Electroforese en xel de poliacrilamida

miniatura|230px|Ilustración da SDS-PAGE. Os marcadores moleclares (escada) están no carreiro esquerdo
A **electroforese en xel de poliacrilamida** (ou **PAGE**, do inglés *polyacrylamide gel electrophoresis*) é unha técnica amplamente usada en bioquímica, química forense, xenética, bioloxía molecular e biotecnoloxía para separar macromoléculas biolóxicas, xeralmente proteínas ou ácidos nucleicos, segundo a súa mobilidade electroforética. A mobilidade electroforética é función da lonxitude, conformación e carga da molécula. A electroforese en xel de poliacrilamida é unha ferramenta poderosa usada para analizar mostras de ARN. Cando o xel de poliacrilamida é desnaturalizado despois da electroforese, pode obterse información sobre a composición da mostra de especies de ARN. Existen principalmente dous grandes tipos de electroforese en xeles de poliacrilamida, que son: **PAGE nativa** (non desnaturalizante) e **SDS-PAGE** (desnaturalizante).

A poliacrilamida fórmase a partir da acrilamida. A hidratación de acrilonitrilo ten como resultado a formación de moléculas de acrilamida (C3H5NO) pola nitrilo hidratase. A acrilamida é tóxica para o sistema nervioso humano, polo que deben seguirse todas as medidas de seguridade cando se traballa con ela. Antes da adición de auga o monómero de acrilamida é un po, pero é soluble en auga, polo que engadindo auga se polimeriza formando a poliacrilamida. Deste modo, o deterxente dálle a todas as proteínas unha proporción uniforme carga-masa. Ao unirse ás proteínas o deterxente destrúe as súas estruturas secundaria, terciaria e cuaternaria, desnaturalizándoas e converténdoas en cadeas polipeptídicas aproximadamente lineais cargadas negativamente. Cando se someten a un campo eléctrico na PAGE, as cadeas polipeptídicas cargadas negativamente viaxan cara ao ánodo con diferente mobilidade. A súa mobilidade ou distancia á que viaxan as moléculas é inversamente proporcional ao logaritmo do seu peso molecular. Comparando a proporción relativa da distancia viaxada por cada proteína coa lonxitude do xel (Rf) poden extraerse conclusións sobre o peso molecular relativo das proteínas, nas que a lonxitude do xel é determinada pola distancia viaxada por unha pequena molécula usada como tinguidura de control (*tracking dye*).

Para os ácidos nucleicos, o desnaturalizante máis comunmente usado é a urea. Para as proteínas úsase o dodecil sulfato sódico (SDS), que é un deterxente aniónico aplicado ás mostras proteicas para cubrir as proteínas e facer que incorporen dúas cargas negativas con cada molécula de SDS unida en cada dous aminoácidos da proteína desnaturalizada. Procedimentalmente, poden usarse xuntas a PAGE nativa e a SDS-PAGE para purificar e separar as diversas subunidades dunha proteína. A PAGE nativa mantén a forma oligomérica intacta e mostrará unha banda no xel que é representativa do nivel de actividade. A SDS-PAGE desnaturaliza e separa a forma oligomérica nos monómeoros que a constitúen, mostrando bandas que son representativas dos seus pesos moleclares. Estas bandas poden utilizarse para identificar e avaliar a pureza da proteína.

Ademais do SDS, as proteínas poden opcionalmente ser tratadas brevemente con calor ata preto a ebulición en presenza dun axente redutor, como o ditiotreitol (DTT) ou o 2-mercaptoetanol (beta-mercaptoetanol/BME), que axuda a desnaturalizar as proteínas ao reducir quimicamente as pontes disulfuro, debilitando así algunhas formas de pregamento terciario das proteínas, e rompendo a estrutura cuaternaria da proteína (sepáranse as subunidades do oligómero). Este método denomínase SDS-PAGE redutora.

Pode engadirse á solución unha tinguidura de control, que adoita ter unha maior mobilidade electroforética que os analitos e permite ao experimentador trazar o avance da solución a través do xel durante o percorrido electroforético.

center

### Preparación de xeles de acrilamida 
Os xeles constan normalmente de acrilamida, bisacrilamida, o desnaturaliante opcional (SDS ou urea), e un tampón cun pH axustado. A solución nalgunhas ocasións pode ser desgasificada ao baleiro para previr a formación de burbullas de aire durante a polimerización. Alternativamente, pode engadirse butanol ao xel de resolución (para proteínas) despois de que se verte este, xa que o butanol elimina as burbullas e fai a superficie máis lisa.

Engádese unha fonte de radicais libres e un estabilizador, como o persulfato amónico e o TEMED para iniciar a polimerización. A reacción de polimerización crea un xel debido á bisacrilamida engadida, a cal pode formar enlaces cruzados entre dúas moléculas de acrilamida. A proporción de bisacrilamida/acrilamida pode variarse con propósitos especiais, pero xeralmente é de 1 parte por cada 35. A concentración de acrilamida do xel pode variarse tamén, xeralmente entre o 5% e o 25%. Os xeles con porcentaxe baixa son mellores para resolver moléculas de peso molecular moi elevado, mentres que cómpren porcentaxes moito máis altas de acrilamida para resolver pequenas proteínas. O diámetro medio do poro dos xeles de poliacrilamida está determinado pola concentración total de acrilamidas (% T, onde T = concentración total de acrilamida e bisacrilamida) e a concentración do axente que forma os enlaces cruzados, a bisacrilamida (%C, onde C = concentración de bisacrilamida). O tamaño do poro redúcese reciprocamente á %T. En canto á %C, a concentración do 5% produce os poros máis pequenos, xa que a influencia da bisacrilamida no tamaño do poro describe unha gráfica con forma de parábola co vértice no 5%.

center

Os xeles adoitan polimerizarse entre dúas placas de vidro nun molde de xel, cun peite inserido na parte superior para crear os pozos para depositar a mostra. Despois de que o xel foi polimerizado o peite pode ser eliminado e o xel está listo para iniciar unha electroforese.

center

### Electroforese 
Na PAGE utilízanse varios sistemas rampón dependendo da natureza da mostra e do obxectivo experimental. Os tampóns utilizados no ánodo e cátodo poden ser o mesmo ou diferentes.

center

center

Aplícase un campo eléctrico a través do xel, causando que os ácidos nucleicos ou as proteínas cargadas negativamente migren a través do xel afastándose do eléctrodo negativo (que aquí é o cátodo, dado que é unha cela electrolítica en vez de galvánica) e achegándose ao eléctrodo positivo (o ánodo). Dependendo do seu tamaño, cada biomolécula móvese de xeito diferente a través da matriz do xel: as pequenas moléculas deslízanse máis facilmente a través dos poros do xel, mentres que as máis grandes teñen máis dificultade. O xel faise "correr" xeralmente durante unhas poucas horas, aínda que isto depende da voltaxe aplicada ao xel; a migración ocorre máis rapidamente a voltaxes maiores, pero estes resultados son normalmente menos exactos que os obtidos aplicando voltaxes baixas. Pasado o período de tempo establecido, obsérvase que as biomoléculas migraron a diferentes distancias segundo o seu tamaño. As biomoléculas máis pequenas viaxan a máis distancia ao longo do xel, mentres que as grandes permanecen preto do punto de orixe. Deste xeito, as biomoléculas poden ser separadas de forma moi aproximada de acordo co seu tamaño, o cal depende principalmente do peso molecular en condicións desnaturalizantes, pero depende tamén das conformacións de orde superior en condicións nativas. A mobilidade no xel defínese como a migración viaxada cun gradiente de voltaxe de 1V/cm e mídese en unidades de cm2/sec/V. Con fins analíticos, a mobilidade relativa das biomoléculas, *Rf*, a proporción da distancia que viaxou a molécula no xel con respecto á distancia total que se desprazou a tinguidura de control represéntase graficamente fronte ao peso molecular da molécula (ou ás veces o logaritmo de MW, é dicir, a masa molar media, ou o Mr, o raio molecular). Estes gráficos ou *plots* tipicamente lineais representan os marcadores estándar ou curvas de calibración que son amplamente utilizados para a estimación cuantitativa de diversos tamaños moleculares.

### Procesamento posterior 
miniatura|esquerda|Dous xeles de SDS-PAGE despois de completada a electroforese

Despois da electroforese, o xel pode tinguirse; para as proteínas xeralmente con Azul Brillante Coomassie R-250 (CCB, do inglés *Coomassie Brilliant Blue R-250*) con autorradiografía, e para os ácidos nucleicos con bromuro de etidio; ou para ambos, con tinguidura de prata. Isto permite a visualización das proteínas separadas, ou seguir facendo un maior procesamento (por exemplo, con western blot). Despois da tinguidura, as diferentes especies de biomoléculas aparecen como bandas diferenciadas no xel. É común facer "correr" tamén marcadores de peso molecular que teñen un peso molecular coñecido nun carreiro separado do xel para calibrar o xel e determinar a masa molecular aproximada de biomoléculas descoñecidas comparando a distancia viaxada en relación co marcador.

Para proteínas a SDS-PAGE é normalmente o ensaio de pureza elixido debido á súa fiabilidade e facilidade de uso. A presenza de SDS e o paso desnaturalizante fan que as proteínas se separen, aproximadamente segundo o seu tamaño, pero pode ocorrer unha migración anormal dalgunhas proteínas. Distintas proteínas poden tamén quedar tinguidas de maneira diferente, o cal interfire coa cuantificación por tinguidura. A PAGE pode tamén utilizarse como unha técnica preparatoria para a purificación de proteínas. Por exemplo, a *electroforese en xel de poliacrilamida continua nativa preparatoria cuantitativa* (QPNC-PAGE) é un método para separar metaloproteínas nativas en matrices biolóxicas complexas.

## Ingredientes químicos e as súas funcións 
***Xel de poliacrilamida***. Coñecíase como un medio de incrustación potencial para facer cortes de tecidos para preparacións xa en 1964, e dous grupos independentes empregaron o xel de poliacrilamida na electroforese en 1959. Posúe varias características electroforéticas desexables que fan que sexa un medio moi versátil. É un xel sintético, termoestable, transparente, forte, e relativamente inerte quimicamente e pode ser preparado cun amplo rango de tamaño medio de poros. O tamaño do poro dun xel e a reproducibilidade do tamaño do poro do xel están determinados por tres factores, a cantidade total de acrilamida presente (%T) (T = concentración total de acrilamida e bisacrilamida monómero), a cantidade de axente que xera enlaces cruzados (%C) (C = concentración de bisacrilamida), e o tempo de polimerización da acrilamida (cf. QPNC-PAGE). O tamaño do poro diminúe cando se incrementa a %T; con enlaces cruzados, un 5%C orixina o menor tamaño de poro. Calquera incremento ou diminución na %C desde o 5% fai incrementar o tamaño do poro, xa que o tamaño do poro con respecto á %C é unha función parabólica co vértice en 5%C. Isto parece deberse ao empaquetamento non homoxéneo das febras do polímero no xel. Este material xelatinoso pode tamén soportar altos gradientes de voltaxe, é axeitado para varios procedementos de tinguidura e destinguidura e poden ser dixerido para extraer fraccións separadas ou secadas para autorradiografía e rexistro permanente.

### Compoñentes 
Os xeles de poliacrilamida están compostos dun xel de concentración (*stacking gel*) e un xel separador ou de resolución. O xel de concentración ten unha maior porosidade en relación co xel separador, e permite que as proteínas migren nunha área concentrada. Ademais, os xeles de concentración ou *stacking* xeralmente teñen un pH de 6,8, xa que as moléculas neutras de glicina do tampón permiten unha mobilidade das proteínas máis rápida, así como unha concentración de acrilamida máis baixa e diferente contido iónico. Isto permite que as proteínas dunha mostra cargada se concentren nunha banda estreita durante os primeiros minutos da electroforese antes de entrar na porción do xel separador. Os xeles de concentración non son necesarios cando se usan xeles de gradiente. Por outra parte, os xeles separadores teñen un pH de 8,8, no que a glicina aniónica fai máis lenta a mobilidade das proteínas. Os xeles separadores permiten a separación das proteínas e teñen unha porosidade relativamente baixa. Aquí, as proteínas son separadas baseándose no tamaño (en SDS-PAGE) e tamaño/carga (PAGE nativa).

O tampón químico estabiliza o pH no valor desexado dentro do xel e no tampón electroforético. A elección do tampón tamén afecta a mobilidade electroforética dos contraións do tampón e, por tanto, a resolución do xel. O tampón debería tamén non ser reactivo e non modificar ou reaccionar coa maioría das proteínas. Poden utilizarse diferentes tampóns como tampóns de ánodo e cátodo, dependendo da aplicación. Poden utilizarse moitos valores de pH nun só xel, por exemplo na electroforese DISC. Tampóns comúns usados na PAGE son: Tris, Bis-Tris, ou imidazol.

Os contraións equilibran a carga intrínseca do ión tampón e tamén afectan a forza do campo eléctrico durante a electroforese. Xeralmente evítase o uso de ións moi cargados e móbiles en tampóns de cátodo de SDS-PAGE, pero poden estar incluídos no propio xel, onde migran por diante das proteínas. En aplicacións como a DISC SDS-PAGE os valores de pH dentro do xel poden variar para cambiar a carga media dos contraións durante o funcionamento da electroforese para mellorar a resolución. Os contraións máis usados son a glicina e a tricina. A glicina foi utilizada como fonte de ións que van á cola ou ións lentos, porque o seu pKa é de 9,69 e mobilidade do glicinato é tal que a mobilidade efectiva pode establecerse nun valor por debaixo do das proteínas máis lentas coñecidas con carga negativa neta no rango de pH. O mínimo pH deste rango é de aproximadamente 8,0.

Cando a acrilamida (C3H5NO; mW ou masa molar media: 71.08) está disolta en auga, ten lugar a súa lenta e espontánea autopolimerización, uníndose as moléculas cabeza con cola para formar polímeros de cadeas simples longas. A presenza dun sistema xerador de radicais libres acelera moito a polimerización. Este tipo de reacción coñécese como polimerización por adición de vinilo. Unha solución destas cadeas de polímeros faise viscosa pero non forma un xel, porque as cadeas simplemente se deslizan unhas sobre outras. Para a formación do xel cómpre que se produza o enlace de varias cadeas entre si. A acrilamida é carcinóxena, e tamén unha neurotoxina e unha toxina reprodutora. É igualmente esencial almacenar acrilamida nun lugar frío, escuro e seco para reducir a autopolimerización e a hidrólise.

A bisacrilamida (*N*,*N*&prime;-metilenobisacrilamida) (C7H10N2O2; mW: 154.17) é o axente de formación de enlaces cruzados máis usado para xeles de poliacrilamida. Quimicamente pode considerarse como dúas moléculas de acrilamida acopladas cabeza con cabeza nos seus extremos non reactivos. A bisacrilamida pode establecer enlaces cruzados entre dúas cadeas de poliacrilamida, orixinando así o xel.

O dodecil sulfato sódico (SDS) (C12H25NaO4S; mW: 288.38) (utilizado só en xeles desnaturalizantes de proteínas) é un forte axente deterxente usado para desnaturalizar proteínas nativas orixinando polipéptidos individuais. Esta desnaturalización, que se refire a unha desnaturalización construtiva, non se realiza pola total linearización da proteína, senón por cambios conformacionais na que a proteína para a ter unha combinación de pregamentos aleatorios e estruturas secundarias helicoidais. O bromuro de etidio únese ás cadeas de ácidos nucleicos polo proceso de intercalación.  É importante utilizar con coidado o EtBr, xa que é carcinóxeno. Debido a isto, moitos investigadores optan por usar tinguiduras como o SYBR Green e o SYBR Safe, que son alternativas máis seguras que o EtBr. O EtBr é utilizado engadíndoo simplemente á mestura do xel. Unha vez que se fixo "correr" o xel, o xel pode ser visto usando un sistema de fotodocumentación. A tinguidura de prata foi introducida por Kerenyi e Gallyas como un procedemento sensible para detectar cantidades traza de proteínas en xeles. A técnica foi aplicada despois ao estudo doutras macromoléculas biolóxicas que eran separadas en diversos soportes. Hai moitas variables que poden influír na intensidade da cor e cada proteína ten as súas propias características de tinguidura. Usar vidros limpos, reactivos puros e auga de alta pureza son os puntos clave para facer unha tinguidura con éxito.

A autorradiografía, tamén usada para a detección de bandas de proteínas despois dunha electroforese en xel, utiliza isótopos radioactivos para etiquetar proteínas, as cales son despois detectadas usando unha película de raios X.

O western blot é un proceso polo cal as proteínas separadas no xel de poliacrilamida son transferidas a unha membrana estable e manipulable de nitrocelulosa, nailon ou PVDF. Despois é posible aplicar técnicas inmunoquímicas para visualizar as proteínas transferidas e identificar adecuadamente os incrementos ou diminucións relativos da proteína de interese.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
*Electroforese en xel de agarosa  
*Electroforese capilar 
*Electroforese de ADN
*Eastern blot
*Electroblotting
*Historia da electroforese
*Isoelectroenfoque
*Isotacoforese
*Electroforese en xel nativa
*Northern blot
*Electroforese de proteínas
*Southern blot
*SDS-PAGE bidimensional
*Zimografía

### Ligazóns externas 
* SDS-PAGE: How it Works
* SDS-PAGE Video Protocol
* Demystifying SDS-PAGE Video
* Demystifying SDS-PAGE
* SDS-PAGE Calculator for customised recipes for TRIS Urea gels.
* 2-Dimensional Protein Gelelectrophoresis
* Moll K, Ljungström J, Perlmann H, Scherf A, Wahlgren M (eds) Methods in Malaria Research Hempelmann E. SDS-Protein PAGE and Proteindetection by Silverstaining and Immunoblotting of Plasmodium falciparum proteins. 5ª edición, 2008, 263-266