単一細胞トランスクリプトミクス

**単一細胞トランスクリプトミクス**（たんいつさいぼうトランスクリプトミクス、英: *single-cell transcriptomics*）とは、個々の細胞に存在する転写産物、とくにメッセンジャーRNA（mRNA）の発現量を網羅的かつ定量的に測定することによって、同一集団内における細胞の不均一性、細胞状態の多様性、さらには分化や応答の連続的な過程を明らかにする研究分野および技術群の総称である。

従来のバルクRNAシーケンス（bulk RNA-seq）は組織や細胞集団の平均的な遺伝子発現しか捉えることができず、集団内に潜在する希少細胞集団や一過的な遷移状態を識別することは困難であった。これに対して単一細胞レベルでの測定は、個々の細胞の違いを直接的に把握できるため、分化系列の再構築、発生過程の動態解析、疾患における細胞状態の特定、さらには治療応答や抵抗性メカニズムの探索など、生命科学や医学研究の幅広い領域に新たな知見をもたらしている。

## 概要
単一細胞トランスクリプトミクスは、従来のバルクRNAシーケンスでは平均化されて見えなかった**細胞間の多様性や動態**を直接的に明らかにできる点に大きな特徴がある。1細胞ごとの発現量のばらつきを捉えることで、未知の細胞型やサブタイプの同定、活性化や休止といった細胞状態の違いの解析、さらに分化や刺激応答が時間的にどのように進行するかの推定が可能となる。また、遺伝子間の共発現パターンを解析することにより、細胞内で機能する転写制御ネットワークや調節因子群を推測する研究にも活用されている。

一方で、単一細胞から得られるRNA量は極めて少なく、増幅過程に由来するバイアスや技術的ノイズの影響を強く受ける。そのため、解析の定量性を担保する工夫が不可欠であり、特に広く普及しているのが**バーコード化とユニーク分子識別子（unique molecular identifier; UMI）**の導入である。UMIはcDNA分子ごとに固有の短い配列タグを付与するもので、これによりPCR増幅によるコピー数の偏りを補正し、各分子の由来を追跡することが可能になる。この技術は、絶対的な分子数の推定や低発現遺伝子の検出精度向上に大きく貢献している。

## 歴史
単一細胞規模での網羅的なトランスクリプトーム解析は、2009年に中国・北京大学の唐福周（Tang Fuchou）らが発表した研究に端を発する。この研究では、マウス初期胚から得られた個々の細胞を対象にcDNAライブラリを構築し、次世代シーケンスによって全転写産物の解析を行う手法（mRNA-Seq）が報告された。

その後、2012年にRamsköldらによって**SMART-Seq**（Switching Mechanism at 5′ end of RNA Template sequencing）が開発され、さらに改良版のSMART-Seq2が登場した。この方式では全長cDNAを取得できるため、アイソフォームの同定や点変異解析にも適しており、従来法に比べて感度と網羅性が大幅に向上した。

2015年には、米国ハーバード大学とブロード研究所のグループにより、マイクロ流体ドロップレットを利用した高スループット手法**Drop-seq**と**inDrop**が相次いで報告された。これらは細胞とバーコードビーズをナノリットルスケールの液滴中に閉じ込め、個別に転写産物をタグ付けする仕組みであり、数千から数万単位の細胞を同時に解析できる画期的な技術であった。

2017年には、米国企業10x Genomicsが商用プラットフォーム**Chromium**を発売し、ドロップレット法を標準化した。これにより研究室間での再現性が高まり、単一細胞RNA-seqは世界的に急速に普及した。

同年にはさらに、コロンビア大学のCaoらによって**combinatorial indexing**（分割プール法）が提案された。これは細胞を物理的に一つひとつ分離するのではなく、固定化した細胞や核に対して複数ラウンドのバーコード付与を行う方式であり、大規模化と低コスト化を実現した。この原理に基づいて開発された**sci-RNA-seq**や、2018年に報告された**SPLiT-seq**は、専用装置を必要とせずに数十万細胞規模の解析を可能にした。

このように、2009年の初報からわずか10年余りで、単一細胞トランスクリプトミクスは低スループットの実験的技術から、大規模な国際プロジェクト（Human Cell Atlasなど）を支える汎用的基盤技術へと急速に発展した。

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## 実験ワークフロー
単一細胞トランスクリプトミクスの実験は、試料調製からデータ解析まで複数のステップで構成される。各段階では、細胞数が少なく分子量も極めて低いことに起因する技術的課題が存在するため、手法ごとに最適化が行われている。以下に代表的なワークフローを示す。

### 細胞・核の単離
最初の工程は、生体組織から単一細胞あるいは単一核を分離することである。酵素消化や機械的解離によって組織を分散させ、その後に蛍光活性化セルソーター（FACS）やマイクロ流体デバイスを用いて細胞を個別に扱う手法が一般的に採用されている。凍結検体や強固な組織では、細胞膜を破り核のみを単離する単一核RNA-seq（snRNA-seq）が適している。この段階の品質は、下流で得られるデータの信頼性に直結するため、解離ストレスに伴うアーティファクトや細胞死を最小化する工夫が重要となる。

### 逆転写とcDNA合成
単離された細胞や核から抽出したmRNAは、逆転写酵素によってcDNAへと変換される。この過程では、各cDNAに細胞バーコードとユニーク分子識別子（UMI）が付与される。細胞バーコードは「どの細胞に由来するか」を示し、UMIは「同一分子か否か」を識別する短い配列タグである。UMIを導入することで、PCR増幅に伴うコピー数の偏りを補正し、分子数のより正確なカウントが可能になる。

### 増幅とライブラリ化
得られたcDNAはごく微量であるため、PCRまたはin vitro転写（IVT）によって増幅が行われる。PCRは全長cDNAの取得に有利であるが配列依存的なバイアスが生じやすく、一方IVTは異なる種類のバイアスをもたらす。増幅後にはシーケンスアダプターを付与し、次世代シーケンサーで読み取れるライブラリが構築される。

### シーケンシング
増幅ライブラリは、Illuminaなどの次世代シーケンサーを用いて解読される。ドロップレット法によるscRNA-seqでは、1細胞あたり数万から十万程度のリード数を確保するのが一般的であり、実験の目的に応じてシーケンス深度が調整される。

データ処理

得られた配列リードは、まずバーコードとUMIに基づいて整理され、リファレンスゲノムへのマッピングとUMI重複除去を経て、遺伝子発現の「細胞×遺伝子カウント行列」としてまとめられる。この行列は正規化やクラスタリングなど後続解析の基盤となる。UMIの利用により、PCR由来の重複バイアスが軽減され、より定量的な発現解析が可能になる。

## 代表的な技術プラットフォーム
単一細胞トランスクリプトミクスの測定技術は、使用する分離方式やライブラリ調製法により大きく三つの方式に分けられる。すなわち、（1）マイクロ流体を用いた**ドロップレット法**、（2）マイクロプレートを利用した**フルレングス法**、（3）分割プール方式による**combinatorial indexing法**である。それぞれの方式は解析の目的やスループット、解像度に応じて使い分けられる。

### ドロップレット法
ドロップレット法は、マイクロ流体技術を利用して油相中にナノリットルサイズの液滴を生成し、各液滴に単一の細胞とバーコード付きビーズを共封入する方式である。細胞が溶解するとmRNAはバーコードオリゴに捕捉され、逆転写を経てcDNA化される。代表的な実装には**Drop-seq**、**inDrop**、および10x Genomics社の商用プラットフォーム**Chromium**がある。ドロップレット法は数千から数十万の細胞を同時に解析可能であり、免疫細胞受容体配列の再構成や多様な拡張技術（例：CITE-seq）にも対応できる。一方で、液滴に複数細胞が封入される「ダブレット」や、溶出RNAによる「アンビエントRNA」の影響を受けやすいという課題も存在する。

### フルレングス法（プレートベース）
フルレングス法は、マイクロプレートに単一細胞を分注し、逆転写からPCR増幅までを各ウェル内で行う方式である。代表的な技術である**SMART-Seq**および改良版の**SMART-Seq2**は、全長cDNAを取得できる点に特徴がある。これによりアイソフォームの同定やスプライシング解析、体細胞変異の検出が可能である。感度も高く、希少細胞や少数のサンプルに適している。一方で、スループットが数十から数千細胞程度に限られ、コストや作業負担が大きい点が制約となる。

### 分割プール法（Combinatorial Indexing）
分割プール法は、個々の細胞を物理的に単離するのではなく、固定化した細胞や核に対して複数ラウンドのバーコード付与を行う方式である。細胞をランダムに分割した後、各ウェルで異なるバーコードを付加し、これを繰り返すことで細胞ごとに一意のバーコード組み合わせが得られる。2017年に報告された**sci-RNA-seq**や、2018年の**SPLiT-seq**が代表例である。分割プール法は特殊な機器を必要とせず、数十万から百万規模の細胞解析も可能であり、大規模な組織アトラスの構築に適している。ただし、手順が複雑であり、固定条件やバーコード効率に影響を受けやすい。

## マルチモーダル解析
単一細胞トランスクリプトミクスは当初、各細胞におけるmRNAの発現量のみを測定する技術であったが、その後の発展により、RNAに加えてタンパク質やエピゲノム情報を同時に取得する**マルチモーダル解析**が可能となった。これにより、細胞の表現型と機能をより包括的に理解できるようになり、細胞型の精密な分類、シグナル伝達経路の解明、分化や疾患に伴う複合的な分子変化の解析が進んでいる。

### RNAとタンパク質の同時測定
2017年に報告された**CITE-seq**（Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by sequencing）と**REAP-seq**（RNA Expression and Protein sequencing）は、オリゴヌクレオチドで標識した抗体を用いることで、細胞表面タンパク質の発現量とmRNA発現プロファイルを同時に測定する手法である。これにより、RNA情報だけでは区別が難しい近縁細胞集団を高精度に識別でき、特に免疫細胞のサブタイプ分類や腫瘍微小環境の解析に応用されている。

### RNAとクロマチンアクセスビリティの同時測定
次世代のマルチモーダル技術では、RNAと同時にエピゲノム情報を測定することが可能になった。代表例が**ASAP-seq**および**DOGMA-seq**である。ASAP-seqは、scRNA-seqとATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）を統合し、同一細胞における転写活性とクロマチン開放状態を同時に記録する技術である。DOGMA-seqは、これに加えてタンパク質の情報も含めた三者同時計測を実現しており、転写制御からタンパク質発現に至る分子機構を単一細胞レベルで統合的に解析できる。

### サンプル多重化と実用的拡張
マルチモーダル解析を効率化するために、複数の試料を一度に処理し、後から計算的に識別する**サンプル多重化（multiplexing）**技術も発展している。これには、ハッシュタグ抗体を用いる**Cell Hashing**や、脂質にオリゴを結合させて細胞膜に組み込む**MULTI-seq**、さらには遺伝型情報に基づく**demuxlet**などがある。これらの方法はコストを削減するだけでなく、バッチ効果の抑制にも寄与する。

### 意義と課題
マルチモーダル解析は、従来の単一オミクス解析では得られなかった包括的な細胞像を描き出す強力な手段である。しかし、取得できる分子情報のスケールや感度はモダリティごとに異なり、また実験コストや計算資源の負担も大きい。そのため、得られたデータの正規化・統合には高度な統計モデルや機械学習手法が必要であり、今後も解析手法の改良が求められている。

## 空間トランスクリプトミクスとの接続
単一細胞RNAシーケンス（scRNA-seq）は個々の細胞の遺伝子発現プロファイルを高精度に得ることができるが、細胞がもともと組織内のどこに存在していたかという**空間的コンテキスト**は失われる。一方で、空間トランスクリプトミクスは、組織切片上の位置情報を保持したまま遺伝子発現を測定する技術であり、細胞型や発現状態を地理的に対応づけることができる。両者を統合することで、特定の細胞型が組織内でどのように配置され、隣接する細胞との相互作用や微小環境を通じてどのような役割を果たしているのかを明らかにすることが可能となる。

### 主要なプラットフォーム
近年は、商用の空間トランスクリプトミクス技術が整備され、scRNA-seqとの統合解析に広く用いられている。

**Xenium In Situ**（10x Genomics）— 組織切片上で数百から数千の遺伝子を対象とした*in situ*ハイブリダイゼーションを行い、細胞内のサブセルラー解像度で発現を可視化する。これにより、細胞境界内での遺伝子局在や組織内での配置を同時に把握できる。

**CosMx Spatial Molecular Imager**（NanoString）— 数千種類に及ぶ遺伝子やタンパク質の発現を組織切片上で高多重に検出できるシステムであり、免疫微小環境や腫瘍組織における細胞間相互作用の解析に適している。

これらのプラットフォームは、従来の空間解像度が粗い技術（数十μmスケールのスポット測定）を超えて、単一細胞あるいは細胞内局在レベルの解析を可能とした点で大きな進歩である。

### 統合解析の方法論
典型的な解析フローは、まずscRNA-seqデータから高精度な「細胞型辞書」を構築し、それを空間発現データに投影して組織内の細胞型配置を推定する、という手順である。具体的には、バルク的な空間スポットをデコンボリューションし、そこに含まれる細胞型の比率をscRNA-seqの参照プロファイルと照合する。また、*in situ*型のデータでは、細胞境界や位置情報を直接利用して細胞型を割り当てる。

### 意義と課題
scRNA-seqと空間トランスクリプトミクスの統合により、発生過程における細胞配置の時間的変化、腫瘍組織における免疫細胞やがん関連線維芽細胞の局在、神経組織における細胞回路構造など、従来は捉えられなかった空間的多様性が明らかになりつつある。一方で、空間技術は測定できる遺伝子数や感度に限界がある場合が多く、またデータ統合におけるバッチ効果や解像度差の補正が大きな課題となっている。そのため、今後は測定技術の改良とともに、より高度な統合アルゴリズムの開発が求められている。

## データ解析
単一細胞トランスクリプトミクスで得られるデータは、数千から数百万細胞を対象にした巨大な遺伝子発現カウント行列である。このデータはノイズや技術的バイアスを多く含むため、適切な前処理と統計的手法を組み合わせた解析パイプラインが不可欠となる。以下では、一般的に用いられる解析手順を概説する。

### 前処理と品質管理（QC）
初期段階では、低品質細胞や技術的アーティファクトを検出・除去する。典型的なQC指標には、1細胞あたりのUMI総数、検出遺伝子数、ミトコンドリア遺伝子比率がある。複数細胞が誤って同一液滴に封入される「ダブレット」は、**DoubletFinder**や**Scrublet**によって計算的に検出される。また、溶出RNAが周囲の液滴に混入する「アンビエントRNA」は、**SoupX**や**DecontX**によって補正される。

### 正規化とバッチ補正
細胞間でシーケンス深度が異なるため、そのままでは発現量を比較できない。UMIカウントを前提とした正規化や分散安定化の手法（例：**SCTransform**）が広く用いられる。実験バッチや施設間の差異を補正するためには、**Harmony**、**Seuratアンカー法**、深層生成モデルに基づく**scVI**といった統合アルゴリズムが用いられる。

### 次元削減と可視化
数千遺伝子を同時に扱う高次元データを理解しやすくするために、まず主成分分析（PCA）で次元を圧縮し、その後に**t-SNE**や**UMAP**で二次元あるいは三次元に可視化するのが一般的である。これにより細胞集団間の類似性や連続性を直感的に把握できる。

### クラスタリングと細胞型アノテーション
近傍グラフを用いたクラスタリング手法（例：**Leiden法**）により、発現プロファイルが類似した細胞群が抽出される。各クラスタは、既知のマーカー遺伝子や参照アトラス（例：**Azimuth**）との比較によって細胞型ラベルが付与される。クラスタ解像度の設定は過剰分割や過少分割を招きうるため、複数条件での検証が推奨される。

### 差次的発現解析
群間での発現差を検出する解析は、生物学的差異の解釈に直結する。単一細胞をそのまま統計的反復とみなすと偽陽性が増えるため、同一試料由来の細胞を集約した**擬似バルク（pseudobulk）解析**が推奨される。近年は、混合効果モデルなど多階層的な統計手法も導入され、細胞集団の遷移や条件差をより堅牢に検出できるようになっている。

### 軌跡推定と動態解析
細胞分化や応答の時間的過程を再構築するために、擬似時間（pseudotime）解析が行われる。**Monocle**や**Diffusion pseudotime**は、発現の類似性に基づき細胞を並べ替え、連続的な分化系列や分岐構造を推定する手法である。さらに、**RNA velocity**は、スプライシング前後の転写産物比率を利用して、細胞が将来どの方向へ状態遷移するかをベクトルとして推定する革新的なアプローチである。

### データ統合とアトラス構築
研究規模の拡大に伴い、複数の実験や施設で得られたデータを統合し、包括的な細胞参照地図を構築する取り組みが進められている。代表例が国際プロジェクト**Human Cell Atlas**であり、ヒト全身の細胞多様性をカタログ化することを目指している。こうした参照アトラスに自らのデータを投影することで、未知の細胞型の同定や臓器横断的な比較が可能となり、研究の再現性と一般化可能性が大きく向上している。

## 臨床応用
単一細胞トランスクリプトミクスは、基礎研究の枠を超えて臨床領域にも急速に応用が広がっている。特に腫瘍学、免疫療法、自己免疫疾患、感染症といった分野では、従来のバルク解析では見落とされていた細胞レベルの多様性や稀少サブタイプの同定が、診断や治療戦略の最適化に直結している。

### 腫瘍学と腫瘍微小環境（TME）
がん研究において単一細胞解析は、腫瘍細胞そのものの多様性だけでなく、腫瘍微小環境（tumor microenvironment, TME）に存在する免疫細胞や間質細胞の役割を解明するための強力な手段となっている。転移性悪性黒色腫の研究では、腫瘍内に異なる転写状態を持つ複数のがん細胞集団が共存しており、これらが免疫応答や薬剤感受性に異なる影響を与えることが報告された。この研究は、TMEの中でがん細胞と免疫細胞の相互作用を解剖し、腫瘍の進展に寄与する「生態系」としてのがん組織の理解に大きく貢献した。

### 免疫療法応答と抵抗性の解析
免疫チェックポイント阻害剤などのがん免疫療法では、患者によって応答に大きな差が存在する。その分子基盤を解明するために単一細胞解析が活用されている。Jerby-Arnonらの研究では、腫瘍細胞が特定の転写プログラムを獲得することで、腫瘍内からT細胞を排除し、免疫チェックポイント阻害剤への抵抗性を示すことが明らかにされた。このような知見は、免疫療法の効果予測や新たな治療標的の発見につながっている。

### 自己免疫疾患・炎症性疾患
関節リウマチや炎症性腸疾患などの自己免疫疾患では、病変組織内に存在する免疫細胞サブセットが病態の中心的な役割を担うことが多い。単一細胞解析により、これらの疾患で特異的に活性化しているT細胞やマクロファージの遺伝子発現プログラムが特定され、疾患進行や治療応答のバイオマーカー候補として注目されている。

### 感染症とワクチン応答
感染症研究では、病原体感染に対する宿主免疫応答を細胞レベルで解明するために利用されている。COVID-19のパンデミックでは、単一細胞RNA-seqを用いた大規模免疫細胞解析が行われ、重症例に特徴的な免疫サブセットやサイトカイン応答異常が明らかにされた。さらに、ワクチン接種後の免疫細胞動態の追跡にも用いられ、抗体産生細胞や記憶T細胞の誘導過程が詳細に解明された。

### 展望
臨床応用における単一細胞トランスクリプトミクスは、がんの精密医療や免疫療法の個別化、自己免疫疾患の病態解明、感染症制御のためのワクチン設計に直結している。一方で、解析コストやデータ解釈の複雑さ、臨床検体の取り扱いといった課題も存在する。今後は、空間トランスクリプトミクスやマルチモーダル解析との統合により、臨床現場での実装がさらに加速すると期待される

## 技術的考慮点と限界
単一細胞トランスクリプトミクスは強力な手法である一方で、技術的な限界やデータ品質に関する課題が存在する。これらの制約を理解し、適切に補正・解釈することは、生物学的知見を誤らずに導き出すために不可欠である。

### 捕捉効率の制限
1細胞あたりに存在するmRNA分子数のうち、実際にシーケンスで検出できる割合は限られている。特に低発現の遺伝子は捕捉効率の影響を強く受け、不検出（ゼロカウント）として扱われることが多い。深度の深いシーケンスや全長cDNA法（SMART-Seq系）を用いることで改善は可能であるが、コストやスループットの制約とのバランスが必要となる。

### ドロップアウト（Dropout）
単一細胞RNA-seqに特徴的な現象として、発現しているはずの遺伝子が測定結果でゼロとして記録される「ドロップアウト」がある。これはmRNA分子数の少なさや逆転写効率のばらつきに起因する。ドロップアウトは統計解析を複雑化させる要因となるため、ロバストな統計手法や遺伝子フィルタリング、場合によってはデータ補完アルゴリズムの利用が行われる。ただし、過度な補完は偽陽性や過解釈を招く可能性があるため注意が必要である。

### アンビエントRNA（Ambient RNA）
細胞解離や操作の過程で、RNA分子が細胞外に漏出し、他の液滴やウェルに混入することがある。これが「アンビエントRNA」と呼ばれるノイズの主因であり、実際には発現していない遺伝子が誤って検出される原因となる。近年は、計算的にアンビエントRNAを推定・除去する手法が開発されており、代表的なものに**SoupX**や**DecontX**がある。これらのアルゴリズムは、背景に由来する発現シグナルを統計的に分離することで、解析の信頼性を高めている。

### コストとスケーラビリティ
大規模なscRNA-seq実験は数万から数百万の細胞を対象とするため、試薬やシーケンスのコストが高額になる。分割プール法や多重化技術（Cell Hashing, MULTI-seqなど）はコスト効率を改善する手段として利用されているが、臨床現場での日常的な利用には依然として課題が残る。

### 解釈上の課題
技術的なノイズを完全に除去することは難しく、得られる発現行列には依然として不確実性が残る。そのため、解析結果を解釈する際には、細胞群間の差異が生物学的なものなのか、技術的な要因によるものなのかを慎重に判断する必要がある。特に差次的発現解析や擬似時間解析のように下流解析への影響が大きい場合には、複数の手法を組み合わせて再現性を検証することが推奨される。

### 展望
今後は、より効率的な捕捉技術や低ノイズ化の実験手法が開発されるとともに、ノイズを統計的に補正する計算アルゴリズムの高度化が進むと考えられる。こうした改良は、臨床応用に向けた精度向上やコスト削減に直結すると期待されている。

## 関連項目
* RNA-seq
* トランスクリプトーム
* バイオインフォマティクス
* ATAC-seq

## 脚注


## 参考文献
* 
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## 外部リンク
* Human Cell Atlas 公式サイト（英語）