Metilación do ADN

[miniatura|300px|Ilustración dunha molécula de [ADN que é metilada nas dúas citosinas do centro. A metilación do ADN xoga un importante papel na regulación xénica epixenética durante o desenvolvemento e enfermidades.]]

A **metilación do ADN** é un proceso polo cal se engaden grupos metilo ao ADN. A metilación modifica a función do ADN, actuando normalmente para suprimir a transcrición de xenes. A metilación do ADN é esencial para o desenvolvemento normal e está asociada cun número de procesos clave como a impronta xenómica, inactivación do cromosoma X, supresión dos elementos repetitivos, e a carcinoxénese.

Poden metilarse dous dos catro nucleótidos do ADN, a citosina e a adenina. A metilación da adenina está restrinxida aos procariotas. A taxa de metilación da citosina do ADN difire moito entre especies: o 14% das citosinas están metilads na planta *Arabidopsis thaliana*, o 4% no rato *Mus musculus*, o 2,3% na bacteria *Escherichia coli*, o 0,03% na mosca *Drosophila*, e practicamente ningún (6)GTGC e GCAC(N6)GTT.

### Clonación molecular 
A maioría das cepas utilizadas polos biólogos moleculares son derivadas de *E. coli* K-12, e posúen tanto metilases Dam coma Dcm, pero disponse comercialmente de cepas que son dam-/dcm- (carecen da actividade de ambas as metilases). De feito, é posible desmetilar o ADN extraído de cepas dam+/dcm+ transformándoas en cepas dam-/dcm-. Isto axuda a dixerir as secuencias que non son recoñecidas por encimas de restrición sensibles á metilación.

O encima de restrición DpnI pode recoñecer os sitios 5'-GmeATC-3' e dixerir o ADN metilado. Como ese é un motivo curto, aparece frecuentemente en secuencias por casualidade, e o seu uso principal en investigación é degradar ADNs molde despois de PCRs (os produtos de PCR carecen de metilación, xa que na reacción non están presentes metilases). De xeito similar, algúns encimas de restrición comerciais son sensibles á metilación nos seus sitios de restrición cognados, e deben, como se mencionou antes, utilizarse sobre ADN pasado por cepas dam-/dcm- para permitir o corte.

## Detección 
A metilación do ADN pode detectarse utilizando as seguintes probas científicas:
* Espectrometría de masas. É un método analítico fiable e moi sensible para detectar a metilación do ADN. Porén, non dá información sobre o contexto da secuencia da metilación, polo que está limitada ao estudo da función desta modificación do ADN.
* PCR específica de metilación (MSP). Está baseada nunha reacción química do bisulfito de sodio co ADN que converte as citosinas non metiladas de dinucleótidos CpG en uracilos ou UpG, seguido dunha PCR tradicional. Non obstante, as citosinas metiladas non se converten neste proceso, e deséñanse cebadores que se solapan ao sitio CpG que interesa, o que permite determinar o estado de metilación ou non metilación.
* Secuenciación de bisulfito de xenoma completo, tamén coñecida como BS-Seq. É unha análise de xenoma completo de alto rendemento da metilación do ADN. Está baseada na antes mencionada conversión do bisulfito de sodio do ADN xenómico, que é despois secuenciado nunha plataforma de secuenciación da seguinte xeración. As secuencias obtidas son despois realiñadas co xenoma de referencia para determinar os estados de metilación dos dinucleótidos CpG baseándose na falta de concordancia nos apareamentos de bases resultantes da conversión das citosinas non metiladas en uracilos.
* O ensaio HELP. Está baseado na capacidade diferencial dos encimas de restrición de recoñecer e cortar os sitios CpG do ADN metilados e non metilados.
* Ensaios ChIP-on-chip. Baseados na capacidade de anticorpos preparados comercialmente de unirse a proteínas asociadas á metilación do ADN como MeCP2.
* Escaneo xenómico de puntos de referencia de restrición. É un ensaio complicado e agora escasamente utilizado baseado no recoñecemento diferencial feito por encimas de restrición de sitios CpG metilados e non metilados. En concepto este ensaio é similar ao ensaio HELP.
* Inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP). É análoga á inmunoprecipitación da cromatina. Esta inmunoprecipitación utilízase para illar fragmentos de ADN metilados para entradas (*input*) nos métodos de detección de ADN como as micromatrices de ADN (MeDIP-chip) ou secuenciación de ADN (MeDIP-seq).
* Pirosecuenciación de ADN tratado con bisulfito. Consiste na secuenciación dun amplicón feito por un cebador "cara adiante" normal, pero un cebador inverso biotinilado para someter a PCR o xene de elección. O pirosecuenciador analiza despois a mostra ao desnaturalizar o ADN e engadir un nucleótido de cada vez á mestura segundo unha secuencia dada polo usuario. Se hai unha falta de concordancia na complementariedade de bases, esta é rexistrada e anótase a porcentaxe de ADN na cal está presente a discordancia. Isto proprociona unha porcentaxe de metilación por illa CpG.
* Ensaio de luz de rotura molecular para a actividade de ADN adenina metiltransferase. É un ensaio que se basea na especificidade do encima de restrición DpnI para os sitios GATC completamente metilados (metilación da adenina) en oligonucleótidos etiquetados cun fluoróforo e un *quencher*. A adenina metiltransferase metila os sitios do oligonucleótido facéndoo un substrato da DpnI. O corte do oligonucleótido pola DpnI dá lugar a un incremento da fluorescencia.
* Southern blot sensible ao metilo. É similar ao ensaio HELP, aínda que usa técnicas de Southern blot para sondar diferenzas na metilación específicas de xene usando dixestión de restrición. Esta técnica utilízase para avaliar a metilación local preto do sitio de unión da sonda.
* Utilízanse proteínas de unión a metilCpG (MBPs) e proteínas de fusión que conteñen o Dominio de Unión ao Metilo (MBD) para separar o ADN nativo en fraccións metiladas e non metiladas. A porcentaxe de metilación de illas CpG concretas pode determinarse cuantificando a cantidade de dianas en cada fracción. A detección extremadamente sensible pode conseguirse en tecidos FFPE con detección baseada na abscrición.
* Análise de fusión de alta resolución (*High Resolution Melt*, HRM ou HRMA), é unha técnica analítica post-PCR. O ADN diana é tratado con bisulfito de sodio, que converte quimicamente as citosinas non metiladas en uracilos, mentres que se preservan as citosinas metiladas. Despois realízase unha amplificación por PCR con cebadores deseñados para amplificar tanto os moldes metilados coma os non metilados. Despois desta amplificación, as secuencias de ADN moi metiladas conteñen un alto número de sitios CpG en comparación cos moldes non metilados, o cal ten como resultado que presenten unha diferente temperatura de fusión que pode utilizarse na detección da metilación cuantitativa.
* Reconstrución da metilación de ADN antigo. É un método para reconstruír a metilación de ADN de alta resolución a partir de mostras de ADN antigo (por exemplo de fósiles). O método está baseado nos procesos de degradación natural que ocorren no ADN antigo: co tempo, as citosinas metiladas son degradadas en timinas, mentres que as citosinas non metiladas son degradadas a uracilos. Esta asimetría nos sinais de degradación foi utilizada para reconstruír os mapas de metilación completos dos homes de Neanderthal e de Denisova 

## Rexións metiladas diferencialmente (DMRs) 
As rexións metiladas diferencialmente (DMRs), son rexións xenómicas que presentan diferentes estados de metilación en diversas mostras biolóxicas (tecidos, células, individuos ou outros), e son consideradas como posibles rexións funcionais implicadas na regulación xénica transcricional. A identificación de DMRs en múltiples tecidos (T-DMRs) proporciona unha visión xeral das diferenzas epixenéticas entre tecidos humanos. As DMRs entre mostras de tecidos cancerosos e normais (C-DMRs) demostran que os cancros teñen unha metilación anormal. Sábese tamén que a metilación do ADN está asociada coa diferenciación e a proliferación celular. Moitas DMRs encontráronse en certos estados de desenvolvemento (D-DMRs)  e en células reprogramadas (R-DMRs). Ademais, hai DMRs intraindividuais (Intra-DMRs) que presentan cambios lonxitudinais na metilación de ADN global conforme aumenta a idade dun individuo dado. Hai tamén DMRs inter-individuais (Inter-DMRs) que teñen diferentes patróns de metilación en distintos individuos.
 
As Rexións Metiladas Diferencialmente Cuantitativas (QDMR, *Quantitative Differentially Methylated Regions*) son unha estratexia cuantitativa para cuantificar as diferenzas de metilación e identificar as DMRs en perfís de metilación de xenoma completo adaptando a entropía de Shannon (https://web.archive.org/web/20151023040525/http://bioinfo.hrbmu.edu.cn/qdmr/). A natureza das QDMR de ser de independentes de plataforma e especie fainas potencialmente aplicables a varios conxuntos de datos de metilación. Esta aproximación proporciona unha ferramenta efectiva para a identificación de alto rendemento das rexións funcionais implicadas na regulación epixenética. A QDMR pode utilizarse como unha ferramenta efectiva para a cuantificación das diferenzas de metilación e a identificación de DMRs en mostras múltiples.

A análise de conxuntos de xenes (*gene-set*, tamén chamada análise de vías; xeralmente usando ferramentas como DAVID, GoSeq ou GSEA) está moi nesgada cando se aplica a datos de metilación de alto rendemento (por exemplo, MeDIP-seq, MeDIP-ChIP, HELP-seq etc.), e por esa razón moitos estudos informaron incorrectamente da hipermetilación de xenes relacionados co desenvolvemento e a diferenciación; suxeriuse que isto pode corrixirse usando permutacións de etiquetas de mostras ou utilizando un modelo estatístico para controlar as diferenzas nos números de sondas CpG / sitios CpG dirixidas a cada xene.

## Predición por computador 
A metilación do ADN pode tamén ser detectada por medio de modelos computacionais que usan complexos algoritmos e métodos.
Os modelos computacionais poden facilitar os perfís globais de metilación do ADN nos cromosomas, e con frecuencia ditos modelos son máis rápidos e baratos que outros métodos para realizar ensaios biolóxicos.
Estes modelos computacionais postos ao día inclúen Bhasin, *et al.*, Bock, *et al*., e Zheng, *et al*.

Xunto cos ensaios biolóxicos, estes métodos facilitan enormemente a análise da metilación do ADN.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* 5-Hidroximetilcitosina
* 5-Metilcitosina
* 7-Metilguanosina
* Axente desmetilante
* Desmetilación do ADN
* Epixenética
* Impronta xenómica
* MethDB, base de datos de metilación do ADN
* N6-Metiladenosina
* Reprogramación

### Bibliografía 
* 
* 
* 
* 

### Ligazóns externas 
* 
* ENCODE threads explorer Non-coding RNA characterization. Nature
* PCMdb Pancreatic Cancer Methylation Database. Nature Scientific Report 4:4197