Topoisomerase tipo II

As **topoisomerases tipo II** son topoisomerases que cortan ambas as febras da hélice do ADN simultaneamente para solucionar os enredos e superenrolamentos do ADN. Usan a hidrólise do ATP, a diferenza da tipoisomerase tipo I. Neste proceso, estes encimas cambian o número de enlace (ou índice de ligazón) do ADN circular en ±2. As topoisomerases son encimas ubicuos, atopados en todos os organismos vivos.

En animais a topoisomerase II é unha diana da quimioterapia. En procariotas a xirase é unha diana antibacteriana. Estes encimas son interesantes para unha ampla variedade de efectos.

## Función 
As topoisomerases tipo II aumentan ou diminúen o número de enlace dun bucle de ADN en 2 unidades, e promoven o desenredo dos cromosomas. Por exemplo, a ADN xirase, unha topoisomerase de tipo II de *Escherichia coli* e da maioría dos demais procariotas, introduce superenrolamentos negativos e diminúe o número de enlace en 2. A xirase tamén pode eliminar os nós do cromosoma bacteriano. Xunto coa xirase, a maioría dos procariotas tamén conteñen unha segunda topoisomerase tipo IIA, denominada topoisomerase IV. A xirase e a topoisomerase IV diferéncianse nos seus dominios C-terminais, que se cre determinan a especificidade do substrato e a funcionalidade destes dous encimas. A determinación das pegadas de xirase (*footprints*) indica que a xirase, que forma unha pegada de 140 pares de bases e envolve o ADN, introduce superenrolamentos negativos, mentres que a topoisomerase IV, que as forma de 28 pares de bases, non envolve o ADN.

As topoisomerases tipo II eucariotas non poden introducir superenrolamentos; só poden relaxalos.

As funcións das topoisomerases tipo IIB coñécense menos. A diferenza das topoisomerases de tipo IIA, as de tipo IIB non poden simplificar a topoloxía do ADN (ver máis abaixo), senón que comparten varias características estruturais coas topoisomerases IIA.

## Simplificación da topoloxía 
As topoisomerases tipo IIA son esenciais para a separación de febras fillas enredadas durante a replicación. Esta función crese que a realiza a topoisomerase II en eucariotas e pola topoisomerase IV en procariotas. Os fallos á hora de separar estas febras orixina a morte da célula, As topoisomerases tipo IIA teñen a capacidade especial de relaxar o ADN a un estado por debaixo do de equilibrio termodinámico, unha cracterística diferente da que presentan as topoisomerases de tipo IA, IB e IIB. Esta capacidade, coñecida como simplificación da topoloxía, foi identificada por Rybenkov et al. A hidrólise do ATP causa esta simplificación, pero aínda non se coñece un mecanismo molecular claro desta simplificación. Propuxéronse varios modelos para explicar este fenómeno, incluíndo dous modelos que dependen da capacidade das topoisomerases tipo IIA de recoñecer dúplex de ADN dobrados. A bioquímica, a microscopia electrónica e as recentes estruturas coñecidas de topoisomerases II unidas ao ADN revelan que as topoisomerases tipo IIA se unen aos ápices do ADN, o que apoia este modelo.

## Clasificación 
Hai dúas subclases de topoisomerase de tipo II: IIA e IIB.

* As topoisomerases tipo IIA comprenden os encimas ADN xirase, topoisomerase II eucariota (topo II), e topoisomerase IV bacteriana (topo IV). Estes encimas abranguen todos os dominios da vida e son esenciais para a función.
* As topoisomerases tipo IIB son distintos desde o punto de vista estrutural e bioquímico, e o membro prototípico é a topoisomerase VI (topo VI). As topoisomerases tipo IIB encóntranse en arqueas e algunhas plantas superiores.

Algúns organismos, incluíndo os humanos, teñen dúas isoformas de topoisomerase II: alfa e beta. En cancros, a topoisomerase IIα exprésase profusamente en células proliferantes. En certos cancros, como os tumores da vaíña de nervios periféricos, a alta expresión da súa proteína codificada está tamén asociada a un mal prognóstico de supervivencia do paciente.

As dúas clases de topoisomerases posúen un mecanismo de paso de febra similar e estrutura de dominios (ver abaixo), pero tamén teñen importantes diferenzas. As topoisomerases tipo IIA forman roturas de dobre febra con extremos colgantes que sobresaen de catro pares de bases, mentres que as topoisomerases tipo IIB forman roturas de dobre febra con extremos que sobresaen de dúas bases. Ademais, as topoisomerases tipo IIA poden simplificar a topoloxía do ADN, e a rexión ATPase da topoisomerase II de lévedos foron resoltas en complexo con AMPPNP (un análogo do ATP), mostrando que dous dominios de ATPase se dimerizan para formar unha conformación pechada. Na xirase, a estrutura ten un burato substancial no medio, que se supón é onde se acomoda o segmento T (T de transporte).

Unindo o dominio ATPase co pregamento Toprim hai un elemento helicoidal coñecido como dominio transdutor. Este dominio pénsase que comunica o estado nucleótido do dominio ATPase co resto da proteína. Modificacións deste dominio afectan a actividade da topoisomerase, e ao traballo estrutural feito polo grupo liderado por Verdine mostra que o estado con ATP afecta a orientación do dominio transdutor.

O núcleo central da proteína contén un pregamento Toprim e un núcleo de unión ao ADN que contén un dominio de hélice alada (WHD), a miúdo denomoinado dominio CAP, xa que foi identificado inicialmente como parecido á proteína activadora por catabolito WHD. A tirosina catalítica sitúase neste WHD. O pregamento Toprim é un pregamento Rossmann que contén tres residuos ácidos invariantes que se coordinan con ións magnesio implicados na clivaxe do ADN e na religazón do ADN. A estrutura do pregamento Toprim e o núcleo de unión ao ADN da topoisomerase II de lévedos foi resolta por primeira vez por Berger e Wang, e o primeiro núcleo de unión ao ADN de xirase resolvérono Morais Cabral et al. A estrutura resolta por Berger revelou importantes pistas sobre a función do encima. O núcleo de unión ao ADN consta do WHD, o cal orixina un dominio torre. Unha rexión superenrolada orixina un dominio C-terminal que forma a principal interface do dímero para este estado cristalino (que se adoita denominar porta C). Aínda que a estrutura da topoisomerase II orixinal mostra unha situación na que os WHDs están separados por unha gran distancia, a estrutura de xirase mostra unha conformación pechada, na cal os WHDs están próximos.

O núcleo da topoisomerase II foi posteriormente resolto en novas conformacións, entre elas unha resolta por Fass et al. e outra por Dong et al. A estrutura de Fass mostra que o dominio Toprim é flexible e que esta flexibilidade pode permitir que dito domino se coordine co WHD para formar un complexo de clivaxe competente. Isto foi finalmente solucionado pola estrutura obtida por Dong et al., que foi resolta en presenza de ADN. Esta última estrutura mostrou que o dominio Toprim e o WHD formaban un complexo de clivaxe moi similar ao das topoisomerases de tipo IA e indicaba que a unión e clivaxe do ADN podían estar desacopladas, e a estrutura obtida mostrou que o ADN estaba dobrado uns ~150 graos á altura dunha isoleucina invariante (na topoisomerase II é a I833 e na xirase é a I172). Este mecanismo de dobramento lembra o da integración do factor hóspede (IHF) e HU, que son dúas proteínas arquitecturais de bacterias. Ademais, aínda que as estruturas previas do núcleo de unión ao ADN tiñan a porta C pechada, esta estrutura capturou a porta aberta, un paso clave no mecanismo de dúas portas (ver abaixo).

Máis recentemente, resolvéronse varias estruturas con ADN unido nun intento de comprender tanto o mecanismo químico para a clivaxe do ADN coma as bases estruturais da inhibición da topoisomerase por velenos antibacterianos. A primeira arquitectura completa da ADN xirase de *Escherichia coli* resolveuse por microscopia crioelectrónica a unha resolución case atómica. O complexo da nucleoproteína foi capturado cun longo dúplex de ADN e xepotidacina, un novo inhibidor de topoisomerase bacteriano.

A rexión C-terminal das topoisomerases procariotas resolveuse en moitas especies. A primeira estrutura dun dominio C-terminal de xirase resolvérono Corbett et al. e o dominio C-terminal da topoisomerase IV resolvérono Corbett et al. As estruturas formaban un novo barril beta, que dobra o ADN ao envolver o ácido nucleico ao seu arredor. Propúxose que o dobramento do ADN pola xirase era un mecanismo clave na capacidade da xirase de intoducir superenrolamentos negativos no ADN. Isto é consistente con datos de pegadas de xirase que mostran que a xirase ten unha pegada de 140 pares de bases. Tanto os dominios C-terminais de xirase coma de topoisomerase IV dobran o ADN, mais só a xirase introduce superenrolamentos negativos.

A diferenza da función ben coñecida do dominio C-terminal das topoisomerases procariotas, a función desta rexión na topoisomerase II eucariota aínda non está clara. Os estudos suxeriron que esta rexión está regulada por fosforilación e isto modula a actividade da topoisomerase, aínda que cómpre facer máis investigacións.

### Tipo IIB 
miniatura|upright=2|Estrutura da topo VI () nunha orientación similar ao exemplo de lévedo. As cadeas están coloreadas de xeito distinto. O dominio Toprim queda na parte de arriba e o dominio de ATPase na parte inferior; cada unha forma unha porta ADN.

A organización das topoisomerases tipo IIB é similar a das de tipo IIA, excepto en que todas as de tipo IIB proceden de dous xenes e forman heterotetrámeros. Un xene, denominado topo VI-B (xa que lembra a gyrB), contén o dominio de ATPase, un dominio transdutor (), e un dominio H2TH de pregamento similar a Ig C-terminal (). O segundo xene, denominado topo VI-A (), contén o WHD e o dominio Toprim.

O dominio ATPase da topo VI B resolveuse en moitos estados nucleotídicos. Lembra estreitamente ao dominio GHKL da topo II e MutL e mostra que o estado nucleotídico (ADP fronte a ATP) ten efectos na orientación do dominio transdutor.

A estrutura da topo VI-A foi resolta por Bergerat et al. mostrando que o HTH e o pregamento Toprim teñen unha nova conformación comparada coa da topo IIA.

Resolveuse recentemente unha estrutura do complexo topo VI A/B, mostrando unha conformación aberta e pechada, que son dous estados preditos polo mecanismo de dúas portas (ver máis abaixo). Estas estruturas, das cales unha é unha estrutura de cristalografía de raios X e a outra é unha reconstrución de dispersión de raios X de ángulo pequeno (SAXS), mostran que o dominio ATPase pode estar aberto ou pechado.

## Mecanismo de acción 
### Paso da febra 
A topoisomerase tipo IIA opera por un mecanismo de "dúas portas" ou cancelas (*two gates*, que é unha notación histórica), que está apoiado pola bioquímica e por traballos estruturais.

Unha febra de ADN, chamada a porta (*gate*) ou segmento G, únese a unha porta de unión ao ADN central (porta ADN). Unha segunda febra de ADN, chamada o transporte ou segmento T, captúrase por dimerización do dominio ATPase N-terminal (porta ATPase) cando se unen dúas moléculas de ATP. A hidrólise de ATP e a liberación dun fosfato inorgánico leva á clivaxe do segmento G, e as tirosinas catalíticas forman un enlace fosfotirosina covalente no extremo 5' do ADN. Isto crea un tramo colgante sobresaínte de catro bases e unha rotura de dobre febra no segmento G. A medida que a porta de unión ao ADN se separa, o segmento T transfírese a través do segmento G. O segmento G sélase, causando que a porta C-terminal (porta C) se abra, permitindo a liberación do segmento T. A liberación do produto ADP orixina a reiniciación do sistema, e permite que se capture un segundo segmento T.

As topoisomerases tipo IIB funcionan de xeito similar, excepto que a proteína forma un colgante de dúas bases no segmento G e a porta C-terminal está completamente ausente.

### Clivaxe do ADN 
No mecanismo de paso da febra, a clivaxe do ADN é esencial para que o segmento T poida transferirse a través do segmento G. O mecanismo de clivaxe do ADN polas topoisomerase tipo IIA foi recentemente obxecto de moitos estudos bioquímicos e de boloxía estrutural.

## Catenación 
A catenación é o proceso polo cal dúas febras de ADN circulares se ligan entre si como elos dunha cadea. Isto ocorre despois da replicación do ADN, onde dúas febras simples se concatenan e poden seguir replicándose pero non separarse en células fillas distintas. Como as topoisomerases tipo II poden romper unha febra dobre, poden reparar ese estado (as topoisomerases tipo I poden facer isto soamente se hai xa unha amosega de febra simple), e a célula filla pode seguir tendo o número correcto de cromosomas. O ADN liñal en eucariotas é tan longo que pode considerarse na práctica como se non tivese extremos; as topoisomerases tipo II son necesarias por esa razón.

## Inhibición 
As pequenas moléculas que se unen ás topoisomerases tipo II divídense en dúas clases: inhibidores e velenos. Debido á súa presenza frecuente nas células eucariotas proliferantes, os inhibidores das topoisomerases tipo II foron estudados intensamente e utilizados como medicamentos contra o cancro.

* Entre os inhibidores das topoisomerases tipo II están HU-331, ICRF-187, ICRF-193 e mitindomida. Estas moléculas funcionan inhibindo a actividade de ATPase ao actuaren como inhibidores non competitivos para o ATP. Isto demostrouse en estudos estruturais

Os velenos de topoisomerases foron amplamente usados en terapias anticancro e antibacterianos. Aínda que os compostos antibacterianos como a ciprofloxacina afectan á xirase bacteriana, non conseguen inhibir as topoisomerases tipo IIA eucariotas. Ademais, as bacterias resistentes a fármacos a miúdo teñen unha mutación puntual na xirase (Serina79Alanina en *E. coli*) que fai que as quinolonas non sexan efectivas. Estudos estruturais recentes levaron ao descubrimento dun composto que xa non depende destes residuos e, por tanto, é eficaz contra as bacterias resistentes a fármacos.

## Xirase do bacteriófago T4 
A xirase do bacteriófago T4 (unha topoisomerase tipo II) é unha proteína multisubunidade que consta dos produtos dos xenes 39, 52 e probablemente 60. Cataliza a relaxación do ADN superhelicoidal negativo ou positivo e emprégase na replicación do ADN do fago durante a infección do hóspede bacteriano *E. coli*. O xene da proteína 52 do fago comparte homoloxía coa subunidade gyrA da xirase de *E. coli* e o xene da proteína 39 do fago comparte homoloxía coa subunidade gyrB. Como a ADN xirase do hóspede *E. coli* pode compensar parcialmente a perda dos produtos do xene do fago T4, os mutantes defectivos nos xenes 39, 52 ou 60 non suprimen completamente a replicación do ADN do fago, senón que atrasan o seu inicio. Os mutantes defectivos nos xenes 39, 52 ou 60 mostran un aumento da recombinación xenética así como un aumento das mutacións por substitución de bases e delecións suxerindo que a síntese de ADN compensada polo hóspede é menos exacta que a dirixida polo fago de tipo silvestre. Un mutante defectivo no xene 39 mostra un aumento de sensibilidade á inactivación por irradiación ultravioleta durante o estadio de infección do fago despois da iniciación da replicación do ADN cando están presentes moitas copias do cromosoma do fago. Os mutantes defectivos nos xenes 39, 52 e 60 presentan unha redución da capacidade de levar a cabo a reactivación de multiplicidade, unha forma de reparación recombinacional que pode tratar con diferentes tipos de danos no ADN. A especificidade da xirase polo xenoma de bacteias *E. coli* non infectadas tamén parece participar na reparación recombinacional proporcionando un punto de iniciación para o intercambio de febras recíproca impulsada pola proteína RecA.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Bibliografía 
* 

### Ligazóns externas 
*