Transformación xenética

[miniatura|dereita|350px|[Experimento de Griffith|Experimento no que F. Griffith descubriu a transformación bacteriana na bacteria *Streptococcus*.]]
En bioloxía molecular denomínase **transformación** á alteración xenética dunha célula como resultado da captación a través da membrana celular, incorporación e expresión de material xenético exóxeno (ADN exóxeno) do medio que a rodea. A transformación ten lugar de forma natural nalgunhas especies de bacterias (transformación bacteriana), pero pode tamén efectuarse por medios artificiais noutras células. Para que se produza a transformación, as bacterias deben estar nun estado chamado *competente* ou de *competencia*, que pode acontecer como unha resposta por tempo limitado ás condicións ambientais como escaseza de nutrientes e densidade celular. A transformación é un dos tres procesos polos cales o material xenético exóxeno pode introducirse nunha célula bacteriana; os outros dous son a conxugación bacteriana (na que as células transfiren ADN por contacto directo) e a transdución (na que un virus transporta xenes dunha bacteria a outra). O termo "transformación" pode utilizarse tamén para describir a inserción de novo material xenético en células non bacterianas, como fungos, plantas e animais, pero especialmente para os animais prefírese usar o termo transfección para non confundila coa "transformación" celular que ten lugar durante o cáncer. A introdución de ADN alleo en células eucariotas denomínase "transfección".

## Historia 
A transformación foi descuberta en 1928 polo bacteriólogo británico Frederick Griffith. Griffith estaba traballando co *Streptococcus pneumoniae*, bacteria que ten dúas cepas, unha virulenta ou S e outra non virulenta ou R. Griffith descubriu que a cepa non virulenta de *Streptococcus pneumoniae* podía ser transformada en virulenta se a mesturábamos con bacterias da cepa virulenta mortas por calor. Griffith supuxo que algún "principio transformante" pasaba das células mortas virulentas ás células vivas non virulentas, que dese modo se *transformaban* en virulentas, pero non puido identificar que substancia era o principio transformador. En 1944 Oswald Avery, Colin MacLeod, e Maclyn McCarty identificaron o principio transformador como o ADN, o que serviu para demostrar que o ADN é a molécula que contén a información xenética nas células (o que ata entón se poñía en dúbida). Parte do ADN dos *Streptococcus* S pasaba ás células R, provocando a transformación.

Pensábase inicialmente que *Escherichia coli*, unha bacteria utilizada correntemente como organismo de laboratorio, non podía experimentar transformación. Porén, en 1970, Morton Mandel e Akiko Higa demostraron que *E. coli* pode ser inducida a captar ADN do bacteriófago λ sen ter que utilizar fagos axudantes despois de ser tratada con solucións de cloruro de calcio. Dous anos despois en 1972, Stanley Cohen, Annie Chang e Leslie Hsu demostraron que o tratamento con CaCl2 é tamén efectivo para a transformación de ADN de plásmidos. O método de transformación de Mandel e Higa foi despois mellorado por Douglas Hanahan. O descubrimento da existencia de competencia inducida artificialmente en *E. coli* proporcionou un eficiente e útil procedemento para provocar a transformación de bacterias, que permitiu simplificar os métodos de clonaxe molecular en biotecnoloxía e investigación, e que se converteu nun procedemento de rutina nos laboratorios.

A transformación utilizando electroporación desenvolveuse a finais da década de 1980, e incrementou a eficiencia da transformación in vitro e o número de cepas bacterianas que se podían transformar. A transformación de células animais e vexetais investigouse no primeiro rato transxénico que se creou, inxectando un xene dunha hormona de crecemento da rata nun embrión de rato en 1982. En 1907 descubriuse que a bacteria *Agrobacterium tumefaciens* causaba tumores nas plantas, e a principios da década de 1970 descubriuse que o axente indutor de tumores era un plásmido chamado plásmido Ti. Eliminando os xenes do plásmido que causaban o tumor e engadindo novos xenes os investigadores estiveron en condicións de poder infectar plantas con *A. tumefaciens* para que a bacteria inserise o ADN seleccionado nos xenoma das plantas. Non todas as plantas son susceptibles ás infección por *A. tumefaciens* polo que se desenvolveron métodos alternativos como a electroporación e a microinxección. O bombardeo de partículas fíxose posible coa invención da "pistola (canón, escopeta) de xenes" ou biolística por John Sanford en 1990.

## Mecanismos 
### Bacterias 
A transformación bacteriana pode definirse como o cambio xenético estable producido pola captación de ADN espido (ADN sen células asociadas ou proteínas), e a **competencia** como o estado no que a bacteria pode captar o ADN exóxeno do medio que a rodea. Hai dúas formas de competencia: natural e artificial.

#### Competencia natural 
Aproximadamente o 1% das especies bacterianas poden captar de forma natural ADN nas condicións de laboratorio, e máis especies poden captalo nos seus ambientes naturais. O ADN pode transferirse entre diferentes cepas de bacterias, nun proceso que se denomina transferencia horizontal de xenes. Algunhas especies cando a célula morre liberan o seu ADN que pode ser captado por outras células, pero a transformación funciona mellor con ADN de especies moi emparentadas. Estas bacterias competentes de forma natural teñen conxuntos de xenes que proporcionan a maquinaria proteica necesaria para transportar o ADN a través das membranas celulares. O transporte de ADN exóxeno nas células pode requirir proteínas que están implicadas na ensamblaxe de pili de tipo IV e sistemas de secreción de tipo II (T2SS), xunto cun complexo ADN translocase na membrana plasmática. 
  
Debido ás diferenzas de estrutura das envolturas celulares das bacterias grampositivas e gramnegativas, hai tamén algunhas diferenzas nos mecanismos da captación do ADN entre estas células, pero a maioría delas comparten características comúns que implican a proteínas relacionadas. O ADN únese primeiro á superficie de células competentes nun receptor do ADN, e pasa a través da membrana plasmática utilizando unha ADN translocase. Só pode atravesar o ADN monocatenario, polo que unha nuclease degrada a outra cadea durante o proceso, e o ADN monocatenario translocado pode despois integrarse no cromosoma bacteriano por medio dun proceso dependente de RecA. Nas células gramnegativas, debido á presenza dunha membrana extra, o ADN require a presenza de canais formados por secretinas na membrana externa da súa parede. Poden requirirse pilinas para que exista competencia, pero non está claro. A captación do ADN xeralmente non é específico de secuencia, aínda que nalgunhas especies a presenza de secuencias de captación de ADN específicas pode facilitar a captación eficiente do ADN.

#### Competencia artificial 
A competencia artificial pode inducirse por procedementos de laboratorio nos que primeiro hai que facer a célula pasivamente permeable ao ADN ao expoñela a condicións que normalmente non se darían na natureza. Normalmente o que se fai é incubar as células nunha solución que contén catións divalentes, xeralmente unha solución de cloruro de calcio a temperatura baixa, e despois expoñela a un shock por un pulso de calor. Porén, o mecanismo de captación de ADN por medio da competencia inducida quimicamente por este método de transformación por cloruro de calcio non está claro. A superficie de bacterias como *E. coli* está cargada negativamente debido aos fosfolípidos e lipopolisacáridos da súa superficie, e o ADN está tamén cargado negativamente (deberían repelerse). Unha das funcións do catión divalente sería apantallar as cargas por coordinación dos fosfatos e outras cargas negativas, o que permitiría que a molécula de ADN se adherise á superficie. Suxeriuse que a exposición das células a catións divalentes en condicións frías pode tamén cambiar ou debilitar a estrutura da superficie celular facéndoa máis permeable ao ADN. O pulso térmico pénsase que crea un desequilibrio térmico entre os dous lados da membrana, que forza ao ADN a entrar na célula por poros celulares ou por zonas danadas da parede celular.

A electroporación é outro método de facer a unha célula competente. Neste método as células son sometidas durante breve tempo a un campo eléctrico de 10-20 kV/cm que se pensa crea buratos na membrana celular a través dos cales poden entrar os plásmidos. Despois do shock eléctrico os buratos volven a pecharse rapidamente polos mecanismos de reparación da membrana celulares.

### Lévedos 
A maioría das especies de lévedos, incluíndo *Saccharomyces cerevisiae*, poden ser transformados por ADN exóxeno presente no medio natural ou en condicións de laboratorio. Ao expoñer lévedos intactos a catións alcalinos como os de cesio ou litio as células poden captar plásmidos de ADN. Os últimos protocolos adaptan este método de transformación utilizando acetato de litio, polietilenglicol, e ADN monocatenario. Nestes protocolos, o ADN monocatenario únese preferentemente á parede celular do lévedo, impedindo que o ADN do plásmido faga o mesmo e deixándoo dispoñible para a transformación.

A dixestión encimática, a electroporación, ou a axitación con partículas de cristal  pode utilizarse tamén para a transformación de células de lévedos.

### Plantas 
Existen varios métodos para transferir ADN a células de plantas:
* A transformación mediada pola bacteria *Agrobacterium* é o método máis doado e simple de transformación. O tecido da planta (xeralmente follas) córtase en pequenos cachos, por exemplo, de 10x10mm, e mergúllanse durante 10 minutos nun fluído que contén en suspensión células de *Agrobacterium*. Ao longo da zona do corte algunhas células serán transformadas polas bacterias, as cales inserirán o seu ADN na célula. Situada nun medio seleccionado de crecemento e enraizamento, a planta volverá medrar. Algunhas especies de plantas poden ser transformadas simplemente metendo as súas flores na suspensión de *Agrobacterium* e despois plantando as sementes nun medio selectivo. Pero por desgraza moitas plantas non son transformables por este método.
* Bombardeo con partículas. Prepáranse partículas de ouro ou volframio cubertas de ADN e dispáranse cun aparato en células dunha planta nova ou dun embrión de planta. Parte do material xenético permanecerá dentro das células e causará a súa transformación. Este método tamén permite a transformación dos plastidios das plantas. A eficiencia da transformación é menor ca no método da *Agrobacterium*, pero a maioría das plantas poden ser transformadas deste modo.
* Electroporación. Provócase a formación de pequenos buracos transitorios na membrana celular aplicando rápidos shocks eléctricos; isto permitirá que entre o ADN e transforme a planta.
* Transformación viral (transdución). O material xenético desexado empaquétase dentro dun virus de planta axeitado e inféctase a planta con el. Se o material xenético é ADN, pode recombinarse cun cromosoma e producir células transformantes. Porén, os xenomas da maioría dos virus de plantas son de ARN monocatenario, que se replica no citoplasma da célula infectada. En tales xenomas este método é unha forma de transfección e non unha verdadeira transformación, xa que os xenes inseridos nunca chegan ao núcleo celular e non se integran no xenoma do hóspede. A proxenie das plantas infectadas está libre de virus e tamén libre do xene inserido.

### Animais 
A introdución de ADN en células animais denomínase xeralmente transfección.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Conxugación bacteriana
* Transdución
* Transfección

### Ligazóns externas 
* Animación da transformación bacteriana 
* “Ready, aim, fire!” Bombardeo de células cunha pistola de partículas