Operón lac

O '*operón *lac'''* é un operón (sistema xenético regulador) necesario para a regulación do transporte e metabolismo da lactosa na bacteria *Escherichia coli* e algunhas outras bacterias entéricas. O operón consta dun promotor e rexións reguladoras no ADN e ten tres xenes estruturais adxacentes aos que controla, chamados *lacZ*, *lacY*, e *lacA*, os cales codifican os encimas β-galactosidase, lactosa permease, e tiogalactósido transacetilase (ou galactósido O-acetiltransferase), respectivamente.

Na natureza o operón *lac* permite a utilización da lactosa pola bacteria (que vai ser utilizada como fonte de enerxía). A lactosa permease, que se encontra na membrana plasmática, transporta lactosa á célula. A β-galactosidase, que é un encima citoplasmático, cliva posteriormente o azucre lactosa orixinando o glicosa e galactosa. Como é un gasto inútil de enerxía producir os encimas cando non hai lactosa dispoñible ou cando hai unha fonte de enerxía máis fácil de utilizar, como a glicosa, nesas situacións eses xenes están inactivados pola regulación feita polo operón. A regulación xénica do operón *lac* foi o primeiro mecanismo xenético regulador que se chegou a comprender claramente e é un dos principais exemplos de regulación xénica en procariotas. O operón *lac* é un dos modos máis básicos de explicar como un represor encimático funciona sobre o ADN da célula, e por esa razón o exemplo exponse en moitos libros e programas introdutorios de bioloxía celular e molecular.

Esquema do operón *lac*.
miniatura|250px|O operón *lac*. Arriba: Reprimido. Abaixo: Activo. 
*'*1*: ARN polimerase, *2*: Represor, *3*: Promotor, *4*: Operador, *5*: Lactosa, *6*: *lacZ*, *7*: *lacY*, *8*: *lacA*.

O operón *lac* operon utiliza un mecanismo de control que consta de dúas partes para asegurar que a célula gasta enerxía en producir os encimas codificados polo operón *lac* só cando é necesario. Está controlado principalmente polo represor *lac*, que detén a produción de encimas en ausencia de lactosa, e polo EIIAGlc, que corta a produción de lactosa permease cando se está a transportar glicosa á célula. Este mecanismo de control dual causa a utilización secuencial da glicosa e a lactosa en dúas fases distintas do crecemento da bacteria, o que se coñece como diauxia.

## Estrutura do operón *lac* 
[miniatura|300px|Estrutura da lactosa e dos produtos da súa clivaxe por [hidrólise.]]

O operón *lac* consta de tres xenes estruturais, un promotor, un terminador, un regulador, e un operador. Os tres xenes estruturais son: *lacZ*, *lacY*, e *lacA*.
:* *lacZ* codifica o encima β-galactosidase (ou LacZ), que é un encima intracelular que cliva o disacárido lactosa nos seus dous compoñentes os monosacáridos glicosa e galactosa.
:* *lacY* codifica o encima β-galactósido permease (LacY), un transportador de membrana de tipo simportador que bombea lactosa ao interior da célula utilizando un gradiente de protóns.
:* *lacA* codifica o encima β-galactósido transacetilase (LacA), un encima que transfire un grupo acetilo desde o acetil-CoA a β-galactósidos.
Só os xenes *lacZ* e *lacY* parecen ser estritamente necesarios para o catabolismo da lactosa.

### Nomenclatura xenética 
Utilízanse abreviacións de tres letras empezando con maiúscula e con letra normal para describir os fenotipos de bacterias como *E. coli*.

Son exemplos:
* Lac (capacidade de utilizar lactosa). Neste caso, as células de tipo salvaxe son Lac+ e poden utilizar a lactosa como fonte de carbonos e enerxía, mentres que o mutante Lac- non a pode usar.
* His (capacidade de sintetizar o aminoácido histidina).
* Mot (motilidade natatoria).
* SmR (resistencia ao antibiótico estreptomicina).

As mesmas tres letras utilízanse normalmente para designar os xenes implicados nun determinado xenotipo, pero esta vez escritas con minúscula e en cursiva. Cada xene diferente distínguese cunha letra adicional; por exemplo os xenes *lac* que codifican os tres encimas do operón *lac* denomínanse *lacZ*, *lacY*, e *lacA*. Hai un cuarto xene *lac* que é *lacI*, que codifica o represor da lactosa, no que "I" significa *inducibilidade*.

O uso actual designa as proteínas codificadas por un xene coas mesmas letras en maiúscula e normais (non cursivas). Así, LacZ é o produto proteico (a β-galactosidase) do xene *lacZ*.

Varias secuencias curtas que non son xenes pero tamén afectan á expresión xénica son o promotor *lac* ou *lac p*, e o operador *lac* ou *lac o*. Aínda que non é estritamente un uso estándar, as mutacións que afectan a *lac o* denomínanse *lac o*c, por razóns históricas.

## Regulación 
O control específico dos xenes *lac* depende da dispoñibilidade do substrato lactosa para a bacteria. A bacteria non produce estas proteínas cando a lactosa non está dispoñible como fonte de carbono. Os xenes *lac* están organizados nun operón; é dicir, están orientados na mesma dirección uns detrás dos outros no cromosoma e son cotranscritos nunha soa molécula de ARNm policistrónico. A transcrición de todos os xenes empeza coa unión do encima ARN polimerase (RNAP), que é unha proteína que se une ao ADN nun sitio de unión específico do ADN, que é o promotor, situado inmediatamente *augas arriba* do xene. Na unión da ARN polimerase ao promotor colabora a proteína activadora por catabolito (CAP) unida á adenosina monofosfato cíclica ou AMPc (a CAP tamén se chama proteína receptora do AMPc). Desde esta posición a ARN polimerase avanza para transcribir os tres xenes (*lacZYA*) nun ARNm. As secuencias de ADN do operón *lac* de *E. coli*, do ARNm lacZYA, e dos xenes *lacI * están dispoñibles en GenBank (ver).

**Resposta á lactosa**. Este primeiro mecanismo de control é a resposta reguladora á lactosa, que utiliza unha *proteína reguladora* intracelular chamada *represor da lactosa* para dificultar a produción de β-galactosidase en ausencia de lactosa. O xene *lacI* que codifica o represor sitúase preto do operón *lac* e exprésase sempre (*constitutivamente*). Se desaparece a lactosa do medio de crecemento, o represor únese moi fortemente a unha curta secuencia de ADN situada *augas abaixo* do promotor preto do inicio de *lacZ* chamada *operador lac*. A unión do represor ao operador interfire coa unión da ARN polimerase ao promotor, e deste modo a transcrición do ARNm que codifica LacZ e LacY apenas pode realizarse a moi baixos niveis. polo contrario, cando as célula crecen en presenza de lactosa, fórmase un metabolito da lactosa chamado alolactosa, que se une ao represor, causando un cambio na súa forma. Este cambio de conformación altera o represor de tal xeito que é incapaz de unirse ao operador, o que permite que a ARN polimerase poida transcribir os xenes *lac* e facendo que aumenten os niveis das proteínas codificadas nos xenes.

**Resposta á glicosa**. O segundo mecanismo de control é unha resposta á glicosa, que é transportada dentro da célula bacteriana polo sistema da fosfotransferase dependente de PEP. O grupo fosfato do fosfoenolpiruvato (PEP) transfírese por medio dunha fervenza de fosforilación que consta das proteínas do sistema PTS (sistema da fosfotransferase) xerais HPr e EIA e as proteínas PTS específicas da glicosa EIIAGlc e EIIBGlc, que é o dominio citoplasmático do transportador de glicosa EII. O transporte de glicosa é acompañado pola súa fosforilación por EIIBGlc, tomando o grupo fosfato das outras proteínas PTS, como EIIAGlc. A forma desfosforilada de EIIAGlc únese á permease *lac* e impide que esta transporte máis lactosa ao interior da célula. Por tanto, se están presentes tanto a glicosa coma a lactosa, o transporte de glicosa bloquea o transporte do indutor do operón *lac*. Este proceso denomínase *exclusión do indutor*.

**Resumo**. En consecuencia as situacións que se poden dar son:
* Hai glicosa: operón inactivo. A célula usa a glicosa tanto se hai lactosa como se non. A lactosa non a usa.
* Non hai glicosa nin lactosa: operón inactivo.
* Non hai glicosa pero si lactosa: operón activo. A célula usa a lactosa.

### Natureza multimérica do represor 
miniatura|dereita|300px|**A LacI tetramérica únese a dúas secuencias operadoras e induce a formación dun bucle no ADN**. Dúas subunidades funcionais diméricas de *LacI* (vermello+azul e verde+laranxa) únense á secuencia operadora do ADN (indicada). Estas dúas subunidades funcionais están acopladas á rexión de tetramerización (indicada); deste modo, a *LacI* tetramérica únese a dúas secuencias operadoras. Isto permite que a *LacI* tetramérica induza a formación do bucle no ADN.

O represor lac é unha proteína tetrámera de subunidades idénticas. Cada subunidade contén un motivo hélice-xiro-hélice (HTH) que pode unirse ao ADN. O sitio operador onde se une o represor é unha secuencia de ADN con simetría repetida invertida. Os dous medios sitios no ADN do operador xuntos únense a dúas das subunidades do represor tetramérico. As outras dúas subunidades do represor non teñen función neste modelo, pero esta propiedade non se comprendeu durante moitos anos.

Finalmente, descubriuse que están implicados dous operadores adicionais na regulación *lac*. Un (chamado O3) sitúase ao final do xene *lacI* e o outro (O2) está situado a 400 pares de bases *augas abaixo* na parte inicial do *lacZ*. Estes dous sitios non foron atopados nas primeiras investigacións porque teñen funcións redundantes e as mutacións individuais non afectan moito á represión. Unha soa mutación en O2 ou O3 ten só efectos na desrepresión nun factor de 2 ou 3. Con todo, a súa importancia demóstrase polo feito de que un mutante dobre defectivo tanto en O2 coma en O3 é drasticamente desreprimido (nun factor de 70).

No modelo actual, o represor está unido simultaneamente tanto ao principal operador O1 coma a O2 ou a O3. O ADN intercalado forma un bucle desde o complexo. A natureza redundante dos dous operadores menores suxire que non é importante a formación dun complexo en bucle específico. Unha idea é que o sistema funciona por medio de ligaduras (*tethering*). Se o represor unido se libera de O1 momentaneamente, a unión a un operador menor manteno na súa veciñanza, para que poida volverse a unir rapidamente. Isto incrementaría a afinidade do represor por O1.

#### Mecanismo de indución 
miniatura|250px|Operón *lac*. '''*1*: ARN polimerase, *2*: Represor, *3*: Promotor, *4*: Operador, *5*: Lactosa, *6*: *lacZ*, *7*: *lacY*, *8*: *lacA*.
** **Arriba**: O xene está esencialmente desactivado. Non hai lactosa que inhiba o represor, así que o represor se une ao operador, o cal obstrúe a unión da ARN polimerase ao promotor e a formación de encima. 
**Abaixo'*: O xene está activado. A lactosa está inhibindo ao represor, o que permite que a ARN polimerase se una ao promotor, os xenes exprésanse e prodúcese o encima. Finalmente, o encima dixire toda a lactosa, ata que non hai ningunha para que se una ao represor. O represor agora pode unirse ao operador, facendo parar a produción de encima.
[miniatura|150px|[IPTG.]] 
[miniatura|150px|[orto-nitrofenil-β-galactósido ou ONPG.]] 
[miniatura|150px|[X-gal.]]
[miniatura|150px|[alolactosa.]]
O represor é unha proteína alostérica, é dicir, pode adoptar dúas formas algo distintas, que están en equilibrio entre si. Nunha das súas formas o represor únese ao operador do ADN co cal ten alta especificidade, e na outra forma perde esa especificidade. Segundo o modelo clásico de indución, a unión do indutor, sexa a alolactosa ou o IPTG, ao represor afecta á distribución das dúas formas do represor. Así, o represor unido a un indutor está estabilizado na conformación que non se une ao ADN. Con todo, este modelo simple non pode explicar todo o fenómeno, porque o represor está unido bastante establemente ao ADN, pero libérase rapidamente coa adición do indutor, polo que quedan cousas por coñecer sobre este mecanismo de unión.

### Análogos da lactosa 
Describíronse varios derivados ou análogos da lactosa que son útiles para traballar co operón *lac*. Estes compostos son principalmente galactósidos substituídos, nos que en vez do residuo glicosa da lactosa teñen outro grupo químico. Son os seguintes:

* Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG). Utilízase frecuentemente como indutor do operón *lac* en traballos fisiolóxicos. O IPTG únese ao represor e inactívao, pero non é un substrato da β-galactosidase. Unha vantaxe do IPTG nos estudos *in vivo* é que como non pode ser metabolizado por *E. coli* a súa concentración permanece constante e o grao de expresión dos xenes controlados polo *lac p/o*, non é unha variable no experimento. A captación de IPTG é dependente da acción da lactosa permease en *Pseudomonas fluorescens*, pero non en *E. coli*.
* Fenil-β-D-galactosa (fenil-Gal). É un substrato da β-galactosidase, pero non inactiva o represor e, por tanto, non é un indutor. Como as células de tipo salvaxe producen moi pouca β-galactosidase, non poden crecer con fenil-Gal como fonte de carbono e enerxía. Os mutantes que carecen de represor son capaces de crecer con fenil-Gal. Así, medios mínimos que conteñan só fenil-Gal como fonte de carbono e enerxía son selectivos para mutantes do represor e mutantes do operador. Se sementamos 108 células dunha cepa de tipo salvaxe nunha placa de ágar que contén fenil-Gal, as escasas colonias que crecen son principalmente mutantes espontáneos para o represor. A distribución relativa de mutantes do represor e o operador está afectada polo tamaño da diana. Como o xene *lacI* que codifica o represor é 50 veces máis grande que o operador, os mutantes do represor predominan na selección.
* Outros compostos que serven de indicadores coloreados da actividade da β-galactosidase son:
** Orto-nitrofenil-β-galactósido (ONPG). Este composto é clivado para producir o composto intensamente amarelo ortonitrofenol, e utilízase comunmente como un substrato para ensaios de β-galactosidase *in vitro*.
** X-gal. As colonias que producen β-galactosidase vólvense azuis co X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido).
* Alolactosa. É un isómero da lactosa producido naturalmente na célula e é o indutor do operón *lac*. A lactosa é o disacárido galactosa-(β1→4)-glicosa, mentres que a alolactosa é galactosa-(β1→6)-glicosa. A lactosa convértese en alolactosa pola β-galactosidase nunha rección alternativa á hidrolítica. Un experimento fisiolóxico que demostra o papel de LacZ na produción do "verdadeiro" indutor en células de *E. coli* é a observación de que un mutante nulo de *lacZ* pode aínda producir permease LacY cando crece con IPTG pero non cando crece con lactosa. A explicación é que o procesamento da lactosa a alolactosa (catalizado pola β-galactosidase) é necesario para producir o indutor dentro da célula.

## Desenvolvemento do modelo clásico 
Os descubridores deste operón, François Jacob e Jacques Monod utilizaron nos seus experimentos a bacteria, *E. coli*, pero moitos dos conceptos básicos sobre regulación que descubriron son fundamentais para a regulación celular de todos os organismos. A idea básica é que as proteínas non se sintetizan cando non se necesitan. *E. coli* conserva os seus recursos celulares e enerxía ao non producir as tres proteínas do operón *lac* cando no hai necesidade de metabolizar a lactosa, como cando hai outros azucres máis facilmente metabolizables como a glicosa. Na seguinte sección discútese como *E. coli* controla certos xenes en resposta ás necesidades metabólicas.

Durante a segunda guerra mundial, Monod estaba probando os efectos de combinacións de azucres como fontes de nutrientes para *E. coli* e *Bacillus subtilis*. Monod seguía estudos similares que levaran a cabo outros científicos con bacterias e lévedos. Atopou que as bacterias que crecían con dous diferentes azucres a miúdo mostraban dúas fases de crecemento. Por exemplo, se dispoñían de glicosa e lactosa, metabolizábase primeiro a glicosa (fase I de crecemento, ver figura 2) e despois a lactosa (fase II de crecemento). A lactosa non era metabolizada durante a primeira parte dunha curva de crecemento diáuxico porque non se produce β-galactosidase cando están presentes no medio á vez a glicosa e a lactosa. Monod denominou a este fenómeno diauxia.
miniatura|dereita|200px|Figura 2: Curva de crecemento bifásica atopada por Monod.

Monod enfocou entón a súa atención na indución da formación de β-galactosidase que ocorría cando o único azucre no medio de cultivo era a lactosa.

### Clasificación dos mutantes reguladores 
Un grande avance conceptual de Jacob e Monod foi recoñecer a distinción entre substancias reguladoras e sitios onde actúan para cambiar a expresión xénica. Jacob, que foi un antigo soldado, utilizou a analoxía dun bombardeiro que libera o seu cargamento letal segundo a recepción dun sinal especial dun radiotransmisor. Un sistema que funcione require tanto un transmisor en terra coma un receptor no avión. Agora, supoñamos que o transmisor está avariado. O sistema pode poñerse a funcionar se introducimos un segundo transmisor funcional. Pero, dixo, se consideramos que o bombardeiro ten un receptor defectuoso, o comportamento "deste" bombardeiro non poderá cambiarse pola introdución dun segundo avión funcional.

Para analizar os mutantes reguladores do operón *lac*, Jacob desenvolveu un sistema polo cal podía introducirse unha segunda copia dos xenes *lac* (*lacI* co seu promotor, e *lacZYA* co seu promotor e operador) nunha soa célula. Un cultivo de tales bacterias, que son diploides só para os xenes *lac* pero polo demais son normais, pode comprobarse para o fenotipo regulador. En concreto, determínase se se producen LacZ e LacY mesmo en ausencia de IPTG (debido a que o *represor da lactosa* producido polo xene mutante non é funcional). Este experimento, no cal os xenes ou agrupacións de xenes son probados por pares, chámase *proba de complementación*.
center|500px

Esta proba ilústrase na figura (*lacA* foi omitido para maior simplicidade). Primeiro, móstranse certos estados haploides (é dicir, a célula leva unha soa copia dos xenes *lac*). No panel, (a) mostra a represión, (b) mostra a indución por IPTG, e (c) e (d) mostran o efecto dunha mutación no xene *lacI* ou no operador, respectivamente. No panel, (e) mostra a proba de complementación para o represor. Se unha copia dos xenes *lac* leva unha mutación en *lacI*, pero a segunda copia é de tipo salvaxe para *lacI*, o fenotipo resultante é normal, pero lacZ exprésase cando se expón ao indutor IPTG. As mutacións que afectan ao represor dise que son *recesivas* para o tipo salvaxe (e que o tipo salvaxe é *dominante*), e isto explícase porque o represor é unha pequena proteína que pode difundir na célula. A copia do operón *lac* adxacente ao xene *lacI* defectivo é efectivamente desactivada pola proteína producida pola segunda copia do *lacI*.

Se o mesmo experimento se leva a cabo utilizando unha mutación no operador, obtense un resultado diferente (panel (f)). O fenotipo dunha célula que leve un mutante e un sitio operador de tipo salvaxe é que se producen LacZ e LacY mesmo en ausencia do indutor IPTG; porque o sitio operador danado non permite a unión do represor para inhibir a transcrición dos xenes estruturais. A mutación do operador é dominante. Cando está danado pola mutación o sitio operador onde debe unirse o represor, a presenza dun segundo sitio funcional na mesma célula non produce ningunha diferenza na expresión dos xenes controlados polo sitio mutante.

Unha versión máis sofisticada deste experimento usa operóns *marcados* para distinguir entre as dúas copias dos xenes *lac* e mostrar que o xene ou xenes estruturais non regulados son os que están despois do operador mutante (panel (g). Por exemplo, supoñamos que se marca unha copia por medio dunha mutación que inactiva *lacZ* para que só poida producir a proteína LacY, mentres que a segunda copia leva unha mutación que afecta a *lacY* e só pode producir LacZ. Nesta versión, só a copia do operón *lac* que está adxacente ao operador mutante poderá expresarse sen IPTG. Dise que a mutación do operador é *cis-dominante*, é dicir, é dominante para o tipo salvaxe pero afecta só á copia do operón que está inmediatamente adxacente a el.

Esta explicación é un pouco enganosa nun importante sentido: procede dunha descrición do experimento e despois explica os resultados segundo un modelo. De feito, a miúdo é certo que o que se fai primeiro é o modelo, e despois o experimento deséñase especificamente para comprobar ese modelo. Monod primeiro imaxinou que debería haber un *sitio* no ADN coas propiedades do operador, e despois deseñou a súa proba de complementación para demostrar iso.

A dominancia dos mutantes no operador tamén suxire un procedemento para seleccionalos especificamente. Se seleccionamos nun cultivo do tipo salvaxe os mutantes reguladores utilizando fenil-Gal, como se describiu máis arriba, as mutacións no operador son raras comparadas cos mutantes no represor porque o tamaño da diana é pequeno. Pero se en vez de facelo así, empezamos cunha cepa que leva dúas copias da rexión *lac* completa (que é diploide para *lac*), non se obteñen aparentemente mutacións no represor (que aínda ocorren), porque a complementación polo segundo xene *lacI* salvaxe fai que teña un fenotipo salvaxe. Polo contrario, a mutación dunha copia no operador fai que apareza un fenotipo mutante, porque é dominante sobre o segunda copia de tipo salvaxe.

## Uso en bioloxía molecular 
O xene *lac* e os seus derivados son moi axeitados para ser usados como xenes reporteiros en varias técnicas de selección baseadas en cultivos bacterianos, como a análise de dous híbridos, na cal debe determinarse a unión exitosa dun activador transcricional a unha secuencia promotora específica. En placas LB que conteñen o produto X-gal, o cambio de cor de colonias brancas a escuras ou azuis corresponde coa presenza no cultivo de 20-100 unidades de β-galactosidase, mentres que en medios de tetrazolio lactosa e MacConkey lactosa o rango é de 100-1000 unidades, e son máis sensibles nas partes alta e baixa dese rango, respectivamente. Como os medios MacConkey lactosa e tetrazolio lactosa dependen dos produtos da degradación da lactosa, requiren a presenza á vez dos xenes *lacZ* e *lacY*. Hai moitas técnicas de fusión *lac* que inclúen só o xene *lacZ'', que son axeitadas para as placas X-gal  ou caldos líquidos ONPG.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Ligazóns externas 
* 
* Virtual Cell Animation Collection Presentando: O operón lac 
* O operón lac: Bozeman Science
* Tinguidura de embrións de rato completos para a actividade da β-galactosidase (lacZ)