Homologinis modeliavimas

**Homologinis modeliavimas** – baltymo („taikinio“) tretinės struktūros sudarymas remiantis vieno ar keleto panašių baltymų žinomomis tretinėmis struktūromis (šablonais). Baltymo tretinė struktūra informatyvesnė nei jį sudarančių aminorūgščių seka, nes baltymo ir kitų molekulių tarpusavio sąveikas lemia aminorūgštys, artimos erdvėje, bet galinčios būti toli viena nuo kitos sekoje. Būtinos homologiniam modeliavimui sąlygos: pakankamas panašumas tarp „taikinio“ sekos ir šablono struktūros, galimybė sudaryti korektišką šių baltymų aminorūgščių sekų palyginį. Šis struktūros nuspėjimo būdas remiasi pastebėjimais, kad:
* Maži pakeitimai baltymo sekoje lemia mažus tretinės struktūros pokyčius.
* Baltymo aminorūgščių seka apsprendžia jo struktūrą. Žinant seką, turėtų būti įmanoma nusakyti struktūrą .
* Evoliucijos metu tretinė struktūra yra stabilesnė ir keičiasi lėčiau nei seka, todėl panašios arba mažai panašios, bet giminingos sekos susisuka į panašias erdvines struktūras. Taip pat ir tolimai susiję sekos susisuka į panašias struktūras. Rost (1999) šiai taisyklei išvedė apribojimus, nurodytus paveiksle. Kol dviejų sekų ilgis ir identiškų aminorūgščių procentas patenka į „saugų” regioną, abi sekos turės panašias struktūras .

Homologijos nereikėtų painioti su panašumu. „Homologija“ reiškia „bendros evoliucinės ištakos turėjimą“ ir yra kokybinis ryšio tarp objektų aprašymas.

Šiuo metu didžioji dalis homologinio modeliavimo yra automatizuota. Homologinio modeliavimo pagalba galima sukurti modelius ~25 % genomo koduojamų baltymų. Likusiems 75 % genomo nėra šablonų su žinoma struktūra arba jų neaptinka paprasta BLAST paieška. Joms reikia naudoti sanklodos atpažinimo, *ab initio* metodus arba tiesiog atlikti eksperimentinį struktūros nustatymą.

Modelio kokybę galima apytiksliai nuspėti iš „taikinio“ ir šablono sekų panašumo. Didesnis nei 30 % sekų identiškumas dažniausiai rodo, jog bus gautas gana tikslus modelis. Jei taikinio ir matricos sekų identiškumas 40 %, standartiniai automatiniai sekos-sekos palyginimo metodai generuoja tikslius palyginius. Kai sekų identiškumas \alpha-spiralėse]] ir <math>\beta</math>-juostose), paslėptuose regionuose. Kai kurie palyginių sudarymo metodai atsižvelgia į šiuos kriterijus, tačiau svarbu modeliuotojui pačiam patikrinti palyginį. Blogas vienos liekanos pozicijos sulyginimas gali lemti 4 Å dydžio paklaidą modelyje, nes esami modeliavimo metodai negali ištaisyti palyginyje padarytų klaidų.

Detali „taikinio“ ir šablono šeimų sekų analizė, charakteringų sanklodos savybių ištyrimas bei literatūros ir bet kokių prieinamų biocheminių žinių (mutacijų, katalitinių liekanų ir t. t.) panaudojimas yra būtinas, nes net mažiausios detalės gali padėti sudaryti teisingą seka-struktūra palyginį neaiškiose dalyse. Taip pat labai patartina padalinti „taikinio“ seką į atskirus domenus, pašalinti ilgus intarpus iš sanklodos šerdies ir pakartotinai pateikti užklausas nuspėjimo serveriams.

### Modelio sudarymas
Turint palyginį, galima konstruoti 3D modelį. Modelio sudarymas skirstomas į šiuos etapus:
# Karkaso generavimas.
# Kilpų modeliavimas.
# Šoninių grandinių modeliavimas.
Modelio sudarymo metodai skirstomi į tris grupes:
# Modeliavimas surenkant fragmentus – modelis surenkamas iš išspręstų giminingų struktūrų fragmentų.
# Modeliavimas pagal segmentų atitikimą. Metodas remiasi šablonų konservatyvių atomų pozicijų panaudojimu kitų atomų koordinatėms apskaičiuoti. „Taikinys“ padalijamas į trumpus segmentus, kurių kiekvienas sulyginamas su tam tikru šablonu iš PDB. Sekų palyginys sudaromas su segmentais, o ne su visa baltymo struktūra. Šablonai parenkami pagal sekos panašumą, C<math>\alpha</math> koordinačių palyginimus ir spėjamus sterinius neatitikimus tarp „taikinio“ ir šablono 
# Modeliavimas patenkinant erdvinius apribojimus. Iš „taikinio“ sekos ir šablonų struktūrų palyginių suskaičiuojami erdviniai apribojimai, kurie pritaikomi modeliuojamo baltymo pagrindinėms koordinatėms (karkaso atstumams, dvisieniams kampams). Gautieji apribojimai naudojami ir baltymo struktūrai optimizuoti. Šis metodas pritaikytas MODELLER programoje .

#### Karkaso generavimas
Turint palyginį, pradedamas modeliavimas nukopijuojant tų šablono aminorūgščių koordinates, kurios sutampa su „taikinio“ seka palyginyje. Jei sulygintos aminorūgštys skiriasi, kopijuojamos tik karkaso koordinatės (N, C\alpha, C ir O). Jei sutampa, gali būti įjungiamos ir šoninės grandinės.

Eksperimentiškai nustatytos baltymų struktūros turi paklaidas, todėl sėkmingo modelio sudarymas priklauso nuo tiksliausio šablono pasirinkimo. Padėti gali PDBREPORT duomenų bazė. Turint du šablonus su blogiau apibrėžtais, bet nesutampančiais regionais, galima panaudoti abejų šablonų gerąsias dalis. Toks modeliavimas vadinamas daugybinių šablonų modeliavimu (). Jis taip pat taikomas, kai palyginys tarp „taikinio“ ir šablonų gerai sutampa skirtinguose regionuose.

#### Kilpų modeliavimas
Daugumoje atvejų, modelio ir šablono sekų palyginiuose yra tarpų (). Jie gali būti arba modelio sekoje (delecijos), arba šablonos sekoje (insercijos). Esant delecijoms, tiesiog praleidžiamos šablono aminorūgščių liekanos sukuriant skylę modelyje, kurią reikia užpildyti. Esant insercijoms, iš šablono imamas ištisinis karkasas, perkerpamas ir įterpiamos trūkstamos liekanos. Abu atvejai reiškia konformacinius pakitimus karkase. Konformaciniai pakitimai rečiau sutinkami įprastuose antrinės struktūros elementuose, todėl dažniausiai saugu visas insercijas ir delecijas perstumti iš \beta-lakštų ir \alpha- spiralių į kilpas ir linkius. Šiuos pokyčius kilpose sunku numatyti (taikonformaciją. viena didelė neišspręsta problema homologiniame modeliavime). Netgi nesant insercijų ar delecijų, dažnai randamos skirtingų konformacijų kilpos taikinyje ir šablone. Šio reiškinio priežastys gali būti kelios:
# Formuojantis baltymo kristalui, kilpų konformacija gali keistis, ypač jei kilpos dalyvauja sudarant kristalinius kontaktus.
# Kilpos pradžioje esančios mažos šoninės grandinės pakeitimas į didelę arba didelės į mažą gali pakeisti kilpos padėtį.
# Kilpos aminorūgšties pakeitimas į proliną arba iš glicino į bet kurią kitą aminorūgštį. Prolinas turi mažesnę prieinamų konformacijų aibę, o glicinas – didesnę, todėl nauja liekana turi tilpti į labiau suvaržytą Ramachandrano žemėlapio dalį, kas dažniausiai reikalauja kilpos konformacinių pokyčių.
Yra du galimi variantai kilpoms modeliuoti:
# Pagrįstas žiniomis: PDB ieškoma žinomų kilpų, kurių galai sutampa su liekanomis, tarp kurių turi būti įterpta kilpa, ir tiesiog nukopijuojama kilpos konformacija. Visos didžiosios molekulinio modeliavimo programos ir serveriai turi šią funkciją (pvz., 3D-Jigsaw, Insight, Modeller, Swiss-Model, WHAT IF).
# Pagrįstas jėgų laukais: kilpos kokybei nustatyti naudojama energijos funkcija. Ji minimizuojama naudojant Monte Carlo metodą arba molekulinės dinamikos metodą, norint gauti pačią geriausią kilpos konformaciją.
Trumpų kilpų (5-8 liekanų) konformacijas galima nuspėti gana patikimai. Paviršiaus kilpos linkę pakeisti savo konformaciją dėl kristalinių kontaktų. Taigi, jei modelis darytas išskirtam baltymui, o vėliau nustatyta jo struktūra, kuri nesutampa su modeliu, vistik modelis gali būti teisingas.

#### Šoninių grandinių modeliavimas
Šoninės grandinės, kurios yra konservatyvios struktūriškai panašiuose baltymuose, dažnai turi panašius \chi1-kampus (sukimo kampas aplink C\alpha-C\beta ryšį). Todėl galima tiesiog nukopijuoti konservatyvias liekanas nuo šablono į modelį ir išgauti didesnį tikslumą nei vien kopijuojant karkasą ir iš naujo spėjant šoninių grandinių struktūrą. Praktikoje ši taisyklė galioja tik kai sekos labai identiškos, kai konservatyvios liekanos formuoja kontaktų tinklą. Kai sekų identiškumas \chi1-kampų patenka į ±20° nuo eksperimentinių verčių, ir daug mažesnis paviršiuje esančioms liekanoms, kur procentas dažnai mažesnis nei 50 %. Tam yra dvi priežastys:
# Eksperimentinės: lanksčios paviršiaus aminorūgščių šoninės grandinės linkę išsidėlioti į įvairias konformacijas, kurias dar įtakoja kristaliniai kontaktai. Net eksperimentas negali duoti vieno vienintelio teisingo atsakymo.
# Teorinės: energijos funkcijos, naudojamos rotamerams įvertinti, gali lengvai susidoroti su hidrofobiniu supakavimu šerdyje (daugiausia Van der Valso sąveikomis), tačiau nėra tokios tikslios teisingoms sudėtingoms elektrostatinėms sąveikoms paviršiuje, tarp jų ir vandeniliniams ryšiams su vandens molekulėmis ir susijusiems entropiniams efektams gauti.

Norint labai tiksliai nuspėti šoninių grandinių rotamerus, reikalingas teisingas karkasas, kuris priklauso nuo rotamerų ir jų išsidėstymo. Įprastas tokios problemos sprendimo būdas yra nuspėti rotamerus, tuomet ištaisyti atsiradusius poslinkius karkase, tuomet rotamerus naujam karkasui ir t. t. Tai sudaro ciklą rotamerų nuspėjimo ir energijos minimizavimo stadijų. Naudojami metodai, aprašyti kilpų modeliavime, tik šį kartą jie taikomi visai baltymo struktūrai.

### Modelio įvertinimas
Sukurtą modelį reikia patikrinti, ar jame nėra klaidų, ar jis teisingas. Tai atliekama dviem būdais:
# „Vidinė“ patikra. Tikrinama, ar modelis atitinka nustatymus, naudotus jam apskaičiuoti.
# „Išorinė“ patikra. Remiamasi informacija, kuri nebuvo naudota modeliui apskaičiuoti. „Išorinės“ patikros metu:
## Tikrinama, ar modeliavimui buvo pasirinktas tinkamas šablonas. Tai ypač svarbu, jei palyginys nežymiai reikšmingas arba turi būti įvertinta keletas šablonų su skirtingomis struktūromis. Kai sekų identiškumas mažas (-15 s) ir pamėgžioja tikrą susivyniojimo procesą. Tikimasi, kad modeliavimo metu modelis susivynios į galutinę tikrą struktūrą. Privalumas tas, kad molekulinės dinamikos modeliavimas įtraukia entropinius efektus, kuriuos kitu būdu sunku suvaldyti. Trūkumas tas, kad jėgos laukai nepakankamai tikslūs. Išlieka didelė tikimybė, kad modeliavimo metu modelis bus sujauktas, jo kokybė žymiai pablogės. Šiuos modeliavimus atlikti galima tik turint solvatuotas molekules. Tam dažnai panaudojamas kristalizacinis vanduo.

## Modelio patikimumas ir paklaidos
Galimybę sudaryti tikslų modelį įtakoja keletas svarbių faktorių:
# **Struktūrinio konservatyvumo laipsnis tarp taikinio ir šablono**: Jei šablono ir „taikinio“ sekų identiškumas didesnis nei 90 %, modelio tikslumas gali būti palyginamas su kristalografiškai nustatytomis struktūromis. Modeliai, sudaryti naudojant 50-90 % identišką šabloną, dažniausiai labai tikslūs – nuokrypis nuo eksperimentinės struktūros yra tik ~1 Å C\alpha atomo koordinačių standartinis nuokrypis (RMSD, ) su žymiai didesnėmis vietinėmis paklaidomis. RMSD naudojamas norint įvertinti pagrindinius atstumus tarp atitinkamų atomų sutapatintose struktūrose. Baltymų su 30-50 % sekų identiškumu, sutampa bent 80 % struktūros, o gaunamų modelių nuokrypis nuo natyvių struktūrų neperžengia 4 Å RMSD (vidutiniškai 2-3 Å). Klaidos dažniausiai randamos kilpų regionuose. Baltymų, kurių sekų identiškumas 20-30 %, struktūrinis konservatyvumas yra tik apie 55 %, ir dar mažesnis, kai sekų identiškumas nukrenta žemiau 20 %. Šiuo atveju palyginys tampa pagrindine silpna vieta homologiniame modeliavime, dažnai lemiančia labai dideles paklaidas.
# **Palyginio tikslumas/teisingumas**: palyginiai dažniausiai artimi optimaliems, kai „taikinio“ seka daugiau nei 30 % identiška šablono struktūrai. Kai sekų identiškumas mažesnis nei 20 %, palyginio kokybė stipriai krenta ‒ daugiau nei pusė visų liekanų gali būti neteisingai išlygiuotos.
# **Klaidų kiekis šablone ir koordinačių paklaidos**.

## Modelio klaidos
Kiekvienas homologinis modelis turi paklaidų ir gali turėti klaidų. Klaidos, įtakojančios modelio kokybę, gali įsivelti kiekviename žingsnyje. Mažėjant panašumui tarp šablono ir „taikinio“, klaidų modelyje daugėja. Tipiškos klaidos palyginamuosiuose modeliuose:
# **Klaidos šoninių grandinių supakavime**: kai sekos skiriasi, šoninių grandinių pakavimas į baltymo šerdį keičiasi. Kartais netgi identiškų šoninių grandinių konformacija yra nekonservatyvi. Šio tipo klaidos nėra svarbios, nebent jos yra regionuose, svarbiuose baltymo funkcijoms, pvz., aktyviajame centre arba ligandų surišimo vietose.
# **Iškraipymai ir poslinkiai teisingai sulygintuose regionuose**: dėl sekų skirtumų pagrindinės grandinės konformacija taip pat keičiasi, net jei bendra sankloda išlieka tokia pati. Kai kuriuose teisingai sulygintuose modelio segmentuose šablonas gali lokaliai (<3 Å) skirtis nuo „taikinio” ir todėl tame regione gaunamas neteisingas modelis. Kartais „taikinio“- šablono skirtumai yra pasekmė artefaktų, gautų nustatant struktūras (pvz., kristalų susipakavimo) arba struktūras nustatant skirtingose aplinkose. Keleto šablonų naudojimas tuo pačiu metu sumažina tokių klaidų kiekį.
# **Klaidos regionuose, neturinčiuose šablono**: taikinio sekos segmentus, neturinčius atitinkamo regiono šablono struktūroje (insercijas) yra sunkiausia modeliuoti. Jei insercija trumpa (<8 liekanos), kai kuriais metodais galima patikimai nuspėti karkaso struktūrą. Tam būtinas teisingas palyginys ir tiksliai sumodeliuota aplinka aplink inserciją. Didesnių nei 8 liekanų insercijų turimais metodais dažniausiai neįmanoma teisingai sumodeliuoti.
# **Klaidos dėl neteisingų palyginių**: neteisingi palyginiai yra didžiausias klaidų šaltinis, ypač kai „taikinio“- šablono panašumas <40 %. Pvz., esant 30 % sekų identiškumui, vidutiniškai 20 % liekanų yra išlygiuojamos neteisingai. Vienos liekanos neteisingas išlygiavimas reiškia apie 4 Å pozicinę klaidą modelyje. Dabartinės palyginamojo modeliavimo programos negali ištaisyti klaidų palyginyje. Šios klaidos gali būti ištaisytos arba jų išvengta dviem būdais: 1) galima sudaryti daugybinį palyginį naudojant daugiau homologinių baltymų sekų, net jei dauguma ir neturi žinomų struktūrų. Daugybiniai palyginiai paprastai yra patikimesni nei poriniai. 2) pakeisti tuos palyginio regionus, kurie atitinka nuspėtas klaidas modelyje, aptiktas modelio tikrinimo metu.
# **Neteisingi šablonai**: tai potenciali problema, kuomet kaip šablonai naudojami tolimai susiję baltymai (sekų identiškumas <30 %). Modeliai, gauti naudojant neteisingus šablonus, gali būti aptikti įvertinimo etape. Didžiausia praktinė problema yra atskirti modelį, gautą naudojant neteisingą šabloną, nuo modelio, gauto sudarius neteisingą palyginį su teisingu šablonu. Abiem atvejais, įvertinimo metodai nustatys nepatikimą modelį. Svarbiausia patikrinti šabloną prieš pradedant modeliuoti.

## Metodų kokybės įvertinimas
Kas dvejus metus vyksta tarptautinis homologinio modeliavimo eksperimentas CASP – Critical Assessment of Technicues for Protein Structure Prediction. Jo metu išsiaiškinami naujausi pasiekimai baltymų struktūrų nuspėjimo srityje. Yra sukurta duomenų bazė ModBase, talpinanti homologinio modeliavimo pagalba gautas struktūras. Taip pat kuriama duomenų bazė 3Dcrunch, skirta talpinti struktūras, generuotas naudojant Swiss-Model programinę įrangą.

## Programos ir serveriai homologiniam modeliavimui

## Išnašos