Urease

**Urease** () ialah enzim yang tergolong dalam superkeluarga amidohidrolase dan fosfotriterase. Urease ditemui dalam banyak bakteria, kulat, alga, tumbuhan, dan beberapa invertebrata, serta dalam tanah, sebagai enzim tanah. Ia merupakan metaloenzim yang mengandungi nikel dengan berat molekul tinggi.

Enzim ini memangkinkan hidrolisis urea kepada karbon dioksida dan ammonia:

: (NH2)2 CO + H2O  CO2 + 2 NH3

Hidrolisis urea berlaku dalam dua peringkat. Dalam peringkat pertama, ammonia dan asid karbamik dihasilkan. Karbamat secara spontan dan cepat terhidrolisis kepada ammonia dan asid karbonik. Aktiviti urease meningkatkan pH persekitarannya apabila ammonia dihasilkan, yang merupakan asas.

## Sejarah
Aktivitinya pertama kali dikenal pasti pada tahun 1876 oleh Frédéric Alphonse Musculus sebagai bahan tapai larut. Pada tahun 1926, James B. Sumner menunjukkan bahawa urease ialah protein dengan memeriksa bentuk terhablurnya. Kerja Sumner ialah demonstrasi pertama bahawa protein boleh berfungsi sebagai enzim, dan akhirnya membawa kepada pengiktirafan bahawa kebanyakan enzim sebenarnya ialah protein. Urease ialah enzim pertama yang dihablurkan. Untuk kerja ini, Sumner telah dianugerahkan hadiah Nobel dalam Kimia pada tahun 1946.  Struktur kristal urease pertama kali diselesaikan oleh PA Karplus pada tahun 1995.

## Struktur
Kajian 1984 yang memfokuskan pada urease daripada kacang jack mendapati bahawa tapak aktifnya mengandungi sepasang pusat nikel. Pengaktifan ''in vitro'' juga telah dicapai dengan mangan dan kobalt sebagai pengganti nikel. Garam plumbum merupakan perencat.

Jisim molekul adalah sama ada 480 atau 545 kDa bagi urease kacang jack (jisim berdasarkan jujukan asid amino). Ia memiliki 840 asid amino setiap molekul, di mana 90 daripadanya adalah sisa sisteina. 

pH optimum ialah 7.4 dan suhu optimum ialah 60&nbsp;°C. Substrat termasuk urea dan hidroksiurea.

Urease bakteria terdiri daripada tiga subunit berbeza, iaitu satu subunit pemangkin besar (α 60–76kDa) dan dua subunit kecil (β 8–21 kDa, γ 6–14 kDa) yang biasanya membentuk trimer (αβγ)3 stoikiometri dengan struktur simetri ganda dua (ambil perhatian bahawa imej di atas memberikan struktur unit asimetri, satu pertiga daripada susunan gabungan biologi sebenar), ia merupakan enzim yang kaya dengan sisteina, menghasilkan jisim molar enzim antara 190 dan 300 kDa.

Urease yang luar biasa diperolehi daripada *Helicobacter* sp.. Ini terdiri daripada dua subunit, α(26–31 kDa)-β(61–66 kDa). Subunit ini membentuk supramolekul kompleks dodekamer (αβ)12 subunit α-β berulang, dengan setiap pasangan subunit yang digabungkan mempunyai tapak aktif, dengan jumlah 12 tapak aktif. Ia memainkan fungsi penting dalam kelangsungan hidup dengan meneutralkan asid gastrik dengan membenarkan urea masuk ke dalam periplasma melalui saluran urea berpagaran proton. Kehadiran urease digunakan dalam diagnosis spesies *[[Helicobacter]]*.

Semua urease bakteria adalah semata-mata bersifat sitoplasma kecuali *Helicobacter pylori*, yang bersama-sama dengan aktiviti sitoplasmanya, mempunyai aktiviti luaran dengan sel perumah. Sebaliknya, semua urease tumbuhan hadir dalam sitoplasma.

Urease kulat dan tumbuhan terdiri daripada subunit yang sama (~90 kDa setiap satu), dengan jenis paling biasa dipasang sebagai trimer dan heksamer. Sebagai contoh, urease kacang jack mempunyai dua subunit struktur dan satu subunit pemangkin. Subunit α mengandungi tapak aktif yang terdiri daripada 840 asid amino setiap molekul (90 sisteina), dengan jisim molekulnya tanpa ion Ni(II) berjumlah 90.77 kDa. Jisim heksamer dengan 12 ion nikel ialah 545.34 kDa. Contoh lain struktur homoheksamer urease tumbuhan ialah enzim kacang soya, kacang merpati dan biji kapas.

Satu hal penting adalah meskipun ia terdiri daripada pelbagai jenis subunit, urease daripada sumber yang berbeza menjangkau daripada bakteria ke tumbuhan dan kulat mempamerkan homologi jujukan asid amino yang tinggi. Rantaian urease tumbuhan tunggal adalah bersamaan dengan organisasi γ-β-α yang bersatu. *Helicobacter* "α" adalah bersamaan dengan gabungan subunit γ-β bakteria biasa, manakala subunit "β"nya bersamaan dengan α bakteria biasa. Penyusunan rantai bertiga itu mungkin diwarisi.

## Aktiviti
*K*cat/*K*m urease dalam pemprosesan urea adalah 1014 kali lebih besar daripada kadar tindak balas penyingkiran tidak bermangkin urea. Terdapat banyak sebab pemerhatian ini ada dalam alam semula jadi. Kehampiran urea dengan kumpulan aktif dalam tapak aktif bersama-sama dengan orientasi urea yang betul membolehkan hidrolisis berlaku dengan cepat. Urea sahaja sangat stabil oleh kerana bentuk resonans yang boleh diterima pakai. Kestabilan urea difahamkan disebabkan oleh tenaga resonansnya yang telah dianggarkan pada 30–40 kcal/mol. Ini kerana resonans zwiterion membentuk semua elektron yang menderma kepada karbon karbonil, menjadikannya kurang elektrofil menjadikannya kurang reaktif terhadap serangan nukleofil.

### Tapak aktif
Tapak aktif urease terletak dalam subunit α (alfa). Ia merupakan pusat nikel dimer bis-μ-hidrokso dengan jarak antara atom ~3.5 Å. Pasangan Ni(II) adalah bergandingan antiferomagnetik lemah. Kajian spektroskopi serapan sinar-X (XAS) *[[Canavalia ensiformis]]* (kacang bingka), *Klebsiella aerogenes* dan *[[Sporosarcina pasteurii]]* (dahulunya dikenali sebagai *Bacillus pasteurii*) mengesahkan 5–6 ion nikel koordinat dengan pengikatan O/N secara eksklusif, termasuk dua ligan imidazola setiap nikel. Substrat urea dicadangkan untuk menggantikan ligan akuo.

Molekul air yang terletak ke arah pembukaan tapak aktif membentuk gugusan tetrahedron yang mengisi tapak rongga melalui ikatan hidrogen. Beberapa sisa asid amino dicadangkan untuk membentuk flap mudah alih tapak yang memagari substrat. Sisa sisteina adalah biasa di kawasan flap enzim yang telah ditentukan sebagai tidak penting dalam pemangkinan, walaupun ia terlibat dalam meletakkan residu utama lain dalam tapak aktif dengan sewajarnya. Dalam *[[Sporosarcina pasteurii]]*, flap ditemui dalam konformasi terbuka, manakala konformasi tertutup nampaknya diperlukan untuk tindak balas.

Dalam perbandingan, subunit α urease *[[Helicobacter pylori]]* serta urease bakteria lain sejajar dengan urease kacang jack.

Pengikatan urea ke tapak aktif urease tidak diperhatikan.

### Cadangan mekanisme

#### Blakeley/Zerner
Satu mekanisme untuk pemangkinan tindak balas ini oleh urease telah dicadangkan oleh Blakely dan Zerner. Ia bermula dengan serangan nukleofil oleh oksigen karbonil molekul urea ke 5-koordinat Ni (Ni-1). Ligan air yang diselaraskan lemah disesarkan di tempatnya. Sepasang elektron tunggal daripada salah satu atom nitrogen pada molekul Urea mencipta ikatan berganda dengan karbon pusat, dan terhasil NH2- substrat yang diselaraskan berinteraksi dengan kumpulan bercas positif yang berdekatan. Blakeley dan Zerner mencadangkan kumpulan berdekatan ini menjadi ion karboksilat, walaupun karboksilat terdeprotonasi bercas negatif.

Ligan hidroksida di enam koordinat Ni dinyahproton oleh tapak. Karbon karbonil kemudiannya diserang oleh oksigen elektronegatif. Sepasang elektron daripada ikatan berganda nitrogen-karbon kembali kepada nitrogen dan meneutralkan cas di atasnya, manakala karbon 4 koordinat kini menganggap orientasi tetrahedron pertengahan.

Pecahan perantaraan ini kemudiannya dibantu oleh kumpulan sulfhidril sisteina yang terletak berhampiran tapak aktif. Ikatan hidrogen mengikat salah satu atom nitrogen lalu memutuskan ikatannya dengan karbon, dan membebaskan satu molekul ammonia. Pada masa sama, ikatan antara oksigen dan nikel 6 koordinat terputus. Ini meninggalkan ion karbamat yang diselaraskan terhadap 5 koordinat Ni, yang kemudiannya disesarkan oleh molekul air, menjana semula enzim.

Karbamat yang dihasilkan kemudian secara spontan terurai untuk menghasilkan ammonia dan asid karbonik yang lain.

#### Hausinger/Karplus
Mekanisme yang dicadangkan oleh Hausinger dan Karplus cuba menyemak semula beberapa isu yang nyata dalam laluan Blakely dan Zerner, dan memfokuskan pada kedudukan rantai sisi yang membentuk poket pengikat urea.  Daripada struktur kristal dari *K. aerogenes* urease, telah dihujahkan bahawa asas umum yang digunakan dalam mekanisme Blakely, His 320, adalah terlalu jauh dari air terikat Ni2 untuk menyahprotonasi untuk membentuk bahagian hidroksida yang menyerang. Di samping itu, ligan berasid am yang diperlukan untuk meprotonasi nitrogen urea tidak dikenalpasti.  Hausinger dan Karplus mencadangkan skim protonasi terbalik, di mana bentuk terprotonasi ligan His 320 memainkan peranan asid am dan air terikat Ni2 sudah berada dalam keadaan terdeprotonasi.  Mekanisme ini mengikut laluan yang sama, dengan asas am ditiadakan (kerana tidak ada lagi keperluan untuknya) dan His 320 menderma protonnya untuk membentuk molekul ammonia, yang kemudiannya dibebaskan daripada enzim. Walaupun sebahagian besar ligan His 320 dan air terikat tidak akan berada dalam bentuk aktifnya (masing-masing terprotonasi dan terdeprotonasi), ia dikira bahawa kira-kira 0.3% daripada jumlah enzim urease akan aktif pada satu-satu masa.  Walaupun secara logiknya, ini akan membayangkan bahawa enzim tidak begitu cekap, bertentangan dengan pengetahuan sedia ada, penggunaan skema protonasi terbalik memberikan kelebihan dalam peningkatan kereaktifan untuk bentuk aktif, mengimbangi kelemahan.  Meletakkan ligan His 320 sebagai komponen penting dalam mekanisme juga mengambil kira kawasan flap mudah alih enzim. Oleh kerana ligan histidin ini adalah sebahagian daripada kepak mudah alih, pengikatan substrat urea untuk pemangkinan menutup kepak ini di atas tapak aktif dan dengan penambahan corak ikatan hidrogen kepada urea daripada ligan lain di dalam poket, bercakap kepada selektiviti urease. enzim untuk urea. 

#### Ciurli/Mangani
Mekanisme yang dicadangkan oleh Ciurli dan Mangani adalah salah satu pandangan yang lebih terkini dan diterima mengenai mekanisme urease, dan secara besarnya berdasarkan terhadap peranan berbeza dua ion nikel di tapak aktif. Satu daripadanya mengikat dan mengaktifkan urea sementara yang satu lagi mengikat dan mengaktifkan molekul air nukleofilik. Berkenaan dengan cadangan ini, urea memasuki rongga tapak aktif apabila "flap" mudah alih (yang membenarkan kemasukan urea ke dalam tapak aktif) terbuka. Kestabilan pengikatan urea ke tapak aktif dicapai melalui rangkaian ikatan hidrogen, mengorientasikan substrat ke dalam rongga pemangkin. Urea mengikat kepada nikel koordinasi lima (Ni1) dengan atom oksigen karbonil. Ia menghampiri nikel koordinasi enam (Ni2) dengan salah satu kumpulan aminonya, dan seterusnya merapatkan dua pusat nikel. Pengikatan atom oksigen karbonil urea kepada Ni1 distabilkan melalui keadaan pemprotonan Hisα222 Nԑ. Selain itu, perubahan konformasi daripada keadaan terbuka kepada tertutup bagi kepak mudah alih menjana penyusunan semula kumpulan karbonil Alaα222 sedemikian rupa sehingga atom oksigennya menghala ke Ni2. Alaα170 dan Alaα366 kini berorientasi dengan gaya di mana kumpulan karbonilnya bertindak sebagai penerima ikatan hidrogen terhadap kumpulan urea NH2, dengan itu membantu pengikatannya kepada Ni2. Urea ialah ligan pengkelat yang sangat lemah kerana sifat bes Lewis rendah kumpulan NH2. Walau bagaimanapun, oksigen karbonil Alaα170 dan Alaα366 meningkatkan keasidan kumpulan NH2, dan membenarkan pengikatan terhadap Ni2. Oleh itu, dalam mekanisme cadangan ini, kedudukan urea dalam tapak aktif dicetuskan oleh ciri-ciri struktur sisa tapak aktif yang diletakkan untuk bertindak sebagai penderma ikatan hidrogen di sekitar Ni1 dan sebagai penerima di sekitar Ni2. Perbezaan struktur utama antara mekanisme Ciurli/Mangani dan dua yang lain adalah ia menggabungkan nitrogen, urea penyambung oksigen yang diserang oleh hidroksida penyambung.

### Tindakan dalam patogenesis
Urease bakteria selalunya merupakan cara patogenesis dalam banyak keadaan perubatan. Ia dikaitkan dengan ensefalopati/koma hati, batuan jangkitan dan ulser peptik. 

#### Batu jangkitan
Batuan kencing disebabkan jangkitan ialah campuran struvit (MgNH4PO4•6H2O) dan apatit karbonat [Ca10(PO4)6•CO3]. Ion polivalen ini larut tetapi menjadi tidak larut apabila ammonia dihasilkan daripada urease mikrob semasa hidrolisis urea kerana ini meningkatkan pH persekitaran sekitar daripada kira-kira 6.5 kepada 9. Pengalkalian terhasil menghasilkan penghabluran batu. Dalam manusia, urease mikrob *Proteus mirabilis* ialah jenis enzim yang paling biasa dalam batu kencing jangkitan.

#### Urease dalam ensefalopati hepatik / koma hepatik
Kajian telah menunjukkan bahawa *[[Helicobacter pylori]]* bersama-sama dengan sirosis hati menyebabkan ensefalopati hati dan koma hati. *Helicobacter pylori* membebaskan urease mikrob ke dalam perut. Urease menghidrolisis urea untuk menghasilkan ammonia dan asid karbonik. Oleh kerana bakteria disetempatkan ke dalam perut ammonia yang dihasilkan mudah diambil oleh sistem peredaran darah dari lumen gastrik. Ini mengakibatkan paras ammonia meningkat dalam darah dalam keadaan yang dikenali sebagai hiperammonemia; pembasmian *Helicobacter pylori* membawa kepada penurunan tahap ammonia yang ketara.

#### Urease dalam ulser peptik
*Helicobacter pylori* juga merupakan punca ulser peptik dengan manifestasinya dalam 55-68% kes yang dilaporkan. Ini disahkan oleh penurunan pendarahan serta pengulangan ulser selepas pembasmian patogen. Di dalam perut, terdapat peningkatan pH lapisan mukosa akibat hidrolisis urea yang menghalang pergerakan ion hidrogen antara kelenjar gastrik dan lumen gastrik. Di samping itu, kepekatan ammonia yang tinggi mempunyai kesan pada persimpangan ketat antara sel yang meningkatkan kebolehtelapan dan juga mengganggu membran mukus gastrik perut.

## Kewujudan dan aplikasi dalam pertanian
Urea ditemui secara semula jadi di alam sekitar dan juga diperkenalkan secara buatan, yang terdiri daripada lebih separuh daripada semua baja nitrogen sintetik global. Penggunaan urea secara berlebihan dianggap menggalakkan eutrofikasi, walaupun terdapat pemerhatian bahawa urea cepat berubah oleh urease mikrob, dan oleh itu, biasanya tidak berterusan. Aktiviti urease alam sekitar sering diukur sebagai penunjuk kesihatan komuniti mikrob. Dalam ketiadaan tumbuhan, aktiviti urease dalam tanah secara amnya dikaitkan dengan mikroorganisma heterotrof, walaupun telah ditunjukkan bahawa beberapa bakteria pengoksida amonium kemoautotrof mampu tumbuh dengan urea sebagai sumber tunggal karbon, nitrogen dan tenaga.

### Perencatan dalam baja
Perencatan urease ialah matlamat penting dalam pertanian kerana penguraian pantas baja berasaskan urea ialah satu pembaziran pertanian serta merosakkan alam sekitar. Fenil fosforodiamidat dan N-(n-butil)tiofosforik triamida ialah dua contoh perencat.

### Biomineralisasi
Dengan menggalakkan pembentukan kalsium karbonat, urease berpotensi berguna dalam proses biomineralisasi yang diilhamkan. Secara utamanya, pembentukan kalsium karbonat oleh mikrobiologi boleh digunakan dalam membuat biokonkrit.

## Tindakan bukan enzim
Selain bertindak sebagai enzim, sesetengah urease (terutamanya terbitan tumbuhan) mempunyai kesan tambahan yang berterusan walaupun fungsi pemangkin dilumpuhkan. Ini termasuk entomotoksisiti, perencatan kulat, neurotoksisiti dalam mamalia, promosi endositosis dan pengeluaran eikosanoid keradangan dalam mamalia, dan cetusan kemotaksis dalam bakteria. Aktiviti ini mungkin sebahagian daripada mekanisme pertahanan.

Ketoksikan serangga urease pada asalnya dicatatkan dalam kanatoksin, isobentuk ortolog urease kacang jack. Pencernaan peptida mengenal pasti bahagian 10 kDa yang paling bertanggungjawab bagi kesan ini, dipanggil "jaburetoks". Bahagian yang serupa daripada urease kacang soya dinamakan "soyuretoks". Namun begitu, kajian mengenai serangga menunjukkan bahawa keseluruhan protein adalah toksik tanpa memerlukan sebarang penghadaman. Walau bagaimanapun, peptida "uretoks" yang lebih tertumpu dalam ketoksikan, menunjukkan peluang sebagai bioracun perosak.

## Dalam ujian diagnostik
Banyak patogen gastrousus atau saluran kencing menghasilkan urease, membolehkan pengesanan urease digunakan sebagai diagnostik untuk mengesan kehadiran patogen.

Patogen positif urease termasuk:

* *[[Proteus mirabilis]]* dan *[[Proteus vulgaris]]*
* *[[Ureaplasma urealyticum]]*, saudara kepada *[[Mikoplasma|Mycoplasma]]* spp.
* *[[Nocardia]]*
* *[[Corynebacterium urealyticum]]*
* *[[Cryptococcus (kulat)|Cryptococcus]]* spp., kulat oportunistik
* *[[Helicobacter pylori]]*
* Bakteria enterik tertentu termasuk *[[Proteus (bakteria)|Proteus]]* spp., *[[Klebsiella]]* spp., *[[Morganella (bakteria)|Morganella]]*, *[[Providencia (bakteria)|Providencia]]* dan mungkin *[[Serratia]]* spp.
* *[[Brucella]]*
* *[[Staphylococcus saprophyticus]]*
* *[[Staphylococcus aureus]]*

## Ligan

### Perencat
Pelbagai perencat urease dari keluarga struktur yang berbeza diketahui. Perencatan urease bukan sahaja menarik minat dalam bidang pertanian, tetapi juga dalam bidang perubatan kerana patogen seperti *[[Helicobacter pylori|H. pylori]]* menghasilkan urease sebagai mekanisme kelangsungan. Kelas struktur perencat yang diketahui termasuk:

* Analog urea, dengan analog yang paling kuat ialah tiourea seperti 1-(4-klorofenil)-3-palmitoiltiourea.
* Fosforamidat, paling biasa digunakan dalam pertanian (lihat di atas).
* Hidrokuinon dan kuinon. Dalam bidang perubatan, jenis yang paling menarik ialah kuinolon, dan telah menjadi kelas antibiotik yang digunakan secara meluas.
* Sesetengah metabolit tumbuhan juga merupakan perencat urease seperti alisin. Ini berpotensi sebagai bahan tambahan baja mesra alam dan ubat semula jadi.

## Rujukan

## Pautan luar

*