Anfinsenova hipoteza

**Anfinsenova hipoteza** (takođe poznata i kao **termodinamička hipoteza**) je postulat u biofizičkoj hemiji postavljen od strane američkog hemičara Kristijana B. Anfinsena. Hipoteza tvrdi da je, bar za male globularne proteine, nativna konformacija određena minimumom Gibsove slobodne energije sistema i tako predstavlja, termodinamički gledano, najstabilniju konformaciju. Iz ove hipoteze sledi da je nativnu konformaciju proteina moguće odrediti polazeći samo od primarne aminokiselinske sekvence i opštih fizičko-hemijskih principa. Anfinsen je zajedno sa saradnicima došao do gore iznesenih zaključaka nakon niza eksperimenata izvedenih pedesetih godina dvadesetog veka i za ova otkrića je dobio Nobelovu nagradu 1972. godine.

## Uvod

Pitanje uvijanja proteina je jedan od glavnih problema koji stoje pred velikim brojem naučnika iz različitih oblasti. Informacija o aminokiselinskoj sekvenci sadržana je u DNK i kada jednom dođe do ekspresije gena i njegovog prevođenja u lanac aminokiselina, protein relativno brzo, u zavisnosti od složenosti, prelazi iz razvijenog oblika u fiziološki aktivnu (nativnu) konformaciju. Pitanje čime je određena tercijarna struktura i termodinamička razmatranja uvijanja proteina javili su se još u prvoj polovini dvadesetog veka u radovima Vua, Polinga i Mirskog. Radom Anfinsena i saradnika pokazano je da je pod odgovarajućim fizičko-hemijskim uslovima uvijanje proteina spontano i određeno samo njegovom aminokiselinskom sekvencom, a da je nativna konformacija određena globalnim minimumom slobodne energije sistema. Ubrzo nakon rada Anfinsena, javila su se gledišta da je uvijanje proteina kinetički kontrolisano i da nativna konformacija ne mora da bude globalni minimum energije. Rasprave o odnosu termodinamičke i kinetičke kontrole uvijanja proteina i dalje se vode, a problem uvijanja ostaje otvoren.

## Anfinsenovi eksperimenti

Anfinsen i saradnici su vršili eksperimente na ribonukleazi A (RNaza A) izolovanoj iz goveđeg pankreasa. To je mali jednolančani protein uključen u procese replikacije DNK. Sastoji se iz 124 aminokiseline i u nativnoj konformaciji sadrži 4 disulfidna mosta.
U ovim eksperimentima RNaza je denaturisana 8 M urejom, a njeni disulfidni mostovi su redukovani β-merkaptoetanolom.  Nakon ovog tretmana RNaza je potpuno izgubila aktivnost. Da bi RNaza povratila aktivnost ona mora prilikom uvijanja da formira 4 disulfidna mosta na tačno definisanim položajima. U slučaju da je formiranje disulfidnih mostova stohastički proces, verovatnoća formiranja prave kombinacije disulfidnih mostova je

:\frac{1}{7} \frac{1}{5} \frac{1}{3} =  \frac{1}{105}\,

U slučajevima kada je renaturacija enzima vršena u prisustvu 8 M ureje, konačni preparat je pokazivao samo 1% ukupne aktivnosti, odakle je zaključeno da je formiranje disulfidnih mostova pod ovim uslovima slučajno.

Kada je ovako dobijenom preparatu dodat β-merkaptoetanol, enzim je nakon desetak sati potpuno povratio aktivnost, odakle su Anfinsen i saradnici zaključili da su svi molekuli sa pogrešnom kombinacijom disulfidnih veza prešli u oblik sa pravilnim rasporedom. U drugom delu eksperimenta oksidacija enzima je vršena uz istovremeno uklanjanje uree dijalizom. Dobijeni preparat je pokazivao 100% aktivnosti. Proces renaturacije je bio značajno ubrzan u slučaju da su u rastvoru sve vreme bili prisutni tragovi β-merkaptoetanola. S druge strane, vreme potrebno za renaturaciju se smanjuje na 2 minuta u prisutvu enzima protein-disulfid-izomeraze koji katalizuje izmenu disulfida.

Da bi se isključila pretpostavka da je renaturacija RNaze posledica zaostajanja delova uređene strukture u denaturisanoj RNazi, eksperimenti su izvršeni i sa hemijski sintetisanom RNazom. Rezultati koji su dobijeni sa ovim preparatom enzima su bili identični onima koji su dobijeni sa denaturisanim enzimom.

Na osnovu ovih rezultata Anfinsen i saradnici su zaključili da je nativna forma enzima termodinamički najstabilniji oblik, a da je glavna pokretačka sila uvijanja koncertovana interakcija bočnih lanaca aminokiselinskih ostataka raspoređenih oko primarne sekvence. Drugim rečima, hipoteza tvrdi da je trodimenzionalna struktura nativnog proteina u njegovom normalnom fiziološkom miljeu (rastvarač, pH, jonska sila, prisustvo drugih komponenata kao što su metalni joni ili prostetične grupe, temperatura i sl.) ona u kojoj Gibsova slobodna energija celog sistema ima globalni minimum, odnosno da je nativna konformacija u datom okruženju određena sveukupnošću međuatomskih interakcija i stoga aminokiselinskom sekvencom.

## Termodinamički aspekti uvijanja proteina

Procesi denaturacije i renaturacije proteina se mogu razmatrati čisto termodinamički, ne ulazeći u tipove interakcije u molekulu ili molekula sa rastvaračem. Proces se može posmatrati prema modelu dva stanja, pri čemu primenjivost dobijenih rezultata direktno zavisi od validnosti pretpostavki na kojima počiva model u realnom sistemu. Prema ovom modelu, prelaz između dva stanja nije praćen nagomilavanjem stabilnih intermedijera koji se mogu eksperimentalno detektovati, a protein se smatra potpuno uvijenim ili potpuno razvijenim. Ravnoteža se može prikazati jednačinom:

R\rightleftharpoonsN

gde je sa N označena nativna konformacija proteina, a sa R razvijeni oblik. Treba naglasiti da ova jedačina ne predstavlja hemijsku reakciju jer ne dolazi do formiranja kovalentnih veza.

Prelaz može biti izazvan promenom temperature, vrednosti pH sredine ili dodatkom (uklanjanjem) nekog denaturišućeg agensa. Gornja ravnoteža se može okarakterisati odgovarajućim termodinamičkim funkcijama, Gibsovom slobodnom energijom reakcije (ΔG), entalpijom (ΔH) i entropijom (ΔS). Konstanta ravnoteže je definisana sa:

:K = \frac{[N]}{[R]}

(sa [*N*] i [*R*] su označene koncentracije nativnog i razvijenog oblika) i povezana je sa promenom slobodne energije razvijanja preko:

:\Delta G = - R T ln K \,

Razvijanje proteina je praćeno povećanjem entalpije i entropije (za gornju reakciju ΔH−1, što znači da je srednja stabilišuća slobodna energija po aminokiselinskom ostatku manja od srednje energije termalnog kretanja (2,5 KJmol−1 na 300˚K) pod istim uslovima. Ovi rezultati ukazuju na kooperativnu prirodu uvijanja proteina: individualne interakcije su nedovoljne da održe stabilnu konformaciju, ali zajednički, koncentrovano, su u stanju da to učine.

U svetlu statističke termodinamike, pod denaturišućim uslovima moguće je posmatrati ansambl molekula proteina u razvijenom obliku nasumično raspoređen preko ogromnog dela površi slobodne energije (PSE, ). Prema Levintalu (vidi niže), broj mogućih konformacija je astronomski, ali pri postizanju uslova pogodnih za uvijanje (fizioloških) proces uvijanja može da bude završen u vremenskom intervalu milisekundi ili čak mikrosekundi, kod nekih proteina. Prema pojedinoj literaturi pod uslovima pogodnim za uvijanje, PSE je oblika (višedimenzionalnog) levka (slivnika, ). Bez obzira gde su se pojedinačni molekuli proteina zatekli na PSE, oni prate gradijent potencijalne energije ka energetski povoljnijem stanju. Drugim rečima nije definisan put kojim svi molekuli dolaze do nativne konformacije. Analogon ovakvom ponašanju je lopta koja se kotrlja niz strminu. U svetlu Anfinsenove hipoteze, profil ove PSE pod uslovima pogodnim za uvijanje proteina, određen je isključivo aminokiselinskom sekvencom. Profil PSE u denaturišućim uslovima je, s druge strane, nezavisan od primarne sekvence.

Ipak treba naglasiti da realno „nativna struktura“ nije jedna tačka u konformacionom prostoru, nego čitav ansambl faznih tačaka, lokalizovan u određenom delu prostora, tako da svi molekuli ansambla imaju ista ključna svojstva za obavljanje biološke funkcije.

## Odnos termodinamike i kinetike uvijanja proteina

Anfinsenova hipoteza tvrdi da je nativna konformacija enzima termodinamički najpovoljnija i da je enzim postiže, ali ne govori na koji način enzim prelazi iz razvijenog oblika u fiziološki aktivnu konformaciju, odnosno kojim putem se kreće preko PSE. Drugim rečima, ona ne govori ništa o mehanizmu uvijanja kao ni o tome kojom brzinom se odvija ovaj proces. Odgovore na ova pitanja pokušava da da kinetika uvijanja proteina.

Anfinsenova hipoteza je do početka devedesetih godina dvadesetog veka bila široko prihvaćena, ali su je neki novi eksperimentalni rezultati doveli u sumnju. Glavna eksperimentalna potvrda termodinamičke hipoteze su bile serije eksperimenata razvijanje/uvijanje na malim proteinskim molekulima koji su pokazali da je ovaj proces reverzibilan.  U prilog hipotezi je takođe išla činjenica da uvijanje proteina *[[in vivo]]* i *[[in vitro]]* ima isti krajnji rezultat iako se u drugom slučaju polazi od potpuno razvijenog proteina. Međutim, neki eksperimentalni rezultati navode na zaključak da i uvijanje proteina *in vivo* efektivno počinje tek kada se sinteza završi.

Postoji gledište da izneseni eksperimentalni rezultati mogu poslužiti isključivo kao dokaz da je nativno stanje proteina stanje najniže energije samo u onom delu konformacionog prostora koji je kinetički dostupan. Kako se, s druge strane, konformacije van ovog dela konformacionog prostora ne mogu eksperimentalno postići pod normalnim uslovima, termodinamička hipoteza se, strogo gledano, ne može eksperimentalno verifikovati. Postoje opravdani razlozi za verovanje da nativno stanje ne mora da odgovara globalnom energetskom minimumu. Cirus Levintal (Levintalov paradoks) je pokazao da se uvijanje proteina odvija u malom delu vremena od neophodnog da protein isproba sve moguće konformacije. Tako bi, na primer, za polipeptid od 101 aminokiseline bilo potrebno 1027 godina da isproba sve moguće konformacije (3100 konformera, brzina prelaska iz jedne u drugu konformaciju 1013 s−1; poređenja radi starost kosmosa je reda 109 godina). Levintal je zaključio da protein ne „pretražuje“ PSE, nego da u toku uvijanja prolazi kroz mali deo od ukupnog broja mogućih konformacija i da se ove konformacije mogu posmatrati kao kinetički put uvijanja (u vezi sa ovim definisan je „problem traženja“, ). Dok ovi putevi obavezno vode kinetički dostupnim konformacijama koje su energetski najpovoljnije, prema nekim autorima, ne postoji nikakav određeni razlog da se, s obzirom na veličinu konformacionog prostora, veruje da su ove niskoenergetske konformacije zaista globalni minimumi energije. Prema ovom gledištu, mogu postojati velike oblasti konformacionog prostora koje su kinetički nedostupne, a u kojima postoje stanja sa još nižom energijom od one koja odgovara nativnom stanju.

Neki rezultati navode na zaključak da kinetička kontrola uvijanja dolazi do izražaja samo u vrlo retkim slučajevima kod manjih globularnih proteina, ali može češće da se javlja kod velikih, kompleksnih proteina. Primer proteina kod koga je aktivna forma metastabilna je *plazminogen aktivator inhibitor* (PAI-1). Ovaj protein tek nekoliko sati nakon sinteze prelazi u neaktivnu stabilniju konformaciju.

S druge strane, prema drugim autorima ni u jednom poznatom slučaju kada se uvijanje proteina odvija na kratkoj vremenskoj skali, ne dolazi do ovog zaglavljivanja proteina u lokalnom kinetički dostupnom minimumu energije. Govoreći u svetlu površi slobodne energije pitanje je zašto se protein, spuštajući se niz gradijent energije, u slučaju da PSE nije dovoljno glatka, ne zaglavi u nekoj kinetičkoj „zamci“ () na svom putu ka globalnom minimumu energije.

Čest je sledeći odgovor: proteini su izgrađeni od 20 različitih aminokiselina, pa je za polipeptidni lanac od 100 aminokiselina moguće 20100 različitih kombinacija. Svaka ova kombinacija ima svoju površ slobodne energije od kojih su neke više, a neke manje glatke. U svetlu iznesenog, biološki funkcionalan protein je uspešan ishod čitavog niza eksperimenata tipa pokušaj-pogreška, koji je pod evolucionim pritiskom da uvijanje bude što efikasnije (optimalnije) evoluirao na takav način da je nativna forma dubok globalni minimum slobodne energije, koji je pored toga u dostupnom delu konfiguracionog prostora. Na ovaj način, smatraju neki autori, priroda (evolucija) je sama probrala među mogućim proteinskim sekvencama one koje će uvijanjem dostići globalni minimum. Na ovaj način se i metastabilna aktivna forma pomenutog PAI-1 smatra posledicom određenih funkcionalnih potreba i selekcionih prednosti.

Proteini se često uvijaju uz pomoć šaperona, pa neki smatraju da se ova činjenica protivi termodinamičkoj hipotezi. Druga gledišta tvrde da ovo ne može biti dokaz da termodinamička hipoteza nije tačna, obzirom da šaperoni proteinima samo obezbeđuju pogodnu sredinu za uvijanje, štiteći ih od mogućih nepovoljnih uticaja. Danas je dobrim delom prihvaćeno gledište da nativna konformacija zaista predstavlja globalni minimum slobodne energije.

Na kraju treba reći da termodinamička i kinetička kontrola ne moraju nužno da se isključuju. Prema rezultatima određenih kompjuterskih simulacija Govindarajan i Goldstin su zaključili da i u slučajevima kada je uvijanje pod kinetičkom kontrolom i ne postoji nikakva evoluciona prednost da protein zadovoljava termodinamičku hipotezu, proces slučajnih mutacija još uvek može da rezultuje u tome da nativno stanje (p)ostane stanje najniže energije.

## Šta Anfinsen nije mogao da zna

Prirodu problema uvijanja proteina suštinski menja činjenica da postoji svega nekoliko hiljada stabilnih domena. Milioni sekvenci sposobnih za uvijanje ne moraju da reše konvencionalni problem uvijanja - da pronađu pravu konformaciju, nego samo treba da razluče između nekoliko hiljada mogućnosti za pravilno uvijanje. Zbog toga će promene uslova koji vode destabilizaciji proteina favorizovati ne alternativno uvijanje, nego razvijanje proteina. Ovakva koncepcija uvijanja vodi zaključku da su konformacija proteina i njegova stabilnost dve potpuno odvojene stvari.

## Anfinsenova hipoteza i mogućnosti predviđanja strukture proteina

Ne ulazeći u problem definisanja „nativnog stanja“ za svrhe kompjutacione hemije čini se moguće naći nativnu konformaciju proteina primenom Anfinsenove hipoteze, makar samo u slučajevima kada je uvijanje termodinamički kontrolisano. Ukoliko smatramo da se u nekim slučajevima može javiti kinetička kontrola uvijanja, direktnoj primeni Anfinsenove hipoteze predstojao bi problem određivanja uslova pod kojima važi termodinamička kontrola procesa uvijanja.

Direktno iz formulacije hipoteze sledi da je jedino potrebno izračunati ukupnu energiju sistema uzimajući u obzir sve moguće međuatomske interakcije, za svaku moguću konformaciju proteina, a zatim utvrditi u kojoj konformaciji je energija najmanja, odnosno polazeći od odgovarajućeg polja sila korišćenjem nekog od algoritama za globalnu optimizaciju naći globalni minimum energije sistema. Do nedavno ovaj zadatak je bio praktično neizvodljiv i to iz dva razloga: prvo, nije postojalo dovoljno dobro polje sila, odnosno parametri potencijala nisu bili dovoljno pouzdani i drugo, nisu postojali dovoljno snažni računari.

Nedavnim naprecima, kako u sirovoj kompjuterskoj snazi, tako i razvojem novih algoritama za predviđanje strukture proteina, stekli su se uslovi za *[[in silico]]* realizaciju Anfinsenove hipoteze, makar za slučajeve manjih proteina.

Kako protein nalazi put do svog globalnog minimuma slobodne energije, preko određenog broja lokalnih minimuma, tako i algoritam koji koristimo za predviđanje strukture u minimumu energije mora da učini isto. Ovo je bio jedan od glavnih problema na putu kompjutacione biologije, s obzirom da se deterministički algoritmi za optimizaciju zaglavljuju u lokalnim minimumima. Jedan od ključnih koraka u rešavanju ovog problema bio je razvijanje Monte Karlo metoda za problem minimizacije 1987. godine. Dejvid Bejker sa kolegama sa Univerziteta u Vašingtonu je 2005. godine uspeo da primenom programa ROSETTA izračuna strukture 17 malih proteina sa do 100 aminokiselina na atomskom nivou tačnosti. Uz pretpostavku daljeg napretka, mnogi smatraju da je ovo korak ka *in silico* realizaciji Anfinsenove hipoteze za slučajeve većih molekula.

## Izvori