Imunohistohemija

**Imunohistohemija (IHH)** je metoda u laboratorijskoj dijagnostici koja se, koristeći osnovni princip u imunologiji da se određeno antitelo veže i prepoznaje samo ciljni antigen, bavi primenom obeleženih antitela kao specifičnih reagenasa za lokalizaciju i detekciju tkivnih konstituenata. Ukoliko se govori o lokalizaciji proteina u ili na ćeliji onda govorimo o metodi imunocitohemije.

Poslednjih godina imunohistohemija se razvila u snažno dijagnostičko sredstvo koje pruža dodatne informacije prilikom rutinske morfološke analize tkiva, jer „ omogućava vizuelizaciju definisanih antigena u tkivnim presecima, vezivanjem antitela za male, specifične regione antigena epitope.“ Primena imunohistohemije u proceni odgovarajućih ćelijskih markera koji definišu specifični fenotip, omogućila je dobijanje važnih dijagnostičkih, prognostičkih i prediktivnih informacija neophodnih za klasifikovanje i diferenciranje pojedinih bolesti. Osim u dijagnostičke, metode imunohistohemija se koristi i u naučno-istraživačke svrhe kako bi se bolje razumela distribucija i lokalizacija biomarkera i ekspresija pojedinih proteina u različitim tkivima.

Upotreba antitela na fiksiranom tkivu, da bi se izučavala patologija tkiva, zahtevala je određena prilagođavanja i usklađivanje imunohistohemijskih tehnika. Budući da je očuvanost antigena u fiksiranom tkivu varijabilna kroz istoriju su se imunohistohemijske tehnike unapređivale kako bi se povećala osetljivost analize. Specifični molekularni markeri su karakteristika pojedinih aktivnih događaja, kao što su proliferacija ćelija ili ćelijska smrt (apoptoza).

Vizuelizacija antitela i intereakcija sa antigenom može se postići na više načina. Najjednostavniji primer; antitelo se konjuguje enzimom, kao što je peroksidaza, koji može ubrzati proces bojenja i proizvesti reakciju (vidi mrlje imunoperokidaze na slici). Alternativno, antitela mogu biti označena i fluorescentnim jedinjenjima, kao što fluorescein ili rodamin (vidi imunofluorescencija). Imunohistohemijska bojenja se široko primenjuju u dijagnostici oštećenja ćelija, kao što su ona koja se javljaju u kancerogenim tumorima.

## Principi
Ćelija je funkcionalna jedinica svih živih tkiva u kojoj se obavljaju osnovne životne funkcije organizma. Procesi u kojima ćelije stiču specijalizovanu građu i funkciju naziva se diferencijacija.
Svetlosnim mikroskopom uočava se da ćelije stvaraju jezgro i citoplazmu, a elektronskim mikroskopom uočavaju se razne ćelijske organele. Ono što ove dve metode ne mogu može imunohistohemijska tehnika koja omogućava lokalizaciju specifičnih antigena u tkivu ili u ćelijama zasnovanu na prepoznavanju antigena i antitela i omogućava vizuelizaciju tog kompleksa na mikroskopskom nivou. Imunohistohemija u svom radu primenjuje obeležena antitela kao specifične reagenase za određivanje lokalizacije i otkrivanje (vizuelizaciju) tkivnih konstituenata (antigena) u preparatu in situ.

Imunohistohemija (IHH) je savremena metoda u medicinskoj dijagnostici u kojoj se zahvaljujući primeni imunoloških principa postigao veliki napredak u dijagnostici mnogih bolesti a posebno u patohistološkoj dijagnostici i istraživanju sve učestalijih tumora.

Kako se imunoglobulini i antigeni mikroskopski ne mogu videti mesto nastalog imunokompleksa postaje vidljivo uz pomoć enzima koji oksidira hromogen u prisustvu odgovarajućeg supstrata. Kako bi ova metoda u praksi imala potpunu i pouzdanu primenu i značaj u dijagnostici u radu sa njom je potrebno poznavati metodologiju, a u dijagnostici interpretaciju imunohistohemijskih nalaza pri identifikaciji različitih antigena, intermedijarnih filamenata, hormonskih receptora, funkcionalnih proteina, onkofetalnih antigena i genskih produkata.

Dva osnovna načina prikazivanja nastalog imunokompleksa su imunoenzimska reakcija i obeležavanje antitela florescentnom materijom.

**Direktna imunohistohemija** 

Najstarija metoda u imunohistohemiji je direktna imunohistohemija, koja se zasniva na reakciji specifičnog vezivanja antitela direktno na detektovanu supstancu (vidi sliku). Godine 1940. Kons je na rezu smrznutog tkiva otkrio određene antigene primenom antitela obeleženog fluoresceinom. Antitela se mogu obeležiti radioaktivnim materijalom ili fluorescentnom bojom (npr. fluorizocijanatom ili rodaminom), koji emituju svetlo veće talasne dužine. Nakon bojenja imunofulorescentnom bojom da bi se nastale promene mogle uočiti potreban je fluorescentni mikroskop sa živinom lampom i odgovarajućim vrstama filtera.
* *Loše strane imunofluorescentne tehnike su*; visoka cena florescentnog mikroskopa, otežana morfološka analiza i autofluorescencija fiksiranog tkiva, 
* *Dobre strane imunofluorescentne tehnike su*; jednostavnost primene i dobra rezolucija pozitivnog nalaza kao zrnastog, linearnog, glatkog ili vlaknastog depozita.

**Indirektna imunohistohemija**

 
S kraja 20. veka razvila se i započela široka primena u hirurškoj patologiji, mnogo osetljivija metoda, indirektna imunohistohemija, zahvaljujući ranijem otkriću enzimskog obeležavanja antitela koja uz odgovarajući sistem hromogena i supstrata omogućava vizuelizaciju imunih kompleksa svetlosnim mikroskopom. Enzim deluje na supstrat oslobađanjem jona koji oksidira rastvorljivi bezbojni hromogen u obojeni talog na mestu imunokompleksa.
Osetljivost metode povećavala se od antitela obeleženog enzimom preko višestepene detekcije sistemima peroksidaza-antiperoksidaza, konjugata avidin-biotina i biotin-streptavidina do amplifikacije tiramidom i vrlo osetljivih obeležavajućih sistema koji se zasnivaju na polimeru.
 
Nakon otkrića hibridomske tehnike, koja je uticala na obimnu industrijsku proizvodnju visoko specifičnih monoklonalnih antitela i iznalaženje mogućnosti upotrebe IHH na rutinski obrađenom i uklopljenom tkivu, dogodili su se ključni pomaci u primeni ovih metoda

**Dvostruko imunohistohemijsko bojenje**

Primena dvostrukog imunohistohemijskog bojenje omogućava istovremeno otkrivanje više različitih
antigena na istom preparatu. U ovoj metodi primenjuje se dva ili više različitih antitela koja su u direktnoj imunohistohemiji obeležena različitim fluorescentnim materijama, a u indirektnoj imunohistohemiji vidljiva uz pomoć različitih enzimskih detekcijskih sistema.

Za izvođenje metode bitna je postupnost, pa se tek nakon potpunog dovršavanja tih reakcija i blokiranja prve reakcije pristupa narednoj.

## Antigeni

Antigeni su supstance koje u organizmu pokreću stvaranje imunoglobulina antitela. Antigeni su uglavnom proteini, a ređe ugljeni hidrati. Razna molekularna mesta na antigenima zovu se epitopi–ili delovi antigena koje prepoznaju receptori na T i B limfocitima. Determinanta ili epitop je deo makromolekula koji prepoznaje antitelo. Deo jednog antitela koja prepoznaje epitope zove se paratop. Makromolekuli sadrže veći broj epitop, od kojih se neki mogu ponavljati, a broj multiplih identičnih determinanti određuje valentnost antigena. Epitop mogu biti nepreklapajući, kada su prostorno udaljeni i omogućavaju vezivanje dva ili više antitela. Preklapajuće determinante su blizu jedna drugoj i dovode do sternih smetnji prilikom vezivanja antitela, a u retkim slučajevima je moguće i da vezivanje prvog antitela dovede do konformacione promene strukture antigena čime se utiče na vezivanje drugog antitela. Epitop ugljenih hidrata i fosfolipida su kovalentne strukture.

Monoklonska antitela reaguju sa jednim, a poliklonska sa više epitopa na molekulu antigena. Antigen i antitelo vezuju se hidrofobnim, jonskim ili Van der Valsov-im silama i tako stvaraju **imunokompleks antigen-antitelo**.

Antigeni i imunoglobulini-antitela se klasičnom mikroskopijom ne mogu videti, i zato mesto nastalog imunokompleksa postaje vidljivo uz pomoću enzima koji oksidira hromogen u prisustvu odgovarajućeg supstrata.

## Antitela
Za svaku imunohistohemijski tehniku najvažniji reagens je antitelo. Antitela se nazivaju imunoglobulini (Ig) koji spadaju u grupu proteina a prisutni su u krvi imunizovanih životinja.

Imunoglobulini su građeni od:
* *Dva istovetna teška lanca (H)*. Teški lanci se razlikuju u antigenim i strukturnim karakteristikama i određuju klasu odnosno podklasu molekula imunoglobulina.
* *Dva laka lanca (L)*. Laki lanci su ili tipa *kapa* *(κ)* ili *lambda* *(λ)*.
Idući od onih kojih ima u najvećoj količini prema onima kojih ima najmanje, u krvi nalazimo pet vrsta (klasa) imunoglobulina: IgG, IgA, IgM, IgD i IgE.

Distribucija *(κ)* i *(λ)* lanaca razlikuje se između različitih životinjskih vrsta kao i kod svih imunoglobulinskih klasa i podklasa Lanci su međusobno povezani kovalnetnim disulfidnim
mostovima (L lanci sa H i H lanac sa H lancem), što dopunski povećava stabilnost
molekula imunoglobulina i same tercijarne strukture proteina.

Od pet klasa imunoglobulina u imunohistohemijskim analizama najzastupljeniji su i najčešće se koriste IgG i IgM.
* *Poliklonska antitela* nastaju imunizacijom životinje jednim antigenom. Ona prepoznaju više različitih epitopa istovetnog antigena. U antiseruma imunizovane životinje pored antitela na taj antigen postoje nespecifična antitela koja treba ukloniti jer reaguju sa tkivnim antigenima i uzrokuju nespecifično bojenje pozadine.
* *Monoklonska antitela* nastaju iz hibridoma, ćelije nastale spajanjem mišje ili zečje plazmocitomske ćelije i B limfocita iz slezine imunizovane životinje iste vrste.
Iz mnogobrojnih hiridomskih klonova izoluje se klon koji produkuje traženo specifično antitelo i odrasta u kulturi ćelija ili ascitesu. Ćelije jednog klona proizvode čisto, monospecifično antitelo koje prepoznaje samo jedan epitop nekog antigena. Monoklonska antitela su manje osetljiva, ali zato specifičnija od poliklonskih. Zato je za uspostavljanje reproduktabilnosti metode potrebna u svakom bojenju pozitivna kontrola kao potvrda da su svi reagensi pravilno upotrebljni.

## Primena imunohistohemije



## Imunohistohemijske metode i tehnike
Imunohistohemijske metode zasnivaju se na analizi:
* *rutinski obrađenih, u parafin uklopljenih, uzorkovanih preseka tkiva*
* *krio isečaka - nativnih trenutno zamrznutih delova tkiva*
* *ćelijskih razmaza odnosno suspenzije*

Imunohistohemijske tehnike međusobno se razlikuju prema:
* *Primenljivosti određene tehnike na parafinske ili na nativne (krio.zamrznute) isečke*.
* *Broju primenjenih slojeva antitela*.
* *Obeleživaču poslednjeg sloja*.
* *Po tome da li je primarni sloj monoklonski ili poliklonski*.

## Izvori
# Novaković Z, Katić-Radivojević S, Todorović V. *Primena imunohistohemijskih metoda u dijagnostici sarkocistioze goveda.* Veterinarski glasnik. 2006; 60(3-4):175-186.
# Osborn, M., Isenberg, S. (1998) *Immunocytochemistry of frozen and of paraffin tissue sections.* u: Cells J.E. (ur.) Cell Biology, San Diego, California: Academic Press, 2. str. 486–492
# Shi, S., Cote, R.J., Young, L.L., Taylor, C.R. (1997) *Antigen retrieval immunohistochemistry: Practice and development. Journal of Histotechnology*, 20(2): 145-154
# Immunocytochemistry Methods and Protocols. Edited by Lorette C. Javois, 2nd edition, 1999. Human Press.
# Immunofluorescence Labeling of Cells (Sigma-Aldrich)
# Stephen B. Howell Lab Protocol – Immunocytochemistry 
# Spector Lab Protocol - Immunofluorescence Technique.
# Immunofluorescence on Cultured Cells (University of London)  
# The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies - (11th Edition)
# Beesley, J.E. (1989) *Colloidal gold: A new perspective for cytochemical marking.* Royal Microscopy Handbook #17. Oxford Univ. Press. pp 48.
# Blose, S.H. & Feramisco, J.R. (1983) *Fluorescent methods in the analysis of cell structure.* Cold Spring Harbour Laboratory.
# Fujiwara, K. & Pollard, T.D. (1976) *Fluorescent antibody localization of myosin in the cytoplasm, cleavage furrow, and mitotic spindle of human cells.* J. Cell Biol. 71, 848-875.
# McBeath, E. & Fujiwara, K. (1984) *Improved fixation for immunofluorescence microscopy using light-activated 1,3,5-triazido-2,4,6-trinitrobenzene (TTB).* J. Cell Biol. 99, 2061-2073.
# Richman, D.D., Cleveland, P.H., Oxman, M.N., & Johnson, K.M. (1982) *The binding of Staphylococcal protein A by the sera of different animal species*. J. Immunol. 128, 2300-2305.
# Savage, M.D., Mattson, G., Desai, S., Nielander, G.W., Morgensen, S., & Conklin, E.J. (1992) *Avidin-Biotin Chemistry: A handbook.* Pierce Chemical Company. pp 467.
# Wang, K., Feramisco, J., & Ash, J. (1982) *Fluorescent localization of contractile proteins in tissue culture cells.* In: Methods in Enzymology 85, 514-562.

## Vanjske veze
* Overview of Immunohistochemistry--describes all aspects of IHC including sample prep, staining and troubleshooting 
* Yale Core Tissue Microarray Facility
* Histochemical Staining Methods - University of Rochester Department of Pathology
* Immunohistochemistry Staining Protocol 
* 
*