Enxeñaría de proteínas

A **enxeñaría de proteínas** é a disciplina técnica utilizada para desenvolver proteínas útiles e valiosas por medio do deseño e a produción de polipéptidos non naturais, a miúdo alterando secuencias de aminoácidos atopadas na natureza. É unha disciplina nova, na que se están a facer moitas investigacións para comprender o pregamento de proteínas e o recoñecemento dos principios para o deseño de proteínas. Foi utilizada para mellorar a función de moitos encimas para a catálise industrial. É tamén un mercado de servizos e produtos, cun valor estimado de 168.000 millóns de dólares en 2017.

Hai dúas estratexias xerais para realizar a enxeñaría de proteínas: deseño de proteínas racional e evolución dirixida. Estes métodos non son mutuamente excluíntes, xa que a miúdo se aplican ambos. No futuro, un coñecemento máis detallado da estrutura das proteínas e da súa función, e os avances en cribado de alto rendemento, poden expandir grandemente as capacidades da enxeñaría de proteínas. Finalmente, poderán incluírse mesmo aminoácidos non naturais por medio de métodos máis modernos, como o código xenético expandido, que permiten codificar novos aminoácidos no código xenético.

## Estratexias 
### Deseño racional 
No deseño de proteínas racional utilízase o coñecemento detallado da estrutura e función dunha proteína para facerlle os cambios desexados. En xeral, isto ten a vantaxe de ser barato e tecnicamente doado de realizar, xa que os métodos de mutaxénese dirixida ao sitio están ben desenvolvidos. Porén, o seu maior inconveniente é que o coñecemento estrutural detallado dunha proteína adoita non estar dispoñible, e, incluso cando está dispoñible, pode ser moi difícil de predicir os efectos de varias mutacións porque as máis das veces a información estrutural proporciona unha imaxe estática da estrutura dunha proteína. Con todo, programas como Folding@home e Foldit utilizaron técnicas de crowdsourcing para aprender máis sobre os motivos presentes no pregamento das proteínas.

Os algoritmos para o deseño de proteínas computacional tratan de identificar novas secuencias de aminoácidos que son de baixa enerxía cando se pregan nunha estrutura diana preespecificada. Mentres que o espazo secuencia-conformación que se debe investigar é grande, a necesidade máis complicada de satisfacer no deseño de proteínas computacional é unha función de enerxía rápida pero exacta que poida distinguir as secuencias óptimas doutras similares subóptimas.

### Aliñamento de secuencias múltiples 
Sen información estrutural sobre unha proteína, a análise de secuencias adoita ser útil para dilucidar información sobre a proteína. Estas técnicas implican o aliñamento de secuencias diana da proteína con outras secuencias de proteínas relacionadas. Este aliñamento pode mostrar os aminoácidos que están conservados entre especies e son importantes para a función da proteína. Estas análises poden axudar a identificar os aminoácidos clave que poden servir como sitios diana para realizar mutacións. O aliñamento de secuencias múltiples utiliza bases de datos como PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE e BALIBASE para establecer referencias cruzadas de secuencias diana de proteínas sen secuencias coñecidas. As técnicas de aliñamento de secuencias múltiples lístanse máis abaixo.

Este método empeza realizando un aliñamento de secuencias por pares usando os métodos k-tuple ou Needleman–Wunsch. Estes métodos calculan unha matriz que representa a semellanza por pares entre os pares de secuencia. Os valores de similitude son despois transformados en valores de distancias que se utilizan para producir unha árbore guía usando o método de unión de veciños. esta árbore guía emprégase despois para render aliñamentos de secuencias múltiples.

#### Proteínas multivalentes 
As proteínas multivalentes son relativamente fáciles de producir por informacións postraducionais ou multiplicando a secuencia de ADN que codifica a proteína. A principal desvantaxe das proteínas multivalentes e multiespecíficas é que poden incrementar a afinidade efectiva para unha diana dunha proteína coñecida. No caso dunha diana inhomoxénea usar unha combinación de proteínas que resulta na unión multiespecífica pode incrementar a especificidade, o cal ten unha grande aplicabilidade en terapéuticas de proteínas.

O exemplo máis común de unión multivalente son os anticorpos, e hai unha extensa investigación sobre anticorpos biespecíficos. As aplicacións de anticorpos biespecíficos cobren un amplo espectro que inclúe a diagnose, formación de imaxes, profilaxe e terapia.

### Evolución dirixida 
Na evolución dirixida aplícase a unha proteína a mutaxénese aleatoria, por exemplo por PCR tendente ao erro ou mutaxénese de saturación de secuencias, e úsase un réxime de selección para escoller as variantes que teñen as características desexadas. Aplícanse despois máis roldas de mutación e selección. Este método imita a evolución natural e, en xeral, produce resultados superiores ao deseño racional. Un proceso engadido denominado barallado de ADN (*DNA shuffling*) mestura e une as pezas de variantes con éxito para producir mellores resultados. Tales procesos imitan a recombinación que ocorre de forma natural durante a reprodución sexual. Vantaxes da evolución dirixida son que non necesita o coñecemento estrutural previo dunha proteína, nin é necesaria para predicir o efecto que terá unha determinada mutación. De feito, os resultados dos experimentos de evolución dirixida son a miúdo sorprendentes porque os cambios desexados adoitan ser causados por mutacións que non se esperaba que tivesen ningún efecto. O inconveniente é que cómpre facer un cribado de alto rendemento, o cal non é factible para todas as proteínas. Deben facerse grandes cantidades de ADN recombinante e os produtos cribados para as características desexadas. O gran número de variantes adoita requirir un equipo robótico caro para automatizar o proceso. Ademais, non todas as actividades desexadas poden cribarse doadamente.

A evolución darwinista natural pode imitarse no laboratorio modelando a medida as propiedades das proteínas para diversas aplicacións, incluíndo a catálise. existen moitas tecnoloxías experimentais para producir grandes e diversas bibliotecas de proteínas e para o cribado ou selección de variantes funcionais pregadas. As proteínas pregadas orixínanse de forma frecuentemente sorprendente no espazo de secuencias aleatorio, algo aproveitable para facer evolucionar ligantes selectivos e catalizadores. Aínda que é máis conservadora que a selección dirixida do espazo de secuencias profundo, o redeseño de proteínas existentes por mutaxénese aleatoria e selección/cribado é un método especialmente robusto para optimizar ou alterar as propiedades existentes. Tamén representa un excelente punto de partida para conseguir obxectivos de enxeñaría ambiciosos. Combinar a evolución experimental con modernos métodos computacionais é probablemente a estratexia máis ampla e frutífera para xerar macromoléculas funcionais descoñecidas na natureza.

Os principais retos para deseñar bibliotecas mutantes de alta calidade solucionáronse significativamente no pasado recente. Este progreso debeuse a que se fixeron mellores descricións dos efectos das cargas mutacionais sobre as características da proteína. Tamén as estratexias computacionais experimentaron grandes avances no enormemente grande espazo de secuencias para tamaños de cribado máis manexables, creando así boas bibliotecas de mutantes. O tamaño de biblioteca tamén se reduciu a tamaños máis cribables pola identificación de residuos clave beneficiosos usando algoritmos para a recombinación sistemática. Finalmente, un avance significativo para unha reenxeñerización eficiente de encimas fíxose co desenvolvemento de modelos estatísticos máis axeitados e de algoritmos que cuantifican e predín efectos mutacionais acoplados sobre as funcións das proteínas.

Xeralmente, a evolución dirixida pode resumirse como un proceso iterativo en dous pasos no que se xeran bibliotecas de proteínas mutantes, e procesos de cribado de alto rendemento para seleccionar variantes con características melloradas. Para aplicar esta técnica non cómpre ter un coñecemento previo da estrutura das proteínas e as relacións coas funcións. A evolución dirixida utiliza a mutaxénese aleatoria ou focalizada para xerar bibliotecas de proteínas mutantes. As mutacións aleatorias poden introducirse usando a PCR tendente ao erro ou a mutaxénese de saturación de sitio. Os mutantes poden tamén xerarse usando a recombinación de xenes homólogos múltiples. Na natureza evolucionaron un número limitado de secuencias beneficiosas. A evolución dirixida fixo posible identificar secuencias proteicas non descubertas que teñen novas funcións. Esta capacidade é continxente coa capacidade das proteínas de ser tolerantes a substitucións de residuos de aminoácidos sen que isto comprometa o seu pregamento ou estabilidade.).

Os avances en enxeñaría de encimas semirracional e o deseño de encimas *de novo* posibilita novas estratexias poderosas e efectivas para manipular biocatalizadores. As estratexias baseadas na integración da secuencia e estrutura no deseño de bibliotecas demostrou ser unha gran guía para o redeseño de encimas. Xeralmente, os métodos actuais computacionais *de novo* e de redeseño non son comparables coas variantes resultado da evolución en prestacións catalíticas. Aínda que a optimización experimental pode producirse usando evolución dirixida, conséguense maiores aumentos na exactitude da predición da estrutura e maiores capacidades catalíticas con melloras no deseño de algoritmos. Poden incluírse máis melloras funcionais no futuro integrando a dinámica de proteínas. ou para converter certos compostos noutros (biotransformación). Estes produtos son útiles como compostos químicos, produtos farmacéuticos, combustibles, alimentos ou aditivos agrícolas.

Un *reactor de encimas*  consiste nun recipiente que contén un medio de reacción que se utiliza para realizar unha conversión desexada por medios encimáticos. Os encimas utilizados neste proceso están libres en solución. Ademais, os microorganismos son unha das orixes importantes de encimas xenuínos.

## Exemplos de proteínas de enxeñaría 
Utilizáronse métodos computacionais para deseñar unha proteína cun pregamento novo chamada Top7, e sensores para moléculas non naturais. A enxeñaría de proteínas de fusión rendeu o fármaco rilonacept, que ten a aprobación da FDA norteamericana para o tratamento da síndrome periódica asociada á criopirina.

Outro método computacional, IPRO, serviu para preparar por enxeñaría o cambio da especificidade de cofactor da xilose redutase de *Candida boidinii*. O Redeseño e Optimización Iterativos de Proteínas (*Iterative Protein Redesign and Optimization*, IPRO) redeseña proteínas para incrementar ou dar especificidade a substratos nativos e novos e cofactores. Isto faise perturbando aleatoriamente de forma repetida a estrutura da proteína arredor de posicións de deseño especificado, identificando a combinación de menor enerxía de rotámeros, e determinando se o novo deseño ten unha enerxía de unión máis baixa que os previos.

O deseño asistido por computador tamén se utilizou para obter por enxeñaría propiedades complexas dunha ensamblaxe nanoproteica altamente ordenada. Unha gaiola proteíca, a da bacterioferritina de *E. coli* (EcBfr), que mostra de forma natural inestabilidade estrutural e un comportamento de autoensamblaxe incompleta en dous estados de oligomerización, é a proteína modelo deste estudo. Por análise computacional e comparación cos seus homólogos, atopouse que esta proteína ten unha interface dímera máis pequena que a media no seu eixe de simetria binario debido principalmente á existencia dun peto de auga interfacial centrado en dous residuos de asparaxina ligados con ponte de auga. Para investigar a posibilidade de preparar por enxeñaría a EcBfr para a estabilidade estrutural modificada, utilízase un método computacional semiempírico para explorar virtualmente as diferenzas de enerxía de 480 mutantes posibles na interface dimérica en relación coa EcBfr de tipo silvestre. Este estudo computacional tamén converxe nas asparaxinas ligadas con ponte de auga. Substituír estas dúas asparaxinas con aminoácidos hidrófobos ten como resultado a formación de proteínas que se pregan en monómeros de hélice alfa e se ensamblan en gaiolas, como se evidencia por dicroísmo circular e microscopia electrónica de transmisión. Tanto a desnaturalización térmica coma química confirman que todas as proteínas redeseñadas, de acordo cos cálculos, presentan unha maior estabilidade. Unha das tres mutacións cambia a poboación en favor do estado de oligomerización de orde máis alta en solución, como mostran a cromatografía de exclusión por tamaños e a electroforese en xel nativa. foi desenvolvido con éxito para redeseñar a proteína de canle bacteriana (OmpF) para reducir o seu tamaño de poro de 1&nbsp;nm a calquera dimensión subnanométrica desexada. Os experimentos de transporte polos poros deseñados máis estreitos revelaron un completo rexeitamenteo de sales cando se ensamblaban en matrices de polímeros en bloques biomiméticos.

## Notas 
## Véxase tamén 
### Outros artigos 
* Técnicas de display:
** Bacterial display
** Phage display
** mRNA display
** Ribosome display
** Yeast display
* Enxeñaría biomolecular
* Encimoloxía
* Código xenético expandido
* Proteólise paralela rápida (FASTpp)
* Síntese de xenes
* Enxeñaría xenética
* Análogos de ácidos nucleicos
* Software para a predición da estrutura de proteínas
* Proteómica
* Proteoma
* SCOPE (enxeñaría de proteínas)
* Bioloxía estrutural
* Bioloxía sintética

### Ligazóns externas 
* servidores para enxeñaría de proteínas  e temas relacionados baseados no software WHAT IF
* Encimas construídos desde cero – Os investigadores preparan por enxeñaría catalizadores nunca vistos usando unha nova técnica computacional, *Technology Review*, 10 de marzo de 2008