ՌՆԹ պոլիմերազ II

**ՌՆԹ պոլիմերազ II,** բազմասպիտակուցային համալիր, որը տրանսկրիպցիայի է ենթարկում ԴՆԹ-ն՝ վերածելով այն ինֆորմացիոն ՌՆԹ-ի (իՌՆԹ) նախորդների, ինչպես նաև փոքր կորիզային ՌՆԹ-ների (փկՌՆԹ, snRNA) և միկրոՌՆԹ-ների մեծ մասի: Այն էուկարիոտ բջիջների կորիզում հայտնաբերված երեք ՌՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտներից մեկն է: Լինելով 12 ենթամիավորից բաղկացած 550 կիլոդալտոն զանգվածով համալիր՝ ՌՆԹ պոլիմերազ II-ը ՌՆԹ պոլիմերազների ամենաշատ ուսումնասիրված տեսակն է: Տրանսկրիպցիոն գործոնների լայն շրջանակ է անհրաժեշտ, որպեսզի այն կարողանա կապվել գեների պրոմոտորների հետ և սկսել տրանսկրիպցիան։

## Հայտնագործություն

Վաղ շրջանի հետազոտությունները ենթադրում են առնվազն երկու ՌՆԹ պոլիմերազների գոյության մասին. մեկը, որը կորիզակում սինթեզում է ռՌՆԹ-ն, և մյուսը, որը սինթեզում է այլ ՌՆԹ-ներ կորիզահյութում՝ կորիզի այն հատվածում, որը կորիզակից դուրս է: 1969 թվականին կենսաքիմիկոսներ Ռոբերտ Գ. Ռոդերը և Ուիլյամ Ռատերը բացահայտել են, որ գոյություն ունեն ընդհանուր առմամբ երեք տարբեր կորիզային ՌՆԹ պոլիմերազներ՝ ներառյալ մի լրացուցիչ ՌՆԹ պոլիմերազ, որը պատասխանատու է եղել կորիզահյութում որոշակի տեսակի ՌՆԹ-ների տրանսկրիպցիայի համար: Այս արդյունքը ստացվել է իոնափոխանակային քրոմատոգրաֆիայի կիրառմամբ՝ դիէթիլէթանոլամինով պատված սեֆադեքս հատիկների միջոցով: Այս մեթոդը թույլ է տվել անջատել ֆերմենտներն ըստ համապատասխան հայտնաբերման հերթականության՝ I, II, III՝ ավելացնելով ամոնիումի սուլֆատի կոնցենտրացիան: Ֆերմենտներն անվանվել են ըստ հայտնաբերման հերթականության՝ ՌՆԹ պոլիմերազ I, ՌՆԹ պոլիմերազ II և ՌՆԹ պոլիմերազ III: Այս հայտնագործությունն ապացուցել է, որ կորիզահյութում առկա է ևս մեկ լրացուցիչ ֆերմենտ, ինչը թույլ է տվել տարբերակել ՌՆԹ պոլիմերազ II-ը և ՌՆԹ պոլիմերազ III-ը միմյանցից:

ՌՆԹ պոլիմերազ II-ը ենթարկվում է կարգավորվող տրանսկրիպցիոն դադարի՝ էլոնգացիայի վաղ փուլում: Տարբեր հետազոտություններ ցույց են տվել, որ տրանսկրիպցիոն էլոնգացիայի խաթարումը կապված է քաղցկեղի, նեյրոդեգեներատիվ հիվանդությունների, ՄԻԱՎ-ի լատենտության և այլնի հետ:

## Ենթամիավորներ

Կորիզավորների կորիզային ՌՆԹ պոլիմերազ II-ն առաջին անգամ զտվել է տրանսկրիպցիոն անալիզների միջոցով**:** Զտված ֆերմենտը սովորաբար ունի 10–12 ենթամիավոր և անկարող է ինքնուրույն ճանաչել սպեցիֆիկ պրոմոտորները: Հայտնի են բազմաթիվ ենթամիավոր-ենթամիավոր փոխազդեցություններ։
* **ԴՆԹ-կախյալ ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի RPB1 ենթամիավոր**՝ ֆերմենտ, որը մարդկանց մոտ կոդավորվում է POLR2A գենով, իսկ խմորասնկերի մոտ՝ RPO21 գենով: RPB1-ը ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի ամենամեծ ենթամիավորն է: Այն պարունակում է կարբոքսի-ծայրային դոմեն (CTD), որը բաղկացած է մինչև 52 հեպտապեպտիդային կրկնություններից (YSPTSPS), որոնք էական են պոլիմերազի ակտիվության համար: CTD-ն հայտնաբերվել է Տորոնտոյի համալսարանում՝ Ք. Ջ. Ինգլսի լաբորատորիայում և Ջոնս Հոփքինսի համալսարանում՝ Ջ. Լ. Քորդենի կողմից: Պոլիմերազի մի քանի այլ ենթամիավորների հետ համակցվելով՝ RPB1-ը ձևավորում է պոլիմերազի ԴՆԹ-կապող դոմենը՝ ակոս, որտեղ ԴՆԹ-ի կաղապարը տրանսկրիպցիայի է ենթարկվում ՌՆԹ-ի: Այն ուժեղ փոխազդում է RPB8-ի հետ:
* **RPB2** (POLR2B)՝ երկրորդ ամենամեծ ենթամիավորը, որը պոլիմերազի առնվազն երկու այլ ենթամիավորների հետ համակցված ձևավորում է կառուցվածք, որը ֆերմենտի ակտիվ կենտրոնում պահպանում է կապը ԴՆԹ-ի մատրիցի և նոր սինթեզված ՌՆԹ-ի միջև։
* **RPB3** (POLR2C)՝ երրորդ ամենամեծ ենթամիավորը։ Գոյություն ունի որպես հետերոդիմեր պոլիմերազի մեկ այլ՝ POLR2J ենթամիավորի հետ՝ ձևավորելով միջուկային ենթահամալիր։ RPB3-ը ուժեղ փոխազդեցության մեջ է մտնում RPB1-5, 7, 10–12 ենթամիավորների հետ։
* **ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի ենթամիավոր B4-ը (RPB4)**՝ կոդավորվում է POLR2D գենով և հանդիսանում է չորրորդ ամենամեծ ենթամիավորը, որը կարող է ունենալ սթրես-պաշտպանիչ դեր։
* **RPB5**՝ մարդկանց մոտ այն կոդավորվում է POLR2E գենով: Յուրաքանչյուր ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի կազմում առկա են այս ենթամիավորի երկու մոլեկուլ: RPB5-ը ուժեղ փոխազդեցության մեջ է մտնում RPB1-ի, RPB3-ի և RPB6-ի հետ:
* **RPB6 (POLR2F)**՝ ձևավորում է կառուցվածք առնվազն երկու այլ ենթամիավորներով, որոնք կայունացնում են ԴՆԹ-ի կաղապարի վրա տրանսկրիպցիոն պոլիմերազը։
* **RPB7**՝ կոդավորված է POLR2G-ով և կարող է դեր խաղալ պոլիմերազի ֆունկցիայի կարգավորման գործում: RPB7-ը ուժեղ փոխազդում է RPB1-ի և RPB5-ի հետ։
* **RPB8 (POLR2H)**՝ փոխազդում է RPB1-3, 5 և 7 ենթամիավորների հետ։
* **RPB9**՝ ակոսը, որտեղ ԴՆԹ-կաղապարը տրանսկրիպցիայի է ենթարկվում ՌՆԹ-ի, կազմված է RPB9 (POLR2I) և RPB1 ենթամիավորներից:
* **RPB10**՝ POLR2L գենի արտադրանքը: Այն փոխազդում է RPB1-3-ի և 5-ի հետ, և ուժեղ RPB3-ի հետ։
* **RPB11**՝ RPB11 ենթամիավորը մարդկանց մոտ իր հերթին բաղկացած է երեք ենթամիավորներից՝ POLR2J (RPB11-a), POLR2J2 (RPB11-b) և POLR2J3 (RPB11-c)։
* **RPB12**՝ փոխազդում է RPB3-ի և RPB12-ի (POLR2K) հետ:

## Կառուցվածք
RPB3-ը մասնակցում է ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի հավաքմանը: Ենթամիավորների սինթեզից անմիջապես հետո ձևավորվում է RPB2-ի և RPB3-ի ենթամիավորը: Այս համալիրը հետագայում փոխազդում է RPB1-ի հետ: RPB3-ը, RPB5-ը և RPB7-ը փոխազդում են միմյանց հետ՝ ձևավորելով հոմոդիմերներ, իսկ RPB3-ը և RPB5-ը միասին կարող են կապ հաստատել բոլոր մյուս RPB ենթամիավորների հետ, բացառությամբ RPB9-ի: Միայն RPB1-ն է ամուր կապվում RPB5-ի հետ: RPB1 ենթամիավորը կապվում է նաև RPB7-ի, RPB10-ի հետ, իսկ ավելի թույլ, բայց առավել արդյունավետ կերպով՝ RPB8-ի հետ: Երբ RPB1-ը մտնում է համալիրի կազմի մեջ, կարող են միանալ այլ ենթամիավորներ, ինչպիսիք են RPB5-ը և RPB7-ը, որտեղ RPB5-ը կապվում է RPB6-ի և RPB8-ի հետ, իսկ RPB3-ը ներգրավում է RPB10-ին, RPB11-ին և RPB12-ին: RPB4-ը և RPB9-ը կարող են միանալ այն ժամանակ, երբ համալիրի մեծ մասն արդեն հավաքված է: RPB4-ը համալիր է կազմում RPB7-ի հետ:

## Կինետիկա
Ֆերմենտները կարող են վայրկյանում մինչև մի քանի միլիոն ռեակցիա կատալիզել: Ֆերմենտային ռեակցիաների արագությունը կախված է լուծույթի պայմաններից և սուբստրատի կոնցենտրացիայից: Ինչպես մյուս ֆերմենտները, POLR2-ն ունի հագեցման կոր և առավելագույն արագություն (Vmax): Այն ունի Km (սուբստրատի կոնցենտրացիան, որն անհրաժեշտ է Vmax-ի կեսին հասնելու համար) և kcat (մեկ ակտիվ կենտրոնի կողմից վայրկյանում մշակվող սուբստրատի մոլեկուլների քանակը): Սպեցիֆիկության հաստատունը տրվում է kcat/Km հարաբերակցությամբ: Այս հաստատունի տեսական առավելագույնը դիֆուզիոն սահմանն է՝ մոտ 108-ից 109 (M-1 s-1), որտեղ ֆերմենտի և սուբստրատի յուրաքանչյուր բախում հանգեցնում է կատալիզի: Խմորասնկերի մոտ ամենամեծ ենթամիավորի Trigger-Loop դոմենի մուտացիան կարող է փոխել ֆերմենտի կինետիկան:

Բակտերիային ՌՆԹ պոլիմերազը, որը հանդիսանում է ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի ազգակիցը, անցնում է ինակտիվացված և ակտիվացված վիճակների միջև՝ ԴՆԹ-ի երկայնքով հետ ու առաջ տեղաշարժվելու (տրանսլոկացիայի) միջոցով։ Նուկլեոտիդների հետևյալ կոնցենտրացիաները՝ [GTP] = 10 մկՄ, [UTP] = 10 մկՄ, [ATP] = 5 մկՄ և [CTP] = 2.5 մկՄ, բակտերիային RNAP-ի համար ապահովում են էլոնգացիայի միջին արագություն (շրջանառության թիվ)՝ մոտավորապես 1 նուկլեոտիդ վայրկյանում։

ՌՆԹ պոլիմերազ II-ը տրանսկրիպցիայի էլոնգացիայի (շղթայի երկարացման) ընթացքում ենթարկվում է տևական կո-տրանսկրիպցիոն դադարների։ Այս դադարներն առավել արտահայտված են նուկլեոսոմների մոտ և մասամբ պայմանավորված են պոլիմերազի անցմամբ տրանսկրիպցիոն առումով ոչ կոմպետենտ «հետադարձ շարժման» վիճակի։ Այս դադարների տևողությունը տատանվում է վայրկյաններից մինչև րոպեներ կամ ավելի երկար, իսկ երկարատև դադարներից դուրս գալուն կարող են նպաստել էլոնգացիայի գործոնները, ինչպիսին է TFIIS-ը։ Իր հերթին, տրանսկրիպցիայի արագությունն ազդում է այն բանի վրա, թե արդյոք տրանսկրիպցիայի ենթարկված նուկլեոսոմների հիստոնները կհեռացվեն քրոմատինից, թե նորից կտեղադրվեն տրանսկրիպցիա իրականացնող պոլիմերազի հետևում։

### Ալֆա Ամանիտին
ՌՆԹ պոլիմերազ II-ը պաշարվում է Ալֆա ամանիտինի և այլ ամատոքսինների կողմից: Ալֆա-ամանիտինը խիստ թունավոր նյութ է, որը հանդիպում է բազմաթիվ սնկերի մեջ: Սնկային թույնը (ալֆա-ամանիտինը) տարբեր ազդեցություն է թողնում ՌՆԹ պոլիմերազների վրա՝ I, II և III: ՌՆԹ պոլիմերազ I-ը լիովին բացարձակ զգայուն չէ է այս նյութի նկատմամբ և շարունակում է բնականոն գործել, մինչդեռ ՌՆԹ պոլիմերազ III-ն ունի չափավոր զգայունություն: Սակայն ՌՆԹ պոլիմերազ II-ը լիովին պաշարվում է այս թույնի կողմից: Ալֆա-ամանիտինն արգելակում է ՌՆԹ պոլիմերազ II-ը՝ ուժեղ փոխազդեցությունների մեջ մտնելով ֆերմենտի «ձագարի», «ճեղքի» և RPB-1 ենթամիավորի առանցքային «կամրջակային ալֆա-պարույրի» շրջանի հետ:

## Հոլոֆերմենտ
ՌՆԹ պոլիմերազ II հոլոֆերմենտը էուկարիոտիկ ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի այն ձևն է, որը ներգրավվում է կենդանի բջիջների սպիտակուց-կոդավորող գեների պրոմոտորների վրա: Այն բաղկացած է ՌՆԹ պոլիմերազ II-ից, ընդհանուր տրանսկրիպցիոն գործոնների մի խմբից և կարգավորող սպիտակուցներից, որոնք հայտնի են որպես SRB սպիտակուցներ:

Հոլոֆերմենտի հավաքման մի մասը կոչվում է նախամեկնարկային համալիր, քանի որ դրա հավաքումը տեղի է ունենում գենի պրոմոտորի վրա՝ նախքան տրանսկրիպցիայի մեկնարկը: Միջնորդ համալիրը որպես կամուրջ է գործում ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի և տրանսկրիպցիոն գործոնների միջև։

## Քրոմատինային կառուցվածքով հսկողություն
Սա մի օրինակելի մեխանիզմի ուրվագիծ է խմորասնկերի բջիջներում, որի միջոցով քրոմատինի կառուցվածքը և հիստոնների հետտրանսլյացիոն ձևափոխումները օգնում են կարգավորել և արձանագրել գեների տրանսկրիպցիան ՌՆԹ պոլիմերազ II-ով գեների տրանսկրիպցիան։ Այս ուղին ներկայացնում է կարգավորման օրինակներ տրանսկրիպցիայի հետևյալ կետերում.
* Նախամեկնարկ (պրե-ինիցիացիա, խթանում Bre1-ի միջոցով, հիստոնների ձևափոխում)
* Մեկնարկ (ինիցիացիա, խթանում TFIIH-ի միջոցով՝ Pol II-ի ձևափոխում, և խթանում COMPASS-ի միջոցով՝ հիստոնների ձևափոխում)
* Երկարում (էլոնգացիա, խթանում Set2-ի միջոցով, հիստոնների ձևափոխում)
Սա գործընթացի տարբեր փուլերը դիտարկում է որպես կարգավորիչ քայլեր: Դեռևս ապացուցված չէ, որ դրանք օգտագործվում են կարգավորման համար, սակայն շատ հավանական է, որ այդպես է:

ՌՆԹ Պոլիմերազ II երկարացման խթանիչները կարելի է ամփոփել 3 դասերի մեջ:
#Դեղամիջոց կամ հաջորդականություն–կախյալ գործոններ, որոնց վրա ազդում է կանգը (տարբեր միջամտող սպիտակուցներ)
#Քրոմատինի կառուցվածքին ուղղված գործոններ (հիստոնների հետտրանսլյացիոն ձևափոխիչներ, օրինակ՝ հիստոն մեթիլտրանսֆերազներ)
#ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի կատալիզը բարելավող գործոններ (տարբեր միջամտող սպիտակուցներ և պոլիմերազ II-ի կոֆակտորներ)

## Տրանսկրիպցիոնային մեխանիզմներ
* Քրոմատինի կառուցվածքի վրա ազդող գործոնները․(HMTs (**H**istone **M**ethyl**T**ransferases)): COMPASS§† – (**COM**plex of **P**roteins **AS**sociated with **S**et1)՝ մեթիլացնում է հիստոն H3-ի լիզին 4-ը (H3K4) և պատասխանատու է տրանսկրիպցիայի ռեպրեսիայի (ճնշման) կամ «լռեցման» համար: Այն բջջի աճի և ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի (RNAP II) շրջանակներում տրանսկրիպցիայի կարգավորման բնականոն մասն է:
* Set2՝ մեթիլացնում է հիստոն H3-ի լիզին 36-ը (H3K36)։ Set2-ը մասնակցում է տրանսկրիպցիայի էլոնգացիայի (շղթայի երկարացման) կարգավորմանը՝ CTD-ի (ՌՆԹ պոլիմերազի կարբոքսիլ-ծայրային դոմենի) հետ անմիջական շփման միջոցով։
* Bre1՝ ուբիկվիտինացնում է (ավելացնում է ուբիկվիտին) հիստոն H2B-ի լիզին 123-ը (K123)։ Այն ասոցացված է նախաինիցիացիայի (տրանսկրիպցիայի նախամեկնարկի) հետ և հնարավորություն է տալիս ՌՆԹ պոլիմերազ II-ին կապվել ԴՆԹ-ին։

### C-տերմինալ դոմեն
RPB1-ի C-ծայրը երկարում է՝ ձևավորելով C-ծայրային դոմենը: ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի C-ծայրային դոմենը սովորաբար բաղկացած է Տիր–Սեր–Պրո–Տրե–Սեր–Պրո–Սեր հաջորդականության մինչև 52 կրկնություններից: Այս դոմենը ձգվում է RNAPII ֆերմենտի միջուկից մինչև ելքային անցուղի. այս տեղակայումն արդյունավետ է, քանի որ այն խթանում է «ՌՆԹ-ի պրոցեսինգի (մշակման) ռեակցիաները՝ ՌՆԹ-ի պրոցեսինգի մեխանիզմի բաղադրիչների հետ ուղղակի կամ անուղղակի փոխազդեցությունների միջոցով»: CTD-ն գոյություն չունի ՌՆԹ պոլիմերազ I-ում կամ III-ում: ՌՆԹ պոլիմերազի CTD-ն առաջին անգամ հայտնաբերվել է Տորոնտոյի համալսարանում՝ Ս. Ջ. Ինգլեսի լաբորատորիայում, ինչպես նաև Ջոնս Հոփքինսի համալսարանում՝ Ջ. Քորդենի լաբորատորիայում՝ համապատասխանաբար խմորասնկերի և մկների ՌՆԹ պոլիմերազի RPB1 ենթամիավորը կոդավորող ԴՆԹ-ի հաջորդականացման ընթացքում: Այլ սպիտակուցները հաճախ կապվում են ՌՆԹ պոլիմերազի C-ծայրային դոմենին՝ պոլիմերազի ակտիվությունը խթանելու համար: Այն սպիտակուցային դոմեն է, որը մասնակցում է տրանսկրիպցիայի ինիցիացիային (մեկնարկին), ՌՆԹ տրանսկրիպտի «քեփինգին» (գլխարկավորմանը) և սպլայսոսոմին միացմանը՝ ՌՆԹ-ի սփլայսինգի համար:

#### CTD-ի ֆոսֆորիլացում
ՌՆԹ պոլիմերազ II-ը գոյություն ունի երկու ձևով՝ չֆոսֆորիլացված և ֆոսֆորիլացված, համապատասխանաբար՝ II A և II O։ Այս երկու ձևերի միջև անցումը հեշտացնում է տրանսկրիպցիայի տարբեր գործառույթները: CTD-ի (ծայրային դոմենի) ֆոսֆորիլացումը կատալիզվում է վեց ընդհանուր տրանսկրիպցիոն գործոններից մեկի՝ TFIIH-ի միջոցով: TFIIH-ը ծառայում է երկու նպատակի. մեկը տրանսկրիպցիայի մեկնարկային կետում ԴՆԹ-ի պարույրի քանդումն է, իսկ մյուսը՝ ֆոսֆորիլացումը: II ձևը միանում է նախամեկնարկային համալիրին. սա ենթադրվում է այն պատճառով, որ II A-ն ավելի բարձր խնամակցությամբ է կապվում TBP-ին (TATA-բոքս կապող սպիտակուցին), քան II O ձևը: ՌՆԹ պոլիմերազ II O ձևը նպաստում է ՌՆԹ շղթայի երկարացմանը: Երկարացման մեկնարկի մեթոդն իրականացվում է 5-րդ դիրքում գտնվող սերինի (Ser5) ֆոսֆորիլացման միջոցով՝ TFIIH-ի օգնությամբ: Նոր ֆոսֆորիլացված Ser5-ը ներգրավում է ֆերմենտներ՝ նոր սինթեզված ՌՆԹ-ի 5' ծայրը գլխարկավորելու համար, ինչպես նաև «3' մշակման գործոններ՝ poly(A) կայքերի համար»: Երբ ֆոսֆորիլացվում է երկրորդ սերինը՝ Ser2-ը, ակտիվանում է էլոնգացիան: Էլոնգացիան դադարեցնելու համար պետք է տեղի ունենա դեֆոսֆորիլացում: Երբ դոմենն ամբողջությամբ դեֆոսֆորիլացվում է, RNAP II ֆերմենտը «վերամշակվում» է և կատալիզում նույն գործընթացը մեկ այլ մեկնարկային կայքում:

## Տրանսկրիպցիայով ընթացող ռեկոմբինացիոն ռեպարացիա
ԴՆԹ-ի օքսիդացիոն վնասումը կարող է արգելակել ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի տրանսկրիպցիան և առաջացնել շղթայի վնասումներ: Նկարագրվել է ՌՆԹ-կաղապարով տրանսկրիպցիայի հետ կապված ռեկոմբինացիոն գործընթաց, որը ԴՆԹ-ն կարող է պաշտպանել վնասումից: Բջջային ցիկլի G1/G0 փուլերի ընթացքում բջիջները ցուցաբերում են հոմոլոգիական ռեկոմբինացիայի գործոնների հավաքագրում՝ հենց այն երկշղթա վնասված հատվածներում, որոնք գտնվում են ակտիվ տրանսկրիպցիայի ենթարկվող տիրույթներում: Ըստ ամենայնի, տրանսկրիպցիան կապված է ԴՆԹ-ի երկշղթա վնասված հատվածների վերականգնման հետ՝ ՌՆԹ-կաղապարով հոմոլոգ ռեկոմբինացիայի միջոցով: Վերականգնման այս գործընթացը արդյունավետորեն և ճշգրտորեն վերամիավորում է այն գեների երկշղթա վնասված հատվածները, որոնք տվյալ պահին ակտիվորեն տրանսկրիպցիայի են ենթարկվում ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի կողմից:

## Տես նաև
* Տրանսկրիպցիա

## Ծանոթագրություններ

## Արտաքին հղումներ
* Լրացուցիչ տեղեկություններ Բերկլիի ազգային լաբորատորիայում (Berkeley National Lab):
* 

Կատեգորիա:Գենետիկա
Կատեգորիա:ՌՆԹ
Կատեգորիա:Սպիտակուցներ
Կատեգորիա:Տրանսֆերազներ
Կատեգորիա:Ֆերմենտներ