Væskekromatografi–massespektrometri

**Væskekromatografi–massespektrometri** (**LC-MS**) er en analytisk kjemiteknikk som kombinerer de fysiske separasjonsegenskapene til væskekromatografi (eller HPLC) med masseanalysefunksjonene til massespektrometri (MS). Koblet kromatografi - MS-systemer er populære i kjemisk analyse fordi de individuelle egenskapene til hver teknikk forbedres synergistisk. Mens væskekromatografi skiller blandinger med flere komponenter, gir massespektrometri strukturell identitet til de enkelte komponentene med høy molekylær spesifisitet og deteksjonsfølsomhet. Denne tandemteknikken kan brukes til å analysere biokjemiske, organiske og uorganiske forbindelser som ofte finnes i komplekse prøver av miljø og biologisk opprinnelse. Derfor kan LC-MS brukes i et bredt spekter av sektorer, inkludert bioteknologi, miljøovervåking, næringsmiddelindustri og farmasøytisk, agrokjemisk og kosmetisk industri.

I tillegg til væskekromatografi og massespektrometriinnretninger inneholder et LC-MS-system et grensesnitt som effektivt overfører de separerte komponentene fra LC-kolonnen til MS-ionekilden. Grensesnittet er nødvendig fordi LC- og MS-enhetene i utgangspunktet er inkompatible. Mens den mobile fasen i et LC-system er en væske under trykk, opererer MS-analysatorene ofte under høyt vakuum (rundt 10−6 Torr). Det er således ikke mulig å pumpe direkte eluatet direkte fra LC-kolonnen. Generelt er grensesnittet en mekanisk enkel del av LC-MS-systemet som overfører maksimal mengde analytt, fjerner en betydelig del av den mobile fasen som brukes i LC og bevarer den kjemiske identiteten til kromatografiproduktene (kjemisk inert). Som et krav skal grensesnittet ikke forstyrre ioniseringseffektiviteten og vakuumforholdene til MS-systemet. I dag er de mest omfattende anvendte LC-MS-grensesnittene basert på strategier for atmosfærisk trykkionisering (API) som elektrosprayionisering ( ESI), kjemisk ionisering ved atmosfærisk trykk (APCI) og fotojonisering i atmosfæretrykk (APPI). Disse grensesnittene ble tilgjengelige på 1990-tallet etter en to tiårs lang forsknings- og utviklingsprosess.

## Historien til LC-MS
Koblingen av kromatografi med MS er en velutviklet strategi for kjemisk analyse fra 1950-tallet. Gasskromatografi (GC)–MS ble opprinnelig introdusert i 1952, da A. T. James og A. J. P. Martin prøvde å utvikle teknikker for tandemseparasjon-masseanalyse. I GC elueres analyttene fra separasjonskolonnen som en gass, og forbindelsen med elektronionisering (EI) eller kjemisk ionisering (CI) ionekilder i MS-systemet var en teknisk enklere utfordring. På grunn av dette var utviklingen av GC-MS-systemer raskere enn LC-MS, og slike systemer ble først kommersialisert på 1970-tallet. Utviklingen av LC-MS-systemer tok lengre tid enn GC-MS og var direkte relatert til utviklingen av riktige grensesnitt. V. L. Tal'roze og samarbeidspartnere startet utviklingen av LC-MS tidlig på 1970-tallet, da de først brukte kapillærer for å koble LC-kolonner og MS-ionekilder. En lignende strategi ble undersøkt av McLafferty og samarbeidspartnere i 1973. Dette var den første og mest åpenbare måten å koble LC til MS, og var kjent som kapillærinnløpsgrensesnittet. Dette pionergrensesnittet for LC-MS hadde de samme analysefunksjonene som GC-MS og var begrenset til ganske flyktige analytter og ikke-polære forbindelser med lav molekylvekt (under 400 Da). I kapillærinnløpsgrensesnittet var fordampningen av mobilfasen inne i kapillæren et av hovedproblemene. I løpet av de første årene av utviklingen av LC-MS, ble online- og offlinealternativer foreslått som koblingsalternativer. Generelt involverte offlinekobling fraksjonssamling, fordampning av løsemiddel og overføring av analytter til MS ved bruk av sonder. Offline analysebehandlingsprosessen var tidkrevende, og det var en iboende risiko for prøveforurensning. Raskt ble det innsett at analysen av komplekse blandinger ville kreve utvikling av en helautomatisk online koblingsløsning i LC-MS.

### Grensesnitt med belte
Moving-belt interface (MBI) ble utviklet i 1977. Dette grensesnittet besto av et endeløst bevegelige belte som mottok LC-kolonneutløpet. På beltet ble løsningsmidlet fordampet ved forsiktig oppvarming og effektivt uttømming av løsemiddeldampene under redusert trykk i to vakuumkamre. Etter å ha fjernet væskefasen, ville analytene desorbere fra beltet og migrere til MS-ionekilden som skal analyseres. MBI ble vellykket brukt til LC-MS-applikasjoner mellom 1978 og 1990 fordi det tillot kobling av LC til MS-enheter ved bruk av EI-, CI- og FAB-ionekilder. De vanligste MS-systemene koblet med MBI-grensesnitt til LC-kolonner var magnetiske sektorer og kvadropoler. MBI-grensesnitt for LC-MS tillot at MS ble brukt mye i analysen av medisiner, plantevernmidler, steroider, alkaloider og polysykliske aromatiske hydrokarboner. Dette grensesnittet brukes ikke lenger på grunn av dets mekaniske kompleksitet og vanskelighetene forbundet med fornyelse av beltet. Partikkelstrålegrensesnitt overtok de store anvendelsene av MBI for LC-MS i 1988.

### Grensesnitt med direkte innføring av væske
Det direkte væskeinnføringsgrensesnittet (DLI fra engelsk  direct liquid introduction) ble utviklet i 1980. Dette grensesnittet ble tenkt som en løsning på fordampning av væske inne i kapillærinnløpsgrensesnittet. I DLI ble en forstøver brukt til å oppløse en del av utflytende som kommer fra kolonnen. En liten membran ble brukt til å danne en flytende stråle sammensatt av små dråper som deretter ble tørket i et desolvasjonskammer.et En kapillær kolonne med mikrohull ble brukt til å overføre det forstøvede flytende produktet til MS-ionekilden. Analyttene ble ionisert ved hjelp av en løsningsmiddelassistert kjemisk ioniseringskilde, der LC-løsningsmidlene fungerte som reagensgasser. For å bruke dette grensesnittet var det nødvendig å dele strømmen som kom ut av LC-kolonnen fordi bare en liten del av avløpet (10 til 50 µl/min av 1 ml/min) kunne analyseres online uten å bryte MS vakuumet. Et av de viktigste driftsproblemene med DLI-grensesnittet var hyppig tilstopping av membranåpningene. DLI-grensesnittet ble brukt mellom 1982 og 1985 for analyse av plantevernmidler, kortikosteroider, metabolitter i hest urin, erytromycin og vitamin B12. Imidlertid ble dette grensesnittet erstattet av termospraygrensesnittet, som fjernet strømningshastighetsbegrensningene og problemene med tette membraner.

### Grensesnitt med termospray
Termospray-grensesnittet (TSP) ble utviklet i 1983 av Vestal-laboratorier ved University of Houston. Grensesnittet skyldes et langsiktig forskningsprosjekt ment å finne et LC-MS-grensesnitt som er i stand til å håndtere høye strømningshastigheter (1 ml/min) og unngå strømningsdelingen i DLI-grensesnitt. TSP-grensesnittet ble sammensatt av en oppvarmet sonde, et oppløsningskammer og en ionebytterskimmer. LC-utflytende passerte gjennom den oppvarmede sonden og dukket opp som en dampstråle og små dråper som strømmer inn i oppløsningskammeret ved lavt trykk. Ioniseringen av oppløste stoffer skjedde ved direkte fordampning eller ion-molekylreaksjoner indusert av løsningsmidlet. Dette grensesnittet var i stand til å håndtere opptil 2 ml/min eluat fra LC-kolonnen og ville effektivt introdusere det i MS-vakuumsystemet. TSP var også mer egnet for LC-MS applikasjoner som involverer reversert fase væskekromatografi (RT-LC). TSP-systemet hadde en dobbel funksjon som fungerte som et grensesnitt og en løsemiddel-mediert kjemisk ioniseringskilde. Med tiden ble TSPs mekaniske kompleksitet forenklet, og dette grensesnittet ble populært som det første ideelle LC-MS-grensesnittet for farmasøytiske applikasjoner som omfattet analyse av medisiner, metabolitter, konjugater, nukleosider, peptider, naturlige produkter og plantevernmidler. Innføringen av TSP markerte en betydelig forbedring for LC-MS-systemer og var det mest anvendte grensesnittet til begynnelsen av 1990-tallet, da det begynte å bli erstattet av grensesnitt som involverer ionisering ved atmosfærisk trykk (API).

### FAB-basert grensesnitt
Frit FAB og kontinuerlig flyt-FAB (CF-FAB) grensesnitt ble utviklet i henholdsvis 1985 og 1986. Begge grensesnittene var like, men de skilte seg ut ved at den første brukte en porøs fritsonde som tilkoblingskanal, mens CF-FAB brukte en sondespiss. Fra disse var CF-FAB mer vellykket som et LC-MS-grensesnitt og var nyttig for å analysere ikke-flyktige og termisk ubestandige forbindelser. I disse grensesnittene passerte LC-utløpet gjennom frit- eller CF-FAB-kanalene for å danne en jevn væskefilm ved spissen. Der ble væsken bombet med ionestråle eller høyenergi-atomer (hurtigatom). For stabil drift klarte de FAB-baserte grensesnittene å håndtere væskestrømningshastigheter på bare 1–15 µl og var også begrenset til mikroboring og kapillærsøyler. For å kunne brukes i FAB MS-ioniseringskilder, bør analysene av interesse blandes med en matrise (f.eks. Glyserol) som kan tilsettes før eller etter separasjonen i LC-kolonnen. FAB-baserte grensesnitt ble mye brukt for å karakterisere peptider, men mistet anvendeligheten med fremkomsten av elektrospraybaserte grensesnitt i 1988.

## Referanser