단백질 공학

**단백질 공학**(蛋白質工學, protein engineering)은 유용하거나 가치있는 단백질을 개발하는 과정이다. 그것은 단백질 접힘과 단백질 설계 대한 많은 이해가 필요한 학문이다.

단백질 공학은 종종 자연에서 발견되는 아미노산 서열을 변경하여 비천연 폴리펩티드의 설계 및 생산을 통해 유용하거나 가치 있는 단백질을 개발하는 과정이다. 이는 단백질 폴딩의 이해와 단백질 설계 원리에 대한 인식에 대한 많은 연구가 진행되고 있는 젊은 분야이다. 그것은 산업 촉매 작용을 위한 많은 효소의 기능을 향상시키는 데 사용되었다. 또한 2017년까지 1,680억 달러로 추산되는 제품 및 서비스 시장이다.

단백질 공학에는 두 가지 일반적인 전략이 있다: 합리적 단백질 설계와 유도 진화. 이러한 방법은 상호 배타적이지 않다. 연구자들은 종종 이 두 가지를 모두 적용한다. 미래에는 단백질 구조와 기능에 대한 보다 자세한 지식과 고처리량 스크리닝의 발전으로 단백질 공학의 능력이 크게 확장될 수 있다. 결국에는 유전자 코드에 새로운 아미노산을 암호화할 수 있는 확장된 유전자 코드와 같은 새로운 방법을 통해 비천연 아미노산도 포함될 수 있다.

## 접근 방식

### 합리적 설계

합리적 단백질 설계에서 과학자는 단백질의 구조와 기능에 대한 상세한 지식을 사용하여 원하는 변화를 만든다. 일반적으로 부위지정 돌연변이 유발 방법이 잘 개발되어 있기 때문에 저렴하고 기술적으로 쉽다는 장점이 있다. 그러나 가장 큰 단점은 단백질의 상세한 구조 정보가 종종 부족하며, 설령 있다고 해도 구조 정보는 대부분 단백질 구조의 정적인 그림을 제공하기 때문에 다양한 돌연변이의 영향을 예측하기 매우 어려울 수 있다는 점이다. 하지만 Folding@home 및 폴드잇과 같은 프로그램은 크라우드소싱 기술을 활용하여 단백질의 접힘 모티프에 대한 통찰력을 얻고 있다.

컴퓨터 단백질 설계 알고리즘은 미리 지정된 목표 구조로 접혔을 때 에너지가 낮은 새로운 아미노산 서열을 식별하고자 한다. 검색해야 할 서열-형태 공간은 넓지만, 컴퓨터 단백질 설계의 가장 어려운 요구 사항은 최적의 서열을 유사한 차선의 서열과 구별할 수 있는 빠르고 정확한 에너지 함수이다.

### 다중 서열 정렬
단백질에 대한 구조 정보가 없는 경우, 서열 분석은 단백질에 대한 정보를 밝히는 데 종종 유용하다. 이러한 기술에는 대상 단백질 서열을 다른 관련 단백질 서열과 정렬하는 것이 포함된다. 이 정렬은 종 간에 보존되어 있으며 단백질 기능에 중요한 아미노산이 무엇인지 보여줄 수 있다. 이러한 분석은 돌연변이의 표적이 될 수 있는 핫스팟 아미노산을 식별하는 데 도움이 될 수 있다. 다중서열정렬은 PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE, BALIBASE와 같은 데이터베이스를 활용하여 대상 단백질 서열을 알려진 서열과 상호 참조한다. 다중 서열 정렬 기술은 아래에 나열되어 있다.

이 방법은 k-튜플 또는 니들만-분쉬 방법을 사용하여 서열의 쌍별 정렬을 수행하는 것으로 시작된다. 이러한 방법은 서열 쌍 간의 쌍별 유사성을 나타내는 매트릭스를 계산한다. 유사성 점수는 이웃 연결 방법을 사용하여 가이드 트리를 생성하는 데 사용되는 거리 점수로 변환된다. 이 가이드 트리는 다중 서열 정렬을 생성하는 데 사용된다.

#### 클러스탈 오메가
이 방법은 k-튜플 방법을 활용하여 최대 190,000개의 서열을 정렬할 수 있다. 다음으로 mBed 및 k-평균 방법을 사용하여 서열을 클러스터링한다. 그런 다음 HH 정렬 패키지에서 사용하는 UPGMA 방법을 사용하여 가이드 트리를 구성한다. 이 가이드 트리는 다중 서열 정렬을 생성하는 데 사용된다.

#### MAFFT
이 방법은 고속 푸리에 변환(FFT)을 활용하여 아미노산 서열을 각 아미노산 잔기의 부피 및 극성 값으로 구성된 서열로 변환한다. 이 새로운 서열은 상동 영역을 찾는 데 사용된다.

#### K-Align
이 방법은 우-맨버(Wu-Manber) 근사 문자열 일치 알고리즘을 사용하여 다중 서열 정렬을 생성한다.

#### 로그 기대치를 통한 다중 서열 비교(MUSCLE)
이 방법은 Kmer 및 Kimura 거리를 활용하여 다중 서열 정렬을 생성한다.

#### T-Coffee
이 방법은 정렬 진화를 위한 트리 기반 일관성 목적 함수를 활용한다. 이 방법은 Clustal W보다 5~10% 더 정확한 것으로 나타났다.

### 공진화 분석
공진화 분석은 상관 돌연변이, 공변이 또는 공동 치환이라고도 알려져 있다. 이 유형의 합리적 설계는 진화적으로 상호작용하는 유전자 좌위에서 상호적인 진화적 변화를 포함한다. 일반적으로 이 방법은 대상 서열에 대한 큐레이션된 다중 서열 정렬을 생성하는 것으로 시작된다. 이 정렬은 그 다음 고도로 갭이 있는 서열과 서열 유사성이 낮은 서열을 제거하는 수동 정제 과정을 거친다. 이 단계는 정렬의 품질을 높인다. 다음으로, 수동으로 처리된 정렬은 서로 다른 상관 돌연변이 알고리즘을 사용하여 추가 공진화 측정을 위해 활용된다. 이러한 알고리즘은 공진화 점수 매트릭스를 생성한다. 이 매트릭스는 다양한 유의성 테스트를 적용하여 유의미한 공진화 값을 추출하고 배경 잡음을 제거하여 필터링된다. 공진화 측정은 그 성능과 엄격성을 평가하기 위해 추가로 평가된다. 마지막으로, 이 공진화 분석의 결과는 실험적으로 검증된다.

### 구조 예측
단백질의 드 노보 생성은 기존 단백질 구조에 대한 지식의 이점을 얻는다. 기존 단백질 구조에 대한 이러한 지식은 새로운 단백질 구조를 예측하는 데 도움이 된다. 단백질 구조 예측 방법은 다음 네 가지 범주 중 하나에 속한다: 선험적 방법, 단편 기반 방법, 상동성 모델링, 단백질 스레딩.

#### 선험적 방법
이러한 방법은 템플릿에 대한 구조 정보를 사용하지 않고 자유 모델링을 포함한다. 선험적 방법은 자유 에너지의 전역 최소값에 해당하는 단백질의 고유 구조를 예측하는 것을 목표로 한다. 선험적 방법의 몇 가지 예로는 AMBER, GROMOS, GROMACS, CHARMM, OPLS, ENCEPP12가 있다. 선험적 방법의 일반적인 단계는 관심 단백질의 기하학적 표현으로 시작된다. 다음으로 단백질에 대한 잠재 에너지 함수 모델이 개발된다. 이 모델은 분자 역학 포텐셜 또는 단백질 구조 유래 포텐셜 함수를 사용하여 생성될 수 있다. 잠재 모델 개발 후, 분자 동역학 시뮬레이션, 몬테카를로 시뮬레이션 및 유전 알고리즘을 포함한 에너지 검색 기술이 단백질에 적용된다.

#### 단편 기반 방법
이러한 방법은 구조에 대한 데이터베이스 정보를 사용하여 상동 구조를 생성된 단백질 서열과 일치시킨다. 이러한 상동 구조는 가장 낮은 잠재 에너지 점수를 달성하는 것을 목표로 점수 매기기 및 최적화 절차를 사용하여 컴팩트한 구조로 조립된다. 단편 정보를 위한 웹 서버는 I-TASSER, ROSETTA, ROSETTA @ home, FRAGFOLD, CABS fold, PROFESY, CREF, QUARK, UNDERTAKER, HMM, ANGLOR이다.

#### 상동성 모델링
이러한 방법은 단백질의 상동성에 기반을 둔다. 이러한 방법은 비교 모델링이라고도 알려져 있다. 상동성 모델링의 첫 번째 단계는 일반적으로 쿼리 서열과 상동인 알려진 구조의 템플릿 서열을 식별하는 것이다. 다음으로 쿼리 서열을 템플릿 서열에 정렬한다. 정렬 후, 구조적으로 보존된 영역은 템플릿 구조를 사용하여 모델링된다. 이어서 템플릿과 다른 측쇄와 루프를 모델링한다. 마지막으로 모델링된 구조는 정제 및 품질 평가를 거친다. 상동성 모델링 데이터를 위한 사용 가능한 서버는 다음과 같다: SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA, I-TASSER.

#### 단백질 스레딩
단백질 스레딩은 쿼리 서열에 대한 신뢰할 수 있는 상동체가 발견되지 않을 때 사용될 수 있다. 이 방법은 쿼리 서열과 템플릿 구조 라이브러리를 얻는 것으로 시작된다. 다음으로, 쿼리 서열은 알려진 템플릿 구조 위에 스레딩된다. 이러한 후보 모델은 점수 함수를 사용하여 점수가 매겨진다. 이들은 쿼리 및 템플릿 서열의 잠재 에너지 모델에 기반하여 점수가 매겨진다. 가장 낮은 잠재 에너지 모델을 가진 일치가 선택된다. 스레딩 데이터를 검색하고 계산을 수행하는 방법 및 서버는 다음과 같다: GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, LOOPP server, Sparks-X, SEGMER, THREADER2, ESYPRED3D, LIBRA, TOPITS, RAPTOR, COTH, MUSTER.

합리적 설계에 대한 자세한 내용은 부위지정 돌연변이 유발을 참조하시오.

### 다중가 결합

다중가 결합은 친화성 효과를 통해 결합 특이성 및 친화도를 높이는 데 사용될 수 있다. 단일 생체분자 또는 복합체에 여러 개의 결합 도메인이 있으면 개별 결합 이벤트를 통해 다른 상호작용이 발생할 가능성이 높아진다. 친화도 또는 유효 친화도는 개별 친화도의 합보다 훨씬 높을 수 있어, 표적 결합에 비용 및 시간 효율적인 도구를 제공한다.

#### 다중가 단백질
다중가 단백질은 번역 후 변형 또는 단백질 코딩 DNA 서열의 증식을 통해 비교적 쉽게 생산될 수 있다. 다중가 및 다중특이성 단백질의 주요 장점은 알려진 단백질의 표적에 대한 유효 친화도를 높일 수 있다는 것이다. 불균일한 표적의 경우 단백질 조합을 사용하여 다중특이성 결합을 유도하면 특이성이 증가할 수 있으며, 이는 단백질 치료제에 높은 적용 가능성을 가진다.

다중가 결합의 가장 일반적인 예는 항체이며, 이중특이성 항체에 대한 광범위한 연구가 진행 중이다. 이중특이성 항체의 응용 분야는 진단, 영상화, 예방 및 치료를 포함하는 광범위한 스펙트럼을 포함한다.

### 유도 진화

유도 진화에서는 예를 들어 오류 경향 PCR 또는 서열 포화 돌연변이 유발에 의해 무작위 돌연변이 유발이 단백질에 적용되고, 원하는 특성을 가진 변이체를 선택하기 위해 선택 체제가 사용된다. 그런 다음 추가적인 돌연변이 및 선택 라운드가 적용된다. 이 방법은 자연적인 진화를 모방하며, 일반적으로 합리적인 설계보다 우수한 결과를 생성한다. DNA 셔플링이라는 추가적인 과정은 성공적인 변이체의 조각들을 혼합하여 더 나은 결과를 생성한다. 이러한 과정은 유성 생식 중에 자연적으로 발생하는 상동 재조합을 모방한다. 유도 진화의 장점은 단백질에 대한 사전 구조 지식이 필요하지 않으며, 주어진 돌연변이가 어떤 영향을 미칠지 예측할 필요도 없다는 것이다. 실제로 유도 진화 실험의 결과는 종종 놀랍다. 왜냐하면 원하는 변화는 종종 예상치 못한 영향을 미치는 돌연변이에 의해 발생하기 때문이다. 단점은 고속대량 스크리닝이 필요하다는 것인데, 이는 모든 단백질에 대해 실현 가능하지 않다. 많은 양의 재조합 DNA를 돌연변이시키고 원하는 특성을 위해 제품을 스크리닝해야 한다. 많은 수의 변이체는 종종 프로세스를 자동화하기 위해 값비싼 로봇 장비를 필요로 한다. 또한 모든 원하는 활동을 쉽게 스크리닝할 수 있는 것은 아니다.

자연 다윈 진화는 실험실에서 촉매 작용을 포함한 다양한 응용 분야에 대한 단백질 특성을 맞춤화하기 위해 효과적으로 모방될 수 있다. 크고 다양한 단백질 라이브러리를 생산하고 접힌 기능적 변이체를 스크리닝하거나 선택하기 위한 많은 실험 기술이 존재한다. 접힌 단백질은 무작위 서열 공간에서 놀랍도록 자주 발생하며, 이는 선택적 결합제와 촉매를 진화시키는 데 활용될 수 있다. 심층 서열 공간에서 직접 선택하는 것보다 더 보수적이지만, 무작위 돌연변이 및 선택/스크리닝에 의한 기존 단백질의 재설계는 기존 특성을 최적화하거나 변경하는 데 특히 강력한 방법이다. 또한 더 야심 찬 공학 목표를 달성하기 위한 훌륭한 출발점을 나타낸다. 실험 진화를 현대 계산 방법과 결합하는 것은 자연에 알려지지 않은 기능성 거대분자를 생성하기 위한 가장 광범위하고 생산적인 전략일 것이다.

고품질 변이 라이브러리를 설계하는 주요 과제는 최근 상당한 진전을 보였다. 이러한 진전은 돌연변이 부하가 단백질 특성에 미치는 영향에 대한 더 나은 설명 형태로 나타났다. 또한 계산적 접근 방식은 수없이 많은 서열 공간을 보다 관리 가능한 스크리닝 가능한 크기로 줄이는 데 큰 발전을 보여 스마트 변이 라이브러리를 만들었다. 라이브러리 크기도 체계적인 재조합을 위한 알고리즘을 사용하여 핵심 유익 잔기를 식별함으로써 더 스크리닝 가능한 크기로 줄어들었다. 마지막으로 효소의 효율적인 재공학을 향한 중요한 진전은 단백질 기능에 대한 결합 돌연변이 효과를 정량화하고 예측하는 더 정확한 통계 모델과 알고리즘의 개발로 이루어졌다.

일반적으로 유도 진화는 단백질 돌연변이 라이브러리 생성과 개선된 특성을 가진 변이체를 선택하기 위한 고속 스크리닝 과정을 포함하는 반복적인 두 단계 과정으로 요약될 수 있다. 이 기술은 단백질 구조와 기능 관계에 대한 사전 지식을 필요로 하지 않는다. 유도 진화는 무작위 또는 집중 돌연변이 유발을 활용하여 돌연변이 단백질 라이브러리를 생성한다. 무작위 돌연변이는 오류 경향 PCR 또는 부위 포화 돌연변이 유발을 사용하여 도입될 수 있다. 돌연변이는 여러 상동 유전자의 재조합을 사용하여 생성될 수도 있다. 자연은 제한된 수의 유익한 서열을 진화시켰다. 유도 진화는 새로운 기능을 가진 발견되지 않은 단백질 서열을 식별하는 것을 가능하게 한다. 이 능력은 접힘 또는 안정성을 손상시키지 않고 아미노산 잔기 치환을 허용하는 단백질의 능력에 달려 있다.

유도 진화 방법은 크게 무성 및 유성 전략으로 분류할 수 있다.

### 무성 방법
무성 방법은 부모 유전자 간에 교차 연결을 생성하지 않는다. 다양한 돌연변이 유발 기술을 사용하여 단일 유전자로 돌연변이 라이브러리를 생성한다. 이러한 무성 방법은 무작위 또는 집중 돌연변이 유발을 생성할 수 있다.

#### 무작위 돌연변이 유발
무작위 돌연변이 유발 방법은 관심 유전자 전체에 걸쳐 무작위로 돌연변이를 생성한다. 무작위 돌연변이 유발은 다음과 같은 유형의 돌연변이를 도입할 수 있다: 전이, 전위, 삽입, 삭제, 역위, 미스센스, 넌센스. 무작위 돌연변이 유발을 생성하는 방법의 예는 아래와 같다.

#### 오류 경향 PCR
오류 경향 PCR은 Taq DNA 중합효소가 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 활성이 부족하다는 사실을 활용한다. 이는 복제당 뉴클레오타이드당 0.001~0.002%의 오류율을 초래한다. 이 방법은 돌연변이시키려는 유전자 또는 유전자 내 영역을 선택하는 것으로 시작된다. 다음으로, 생성하려는 활동의 유형 및 정도에 따라 필요한 오류 정도를 계산한다. 이 오류 정도는 사용될 오류 경향 PCR 전략을 결정한다. PCR 후, 유전자는 플라스미드에 클로닝되고 유능한 세포 시스템에 도입된다. 이 세포는 그 다음 원하는 특성을 위해 스크리닝된다. 플라스미드는 개선된 특성을 보이는 콜로니에서 분리되어 다음 돌연변이 라운드의 템플릿으로 사용된다. 오류 경향 PCR은 다른 돌연변이에 비해 특정 돌연변이에 대한 편향을 보인다. 예를 들어 전위에 비해 전이에 대한 편향.

PCR 오류율은 다음 방법으로 증가시킬 수 있다:
# 비상보적 염기쌍을 안정화시키는 염화마그네슘 농도 증가.
# 염화망간을 추가하여 염기쌍 특이성을 감소시킨다.
# dNTP의 증가 및 불균형 추가.
# dITP, 8-oxo-dGTP, dPTP와 같은 염기 유사체 추가.
# Taq 중합효소 농도 증가.
# 연장 시간 증가.
# 사이클 시간 증가.
# 덜 정확한 Taq 중합효소 사용.
자세한 내용은 중합효소 연쇄 반응도 참조하시오.

#### 롤링 서클 오류 경향 PCR
이 PCR 방법은 세균이 원형 DNA를 증폭하는 방법을 모델로 한 롤링 서클 증폭을 기반으로 한다. 이 방법은 선형 DNA 이중체를 생성한다. 이 단편은 코카타머(concatamer)라고 불리는 원형 DNA의 반복 서열을 포함하며, 이는 세균 균주로 형질 전환될 수 있다. 돌연변이는 먼저 표적 서열을 적절한 플라스미드에 클로닝함으로써 도입된다. 다음으로, 오류 경향 롤링 서클 증폭 조건 하에서 무작위 헥사머 프라이머 및 Φ29 DNA 중합효소를 사용하여 증폭 과정이 시작된다. 오류 경향 롤링 서클 증폭을 생성하기 위한 추가 조건은 1.5 pM의 템플릿 DNA, 1.5 mM MnCl2, 24시간 반응 시간이다. MnCl2는 DNA 가닥에 무작위 점 돌연변이를 촉진하기 위해 반응 혼합물에 첨가된다. 돌연변이율은 MnCl2 농도를 증가시키거나 템플릿 DNA 농도를 감소시킴으로써 증가시킬 수 있다. 오류 경향 롤링 서클 증폭은 특정 프라이머 대신 범용 무작위 헥사머 프라이머를 사용하기 때문에 오류 경향 PCR에 비해 유리하다. 또한 이 증폭의 반응 산물은 리가아제나 제한효소로 처리할 필요가 없다. 이 반응은 등온이다.

#### 화학적 돌연변이 유발
화학적 돌연변이 유발은 유전 서열에 돌연변이를 도입하기 위해 화학 물질을 사용하는 것을 포함한다. 화학적 돌연변이 유발 물질의 예는 다음과 같다.

아황산수소나트륨은 G/C가 풍부한 유전체 서열을 돌연변이시키는 데 효과적이다. 이는 아황산수소나트륨이 비메틸화된 시토신을 우라실로 탈아민화하는 것을 촉매하기 때문이다.

에틸 메탄 설포네이트는 구아니딘 잔기를 알킬화한다. 이 변경은 DNA 복제 중 오류를 유발한다.

아질산은 아데닌과 시토신을 탈아민화하여 전위를 유발한다.

무작위 화학적 돌연변이 유발에 대한 이중 접근 방식은 반복적인 두 단계 과정이다. 첫째, EMS를 통해 관심 유전자의 생체 내 화학적 돌연변이 유발이 포함된다. 다음으로, 처리된 유전자는 플라스미드 백본의 돌연변이를 방지하기 위해 처리되지 않은 발현 벡터에 분리되어 클로닝된다. 이 기술은 플라스미드의 유전적 특성을 보존한다.

#### 돌연변이 유발을 위한 임베디드 어레이에 글리코실라제 표적화 (TaGTEAM)
이 방법은 효모에서 표적화된 생체 내 돌연변이 유발을 생성하는 데 사용되었다. 이 방법은 3-메틸아데닌 DNA 글리코실라제와 tetR DNA 결합 도메인의 융합을 포함한다. 이는 tetO 부위를 포함하는 게놈 영역에서 돌연변이율을 800배 이상 증가시키는 것으로 나타났다.

#### 무작위 삽입 및 삭제에 의한 돌연변이 유발
이 방법은 임의 길이의 염기 덩어리를 동시에 삭제하고 삽입하여 서열 길이를 변경하는 것을 포함한다. 이 방법은 새로운 제한 부위, 특정 코돈, 비천연 아미노산에 대한 4개 염기 코돈의 도입을 통해 새로운 기능을 가진 단백질을 생성하는 것으로 나타났다.

#### 전이요소 기반 무작위 돌연변이 유발
최근 전이요소 기반 무작위 돌연변이 유발을 위한 많은 방법이 보고되었다. 이러한 방법에는 다음이 포함되지만 이에 국한되지 않는다: PERMUTE-무작위 원형 재배열, 무작위 단백질 절단, 무작위 뉴클레오타이드 삼중항 치환, 무작위 도메인/태그/다중 아미노산 삽입, 코돈 스캐닝 돌연변이 유발, 다중코돈 스캐닝 돌연변이 유발. 이러한 앞서 언급된 기술들은 모두 미니-Mu 전이요소의 설계를 필요로 한다. Thermo scientific은 이러한 전이요소의 설계를 위한 키트를 제조한다.

#### 표적 DNA 길이를 변경하는 무작위 돌연변이 유발 방법
이 방법은 삽입 및 삭제 돌연변이를 통해 유전자 길이를 변경하는 것을 포함한다. 그 예로는 직렬 반복 삽입(TRINS) 방법이 있다. 이 기술은 롤링 서클 증폭과 동시에 이러한 반복을 표적 유전자에 통합함으로써 표적 유전자의 무작위 단편의 직렬 반복을 생성한다.

#### 돌연변이 유발 균주
돌연변이 유발 균주는 하나 이상의 DNA 복구 메커니즘에 결함이 있는 세균 세포주이다. 돌연변이 유발 균주의 한 예는 E. coli XL1-RED이다. 이 E. coli 하위 균주는 MutS, MutD, MutT DNA 복구 경로에 결함이 있다. 돌연변이 유발 균주를 사용하는 것은 많은 유형의 돌연변이를 도입하는 데 유용하지만, 이러한 균주는 자체 게놈에 돌연변이가 축적되어 배양물의 진행성 질병을 보인다.

#### 집중 돌연변이 유발
집중 돌연변이 유발 방법은 미리 결정된 아미노산 잔기에서 돌연변이를 생성한다. 이러한 기술은 관심 단백질에 대한 서열-기능 관계에 대한 이해를 필요로 한다. 이 관계에 대한 이해는 안정성, 입체 선택성 및 촉매 효율성에 중요한 잔기를 식별하는 것을 가능하게 한다. 집중 돌연변이 유발을 생성하는 방법의 예는 아래와 같다.

#### 부위 포화 돌연변이 유발
부위 포화 돌연변이 유발은 단백질 기능에 중요한 역할을 하는 아미노산을 표적으로 하는 PCR 기반 방법이다. 이를 수행하는 가장 일반적인 두 가지 기술은 전체 플라스미드 단일 PCR과 오버랩 익스텐션 PCR이다.

전체 플라스미드 단일 PCR은 부위 지향 돌연변이 유발(SDM)이라고도 한다. SDM 산물은 Dpn 제한효소 소화에 의해 처리된다. 이 소화는 부모 가닥만 절단하는데, 이는 부모 가닥에 아데닌의 N6에서 메틸화된 GmATC가 포함되어 있기 때문이다. SDM은 10킬로베이스를 초과하는 큰 플라스미드에는 잘 작동하지 않는다. 또한 이 방법은 한 번에 두 개의 뉴클레오타이드만 교체할 수 있다.

오버랩 익스텐션 PCR은 두 쌍의 프라이머 사용을 필요로 한다. 각 세트의 한 프라이머에는 돌연변이가 포함되어 있다. 이러한 프라이머 세트를 사용한 첫 번째 PCR 라운드가 수행되어 두 개의 이중 가닥 DNA 이중체가 형성된다. 그런 다음 두 번째 PCR 라운드가 수행되는데, 여기서 이 이중체는 변성되고 프라이머 세트와 다시 어닐링되어 이중나선체를 생성하며, 여기서 각 가닥에는 돌연변이가 있다. 새로 형성된 이 이중나선체의 모든 틈은 DNA 중합효소로 채워지고 추가로 증폭된다.

#### 서열 포화 돌연변이 유발(SeSaM)
서열 포화 돌연변이 유발은 모든 뉴클레오타이드 위치에서 표적 서열의 무작위화를 초래한다. 이 방법은 3' 말단에서 주형 전이효소를 사용하여 범용 염기로 꼬리표가 붙은 가변 길이 DNA 단편을 생성하는 것으로 시작된다. 다음으로, 이 단편은 단일 가닥 주형을 사용하여 전체 길이로 확장된다. 범용 염기는 무작위 표준 염기로 대체되어 돌연변이를 유발한다. 이 방법에는 SeSAM-Tv-II, SeSAM-Tv+, SeSAM-III와 같은 여러 수정된 버전이 있다.

#### 평행 단일 프라이머 반응(SPRINP)
이 부위 포화 돌연변이 유발 방법은 두 개의 별도 PCR 반응을 포함한다. 첫 번째 반응은 포워드 프라이머만 사용하고, 두 번째 반응은 리버스 프라이머만 사용한다. 이는 프라이머 이량체 형성을 방지한다.

#### 메가 프라이밍 및 라이가제 없는 집중 돌연변이 유발
이 부위 포화 돌연변이 유발 기술은 하나의 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드와 하나의 범용 측면 프라이머로 시작된다. 이 두 반응물은 초기 PCR 주기에 사용된다. 이 첫 번째 PCR 주기에서 얻은 산물은 다음 PCR의 메가 프라이머로 사용된다.

#### Ω-PCR
이 부위 포화 돌연변이 유발 방법은 오버랩 익스텐션 PCR을 기반으로 한다. 이는 원형 플라스미드의 모든 부위에 돌연변이를 도입하는 데 사용된다.

#### PFunkel-ominchange-OSCARR
이 방법은 단일 또는 다중 부위에서 동시에 사용자 정의된 부위 지정 돌연변이 유발을 활용한다. OSCARR은 카세트 무작위화 및 재조합을 위한 원팟(one pot) 간단한 방법론의 약자이다. 이 무작위화 및 재조합은 단백질의 원하는 단편을 무작위화한다. 옴니체인지는 서열 독립적, 다중 부위 포화 돌연변이 유발로, 유전자의 최대 5개 독립적인 코돈을 포화시킬 수 있다.

#### 삼량체-이량체 돌연변이 유발
이 방법은 중복 코돈과 정지 코돈을 제거한다.

#### 카세트 돌연변이 유발
이것은 PCR 기반 방법이다. 카세트 돌연변이 유발은 제한 부위에 의해 양쪽에 인접한 관심 유전자를 포함하는 DNA 카세트의 합성과 함께 시작된다. 이 제한 부위를 절단하는 제한효소는 또한 표적 플라스미드의 부위를 절단한다. DNA 카세트와 표적 플라스미드는 모두 제한효소로 처리되어 이 제한 부위를 절단하고 점착성 말단을 생성한다. 다음으로 이 절단 산물은 함께 결합되어 유전자가 표적 플라스미드에 삽입된다. 조합 카세트 돌연변이 유발이라고 불리는 카세트 돌연변이 유발의 대안적인 형태는 관심 단백질에서 개별 아미노산 잔기의 기능을 식별하는 데 사용된다. 재귀 앙상블 돌연변이 유발은 이전 조합 카세트 돌연변이 유발의 정보를 활용한다. 코돈 카세트 돌연변이 유발은 이중 가닥 DNA의 특정 부위에 단일 코돈을 삽입하거나 대체할 수 있도록 한다.

### 유성 방법
유도 진화의 유성 방법은 자연적인 생체 내 재조합을 모방하는 시험관 내 재조합을 포함한다. 일반적으로 이러한 기술은 부모 서열 간에 높은 서열 상동성을 필요로 한다. 이러한 기술은 종종 두 개의 다른 부모 유전자를 재조합하는 데 사용되며, 이러한 방법은 이 유전자들 간에 교차를 생성한다.

#### 시험관 내 상동 재조합
상동 재조합은 생체 내 또는 시험관 내로 분류될 수 있다. 시험관 내 상동 재조합은 자연적인 생체 내 재조합을 모방한다. 이러한 시험관 내 재조합 방법은 부모 서열 간에 높은 서열 상동성을 필요로 한다. 이러한 기술은 부모 유전자의 자연적인 다양성을 활용하여 키메라 유전자를 생성하기 위해 재조합한다. 결과적인 키메라는 부모 특성의 혼합을 보여준다.

#### DNA 셔플링
이 시험관 내 기술은 재조합 시대의 첫 번째 기술 중 하나였다. DNase1에 의해 상동 부모 유전자를 작은 단편으로 소화하는 것으로 시작된다. 이 작은 단편은 소화되지 않은 부모 유전자에서 정제된다. 정제된 단편은 프라이머 없는 PCR을 사용하여 재조합된다. 이 PCR은 서로 다른 부모 유전자에서 온 상동 단편이 서로를 위한 프라이밍을 포함하여 키메라 DNA를 생성한다. 부모 크기의 키메라 DNA는 일반 PCR에서 말단 프라이머를 사용하여 증폭된다.

#### 무작위 프라이밍 시험관 내 재조합(RPR)
이 시험관 내 상동 재조합 방법은 무작위 서열 프라이머를 사용하여 점 돌연변이를 나타내는 많은 짧은 유전자 단편의 합성과 함께 시작된다. 이 단편은 프라이머 없는 PCR을 사용하여 전체 길이 부모 유전자로 재조립된다. 이 재조립된 서열은 PCR을 사용하여 증폭되고 추가 선택 과정에 노출된다. 이 방법은 DNase1을 사용하지 않으므로 DNA 셔플링에 비해 유리하며, 따라서 피리미딘 뉴클레오타이드 옆의 재조합에 대한 편향이 없다. 이 방법은 또한 길이가 균일하고 편향이 없는 합성 무작위 프라이머를 사용하기 때문에 유리하다. 마지막으로 이 방법은 DNA 주형 서열의 길이에 독립적이며 소량의 부모 DNA를 필요로 한다.

#### 절단 메타게놈 유전자 특이 PCR
이 방법은 메타게놈 샘플에서 직접 키메라 유전자를 생성한다. 먼저 메타게놈 DNA 샘플에서 기능적 스크리닝을 통해 원하는 유전자를 분리한다. 다음으로, 특정 프라이머를 설계하고 이를 사용하여 다른 환경 샘플에서 상동 유전자를 증폭한다. 마지막으로, 이 증폭된 상동 유전자를 셔플링하여 원하는 기능적 클론을 검색하기 위해 키메라 라이브러리를 생성한다.

#### 단계적 확장 과정(StEP)
이 시험관 내 방법은 템플릿 전환을 기반으로 하여 키메라 유전자를 생성한다. 이 PCR 기반 방법은 템플릿의 초기 변성으로 시작하며, 이어서 프라이머의 어닐링과 짧은 확장 시간을 갖는다. 모든 후속 주기는 이전 주기에 생성된 짧은 단편과 템플릿의 다른 부분 사이의 어닐링을 생성한다. 이러한 짧은 단편과 템플릿은 서열 상보성에 따라 함께 어닐링된다. 단편이 템플릿 DNA에 어닐링되는 이 과정은 템플릿 전환으로 알려져 있다. 이 어닐링된 단편은 추가 확장을 위한 프라이머 역할을 할 것이다. 이 방법은 부모 길이 키메라 유전자 서열이 얻어질 때까지 수행된다. 이 방법의 실행은 시작하기 위해 플랭킹 프라이머만 필요하다. Dnase1 효소도 필요하지 않다.

#### 일시적 주형에 대한 무작위 키메라 유발(RACHITT)
이 방법은 키메라 유전자당 평균 14개의 교차를 가진 키메라 유전자 라이브러리를 생성하는 것으로 나타났다. 이 방법은 상동 유전자의 우라실 함유 주형의 하단 가닥에 부모 상단 가닥의 단편을 정렬하는 것으로 시작된다. 5' 및 3' 오버행 플랩은 절단되고, Pfu 및 Taq DNA 중합효소의 엑소뉴클레아제 및 제한효소 활성에 의해 틈이 채워진다. 우라실 함유 주형은 우라실 DNA 글리코실라제 처리 후 이중나선체에서 제거되고, 이어서 PCR을 사용하여 추가 증폭된다. 이 방법은 비교적 높은 교차 빈도를 가진 키메라를 생성하므로 유리하다. 그러나 단일 가닥 DNA 및 우라실 함유 단일 가닥 주형 DNA의 생성 필요성 및 복잡성으로 인해 다소 제한적이다.

#### 합성 셔플링
합성 퇴화 올리고뉴클레오타이드의 셔플링은 최적 코돈 및 유익한 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있으므로 셔플링 방법에 유연성을 더한다.

#### 생체 내 상동 재조합
효모에서 수행되는 클로닝은 단편화된 발현 벡터의 PCR 의존적 재조립을 포함한다. 이러한 재조립된 벡터는 효모에 도입되고 클로닝된다. 효모를 사용하여 벡터를 클로닝하는 것은 E. coli에서의 연결 및 증식에 의해 유발될 수 있는 독성 및 역선택을 피할 수 있다.

#### 상동 생체 내 그룹화를 통한 돌연변이 유발 조직 재조합 과정(MORPHING)
이 방법은 효모에서 상동 재조합의 높은 빈도를 활용하여 유전자의 특정 영역에 돌연변이를 도입하고 다른 부분은 그대로 유지한다.

#### 파지 보조 연속 진화(PACE)

이 방법은 변형된 생활 주기를 가진 박테리오파지를 활용하여 진화하는 유전자를 숙주에서 숙주로 전달한다. 파지의 생활 주기는 효소의 관심 활동과 전달이 상관관계가 있도록 설계된다. 이 방법은 유전자의 연속적인 진화에 최소한의 인간 개입이 필요하다는 장점이 있다.

### 시험관 내 비상동 재조합 방법
이러한 방법은 단백질이 서열 상동성이 부족하더라도 유사한 구조적 동일성을 나타낼 수 있다는 사실을 기반으로 한다.

### 엑손 셔플링
엑손 셔플링은 인트론에서 발생하는 재조합 이벤트를 통해 다른 단백질의 엑손을 조합하는 것이다. 직계 엑손 셔플링은 다른 종의 직계 유전자에서 엑손을 조합하는 것을 포함한다. 직계 도메인 셔플링은 다른 종의 직계 유전자에서 전체 단백질 도메인을 셔플링하는 것을 포함한다. 병렬 엑손 셔플링은 같은 종의 다른 유전자에서 엑손을 셔플링하는 것을 포함한다. 병렬 도메인 셔플링은 같은 종의 병렬 단백질에서 전체 단백질 도메인을 셔플링하는 것을 포함한다. 기능적 동족 셔플링은 기능적으로 관련된 비상동 도메인을 셔플링하는 것을 포함한다. 이 모든 과정은 키메라 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 다른 유전자에서 원하는 엑손을 증폭하는 것으로 시작된다. 이 증폭 산물은 프라이머 없는 PCR을 사용하여 전체 길이 유전자로 재조립된다. 이 PCR 주기 동안 단편은 주형 및 프라이머 역할을 한다. 이는 키메라 전체 길이 유전자를 생성하며, 이는 스크리닝을 거친다.

#### 하이브리드 효소 생성을 위한 점진적 절단(ITCHY)
부모 유전자의 단편은 엑소뉴클레아제 III에 의한 통제된 소화를 통해 생성된다. 이 단편은 제한효소로 무딘 끝을 만들고 연결하여 하이브리드 유전자를 생산한다. THIOITCHY는 α-포스포티오에이트 dNTP와 같은 뉴클레오타이드 삼인산 유사체를 활용하는 수정된 ITCHY 기술이다. 이러한 뉴클레오타이드의 통합은 엑소뉴클레아제 III에 의한 소화를 차단한다. 엑소뉴클레아제 III에 의한 소화의 이러한 억제를 스파이킹(spiking)이라고 한다. 스파이킹은 먼저 엑소뉴클레아제로 유전자를 절단하여 짧은 단일 가닥 오버행을 가진 단편을 생성함으로써 달성할 수 있다. 이 단편은 소량의 포스포티오에이트 dNTP가 존재하는 DNA 중합효소에 의한 증폭을 위한 템플릿 역할을 한다. 이 결과 단편은 연결되어 전체 길이 유전자를 형성한다. 또는 온전한 부모 유전자는 정상 dNTP와 포스포티오에이트 dNTP가 존재하는 PCR로 증폭될 수 있다. 이 전체 길이 증폭 산물은 엑소뉴클레아제에 의한 소화에 노출된다. 소화는 엑소뉴클레아제가 α-pdNTP를 만날 때까지 계속되어 다른 길이의 단편을 생성한다. 이 단편은 연결되어 키메라 유전자를 생성한다.

#### SCRATCHY
이 방법은 DNA 셔플링과 ITCHY를 결합하여 여러 교차를 억제하는 하이브리드 유전자 라이브러리를 생성한다. 이 방법은 두 개의 독립적인 ITCHY 라이브러리 구축으로 시작된다. 첫 번째는 N-말단에 유전자 A를 가진다. 다른 하나는 N-말단에 유전자 B를 가진다. 이러한 하이브리드 유전자 단편은 아가로스 겔 전기영동을 통해 제한효소 소화 또는 말단 프라이머를 사용한 PCR로 분리된다. 이 분리된 단편은 함께 혼합되고 DNase1로 추가 소화된다. 소화된 단편은 템플릿 전환을 통해 프라이머 없는 PCR로 재조립된다.

#### 절단된 주형에서의 재조합 확장(RETT)
이 방법은 키메라를 위한 주형으로 단일 가닥 DNA 단편이 있는 상태에서 단방향으로 성장하는 폴리뉴클레오타이드의 주형 전환을 통해 하이브리드 유전자 라이브러리를 생성한다. 이 방법은 표적 mRNA로부터 역전사를 통해 단일 가닥 DNA 단편을 준비하는 것으로 시작된다. 유전자 특이적 프라이머는 단일 가닥 DNA에 어닐링된다. 이 유전자는 PCR 주기 동안 확장된다. 이 주기에 이어서 주형 전환 및 초기 프라이머 확장으로 얻은 짧은 단편을 다른 단일 가닥 DNA 단편에 어닐링한다. 이 과정은 전체 길이 단일 가닥 DNA가 얻어질 때까지 반복된다.

#### 서열 상동성 독립 단백질 재조합(SHIPREC)
이 방법은 서열 상동성이 거의 없거나 전혀 없는 유전자들 사이의 재조합을 생성한다. 이 키메라는 여러 제한 부위를 포함하는 링커 서열을 통해 융합된다. 이 구조는 DNase1으로 소화된다. 단편은 S1 뉴클레아제로 무딘 끝으로 만들어진다. 이 무딘 끝 단편은 연결에 의해 원형 서열로 결합된다. 이 원형 구조는 링커 영역에 제한 부위가 존재하는 제한 효소를 사용하여 선형화된다. 이는 시작 구조와 비교하여 5' 및 3' 말단에 대한 유전자의 기여가 역전될 키메라 유전자 라이브러리를 생성한다.

#### 서열 독립적 부위 지향 키메라 유발(SISDC)
이 방법은 여러 부모 유전자로부터 여러 교차를 가진 유전자 라이브러리를 생성한다. 이 방법은 부모 유전자 간의 서열 동일성을 필요로 하지 않는다. 각 교차 위치에 하나 또는 두 개의 보존된 아미노산이 필요하다. 이 방법은 부모 서열을 정렬하고 교차 부위 역할을 하는 컨센서스 영역을 식별하는 것으로 시작된다. 이어서 제한 부위를 포함하는 특정 태그를 통합하고, Bac1으로 소화하여 태그를 제거하여 응집성 말단을 가진 유전자를 생성한다. 이 유전자 단편은 혼합되고 적절한 순서로 연결되어 키메라 라이브러리를 형성한다.

#### 퇴화 상동 이중체 재조합(DHR)
이 방법은 상동 유전자의 정렬로 시작하며, 이어서 다형성 영역의 식별이 이루어진다. 다음으로 유전자의 상단 가닥은 작은 퇴화 올리고뉴클레오타이드로 나뉜다. 하단 가닥도 올리고뉴클레오타이드로 소화되어 지지대 역할을 한다. 이 단편은 용액에서 결합되고 상단 가닥 올리고뉴클레오타이드는 하단 가닥 올리고뉴클레오타이드에 조립된다. 이 단편 사이의 틈은 중합효소로 채워지고 연결된다.

#### 무작위 다중 재조합 PCR(RM-PCR)
이 방법은 상동성이 없는 여러 DNA 단편을 단일 PCR에서 셔플링하는 것을 포함한다. 이는 서로 다른 구조 단위를 인코딩하는 모듈을 조립하여 완전한 단백질을 재구성하는 결과를 낳는다.

#### 사용자 친화적인 DNA 재조합(USERec)
이 방법은 우라실 dNTP를 사용하여 재조합해야 하는 유전자 단편을 증폭하는 것으로 시작된다. 이 증폭 용액에는 프라이머, PfuTurbo 및 Cx Hotstart DNA 중합효소도 포함되어 있다. 증폭된 산물은 USER 효소와 함께 배양된다. 이 효소는 DNA에서 우라실 잔기를 제거하여 단일 염기쌍 틈을 만드는 것을 촉매한다. USER 효소 처리된 단편은 T4 DNA 리가아제를 사용하여 혼합 및 연결되고 주형 DNA를 제거하기 위해 Dpn1 소화를 거친다. 이 결과적인 단일 가닥 단편은 PCR을 사용하여 증폭되고 E. coli로 형질 전환된다.

#### 골든 게이트 셔플링(GGS) 재조합
이 방법은 제한 부위 외부를 절단하는 유형 2 제한 효소를 사용하여 수용체 벡터에서 최소 9개의 다른 단편을 재조합할 수 있도록 한다. 이는 양쪽에 Bsa1 플랭킹 서열을 생성하기 위해 단편을 별도의 벡터에 서브클로닝하는 것으로 시작된다. 이 벡터는 유형 II 제한 효소 Bsa1을 사용하여 절단되어 4개의 뉴클레오타이드 단일 가닥 오버행을 생성한다. 상보적인 오버행을 가진 단편은 T4 DNA 리가아제를 사용하여 하이브리드화되고 연결된다. 마지막으로 이 구조는 E. coli 세포로 형질 전환되며, 이 세포는 발현 수준에 대해 스크리닝된다.

#### 포스포로티오에이트 기반 DNA 재조합 방법(PRTec)
이 방법은 구조 요소 또는 전체 단백질 도메인을 재조합하는 데 사용될 수 있다. 이 방법은 포스포로티오에이트 화학을 기반으로 하며, 이는 포스포로티오디에스터 결합의 특정 절단을 허용한다. 이 과정의 첫 번째 단계는 재조합해야 하는 단편과 벡터 백본의 증폭으로 시작된다. 이 증폭은 5' 말단에 포스포로티올화된 뉴클레오타이드를 가진 프라이머를 사용하여 이루어진다. 증폭된 PCR 산물은 고온에서 에탄올-요오드 용액에서 절단된다. 다음으로 이 단편은 실온에서 하이브리드화되고 닉을 복구하는 E. coli로 형질 전환된다.

#### 인테그론
이 시스템은 E. coli의 자연적인 부위 특이적 재조합 시스템을 기반으로 한다. 이 시스템은 인테그론 시스템이라고 불리며 자연적인 유전자 셔플링을 생성한다. 이 방법은 인테그론 시스템으로 개별 재조합 카세트 또는 trpA-E 유전자와 조절 요소를 전달하여 트립토판 결핍 E. coli에서 기능적인 트립토판 생합성 오페론을 구축하고 최적화하는 데 사용되었다.

#### Y-연결 기반 셔플링(YLBS)
이 방법은 5' 또는 3' 말단에 단일 블록 서열을 포함하고, 줄기 루프 영역에 상보적인 서열을 가지며, PCR을 위한 프라이머 결합 부위 역할을 하는 D 분기 영역을 포함하는 단일 가닥 DNA 가닥을 생성한다. 5' 및 3' 반 가닥의 등량은 혼합되어 줄기 영역의 상보성으로 인해 하이브리드를 형성한다. 3' 반 가닥의 유리 인산화 5' 말단을 가진 하이브리드는 0.1mM ATP 존재 하에 T4 DNA 리가아제를 사용하여 5' 반 가닥의 유리 3' 말단과 연결된다. 연결된 산물은 두 가지 유형의 PCR을 통해 증폭되어 사전 5' 반 및 사전 3' 반 PCR 산물을 생성한다. 이 PCR 산물은 비오틴 표지된 줄기 서열을 포함하는 프라이머의 5' 말단에 아비딘-비오틴 결합을 통해 단일 가닥으로 전환된다. 다음으로, 비오틴화된 5' 반 가닥과 비비오틴화된 3' 반 가닥은 다음 Y-연결 주기를 위한 5' 및 3' 반 가닥으로 사용된다.

## 반합리적 설계
반합리적 설계는 단백질 서열, 구조 및 기능에 대한 정보를 예측 알고리즘과 함께 사용하여 단백질 기능에 가장 큰 영향을 미칠 가능성이 있는 표적 아미노산 잔기를 식별한다. 이러한 주요 아미노산 잔기의 돌연변이는 향상된 특성을 가질 가능성이 더 높은 돌연변이 단백질 라이브러리를 생성한다.

반합리적 효소 공학 및 드 노보 효소 설계의 발전은 생체 촉매를 조작하기 위한 강력하고 효과적인 새로운 전략을 연구자들에게 제공한다. 라이브러리 설계에서 서열 및 구조 기반 접근 방식의 통합은 효소 재설계에 훌륭한 지침이 되는 것으로 입증되었다. 일반적으로 현재의 계산적 드 노보 및 재설계 방법은 촉매 성능에서 진화된 변이체와 비교할 수 없다. 비록 실험적 최적화가 유도 진화를 통해 생성될 수 있지만, 구조 예측의 정확성 향상과 더 큰 촉매 능력은 설계 알고리즘의 개선과 함께 달성될 것이다. 단백질 역학을 통합함으로써 미래 시뮬레이션에 추가적인 기능 향상이 포함될 수 있다.

생화학적 및 생물리학적 연구는 예측 프레임워크의 미세 조정과 함께 개별 설계 기능의 기능적 중요성을 실험적으로 평가하는 데 유용할 것이다. 이러한 기능적 기여에 대한 더 나은 이해는 미래 설계 개선에 대한 피드백을 제공할 것이다.

유도 진화는 단백질 공학의 선택 방법으로 대체되지 않을 가능성이 높지만, 계산적 단백질 설계는 단백질 공학이 생체 고분자를 조작하는 방식을 근본적으로 변화시켰다. 예측 프레임워크를 통합하는 방법에서 더 작고, 더 집중적이며 기능적으로 풍부한 라이브러리를 가설 주도 단백질 공학을 위해 생성할 수 있다. 새로운 설계 전략과 기술적 발전은 수백만 후보자의 기념비적인 스크리닝 및 선택 노력 대신 고도로 특이적인 저처리 스크리닝 분석법이 점점 더 적용되는 것과 같이, 유도 진화와 같은 전통적인 프로토콜에서 벗어나기 시작했다. 유전자 전체 라이브러리 합성은 라이브러리 준비를 위한 셔플링 및 돌연변이 유발 프로토콜을 대체하고 있다. 이러한 발전은 함께 단백질 공학을 유도 진화를 넘어 생체 촉매를 맞춤화하기 위한 실용적이고 효율적인 전략으로 이끌 준비가 되어 있다.

## 스크리닝 및 선택 기술
단백질이 유도 진화, 합리적 설계 또는 반합리적 설계를 거치면, 돌연변이 단백질 라이브러리를 스크리닝하여 어떤 돌연변이가 향상된 특성을 나타내는지 결정해야 한다. 파지 디스플레이 방법은 단백질 스크리닝을 위한 한 가지 옵션이다. 이 방법은 변이 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 파지 외피 단백질 유전자와 융합하는 것을 포함한다. 파지 표면에 발현된 단백질 변이체는 시험관 내에서 고정된 표적과의 결합에 의해 선택된다. 선택된 단백질 변이체를 가진 파지는 세균에서 증폭된 후 효소결합 면역흡착 분석법에 의해 양성 클론이 식별된다. 이 선택된 파지는 그 다음 DNA 시퀀싱을 거친다.

세포 표면 디스플레이 시스템은 돌연변이 폴리펩타이드 라이브러리를 스크리닝하는 데에도 활용될 수 있다. 라이브러리 돌연변이 유전자는 발현 벡터에 통합된 후 적절한 숙주 세포로 형질 전환된다. 이 숙주 세포는 원하는 표현형을 가진 세포를 식별하기 위해 추가적인 고속 대량 스크리닝 방법을 거친다.

시험관 내 단백질 번역 또는 세포 없는 번역을 활용하기 위해 세포 없는 디스플레이 시스템이 개발되었다. 이러한 방법에는 mRNA 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 공유 및 비공유 DNA 디스플레이, 시험관 내 구획화가 포함된다.

### 효소 공학
효소 공학은 효소 구조(및 그 기능)를 변형하거나 분리된 효소의 촉매 활성을 변형하여 새로운 대사 산물을 생산하거나, 반응을 위한 새로운 (촉매) 경로를 허용하거나, 또는 특정 화합물을 다른 것으로 변환하는 것(생물전환)의 응용이다. 이러한 제품은 화학 물질, 의약품, 연료, 식품 또는 농업 첨가제로 유용하다.

효소 반응기는 효소 수단으로 원하는 전환을 수행하는 데 사용되는 반응 매체를 포함하는 용기로 구성된다. 이 과정에서 사용되는 효소는 용액에 자유롭게 존재한다. 또한 미생물은 순수 효소의 중요한 원천 중 하나이다.

## 공학적 단백질의 예시
컴퓨팅 방법은 Top7과 같은 새로운 접힘 구조를 가진 단백질, 그리고 비천연 분자를 위한 센서를 설계하는 데 사용되었다. 융합 단백질 공학은 크리오피린 관련 주기 증후군 치료를 위해 미국 식품의약국 (FDA) 승인을 받은 의약품인 릴로나셉트를 탄생시켰다.

또 다른 컴퓨팅 방법인 IPRO는 칸디다 보이드니 자일로스 환원효소의 보조인자 특이성을 성공적으로 변경했다. 반복 단백질 재설계 및 최적화(IPRO)는 천연 또는 새로운 기질 및 보조인자에 대한 특이성을 높이거나 부여하도록 단백질을 재설계한다. 이는 지정된 설계 위치 주변에서 단백질 구조를 반복적으로 무작위로 교란하고, 가장 낮은 에너지의 로타머 조합을 식별하고, 새로운 설계가 이전 설계보다 낮은 결합 에너지를 갖는지 여부를 결정함으로써 이루어진다. 이 과정의 반복적인 특성은 IPRO가 단백질 서열에 집합적으로 원하는 기질 및 보조인자에 대한 특이성을 향상시키는 첨가적 돌연변이를 만들 수 있도록 한다.

컴퓨터 지원 설계는 고도로 정렬된 나노 단백질 복합체의 복잡한 특성을 공학적으로 설계하는 데도 사용되었다. 구조적 불안정성과 두 가지 올리고머화 상태를 나타내어 불완전한 자가 조립 거동을 보이는 단백질 케이지, 대장균 박테리오페리틴(EcBfr)이 이 연구의 모델 단백질이다. 컴퓨터 분석 및 상동체와의 비교를 통해, 이 단백질이 두 개의 물로 연결된 아스파라긴 잔기에 중심을 둔 계면 물 주머니의 존재로 인해 2회 대칭축에서 평균보다 작은 이량체 계면을 가지고 있음이 밝혀졌다. EcBfr의 구조적 안정성을 변경하기 위한 공학적 설계 가능성을 조사하기 위해, 반경험적 계산 방법을 사용하여 야생형 EcBfr에 대한 이량체 계면의 480가지 가능한 돌연변이체의 에너지 차이를 가상으로 탐색했다. 이 계산 연구는 또한 물로 연결된 아스파라긴에 수렴된다. 이 두 아스파라긴을 소수성 아미노산으로 대체하면 원형 이색성 및 투과 전자 현미경에 의해 입증된 바와 같이 알파 나선형 단량체로 접히고 케이지로 조립되는 단백질이 생성된다. 열 및 화학적 변성은 모든 재설계된 단백질이 계산과 일치하게 안정성이 증가했음을 확인한다. 세 가지 돌연변이 중 하나는 크기 배제 크로마토그래피 및 천연 겔 전기영동 모두에 의해 용액에서 더 높은 차수의 올리고머화 상태를 선호하도록 개체군을 이동시킨다.

시험관 내 방법인 PoreDesigner는 세균 채널 단백질(OmpF)의 1nm 기공 크기를 원하는 서브-nm 크기로 줄이기 위해 재설계하는 데 개발되었다. 가장 좁게 설계된 기공에 대한 수송 실험에서는 생체모방 블록-폴리머 매트릭스에 조립되었을 때 완전한 염분 배제를 나타냈다.

## 같이 보기
* 유전공학
* 단백체학
* 단백체
* 구조생물학
* 합성생물학

## 각주


분류:생명공학
분류:생물공학
분류:효소
분류:생화학