Hibridizacija nukleinskih kiselina

U molekulskoj biologiji, **hibridizacija**  je fenomen u kojem se jednostruki polulanci molekula dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) ili ribonukleinske kiseline (RNK) različitog porijekla međusobno ostvaruju komplementarne veze, stvarajući kombiniranu DNK ili RNK- Iako je dvostruka DNK sekvenca, u  fiziološkim uvjetima, uglavnom stabila, promjena uvjeta u laboratoriji (uglavnom podizanjem temperature okoline) će uzrokovati da se molekule rastaviti na jednostruke niti. Te niti su, naravno,  komplementarne jedna drugoj, ali mogu biti komplementarne i za druge sekvence koje su prisutne u njihovom u okruženju. Spuštanje okolne temperature omogućuje molekulama jednostrukih lanaca da se komplementarno  "ukrste", tj. hibridiziraju.

Replikacija DNK i transkripcija DNK u  RNK se oslanjaju na hibridizaciju  nukleotida,  pogodnim tehnikama molekularne biologije, uključujući Southern blotove i Northern blotove,  u polimeraznoj lančanoj reakciji (PCR) u većini pristupa sekvenciranju DNK. 
## Primjena
Hibridizacije je osnovno svojstvo nukleotidnih sekvenci i ima prednost u brojnim tehnikama molekularne biologije. Ukupna genetička srodnost dvije vrste može se odrediti hibridizacijom segmeata njihove DNK (DNK-DNK hibridizacija). Ako se pokušavaju hibridizirati  sličnije sekvenca (srodnički usko povezanih organizama), potrebne su više temperature za razdvajanje polulanaca DNK, u odnosu na nesrodnije sekvence. Koristi se mnoštvo različitih metoda hibridizacije koje mogu ukazati na porijeklo uzoraka DNK, uključujući i polimeraznu lančanu reakciju (PCR).  Drugom tehnikom, kratke DNK sekvence su hibridizirane sa  ćelijskom iRNK za identificiranje ekspresije  gena. Farmaceutske kompanije istražuju korištenje *antisens* RNK da se vezuju za neželjene iRNK, sprečavajući ribosome za translaciju iRNK  u protein.
## DNK-DNK hibridizacija

**DNK–DNK hbridizacija** općenito se odnosi na molekularno-genetičku tehniku kojom se mjeri stepen genetičke sličnosti između kompariranih fondova DNK sekvenci.  Pritom se obično određuje međusobna genetička distanca organizama i/ili populacija. Široko se primijenjuje u filogeniji i taksonomiji. 
### Pincipi
Radioaktivno označena DNK jednog organizma se miješa  miješa s neoznačenom  DNK sa kojom seda se poredi. Mješavina se inkubira kako bi se omogućilo da DNK disocira na polulance  i ponovo izduži, te formira hibridni,  dvosttruki (dvolančani)  niz nukleotida  hibridne DNK. Hibridizirane sekvence sa visokim stepenom  sličnosti će se povezati čvršće, i zahtijevaju više  energije za  razdvajanje, tj.  one se razdvajaju kada se zagrijavaju na višoj temperaturi nego različitije sekvence. To je proces poznat kao "DNK stapanje" (eng. *DNK melting*).
Za procjenu profila stopljenje hibridizirane  DNK, dvostruki DNK je potrebno  stavitti u kolonu i smešu grijati  u postupnim malim koracima. Na svakom koraku, kolona spere; hibridne sekvence će se u jednom ciklusu spiralizirati i sprati sa  kolone. Temperature na kojima označena DNK silazi sa kolone odražavaju  količinu sličnosti između sekvenci (a samohibridizirajući  uzorak služi kao kontrola). Ovi rezultati se kombiniraju,  kako bi se utvrdio stupanj genetičke sličnosti između poređenih organizama.
### Denaturacija
Denaturacija DNK, također zvana i DNK  stapanje, je proces kojim dvolančana dezoksiribonukleinska kiselina odvija  i razdvaja u jednostruke (polu)niti  kidanjem hidrofobnih veza između baza. Oba termina se koriste da se označi  proces jer se javlja kada se mješavina grije, iako se "denaturacija" može odnositi i na odvajanje DNK izazvano hemikalijama kao što je  urea.

Proces DNK denaturacije može se koristiti za analizu nekih njenih  aspekata  DNK,  jer  je uparivanje baza citozin / guanin općenito snažnije od  spajanja para adenin / timin.  Iznos citozin-guanin u genomu ("GC sadržaj") može se procijeniti mjerenjem temperature na kojoj se genomska DNK stapa.   Više temperature su znak visokog sadržaja para G-C.

DNK denaturacija se također može koristiti za detekciju razlika između dvije DNK sekvence. DNK se zagrijava i denaturira u jednodtruko stanje, a zatim  se hladi kako bi se omogućilo da se niti  hibridiziraju.  Hibridna molekula se formira između sličnih sekvenci i bilo kakve razlike između tih sekvenci će rezultirati poremećajem uparivanja baza. Na genomskoj razini, metod se koristi  za procjenu genetičke udaljenosti  između dvoje vrste, što je proces poznat kao DNK-DNK hibridizacija.

U kontekstu jedne izolirane regije DNK, gradijent denaturacije gelova i temperaturni gradijent gelova se mogu koristiti za otkrivanje prisutnosti malih neusklađenosti između dva niza, što je proces poznat kao temperaturni gradijent gel elektroforeze.

Metode DNK analize  koje su  zasnovana na temperaturi topljenja imaju nedostatak  što za proučavanje služi osnovna sekvencaslijed. Uobičajeno je da se sekvenciranje DNK smatra preciznijom  metodom.

Process DNK stapanja se također koristi u tehnikama molekulske biologije, posebno u  lančanoj reakciji polimeraze. Iako temperatura stapanja DNK nije  određujuća u ovoj tehnici, metode za procjenu * T* m  su važne za određivanje odgovarajuće temperature za primjenu  u određenom protokolu. Temperatura DNK  stapanja („meltinga“) može se koristiti i kao prednost za izjednačavanje  hibridizacijskih  strana skupa molekula, npr.  oligonukleotidne  sonde DNK mikronizova.
***Faktori koji utiču na denaturaciju**

### Izduživanje
*Aniling*, u genetici, sredstvo za komplementarnost  sekvenci  jednostrukog  DNK  (polulanca) ili RNK uparivanja  spreko  vodikovih veza do formiraju dvostrko usukanih polnukleotida. Termin se često koristi za opisivanje vezivanja DNK sonde  ili vezivanje  prajmer na DNK tokom lančane reakcije polimeraze (PCR). Pojam se često koristi  i za opisivanje reformacije (renaturalizacije nukleinskih kiselina) komplementarnih niti koje su toplinski denaturirane. U  tom procesu mogu pomoći proteini kao što su RAD52.

### Primjena u zoologiji
Kada se nekoliko vrsta komparira na taj način, mjere sličnosti dozvoljavaju da se rekonstruira  filogenetsko stablo. Zato je ovo jedan od mogućih pristupa istraživanju molekularne biosistematike. Charles Sibley i Jon Ahlquist, pioniri ove tehnike, koristili su  DNK-DNK hibridizaciju da ispitaju filogenetske odnose u  Sibley-Ahlquist taksonomiji ptica i Sibley-Ahlquist taksonomiji  primata.

### Primjena u mikrobiologiji
DNK-DNK hibridizacije je zlatni standard za razlikovanje bakterijskih vrsta, kada  vrijednost sličnosti manja od 70%  ukazuje da poređeni sojevi pripadaju posebnim  vrstama.

U 2014. godini,  kao prag sličnosti od 79% je predložen za razdvajanje bakterijskih podvrsta * Escherichia coli *,  kao i prijedlog za razgraničavanje podvrsta ostalih mikroba.

## Fluorescentna  ''in situ'' hibridizacija
Fluorescentna  *in situ* hibridizacija (FISH) ije laboratorijski metod koji se upotrebljava za detekciju i lociranje DNK sekvence, često na pojedinom hromosomu.

Istraživači Joseph Gall i Mary Lou Pardue otkrili su u 1960.  Da se molekulska hibridizacija  može koristiti za identifikaciju DNK sekvenci položaju  *in situ* (tj. u njihovom prirodnom pozicijama unutar hromosoma). U  1969., dva naučnika su objavili rad koji  pokazuje da radioaktivne kopija ribosomske DNK  sekvence može  koristiti za otkrivanje komplementarne DNK sekvence u jezgru žabljeg jajeta. Od tih originalnih zapažanja, veoma  su poboljšana i  povećana svestranost i osjetljivost postupka u toj mjeri da  se *in situ* hibridizacija danas smatra bitnim alatom u citogenetici.
## Dvofazni model termodinamike
Za proračun vrijednosti  *T<sub>m</sub>*  primjenjuje se nekoliko formula.
Za  DNK oligonukleotidee, tj. kratke sekvence  DNK, termodinamika hibridizacije se može tačno odrediti kao dvostepeni proces.  U ovoj aproksimaciji jedan zanemaruje mogućnost intermedijarnih parcijalnih obavezujuće faza u formiranju stanja dvostruke  niti od dva odvojena uvijena oligonukleotida. Prema ovoj pretpostavci,  mogu se elegantno opisati termodinamički parametari za formiranje dvolančane nukleinske kiseline AB iz jednolančanih  nizova  nukleinskih kiselina A i B.
:AB ↔ A + B
Ravnotežna konstanta za ovu reakciju je  K=\frac{[A][B]}{[AB]}.  Suglasno Van´t Hoff ovoj jednadžbi, relacija između slobodne energije,  Δ*G* i *K* is Δ*G°* = -*RT*ln *K*,  gdje je *R*  idealni zakon plinske konstante, a * T * je Kelvinska  temperatura reakcije.  Za sistem nukleinske kiseline, to daje:
\Delta G^\circ = -RT\ln\frac{[A][B]}{[AB]}.

Temperatura stapanja, *T*m, javlja se kada polovina dvostruko lančane  nukleinske kiseline disocira.  Ako nisu prisutne dodatne nukleinske kiseline, tada će  [A], [B], i  [AB] biti jednake i izjednačene sa inicijalnom koncentracijo  dvolančane nukleinske kiseline [AB]inicijalno.  To se ispoljava kao stapajuća tačku jednog  dupleksa nukleinske  kiseline: 
T_m = -\frac{\Delta G^\circ}{R\ln\frac{[AB]_{inicijalno}}{2}}.

Jer  Δ*G*° = Δ*H*° -*T*Δ*S*°, *T*m je također dat prema:

T_m = \frac{\Delta H^\circ}{\Delta S^\circ-R\ln\frac{[AB]_{inicijalno}}{2}}.

Oznake  Δ*H*° i  Δ*S*°  s obično date za asocijaciju a ne disocijacijsku reakciju. Ova formula tada prelazi u:

T_m = \frac{\Delta H^\circ}{\Delta S^\circ+R\ln([A]_{ukupno} - [B]_{ukupno}/2)}, gdje je [B]ukupno ukupno.

Kao što je pomenuto, ova jednadžba se temelji na pretpostavci da su u stapljenje uključene samo dvije faze: dvostruka zavojnica slučajna zavojnica. Međutim, nukleinska  kiselina se može stopiti i preko nekoliko intermedijarnih faza. Za računanje u  takvim slučajevima moraju se koristiti  komplikovane metode statističke mehanone, što je posebno relevantno za duge sekvence.

## Procjena termodinamskih svojstava  sekvenci nukleinskih kiselina
Prethodni podaci  pokazuju kakav je međuodnos temperatura stapanja i termodinamičkih parametara (Δ*G* ° ili Δ*H * ° i Δ *S*°). Posmatranjem temperature stapanja mogu se eksperimentalno odrediti termodinamički  parametari. *Vice versa*, i važni za aplikaciju, kada su poznati termodinamički parametri  date sekvence nukleinske kiseline, može se predvidjeti temperatura stapanja. Ispostavilo se da se,  za oligonukleotide, ti parametri mogu dobro aproksimirati modelom  najbližeg susjeda.
### Metod najbližeg susjeda (''nearest-neighbor'' metod)
Interakcija između baza na različitim nitima onekle  ovisi osusjednoj  baz. Umjesto tretiranja DNK spirale kao niza  interakcija između parova baza, model najbližeg susjeda tretira DNAK spiralu kao niz interakcija između 'susjednih' parova baza.  Tako, na primjer,  slijedeća DNK   ima najbližeg susjeda interakcije koji je prikazan strelicama.
:**↓↓↓↓↓** 
:  5 **C-G-T-T-G-A** 3
:  3 **[[genbio|G-C-A-A-C-T]]** 5
Slobodne energije formiraju  ove DNK iz pojedinačnih niti, Δ*G*°, predstavljeni su (na 37°C), kao:
Δ*G*°37(predikcija) = Δ*G*°37(CG inicijacija) + Δ*G*°37(CG/GC) + Δ*G*°37(GT/CA) + Δ*G*°37(TT/AA) + Δ*G*°37(TG/AC) + Δ*G*°37(GA/CT) + Δ*G*°37(AT inicijacija)

Prvi termin predstavlja energiju prvog baznog para,  CG,  u odsustvu najbližeg susjeda, Drugi termin uključuje obje slobodne energije formacije drugog baznog para, GC, interakcije slaganja između ova bazna para i prethodnog baznog para. Preostali termini su definirani na sličan način. U principu, slobodne energije formiranja  dvostrukih nukleinskih  kiselina  je:
\Delta G_{37}^\circ (\mathrm{ukupno}) = \Delta G_{37}^\circ (\mathrm{inicijacije}) + \sum_{i=1}^{10} n_i\Delta G_{37}^\circ (i).
Svaki  Δ*G*°  termin ima enhalpični, Δ*H*°  i entropijski, Δ *S*°, parametar, tako da promjena slobodne energije također data kao:
 \Delta G^\circ (\mathrm{ukupno}) = \Delta H_{\mathrm{ukupno}}^\circ - T\Delta S_{\mathrm{ukupno}}^\circ.

Vrijednosti Δ*H*° i Δ *S*° su određene za deset mogućih parova interakcije. Date su  u  narednoj tabeli, zajedno sa vrijednostima  Δ*G*° obračunatim  za 37°C. Koristeći ove vrijednosti, vrijednost Δ*G*37°, za DNK spirale prikazane iznad,  bile su -22.4 kJ/mol. Eksperimentalna vrijednost je -21.8 kJ /mol.

Parametri koji su povezani sa deset grupa susjeda  prikazani u u tabeli su određeni iz tački stapanja kratkih oligonukleotidnih  dupleksa. Zanimljivo je da ispada  da je nezavisno  samo osam od deset grupa.
Model najbližeg susjeda može se prodširiti izvan Watson-Crickovih  parova ukljujući parametre za interakcije  između neusklađenosti i susjednih baznih parova.

Ovo proističe iz procjene termodinamičkih parametara sekvenci koje sadrže izolirana neslaganja kao u onim lkoja su pokazana strelicama:
:↓↓↓
:5' **G-G-A-C-T-G-A-C-G** 3'
:3' **[[genbio|C-C-T-G-G-C-T-G-C]]** 5'

Ovi parametri su potvđeni eksperimentima  stapljanja i u  produžetku tabele koji uključuje neusklađenosti koje se mogu naći u literaturi.

Izgleda da je realniji način modeliranja ponašanja nukleinskih kiselina prema imati parametarima koji ovise o susjednim grupama na obje strane jednog nukleotida, dajući podlogu  sa stavke kao što su "TCG / AGC". Međutim, to bi značilo postojanje oko 32 grupe; brojni eksperimenati su  potrebni i značajni da se u tom pogledu nađu pouzdani podaci za toliko grupa. Zato što se predviđanja metoda najbližeg susjeda razložno slažu s eksperimentalnim rezultatima,  dodatni napori u razvoju drugačijih  modela ne mogu biti opravdani.

## Reference