CRISPR gene-edizio

thumb|CRISPR-Cas9 sistema
**CRISPR gene-edizioa** (CRISPR, ingelesetik *"**C**lustered **R**egularly **I**nterspaced **S**hort **P**alindromic **R**epeats",* erregularki taldekatutako eta interespaziatutako sekuentzia palindromiko errepikakor laburrak) biologia molekularrean erabiltzen den ingeniaritza genetikoko teknika bat da, zeinaren bidez izaki bizidunen genomak alda daitezkeen. Bakterioen CRISPR-Cas9 oinarritzen da defentsa-sistema antibiralaren bertsio sinplifikatuan. Cas9 nukleasa RNA gidari (gRNA) sintetiko batekin elkartzean sortutako konplexua zelula batean barneratzean, zelularen genoma moztu egin daiteke desiratutako lekuan, eta horrela posible egin dagoeneko existitzen diren geneak *in vivo* kentzea edota gene berriak txertatzea. 

Guraize genetiko gisa lan eginez, Cas9 nukleasak DNAren itu-sekuentziaren bi harizpiak irekitzen ditu aldaketa sartzeko. *Knock-in* mutazioak egitea da, homologian oinarritutako konponketaren bidez (HDR), edizio genomikoan erabilitako bide tradizionala. Cas9 nukleasaren aldaera berriak garatu dira, *off-target* (ituz kanpoko) jarduera nabarmen murrizten dutenak.

CRISPR teknika oso garrantzitsua da bioteknologian eta medikuntzan, genomak *in vivo* modu oso zehatz, merke eta errazean editatzeko ematen baitu aukera. Erabil daiteke sendagai, nekazaritza-produktu eta genetikoki eraldatutako organismo berriak sortzeko, edo patogenoak eta izurriteak kontrolatzeko baliabide gisa. Gaixotasun genetiko hereditarioen tratamenduan ere erabili izan da, baita mutazio somatikoetatik eratorritako gaixotasunetan ere, minbizia kasu. Hala ere, kezka bioetiko asko azaldu dira CRISPR teknika lerro germinalen ediziorako erabiltzeko aukeraren inguruan, bereziki giza enbrioietan. Teknikaren garapenari esker, Jennifer Doudnak eta  Emmanuelle Charpentierrek Kimikako Nobel saria jaso zuten 2020an.

## Ingeniaritza genomikoa 
### Cas proteinen sailkapena 
Gaur egun, CRISPR sistemak 6 mota dituzten bi klase handitan banatzen dira: 1. Klasea (I, III eta IV motak) eta 2. Klasea (II, V eta VI motak). I. motako sistema da bakterioetan gehien hedatuta dagoena, eta crRNAri lotuz konplexu multiproteiko bat eratuta bereizten dena, “babes antibiraleko CRISPRari lotutako konplexu” edo “Cascade” izenez ezaguna. Konplexu horrek DNA sekuentzia inbaditzaileak ezagutzen ditu eta Cas3 nukleasa bat erreklutatzen du dagokion mozketa egiteko. III. motako sistemak interferentziarako multi-Cas-proteina konplexuak (Csm) erabiltzen ditu. II. motako sisteman, Cas9 nukleasak tracrRNAren beharra du crRNArekin osatzeko eta, heltzean, itu-DNAren hiru nukleotidoren PAM sekuentzia ezagutzen du. V sisteman, Cas12 da proteina efektore bereizgarria. II. motako sistemetan bezala, V sistemen azpimota batzuek tracrRNA behar dute crRNAren heltzerako eta interferentziarako. Azkenik, VI. motako sistemak Cas13 proteina erabiltzen du, itu-RNArekin lotzean aktibatzen den RNAsa bat, itu-RNA zein alboko RNA degradatzen dituena. PAM gune bat ezagutzen duten beste Cas proteinek ez bezala, Cas13-k RNA inbaditzailean protobanatzailearen (PFS) alboko gune bat ezagutzen du.

II. motako sistema da organismoen genomak editatzeko tresna molekular gisa gehien erabiltzen dena. Sistema horrek Cas9 nukleasa du, crRNAk gidatuta DNAn kate bikoitzeko ebakiak sortzen dituen entzima. Plasmido honen osagai nagusiak taulan zerrendatu dira. crRNA aplikazio bakoitzerako modu espezifikoan diseinatzen da, hori baita Cas9-k zelula ostalariaren DNAren sekuentzia espezifikoak identifikatzeko eta horiei batzeko erabiltzen duen sekuentzia. crRNA soilik batu behar da editatu nahi diren sekuentzietan. Konponketa-txantiloia ere aplikazio bakoitzerako espezifikoki diseinatuta dago; izan ere, nolabaiteko osagarritasuna izan behar du ebaketaren alde bakoitzeko DNA sekuentziekin. Gainera, ostalariaren genoman txertatu nahi den edozein sekuentzia eduki behar du bere baitan.

crRNA eta tracrRNA asko paketatu daitezke “single-guide” RNA (sgRNA) bakarra sortzeko. sgRNA hori Cas9 proteina kodetzen duen genearekin batera sar daiteke eta plasmidoan txertatua izan, zeluletan transfektatua izateko. Tresna online asko eskuragarri daude sgRNA sekuentzia eraginkorrak diseinatzen laguntzeko.thumb|CRISPR-Cas9 plasmidoaren eraikuntzaren ikuspegi orokorra
##### Egitura 
CRISPR-Cas9-k fideltasun maila handia eta eraikuntza nahiko sinplea eskaintzen ditu. Bi faktoreren menpe dago bere espezifikotasunerako: itu-sekuentzia eta ondoko motibo protobanatzailearen (PAM) sekuentzia. Itu-sekuentziak 20 baseko luzera du CRISPR locus bakoitzaren zati gisa.

PAM sekuentzia ostalariaren genoman Cas9-ren bidez ezagutzen da. Cas9 ezin da erraz aldatu PAM sekuentzia desberdin bat ezagutzeko. Dena den, hori azken finean ez da mugatzaileegia, normalean genoman zehar leku askotan gertatzen den sekuentzia oso laburra eta inespezifikoa izaten baita.

DNA ostalarian behar bezala tartekatutako haustura monokatenarioek homologiak zuzendutako konponketa eragin dezakete, haustura bikatenario baten ondoren gertatzen den mutur ez-homologoen elkarketak baino akats gutxiago egiteko joera duena.

## Metodoak 
### *Knock-out* baten eraketa 
Gene edo eskualde genomiko baten funtzioaren ezabapena mutazioak sortzean edo sekuentzia interesgarriak mugitzean lortzen da, Cas9 edo Cas12 nukleasa eta sgRNA bat erabiliz, azken honek nukleasa ebaketa-gune zehatz baterantz gidatu duela. Ebaketaren konponketa organismoaren gaitasunaren araberakoa izango da; hala ere, konponketa-prozesuan mutazioak edo delezioak sar daitezke eta, ondorioz, funtzioa galdu eta *knockout* (Ko) bat sortu. Mutazio-mota horren bidez, funtzioren bat duten eskualde kodifikatzaileen eta eskualde ez-kodifikatzaileen funtzioa identifika daiteke. DNA-sekuentzia espezifikoak aldatzeko duen gaitasunak bihurtzen du gaixotasuna eragiten duten mutazioak zuzentzeko ahalmena duen tresna. Animalia-ereduetan egindako aurretiazko ikerketak iradokitzen du CRISPR teknologian oinarritutako terapiek gaixotasun mota ugari tratatzeko ahalmena dutela, barne direla minbizia, progeria, beta-talasemia, anemia faltziformea, hemofilia, fibrosi kistikoa, Duchenneren distrofia muskularra, Huntingtonen gaixotasuna, amiloidosi transtinikoa eta bihotzeko gaixotasuna. Eltxoetan malaria sendatzeko ere erabili izan da CRISPR, eta horrek bektorea eta gaixotasuna desagerraraz litzake gizakiengan. CRISPRek ehun-ingeniaritzan eta birsortze-medikuntzan ere izan ditzake aplikazioak; adibidez, II. motako MHC proteinen adierazpenik ez duten giza odol-hodiak sortzeko, askotan uko egiten baitiote transplanteari.

Gainera, CRISPR-Cas9 teknologia erabiliz giza pazienteetan beta-talasemia eta anemia faltziformea sendatzeko egin diren saiakuntza klinikoek etorkizun handiko emaitzak erakutsi dituzte. 

Hala ere, oraindik ere muga batzuk daude terapia genikoan teknologiaren erabileran: efektuaren maiztasun erlatiboki altua helburutik kanpo, PAM sekuentzia baten eskakizuna itu-gunetik gertu, CRISPRek eragindako kate bikoitzeko hausturengatik p53 bitarteko apoptosia eta birusek eragindako ohiko askapen sistemaren ondoriozko toxikotasun immunogenikoa.

##### Minbizia 
CRISPRek aplikazio asko aurkitu ditu zeluletan oinarritutako immunoterapien garapenean ere. CRISPR bidezko lehen entsegu klinikoa 2016an hasi zen. Hartan biriketako minbizia zuten pertsonen immunitate-zelulak hartu ziren, CRISPR erabiliz adierazitako PD-1 genea editatzeko, eta, ondoren, alteratutako zelulak berriro pertsona berari emateko. Beste 20 entsegu bidean edo ia prest zeuden, batez ere Txinan, 2017tik aurrera.

2022ko abenduan, Great Ormond Street Ospitaleko medikuek 13 urteko neskato britainiar bat sendatu zuten, T zelulen leuzemia linfoblastiko akutua diagnostikatu ziotenean. Gene terapeutikoak editatzeko lehen erabilera dokumentatua izan zen, eta sei hilabetez tratamendu esperimental bat egin ondoren, porrot egin zuten beste tratamendu batzuen aurreko saiakerek. Prozedura izan zen T zelula osasuntsu bat birprogramatzea, minbizidun T zelulak suntsitzeko, lehenengo leuzemiatik libratzeko, eta, ondoren, bere sistema immunologikoa zerotik berreraikitzeko zelula immune osasuntsuak erabiliz. Taldeak BASE edizioa erabili zuen, eta aurretik leuzemia linfoblastiko akutuko kasu bat tratatu zuen 2015ean, TALENak erabiliz.

##### Diabetesa 
1. motako diabetesa nahasmendu endokrinoa da, eta intsulina sortzeko beta zelula pankreatikorik ez izatearen ondorio da. Intsulina ezinbesteko konposatua da odolean dagoen azukrea zeluletara garraiatzean energia sortzeko. Beta zelula osasuntsuak transplantatzeko ahaleginetan aritu dira ikertzaileak. Zelulak editatzeko erabiltzen da CRISPR, pazientearen gorputzak transplantea errefusatzeko aukera murrizteko.

2021eko azaroaren 17an, CRISPR terapeutikak eta Cyte agentziak iragarri zuten Kanadako agentzia medikoak VCTX210-erako saiakuntza kliniko bat egiteko eskaera onartu zuela. Zelula amen terapia bat da VCTX210, CRISPR erakundeak editatua eta 1.motako diabetesa tratatzeko diseinatua. Esanguratsua izan zen hori, kliniketara heldu zen gene-edizioan oinarritutako diabetesarentzako lehen terapia izan zelako. Konpainia horiek 1. motako diabetesa tratatzeko tratamendu berri bat ere garatu zuten, intsulina ekoiztea lortu zuena CRIPSR teknikaren bitartez genetikoki editatutako zelula ametatik eratorritako milioika zelula pankreatiko erabiltzen dituen inplante mediko txiki baten bidez.

2022ko otsailean, 1. faseko saiakuntza bat egin zen, eta paziente boluntario batek tratamendua jaso zuen.

##### IHESa 
Giza immunoeskasiaren birusa edo GIBa gorputzeko immunitate-sistemari erasotzen dion birusa da. Badira tratamendu eraginkorrak pazienteei bizitza osasuntsua izatea ahalbidetu diezaieketenak, baina GIBa atzeraeraginezkoa da, eta horrek esan nahi du bere buruaren bertsio ez-aktibo bat txertatzen duela giza genoman. CRISPR erabil daiteke birusa genomatik selektiboki ezabatzeko, GIBaren atzeraeraginezko genomari zuzendutako RNA gidaren diseinuaren bidez. Ikuspegi horrek duen arazoetako bat da GIBaren genoma ia zelula guztietatik kendu behar dela, eta hori lortzea zaila izan daiteke modu errealistan. 2022an hasi ziren gizakietan CRISPR-Cas9 terapian oinarritutako EBT-101 entsegu klinikoak. 2023ko urrian, ETB-101-eko 3 pertsonatan egindako hasierako faseko ikerketa batek iragarri zuen tratamenduak segurua zirudiela eta ez zuela albo-ondorio garrantzitsurik, baina ez zen haren eraginkortasunari buruzko daturik eman.

## Erreferentziak 
## Kanpo estekak