Célula nai pluripotente inducida

[miniatura|300px|**Esquema da xeración de células nai pluripotentes inducidas (iPS) a partir de células adultas (reprogramación).** (1) Íllanse e cultívanse as [célula (bioloxía)|células adultas que se van utilizar. (2) Faise a transferencia de xenes exóxenos provenientes de células nai ás células por medio de vehículos retrovirais. As células de cor vermella son células transfectadas que xa expresan os xenes exóxenos. (3) Cultívanse as células transfectadas con métodos de cultivo de células nai usando células inactivadas como capas alimentadoras (cor gris). (4) Un subgrupo pequeno destas células transfectadas transfórmanse en células nai pluripotentes inducidas (iPS) e a partir dese momento producen colonias de células nai.]]
[miniatura|Colonias de células iPS humanas. As células con forma de fuso do fondo son [fibroblastos de rato. Só as células que están no centro da colonia son células iPS humanas.]]

As **células nai pluripotentes inducidas** (normalmente abreviadas como células **iPS**, polas súas siglas en inglés de "Induced Pluripotent Stem") son un tipo de células nai con características pluripotenciais (con capacidade de xeraren a maioría dos tecidos) derivadas artificialmente dunha célula que inicialmente non era pluripotencial. Xeralmente, utilízase para obtelas unha célula adulta diferenciada procedente dun tecido, sobre a que se induce a expresión de varios xenes exóxenos, tales como Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4, que poden desdiferenciala. Esta desdiferenciación denomínase reprogramación. As células iPS poden: a) diferenciarse en células de tecidos pertencentes ás tres capas xerminais dun embrión natural (ver embrioxénese humana): endoderma, mesoderma e ectoderma, b) formar teratomas, e c) orixinar ratos quiméricos ou quimeras.

Demostrouse que as células iPS son idénticas en moitos aspectos e similares noutros ás células nai embrionarias (normalmente abreviadas como **ES**, polas súas siglas en inglés de "Embryonic Stem"). Por exemplo, son iguais en morfoloxía, expresión de certos xenes e proteínas, padróns de metilación do ADN, tempo de duplicación celular e capacidade de diferenciación a células doutros tecidos. Porén, o mecanismo por medio do cal se inducen e a súa relación coas células ES segue aínda en investigación

As células iPS obtivéronse por primeira vez no ano 2006 a partir de células de ratos Isto considérase un dos avances máis importantes da investigación con células nai, xa que permite obter células nai pluripotentes a partir de células adultas. As iPS teñen aplicacións como modelos para o estudo de doenzas, posibles usos terapéuticos (diminuíndo o rexeitamento nos transplantes e sen a controversia do uso de embrións que teñen as células ES), e en investigacións básicas.

Shinya Yamanaka e John Gurdon foron galardoados en 2012 co Premio Nobel de Fisioloxía ou Medicina. Os xenes exóxenos transferidos son principalmente os correspondentes a factores de transcrición asociados ás células ES. Tres ou catro semanas despois, unha pequena porcentaxe das células transferidas comenzan a diferenciarse volvéndose morfolóxica e bioquimicamente similares ás células ES. As células iPS ou células adultas reprogramadas íllanse por selección cun xene de resistencia a antibióticos e para confirmar a súa identidade (véxase máis adiante).

O equipo de Shinya Yamanaka da Universidade de Kyoto (Xapón) en 2006 foi o primeiro que creou células iPS. Catro xenes que codificaban factores de transcrición resultaron esenciais para producir células iPS: os denominados Oct-3/4, Sox2, c-Myc e Klf4. Das células tratadas con retrovirus que codifican ditos xenes seleccionáronse só aquelas que os expresaban con antibióticos e pola presenza do xene Fbx15 (células Fbx15+). Porén, estas células iPS tiñan padróns de metilación do ADN distintos dos das células ES e ademais non producían ratos quiméricos viables.

### Segunda xeración en ratos 
En 2007, o mesmo grupo publicou un traballo xunto con outros grupos de investigación independentes da Universidade Harvard, o MIT e a Universidade de California, que demostraba que se podían obter células iPS a partir de fibroblastos de rato con capacidade de formar quimeras viables utilizando o xene Nanog en vez do Fbx15. Os padróns de metilación do ADN e a produción de ratos quiméricos viables indicaron que Nanog é un determinante importante da pluripotencia celular. Nun estudo posterior, demostrouse que se poden manter células iPS sen c-Myc que non desenvolven cancro, mais o procedemento é menos eficiente.

## Problemas dos primeiros métodos de reprogramación celular 
Aínda que os primeiros métodos que utilizaban xenes que codificaban factores de transcrición demostraron que as células adultas diferenciadas poden reprogramarse a células iPS, aínda existen problemas importantes, tales como: i) eficiencia, ii) mutaxénese insercional, iii) tumores e iv) reprogramación incompleta. 
 
* **Eficiencia**: é un problema que afecta o proceso de obtención de células iPS. A eficiencia ou porcentaxe de obtención de células reprogramadas é aínda moi baixa. Por exemplo, a porcentaxe de reprogramación no estudo en ratos de Yamanaka foi só do 0,1-1% e constantemente se producen novos avances. Por exemplo, para obter unha máxima eficiencia, nos primeiros métodos descritos cumpría que as células iPS crecesen sobre unha capa de células alimentadoras que aínda que estaban inactivadas supoñían unha posible fonte de contaminación. Con novos métodos conseguiuse facer crecer células iPS en ausencia de ditas capas en boas condicións e durante tempo prolongado.

* **Mutaxénese insercional**: é un problema que afecta as posibles aplicacións en medicina rexenerativa. A inserción dos xenes exóxenos que codifican os factores de transcrición no xenoma da célula diana limita a súa utilidade debido ao risco de mutaxénese insercional no xenoma das células diana. As mutacións introducidas poden ser deletéreas ou inducir tumores. Unha estratexia para evitar a mutaxénese insercional é o uso de vectores alternativos. Para iso exploráronse plásmidos, adenovirus e transposóns, que aínda que reducen as posibilidades de mutaxénese insercional, teñen unha eficiencia de reprogramación menor. Outras estratexias que empregan proteínas ou ARN tamén teñen unha eficiencia menor. Por último, o emprego de moléculas de baixo peso molecular que simulan o efecto dos factores de transcrición parece hoxe por hoxe a alternativa máis esperanzadora. 

* **Tumores**: é un problema que afecta as posibles aplicacións en medicina rexenerativa. Algúns dos xenes reprogramadores son oncoxenes, o que aumenta a probabilidade de indución de tumores. Aínda que se puido eliminar o c-Myc despois de xerar células iPS para eliminar a formación de tumores,

* **Reprogramación incompleta**: é un problema que afecta as posibles aplicacións en medicina rexenerativa. Para reprogramar completamente unha célula diferenciada dun tipo celular a outro, o código epixenético causante da diferenciación celular debe ser "reformateado", o que non sempre se consegue ao 100% dependendo de cada tipo de célula diana. Malia estes inconvenientes, tres equipos independentes puideron xerar células iPS que deron orixe a ratos derivados enteiramente de células iPS inxectándoas a blastocistos tetraploides.

## Métodos alternativos de reprogramación celular 
Para que un método de reprogramación sexa práctico ou mesmo viable, as eficiencias ou porcentaxes de reprogramación (número de células reprogramadas respecto ao total de células adultas diana iniciais) deben ser o máis altas posible. Por exemplo, unha eficiencia de reprogramación do 50-100 % sería óptima, pero os primeiros porcentaxes de reprogramación estaban no 0,1-1%. Suponse que o ácido valproico simula os sinais do factor de transcrición c-Myc. Propúxose un tipo similar de mecanismo para o BIX-01294, un inhibidor da histona metiltransferase que simula os efectos do Sox2. A simulación doutros sinais é un tema de activa investigación (Chen, et al. 2011). 

Outra estratexia estaba baseada no estudo da ruta molecular natural de diferenciación das células mesenquimais a epiteliais na que interveñen o TGF-beta (factor de transformación beta) e MEK (quinase das proteínas epiteliais activada por mitóxenos). Primeiro seleccionáronse dous inhibidores de TGF-beta e MEK entre aqueles que non só inhibían a diferenciación senón que tamén eran os máis activos en reprogramación (SB431412 e PD0325901). Cando se usaron estes dous inhibidores en combinación, multiplicouse aproximadamente por 100 a eficiencia de reprogramación. Despois investigouse dunha maneira similar, a ruta molecular natural empregada para manter a supervivencia celular. Así, despois de ensaiar en reprogramación varios compostos que inhiben dita ruta, seleccionouse o Thiazovivin. Usando unha mestura destes tres inhibidores conseguiuse unha mellora na eficiencia de reprogramación, que se multiplicou case por 200.

Por outra parte, o estudo dos mecanismos de reprogramación posiblemente achegará novas alternativas e ideas sobre este importante asunto.

### Adenovirus, plásmidos e transposóns 
Outra estratexia para evitar a formación de tumores foi o uso de vectores alternativos ou non retrovirais, tales como os adenovirus, plásmidos e transposóns. Porén, aínda que os métodos baseados en todos estes vectores alternativos evitan o uso de retrovirus, seguen requirindo o uso de xenes exóxenos provocadores de tumores para obter a reprogramación. 

Os adenovirus son únicos entre os vectores virais porque non incorporan ningún dos seus propios xenes ao xenoma da célula diana e por tanto evitan a mutaxénese insercional. Outra vantaxe de usar adenovirus é que soamente necesitan estar presentes durante un breve tempo para induciren a reprogramación. En 2008, usouse adenovirus para vehiculizar os catro xenes exóxenos (factores de transcrición) a células de ratos obtendo células idénticas ás ES, En ditos traballos, descríbese como conseguiron transformar células de rato con dous plásmidos, un deles expresaba o c-Myc, mentres que o segundo expresaba Oct4, Klf4 e Sox2. Porén, estes métodos son moito menos eficientes que os baseados en retrovirus e tamén teñen posibilidades de mutaxénese insercional aínda que en menor proporción que os retrovirus.

Intentouse tamén o uso dalgúns transposóns. Por exemplo, varios estudos demostraron que os transposóns denominados piggyBac poden  transportar os xenes de reprogramación sen introduciren mutacións indesexables no xenoma da célula diana, xa que efectúan unha reexcisión dos xenes exóxenos evitando a mutaxénese insercional. Así, púidose demostrar que as proteínas recombinantes correspondentes aos factores de transcrición se podían usar para a reprogramación. Os microARNs quizais actúan bloqueando a expresión de represores dos catro ou algún dos catro factores de transcrición de Yamanaka. Un obstáculo para o uso da reprogramación por ARN é a súa inestabilidade. Porén, poderíanse usar ARNs con modificacións estabilizadoras (5-metilguanosinas ou pseudouracilos), que ademais de seren máis estables e teñen menor probabilidade de mutaxénese insercional. Outro obstáculo quizais máis importante, é que os ARN exóxenos provocan respostas antivirais innatas nas células diana.

## Xenes que inducen reprogramación 
A xeración de células iPS depende de que se usen os xenes axeitados para a indución da reprogramación. Ata agora identificáronse os Oct-3/4 e varios membros da familia dos xenes Sox (Sox1, Sox2, Sox3, Sox15) como xenes indispensables para inducir a reprogramación. Por outra parte, xenes tales como os das familias dos factores Kruppel (Klf1, Klf2, Klf4, Klf5), Myc (c-myc, L-myc, N-myc), Nanog e LIN28, identificáronse como xenes implicados en aumentar a eficiencia de reprogramación. Máis en detalle:
* **Xenes indispensables na reprogramación**
** **Xene Oct-3/4**: o Oct-3/4 (Pou5f1) é un dos xenes da familia dos factores de transcrición de estrutura octamérica, coñecido polo seu papel no mantemento da pluripotencia e do potencial de diferenciación das células ES. A ausencia de Oct-3/4 en células que son naturalmente Oct-3/4+, tales como os blastómeros e as células ES causa a súa diferenciación espontánea. Outros xenes da familia Oct, como Oct1 e Oct6, non producen indución da reprogramación, demostrando a especificidade de Oct-3/4.
** **Xenes Sox**: a familia de xenes Sox está asociada ao mantemento tanto da pluripotencia coma da multipotencia mentres que os xenes Oct-3/4 están exclusivamente implicados no mantemento da pluripotencia. O xene Sox2 foi o que se utilizou inicialmente, pero despois demostrouse que tamén se poden usar outros xenes da familia Sox. Por exemplo o Sox1 induce células iPS cunha eficiencia similar a Sox2, mentres que os xenes Sox3, Sox15 e Sox18 tamén inducen células iPS pero con menor eficiencia.
* **Xenes que aumentan a eficiencia da reprogramación**
** **Xenes Kruppel (Klf)**: o xene Klf4 da familia Klf identificouno inicialmente o grupo de Yamanaka como un factor de indución de células iPS para rato, aínda que o grupo de Thomson comprobou que Klf4 non inducía células iPS humanas. Klf2 e Klf4 inducen células iPS con alta eficiencia mentres que Klf1 e Klf5 o fan cunha eficacia menor.
** **Xenes Myc**: a familia de xenes Myc son oncoxenes envolvidos no cancro. O xene c-Myc está implicado na indución de células iPS de rato e humanas. Porén, despois comprobouse que a súa presenza non é necesaria para manter células iPS humanas.
** **Perfil global de metilación**: as células iPS humanas teñen perfís de metilación global moi similares aos das células ES. Porén, distintas iPS mostran variacións da orde dunhas 1000 veces nos seus perfís de metilación. A metade deses perfís son semellantes aos da célula da que se derivaron mentres que a outra metade é específica de células iPS. Nalgunhas iPS atopáronse decenas de rexións do ADN de megabases de lonxitude que non están reprogramadas como as das células ES.

## Aplicacións: modelos, medicina rexenerativa e ciencia básica 
As células iPS estanse aplicando ao estudo de doenzas xenéticas humanas: i) como modelos in vitro de enfermidades para desenvolver medicamentos específicos, ii) considerando o seu uso como posible tratamento individual en medicina rexenerativa, e iii) utilizándoas para investigación básica. Para adiantarse a estas posibles aplicacións, xa se comezou a pensar na organización de bancos de células nai.

miniatura|500px|**Esquema da xeración e aplicacións das células iPS**. As células iPS poden derivarse de cada paciente. Unha vez obtidas, amplifícanse por división celular e parte delas consérvase conxelada en nitróxeno líquido. As súas aplicacións son: i) como modelos in vitro de enfermidades para desenvolver medicamentos específicos, ii) para o seu uso como posible tratamento individual en medicina rexenerativa, e iii) utilizalas para investigación básica.

* **Modelos in vitro de enfermidades**. Para o seu uso como modelos in vitro de enfermidades específicas de cada paciente, as células iPS derívanse dos pacientes correspondentes. Por exemplo, en 2011 publicáronse traballos con células iPS desenvolvidas a partir de pacientes con varios tipos de síndromes raras, atrofia muscular, desordes cardiovasculares, e ataxia (Liu, et al. 2011). Debido a que en principio se poden obter cantidades ilimitadas de células iPS “enfermas”, pódense estudar as características moleculares da doenza e ensaiar posible tratamentos e fármacos in vitro antes de aplicalos ao paciente.

* **Medicina rexenerativa**. O desafío de producir células iPS máis seguras continúa para desenvolver posibles tratamentos terapéuticos de enfermidades humanas en medicina rexenerativa, (Zhang, et al. 2011). Ademais, un traballo recente indica que as células iPS poderían ser máis tumoroxénicas que as ES. Isto podería deberse a que algúns dos xenes, por exemplo, os xenes Myc, son oncoxenes moi coñecidos. A omisión dos Myc provoca unha diminución á centésima parte da eficiencia de reprogramación, aínda que en 2008, se describiu unha nova técnica para eliminar os oncoxenes Myc unha vez conseguida a indución da pluripotencia, incrementando así a súa seguridade. Relacionado con estas posibles aplicacións é o tema dos rexeitamentos de autotransplantes. Debido a que as células iPS se poden derivar das propias células adultas do propio paciente, ao contrario que as células ES, pensábase que un tratamento coas súas células iPS (autotransplante) evitaría as respostas inmunolóxicas responsables de rexeitamentos. Porén, xa existen as primeiras evidencias de que tamén este pode seguir sendo un problema coas células iPS. 

* **Investigación básica**. En canto a estudos máis básicos necesarios para comprender os mecanismos de reprogramación e con posibilidades de aplicación a máis longo prazo, outro reto importante é a caracterización proteómica e dos perfís de transcrición das células iPS. O grupo dirixido por Wu na Universidade Stanford fixo avances significativos en proteómica, mentres que outros equipos traballan na caracterización do transcritoma.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Shinya Yamanaka
* Célula nai

### Bibliografía 
* Chen HF, Chuang CY, Lee WC, Huang HP, Wu HC, Ho HN, Chen YJ, Kuo HC (**2011**). "Surface marker epithelial cell adhesión molecule and E-cadherin facilitate the identification and selection of induced pluripotent stem cells". Stem Cell Rev 7 (3): 722-735. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21305366).
* Chen J, Liu J, Chen Y, Yang J, Liu H, Zhao X, Mo K, Song H, Guo L, Chu S et al (**2011**). "Rational optimization of reprogramming culture conditions for the generation of induced pluripotent stem cells with ultra-high efficiency and fast kinetics". Cell Res 21 (6): 884-894. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21445094).
* Chen T, Shen L, Yu J, Wan H, Guo A, Chen J, Long Y, Zhao J, Pei G (**2011**). "Rapamycin and other longevity-promoting compounds enhance the generation of mouse induced pluripotent stem cells". Aging Cell 10 (5): 908-911. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21615676).
* Liu J, Verma PJ, Evans-Galea MV, Delatycki MB, Michalska A, Leung J, Crombie D, Sarsero JP, Williamson R, Dottori M et al (**2011**). "Generation of induced pluripotent stem cell lines from Friedreich ataxia patients". Stem Cell Rev 7 (3): 703-713. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21181307).
* Liu SP, Fu RH, Huang YC, Chen SY, Chien YJ, Hsu CY, Tsai CH, Shyu WC, Lin SZ (**2011**). "Induced pluripotent stem (iPS) cell research overview". Cell Transplant 20 (1): 15-19. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20887681).
* Zhang F, Citra F, Wang DA (**2011**). "Prospects of induced pluripotent stem cell technology in regenerative medicine". Tissue Eng Part B Rev 17 (2): 115-124. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21210760).
* Zhang G, Shang B, Yang P, Cao Z, Pan Y, Zhou Q (**2011**). "Induced pluripotent stem (iPS) cell consensus genes: Implication for the risk of tumorigenesis and cancers in iPS cell therapy". Stem Cells Dev (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22185567).
* Zhao T, Zhang ZN, Rong Z, Xu Y (**2011**). "Immunogenicity of induced pluripotent stem cells". Nature 474 (7350): 212-215. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21572395).

### Ligazóns externas 
* Las células iPS inauguran una tercera vía, Diario Médico 30/05/2008
* Center for iPS Cell Research and Application, Universidade de Kioto
* With few factors, adult cells take on character of embryonic stem cells 
* Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4 
* Vídeo de 2 minutos de BSCRF sobre céluls nais pluripotentes inducidas
* 20Minute Video / The Discovery and Future of Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells de Dr.Yamanaka 8 de xaneiro de 2008
* Blog que trata especificamente de células iPS e investigación, biotecnoloxía e asuntos orientados a pacientes
* Folla de datos sobre reprogramación
* Insertech on stem cells