Clonación molecular

miniatura|350px|Diagrama dunha clonación molecular usando bacrterias e plásmidos.

A **clonación molecular** ou **clonación de xenes** é un conxunto de métodos experimentais de bioloxía molecular que se usan para ensamblar moléculas de ADN recombinante e para dirixir a súa replicación dentro dun organismo hóspede. Utilízase o termo *clonación* para indicar que o método implica a replicación dunha molécula por un método no que se vai producir unha poboación de células que teñen moléculas de ADN idénticas. Outros tipos de clonación son a clonación celular e a clonación de organismos. A clonación molecular usa xeralmente secuencias de ADN procedentes de dous organismos distintos: a especie que é a fonte do ADN que se vai clonar, e a especie que servirá como hóspede vivo para a replicación do ADN recombinante. Os métodos de clonación molecular son básicos en moitas áreas da bioloxía molecular e medicina contemporáneas.

Nun experimento convencional de clonación molecular, o ADN que se vai clonar obtense dun organismo de interese, despois trátase con encimas no tubo de ensaio para xerar fragmentos de ADN máis pequenos. Despois, estes fragmentos combínanse cun vector de ADN para xerar moléculas de ADN recombinantes. O ADN recombinante introdúcese seguidamente nun organismo hóspede (normalmente unha cepa de laboratorio de *Escherichia coli* fácil de cultivar e benigna). Isto xerará unha poboación de organismos na cal as moléculas de ADN recombinante se replican ao mesmo tempo que se replica o ADN do hóspede. Como estes organismos conteñen fragmentos de ADN alleos son microorganismos transxénicos ou modificados xeneticamente (OMX). Este proceso aproveita o feito de que unha soa célula bacteriana pode ser inducida a captar e replicar unha soa molécula de ADN recombinante. Esta única célula pode despois ser expandida exponencialmente para xerar unha gran cantidade de bacterias, cada unha das cales contén copias da molécula recombinante orixinal. Así, tanto a poboación bacteriana resultante, coma a molécula de ADN recombinante, denomínanse comunmente "clons". Falando estritamente, o *ADN recombinante* refírese a moléculas de ADN, mentres que *clonación molecular* refírese aos métodos usados para ensamblalas e introducilas nas células.

## Historia da clonación molecular 
Antes da década de 1970, a comprensión da xenética e bioloxía molecular estaba gravemente dificultada pola incapacidade de illar e estudar xenes individuais de organismos complexos. Isto cambiou totalmente cando apareceron os métodos de clonación molecular. Os microbiólogos que trataban de comprender os mecanismos moleculares por medio dos cales as bacterias restrinxían a replicación no seu interior de bacteriófagos, illaron endonucleases de restrición, encimas que podían cortar (clivar) moléculas de ADN cando encontraban nelas certas secuencias de nucleótidos específicas. Descubriron que os encimas de restrición clivaban moléculas de ADN de lonxitude cromosómica en sitios específicos, e que as seccións específicas dunha molécula longa podían purificarse por fraccionamento por tamaños. Usando un segundo encima chamado ADN ligase, podían unir os fragmentos xerados polos encimas de restrición formando novas combinacións, orixinando o que se denominou ADN recombinante. Ao recombinaren segmentos de ADN de interese cun vector de ADN, como un bacteriófago ou un plásmido, os cales se replican de forma natural dentro da bacteria, os científicos podían producir grandes cantidades de ADN recombinante purificado en cultivos bacterianos. As primeiras moléculas de ADN recombinantes xeráronse e estudáronse en 1972.

## Introdución 
A clonación molecular aprovéitase de que a estrutura química do ADN é fundamentalmente a mesma en todos os organismos vivos. Por tanto, se calquera segmento de ADN de calquera organismo se insire nun segmento de ADN que contén as secuencias moleculares que son necesarias para a replicación do ADN, e o ADN recombinante resultante se introduce no organismo no cal se obtiveran ditas secuencias, o ADN alleo replicarase á vez que o ADN da célula hóspede no organismo transxénico.

A clonación molecular é similar á reacción en cadea da polimerase (PCR) en que permite a replicación da secuencia de ADN. A diferenza fundamental entre estes dous métodos é que a clonación molecular implica a replicación do ADN nun organismo vivo, mentres que a PCR replica o ADN nunha solución *in vitro*, sen células vivas.

## Pasos a seguir nunha clonación molecular 
En experimentos de clonación convencionais, a clonación de calquera fragmento de ADN implica esencialmente seguir sete pasos: (1) elixir un organismo hóspede e o vector de clonación, (2) preparación do vector de ADN, (3) preparación do ADN que se vai clonar, (4) creación do ADN recombinante, (5) introdución do ADN recombinante no organismo hóspede, (6) selección de organismos que conteñen ADN recombinante, (7) detección e selección dos clons coa inserción do ADN desexado e propiedades biolóxicas procuradas.

Aínda que se pode facer a planificación dunha clonación en calquera editor de texto, e usar ferramentas on line para, por exemplo, o deseño de cebadores de PCR, existe tamén software específico para ese mester. Ese software inclúe por exemplo ApE http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ (de código aberto), DNAStrider http://sourceforge.net/projects/dnastrider/ (de código aberto), Serial Cloner https://web.archive.org/web/20151015025451/http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html (gratuíto) e Collagene http://collagene.org/  (de código aberto).

### Elección do organismo hóspede e o vector de clonación 
Aínda que se usan unha gran variedade de organismos hóspedes e vectores de clonación molecular, a gran maioría dos experimentos de clonación molecular empezan usando unha cepa de laboratorio da bacteria *Escherichia coli* e un vector de clonación plásmido. *Escherichia coli* e os vectores plásmidos teñen un uso tan común porque son tecnicamente sofisticados, versátiles, están doadamente dispoñibles, e facilitan un crecemento rápido dos organismos recombinantes requirindo un mínimo equipamento. ou un cromosoma artificial de lévedo.

Certas aplicacións especializadas poden necesitar sistemas hóspede-vector especializadas. Por exemplo, se os experimentadores queren colleitar unha determinada proteína a partir do organismo recombinante, entón elíxese un vector de expresión que contén sinais apropiados para a transcrición e a tradución no organismo hóspede desexado. Alternativamente, se o que se pretende é a replicación do ADN en diferentes especies (por exemplo, a transferencia de ADN desde bacterias a plantas), pode seleccionarse un vector cun rango de múltiples hóspedes (tamén chamado vector lanzadeira). Porén, na práctica, os experimentos de clonación molecular especializados xeralmente empezan cunha clonación nun plásmido bacteriano, seguida da subclonación no vector especializado.

Sexa cal for a combinación do hóspede e o vector utilizada, o vector case sempre contén catro segmentos de ADN que teñen unha importancia esencial para a súa función e utilidade experimental, que son os seguintes: (1) unha orixe de replicación do ADN, que cómpre para que se replique o vector (e as secuencias recombinantes ligadas a el) dentro do organismo hóspede, (2) un ou máis sitios de recoñecemento de endonuclease de restrición únicos que funcionan como sitios nos que se pode introducir o ADN alleo, (3) un xene que sirva de marcador xenético seleccionable que pode utilizarse para permitir a supervivencia das células que captaron as secuencias vectoras, e (4) un xene adicional que pode usarse para detectar cales células conteñen o ADN alleo.

### Preparación do ADN que se vai clonar 
Para clonar ADN xenómico, extráese o ADN que se quere clonar do organismo de interese. Pode usarse virtualmente calquera fonte de tecido (mesmo tecidos de animais extintos ), con tal de que o ADN non estea moi degradado. O ADN é despois purificado usando métodos simples para eliminar as proteínas contaminantes (extracción con fenol), ARN (ribonuclease) e moléculas máis pequenas (precipitación e/ou cromatografía). Tamén se usan a miúdo métodos con reacción en cadea da polimerase (PCR) para a amplificación de secuencias de ADN ou ARN específico (RT-PCR) antes da clonación molecular.

O ADN para os experimentos de clonación pode obterse tamén a partir dun ARN usando o encima transcriptase inversa (é ADN complementario ou clonación de ADNc), ou en forma de ADN sintético (síntese de xenes artificial). A clonación do ADNc utilízase xeralmente para obter clons representativos da poboación de ARNm das células de interese, mentres que se usa o ADN sintético para obter calquera secuencia precisa definida polo deseñador.

O ADN purificado é despois tratado cun encima de restrición para xerar fragmentos con extremos que poden ser ligados aos do vector. Se é necesario, poden engadirse segmentos de ADN curtos de dobre cadea (*linkers*) que conteñen os sitios de restrición desexados para crear estruturas nos extremos que sexan compatibles co vector. En cultivos celulares de mamíferos, o proceso análogo de introducir o ADN nas células denomínase normalmente transfección. Tanto a transformación coma a transfección adoitan requirir a preparación das células por medio dun réxime de crecemento especial e un proceso de tratamento químico que variará coa especie concreta e os tipos celulares que se usen.

A electroporación utiliza pulsos eléctricos de alta voltaxe para translocar o ADN a través da membrana plasmática (e da parede celular se está presente). A diferenza disto, a transdución implica o empaquetamento do ADN en partículas derivadas de virus, e a utilización destas partículas similares a virus para introducir na célula o ADN encapsulado por medio dun proceso que lembra as infeccións virais. Aínda que a electroporación e a transdución son métodos moi especializados, poden ser os métodos máis eficaces para introducir o ADN nas células.

### Selección de organismos que conteñan as secuencias vector 
Calquera que sexa o método que se utilice, a introdución do ADN recombinante no organismo hóspede elixido é xeralmente un proceso de baixa eficacia; é dicir, só unha pequena fracción das células captarán realmente o ADN. Os científicos experimentais enfróntanse a este problema realizando unha selección xenética artificial, na cal as células que non captaron o ADN son matadas selectivamente, e só sobreviven aquelas células que poden replicar o ADN activamente que conteñen un xene marcador seleccionable codificado polo vector. e a insulina recombinante, usada para tratar algunhas formas de diabetes), (2) proteínas que poden administrarse como axuda para resolver unha urxencia médica potencialmente mortal (por exemplo, o activador do plasminóxeno dos tecidos, usado para tratar os accidentes cerebrovasculares), (3) vacinas de subunidades recombinantes, nas cales unha proteína purificada pode utilizarse para inmunizar os pacientes contra doenzas infecciosas, sen expoñelos ao axente infeccioso (por exemplo, a vacina da hepatite B), e (4) proteínas recombinantes usadas como material estándar para probas de diagnóstico de laboratorio.

### Organismos transxénicos 
Os xenes clonados, unha vez caracterizados e manipulados para proporcionar sinais para unha apropiada expresión, poden ser inseridos nos organismos, xerando organismos transxénicos, tamén chamados organismos modificados xeneticamente (OMX ou GMO). Aínda que a maioría dos OMX se xeran para utilizalos en investigación biolóxica básica (ver por exemplo, os ratos transxénicos), algúns OMX desenvolvéronse para o seu uso comercial, que vai desde o de animais e plantas que producen fármacos e outros compostos, a plantas agrícolas resistentes a herbicidas, e peixes tropicais fluorescentes (GloFish) para acuarios. O segundo tipo de terapia xénica é a “terapia xénica de células somáticas”, que é substancialmente análoga a un transplante de órganos. Neste caso, diríxese o tratamento sobre un ou máis tecidos específicos ou extráese o tecido, engádese o xene ou xenes terapéuticos no laboratorio, e devólvense as células tratadas ao paciente. As probas clínicas da terapia xénica de células somáticas empezaron a finais da década de 1990, principalmente para o tratamento de cancros e trastornos do sangue, fígado e pulmóns.

Malia a moita publicidade que tivo e o prometedora que é a técnica, a historia da terapia xénica humana caracterizouse por ter un éxito relativamente limitado. O efecto de introducir un xene nas células a miúdo promove só un alivio parcial ou transitorio dos síntomas da doenza que se quere tratar. Algúns pacientes de ensaios de terapia xénica sufriron consecuencias adversas polo propio tratamento, e houbo casos de mortes. Nalgúns casos, os efectos adversos orixínanse da alteración de xenes esenciais do xenoma do paciente por inactivación insercional. Noutros, os vectores virais usados para a terapia xénica foran contaminados con virus infecciosos. Non obstante, a terapia xénica aínda se considera unha futura área prometedora da medicina, e é unha área na que se está a realizar un significativo esforzo de investigación e desenvolvemento.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Clonación