Operon lac

**Operon laktosa** (operon ***lac***) ialah operon yang diperlukan dalam pengangkutan dan metabolisme laktosa dalam ''E. coli'' dan banyak bakteria enterik yang lain. Walaupun glukosa ialah sumber karbon pilihan untuk kebanyakan bakteria enterik, operon *lac* membolehkan pencernaan laktosa yang berkesan apabila glukosa tidak tersedia melalui aktiviti beta-galaktosidase. Kawal atur gen operon *lac* ialah mekanisme kawal atur genetik pertama yang difahami dengan jelas, dan telah menjadi contoh utama kawal atur gen prokariot. Ia sering diajar dalam kelas-kelas asas biologi molekul dan biologi sel atas sebab ini. Sistem metabolisme laktosa ini digunakan oleh François Jacob dan Jacques Monod untuk menentukan bagaimana sel biologi mengetahui enzim yang hendak disintesis. Hasil kerja mereka mengenai *lac* operon memenangi Hadiah Nobel dalam Fisiologi pada tahun 1965.

Kebanyakan sel bakteria termasuk *E. coli* ketiadaan intron dalam genomnya. Mereka juga tidak mempunyai membran nukleus. Oleh itu peraturan gen oleh operon *lac* berlaku di peringkat transkripsi, dengan menghalang penukaran DNA kepada mRNA.

Operon bakteria ialah transkripsi polisistron yang mampu menghasilkan pelbagai protein daripada satu transkrip mRNA. Dalam kes ini, apabila laktosa diperlukan sebagai sumber gula bakteria, tiga gen *lac* operon boleh dinyatakan dan protein seterusnya diterjemahkan: *lacZ*, *lacY*, dan *lacA*. Produk gen *lacZ* ialah β-galaktosidase yang membelah laktosa, disakarida, kepada glukosa dan galaktosa. *lacY* mengekod β-galaktosida permease, protein membran yang menjadi tertanam di membran plasma bagi membolehkan pengangkutan sel laktosa ke dalam sel. Akhirnya, *lacA* mengodkan β-galaktosida transasetilase.

Ia merupakan satu pembaziran jika enzim dihasilkan apabila tiada laktosa tersedia atau jika sumber tenaga yang lebih baik seperti glukosa tersedia. Operon *lac* menggunakan mekanisme kawalan dua bahagian untuk memastikan sel membelanjakan tenaga menghasilkan enzim yang dikodkan oleh operon *lac* hanya apabila perlu.

Dengan ketiadaan laktosa, penindas ''lac'' yang dikodkan oleh *lacI* menghentikan pengeluaran enzim dan protein pengangkutan yang dikodkan oleh operon *lac*. Ia melakukannya dengan menyekat polimerase RNA bergantungan DNA . Penyekatan/penghentian ini tidak sempurna, dan jumlah ekspresi gen yang minimum berlaku sepanjang masa. Protein penindas sentiasa dinyatakan, tetapi operon *lac* (enzim dan protein pengangkutan) ditindas, walaupun tidak sepenuhnya.

Apabila laktosa tersedia tetapi tidak glukosa, maka beberapa laktosa memasuki sel menggunakan protein pengangkutan sedia ada yang dikodkan oleh *lacY*. Laktosa ini kemudiannya bergabung dengan penindas dan menyahaktifkannya, justeru membenarkan operon *lac* diekspresikan. Kemudian, lebih banyak β-galaktosida permease terhasil, membolehkan lebih banyak laktosa masuk, dan enzim yang dikodkan oleh *lacZ* dan *lacA* boleh mencernanya.

Walau bagaimanapun, Dengan kehadiran glukosa, tanpa mengira kehadiran laktosa, operon akan ditindas. Ini kerana protein pengaktif katabolit (CAP) yang diperlukan dalam penghasilan enzim kekal tidak aktif, dan EIIA<sup>Glc</sup> menutup permease laktosa untuk menghalang pengangkutan laktosa ke dalam sel. Mekanisme kawalan duaan ini menyebabkan penggunaan glukosa dan laktosa secara berurutan dalam dua fasa pertumbuhan yang berbeza, dikenali sebagai "diauksi".

## Struktur

* *Lac* operon terdiri daripada 3 gen struktur dan satu promoter, terminator, pengawal atur, dan operator. Tiga gen struktur ialah *lacZ*, *lacY*, dan *lacA* .
** *lacZ* mengekod β-galaktosidase (LacZ), enzim intrasel yang membelah laktosa disakarida kepada glukosa dan galaktosa.
** *lacY* mengekodkan beta-galaktosida permease (LacY), simporter transmembran yang mengepam β-galaktosida termasuk laktosa ke dalam sel menggunakan kecerunan proton dalam arah yang sama. Permease meningkatkan kebolehtelapan sel kepada β-galaktosida.
** *lacA* mengekod β-galaktosida transasetilase (LacA), enzim yang memindahkan kumpulan asetil dari asetil-KoA kepada tiogalaktosida.

Hanya *lacZ* dan *lacY* nampaknya diperlukan bagi laluan katabolik laktosa.

### Tatanama genetik
Singkatan tiga huruf digunakan untuk menerangkan fenotip dalam bakteria termasuk *E. coli*.

Contohnya termasuk:

* Lac (keupayaan untuk menggunakan laktosa)
* His (keupayaan sintesis asid amino histidina)
* Mot (kemotilan berenang)
* SmR (rintangan terhadap antibiotik streptomisin)

Dalam kes Lac, sel jenis liar ialah Lac+ dan boleh menggunakan laktosa sebagai karbon dan sumber tenaga, manakala terbitan termutasi Lac- tidak boleh menggunakan laktosa. Tiga huruf yang sama biasanya digunakan (huruf kecil, condong) untuk melabelkan gen yang terlibat dalam fenotip tertentu, di mana setiap gen berbeza dibezakan dengan huruf tambahan. Gen pengekod enzim ialah *lacZ*, *lacY*, dan *lacA*. Gen *lac* keempat ialah *lacI* yang mengekodkan penindas laktosa—"I" bermaksud "kebolehcetusan" (*inducibility*).

Seseorang boleh membezakan antara gen *struktur* pengekodan enzim, dan gen kawal atur pengekodan protein yang mempengaruhi ekspresi gen. Penggunaan semasa mengembangkan tatanama fenotip untuk digunakan pada protein: oleh itu, LacZ ialah produk protein gen *lacZ*, β-galaktosidase. Pelbagai jujukan pendek bukan gen juga mempengaruhi ekspresi gen, termasuk promoter *lac*, *lac p*, dan operator *lac*, *lac o*. Walaupun bukan penggunaan piawai yang khusus, mutasi yang mempengaruhi *lac o* dirujuk sebagai *lac o*c atas sebab sejarah.

## Kawal atur
Kawalan spesifik gen *lac* bergantung pada ketersediaan substrat laktosa kepada bakteria. Protein tidak dihasilkan oleh bakteria apabila laktosa tidak tersedia sebagai sumber karbon. Gen *lac* disusun menjadi operon; iaitu, ia berorientasikan ke arah yang sama serta-merta bersebelahan di kromosom, dan ditranskripsi bersama ke dalam molekul mRNA polisistron tunggal. Transkripsi semua gen bermula dengan pengikatan enzim RNA polimerase (RNAP), protein pengikat DNA yang mengikat tapak pengikatan DNA tertentu, promoter, yang terletak terus di perhuluan gen. Pengikatan RNA polimerase kepada promoter dibantu oleh protein pengaktif katabolit terikat cAMP (CAP, juga dikenali sebagai protein reseptor cAMP). Walau bagaimanapun, gen *lacI* (gen kawal atur operon *lac*) menghasilkan protein yang menghalang RNAP daripada mengikat operator operon. Protein ini hanya boleh dikeluarkan apabila alolaktosa mengikatnya lalu menyahaktifkannya. Protein yang dibentuk oleh gen *lacI* dikenali sebagai penindas lac. Jenis kawal atur yang dilalui operon *lac* dirujuk sebagai cetusan negatif, bermakna gen dimatikan oleh faktor kawal atur (penindas *lac*) melainkan beberapa molekul (laktosa) ditambah. Sebaik sahaja penindas dikeluarkan, RNAP kemudian meneruskan untuk menyalin ketiga-tiga gen (*lacZYA*) ke dalam mRNA. Setiap tiga gen di untaian mRNA mempunyai jujukan Shine-Dalgarno sendiri, jadi setiap gen diterjemahkan secara bebas. Urutan DNA operon *[[Escherichia coli|E. coli]]* *lac*, mRNA *lacZYA* dan gen *lacI* boleh didapati daripada GenBank (lihat) .

Mekanisme kawalan pertama ialah tindak balas kawal atur kepada laktosa, yang menggunakan *protein kawal atur* intrasel yang dipanggil *penindas laktosa* untuk menghalang pengeluaran β-galaktosidase dalam ketiadaan laktosa. Pengekodan gen *lacI* untuk penindas terletak berhampiran operon *lac* dan sentiasa diekspresikan. Jika laktosa tidak ada dalam medium pertumbuhan, penindas mengikat sangat ketat terhadap jujukan DNA pendek hanya di hilir promoter berhampiran permulaan *lacZ* yang dipanggil *operator lac*. Penindas yang mengikat terhadap operator mengganggu pengikatan RNAP kepada promoter, dan oleh itu pengekodan mRNA LacZ dan LacY hanya berlaku di tahap yang sangat rendah. Walau bagaimanapun, apabila sel tumbuh dengan kehadiran laktosa, metabolit laktosa yang dipanggil alolaktosa, diperbuat daripada laktosa oleh produk gen *lacZ*, mengikat terhadap penindas lalu menyebabkan anjakan alosterik. Melalui perubahan itu, penindas tidak dapat mengikat operator lagi, dan membenarkan RNAP menyalin gen *lac*, dan dengan itu, tahap protein yang dikodkan menjadi lebih tinggi.

Mekanisme kawalan kedua ialah tindak balas kepada glukosa, yang menggunakan homodimer protein pengaktif katabolit (CAP) untuk meningkatkan pengeluaran β-galaktosidase dengan ketiadaan glukosa. Adenosina monofosfat siklik (cAMP) ialah molekul isyarat dengan kepekatannya berkadar songsang dengan glukosa. Ia mengikat CAP, dan seterusnya membolehkan CAP mengikat ke tapak pengikatan CAP (jujukan DNA 16 bp di hulu promoter di sebelah kiri dalam rajah di bawah, kira-kira 60 bp di hulu tapak permulaan transkripsi), yang membantu RNAP dalam mengikat DNA. Tanpa glukosa, kepekatan cAMP adalah tinggi, dan pengikatan CAP-cAMP kepada DNA dengan ketara meningkatkan pengeluaran β-galaktosidase, membolehkan sel menghidrolisis laktosa dan membebaskan galaktosa dan glukosa.

Baru-baru ini, ada dapatan bahawa pengecualian pencetus menyekat ekspresi *lac* operon apabila glukosa hadir. Glukosa diangkut ke dalam sel oleh sistem fosfotransferase bergantungan PEP. Kumpulan fosfat fosfoenolpiruvat dipindahkan melalui lata pemfosforilan yang terdiri daripada protein PTS umum (sistem fosfotransferase) HPr dan EIA dan protein PTS khusus glukosa, EIIAGlc dan EIIBGlc, domain sitoplasma bagi pengangkut glukosa, EII. Pengangkutan glukosa disertai dengan pemfosforilan oleh EIIBGlc, mengalirkan kumpulan fosfat daripada protein PTS lain termasuk EIIAGlc . Bentuk EIIAGlc yang tidak terfosforilasi mengikat terhadap permease *lac* dan menghalangnya daripada membawa laktosa ke dalam sel. Oleh itu, jika kedua-dua glukosa dan laktosa hadir, pengangkutan glukosa menyekat pengangkutan pencetus operon *lac*.

Penindas lac ialah protein empat bahagian (tetramer) dengan subunit yang sama. Setiap subunit mengandungi motif heliks-pusing-heliks (HTH) yang mampu mengikat DNA. Tapak operator yang diikat penindas ialah urutan DNA dengan simetri berulang terbalik. Kedua-dua tapak separuh DNA operator bersama-sama mengikat dua daripada subunit penindas. Walaupun dua subunit penindas yang lain tidak melakukan apa-apa dalam model ini, sifat ini tidak difahami selama bertahun-tahun.

Akhirnya, ada dapatan bahawa dua pengendali tambahan terlibat dalam peraturan *lac*. Satu (O3) terletak kira-kira −90 bp di hulu O1 di hujung gen *lacI*, dan satu lagi (O2) adalah kira-kira +410 bp di hilir O1 di bahagian awal *lacZ*. Kedua-dua tapak ini tidak ditemui dalam kerja awal kerana ia mempunyai fungsi berlebihan, dan mutasi individu tidak banyak mempengaruhi penindasan. Mutasi tunggal kepada sama ada O2 atau O3 hanya mempunyai kesan 2 hingga 3 kali ganda. Walau bagaimanapun, kepentingannya ditunjukkan oleh fakta bahawa mutan berganda yang merosakkan kedua-dua O2 dan O3 dinyahtindas secara ketara (kira-kira 70 kali ganda).

Dalam model semasa, penindas *lac* diikat serentak di kedua-dua operator utama O1 dan sama ada O2 atau O3. Gelungan DNA yang bercampuran keluar dari kompleks. Sifat berlebihan kedua-dua operator kecil menunjukkan bahawa ia bukan kompleks bergelung khusus yang penting. Satu idea ialah sistem berfungsi melalui penambatan; jika penindas terikat dilepaskan dari O1 seketika, pengikatan terhadap operator kecil menyimpannya di kawasan setempat supaya ia boleh mengikat semula dengan cepat. Ini akan meningkatkan pertalian penindas terhadap O1.

#### Mekanisme cetusan
Penindas ialah protein alosterik, iaitu ia boleh menganggap salah satu daripada dua bentuk yang sedikit berbeza yang berada dalam keseimbangan antara satu sama lain. Dalam satu bentuk, penindas akan mengikat DNA operator dengan kekhususan yang tinggi, dan dalam bentuk lain, ia telah kehilangan kekhususannya. Menurut model induksi klasik, pengikatan pencetus terhadap penindas, sama ada alolaktosa atau IPTG, mempengaruhi pengedaran penindas antara kedua-dua bentuk. Oleh itu, penindas dengan ikatan pencetus distabilkan dalam konformasi tak terikat DNA. Walau bagaimanapun, model ringkas ini tidak boleh menjadi gambaran keseluruhan, kerana penindas terikat dengan agak stabil kepada DNA, namun dikeluarkan dengan cepat dengan penambahan pencetus. Oleh itu, nampaknya jelas bahawa pencetus juga boleh mengikat terhadap penindas apabila sudah terikat dengan DNA. Ia masih tidak diketahui sepenuhnya apa mekanisme pengikatan yang tepat.

#### Peranan pengikatan tidak khusus
Pengikatan tak khusus penindas terhadap DNA memainkan peranan penting dalam penindasan dan induksi operon *lac*. Tapak pengikat khusus protein penindas ialah operator. Interaksi tidak khusus dibantu terutamanya oleh interaksi cas-cas manakala pengikatan terhadap operator diperkukuh oleh interaksi hidrofobik. Di samping itu, terdapat banyak urutan DNA tidak khusus yang boleh diikat oleh penindas. Pada asasnya, sebarang jujukan bukan operator, dianggap tidak khusus. Kajian telah menunjukkan bahawa tanpa kehadiran pengikatan tak khusus, pencetusan (atau penyahtindasan) operon *lac* tidak boleh berlaku walaupun dengan pencetus dalam kepekatan tepu. Kajian menunjukkan bahawa, tanpa pengikatan tak khusus, tahap cetusan basal adalah sepuluh ribu kali lebih kecil daripada yang diperhatikan dalam keadaan normal. Ini kerana DNA tak khusus bertindak sebagai sejenis "sinki" buat protein penindas yang mengganggunya daripada operator. Urutan tidak khusus mengurangkan jumlah penindas yang tersedia dalam sel. Ini seterusnya mengurangkan jumlah pencetus yang diperlukan untuk membatalkan tekanan sistem.

### Analog laktosa

Beberapa derivatif laktosa atau analog telah diterangkan berguna untuk bekerja dengan operon *lac*. Sebatian ini kebanyakannya digantikan dengan galaktosida, di mana bahagian glukosa laktosa digantikan oleh kumpulan kimia lain.

* Isopropil-β-D-tiogalaktopiranosida (IPTG) kerap digunakan sebagai pencetus operon dalam kerja fisiologi. IPTG mengikat kepada penindas dan menyahaktifkannya, tetapi bukan substrat untuk β-galaktosidase. Satu kelebihan IPTG dalam kajian *[[in vivo]]* ialah ia tidak boleh dimetabolismekan oleh *E. coli*. Kepekatannya kekal malar dan kadar ekspresi gen terkawal *lac p/o* tidak menjadi pemboleh ubah dalam eksperimen. Pengambilan IPTG bergantung kepada tindakan laktosa permease dalam *P. fluorescens*, tetapi tidak dalam *E. coli*.
* Fenil-β-D-galaktosa (fenil-Gal) ialah substrat β-galaktosidase, tetapi tidak menyahaktifkan penindas serta bukan pencetus. Oleh kerana sel jenis liar menghasilkan β-galaktosidase yang begitu sedikit, ia tidak boleh tumbuh dengan fenil-Gal sebagai karbon dan sumber tenaga. Mutan tanpa penindas boleh tumbuh dengan fenil-Gal. Oleh itu, medium minimum yang mengandungi hanya fenil-Gal sebagai sumber karbon dan tenaga adalah selektif terhadap mutan penindas dan operator. Jika 108 sel daripada strain jenis liar disalut di plat agar yang mengandungi fenil-Gal, koloni yang tumbuh adalah terutamanya mutan spontan yang menjejaskan penindas. Taburan relatif mutan penindas dan pengendali dipengaruhi oleh saiz sasaran. Oleh kerana penindas pengekodan *gen lacI* adalah kira-kira 50 kali lebih besar daripada operator, mutan penindas mendominasi dalam pemilihan.
* Tiometil galaktosida (TMG) ialah satu lagi analog laktosa. Ini menghalang penindas lacI. Pada kepekatan pencetus yang rendah, kedua-dua TMG dan IPTG boleh memasuki sel melalui laktosa permease. Walau bagaimanapun, pada kepekatan pencetus tinggi, kedua-dua analog boleh memasuki sel secara bebas. TMG boleh mengurangkan kadar pertumbuhan pada kepekatan ekstraselular yang tinggi.
* Sebatian lain berfungsi sebagai penunjuk berwarna aktiviti β-galaktosidase.
** ONPG dibelah untuk menghasilkan sebatian kuning pekat, ortonitrofenol dan galaktosa, dan biasanya digunakan sebagai substrat ujian β-galaktosidase *[[in vitro]]*.
** Koloni yang menghasilkan β-galaktosidase bertukar menjadi biru oleh X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktosida) yang merupakan substrat buatan B-galaktosidase, di mana pembelahannya menghasilkan galaktosa dan nila 4-Cl,3-Br, lalu menghasilkan warna biru tua.
* Alolaktosa ialah isomer laktosa dan merupakan inducer *lac* operon. Laktosa ialah galaktosa-β(1→4)-glukosa, manakala alolaktosa ialah galaktosa-β(1→6)-glukosa. Laktosa ditukar kepada alolaktosa oleh β-galaktosidase dalam tindak balas alternatif berbanding hidrolisis. Eksperimen fisiologi yang menunjukkan peranan LacZ dalam penghasilan pencetus "sebenar" dalam sel *E. coli* ialah pemerhatian bahawa mutan nol *lacZ* masih boleh menghasilkan permease LacY apabila ditanam dengan IPTG, analog alolaktosa yang tidak boleh dihidrolisis, tetapi tidak apabila ditanam dengan laktosa. Penjelasannya ialah pemprosesan laktosa kepada alolaktosa (dimangkinkan oleh β-galaktosidase) diperlukan untuk menghasilkan pencetus di dalam sel.

## Pembangunan model klasik
Mikroorganisma eksperimen yang digunakan oleh François Jacob dan Jacques Monod ialah bakteria makmal biasa, *E. coli*, tetapi kebanyakan konsep kawal atur asas yang ditemui oleh Jacob dan Monod menjadi asas kepada kawal atur sel dalam semua organisma. Idea utama ialah protein tidak disintesis apabila ia tidak diperlukan; *E.* *coli* menjimatkan sumber dan tenaga selular dengan tidak menghasilkan tiga protein Lac apabila tiada keperluan untuk memetabolismekan laktosa seperti apabila gula lain seperti glukosa tersedia. Bahagian berikut membincangkan bagaimana *E. coli* mengawal gen tertentu sebagai tindak balas kepada keperluan metabolisme.

Semasa Perang Dunia II, Monod telah menguji kesan gabungan gula sebagai sumber nutrien *E. coli* dan ''B. subtilis''. Monod mengikuti kajian serupa yang telah dijalankan oleh saintis lain dengan bakteria dan yis. Beliau mendapati bahawa bakteria yang tumbuh dengan dua gula berbeza sering memaparkan dua fasa pertumbuhan. Contohnya, jika glukosa dan laktosa kedua-duanya tersedia, glukosa dimetabolismekan dahulu (fasa pertumbuhan I, lihat Rajah 2) sebelum laktosa (fasa pertumbuhan II). Laktosa tidak dimetabolismekan semasa bahagian pertama lengkung pertumbuhan diauksik kerana β-galaktosidase tidak dihasilkan apabila kedua-dua glukosa dan laktosa hadir dalam medium. Monod menamakan fenomena ini sebagai "diauksi".

Monod kemudian menumpukan perhatiannya pada pencetusan pembentukan β-galaktosidase yang berlaku apabila laktosa menjadi gula tunggal dalam medium kultur.

### Pengelasan mutan kawal atur
Satu kejayaan konsep Jacob dan Monod adalah untuk mengenali perbezaan antara bahan kawal selia dan tapak di mana mereka bertindak untuk mengubah ekspresi gen. Seorang bekas tentera, Jacob menggunakan analogi pengebom yang akan melepaskan kargo mautnya apabila menerima penghantaran atau isyarat radio khas. Sistem kerja memerlukan pemancar darat dan penerima dalam kapal terbang. Sekarang, anggap pemancar lazim rosak. Sistem ini boleh berfungsi dengan memperkenalkan pemancar berfungsi kedua. Sebaliknya, katanya, pertimbangkan pengebom dengan penerima yang rosak. Tingkah laku pengebom *ini* tidak boleh diubah dengan pengenalan pesawat kedua yang berfungsi.

Untuk menganalisis mutan kawal atur operon *lac*, Jacob membangunkan sistem di mana salinan kedua gen *lac* (*lacI* dengan promoternya, dan *lacZYA* dengan promoter dan operator) boleh dimasukkan ke dalam satu sel. Kultur bakteria sedemikian yang diploid bagi gen *lac* tetapi sebaliknya normal kemudiannya diuji bagi fenotip kawal atur. Khususnya, ia ditentukan sama ada LacZ dan LacY dibuat walaupun tanpa IPTG (disebabkan *penindas laktosa* yang dihasilkan oleh gen mutan tidak berfungsi). Percubaan ini, di mana gen atau kelompok gen diuji secara berpasangan, dipanggil sebagai *[[Pelengkap (genetik)|ujian pelengkap]]*.

Ujian ini digambarkan dalam rajah (*lacA* ditinggalkan sebagai langkah peringkasan). Pertama, keadaan haploid tertentu ditunjukkan (iaitu sel hanya membawa satu salinan gen *lac*). Panel (a) menunjukkan penindasan, (b) menunjukkan cetusan oleh IPTG, dan (c) dan (d) masing-masing menunjukkan kesan mutasi kepada gen *lacI* atau operator. Dalam panel (e), ujian pelengkap penindas ditunjukkan. Jika satu salinan gen *lac* membawa mutasi dalam *lacI*, tetapi salinan kedua adalah jenis liar untuk *lacI*, fenotip yang terhasil adalah normal—tetapi lacZ dinyatakan apabila terdedah kepada IPTG selaku pencetus. Mutasi yang mempengaruhi penindas dikatakan *resesif* kepada jenis liar (dan jenis liar itu *dominan*), dan ini dijelaskan oleh fakta bahawa penindas ialah protein kecil yang boleh meresap dalam sel. Salinan *lac* operon bersebelahan dengan gen *lacI* yang rosak dimatikan secara berkesan oleh protein yang dihasilkan daripada salinan kedua *lacI*.

Jika eksperimen yang sama dijalankan menggunakan mutasi operator, keputusan yang berbeza diperolehi (panel (f)). Fenotip sel yang membawa satu mutan dan satu tapak operator jenis liar ialah LacZ dan LacY dihasilkan walaupun tanpa IPTG; kerana tapak operator yang rosak tidak membenarkan pengikatan penindas untuk menghalang transkripsi gen struktur. Mutasi operator adalah dominan. Apabila tapak operator di mana penindas perlu mengikat dirosakkan oleh mutasi, kehadiran tapak berfungsi kedua dalam sel yang sama tidak memberi perbezaan kepada ekspresi gen yang dikawal oleh tapak mutan.

Versi eksperimen yang lebih canggih menggunakan operon *bertanda* untuk membezakan antara dua salinan gen *lac*, dan menunjukkan bahawa gen struktur tidak dikawal ialah gen bersebelahan operator mutan (panel (g). Sebagai contoh, katakan bahawa satu salinan ditandakan dengan mutasi yang menyahaktifkan *lacZ* supaya ia hanya boleh menghasilkan protein LacY, manakala salinan kedua membawa mutasi yang menjejaskan *lacY* dan hanya boleh menghasilkan LacZ. Dalam versi ini, hanya salinan operon *lac* yang bersebelahan dengan pengendali mutan diekspresikan tanpa IPTG. Maka, boleh dikatakan bahawa mutasi operator adalah *cis-dominan*, ia dominan kepada jenis liar, tetapi hanya memberi kesan kepada salinan operon yang bersebelahan dengannya.

Penjelasan ini mengelirukan dalam pengeertian penting kerana ia bermula daripada penerangan eksperimen dan kemudian menerangkan keputusan sebagai suatu model. Namun begitu, sebenarnya, selalunya benar bahawa model yang dahulu betul, dan percubaan dibuat khusus untuk menguji model. Jacob dan Monod mula-mula membayangkan bahawa mesti ada *tapak* di DNA dengan sifat operator, dan kemudian mereka bentuk ujian pelengkap mereka untuk menunjukkan perihal ini.

Dominasi mutan operator juga mencadangkan prosedur untuk memilihnya secara khusus. Jika mutan kawal atur dipilih daripada kultur liar menggunakan fenil-Gal seperti yang diterangkan di atas, mutasi operator jarang berlaku berbanding mutan penindas kerana saiz sasaran adalah sangat kecil. Namun, jika ia dimulakan dengan strain yang membawa dua salinan seluruh rantau *lac* (iaitu *lac* diploid), mutasi penindas (yang masih berlaku) tidak dipulihkan kerana pelengkap oleh gen *lacI* jenis liar kedua memberikan jenis liar fenotip. Sebaliknya, mutasi satu salinan pengendali memberikan fenotip mutan kerana ia dominan kepada salinan kedua yang liar.

### Kawal atur AMP siklik
Penjelasan diauksi bergantung terhadap pencirian mutasi tambahan yang mempengaruhi gen *lac* selain daripada yang dijelaskan oleh model klasik. Dua gen lain, *cya* dan *crp* yang dipetakan jauh dari *lac* kemudiannya dikenal pasti, dan apabila ia bermutasi, ia mengakibatkan penurunan tahap ekspresi *dengan kehadiran* IPTG, dan juga dalam strain bakteria yang tiada penindas atau operator. Penemuan cAMP dalam *E. coli* membawa kepada dapatan bahawa mutan yang merosakkan gen *cya* tetapi bukan *crp* boleh dipulihkan balik kepada aktiviti penuh dengan penambahan cAMP ke dalam medium.

Gen *cya* mengekod adenilat siklase yang menghasilkan cAMP. Dalam mutan *cya*, ketiadaan cAMP menjadikan ekspresi gen *lacZYA* lebih sepuluh kali lebih rendah daripada biasa. Penambahan cAMP membetulkan ciri ekspresi Lac rendah bagi mutan *cya*. Gen kedua, *crp*, mengekod protein yang dipanggil protein pengaktif katabolit (CAP) atau protein reseptor cAMP (CRP).

Walau bagaimanapun, enzim metabolisme laktosa dibuat dalam kuantiti yang kecil dengan kehadiran kedua-dua glukosa dan laktosa (kadang-kadang dipanggil "ungkapan bocor") oleh kerana fakta bahawa RNAP masih kadangkala boleh mengikat dan memulakan transkripsi walaupun tanpa CAP. Ungkapan bocor adalah perlu untuk membolehkan metabolisme beberapa laktosa selepas sumber glukosa dibelanjakan, tetapi sebelum ekspresi *lac* diaktifkan sepenuhnya.

Secara ringkasnya:

* Apabila laktosa tidak hadir, maka pengeluaran enzim Lac sangat sedikit (operator mempunyai penindas Lac yang terikat kepadanya).
* Apabila laktosa ada tetapi sumber karbon yang lebih baik (seperti glukosa) juga ada, maka sejumlah kecil enzim terhasil (penindas Lac tidak terikat kepada operator).
* Ketika glukosa tidak ada, CAP-cAMP mengikat ke tapak DNA tertentu di hulu promoter dan melakukan interaksi protein-protein langsung dengan RNAP lalu memudahkan pengikatan RNAP kepada promoter.

Kelewatan antara fasa pertumbuhan mencerminkan masa yang diperlukan untuk menghasilkan kuantiti enzim metabolisme laktosa yang mencukupi. Pertama, protein CAP kawal atur perlu dipasang pada promoter *lac*, mengakibatkan peningkatan dalam pengeluaran mRNA *lac*. Salinan mRNA *lac* yang lebih banyak tersedia menghasilkan pengeluaran lebih banyak salinan LacZ (β-galaktosidase) dan LacY (laktosa permease). Selepas penangguhan yang diperlukan untuk meningkatkan tahap enzim metabolisme laktosa, bakteria memasuki fasa pertumbuhan sel baru yang pesat.

Dua teka-teki penindasan katabolit adalah berkaitan cara paras cAMP digandingkan dengan kehadiran glukosa, dan kedua, persoalan keperluan bagi aspek sel. Selepas laktosa dibelah, ia sebenarnya membentuk glukosa dan galaktosa (yang mudah ditukar kepada glukosa). Dari segi metabolisme, laktosa adalah sama baiknya sebagai sumber karbon dan tenaga seperti glukosa. Tahap cAMP tidak ada kaitan dengan kepekatan glukosa intrasel tetapi dengan kadar pengangkutan glukosa, yang mempengaruhi aktiviti adenilat siklase. (Selain itu, pengangkutan glukosa juga membawa kepada perencatan langsung laktosa permease.) Berkenaan kenapa *E. coli* berfungsi dengan cara ini, ini hanya dapat dijawab dengan spekulasi. Semua bakteria enterik memproses glukosa, yang menunjukkan mereka kerap menjumpainya. Ada kemungkinan bahawa perbezaan kecil dalam kecekapan pengangkutan atau metabolisme glukosa berbanding laktosa menjadikannya berfaedah bagi sel mengawal operon *lac* dengan cara ini.

## Penggunaan dalam biologi molekul
Gen *lac* dan derivatifnya boleh digunakan sebagai gen pelapor dalam beberapa teknik pemilihan berasaskan bakteria seperti analisis dua hibrid, di mana kejayaan pengikatan pengaktif transkripsi kepada jujukan promoter tertentu mesti ditentukan. Dalam plat LB yang mengandungi X-gal, perubahan warna daripada koloni putih kepada warna biru sepadan dengan kira-kira 20-100 unit β-galaktosidase, manakala tetrazolium laktosa dan media laktosa MacConkey mempunyai julat 100-1000 unit, yang paling sensitif dalam bahagian tinggi dan rendah julat ini masing-masing. Memandangkan media laktosa MacConkey dan tetrazolium laktosa kedua-duanya bergantung terhadap produk pecahan laktosa, ia memerlukan kehadiran kedua-dua gen *lacZ* dan *lacY* . Oleh itu, banyak teknik gabungan *lac* yang merangkumi hanya gen *lacZ* sesuai buat plat X-gal atau sup cecair ONPG.

## Rujukan