تکثیر هم‌دمای متصل به حلقه

**تکثیر [[فرایند هم‌دما|هم‌دما]]ی متصل به حلقه** یا **تکثیر ایزوترمال متصل به حلقه** ، تکنیک تک‌لوله‌ای برای تکثیر DNA است. از این روش ممکن است در آینده به عنوان یک جایگزین کم‌هزینه برای تشخیص بیماری‌های خاص استفاده شود. همچنین این تکنیک ممکن است با رونویسی معکوس برای شناسایی **RNA** نیز ترکیب شود.بندانگشتی

## روش
**LAMP** یک روش تکثیرکننده اسید نوکلئیک به صورت ایزوترمال است. برخلاف واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) که به‌صورت مرحله‌ای و با تغییرات متناوب دما انجام می‌گیرد، تکثیر ایزوترمال در دمای ثابت انجام می‌شود و نیازی به ترموسایکلر نیست.

در روش **LAMP**، توالی هدف در دمای ثابت ۶۰–۶۵ درجه سانتی گراد با استفاده از دو یا سه مجموعه پرایمر (آغازگر) و یک آنزیم پلیمراز که علاوه بر فعالیت رونویسی، فعالیت جابجایی رشته بالایی نیز دارد، تکثیر می‌شود. به‌طور معمول، ۴ آغازگر متفاوت برای شناسایی ۶ ناحیه متمایز در ژن هدف مورد استفاده قرار می‌گیرد، که به شدت به اختصاصیت روش می‌افزاید. یک جفت «آغازگر حلقه ای» اضافی نیز می‌تواند واکنش را بیشتر تسریع کند. با توجه به ماهیت خاص عملکرد این آغازگرها، مقدار **DNA** تولید شده در روش **LAMP** به‌طور قابل توجهی بالاتر از روش PCR است.

در این روش مقدار زیادی رسوب منیزیم پیروفسفات به عنوان محصول جانبی در محلول تولید و سبب ایجاد کدورت می‌شود. به همین دلیل برای شناسایی محصول تکثیر شده واکنش از روش فتومتری استفاده می‌شود.فتومتری باعث آسان‌تر شدن تجسم با چشم غیر مسلح به ویژه در واکنش‌های با حجم بالا می‌شود. این واکنش می‌تواند به صورت **real time** یا در لحظه با اندازه‌گیری کدورت یا با روش فلورسانس (با استفاده از رنگ‌های **intercalating** مثل **SYTO9**) نیز انجام شود. رنگ‌هایی مثلSYBR green می‌توانند برای ایجاد تغییر رنگی که با چشم غیرمسلح قابل مشاهده است و نیازی به تجهیزات گران‌قیمت ندارد، یا برای ایجاد پاسخی که با دقت بیشتری توسط تجهیزات اندازه‌گیری می‌شود، مورد استفاده قرار گیرند. مولکول‌های رنگ، **DNA** را جاگذاری یا به‌طور مستقیم برچسب گذاری می‌کنند و به نوبه خود می‌توانند با تعداد نسخه‌هایی که از ابتدا حضور دارند، همبستگی داشته باشند. از این رو روش **LAMP** می‌تواند کمی هم باشد. تشخیص درون لوله ای تکثیر **DNA** با استفاده از کلسین بارگذاری شده با منگنز ممکن می‌شود. طی واکنش سنتز**DNA** به صورت**in vitro**، کلسین واکنش فلورسانس را با ترکیب منگنز با پیروفسفات آغاز می‌کند.علاوه بر این تشخیص آمپلیکون‌های **LAMP** با چشم غیرمسلح به توانایی آن‌ها در ترکیب با **ss-** **DNA** متصل به طلا و در نتیجه جلوگیری از تغییر رنگ قرمز طبیعی به بنفش آبی بستگی دارد که در غیر این صورت با تجمع ناشی از نمک ذرات طلا صورت می‌گیرد؛ بنابراین روش**LAMP** ترکیب شده با شناسایی آمپلیکون‌ها به وسیله **AuNP** مزایای بیشتری نسبت به روش‌های قبلی دارد. این مزایا عبارتند از:کاهش زمان تست، تثبیت آمپلیکون با هیبریداسیون و تجهیزات ساده‌تر (مثل عدم نیاز به ترموسایکلر، تجهیزات الکتروفورز و لامپ اشعه ماورای بنفش)

## کاربردها و مزایا
**LAMP** یک تکنیک نسبتاً جدید برای تکثیر **DNA** است که به خاطر هزینه کم و سادگی می‌تواند مزایای زیادی به همراه داشته باشد.**LAMP** این توانایی را دارد که به عنوان یک تست غربالگری ساده در زمینه مراقبت توسط پزشکان مورد استفاده قرار گیرد. از آنجایی که **LAMP** به صورت ایزوترمال است و نیاز به ترموسایکلر گران‌قیمت استفاده شده در **PCR** معمولی را از بین می‌برد، ممکن است یک روش بسیار مفید برای تشخیص بیماری‌های عفونی در کشورهای کم درآمد و متوسط باشد. در حالی که **LAMP** به‌طور گسترده برای تشخیص بیماری‌های عفونی مانند سل، مالاریا و بیماری خواب مطالعه می‌شود، در مناطق در حال توسعه هنوز به‌طور گسترده برای سایر پاتوژن‌های رایج معتبر شمرده نمی‌شود.

**LAMP** در مقایسه با **PCR** نسبت به مهارکننده‌های موجود در نمونه‌های پیچیده مثل خون حساسیت کمتر و مقاومت بیشتری دارد. علت این امر استفاده از **DNA**پلیمراز متفاوت (معمولاً پلیمراز **Bst** به جای پلیمراز **Taq** در **PCR**)می‌باشد. گزارش‌های متعدد حاکی از موفقیت‌آمیز بودن تشخیص پاتوژن‌ها در نمونه‌های کمتر فراوری شده مثل خون‌گرم شده یا در حضور نمونه بالینی می‌باشد. این ویژگی **LAMP** ممکن است در تنظیمات کم منابع یا کم زمینه مفید باشد، زیرا استخراج **DNA** یا **RNA** متعارف قبل از آزمایش‌های تشخیصی غیرممکن است.

## محدودیت‌ها
**LAMP** نسبت به **PCR**(متدوال‌ترین روش تکثیر**DNA**) تنوع کمتری دارد.**LAMP** عمدتاً به عنوان یک روش تشخیصی مفید واقع می‌شود ولی برای کلونینگ و هزاران کاربرد زیست‌شناسی مولکولی که با **PCR** انجام می‌شوند، ناکارآمد است؛ زیرا در روش **LAMP** از ۴یا۶ پرایمر استفاده می‌شود که ۶ یا ۸ ناحیه را در یک بخش نسبتاً کوچک از ژنوم، هدف قرار می‌دهد و چون طراحی پرایمر محدودیت‌های زیادی دارد، طراحی آن‌ها با چشم مشکل می‌شود. به‌طور کلی برای کمک به طراحی پرایمر، بسته‌های نرم‌افزاری رایگان یا تجاری مورد استفاده قرار می‌گیرند، گرچه محدودیت‌های طراحی پرایمر به معنای آزادی کمتر در انتخاب توالی هدف نسبت به **PCR** است.

در برنامه‌های تشخیصی باید نیاز به انتخاب یک توالی هدف مناسب (به عنوان مثال یک توالی محافظت شده در یک ژنوم بسیار متغیر ویروسی یا یک توالی هدف خاص برای سویه خاصی از پاتوژن) متعادل شود. توالی‌های چندگانه ممکن است برای پوشش سویه‌های متغیر از گونه‌های یکسان مورد استفاده قرار گیرند. با این وجود، داشتن چنین کوکتل پرایمرهایی ممکن است منجر به تکثیر نهایی غیراختصاصی شود.

رویکردهای **Multiplexing** برای **LAMP** کمتر از **PCR** توسعه یافته‌است. تعداد بیشتر پرایمر به ازای هر هدف در **LAMP** احتمال برهم کنش پرایمر-پرایمر را افزایش می‌دهد. محصول روش **LAMP** یک مجموعه به هم پیوسته از منطقه هدف است که باعث ایجاد یک حالت نردبانی روی ژل می‌شود. بر خلاف**PCR** که یک باند واحد روی ژل تشکیل می‌شود. اگر چه این مسئله هنگام شناسایی اهداف واحد مشکلی ایجاد نمی‌کند، اما برنامه‌های **PCR**چندگانه سنتی(**end point**) که در آن هویت یک هدف توسط اندازه باند بر روی ژل تعیین می‌شود با **LAMP** امکان‌پذیر نیست.**Multiplexing** در **LAMP** با انتخاب یک منطقه هدف با توالی محدود و دستیابی به تجزیه قبل از اجرا بر روی ژل انجام می‌شود. به طوری که هر محصول با اندازه خاص خودش مشخص می‌شود.اگرچه این روش باعث پیچیدگی پروتکل و طراحی تجربی می‌شود. استفاده از **DNA** پلیمراز جابجاکننده رشته در **LAMP** همچنین مانع استفاده از پروب‌های هیدرولیزکننده، مثل پروب‌های **TaqMan**، که بر فعالیت اگزونوکلئازی ۵'-۳ 'پلیمراز **Taq** تکیه می‌کنند، شده‌است. یک روش جایگزین **real-time multiplexing** بر اساس فلوئورسانس خنک‌کننده گزارش شده‌است.

رنگ **Sybrgreen** برای مشاهده real-time **LAMP** اضافه می‌شود. با این حال، در تکثیر نهایی، تکثیرپرایمر- دیمر ممکن است به سیگنال مثبت کاذب کمک کند. بر خلاف آزمایش‌های **PCR** مبتنی بر رنگ **SYBR**®green، تجزیه و تحلیل منحنی ذوب جهت بررسی حضور پرایمر-دیمر در **LAMP** قابل انجام نیست.

## منابع

رده:تکنیک‌های ژن‌شناسی
رده:روش‌های شناسایی بیوشیمیایی
رده:زیست‌شناسی مولکولی
رده:ژنتیک
رده:همانندسازی
رده:تقویت‌کننده‌ها