Replisoma

miniatura|600px|dereita|Unha representación das estruturas do replisoma durante a replicación do ADN.
O **replisoma** é unha complexa máquina molecular que leva a cabo a replicación do ADN. En primeiro lugar o replisoma desenrola o ADN bicatenario en dúas febras monocatenarias. Para cada unha das febras simples resultantes, sintetízase unha nova secuencia complementaria de ADN. O resultado neto é a formación de dúas novas secuencias de ADN bicatenarias que son copias exactas da secuencia bicatenaria orixinal de ADN.

En canto á súa estrutura, o replisoma está composto por dous complexos de ADN polimerase replicativos, un dos cales sintetiza a febra líder, mentres que a outra sintetiza a febra retardada. O replisoma está composto por varias proteínas como a helicase, RFC, PCNA, xirase/topoisomerase, SSB/RPA, primase, ADN polimerase III, RNase H, e ligase.

## Resumo do proceso de replicación do ADN 
En **procariotas**, cada nucleoide en división require dous replisomas para realizar a replicación bidireccional. Os dous replisomas continúan a replicación en ambas as forquitas de replicación no medio da célula a partir dunha única orixe de replicación. Finalmente, cando se replica o sitio de terminación, os dous replisomas sepáranse do ADN. O replisoma permanece nunha localización no medio da célula fixa, unido á membrana plasmática, e as febras molde de ADN enfíanse ao seu través, é dicir, o ADN vai entrando a través do par estacionario de replisomas localizado na membrana da célula.

En **eucariotas**, na replicación hai numerosas burbullas de replicación formadas nas moitas orixes de replicación situadas ao longo do cromosoma (a diferenza dos procariotas que só tiñan unha orixe). Igual que nos procariotas, cómpren dous replisomas en cada burbulla, un en cada forquita de replicación situada en cada extremo da burbulla de replicación. Debido a que hai diferenzas significativas no tamaño dos cromosomas, e ás complexidades asociadas coa alta condensación dos cromosomas, hai varios aspectos do proceso de replicación do ADN en eucariotas, como as fases terminais, que están peor caracterizadas que en procariotas.

## Problemas na replicación do ADN 
O replisoma é un sistema no cal actúan xuntos varios factores proteicos para resolver os problemas estruturais e quimicos que se presentan na replicación do ADN. O tamaño e estrutura dos cromosomas varía dun organismo a outro, pero como as moléculas de ADN son o depósito da información xenética en todos os dominios da vida, moitos problemas e solucións para a replicación son os mesmos en diferentes organismos. Como resultado, os factores de replicación que resolven estes problemas están moi conservados en canto á súa estrutura, química, funcionalidade, ou secuencia. As dificultades estruturais e químicas que hai que vencer son as seguintes:

* Ensamblaxe do replisoma eficiente nas orixes de replicación (complexos de recoñecemento das orixes ou secuencias de orixe de replicación específicas nalgúns organismos).
* Separar o dúplex de ADN nas febras molde líder e retardada (helicases).
* Protexer as febras líder e retardada de danos despois da separación do dúplex (factores SSB e RPA).
* Cebado das febras molde líder e retardada (primase ou ADN polimerase alfa).
* Asegurar a procesividade (factores de carga de abrazadeiras, proteínas abrazadeira con forma de anel, proteínas de unión á febra).
* Alta fidelidade na replicación do ADN (ADN polimerase III, ADN polimerase delta, ADN polimerase epsilon. Todas teñen unha taxa de erro baixa debido á súa estrutura e química).
* Corrección de erros (sitios activos da polimerase replicativa sensibles aos erros; os dominios de exonuclease 3' a 5' das polimerases replicativas corrixen os erros).
* Polimerización sincronizada das febras líder e retardada a pesar da estrutura antiparalela (estrutura da forquita de replicación, dimerización das polimerases replicativas).
* Eliminación do cebador ou *primer* (ADN polimerase I, RNAse H, endonucleases flap como a FEN1, ou outros factores de reparación do ADN).
* Formación de enlaces fosfodiéster nos ocos entre os fragmentos de Okazaki (ligase).

En xeral, estas dificultades que ten a replicación do ADN implican a estrutura e química das moléculas, e, desde unha perspectiva de sistemas, as relacións subxacentes entre a estrutura e a química.

## Resolución dos problemas na replicación do ADN 
Como se dixo antes, moitos dos problemas estruturais e químicos asociados coa replicación do ADN son xestionados por unha maquinaria molecular que está moi conservada entre especies. Neste capítulo discútese como os factores que forman parte do replisoma resolven todas estas dificultades.

### Ensamblaxe do replisoma 
A replicación do ADN empeza en sitios chamados orixes de replicación. Nos organismos con xenomas pequenos e estrutura cromosómica simple, como as bacterias, pode haber só unha orixe de replicación no cromosoma. Nos organismos con xenomas grandes e estrutura cromosómica complexa, como os humanos, pode haber centos ou miles destas orixes espalladas por todos os cromosomas.

A estrutura do ADN nun cromosoma varía co tempo, no espazo e coa secuencia, e crese que estas variacións, ademais do seu papel na expresión xénica, tamén xogan papeis activos na ensamblaxe dos replisomas durante a síntese de ADN. A ensamblaxe do replisoma nunha orixe de replicación pode dividirse *grosso modo* en tres fases.

En procariotas:

* Formación do complexo de pre-replicación. A proteína DnaA únese ao complexo de recoñecemento da orixe e separa os dúplex do ADN. Isto atrae as proteínas DnaB helicase e DnaC, que manteñen a burbulla de replicación.
* Formación do complexo de pre-iniciación. A proteína SSB únese á febra sinxela separada e despois o factor gamma (factor de carga da abrazadeira) únese a SSB.
* Formación do complexo de iniciación. Gamma deposita a abrazadeira escorregante (beta) e atrae á ADN polimerase III.

En eucariotas:

* Formación do complexo de pre-replicación. Os factores MCM únense ao complexo de recoñecemento da orixe e separan o dúplex, formando unha burbulla de replicación.
* Formación do complexo de pre-iniciación. A proteína de replicación A (RPA) únese á febra simple de ADN e despois RFC (factor de carga da abrazadeira) únese a RPA.
* Formación do complexo de iniciación. O RFC deposita a abrazadeira escorregante (PCNA) e atrae a ADN polimerases como a alfa (α), delta (δ), e epsilon (ε).

Tanto en procariotas coma en eucariotas, o seguinte paso denomínase xeralmente "elongación", e durante esta fase ocorre a maioría da síntese de ADN.

### Separación do dúplex 
O ADN é un dúplex formado por dúas febras antiparalelas. Como demostraron Meselson e Stahl, o proceso de replicación é semiconservador. Durante a replicación o dúplex sepárase nas dúas febras que servirán de molde chamadas febra líder e febra retardada. Cada unha destas febras formará un novo dúplex ao unirse á febra que se sintetiza de novo a partir dos nucleótidos disoltos no medio. Factores proteicos chamados helicases encárganse de desenrolar o dúplex.

#### Helicases 
A helicase é un encima que rompe os enlaces de hidróxeno entre os pares de bases situados no medio do dúplex de ADN. Teñen unha estrutura parecida a un donuts ou rosquilla que se envolve arredor do ADN e separa as febras por diante de onde se está a realizar a síntese do ADN. En eucariotas, o complexo Mcm2-7 actúa como unha helicase, aínda que non está de todo claro cales das súas unidades cómpren para a actividade de helicase. Esta helicase translócase na mesma dirección que a ADN polimerase (de 3' a 5' con respecto á febra molde). En procariotas, as helicases están mellor identificadas e inclúen a dnaB, que se move de 5' a 3' sobre a febra oposta á da ADN polimerase.

### Desenrolando os superenrolamentos e descatenación 
miniatura|350px|dereita|Exemplos de enrolamentos topolóxicos introducidos durante o desenrolamento do dúplex e a separación das febras.

A medida que as helicases desenrolan a dobre hélice, cambios topolóxicos inducidos polo movemento rotacional das helicases fan que se produza un superenrolamento por diante da helicase (similar ao que ocorre cando se enrola unha corda).

#### Xirase e topoisomerases 
A xirase (unha forma de topoisomerase) relaxa e desfai o superenrolamento causado pola helicase. Faino cortando as febras de ADN, o que lle permite a este rotar e liberar o superenrolamento, e despois volve a unir as febras. A xirase atópase comunmente *augas arriba* da forquita de replicación, onde se forma o superenrolamento.

### Protección das febras líder e retardada 
[miniatura|dereita|350px|Representación da subunidade de 70kd da [proteína de replicación A.]]
O ADN monocatenario é moi inestable e pode formar enlaces de hidróxeno consigo mesmo que se denominan "forquitas" (ou a febra monocatenaria pode unirse inapropiadamente con outra febra monocatenaria). Para contrarrestar esta inestabilidade, hai **proteínas de unión á febra sinxela** (SSB en procariotas e proteína de replicación A en eucariotas) que se unen ás bases expostas para impedir un enlazamento inapropiado.

Se se considera cada febra como unha "corda elástica dinámica", o potencial estrutural para que se produza un enlazamento inapropiado é obvio.

A química que subxace no problema é o potencial para a formación de enlaces de hidróxeno entre pares de bases non relacionados. As proteínas de unión estabilízan a febra sinxela (monocatenaria) e protéxena de danos causados por reaccións químicas indebidas. A combinación dunha febra sinxela e as súas proteínas de unión serve de mellor substrato para as polimerases replicativas que a febra sinxela espida (as proteínas de unión proporcionan unha forza impulsora termodinámica extra para a reacción de polimerización). As proteínas de unión á febra son eliminadas por polimerases replicativas.

### Cebado das febras líder e retardada 
Desde unha perspectiva estrutural e química, unha febra simple de ADN por si soa (e as proteínas de unión á febra sinxela asociadas) non é axeitada para a polimerización. Isto débese a que as reaccións químicas catalizadas polas polimerases replicativas necesitan un 3' OH libre para iniciar a elongación da cadea de nucleótidos. En termos de estrutura, a conformación dos sitios activos da ADN polimerase replicativa (o cal está moi relacionado coa exactitude inherente das polimerases replicativas) non pode comezar a elongación da cadea sen partir dunha cadea preexistente de nucleótidos, e ningunha ADN polimerase pode comezar a cadea *de novo* (partindo de cero, é dicir, colocar o primeiro nucleótido, despois o segundo, despois o terceiro etc.; sempre ten que haber unha cadea xa feita á que se engaden nucleótidos).

Os encimas cebadores que resolven este problema son ARN polimerases ADN-dependentes, que crean un cebador ou *primer* de ARN nas febras líder e retardada. A febra líder é cebada só unha vez, mais a febra retardada é cebada aproximadamente cada 1000 (+/- 200) pares de bases (forman un cebador por cada fragmento de Okazaki da febra retardada). Os cebadores están, pois, feitos de ARN e teñen aproximadamente unha lonxitude de 10 bases.

A interface en (A*) contén un 3' OH libre que é quimicamente axeitado para a reacción catalizada polas polimerases replicativas, e a configuración cunha parte que sobresae é estruturalmente axeitada para a elongación da cadea polas polimerases replicativas. Así, as polimerases replicativas poden empezar a elongación da cadea en (A*).

#### Primase 
En procariotas, o encima primase crea o *primer* ou cebador de ARN ao inicio das febras acabadas de separar líder e retardada.

#### ADN polimerase alfa 
En eucariotas, a ADN polimerase alfa crea un cebador de ARN ao inicio das febras separadas líder e retardada e, a diferenza da primase, a ADN polimerase alfa tamén sintetiza unha cadea curta de desoxirribonucleótidos despois de crear o cebador.

### Asegurar a procesividade e a sincronización 
Co termo procesividade faise referencia á velocidade e continuidade da replicación do ADN, e cómpre que haxa unha alta procesividade para que a replicación estea ben temporizada. Asegúrase unha alta procesividade en parte polas proteínas con forma de anel denominadas "abrazadeiras" (*clamps*) que axudan ás polimerases replicativas a permanecer asociadas ás febras líder ou retardada. Hai outras variables tamén: desde unha perspectiva química, as proteínas que se unen ás febras estimulan a polimerización e proporcionan unha enerxía termodinámica extra para a reacción. Desde unha perspectiva de sistemas, a estrutura e química de moitos factores do replisoma (como as características de AAA+ ATPase das subunidades de carga de abrazadeiras individuais, xunto coa conformación helicoidal que adoptan), e as asociacións entre os factores de carga das abrazadeiras e outros factores accesorios, tamén incrementan a procesividade.

Segundo as investigacións feitas por Kuriyan et al., debido ao seu papel no recrutamento e unión doutros factores como os encimas cebadores e as polimerases replicativas, os cargadores das abrazadeiras e as abrazadeiras escorregantes son a peza central da maquinaria do replisoma e esenciais para a replicación, o cal explica o alto grao de conservación estrutural observada en ditos factores. Esta conservación arquitectural e estrutural vese en organismos tan diversos como bacterias, fagos, lévedos e humanos. Ademais, esta conservación estrutural non vai acompañada de homoloxía de secuencia, o que subliña a importancia destas solucións estruturais aos problemas que presenta a replicación.

#### Carga de abrazadeiras 
Cargador de abrazadeiras é o nome que se lle dá aos factores de replicación denominados gamma (en procariotas) ou RFC (en eucariotas). A combinación do ADN molde e do cebador de ARN denomínase 'forma A do ADN' e crese que as proteínas de replicación cargadoras da abrazadeira (heteropentámeros helicoidais) se asocian co ADN en forma A debido á súa forma (a estrutura dos sucos maior e menor) e química (patróns de doantes e aceptores de enlaces de hidróxeno). Deste modo, as proteínas cargadoras de abrazadeira asócianse coa rexión cebada das febras, o que causa a hidrólise de ATP e proporciona enerxía para abrir a abrazadeira e unila á febra. (Crese que forma un dímero asimétrico coa ADN polimerase epsilon.)
* ADN polimerase epsilon. Esta polimerase sintetiza a febra líder en eucariotas. (Crese que forma un dímero asimétrico coa ADN polimerase delta.) Seguidamente, a reacción química na unidade exonulcease elimina os nucleótidos do extremo exposto 3' da cadea en crecemento. Unha vez que se retira a base errada, a estrutura e química da unidade de polimerización recupera a normalidade e a replicación do ADN pode continuar. Deste modo, o sitio de polimerización activa pode dicirse que realiza un labor de "corrector de probas", xa que detecta os apareamentos impropios e corríxeos.

Os erros no apareamento de bases distorsionan o sitio activo da polimerase nun tramo de entre 4 e 6 nucleótidos, o que significa, dependendo do tipo de discordancia, que hai ata seis posibilidades para a corrección de erros.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Bibliografía 
* 

### Outros artigos 
* Replicación do ADN

### Ligazóns externas 
*