מבחני אסוציאציה

**מחקרי אסוציאציה** (באנגלית: **Association studies**) הם אוסף שיטות בתחום הגנטיקה של אוכלוסיות, שמטרתן איתור אסוציאציה גנטית בין גנוטיפ לפנוטיפ (תכונה נמדדת של אורגניזם). למעשה, מחקרי אסוציאציה בוחנים היתכנות של מצב בו באוכלוסייה מסוימת, אלל (צורת הופעה של אתר גנטי) אחד או יותר מופיע יחד עם פנוטיפ נחקר בתדירות גבוהה מהצפוי באקראי. זיהוי אסוציאציה גנטית יכול להוות שלב ראשוני בתהליך מציאת אתרים בגנום התורמים להופעת תכונה, או מחלה מסוימת.

מחקרי אסוציאציה מודרניים מתבססים על סקירה רחבה של מיליוני אתרים רב-צורניים (פולימורפיים) המתאפשרת בזכות הפיתוח של טכנולוגיות ריצוף וקביעת גנוטיפ (Genotyping). באמצעות מבחנים אלה, ניתן למצוא אסוציאציה בין פולימורפיזם נפוץ (הקיים ביותר מאחוז מהאוכלוסייה) לפנוטיפים מורכבים נחקרים, כגון סוכרת מסוג 2, נטייה ללחץ דם גבוה או השמנת יתר. בשונה מכך, מחקרי אסוציאציה קלאסיים מתמקדים באתר גנטי (לוקוס) ספציפי או מספר גנים מועמדים בלבד לחיפוש אסוציאציה עם הנטייה לפתח פנוטיפ נחקר.

למחקרי אסוציאציה שימוש נרחב בענפים מדעיים רבים כגון רפואה, פסיכיאטריה וגנטיקה. זאת כיוון שמדובר באחת משיטות המחקר היחידות שמאפשרות ללמוד על המקורות הגנטיים של מחלות ותכונות מורכבות (מחלות פוליגניות, שנובעות ממספר לוקוסים שונים).

## רקע
בין כל שני מכלולי גנים של בני אדם (או כל יצור אחר) ישנה שונות גדולה מאוד, כגון וריאציה בבסיסים בודדים, מחיקות של מקטעים, תוספות של מקטעים חדשים ושוני במספר העותקים של אתרים חזרתיים . ב-1975 הראו מדענים שישנם וריאנטים רבים נפוצים יחסית באוכלוסיית בני האדם, חלקם אפילו נמצאים באזורים מקודדים, ובעלי פוטנציאל לחולל שוני במבנה חלבון. מכאן העלו חוקרים את ההשערה, שאותם וריאנטים נפוצים אחראיים לשונות המורשת בתכונות הפיזיות והפיזיולוגיות של בני אדם, ולשוני בנטייה לפתח מחלות נפוצות (Common variant common disease hypothesis).

אסוציאציה גנטית יכולה להיות בין פנוטיפים: תכונות מורפולוגיות כגון משקלו ואורך זנבו של עכבר, בין פנוטיפ ופולימורפיזם גנטי, בדרך כלל פולימורפיזם בנוקלאוטיד יחיד (המכונה SNP או סניפּ) או בין שני גנוטיפים שונים. אסוציאציה גנטית בין שני אתרים פולימורפיים שונים יכולה להתרחש עקב מספר סיבות, כגון קשר פונקציונלי בין האתרים (לדוגמה חלק מאותו קומפלקס חלבוני או שרשרת מטבולית) או קרבה פיזית בין האתרים על גבי אותו הכרומוזום.

אם אכן קיימת אסוציאציה בין אתר פולימורפי לפנוטיפ, אותו האלל, גנוטיפ או הפלוטיפ (קבוצת אללים בתאחיזה על גבי אותו כרומוזום המורשים יחדיו) יופיע יותר מהצפוי באקראי בפרטים להם יש את התכונה. קיימות מספר סיבות אפשריות לקיומה של אסוציאציה גנטית: ישנו קשר סיבתי בין הפולימורפיזם לפנוטיפ, אין קשר סיבתי אך ישנו אתר פולימורפי נוסף בתאחיזה לאתר הפולימורפי הנחקר, אשר לו יש קשר סיבתי לפנוטיפ, או שהאסוציאציה נובעת משוני נוסף באוכלוסייה הנבדקת, כגון מוצא אתני, גאוגרפי, מין וגיל. באוכלוסייה המורכבת מתתי-קבוצות הנבדלות במקורם האתני או הגאוגרפי, סביר שרבים מן האללים המבדילים בין תתי הקבוצות יראו אסוציאציה למחלה או לתכונה, גם אם אין קשר סיבתי. כדי לאמת את האסוציאציה משתמשים בשיטות הסקה סטטיסטית, כגון מבחני חי בריבוע או המבחן המדויק של פישר. במחקרי אסוציאציה של כלל הגנום האנליזה מורכבת יותר, כיוון שמבצעים מספר רב של מבחנים סטטיסטיים על אותו המאגר, תחת אותה שאלה מחקרית; ככל שמבצעים יותר מבחנים סטטיסטיים, הסיכוי לטעות מסוג אלפא עולה (דחייה שגויה של השערת ה-0). לכן, מקובל להתמודד עם כך בעזרת תיקון חישובי למבחנים מרובים כגון תיקון בונפרוני או תיקון המעריך את שיעור התגליות השגויות.

בשונה ממחקרי תאחיזה, שמהותם היא חיפוש מתאם בין פנוטיפ להורשת אללים בקרב משפחות (היינו האלל החשד יופיע רק אצל החולים ולא אצל הבריאים במשפחה), מחקרי אסוציאציה מתבססים על השוואה בין פרטים מרוחקים מבחינה גנטית. יתרה מכך, במחקרי אסוציאציה, חשוב שהפרטים לא יהיו מאותה השושלת כדי להמעיט השפעה של משתנים מתערבים שעלולים להוביל לאסוציאציות לא אינפורמטיביות בין הפנוטיפ הנבדק לווריאנטים נפוצים בקרב אותה השושלת. למרות זאת, כיוון שלכל היצורים החיים מקור משותף, יש המגדירים מחקרי אסוציאציה כגרסה מיוחדת של מבחני תאחיזה בהם המשפחה היא המין או האוכלוסייה הנחקרת.  מסיבות אלה, על החוקרים לעצב את המחקר בצורה המתאימה ביותר עבור האוכלוסייה הנבדקת והפנוטיפ. בטבלה ניתן לראות מבחר של עיצובי מבחן נפוצים ואת היתרונות והחסרונות של כל אחד.

## סוגים של מחקרי אסוציאציה
מחקרי אסוציאציה גנטיים נבדלים בהיקף החיפוש (מספר האתרים הפולימורפיים שיבחנו), בידע המקדים הנדרש לפני התחלת המבחן ובשיטה שבעזרתה החוקרים יבחינו באתר פולימורפי שמצוי באסוציאציה עם תכונה נחקרת.

### מחקרי אסוציאציה כלל גנומיים
מחקרי אסוציאציה כלל גנומיים (Genome wide association study, בראשי תיבות GWAS) הם הסוג הנפוץ ביותר של מחקרי אסוציאציה כיום. GWAS מאפשר חיפוש אסוציאציה בין אוסף גדול של אתרים פולימורפיים (בדרך כלל של סניפּים) ברחבי הגנום לתכונה או מחלה מסוימת. השימוש השכיח ביותר נובע ממניעים קליניים, במטרה למצוא אסוציאציה בין סניפּים לנטייה לפתח מחלות מורכבות באדם, אך ניתן באופן דומה לחפש אסוציאציות ביצורים אחרים ולפנוטיפים שאינם קשורים למחלה.

כשמם, מחקרי אסוציאציה כלל גנומיים סורקים את כל הגנום, בניגוד לשיטות אחרות המתמקדות באתר גנומי (לוקוס) מסוים או מספר קטן של גנים באופן פרטני. כלומר, מדובר בשיטה בלתי מוטה אשר אינה מניחה כל הנחה על המיקום הגנומי המעורב בקביעת הפנוטיפ הנבדק, בניגוד למחקרי אסוציאציה המתבססים על גנים מועמדים (ראו פירוט מטה). בחינה של כל הגנום מגדילה משמעותית את הסיכוי למצוא אללים המצויים באסוציאציה עם הפנוטיפ. עם זאת, כיוון שהסיכוי למצוא אסוציאציות ללא קשר סיבתי גדל גם כן, לא ניתן להסיק מניסוי זה אילו גנים או אזורים בקרתיים גורמים בוודאות, או לוקחים חלק תפקודי בפנוטיפ. כדי להעריך את המשמעות התפקודית של אתר שנתגלה כבעל אסוציאציה לנטייה לפתח פנוטיפ מסוים, על החוקרים לבצע ניסויי המשך, בדרך כלל ניסויים הבוחנים את פעילות הלוקוס בתאים בתרבית, או בחיות מודל.

עיצוב המחקר הנפוץ ביותר למחקרי אסוציאציה כלל גנומיים הוא מקרה-בקרה (case-control), בו משווים בין שתי קבוצות של פרטים, אחת מורכבת מחולים או פרטים בעלי תכונה נבדקת, והשנייה מורכבת מפרטים בריאים או פרטים ללא התכונה. בעזרת שיטות כמו מערך סניפּים , נבדקים האללים של הפרטים במספר רב של סניפּים, בדרך כלל יותר ממיליון. לאחר מכן, עבור כל אתר פולימורפי, תדירות האלל מחושבת ונבדקת, על מנת לגלות אם היא משתנה בצורה מובהקת בין שתי הקבוצות בעזרת הסקה סטטיסטית. אם היא קיימת, מקובל לדווח על חוזק האסוציאציה בעזרת יחס הסתברויות (odds ratio), המנה של חלוקה בין ההסתברות לאלל מסוים להסתברות לאלל אחר. לדוגמה, עבור וריאנט בעל שני אללים: T ו-C, יהא מספר הפרטים בקבוצת המקרה עם האלל T  'A', ובקבוצת הבקרה יהא ‘B’. באופן דומה, מספר הפרטים בעלי האלל C בקבוצת המקרה יהיה ‘C’ ובקבוצת הבקרה ‘D’, כך שיחס ההסתברויות הוא

OR = \frac{A \div B}{C \div D}
טקסט=דוגמה למבנה נפוץ של מחקרי אסוציאציה כלל גנומיים.|ממוזער|דוגמה לחישוב ערכי p ותדירויות אללים במבחן אסוציאציה כלל גנומי במבנה מקרה-בקרה. מספר הפרטים עם כל אחד מהאללים מחושבים עבור כל הסניפּים, ערך ה-p מחושב בעזרת מבחן חי בריבוע. הנתונים בדוגמה זו לקוחים ממאמר מ-2007 בו נמצאה אסוציאציה בין אלל מסוים של נוקלאוטיד בודד למחלת לב כלילית.
כאשר אלל מסוים קיים יותר אצל קבוצת המקרה, מספר זה יהיה גדול מ-1. בנוסף ליחס ההסתברויות, מקובל לחשב ערך הסתברותי (p) המתבסס בדרך כלל על מבחן חי בריבוע. עקב הכמות הגדולה של סניפּים שנבדקים, מקובל להחשיב רק ערכי p נמוכים מאוד (בדרך כלל קטן מ-5x10-8) כמובהקים סטטיסטית. במטרה להפחית עלויות ולהגדיל את הסיכוי למצוא אסוציאציות, ניתן להשתמש בתהליך ייחוס גנטי . על בסיס סניפּים שנבדקו ניסויית המאפיינים הפלוטיפ מסוים , ניתן להסיק מהו האלל הסביר של וריאנטים נוספים המשתייכים לאותו ההפלוטיפ. פרויקט HapMap  שפורסם לראשונה ב-2005, מכיל מאגר גדול של סניפּים אופייניים לכל הפלוטיפ ברחבי גנום האדם, ומהווה כלי שבעזרתו חוקרים יכולים לבצע ייחוס גנטי ובכך להגדיל משמעותית את מאגר הסניפּים ואת הסיכוי למצוא אסוציאציות. כיום, פרויקט 1,000 הגנומים עבר את HapMap כמאגר הסניפּים הגדול ביותר.

מעבר לכך, ידוע שווריאנטים רבים מאפיינים אוכלוסיות בעלות קשר אתני או גאוגרפי, עקב מוצא משותף בו התפתחו לראשונה אותם הווריאנטים. לכן, מחקרי אסוציאציה חייבים לקחת בחשבון את הרקע הגאוגרפי והאתני של הפרטים הנבדקים. אחרת, ייתכן שהמחקר יניב תוצאות חיוביות כוזבות.

על מנת להציג את המידע שחושב באנליזה הסטטיסטית, יחסי ההסתברויות המודדים את גודל האפקט וערכי p, מקובל להשתמש בגרף מנהטן . בגרף מיוצג הלוגריתם השלילי של ערך ה-p כפונקציה של מיקום גנטי, כך הסניפּים עם האסוציאציה החזקה ביותר (ערך p קטן מאוד) מופיעים כעמדות גבוהות בגרף.

השימוש הראשון ב-GWAS שפורסם היה ב-2001, במחקר שבו נמצאה אסוציאציה בין סניפּ הממוקם בגן lymphotoxin-α , חלבון שמופרש מלימפוציטים וקשור למוות תאים מתוכנן (אפופטוזה) וחלוקת תאים, לאוטם שריר הלב. נכון ל-2020, התבצעו כמעט 5,000 מחקרי אסוציאציה שונים ליותר מ-2,000 תכונות ומחלות.
טקסט=גרף המציג את ערכי הp כפונקציה של מיקום גנומי, שיטה ויזואלית לראות תוצאות של GWAS, התוצאות המובהקות סטטיסטית קלות להבחנה כ'בניינים' בגרף.|ממוזער|דוגמה לגרף מנהטן עבור מבחן אסוציאציה כלל גנומי, כל נקודה בגרף היא סניפּ יחיד, ערכים שחוצים את הקו המקווקו העליון הם מובהקים סטטיסטיים ומסומנים כאסוציאטיביים עם הפנוטיפ הנבדק.

### מבחן גנים מועמדים
בניגוד למחקרי אסוציאציה כלל גנומיים, מבחני גנים מועמדים  מתמקדים במציאת אסוציאציה בין וריאנטים הממוקמים בגנים שנבחרו מראש כמוקדי עניין לתכונה או מחלה. סוג מבחן זה מתאים כאשר לחוקרים יש ידע מוקדם על ההשפעה הפונקציונלית של אותם גנים על התכונה או המחלה הנבדקת. הרעיון המרכזי מאחורי שיטה זו, המתמקדת בווריאציה באתרים גנומיים ספציפיים הוא שמוטציות מסוימות ישפיעו באופן ישיר (קשר סיבתי) על תפקוד הגן בו הם נמצאות, וזה יוביל או יתרום לפנוטיפ השונה או המחלה הנחקרת. מבנה המבחן הנפוץ ביותר לשיטה זו הוא מקרה-בקרה, המנסה לענות על השאלה: "האם אלל מסוים של גן מועמד נפוץ יותר בקבוצה בעלת הפנוטיפ מאשר בקבוצת הביקורת?".

בחירה נכונה של גנים מועמדים היא השלב הקריטי הראשון למציאת אסוציאציות בשיטה זו. הבחירה מתבססת על רלוונטיות ביולוגית, פיזיולוגית או פונקציונלית לפנוטיפ או המחלה הנבדקת. גישה זו תלויה בידע מוקדם ומבוסס על המנגנון הביולוגי המולקולרי שמוביל להתהוות הפנוטיפ או המחלה. ניתן למצוא גנים מועמדים בעזרת שיטות כמו GWAS ומיפוי לוקוס תכונה כמותית בוחנות שונות בכל הגנום, ולכן יכולות לאתר אתרים חדשים בהם יש אללים אסוציאטיביים למחלה, ייתכן שאתרים אלה נמצאים בתוך, או סמוכים לגנים הקשורים באופן ישיר למחלה. בנוסף, ניתן להשתמש בנתונים מהערכת רמת ביטוי גנים במערך דנ"א (micro-array) או ריצוף רנ"א (RNA-seq) כדי לבחון ביטוי גנים דיפרנציאלי בין קבוצה בעלת פנוטיפ לקבוצת ביקורת, וכך למצוא גנים מועמדים נוספים (הגנים המתבטאים באורח שונה בין שתי הקבוצות).

מחקר של גנים מועמדים שואף לאזן את כמות המידע הקיים עם הסיכוי לקבל תוצאות כזב חיוביות או שליליות. בגלל הקושי בשמירה על איזון שכזה, במחקרי אסוציאציה רבים מתקבלות אסוציאציות סתמיות. לדוגמה, הדמיה של מחקרי אסוציאציה עם 10 סניפּים שנמצאו בעבר כקורלטיביים לפעילות קוגניטיבית הראו שברוב המקרים (96.8%) ההדמיות מייצרות תוצאות כזב חיוביות. בנוסף, למחקרי אסוציאציה ככלל, ומבחני גנים מועמדים בפרט, יש הדירות נמוכה הנובעת מאותה הסתברות לתוצאות שקריות. במטא-אנליזה, אחת התגלה כי מתוך 166 אסוציאציות שנתגלו, רק שש חזרו על עצמן בצורה עקבית. קיימות דוגמאות למקרי שגיאה קיצוניים: מחקר של 18 גנים מועמדים שנמצאו באסוציאציה לדיכאון ב־10 מחקרים נפרדים לפחות, גילה כי אף אחד מהם לא הראה אסוציאציה מובהקת עם דיכאון במחקר בו ניסו לשחזר את התוצאות, וזאת אף על פי שעבדו עם גודל מדגם גדול בכמה סדרי גודל מהמחקרים המקוריים. בנוסף לבעיות בכוח סטטיסטי, קיומו של ריבוד באוכלוסייה (population stratification) יכול גם כן להוביל לחוסר העקביות של תגליות העולות ממחקרי אסוציאציה.

אחת הדוגמאות המוקדמות ביותר לשימוש מוצלח בסוג מבחן זה הייתה בזיהוי מוטציה בבסיס (נוקלאוטיד) יחיד הממוקמת באזור הלא מקודד של הגן APOC3 , אשר מיוחסת לסיכון גבוה לסבול מעודף טריגליצרידים בדם וטרשת עורקים.

## דוגמאות נבחרות
המוטיבציה לרוב מבחני האסוציאציה היא קלינית, במטרה לאתר אסוציאציות בין אתרים פולימורפיים למחלות נפוצות ומורכבות בבני אדם, לעיתים כשלב מקדים לחיפוש גנים או אתרים רגולטוריים התורמים למחלה. מלבד מחלות מורכבות, חוקרים מבצעים מחקרי אסוציאציה כדי לאתר את הגורמים הגנטיים המעורבים בתכונות פיזיות כגון גובה, משקל ויחס מותניים-ירכיים ובתכונות פסיכולוגיות, כמו התמכרות לעישון.

### סוכרת מסוג II
סוכרת מסוג II מאופיינת בחוסר תגובתיות לאינסולין (Insulin resistance) ועודף אינסולין בדם . בחלק ניכר מן החולים מתפתח חוסר ניצול גלוקוז ועודף גלוקוז בדם. המחלה נגרמת משילוב של פקטורים גנטיים וסביבתיים. מבחינה גנטית, מדובר במחלה מורכבת המערבת מספר רב של גנים שכל אחד מהם תורם במידה שונה להתפתחות המחלה. סוכרת מסוג II היא אחת המחלות הנחקרות ביותר במחקרי אסוציאציה - ב-144 מחקרי אסוציאציה נפרדים, התגלו כ-2,284 סניפּים אסוציאטיביים למחלה. הסניפּים שמראים את האסוציאציות החזקות ביותר ממוקמים בפקטורי תיעתוק ושחקנים מרכזיים אחרים בשמירה על הומאוסטאסיס של גלוקוז והפרשת אינסולין.

### דלקת מפרקים שיגרונית
דלקת מפרקים שיגרונית היא מחלה אוטואימונית כרונית רב-מערכתית המאופיינת בדלקת רב-מפרקית, יחד עם חום, נפיחות, כאב ולעיתים, בפגיעה מערכתית מחוץ למפרקים. המחלה מתרחשת בעקבות שילוב של גורמים גנטיים וסביבתיים. מדובר במחלה חשוכת מרפא ונפוצה יחסית, המשפיעה על בין 0.5 ל-1% מהאוכלוסייה המבוגרת בעולם המפותח. מסיבות אלה, ישנם מחקרי אסוציאציה רבים המנסים לחשוף את הווריאנטים שתורמים להתפתחות המחלה. נכון ל-2020 נמצאו כ-941 סניפּים ב-67 מחקרים נפרדים. מספר רב של סניפּים ממוקמים בגן HLA-DRB1  המקודד לחלבון ממברנה MHC class I שתפקידו לאפשר לתאים של מערכת החיסון להבדיל בין תאים פגומים שצריך להשמיד (לדוגמה, מודבקים על ידי נגיף או גידול סרטני) לתאים במצב תקין.

### מדד מסת גוף
מדד מסת גוף, או BMI, מבוסס על גובהו ומשקלו של אדם, ומחושב כמשקל גוף חלקי גובה בריבוע. ה-BMI הוא מדד נוח לחלק אנשים לארבע קטגוריות: תת-משקל, משקל תקין, משקל עודף והשמנת יתר חולנית. כאשר ערכים מתחת ל-20 ומעל 25 נחשבים כקורלטיביים למחלות רבות. למרות, שערך ה-BMI של אדם מסוים מושפע בעיקר מאלמנטים סביבתיים, מחקרי אסוציאציה הראו שישנו גם מרכיב גנטי. נכון ל-2020, ב-179 מחקרים נפרדים נמצאו כ-7,751 סניפּים אסוציאטיביים. כצפוי למדד רציף המושפע מאלמנטים רבים, ישנו מגוון רחב מאוד של גנים שנמצאו כאסוציאטיביים ל-BMI גבוה, ביניהם גנים המעורבים בביו-סינתזה של כולסטרול, התפתחות רקמות שומן ותרמו-רגולציה.

## ראו גם
* תאחיזה
* תאחיזה לא שוויונית
* רב צורניות של נוקלאוטיד בודד
* גנטיקה של תכונות מורכבות
* תורשה

## קישורים חיצוניים
* ד"ר סמיר קאסם, סוכרת סוג 2: מחלה פוליגנית מורכבת. “TheMEDICAL” 01/07/2008
* ד"ר חגית יונת, חשיבות הגנטיקה הקלינית במבוגרים. “Israeli Journal of Medicine” 01/06/2008

## הערות שוליים

קטגוריה:גנטיקה
קטגוריה:גנומיקה
קטגוריה:אפידמיולוגיה
קטגוריה:פרויקטים גנומים