Inmunohistoquímica

miniatura|Preparación de cerebro de rato tinguido inmunohistoquimicamente.

A **inmunohistoquímica** (**IHQ** ou **IHC**, polas súas siglas en inglés) é a técnica que obtén selectivamente imaxes de antíxenos proteicos das células dunha sección dun tecido utilizando anticorpos que se unen especificamente aos antíxenos de tecidos biolóxicos.

A tinguidura inmunohistoquímica utilízase amplamente no diagnóstico de células anormais como as que se encontran en tumores canceríxenos. Os marcadores moleculares específicos son característicos de estados ou eventos celulares particulares como a proliferación ou morte celular (apoptose).
A inmunohistoquímica utilízase moito tamén en investigación básica para comprender a distribución e localización de biomarcadores e proteínas expresadas diferencialmente en distintas partes dun tecido biolóxico.

A visualización da interacción anticorpo-antíxeno pode realizarse de varias maneiras. No caso máis común, un anticorpo é conxugado cun encima, como a peroxidase, que pode catalizar unha reacción produtora de cor (ver tinguidura con inmunoperoxidase). Estes pasos poden establecer unha diferenza entre a tinguidura ou non dos antíxenos diana.

### Redución da inmunotinguidura non específica 
Dependendo do tipo de tecido e o método de detección do antíxeno, pode ser necesario que a biotina ou encimas endóxenos sexan bloqueados ou temperados (*quench*), respectivamente, antes da tinguidura polo anticorpo.
Aínda que os anticorpos mostran avidez preferencial por epítopos específicos, poden unirse parcialmente ou debilmente a sitios de proteínas non específicas (tamén chamados sitios reactivos) que son similares aos sitios de unión semellantes dos antíxenos diana. Unha gran cantidade de unións non específicas causa unha alta tinguidura de fondo, que enmascararía a detección do antíxeno diana. Para reducir esta tinguidura de fondo en hinmunohistoquímica, inmunocitoquímica e outros métodos de inmunotinguidura, as mostras son incubadas cun tampón que bloquea os sitios reactivos aos cales se poderían unir os anticorpos primarios e secundarios. Entre os tampóns comúns bloqueantes están o soro normal, leite en po desnatado, seroalbumina bovina (BSA) ou xelatina. Disponse de tampóns bloqueantes comerciais con formulacións de marca rexistrada para unha maior eficiencia. Entre os métodos para eliminar a tinguidura de fondo están a dilución dos anticorpos primario ou secundario, cambiar o tempo ou a temperatura de incubación, e usar un sistema de detección diferente ou un anticorpo primario diferente. O control de calidade debería como mínimo incluír un tecido que funcione como control positivo que se saiba que expresa o antíxeno e controis negativos de tecidos que se saiba que non expresan o antíxeno, así como o mesmo tecido comprobado da mesma maneira con omisión do anticorpo primario (ou mellor, a absorción do anticorpo primario).

Nos métodos de detección inmunohistoquímicas, os anticorpos son clasificados como reactivos primarios e secundarios. Os anticorpos primarios son específicos para o antíxeno de interese e normalmente non están conxugados (non están etiquetados), mentres que os anticorpos secundarios son específicos contra os propios anticorpos primarios. O anticorpo secundario está normalmentre conxugado a unha molécula enlazadora como a biotina, que despois recruta as moléculas reporteiras (que dan cor), ou ben o anticorpo secundario únese directamente á molécula reporteira. producindo unha tinguidura púrpura/negra intensa. Os reporteiros fluorescentes son pequenas moléculas orgánicas usadas para a detección inmunohistoquímica e tradicionalment inclúen a FITC, TRITC e AMCA, e derivados comerciais como os Alexa Fluors e Dylight Fluors, que mostran unha mellora similar do rendemento pero varían en prezo. Para os métodos de detección cromoxénicos e fluorescentes, a análise densitométrica do sinal pode proporcionar datos semi ou completamente cuantitativos, respectivamente, para correlacionar o nivel do sinal reporteiro ao nivel da expresión ou localización de proteínas.
miniatura|300px|O *método directo* de tinguidura inmnohistoquímica usa un anticorpo etiquetado, que se une directamente ao antíxeno que está sendo tinguido.
miniatura|300px|O *método indirecto* de tinguidura inmunohistoquímica usa un anticorpo contra o antíxeno que se está a probar, e un segundo anticorpo, etiquetado, contra o primeiro.

### Métodos de detección de antíxenos diana 
O *método directo* é un método de tinguidura nunha soa etapa e implica o uso dun anticorpo etiquetado (por exemplo, antisoro conxugado con FITC) que reacciona directamente co antíxeno en seccións de tecidos. Aínda que esta técnica utiliza só un anticorpo e, por tanto, é simple e rápida, a sensibilidade é menor debido á pequena amplificación do sinal, a diferenza dos métodos indirectos. Porén, esta estratexia é utilizada menos frecuentemente que a súa alternativa multifase.

O *método indirecto* implica usar un anticorpo primario non etiquetado (primeira capa) que se une ao antíxeno diana no tecido, e un anticorpo secundario etiquetado que reacciona co anticorpo primario. Como se mencionou máis arriba, o anticorpo secundario debe ir dirixido contra a IgG da especie animal na cal o anticorpo primario se produciu. Este método é máis sensible que as estratexias de detección directa a causa da amplificació do sinal debida á unión de varios anticorpos secundarios a cada anticorpo primario se o anticorpo secundario é conxugado a un reporteiro fluorescente ou encimático.

## Marcadores inmunohistoquímicos diagnósticos 
[miniatura|Tingidura inmunohistoquímica de [ril normal con CD10.]]

A inmunohistoqímica é unha excelente técnica de detección e ten a tremenda vantaxe de poder mostrar exactamemente onde se localiza unha determinada proteína dentro do tecido examinado. Tamén é un método efectivo para examinar os tecidos. Isto fai que sexa unha técnica moi utilizada en neurociencias, que permite examinar a expresión de proteínas en estruturas específicas do cerebro. A súa maior desvantaxe é que, a diferenza das técnicas de inmunoblotting, nas que a tinguidura se comproba cunha escala de pesos moleculares, é imposible mostrar en inmunohistoquimica que a tinguidura se corresponde coa proteína de interese. Por esta razón, os anticorpos primarios deben ser ben validados nunha western blot ou procedemento similar. A técnica é incluso máis utilizada en patoloxía cirúrxica diagnóstica para a inmunofenotipificación de tumores; por exemplo, a inmunotinguidura para E-cadherina para diferenciar entre o carcinoma ductal in situ (tinguidura positiva) e o carcinoma lobular in situ (sen tinguidura positiva)). Máis recentemente, as técnicas inmunohistoquímicas foron útiles na diagnose diferencial de múltiples formas de carcinomas de glándula salivar, e cabeza e pescozo.

A diversidade de marcadores inmunohistoquímicos usados en patoloxía cirúrxica diagnóstica é grande. Moitos laboratorios clínicos en hospitais terciarios teñen menús duns 200 anticorpos usados para diagnóstico, prognóstico e biomarcadores preditivos. Exemplos dalgúns marcadores comunmente usados son:

* BrdU: usada para identificar células. Usada para identificar tumores e en investigacións de neurociencia.
* Citoqueratinas: usadas para a identificación de carcinomas, pero poden tamén ser expresadas nalgúns sarcomas.
* CD15 e CD30: usados para a enfermidade de Hodgkin.
* Alfa fetoproteína: para os tumores de sacovitelino e carcinoma hepatocelular.
* CD117 (KIT): para os tumores estromais gastrointestinais e tumores de mastocito .
* CD10 (CALLA): para carcinoma de célula renal e leucemia linfoblástica aguda.
* Antíxeno prostático específico (PSA): para o cancro de próstata.
* A tinguidura de receptores de estróxenos e proxesterona (ER & PR) utilízase tanto para o dignóstico (tumores de mama e xinecolóxicos) e para o prognóstico do cancro de mama e na predición da resposta á terapia (receptor de estróxenos).
* Identificación de linfomas de célula B usando CD20.
* Identificación de linfomas de célula T usando CD3.

## Terapia dirixida 
No cancro son alteradas diversas vías moleculares e algunhas das alteracións poden ser a diana da terapia do cancro. A inmunohistoquímica pode utilizarse para avaliar aqueles tumores que é probable que respondan á terapia, ao detectarse a presenza ou niveis elevados da diana molecular.

### Inhibidores químicos 
A bioloxía dos tumores permitiu descubrir diversas dianas intracelulares potenciais. Moitos tumores son dependentes de hormonas. A presenza de receptores de hormonas pode utilizarse para determnar se un tumor pode responder potencialmente á terapia hormonal. Unha das primeiras terapias foi a administración do axente antiestroxénico tamoxifeno, usado para tratar o cacnro de mama. Estes receptores de hormonas poden ser detectados por inmunohistoquímica.
Imatinib, un inhibidor intracelular da tirosina quinase, desenvolveuse para tratar a leucemia mielóxena crónica, unha doenza caracterizada pola formación dunha tirosina quinase anormal específica. Imitanib demostrou ser efectivo en tumores que expresan outras tirosina quinases, especialmente KIT. A maioría dos tumores estromais gastrointestinais expresan KIT, que pode ser detectada por inmmunohistoquímica.

### Anticorpo monoclonal 
Por inmunohistoquímica demóstrase que moitas proteínas están moi reguladas á alza en estados patolóxicos, e estas son dianas potenciais para as terapias que utilizan anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais, debido ao seu tamaño, son utilizados contra dianas da superficie celular. Entre as dianas sobreexpresadas están membros da familia do receptor do factor de crecemento epidérmico (EGFR), proteínas transmembrana cun dominio receptor extracelular que regula unha tirosina quinase intracelular. Destes, HER2/neu (tamén chamado Erb-B2) foi o primeiro que se desenvolveu. A molécula exprésase fortemente en vaios tipos de células cancerosas, moi notablemente no cancro de mama. Os anticorpos contra HER2/neu foron aprobados pola FDA para o tratamento clínico do cancro co nome de fármaco *Herceptin*. Hai tamén probas inmunohistoquímicas dispoñibles comercialmente, como Dako HercepTest, Leica Biosystems Oracle e Ventana Pathway.

De xeito similar, EGFR (HER-1) é sobreexpresado en diversos cancros como o de cabeza e pescozo e o de colon. A inmunohistoquímica utilízase para determinar os pacientes que se poden beneficiar de anticorpos terapéuticos como Erbitux (cetuximab). Un sistema comercial para detectar o EGFR por inmunohistoquímica son o Dako pharmDx.

## Mapado da expresión proteica 
A inmunohistoquímica pode tamén utilizarse para facer un perfil máis xeral das proteínas, sempre que se dispoña de anticorpos validados para inmunohistoquímica. O Atlas das Proteínas Humanas mostra un mapa de expresión de proteínas en órganos humanos normais e tecidos. A combinación de inmunohistoquímica e micromatrices de tecidos proporciona os padróns de expresión proteica nun gran número de tipos de tecidos. A inmunohistoquímica tamén se usa para facer un perfil de proteínas nas formas máis comúns de cancro humano.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Hibridación in situ cromoxénica

### Ligazóns externas 
* The Human Protein Atlas
* 
* Overview of Immunohistochemistry--describes all aspects of IHC including sample prep, staining and troubleshooting 
* Immunofluorescent Staining of Paraffin-Embedded Tissue (IF-P)
* IHC Tip 1: Antigen retrieval - should I do PIER or HIER? 
* Histochemical Staining Methods - University of Rochester Department of Pathology
* Immunohistochemistry Staining Protocol 
* 
* 
*