Helicase

[miniatura|220px|Estrutura da helicase [RuvA de *Escherichia coli*.]]

As **helicases** son unha clase de encimas vitais para todos os organismos vivos, xa que a súa principal función é desempaquetar os xenes dun organismo. Son proteínas motoras que se moven direccionalmente ao longo dunha molécula de ácido nucleico, separando as dúas febras apareadas do ácido nucleico (en ADNs, ARNs bicatenarios, ou en híbridos ARN-ADN) usando enerxía derivada da hidrólise do ATP.
Existen moitas helicases debido á gran variedade de procesos nos cales se debe catalizar a separación de febras de ácidos nucleicos. Aproximadamente o 1% dos xenes eucariotas codifican helicases. No xenoma humano están codificadas 95 helicases non redundantes, que son 64 ARN helicases e 31 ADN helicases.
Moitos procesos celulares, como a replicación do ADN, transcrición, tradución, recombinación, reparación do ADN, e bioxénese de ribosomas implican a separación de febras de ácido nucleico para o cal cómpre a intervención das helicases.

## Función 
200px|miniatura|dereita|Acción das helicases na replicación do ADN.
As helicases utilízanse con frecuencia para separar as febras do ADN de dobre hélice ou unha molécula de ARN autoapareada (*self-annealed*) utilizando a enerxía da hidrólise do ATP, un proceso no que se produce a rotura dos enlaces de hidróxeno entre os pares de bases apareados. Tamén funcionan retirando proteínas asociadas ao ácido nucleico e catalizan a recombinación homóloga do ADN. Os procesos metabólicos nos que intervén o ARN, como a tradución, transcrición, bioxénese dos ribosomas, splicing do ARN, transporte do ARN, modificación ou edición do ARN, e degradación do ARN son todos facilitados polas helicases. ou poden ter un papel activo catalizando a separación das febras usando a enerxía xerada pola hidrólise do ATP. Neste último caso, a helicase actúa comparablemente a un motor activo, desenrolando as febras e translocándose ao longo do seu substrato como resultado directo da súa actividade de ATPase. As helicases poden procesar moito máis rápido *in vivo* que *in vitro* debido á presenza de proteínas accfesorias que axudan na desestabilización da unión en forquita. A barreira de activación é o resultado de varios factores, e pode definirse usando a seguinte ecuación, na cal ***N*** = número de pares de bases desenroladas (bps), **ΔGbp** = enerxía libre da formación de pares de bases, **Gint** = redución da enerxía libre debido á helicase, e **Gƒ** = redución da enerxía libre debido ás forzas de abertura da hélice. A primeira ADN helicase eucariótica coñecida atopouse en 1978 nas plantas liliáceas (*Lilium*). Desde entón, descubríronse e illáronse ADN ligases en diversas bacterias, virus, lévedos, moscas e eucariotas superiores. Ata agora foron illadas 14 helicases diferentes de organismos unicelulares, 6 helicases de bacteriófagos, 12 doutros virus, 15 de lévedos, 8 de plantas, 11 do timo de tenreiras, e aproximadamente 25 helicases de células humanas.
* **1986** – Publícase que o antíxeno tumoral grande de SV40 é unha helicase viral, a cal é a primeira ADN helicase descuberta en virus non bacteriófagos.
* **1986** – Determínase que a ATPaseIII de lévedos é unha ADN helicase.
* **1988** – Descubrimento de dominios con aminoácidos conservados, que se determina que son os motivos de helicase
* **1989** – Designación das superfamilias I e II de ADN helicases.
* **1989** - Identificación da familia de helicases de caixa DEAD.
* **1990** - Illamento dunha ADN helicase humana.
* **1992** – Illamento da primeira ADN helicase mitocondrial (do cerebro bovino).
* **1996** – Descubrimento da primeira ADN helicase purificada de cloroplasto do chícharo.
* **2002** – Illamento e caracterización da primeira ADN helicase bioloxicamente activa do parasito *Plasmodium cynomolgi*.

## Características estruturais 
A función común das helicases explica que teñan un certo grao de homoloxía de secuencia de aminoácidos; todas posúen un motivo de secuencia localizado na súa estrutura primaria, implicado na unión ao ATP, na hidrólise do ATP e na translocación ao longo do seu substrato o ácido nucleico. A porción variable da secuencia de aminoácidos está relacionada coas características específicas de cada helicase.

A presenza destes motivos de helicase permite que a unha determinada proteína se lle poida atribuír unha suposta actividade de helicase, pero non necesariamente confirma dita actividade. Os motivos conservados apoian unha homoloxía evolutiva entre os encimas. Baseánsode nestes motivos de helicase, distinguíronse varias superfamilias.

## Superfamilias 
As helicases clasifícanse en 6 grupos (superfamilias) baseándose nos motivos de secuencia que comparten. As helicases que non forman unha estrutura en anel clasifícanse nas superfamilias 1 e 2 e as que forman o anel forman parte das superfamilias 3 a 6. As helicases tamén se clasifican como α ou β dependendo de se funcionan con ADN monocatenario (α helicases) ou bicatenario (β helicases). Tamén se clasifican pola súa polaridade de translocación, de tal maneira que se a trnalocación ocorre en dirección 3’-5’ a helicase considérase de tipo A, e se esta ocorre en dirección 5’-3’ é de tipo B. As helicases máis coñecidas de tipo SF1A son Rep e UvrD de bacterias gramnegativas, e a helicase PcrA helicase de bacterias grampositivas. Caracterízanse pola presenza de nove motivos conservados: Q, I, Ia, Ib, II, III, IV, V e VI. Teñen unha direccionalidade de translocación 3’-5’, o que significa que son helicases de tipo A. Estas funcións axudan a previr a apoptose, que regula o tamaño do córtex cerebral, e contribúe á supervivencia de estruturas do hipocampo e corticais, que afectan á memoria e aprendizaxe. Atropáronse mutacións na proteína *ATRX*, e o 90% delas están asociadas con dominios dedo de cinc e helicase. As mutacións da ATRX poden causar atraso mental con alfa-talasemia ligada ao X (síndrome ATR-X). O fenotipo da síndrome ATR-X suxire que a mutación do xene ATRX causa a regulación á baixa da expresión xénica, como por exemplo nos xenes da alfa-globina. As mutacións puntuais herdadas na helicase XPD están asociadas con trastornos de envellecemento acelerado como a síndrome de Cockayne (CS) e a tricotiodistrofia (TTD). A síndrome de Cockayne e a tricotiodistrofia son ambas trastornos de desenvolvemento que implican a sensibilidade á luz ultravioleta e o envellecemento prematuro, e a síndrome de Cockayne preséntase con atraso mental grave desde o momento do nacemento. Como membro deste complexo, facilita a reparación de excisión de nucleótido ao desenrolar o ADN. As deficiencias ou mutacións na familia das helicases RecQ producen unha recombinación xenética e replicación do ADN anormais, o que leva a unha inestabilidade cromosómica e a un descenso global da capacidade da célula de proliferar.

A síndrome de Bloom caracterízase por unha predisposición ao cancro de aparición temperán, a unha idade media de inicio de 24 anos. As células dos pacientes de síndrome de Bloom presentan unha alta frecuencia de intercambio recíproco entre cromátides irmás e un dano cromosómico excesivo. Hai probas que suxiren que a BLM xoga un papel en recuperar a replicación do ADN interrompida en forquitas de replicación. As células dos pacientes de síndrome de Werner mostran unha duranción da súa etapa reprodutiva reducida con roturas cromosómicas e translocacións, e grandes delecións de compoñentes cromosómicos, causando inestabilidade xenómica. Nas células de pacientes desta síndrome atópanse rearranxos cromosómicos que causan inestabilidade xenómica. As ARN helicases defectuosas foron asociadas con cancros, doenzas infecciosas e trastornos neurodexenerativos. Todas as ARN helicases eucariotas que foron identificadas ata agora non forman anel e son de tipo SF1 ou SF2. Por outra parte, as ARN helicases que forman anel encontráronse en bacterias e virus. Aínda que estas proteínas levan os motivos típicos das helicases, hidrolizan ATP de maneira dependente de ácido nucleico, e están construídas arredor dun núcleo de helicase, en xeral, non se observa nelas ningunha actividade de desenrolamento de ácidos nucleicos.

As ARN helicases que mostran unha actividade de desenrolamento foron caracterizadas por polo menos dous mecanismos diferentes: desenrolamento do dúplex canónico e separación de febras local. O desenrolamento de dúplex canónico é a separación direccional gradual dunha febra dúplex, como se describiu máis arriba, para o desenrolamento do ADN. Porén, a separación de febras local ocorre por un proceso no que o encima helicase cárgase en calquera punto ao longo do dúplex. A isto axuda unha rexión monocatenaria do ARN, e a carga do encima está acompañada da unión de ATP. Unha vez que están unidos as helicases e o ATP, ocorre a separación de febras local, o cal require a unión do ATP pero non a hidrólise de dito ATP. O dúplex ten poucos pares de bases e disóciase despois sen necesitar máis asistencia do encima. Este modo de desenrolamento é o utilizado polas helicases de caixa DEAD.

Hai unha base de datos de ARN helicases dispoñible on line que contén unha lista de ARN helicases con información da súa secuencia, estrutura, e funcións bioquímicas e celulares.

## Ferramentas de diagnóstico para a medida das helicases 
### Medida e monitorización da actividade de helicase 
Utilízanse varios métodos para medir a actividade de helicase *in vitro*. Estes métodos poden ser ensaios ou probas cualitativos ou cuantitativos. En 1982-1983, desenvolveuse o primeiro ensaio bioquímico directo para medir a actividade de helicase. Este método denomínase “ensaio de desprazamento de febra”.
:* O ensaio de desprazamento de febra implica o radioetiquetado dun dúplex de ADN. Despois do tratamento con helicase, detéctase visualmente o ADN monocatenario separado do ADN bicatenario por electroforese PAGE non desnaturalizante. Despois da detección do ADN monocatenario, a cantidade de marcaxe radioactiva que está no ADN monocatenario cuantifícase para dar un valor numérico á cantidade de ADN bicatenario que foi desenrolado.
::O ensaio de desprazamento de febra é aceptable para unha análise cualitativa, pero a súa incapacidade de dar resultados para máis dun só punto temporal, o seu consumo de tempo, e a súa dependencia de produtos radioactivos perigosos para o etiquetado fixo necesario o desenvolvemento de métodos de diagnóstico que puidesen monitorizar a actividade de helicase en tempo real.
Outros métodos que se desenvolveron máis tarde incorporaron características como: mecánica de alto rendemento, o uso do etiquetado de nucleótidos (menos perigoso), tempo de reacción máis rápido/menos consumo de tempo, monitorización en tempo real da actividade de helicases (usando medicións cinéticas en troques de análises de punto final/de punto único). Entre estas metodoloxías están: "un método de fluxo de arrefriado rápido, ensaios baseados en fluorescencia, ensaios de filtración, un ensaio de proximidade de escintileo, ensaio de transferencia de enerxía de resonancia de fluorescencia resolta no tempo, un ensaio baseado na tecnoloxia *flashplate*, ensaios de arrefriamento resolto no tempo homoxéneos, e ensaios de helicase baseados en electroquimioluminescencia". Co uso de ecuacións matemáticas especializadas, poden utilizarse algúns destes ensaios para determinar que cantidade de nucleótidos apareados pode separar a helicase por hidrólise de 1 molécula de ATP.

Hai kits de diagnóstico dispoñibles comercialmente. Un deles é o ensaio de diagnóstico "Trupoint" de PerkinElmer, Inc. Este ensaio é un ensaio de arrefriamento (*quenching*) de fluorescencia resolto no tempo que utiliza a tecnoloxía PerkinEmer "SignalClimb" que está baseada en dúas etiquetas que se unen en estreita proximidade pero en febras do ADN opostas.

### Determinación das propiedades das helicases 
A polaridade da helicase, que tamén se denomina "direccionalidade", defínese como a dirección (que pode ser 5'→3' ou 3'→5') do movemento da helicase sobre un ADN monocatenario. Esta determinación da polaridade é vital para determinar se a helicase probada se une á febra líder do ADN ou á febra atrasada. Para caracterizar esta característrica da helicase, utilízase un dúplex parcial de ADN como substrato que ten unha rexión de ADN monocatenario con diferentes lonxitudes de rexións dúplex de ADN (unha rexión curta que corre en dirección 5'→3' e unha máis longa que corre en 3'→5') a ambos os lados da rexión. Unha vez que se engade a helicase a esa rexión monocatenaria central, determínase a polaridade por caracterización no ADN monocatenario de nova formación.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Proteínas de unión ao ADN de cromodominio helicase: CHD1, CHD1L, CHD2, CHD3, CHD4, CHD5, CHD6, CHD7, CHD8, CHD9
* caixa DEAD/DEAD/helicase de caixa DEAH: DDX3X, DDX5, DDX6, DDX10, DDX11, DDX12, DDX58, DHX8, DHX9, DHX37, DHX40, DHX58
* ASCC3, BLM, BRIP1, DNA2, FBXO18, FBXO30, HELB, HELLS, HELQ, HELZ, HFM1, HLTF, IFIH1, NAV2, PIF1, RECQL, RTEL1, SHPRH, SMARCA4, SMARCAL1, WRN, WRNIP1

### Ligazóns externas 
* 
*