Xenopus

***Xenopus*** (do grego ξενος, *xenos*, 'estraño', πους, *pous*, 'pé') é un xénero de ras de vida moi acuática nativas da África subsahariana. Describíronse polo momento 20 especies dentro deste xénero. As dúas especies mellor coñecidas son *Xenopus laevis* e *Xenopus tropicalis*, que son frecuentemente estudados como organismos modelo para a bioloxía do desenvolvemento, bioloxía celular, toxicoloxía, neurociencia e como modelo de doenzas humanas e defectos conxénitos.

O xénero é tamén coñecido pola súa poliploidía, e algunhas especies teñen 12 xogos de  cromosomas.

## Características 
### Descrición 
Todas as especies de *Xenopus* teñen corpos aplanados, algo ovoides e hidrodinámicos, cunha pel moi escorregadiza debido ao seu recubrimento de moco protector. A pel desta ra é lisa, pero cunha liña lateral sensorial que ten unha aparencia de liña. Estas ras son todas excelentes nadadoras e teñen as dedas dos pés completamente palmadas e potentes, aínda que os dedos das mans carecen de membrana interdixital. Tres das dedas de cada pé teñen unhas garras ben visibles.

Os ollos destas ras están na parte superior da cabeza, mirando cara a adiante. As pupilas son circulares. Non teñen pálpebras móbiles, nin lingua móbil (a lingua está completamente pegada ao solo da boca).

A diferenza da maioría dos anfibios, carecen de haptoglobina no seu sangue. As femias de moitas especies producen unha chamada de liberación, e as femias de *Xenopus laevis* producen unha chamada adicional cando son sexualmente receptivas e están preparadas para poñer ovos. As especies de *Xenopus* son tamén activas durante as horas de lusco-fusco. Porén, a ampla duración do uso de *Xenopus* en investigación nace do feito adicional de que os extractos libres de célula feitos a partir de *Xenopus* son un excelente sistema in vitro para estudos de aspectos fundamentais de bioloxía celular e molecular. Así, *Xenopus* é o único sistema modelo de vertebrado que permite un alto rendemento de análises *in vivo* da función xénica e bioquímica de alto rendemento. Ademais, os ovocitos de *Xenopus* son un sistema líder para estudos da fisioloxía das canles de transporte iónico. xa que as diferentes especies de *Xenopus* forman unha serie de ploidía formada por hibridación interespecífica.

Xenbase  é o base de datos de organismo modelo tanto para *Xenopus laevis* coma para *Xenopus tropicalis*.

## Investigación de xenes humanos de enfermidades 
Todos os modos de investigación de *Xenopus* (embrións, extractos libres de células e ovocitos) son utilizados comunmente en estudos directos de xenes de doenzas humanas e para estudar a ciencia básica que subxace no inicio e progresión do cancro. Os embrións de *Xenopus* para estudos *in vivo* da función de xenes de enfermidades humanas: os embrións de *Xenopus* son grandes e doados de manipular, e ademais, poden obterse miles de embrións nun só día. De feito, *Xenopus* foi o primeiro animal vertebrado para o cal se desenvolveron métodos que permitían unha rápida análise da función xénica usando a alteración da expresión (por inxección de ARNm ).  A inxección de ARNm de *Xenopus* levou á clonación do interferón. Ademais, o uso de oligonucleótidos morfolino antisentido para realizar knockdowns de xenes en embrións de vertebrados, que é agora amplamente usado, foi desenvolvido primeiro por Janet Heasman usando *Xenopus*.

Nos últimos anos estes enfoques foron moi importantes en estudos de xenes de doenzas humanas. O mecanismo de acción de varios xenes mutados nos trastornos de ril quístico humano (por exemplo a nefronoftise) foron amplamente estudados en embrións de *Xenopus*, o que serviu para aclarar a ligazón entre estes trastornos, a cilioxénese e a sinalización Wnt. Os embrións de *Xenopus* proporcionaron tamén unha rápida forma de probar e validar novos xenes de enfermidades que se foron descubrindo. Por exemplo, os estudos en *Xenopus* confirmaron e diluciaron o papel de *PYCR1* na cute laxa con características proxeroides.

*Xenopus* transxénico para o estudo da regulación transcricional de xenes de enfermidades humanas: Os embrións de *Xenopus* desenvólvense rapidamente, así a transxénese en *Xenopus* é un método rápido e efectivo para analizar secuencias xenómicas reguladoras. Nun estudo recente, revelouse que as mutacións no locus *SMAD7* estaban asociadas co cancro colorrectal humano. Un dato interesante é que as mutacións se encontran en secuencias conservadas pero non codificantes, o que suxire que estas mutacións exercen un impacto sobre os padróns de transcrición de *SMAD7*. Para comprobar estas hipóteses, os autores usaron a tranxénese de *Xenopus*, e revelaron que esta rexión xenómica orixinaba a expresión da GFP no intestino posterior. Ademais, os transxénicos feitos coa versión mutante desta rexión mostraban unha expresión substancialmente menor no intestino posterior.

Extractos libres de células de *Xenopus* para estudos bioquímicos de proteínas codificados por xenes humanos de enfermidades: unha vantaxe única do sistema de *Xenopus* é que os extractos citosólicos conteñen tanto proteínas solubles citoplásmicas coma nucleares (incluíndo proteínas cromatínicas). Isto está en contraste cos extractos celulares preparados a partir de células somáticas con compartimentos celulares xa diferenciados. Os extractos de ovos de *Xenopus* proporcionaron moita información sobre a bioloxía básica das células, especialmente sobre a división celular e as transaccións de ADN asociadas con ela (véxase máis abaixo).

Os estudos feitos en extractos de ovos de *Xenopus* tamén serviron para dilucidar os mecanismos de acción de xenes de enfermidades humanas asociadas con inestabilidade xenética e elevado risco de cancro, como a ataxia telanxiectasia, cancro de ovario e de mama de *BRCA1* herdado, síndrome de rotura de Nijmegen *Nbs1*, síndrome de Rothmund-Thomson *RecQL4*, oncoxene *c-Myc* e proteínas FANC (de anemia de Fanconi).

Ovocitos de *Xenopus* para estudos de expresión xénica e actividade de canles iónicas relacionadas cos doenzas humanas: Outra vantaxe de *Xenopus* é a capacidade de ensaiar de forma rápida e doada a actividade de canles e proteínas de transporte usando a expresión en ovocitos. Esta aplicación foi moi útil para a comprensión de enfermidades humanas, como os estudos relacionados coa transmisión do tripanosoma, epilepsia con ataxia e xordeira neurosensorial, arritmia cardíaca catastrófica (síndrome da QT longa), e leucoencefalopatía megaloencefálica.

A edición de xenes polo sistema CRISPR/CAS foi demostrada recentemente en *Xenopus tropicalis* e *Xenopus laevis*. Esta técnica está utilizándose para facer cribados dos efectos de xenes de enfermidades humanas en *Xenopus* e o sistema é suficientemente eficiente para estudar os efectos nos mesmos embrións que foron manipulados.

## Investigación de procesos biolóxicos fundamentais 
Transdución de sinais: Os embrións e extractos libres de células de *Xenopus* son amplamente usados para a investigación básica en transdución de sinais. Nos últimos anos, os embrións de *Xenopus* proporcionaron información sobre os mecanismos do TGF-beta e a transdución de sinais Wnt. Por exemplo, os embrións de *Xenopus* foron utilizados para identificar os encimas que controlan a ubiquitinación de Smad4, e para demostrar as ligazóns directas entre as vías de sinalización da superfamilia do TGF-beta e outras redes importantes, como a vía da quinase MAP e a vía Wnt. Ademais, os novos métodos que usaban extractos de ovos revelaron novas e importantes dianas do complexo de destrución Wnt/GSK3.

División celular: Os extractos de ovos de *Xenopus* permitiron o estudo de moitos eventos celulares complicados in vitro. Como o citosol dos ovos pode soportar ciclos sucesivos entre a mitose e a interfase in vitro, foi esencial para diversos estudos da división celular. Por exemplo, encontrouse primeiro que a pequena GTPase Ran regulaba o transporte nuclear na interfase, pero os extractos de ovos de *Xenopus* revelaron un papel fundamental exercido pola GTPase Ran na mitose independentemente do seu papel no transporte nuclear na interfase. De xeito similar, os extractos libres de células utilizáronse como modelo de ensamblaxe da envoltura nuclear a partir da cromatina, o que revelou a función da GTPase Ran na regulación da reensamblaxe da envoltura nuclear despois da mitose. Máis recentemente, usando extractos de ovos de *Xenopus*, era posible demostrar a función específica da mitose da lamina B nuclear na regulación da morfoxénese do fuso e para identificar novas proteínas que median a unión do cinetocoro aos microtúbulos.

Desenvolvemento embrionario: Os embrións de *Xenopus* foron amplamente usados na bioloxía do desenvolvemento. Un sumario dos recentes avances feitos por medio de investigacións en *Xenopus* en anos recentes inclúe:

#Epixenética da especificación do destino que vai ter a célula e mapas de referencia epixenómicos
#microARN nos padróns da capa xerminal e desenvolvemeno do ollo
#Ligazón entre a sinalización Wnt e a telomerase
#Desenvolvemento da vasculatura
#Morfoxénese do tracto gastrointestinal
#Inhibición de contacto e migración das células da crista neural e a xeración da crista neural a partir de células da blástula pluripotentes

Replicación do ADN: os extractos libres de células de *Xenopus* tamén soportan estudos da ensamblaxe sincronizada e a activación das orixes da replicación do ADN. Foron instrumentais para caracterizar a función bioquímica do complexo prerreplicativo, incluíndo as proteinas MCM.

Resposta aos danos no ADN: os extractos libres de células foron esenciais para desvelar as vías de sinalización que se activan en resposta a roturas de dobre febra no ADN (ATM), detención da forcada de replicación (ATR) ou ligazóns cruzadas entre febras do ADN (proteínas FA e ATR). Especialmente, varios mecanismos e compoñentes destas vías de transdución de sinais foron identificados primeiramente en *Xenopus*.

Apoptose: os ovocitos de *Xenopus* proporcionan un modelo axeitado para estudos bioquímicos da apoptose. Recentemente, os ovocitos foron utilizados para estudar os mecanismos bioquímicos da activación da caspase-2; un dato importante é que este mecanismo está conservado nos mamíferos.

Medicina rexenerativa: en anos recentes, o tremendo interese na bioloxía do desenvolvemento acrecentouse pola promesa de aplicala á medicina rexenerativa. *Xenopus* xogou tamén un papel aquí. Por exemplo, a expresión de sete factores de transcrición en células pluripotentes de *Xenopus* fixeron que estas células puidesen desenvolverse en ollos funcionais cando se implantaban en embrións de *Xenopus*, proporcionando información sobre a reparación da dexeneración ou dano retinal. Nun estudo completamente diferente, os embrións de *Xenopus* foron utilizados para estudar os efectos da tensión dos tecidos na morfoxénese, un aspecto que é esencial para a enxeñaría de tecidos in vitro.

Fisioloxía: o batido direccional dos cilios de células multiciliadas é esencial para o desenvolvemento e homeostase no sistema nervioso central, as vías aéreas e o oviduto. As células multiciliadas da epiderme de *Xenopus* desenvolvéronse recentemente como o primeiro banco de probas in vivo para estudos con células vivas de ditos tecidos ciliados, e estes estudos proporcionaron moitos datos sobre o control molecular e biomecánico do batido direccional.

## Cribados de pequenas moléculas para desenvolver novas terapias 
Debido á enorme cantidade de material que se obtén doadamente, todas as modalidades de investigación en *Xenopus* están agora sendo utilizadas para cribados baseados en pequenas moléculas.

A xenética química de crecemento vascular en cágados de *Xenopus*: Dada a importancia da neovascularización na progresión do cancro, os embrións de *Xenopus* foron utilizados recentemente para identificar novas pequenas moléculas inhibidoras do crecemento dos vasos sanguíneos. Os compostos identificados en *Xenopus* foron efectivos en ratos. Os embrións de ras foron moi importantes nun estudo que utilizou principios evolutivos para identificar un novo axente perturbador vascular que pode ter un potencial quimioterapéutico.

Probas in vivo de potenciais perturbadores endócrinos en embrións transxénicos de *Xenopus*: un ensaio de alto rendemento para a perturbación tiroide foi desenvolvido recentemente usando embrións transxénicos de *Xenopus*.

Cribados de pequenas moléculas en extractos de ovos de *Xenopus*: os extractos de ovos proporcionan rápidas análises de procesos de bioloxía molecular e poden ser cribados rapidamente. Este enfoque foi utilizado para identificar novos inhibidores de degradación de proteínas mediados polo proteasoma e encimas de reparación do ADN.

## Estudos xenéticos 
Aínda que *Xenopus laevis* é a especie máis comunmente utilizada en estudos de bioloxía do desenvolvemento, os estudos xenéticos, especialmente os estudos xenéticos avanzados, poden ser complicados polo seu xenoma pseudotetraploide.  *Xenopus tropicalis* proporciona un modelo máis simple para estudos xenéticos, ao ter un xenoma diploide.

## Técnicas de knockdown da expresión xenética 
A expresión dos xenes pode ser reducida por diversos medios, por exemplo usando oligonucleótidos antisentido dirixidos a moléculas de ARNm específicas. Os oligonucleótidos de ADN complementarios de moléculas de ARNm específicas adoitan ser modificados quimicamente para mellorar a súa estabilidade in vivo. As modificacións químicas usadas para este propósito inclúen o uso de fosforotioato, 2'-O-metil, morfolino, MEA fosforamidato e DEED fosforamidato.

### Oligonucleótidos morfolino 
Os oligos morfolino (ou Morpholino) utilízanse tanto en *X. laevis* coma en *X. tropicalis* para probar a función dunha proteína observando os resultados de eliminar a actividade da proteína. Por exemplo, cribouse desta forma un conxunto de xenes de *X. tropicalis*.

Os oligos morfolino (MOs) son oligos curtos antisentido feitos de nucleótidos modificados. Os MOs poden realizar un knockdown da expresión xénica ao inhibiren a tradución do ARNm, bloqueando o empalme de ARN, ou inhibindo a actividade e maduración dos miARN. Os MOs demostraron ser efectivos como ferramentas para o knockdown en experimentos de bioloxía do desenvolvemento e reactivos que bloquean o ARN para o cultivo de células. Os MOs non degradan os seus ARN diana, pero en vez diso actúan vía un mecanismo de bloqueo estérico de maneira independente de RNAseH. Permanecen estables en células e non inducen respostas inmunes. A microinxección de MOs en embrións temperáns de *Xenopus* poden suprimir a expresión xénica de maneira dirixida.

Como en todas as estratexias antisentido, diferentes MOs poden ter diferente eficacia, e poden causar efectos non específicos fóra da diana. A miúdo, varios MOs necesitan ser probados para encontrar unha secuencia diana efectiva. Utilízanse controis rigorosos para demostrar a especificidade, Xenbase mapea os MOs dos últimos xenomas de *Xenopus* obtidos en GBrowse, predín os impactos 'fóra de diana', e teñen unha listaxe de toda a literatura de *Xenopus* na cal se publicou o morfolino.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Ligazóns externas 
*Xenbase  ~ Unha páxina web de recursos de *Xenopus laevis* e *X. tropicalis*