Western blot

[miniatura|Western blot no que se usa un anticorpo que recoñece proteínas modificadas con [ácido lipoico.]]
O **western blot** (ás veces chamado **inmunoblot de proteínas** ou **transferencia western**) é unha técnica analítica moi utilizada para detectar proteínas específicas nunha mostra de homoxeneizado de tecidos ou extracto. Utiliza electroforese en xel para separar as proteínas nativas pola súa estrutura tridimensional ou proteínas desnaturalizadas pola lonxitude da súa cadea polipeptídica. As proteínas son despois transferidas a unha membrana (tipicamente de nitrocelulosa ou PVDF), polo que é unha técnica de *blotting* ou transferencia. Unha vez na membrana son marcadas con anticorpos específicos para a proteína diana. ou epicocconona (do fungo *Epicoccum nigrum*). Esta práctica asegura a corrección para a cantidade de proteína total na membrana en caso de erros ou transferencias incompletas.

#### Detección colorimétrica 
O método de detección colorimétrica depende da incubación do western blot cun substrato que reacciona cun encima reporteiro (como a peroxidase) que está unido ao anticorpo secundario. Isto converte o colorante soluble nunha forma insoluble de diferente cor que precipita ao lado do encima e dese modo tingue a membrana. O desenvolvemento do blot detense despois por medio do lavado do colorante soluble. Os niveis proteicos avalíanse por medio de densitometría (mide a intensidade da tinguidura) ou por espectrofotometría.

#### Detección quimioluminescente 
Os métodos de detección quimioluminescentes dependen da incubación do western blot cun substrato que se fai luminoso cando é exposto ao reporteiro no anticorpo secundario. Despois, detéctase a luz por cámaras CCD que capturan imaxes dixitais do western blot ou da película fotográfica. O uso da película para a detección do western blot está desaparecendo lentamente debido á súa non linearidade da imaxe (cuantificación imprecisa). A imaxe analízase por densitometría, o cal avalía as cantidades relativas de tinguidura da proteína e cuantifica os resultados en termos de densidade óptica. Hai novo software que permite analizar datos como o peso molecular se se utilizan estándares axeitados.

As principais compañías que ofrecen sistemas de imaxes de quimioluminescencia son Analytik Jena, UVP, Azure Biosystems，UVITEC, GE e Biorad.

center

#### Detección radioactiva 
A etiquetaxe radioactiva non require substratos encimáticos, e permite situar unha película de raios X médica directamente contra o western blot, a cal se revela a medida que é exposta á etiqueta e crea rexións escuras que corresponden a bandas proteicas de interese. A importancia dos métodos de detección radioactiva está declinando debido ao perigo inherente aos produtos radioactivos, a que é moi cara, riscos de saúde e seguridade, e a que a quimioluminescencia potenciada (ECL, *enhanced chemiluminescence*) proporciona unha alternativa útil.

#### Detección fluorescente 
A sonda etiquetada fluorescentemente é excitada pola luz e a emisión da excitación detéctase despois por medio dun fotosensor como pode ser unha cámara CCD equipada con filtros de emisións apropiados que capturan a imaxe dixital do western blot e permiten analizar máis datos como facer análises de pesos moleculares e unha análise de western blot cuantitativa. A fluorescencia considérase que é un dos mellores métodos para a cuantificación, pero é menos sensible que a quimioluminescencia.

### Sondaxe secundaria 
Unha diferenza importante entre as membranas de nitrocelulosa e de PVDF ten que ver coa capacidade de cada unha delas de soportar que se "arranquen" os anticorpos e se reutilice a membrana para posteriores sondas de anticorpos. Aínda que se dispoñen de protocolos ben establecidos para espir de anticorpos as membranas de nitrocelulosa, as máis robustas membranas PVDF permiten facer ese proceso de forma máis doada, e poden ser reutilizadas máis veces antes de que o ruído de fondo limite os experimentos. Outra diferenza é que, a diferenza da nitrocelulosa, a PVDF antes do seu uso debe ser mergullada en etanol ao 95% (ou isopropanol ou metanol). As membranas PVDF tamén tenden a ser máis grosas e máis resistentes aos danos durante o uso.

## Electroforese en xel bidimensional 
O SDS-PAGE bidimensional usa os principios e técnicas indicadas anteriormente. O SDS-PAGE bidimensional, como indica o seu nome, implica a migración de polipéptidos en dúas dimensións. Por exemplo, na primeira das dimensións, os polipéptidos sepáranse polo seu punto isoeléctrico, mentres que na segunda dimensión, os polipéptidos sepáranse de acordo cos seus pesos moleculares. O punto isoeléctrico dunha proteína determínase polo número relativo de aminoácidos cargados positivamente (por exemplo, lisina e arxinina) e negativamente (por exemplo, glutamato e aspartato), e os aminoácidos cargados negativamente contribúen a que o punto isoeléctrico sexa baixo, e os cargados positivamente contribúen a que sexa alto. As mostras poderían tamén separarse primeiramente en condicións non redutoras usando SDS-PAGE, e baixo condicións redutoras na segunda dimensión, o cal rompe as pontes disulfuro que mantiñan xuntas as subunidades. O SDS-PAGE pode tamén ser acoplado con urea-PAGE para un xel bidimensional.

En principio, este método permite a separación de todas as proteínas celulares sobre un xel grande único. Unha vantaxe importante deste método é que a miúdo distingue entre diferentes isoformas dunha proteína particular, por exemplo unha proteína que foi fosforilada (por adición dun grupo cargado negativamente). As proteínas que foron separadas poden ser cortadas do xel e despois analizadas por espectroscopia de masas, o cal identifica a proteína.

## Aplicacións diagnósticas médicas 
* A proba do VIH confirmatoria emprega un western blot para detectar anticorpos anti-VIH nunha mostra de soro sanguíneo humano. As proteínas de células infectadas polo VIH coñecidas son separadas e transferidas á membrana como se explicou máis arriba. Despois, o soro que se vai probar aplícase no primeiro paso de incubación do anticorpo; os anticorpos libres son lavados, e engádese un anticorpo anti-humano secundario ligado a un sinal encimático. As bandas tinguidas entón indican as proteínas para as cales o soro do paciente contén anticorpos.
* O western blot utilízase tamén como unha proba definitiva para a encefalopatía esponxiforme bovina (tamén coñecida como 'mal das vacas tolas').
* Algunhas formas das probas para a detección da enfermidade de Lyme empregan o western blot.
* O western blot pode tamén usarse como unha proba confirmatoria para a hepatite B.
* En medicina veterinaria, o western blot utilízase ás veces para confirmar o status FIV+ en gatos (presenza do virus da inmunodeficiencia felina).

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Far-Eastern blot
* Far-western blot
* Eastern blot
* Northwestern blot
* SDS-PAGE
* Proteólise paralela rápida (FASTpp) [=== Ligazóns externas ===
* https://web.archive.org/web/20100420005952/http://www.natureprotocols.com/2006/09/15/western_blot_analysis_of_subce.php Western blot analysis of sub-cellular fractionated samples using the Odyssey Infrared Imaging System (a protocol)
* Western blot protocol including example buffers and reprobing procedure 
* Image Studio Lite Western Blot Analysis Software (Free) 
* Western Blotting Principles and Methods Handbook
* Advansta WiKi on Western Blots

### Protocolos 
* Western Blot Video Protocol 
* Western Blotting Protocol from Protocolmonkey
* Modified western blotting protocols from Biotechniques
* Dr. Mark Barton Frank Lab protocol
* 
* CSH Protocols collection: Immunoblotting
* Western Blot Protocol from HowtoWesternBlot.net