Ensaio de retardo na mobilidade electroforética

[miniatura|No carreiro ou pista 1 do xel hai un control negativo, que contén só material xenético. O carreiro 2 contén proteína e tamén un fragmento de ADN que, baseándose na súa secuencia, non interacciona. O carreiro 3 contén a proteína e o fragmento de ADN que non reacciona; o complexo resultante é meirande, máis pesado, e móvese máis lentamente. O patrón mostrado no carreiro 3 é un dos que resultaría se todo o ADN estivese unido e non houbese disociación do complexo durante a [electroforese. Cando non se dan estas condicións pode verse unha segunda banda no carreiro 3 que indica a presenza de ADN libre ou a disociación do complexo ADN-proteína.]]

Un **ensaio de retardo na mobilidade electroforética** ou **EMSA** (do inglés *electrophoretic mobility shift assay*), tamén chamado **electroforese de retardo de mobilidade**, **ensaio de retardo en xel**, **ensaio de retardo de mobilidade en xel**, **ensaio de retardo de banda**, ou **ensaio de retardo en xel**, é unha técnica común de electroforese de afinidade utilizada para estudar interaccións proteína-ADN e proteína-ARN. Este procedemento pode determinar se unha proteína ou mestura de proteínas pode unirse a unha secuencia dada de ADN ou ARN, e pode ás veces indicar se está implicada máis dunha molécula de proteína no complexo de unión. Os ensaios de retardo en xel realízanse a miúdo in vitro xunto cun perfil de DNase, unha extensión de cebador, e experimentos de promotor-sonda cando se estuda a iniciación da transcrición, replicación do ADN, reparación do ADN ou procesamento e maduración do ARN. Aínda que na literatura poden encontrarse métodos precursores desta técnica, a maioría dos ensaios actuais deste tipo están baseados nos métodos descritos por Garner e Revzin  e Fried e Crothers.

## Principio 
Un ensaio de retardo de mobilidade é a separación electroforética dunha mestura de proteína–ADN ou proteína–ARN en xel de poliacrilamida ou agarosa durante un curto período (unhas 1,5-2 horas para un xel de 15 a 20&nbsp;cm). A velocidade á cal diferentes moléculas (e combinacións delas) se moven a través do xel está determinada polo seu tamaño e carga, e en menor medida, pola súa forma (ver electroforese en xel). O carreiro de control (no que hai unha sonda de ADN sen proteína) contén unha soa banda correspondente ao fragmento de ADN ou ARN non unido. Porén, asumindo que a proteína pode unirse ao fragmento, o carreiro con proteína conterá outra banda que representa o complexo de maior tamaño e menor mobilidade da sonda de ácido nucleico unida á proteína, a cal queda retardada no xel (xa que se moveu máis lentamente).

Baixo as condicións experimentais correctas, a interacción entre o ADN (ou ARN) e a proteína é estabilizada e a proporción de ácido nucleico unido respecto ao non unido no xel reflicte a fracción de moléculas de sonda libres e unidas a medida que a reacción de unión entra no xel. Esta estabilidade é en parte debida a un "efecto gaiola", polo cal a proteína, rodeada pola matriz do xel, é incapaz de difundir lonxe da sonda antes de que se recombinen. Se se coñecen as concentracións iniciais de proteína e de sonda, e tamén a estequiometría do complexo, pode determinarse a afinidade aparente da proteína pola secuencia de ácido nucleico. A non ser que o complexo teña unha vida moi longa nas condicións do xel, ou sexa tomada en conta a disociación durante a electroforese, o número é unha Kd aparente. Se non se coñece a concentración de proteína pero si a estequiometría do complexo, pode determinarse a concentración da proteína ao incrementar a concentración da sonda de ADN ata que maiores incrementos non aumenten a fracción de proteína unida. Pode calcularse o número de moles de proteína facendo unha comparación cun conxunto de dilucións estándar de sonda libre *corrida* no mesmo xel.

Para propósitos de visualización, o fragmento de ácido nucleico márcase xeralmente cun isótopo radioactivo, un marcador fluorescente ou biotina. A tinguidura estándar con bromuro de etidio é menos sensible que estes métodos e pode carecer de sensiblidade para detectar o ácido nucleico se nestes experimentos se utilizan pequenas cantidades de ácidos nucleicos ou ácidos nucleicos monocatenarios. Cando se usa un etiquetado con biotina, utilízase para detectar o fragmento de ADN a estreptavidina conxugada a un encima como a peroxidase de ravo picante (*Armoracia rusticana*) (ver EMSA non radioactivo). Aínda que a etiquetaxe do ADN ten pouco ou ningún efecto sobre a afinidade de unión á proteína, o uso de etiquetas non isotópicas incluíndo os fluoróforos ou a biotina poden alterar a afinidade ou esteiquiometría da interacción coa proteína de interese. A competición entre a sonda unida a fluoróforo ou biotina e o ADN non etiquetado da mesma secuencia pode usarse para determinar se a etiqueta altera a afinidade de unión ou a estequiometría.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Ligazóns externas 
;Protocolos:
* Dr. Mirmira EMSA Protocol
* Preparation of nuclear extract for EMSA
* Jonathan Flint Lab Protocol
* EMSA for Transcription Factor Binding
* Chemiluminescent Gel Shift Protocol