Hibridación in situ cromoxénica

A **hibridación in situ cromoxénica** (que se adoita abreviar como **CISH**, do inglés *chromogenic in situ hybridization*) é unha técnica citoxenética que combina o método de detección de sinais cromoxénicos das técnicas de inmunohistoquímica coa hibridación in situ. Foi desenvolvida arredor do ano 2000 como alternativa á hibridación in situ fluorescente (FISH) para a detección da amplificación do oncoxene HER-2/neu.

## Procedemento 
miniatura|Procedemento para realizar a hibridación in situ cromoxénica

### Deseño de sondas 
O deseño de sondas para CISH é moi similar ao das sondas para FISH con diferenzas só en etiquetado e detección. As sondas para FISH son xeralmente etiquetadas con diversas etiquetas fluorescentes e só pode detectarse con microscopio fluorescente, mentres que as sondas para CISH son etiquetadas con biotina ou digoxixenina  e poden detectarse usando un microscopio de campo brillante unha vez que se aplicaron outros pasos do tratamento. Os BACs foron desenvolvidos durante o Proxecto Xenoma Humano, xa que era necesario illar e amplificar curtos fragmentos de ADN humano para propósitos de secuenciación. Hoxe os BACs poden seleccionarse e posicionarse no xenoma humano usando bases de datos públicas como o UCSC Genome Browser. Os seguintes clons son secuenciados e verifícanse as súas posicións no xenoma. A etiquetaxe de sondas pode realizarse usando un cebado aleatorio ou a translación de amosega para incorporar biotina ou digoxixenina.

### Preparación dos tecidos, hibridación de sondas e detección 
Para que a CISH funcione optimamente, os cromosomas deben estar en interfase ou metafase. As mostras de tecidos están adheridas con seguridade a unha superficie, que adoita ser un portaobxectos de cristal, con parafina. As mostras de tecidos deben despois lavarse e quentarse varias veces para eliminar toda a parafina antes do paso de hibridación. Despois disto, a mostra sométese a unha dixestión con pepsina para asegurarse de que a diana é accesible. Ao día seguinte, a mostra é lavada e aplícase un bloqueador para sitios de unión a proteínas non específicas. Pode utilizarse unha contratinguidura como a hematoxilina e eosina para facer o produto máis visible. Outras técnicas que se desenvolveron para detectar anormalidades cromosómicas son comparadas xeralmente coa sensibilidade e especificidade da FISH para ver se están ao mesmo nivel. Porén, ás veces a CISH mostra unha baixa sensibilidade para amplificacións de baixo nivel.

Unha desvantaxe da inmunohistoquímica é que non é posible identificar resultados de falso negativo e falso positivo. Mostrouse que os anticorpos monoclonais son mellores que os anticorpos policlonais para a detección en inmunohistoquímica ou en CISH , xa que se unen máis especificamente, o que causa unha maior taxa de concordancia. A amplificación HER-2/neu está asociada cunha maior mortalidade, maior taxa de recorrencia e peor prognóstico no cancro de mama. O anticorpo monoclonal trastuzumab é un bloqueador de receptor que probou ser clinicamente moi efectivo en tumores con sobreexpresión de HER-2/neu. Por tanto, é esencial determinar o status do receptor antes de comezar o tratamento contra o cancro.

Ademais de en cancros, a CISH tamén é útil para detectar as infeccións por papilomavirus humano.

## Variacións 
### Hibridación in situ potenciada por prata (SISH) 
A hibridación in situ potenciada por prata (ou SISH, do inglés *silver-enhanced in situ hibridization*) utiliza un método similar ao da CISH, pero o produto final é un precipitado de prata en vez dun produto marrón. Neste método, unha sonda etiquetada con dinitrofenol (DNP) únese á secuencia diana. É unha técnica ben establecida para a detección da amplificación HER-2/neu incluso se ás veces se informa que é menos efectiva que a FISH. Nesta técnica, unha sonda únese á referencia, a cal, no caso da detección da amplificación de HER-2/neu, é CEN17 (o centrómero do cromosoma 17), mentres que a outra sonda únese á secuencia diana, a cal é HER-2/neu. DuoCISH combina a FISH e a CISH porque converte sinais das sondas da FISH en substratos cromoxénicos. Funciona baseándose no principio de que a tinguidura de cianina azul é un substrato para a HRP e a tinguidura vermella é un substrato para a AP. Por exemplo, os sinais de isotiocianato de fluoresceína (FITC) verde son convertidos en precipitados cromoxénicos azuis por medio de anticorpos anti-FITC conxugados coa HRP, e os sinais de Texas Red son convertidos en precipitados cromoxénicos vermellos por medio dun anticorpo anti-Texas Red conxugado á AP. Unha vantaxe do DuoCISH é que é posible distinguir entre a aneuplodía cromosómica e a amplificación xénica, xa que o xene de referencia será tamén amplificado en aneuploidía, pero non na detección da amplificación xénica.

## Notas