niekoľko typov škvŕn, pričom pri detekcii postupujeme v tomto poradí detekcie (vizualizácie) škvŕn:
***# farebné škvrny  – viditeľné bez potreby vizualizácie (zviditeľnenia) – tie látky, ktoré absorbujú elektromagnetické žiarenie vo viditeľnej časti elektromagnetického spektra – typicky organické látky so obsiahlym konjugovaným systémom dvojitých väzieb.
***# škvrny detegovateľné pomocou ultrafialového žiarenia – typicky organické látky obsahujúce aromatické systémy, chromatografickú doštičku vložíme pod UV lampu vyžarujúcu 365 nm svetlo, resp. 245 nm UV svetlo. Spozorujeme tmavé škvrny, kde sa nachádzajú organické látky, ktoré zhášajú fluorescenciu indikátora, ktorým je pokrytá stacionárna fáza, ale nedochádza ku jeho vymývaniu organickýcmi rozpúšťadlami (mobilnými fázami). 
***# škvrny detegovateľné chemickými činidlami: detekcia týchto látok je založená na schopnosti: 
***#* zuhoľnatenia organických látok: typicky sa používa roztok kyseliny sírovej, ktorý sa nastrieka na chromatografickú doštičku, zahreje sa horúcovzdušnou pištoľou a nachá sa pôsobiť do zuhoľnatenia organických látok na doštičke. Táto metóda sa nemôže použiť, ak je sorbentom celulóza, respektíve bol použitý dextrán na lepenie stacionárnej fázy (tiež by zuhoľnateli).
***#* oxidácie organických látok: používa sa manganistan draselný
***#* reakcie nukleofilov s aldehydmi: používa sa anisaldehyd
***#* reakcie aromátov s jódom: doštička sa vloží na niekoľko sekúnd do nádoby s jódom, pary jódu reagujú s chemickými látkami na chromatografickej doštičke za vzniku viditeľných škvŕn.
*** Preparatívna chromatografia na tenkej vrstve (pTLC) – využíva sa v prípade vykonania chemickej reakcie v malej škále (0,1 mmol – 0,25 mmol škála) na izoláciu reakčných produktov, je možné reakčnú zmes naniesť na dlhšiu stranu chromatografickej dosky (na štart), pričom môže byť potrebné použiť niekoľko takýchto celých komerčných dosiek ( x ). Reakčná zmes sa nanáša na štart opatrne, aby nedošlo ku poškodeniu vrstvy adsorbentu alebo vyliatiu väčšieho množstva reakčnej zmesi na jednom mieste na štarte. Počas nanášania reakčnej zmesi na štart, sušíme nanesenú vzorku horúcovzdušnou pištolou. Po nanesení vzorky, vyvíjame chromatografickú dosku v predbežne určenej mobilnej fáze. Po ukončení chromatografie, celú dosku osušíme horúcovzdušnou pištolou a stacionárnu fázu odškriabeme kopistkou zo skla (inertného nosiča) do lievika s fritou (a premývame stacionárnu fázu s naadsorbovanou látkou veľkým množstvom vhodného rozpúšťadla (dichlórmetánom, DCM). Filtrát zachytávame do odváženej guľatej destilačnej banky, filtrát destilujeme na rotačnej vákuovej odparke dosucha a získanú látku presušíme na hlbokom vákuu na olejovej pumpe.
* kolónová chromatografia (niekedy tiež stĺpcová) – je základná technika izolácie produktov organických reakcií zo zložitých reakčných zmesí, ktoré obsahujú nezreagované reaktanty, činidlá, katalyzátory a vedľajšie produkty. Na rozdiel od preparatívnej tenkovrstvovej chromatografie, je stĺpcová chromatografia určená na izoláciu produktov reakcií vo väčšej škále, typicky nad 0,25 mmol. Stĺpcová chromatografia sa uskutočňuje v kolónach (sklených/plastových), v ktorých je stacionárna fáza (silikagél, resp. nepolárny C18-silikagél). Na úvod je nutné vybrať vhodnú stacionárnu fázu. Stacionárna fáza prvej voľby je silikagél. Množstvo použitého silikagélu závisí od škály reakcie, pre jednoduché separácie platí, že stačí 30násobok hmotnosti súčtu hmotností reaktantov použitých v reakcii, t. j. 30 g silikagélu na 1 g reaktantov; pre náročnejšie separácie je možné použiť až 100násobok hmotnosti súčtu hmotností reaktantov použitých v reakcii, t. j. 100 g silikagélu na 1 g reaktantov. Výber mobilnej fázy závisí od optimalizácie, ktorú robíme pomcou TLC. Z predpripravených mobilných fáz zo zásobných fliaš (každé laboratórium by malo disponovať zásobnými predpripravenými mobilnými fázami určených na TLC a hľadanie optimálnej mobilnej fázy pre stĺpcovú chromatografiu). Predpripravené zásobné mobilné fázy by mali byť roztoky hexánu a etylacetátu v rôznych pomeroch 100/1 (hexán/etylacetát) až 1/1 (hexán/etylacetát), roztoky dichlórmetánu a metanolu v rôznych pomeroch 100/1 (dichlórmetán/metanol) až 1/1 (dichlórmetán/metanol). Úlohou optimalizácie (hľadania) mobilnej fázy je nájdenie takej mobilnej fázy, v ktorej má žiadaný produkt reakcie retenčný faktor *R*F = 0,3 a rozostup od ostatných chemických látok na TLC doštičke aspoň *R*F = 1. Vzorka (reakčná zmes, z ktorej bolo oddestilované rozpúšťadlo), sa môže nanášať na kolónu tzv. **mokrou cestou** (wet loading), čo je technika nanášania vzorky rozpustenej v rozpúšťadle, v ktorom je rozpustná. Druhou technikou je nanášanie vzorky na kolónu tzv. **suchou cestou** (dry loading), čo je technika, keď sa vzorka rozpustí v ľahko destilovateľnom rozpúšťadle (hexán/dichlórmetán/metanol) a do takto pripraveného roztoku sa nasype silikagél (5násobok súčtu hmotností reaktantov použitých v reakcii). Rozpúšťadlo sa opatrne oddestiluje na rotačnej vákuovej odparke a silikagél s naadsorbovanými látkami sa nasype na povrch kolóny. V prípade, že chromatografiu realizujeme s použitím mobilnej fázy s konštantným zložením (nemení sa zloženie mobilnej fázy), hovoríme o **izokratickej elúcii**. Izokratická elúcia znamená buď použitie jedného rozpúšťadla alebo použitie dvoch resp. viacerých rozpúšťadiel, ktorých objemový pomer sa počas chromatografie nemení. V prípade, že chromatografiu realizujeme s použitím mobilnej fázy s nekonštantným zložením (mení sa zloženie mobilnej fázy), hovoríme o **gradientovej** **elúcii**. Gradientová elúcia znamená, že na úvod chromatografie volíme menej polárnu mobilnú fázu (u silikagélu), napríklad zmes hexán/etylacetát v objemovom pomere (95/5) a následne sa zvyšuje objemový podiel viac polárneho rozpúšťadla (lineárne/kovexne/konkávne stúpa objemové zastúpenie polárnejšieho rozpúšťadla etylacetátu), typicky až do pomeru hexán/etylacetát (0/100). Výhody gradientovej elúcie v porovnaní s izokratickou elúciou: rýchlejšia elúcia látok z kolóny (zníženie času potrebného na realizáciu chromatografie), vyššia čistota látok (neprekrývajúce sa peaky pri zoptimalizovaných parametroch chromatografie), nižšia spotreba rozpúšťadiel. V priebehu chromatografie, sa zbiera eluent do skúmaviek (typicky 40 ml skúmavky, ktoré sa plnia do 35 ml, resp. do menšieho objemu). Priebeh chromatografie sa sleduje na diplayi automatického chromatografu, kde sú zobrazené chromatogramy pri rôznych vlnových dĺžkach, ktorých počet závisí od množstva diód a detektorov chromatografu na výstupe z kolóny. Niektoré vlnové dĺžky diód detektora môžu však rozkladať organické látky, z toho dôvodu je nutné dbať na výber vhodných vlnových dĺžok pred chromatografiou. V prípade, že sa kolónová chromatografia realizuje ručne, je potrebné sledovať priebeh chromatografie pomocou TLC, na ktoré sa nanáša vzorka z každej skúmavky. Skúmavky, ktoré obsahujú rovnakú látku sa zlejú dohromady (tzv. chromatografické **frakcie**). Platí, že nikdy nezlievame skúmavky, ktoré na TLC vykazujú viac ako jednu škvrnu (zmes látok), resp. ktoré na chromatograme vykazujú prekrývajúce sa peaky, hoci by to znamenalo nižší výťažok reakcie.

## Zoznam referencií