Secuenciación de escopeta

En xenética, a '*secuenciación *de escopeta*** ou **secuenciación *shotgun'''* é un método utilizado para secuenciar febras de ADN longas. Denomínase así por analoxía co padrón de disparo case aleatorio e de rápida expansión dunha escopeta.

O método de terminación da cadea de secuenciación de ADN tradicional ("secuenciación de Sanger") só pode utilizarse para febras de ADN curtas de 100 a 1&nbsp;000 pares de bases. Debido a este límite de tamaño, as secuencias máis longas poden ser divididas en fragmentos máis pequenos que se poidan secuenciar separadamente, e estas secuencias son despois ensambladas para dar a secuencia completa.

Hai dous métodos principais para este proceso de fragmentación e secuenciación. O *primer walking* (ou "chromosome walking") progresa ao longo do anaco enteiro de febra, anaco por anaco, mentres que a secuenciación de escopeta é un proceso máis rápido pero máis complexo, que usa fragmentos ao chou.

Na secuenciación de escopeta, o ADN fragméntase de forma aleatoria orixinando numerosos segmentos pequenos, que son secuenciados usando o método de terminación de cadea para obter *lecturas*. Realizando varias roldas desta fragmentación e secuenciación obtéñense múltiples lecturas que se solapan para o ADN diana. Certos programas informáticos utilizan despois os extremos solapantes de diferentes lecturas para ensamblalas formando unha secuencia continua.

## Secuenciación de escopeta de xenoma completo 
### Historia 
A secuenciación de escopeta de xenoma completo de pequenos xenomas (de 4&nbsp;000 a 7&nbsp;000 pares de bases) foi suxerida por primeira vez en 1979.

### Secuenciación de extremos apareados 
Unha aplicación máis ampla da técnica beneficiouse da secuenciación de extremos apareados, coñecida coloquialmente como *secuenciación de escopeta de dobre canón*. A medida que os proxectos de secuenciación empezaron a tratar con secuencias de ADN máis longas e complicadas, moitos grupos empezaron a decatarse de que podía obterse información útil secuenciando ambos os extremos dun fragmento de ADN. Aínda que secuenciar ambos os extremos do mesmo fragmento e facer un seguimento dos datos apareados era máis laborioso que secuenciar un só extremo de dous fragmentos distintos, o coñecemento de que as dúas secuencias estaban orientadas en direccións opostas e eran de aproximadamente a lonxitude dun fragmento era valioso para reconstruír a secuencia do fragmento diana orixinal.

**Historia**. A primeira descrición publicada do uso de extremos apareados é do ano 1990 e formaba parte da secuenciación do locus HGPRT humano, aínda que o uso de extremos apareados estaba limitado a pechar ocos (na secuencia) despois da aplicación da estratexia tradicional de escopeta. A primeira descrición teórica dunha estratexia de secuenciación apareada pura, asumindo fragmentos de lonxitude constante, fíxose en 1991. Nesa época, había un consenso na comunidade de investigadores de que a lonxitude de fragmento óptimo para a secuenciación de extremos apareados sería de tres veces a lonxitude da lectura de secuencia. En 1995 Roach et al. introduciron a innovación de usar fragmentos de varios tamaños e demostraron que unha estratexia de secuenciación de extremos apareados pura sería posible en dianas grandes. A estratexia foi adoptada seguidamente por The Institute for Genomic Research (TIGR) para secuenciar o xenoma da bacteria *Haemophilus influenzae* en 1995, e despois por Celera Genomics para secuenciar o xenoma da mosca do vinagre *Drosophila melanogaster* en 2000, e seguidamente o xenoma humano.

### Estratexia 
Para aplicar a estratexia, unha febra de ADN de alto peso molecular rómpese en fragmentos ao chou, de tamaño seleccionado (xeralmente de 2, 10, 50 e 150 kb), e clónase nun vector apropiado. Os clons son despois secuenciados desde ambos os extremos usando o método de terminación da cadea rendendo dúas curtas secuencias. Cada secuencia denomínase *lectura de extremo* ou *lectura* e dúas lecturas de cada clon denomínanse *pares apareados* (*mate pairs*). Como o método de terminación da cadea xeralmente só pode producir lecturas de entre 500 e 1&nbsp;000 bases de longo, en todos menos nos clons máis pequenos, os pares apareados raramente se solapan.

### Ensamblaxe 
A secuencia orixinal reconstrúese a partir doas lecturas usando software para a ensamblaxe de secuencias. Primeiro, as lecturas que se solapan recóllense formando secuencias compostas máis longas denominadas *cóntigos* (*contigs*). Os cóntigos poden ser ligados en *armazóns* seguindo as conexións entre os pares apareados. A distancia entre cóntigos pode inferirse a partir das posicións dos pares apareados se se coñece cal é a lonxitude do fragmento media da biblioteca e ten unha fiestra estreita de desviación. Dependendo do tamaño do oco entre cóntigos, poden utilizarse diferentes técnicas para encontrar a secuecia que hai nos ocos. Se o oco é pequeno (5-20kb) entón cómpre utilizar a PCR para amplificar a rexión, seguida de secuenciación. Se o oco é grande (>20kb) entón clónase o fragmento grande en vectores especiais como un BAC (cromosoma artificial bacteriano) e seguidamente secuénciase o vector.

### Pros e contras 
Os que propoñen esta estratexia argumentan que é posible secuenciar o xenoma completo dunha vez usando grandes conxuntos de secuenciadores, o que fai o proceso total sexa moito máis eficiente que as estratexias máis tradicionais. Os detractores argumentan que, aínda que a técnica secuencia rapidamente grandes rexións do ADN, a súa capacidade de ligar correctamente estas rexións é dubidosa, especialmente para xenomas con rexións repetitivas. A medida que os programas de ensmblaxe de secuencias sexan máis sofisticados e o poder de computaión se faga máis barato, será posible superar esta limitación.

### Cobertura 
A cobertura (profundidade de lectura ou profundidade) é o número medio delecturas que representan un determinado nucleótido na secuencias reconstruída. Pode calcularse a partir da lonxitude do xenoma orixinal (*G*), o número de lecturas (*N*), e a lonxitude media das lecturas (*L*) como N\times L/G. Por exemplo, un xenoma hipotético de 2&nbsp;000 pares de bases reconstruído a partir de 8 lecturas cunha lonxitude media de 500 nucleótidos terá unha redundancia de 2x. Este prámetro tamén permite estimar outras cantidades, como a porcentaxe do xenoma cuberto polas lecturas (ás veces tamén chamada cobertura). É moi interesante que haxa unha alta cobertura na secuenciación de escopeta porque pode superar os erros na *chamada de bases* (ou *base calling*, a asignación de nucleobases a picos do cromatograma) e de ensamblaxe. A teoría de secuenciación do ADN trata das relacións estes estas cantidades.

Ás veces faise unha distinción entre a *cobertura da secuencia* e a *cobertura física*. A cobertura da secuencia é o número medio de veces que se le unha base (como se describiu antes). A cobertura física é o número medio de veces que se le unha base ou é abranguida por lecturas de pares apareados.

## Secuenciación de escopeta xerárquica 
miniatura|Na secuenciacion de escopeta de xenoma completo (arriba), o xenoma enteiro é roto aleatoriamente en pequenos fragmentos (do tamaño axeitado para a secuenciación) e despois reensamblado. Na secuenciación de escopeta xerárquica (abaixo), o xenoma rómpese primeiro en segmentos máis grandes. Despois de que se deduce a orde destes segmentos, estes son despois rotos en fragmentos de tamaño axeitado para secuenciar.

Aínda que a secuenciación de escopeta pode en teoría aplicarse a un xenoma de calquera tamaño, a súa aplicación directa á secuenciación de xenomas grandes (por exemplo, o xenoma humano) estivo limitada ata finais da década de 1990, cando os avances tecnolóxicos fixeron que fose práctico manexar as enormes cantidades de datos complexos implicados no proceso. Historicamente, a secuenciación de escopeta de xenoma completo críase que estaba limitada polo tamaño dos grandes xenomas e pola complexidade engadida pola alta porcentaxe de ADN repetitivo (maior do 50% para o xenoma humano) presente en grandes xenomas. Non estaba amplamente aceptado que a secuencia de escopeta de xenomas completos proporcionase datos fiables. Por estas razóns, ideáronse outras estratexias que rebaixaban a carga computacional de ensamblaxe de secuencias que tiña que ser utilizada antes da secuenciación de escopeta. Deste modo, requírese a mínima cantidade de secuenciación de alto rendemento e ensamblae.

O xenoma amplificado é primeiramente fragmentado en anacos máis grandes (de 50-200kb) e clonado nun hóspede bacteriano usando BACs ou PACs. Como se fragmentaron múltiples copias de xenomas de forma aleatoria, os fragmentos contidos neses clons teñen extremos diferentes, e con suficiente cobertura (ver sección máis arriba) é teoricamente posible atopar un **armazón** de cóntigos de BAC que cobre o xenoma enteiro. Esta armazón denomínase **camiño de baldosas** (*tilling path*). Unha vez que se encontra un camiño de baldosas, os BACs que forman este camiño son fragmentados ao chou en pequenos fragmentos e poden secuenciarse usando o método de escopeta a escala menor.
miniatura|Un cóntigo BAC que cobre a área xenómica enteira de interese constitúe o camiño de baldosas.

Aínda que as secuencias completas de cóntigos de BACs non se coñecen, as orientacións relativas entre eles si se saben. Hai varios métodos para deducir esta orde e seleccionar os BACs que constitúen o camiño de baldosas. A estratexia xeral supón identificar as posicións de clons unha en relación doutra e despois seleccionar o menor número de clons necesarios para formar un armazón contiguo que cubra toda a área de interese. A orde dos clons dedúcese determinando o modo no cal se solapan. Os clons que se solapan poden ser identificados de varias maneiras. Pode hibridarse unha pequena sonda etiquetada radioactivamente ou quimicamente que contén un sitio etiquetado por secuencia (STS ou *sequence-tagged site*) nunha micromatriz sobre a cal se imprimen os clons.
Isto ten como resultado unha alta cobertura, pero o proceso de ensamblaxe require un uso máis intensivo da computación. Estas tecnoloxías son moi superiores á secuenciación de Sanger debido ao alto volume de datos e o tempo relativamente curto que se tarda en secuenciar un xenoma completo.

## Secuenciación de escopeta metaxenómica 
Para determinar a especie/cepa do organismo do cal procede o ADN examinado, é dabondo ter lecturas de 400-500 pares de bases con tal que o seu xenoma sexa xa coñecido, usando por exemplo un software de clasificación taxonómica baseado en k-mer. Con millóns de lecturas de secuenciación de seguinte xeración de mostras ambientais, é posible ter unha visión completa de calquera microbioma complexo formado por miles de especies, como a flora intestinal. As vantaxes sobre a secuenciación de amplicón de ARNr 16S son: non está limitada a bacterias; pode facer unha clasificación ao nivel de cepas, mentres que a secuenciación de amplicón só o fai a nivel de xénero; e a posibilidade de extraer xenes completos e especificar as súas funcións como parte do metaxenoma.
A sensibilidade da secuenciación metaxenómica faina unha elección atractiva para o uso clínico.
Porén, enfatiza o problema da contaminación da mostra ou a canle de secuenciación.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Secuenciación do ADN

### Bibliografía 
*
*
*

### Ligazóns externas 
*Este artigo incorpora material en dominio público do documento do National Center for Biotechnology Information "NCBI Handbook".''