Pengurutan keseluruhan genom

**Pengurutan keseluruhan genom** atau **pengurutan genom lengkap** adalah proses menentukan urutan DNA lengkap dari suatu genom organisme pada satu waktu. Ini mencakup pengurutan semua kromosom organisme serta DNA yang terkandung dalam mitokondria dan juga untuk tanaman, dalam kloroplas. Dalam praktiknya, pengurutan genom yang hampir lengkap disebut juga pengurutan keseluruhan genom.

Pengurutan keseluruhan genom telah banyak digunakan sebagai alat penelitian, dan saat ini sedang disosialisasikan ke klinik. Di masa depan, pengobatan perseorangan, suatu manajemen di dunia kedokteran berdasarkan informasi genotipe dari pasien, menggunakan seluruh data urutan genom sebagai alat penting untuk memandu pengobatan. Alat pengurutan DNA pada SNP juga digunakan untuk menentukan varian fungsional dari asosiasi genetik dan meningkatkan pengetahuan bagi para peneliti yang tertarik pada biologi evolusioner, sehingga dapat menjadi dasar untuk memprediksi kerentanan penyakit dan respons obat.

Pengurutan keseluruhan genom berbeda dengan pengujian DNA, yang hanya menentukan kemungkinan suatu bahan genetik berasal dari individu atau kelompok tertentu, dan tidak mengandung informasi tambahan tentang hubungan genetik, asal atau kerentanan terhadap penyakit tertentu. Selain itu, pengurutan keseluruhan genom juga jangan dicampuradukkan dengan metode yang mengurutkan subset genom spesifik - metode tersebut termasuk pengurutan eksom (1-2% dari genom) atau pembuatan genotipe SNP (<0,1% dari genom).

Pada tahun 2022, genom lengkap manusia berhasil diurutkan dengan mengombinasikan berbagai teknologi pengurutan DNA seperti PacBio HiFi, Oxford Nanopore (ONT), dan Illumina Hi-C. Ini merupakan pencapaian pertama karena sejak dirilisnya genom manusia pada tahun 2000, genom manusia yang berhasil diurutkan hanya merupakan bagian eukromatin saja, yang meliputi 92% keseluruhan genom dan menyisakan 8% genom belum diurutkan.

Pengurutan keseluruhan genom dapat dibedakan menjadi pengurutan genom de novo dan pengurutan ulang keseluruhan genom. Pengurutan genom de novo diterapkan pada spesies atau genom yang baru dipelajari untuk menghasilkan urutan baru. Adapun pengurutan ulang keseluruhan genom diterapkan untuk mengidentifikasi varian dengan membandingkan urutan genom individu dengan genom referensi.

## Alur kerja
Pada umumnya, alur kerja pengurutan keseluruhan genom diawali oleh tahap persiapan sampel, persiapan pustaka, pengurutan, penjajaran, pengecekan kualitas, pemanggilan varian, anotasi, dan analisis.

### Persiapan sampel
Pada proses persiapan data, sampel nukleotida dipastikan kesesuaian kualitas dan kuantitasnya. DNA diekstraksi dengan pelisisan sel sampel biologis, kemudian dimurnikan dari protein, dan pengotor seluler lainnya. 

### Persiapan pustaka
Materi genetik yang telah dipisahkan dari pengotornya, kemudian disesuaikan ukuran panjang fragmennya dengan metode mekanik maupun enzimatik. Pada DNA yang telah terfragmentasi dilakukan perbaikan ujung fragmen dan ligasi adaptor nukleotida pada ujung tersebut. Pustaka adaptor yang telah diligasi lalu diberi pengayaan. Hasil dari proses ini divalidasi dan dikuantifikasi untuk memastikan fragmen DNA memiliki konsentrasi yang cukup tinggi untuk masuk ke tahap pengurutan. 

### Pengurutan
Pustaka yang telah dibangun dimasukkan pada alat pengurutan dengan teknologi yang beragam. Beberapa teknologi yang digunakan untuk pengurutan keseluruhan genom seperti Illumina, Oxford Nanopore, dan Pacbio menghasilkan data yang tersimpan dalam format berkas standar untuk digunakan dalam penjajaran. 

### Penjajaran dan perakitan
Data hasil pengurutan digunakan pada tahap penjajaran untuk memetakan bacaan nukleotida ke genom referensi. Proses ini menerapkan langkah komputasi dengan satu atau beberapa algoritma khusus. 

Urutan genom disusun kembali pada tahap perakitan menjadi segmen-segmen besar. Perakitan genom dapat dilakukan melalui dua pendekatan utama, yakni perakitan de novo dan perakitan berbasis referensi. Pada perakitan de novo diterapkan metode komputasi untuk penjajaran pembacaan yang tumpang tindih pada pengurutan keseluruhan genom dan dirakit menjadi *contigs*. Perangkat lunak yang dapat digunakan untuk metode perakitan de novo mencakup ABySS, SOAPdenovo dan Velvet. Sementara itu, perakitan berbasis referensi menerapkan lebih sedikit komputasi. Pendekatan ini menjajarkan hasil pembacaan ke urutan genom referensi untuk membangun urutan konsensus. Adapun perangkat lunak yang dapat digunakan untuk pendekatan ini mencakup MAQ, RMAP, dan SeqMap. 

### Pengecekan kualitas
Kualitas hasil pengurutan dapat diperiksa dengan alat seperti FastQC, FASTX-Toolkit, PRINSEQ, dan QUAST dengan metrik penilaian berupa ukuran perakitan, nomor contig dan jumlah ketidakcocokan urutan.

### Pemanggilan varian
Pada proses pemanggilan varian akan dideteksi adanya varian atau perbedaan antara genom yang telah diurutkan dan genom referensi dari basis data. Varian ini dapat berupa polimorfisme nukleotida tunggal, mutasi berupa penyisipan atau penghapusan basa, serta variasi struktural. Beberapa perangkat yang dapat digunakan untuk pemanggilan varian ini mencakup GATK, SAMtools, Pindel, SVMerge, dan sebagainya. 

### Anotasi
Anotasi merupakan langkah identifikasi segmen genom target dan penambahan informasi biologis pada data hasil pengurutan dan varian yang telah diidentifikasi. Anotasi dapat dilakukan dengan perangkat seperti Genemark untuk mengidentifikasi lokasi gen atau menggunakan BLAST untuk mengetahui fungsi dari gen target. Kelengkapan hasil anotasi dipengaruhi oleh hasil perakitan genom. 

### Analisis
Analisis merupakan langkah penafsiran data hasil anotasi untuk menemukan informasi biologis seperti pengaruh varian pada gen asli. 

## Referensi