ריצוף SOLiD

ממוזער|220x220 פיקסלים|הכנת ספריית DNA עבור פלטפורמת SOLiD. מחלקים קטעי DNA המרכיבים את הכרומוזום, ומכפילים אותם. כך ניתן לרצף קטעים נבחרים, הנושאים גנים מוגדרים.
**ריצוף SOLiD** (באנגלית: **Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection**; ריצוף באמצעות קשירה וזיהוי של אוליגונוקלאוטידים (קבוצה של נוקליאוטידים הקשורים בשרשרת) היא טכנולוגיית הדור החדש לריצוף DNA שפותחה על ידי Applied Biosystems  והייתה זמינה מסחרית מאז 2008. טכנולוגיה זו משתמשת בקידוד דו בסיסי  על מנת לרצף ולא על ידי סינתזה ומאפשרת הפקה של כ-100 ריצופים בקריאה אחת.

## העיקרון הבסיסי של ריצוף קוד גנטי
מבוסס על חיתוך (ליגציה) וזיהוי הנוקליאוטידים המרכיבים את סליל ה־DNA. קיימים ארבעה נוקליאוטידים בסיסיים: A-אדנין, T-טימין, G-גואנין ו־C-ציטוזין. כל קוד גנטי מורכב מרצף של שלשות של בסיסים (למשל AGT), כל שלשה מקדדת לחומצה אמינית ספציפית (קיימות 21 חומצות אמינו), הרצף המקדד לחלבון שלם נקרא גן. הריצוף נעשה כיום במכונות אוטומטיות החותכות ברצף נוקליאוטיד אחד מהקצה פנימה, ומזהות אותו. מכיוון שגן עשוי להכיל אלפי נוקליאוטידים, ככל שהמכונה פועלת מהר ומדויק יותר כך ניתן לרצף דוגמאות רבות יותר, ולגלות הבדלים של נוקליאוטיד בודד. כך ניתן לזהות במהירות מוטציות. הצורך הגובר לריצוף ולזיהוי מחלות תורשתיות, זיהו גנטי של קרובי משפחה ועוד המחייב פיתוח שיטות מהירות ויעילות יותר.

## שיטת SOLid
מבוססת על חיתוך רצף ארוך לקבוצות של 4 נוקליאוטידים, שמרוצפים במקביל. במקום לזהות כל נוקליאוטיד בודד משתמשים בגלאי הנקרא פרוב (prob) הקשור לחומר פלואורוסצנטי, שמזהה את סדר הנוקלאוטידים בכל אוליגונוקליאוטיד על-ידי זיהוי צרופי זוגות (תמונה 2).

## משמעות כלכלית
יחד עם שיטות דומות אחרות (כגון Roche-454 pyrosequencing  ו-Solexa  system), הוזילה השיטה משמעותית את עלויות הריצוף. העלות ירדה מ־0.01 דולר לבסיס בשנת 2004 לכמעט פי 100 פחות בשנת 2006. יתרה מזאת, קיבולת הריצוף גדלה כאשר בודקים במקביל אוליגונוקליאוטידים ומכפילים את מהירות הריצוף לעומת השיטה הקודמת של זיהוי מהקצה פנימה בטור. מ-1,000,000 בסיסים למכונה ליום בשנת 2004 ליותר מ-5,000,000,000 בסיסים למכונה ליום בשנת 2009.

## היסטוריה
אפשרות הריצוף של סדר הנוקליאוטידים ב־DNA, הועלתה כבר על-ידי המדענים ג'יימס ווטסון האמריקאי ופרנסיס קריק הבריטי עם גילוי מבנה ה־DNA ב-1953, אבל חסרו להם הידע, השיטות וההבנה הבסיסית כיצד מורכב הגנום ואיך ניתן לזהות רצפים, ולחבר את הרצף של הקוד למבנה החלבונים שהגן מקודד להם.

### הדור הראשון
ווטסון וקריג פתרו את המבנה התלת-ממדי של ה-DNA בשנת 1953, תוך שימוש בנתונים קריסטלוגרפיים שהופקו על ידי רוזלינד פרנקלין ומוריס וילקינס אשר תרמו למסגרת מושגית הן לשכפול ה-DNA והן לקידוד חלבונים בחומצות גרעין. עם זאת, היכולת 'לקרוא' או לרצף את ה-DNA לא התפתחה במשך זמן מה. אסטרטגיות שפותחו כדי להסיק את רצף שרשראות החלבון לא היו ניתנות ליישום בשיטות חקירת חומצות גרעין שהיו אז. מולקולות ה-DNA היו ארוכות בהרבה ועשויות מפחות יחידות שהיו דומות יותר זו לזו, ולא ניתן היה להבחין ביניהן. אבל הקושי להפיק כמות של רצפים זהים שתאפשר מחקר, גרם לכך שרק עם גילוי מערכת סינתזת החלבונים ו־RNAm וריבוזומים, החלו להפיק RNA ממיטוכונדריות ולייצר DNA בהעתקה הפוכה מ־RNA באמצעות האנזים רוורס טרנסקריפטאז. ב־1965 הצליחו רוברט הולי Robert Holley וחבריו לזהות רצף של tRNA שהופק מהשמר Saccharomyces cerevisiae. רק ב־1972 הצליח וולטר פייר (Walter Fiers) לזהות סדר שלם של גנום בשמר זה. שילוב של אלקטרופורזה עם כרומטוגרפיה בשנות ה־70 של המאה הקודמת אפשר הפרדה דו-ממדית של קטעי DNA וחלבונים, והוביל שלב הבא. שימוש ב־RNA המופק מהגדיל הנבדק באמצעות האנזים DNA פולימראז

### הדור השני

ריצוף מקסאם - גילברט מבוססת על סימון רדיואקטיבי בקצה 5' של ה-DNA. ארבעה טיפולים כימיים שונים במולקולה גורמים ליצירת מקטעים מסוימים ב-DNA (C+G, A+T), אשר מטופלים באנזימי חיתוך הגורמים לניתוק השרשרת בנקודות מוגדרות לכל אנזים, (שהן רצף קצר שלמולקולת DNA). כך נוצרת ספרייה של מקטעי DNA באורכים משתנים, החל מהקצה המסומן. על ידי הפרדת המקטעים באמצעות הפרדה באלקטרופורזה, ניתן להסיק את זהות הבסיס בכל עמדה. מורכבות השיטה והשימוש בחומרים רדיואקטיביים, יחד עם התפתחות שיטות ריצוף אחרות צמצמה את השימוש בשיטת ריצוף זו. בשנות ה־70 וה80, עם המצאת ה־PCR, ופיתוח המכונות האוטומטיות הראשונות, החל המעבר משיטה ששימשה בעיקר למחקר, למוצר המאפשר מתן שירות ריצוף לשימוש רפואי, שאפשרה זיהוי נוקליאוטידים לפי המטענים החשמליים, שימוש באנזימי חיתוך המכוונים לקודונים ספציפיים. שיטת ריצוף ה-DNA הנפוצה ביותר היא השיטה שפותחה על ידי פרדריק סנגר בשנת 1975 ושוכללה ב-1977. על פיתוח השיטה והשימוש בה, זכה סנגר בפרס נובל שני בכימיה בשנת 1980. בשיטה זו משתמשים בפריימרים (תחלים) המתאימים לרצף DNA הצמוד לקטע אותו רוצים לרצף, ובאנזים DNA פולימראז, המשמש ליצירת רצף משלים לקטע ה-DNA.

### הדור השלישי
בשנת 1996 פותחה שיטת ריצוף המתבססת על זיהוי של שחרור פירופוספט בעת הוספת נוקליאוטיד; השיטה, שנקראת Pyrosequencing, פותחה על ידי מוסטפא רונגי ופל ניירן במכון המלכותי לטכנולוגיה בסטוקהולם.בשנת 1997 פסקל מאייר ולורן פרנילי רשמו פטנט על טכנולוגיה להכנת DNA לריצוף בתפוקה גבוהה, כולל שלב של הגברת מקטעי DNA על גבי שבב. פטנט זה, יחד עם שיטה נוספת שפותחה על ידי רוג'ר טסיין משמשת כבסיס לשיטות ריצוף בתפוקה גבוהה של חברת אילומינה. הזמינות של שיטות לריצוף בתפוקה גבוהה מאיצה את עידן הרפואה המותאמת אישית.

קיימים למעלה מ-30 פרסומים שמתארים את השימוש בה לראשונה: בהצבת נוקלאוזום מפרסום של Valouev et al, אנליזת ביטוי גנים ברמת השעתוק של תאי גזע מפרסום של Cloonan et al, אנליזה של תעתיק שלם של תא בודד מפרסום של Tang et al ולבסוף ריצוף מחדש של גנים אנושיים מפרסום של McKernan et al.

אולם שיטה זו ושיטות דומות לה (כלומר שמבוססות על ריצוף על ידי ליגציה ( חיתוך במקומות מזוהים על הגדיל)) דווחו כבעלי בעיות בריצוף של רצפים פלינדרומים (מצב שבו מחצית הרצף מהווה תמונת ראי של המחצית השנייה,)

### הדור האחרון

טכנולוגיה מיוחדת היא שיטת תעלות מרצפות.רעיון של ריצוף DNA בשיטת תעלות מרצפות הוצע בתחילת שנות ה-90 של המאה ה-20 בידי שתי קבוצות שעבדו בנפרד. האחת בראשות Mark Akeson והשנייה בראשות Jens Gundlach. שתי הקבוצות גילו שניתן להעביר מולקולת DNA יחידה דרך תעלה חלבונית ביולוגית וכי זרם יונים שנמדד מהתעלה המרצפת בעת מעבר המולקולה דרך התעלה נותן מידע על רצף הנוקלאוטידים של המולקולה. בשיטה זו יוצרים ננו-תעלות המובילות גדילים בודדים של DNA, דרך ממברנה הקוראת את המטענים החשמליים של כל נוקליאטיד (לכל אחד מארבעת הנוקליאוטידים יש מטען חשמלי אופייני) שעובר דרכה. בשיטה זו כבר אפשר לרצף אלפי יחידות במקביל. שיטה ייחודית היא **ION**, שבה מזהים נוקליאוטידים על-ידי פולימריזציה של גדיל תואם על גבי הגדיל הנבדק. כל קישור כזה מלווה בשחרור פרוטון (יון מימן), מכיוון שלכל זוג נוקליאטידים מספר קשרים שונה (A:T ו־G:C) ניתן לזהות את הנוקליאוטיד על-ידי קריאת פליטת יוני המימן. בין השיטות החדשות, שחלקן עדיין בפיתוח נמצאת גם **SOLid (סוליד).**ממוזער|סכימת קידוד דו-בסיסי בטבלה. בקידוד זה, לכל זוג בסיסים ייחודי בקצה 3' של הפרוב מוקצה אחד מתוך ארבעת הצבעים האפשריים. לדוגמה עבור AA מוקצה הצבע הכחול, עבור AC מוקצה הצבע הירוק וכך לכל 16 הזוגות הייחודיים.

## כימיה
העיקרון הבסיסי שעליו מבוססת השיטה, מבוסס על הזוגות המתקבלים מבין DNAו - RNAm במהלך השעתוק, כאשר ב־DNA אדנין (A)מקיימת היברידיזציה ( חיבור רצפים) שבה תזווג תמיד עם תימין, (T) וגואנין (G) תמיד עם ציטוזין (C). ב־RNA, שאיננו קיים בסליל כפול, אלא נוצר על-ידי שעתוק מ־DNA כאשר במקום אדנין מתחבר הנוקליאוטיד אורציל (U). בשיטת **סוליד,** מייצרים פרוב סינתטי (רצף קצר של RNA שמתחבר לרצף תואם ב־DNA ומסומן בסימון שניתן לזיהוי, פלואורסצנטי, רדיואקטיבי או מגנטי) כאשר קצה אחד של הרצף ('5) מסומן בצבע פלואורסצנטי ובקצה השני ('3) באחת מארבע האפשרויות כך שתמיד ייווצר זיווג בסיסים. שבב שעליו מוטבעים כל ההרכבים האפשריים בין DNA ו־RNA קושר אליו את הנוקלאוטידים המזווגים לו. הצבע נקרא במכשיר ומציין זוג בסיסים כפול. השבב עצמו מורכב מרצף קצר שמצוין באותיות N ו-Z שתפקידם לחזק את הקשר בין רצף הנוקליאוטידים המתאים להיברידיזציה עם השבב (אינם מציינים נוקליאוטיד של ה־DNA). כך בטבלה של 4X4 פרובים ניתן תמיד לזהות 2 בסיסים שכנים.(תמונה 2) בהינתן רצף נוקליאוטידים שברצוננו לרצף, תתבצע היברידיזציה בינו לבין אוליגונוקליאוטיד  (פרוב) בעל תבנית ידועה כך שבכל פעם ירוצפו 2 נוקליאוטידים.התבנית מאפשרת למעשה את ההיברידיזציה של 2 בסיסים שכנים. [ממוזער|311x311 פיקסלים|פירוט ברשימה של 16 ה[תמורה (מתמטיקה)|פרמוטציות האפשריות של 2 בסיסים והתאמתם לארבעת הצבעים (כחול, ירוק, צהוב ואדום).]]
כפי שניתן לראות בשני האיורים המצורפים משמאל, ישנן 16 אפשרויות של זוג בסיסים לריצוף, ולכל פרמוטציה יש צבע פלואורסצנטי תואם (אדום, כחול, ירוק או צהוב) או במילים אחרות - לכל צבע יש 4 פרובים מתאימים. שיטות דומות מבוססות על ננו כדוריות (beads) הקשורות לרצפים המסומנים בצבע פלוארוסנטי או בסמן מגנטי.

התהליך של שיטה זו מחולק לשלבים:
### הכנת ספריית מקטעי דנ"א
בהינתן דגימת דנ"א שהיא רצף המטרה שברצוננו לרצף, מכינים ספריית מקטעים בעזרת פרגמנטציה (יצירת רצפים קצרים מדגימת הדנ"א) על ידי שיטות שונות כמו: Digestion. בעזרת אנזימי חיתוך שקוטעים את הרצף בנקודות הכוללות סדר קבוע של נוקליאוטידים. הטכנולוגיה מאפשרת שני סוגי ספריות - ספריות רצף יחיד (Single Fragment Library) וספריות דו-רצפים (Mate-Paired Library). לכל מקטע דנ"א קצה אחד שמסתיים בקצה 'C5 והקצה השני מסתיים ב-'C3. לקצה זה מחברים ריאגנט פלואורוצנטי שמקרין אור בצבע שנקבע כאשר מאירים אותו באולטרא סגול,(UV) ושל רצפי נוקליאוטידים ידועים שבהמשך יעזרו להבין מה היא נקודת ההתחלה והסוף של רצף המטרה. הכוונה ב־Mate-Paired Library היא שיש אפשרות למקבל את הריצוף כך ששני מקטעי רצפים באורכים ידועים יהיו מחוברים לשלושה אדפטרים (אדפטר הוא "מתאם" המחבר בין שני קטעים שלא מתחברים זה לזה). לבסוף, מכינים אוסף (ספריה) של מקטעים מסומנים שאורכם ידוע, ומצמידים אותם לננו-כדוריות (NanoBeads).(NB) לעיתים כל כדורית ניתנת לזיהוי על-ידי ברקוד הטבוע בה.

### הכפלה ב-PCR

כל NB מורכב מהרבה פרובים של דנ"א שמשלימים למתאםP1 כך שניתן לבצע היברידיזציה בין ה־NB לבין מקטעי הדנ"א שהכנו בשלב הקודם. וכל קטע דנ"א יתקשר ל־NB משלו. כדי לקבל יותר חומר של הרצף (Strand) מבצעים שכפול באמצעות PCR על כל NB. לאחר הכפלת המקטע הצמוד ל־NB מבודדים את המקטעים שהוכפלו כך שנשאר רק עם NB שכן התחברו למקטע דנ"א ועברו הכפלה ב־PCR.

### שלב הליגציה
(ליגציה היא תהליך כימי שמחבר בעזרת אנזים ספציפי שני קטעי רצף). בשלב זה התחל נקשר למתאם P1 ואחריו נקשר הפרוב בתבנית של אחת מ-256 האפשרויות. לאחר מכן, אנזים ליגאז מחבר את הקשרים הכימיים בין הפרוב ל רצף המתקבל של המטרה, כשרשרת של חרוזים, שבכול מחזור מצורפים שני חרוזים..

### שלב קריאת התוצאות
חיישן קולט, מודד ומקליט את הפלואורסצנציה שנוצרה באותו חיבור על פי מולקולת הפלואורסצנציה שקשורה לחלק ה־ZZZ של הפרוב. לאחר מכן, חלק ה־ZZZ של הפרוב נחתך מה שמאפשר לפרוב הבא להתחבר בליגציה. וכך נעשה פרוב אחר פרוב עד סוף מקטע הדנ"א. את שלב זה מבצעים חמש פעמים בסה"כ, כאשר בארבע הפעמים הבאות התחל מתקצר בבסיס אחד בכל פעם. מכיוון שיש קריאה של פלואורסצנציה עבור כל נוקליאוטיד חמישי (עקב חלק ה־NNN בכל פרוב). כך מתקבל רצף של תגובות פלואורסצנטיות בצבעים המעידים על זיהוי נוקליאוטיד אחד.

### ניתוח הנתונים
ממוזער|260x260px|תיאור ניתוח רצף המטרה בשיטת SOLiD
ניתוח רצף המטרה מתבצע על ידי קידוד דו-בסיסי. בעזרת הטבלה של צבעי הבסיסים והידיעה של רצף האדפטור P1 ניתן לנתח את רצף המטרה בסיס אחרי בסיס. כדי לוודא שאכן זהו רצף המטרה, ניתן לנתח באותו אופן גם מהצד של האדפטור P2. הקוד הגנטי מורכב תמיד מ"מילים" שהם רצף של שלושה נוקליאוטידים כמן AGC, המקודד ל־RNAm שבו הרצף יהיה UCG, בריבוזום תתקשר חומצה אמינית אחת (מתוך 21 חומצות אמינו, שלכל אחת יש לפחות " מילה" אחת). לכן הרצף של שלשות המתקבל יכול להסביר את מבנה החלבון שייווצר. כאשר יש מוטציה (שינוי במבנה הרצף של מילה על ידי החלפת אות, או חיתוך קטע מהרצף, ניתן לזהות את השינוי שיהיה בחלבון שייוצר. ומכאן לבחון את משמעות המוטציה. לדוגמה: אם הרצף מקודד לאנזים חיוני, והמוטציה פוגעת בפעילות האנזים, תתקבל בדרך כלל מחלה תורשתית רצסיבית הנגרמת ממחסור באנזים, כלומר הרצף נושא גן פגום.

## חסרונות
אחת החסרונות הידועות של השיטה הוא ברצפים פלינדרומים. הדבר מתבטא כאשר הרצף הפלינדרומי הוא חד גדילי ואז יש לו נטייה להתחבר לעצמו וליצור לולאות, Stem-loop s. כך הפרובים לא יוכלו להתקשר למקטעי רצפים אילו ולא יהיה ניתן לרצף אותם.

חסרון נוסף הוא אם וכאשר ישנה טעות אחת בשלב הריצוף (שלב הליגציה) אז תוצאת ניתוח הרצף תהיה שונה לגמרי מרצף המטרה המקורי, משום שכל ניתוח של בסיס תלוי בניתוח של הבסיס הקודם וצבעו.

## תפוקה ודיוק
פלטפורמת SOLiD מניבה 60 ג'יגה-בסיסים של נתוני דנ"א בכל ריצה. בשל מערכת הקידוד הדו-בסיסי הטכנולוגיה מציעה 99.94% של דיוק. ניתנת לאוטומציה ומתאימה לתוכנות החדישות ביותר לעיבוד תוצאות.

## יישומים של השיטה
# ריצוף גנום שלם
# זיהוי מחלות תורשתיות בפרופילים, כדי למנוע תפוצה או ביטוי כאשר ההורים נושאים את אותה המוטציה.
# Targeted Resequencing ייצור של רצפים ספציפיים למטרות מחקר וחיסונים הנקראים בשיטת ה־PCR (דוגמת חיסון לקורונה).
# ניתוח Small RNA. יש מחלות אוטואימוניות ואחרות שבהן נוצרים מקטעים של RNA שגורמים נזק.
# ChIP תוכנה ייעודית המפענחת סדרות של רצפים שנקראו בשיטת ה־SOLiD' וגם בשיטות אחרות, בעיקר במחקרי אוכלוסיות לבדיקת שכיחות מוטציות או גנומים שונים.
# זיהוי גנומים של קרובי משפחה, או של בדיקות פורנזיות.

## ראו גם
* אילומינה

## הערות שוליים

קטגוריה:DNA
קטגוריה:ביוטכנולוגיה