Kiinteäfaasiuutto

**Kiinteäfaasiuutto** eli **SPE** () on  erotusmenetelmä, jolla erotetaan aineseoksen osat toisistaan, tai pääaine epäpuhtauksista. SPE:tä käytetään laboratorioissa puhdistamaan analysoitavia näytteitä esimerkiksi veri- tai vesinäytteitä. Menetelmää voidaan verrata neste-neste uuttoon. SPE:ssä erotettavaa ainetta sitova stationäärifaasi on kiinteä ja se on yleensä pakattu lieriömäiseen injektioruiskua muistuttavaan koteloon tai vaihtoehtoisesti lieriömäiseen kasettiin. Erotettavat aineet tuodaan stationäärifaasiin sopivaan nesteeseen liuotettuina. Menetelmää käytetään selektiivisesti uuttamaan, konsentroimaan ja puhdistamaan kohdeanalyyttejä ennen analysointia HPLC:llä tai GC:llä.

SPE:n etuina ovat:

* helppous
* suoritusteho
* liuottimien vähäinen kulutus
* analyytin konsentroituminen ja
* epäpuhtauksien poistuminen

Kiinteäfaasiuutossa käytetään pieniä kertakäyttöisiä kolonneja, joissa täytteenä on vastaavanlaisia materiaaleja kuin nestekromatografiassa. Lisäksi on kehitetty erikoismateriaaleja spesifisiin erottamisiin.

## Periaate
Kiinteäfaasiuutossa stationäärifaasi on kiinteä ja liikkuva faasi nestemäinen. Kun valitaan sopiva liuotin ja täytemateriaali, saadaan tutkittava yhdiste pidättymään stationäärifaasiin ja matriisin aineet kulkeutumaan kolonnin läpi pidättymättä. Vaihtamalla tämän jälkeen eluenttia ja/tai eluentin pH:ta, saadaan tutkittava(t) yhdiste(et) eluoitumaan ulos kolonnista.

## Stationäärifaasi
Kiinteäfaasiuuton tärkein tekijä on stationäärifaasi. Stationäärifaasin fysikaalis-kemialliset ominaisuudet määrittävät uuton tehokkuuden ja yleensäkin erottumisen laadun. Stationäärifaaseja on saatavilla erilaisilla
* huokoskoolla
* partikkelikoolla
* materiaaleilla	
Optimaalinen stationäärifaasi valitaan kohdeanalyytin ja näytteen/matriisin koostumuksen mukaan.

Silikapohjaiset stationäärifaasit ovat suosituimpia, koska ne ovat halpoja, helppoja käyttää, vakaita ja niiden koko ei muutu vesiliuoksissa eikä orgaanisilla liuottimilla. Suosituimpia silikastationäärifaaseja ovat kemiallisesti modifioidut silikapartikkelit joissa on pintaan kovalenttisesti sitoutuneita funktionaalisia ryhmiä. Silikan modifiointi muuttaa sen kromatografista selektiivisyyttä. Pelkkä silika on erittäin polaarista, ja se pidättää analyyttejä normaalifaasi- ja kationinvaihtomekanismeissa. Kun kiinnitetään pintaan hiilivetyjä, esimerkiksi C18, pinta muuttuu hydrofobiseksi (poolittomaksi). Pintaan jää kuitenkin edelleen vapaita silanoleja, jolloin silikapohjainen C18-stationäärifaasi toimii erittäin hyvin yhdisteiden, joiden polaarisuus on erilainen, erottamisessa.

Polymeeripohjaiset stationäärifaasit koostuvat tyypillisesti crosslinkatusta polystyreenidivinyylibentseenistä (PSDVB tai SDB). SDB on pooliton ja kykenevä voimakkaisiin hydrofobisiin ja π-π-vuorovaikutuksiin. Kuten silikan, SDB:n pintaa voidaan modifioida lisäämällä funktionaalisia ryhmiä.

Tyypillisen SPE-stationäärifaasin pinta-ala vaihtelee 250-600 m2/g. Suuri osa pinta-alasta muodostuu huokosten sisäpinnasta. Useimmilla SPE-stationäärifaaseilla on pieni huokoskoko, noin 60-70 Å (6-7 nm), ja siitä syystä yli 15 kDa kokoiset makromolekyylit eivät juuri kykene vuorovaikutukseen stationäärifaasin kanssa. Useimpien SPE-stationäärifaasien partikkelikoko on noin 50 µm. Suuresta partikkelikoosta johtuen paine pysyy alhaisena ja voidaan käyttää suurta virtausta ilman, että kolonni tukkeutuu.

## Uuttomekanismit
### Käänteisfaasi

Käänteisfaasiuuttoa käytetään yleisesti uuttamaan hydrofobisia tai poolittomia orgaanisia analyyttejä vesiliuoksista. Hiilivetyketjut sekä analyytissä että stationäärifaasissa vetävät toisiaan puoleensa van der waalsin voimien ansiosta. Käänteisfaasiuutot ovat suhteellisen epäspesifisiä.

### Normaalifaasi

Normaalifaasiuuttoa käytetään yleensä uuttamaan polaarisia analyyttejä poolittomista orgaanisista liuottimista. Erottumismekanismi perustuu vetysitoutumiseen, dipoli-dipoli- sekä π-π-vuorovaikutuksiin polaarisen analyytin ja polaarisen stationaarifaasin välillä. Normaalifaasiuutosta voidaan saada erittäin spesifinen tasapainotusliuoksen ja näytteessä käytetyn liuottimen polaarisuuden huolellisella optimoinnilla. 

### Ioninvaihto
Ioninvaihtomekanismia käytetään uuttamaan varautuneet analyytit vesiliuoksista tai orgaanisista näytteistä, joilla on alhainen ionivahvuus. Varautunut stationäärifaasi pidättää analyyttejä, joilla on vastakkaismerkkinen varaus. Ioninvaihtomekanismi perustuu spesifiseen, korkeaenergiaiseen kulombiseen vuorovaikutukseen stationäärifaasin ja analyytin välillä. Vain näytteet, joilla on sopiva varaus, pidättyvät kolonniin, joten useimmat matriisissa olevat epäpuhtaudet huuhtoutuvat pois näytteen lataus- ja pesuvaiheissa. Tästä syystä kationinvaihto SPE:a käytetään yleisesti uuttamaan emäksisiä yhdisteitä monimutkaisista biologisista näytteistä. Analyytit eluoidaan tyypillisesti suoloilla, puskureilla ja/tai vahvoilla hapoilla, joilla on suuri ionivahvuus.

## SPE käytännössä

### Uuton suoritus
Kiinteäfaasiuuton suorituksessa on neljä vaihetta:
# pylvään aktivointi eli "herätys"
# näytteen applikointi pylvääseen
# pesut sekä
# eluointi.

Aktivointi parantaa uuttojen toistettavuutta ja perustuu kiinteän faasin partikkelien tasaiseen kostumiseen, jolloin sen vuorovaikutus näytemolekyylien kanssa on kerrasta toiseen mahdollisimman samanlainen. Poolittomat faasit tasapainotetaan ensin polaarisilla liuottimilla ja polaariset vastaavasti poolittomilla 2-3 kertaa kolonnin tilavuuden suuruisella määrällä liuotinta. Tämän jälkeen tasapainotetaan vielä samalla liuoksella johon näyte on liuotettu. Tasapainottamisen jälkeen erotusmateriaalia ei saa päästää enää kuivumaan ennen uuton valmistumista.

Seuraavassa vaiheessa lisätään näyte. Näytemäärä riippuu käytetyn kolonnin sisältämästä kiinteän faasin määrästä, eli kolonnin kapasiteetista. Näyte voidaan applikoida käyttäen joko positiivista tai negatiivista painetta tai pelkästään painovoimaa hyväksi käyttäen, joka kuitenkin useimmissa tapauksissa on erittäin hidasta.

Pesuvaiheessa kolonnista poistetaan mahdollisimman paljon sinne jääneitä, mutta kuitenkin uuttomateriaaliin joko kiinnittymättömiä tai heikosti kiinnittyneitä, matriisin aineita. Pesu ei kuitenkaan ole välttämätön vaihe, sillä esimerkiksi analyyttimolekyylin ollessa hyvin polaarinen ja matriisin muiden aineiden ollessa melko poolittomia (tietyssä pH:ssa), on mahdollista että matriisin aineet tulevat ulos jo näytettä applikoitaessa, kun taas analyytti tarttuu erittäin voimakkaasti adsorbenttiin.

Eluointi suoritetaan liuottimella, liuotinseoksella tai puskuriliuoksella jonka analyyttiä liuottavat ominaisuudet ovat mahdollisimman hyvät. Eluointia ei pitäisi suorittaa liian nopeasti, sillä tällöin analyytti saattaa lähteä liikkeelle laajana rintamana, joka etenkin konsentroitaessa näytettä ei ole suotavaa. Hieman toisistaan, joko polaarisuudeltaan tai pH:ltaan, eroavia eluentteja käyttäen on mahdollista saada yhdellä uutolla eroamaan useampia kuin yksi analyytti.