Inmunofluorescencia

[miniatura|200px|Fotomicrografía dunha preparación histolóxica de [pel humana preparada para **inmunofluorescencia directa** usando un anticorpo anti-IgA. A pel era dun paciente con púrpura de Henoch–Schönlein: encóntranse depósitos de IgA nas paredes de pequenos capilares superficiais (frechas amarelas). A área ondulada verde clara de arriba é a epiderme, a área fibrosa de abaixo é o derma.]]
[miniatura|Estas figuras mostran os mecanismos básicos da inmunofluorescencia. A inmunofluorescencia primaria ilústrase á esquerda, e mostra un anticorpo cun grupo [fluoróforo ligado a el unido directamente ao epítopo dun antíxeno para o cal é específico. Unha vez que o anticorpo se uniu ao epítopo, a mostra pode verse no microscopio de fluorescencia para confirmar a presenza do antíxeno na mostra. Inversamente, a inmunofluorescencia secundaria que se mostra á dereita, vese primeiro como un anticorpo primario non etiquetado se une ao epítopo do antíxeno por un mecanismo similar ao descrito arriba. Porén, despois de que os anticorpos primarios se uniron ás súas dianas, aparece un anticorpo secundario (etiquetado cun fluoróforo). Estes sitios específicos de unión do anticorpo secundario son específicos para o anticorpo primario que xa está unido ao antíxeno, e, por tanto, o anticorpo secundario únese ao anticorpo primario. Este método permite que máis anticorpos etiquetados con fluoróforo se unan á diana, o que incrementa o sinal fluorescente durante a micoscopía.]]
A **inmunofluorescencia** é unha técnica usada en microscopía óptica con microscopio de fluorescencia, que se aplica principalmente a mostras microbiolóxicas. Esta técnica usa a especificidade dos anticorpos co seu antíxeno para dirixir tinguiduras fluorescentes a biomoléculas diana específicas que se encontran dentro da célula, o que permite a visualización da distribución da molécula diana pola mostra. A rexión específica que recoñece un anticorpo sobre un antíxeno denomínase epítopo. Houbo que facer grandes esforzos para poñer a punto o mapado de epítopos, xa que moitos anticorpos poden unirse ao mesmo epítopo e o grao de unión entre anticorpos que recoñecen o mesmo epítopo pode variar. Adicionalmente, a unión dun fluoróforo ao anticorpo non pode interferir coa especificidade inmunolóxica do anticorpo ou a capacidade de unión ao seu antíxeno.

A inmunofluorescencia pode utilizarse en cortes de tecidos, liñas celulares cultivadas ou células individuais, e pode servir para analizar a distribución de proteínas, glicanos e pequenas moléculas biolóxicas e non bioloxicas. Esta técnica pode incluso utilizarse para visualizar estruturas como os filamentos intermedios do citoesqueleto. Se aínda non se determinou a topoloxía dunha membrana plasmática, pode utilizarse a inserción de epítopos nas proteínas en conxunción coa inmunofluorescencia para determinar estruturas. A inmunofluorescencia pode usarse tamén como método "semicuantitativo" para estudar os niveis e padróns de localización da metilación do ADN, pero é un método que require máis tempo que os métodos verdadeiramente cuantitativos e hai certa subxectividade na análise dos niveis de metilación. A inmunofluorescencia pode aplicarse en combinación con outros métodos de marcaxe fluorescente que non usan anticorpos, por exemplo, o DAPI para etiquetar o ADN. Para a análise de mostras de inmunofluorescencia poden utilizarse varios deseños de microscopios; o máis simple son o microscopio de epifluorescencia e o microscopio confocal. Disponse tamén de varios deseños de microscopio de super-resolución igualmente útiles nos estudos de inmunofluorescencia.

## Tipos 
[miniatura|200px|Fotomicrografía dun corte [histoloxía|histolóxico da pel humana preparada para a **inmunofluorescencia directa** usando un anticorpo anti-IgG. A pel é dun paciente de lupus eritematoso sistémico e mostra depósitos de IgG en dous lugares: o primeiro é un depósito con forma de banda que discorre ao longo da membrana basal epidérmica (polo que a "proba da banda de lupus" é positiva); a segunda está dentro dos núcleos das células epidérmicas (anticorpos antinucleares).]]

### Preparación da fluorescencia 
Para producir anticorpos etiquetados con fluorocromo, debe conxugarse ("etiquetaxe ou marcaxe") un fluorocromo co anticorpo. Igualmente, un antíxeno pode conxugarse tamén co anticorpo cunha sonda fluorescente nunha técnica chamada técnica do antíxeno fluorescente. Os procedementos de marcaxe fluorescente poden aplicarse tanto a antíxenos fixados no citoplasma coma a antíxenos da superficie celular de células vivas, o que se chama "inmunofluorescencia de membrana". Tamén é posible etiquetar o complemento do complexo antíxeno-anticorpo cunha sonda de fluorescencia. Ademais dos elementos aos cales están unidos as sondas de fluorescencia, hai dúas clases xerais de técnicas de inmunofluorescencia: primaria (ou directa) e secundaria (ou indirecta). As seguintes descricións céntranse principalmente nesas clases en termos de anticorpos conxugados. A inmunofluorescencia directa, aínda que algo menos común, ten notables vantaxes sobre o procedemento indirecto ou secundario. A unión directa do mensaxeiro ao anticorpo reduce o número de pasos no procedemento, aforrando tempo e reducindo o sinal de fondo non específico. Isto tamén limita a posibilidade de reactividade cruzada do anticorpo e posibles erros durante o proceso.

Porén, hai algunhas desvantaxes neste método. Como o número de moléculas fluorescentes que pode estar unido a un anticorpo primario é limitado, a inmunofluorescencia directa é substancialmente menos sensible que a indirecta e pode orixinar falsos negativos. A inmunoflorescencia directa tamén require o uso de moita máis cantidade de anticorpo primario, o cal é extremadamente caro.

### Indirecta ou secundaria 
[miniatura|Tinguidura fluorescente para a proteína [actina no músculo liso da pel.]]

A **inmunofluorescencia indirecta** ou secundaria utiliza dous anticorpos; o primeiro anticorpo non etiquetado (primario) únese especificamente á molécula diana, e o anticorpo secundario, que leva o fluoróforo, recoñece o anticorpo primario e únese a el. Poden unirse múltiples anticorpos secundarios a un só anticorpo primario. Isto proporciona unha amplificación do sinal ao incrementar o número de moléculas de fluoróforos por antíxeno. Os anticorpos intactos poden tamén ser demasiado grandes para tinguir células cancerosas *in vivo*. O seu tamaño ten como resultado unha lenta penetración no tumor e vida media circulante longa. Investigouse no uso dos chamados diacorpos (*diabodies*) para sortear esta limitación.

## Avances 
Moitas dos avances neste método dependen das melloras nos microscopios de fluorescencia e os fluoróforos. Os métodos de super-resolución dependen da capacidade dun microscopio de producir unha resolución por debaixo do límite de Abbe (un límite que ten a luz debido á súa lonxitude de onda). Este límite de difracción é duns 200-300&nbsp;nm na dirección lateral e de 500-700&nbsp;nm na dirección axial. Este límite é comparable ou maior que algunhas estruturas da célula, e en consecuencia, este límite impide determinar detalles da súa estrutura. A super-resolución en fluorescencia, máis especificamente, refírese á capacidade dun microscopio de impedir a fluorescencia simultánea de fluoróforos adxacentes espectralmente idénticos. Exemplos de métodos de microscopía de fluorescencia de super-resolución desenvolvidos recentemente son a microscopía de depleción de emisión estimulada (STED), a microscopía de iluminación estruturada saturada (SSIM), a microscopía de localización de fotoactivación de fluorescencia (FPALM), e a microscopía de reconstrución óptica estocástica (STORM).

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Inmunoquímica

### Ligazóns externas 
* Imaxes asociadas con enfermidades autoinmunes  da Universidade de Birmingham
* Protocolo de tinguidura de inmunofluorescencia 
* Resumo do Davidson College
* 
* SynD - Detección de neurita e sinapse automática en imaxes de inmunofluorescencia