מיקרוסקופיית עירור רב-פוטונית

**מיקרוסקופיית עירור רב-פוטונית** (באנגלית: **Multi-photon excitation microscopy**) היא טכניקה המאפשרת הדמיה של רקמות חיות עבות ברזולוציה גבוהה. אופן פעולתה הייחודי מקטין את הפגיעה ברקמות אותן מאירים, מה שהופך אותה לאחת משיטות ההדמיה הבודדות המאפשרות צפייה ברקמות חיות, כמו מוחות פעילים של ייצורים חיים, מבלי לפגוע בתפקוד מושא המחקר לאורך זמן. על כן, טכניקה זו נמצאת בשימוש יחסית נרחב בביולוגיה ובמדעי המוח, ענפים בהם ישנה חשיבות למזעור הפגיעה או ההפרעה לאיבר שאותו בוחנים תחת המיקרוסקופ.
[טקסט=תמונות של מוח של עכבר שהוקלטו על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני.|ממוזער|316x316 פיקסלים|תמונות של מוח של עכבר שהוקלטו על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני תוך שימוש בפלואורסצנציה. (א) כלי דם תוך-מוחיים. הפסים השחורים מייצגים תנועה של כדוריות דם אדומות. (ב) הדמיה דו-צבעית של נוירונים (ירוק) וכלי דם (אדום). העכבר להדמיה נוצר על ידי Jeffrey M. Friedman, Rockefeller University, New York. (ג) הדמיה תלת-צבעית של עכבר מודל ל[מחלת אלצהיימר. בכחול צבועים עמילואידים, בירוק צבועים תאי עצב וכלי הדם באדום. נתרם על ידי Elizabeth Hillman (Columbia University, New York).]]

## רקע פיזיקלי
טקסט=דיאגרמת יבלונסקי עבור סוגי העירור השונים|ממוזער|דיאגרמת יבלונסקי עבור עירור חד פוטוני (400 ננומטר), דו פוטוני (800 ננומטר) ותלת-פוטוני (1200 ננומטר). בכל המקרים הפוטון הנפלט הוא בעל אורך גל של 500 ננומטר.
עירור "סטנדרטי" כולל מעבר של חלקיק, לדוגמה מולקולה פלואורסצנטית, ממצב היסוד שלה למצב בעל אנרגיה גבוהה יותר על ידי קליטה של חלקיק (נניח פוטון) עם אנרגיה השווה לפער האנרגיה בין שני המצבים. כבר ב־1931 הוצגה סברה על ידי Maria Göppert-Mayer כי תהליך זה יכול להתבצע בעזרת שני חלקיקים (פוטונים), כל אחד עם חצי מכמות האנרגיה הדרושה, שמגיעים יחדיו לאותה מולקולה ומעוררים אותה כאילו היו חלקיק אחד. על החלקיקים להגיע באותו הרגע (הפרש שלא עולה על עשירית הפמטו-שנייה בערך, 10-16~ שניות) לאותה הנקודה בכדי לייצר את האפקט, מה שהקשה מאוד על הדגמה פיזיקלית של רעיון תאורטי זה במשך עשרות שנים. עם זאת, בתחילת שנות ה־60, לאחר המצאת הלייזר, מדענים הראו כי ניתן לערוך ניסוי המדגים את העיקרון הפיזיקלי הבסיסי ולעורר מולקולות ואף אטומים בודדים בעזרת צמדי פוטונים באורכי גל מתאימים.

אורכי הגל הנפוצים במיקרוסקופיה שכזאת נמצאים לרוב בתחומי האינפרא-אדום, כיוון שהאנרגיה של פוטון הופכית לאורך הגל שלו; במילים אחרות, כשאורך הגל גדל פי שניים האנרגיה נחתכת בחצי. לדוגמה, אם מולקולה פלואורסצנטית נמצאת במצב הייסוד שלה ואנו מעוניינים לעורר אותה לאחד מהמצבים המעוררים שלה, עלינו לכוון לעברה פוטון עם האנרגיה המתאימה לפער אנרגטי זה. אם לפוטון עם אורך גל של 400 ננומטר ישנה אנרגיה מתאימה עבור ניסוי זה, אז גם לשני פוטונים בעלי אורך גל של 800 ננמוטר ישנה אנרגיה מתאימה לעירור המולקולה, וכך גם לשלושה עם אורך גל של 1200 ננומטר, וכו'. אורכי גל ארוכים יותר אלו אכן אופייניים למיקרוסקופיית עירור רב-פוטונית, כאשר אורך הגל המדויק לעירור ייקבע לפי החומרים הפלואורסצנטיים בהם נעשה שימוש בניסוי ספציפי.
טקסט=עירור פלאורוסנטי של דוגמה עם פוטון אחד ושניים|ממוזער|הדמיה של עירור פלואורסצנטי בעזרת פוטון אחד או יותר. בשיטה המתבססת על שני פוטונים הדוגמה פולטת אור אך ורק במישור הפוקוס (הקו השחור) כיוון ששטף הפוטונים נמוך מדי בכל נקודה אחרת בדוגמה. זאת בניגוד לשיטת העירור המתבססת על פוטון אחד, במסגרתה נפלט אור מכל נקודה בדוגמה שבה פוטון עובר. במיקרוסקופיה רוצים לרוב לאסוף נתונים ממישור אחד ולא יותר ("חיתוך אופטי"), ועל כן לעירור המבוסס על לפחות שני פוטונים ישנו יתרון בולט על פני עירור חד-פוטוני.
לעירור המבוסס על שני פוטונים ומעלה ישנה יכולת גבוהה של "חיתוך אופטי" (optical sectioning), כלומר עירור בנקודה או מישור בודדים בדוגמה ולא בכל הנפח המואר. תופעה זאת מתרחשת כתוצאה מהשימוש באורכי הגל הארוכים יותר, כלומר באנרגיות נמוכות יותר לכל פוטון. בעירור המתבצע בעזרת פוטון אחד לכל פוטון ישנה מספיק אנרגיה בכדי לעורר את הדוגמה - אחרת היה נבחר אורך גל אחר, קצר יותר (אנרגיה גבוהה יותר) שמספיק בכדי לעורר את הדוגמה. על כן, עוד לפני שהפוטון מגיע למישור המוקד אותו הוא אמור להאיר סביר שייתקל במולקולה אותה הוא מסוגל לעורר ואכן יעשה זאת. כשהדוגמה היא פלואורסצנטית אז המולקולה תפלוט חזרה פוטון באורך גל אחר, וכך יקרה לאורך כל מסלולי הפוטונים בתוך הדוגמה. כתוצאה מכך נפח גדול מאוד מהדוגמה יעורר וייווצר "קונוס אור", תוצאה שאינה רצויה במיקרוסקופיה בה יש רצון לזהות פרטים בודדים מתוך הדוגמה כולה. עם זאת, בעירור המבוסס על שני פוטונים או יותר, לפוטון בודד אין מספיק אנרגיה בכדי לעורר את הדוגמה. בנוסף, הסיכוי שיגיעו שני פוטונים (או יותר) לנקודה קטנה במרחב (כ- 1 פמטוליטר) בו-זמנית הוא נמוך במיוחד וכמעט אפסי מחוץ למישור המוקד. על כן, רק כאשר כלל הפוטונים "מתכנסים" במישור המוקד שאליו כוונו נוצרים תנאים מתאימים לעירור - יש שטף גבוה מספיק שלהם שמעלה את הסיכוי לעירור רב-פוטוני, והוא אכן קורה באותה הנקודה (או המישור), ובה בלבד. תכונה זו נקראת "חיתוך אופטי" כיוון שהעירור מתבצע בחתך אחד בלבד של הדוגמה, ואם הדוגמה היא פלואורסצנטית פירושו של דבר הוא שהאור שנפלט מהדוגמה מגיע אך ורק מנקודה אחת בודדת בדוגמה, מה שמקנה לשיטת עירור זו יתרון עצום במיקרוסקופיה של דוגמאות "עבות" יחסית, כלומר בעובי של מעל כמה עשרות בודדות של מיקרון.

## מבנה אופטי ואופן הפעולה
המבנה האופטי של מיקרוסקופ רב פוטוני הוא בסיסי יחסית, ומורכב ממספר אלמנטים בולטים. הראשון שבהם הוא מקור אור - הלייזר המעורר את הדוגמה. עד להמצאת הלייזר לא היה ניתן לייצר שטף פוטונים גדול מספיק בכדי לייצר עירור רב-פוטוני, וגם לייזרים מודרניים מסוגלים לייצר את העירור אך ורק במישור המוקד שלהם, כלומר בנקודה בה שטף הפוטונים הוא הגדול ביותר. בכדי להגדיל את הסיכוי לעירור עוד יותר, לרוב משתמשים בלייזרים שפולטים פעימות של אור, כלומר האור "נדחס" לפעימות קצרות ובהירות מאוד, כשביניהן הלייזר לא פולט אור.
טקסט=שרטוט סכמטי של מיקרוסקופ עירור רב פוטונים|ממוזער|שרטוט סכמטי של מיקרוסקופ עירור רב פוטונים. האור שפולט הלייזר יעבור במראות סורקות (או אלמנט אחר שיבצע סריקה), יפגוש בשתי עדשות שייצרו דמות של המראות הסורקות על עדשת האובייקטיב, ולבסוף יגיע לדוגמה ויעורר אותה. אור שחוזר ייאסף דרך האובייקטיב לגלאי פוטונים.
האלמנט הנדרש הבא אחראי על ניהוג הקרן (beam steering), כלומר הזזה שלה במרחב. זאת מכיוון שמיקרוסקופ רב-פוטוני לרוב מתבסס על טכניקה של סריקת קרן-לייזר לאורך ולרוחב דוגמה (כאמור, בדרך כלל פלאורוסנטית), בדומה למיקרוסקופ קונפוקלי. כלומר, בכל רגע נתון קרן האור שנשלחת אל הרקמה מרוכזת כולה בנקודה אחת בדוגמה, והאור החוזר משויך כולו לפיקסל אחד בתמונה הסופית. לאחר סיום איסוף האור מאותו הפיקסל, לרוב תוך כמיקרו שנייה אחת, מראות גלוונומטריות מיוחדות - או כל אלמנט אופטי דומה אחר - מסיטות את קרן האור במעט לכיוון הפיקסל הבא, והתהליך חוזר על עצמו שוב.

האלמנט הבא הוא זוג עדשות המכונות scan lens ו־tube lens (עדשת סריקה ועדשת צינור) המייצרות דמות של המראות הסורקות בגב עדשת האובייקטיב ("עצמית"). דבר זה נדרש לצורך מימוש פעולת הסריקה של המראות על גבי הדוגמה. עדשת האובייקטיב (objective lens) היא עדשה ש"מתרגמת" את סריקת קרן הלייזר לתנועה שלה על הדוגמה שעליה מסתכלים במיקרוסקופ. בנוסף, במיקרוסקופיה רב פוטונית המתבססת על פלואורסצנציה, האור הנפלט מהדוגמה נאסף דרך עדשת האובייקטיב חזרה ופוגע במסנן. מסנן זה מעוצב כך שהוא יעביר אורכי גל ארוכים (כמו חלון שקוף), אך ישמש כמראה עבור אורכי גל קצרים. תכונה זו מאפשרת לו לנתב את הפוטונים החוזרים מהדוגמה אל גלאי אלקטרוני המסוגל להמיר אור לאות חשמלי, כדוגמת photomultiplier tube, הרכיב האחרון הנדרש במיקרוסקופ רב-פוטוני. לסיום, אותו גלאי מחובר למחשב המציג תמונה המתבססת על קריאת הגלאי בכל נקודה בדוגמה; ככל שנקלטו יותר פוטונים בזמן נתון כך התמונה במחשב, בפיקסל המשויך לנקודה הזו, תהיה בהירה יותר.

## תיאור מתמטי
עירור רב-פוטוני הוא תהליך לא-ליניארי, כלומר תלוי בחזקה גבוהה של העוצמה או שטף הפוטונים (Intensity, flux) במישור המוקד. ככלל בתהליך רב פוטוני שמבוסס על עירור של n פוטונים, הסיכוי לעירור מוצלח מתכונתי ל- I^n(\mathbf{x}, t). ביטוי זה מדגיש כי עוצמת ההארה תלויה בהתפלגות הפוטונים במרחב - קרן אור גאוסיאנית, לדוגמה - כמו גם בזמן המדויק בו אנו מודדים את השטף. לייזרים המשמשים לעירור רב-פוטוני לרוב עובדים במצב של פולסים, כלומר מאירים רק למשך תקופות קצרות במיוחד, ועל כן לזמן המדידה יש חשיבות גדולה.

הביטוי לעוצמת ההארה של לייזר פולסי יכול גם להיכתב באופן הבא: I^n(\mathbf{x}, t) \varpropto \left(\frac{P_\text{avg}}{F_{\text{rep}}\cdot\tau}\right). ביטוי זה מראה כי העוצמה, שהיא הספק ליחידת שטח, תלויה באופן ישר בהספק האור, אך גם בכמות הפולסים לשנייה F_\text{rep} ובמשכו של כל פולס \tau. ההספק הממוצע של לייזר המשתמש לעירור רב פוטוני הוא כ- 1 וואט, כמות הפולסים לשנייה היא כ- 1–100 מיליון, ומשכו הממוצע של פולס הוא כ־100 פמטו שניות. ביטוי זה מדגיש את חשיבות השימוש בלייזרים בעלי הספק גבוה ומשך פולס קצר במיוחד בזמן הדמיה של דוגמאות תוך שימוש בשיטת עירור רב-פוטונית.

הערכים הנפוצים שהוזכרו מעלה מובילים אותנו למסקנה כי פולס אור ממוצע של לייזר מכיל כמיליארד פוטונים המגיעים לדוגמה. בכדי להעריך מה תהיה בהירות הפיקסל אותו אנו מאירים בתמונה הסופית יש להביא בחשבון את היעילות הנמוכה של תהליך העירור ואת העובדה שרק חלק קטן מהפוטונים הנפלטים מהחומר הפלואורסצנטי נקלטים בגלאים. לכן, בהערכה גסה, כמות האור המתוארת למעלה תוביל לגילוי של כ־100 פוטונים מאותה הנקודה.

## יתרונות
השימוש במיקרוסקופ רב-פוטונים נפוץ במיוחד במדעי החיים והמוח ממספר סיבות. הראשונה היא שהשימוש בפוטונים עם אורכי גל ארוכים מאפשר להם לעבור מרחק רב יותר בתוך הרקמה מבלי להיבלע או להתפזר בתוכה. בעוד שמיקרוסקופ שמתבסס על עירור חד-פוטוני יכול לצלם בעומק של כ־50 מיקרומטר ברקמה חיה (המסוגלת לבלוע ולפזר אור ביעילות), מיקרוסקופ המתבסס על בליעה דו-פוטונית יכול לחדור לעומק של כמילימטר בתוך הרקמה, או 1000 מיקרומטר. מיקרוסקופ המתבסס על בליעה של שלושה פוטונים כבר מגיע לעומק של כ־2000 מיקרון ברקמה חיה. עומקים אלו מאפשרים למדעני מוח, לדוגמה, להקליט מידע מכל שכבות קליפת המוח בחיות מעבדה כמו עכבר, מה שעוזר לפענח את תפקודו הבסיסי של המוח בחולייתנים, כמו גם את השוני בדפוסי פעולתו כתוצאה ממחלות נוירודגנרטיבית כדוגמת מחלת אלצהיימר.

יתרון נוסף של מיקרוסקופיה רב-פוטונית הוא הפגיעה המועטת שהיא יוצרת בדוגמה. אורך הגל הארוך מאפשר לפוטונים לעבור דרך רוב הרקמה החיה, עד שהם מגיעים למישור המוקד ושם מייצרים עירור. בנוסף, כשהפוטונים עוברים דרך הרקמה הם לא מבצעים איתה שום אינטראקציה, או במילים אחרות לא משפיעים עליה. ספיגה של הפוטונים ברקמה פירושה חימום שלה - אנרגיית הפוטון עוברת לחימום התאים בנקודה - וחימום גבוה לאורך זמן יכול לגרום לנזק כמו פירוק חלבונים בתאים שעוררו. הגבלת נקודת העירור לאזור קטן מאוד בדוגמה דואגת שגם אם נוצר מעט נזק הוא מקומי בלבד ולא משפיע לאורך, לרוחב ולעומק הרקמה.

יתרון שלישי נובע מיכולות החיתוך האופטיות (optical sectioning) של המיקרוסקופ. כיוון שעירור רב-פוטוני הוא תופעה מאוד מקומית, האור שנפלט מהרקמה (אם היא פלואורסצנטית) מגיע אך ורק מנקודה בודדת, ועל כן קל מאוד לשייך את האור שנאסף מנקודה זו לאזור קטן מאוד (פיקסל בודד) בתמונה שאותה יוצר המיקרוסקופ. לו אור היה מגיע ממספר אזורים שונים בדוגמה, היה נדרש בדיעבד להסיק מהו מקור האור המרכזי שגרם לפליטת כל הפוטונים שנקלטו, תהליך עיבוד קשה המכיל חוסר ודאות.

## קישורים חיצוניים

## הערות שוליים

קטגוריה:ביוטכנולוגיה
קטגוריה:ביולוגיה: שיטות ומכשור
קטגוריה:כלי מעבדה
עירור רב-פוטונית