아데노 연관 바이러스

[섬네일|수많은 작은 AAV에 둘러싸인 두 개의 [아데노바이러스(음성 염색 전자 현미경, 배율 약 200,000배)]]
**아데노 연관 바이러스**(, 이하 **AAV**)는 인간과 일부 다른 영장류를 감염시키는 작은 바이러스이다. 파르보바이러스 과에 속하며, 직경이 약 26nm인 외피가 없는 바이러스이고 약 4.8(kb)의 선형 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 가지고 있다.

AAV는 유전자 치료용 바이러스 벡터를 만드는데 있어서 매력적인 몇 가지 특징을 가지고 있다. AAV를 사용하는 유전자 치료 벡터는 분열 세포와 휴면 세포 모두를 감염시킬 수 있으며 숙주 세포의 유전체에 통합되지 않고 염색체 외 상태로 지속될 수 있다. 그러나 원래 바이러스에서는 바이러스가 운반하는 유전자가 숙주 게놈에 통합(integration)된다. 이 통합되는 특징은 상황에 따라 유용하게도, 아니게도 사용된다.

AAV는 최근 인간 임상 망막 유전자 치료에서 시험에서 좋은 결과를 보였다.

2023년 3월, 네이처 지의 한 논문에서는 유행하는 소아 간염 샘플에서 아데노바이러스 및 헤르페스바이러스와 함께 높은 수준의 아데노 연관 바이러스 2(AAV2)가 검출되었다고 말했다. 한 논문에서는 AAV2 동시 감염이 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 단독 감염보다 더 심각한 간 질환을 유발할 수 있으며 인과 관계는 아직 확립되지 않았다고 말했다.

## 역사
이전에는 아데노바이러스 제제의 오염물질로 여겨졌던 AAV는 1960년대 피츠버그의 Bob Atchison 연구실과 NIH의 Wallace Rowe 연구실에서 처음으로 이것이 의존성 파르보 바이러스임이 확인되었다. 이후 인간을 대상으로 한 혈청학적 연구에서는 아데노바이러스나 헤르페스 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스에 감염된 사람에게 AAV가 존재함에도 불구하고 AAV 자체는 질병을 유발하지 않는다는 사실이 밝혀졌다. 현재 AAV 벡터는 유전자 치료의 표준으로 여겨지고 있다.

## 유전자 치료에 사용

### 장점과 단점
야생형 AAV는 여러 가지 특징으로 인해 유전자 치료 연구자들에게 상당한 관심을 끌었다. 그중 가장 중요한 특징은 바이러스의 병원성이 거의 없다는 점이다. 또한 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있으며, 인간 19번 염색체의 특정 부위(AAVS1으로 명명됨)에 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합될 수 있다. 이러한 특징 덕분에 무작위 삽입 및 돌연변이 유발(때로는 암 발생으로 이어지는)의 위험이 있는 레트로바이러스보다 예측 가능성이 더 높다.

AAV 게놈은 대부분 앞서 언급한 부위에 통합되며, 게놈에 무작위로 통합되는 경우는 극히 드물다. 그러나 유전자 치료 벡터로서 AAV를 개발하는 과정에서는 벡터 DNA에서 *rep*와 *cap* 서열을 제거함으로써 이러한 통합 능력을 없앴다. 원하는 유전자와 해당 유전자의 전사를 유도하는 프로모터는 단일 가닥 벡터 DNA가 숙주 세포 DNA 중합효소 복합체에 의해 이중 가닥 DNA로 변환된 후 핵 내에서 연결체 형성을 돕는 inverted terminal repeats(ITR) 사이에 삽입된다.

AAV 기반 유전자 치료 벡터는 숙주 세포 핵에서 에피소말(episomal) 연결체를 형성한다. 분열하지 않는 세포에서는 이러한 연결체가 숙주 세포의 수명 동안 온전하게 유지된다. 분열하는 세포에서는 에피소말 DNA가 숙주 세포 DNA와 함께 복제되지 않기 때문에 AAV DNA는 세포 분열을 통해 소실된다. AAV DNA가 숙주 게놈에 무작위로 통합되는 것은 감지할 수 있지만 매우 낮은 빈도로 발생한다.

또한 AAV는 면역원성이 매우 낮아 중화 항체 생성에만 국한되는 것으로 보이며, 세포독성 반응은 정확하게 유도하지는 않는다. 이 특징은 휴면 세포를 감염시키는 능력과 함께 인간 유전자 치료의 벡터로서 아데노바이러스보다 선호하게끔 하는 특성 중 하나이다.*[[위키백과:출처 필요|<span title="This claim needs references to reliable sources. (February 2023)">출처 필요</span>]]*

AAV 생산의 주요 방법은 치료 유전자, AAV rep/cap 유전자 및 헬퍼 아데노바이러스 유전자를 포함하는 세 가지 플라스미드를 사용하여 HEK-293 세포를 일시적으로 형질전환하는 것이다. 생산 공정에는 배양, 특히 생물반응기에서의 배양과 완전한 캡시드의 수율을 높이고 불순물을 제거하기 위한 정제가 포함된다. 생산성을 향상시키기 위해 조작된 재조합 헬퍼 바이러스를 사용하거나, 안정적인 생산 세포주 확립 등 새로운 방법이 개발되는 중이다.

그러나 이 바이러스를 사용하는 데에는 몇 가지 단점이 있다. AA벡터의 클로닝 용량이 상대적으로 제한적이며, 대부분의 치료 유전자는 바이러스의 4.8킬로베이스 게놈 전체를 사용한다. 따라서 큰 유전자의 경우 표준 AAV 벡터에 사용하기에 적합하지 않다. 현재 이러한 제한된 용량을 극복하기 위한 다양한 방안이 연구되고 있다.*[[위키백과:출처 필요|<span title="This claim needs references to reliable sources. (February 2023)">출처 필요</span>]]*

* 두 게놈의 AAV ITR은 head-to-tail concatemers를 형성할 수 있으며 벡터의 용량을 거의 두 배로 늘릴 수 있다. 또한 스플라이스 부위의 삽입을 통해 전사체에서 ITR을 제거할 수 있다.
* CRISPR는 원하는 위치에 순차적 삽입을 사용할 수 있도록 한다. 그러므로 첫 번째 벡터로 표적 위치를 인식하고 원하는 유전자의 절반을 삽입한다. 그런 다음 두 번째 벡터는 절반이 완료된 삽입을 인식하고 나머지 절반을 삽입한다.

AAV의 특수 유전자 치료 이점 때문에 연구자들은 자가상보성 아데노 연관 바이러스(self-complementary adeno-associated virus, 이하 scAAV)라고 하는 변형된 AAV를 만들었다. AAV는 단일 가닥 DNA를 패키징하고 두 번째 가닥이 합성될 때까지 기다려야 하는 반면, scAAV는 서로 상보적인 두 개의 짧은 가닥을 패키징한다. 두 번째 가닥 합성을 피함으로써 scAAV는 더 빠르게 발현될 수 있지만, 단점으로는 scAAV는 이미 제한된 AAV 용량의 절반만 인코딩할 수 있다는 것이다. 최근 보고에 따르면 scAAV 벡터는 단일 가닥 아데노바이러스 벡터보다 면역원성이 더 높으며 세포독성 T 림프구의 활성화를 더 강하게 유도하는 것으로 나타났다.

야생형 바이러스 감염으로 유발되는 체액성 면역은 흔한 것으로 여겨진다. 이와 관련된 중화 활성은 가장 일반적으로 사용되는 AAV2 혈청형의 특정 적용 분야에서의 유용성을 제한한다. 따라서 현재 진행 중인 대부분의 임상 시험은 상대적으로 면역학적으로 특권적인 기관인 뇌에 AAV2를 전달하는 것을 목표로 한다.*[[위키백과:출처 필요|<span title="This claim needs references to reliable sources. (February 2023)">출처 필요</span>]]* 뇌에서 AAV2는 신경 세포에 대한 특이성이 매우 높다.*[[위키백과:출처 필요|<span title="This claim needs references to reliable sources. (February 2023)">출처 필요</span>]]*

2025년의 한 리뷰 논문은 AAV에 대한 생물학, 벡터 엔지니어링, 제조 및 임상 응용 분야의 발전을 요약했다.

### 임상 시험
2019년 현재 AAV 벡터는 전 세계적으로 250건 이상의 임상 시험에 사용되었으며 이는 바이러스 벡터 유전자 치료 시험의 약 8.3%에 해당한다. 최근에는 레버 선천성 흑내장(Leber's congenital amaurosis), 혈우병, 울혈성 심부전, 척수성 근위축증, 지질단백질 분해효소 결핍증, 파킨슨병 등을 포함한 여러 질병에 대한 1상 및 2상 시험에서 긍정적인 결과가 얻어졌다 .
## 면역학
섬네일|AAV2 캡시드를 리본 모형으로 나타낸 것으로, 이해를 돕기 위해 뒷부분은 가려져 있다. 5중 대칭축 하나가 중앙에 표시되어 있다.
AAV는 유전자 치료에서 특히 주목받는데, 인체에서 면역 반응을 유발하는 능력이 제한적이기 때문이다. 이러한 특성은 벡터 전달 효율을 높이는 동시에 면역 관련 질병 발생 위험을 줄이는데 긍정적인 영향을 미칠 것으로 예상된다.

AAV는 질병에 알려진 역할이 없는 것으로 여겨진다. 그러나 숙주 면역 반응과 면역 관용은 AAV 매개 유전자 치료의 효능을 감소시킨다. 숙주 면역 반응은 AAV 벡터, 형질전환 세포 및 형질전환 단백질에 반응하는 것으로 나타났다.

### 선천면역
AAV 벡터에 대한 선천면역 반응은 동물 모델에서 특성화되었다. 쥐에게 AAV를 정맥 투여하면 일시적인 염증성 사이토카인 생성과 간으로의 호중구 및 기타 백혈구의 침투가 발생하며, 이는 주입된 바이러스 입자의 상당 부분을 격리하는 것으로 보인다. 가용성 인자 수준과 세포 침투는 모두 6시간 이내에 기준선으로 돌아오는 것으로 보인다. 대조적으로, 더 공격적인 바이러스는 24시간 이상 지속되는 선천 반응을 생성한다.

생체 내 연구에 따르면 AAV 벡터는 Toll-like receptor (TLR)9 및 TLR2-MyD88 경로와 상호 작용하여 인터페론 생성을 자극함으로써 선천 면역 반응을 유발한다. TLR9 결핍 마우스는 AAV 치료에 더 잘 반응하고 더 높은 수준의 유전자 발현을 나타내는 것으로 나타났다.

### 체액 면역
AAV에 대한 체액 면역은 이미 많은 사람들이 이전의 자연 감염으로 인해 형성된 상태이며, 이 과정에서 생긴 중화항체(neutralizing antibodies, NAbs)를 가지고 있어 유전자 치료에서의 적용이 크게 제한될 수 있다. AAV는 야생형부터 합성 변종까지 매우 다양한 변종을 가지지만, 항체 인식 부위는 이 진화 과정에서 보존되었다.

이 바이러스는 동물 모델과 인간 집단에서 강력한 체액 면역을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 최대 80%의 개인이 AAV2에 대해 혈청 양성인 것으로 추정된다. 항체는 중화 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 유전자 치료 응용 분야에서는 일부 투여 경로를 통해 벡터 전달 효율에 영향을 미친다. 지속적인 AAV 특이 항체 수준 외에도 동물의 prime-boost studies와 임상 시험 모두에서 B 세포를 통한 기억도 감함을 알 수 있었다. 혈청 양성인 사람의 경우, AAV2에 대한 순환 IgG 항체는 주로 IgG1, IgG2 아형으로 구성되며, IgG3, IgG4는 거의 존재하지 않는 것으로 나타났다.

### 세포 매개 면역
바이러스 및 벡터에 대한 세포 매개 면역 반응은 아직 제대로 규명되지 않았으며, 2005년까지만 해도 문헌에서 거의 다뤄지지 않았다. 그 중 혈우병 B 치료를 위해 AAV2 기반 벡터를 사용한 임상 시험 결과, 형질전환된 세포의 표적 파괴가 일어날 수 있음을 시사하는 연구 결과가 존재한다. CD8+ 세포독성 T 세포가 시험관 내(*in vitro*)에서 AAV 캡시드의 구성 요소를 인식할 수 있다는 데이터와 함께, AAV 벡터에 대한 세포독성 T 림프구 반응이 있을 수 있음을 시사한다. 세포독성 반응은 AAV에 대한 반응에 CD4+ 보조 T 세포가 관여함을 의미하며, 인체 연구의 시험관 내 데이터는 바이러스가 실제로 Th1과 Th2 기억 반응을 포함한 이러한 반응을 유도할 수 있음을 시사한다. AAV 캡시드 단백질 VP1 내에서 여러 개의 T 세포 자극 에피톱(epitopes) 후보가 확인되었으며, 이 바이러스를 유전자 치료용 벡터로 사용하기 위해 캡시드 변형을 사용하는 것 또한 좋은 후보가 될 수 있다.

이러한 단계 중 일부는 다양한 유형의 세포에서 다르게 보일 수 있으며 이는AAV의 고유한 방향성에 영향을 준다. 바이러스 복제는 세포의 현재 세포 주기 단계에 따라 한 유형의 세포 내에서도 달라질 수 있다.

AAV의 특징 중 하나는 자가 복제 능력이 부족하여 정상 세포에서 증식할 수 없다는 점이다. AAV는 헬퍼 바이러스와 함께 세포를 감염시킴으로써 확산된다. 새로운 AAV 입자 생성을 성공적으로 제공하는 것으로 처음 밝혀진 헬퍼바이러스는 아데노바이러스였으며, AAV라는 이름도 여기서 유래되었다. 이후 AAV 복제는 아데노바이러스 게놈에서 유래한 특정 단백질, HSV, 백시니아 바이러스와 같은 다른 바이러스, 또는 자외선을 조사하거나, 하이드록시우레아와 같은 유전 독성 물질 등에 의해 촉진될 수 있음이 밝혀졌다. 헬퍼바이러스의 존재 여부에 따라 AAV의 생활주기는 각각 용해성 또는 용원성 경로를 따른다. 헬퍼바이러스가 존재하면 AAV의 유전자 발현이 활성화되어 숙주 세포의 중합효소를 이용하여 복제할 수 있게 된다. 헬퍼바이러스가 숙주 세포를 죽이면 새로운 AAV 바이러스 입자가 방출된다. 헬퍼바이러스가 존재하지 않으면 AAV는 용원성 행동을 나타낸다. AAV가 단독으로 세포를 감염시키면 유전자 발현이 억제되고(AAV는 복제되지 않음) 게놈이 숙주 게놈(인간의 경우 19번 염색체)에 통합된다. 드물게 헬퍼바이러스 없이도 용해가 발생할 수 있지만, 일반적으로 AAV는 자체적으로 복제하여 세포를 죽일 수 없다.

효율적인 AAV 생성에 필요한 최소한의 아데노바이러스 유전자 세트는 Matsushita, Ellinger 등이 발견했다. 이 발견으로 AAV 생산 세포가 아데노바이러스에 동시 감염될 필요 없는 새로운 재조합 AAV 생산 방법이 가능해졌다. 헬퍼 바이러스나 유전독성 인자가 없는 경우, AAV DNA는 숙주 게놈에 통합되거나 에피소말 형태로 존재할 수 있다. 전자의 경우, 숙주에 대한 통합은 Rep78 및 Rep68 단백질에 의해 매개되며, 통합되는 영역을 둘러쌀 ITR가 필요하다. 쥐를 이용한 동물 실험에서 AAV 게놈은 골격근과 같은 휴면 조직에서 에피소말 형태(head-to-tail concatemers 형태)로 장기간 존재하는 것이 관찰되었다.

## 각주

## 외부 링크

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분류:파르보바이러스과
분류:실험용 암치료
분류:응용유전학