میکروسکوپی تخلیۀ گسیل تحریک‌شده (STED)

**میکروسکوپی تخلیۀ گسیل تحریک‌شده** یکی از تکنیک‌های میکروسکوپی فرابُلد یا سوپررزولوشن است. این روش با غیرفعال‌سازی انتخابی فلورفورها، ناحیۀ روشن‌شده در نقطۀ کانونی را کوچک می‌کند و بنابراین وضوح قابل دستیابی را در یک سیستم افزایش می‌دهد. این تکنیک در سال 1994 توسط استفان دبلیو. هل و یان ویشمان توسعه یافت و نخستین بار در سال 1999 توسط هل و توماس کلار به‌صورت تجربی نشان داده شد. هل در سال 2014 برای توسعۀ این رو، جایزۀ نوبل شیمی را دریافت کرد. در سال 1986، و. آ. اوخونین (مؤسسۀ بیوفیزیک، آکادمی علوم شوروی، شعبۀ سیبری، کراسنویارسک) ایدۀ STED را ثبت اختراع کرده بود. این پتنت در سال 1994 برای هل و ویشمان ناشناخته بود.

میکروسکوپی STED یکی از چندین نوع روش‌های میکروسکوپی سوپررزولوشن است که اخیراً برای غلبه بر حد پراش در میکروسکوپی نوری و افزایش وضوح توسعه یافته‌اند. STED یک تکنیک قطعی (deterministic) است که از پاسخ غیرخطی فلورفورهای معمول در نشانه‌گذاری نمونه‌های زیستی بهره می‌گیرد تا وضوح را بهبود ببخشد؛ یعنی STED امکان ثبت تصاویر با وضوح کمتر از حد پراش را فراهم می‌کند. این روش با تکنیک‌های تصادفی (stochastic) مانند میکروسکوپی مکان‌یابی با فعال‎‌سازی نوری (PALM) و میکروسکوپی بازسازی نوری تصادفی (STORM) متفاوت است، زیرا آن روش‌ها از مدل‌سازی ریاضی برای بازسازی یک تصویر زیر حد پراش از مجموعه‌های متعدد تصویرهای محدود به پراش استفاده می‌کنند.
بندانگشتی|میکروسکوپی تخلیۀ گسیل القایی (STED) نسبت به میکروسکوپ کانفوکال بهبودهای قابل‌توجهی در تفکیک‌پذیری فراهم می‌کند.

## پیشینه
در میکروسکوپی سنتی، وضوحی که می‌توان به‌دست آورد به وسیلۀ پراش نور محدود می‌شود. ارنست آبّه معادله‎‌ای را برای توصیف این حد توسعه داد. معادله این است:

D = \frac{\lambda}{2 n \sin \alpha}=\frac{\lambda}{2 NA}

که در آن D حد پراش است، λ طول موج نور است، و NA عدد دهانۀ مؤثر (numerical aperture) یا ضریب شکست محیط ضرب‌در سینوس زاویۀ تابش است. n ضریب شکست نمونه را توصیف می‌کند، α نیم‌زاویۀ جامدی را اندازه می‌گیرد که از آن نور توسط یک عدسی جمع‌آوری می‌شود، λ طول موج نوری است که برای تحریک نمونه استفاده می‌شود، و NA عدد دهانۀ مؤثر است. برای به‌دست آوردن وضوح بالا (یعنی مقادیر کوچکD) طول موج‌های کوتاه و مقادیر بالای عدد دهانۀ مؤثر (NA = nsinα) بهینه هستند. این حد پراش، معیاری است که همۀ روش‌ های سوپررزولوشن با آن سنجیده می‌شوند. از آنجا که STED به‌طور انتخابی فلورسانس را غیرفعال می‌کند، می‌تواند وضوحی بهتر از میکروسکوپی کانفوکال سنتی به‌دست آورد. فلورسانس طبیعی با برانگیختن یک الکترون از حالت پایه به حالت الکترونی برانگیخته‌ای با سطح انرژی بنیادی متفاوت (S0 به S1 می‌رود) رخ می‌دهد که پس از بازگشت به حالت ارتعاشی پایه (از S1)، با افت انرژی الز S1 به سطح انرژی ارتعاشی روی S0 یک فوتون را ساطع می‌کند. STED این فرایند را پیش از اینکه فوتون آزاد شود قطع می‌کند. الکترون برانگیخته مجبور می‌شود به یک حالت ارتعاشی بالاتر نسبت به حالتی که گذار فلورسانس آن را وارد می‌کرد، آرامش یابد، که باعث می‌شود فوتونی که قرار است آزاد شود به‌سمت قرمز جابه‌جا شود، همان‌طور که در تصویر نشان داده شده است. از آنجا که الکترون به یک حالت ارتعاشی بالاتر می‌رود، اختلاف انرژی بین دو حالت کمتر از اختلاف انرژی فلورسانس طبیعی است. این کاهش انرژی طول موج را افزایش می‌دهد و باعث می‌شود فوتون بیشتر به سمت انتهای قرمز طیف جابه‌جا شود. این جابه‌جایی دو نوع فوتون را از یکدیگر متمایز می‌کند و اجازه می‌دهد فوتون تحریک‌شده نادیده گرفته شود.
بندانگشتی|نمودار جابلونسکی، تغییر به‌سمت قرمز فوتون القاشده را نشان می‌دهد. این تغییر به‌سمت قرمز باعث می‌شود فوتون القاشده نادیده گرفته شود.
برای وادار کردن این گسیل جایگزین به وقوع، باید یک فوتون فرودی به فلورفور برخورد کند. این نیاز به برخورد فوتون فرودی دو پیامد برای STED دارد. نخست، تعداد فوتون‌های فرودی مستقیماً بر کارایی این گسیل اثر می‌گذارد، و دوم اینکه با تعداد کافی فوتون، می‌توان فلورسانس را به‌طور کامل سرکوب کرد. برای رسیدن به تعداد زیاد فوتون‌های فرودی موردنیاز برای سرکوب فلورسانس، لیزری که برای تولید فوتون‌ها استفاده می‌شود باید شدت بالایی داشته باشد. متأسفانه این لیزر پرشدت می‌تواند منجر به مشکل فوتوبلچینگ فلورفور شود. فوتوبلچینگ نامی است برای تخریب فلورفورها توسط نور با شدت بالا.

## فرایند
STED با تخلیۀ فلورسانس در نواحی خاصی از نمونه در حالی عمل می‌کند که یک نقطۀ کانونی مرکزی را فعال باقی می‌گذارد تا فلورسانس متشر کند. این ناحیۀ کانونی را می‌توان با تغییر ویژگی‌های صفحۀ مردمک عدسی شیئی طراحی کرد. رایج ترین نمونۀ اولیه از این عناصر نوری پراشی یا DOEها، یک شکل توری (donut) است که در محدودسازی جانبی دوبعدی استفاده می‌شود و در زیر نشان داده شده است. ناحیۀ قرمز تخلیه شده است، در حالی که نقطۀ سبز فعال باقی می‌ماند. این DOE با قطبش دایره‌ای لیزر تخلیه، همراه با یک ورتکس نوری ایجاد می‌‌شود. وضوح جانبی این DOE معمولاً بین 30 تا 80 نانومتر است. با این حال، مقادیری تا 2.4 نانومتر نیز گزارش شده است. با استفاده از DOEهای مختلف، وضوح محوری در حد 100 نانومتر نشان داده شده است. یک معادلۀ اصلاح‌شدۀ آبّه این وضوح زیر پراشی را به‌صورت زیر توصیف می‌کند:

D = \frac{\lambda}{2 n \sin \alpha
\sqrt{1+\frac{I}{I_{\text{sat}}}}}
=\frac{\lambda}{2 NA \sqrt{1+\sigma}}

که در آن n ضریب شکست محیط است، I شدت داخل کاواک (intracavity intensity) است، و I_sat شدت اشباع است. همچنین σ عامل اشباع است که نسبت شدت اعمال شدۀ بیشینۀ STED به شدت اشباع را بیان می‌کند:

\sigma=\frac{I_{\max}}{I_{\text{sat}}}
بندانگشتی|مقایسۀ میکروسکوپی کانفوکال و میکروسکوپی STED. این مقایسه نشان می‌دهد که میکروسکوپی STED نسبت به روش‌های سنتی، تفکیک‌پذیری بهتری ارائه می‌دهد.
بندانگشتی|نقطۀ برانگیزش (دوبعدی، چپ)، نقطۀ غیربرانگیزش با شکل دوناتی (مرکز)، و ناحیۀ باقی‌مانده که امکان فلورسانس را فراهم می‌کند (راست).
برای بهینه‌سازی کارایی STED، تداخل مخرب در مرکز نقطۀ کانونی باید تا حد ممکن به حالت ایده‌آل نزدیک باشد. این موضوع محدودیت‌هایی را بر اپتیکی که می‌توان استفاده کرد تحمیل می‌کند.

## رنگینه‌ها
در ابتدای توسعۀ STED، تعداد رنگینه‌هایی که می‌توانست در این فرایند استفاده شود بسیار محدود بود. رودامین B در اولین توصیف تئوریک STED نام برده شد. در نتیجه، نخستین رنگینه‌های استفاده‌شده، رنگینه‌هایی بودند که در بخش قرمز طیف لیزر ساطع می‌‌کردند. برای امکان‌پذیر کردن تحلیل STED در سیستم‌های زیستی، رنگینه‌ها و منابع لیزر باید با سیستم سازگار شوند. این تمایل برای تحلیل بهتر این سیستم‌ها منجر به STED در سلول زنده و STED چندرنگ شد، اما همچنین نیاز به رنگینه‌ها و سیستم‌های تحریک پیشرفته‌تر و پیشرفته‌تری را برای سازگاری با کارکردهای افزایش‌یافته ایجاد کرد.

یکی از این پیشرفت‌ها، توسعۀ سلول‌های ایمونولیبل‌شده بود. این سلول‌ها رنگینه‌های فلورسانس STED هستند که از طریق پیوندهای آمیدی به آنتی‌بادی‌ها متصل شده‌اند. نخستین استفاده ار این تکنیک، MR-121SE، یک رنگ قرمز را با یک آنتی‌بادی ثانویۀ ضد موش ترکیب کرد. از زمان اولین کاربرد آن، این تکنیک به دامنۀ بسیار وسیع‌تری از رنگینه‌ها اعمال شده است، از جمله رنگینه‌های گسیل کنندۀ سبز مانند Atto 532، و رنگینه‌های گسیل‌کنندۀ زرد مانند Atto 590، همچنین رنگینه‌های اضافی گسیل‌کنندۀ قرمز. علاوه بر این، Atto 647N نخستین بار با این روش برای تولید STED دو رنگ استفاده شد.

## کاربردها
در چند سال گذشته، STED از یک تکنیک پیچیده و بسیار خاص به یک روش عمومی فلورسانس تبدیل شده است. در نتیجه، تعدادی روش برای گسترش کاربرد STED و فراهم کردن اطلاعات بیشتر توسعه یافته‌اند.

### تحلیل ساختاری
از ابتدای فرایند، STED به میکروسکوپی فلورسانس اجازه داده است کارهایی را انجام دهد که تنها با میکروسکوپی الکترونی امکان‌پذیر بود. به عنوان مثال، از STED برای روشن‌سازی تحلیل ساختار پروتئین در سطح زیرارگانی استفاده شده است. اثبات رایج این سطح از مطالعه، مشاهدۀ رشته‌های اسکلت سلولی است. علاوه بر این، نوروفیلامنت‌ها، اکتین و توبولین اغلب برای مقایسۀ قدرت تفکیک STED و میکروسکوپ‌های کانفوکال استفاده می‌شوند.

با استفاده از STED، وضوح جانبی 70 تا 90 نانومتر هنگام بررسی SNAP25، یک پروتئین انسانی تعیین‌کنندۀ همجوشی غشایی، به دست آمده است. این مشاهده نشان داده است که SNAP25 به‌طور مستقل از قابلیت عملکرد موتیف SNARE خوشه تشکیل می‌دهد و به سینتاکسین خوشه‌شده متصل می‌شود. مطالعۀ اندامک‌های پیچیده مانند میتوکندری نیز برای تحلیل ساختاری از میکروسکوپی STED بهره می‌برد. با استفاده از میکروسکوپ‌های STED سفارشی با وضوح جانبی کمتر از 50 نانومتر، پروتئین‌های میتوکندریایی Tom20، VDAC1 و COX2 به صورت خوشه‌های در مقیاس نانو توزیع شده یافت شدند. مطالعۀ دیگری از یک میکروسکوپ STED دست‌ساز و یک رنگ فلورسانس متصل‌شونده به DNA استفاده کرد و طول قطعات DNA را بسیار دقیق‌تر از اندازه‌گیری متداول با میکروسکوپی کانفوکال اندازه‌گیری کرد.

### روش‌های همبسته
به دلیل عملکرد خود، میکروسکوپی STED اغلب می‌تواند همراه با سایر روش‌های با وضوح بالا استفاده شود. وضوح هر دو میکروسکوپ الکترونی و نیروی اتمی حتی بهتر از وضوح STED است، اما با ترکیب میکروسکوپی نیروی اتمی با STED، شیما و همکاران توانستند اسکلت اکتین سلول‌های سرطان تخمدان انسان را در حالی که تغییرات سختی سلول را مشاهده می‌کردند، تجسم کنند.

### چندرنگ
STED چندرنگ در پاسخ به مشکل روبه‌رشد استفاده از STED برای مطالعۀ وابستگی بین ساختار و عملکرد پروتئین‌ها توسعه یافت. برای مطالعۀ چنین سیستم پیچیده‌ای، حداقل دو فلورفور جداگانه لازم است. با استفاده از دو رنگ فلورسنت و جفت پرتو، تصویربرداری هم‌مکانی از خوشه‌های پروتئین سیناپسی و میتوکندریال با وضوح تا 5 نانومتر ممکن است. STED چندرنگ همچنین نشان داده است که جمعیت‌های مختلف پروتئین‌های وزیکول سیناپسی با یکدیگر مخلوط نمی‌شوند یا از بوتون‌های سیناپسی خارج نمی‌شوند. با استفاده از STED دورنگ با تصویربرداری چند-طول‌عمر، STED سه‌کاناله امکان‌پذیر است.

### سلول زنده
در ابتدا STED به عنوان یک تکنیک مفید برای کار با سلول‌های زنده درنظر گرفته می‌شد. متأسفانه، تنها راه مطالعۀ سلول‌ها این بود که غشای پلاسما با رنگ‌های آلی برچسب‌گذاری شود. ترکیب STED با طیف‌سنجی همبستگی فلورسانس نشان داد که کمپلکس‌های مولکولی میانجی‌شده با کلسترول اسفنگولیپیدها را به دام می‌اندازند، اما فقط به‌طور گذرا. با این حال، تنها پروتئین‌های فلورسنت توانایی تصویرسازی از هر اندامک یا پروتئین در یک سلول زنده را فراهم می‌کنند. این روش نشان داده شد که با وضوح جانبی 50 نانومتر در سلول‌های پستانداری بیان‌کنندۀ Citrine-tubulin کار می‌کند. علاوه بر تشخیص ساختارها در سلول‌های پستانداران، STED امکان تجسم خوشه‌بندی پروتئین‌های PIN دارای برچسب YFP در غشای پلاسمای سلول‎‌های گیاهی را نیز فراهم کرده است.

اخیراً STED چندرنگ سلول زنده با استفاده از یک لیزر پالسی مادون‌قرمز دور و بیان SNAPf-tag و CLIPf-tag انجام شده است.

### در مغز حیوانات دست‌نخورده
لایه‌های سطحی قشر مغز موش می‌توانند بارها از طریق یک پنجرۀ جمجمه‌ای تصویربرداری شوند. این امکان دنبال کردن سرنوشت و شکل خارهای دندریتی منفرد برای هفته‌ها را فراهم می‌کند. با STED دورنگ، حتی می ‌توان ساختار نانویی چگالی پس‌سیناپسی را در حیوانات زنده حل کرد.

### STED با نرخ ویدئو و فراتر از آن
سوپررزولوشن به پیکسل‌های کوچک نیاز دارد، که به معنی فضاهای بیشتری برای تصویربرداری از یک نمونه است و این منجر به زمان تصویربرداری طولانی‌تر می‌شود. با این حال، اندازۀ نقطۀ کانونی به‌شدت لیزری که برای تخلیه استفاده می‌شود وابسته است. در نتیجه، این اندازۀ نقطه را می‌توان تنظیم کرد و اندازه و سرعت تصویربرداری را تغییر داد. می‌توان مصالحه‌ای بین این دو عامل برای هر وظیفۀ تصویربرداری خاص پیدا کرد. نرخ‌های 80 فریم بر ثانیه ثبت شده‌اند، با نقاط کانونی حدود 60 نانومتر. تا 200 فریم بر ثانیه برای میدان‌های دید کوچک قابل دستیابی است.

## مشکلات
فوتوبلچینگ می‌تواند یا از تحریک به یک حالت برانگیختۀ حتی بالاتر رخ دهد، یا از تحریک در حالت تریپلت. برای جلوگیری از تحریک یک الکترون برانگیخته به یک حالت برانگیختۀ بالاتر دیگر، انرژی فوتونی که برای آغاز گسیل جایگزین لازم است، نباید با انرژی تحریک از یک حالت برانگیخته به حالت دیگر هم‌پوشانی داشته باشد. این تضمین می‌کند که هر فوتون لیزری که با فلورفورها تماس پیدا می‌کند، گسیل تحریک‌شده ایجاد کند و موجب تحریک الکترون به حالت انرژی بالاتر نشود. حالت تریپلت بسیار طولانی‌عمرتر از حالات سینگلت هستند، و برای جلوگیری از تحریک حالات تریپلت، زمان بین پالس‌های لیزر باید به اندازۀ کافی طولانی باشد تا اجازه دهد الکترون از طریق یک روش دیگر خاموش‌سازی آرامش یابد، یا یک ترکیب شیمیایی باید برای خاموش‌سازی حالت تریپلت اضافه شود.

## جستارهای وابسته

* میکروسکوپی کانفوکال
* فلورسانس
* میکروسکوپ فلورسانس
* میکروسکوپی تخلیۀ حالت پایه (GSD)
* میکروسکوپی کانفوکال لیزری
* میکروسکوپ نوری
* میکروسکوپی مکان‌یابی با فعال‌سازی نوری (PALM)
* میکروسکوپی بازسازی نوری تصادفی (STORM)

## منابع


## پیوند به بیرون

* اشتفان هل
* department of nanobiophotonics
* وی‌بک ماشین
* light microscopy: an ongoing contemporary revolution (introductory review)

رده:مقاله‌های ایجادشده توسط ایجادگر