Electroforese en xel de ácidos nucleicos

[200px|miniatura|Impresión dixital dunha [electroforese en xel de agarosa do ADN dun plásmido.]]
A **electroforese en xel de ácidos nucleicos** é unha técnica analítica usada para separar fragmentos de ADN ou ARN polo seu tamaño e reactividade. As moléculas de ácidos nucleicos que deben ser analizadas colócanse nun medio viscoso, o xel, onde se xera un campo eléctrico que induce que os ácidos nucleicos (que teñen carga negativa debido aos seus fosfatos) migren cara ao ánodo (que ten carga positiva porque forma parte dunha célula electrolítica e non dunha célula galvánica). A separación destes fragmentos realízase aproveitando as distintas mobilidades coas que atravesan o xel moléculas de diferente tamaño. As moléculas máis longas migran máis lentamente porque o xel lles presenta máis resistencia. Como o tamaño da molécula afecta a súa mobilidade, os fragmentos pequenos acaban máis preto do ánodo que os máis longos nun período de tempo dado. Pasado certo tempo, retírase a voltaxe e analízase o gradiente de fragmentación. Para conseguirmos separacións máis grandes entre fragmentos de tamaños similares, hai que incrementar ou a voltaxe ou o tempo de funcionamento. Con maiores tempos de funcionamento con voltaxes baixas no xel conséguense as resolucións máis precisas. Porén, a voltaxe non é o único factor que determina a electroforese de ácidos nucleicos.

O ácido nucleico que hai que separar pode prepararse de varias maneiras antes da separación por electroforese. No caso de grandes moléculas de ADN, o ADN é frecuentemente cortado en fragmentos máis pequenos usando unha endonuclease de restrición de ADN (ou encima de restrición). Noutros casos, como en mostras amplificadas nunha PCR, os encimas presentes na mostra que poderían afectar a separación das moléculas son eliminados por varios procedementos antes da análise. Unha vez que o ácido nucleico foi adecuadamente preparado, as mostras da solución de ácidos nucleicos sitúanse nos pozos do xel e aplícase voltaxe ao xel durante un tempo especificado.

Os fragmentos de ADN de diferentes lonxitudes visualízanse usando unha tinguidura fluorescente específica para o ADN, como o bromuro de etidio. O xel mostra bandas correspondentes a diferentes poboacións de moléculas de ácido nucleico con diferentes pesos moleculares. O tamaño dos fragmentos indícase normalmente en "nucleótidos", "pares de bases" ou "kb" (quilobases) dependendendo de se se separou un ácido nucleico monocatenario ou bicatenario. A determinación do tamaño dos fragmentos faise tipicamente por comparación con marcadores de ADN dos que se dispón comercialmente, que conteñén fragmentos lineares de ADN de lonxitudes coñecidas.

Os tipos de xel máis usados na electroforese de ácidos nucleicos son os de agarosa (para moléculas de ADN relativamente longas) e poliacrilamida (para unha alta resolución con moléculas curtas de ADN, por exemplo na secuenciación de ADN). Os xeles utilízanse convencionalmente en forma de láminas ("slabs"), pero a electroforese de capilaridade fíxose tamén importante para aplicacións como a secuenciación de ADN de alto rendemento. As técnicas de electroforese usadas na valoración de danos no ADN poden ser a electroforese en xel alcalina e a electroforese en xel de campo pulsado.

Para segmentos curtos de ADN como os ADN bicatenarios de 20 a 60 bp, a utilización dun xel de poliacrilamida (PAGE) dá unha mellor resolución (condición nativa). De xeito similar, o ARN e o ADN monocatenario poden separarse e visualizarse por xeles de PAGE que conteñan axentes [desnaturalizantes como a [urea. Os xeles PAGE son amplamente utilizados en técnicas como a pegada dactilar de ADN, EMSA e outras técnicas de interacción ADN-proteínas.

A medida e a análise fanse principalmente cun software especializado de análise de xeles. Os resultados da electroforese capilar móstranse xeralmente como un electroferograma.

## Factores que afectan a migración dos ácidos nucleicos 
Varios factores poden afectr a migración dos ácidos nucleicos: a dimensión dos poros do xel, a voltaxe usada, a forza iónica dos tampóns e a concentración da tinguidura de intercalación, como o bromuro de etidio se foi utilizado durante a electroforese.

### Tamaño do ADN 
O xel criba o ADN polo tamaño da molécula do ADN de modo que as moléculas menores viaxan máis rápido. O ADN bicatenario móvese a unha velocidade que é aproximadamente inversamente proporcional ao logaritmo do número de pares de bases. Esta relación, porén, desaparece con fragmentos de ADN moi grandes e non é posible separalos usando a electroforese en xel de agarosa estándar. O límite de resolución depende da composición do xel e da forza do campo, e a mobilidade do ADN circular máis grande pode ser máis fortemente afectada polo tamaño do poro do xel que a do ADN linear. Para a separación de fragmentos de ADN moi grandes cómpre unha electroforese en xel de campo pulsado (PFGE). Na electroforese en xel de inversión de campo (FIGE, un tipo de PFGE), é posible ter unha "inversión de banda", onde as moléculas grandes poden moverse máis rápido que as pequenas.

miniatura|280px|Os xeles de preparacións de plásmidos xeralmente mostran unha gran banda de ADN superenrolado con outras bandas máis febles no mesmo carreiro do xel. Nótese que por convención o xel do ADN preséntase cos fragmentos de ADN máis pequenos preto da parte baixa do xel. Isto é así porque historicamente os xeles de ADN se poñían a funcionar en posición vertical e os fragmentos menores de ADN movíanse cara a abaixo máis rápido.

### Conformación do ADN 
A conformación das moléculas de ADN pode afectar significativamente ao movemento do ADN; por exemplo, o ADN superenrolado xeralmente móvese máis rápido que o ADN relaxado porque está apertadamente enrolado e, por tanto, é máis compacto. Nunha preparación de plásmidos de ADN normal, poden estar presentes múltiples formas de ADN, e o xel da electroforese dos plásmidos mostrará normalmente unha banda principal, que contería a forma con superenrolaento negativo, mentres que outras formas do ADN poden aparecer en bandas menores máis débiles. Estas bandas menores poden ser ADN cortado (forma circular aberta) e a forma circular pechada relaxada que normalmente corre máis lentamente que o ADN superenrolado e a forma monocatenaria (que pode ás veces aparecer dependendo dos métodos de preparación) pode moverse por adiante do ADN superenrolado. Porén, a velocidade á que se moven as distintas formas pode cambiar usando diferentes condicións de electroforese, por exemplo o ADN linear pode correr máis rápido ou máis lento que o ADN superenrolado dependendo das condicións, e a mobilidade do ADN circular máis grande pode ser máis fortemente afectada que o ADN linear por mor do tamaño de poro do xel.

### Concentración de bromuro de etidio 
O ADN circular é máis afectado pola concentración de bromuro de etidio que o ADN linear se este produto está presente no xel durante a electroforese. Todos os círuclos de ADN naturais están subenrolados, pero o bromuro de etidio que se intercala no ADN circular pode cambiar a carga, lonxitude e tamén pode cambiar a superhelicidade da molécula de ADN, polo que a súa presenza durante a electroforese pode afectar ao seu movemento no xel. Un incremento do bromuro de etido intercalado no ADN pode facer que cambie de ser unha molécula con superenrolamento negativo a unha forma completamente relaxada, e despois a unha superhélice de enrolamento positivo coa máxima intercalación. Pode utilizarse a electroforese en xel de agarosa para resolver o ADN circular cunha topoloxía de superenrolamento diferente.

### Concentración do xel 
A concentración do xel determina o tamaño do poro do xel que afecta a migración do ADN. A resolución do ADN cambia coa porcentaxe de concentración do xel. Incrementar a concentración de agarosa dun xel reduce a velocidade de migración e mellora a separación de moléculas de ADN menores, mentres que diminuír a concentración do xel permite separar moléculas grandes de ADN. Para unha electroforese en xel de agrosa estándar, un 0,7% permite unha boa separación ou resolución de grandes fragmentos de ADN de 5 a 10 kb, mentres que un xel ao 2% dá unha boa resolución de fragmentos pequenos de 0,2 a 1 kb. Pode utilizarse ata un 3% para separar fragmentos moi pequenos, pero un xel de poliacrilamida  vertical sería máis apropiado para resolver fragmentos pequenos. Porén, xeles de altas concentracións requiren tempos de funcionamento maiores (ás veces días) e xeles de altas porcentaxes son a miúdo crebadizos e poden non callar uniformemente. En PGFE ou FIGE deberían utilizarse xeles de agarosa de altas porcentaxes. Os xeles de baixas porcentaxes (0,1−0,2%) son fráxiles e poden romper. Os xeles do 1% son comúns para moitas aplicacións.

### Campo eléctrico aplicado 
A baixas voltaxes, a velocidade de migración do ADN é proporcional á voltaxe aplicada, é dicir, canta maior é a voltaxe, máis rápido se move o ADN. Porén, ao incrementar a forza do campo eléctrico, a mobilidade dos fragmentos de ADN de alto peso molecular aumenta diferencialmente e o rango efectivo da separación diminúe e, por tanto, a resoilución é menor a voltaxes altas. Para unha resolución óptima do ADN de tamaño maior de 2 kb en electroforese en xel estándar, recoméndase de 5 a 8 V/cm. Este fenómeno pode ter como resultado a inversión das bandas, na que os fragmentos de ADN máis grandes se moven máis rápido que os pequenos en PFGE.

## Mecanismo de migración e separación 
As cargas negativas dos fosfatos do ADN fan que este se mva cara ao ánodo cargado positivamente durante a electroforese. Porén, a migación das moléculas de ADN en solución, en ausencia dunha matriz xel, é independente do seu peso molecular durante a electroforese, é dicir, non se produce separación por tamaños sen esa matriz que proporciona o xel. A interacción hidrodinámica entre diferentes partes do ADN é limitada por unha corrente de contraións que se moven na dirección oposta, polo que non existe un mecanismo para xerar unha dependencia da velocidade sobre a lonxitude a unha escala maior que unha lonxitude de cribado duns 10&nbsp;nm. Unha proteína globular ou un ADN con enrolamento en pelota aleatoria (ou *random coil*) móvese a través dos poros conectados que sexan grandes dabondo como para permitirlle pasar, e o movemento das moléculas máis grandes é máis probable que sexa impedido e vaia máis lento polas colisións coa matriz xel, e as moléculas de diferentes tamaños poden así separarase neste proceso de cribado. Existen tamén outros modelos.

A microscopía de fluorescencia en tempo real de moléculas tinguidas mostrou unha dinámica mais sutil durante a electroforese, na que o ADN mostraba unha considerable elasticidade, xa que se estiraba alternativamente na dirección do campo aplicado e despois contraíase formando unha bóla, ou tomaba forma de gancho ou de U cando quedaba atrapada por fibras do polímero. Esta observación pode denominarse modelo "eiruga". Outro modelo propón que o ADN queda enredado na matriz do polímero e canto máis grandes son as moléculas máis probable é que queden enredadas e que o seu movemento quede dificultado.

## Visualización 
miniatura|250px|Electroforese en xel do ADN

A tinguidura máis usada para facer visibles as bandas de ADN ou ARN nunha electroforese en xel de agarosa é o bromuro de etidio ou EtBr. Este fluoresce baixo a luz UV cando queda intercalado no suco maior do ADN (ou no ARN). Facendo pasar ou "correr" o ADN a tavés dun xel tratado con EtBr e visualizándoo baixo a luz UV todas as bandas que conteñen máis de ~20&nbsp;ng de ADN fanse claramente visibles. Como o EtBr pode ser mutaxénico ou tóxico existen alternativas máis seguras, como GelRed, producido por Biotium, que se une ao suco menor.

O SYBR Green I é outra tinguidura para ADN bicatenario, producida por Invitrogen. É máis cara pero 25 veces máis sensible e posiblemente máis segura que o EtBr, aínda que non hai datos sobre a súa mutaxenicidade e toxicidade en humanos.

SYBR Safe é unha variante do SYBR Green que ten niveis bastante baixos de mutaxenicidade e toxicidade como para ser considerado un residuo non perigoso nas regulacións dalgúns países, como nos Estados Unidos. Ten uns niveis de sensibilidade similares ao EtBr, Alternativamente, pode utilizarse unha fonte de excitación de luz azul cunha tinguidura excitable pola luz azul como o SYBR Green ou GelGreen.

A investigación con electroforese en xel adoita aproveitar ferramentas de software de análise de imaxe como ImageJ.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Electroforese en xel de proteínas