Replicación do ADN

[miniatura|200px|dereita|Replicación do ADN. A [dobre hélice desenrólase e cada febra actúa como un molde para a seguinte febra. As bases aparéanse para sintetizar as novas febras fillas.]] 
A **replicación do ADN** é o proceso de producir dúas réplicas idénticas a partir dunha molécula orixinal de ADN. Este proceso biolóxico ocorre en todos os organismos vivos e é a base da herdanza biolóxica. Na replicación interveñen moitos encimas. O ADN está constituído por dúas febras e cada febra da molécula de ADN orixinal serve como molde para a produción da febra complementaria, un proceso denominado replicación semiconservadora (ou semiconservativa), polo cal cada molécula replicada conserva unha febra orixinal e leva unha febra sintetizada nova. Os mecanismos celulares de corrección de probas e de comprobación de erros aseguran que a replicación se realice cunha fidelidade case perfecta. Unha replicación imperfecta do ADN dá lugar a mutacións.

Na célula, a replicación do ADN empeza en lugares específicos do xenoma chamados orixes de replicación. O desenrolamento do ADN nas orixes de replicación e a síntese de novas febras forma dúas forquitas de replicación que crecen de forma bidireccional desde a orixe. Diversas proteínas que están asociadas á forquita de replicación axudan na iniciación e continuación da síntese do ADN. A máis salientable delas é a ADN polimerase, que sintetiza o novo ADN engadindo nucleótidos complementarios aos da febra molde.

A replicación do ADN pode tamén realizarse *in vitro* (artificialmente, fóra da célula). Poden utilizarse as ADN polimerases illadas das células e os cebadores (*primers*) de ADN artificiais para iniciar a síntese de ADN en secuencias coñecidas dunha molécula de ADN molde. A reacción en cadea da polimerase (PCR), que é unha técnica de laboratorio moi común, aplica ciclicamente a síntese artificial para amplificar a cantidade de copias dun fragmento de ADN diana específico entre un conxunto de ADNs.

## Estruturas do ADN 
O ADN normalmente ten unha estrutura bicatenaria na que as dúas cadeas ou febras se trenzan entre si formando a característica dobre hélice. Cada febra do ADN é unha cadea formada por catro tipos de nucleótidos, cada un dos cales contén o azucre desoxirribosa, un fosfato, e unha base nitroxenada ou nucleobase (hai catro: adenina, citosina, guanina, e timina, abreviadas como A, C, G e T). A adenina e guanina do ADN son purinas, mentres que a citosina e a timina son pirimidinas. Estes nucleótidos forman enlaces fosfodiéster, creando o esqueleto desoxirribosa-fosfato da dobre hélice do ADN, mentres que as nucleobases están situadas na parte interior da hélice. As bases dos nucleótidos son complementarias coas da febra oposta e enlázanse coas de enfronte por pontes de hidróxeno para formar pares de bases. Os pares son A=T (con dúas pontes de hidróxeno), e C≡G (con tres pontes de hidróxeno).

As febras de ADN teñen unha direccionalidade, e os dous extremos dunha febra monocatenaria denomínanse "extremo 3' (tres prima)" e "extremo 5' (cinco prima)". Por convención, se se dá a secuencia de bases dunha febra monocatenaria do ADN, o extremo esquerdo da secuencia é o 5', e á dereita estará o extremo 3'. As febras dunha dobre hélice son antiparalelas, e unha delas vai de 5' a 3' mentres que a febra oposta vai de 3' a 5'. Os números destes termos refírense ao átomo de carbono da desoxirribosa ao cal se une o seguinte fosfato da cadea. A direccionalidade ten consecuencias na síntese de ADN, porque a ADN polimerase só pode sintetizar o ADN nunha dirección engadindo nucleótidos ao extremo 3' dunha febra de ADN (a síntese do ADN é en dirección 5'-3').

O apareamento de bases complementarias no ADN por medio de pontes de hidróxeno significa que a información contida en cada febra é redundante. Os nucleótidos dunha febra sinxela poden utilizarse para reconstruír nucleótidos sobre a febra de nova síntese complementaria.

## ADN polimerase 
miniatura|250px|dereita| As ADN polimerases engaden nucleótidos ao extremo 3' dunha febra de ADN. Se por accidente se incorpora un nucleótido non complementario, a polimerase queda inhibida para continuar a extensión da febra. A actividade de corrección de probas elimina o nucleótido non complementario e a extensión da febra continúa.

As ADN polimerases son unha familia de encimas que levan a cabo todas as formas de replicación do ADN. As ADN polimerases en xeral non poden iniciar a síntese de novas febras partindo de cero, senón que só poden estender unha febra de ADN ou ARN xa existente apareada cunha febra molde. Para empezar a síntese, debe crearse un curto fragmento de ARN, chamado cebador ou *primer*, que se aparea coa febra molde do ADN.

A ADN polimerase engade unha nova febra de ADN estendendo o extremo 3' dunha cadea de nucleótidos existente, engadindo a ela un a un novos nucleótidos que son complementarios cos da febra molde por medio da creación de enlaces fosfodiéster. Os nucleótidos necesarios chegan á zona de síntese do ADN en forma de nucleósidos trifosfato, pero incorpóranse ao ADN en forma de nucleótidos (monofosfato). Precisamente, a enerxía para este proceso de polimerización do ADN procede da hidrólise dos enlaces fosfoanhidro de fosfato de alta enerxía entre os tres fosfatos dos nucleósidos trifosfato. (propiamente falando os nucleótidos teñen un só fosfato, e se teñen máis denomínanse nucleósidos difosfato ou trifosfato). Cando se engade un nucleótido a unha febra de ADN en crecemento, a formación dun enlace fosfodiéster entre o fosfato proximal do nucleótido á cadea en crecemento vai acompañado da hidrólise dun enlace de alta enerxía coa liberción dos dous fosfatos distais en forma de pirofosfato. A hidrólise encimática do pirofosfato resultante en dous fosfatos inorgánicos separados consome un segundo enlace fosfato de alta enerxía e fai que a reacción sexa irreversible.

En xeral, as ADN polimerases son moi exactas na súa actividade de replicación, e teñen unha taxa de erro intrínseca de menos dun erro por cada 107 nucleótidos engadidos. Ademais, algunhas ADN polimerases teñen tamén unha capacidade de corrección de probas, polo que poden quitar nucleótidos do extremo dunha febra en crecemento para corrixir as bases mal apareadas. Finalmente, os mecanismos de reparación de erros de apareamento post-replicación revisan os erros que poida ter o ADN, e son quen de distinguir erros de apareamento que hai na febra de nova síntese con respecto á secuencia da febra orixinal. En conxunto, estes tres pasos de discriminación permiten unha fidelidade de replicación de menos dun erro por cada 109 nucleótidos engadidos. Durante o período de incremento de ADN exponencial a 37&nbsp;°C, a velocidade é de 749 nucleótidos por segundo. A taxa de mutación por par de bases por replicación durante a síntese do ADN do fago T4 é de 1,7 por 108. Esta replicación é, pois, abraiantemente rápida e exacta.

## Replicación semiconservadora 
[miniatura|dereita|300px|Representación gráfica das tres hipóteses sobre a replicación do [ácido desoxirribonucleico|ADNa) Conservadora b) Dispersantec) Semiconservadora.]]

Na década de 1950 había tres hipóteses sobre a replicación do ADN en canto á conservación das febras orixinais nas moléculas replicadas. Estas hipóteses eran as seguintes:

* **Hipótese semiconservadora** ou semiconservativa (modelo aceptado hoxe). En cada unha das moléculas replicadas consérvase unha das febras completas orixinais, mentres que a outra febra é de nova síntese.
* **Hipótese conservadora** ou conservativa. Sintetízase unha molécula totalmente nova (coas dúas febras de nova síntese), copia da orixinal.
* **Hipótese dispersante** ou dispersiva. As cadeas replicadas constan de fragmentos da cadea antiga e de fragmentos de nova síntese.

O experimento de Meselson e Stahl realizado na bacteria *Escherichia coli* en 1958 demostrou que a hipótese correcta era a semiconservadora, é dicir, cada molécula de ADN replicada ten unha febra completa orixinal e unha febra completa de nova síntese.

## Proceso de replicación 
A replicación do ADN, como todos os procesos de polimerización biolóxica, ten lugar por medio de tres etapas coordinadas e catalizadas encimaticamente, que son: iniciación, elongación e terminación.

### Iniciación 
miniatura|200px|dereita|Papel dos iniciadores na iniciación da replicación do ADN.
miniatura|200px|Formación do complexo de pre-replicación.
Para que se divida unha célula debe primeiro replicarse o seu ADN. Este proceso iníciase en puntos concretos do ADN chamados orixes de replicación, que son a diana de certas proteínas iniciadoras. As secuencias usadas como dianas polas proteínas iniciadoras adoitan ser ricas en AT (adenina e timina), porque os pares A-T teñen dúas pontes de hidróxeno (en vez das tres que forman a unión máis forte do par CG), polo que son fáciles de romper para abrir nese punto o ADN como unha cremalleira. Unha vez que se localiza a orixe, estes iniciadores recrutan outras proteínas e forman o complexo de pre-replicación, que desenrola o ADN bicatenario. A partir da orixe fórmanse dúas forquitas de replicación que avanzan en direccións opostas, polo que a replicación é bidireccional. A zona entre estas dúas forquitas denomínase **burbulla de replicación**.

### Elongación 
A ADN polimerase ten unha actividade 5'-3'.
Todos os sistemas de replicación do ADN coñecidos requiren un grupo 3'-hidroxilo libre para que se poida iniciar a síntese (Nota: o ADN é lido en dirección 3' a 5' mentres que a nova febra sintetízase na dirección 5' a 3'). Distínguense catro mecanismos de iniciación da síntese, que son:
# Todas as formas de vida celulares e moitos virus de ADN, fagos plásmidos usan unha encima primase para sintetizar un curto cebador de ARN cun grupo 3'-OH que despois vai ser elongado por unha ADN polimerase. 
# Os retroelementos (como os retrovirus) empregan un ARN de transferencia que ceba a replicación do ADN ao proporcionar un 3′-OH libre que se utiliza para a elongación pola transcriptase inversa. 
# Nos adenovirus e na familia φ29 de bacteriófagos, o grupo 3'-OH proporciónao a cadea lateral dun aminoácido dunha proteína unida ao xenoma (a proteína terminal), e a este grupo a ADN polimerase engade os nucleótidos para formar a nova febra. 
# Nos virus de ADN monocatenario (entre os que están os circovirus, os xeminivirus, os parvovirus e outros) e tamén nos moitos fagos e plásmidos que utilizan o mecanismo de replicación de círculos rodantes (RCR), a endonuclease RCR crea unha amosega na febra do xenoma (en virus monocatenarios) ou nunha das dúas febras do ADN (en plásmidos). O extremo 5′ da febra coa amosega é transferida a un residuo de tirosina da nuclease e despois o grupo 3′-OH libre é utilizado pola ADN polimerase para sintetizar a nova febra.

O primeiro destes mecanismos é o mellor coñecido e é o utilizado polos organismos celulares. Neste mecanismo, unha vez que as dúas febras están separadas, a primase engade cebadores de ARN a febras molde. A febra guía (líder, condutora ou continua) recibe un cebador de ARN mentres que a febra retardada (ou descontinua) recibe varios. A ADN polimerase estende a febra guía de forma continua desde o cebador con alta procesividade, mentres que a febra retardada esténdese de forma descontinua desde cada un dos cebadores, formando fragmentos de Okazaki (de aí que tamén se chamen febra continua e descontinua). A RNase retira os fragmentos de cebador de ARN, e unha ADN polimerase de baixa procesividade distinta da polimerase replicativa entra para encher con ADN os ocos onde estaban os cebadores. Cando isto se completa, atópase unha soa amosega na febra guía e varias amosegas na febra retardada. Un encima ligase actúa agora para encher estas amosegas, completando así a nova molécula de ADN replicada. Por tanto, a febra retardada ou descontinua, que estaba formada por fragmentos de Okazaki separados, faise finalmente continua.

A primase usada neste proceso difire significativamente entre bacterias e arqueas/eucariotas. As bacteias usan unha primase que pertence á superfamilia da proteína DnaG, que contén un dominio catalítico de tipo pregamento TOPRIM. O pregamento TOPRIM contén unha parte central α/β con catro febras conservadas nunha topoloxía de tipo Rossmann. Esta estrutura tamén se encontra nos dominios catalíticos da topoisomerase Ia, topoisomerase II, a familia OLD de nucleases e nas proteínas de reparación do ADN relacionadas coa proteína RecR.

A primase utilizada por arqueas e eucariotas contén unha versión moi conservada derivada do motivo de recoñecemento do ARN (RRM). Esta primase é estruturalmente similar a moitas ARN polimerases dependentes de ARN virais, transcriptases inversas, ciclases xeradoras de nucleótidos cíclicos e ADN polimerases das familias A/B/Y que están implicadas na replicación e reparación do ADN. Na replicación eucariota, a primase forma un complexo coa Pol α.

No proceso de replicación do ADN as ADN polimerases teñen diferentes papeis. En *E. coli*, a ADN Pol III é o encima polimerase principal responsable da replicación do ADN. Ensámblase no complexo de replicación na forquita de replicación que presenta unha procesividade extremadamente alta, e permanece intacto en todo o ciclo de replicación. Ao contrario, a ADN Pol I é o encima responsable da substitución dos cebadores de ARN por ADN. A ADN Pol I ten unha actividade de exonuclease 5' a 3' ademais da súa actividade de polimerase, e usa a súa actividade exonuclease para degradar os cebadores de ARN por diante del a medida que estende a febra de ADN por detrás del, nun proceso chamado traslado de amosega (*nick translation*). A Pol I é moito menos procesiva que a Pol III porque a súa función principal na replicación do ADN é crear moitos tramos de ADN curtos e non uns poucos tramos moi longos.

En eucariotas, o encima de baixa procesividade Pol α, axuda a iniciar a replicación. Os encimas de alta procesividade son a Pol δ e a Pol ε.

A medida que continúa a síntese de ADN, as febras de ADN orixinais seguen desenrolándose a cada lado da burbulla de replicación, formando unha forquita de replicación con dous brazos. Nas bacterias, que teñen unha única orixe de replicación no seu cromosoma circular, este proceso xera unha "estrutura en theta" (que lembra á letra grega theta, θ). Ao contrario, os eucariotas teñen cromosomas máis longos e lineares e inician a replicación desde moitas orixes en cada cromosoma.

### Forquita de replicación 
[dereita|miniatura|Esquema da forquita de replicación.a: molde, b: febra guía, c: febra retardada, d: forquita de replicación, e: cebador, f: [fragmento de Okazaki.]]
miniatura|300px|dereita|Na forquita de replicación do ADN actúan moitos encimas.

A forquita de replicación ou forcada de replicación é unha estrutura que se forma no núcleo durante a replicación do ADN. É creada pola acción das helicases, que rompen as pontes de hidróxeno que mantiñan unidas as dúas febras do ADN. A estrutura resultante ten dúas ramificacións ou brazos da forquita, cada unha constituída por unha soa febra do ADN. Estas dúas febras serven como moldes para as fibras guía e retardada, que se crean cando a ADN polimerase introduce nucleótidos complementarios sobre os moldes; os moldes poden denominarse molde da febra guía e molde da febra retardada.

'''O ADN sempre se sintetiza en dirección 5' a 3'.'* Como os moldes das febras guía e retardada están orientados en direccións opostas na forquita de replicación, un importante problema é conseguir sintetizar a febra do ADN retardada nacente (nova), cuxa dirección de síntese é oposta á dirección de crecemento da forquita de replicación.

#### Febra guía 
A febra guía (ou líder ou condutora ou continua) é a febra do ADN nacente que está sendo sintetizada na mesma dirección en que avanza a forquita de replicación en crecemento. Unha polimerase fai a "lectura" da febra guía molde e engade nucleótidos complementarios á febra guía nacente de forma continua.

A polimerase implicada na síntese da febra guía é a ADN polimerase III (ADN Pol III) en procariotas e a Pol δ en eucariotas. A Pol ε pode substituír a Pol δ en circunstancias especiais.

#### Febra retardada 
A febra retardada (ou atrasada ou descontinua) é a febra de ADN nacente cuxa dirección de síntese é oposta á dirección de crecemento da forquita de replicación. Debido a esta orientación, a replicación da febra retardada é máis complicada comparada coa da febra guía.

A febra retardada sintetízase en segmentos curtos separados (descontinuos). Sobre a febra retardada molde, unha primase "le" o mode de ADN e inicia a síntese dun cebador de ARN curto complementario. Unha ADN polimerase estende os segmentos cebados, formando fragmentos de Okazaki (que constan de ARN e ADN). Os cebadores de ARN son despois eliminados e substituídos por ADN, polo que todo o fragmento de Okazaki é agora de ADN, e os fragmentos de ADN separados son unidos por unha ADN ligase formando unha febra continua.

A responsable da extensión (con ADN) dos cebadores (de ARN) engadidos durante a replicación da febra retardada é a ADN polimerase III (en procariotas) ou a Pol δ (en eucariotas). A eliminación dos cebadores realízaa a ADN polimerase I (en procariotas) e a Pol δ (en eucariotas). A primase eucariota é intrínseca á Pol α. En eucariotas, a Pol ε axuda á reparación durante a replicación do ADN.

#### Dinámica da forquita de replicación 
[miniatura|200px|A [abrazadeira do ADN humana ensamblada, que é un trímero da proteína PCNA.]]
A medida que a helicase desenrola o ADN na forquita de replicación, o ADN que está por diante é obrigado a rotar. Este proceso ten como resultado unha acumulación de retorceduras no ADN que está diante. Esta acumulación forma unha resistencia torsional que finalmente faría deter o avance da forquita de replicación. As topoisomerases son ecimas que rompen temporalmente as febras de ADN, aliviando a tensión causada polo desenrolamento das dúas febras da hélice de ADN; as topoisomerases (como a ADN xirase) conseguen isto ao engadir superenrolamentos negativos á hélice de ADN.

Os ADN monocatenarios espidos tenden a pregarse sobre si mesmos formando estruturas secundarias; estas estruturas poden interferir co movemento da ADN polimerase. Para evitar isto, únese ao ADN unha proeínas de unión á febra sinxela ata que se sintetiza unha segunda febra, o que impide a formación da mencionada estrutura secundaria.

As proteínas abrazadeira forman unha abrazadeira escorregante arredor do ADN, o que axuda á ADN polimerase a manter o contacto co seu molde, o que contribúe á procesividade. A cara interna da abrazadeira permite que o ADN se enfíe a través dela. Unha vez que a polimerase chega ao final do molde ou detecta ADN bicatenario, a abrazadeira escorregante sofre un cambio conformacional que libera a ADN polimerase. As *proteínas de carga da abrazadeira* utilízanse para cargar inicialmente a abrazadeira sobre o ADN, xa que rcoñecen a zona de unión entre o molde e os cebadores de ARN.

### Maquinaria de replicación 
As **maquinarias de replicación** constan de factores implicados na replicación do ADN e aparecen nas febras monocatenarias molde do ADN. As maquinarias de replicación inclúen os primosotores, que son encimas de replicación, como os seguintes: ADN polimerase, ADN helicases, abrazadeiras do ADN e ADN topoisomerases, e tamén as proteínas de replicación, como por exemplo as proteínas de unión á febra sinxela do ADN (SSB). Nas maquinarias de replicación estes compoñentes coordínanse. Na maioría das bacterias, todos os factores implicados na replicación do ADN están localizados en forquitas de replicación e os complexos permanecen nas forquitas durante a replicación do ADN. Estas maquinarias de replicación denomínanse **replisomas** ou **sistemas de ADN replicase**, termos que orixinalmente se aplicaban de forma xenérica ás proteínas localizadas nas forquitas de replicación. Non obstante, nas células eucariotas e nalgunhas células bacterianas non se forman replisomas.

Como as maquinarias de replicación non se moven do seu sitio en relación ao ADN molde, estas fábricas ou factorías denomínanse **factorías de replicación**. Nunha imaxe descritiva alternativa, as factorías de ADN son similares a proxectores, e os ADNs son como filmes cinematográficos que van pasando continuamente polos proxectores. No modelo da factoría de replicación, despois de que ambas as ADN helicases para a febra retardada e a guía se cargan nos ADNs molde, as helicasaes móvense ao longo dos ADNs unha en dirección á outra ata que chocan. As helicases permanecen asociadas durante o resto do proceso de replicación. Peter Meister et al. observaron os sitios de replicación directamente no lévedo de xemación monitorizando ADN polimerases α etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP). Detectaron a replicación do ADN de pares de loci etiquetados espazados simetricamente desde unha orixe de replicación e atoparon que a distancia entre os pares diminuía marcadamente co tempo. Este descubrimento indica que o mecanismo da replicación do ADN funciona con dúas factorías de ADN. É dicir, cárganse parellas de factorías de replicación nas orixes de replicación e as factorías asócianse unha coa outra. Ademais, os ADNs molde móvense ás factorías, o cal produce unha extrusión dos ADNs monocatenarios molde e os ADNs nacentes. O descubrimento de Meister é a primeira proba directa do modelo da factoría de replicación. Posteriores investigacións indicaron que as ADN helicases forman dímeros en moitas células eucariotas e as maquinarias de replicación bacterianas permanecen nunha soa localización intranuclear durante a síntese de ADN.

## Regulación 
[miniatura|150px|O [ciclo celular das células eucariotas.]]

### Eucariotas 
Nos eucariotas, a replicación do ADN está controlada no contexto do ciclo celular. A medida que a célula crece e se divide, progresa a través das distintas fases do ciclo celular. A replicación do ADN ten lugar durante a fase S (fase de síntese de ADN). O avance da célula eucariota polas sucesivas fases do ciclo está controlado por puntos de control do ciclo celular. A progresión por estes puntos de control (*checkpoints*) está controlada por complexas interaccións entre varias proteínas, entre as que están as ciclinas e as quinases dependentes de ciclina. A diferenza das bacterias, o ADN eucariota replícase dentro dos límites do núcleo (pero hai tamén ADN nas mitocondrias e cloroplastos).

O punto de control G1/S (ou punto de control de restrición) regula se a célula eucariota entrará no proceso de replicación do ADN e na subseguinte división. As células que nunca avanzan alén deste punto de control permanecen no estado G0 e non replican o seu ADN.

As replicacións dos xenomas do cloroplasto e mitocondrial ocorren independentemente do ciclo celular, por medio do proceso da replicación de bucle D.

#### Foco de replicación 
En células de vertebrados, os sitios de replicación concéntranse en localizacións chamadas focos de replicación. En *E. coli*, que é a bacteria mellor estudada, a replicación do ADN está regulada por varios mecanismos, incluíndo os seguintes: a hemimetilación e secuestro da secuencia de orixe, a proporción de ATP con respecto ao ADP, e os niveis da proteína DnaA. Todo isto controla a unión de proteínas iniciadoras ás secuencias de orixe.

Como *E. coli* metila as secuencias GATC do ADN, a síntese de ADN dá lugar a secuencias hemimetiladas. Este ADN hemimetilado é recoñecido pola proteína SeqA, que se une e secuestra a secuencia orixe; ademais, a DnaA (necesaria para a iniciación da replicación) únese peor ao ADN hemimetilado. Como consecuencia, as orixes que acaban de ser replicadas non poden iniciar inmediatamente outra rolda de replicación do ADN.

O ATP acumúlase cando a célula está nun medio rico, o que desencadea a replicación do ADN unha vez que a célula alcanzou un tamaño específico. O ATP compite co ADP para unirse á proteína DnaA, e o complexo DnaA-ATP pode iniciar a replicación. Certo número de proteínas DnaA son tamén necesarias para a replicación, xa que cada vez que se copia unha orixe, o número de sitios de unión para a DnaA duplícase, polo que se require a síntese de máis DnaA para posibilitar outra iniciación da replicación.

## Reacción en cadea da polimerase 
Os investigadores xeralmente replican o ADN *in vitro'' usando a reacción en cadea da polimerase (PCR). A PCR utiliza un par de cebadores para cubrir unha rexión diana no ADN molde, e despois polimeriza febras complementarias en cada dirección desde estes cebadores usando unha ADN polimerase termoestable chamada Taq polimerase. Repetindo este proceso en moitos ciclos amplifícase a cantidade da rexión diana do ADN. Ao comezo de cada ciclo, a mestura do molde e os cebadores quéntase, para separar as moléculas acabadas de sintetizar das moléculas molde. Despois, cando a mestura arrefría, ambas as moléculas convétense en novos moldes para que se unan a elas novos cebadores, e a polimerase estende o ADN a partir deles. O resultado é que o número de copias da rexión diana duplícase en cada rolda, crecendo exponencialmente.

## Notas