Fluoróforo

miniatura|Unha célula humana etiquetada cun fluoróforo.

Un **fluoróforo** ou **fluorocromo** (termo similar a cromóforo) é un composto químico fluorescente que pode reemitir luz cando é excitado pola luz. Os fluoróforos conteñen caracteristicamente varios grupos aromáticos combinados ou moléculas planas ou cíclicas con varios enlaces π.

Os fluoróforos son ás veces usados sós, como trazadores en fluídos, como tinguiduras para tinguir certas estruturas, como substratos dun encima, ou como sondas ou indicadores (cando a súa fluorescencia é afectada por aspectos ambientais como a polaridade ou ións). Pero o máis xeral é que se usen unidos covalentemente a macromoléculas, funcionando como marcadores (ou tinguiduras ou etiquetas ou reporteiros) para reactivos de afinidade ou bioactivos (anticorpos, péptidos, ácidos nucleicos). Os fluoróforos son usados para tinguir tecidos, células ou materiais nunha variedade de métodos analíticos, como na obtención de imaxes fluorescentes e na espectroscopia de fluorescencia.

A fluoresceína, por medio do seu derivado aminorreactivo de isotiocianato, o isotiocianato de fluoresceína (FITC), foi un dos fluoróforos máis utilizados. Desde a súa aplicación inicial para o etiquetado de anticorpos, as aplicacións ampliáronse aos ácidos nucleicos grazas á utilización da carboxifluoresceína. Outros fluoróforos historicamente comúns son os derivados da rodamina (TRITC), coumarina e cianina. As novas xeracións de fluoróforos, moitos dos cales son de marcas comerciais, adoitan ter unhas prestacións mellores, como ser máis fotoestables, máis billantes ou menos sensibles ao pH que as tingjuiduras tradicionais cunha excitación e emisión comparables.

## Fluorescencia 
O fluoróforo absorbe enerxía da luz dunha lonxitude de onda específica e reemite luz dunha lonxitude de onda máis longa. As lonxitudes de onda absorbidas, a eficiencia da transferencia de enerxía, e o tempo antes da emisión dependen da estrutura do fluoróforo e do seu ambiente químico, xa que a molécula no seu estado excitado interacciona coas moléculas que o rodean. As lonxitudes de onda de absorción máxima (≈ excitación) e emisión (por exemplo, Absorión/Emisión = 485&nbsp;nm/517&nbsp;nm) son as propiedades típicas usadas para referirse a un fluoróforo determinado, pero o espectro completo pode ser tamén algo importante a considerar. O espectro de lonxitudes de onda de excitación pode ser unha banda moi estreita ou moi ancha ou pode estar todo máis alá do nivel límite. O espectro de emisión é xeralmente máis  nítido que o espectro de excitación, e é dunha lonxitude de onda mais longa e, en consecuencia, dunha enerxía menor. As enerxías de excitación van desde o ultravioleta ata o espectro visible, e as enerxías de emisión poden continuar desde a luz visible á rexión do infravermello próximo.

As principais características dos fluoróforos son:
* **Lonxitudes de onda de máxima excitación e emisión** (expresada en nanómetros (nm)): corresponde ao pico nos espectros de excitación e emisión (usualmente un pico para cada un).
* **Coeficiente de absorción molar** (en mol−1cm−1): liga a cantidade de luz absorbida, a unha lonxitude de onda dada, á concentración de fluoróforo en solución.
* **Rendemento cuántico**: eficiencia da enerxía transferida desde a luz incidente á fluorescencia emitida (o número de fotóns emitidos por fotóns absorbidos).
* **Tempo de vida** (en picosegundos): duración do estado excitado dun fluoróforo antes de volver ao seu esatado fundamental. Refírese ao tempo que tarda unha poboación de fluoróforos excitados en decaer a 1/e (≈0,368) da cantidade orixinal.
* **Desprazamento de Stokes**: a difernza entre as lonxitudes de onda de excitación máxima e emisión máxima.
* **Fracción escura**: a proporción das moléculas non activas na emisión de fluorescencia. Para puntos cuánticos, a microscopia de molécula única prolongada mostrou que o 20-90 % de todas as partículas nunca emiten fluorescencia. Por outra parte, as nanopartículas poliméricas conxugadas (Pdots) non mostran case ningunha fracción escura na súa fluorescencia. As proteínas fluorescentes poden ter unha fración escura por mal pregamento da proteína ou formación defectuosa do cromóforo.

Destas carcterísticas derivan outras propiedades, como o fotobranqueamento ou a fotorresistencia (perda de fluorescencia despois dunha excitación continua pola luz). Deberían considerarse igualmente outros parámetros, como a polaridade da molécula fluoróforo, o tamaño e forma do fluoróforo (é dicir, para o padrón de fluorescencia de polarización), e outros factores poden cambiar o comportamento dos fluoróforos.

Os fluoróforos poden usarse tamén para atenuar (*quench*) a fluorescencia doutras tinguiduras fluorescentes ou para transmitir a súa fluorescencia a lonxitudes de onda incluso máis longas.

## Tamaño (peso molecular) 
A maioría dos fluoróforos son pequenas moléculas orgánicas de 20–100 átomos (200–1000 daltons (Da); o peso molecular pode ser maior dependendo das modificacións aplicadas e as moléculas conxugadas), pero hai tamén fluoróforos naturais moito máis grandes que son proteínas: a proteína fluorescente verde (GFP) é de 27 kDa, e varias ficobiliproteínas (PE, APC...) son de 240 kDa. En 2020 o fluoróforo máis pequeno coñecido era o 3-hidroxiisonicotinaldehido, un composto de só 14 átomos e só 123 Da.

As partículas fluorescentes como puntos cuánticos (2–10&nbsp;nm de diámetro, 100–100.000 átomos) son tamén considerdas fluoróforos.

O tamaño do fluoróforo podería ocultar estericamante a molécula etiquetada e afectar a polaridade de fluorescencia.

## Familias 
[miniatura|Fluorescencia de diversas substancias baixo a luz UV. O composto que dá cor verde é a [fluoresceína, o vermello é a Rodamina B, o amarelo é a Rodamina 6G, o azul é a quinina, o púrpura é unha mestura de quinina e Rodamina 6g. As solucións son aproximadamente dunha concentración do 0,001 % en auga.]]

As moléuculas fluoróforos poden ser utilizadas soas ou servir como motivo fluorescente dun sistema funcional. Baseándose na complexidade molecular e métodos sintéticos, as moléculas fluoróforas poderían ser xeralmente clasificadas en catro categorías: proteínas e péptidos, pequenos compostos orgánicos, oligómeros e polímeros sintéticos, e sistemas multicompoñentes.

As proteínas fluorescentes GFP, YFP e RFP (verde, amarela e vermella, respectivamente) poden ser unidas a outras proteínas específicas para formar unha proteína de fusión, sintetizada en células despois da transfección dun plásmido transportador axeitado.

Os fluoróforos orgánicos **non proteicos** pertencen ás seguintes familias químicas principais:
* **Derivados do xanteno:** fluoresceína, rodamina, verde Oregón, eosina e vermello Texas
* **Derivados da cianina:** cianina, indocarbocianina, oxacarbocianina, tiacarbocianina e merocianina
* **Derivados da escuaraína e escuaraínas de anel susbstituído**, incluíndo as tinguiduras Seta e Square
* **Derivados da escuaraína rotaxano:** Ver tinguiduras Tau
* **Derivados do naftaleno** (derivados do dansilo e prodán)
* **Derivados da coumarina**
* **Derivados do oxadiazol:** piridiloxazol, nitrobenzoxadiazol, e benzoxadiazol
* **Derivados do antraceno:** antraquinonas, incluídas DRAQ5, DRAQ7 e CyTRAK Orange
* **Derivados do pireno:** Cascade Blue, etc.
* **Derivados da oxazina:** vermello Nilo, azul Nilo, violeta de cresilo, oxazina 170, etc.
* **Derivados da acridina:** proflavina, laranxa de acridina, amarelo de acridina etc.
* **Derivados do arilmetino:** auramina, cristal violeta, verde malaquita
* **Derivados do tetrapirrol:** porfina, ftalocianina, bilirrubina
* **Derivados do dipirrometeno:** BODIPY, aza-BODIPY

Estes fluoróforos fluorescen debido a electróns deslocalizados que poden saltar unha banda e estabilizar a enerxía absorbida. Por exemplo, o benceno, un dos hidrocarburos aromáticos máis simples, é excitado a 254&nbsp;nm e emite a 300&nbsp;nm. Isto discrimina os fluoróforos dos puntos cuánticos, que son nanopartículas semicondutoras fluorescentes.

Poden ser unidos a proteínas a grupos funcionais específicos, como grupos amino (éster activo, carboxilato, isotiocianato, hidrazina), gruos carboxilo (carbodiimida), tiol (maleimida, bromuro de acetilo) e azida orgánica (por medio de química *click* ou non especificamente (glutaraldehido)).

Ademais, varios grupos funcionais poden estar presentes para alterar as súas propiedades, como a solubilidade, ou conferir propiedades especiais, como o ácido borónico que se une a azucres ou múltiples grupos carboxilo para enlazar certos catións. Cando a tinguidura contén un doante de electóns e un grupo aceptor de electróns en extremos opostos dun sistema aromático, esta tinguidura probablemente será sensible á polaridade do ambiente (solvatocrómica), polo que se chama sensible ao ambiente. A miúdo as tinguiduras utilízanse dentro das células, que son impermeables a 
moléculas cargadas; como resultado disto, os grupos carboxilo son convertidos nun éster, que é retirado por esterases dentro das células; por exemplo, fura-2AM e fluoresceína-diacetato.

As seguintes familias de tinguiduras son **grupos de marcas comerciais** e non necesariamente comparten semellanzas estruturais.
* Tinguidura CF (Biotium)
* Sondas DRAQ e CyTRAK (BioStatus)
* BODIPY (Invitrogen)
* EverFluor (Setareh Biotech)
* Alexa Fluor (Invitrogen)
* Bella Fluor (Setareh Biotech)
* DyLight Fluor (Thermo Scientific, Pierce)
* Atto e Tracy (Sigma Aldrich)
* FluoProbes (Interchim)
* Tinguiduras Abberior (Abberior)
* Tinguiduras DY e MegaStokes (Dyomics)
* Tinguiduras Sulfo Cy (Cyandye)
* HiLyte Fluor (AnaSpec)
* Tinguiduras Seta, SeTau e Square (SETA BioMedicals)
* Tinguiduras Quasar e Cal Fluor (Biosearch Technologies)
* Tinguiduras SureLight (APC, RPEPerCP, ficobilisomas) (Columbia Biosciences)
* APC, APCXL, RPE, BPE (Phyco-Biotech, Greensea, Prozyme, Flogen)
* Tinguiduras Vio (Miltenyi Biotec)

[miniatura|Núcleos de células endoteliais de arteria pulmonar bovina tinguidas de azul con [DAPI, mitocondrias tinguidas de vermello con MitoTracker Red CMXRos, e F-actina tinguida de verde con Alexa Fluor 488 faloidina nunha imaxe obtida con microscopio de fluorescencia.]]

## Aplicacións 
Os fluoróforos teñen especial importancia no campo de bioquímica e estudos de proteínas, por exemplo, en inmunofluorescencia, análise de células, inmunohistoquímica, e sensores de pequenas moléculas.

## Usos fóra das ciencias da vida 
miniatura|Tinguidura mariña fluorescente
As tinguiduras fluorescentes, que utilizan o nome de "colores neon", atoparon unha ampla variedade de usos na industria, como:
* Usos de escala multitón en tiguiduras téxtiles e abrillantadores ópticos en deterxentes de lavandaría
* Formulacións cosméticas avanzadas
* Roupa e equipos de seguridade
* Díodos orgánicos emisores de luz (OLEDs)
* Arte e deseños refinados (pósters e pinturas)
* Sinerxistas de insecticidas e drogas experimentais
* Tinguiduras en rotuladores marcadores ou resaltadores de texto para dar un efecto de resplandor
* Paneis solares para captar máis luz / lonxitudes de onda
* Tinguiduras mariñas fluorescentes usadas para axudar aos equipos de busca e rescate aéreo a localizar obxectos na auga

## Exemplos de fluoroforos que se usan frecuentemente 
### Tinguiduras reactivas e conxugadas 
Abreviaturas:
*Ex (nm): Lonxitude de onda de excitación en nanómetros
*Em (nm): Lonxitude de onda de emisión en nanómetros
*PM: Peso molecular
*QY: Rendemento cuántico (*Quantum yield*)

### Tinguiduras de ácidos nucleicos 
### Tinguiduras da función celular 
### Proteínas fluorescentes 
Abreviaturas:
*Ex (nm): Lonxitude de onda de excitación en nanómetros
*Em (nm): Lonxitude de onda de emisións en nanómetros
*MW: Peso molecular
*QY: Rendemento cuántico (*Quantum yield*)
*BR: Brillantez: Coeficiente de absorción molar * rendemento cuántico / 1000
*PS: Fotoestabilidade: tempo [seg] para reducir a brillantez nun 50 %

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Fluorescencia nas ciencias da vida
* Quenching (fluorescencia)
* Recuperción da fluorescencia despois do fotobranqueamento (FRAP) - unha aplicación para cuantificar a mobilidade de moléculas en bicapas lipídicas.

### Ligazóns externas 
* The Database of fluorescent dyes
* Táboa de fluorocromos
* The Molecular Probes Handbook - un recurso completo para a tecnoloxía da fluorescencia e as súas aplicacións.