Northwestern blot

O **northwestern blot**, tamén chamado **ensaio northwestern**, é unha técnica analítica de bioloxía molecular híbrida entre o western blot e o northern blot, que se utiliza para detectar as interaccións entre o ARN e as proteínas. A técnica relacionada do western blot utilízase para detectar proteínas de interese realizando unha transferencia a unha membrana de nitrocelulosa de ditas proteínas, que son separadas previamente por electroforese en xel. Os grupos de precipitados coloreados ao longo das bandas que quedan sobre a membrana conteñen unha determinada proteína diana. O northern blot é unha técnica similar que, en vez de detectar unha proteína de interese, úsase para estudar a expresión xénica pola detección de ARN (ou ARNm illado) sobre unha membrana similar á do western blot. Pola súa parte, o northwestern blot combina as dúas técnicas, e implica especificamente a identificación de ARN etiquetado que interacciona con proteínas que son inmobilizadas nunha membrana de nitrocelulosa similar. Serve para separar proteínas que interaccionan co ARN.

## Historia 
O científico Edwin Southern foi o creador da primeira técnica de blotting ou transferencia, que se denominou co seu apelido Southern blot (transferencia de Southern), que era unha técnica analítica utilizada para detectar ADN. A técnica requiría usar electroforese en xel, un importante método analítico que implica a migración de ADN, ARN ou proteínas cargados a través dun campo eléctrico, que se separan baseándose no seu tamaño e carga. No Southern blot, os fragmentos de ADN separados son despois transferidos a unha membrana de filtración para a detección.

## Especificidades da técnica 
Realizar un northwestern blot implica separar as proteínas que se unen ao ARN por medio de electroforese en xel, que as sepra bseándose no seu tamaño e carga. Cada mostra debe cargarse nos pozos dun xel de agarosa ou poliacrilamida (xeralmente para facer unha SDS-PAGE) para analizar múltiples mostras ao mesmo tempo.

Os blots acabados de transferir son despois mergullados nunha solución bloqueante; tampóns bloqueantes comúns son o leite desnatado e a seroalbumina bovina. Esta solución bloqueante axuda a impedir que se produzan unións non específicas cos anticorpos primarios ou secundarios da membrana de nitrocelulosa. Unha vez que se deixou que a solución bloqueante tivese un tempo adecuado de contacto co blot, aplícase un ARN competidor específico e déixase tempo para que incube á temperatura dunha habitación. Durante este tempo, o ARN competidor únese ás proteínas que se unen ao ARN nas mostras do blot. O tempo de incubación durante este proceso pode variar dependendo da concentración do ARN competidor aplicado, pero adoita ser dunha hora. Despois de completada a incubación, o blot adoita lavarse polo menos tres veces durante 5 minutos en cada lavado, para diluír e retirar o ARN da solución. Tampóns de lavado comúns son o salino tamponado con fosfato (PBS) ou unha solución ao 10% de Tween 20. Un lavado incorrecto afecta á claridade do revelado do blot. Unha vez rematado o lavado, o blot revélase despois con raios X ou métodos similares de autorradiografía.

## Aplicacións 
Despois de revelar o blot usando raios X ou autorradiografía, os resultados poden anlizarse e interpretarse para determinar o tamaño proximado e concentración das proteínas de interese que se unen o ARN para realizar un posterior estudo das mesmas. A localización e concentración das proteínas que se unen ao ARN no blot poden afectar os resultados, e por veces poden aparecer bandas despois do revelado. Estas bandas poden axudar aos investigadores a determinr o tamaño e a concentración das proteínas que se unen ao ARN de interese. Cando se coñece o tamaño aproximado da proteína, a mostra orixinal pode facerse pasar por unha máquina de cromatografía para separala por tamaño. Ademais, unha vez que se illa a proteína, pode dixerirse con tripsina, e pode utilizarse a espectrometría de masas para secuenciar os péptidos e determinar a identidade da proteína específica.

## Vantaxes e desvantaxes 
Entre as vantaxes que teñen os northwestern blots están a detección rápida de proteínas específicas que se unen ao ARN e a estimación dos pesos moleculares aproximados de ditas proteínas. O northwestern blot permite a detección de proteínas identificadas de forma barata. O blot é normalmente o primeiro paso que se realiza nunha investigación, xa que permite a identificación dos pesos moleculares aproximados, e unha vez que se coñece o peso molecular permite posteriores investigacións ou purificacións usando outros métodos como a cromatografía. Outra vantaxe do northwestern blot é que axuda a construír bibliotecas de expresión de ligandos cognados.

Unha desvantaxe que se ten sinalado é que algunhas interaccións ARN-proteína con propiedades de unión ao ARN malas poden non ser detectables con esta técnica.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Southern blot
* Western blot
* Northern blot
* Southwestern blot
* Eastern blot
* Electroforese en xel
* SDS-PAGE
* Cromatografía

### Ligazóns externas 
;Protocolos

* Northwestern blot da interacción proteínas-ARN de panículas novas de arroz
* Illamento de ARN e análise por nortern blot
* Técnicas de blotting de proteínas