Microscopio de forza atómica

miniatura|250px|Diagrama dun microscopio de forza atómica.
miniatura|dereita|Microscopio de forza atómica á esquerda, e computadores que o controlan á dereita.
miniatura|dereita|Imaxe de AFM dun escaneado da superficie dun vidro. Aínda que os vidros parecen lisos, a escala micro e nanométrica presentan toda clase de rugosidades.
O **microscopio de forza atómica** (**AFM**, nas súas siglas en inglés, de ***A**tomic **F**orce **M**icroscope*) é un instrumento mecano-óptico con capacidade para detectar forzas da orde dos nanonewtons. Ao escanear unha mostra pasando unha sonda de punta afiada detectora pola súa superficie, este microscopio pode rexistrar continuamente a súa topografía. A punta da sonda pode ser de forma piramidal ou cónica. A sonda vai acoplada a un brazo ou panca microscópica moi flexible de só uns 200 µm. O microscopio de forza atómica foi esencial para o desenvolvemento da nanotecnoloxía, para a caracterización e visualización de mostras a dimensións nanométricas (10-9 m = 1 nm). Ten unha resolución de ata fraccións de nanómetro, o que mellora en máis de 1000 veces o límite de difracción óptico.

O AFM é un tipo de microscopia de sonda de varrido (SPM: *Scanning probing microscopy*), que inclúe tamén ao STM (microscopio de efecto túnel). O STM permite visualizar rexións de alta ou baixa densidade electrónica superficial, e de aí inferir a posición de átomos individuais ou moléculas na superficie dunha rede. A microscopia de sonda de varrido utilízase en áreas da ciencia que van desde a bioloxía ata a física do estado sólido.

## Historia 
Gerd Binnig e Heinrich Rohrer foron galardoados co Premio Nobel de Física de 1986 polo seu traballo en microscopia de varrido de túnel. Binnig e Rohrer foron recoñecidos polo desenvolvemento da poderosa técnica de microscopia que pode formar unha imaxe de cada un dos átomos sobre unha superficie de metal ou de semicondutores por medio do escaneo realizado pola punta dunha agulla sobre a superficie a unha altitude de só uns poucos diámetros atómicos. Compartiron o premio co científico alemán Ernst Ruska, o deseñador do primeiro microscopio electrónico.

En 2007 un equipo liderado polo Consello Superior de Investigacións Científicas (CSIC) español perfeccionou a técnica empregada polos microscopios atómicos. A nova técnica, denominada Phase Imaging AFM, está baseada na microscopia de forzas, e permite realizar medidas tanto en aire coma en medios líquidos ou fisiolóxicos. O desenvolvemento desta técnica podería ter aplicacións en áreas diferenciadas, como a biomedicina, a nanotecnoloxía, a ciencia de materiais ou estudos medioambientais.

## Instrumentación 
miniatura|esquerda|Diagrama dun microscopio de forza atómica.
Os compoñentes dun AFM son:
* Díodo láser: Forza normal, F*n*=A+B-(C+D), e Forza lateral, F*l*=A+C-(B+D).
* Micropanca
* Fotodíodo
* Tubo piezoeléctrico

### Micropancas 
miniatura|250px|Micropanca.

Historicamente as primeiras pancas tiñan un tamaño de varios mm e adoitaban fabricarse de metal, por exemplo a partir dun fío de volframio cun extremo afiado e dobrado en ángulo recto para formar a punta. Máis tard, para mellorar a velocidade de varrido sen perder resolución, foi necesario que as pancas tivesen masas cada vez menores e simultaneamente frecuencias de resonancia maiores. A solución a este problema atopouse na microfabricación das pancas.

As micropancas prodúcense na actualidade empregando métodos de microfabricación herdados inicialmente da industria microelectrónica, como litografía de superficie e gravados reactivos de plasma de ións (RIE e DRIE, siglas en inglés de *Reactive Ion Etching* e *Deep Reactive Ion Etching*). As **puntas** adoitan fabricarse a partir de deposicións de vapor dalgún material axeitado sobre unha panca xa fabricada, e nese caso o resultado adoita ser unha punta cónica, pero, cando o silicio foi o material elixido, o máis común é recorrer a técnicas de gravado anisótropo. O gravado anisótropo implica o uso dunha solución gravadora que escava o material só ou preferentemente en certas direccións cristalográficas. Desta maneira, é posible producir puntas piramidais limitadas por planos cristalográficos do material.

A forza da micropanca vén dada polo fabricante e determínase pola lei de Hooke. Neste caso, a lei de Hooke represéntase pola ecuación do resorte, onde se relaciona a forza *F* exercida polo resorte coa distancia adicional *x* producida por alongamento, do seguinte modo:

:F = -k\Delta x \, , onde  k = \frac{AE}{L}

O ruído de Johnson-Nyquist, tamén coñecido como ruído térmico, é un factor importante na calibración da micropanca, porque está calibrada á súa frecuencia de resonancia pola temperatura.

### Sensores de flexión 
Existen actualmente distintos sistemas para medir a flexión da panca. O máis común en instrumentos comerciais é o chamado **óptico**, neste a flexión da panca rexístrase mediante un feixe láser que se reflicte na parte posterior da micropanca para logo acadar un fotodetector. A este efecto, a maior parte das micropancas de AFM fabrícanse actualmente cunha capa de ouro dunhas decenas de nm de grosor na súa parte posterior para optimizar a súa reflectancia ao feixe do láser. Porén, historicamente o primeiro sistema de detección usado foi un microscopio de STM (efecto túnel). Neste sistema axustábase á panca unha punta de STM, e a flexión desta era medida por medio da variación na **corrente de túnel**, xa que dita corrente é sensible a cambios subnanométricos na distancia entre a punta de STM e a panca. A razón de que se pensara inicialmente neste sistema é que na súa orixe o microscopio de AFM se concibiu como unha modificación do STM para usalo con mostras electricamente illantes, xa que o microscopio de efecto túnel (STM) só funciona con condutores. Posteriormente, pasouse a substituír este sistema de detección por un interferómetro e finalmente introduciuse a panca óptica. Máis recentemente incorporáronse novos métodos de detección baseados en piezorresistividade ou en medidas de capacitancia. Con todo, ningún destes métodos "electrónicos" acada os niveis de resolución tanto espacial coma temporal da panca óptica.

Por outra parte, a panca óptica presenta un problema de calibración que afecta especialmente ás medidas de forza. Este débese á necesidade que se dá nas medidas de forza de rexistrar de forma precisa a flexión da panca no seu extremo libre. Como o fotodíodo soamente rexistra o desprazamento do punto de láser sobre a súa superficie, cómpre calibrar este desprazamento cunha flexión real da panca para poder obter medidas de flexión. Este procedemento coñecido como calibración da sensibilidade lévase a cabo imprimindo unha flexión coñecida ao extremo da micropanca mentres simultaneamente se rexistra o sinal do fotodiodo. A forma máis común de obter unha flexión coñecida é premer verticalmente o extremo da panca contra unha superficie ríxida, asegurando así que o desprazamento vertical da panca equivale a flexión no seu extremo.

Os métodos interferométricos ou de efecto túnel non requiren deste procedemento.

### Punta 
miniatura|esquerda|Ampliación a 3000x da punta dunha panca de AFM (largura da imaxe 30 microns).
miniatura|dereita|Panca de AFN (a largura da imaxe é 100 microns).
Un dos aspectos máis importantes na resolución das imaxes obtidas por AFM é a agudeza da punta. As primeiras utilizadas polos precursores do AFM fabricáronse pegando o diamante sobre cachos de papel de aluminio. As mellores puntas con raio de curvatura encóntranse arredor dos 5&nbsp;nm.

Existen tres tipos de factores que inflúen para formar as imaxes:
* Alargamento.
* Compresión.
* **Interaccións punta-mostra**: Cando non hai contacto, forzas electrostáticas e magnéticas; cando hai case contacto, forzas de van der Waals; en contacto, capilaridade e forzas de contacto.
* Aspecto do raio.

## Precisión 
A resolución vertical do instrumento é de menos de 1&nbsp;nm, e permite distinguir detalles tridimensionais na superficie da mostra cunha amplificación de varios millóns.

## Tipos de medidas, modos de operación e aplicacións 
O microscopio de forza atómica (AFM) pode realizar dous tipos de medidas: imaxe e forza. 
* No **modo de imaxe** a superficie é varrida no plano da superficie (X-Y) pola punta. Durante o varrido a forza interatómica entre os átomos da punta e os átomos na superficie mostral provoca unha flexión da panca. Esta flexión é rexistrada por un sensor axeitado (normalmente unha balanza óptica) e o sinal obtido introdúcese nun circuíto ou bucle de realimentación. Este último controla un actuador piezoeléctrico que determina a altura (Z) da punta sobre a mostra de forma que a flexión da panca se manteña a un nivel constante (normalmente introducido polo operador). Representando a altura da punta (Z) fronte á súa posición sobre a mostra (X, Y) é posible trazar un mapa topográfico da mostra Z=Z(X, Y). A forza interatómica pódese detectar cando a punta está moi próxima á superficie da mostra. 
* En **medidas de forza** a punta faise oscilar verticalmente mentres se rexistra a flexión da panca. A medida exprésase entón representando forza (F) fronte a altura (Z) sobre a mostra. As medidas de forza son útiles en estudos de forzas de adhesión e permiten estudar a nivel dunha soa molécula interaccións específicas entre moléculas (exemplo: interacción antíxeno-anticorpo, interacción entre febras complementarias de ADN) ou interaccións estruturais das biomoléculas (pregamento de proteínas) así como caracterizar a elasticidade de polímeros. Tamén é útil en estudos de indentación de materiais brandos (polímeros) que permitan caracterizar propiedades elásticas da mostra como o módulo de elasticidade ou viscoelásticas.

### Modos de operación en imaxe 
miniatura|350px|Modos de operación: a. Modo contacto, b. Modo de non contacto, c. Modo de repeniqueo.

#### Modo contacto 
No varrido en **modo contacto** (figura a) a punta é *arrastrada* pola superficie da mostra, e a forza entre punta e mostra mantense constante, mantendo unha constante de deflexión. A deflexión da punta estática utilízase como un sinal de retroalimentación.

A forza de adhesión é unha forza fundamental no modo contacto:

F_{adh}=4 \pi R \gamma_L \cos \theta

onde \gamma_L é a tensión superficial da auga, \theta é o ángulo do menisco entre punta e mostra, e R fai referencia ao raio da punta e da mostra.

En condicións normais, a forza de adhesión é duns 7&nbsp;nN. A forza de adhesión é un dos maiores inconvenientes do modo contacto en aire. No modelo de Hertz asúmese que a superficie é suave e continua, que a área de contacto é pequena, e que non existen forzas de fricción nin adhesión. Porén, a forza de adhesión é moi importante a escala nanométrica, e afecta especialmente á resolución lateral. Para superar este inconveniente, utilízase o **Jumping mode** (modo salto), un modo de contacto no que se evitan as forzas laterais. O AFM en líquido supera tamén este problema, porque en líquido non existen forzas de adhesión.
 
O principal **problema** do modo contacto é que as mostras biolóxicas (brandas e delicadas) poden danarse. De aí que funcione especialmente ben con mostras fortemente adheridas á superficie. En cristais de proteína, por exemplo, as forzas laterais non modifican a mostra, mais si o fan en moléculas individuais.

#### Modo dinámico 
Nos **modos dinámicos** faise vibrar a micropanca á súa frecuencia de resonancia valéndose para iso do actuador piezoeléctrico. A interacción punta-superficie modifica a amplitude, frecuencia e fase da resonancia, mentres o lazo de realimentación mantén constante algunha destas tres propiedades. A propiedade que se vai manter é o criterio que determina o modo concreto de operación:
* No **modo de non contacto ou de frecuencia modulada** (FM-AFM) (figura b) mantense constante a frecuencia de resonancia. A principal aplicación do FM-AFM é obter topografías de superficies duras a escala atómica e operando no baleiro extremo ou UHV (do inglés *Ultra High Vacuum*).
* No **modo de repeniqueo** ("tapping mode") **ou de amplitude modulada** (AM-AFM) (figura c) mantense constante a amplitude. Utilízase principalmente en medio líquido para obter imaxes de mostras biolóxicas que só son estables en solucións acuosas.

Orixinalmente o uso do modo de non contacto implicaba que a punta se encontraba sempre a distancia constante da superficie, mentres que no modo de repeniqueo a punta batía intermitentemente contra a superficie. Posteriormente, demostrouse que ambos os modos poden ser operados tanto a distancia da mostra coma en contacto con ela.

#### Modos dinámicos en líquido 
No modo dinámico en líquido existen dúas **formas de facer oscilar a micropanca**: 
* Nos **modos acústicos** sitúase o piezoeléctrico, ou ben na parte traseira da cela líquida ou ben baixo a mostra. Nesta caso, o movemento da mostra induce o da micropanca. A principal desvantaxe deste modo é que dá lugar a resonancias moi sucias. 
* Nos **modos electrostático e magnético**, a micropanca faise oscilar mediante un campo eléctrico ou electrostático. A principal desvantaxe deste modo é que hai que metalizar as micropancas.

O modo dinámico en líquido, ademais de tratarse dunha técnica aínda en desenvolvemento, presenta fundamentalmente dous **problemas**: 
# É menos sensible ás forzas da interacción punta-mostra que o modo en aire. Isto é debido á redución na auga da constante de amortecemento, o que provoca que os cambios de frecuencia de resonancia se manifesten na amplitude con menor sensibilidade. 
# Ao existir contacto entre punta e mostra, cómpren micropancas máis brandas con frecuencias de resonancia máis altas.

As **aplicacións** do AFM en líquido son moi variadas: permiten a resolución de problemas estruturais e a caracterización mecánica de proteínas, detectar o funcionamento de proteínas *in situ* (como o despregamento de proteínas) e manipular proteínas individuais.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Bibliografía 
* B. Parkinson: Procedures in Scanning Probe Microscopies. John Wiley and Sons Ltd, 1997.
* R. Wiesendanger: Scanning Probe Microscopy and Spectroscopy - Methods and Applications. Cambridge University Press, Cambridge 1994, ISBN 0-521-42847-5.
* B. Cappella, G. Dietler: Force-distance curves by atomic force microscopy. In: Surface Science Reports. 34, Nr. 1–3, 1999, S. 1–104, doi:10.1016/S0167-5729(99)00003-5.
* Franz Josef Giessibl : Advances in atomic force microscopy. In: Reviews of Modern Physics. 75, Nr. 3, 2003, S. 949–983, doi:10.1103/RevModPhys.75.949.
* Alex de Lozanne: Sensors for Proximal Probe Microscopy. Encyclopedia of Sensors (EOS) (EOS-Online).
* P. West: Introduction to Atomic Force Microscopy: Theory, Practice and Applications (Online).

### Ligazóns externas 
*López EA, Solares SD. O microscopio de forzas atómicas Métodos e aplicacións. Revista da Universidade do Valle de Guatemala, 28, 14-23 (2014).
* How AFM works