Northern blot

miniatura|Diagrama sobre o procedemento xeral para a detección de ARN por northern blot.

O **northern blot** (transferencia northern) é unha técnica utilizada en bioloxía molecular para estudar a expresión xénica por medio da detección de ARN (ou ARNm illado) nunha mostra.

Co northern blot é posible observar o control celular sobre as estruturas e funcións determinando os niveis de expresión xénica particulares durante a diferenciación, morfoxénese, e en condicións patolóxicas ou anormais. No northern blot utilízase primeiro electroforese para separar mostras de ARN polo seu tamaño e despois faise unha detección con sondas de hibridación complementarias dunha parte da secuencia completa diana. Sendo moi específico, o termo "northern blot" refírese, en realidade, só á transferencia por capilaridade do ARN desde o xel de electroforese á membrana de transferencia, mentres que o proceso completo xeralmente se denominaría "northern blotting". A técnica do northern blot foi desenvolvida en 1977 por James Alwine, David Kemp, e George Stark na Universidade Stanford. O northern blot recibiu ese nome facendo un xogo de palabras coa técnica previa do Southern blot, denominada así polo biólogo que a inventou, Edwin Southern (neste caso como é un apelido escríbese con maiúscula; western blot non é necesario escribilo con maiúscula, aínda que moitas veces tamén se fai por analoxía). A principal diferenza entre estas dúas técnicas é que no northern blot analízase ARN e no Southern blot ADN.

## Procedemento 
Un procedemento xeral de blotting As mostras de ARN son despois separadas por electroforese en xel. Como os xeles son fráxiles e as sondas son incapaces de entrar na matriz, as mostras de ARN, agora separadas por tamaño, son transferidas a unha membrana de nailon por medio dun sistema de capilaridade ou de baleiro. miniatura|Sistema de transferencia por capilaridade para a transferencia de ARN desde un xel de electroforese á membrana de blotting. O máis efectivo no northern blot é usar unha membrana de nailon con carga positiva, xa que as cargas negativas dos ácidos nucleicos (dos seus fosfatos) teñen unha alta afinidade por elas. O tampón de transferencia utilizado para o blotting xeralmente contén formamida porque isto rebaixa a temperatura de aliñamento (*annealing*) da interacción sonda-ARN, o que evita ter que utilizar temperaturas elevadas, o cal podería causar a degradación do ARN. Unha vez que o ARN foi transferido á membrana, inmobilízase uníndoo á membrana por medio de enlaces covalentes, con luz UV ou con calor. Unha vez que se etiquetou a sonda, esta hibrídase co ARN na membrana. As condicións experimentais que poden afectar á eficiencia e especificidade da hibridación inclúen a forza iónica, viscosidade, lonxitude do dúplex, pares de bases mal apareados, e composición de bases. A membrana lávase para asegurar que a sonda se uniu especificamente e impedir que se orixinen sinais de fondo ("ruído"). Os sinais híbridos son despois detectados cunha película de raios X e poden cuantificarse por densitometría. Despois dunha determinación por micromatrices ou RT-PCR, poden crearse controis para a comparación da northern blot utilizando unha mostra que non presenta o produto xénico de interese. Os xeles poden tinguirse con bromuro de etidio (EtBr) e despois ser ollados baixo luz UV para observar a calidade e cantidade de ARN antes da transferencia (blotting). Xeralmente na electroforese en xel faise *correr* unha escada de ARN xunto coas mostras para observar así o tamaño dos fragmentos obtidos, pero nas mostras de ARN total as propias subunidades ribosómicas poden actuar como marcadores de tamaño.

### Sondas 
As sondas para northern blot están compostas de ácidos nucleicos cunha secuencia complementaria a unha parte ou a todo o ARN de interese, poden ser de ADN, ARN, ou oligonucleótidos cun mínimo de 25 bases complementarias coa secuencia diana. As sondas deben etiquetarse con isótopos radioactivos (32P) ou ben con quimioluminescencia, na cal os encimas fosfatase alcalina ou peroxidase do ravo picante (*Armoracia rusticana*) degradan os substratos quimioluminescentes producindo unha emisión de luz detectable. A etiquetaxe quimiolunimescente pode facerse de dous xeitos: pode unirse o encima á sonda, ou pode etiquetarse a sonda cun ligando (por exemplo, biotina), para o cal se une ao encima unha proteína (por exemplo, avidina ou estreptavidina). A técnica foi utilizada para mostrar a sobreexpresión de oncoxenes e a regulación á baixa de xenes supresores de tumores en células cancerosas cando se comparan co tecido "normal", Se se observa que un xene é regulado porque se detecta unha abundancia do seu ARNm no northern blot feito á mostra, este xene pode despois ser secuenciado para determinar se é un xene coñecido polos investigadores ou se é un descubrimento novo. A vantaxe que teñen as micromatrices sobre os northern blots é que poden visualizarse miles de xenes á vez, mentres que no northern blot o normal é observar un ou uns poucos xenes.

Un problema frecuente do northern blot é a degradación da mostra por RNases (tanto endóxenas da mostra coma procedentes de contaminación ambiental), o cal pode evitarse facendo unha axeitada esterilización do material de vidro e utilizando inhibidores da RNase como DEPC (dietilpirocarbonato). Os compostos químicos utilizados na maioría dos northern blots poden supoñer un risco para o investigador, xa que o formaldehido, o material radioactivo, o bromuro de etidio, o DEPC, e a luz UV son todos nocivos con certas exposicións. Comparada coa RT-PCR, o northern blot ten unha baixa sensibilidade, mais tamén ten unha alta especificidade, o cal é importante para reducir os resultados de falsos positivos.

Entre as vantaxes de usar o northern blot están a detección dos tamaños do ARN, a observación de produtos de splicing alternativos, o uso de sondas con homoloxía parcial, a calidade e cantidade de ARN pode medirse no xel antes de facer o blotting, e as membranas poden almacenarse e resondarse durante anos despois do blotting.

## Northern blot inverso 
Os investigadores en ocasións usan unha variante desta técnica denominada northern blot inverso ou reverso. Neste procedemento, o substrato ácido nucleico (que está fixado a unha membrana) é un conxunto de fragmentos de ADN, e a sonda é un ARN extraído dun tecido e marcado radioactivamente.

O uso de micromatrices de ADN que se xeneralizou a finais da década de 1990 e inicios da de 2000 é moi similar ao procedemento inverso, porque implica o uso de fragmentos de ADN illados fixados a un substrato, e a hibridación cunha sonda feita de ARN celular. Así, o procedemento inverso, aínda que inicialmente era pouco común, permitiu que as análises mediante northern evolucionasen para permitir o estudo de perfís de expresión xénica, nos cales se pode monitorizar a expresión de moitos dos xenes (ou posiblemente de todos) dun organismo.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Southern blot
* Western blot
* Northwestern blot
* Far-eastern blotting
* Far-western blotting
* Eastern blot

### Ligazóns externas 
* OpenWetWare