DNA-metylering

**DNA-metylering** er den biokjemiske prosessen hvor en metylgruppe blir lagt til et DNA molekyl. Metylgruppen vil kunne endre hvordan DNA kommer til uttrykk, og dermed hvordan gener uttrykkes, uten at selve DNA-sekvensen blir endret. I pattedyr involverer mekanismen for DNA-metylering overføringen av en metylgruppe til C5-posisjonen av basen cytosin for å danne 5-metylcytosin (5mC). DNA-metylering er involvert i en rekke biologiske prosesser, blant annet reguleringen av genuttrykk, genomisk imprinting og deaktivering av X-kromosom. Den genetiske informasjonen imprintet i genene blir epigenetisk merket gjennom gametogenesen og videre overført til avkommet på en arvelig måte. All DNA-metylering katalyseres av en gruppe enzymer kalt DNA-metyltransferaser (DNMTs), som er essensielle for etableringen av DNA-metyleringsmønstre i fosterutviklingen og videre gjennom livet. Forstyrrelse i DNA-metylering, og funksjonen til DNMTs, er assosiert med ulike typer sykdomsutvikling. DNA-metylering er en del av en større studie kalt epigenetikk, og er hittil den mest studerte epigenetiske mekanismen. Andre epigenetiske mekanismer er histonmodifisering og ulike mekanismer tilknyttet mikro-RNA. Alle disse mekanismene utgjør en viktig rolle i pakkingen av DNA i cellekjernen, samt reguleringen av hvordan cellens gener kommer til uttrykk.

## Historie
DNA-metylering i pattedyr ble oppdaget samtidig som DNA ble identifisert som det genetiske materialet på midten av 1940-tallet. Selv om det lenge ble postulert at DNA-metylering kan regulere gen-ekspresjonen, var det ikke før på slutten av 1970-tallet og begynnelsen av 1980-tallet at DNA-metyleringens rolle i gen-ekspresjon ble vitenskapelig demonstrert. På veien til denne konklusjonen gjorde McGhee og Ginder i 1979 et forsøk hvor de sammenlignet DNA-metyleringsnivåene i celler som uttrykte og ikke-uttrykte genet for beta-globin. Studien konkluderte med at beta-globulin var umetylert i celler som uttrykte beta-globulin, men metylert i andre celletyper. Etter McGhee og Ginder sin publikasjon ble det også foretatt mer spesifikke eksperimenter på området, blant annet kan Jones og Taylors eksperimenter fra 1980 nevnes. Ved å bruke kjemikaliet 5-azacytidine som inhiberer effekten av DNA metyltransferase-enzymer, kunne de se på de genetiske effektene ved å inhibere metylering av gen-ekspresjon på celler fra mus.

## DNA og metylering
Et DNA-molekyl (forkortet fra deoksyribonukleinsyre) er oppbygd av nukleotider bestående av en fosfatgruppe, et sukkermolekyl (deoksyribose) og en base. Det finnes fire ulike baser: Adenosin (A) og Guanin (G) som er puriner, og Thymidin (T) og Cytosin (C) som er pyrimidiner. Adenosin binder alltid til thymin, og guanin alltid til cytosin. Av disse fire basene er det kun cytosin og adenin som teoretisk kan bli metylert. DNA-metyltransferaser (DNMTs) er enzymer som katalyserer metyleringsprosessen. Ved hjelp av DNMTs katalyseres overføringen av en metylgruppe fra den universielle metyleringsdonoren S-adenosyl-L-metionine (SAM) til det femte karbonatomet til en cytosin residue (C5) for å danne 5-metylcytosine (5mC). Dette metylerte området blir ofte kalt et CpG-sete *(se avsnitt «CpG-øyer»).* Denne metylering-mekanismen er helt essensiell for den normale utviklingen hos pattedyr. Selv om alle celler i en flercellet organisme inneholder det samme DNA, blir ikke alle genene uttrykt likt i alle celler. Epigenetiske mekanismer kan forklare hvorfor det totale uttrykket av gener er så forskjellig i ulike typer celler og vev , og dermed for eksempel hvorfor «muskelceller» er forskjellige fra «hjerneceller». I somatiske celler vil 98% av DNA-metylering finne sted i et CpG-sete, mens 1/4 av all DNA-metylering i stamceller (fra embryo) vil foregå utenfor slike områder.

## DNA-metyltransferaser (DNMTs)
DNA-metyltransferaser (DNMTs) står for essensielle funksjoner i pattedyrceller ved å både opprettholde DNA-metylering og gjennomføre *de novo-*metylering. Det er hittil identifisert fire ulike klasser DNMTs, hvor hver klasse utfører sin spesifikke funksjon: DNMT1, DNMT3A, DNMT3B og DNMT3L. DNMT1, DNMT3A og DNMT3B er aktive på DNA, mens DNMT3L ikke har noen kjent iboende enzymatisk aktivitet. Tidligere ble også DNMT2 regnet for å være en av DNA-metyltransferase-enzymene, men det har vist seg at dette enzymet ikke metylerer DNA. Enzymet DNMT1 står for opprettholdelsen av DNA-metyleringen, og vil dermed sørge for at DNA-metyleringsmønsteret blir overført helt presist til DNA-kopier i datterceller etter en replikasjonssyklus. DNMT3A og DNMT3B står for *de novo-*metylering. Selv om inndelingen av de novo og opprettholdelse av DNA-metylering har vært mye brukt, antyder en rekke studier at det er et betydelig funksjonelt overlapp mellom disse to prosessene.

Prinsippet som frembringes av funksjonen til DNMT1, at DNA-metyleringsmønsteret er stabilt gjennom mange cellegenerasjoner etter hverandre, kan bli sett på som en form for cellulær hukommelse . Derfor blir ofte DNA-metylering sett på som en viktig mekanisme for epigenetisk arv. På den andre siden er ikke disse epigenetiske modifikasjonene permanente. Det er kjent at de kan endres både både av iboende faktorer og eksterne faktorer/miljøpåvirkning. Slike iboende faktorer kan være hormoner, vekstfaktorer og elektriske nerveimpulser, mens eksterne faktorer kan være legemidler, røyking, stress og traumer, trening, diett og miljøgifter. DNA-metylering varierer ikke bare ut ifra hvilke celler de er uttrykt i, men også ut ifra cellens utviklingsstadier og tid på døgnet.

Selv om defekter i DNA-metylering er assosiert med kreft, har ingen mutasjoner eller mangler av DNMT hittil blitt identifisert som en kausal årsak for kreftutvikling. Det er antatt at dette henger sammen med den kritiske nødvendigheten av DNMTs i fosterutviklingen. Dette er for eksempel vist i mudemodeller. I mus hvor begge allelene av DNMT1 var tatt bort, levde ikke muse-embyoene lenger enn til dag E9.

## CpG-øyer
CpG er kort for *5'-C-Phosphate-G-3*', som er steder i DNA-strukturen hvor cytosin er etterfulgt av guanin, bare separert av en fosfat-gruppe som alltid separerer basene. Dette skjer i 5' → 3' retningen av DNA-meolekylet, og en slik spesifikk struktur i arvestoffet blir ofte kalt et CpG-sete. CpG-seter er spredt over hele genomet og er mest studert i områder kalt CpG-øyer (eng: CpG islands). CpG-øyer er betegnelsen på steder hvor det finnes særlig mange CpG-seter etter hverandre, og er oftest lokalisert i områder nær gener, nærmere presist oppstrøms for en gen-promoter. CpG-øyene er, i motsetning til CpG-setene, oftest metyleringsfrie som ivaretas av enkelte transkripsjonsfaktorer. Dersom en CpG-øy er metylert betyr dette som oftest, men ikke utelukkende, at genet er skrudd av. Man tror derfor at de ikke-metylerte CpG-øyene fremmer uttrykket av gener, som aktiveres av at en transkripsjonsfaktor binder seg til det CpG-rike transkripsjonsstartstedet. Det er estimert at ca 70% av alle gen-promotere er lokalisert innenfor slike CpG-tette områder. CpG-øyene har følgende definisjonskriterier: områdene er >200 bp (basepar) lange, de består av over 50% GC og ratioet mellom CpG dinukleotider er over 0.6. I nær lokalisasjon til CpG-øyene, finner man områder med høy tetthet av CpG-seter som gir vevsspesifikke metyleringsmønstre. Dette er steder hvor de største metyleringsforskjellene mellom ulike vev finnes, også mellom friskt vev og for eksempel kreftvev. Genomet til pattedyr uttrykker et særlig høyt nivå av CpG-metylering, og selv om det er noen vevsspesifikke forskjeller, er 70-80% av CpG-seter metylert . CpG blir ofte brukt i genetiske studier som en markør for endring i en organisme. DNA-metylering skjer i hovedsak på palidrome CpG-øyer i pattedyr, men det har også blitt observert utenom disse områdene.

CpG-øyers endringer i DNA-methylering spiller en nøkkelrolle under gametogenesen og fosterutviklingen. Selv om et avkom har fått like mye genetisk materiale fra mor som fra far, et kromosom fra hver, vil ikke dette nødvendigvis bety at gener fra mor og far blir like mye uttrykt. Ofte vil bare ett gen, enten fra kromosomet fra far eller kromosomet fra mor, komme til uttrykk i avkommet. Denne mekanismen er kalt imprinting.                        
                        
CpG forkortelsen må ikke forveksles med CG-forkortelsen. CpG betyr at cytosin følger guanin på en enkel DNA tråd, mens CG betyr at basene danner base-par på en dobbeltrådet DNA-molekyl.

## Differensielt metylerte regioner (DMRs)
Når det har skjedd enkeltendringer i et CpG-sete, kaller man dette en differensielt metylert posisjon eller DMPs (eng.: Different Methylated Positions). Videre, når det finnes områder i DNA hvor det mellom flere CpG-seter er statistisk signifikante forskjeller i DNA-metyleringsmønsteret, kaller man dette differensielt metylerte regioner (eng.: Differentially Methylated Regions) eller DMRs. Slike områder i DNA kan finnes spredd utover hele genomet, men det kan finnes særlig rundt gen-promotere og områder mellom gener bestående av ikke-kodende DNA (eng.: intergenic regulatory regions) . DMRs kan være spesifikke for vev, celler og individer. Man tror også at DMRs kan bli brukt som fremtidige biomarkører og spille en nøkkelrolle i terapi rettet mot epigenetiske endringer.

## DNA-metylering og sykdomsutvikling
Endringer i DNA-metylering er assosiert med utvikling av en heterogen gruppe sykdommer . Dette involverer blant annet kreft , sykdommer relatert til genomisk imprinting, nevrologiske sykdommer og kardiovaskulære sykdommer , autoimmune sykdommer , metabolske sykdommer  såvel som aldringsprosessen .

### Sykdommer relatert til genomisk imprinting
DNA-metylerings rolle i sykdomsutvikling ble initielt forsket på i konteksten av genomisk imprinting (også kalt genomisk pregning) . Genomisk imprinting er et epigenetisk fenomen som legger til grunn den genetiske variansen som kan oppstå ved at et gen enten er nedarvet fra far eller fra mor. Dette er mekanismer som er stabile og arvelige gjennom mitose . Selv om imprinting forekommer naturlig, er det likedan en sentral mekanisme i forståelsen av enkelte typer sykdommer. Mange gener har man både fått en kopi fra mor og en kopi fra far, slik at man har to forskjellige kopier av samme gen, som man kaller et diploid gen. Derimot når det skjer imprinting, vil bare den ene kopien av genet bli uttrykt. Det er som om genet er haploid. Dette gjør genomet svært sårbart om det har skjedd en mutasjon. Tap av imprinting i paternelt arvelig kromosom 15q11.2-q13 er observert i Prader-Willi Syndrom . Likedan vil tap av denne genomiske regionen være bakgrunn for Angelman Syndrom .

### Nevrologiske sykdommer
Sammenhengen mellom nevrologi og metylering ble først foreslått da hyppige mutasjoner i MeCP2-genet ble observert i pasienter med en diagnose i autisme spektrumet  og Rett Syndrom . MeCP2-genet er kort for metyl-CpG-bindende protein 2, og binder til DNA sekvenser med metylert CpG og metylert CH (hvor H refererer til en A, C eller T). Patofysiologien bak disse sykdommene har blitt foreslått forklart ut ifra den endrede MeCP2 bindingsaktiviteten til metylert DNA som igjen vil kunne påvirke reguleringen av genekspresjonen. Eksempel på et slik gen man tror kan være en brikke i sykdommenes sykdomsmekanisme, er BDNF (brain derived neurotrophic factor)  som spiller en viktig rolle i synaptisk aktivitet *.* Studier som ser på hele genomet under ett (Genome-Wide Association Studies eller GWAS), har vist til en signifiant sammenheng mellom differensiert metylerte posisjoner (DMPs) og Parkinsons sykdom . DNA-metylerings rolle i utviklingen av mentale lidelser, får stadig større oppmerksomhet. I pasienter med schizofreni, fant man lavere metyleringsnivå av catechol-O-metyl transferase i perifert blod, sammenlignet med kontroller . Nivået av catechol-O-methyl transferase var korrelert med alvorligheten av de kliniske symptomene, samt den farmakologiske behandlingen pasienten brukte . Senere har teknologien utviklet seg raskt til å kunne studere DNA-metylering med økende sensitivitet og studere økende antall CpG-seter samtidig . Den første studien som tok i bruk et studiedesign som kunne se på DNA-metylering under ett i pasienter med schizofreni, ble publisert i 2008 av *Mill et al*.. I ettertid har flere studier fulgt etter med identifiseringen av en rekke differensiert methylerte posisjoner (DMPs) assosiert med schizofreni, men metodologisk heterogenitet i studier har ført til et lavt antall replikasjoner av studieresultat, selv om det finnes det noe overlapp mellom studier . Andre utfordringer og svakheter ved de fleste studier gjort på dette området er bruken av surrogatvev (for eksempel bruken av blodprøver i stedet for vevsprøver fra hjerne), og små størrelser på forsøksmaterialet. For å validere disse funnene ytterligere, takes det i større grad bruk store biobanker med store datamaterialer tilgjengelig.

### Kreft
Epigenetiske endringer blir antatt å være blant de mest omfattende genomiske avvikende som forekommer under utviklingen av kreftceller (karsiogenese). Det er kjent at profilen av DNA-metylering er unormal i alle former for kreft, men hvordan dette skjer, og hvilken rolle det har i utviklingen er lite forstått . Assosiasjonen mellom uvanlig DNA-metylering og kreft har både blitt antatt å involvere lokalisering til spesifikke imprintede loci såvel som differensiert metylerte regioner (DMRs) detektert av omics-teknologi . I tillegg til dette har endringer i DNMTs, inkludert mutasjoner og unormale uttrykksnivå av enzymene, blitt ofte observert i kreft . Endringene i kreftcellene er karakterisert av global hypometylering av genomet, med fokale hypermetyleringer på flere CpG-øyer . Identifiseringen av de kvantitative endringene i genuttrykk, forårsaket av epigenetiske modifikasjoner (inkludert DNA-metylering) og dets relasjon til utviklingen og progresjonen av kreft, kan bli sett på som ett av de største gjennombruddene i kreftbiologi de siste to tiårene .

### Aldring
Aldring er en naturlig biologisk prosess, men det kan også biologisk klassifiseres som en sykdom. Endringer i DNA-metylering er godt korrelert med aldring, og metylering av spesifikke steder på DNA (spesifikke loci) har blitt brukt til å predikere alder i en rekke ulike vev. I 2013 viste *Horvath et al* i en studie at nivået av DNA-metylering ved 353 CpG-seter kunne danne et godt estimat for biologisk alder i vev og individer . Dette har også blitt kalt en epigenetisk klokke (eng.: epigenetic clock) - en aldersprediktiv epigenetikk model for å kalkulere kronologisk aldring. Sammenlignet med kontroller, har man funnet akselerert DNA-metyleringsalder i individer med sykdommer som for eksempel Parkinsons sykdom  og Alzheimers sykdom . Denne forskningen støtter oppom antagelsen av at DNA-metylering ikke bare kan bli sett på som en biomarkør for aldring, men også kan være relatert til den patologiske prosessen til aldring i seg selv . Likevel er de underliggende mekanismene for modellene lite kjente, og det kreves mer forskning for å forstå hva som ligger til grunn for modellene.

## Teknologi og forskning
For å undersøke endringer i epigenomet, og spesifikt DNA-metylering, utgjør Epigenome-Wide Association Studies (EWAS), den beste teknologien per i dag. Dette er en metode som inkluderer hel-genom sekvensering og DNA-mikomatrise-teknologi. Etter innsikten i at DNA-metylering utgjør en viktig rolle i mange vanlige sykdommer, har forskning på området fått økende popularitet. En fellesnevner i forskningsområdet er håpet om at DNA-metylering kan fungere som en biomarkør i å detektere epigenetiske endringer assosiert med sykdomsstatus . Selv om epigenetiske epidemiologiske studier er lovende, finnes det en rekke utfordringer og svakheter på veien. Et svakhetspunkt er knyttet til at DNA-metylering er svært dynamisk. DNA-metylering kan bli påvirket av en rekke ulike ukjente og kjente faktorer som for eksempel etnisitet, kjønn, alder, røyking og kosthold . Alt dette, med mere, vil derfor være konfundere i studier som ser på DNA-metylering. Derfor må studiens design tenkes nøye igjennom. Andre utfordringer er knyttet til vanskeligheten med å kunne bruke vevsprøver fra det syke organet en vil studere. Mange studier tar derfor i bruk surrogatvev. Dette innebærer for eksempel å samle inn blodprøver i stedet for vevsprøver fra hjerne for å undersøke DNA-metylering i en gitt sykdom med patologi i hjernen, for eksempel schizofreni. I studier er en ofte interessert i å studere sammenhengen mellom DNA-metylering og sykdoms etiologi. En utfordring i denne sammenheng er at DNA-metylering kan bli påvirket av sykdommen i seg selv, og man må derfor kunne klare å skille dette fra biologien bak sykdommen .

## Referanser