Mutaxénese de transposón

A **mutaxénese de transposón** ou **mutaxénese de transposición** é un proceso biolóxico que permite a transferencia de xenes a un cromosoma  dun organismo hóspede, utilizando un transposón que interrompe ou modifica a función dun xene existente no cromosoma causando unha mutación. A mutaxénese de transposón é moito máis efectiva que a mutaxénese química, ten unha maior frecuencia de mutación e unha menor probabilidade de matar o organismo. Outras vantaxes son poder inducir mutacións dun só golpe, poder incorporar marcadores seleccionables na construción dunha cepa e poder recuperar os xenes despois da mutaxénese. Entre as súas desvantaxes están a baixa frecuencia de trransposición en sistemas vivos e a inexactitude da maioría dos sistemas de transposición.

## Historia 
A mutaxénese de transposón foi estudada primeiramente por Barbara McClintock na metade do século XX durante os seus traballos na planta do millo cos que gañou o Premio Nobel. En 1927 McClintock obtivo a súa licenciatura en botánica e empezou inmediatemente a investigar os cromosomas do millo. Na década de 1940 McClintock estaba estudando a descendencia de plants de millo autopolinizadas resultado de cruzamentos, que tiñan un cromosoma 9 roto. Estas plantas perderan os seus telómeros. Esta investigación supuxo o descubrimento dos elementos transpoñibles, Os primeiros experimentos de mutaxénese de transposón utilizaban bacteriófagos e plásmidos bacterianos conxugantes para a inserción de secuencias. Estes non eran moi específicos e facían difícil incorporar xenes específicos. Unha técnica máis nova chamada mutaxénese de lanzadeira usa xenes clonados específicos da especie hóspede para incorporar elementos xenéticos. A secuencia IS50R codifica dúas proteínas: Tnp e Inh. Estas dúas proteínas son idénticas en secuencia, excepto porque Inh carece dos 55 aminoácidos N-terminais. A Tnp codifica a transposase para todo o sistema e a Inh codifica un inhibidor da transposase. O dominio de unión ao ADN de Tnp está situado no tramo de 55 aminoácidos N-terminais e, por tanto, estes residuos son esenciais para a súa función.

miniatura|Sistema do transposón *Sleeping Beauty*. O encima transposase pode expresarse en *cis* ou en *trans* respecto á casete de xenes.

O mecanismo do SBTS é similar ao do sistema do transposón Tn5, pero o encima e secuencias xénicas son eucariotas en vez de procariotas. A transposase do sistema pode actuar en *trans* ou en *cis*, permitindo unha colección diversa de estruturas de transposón. O propio transposón está flanqueado por secuencias repetidas invertidas, que están ambas repetidas dúas veces de maneira directa, designadas secuencias IR/DR. A rexión interna consta do xene ou secuencia que se vai transpoñer e podería tamén conter o xene da transposase. Alternativamente, a transposase pode estar codificada nun plásmido separado ou inxectada na súa forma proteica. Outra estratexia é incorporar tanto o transposón coma os xenes da transposase nun vector viral, o cal pode ter como diana unha célula ou tecido que se elixa. A proteína transposase é extemadamente específica das secuencias ás que se une e pode discernir as súas secuencias IR/DR dunha secuencia similar por unha diferenza de só tres pares de bases. Unha vez que o encima se une a ambos os extremos do transposón, as secuencias IR/DR son xuntadas e sostidas pola transposase nunha Formación do Complexo Sináptico (SCF). A formación da SCF é un punto de control que asegura un correcto corte. A HMGB1 é unha proteína non histona do hóspede que está asociada coa cromatina eucariota. Mellora a unión preferente da transposase ás secuencias IR/DR e probablemente é esencial para a formación e estabilidade do complexo SCF. A transposase corta o ADN nos sitios diana, xerando extremos colgantes 3' que sobresaen ("adherentes"). O encima entón toma como sitios dianas para a integración os dinucleótidos TA do xenoma do hóspede. O mesmo sitio catalítico encimático que clivou o ADN é responsable de integrar o ADN no xenoma, duplicando a rexión do xenoma neste proceso. Aínda que a transposase é específica para os dinucleótidos TA, a alta frecuencia destes pares no xenoma indica que o transposón sofre unha integración bastante aleatoria.

## Aplicacións prácticas 
Como resultado da capacidade da mutaxénese de tansposón de incorporar xenes na maioría das áreas dun determinado cromosoma, hai varias funcións asociadas que se poden estudar con este proceso.
* Os xenes de virulencia en virus e bacterias poden descubrirse alterando xenes e observando se hai cambios no fenotipo. Isto ten importancia na produción de antibióticos e no control de enfermidades.
* Poden descubrirse xenes non esenciais inducindo mutaxénese de trasnposón nun organismo. Os xenes tnasformados poden despois identificarse realizando unha PCR no xenoma recuperado do organismo usando un cebador específico de ORF e un cebador específico de transposón.

## Exemplos específicos 
### Identificación da agrupación de xenes de virulencia de *Mycobacterium tuberculosis* 
En 1999, identificáronse os xenes de virulencia asociados con *Mycobacterium tuberculosis* (axente da tuberculose) por knockout de xenes mediado por mutaxénese de transposón. Preparouse por enxeñaría un plásmido chamado pCG113 que contiña xenes de resistencia á kanamicina e a secuencia de inserción IS*1096* para que contivese etiquetas de 80 pares de bases variables. Esta técnica chámase STM. Os plásmidos foron despois utilizados para a transformación en células de *M. tuberculosis* por electroporación. As colonias foron situadas en placas con kanamicina para seleccionar as células resistentes. As colonias que sufriron eventos de transposición aleatoria identificáronse por medio de dixestión con *Bam*HI e sometidas a Southern blot usando unha sonda de ADN interna IS*1096*. As colonias foron cribadas para buscar multiplicación atenuada para identificar colonias con mutacións en xenes de virulencia candidatos. As mutacións que orixinaban un fenotipo atenuado foron mapados por amplificación das rexións adxacentes ás secuencias IS*1096* e comparados co xenoma publicado de *M. tuberculosis*. Neste exemplo dun tipo de mutaxénese de transposón identificáronse 13 loci patoxénicos no xenoma de *M. tuberculosis* que non foran previamente asociados coa enfermidade. Isto é unha información esencial para a comprensión do ciclo de infección da bacteria.

### Mutaxénese de trasnposón *PiggyBac (PB)* para o descubrimento de xenes do cancro 
O transposón *PiggyBac* (PB) da eiruga do repolo *Trichoplusia ni* foi preparada por enxeñaría para ser moi activa en células de mamífero e pode realizar unha mutaxénese en todo o xenoma. Os transposóns conteñen tanto repeticións inversas *PB* coma *Sleeping Beauty*, para ser recoñecidas por ambas as transposases e incrementar a frecuencia de transposición. Ademais, o transposón contiña elementos promotores e amplificadores, doantes e receptores de empalme para permitir mutacións de ganancia ou perda de función dependendo da orientación do transposón e sinais de poliadenilación bidireccional. Os transposóns foron utilizados para a transformación en células de rato in vitro e foron analizados os mutantes que contiñan tumores. O mecanismo da mutación que causaba a formación do tumor determinaba se o xene era clasificado como unn oncoxene ou un xene supresor de tumores. Os oncoxenes adoitaban ser caracterizados por insercións en rexións que orixinan a sobreexpresión dun xene, mentres que os xenes supresores de tumores eran clasificados como tales baseándose en mutacións de perda de función. Como o rato é un organismo modelo para o estudo da fisioloxía e doenzas humanas, esta investigación axudará a comprender mellor os xenes que causan cancro e as posibles dianas terapéuticas.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Elemento transpoñible
* Barbara McClintock
* Mutaxénese etiquetada con sinatura

### Ligazóns externas 
* 
* "Transposon Mutagenisis" - Food Ingredient News
* 
*