Luziferasa

**Luziferasa** biolumineszentzia sortzen duten entzima oxidatzaileen klaserako termino generikoa da, eta normalean fotoproteina batetik bereizten da. Izena Raphaël Dubois-ek erabili zuen lehen aldiz, luziferina eta luziferasa hitzak asmatu zituen, substraturako eta entzimetarako, hurrenez hurren. Hitz biak latinezko *lucifer* hitzetik eratorritakoak dira, "argi-eramaile" esan nahi duena, hau da, "argia" (*lux*) eta "ekarri edo eraman" (*ferre*) latinezko hitzetatik eratorria.

Luziferasak luziferina oxidatzen duenean argia igortzen duen erreakzio kimiko bat sortzen da.  Sortzen den argia kolore desberdinak hartu ditzazke, urdinetik horira, organismoan dagoen luziferinaren motaren arabera.

Bioluminiszentzia organismo bizidun batzuetan gertatzen den erreakzio kimiko bat da, non animaliek haien argi propioa sortzen duten. Mekanismo hau erabiltzen duten bizudunak, adibidez, ipurtargiak (*Lampyridae familia*), marmoka bioluminiscenteak (*Pelagia noctiluca*) eta linterna arrainak (*Centrophryne spinulosa*) dira. Hortaz gain, onddo eta microorganismo batzuetan ere erabiltzen den prozesua da. Hainbat funtzio biologiko ditu. Animali batzuk haien harrapakinak erakartzeko erabiltzen dute, beste batzuk aldiz, haien defentsa dute helburu. Animalia bioluminiszente askok beren argia erabiltzen dute espezie bereko beste batzuekin komunikatzeko.

Gaitasun hau lortzeko gai diren organismoen inguruan azterketa ugari egon dira. Adibidez, bioteknologian ehunen bioirudiak ekoizteko aplikazioak bioluminiszentziaren bitartez egitea aztertu da, organismo bizidunen prozesuak ezagutzeko markatzaile gisa funtzionatuz. 

Luziferasak zelulen jarduera aztertzeko tresna gisa erabiltzen dira, argia sortzen dutelako erreakzio kimiko baten ondorioz, kanpoko argiztapenaren beharrik gabe. Sistema fluoreszenteek lagina argiztatu behar dute eta nahi ez diren seinaleak sortzen dituzte. Aldiz, sistema bioluminiszenteek seinale gehigarri gutxi sortzen dituzte, eta horregatik hauen erabilera egokiagoa izaten da, aldaketa txikiak argiago detektatzeko aukera ematen baitute. 

Ikerketan hiru luziferasen erabilera nabarmentzen da. Ipurtargiaren luziferasa oso erabilia da, seinale argi eta detektatzeko erraza delako. NanoLuc, itsas algetatik eratorria, txikiagoa eta egonkorragoa da. Renillako luziferasa, koelenterazina erabiltzen du eta argi urdina igortzen du, eta azterketa zelularrean oso erabilia da. Entzima horiek, batez ere, tamainan eta intentsitatean bereizten dira, eta ezaugarri horietan oinarrituta ikerketetaren arabera bat edo beste erabiltzen da.

## Egitura 
Luzifasaren egiturak zehazten du bioluminiszentzian igortzen den argiaren kolorea, hori luziferina inguratzen duten aminoazidoen mende baitago.

Aipatu bezala, hainbat luziferasa mota daude. Hortaz, ez dago kopuru zehatza mota guztietan aplikagarriena dena. 

Egitura primarioari erreparatuz, adibidez, ipurtargien luziferasak 550 aminoazido ditu. Beste organismoetan kopurua berdina ez izan arren, luziferasa guztiek egitura orokor berdina dute. 

Bigarren mailako egiturari dagokionez, proteina honek forma tridimentsional espezifikoa du eta bi zati nagusiz osatuta dago: N-terminala eta C-terminala. C-terminal zatia N-terminala baino handiagoa da, eta biak bi aldeen arteko mugimendua ahalbidetzen duen egitura finkorik gabeko eskualde batek lotzen ditu. Entzima bere substratuarekin elkartzen denean, N-terminal eta C-terminal eskualdeak elkarrengana hurbiltzen dira eta erdigune aktiboa osatzen dute, argia sortzen duen erreakzioa gertatzen den gunea.
thumb|**Luziferasaren 2. mailako egitura: alfa helizea eta beta xaflak (1.irudia)**
Adibidez, bakterioen luziferasan alfa helizeen eta beta xaflen kopuruak hauek dira **(1.irudia**) :

* N-terminala: 
** 7 alfa helize
** 7 beta xafla

* C-terminala:
** 13 alfa helize
** 17 beta xafla
thumb|**Luziferasaren 2. mailako egitura: terminalen bereizketa (2.irudia)**
N-terminal domeinuak bi xafla pilatuk eta muturra estaltzen duen upel batek osatzen duten egitura du. C-terminal domeinua N-terminalari lotuta dago bisagra malgu baten bidez, eta domeinuak banandu edo hurbiltzea ahalbidetzen du. Bi domeinu horien aurrez aurreko gainazaletako aminoazidoak bakterioen luzifasan ere kontserbatuta daude, eta horrek adierazten du zentro aktiboa bi domeinu horien artean sortzen den tartean dagoela. Hala ere, osagaien kantitateak berdinak ez izan arren, egitura oso antzekoa da mota guztietan. 

Luziferasaren egitura tertziarioa egitura globularra da, proteina guztia trinko tolesten da, unitate funtzional bakarra osatuz. Antolaketa horretan, bi zati nagusi bereizten dira, egitura sekundarioan aipatutakoak: N-terminala eta C-terminala **(2.irudia)**. Domeinuak elkartzerakoan gune aktiboa eratzen da. Gune aktiboa proteinaren erreakzio kimikoa gertatzen den gunea da. Luziferina argia sortzeko elkartzen eta oxidatzen den tokia da. Proteinaren bi domeinuen zatiek osatzen dute, eta domeinu horiek elkarrengana hurbiltzen dira erreakzioa modu eraginkorrean gertatzeko. Domeinuen posizio erlatiboa eta proteinaren forma trinkoa beharrezkoak dira luziferasaren funtzionamendua ongi gauzatzeko eta argia igortzeko. 

## Funtzioak 
Ipurtargietan luziferasak duen prozesua ezagunena izateaz gain, biolumniszentzia nola funtzionatzen duen ulertzeko adibide garbia da. Erreakzio hau oinarrizko hiru elementuekin hasten da: luziferasa, luziferina izeneko substratua eta luziferina aktibatzeko behar den energia ematen duen ATP molekula bat. Lehenik eta behin, luziferasak ATPa hausten du, AMP gera dadin. AMP hori luziferinarekin batzen da, eta luziferil adenilato bitartekaria osatzen dute. Honela, luziferina aktibatu egiten da.
thumb|**Luziferasaren erreakzioa               ( 3.irudia)**
Behin aktibatuta, luziferina oxigenoarekin erreakziona dezake. Beraz, une honetan O₂-a luziferil-adenilatoarekin elkartzen da oxiluziferina izeneko molekula desegonkor bat sortzen, bere egoera kitzikatuan. Molekula honek bere egoera normalera bueltatzeko, gehiegizko energia askatzen du fotoi gisa, hau da, argi ikusgai gisa. Honi dela eta, oxigenorik gabe erreakzioa ez da gertatzen, bioluminiszentzia oxidazio honen zuzenki menpekoa delako **(3.irudia)**. 

Luziferasaren erreakzio kimikoa ulertuz gero, interesgarria da prozesua ikupegi energetiko batetik aztertzea bioluminiszentziaren aldetik. Azaldu bezala, luziferina aktibatzean eta oxigenoarekin erreakzionatzean, oxiluziferina sortzen dute, barne energiaren kantitate handi bat askatzen duena. Energia hau ez da bat-batean eta modu desordenatuan askatzen.

Hain zuzen ere, energia oxiluziferinan kontzentratzen da eta molekula kitzikatuta geratzen da. Egoera kitzikatuan dauden molekulak bere egoera egonkorrera bueltatu nahi dute, eta horretarako gehiegizko energia askatzen dute, baina bero bihurtu beharrean, modu ordenatuan askatzen da, hau da, argi gisa.

Mekanismo honen beste alde interesgarri bat bere eraginkortasuna da. Hain zuzen ere, luziferasaren erreakzioa  energia sortzeko sistema natural eraginkorrenetako bat da. Argi-iturri gehienetan, bonbilla edo sugar batean esaterako, energia gehiena bero moduan galtzen da.Luziferasaren kasuan, guztiz kontrakoa gertatzen da: oso bero gutxi askatzen da, funtsezkoa dena argia sortzen duten organismoentzat, gehiegi kaltetu eta berotu gabe argia emititzeko aukera ematen baitie.
thumb|**Luziferasaren funtzioa intsektu batean (4.irudia)**
Luziferasaren funtzio ezagunena argia sortzea izan arren, entzima honek beste paper garrantzitsuak ere baditu bai naturan bai eremu zientifikoan. Organismo bioluminiszente ugarietan, luziferasak zelulen egoera metabolikoaren adierazle gisa ere jarduten du, zuzenean ATPren mende baitago. Horrek esan nahi du argiaren intentsitateak eskura dagoen energia-maila isla dezakeela, baita estres-baldintzak ere. Gainera, luziferasak komunikazio-prozesuetan parte hartzen du: ipurtargietan edo itsas arrainetan, sortzen dituzten distirek bikotea erakartzeko, mugimenduak koordinatzeko edo lurraldea markatzeko ere balio dute. Beste kasu batzuetan, sortutako argia babes-funtzioa dauka, harrapariak nahastea edo argi kontrako teknikaren bidez kamuflatzea ahalbidetzen baitu **(4.irudia)**. 

Ingurune naturaletik kanpo, luziferasak garrantzi handia du bioteknologian eta medikuntzan. Markagailu gisa erabiltzen da, emititzen duen argia oso kantitate txikietan ere detektatzen erraza delako, eta, horri esker, ea gene bat adierazi den ala ez azter daiteke, entzima batzuen aktibitatea neurtu edo farmako baten ekintza aztertu. Ikerketa medikoan ere tresna baliotsua da, adebidez, infekzioen progresioa jarraitzeko, tumore-zelulak eredu esperimentaletan aurkitzeko edo terapia genikoen arrakasta egiaztatzeko.

## Egitura eta funtzioaren arteko erlazioa 
alt=|thumb|218x218px|**Luziferasa egitura globularra, 2 domeinuak bereiziz  (5.irudia)**
Egitura eta funtzioari dagokionez, luziferasaren funtzioak erlazio zuzena du proteinaren egiturarekin. Horregatik, egiturari dagokionez, luziferasak erreakzioa gauzatu aurretik, bere 2 domeinuen arteko guneak tarte handi batez banatuta daude **(5.irudia)**. Domeinuak tamainan desberdinak izateaz gain, azalean aminoazido espezifiko batzuk dituzte funtzioarekin erlazio zuzena dutenak.

Proteinaren bi guneen harteko tarte zabalak erreakzioa gauzatzea eragozten duenez, luziferasaren 2 guneek konformazio aldaketa bat jasotzen dute. Konformazio aldaketa ematen den momentuan, 2 domeinuen arteko tartea irikia egotetik itxia egotera igarotzen da substratua bertan kokatzen den momentuan. Aurretik aipatutako aminoazido horien kokapen espezifikoari esker erreakzioa gauzatzen da gune aktiboan, hau da, luziferina kokatuko den gunea. Proteinaren monomeroek gune aktiboa bere osotasunean osatzea eragingo dute, 2 domeinuen aminoazido espezifiko horiek elkarren ondoan geratzean egituraren itxiera gauzatuko dutelako.

Aipatzekoa da Itxiera hori eragozten duten faktoreak ere badaudela. Hori saiesteko, Luziferasak jasotzen duen konformazio aldaketari esker inguruan dagoen 𝐻2𝑂-a erreakziotik kanpo geratu eta atp-a elektronikoki kitzikatutako produktua ez hidrolizatzea lortzen da. Horrela ingurune hidrofobiko bat lortuko du luziferasak. Hidrolizatuko balitz, erreakzioa ez zen gauzatuko, “***quenching”*** izeneko fenomenoa emango zen eta, hau da, energia luminikoaren galera.

Beste edozein proteinek bezala, Luziferasak mutazio bat jasotzen badu aldaketa nabarmenak izan ditzake bere egituran. Ikerketa munduan Ikusi da S286N mutazio bat barne hartzen duen luziferasa konplexuaren egiturak hain zurruna eta hidrofobikoa ez den forma irekiko komplexu bat sortzen duela. Horregatik, luziferasak bere geometriaren arabera funtzioa modu batean edo bestean gauzatuko du, kasu honetan argi emesio ahulago bat emanez.
thumb|270x270px|**Luziferasaren fotoi emisioa egoera desberdinen aurrean (6.irudia)**
Mutazioen moduan, temperaturak eta pH-ak erlazio zuzena dute luziferasa entzimaren funtzioan; bere egitura tridimentsiolaren eta bere geometriaren menpe dago eta. PH-ari dagokionez, pH-arekiko sentikorrak diren luziferasek, proteinak egitura malguagoa dute. Malgutasun horri esker, ph-a aldatzen denean, aldaketak eman daitezke gune aktiboan: pH neutro alkalinoan, bere bigarren mailako egituraren parte diren α-helize edukia eta egonkortasun termikoa handitzen dira, gune aktiboa egonkortuz. Horri esker kolore berde-horia trasmititzen dute, 550-560 nm-koa. Aldiz estres egoera batean aurkitzen direnean, bai ingurunea azidotu edo temperatura aldaketa bat eman delako, luziferasa entzimaren egitura malguagoa bihurtzeaz gain, kolore gorria trasmititzen du.  Argi kolorearen aldaketa energia galera baten ondorioz ematen da, fotoia trasmititu aurretik. **(6. irudia)**

Luziferasak Egituran aldaketak izatea oso interesgarria da gaur egun bioteknologian dituen aplikazio ezberdinak gauzatzeko. Inguruneko baldintzen aurrean konformazio aldaketak jasotzen dituenez, argi emesio desberdinak ematen ditu. Horri esker, luziferasa lagin zelular batean hainbat elementu ezberdin aztertzeko erabiltzen da. Luziferasa eraldatu edo ez eraldatu bakoitzak uhin luzera ezberdin bat sortuko duenez, seinale indibidualak desberdindu daitezke. Nature communications-en adierazten den moduan, *“Luziferasan oinarritutako erreportarien sistemetarako multiplex gaitasunak aztertzea erabaki genuen. Hemen luzifasa multiplexatuaren erreportari saiakerari buruzko informazioa ematen dugu, esperimentu beraren barruan sei parametro neurtzeko gai dena, luzifasa hexagonal multiplex saiakuntza deritzona”*. Sortuko diren koloreak deberdinak izateari esker, teknika hori oso baliagarria da egiturak desberdintzea lortzeko. Gainera, substratu espezifikoen aurrean argia sortzeko duen gaitasunari esker geneen adierazpena, zelulen prozesuak eta sendagaien eraginkortasuna aztertzea ahalbidetzen du.

Bestetik, aipatutako 2 domeinuko egitura dela eta, proteina 2 zati inaktiboetan banatu daiteke. Teknika horri esker, zati bakoitza elkarren artean eragiten diren 2 proteinekin batu daiteke, egitura birsortuz. Prozesu honetan argia lortzeari esker, organismo bizidunen barneko proteinen arteko interakzioak aztertu daitezke.

## Erreferentziak 
## Kanpo estekak