Química bioortogonal

O termo **química bioortogonal** refírese a calquera reacción química que pode ocorrer dentro dos sistemas vivos sen interferir cos procesos bioquímicos nativos.   O termo *bioorthogonal chemistry* foi acuñado por Carolyn R. Bertozzi en 2003.  Desde a súa introdución, o concepto de reacción bioortogonal permitiu o estudo de biomoléculas como glicanos, proteínas, e lípidos en tempo real en sistemas vivos sen toxicidade celular. Desenvolvéronse varias estratexias de ligadura química que cumpren os requisitos da bioortogonalidade, incluíndo a cicloadición 1,3-dipolar entre azidas e ciclooctilos (tamén denominada química de clic libre de cobre), entre nitronas e ciclooctilos, oxima/hidrazone formación de hidrazona a partir de aldehídos e cetonas, a ligadura de tetrazina, a reacción de clic baseada en isocianuros, e, máis recentemente, a ligadura de cuadriciclanos. 

O uso da química bioortogonal adoita realizarse en dous pasos. En primeiro lugar, modifícase un substrato celular cun grupo funcional bioortogonal (reporteiro químico) e introdúcese na célula; os substratos inclúen metabolitos, inhibidores enzimáticos, etc. O informador químico non debe alterar a estrutura do substrato drasticamente para evitar afectar á súa bioactividade. En segundo lugar, introdúcese unha sonda que contén o grupo funcional complementario para reaccionar e marcar o substrato. 

Aínda que se desenvolveron reaccións bioortogonais eficaces como a química de clic sen cobre, o desenvolvemento de novas reaccións segue xerando métodos ortogonais para o etiquetado que permiten utilizar múltiples métodos de etiquetado nos mesmos biosistemas. Bertozzi foi galardoada co Premio Nobel de Química en 2022 polo seu desenvolvemento da química do clic (*click chemistry*) e da química bioortogonal.
ligazón=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/Bioorthogonal_cell_labeling.svg/220px-Bioorthogonal_cell_labeling.svg.png|miniatura| Aquí móstrase unha ligadura bioortogonal entre a biomolécula X e o compañeiro reactivo Y. Para ser considerados bioortogonais, estes socios reactivos non poden perturbar outras funcións químicas que se atopan naturalmente dentro da célula.

## Etimoloxía 
A palabra bioortogonal provén do grego *bio* [vivo] e *orthogōnios* [en ángulo recto]. Así, literalmente, unha reacción que vai perpendicular a un sistema vivo, polo que non o perturba.

## Requisitos de bioortogonalidade 
Para ser considerada bioortogonal, unha reacción debe cumprir unha serie de requisitos:

* **Selectividade:** a reacción debe ser selectiva entre grupos funcionais endóxenos para evitar reaccións secundarias con compostos biolóxicos.
* **Inercia biolóxica:** os socios reactivos e o enlace resultante non deben posuír ningún modo de reactividade capaz de perturbar a funcionalidade química nativa do organismo obxecto de estudo.
* **Inercia química:** o enlace covalente debe ser forte e inerte para as reaccións biolóxicas.
* **Cinética:**A reacción debe ser rápida, na escala de tempo dos procesos celulares (minutos) para evitar a competencia en reaccións que poidan diminuír os pequenos sinais de especies menos abundantes. As reaccións rápidas tamén ofrecen unha resposta rápida, necesaria para rastrexar con precisión os procesos dinámicos.
* **Biocompatibilidade das reaccións:** as reaccións deben ser non tóxicas e deben funcionar en condicións biolóxicas tendo en conta o pH, os ambientes acuosos e a temperatura. A farmacocinética é unha preocupación crecente a medida que a química bioortogonal se expande a modelos animais vivos.
* **Enxeñaría accesible:** o informador químico debe ser capaz de incorporarse a biomoléculas mediante algunha forma de enxeñaría metabólica ou proteica. De xeito óptimo, un dos grupos funcionais tamén é moi pequeno para que non perturbe o comportamento nativo. 

## Enlace de Staudinger 
### Bioortogonalidade 
A azida pode actuar como un electrófilo brando que prefire os nucleófilos brandos como os fosfanos. Isto contrasta coa maioría dos nucleófilos biolóxicos que normalmente son nucleófilos duros. A reacción prodúcese selectivamente en condicións de tolerancia á auga para producir un produto estable. 

As fosfinas están completamente ausentes dos sistemas vivos e non reducen os enlaces disulfuro a pesar do potencial de redución leve. As azidas demostraron ser biocompatibles en fármacos aprobados pola FDA como a azidotimidina e a través doutros usos como enlaces cruzados. Ademais, o seu pequeno tamaño permítelles incorporarse facilmente ás biomoléculas a través das vías metabólicas celulares.

### Mecanismo 
#### Reacción clásica de Staudinger 
alt=The mechanism of the Staudinger reaction|600x600px|O mecanismo da reacción de Staudinger

A fosfina nucleófila ataca a azida no nitróxeno terminal electrófilo. A través dun estado de transición de catro membros, o N 2 pérdese para formar un aza-iluro. O iluro inestable hidrolízase para formar óxido de fosfina e unha amina primaria. Non obstante, esta reacción non é inmediatamente bioortogonal porque a hidrólise rompe o enlace covalente no aza-iluro.

### Ligadura Staudinger 
alt=The mechanism of the Staudinger ligation using a modified triarylphosphine|600x600px|O mecanismo da ligadura de Staudinger mediante unha triarilfosfina modificada

A reacción foi modificada para incluír un grupo éster orto ao átomo de fósforo nun dos aneis arilo para dirixir o aza-iluro a través dunha nova vía de reactividade co fin de superar a hidrólise inmediata colocando o éster para aumentar a concentración local. O ataque nucleófilo inicial á azida é o paso limitante da velocidade. O iluro reacciona coa trampa de éster electrófilo mediante ciclación intramolecular para formar un anel de cinco membros. Este anel sofre hidrólise para formar un enlace amida estable.

### Limitacións 
Os reactivos de fosfina sofren lentamente a oxidación do aire nos sistemas vivos. Ademais, é probable que sexan metabolizados *in vitro* por encimas do citocromo P450.

A cinética das reaccións é lenta con constantes de velocidade de segunda orde arredor de 0,0020&nbsp;M −1 •s −1 . Os intentos de aumentar as taxas de ataque nucleófilo engadindo grupos doadores de electróns ás fosfinas melloraron a cinética, pero tamén aumentaron a taxa de oxidación do aire.

A cinética deficiente require que se usen altas concentracións de fosfina, o que leva a problemas co sinal de fondo elevado nas aplicacións de imaxe. Intentáronse para combater o problema do fondo elevado mediante o desenvolvemento de reactivos de fosfina fluoroxénica baseados en fluoresceína e luciferina, pero a cinética intrínseca segue sendo unha limitación.

## Química de clic sen cobre 
**A química de clic sen cobre** é unha reacción bioortogonal desenvolvida por primeira vez por Carolyn Bertozzi como unha variante activada dunha cicloadición de Huisgen azida alquino, baseada no traballo de Karl Barry Sharpless et al. A diferenza de CuAAC, a química de clic libre de Cu foi modificada para ser bioortogonal eliminando un catalizador de cobre citotóxico, permitindo que a reacción se produza rapidamente e sen toxicidade celular viva. En lugar de cobre, a reacción é unha cicloadición de alquinazida promovida por cepas (**SPAAC**). Desenvolveuse como unha alternativa máis rápida á ligadura Staudinger, coas primeiras xeracións reaccionando máis de sesenta veces máis rápido. A incrible bioortogonalidade da reacción permitiu que a reacción de clic sen cobre se aplique dentro de células cultivadas, peixe cebra vivo e ratos.
ligazón=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/6a/Clickscheme.png/600px-Clickscheme.png|alt=click chemistry labeling|centro|600x600px| prema en etiquetaxe química

### Toxicidade do cobre 
A clásica cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre foi unha reacción de clic extremadamente rápida e eficaz para a bioconxugación, pero non é adecuada para o seu uso en células vivas debido á toxicidade dos ións Cu(I). A toxicidade débese ao dano oxidativo das especies reactivas do osíxeno formadas polos catalizadores de cobre. Tamén se atopou que os complexos de cobre inducen cambios no metabolismo celular e son absorbidos polas células.

Houbo algún desenvolvemento de ligandos para previr o dano das biomoléculas e facilitar a eliminación en aplicacións *in vitro* . Non obstante, descubriuse que os diferentes ambientes de ligandos dos complexos aínda poden afectar o metabolismo e a captación, introducindo unha perturbación non desexada na función celular.

### Bioortogonalidade 
O grupo azida é particularmente bioortogonal porque é extremadamente pequeno (favorable para a permeabilidade celular e evita perturbacións), metabolicamente estable e non existe naturalmente nas células e, polo tanto, non ten reaccións secundarias biolóxicas competidoras. Aínda que as azidas non son o 1,3-dipolo máis reactivo dispoñible para a reacción, son preferidas pola súa relativa falta de reaccións secundarias e pola súa estabilidade en condicións sintéticas típicas. O alquino non é tan pequeno, pero aínda ten a estabilidade e a ortogonalidade necesarias para o marcado *in vivo*. Os ciclooctinos son tradicionalmente o cicloalquino máis común para os estudos de etiquetaxe, xa que son o anel de alquino estable máis pequeno.

alt=The mechanism proceeds through a standard 1,3-dipolar cycloaddition.|350x350px|O mecanismo procede a través dunha cicloadición estándar 1,3-dipolar.

A reacción procede como unha cicloadición 1,3-dipolar estándar, un tipo de desprazamento pericíclico concertado asíncrono. A natureza ambivalente do 1,3-dipolo debería facer imposible a identificación dun centro electrófilo ou nucleófilo na azida de tal xeito que a dirección do fluxo de electróns cíclico careza de sentido. [p] Porén, os cálculos demostraron que a distribución de electróns entre os nitróxenos fai que o átomo de nitróxeno máis interno teña a maior carga negativa.

### Rexioselectividade 
Aínda que a reacción produce unha mestura rexioisomérica de triazoles, a falta de rexioselectividade na reacción non é unha gran preocupación para a maioría das aplicacións actuais. Os requisitos máis rexioespecíficos e menos bioortogonais son mellor atendidos pola cicloadición Huisgen catalizada por cobre, especialmente tendo en conta a dificultade sintética (en comparación coa adición dun alquino terminal) de sintetizar un ciclooctilo con tensión.

### Desenvolvemento de ciclooctilos 
ligazón=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/9/95/Cyclooctynes.png/450px-Cyclooctynes.png|alt=Strained cyclooctynes developed for copper-free click chemistry|esquerda|450x450px| Ciclooctinos colados desenvolvidos para a química de clics sen cobre
**OCT** foi o primeiro ciclooctilo desenvolvido para a química de clics sen Cu. Aínda que os alquinos lineais non son reactivos a temperaturas fisiolóxicas, a OCT foi capaz de reaccionar facilmente coas azidas en condicións biolóxicas sen mostrar toxicidade. Non obstante, era pouco soluble en auga e a cinética apenas mellorou sobre a ligadura de Staudinger. O **ALO** (aryl-less octyne) foi desenvolvido para mellorar a solubilidade na auga, pero aínda tiña unha cinética pobre.

Os ciclooctinos monofluorados (**MOFO**) e difluorados (**DIFO**) creáronse para aumentar a taxa mediante a adición de substituíntes de flúor que atraen electróns na posición proparxílica. O flúor é un bo grupo de atracción de electróns en termos de accesibilidade sintética e inercia biolóxica. En particular, non pode formar un aceptor de Michael electrófilo que poida reaccionar secundariamente cos nucleófilos biolóxicos. **DIBO** (dibenzociclooctino) foi desenvolvido como unha fusión a dous aneis de arilo, o que provocou unha tensión moi elevada e unha diminución das enerxías de distorsión. Propúxose que a substitución de biarilo aumenta a tensión do anel e proporciona a conxugación co alquino para mellorar a reactividade. Aínda que os cálculos predixeron que a substitución de monoarilo proporcionaría un equilibrio óptimo entre o choque estérico (con molécula de azida) e a cepa, os produtos monoarilados demostraron ser inestables.

**BARAC** (biarylazacyclooctynone) seguiu coa adición dun enlace amida que engade un centro tipo sp2 para aumentar a velocidade por distorsión. A resonancia de amida contribúe a unha tensión adicional sen crear insaturación adicional que levaría a unha molécula inestable. Ademais, a adición dun heteroátomo ao anel de ciclooctino mellora tanto a solubilidade como a farmacocinética da molécula. BARAC ten unha taxa (e sensibilidade) suficientes até o punto de que non é necesario eliminar o exceso de sonda para reducir o fondo. Isto fai que sexa moi útil en situacións nas que o lavado é imposible, como nas imaxes en tempo real ou nas imaxes de animais enteiros. Aínda que BARAC é extremadamente útil, a súa baixa estabilidade require que debe almacenarse a 0&nbsp;°C, protexido da luz e do osíxeno.
ligazón=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e2/Baracsynthesis.png/220px-Baracsynthesis.png|dereita|miniatura| A síntese foi deseñada polo grupo Bertozzi como unha ruta modular para facilitar futuras modificacións na análise SAR. O primeiro paso é a síntese de indol de Fischer. O produto alquilase con bromuro de alilo como asa para a futura fixación da sonda; Despois engádese TMS. A oxidación abre os aneis centrais para formar unha amida cíclica. A cetona trátase como un enolato para engadir un grupo triflato. A reacción do alqueno terminal xera un enlace para a conxugación cunha molécula. A reacción final con CsF introduce o alquino deformado no último paso.
Realizáronse máis variacións de axustes en BARAC para producir **DIBAC/ADIBO** para engadir tensión do anel distal e reducir os estéricos ao redor do alquino para aumentar aínda máis a reactividade. O ceto-DIBO, no que o grupo hidroxilo se converteu nunha cetona, ten un aumento de tres veces na taxa debido a un cambio na conformación do anel. Os intentos de facer un difluorobenzociclooctino (**DIFBO**) non tiveron éxito debido á inestabilidade.

Os problemas con DIFO con estudos *in vivo* con ratos ilustran a dificultade de producir reaccións bioortogonais. Aínda que DIFO foi extremadamente reactivo no etiquetado das células, funcionou mal nos estudos sobre ratos debido á unión coa albumina sérica. A hidrofobicidade do ciclooctilo promove o secuestro por membranas e proteínas séricas, reducindo as concentracións biodisponibles. Como resposta, o **DIMAC** (dimethoxyazacyclooctyne) foi desenvolvido para aumentar a solubilidade en auga, a polaridade e a farmacocinética, aínda que aínda están en desenvolvemento esforzos no etiquetado bioortogonal de modelos de rato.

### Reactividade 
Os esforzos computacionais foron vitais para explicar a termodinámica e a cinética destas reaccións de cicloadición que desempeñaron un papel vital para seguir mellorando a reacción. Existen dous métodos para activar os alquinos sen sacrificar a estabilidade: diminuír a enerxía do estado de transición ou diminuír a estabilidade dos reactivos.
[ligazón=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f7/CyclooctyneReactivity.png/220px-CyclooctyneReactivity.png|centro|miniatura| A frecha vermella mostra a dirección do cambio de enerxía. As frechas negras mostran a diferenza na [enerxía de activación antes e despois dos efectos.]]
**Diminución da estabilidade dos reactivos:** Houk propuxo que as diferenzas na enerxía (Ed ‡) necesaria para distorsionar a azida e o alquino nas xeometrías do estado de transición controlan as alturas da barreira para a reacción. A enerxía de activación (E ‡) é a suma das distorsións desestabilizadoras e as interaccións estabilizadoras (Ei ‡). A distorsión máis significativa está no grupo funcional azida con menor contribución de distorsión alquino. Non obstante, é só o ciclooctino o que se pode modificar facilmente para obter unha maior reactividade. As barreiras de reacción calculadas para a azida de fenila e o acetileno (16,2 kcal/mol) fronte ao ciclooctilo (8,0 kcal/mol) dan como resultado un aumento da taxa previsto de 10 6. O ciclooctilo require menos enerxía de distorsión (1,4 kcal/mol fronte a 4,6 kcal/mol) o que resulta nunha enerxía de activación máis baixa a pesar da menor enerxía de interacción.
ligazón=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c5/Energies.png/220px-Energies.png|dereita|miniatura| Relación entre enerxía de activación, enerxía de distorsión e enerxía de interacción
**Enerxía diminuínte do estado de transición:** os grupos que retiran electróns como o flúor aumentan a taxa ao diminuír a enerxía LUMO e a fenda HOMO-LUMO. Isto leva a unha maior transferencia de carga da azida ao ciclooctilo fluorado no estado de transición, aumentando a enerxía de interacción (menor valor negativo) e a enerxía de activación global. A baixada do LUMO é o resultado da hiperconxugación entre os orbitais doadores alquino π e os aceptores CF σ*. Estas interaccións proporcionan estabilización principalmente no estado de transición como resultado do aumento das capacidades doadores/aceptores dos enlaces a medida que se distorsionan. Os cálculos do NBO demostraron que a distorsión do estado de transición aumenta a enerxía de interacción en 2,8 kcal/mol.

A hiperconxugación entre enlaces π fóra do plano é maior porque os enlaces π no plano están mal aliñados. Non obstante, a flexión do estado de transición permite que os enlaces π no plano teñan unha disposición máis antiperiplanar que facilita a interacción. A estabilización da enerxía da interacción hiperconxugativa adicional conséguese a través dun aumento da poboación electrónica do σ* debido á formación do enlace CN. A hiperconxugación negativa cos enlaces σ* CF mellora esta interacción estabilizadora.

### Rexioselectividade 
Aínda que a rexioselectividade non é un gran problema nas aplicacións actuais de imaxe da química de clic sen cobre, é un problema que impide futuras aplicacións en campos como o deseño de fármacos ou a peptidomimética.

Actualmente a maioría dos ciclooctilos reaccionan para formar mesturas rexioisómeras. A análise computacional descubriu que, aínda que se calcula que a rexioselectividade da fase gasosa favorece a adición de 1,5 sobre a adición de 1,4 até 2,9 kcal/mol en enerxía de activación, as correccións de solvatación orixinan as mesmas barreiras enerxéticas para ambos os rexioisómeros. Mentres que o isómero 1,4 na cicloadición de DIFO está desfavorecido polo seu maior momento dipolar, a solvatación estabilizao máis forte que o isómero 1,5, erosionando a rexioselectividade.
ligazón=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d6/Bicyclenonyne.png|dereita|miniatura
Os ciclooctinos simétricos como o BCN (biciclo[6.1.0]nonino) forman un único rexioisómero tras a cicloadición e poden servir para resolver este problema no futuro.

### Aplicacións 
A aplicación máis estendida da química de clic sen cobre é na imaxe biolóxica en células vivas ou animais utilizando unha biomolécula marcada con azida e un ciclooctilo que leva un axente de imaxe.

As variantes fluorescentes de ceto e oxima de DIBO utilízanse nas reaccións de clic de fluoro-interruptor nas que a fluorescencia do ciclooctilo é apagada polo triazol que se forma na reacción. Por outra banda, os ciclooctinos conxugados con cumarina como **coumBARAC** foron desenvolvidos de xeito que o alquino suprime a fluorescencia mentres que a formación de triazol aumenta o rendemento cuántico de fluorescencia en dez veces.
ligazón=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c5/Coumbarac.png/220px-Coumbarac.png|miniatura| a fluorescencia de coumBARAC aumenta coa reacción
O control espacial e temporal do etiquetado do substrato investigouse mediante ciclooctilos fotoactivables. Isto permite o equilibrio do alquino antes da reacción para reducir os artefactos como resultado dos gradientes de concentración. Os ciclooctinos enmascarados son incapaces de reaccionar coas azidas na escuridade, pero convértense en alquinos reactivos ao irradiarse coa luz.

alt=Light causes a radical reaction that unmasks the alkyne which can then undergo cycloaddition with an azide|600x600px|A luz provoca unha reacción radical que desenmascara o alquino que despois pode sufrir cicloadición cunha azida.

Estase explorando a química de clics sen cobre para a súa utilización na síntese de axentes de imaxe PET que deben fabricarse rapidamente con gran pureza e rendemento para minimizar a desintegración isotópica antes de que se poidan administrar os compostos. Tanto as altas constantes de velocidade como a bioortogonalidade do SPAAC son susceptibles á química PET.

## Outras reaccións bioortogonais 
### Cicloadición de dipolos de nitrón 
A química de clic sen cobre adaptouse para usar nitronas como 1,3-dipolo en lugar de azidas e utilizouse na modificación de péptidos.

alt=Cycloaddition between a quadricyclane and a bis(dithiobenzil)nickel(II) species. Diethyldithiocarbamate is used to prevent photoinduced reversion to a norbornadiene.|600x600px|Cicloadición entre un cuadriciclano e unha especie de bis(ditiobencil)níquel(II). O dietilditiocarbamato úsase para evitar a reversión fotoinducida a un norbornadieno.

Esta cicloadición entre unha nitrona e un ciclooctilo forma isoxazolinas N-alquiladas. A velocidade de reacción é mellorada pola auga e é extremadamente rápida con constantes de velocidade de segunda orde que van de 12 a 32&nbsp;M −1 •s −1, dependendo da substitución da nitrona. Aínda que a reacción é extremadamente rápida, enfróntase a problemas para incorporar a nitrona ás biomoléculas mediante o etiquetado metabólico. A etiquetaxe só se conseguiu mediante a modificación do péptido postraducional.

### Cicloadición de norborneno 
As cicloadicións dipolares 1,3 desenvolvéronse como reacción bioortogonal usando un óxido de nitrilo como 1,3-dipolo e un norborneno como dipolarófilo. O seu uso principal foi para marcar o ADN e o ARN en sintetizadores automáticos de oligonucleótidos, e a reticulación de polímeros en presenza de células vivas.

alt=Cycloaddition between a norbornene and a nitrile oxide|600x600px|Cicloadición entre un norborneno e un óxido de nitrilo

Os norbornenos seleccionáronse como dipolarófilos debido ao seu equilibrio entre a reactividade e a estabilidade promovidas pola cepa. Os inconvenientes desta reacción inclúen a reactividade cruzada do óxido de nitrilo debido á forte electrofilia e á cinética de reacción lenta.

### Cicloadición de oxanorbornadieno 
A cicloadición de oxanorbornadieno é unha cicloadición 1,3-dipolar seguida dunha reacción retro-Diels Alder para xerar un conxugado ligado a triazol coa eliminación dunha molécula de furano. Os traballos preliminares demostraron a súa utilidade en experimentos de marcaxe peptídica e tamén se utilizou na xeración de compostos de imaxe SPECT. Máis recentemente, o uso dun oxanorbornadieno foi descrito nunha reacción "iClick" a temperatura ambiente sen catalizador, na que un aminoácido modelo está ligado ao resto metálico, nunha nova aproximación ás reaccións bioortogonais.

600x600px

A deformación do anel e a deficiencia de electróns no oxanorbornadieno aumentan a reactividade cara ao paso que limita a taxa de cicloadición. A reacción retro-Diels Alder ocorre rapidamente despois para formar o 1,2,3 triazol estable. Os problemas inclúen unha mala tolerancia aos substituíntes que poden cambiar a electrónica do oxanorbornadieno e taxas baixas (constantes de velocidade de segunda orde da orde de 10 −4 ).

### Ligadura de tetrazina 
A **ligadura de tetrazina** é a reacción dun trans-cicloocteno e unha tetrazina nunha reacción de Diels Alder de demanda inversa seguida dunha reacción retro-Diels Alder para eliminar o gas nitróxeno. A reacción é extremadamente rápida cunha constante de velocidade de segundo orde de 2000&nbsp;M −1 –s −1 (en metanol/auga 9:1) permitindo modificacións de biomoléculas a concentracións extremadamente baixas.

600x600px

Segundo o traballo computacional de Bach, a enerxía de deformación dos ciclooctenos Z é de 7,0 kcal/mol en comparación coas 12,4 kcal/mol do ciclooctano debido á perda de dúas interaccións transanulares. O E-cicloocteno ten un dobre enlace moi retorcido que dá como resultado unha enerxía de deformación de 17,9 kcal/mol. Como tal, o trans-cicloocteno altamente tenso úsase como dienófilo reactivo. O dieno é unha 3,6-diaril-s-tetrazina que foi substituída para resistir a reacción inmediata coa auga. A reacción transcorre a través dunha cicloadición inicial seguida dun Diels Alder inverso para eliminar o N2 e evitar a reversibilidade da reacción.

Non só a reacción tolera a auga, senón que se comprobou que a velocidade aumenta en medios acuosos. Tamén se realizaron reaccións utilizando norbornenos como dienófilos a velocidades de segunda orde da orde de 1&nbsp;M −1 •s −1 en medios acuosos. A reacción aplicouse ao marcado de células vivas e ao acoplamento de polímeros.

### [4+1] Cicloadición 
Esta reacción de clic de isocianuro é unha cicloadición [4+1] seguida dunha eliminación retro-Diels Alder de N2.

alt=Red shows undesirable side reactions when primary or secondary isonitriles are used.|550x550px|O vermello mostra reaccións secundarias indesexables cando se usan isonitrilos primarios ou secundarios.

A reacción procede cunha cicloadición inicial [4+1] seguida dunha reversión para eliminar un sumidoiro termodinámico e evitar a reversibilidade. Este produto é estable se se usa unha amina terciaria ou isocianopropanoato. Se se usa un isocianuro secundario ou primario, o produto formará unha imina que se hidroliza rapidamente.

O isocianuro é un informador químico preferido debido ao seu pequeno tamaño, estabilidade, non toxicidade e ausencia nos sistemas de mamíferos. Non obstante, a reacción é lenta, con constantes de velocidade de segunda orde da orde de 10 −2&nbsp;M −1 •s −1 .

### Química de fotoclic de tetrazol 
A química de Photoclick utiliza unha cicloeliminación fotoinducida para liberar N2. Isto xera un intermediario 1,3 nitrilo imina de curta duración a través da perda de gas nitróxeno, que sofre unha cicloadición 1,3-dipolar cun alqueno para xerar cicloaductos de pirazolina.

alt=Photoinduced cycloaddition of an alkene to a tetrazole|650x650px|Cicloadición fotoinducida dun alqueno a un tetrazol

A fotoindución ten lugar cunha breve exposición á luz (a lonxitude de onda depende do tetrazol) para minimizar o fotodano nas células. A reacción realízase en condicións acuosas e xera un único rexioisómero.

A nitrilo imina transitoria é moi reactiva para a cicloadición 1,3-dipolar debido a unha estrutura curvada que reduce a enerxía de distorsión. A substitución con grupos doadores de electróns nos aneis de fenilo aumenta a enerxía HOMO, cando se coloca na 1,3 nitrilo imina e aumenta a velocidade de reacción.

As vantaxes deste enfoque inclúen a capacidade de controlar espacial ou temporalmente a reacción e a capacidade de incorporar tanto alquenos como tetrazoles en biomoléculas mediante métodos biolóxicos sinxelos como a codificación xenética. Ademais, o tetrazol pódese deseñar para ser fluoroxénico para controlar o progreso da reacción.

### Ligadura de cuadriciclano 
A **ligadura do cuadriciclano** utiliza un cuadriciclano altamente tenso para someterse á cicloadición [2+2+2] con sistemas π.

alt=Cycloaddition between a quadricyclane and a bis(dithiobenzil)nickel(II) species. Diethyldithiocarbamate is used to prevent photoinduced reversion to a norbornadiene.|600x600px|Cicloadición entre un cuadriciclano e unha especie de bis(ditiobencil)níquel(II). O dietilditiocarbamato úsase para evitar a reversión fotoinducida a un norbornadieno.

O cuadriciclano é abiótico, non reactivo coas biomoléculas (debido á completa saturación), relativamente pequeno e moi tenso (~80 kcal/mol). Non obstante, é moi estable a temperatura ambiente e en condicións acuosas a pH fisiolóxico. É capaz de reaccionar selectivamente con sistemas π pobres en electróns pero non con alquenos, alquinos ou cicloottinos simples. 

O bis(ditiobencil)níquel(II) foi elixido como un compañeiro de reacción dunha selección de candidatos baseada na reactividade. Para evitar a reversión inducida pola luz ao norbornadieno, engádese dietilditiocarbamato para quelar o níquel do produto.

ligazón=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/d/d5/Quadnireagent.png/250px-Quadnireagent.png|centro|250x250px
Estas reaccións son potenciadas por condicións acuosas cunha constante de velocidade de segundo orde de 0,25&nbsp;M −1 •s −1 . De particular interese é que se demostrou que é bioortogonal tanto á formación de oximas como á química de clics sen cobre.

## Usos 
A química bioortogonal é unha ferramenta atractiva para a orientación previa de experimentos en imaxes nucleares e radioterapia.

## Notas