Krebsov ciklus

**Krebsov ciklus** ili **ciklus limunske kiseline** ili **ciklus trikarboksilnih kiselina (TCA ciklus)** je jedan od temeljnih metaboličkih ciklusa kod stanica koje koriste kisik u procesu staničnog disanja. Kod aerobnih organizama, Krebsov je ciklus ključni metabolički proces koji spaja putove degradacije (katabolizma) ugljikohidrata, lipida (masti) i bjelančevina u ugljični dioksid i vodu uz oslobađanje kemijske energije.
Krebsov ciklus je anfibolički metabolički put, pošto sudjeluje i u degradaciji organskih molekula (katabolizam) i u biosintezi molekula (anabolizam). Najvažniji metabolički putovi koji se vežu na Krebsov ciklus su glikoliza i oksidativna dekarboksilacija piruvata koje mu prethode i oksidativna fosforilacija koja mu slijedi. Krebsov ciklus je važan i kao izvor prekursora aminokiselina (acetil CoA, α-ketoglutarat, sukcinil CoA, sukcinat, fumarat, oksalacetat).
Ciklus nosi ime po Hansu Adolfu Krebsu, britanskom biologu njemačkoga podrijetla koji je otkrio ključne elemente procesa i za to dobio Nobelovu nagradu za medicinu 1953.

## Osnovne reakcije
Krebsov se ciklus odvija u mitohondrijima eukariotskih stanica i u citoplazmi prokariotskih stanica. 
Katabolizam ugljikohidrata i masti stvara acetil-CoA, molekulu sastavljenu od jedne acetilne skupine vezane na koenzim A. Acetil-CoA je osnovni supstrat Krebsovog ciklusa. Dvije molekule acetil-CoA oslobađaju svoje acetilne skupine, koje se spajaju s oksalacetatom i formiraju limunsku kiselinu. Limunska kiselina prolazi kroz niz metaboličkih procesa, oslobađa dvije molekule ugljičnog dioksida (CO2) i regenerira se ponovo u oksalacetat koji je spreman za slijedeći ciklus. Najbitnije reakcije u energetskom smislu su formiranje molekule GTP, koja odmah regenerira jednu molekulu ATP, proizvodnja tri molekule NADH i jedne FADH<sub>2</sub>. Za ključne kemijske reakcije i enzime koje se odvijaju u Krebsovom ciklusu, kao i za njihove produkte vidi tablicu niže.

Reducirani kofaktori (NADH i FADH2) imaju ulogu prijelaznih molekula u procesima oksidacije i redukcije. U reduciranom stanju prenose elektrone od oksidiranih molekula iz samog Krebsovog ciklusa i glikolize do prve faze oksidativne fosforilacije, lanca prijenosa elektrona. Tada dolazi do oksidacije u NAD+ i FAD i davanja elektrona, koji će za vrijeme oksidativne fosforilacije bili iskorišteni za regeneriranje ATP iz ADP.

Konačna stehiometrijska formula svih reakcija je slijedeća:

:\mathrm{Acetil\text{-}CoA + 3\ NAD^+ + FAD + GDP + P_i + 2\ H_2O \longrightarrow 2\ CO_2 + 3\ NADH + 3\ H^+ + FADH_2 + GTP + CoA\text{-}SH}

Energija koja se dobije od potpune razgradnje jedne molekule glukoze kroz tri faze staničnog disanja (glikoliza, Krebsov ciklus i oksidativna fosforilacija) je 36 molekula ATP. U stvarnosti se proizvede 38 molekula ATP, ali dvije su iskorištene za prijenos (aktivnim transportom) dviju molekula NADH proizvedenih putem glikolize iz citoplazme kroz membranu mitohondrija.

## Stupnjevi Krebsovog ciklusa

### Reakcija 1: Citrat sintetaza

Prvi enzim u Krebsovom ciklusu, citrat sintetaza katalizira reakciju kondenzacije acetil-CoA s oksalacetatom iz kojeg nastaje citrat (limunska kiselina). Enzim ima dvije strukturne podjedinice i svaka od njih sposobna je vezati oba supstrata za svoje aktivno mjesto.
Enzim katalizira aktivaciju acetil-CoA, kako bi povećao afinitet prema oksalacetatu. Nakon povezivanja acetilne skupine na oksalacetat, tioesterna se grupa (CoA) odvaja hidrolizom kako bi se oslobodila limunska kiselina.

**Jednadžba reakcije:** Acetil-CoA + oksakacetat + H2O → citrat + CоА + H+

Reakcija je vrlo egzoergonska tj. oslobađa energiju (ΔG'°=-31.4 kJ/mol) što sprječava da reakcija teče u suprotnom smjeru. Limunska kiselina ima i ulogu reguliranja aktivnosti samog enzima, pošto djeluje kao kompetitivni inhibitor. Sposobnost inhibicije citrat sintetaze je jako bitna za reguliranje cijelog Krebsovog ciklusa, pošto ona funkcionira kao biokemijski *pacemaker*.

### Reakcija 2: Akonitaza

Akonitaza katalizira izomerizaciju limunske kiseline (citrata) u izocitrat kroz prijelazno formiranje cis-akonitata. Citrat prolazi proces dehidracije C3 ugljika i stvaranje međuspoja cis-akonitata, koji se potom hidrira u C2 formirajući izocitrat. Reakcija može teći i u suprotnom smjeru, ali to se ne događa u Krebsovom ciklusu zbog zakona o djelovanju masa. Koncentracija citrata je 91%, međuspoja cis-akonitata je 3%, a izocitrata 6%. Reakcija stoga nepovratno teče prema izocitratu.

**Jednadžba reakcije:** citrat → cis-akonitat + H2O → izocitrat

U aktivnom mjestu akonitaze nalazi se skupina željezo-sumpor koja veže supstrat, zajedno s određenim polarnim aminokiselinama. Prostorna struktura aktivnog mjesta dopušta samo vezivanje 1R,2S citrata, odbijajući suprotni izomer.

### Reakcija 3: Izocitrat dehidrogenaza

Mitohondrijska izocitrat dehidrogenaza je enzim koji je ovisan o NAD+, Mn<sup>2+</sup> i/ili Mg<sup>2+</sup>. U početku enzim katalizira oksidaciju izocitrata u oksalsukcinat i proizvede jednu molekulu NADH od NAD+. Potom jedan bivalentni ion (Mn2+ ili Mg2+) veže kisik iz karboksilne skupine i povećava elektronegativnost tog dijela molekule. Dolazi do preraspodjele elektrona u molekuli, kidanja kemijske veze i oslobađanja karboksilne skupine. Dekarboksilacijom dolazi do formiranja α-ketoglutarata i oslobađanja jedne molekule CO<sub>2</sub>..

**Jednadžba reakcije:** izocitrat + NAD+ → Oksalsukcinat + NADH + H+; Oksalsukcinat → α-ketoglutarat + CO2

### Reakcija 4: α-ketoglutarat dehidrogenaza

Pretvorba α-ketoglutarata u sukcinil-CoA od strane α-ketoglutarat dehidrogenaze dešava se putem oksidativne dekarboksilacije. Reakcija predviđa dekarboksilaciju α-ketoglutarata i formiranje tioesterne veze s koenzimom A uz konačni produkt sukcinil CoA i oslobađanje CO2. Istovremeno dolazi do redukcije NAD+ u NADH.

**Jednadžba reakcije:** α-ketoglutarat + NAD+ + CоА-SH → sukcinil CоА + CO2 + NADH + H+

α-ketoglutarat dehidrogenaza je u biti kompleks sastavljen od tri različita enzima. Podjedinica E1 (2-ketoglutarat dehidrogenaza) i E2 (transsukcinilaza) vrlo su slične podjedinicama prisutnim u jednom drugom enzimu: piruvat dehidrogenazi. Podjedinica E3 je pak istovjetna podjedinici istog enzima. Najvjerojatnije jedan enzim evolutivno potječe od drugoga.

### Reakcija 5: Sukcinil CoA sintetaza

Sukcinil CoA je tioester visoke kemijske energije (njegova ΔG°′ hidrolize je -33.5 kJ mol-1, slična onoj ATP -30.5 kJ mol-1). Enzim sukcinil CoA sintetaza koristi ovu energiju za fosforilaciju purinskog nukleozid difosfata kao GDP u jednoj od ključnih reakcija stvaranja kemijske energije iz Krebsovog ciklusa.

Energija prisutna u tioesteru se jednostavno pretvori u energiju u obliku fosfatnih veza koje se kasnije koriste kao univerzalni izvor energije u gotovo svim endoergonskim metaboličkim procesima u cijelom organizmu. U prvom koraku reakcije enzim eliminira Koenzim A iz sukcinil CoA i nastaje međuspoj visoke energije sukcinil fosfat. Potom dolazi do primanja fosfata od jedne molekule histidina prisutom u aktivnom mjestu enzima koji oslobađa sukcinat kao konačni proizvod reakcije i formiranja fosfohistidina. Fosfohistidin odmah prebacuje fosfat na GDP pretvarajući ga u GTP. To je jedina reakcija u Krebsovom ciklusu kod koje dolazi do fosforilacije na nivou substrata.

**Jednadžba reakcije:** sukcinat-CоА + Pi + GDP → sukcinat + GTP + CоА-SH

Organizam ne koristi direktno GTP kao molekulu visoke energije (GTP ima ulogu signalne molekule). Njegova je uloga u Krebsovom ciklusu da posluži kao međuspoj koji prebacuje fosfatnu grupu na ADP kako bi se stvorio ATP. Tu reakciju katalizira enzim nukleozid difosfokinaza.

U završnim fazama Krebsovog ciklusa dolazi do preraspodjele molekula s četiri atoma ugljika do ponovne regeneracije oksalacetata. Da bi to bilo moguće, metilna grupa prisutna na sukcinatu mora doživjeti konverziju u karbonilnu grupu. Konverzija nastaje u tri prijelaza: prva oksidacija, pa hidracija, potom druga oksidacija. Navedeni prijelazi, osim što regeneriraju oksalacetat, omogućavaju „izvlačenje“ dodatne kemijske energije putem nastanka flavin adenin FADH<sub>2</sub> i NADH.

### Reakcija 6: Sukcinat dehidrogenaza

Prvu reakciju oksidacije katalizira enzimski kompleks sukcinat dehidrogenaze, jedini enzim iz ciklusa koji ima FAD kao primatelja vodika umjesto NAD+. FAD je kovalentno vezan za enzim, preko jedne molekule histidina. Enzim koristi FAD kao primatelj vodika, pošto reakcija ne razvija dovoljno slobodne energije da reducira NAD+. Enzim katalizira oksidaciju sukcinata u fumarat.

**Jednadžba reakcije:** sukcinat+ FAD → fumarat + FADH2

Enzimski sustav sukcinat dehidrogenaze je jedini iz cijelog ciklusa koji se nalazi unutar mitohondrijske membrane. Enzim se nalazi u toj poziciji pošto ulazi i u metabolički put lanca prijenosa elektrona (u kojem nosi naziv kompleks II). Nakon prijelaza na FAD, enzim ubacuje elektrone direktno u lanac prijenosa elektrona, koji je prvi dio oksidativne fosforilacije. To je moguće upravo zbog stabilne veze između enzima i samog kofaktora FAD.

### Reakcija 7: Fumaraza

Enzim fumaraza dodaje fumaratu jedan proton i jednu hidroksilnu grupu (OH<sup>-</sup>) dobivenu hidrolizom vode i formira malat kao konačni produkt. Enzim može vezati grupu OH- samo s jedne strane, tako da fumarat prelazi samo u L-malat.

**Jednadžba reakcije:** fumarat + H2O → malat

### Reakcija 8: Malat dehidrogenaza

Posljednja reakcija Krebsovog ciklusa predviđa oksidaciju malata u oksalacetat. Time se oksalacetat regenerira i ulazi u novi ciklus. Enzim malat dehidrogenaza koji katalizira reakciju koristi još jednu molekulu NAD+ kao primatelja vodika kako bi proizveo NADH.

**Jednadžba reakcije:** malat + NAD+ → oksalacetat + NADH + H+

Aktivnost enzima je u potpunosti određena potrošnjom oksalacetata od strane citrat sintetaze (prvog enzima u Krebsovom ciklusu) i potrošnjom NADH od strane lanca prijenosa elektrona. Kontinuirano smanjenje koncentracije navedenih spojeva tjera enzim na stalnu proizvodnju novih spojeva.

## Regulacija aktivnosti Krebsovog ciklusa
Brzina kemijskih reakcija u Krebsovom ciklusu podložna je preciznioj regulaciji, razmjerno energetskim potrebama same stanice. Ključne točke kontrole su alosterični enzimi, izocitrat dehidrogenaza i α-ketoglutarat dehidrogenaza.

Isocitrat dehidrogenazu stimulira prisutnost ADP, koji se veže za enzim, i povećava afinitet prema substratu. Simultano vezanje substrata (isocitrata), NAD+, Mg2+ i ADP na enzim ima potencirajući utjecaj na aktivaciju, dok NADH i ATP smanjuju aktivnost enzima, jer zauzimaju aktivno mjesto vezivanja aktivacijskih spojeva (kompetitivna inhibicija).

Slijedeća ključna točka kontrole je regulacija aktivnosti α-ketoglutarat dehidrogenaze. Enzim je inhibiran od strane sukcinil-CoA i NADH, dva konačna produkta koji nastaju njegovom vlastitom aktivnošću. Enzim može općenito smanjiti aktivnost, ako u stanici već postoji obilje visokoenergetskih molekula kao ATP. Time se smanjuje efikasnost svih procesa proizvodnje energije, među kojima Krebsov ciklus ima središnju ulogu.

Postoje dokazi o reguliranju aktivnosti Krebsovog ciklusa i prije samog ciklusa, na nivou opskrbe prvog enzima u procesu (citrat sintetaze). Velika koncentracija ATP smanjuje afinitet enzima prema svom osnovnom substratu acetil-CoA, smanjujući tako proizvodnju citrata. Stoga, što je više ATP u stanici, manja količina acetil-CoA ulazi u sam Krebsov ciklus.

## Povezanost Krebsovog ciklusa s ostalim metaboličkim putevima

Krebsov ciklus ima središnju ulogu u metabolizmu živih bića, prije svega u katabolizmu organskih molekula, ali i u anabolizmu. Na Krebsov se ciklus nadovezuju različiti metabolički putevi koji između ostalog imaju ulogu opskrbe samog ciklusa međuspojevima koji su utrošeni kod biosinteze drugih organskih molekula. Te se kemijske reakcije zovu anaplerotičke reakcije.

### Procesi koji prethode Krebsovom ciklusu
Krebsov ciklus je drugi stupanj razgradnje ugljikohidrata. Prvi stupanj, glikoliza, razgrađuje glukozu (i ostale šećere) u pirogrožđanu kiselinu (piruvat), α-ketokiselinu s tri atoma ugljika
. Kod eukariota piruvat se prenosi iz citoplazme u mitohondrije, gdje enzimskom reakcijom gubi jedan atom ugljika i nastaje acetil-CoA. Ta se reakcija zove oksidativna dekarboksilacija piruvata, a enzim koji vrši reakciju je piruvat dehidrogenaza. Acetil CoA, koji se oslobađa u mitohondriju ulazi u Krebsov ciklus kao prvi substrat.

Bjelančevine mogu indirektno poslužiti kao izvor energije i njihovi produkti ući u Krebsov ciklus. Bjelančevine se proteolizom razgrađuju u osnovne građevne jedinice: aminokiseline. Neke aminokiseline kao aspartat, valin i isoleucin mogu biti direktno pretvoreni u međuspojeve samog ciklusa. Ostale mogu biti pretvorene u glucide (ugljikohidrate) i ući u ciklus preko metaboličkih puteva karakterističnih za ugljikohidrate.

Produkti razgradnje masti su također izuzetno važan izvor energije koji direktno i indirektno ulaze u Krebsov ciklus. Masti su razgrađene od enzima lipaze koje oslobađaju masne kiseline i glicerol. Glicerol može ući u proces glikolize, pogotovo u stanicama jetre ili biti pretvoren u glukozu putem glukoneogeneze. U mnogim tkivima, pogotovo srcu, masne se kiseline razgrađuju kroz proces beta oksidacije koja direktno proizvodi acetil CoA, osnovni supstrat Krebsovog ciklusa. Beta oksidacija može proizvesti i propionil CoA, koji će putem glukoneogeneze biti pretvoren u glukozu.

### Procesi koji slijede Krebsov ciklus
Osnovni proces koji slijedi Krebsov ciklus je oksidativna fosforilacija, metabolički put gdje završava stanično disanje. Glavna uloga oksidativne fosforilacije je oksidacija kofaktora NADH i FADH2, koji ponovo ulaze u Krebsov ciklus u oksidiranom obliku NAD+ i FAD. Ovaj proces osidacije generira gradijent protona i elektrona, čija se energija iskoristi za proces fosforilacije molekula ADP u visokoenergetske molekule ATP. U tom se procesu protoni (H+) vežu na kisik, kojeg organizmi unose iz atmosfere i stvaraju vodu kao konačni produkt. Oksidativna fosforilacija uvelike povećava efikasnost proizvodnje visokoenergetskih nukleozida kao ATP i GTP koja je relativno niska kod Krebsovog ciklusa.

### Procesi koji koriste međuspojeve Krebsovog ciklusa
Međuspojevi Krebsovog ciklusa ulaze u mnoge druge metaboličke puteve. U popisu niže, navedeni su metaboliti Krebsovog ciklusa i metabolički putevi u kojima sudjeluju.

* **Acetil CoA:** 
** beta oksidacija
** biosinteza masnih kiselina;
** degradacija lizina
** degradacija valina i izoleucina
** metabolizam fenilalanina
* **α-ketoglutarat:** 
** biosinteza lizina
** metabolizam askorbinske kiseline
** metabolizam glutamata
* **Sukcinil CoA:** 
** metabolizam propanoata
** biosinteza porfirina
** degradacija leucina i izoleucina
** metabolizam fenilalanina
* **Sukcinat:** 
** metabolizam butanoata
** metabolizam tirozina
* **Fumarat:** 
** ciklus uree
** metabolizam arginina i prolina
** metabolizam tirozina
* **Oksalacetat:** 
** glukoneogeneza
** metabolizam glutamata i aspartata
** metabolizam glikoksilne kiseline

## Izvori

## Vanjske veze

*  Citric acid cycle Animation (flash required)
*  An animation of the citric acid cycle at Smith College
*  Notes on citric acid cycle  at rahulgladwin.com
*  Citric acid cycle variants at MetaCyc
*  Pathways connected to the citric acid cycle  at KEGG|Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
*  A more detailed tutorial animation  at johnkyrk.com
*  A citric-acid cycle self quiz flash applet  at University of Pittsburgh
*  The chemical logic behind the citric acid cycle