Bioconxugación

[miniatura|O [anticorpo monoclonal ibritumomab conxugado co tiuxetan.]]
A **bioconxugación** é o establecemento de enlaces covalentes estables entre dúas moléculas, das cales polo menos unha é unha biomolécula. Os métodos para conxugar biomoléculas aplícanse en varios eidos da medicina, diagnóstico, biocatálise e ciencias de materiais. As biomoléculas modificadas sinteticamente poden ter diversas funcionalidades, como rastrear eventos celulares, revelar a función de encimas, determinar a biodistribución de proteínas, crear biomarcadores específicos para obter imaxes, e entregar fármacos a células diana. 

A bioconxugación é unha estratexia fundamental que serve para enlazar estas biomoléculas modificadas con diferentes substratos. Ademais das aplicacións en investigación biomédica, a importancia da bioconxugación aumentou recentemente tamén en nanotecnoloxía, como nos puntos cuánticos bioconxugados.

Os tipos máis comúns de bioconxugación son acoplar unha pequena molécula (como a biotina ou unha tinguidura fluorescente) a unha proteína. Os conxugados anticorpo-fármaco como o Brentuximab vedotina e Gemtuzumab ozogamicina son exemplos que entran dentro desta categoría. Outras moléculas menos comúns usadas en bioconxugación son os oligosacáridos, ácidos nucleicos, polímeros sintéticos como o polietilenglicol, e nanotubos de carbono. As conxugacións proteína-proteína, como o acoplamento dun anticorpo a un encima, ou a ligazón de complexos proteicos, é tamén facilitado por bioconxugacións.

## Reaccións de bioconxugación comúns 
A síntese de bioconxugados supón diversos retos, que van desde o uso simple e non específico dun marcador fluorescente a un deseño complexo de conxugados anticorpo-fármaco.

### En aminoácidos naturais 
#### Reaccións das lisinas 
O residuo de lisina nucleófila é comunmente o sitio diana na bioconxugación de proteínas, por medio de ésteres *N*-hidroxisuccinimidil (NHS) reactivos a aminas.

miniatura|center|**Figura 1**. Estratexias de bioconxugación para residuos de lisina.|409x409px

#### Reaccións de cisteínas 
Como as cisteínas libres raramente aparecen na superficie dunha proteína, son unha elección excelente para a modificación quimioselectiva. En condicións básicas, os residuos de cisteína serán desprotonados para xerar un nucleófilo tiolato, que reacciona con electrófilos suaves, como as maleimidas e as iodoacetamidas (mostradas nas dúas primeiras reaccións na Figura 2 de abaixo). Como resultado, fórmase un enlace carbono-xofre. Outra modificación de residuos de cisteína supón a formación dun enlace disulfuro (mostrada na terceira reacción da Figura 2). Os residuos de cisteína reducidos reaccionan con disulfuros exóxenos, xerando un enlace disulfuro novo na proteína. A miúdo úsase un exceso de disulfuros para impulsar a reacción, como a 2-tiopiridona e 3-carboxi-4-nitrotiofenol. ou ben estables hidroliticamente (cando se usan 3-arilpropiolonitrilos; a última reacción da abaixo na Figura 2).

miniatura|center|**Figura 2**. Estratexias de bioconxugación para residuos de cisteína.|409x409px

#### Reaccións de tirosinas 
Os residuos de tirosina son relativamente non reactivos; polo tanto, non foron dianas moi utilizadas para a  bioconxugación. Desenvolvementos recentes mostraron que a tirosina pode modificarse por medio de reaccións de substitución aromática electrófila, e é selectiva para o carbono aromático adxacente ao grupo hidroxilo fenólico. Unha reacción tipo Mannich de tres compoñentes con aldehidos e anilinas (a última reacción na Figura 3) tamén foi descrita como relativamente selectiva para a tirosina baixo unhas condicións de reacción suaves optimizadas.

miniatura|center|**Figura 3**. Estratexias de bioconxugación para residuos de tirosina.|409x409px

#### Reaccións dos N- e C-terminais 
Como os residuos de aminoácidos naturais están habitualmente presentes en grandes cantidades, a miúdo é difícil modificar un só sitio. Desenvolvéronse estratexias que atacan os extremos (terminais) das proteínas, porque melloran moito a selectividade do sitio de modificación da proteína. Unha das modificacións N-terminais consiste na funcionalización do aminoácido terminal. A oxidación dos residuos N-terminais de serina e treonina pode xerar aldehidos N-terminais, os cales poden sufrir reaccións biortogonais (mostrada na primeira reacción na Figura 4). Outro tipo de modificación implica a condensación da cisteína N-terminal con aldehidos, xerando tiazolidina, que é estable a pH alto (segunda reacción da Figura 4). Usando o piridoxal fosfato (PLP), varios aminoácidos N-terminais pode sufrir unha transaminación para render un aldehido N-terminal, como a glicina e o ácido aspártico (terceira reacción da Figura 4).

miniatura|center|**Figura 4**. Estratexias de bioconxugación para o N-terminal|307x307px

Un exemplo de modificación C-terminal é a ligazón química negativa, que é o acoplamento entre o tioéster C-terminal e a cisteína N-terminal (Figura 5).

miniatura|center|**Figura 5**. Estratexias de bioconxugación para o C-terminal.|527x527px

### Reaccións biortogonais: sobre grupos funcionais particulares 
#### Modificación de cetonas e aldehidos 
Pode facerse que unha cetona ou aldehido se una a unha proteína por medio da oxidación de residuos de serina N-terminais ou transaminación con PLP. Adicionalmente, poden introducirse incorporando aminoácidos non naturais polo método de Tirrell ou o de Schultz. Noutras palabras, xérase unha alta concentración de electrófilo reactivo. A ligazón de oximas pode entón ocorrer doadamente, e informouse que a velocidade aumenta multiplicándose ata por 400 en condicións ácidas suaves. para operar a 20 M−1s−1 a pH neutro mentres que as condensacións de oximas proceden a 500-10000 M−1s−1 a pH neutro sen engadir catalizador.

#### Ligazón de Staudinger con azidas 
A ligazón de Staudinger de azidas e fosfina utilizouse amplamente no campo da química biolóxica. Dado pode formar un enlace amida estable nas células vivas, aplicouse á modificación da membrana plasmática, así como na obtención de imaxes in vivo e noutros estudos de bioconxugación. 
 
miniatura|center|**Figura 8**. Ligazón de Staudinger con azidas|500x500px

A diferenza da reacción de Staudinger clásica, a ligaxón de Staudinger é unha reacción de segunda orde na cal o paso limitante da velocidade é a formación de fosfazida (mecanismo de reacción específico mostrado na Figura 9). Primeiro, a trifenilfosfina reacciona coa azida para render un azailuro por medio dun estado de transición dun anel de catro membros, e despois unha reacción intramolecular orixina un  intermediario iminofosforano, que despois dará a ligazón amida por hidrólise.

miniatura|**Figura 9**. Mecanismo da ligazón de  Staudinger.|center|565x565px

#### Ciclación de Huisgen de azidas 
##### Ciclación de Huisen de azidas catalizada polo cobre 
As azidas convertéronse nunha diana común na modificación quimioselectiva de proteínas, porque son de tamaño pequeno e teñen un potencial de reacción termodinámica favorable. Unha desas reaccións de azidas é a reacción de cicloadición [3+2] con alquinos, pero para que se produza a reacción cómpren altas temperaturas e a miúdo orixina mesturas de rexioisómeros. 
 
center|miniatura|**Figura 10**. Ciclación de azidas catalizada por cobre.|460x460px

Unha reacción mellorada desenvolvida polo químico Karl Barry Sharpless utiliza como catalizador o cobre(I), que acopla as azidas con alquinos terminais, que só dá lugar a 1,2,3 triazois 1,4 substituídos con rendementos altos (mostrada máis abaixo na Figura 11). O estudo do mecanismo suxire unha reacción en varios pasos.

miniatura|center|**Figura 12**. Cicloadición de azidas e ciclooctinas promovida pola tensión.|486x486px

## Reaccións de bioconxugación mediadas por metal de transición 
A bioconxugación baseada en metais de transición foi todo un reto debido á natureza das condicións biolóxicas –solución acuosa, temperatura dunha habitación, pH suave, e concentracións baixas de substratos– que son xeralmente unha dificultade para as reaccións organometálicas. Con todo, recentemente, ademais da reacción de [[CuAAC|cicloadición [3 + 2] de azida alquino catalizada por cobre]], aplicáronse cada vez máis transformacións químicas mediadas por diversos metais de transición para as reaccións de bioconxugación, introducindo a metátese de olefinas, a alquilación, a arilación C–H, e as reaccións de acoplamento cruzado C–C, C–S e C–N.

### Alquilación 
#### Alquilación de aminoácidos naturais 
* **Alquilación de Trp e Cys catalizada por rodio**

Usando un RhII-carbenoide xerado in situ por activación de composto diazoicos substituídos por vinilo con Rh2(OAc)4, os triptófanos e cisteínas son alquilados selectivamente en medios acuosos.

Porén, este método está limitado a triptófanos e cisteínas da superficie da molécula debido a restricións estéricas.

Rh-carbenoide.|miniatura|center|484x484px

* **Alquilación (redutora) de Lys e N-terminal catalizada por iridio**

As iminas formadas pola condensación de aldehidos con lisinas ou o N-terminal poden ser reducidas eficientemente por un complexo estable en auga [Cp*Ir(bipy)(H2O)]SO4 en presenza de ións formato (servindo como fonte de hidruros). A reacción ocorre facilmente en condicións fisioloxicamente relevantes e resulta nunha alta conversión de varios aldehidos aromáticos.

miniatura|center|Alquilación (redutora) de Lys catalizada por Ir.|441x441px

* **O-alquilación de Tyr catalizada por paladio**

Usando un reactivo electrófilo preformado π-alilpaladio(II) derivado do acetato alílico ou de precursores carbamatos, pode conseguirse a alquilación alílica selectiva de tirosinas en solución acuosa a temperatura dunha habitación e en presenza de cisteínas.

miniatura|center|O-alquilación de Tyr catalizada por Pd.|402x402px

* **Alquilación de Cys catalizada por ouro**

Os péptidos que conteñen cisteína poden experimentar a adición 1,2 de alenos en presenza de sales de ouro(I) e/ou prata(I), producindo tioéteres de vinilo substituídos por hidroxilo. A reacción con péptidos procede con alto rendemento e é selectiva para cisteínas sobre calquera outro residuo nucleófilo.

Porén, a reactividade con proteínas diminúe moito, posiblemente debido á coordinación do ouro co esqueleto molecular da proteína.

miniatura|center|Alquilación de Cys catalizada por Au.|331x331px

### Arilación 
#### Arilación de aminoácidos naturais 
* **Arilación de Trp**
Hai moitos métodos para conseguir realizar a arilación C-H do triptófano, onde se utilizan diversos electrófilos como os haluros de arilo e ácidos aril borónicos (móstrase un exemplo máis abaixo) para transferir os grupos arilo.

Porén, as codicións da reacción de arilación C-H de triptófano actuais seguen sendo bastante esixentes, requirindo solventes orgánicos, pH baixo e altas temperaturas.

miniatura|center|Arilación do Trp.|379x379px

* **Arilación de Cys**

Os tiois libres consideráronse desfavorables para as reaccións mediadas por Pd debido á descomposición do catalizador de Pd. Porén,  os complexos de adición oxidativa de PdII apoiados por ligandos de dialquilbiaril fosfina funcionan eficientemente na S-arilación de cisteína.

O primeiro exemplo é o uso de complexos de adición oxidativa de PdII (Pd OAC polas súas siglas en inglés) con RuPhos: O complexo de PdII que resulta da adición oxidativa de haluros de arilo ou trifluorometanoesulfonatos e usando o RuPhos como ligando podía modificar quimioselectivamente cisteínas en varios tampóns cun 5 % de cosolvente orgánico a pH neutro. Este método que modifica péptidos e proteínas, consegue a macrociclación de péptidos (usando o reactivo bis-paladio e péptidos con dúas cisteínas non protexidas) e sintetizando conxugados anticorpo-fármaco. Cambiar o ligando a sSPhos axuda ao complexo de PdII a ser suficientemente hidrosoluble para conseguir a S-arilación da cisteína en condicións acuosas sen cosolvente.

miniatura|center|Arilación de Cys con RuPhos.|335x335px

Hai outras aplicacións deste método nas que os complexos de PdII se xeraron como complexos de adición oxidativa de PdII-péptido ao introducir 4-halofenilalanina en péptidos durante a síntese de péptidos en fase sólida para conseguir a ligazón péptido-péptido ou péptido-proteína.

miniatura|center|Complexos de adición oxidativa (OAC nas súa siglas en inglés) de Pd-péptido.|417x417px

Como alternativa á adición oxidativa directa do péptido, os complexos de adición oxidativa podían tamén transferirse á proteína por medio da reacción de acilación amino-selectiva por medio do éster NHS. Este último foi aplicado para etiquetar selectivamente residuos de lisina da superficie dunha proteína (formando complexos de adición oxidativa de PdII-proteína) e oligonucleótidos (formando complexos de adición oxidativa de PdII-oligonucleótido), que poderían despois ligarse a péptidos e proteínas que conteñen cisteína.

miniatura|center|Complexos de adición oxidativa de Pd.|613x613px

Outros exemplos de acoplamento cruzado proteína-proteína conséguense convertendo os residuos de cisteína nun complexo de adición oxidativa S-aril–Pd–X electrófilo utilizando unha estratexia de adición oxidativa intramolecular.

* **Arilación de Lys**

Similar ao que se fai coa cisteína, pode realizarse a N-arilación da lisina por medio de complexos de adición oxidativa de Pd con diferentes ligandos de dialquilbiaril fosfina. Debido a unha nucleofilicidade máis débil e unha velocidade de eliminación redutora máis lenta comparada coa da cisteína, a selección de ligandos de soporte é esencial. Utilizáronse os voluminosos ligandos BrettPhos e *t*-BuBrettPhos xunto con fenóxido de sodio lixeiramente básico como estratexia para funcionalizar lisinas en substratos de péptido. A reacción ocorre en condicións suaves e é selectivo sobre a maioría dos outros residuos de aminoácidos nucleófilos.

miniatura|center|Arilación de Lys.|396x396px

#### Arilación de aminoácidos non naturais 
Aplicáronse amplamente as reaccións de acoplamento cruzado mediadas por Pd de Sonogashira, Heck e Suzuki-Miyaura para modificar péptidos e proteínas, nas cales se desenvolveron diversos reactivos de Pd para a súa aplicación en solucións acuosas. Estas reaccións necesitan un substrato proteína ou péptido que porte grupos funcionais non naturais como os alquinos, haluros de arilo, e ácidos aril borónicos, o que pode conseguirse por expansión do código xenético ou modificación postraducional.

miniatura|center|Arilación UAA.|611x611px

## Exemplos de técnicas de bioconxugación aplicadas 
### Factores de crecemento 
Unha aplicación é a bioconxugaión do TGF-β a nanopartículas de óxido de ferro e a súa activación por hipertermia magnética in vitro. Isto fíxose usando 1-(3-dimetilaminopropil)etilcarbodiimida combinada con N-hidroxisuccinimida para formar enlaces amida primarios con aminas primarias libres no factor de crecemento. Os nanotubos de carbono foron usados con éxito xunto coa bioconxugación para ligarse a TGF-β seguido dunha activación coa luz infravermella próxima. Estas reaccións usan un enlazador cruzado, pero algúns destes engaden un espazo molecular entre o composto de interese e o material base e á súa vez causan maiores graos de unión non específica e reactividade non desexada.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Inmunofluorescencia
* Enxeñaría biomolecular
* Biotinilación
* SpyTag/SpyCatcher
* Ciclación in situ de proteínas
* Aminoácidos non naturais
* *Bioconjugate Chemistry* (revista)