Centrifugación

[miniatura|[Centrífuga de laboratorio]]
A **centrifugación** é un proceso mecánico no que se utiliza a forza centrífuga para separar partículas dunha solución de acordo co seu tamaño, forma, densidade, viscosidade do medio e velocidade do rotor.

A velocidade de centrifugación está especificada pola velocidade angular, xeralmente expresada en revolucións por minuto (RPM), ou como aceleración *g*. O factor de conversión entre as RPM e *g* depende do raio do rotor da centrífuga. A velocidade de sedimentación das partículas na centrifugación é función do seu tamaño e forma, aceleración centrífuga, fracción en volume dos sólidos presentes, diferenza de densidades entre a partícula e o líquido, e viscosidade. A aplicación máis común é a separación de sólidos de suspensións altamente concentradas, o cal se usa no tratamento de lodo de augas residuais para deshidratalo cando se producen sedimentos pouco consistentes.

O método de centrifugación ten unha ampla variedade de aplicacións industriais e de laboratorio; non só é un proceso utilizado para separar dúas substancias miscibles, senón tamén para analizar as propiedades hidrodinámicas das macromoléculas. É un dos métodos de investigación máis importantes e máis comunmente utilizados en bioquímica, bioloxía celular e bioloxía molecular. Nas industrias química e alimentaria, as centrífugas especiais poden procesarse nun fluxo continuo de partículas que van sendo separadas en líquidos como o plasma sanguíneo. A centrifugación é tamén o método máis común para conseguir o enriquecemento do uranio, aproveitando a lixeira diferenza de masa entre os isótopos U-238 e U-235 no gas hexafluoruro de uranio.

## Fórmula matemática 
Nunha suspensión líquida moitas partículas ou células caen gradualmente de forma espontánea ao fondo do contedor debido á gravidade; porén, a cantidade de tempo que levan ditas separacións fai que non sexan factibles ou útiles. Outras partículas, que son moi pequenas, non poden illarse en absoluto en solución a non ser que sexan expostas a unha alta forza centrífuga. A medida que a suspensión rota a unha certa velocidade ou revolucións por minuto (RPM), a forza centrífuga permite que as partículas viaxen radialmente afastándose do eixe de rotación. A fórmula xeral para calcular as revolucións por minuto (RPM) dunha centrífuga é:

RPM= \sqrt{g \over r},

onde *g* representa a forza respectiva da centrífuga e *r* o raio desde o centro do rotor ata un punto da mostra.

Cando se compara coa gravidade, a forza da partícula chámase *forza centrífuga relativa* (FCR). É a forza perpendicular exercida sobre os contidos do rotor como resultado da rotación, sempre en relación á gravidade da Terra, a cal mide a forza dos rotores de diferentes tipos e tamaños. Por exemplo, unha FCR de 1000 x g significa que a forza centrífuga é 1000 veces máis forte que a forza gravitacional terrestre. A FCR depende da velocidade de rotación en rpm e a distancia á que están as partículas desde o centro de rotación. A fórmula máis común usada para calcular a FCR é:

FCR = 1,118 \times 10^{-5} \times r \times (rpm)^2,

onde 1,118 \times 10^{-5} é unha constante; *r* é o raio, expresado en centímetros, entre o eixe de rotación e o centro; e *rpm* é a velocidade en revolucións por minuto. Esta é unha aproximación bastante arbitraria, xa que a FCR aplicada é dependente linearmente do raio, así un raio un 10% máis grande significa que se aplica unha FCR un 10% maior á mesma velocidade. De forma aproximada, a fórmula de arriba pode simplificarse a FCR = 10 \times r, cun erro de só o 0,62%.

## A centrifugación na investigación biolóxica 
### Microcentrífugas 
As microcentrífugas están especialmente deseñadas como modelos pequenos que se poñen sobre unha mesa, con rotores lixeiros de pequeno volume capaces de realizar aceleracións rápidas de ata aproximadamente 17.000 rpm. Son aparellos de pouco peso usados principalemtne para centrifugacións en curto espazo de tempo de mostras de ata uns 0,2–2,0 mL. Porén, debido á súa pequena escala, son doadamente trransportables e, se for necesario, poden funcionar nunha habitación fría. As microcentrífugas deseñadas para funcionar a alta velocidade poden acadar ata as 35.000 rpm, dando RCF de ata 30000×g, e denomínanse microcentrífugas de alta velocidade.

### Centrífugas de baixa velocidade 
As centrífugas de baixa velocidade utilízanse para recoller precipitados químicos, células intactas (de animais, plantas e algúns microorganismos), núcleos, cloroplastos, grandes mitocondrias e os fragmentos máis grandes de membrana plasmática. Os gradientes de densidade para purificar células tamén se poden utilizar nestas centrífugas. Os rotores de 
pa basculante (permiten que o tubo varíe de ángulo durante o funcionamento) adoitan usarse moito debido á gran flexibilidade de tamaño de mostra co uso de adaptadores.

### Centrífugas de alta velocidade 
As centrífugas de alta velocidade son usados normalmente para recoller microorganismos, virus, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas e membranas do aparato de Golgi tubulares intactas. A maioría das tarefas simples de precipitación lévanse a cabo con ángulos fixos do rotor. Algúns traballos de gradiente de densidade para purificar células e orgánulos poden realizarse en rotores de pas basculantes, ou no caso de gradientes de Percoll con ángulos de rotor fixos. Utilízanse para recoller todas as vesículas de membrana derivadas da membrana plasmática, retículo endoplasmático e aparato de Golgi, endosomas, ribosomas, subunidades ribosómicas, plásmidos, ADN, ARN e proteínas en rotores de ángulo fixo.

Son as centrífugas máis usadas para a purificación en gradiente de densidade de todas as partículas excepto células, e, aínda que se utilzaron tradicionalmente os rotores basculantes para este propósito, tamén se usan os rotores de ángulo fixo e os rotores verticais, especialmente para gradientes autoxerados e poden mellorar moito a eficiencia da separación. Hai dous tipos de ultracentrífugas: a analítica e a preparativa.

#### Ultracentrifugación analítica 
A ultracentrifugación analítica pode utilizarse para a determinación das propiedades de macromoléculas como a forma, masa, composición e conformación. É unha técnica de análise biomolecular comunmente usada para avaliar a pureza da mostra, para caracterizar os mecanismos de ensamblaxe e desensamblaxe de complexos biomoleculares, para determinar as estequiometrías das subunidades, para identificar e caracterizar os cambios conformacionais macromoleculares e para calcular as constantes de equilibrio e os parámetros termodinámicos para sistemas de autoasociación e heteroasociación. As ultracentrífugas analíticas incorporan un sistema de detección baseado na luz visible/ultravioleta de escaneo para a monitorización en tempo real do progreso da mostra durante un xiro.

As mostas son centrifugadas cunha solución de alta densidade como a sacarosa, cloruro de cesio ou iodixanol. A solución de alta densidade pode estar a unha concentración uniforme a través do tubo de ensaio ou a unha concentración que varía ("gradiente"). As propiedades moleculares poden ser modeladas por análise da velocidade de sedimentación ou análise de equilibrio de sedimentación. Durante o funcionamento, a partícula ou moléculas migran a través do tubo de ensaio a diferentes velocidades dependendo das súas propiedades físicas e as propiedades da solución e finalmente forman un precipitado no fondo do tubo ou bandas a varias alturas.

#### Ultracentrifugación preparativa 
As ultracentrífugas preparativas úsanse a miúdo para separar partículas segundo as súas densidades, illando e/ou recollendo as partículas máis densas no precipitado, e clarificando as suspensións que conteñen partículas. Algúns investigadores tamén usan ultracentrífugas preparativas se necesitan flexibilidade para cambiar o tipo do rotor no instrumento. As ultracentrífugas preparativas poden ser equipadas cunha ampla gama de tipos de rotores, que poden facer xirar as mostras en diferente número, a diferentes ángulos e a distintas velocidades. A fracción soluble de calquera lisado pode despois separarse nos seus compoñentes usando diversos métodos.

### Centrifugación diferencial 
A centrifugación diferencial é o método máis simple de fraccionamento por centrifugación,

Unha suspensión de células sométese a unha serie de ciclos de forza centrífuga crecente para producir unha serie de precipitados que conteñen células cunha velocidade de sedimentación decrecente. O homoxenado inclúe núcleos, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas, láminas de membrana plasmática e un amplo rango de vesículas derivadas dun número de compartimentos de membrana intracelulares e tamén da membrana plasmática, tipicamente nun medio tamponado.

Úsase para separar prtículas baseándose no seu tamaño, forma e densidade utilizando un medio de densidade graduada. Durante unha centrifugación relativamente curta ou lenta, as partículas sepáranse por tamaño, e as partículas maiores sedimentan máis que as máis pequenas. Durante unha centrifugación longa ou rápida, as partículas viaxan a posicións no gradiente nas que a densidade do medio é a mesma que a densidade da partícula; (ρp – ρm) → 0. Por tanto, unha partícula pequena densa sedimenta inicialmente con menor facilidade que unha grande e de baixa densidade. As partículas grandes chegan á súa posición de equilibrio de densidade axiña, mentres que as pequenas partículas migran lentamente a través da zona de grandes partículas e finalmente quedan nunha posición de equilibrio máis profunda no gradiente.

Un tubo que foi centrifugado por este método ten as partículas ordenadas por densidade segundo a altura no tubo. O obxecto ou partícula de interese situarase na posición no tubo correspondente á súa densidade. Non obstante, cando se usa este método son aínda posibles algúns casos de sedimentacións non ideais. O primeiro posible problema é a agregación non desexada das partículas, mais isto pode ocorrer en calquera centrifugación. A segunda posibilidade ocorre cando as pingas de solución que conteñen partículas sedimentan. Isto é máis probable que ocorra cando se traballa cunha solución que ten unha capa de  suspensión flotando nun líquido denso, que, de feito, ten pouco ou ningún gradiente de densidade. Tamén se utiliza na clarificación e estabilización do viño.

En laboratorios forenses e de investigación pode usarse para a separación de urina e compoñentes do sangue. Tamén axuda á separación de proteínas usando técnicas de purificación como a precipitación salina, por exemplo, precipitación de sulfato amónico. Esta técnica tamén ten o seu papel na separación ciclónica, na cal as partículas se separan dun fluxo de aire sen usar filtros. Nun colector ciclónico o aire móvese seguindo un traxecto helicoidal. As partículas con alta inercia sepáranse pola forza centrífuga, mentres que as partículas máis pequenas continúan no fluxo de aire.

As centrífugas utilizáronse en pequena medida para illar compostos máis lixeiros que a auga, como o aceite. Nesas situacións, sepárase a auga dos sólidos cunha gravidade específica maior que 1, que son os produtos buscados.

## Historia 
En 1923 Theodor Svedberg e o seu estudante H. Rinde analizaron soles de gran groso en canto á súa sedimentación gravitacional. Un sol está formado por unha substancia distribuída uniformente noutra substancia, e tamén se chama coloide. Porén, os soles de gran máis fino, como os que contiñan ouro, non podían ser analizados. Unha proteína que se estaba investigando daquela era a hemoglobina. Determinouse que tiña 712 átomos de carbono, 1.130 de hidróxeno, 243 de oxíxeno, 2 de xofre e polo menos 1 átomo de ferro. Isto dáballe á hemoglobina un peso resultante de aproximadamente 16.000 daltons (Da), pero era dubidoso se este valor era un múltiplo de 1 ou de 4 (dependendo do número de átomos de ferro presentes).

Por medio dunha serie de experimentos que utilizaron a técnica do equilibrio de sedimentación, fixéronse dúas importantes observacións: a hemoglobina ten un peso molecular de 68.000 Da, o que indica que ten 4 átomos de ferro e non 1, e que, non importaba de onde se illase a hemoglobina, porque sempre tiña exactamente o mesmo peso molecular. Que a masa dunha molécula tan grande se puidese obter consistentemente e sen importar de que parte do corpo se tomase a mostra, era algo sen precedentes e apoiaba a idea de que as proteínas son macromoléculas e non coloides. Para investigar este fenómeno, cumpría ter unha centrífuga con velocidades incluso maiores, e creouse a ultracentrífuga para aplicar a teoría da sedimentación-difusión. Coa ultracentrífuga determinouse a mesma masa molecular e a presenza dun límite de espallamento suxería que era unha soa partícula compacta. Ulteriores aplicacións da centrifugación mostraron que en diferentes condicións as grandes partículas homoxéneas podían desfacerse en subunidades discretas. O desenvolvemento da centrifugación foi un grande avance na ciencia das proteínas experimental.

Linderstorm-Lang descubriu en 1937 que podían utilizarse tubos de gradiente de densidade para medidas de densidade. Descubriu isto cando traballaba co virus PYDV, que afecta a pataca. Este método tamén se utilizou no famoso experimento de Meselson e Stahl, no cal probaron que a replicación do ADN é semiconservativa usando diferentes isótopos do nitróxeno. Usaron a centrifugación en gradiente de densidade para determinar que isótopos do nitróxeno estaban presentes no ADN despois de determinado número de ciclos de replicación.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
*Centrífuga

### Bibliografía 
*Harrison, Roger G., Todd, Paul, Rudge, Scott R., Petrides D.P. *Bioseparations Science and Engineering*. Oxford University Press, 2003.
*Dishon, M., Weiss, G.H., Yphantis, D.A. *Numerical Solutions of the Lamm Equation. I. Numerical Procedure*. Biopolymers, Vol. 4, 1966. pp.&nbsp;449–455.
*Cao, W., Demeler B. *Modeling Analytical Ultracentrifugation Experiments with an Adaptive Space-Time Finite Element Solution for Multicomponent Reacting Systems*. Biophysical Journal, Vol. 95, 2008. pp.&nbsp;54–65.
*Howlett, G.J., Minton, A.P., Rivas, G. *Analytical Ultracentrifugation for the Study of Protein Association and Assembly*. Current Opinion in Chemical Biology, Vol. 10, 2006. pp.&nbsp;430–436.
*Dam, J., Velikovsky, C.A., Mariuzza R.A., et al. *Sedimentation Velocity Analysis of Heterogeneous Protein-Protein Interactions: Lamm Equation Modeling and Sedimentation Coefficient Distributions c(s)*. Biophysical Journal, Vol. 89, 2005. pp.&nbsp;619–634.
*Berkowitz, S.A., Philo, J.S. *Monitoring the Homogeneity of Adenovirus Preparations (a Gene Therapy Delivery System) Using Analytical Ultracentrifugation*. Analytical Biochemistry, Vol. 362, 2007. pp.&nbsp;16–37.