Проширен генетски код

**Проширен генетски код** е вештачки модифициран генетски код во кој еден или повеќе специфични кодони се прераспределени да кодираат аминокиселина која не е меѓу 22-те белковинаогени аминокиселини .

Клучните предуслови за проширување на генетскиот код се:

* не-природна аминокиселина за дадениот организам 
* неискористен кодон за декодирање
* тРНК што го препознава неискористениот кодон и
* тРНК синтетаза која ја препознава само страната, специфична тРНК и само нестандардната аминокиселина.

Проширувањето на генетскиот код се врши со цел да ги дизајнира живите системи за точно определени, специфични цели и промени нивните својства различно од природниот генотип. Проширувањето на генетскиот код го збогатува репертоарот на корисни алатки достапни за науката.

Во мај 2019 година научниците создавале нова синтетичка форма на  живот, нов вид на бактеријата *[[Escherichia coli]]*, со намалување на природниот број од 64 кодони во бактерискиот геном на 61 кодон. (елиминирајќи два од шест кодони кои кодираат за серин и еден од трите стоп-кодони) - од кои 59 користеле за кодирање на 20 аминокиселини .

## Вовед
Генетскиот код за сите организми, со многу мали исклучоци, е ист, така што сите живи суштества користат ист „генетски јазик“. Општо земено, воведувањето на нови, синтетски, вештачки, абиогени аминокиселини во белковините на живите клетки ја нарушува универзалноста на генетскиот јазик, што води до алтернативни форми на живот. Белковините се произведуваат благодарение на системот за транслација, кој ги декодираат пораките на РНК во низата аминокиселини. Транслацијата на генетските информации содржани во информациската РНК (иРНК) во дадена белковина е катализирана од рибозомите. Трансфер РНК (тРНК) се користи како клуч за декодирање на иРНК во полипептидот кој таа го кодира. тРНК препознава специфичен кодон во иРНК со комплементарна низа наречена антикодон на една од нејзините јамки. Секој кодон со три нуклеотиди се преведува во една од дваесетте природни аминокиселини. Постои најмалку една тРНК за кој било кодон, кои ја кодираат истата аминокиселина. Ензимот наречен аминоацил тРНК синтетаза ковалентно ја прикачува аминокиселината на соодветната тРНК. Повеќето клетки имаат различни синтетази за секоја аминокиселина (20 или повеќе синтетази). Од друга страна, некои бактерии имаат помалку од 20 синтетази и ја внесуваат „недостасуваната“ аминокиселина(и) со модификација на структурно поврзана аминокиселина со ензим на аминотрансфераза.  Одликата искористена во проширувањето на генетскиот код е фактот што аминоацилна тРНК синтетазата често не го препознава антикодонот, туку друг дел од тРНК, што значи дека ако антикодонот се промени, кодирањето на таа аминокиселина би се променило во нов кодон. Во рибозомите, информациите од мРНК се преведуваат во специфична аминокиселина кога кодонот на иРНК се совпаѓа со комплементарниот антикодон на тРНК, а аминокиселината се додава на растечкиот полипептиден ланец. Кога се ослободува од рибозомот, полипептидниот ланец се витка во функционална белковина.

Со цел да се воведе нова аминокиселина во генетскиот код, потребни се неколку промени. Прво, за успешно декодирање на новата аминокиселина, кодонот на кој и е доделена не може да се користи за било која од 20-те природни аминокиселини. За ова се стоп-кодон или кодон со четири бази, кој се декодира со посебен тип на рибозоми. Второ, потребен е нов пар на тРНК и аминоацил тРНК синтетаза, кои се нарекуваат ортогонални парови, во смисла на тоа да истите ги нема во природниот фенотип на организмот. Во идеален случај, ортогоналните парови не смеат да интерагираат со било кој пар на ендогена тРНК/синтетаза, меѓутоа целиот тој систем треба да биде компатибилен со рибозомот и системот на белковинска транслација. Најчесто, активниот каталитички центар на синтетазата лабораториски се менува на таков начин да истиот е специфичен само и само за абиогената, не-стандардна амино акселина.  Синтетазата исто така се модифицира за да ја интерагира само ортогоналната тРНК.

20-те белковинаогени аминокиселини кои се ендогени на организмот во кој се врши експанзија на генетискиот код се нарекуваат стандардни аминокиселини, односно природни или канонски, додека новите аминокиселини се означуваат како нестандардни аминокиселини (нсАК) или неприродни, киселини  или не-канонски аминокиселини.

## Нестандардни аминокиселини
Првиот елемент на системот е нестандардната аминокиселина.

Покажано е дека над 71 различни нсАК се можат да се додадат во протеомот на *E. coli*, квасеци или цицачи. НсАК се структурно поголеми од стандардните аминокиселини. Најчесто, поради физиолошка сличност, имаат основна структура на фенилаланин која содржи различни супституенти, давајќи им различни својства. Ваквата разновидност овозможува мноштво на нови функции, како што се означување на белковини со помош на т.н. клик хемија, флуоресцентни маркери или белковинини во *E. coli* со еукариотски пост-транслациони модификации (на *пр.* фосфосерин, фосфотреонин и фосфотирозин).

Основата на проширувањето на генетскиот код е за првпат покажана од Ролф Фуртнер, кој сам, користејќи тРНК  која кодира за фенилаланин и соодветната синтетаза, инкорпорирал п-јодофенилаланин во *E.coli*.

До сега, неприродните аминокиселини кои биле инкорпорирани во белковините содржат радиоактивни тешки изотопи со цел да се овозможат одредени кристалографски испитувања со х зраци; аминокиселини кои имаат нови електроснки и стерни својства; фото-врзувачки аминокиселини кои може да се користат за испитување на меѓубелковински интеракции *[[in vitro]]* или *[[in vivo]]*; кето, ацетилен, азид и боронатни супституенти за означување *in vitro* или *in vivo*; редокс својства за испитување и модулирање на процесот на пренос на електрони; фотоактивни својства за регулација на биолошките процеси; лиганди за метали кои може да бидат катализатори или сензори за метални јони; флуоресцентни или инфра-црвени својства за испитување на структурата и динамиката на белковините; α-хидрокси киселини и D-аминокиселини како алатки за проучување на конформацијата и интеракциите помеѓу на водородните врски; миметици на фосфорилирани аминокиселини како проби за пост-транслациски модификации.

Бидејќи се абиогени, нсАА е потребно или да се внесат егзогено или истите да бидат биосинтетизирани. Во првиот случај, нсАА најпрвин хемиски се синтетизира во нејзината оптички чиста L-форма. Потоа истата се додава во хранливиот медиумот кој овозможува раст и одржување на соодветните клетки. Во вториот случај, преку соодветни софтвери се идентификуваат соодветните ензими и истите по пат на генетски инжењеринг се внесуваат во организмот од интерес кој треба да ја биосинтетизира новата аминокиселина. На пример, создаден е сој на *E. coli* кој биосинтетизира p-аминофенилаланин од основни претходници истата ја декодира во својот генетски код.

## Распределба на кодон
Втор елемент на системот е кодон кој ја кодира новата нсАК.

Главната препрека за проширувањето на генетскиот код е тоа фактот што сите кодони кодираат за соодветните биогени аминокиселини.  Генетскиот код има точно определен распоред кој покажува знаци на различни фази на еволуцијата, но во определен временски период истиот престанал да се менивуа и е речиси универзално зачуван. Во однос на честотата во која се случува, некои кодони се поретко застапени од другите. Кај многу сите организми, употребата на 3-те стоп кодони е различно распространета. Кај *E. coli* најреткиот е т.н. килибарен стоп-кодон (UAG).

### Супресија на килибарниот кодон
Можноста за повторно користење на кодоните е за прв пат покажана од Normanly *et al.* во 1990 година, кога сој на *E. coli* го пропушта UAG (килибарниот) стоп-кодон . Ова беше возможно поради ретката застапеност на овој кодон и фактот дека факторот на ослободување 1 сам го катализира процесот на завшеток на транслацијата под дејство на овој кодон. Во лабораторијата на Шулц, тРНКTир/тирозил-тРНК синтетаза (TирРС) од *Methanococcus jannaschii*, архебактерија, била искористена за воведување на тирозин наместо стоп, стандардната функција на килибарниот кодон. Ова е овозможено поради разликите помеѓу ендогените бактериски синтази и ортогоналната археална синтетаза, кои не се препознаваат и интерагираат меѓу себе. Дополнително, групата го еволуирала ортогоналниот пар тРНК/синтетаза за да ја инкорпорира нестандардната аминокиселина *О-* метилтирозин. Ова било дополнително проследено со стерно поголемиот нафтилаланин  и супституентот за фото-врзување бензоилфенилаланин, што ја докажало потенцијалната корисност на системот.

Килибарниот кодон е најмалку користениот кодон кај *E.coli*, но неговата промена  и распределба со друга функционалност резултира со значително губење на нормалниот раст на бактеријата. Едно истражување, покажало дека има најмалку 83 пептиди кои се доминантно главно засегнати и зависат од неговото прескокнување во самата белковинска синтеза  Дополнително, инкорпорирањето на аминокиселината која килибарниот кодон ја кодирал наместо запирање на транслацијата било нецелосно. Како последица на тоа, преку генетски инжињеринг создадени се неколку соеви со цел да се подобри растот на бактеријата, вклучително и отстранување на сите килибарни кодони од геномот. Во повеќето соеви на *E. coli* K-12 (т.е.  (молекуларна биологија)) има 321 UAG стоп-кодони. Следствено, огромни напори се вложени со цел истите да се заменат со аналогни стоп кодони. Единствениот успешен пристап до сега е од страна на групата на проф. Џорџ Чрч од Харвард, т.н. MAGE во CAGE: овие методи се потпираат на мултиплексна трансформација и последователна рекомбинација на добиените соеви во секој чекор за да се отстранат сите UAG кодони - рекомбинацијата претставувал главниот дел на запирање во првиот труд, но истиот бил надминат. Ова резултирало со сојот C321ΔA, на кој му недостасуваат сите UAG кодони и факторот на ослободување 1 (ФО1). Дополнително, овој сој бил дополнително направен „зависен“ од нсАК бисфенилаланин со еволуирање на неколку клучни ензими.

### Пренамена на редок кодон кој кодира за биогени аминокиселини.
Покрај килибарниот кодон, земени се предвид и кодони ретка застапеност кои кодираат за една од 20-те биогени аминокиселини. Кодонот AGG кодира за аргинин и бактериски сој бил успешно модифициран со цел да го пренамени да кодира за 6-*N-*алилоксикарбонил-лизин. Друг кандидат е AUA кодонот, кој е невообичаен по тоа што неговата соодветна тРНК треба да се разликува од AUG што го кодира метионинот. AUA тРНКАта има посебна база, лизидин. Делецијата на генот за оваа синтетаза( *tilS* ) било овозможено со замената на нативната тРНК со онаа на *Mycoplasma mobile* (која не содржи лизидин). Намалената способност за размножување е првиот чекор кон притисокот врз сојот да ги мутира сите AUA кодони во својот геном, овозможувајќи истите да се користат за проширување на генетскиот код.

### Четири базни (квадруплетни) кодони
Додека тројните кодони се основата на генетскиот код кај секој природен генотип, програмираното +1 рамково поместување  е природен процес кој овозможува употреба на четиринуклеотидна низа (квадруплетен кодон) за кодирање на аминокиселина. Покажано е дека квадруплетниот кодон може да се користи за кодирање на нсАК во експериментални услови. Ова овозможува истовремена употреба на две неприродни аминокиселини, *р-* азидофенилаланин (пАзФ) и N6-[(2-пропинилокси)карбонил]лизин (КАЛ), кои меѓусебно интерагираат преку циклоадиција по Хусиген. Квадруплетното декодирање во нормалниот генотип, кој претходно не е генетски модифициран и инжењиран е неефикасно. Ова произлегува од фактот што интеракцијата помеѓу инженерските тРНК со терцијарните комплекси или други компоненти на транслациониот систем не е поволна и силна како кај ендогените елементи. Овој проблем може да се надмине со специфично инженерство и развој на тРНК која може да декодира квадруплетни кодони во соеви со нормален, немодифициран геном и фенотип. На овој начин може да се генерираат до 4 различни квадруплетни парови на ортогонални тРНК/тРНК синтетаза. Пристапот за декодирање на квадруплетни кодони, исто така, бил применет за развој на вакцина против ХИВ-1.

## Парови на тРНК/синтетаза
Друг клучен елемент се тРНК/синтетаза паровите.

Ортогоналнит пар на тРНКА/синтета може да се мутира на точно определени делови во соодветанта низа и преку процесот на насочена еволуција истиот да биде инжењиран со цел да може да ја користи било која аминокиселина. Покрај прекодирањето на тРНК на различен кодон, истите можат да се мутираат за да препознаат кодон со четири бази, овозможувајќи дополнителни опции за кодирање и додавање на останати нсАК.
лево|мини|700x700пкс| Развиени се неколку методи за избор на синтетаза која ја прифаќа само нсАК. Еден од нив е со користење на комбинација на позитивна и негативна селекција

### Ортогонални парови во моделне организми
Ортогоналните парови на тРНК/синтетаза кои се ендогени во еден организам, не треба да бидат активни во нормален, ендоген генотип на друг организам, бидејќи синтетазата може погрешно да ги аминоацилира ендогените тРНК или ортогоналната тРНК да биде погрешно аминоацилирана од ендогена синтетаза. Како резултат на тоа, ортогоналните парови создадени до денес се разликуваат во нивната активност во организмите.

Во 2017 година бил создаден глушец со проширен генетски код кој може да произведува белковини со неприродни аминокиселини.

## Ортогонални рибозоми
Слично на ортогоналните тРНК/синтетаза парови, ортогоналните рибозоми се дизајнирани да вршат транслација паралелно и независно од природните рибозоми. Ортогоналните рибозоми користат различни транскрипти на иРНК од ендогените рибозоми и интерагираат со посебна група на тРНКи. Ова треба да го ублажи ефектот на губењето на нормалната, здрава состојба која е дел произлегува од техниките како што е супресија на амбер кодон. Дополнително, ортогоналните рибозоми може да се мутираат и оптимизираат за одредени задачи, како што е препознавање на четворни кодони. Таквата оптимизација не е можна, или е многу неповолна за природните рибозоми.

### о-Рибозоми
Во 2005 година беа објавени три групи на рибозоми, кои не ја препознаваат ендогената мРНК, туку вршат транслација на посебни ортогонални иРНК (o-иРНК). Ова било постигнато со промена на низата на препознавање на иРНК, т.н. Шајн-Далгарно низа, и соодветната низа на 16S рРНК во рибозомите, т.н. анти-Шајн-Далгарно низа. На овој начин спарувањето на базите, кое обично се губи доколку било која низа е мутирана, останува достапно.

### Рибо-Х
Во 2007 година, групата на Џејсон Чин произвела ортогоналени рибозоми, кои биле оптимизирани за супресија на килибарните кодони. 16S рРНК-та била мутирана на таков начин што го интерагирала со ФО1 помалку силно отколку ендогениот рибозом. Овој систем сепак не го решил проблемот со нарушената физиолошка состојба како резултат на супресијата на стоп-кодоните во ендогените белковини. Меѓутоа, преку подобрената специфичност, значително се зголемиле приносите на правилно синтетизираната целна белковина (од ~ 20% до >60% проценти за еден килибар кодон да биде потиснат и да формира 20% за два килибарни кодони).

### Рибо-Кју
Во 2010 година, повторно групата на Џејсон Чин претставила дополнителна оптимизирана верзија на ортогоналните рибозоми. Рибо-Кју е рибозом каде16S рРНК е оптимизирана да препознава тРНКи, кои имаат квадруплетни анти-кодони за да препознаваат квадруплетни кодони, наместо нормалните триплетни парови. Со овој пристап, бројот на можни кодони се зголемува од 64 на 256. Овој метод овозможува кодирање на повеќе од 200 различни нсАК.

 

## Поврзани методи

### Метод на инкорпорација под селективен притисок за производство на алобелковини
Постојат многу студии кои демонстрираат синтеза на белковини со нестандардни аминокиселини, без притоа да биде променет генетскиот код. Овие белковини, наречени алобелковина, се создаваат со инкубирање на клетките со нсАК во отсуство на слична кодирана аминокиселина со цел првата да биде инкорпорирана во белковината наместо онаа која би се инкорпорирала нормално, на пример L- 2-аминохексанска киселина наместо метионин.

Овие студии се базираат на вродената промискуитетна активност на аминоацил тРНК синтетазата за кон структурен аналог сличен на природниот супстрат, на пример, изолеуцин за метионил-тРНК синтаза наместо метионин. Во белковинската кристалографија, додавањето на селенометионин во култура на ауксотрофичен сој кон метионин резултира со белковини кои содржат селенометионин за наместо метионин. Друг пример се фотолеуцин и фотометионин се додаваат наместо леуцин и метионин за фото-означување на белковини. Слично на тоа, некои габи толерантни кон телур можат да инкорпорираат телуроцистеин и телурометионин во нивниоте белковини наместо цистеин и метионин. Самиот процес на проширување на генетскиот код е покомплексен бидејќи не заменува аминокиселина, туку додава една или повеќе кон нормалниот кодот. Од друга страна, заменувањето на аминокиселини на ниво на протеомот е најефикасно преку целосна замена на аминокиселините. На пример, постојат обиди за целосна замена на природните аминокиселини на ниво на протеомот со флуорирани аналози во *E. coli*  и *B. subtilis* . Целосна супституција на триптофан со тиенопирол-аланин кон 20899 UGG кодони во *E. coli* е опишано во 2015 година од Будиса и Сол . Покрај тоа, многу биолошки феномени, како што се виткањето и стабилност на белковините, се засноваат на синергистички ефекти на многу позиции во белковинската структура.

Во овој контекст, инкорпорацијата под селективен притисок генерира рекомбинантни белковини или алобелковини директно со замена на природните аминокиселини со неприродни аналози. Клетката домаќин која покажува ауксотрофична зависност е дополнета со аналози за време на експресијата на целната белковина. Овој пристап ги избегнува недостатоците на методите засновани на супресија  и е супериорен во однос на ефикасноста, репродуцибилноста и исклучително едноставната експериментална постава. Бројни студии покажуваат како глобалната замена на биогените аминокиселини со различни изостерични аналози предизвикува минимални структурни промени, но драматични промени во термодинамските својства, виткањето, агрегацијата, спектрални својства  и ензимската активност.

### ''Ин витро'' синтеза
Проширувањето на генетскиот код опишано во претходниот параграф е *in vivo* . Друг пристап е користење на *ин витро* системи*.* Ова бара отстранување или целосна сатурација на тРНКи и селективно воведување на одредени аминоацилирани-тРНК, некои кои се однапред хемиски аминоацилирани.

### Хемиска синтеза
Постојат неколку техники за хемиска синтеза на пептиди, кои се базираат на заштитни групи и цврста подлога.

Во ноември 2017 година, тим од Истражувачкиот институт Скрипс објавил дека конструирал полусинтетички геном на *E. coli* користејќи шест различни нуклеински киселини (наспроти нормалните четири пронајдени во природата). Двете дополнителни „букви“ формираат трет, неприроден базен пар. Добиените организми покажале репордукција и синтеза на нови белковини користејќи „неприродни аминокиселини“. Неприродниот базен пар кој се користел е dNaM –dTPT3. Овој неприроден базен пар е претходно идентификуван и синтетизиран, но ова е прва студија која демонстира транскрипција и транслацијад на белковини заснована на неприродени базни парови.

Категорија:Нуклеински киселини
Категорија:Молекуларна генетика