Fago lambda

O **fago λ** (lambda) ou **colifago λ** (nome completo **fago λ de enterobacterias** ou ***Enterobacteria phage λ***) é un virus que infecta a bacterias, é dicir, un virus bacteriófago ou fago, e infecta concretamente á especie bacteriana *Escherichia coli*. Descubriuno Esther Lederberg en 1950 cando traballaba con cultivos de mesturas de dúas cepas de *E. coli*, e decatouse de que cando unha delas era tratada con luz ultravioleta, no cultivo formábanse placas virais (áreas con bacterias mortas). Este virus denomínase temperado, xa que no seu ciclo vital pode reproducirse normalmente dentro da bacteria e lisala (ciclo lítico) ou pode inserir o seu xenoma no xenoma da bacteria e non lisala (ciclo lisoxénico, temperación).

As partículas do fago constan dunha cabeza (ou cápside), unha cola, e fibras da cola (ver imaxe máis abaixo). A cabeza contén o ácido nucleico xenómico, que é ADN bicatenario linear. Durante a infección, a partícula do fago recoñece e únese ao seu hóspede, *E. coli*, o que fai que o ADN no interior da cabeza do fago sexa inxectado a través da cola ao interior do citoplasma da célula bacteriana. Xeralmente, prodúcese un ciclo lítico no que se forman novos fagos completos dentro da bacteria, o que vai seguido da lise da célula, liberando o contido celular e a proxenie de virións no seu contorno. Porén, baixo certas condicións, o ADN do fago pode integrarse no cromosoma da célula hóspede orixinando un ciclo lisoxénico. Neste estado integrado, o ADN de λ dise que é un profago e permanece como residente dentro do xenoma do seu hóspede sen aparentemente causarlle danos á bacteria. O hóspede que contén un profago denomínase lisóxeno. Cando a bacteria se reproduce e copia o seu ADN, tamén se copia o ADN do profago, polo que todo o clon bacteriano formado levará o profago. Este profago pode entrar no ciclo lítico cando se dan certas condicións de estrés.

## Estrutura 
miniatura|250 px |Virión do bacteriófago lambda (esquemático). Móstranse os nomes das proteínas e o seu número de copias na partícula do virión. A presenza de proteínas M e L no virión aínda non está clara.

A partícula do virus consta de cabeza, cola e fibras da cola. A partícula completa consta de 12 a 14 proteínas distintas e de máis de 1000 moléculas de proteínas en total, e unha molécula de ADN localizada na cabeza do fago. Porén, aínda non está claro se as proteínas L e M forman parte do virión. Estes dous segmentos monocatenarios son os "extremos cohesivos" do chamado sitio *cos*. O sitio *cos* circularíza o ADN no citoplasma do hóspede. Nesta forma circular, o xenoma do fago, ten unha lonxitude de 48.502 pares de bases (12 menos que estendido porque se aparearon entre si os dous segmentos dos extremos). que é unha porina, que é parte do operón da maltosa.
# O xenoma lineal do fago introdúcese a través da membrana externa.

# O ADN pasa a través do complexo da manosa permease da membrana interna bacteriana  (codificada polos xenes manXYZ bacterianos) e inmediatamente circularízase utilizando os seus sitios *cos*, que son "extremos cohesivos" de 12 bases de lonxitude ricos en G-C. Os extremos de ADN de cadea simple virais son ligados pola ADN ligase do hóspede.

miniatura|350px|dereita|Entrada do ADN do fago lambda na membrana celular usando a manosa PTS permease (que é un sistema de transporte de azucres) como mecanismo de entrada no citoplasma.

# A ADN xirase do hóspede causa uns superenrolamentos negativos nos cromosomas circulares bacterianos, facendo que as rexións ricas en A-T se desenrolen e sexan transcritas.
# A transcrición do xenoma de lambda empeza a partir dos promotores constitutivos ***PL***, ***PR*** e '''''PR'*** de lambda producindo os transcritos chamados "temperáns inmediatos". Ao principio, estes expresan os xenes ***N*** e ***cro***, producindo as proteínas N, Cro e unha proteína inactiva curta.

miniatura|200px|Eventos de activación temperá que implican a proteína N.

# A proteína **Cro*' únese a *OR3*, impedindo o acceso ao promotor *PRM*, imposibilitando a expresión do xene *cI*. A proteína N únese aos dous sitios *Nut* (= *N utilisation*), un situado no xene *N* do marco de lectura de *PL*, e o outro no xene *cro* no marco de lectura de *PR*.
# A proteína N é un antiterminador, e funciona estendendo os marcos de lectura aos que se une (os transcritos son máis longos). Cando unha ARN polimerase transcribe estas rexións, recruta as proteínas N e forma un complexo con varias proteínas **Nus** do hóspede. Este complexo salta a maioría das secuencias de terminación. Os transcritos estendidos, máis longos (os transcritos chamados "temperáns tardíos"), inclúen os dos xenes ***N*** e ***cro*** xunto cos de ***cII*** e ***cIII***, e ***xis***, ***int***, ***O***, ***P*** e ***Q*** que se discuten máis adiante.
# A proteína **cIII** actúa protexendo a proteína **cII** da proteólise feita por **FtsH** (unha protease de *E. coli* esencial unida a membrana) ao actuar como inhibidor competitivo. Esta inhibición pode inducir un estado bacteriostático, que favorece a lisoxenia. Ademais, cIII estabiliza directamente a proteína cII.

Na infección inicial, a estabilidade de cII determina o ciclo vital do fago (lítico ou lisoxénico); unha cII estable leva ao ciclo lisoxénico, mentres que se cII é degradada o fago entra no ciclo lítico. As baixas temperaturas, a falta de nutrientes na célula e a alta multiplicidade de infección (MOI) son factores que favorecen a lisoxenia (como se discute despois).

#### Antiterminación N 
Isto ocorre sen que a a **proteína N** interaccione co ADN; en vez diso, a proteína únese a un ARNm acabado de transcribir. Os sitios Nut conteñen 3 "caixas" (secuencias de nucleótidos) conservadas, das cales só a **BoxB** é esencial.
# As secuencias de ARN de boxB están localizadas preto do extremo 5' dos transcritos pL e pR. Cando se transcriben, cada secuencia forma unha estrutura en bucle en forquita á que a proteína N pode unirse.
# A proteína N únese a boxB en cada transcrito, e contacta coa ARN polimerase (RNAP) en transcrición por medio do bucle no ARN. O complexo N-RNAP é estabilizado pola seguinte unión de varias proteínas **Nus** (*N utilisation substance*) do hóspede (que inclúen factores de terminación/antiterminación da transcrición e, sorprendentemente, unha subunidade ribosómica).
# O complexo completo (incluíndo o sitio *Nut* unido do ARNm) continúa a transcrición, e pode saltar secuencias de terminación.

### Ciclo lítico 
Este é o ciclo que o fago segue na maioría das infeccións, no cal a proteína cII non chega a ter unha concentración suficiente debido á degradación, polo que non activa os seus promotores.
# Os transcritos "temperáns tardíos" continúan producíndose, incluíndo ***xis***, ***int***, ***Q*** e os xenes para a replicación do xenoma de lambda (*OP*). Cro domina o sitio represor (ver a sección "Represor"), reprimindo a síntese a partir do promotor *PRM* (o cal é un promotor do ciclo lisoxénico).
# As proteínas **O** e **P** inician a replicación do cromosoma do fago (ver "Replicación lítica").
# **Q** é outro antiterminador, que se une agora aos sitios ***Qut***.
# A transcrición a partir do promotor ''PR'* pode agora realizarse e producir ARNm para a lise e as proteínas da cabeza e cola.
# As proteínas estruturais e os xenomas do fago autoensámblanse formando novas partículas de fagos.
# Os produtos dos xenes de lise ***S***,***R***, ***Rz*** e ***Rz1*** causan a lise da célula. A proteína S é unha holina (de *hole* = burato en inglés), unha pequena proteína de membrana que, que nun momento que é determinado pola secuencia da proteína, empeza a facer buratos na membrana. A proteína R é unha endolisina, un encima que escapa da célula a través dos buratos S e cliva a parede celular bacteriana. Rz e Rz1 son proteínas de membrana que forman un complexo que destrúe a membrana externa, despois de que a endolisina degradase a parede celular. No fago lambda de tipo silvestre, a lise ocorre aproximadamente uns 50 minutos despois do comezo da infección e libera uns 100 virións.

#### Transcrición cara á dereita 
A transcrición cara á dereita expresa os xenes ***O***, ***P*** e ***Q***. O e P son responsables da iniciación da replicación, e Q é outro antiterminador que permite a expresión dos xenes da cabeza, cola e de lise a partir de *PR’*.

##### Replicación lítica 
# Nos primeiros (poucos) ciclos de replicación, o xenoma de lambda sofre unha replicación θ (de círculo a círculo).
# Isto iníciase no sitio ***ori*** situado no xene ***O***. A proteína O únese ao sitio *ori*, e a proteína P únese á subunidade DnaB da maquinaria de replicación do hóspede e tamén se une a O. Isto fai que tome o control da ADN polimerase do hóspede.
# Axiña, o fago cambia a unha replicación por círculo rodante similar á do fago M13. Fáiselle unha amosega ao ADN e o extremo 3’ serve como cebador. Nótese que isto non libera copias sinxelas do xenoma do fago senón unha longa molécula con moitas copias do xenoma: un concatémero.
# Estes concatémeros son clivados nos seus sitios *cos* a medida que son empaquetados na cabeza do fago, formando extremos cohesivos
# O sitio *Qut* está moi próximo ao promotor *PR’*, o suficientemente próximo como para que o factor σ no fora liberado do holoencima ARN polimerase. Parte do sitio *Qut* lembra a caixa de Pribnow -10, causando a detención do holoencima.
# A proteína Q únese despois e despraza parte do factor σ e reiníciase a transcrición.
# Transcríbense os xenes da cabeza e a cola e as proteínas correspondentes autoensámblanse.

#### Transcrición cara á esquerda 
Na transcrición cara á esquerda exprésanse os xenes *gam*, *red*, *xis*, e *int*. As proteínas gam e red están implicadas na recombinación. Gam é tamén importante porque inhibe a degradación pola nuclease do hóspede RecBCD dos extremos 3’ na replicación por círculo rodante. Int e xis son proteínas de integración e excisión vitais para a lisoxenia.

##### Regulación de xis e int da inserción e excisión 
miniatura|dereita|upright=1.5|Diagrama que mostra o proceso de retrorregulación que rende unha maior concentración de xis comparado con int. O transcrito de ARNm é dixerido pola RNAse bacteriana empezando polo bucle en forquita clivado en sib.
# ***xis*** e ***int*** atópanse no mesmo ARNm, polo que se producen concentracións aproximadamente iguais das proteínas *xis* e *int*. Isto ten como resultado (inicialmente) a excisión de calquera xenoma que fose inserido no xenoma do hóspede.
# O ARNm do promotor *PL* forma unha estrutura secundaria estable cun talo-bucle da sección ***sib**'' do ARNm. Isto converte o extremo 3' (*sib*) do ARNm nunha diana para a degradación pola RNAaseIII, o que ten como resultado unha concentración efectiva máis baixa do ARNm de *int* que do de *xis* (xa que o cistrón de *int* está máis próximo que o de *xis* á secuencia *sib*), de modo que se observa unha maior concentración de *xis* que de *int*.
# As maiores concentracións de *xis* que de *int* teñen como resultado a non inserción ou excisión de xenomas de fagos, a acción favorecida evolutivamente, deixando inserido calquera xenoma de fago pre-inserido (reducindo así a competición) e impedindo a inserción do xenoma do fago no xenoma dun hóspede condenado á lise.

### Ciclo lisoxénico 
O ciclo lisoxénico empeza unha vez que a proteína **cII** alcanza unha concentración alta dabondo como para activar os seus promotores, despois dun pequeno número de infeccións.
# Os transcritos "temperáns tardíos" seguen producíndose, incluíndo ***xis***, ***int***, ***Q*** e os xenes para a replicación do xenoma de lambda.
# O cII estabilizado actúa promovendo a transcrición a partir dos promotores ***PRE***, ***PI*** e ***Pantiq***.
# O promotor *Pantiq* produce ARNm antisentido para a mensaxe do xene *Q* do transcrito do promotor *PR*, desactivando así a produción de Q. O promotor *PRE* produce ARNm antisentido para a sección cro do transcrito do promotor *PR*, rebaixa a produción de cro, e ten un transcrito do xene ***cI***. Este exprésase, e activa a produción do represor de cI. O promotor ***PI*** expresa o xene *int*, o que ten como resultado que haxa grandes concentracións da proteína int. Esta proteína int integra o ADN do fago no cromosoma do hóspede (ver "Integración do profago").
# Ao non haber **Q** tampouco hai extensión do marco de lectura do promotor '''''PR'***, polo que non se producen proteínas líticas nin estruturais. Os niveis elevados de int (moito maiores que os de xis) teñen como resultado a inserción do xenoma de lambda no xenoma do hóspede (ver diagrama). A produción de cI leva á unión de cI nos sitios ***OR1*** e ***OR2'''* no promotor *PR*, "apagando" a expresión de *cro* e doutros xenes temperáns. cI tamén se une ao promotor *PL*, desactivando tamén a súa transcrición.
# A falta de cro deixa o sitio ***OR3*** libre, polo que a transcrición a partir do promotor *PRM* pode ocorrer, mantendo os niveis de cI.
# A falta de transcrición a partir dos promotores ***PL*** e ***PR*** leva a que non haxa máis produción de cII e cIII.
# Como decrece a concentración de cII e cIII, a transcrición a partir de *Pantiq*, *PRE* e *PI* deixa de ser promovida, xa que xa non son necesarios.
# Soamente quedan activos os promotores ***PRM*** e *'''PR'***, o primeiro producindo a proteína cI e o último un curto transcrito inactivo. O xenoma de lambda permanece inserido no xenoma do hóspede en estado dormente.

O profago duplícase con cada división celular do hóspede. Os xenes do fago expresados neste estado dormente codifican proteínas que reprimen a expresión doutros xenes de fagos (como os xenes estruturais e líticos) para impedir a entrada no ciclo lítico. Estas proteínas represivas son degradadas cando a célula hóspede está baixo estrés, o que orixina a expresión dos xenes do fago reprimidos. Este estrés pode ser a falta de nutrientes, velenos (como antibióticos), ou outros factores que poden danar ou destruír ao hóspede. En resposta ao estrés, o profago activado é excindido do ADN da célula hóspede por un dos produtos dos xenes agora expresados e entra na súa vía lítica.

#### Integración do profago 
A **integración** do fago λ ten lugar nun sitio de adhesión **att*' especial situado nos xenomas da bacteria e do fago, chamado *attλ*.

#### Mantemento da lisoxenia 
miniatura|dereita|upright=1.75|Representación simplificada do paradigma integración/excisión e dos principais xenes implicados.
* A lisoxenia é mantida só por **cI**. cI reprime a transcrición a partir de ***PL*** e ***PR*** mentres que regula á alza e controla a súa propia expresión a partir de *PRM*. É, por tanto, a única proteína que expresa o fago lisoxénico.
miniatura|Represores do lisóxeno e polimerase unidos a OR1 e recruta de OR2, que activará PRM e apaga PR.
* Isto está coordinado polos operadores *PL* e *PR*. Ambos os operadores teñen tres sitios de unión para cI: *OL1*, *OL2*, e *OL3* para *PL*, e *OR1*, *OR2* e *OR3* para *PR*.
* cI únese máis favorablemente a *OR1*; ao unirse aquí inhibe a transcrición a partir de *PR*. Como cI se dimeriza facilmente, a unión de cI a *OR1* incrementa moito a afinidade da unión de cI a *OR2*, e isto ocorre case inmediatamente despois da unión a *OR1*. Isto activa a transcrición na outra dirección desde *PRM*, xa que o dominio terminal de cI sobre *OR2* fai máis forte a unión da ARN polimerase a *PRM* e así cI estimula a súa propia transcrición. Cando está presente a moita maior concentración, únese tamén a *OR3*, inhibindo a transcrición a partir de *PRM*, regulando así os seus propios niveis nun bucle de retroalimentación negativa.
* A unión de cI ao operador *PL* é moi similar, excepto en que non ten un efecto directo sobre a transcrición de cI. Porén, como unha represión adicional da súa propia expresión, os dímeros de cI unidos a *OR3* e *OL3* provocan o dobramento do ADN que está entre eles para tetramerizarse.
* A presenza de cI causa inmunidade a superinfeccións por outros fagos lambda, xa que inhibe os promotores *PL* e *PR* dos outros fagos.

#### Indución 
miniatura|200px|upright=1.5|Estado transcricional das rexións promotoras PRM e PR durante un estado lisoxénico comparado cun estado lítico temperán inducido.
A indución clásica do lisóxeno implicado (a bacteria) facíase irradiando as células infectadas con luz ultravioleta (UV).). A reactivación de multiplicidade do fago λ inactivado por luz UV depende da función de recombinación do hóspede ou do fago infectante. A ausencia de ambos os sistemas de recombinación leva á perda da reactivación de multiplicidade.

A supervivencia do fago λ irradiado con luz UV increméntase cando o hóspede *E. coli* é lisoxénico para un profago homólogo, un fenómeno denominado reactivación de profago. A reactivación de profago no fago λ parece ocorrer por un proceso de reparación recombinacional similar ao da reparación de multiplicidade.

## Represor 
miniatura|dereita|Interaccións proteicas que levan ao ciclo lítico ou ao ciclo lisoxénico no fago lambda.
O represor que se encontra no fago lambda é un exemplo notable do nivel de control posible sobre a expresión xénica por un sistema moi simple. Forma un "interruptor binario" con dous xenes que están baixo expresión mutuamente excluínte, como descubriu Barbara J. Meyer.

O sistema xénico do represor de lambda consta dos seguintes elementos (de esquerda a dereita no cromosoma):
* Xene *cI*
* OR3
* OR2
* OR1
* Xene *cro*
miniatura|esquerda|upright=1.75|Representación visual da unión do tetrámero/octámero represor aos sitios operadores L e R do fago lambda (estado lisoxénico estable).
O represor de lambda é un dímero que se autoensambla tamén chamado proteína cI. Únese ao ADN no motivo de unión hélice-xiro-hélice. Regula a transcrición da proteína cI e a proteína Cro.

O ciclo vital dos fagos lambda é controlado polas proteínas cI e Cro. O fago lambda permanecerá no estado lisoxénico se as proteínas cI predominan, pero pasará ao ciclo lítico se as que predominan son as proteínas Cro.

O dímero cI pode unirse a calquera dos tres operadores, OR1, OR2, e OR3, na seguinte orde: OR1 = OR2 > OR3.
A unión dun dímero de cI a OR1 potencia a unión dun segundo dímero cI a OR2, un efecto chamado cooperatividade. Así, OR1 e OR2 están case sempre simultanemente ocupados por cI. Porén, isto non incrementa a afinidade entre cI e OR3, o cal estará ocupado só cando a concentración de cI é alta.

A altas concentracións de cI, os dímeros tamén se unirán aos operadores OL1 e OL2 (os cales están a uns 2 kb *augas abaixo* dos operadores R). Cando os dímeros cI están unidos a OL1, OL2, OR1, e OR2 indúcese a formación dun bucle no ADN, o que permite que estes dímeros se unan para formar un octámero. Este é un fenómeno chamado *cooperatividade de longo rango*. Despois da formación do octámero, os dímeros de cI poden unirse cooperativamente a OL3 e OR3, reprimindo a transcrición de cI. Esta regulación *autonegativa* asegura unha concentración mínima estable da molécula represora e, en caso de orixinárense sinais SOS, permite unha indución máis eficiente do profago.
* En ausencia de proteínas cI, o xene *cro* pode transcribirse.
* En presenza de proteínas cI, só o xene *cI* pode transcribirse.
* A altas concentracións de cI, as transcricións de ambos os xenes están reprimidas.

## Resumo das funcións das proteínas do fago lambda 
## Lise ou lisoxenia? 
miniatura|Diagrama do ciclo vital dun fago temperado, no que se mostran os ciclos lítico e lisoxénico.
Unha importante distinción que debemos establecer é entre as dúas decisións que o fago debe *tomar* no seu ciclo vital: por un lado lisoxenia ou lise durante a infección, e por outro continuar en estado lisoxénico ou pasar ao ciclo lítico durante a fase de profago. Isto último está determinado soamente pola activación de RecA na respoosta SOS da célula, como se dixo no capítulo sobre indución. A primeira das decisións está tamén afectada por esta; unha célula que está realizando a resposta SOS sempre será lisada, xa que non se poderá acumular a proteína cI. Porén, a decisión inicial lítica/lisoxénica na infección tamén depende da proteínas cII e cIII.

En células que dispoñen de suficientes nutrientes, a actividade da protease é alta, co cal se degrada cII. Isto leva a un ciclo lítico. Nas células con limitación de nutrientes, a actividade da protease é baixa, facendo que cII sexa estable. Isto leva a un ciclo lisoxénico. cIII parece estabilizar cII, tanto directamente coma ao actuar como inhibidor competitivo de proteases relevantes. Isto significa que unha célula que está nunha situación difícil, por exemplo por falta de nutrientes e nun estado máis dormente, é máis probablemente lisoxenizada. Isto sería seleccionado porque o fago pode agora permanecer dormente na bacteria ata que cheguen mellores tempos, e o fago pode crear así máis copias do seu xenoma cos recursos adicionais dispoñibles e coa probable proximidade de máis células infectables.

Un modelo biofísico completo da decisión de lambda de lise ou lisoxenia aínda ten que ser desenvolvido. Os modelos e simulacións por computadora suxiren que os procesos aleatorios durante a infección dirixen a selección entre lise ou lisoxenia en cada célula individual. Porén, experimentos recentes suxiren que as diferenzas físicas entre células, que existen xa antes da infección, predeterminan se unha célula se lisará ou se converterá nun lisóxeno.

## Ferramenta xenética 
O fago lambda foi moi utilizado como organismo modelo, e foi unha rica fonte de útiles ferramentas en xenética microbiana, e posteriormente en xenética molecular. Entre os seus usos están a súa aplicación como vector para a clonación de ADN recombinante; o uso da súa recombinase específica de sitio (int) para a mestura de ADNs clonados polo método *gateway*; e a aplicación do seu operón Red, incluíndo as proteínas Red alfa (tamén chamada 'exo'), beta e gamma no método de enxeñaría do ADN chamado recombinería. O fago lambda tamén foi de grande importancia no estudo da transdución especializada.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Bibliografía 
* James Watson, Tania Baker, Stephen Bell, Alexander Gann, Michael Levine, Richard Losick " Molecular Biology of the Gene (International Edition)" - 6th Edition
* Mark Ptashne and Nancy Hopkins, "The Operators Controlled by the Lambda Phage Repressor", *PNAS*, v.60, n.4, pp.&nbsp;1282–1287 (1968).
* Barbara J. Meyer, Dennis G. Kleid, and Mark Ptashne, "Lambda Repressor Turns Off Transcription of Its Own Gene", *PNAS*, v.72, n.12, pp.&nbsp;4785–4789 (Decembro 1975).
* 
* 
* 
* Gottesman, M. and Weisberg, R.A. 2004 "Little lambda - who made thee?", *Micro and Mol Biol Revs*, 68, 796-813 (dispoñible on line en *Microbiology and Molecular Biology Reviews*, American Society for Microbiology)
* 
* 
* Ptashne, M. "A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited", 3rd edition 2003
* 
* Snyder, L. and Champness, W. "Molecular Genetics of Bacteria", 3rd edition 2007 (Contén un resumo informativo e ben ilustrado do bacteriófago lambda)
* Splasho, Resumo en liña do funcionamento de lambda (ilustra os xenes activos en todos os estados do ciclo de lambda)

### Ligazóns externas 
* Vídeo de microscopía con imaxes aceleradas do MIT que mostra os ciclos líticos e lisoxénico do fago lambda.
* Basic Animation of Lambda Lifecyecle (ilustra a infección e as vías lítica e lisoxénica con detalles das proteínas e da transcrición)
* Lambda Phage Life cycle (demostración visual básica do ciclo de vida do bacteriófago lambda)
* Xenoma do fago lambda en GenBank
* Proteoma de Referencia do fago lambda en UniProt 
* Estruturas das proteínas do fago lambda no NCBI  (imaxes en 3D das estruturas proteícas do bacteriófago lambda)