CRISPR

thumb|CRISPR / Cas konplexua (urdinez) *E. coli*ren DNA itura (laranjaz) lotuta.
thumb|CRISPR-Cas9, geneak mozteko guraizeak. Teknopoliseko bideoa.
**CRISPR**ak (ingelesez *Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats*, euskaraz **Errepikapen Palindromiko Laburrak, Multzokatuak eta Tarteka Bateratuak**) bakterioen DNA-sekuentzien familiak dira. Bakterioei eraso egin dieten birusen DNA zatiak dituzte sekuentzia horiek. Bakterioek antzeko birusen eraso berrietan DNA detektatu eta suntsitzeko erabiltzen dituzte zati horiek eta, hala, haietatik eraginkortasunez defendatzeko. Sekuentzia horiek giltzarri dira bakterioak babesteko sistemetan, eta CRISPR / Cas9 teknologia ezagunean erabiltzen dira. Teknologia horrek eraginkortasunez eta espezifikotasunez aldatzen ditu geneak organismoen barruan. Termino teknikoagoetan, CRISPR sekuentziak base-sekuentzien errepikapen laburrak dituzten DNA-locusak dira. Errepikapen bakoitzaren ondoren, DNA espaziatzailearen segmentu motzak daude, birus baten pean egotearen ondorioz eratorri direnak. Bakterio-genomen % 40tan eta arkeetako genoma sekuentziatuen % 90etan daude gutxi gorabehera. Sarritan, espaziatzailearen segmentuak CRISPRekin lotutako proteina nukleasetarako kodetzen duten cas geneekin lotuta egoten dira. CRISPR/Cas prokariotoen immunitate-sistema da, zeinak kanpoko eragileen aurreko erresistentzia ematen dien, hala nola plasmido eta fagoen aurrekoa eta, horrela, hartutako immunitate mota bat sortzen duen. CRISPRen espaziatzaileek sekuentzia espezifikoak ezagutzen dituzte, eta nukleasak elementu geniko exogenoak moztera eta degradatzera gidatzen dituzte, sistema eukariotikoetako iRNA-aren analogo gisa jokatuz. Zelula bati Cas9 proteina eta RNA gidari egokiak txertatuz gero, genoma nahi den lekuetan ebaki daiteke, eta haren sekuentziak erabilitako gidarien osagarriak izango dira. Horri esker, geneak funtzionalki ezaba daitezke edo mutazioak sar dakizkieke, DNA konpontzeko zelularen makineriak egindako ebaketa konpondu ondoren, haien ondorioak aztertzeko. CRISPR/Cas9 sistemaren azken aldaketei esker, geneen transkripzioari ere eragin dakioke; horrela, geneen funtzionamendu-maila aldatzen da, baina ez informazio genetikoa.

## Mekanismoa 
### Espaziatzaileen eskuratzea CRISPR *loci*en barruan 
Erantzun immunearen lehen etapa DNA inbaditzailea harrapatu eta espaziatzaile gisa CRISPR *locus* batean sartzea da. Cas1 eta Cas2 proteinen prebalentziak espaziatzaileak eskuratzeko erabiltzen direla agerian utzi zuen, CRISPR guztiek egitura errepikakor erregularra partekatzen baitute. Mutazio-azterketek hipotesi hori berretsi dute; izan ere, Cas1 edo Cas2 proteinak kentzeak espaziatzaileak eskuratzea eragozten du, CRISPR erantzun immunea bera ukitu gabe. Datu funtzionalek eta mutazio genetikoaren azterketek Cas1 eta Cas2 proteinek DNA inbaditzailearen zatiak ebaki eta CRISPR moldaketetan txertatzen dituztela iradokitzen dute.
thumb|500x500px|CRISPen mekanismo posiblearen diagrama.
Espaziatzaile (protoespaziatzaile) gisa ebakitako fago-genomen eskualdeen analisi bioinformatikoak erakutsi du horiek ez daudela ausaz banatuta, baizik eta DNA-sekuentzia laburren (PAM edo *Protospacer Adjacent Motifs* sekuentzien) ondoan. Hiru dibisio handietako CRISPR-Cas sistemen azterketak erakutsi du PAM sekuentziak I. eta II. motako sistemetarako garrantzitsuak direla, baina ez III. sistemarako, espaziatzaileen eskuratze-prozesurako.

Espazializatzaile berriak CRISPR moldaketa bati gehitzen zaizkio, norabide batean, nagusiki baina ez esklusiboki sekuentzia liderraren ondoan. *E. coli*ren I-E motako sistemaren analisiak erakutsi du lehen errepikapen zuzena, sekuentzia liderraren ondoan dagoena, kopiatu egiten dela eta berriki lortutako espaziatzailea lehenengo eta bigarren errepikapen zuzenen artean sartzen dela. Badirudi PAM sekuentzia ere garrantzitsua dela I-E motako sistemen espaziatzaileak txertatzeko. I-E sistemaren PAM sekuentziak sendo kontserbatutako amaierako nukleotido bat du protoespaziatzailearen lehen nukleotidoaren ondoan, eta nukleotido hori lehenengo errepikapen zuzenean azken oinarri bihurtzen dela erakutsi da. Horrek aditzera ematen du espaziatzaileak eskuratzeko makineriak kate bakuneko *overhang*ak sortzen dituela, espaziatzailea errepikapen zuzenaren azkenaurreko posizioan eta PAMean txertatzen denean. Hala ere, badirudi CRISPR-Cas sistema guztiek ez dutela mekanismo hori, beste organismo batzuetan karakterizatutako PAMek ez baitute kontserbazio-maila bera azken posizioan.

### Interferentzia-etapa 
thumb|538x538px|CRISPRen hartutako immunitatearen etapak.
CRISPR bidezko erantzun immunea bi etapatan gertatzen da: CRISPR-RNA-ren biogenesia (RNAcr) eta RNAcr-ek gidatutako interferentzia. CRISPRen moldaketa bat transkribakin luze bakar batean transkribatzen da. Transkripto hori errepikatutako sekuentzien barruko ebakien bidez prozesatzen da RNAcr osatzeko. RNA helduak ekoizteko mekanismoak nabariki aldatzen dira CRISPR-Cas-en hiru sistema nagusien artean. Bai I-E motako sistemetan, bai I-F motako sistemetan, hurrenez hurren Cas6e eta Cas6f proteinek zuzeneko errepikapenen izaera palindromikoak sortutako giroak ezagutzen dituzte. Proteina horiek kate bakuneko eta bikoitzeko RNAen arteko loturan ebakitzen dute transkripto primarioa, eta 8 nukleotidoko 5’ mutur bat uzten dute. III. motako sistemek ere Cas6 proteina erabiltzen dute; hala ere, haien errepikapenek ez dute *girosstem-loop*ik eragiten. Horren ordez, transkripto primarioa Cas6-an kiribilduz zatitzen da, errepikapen-sekuentziaren aurretik banatzeko. II. motako sistemek ez dute Cas6 genea; beraz, RNAsaIII erabiltzen dute ebakiak egiteko. II. motako sistema funtzionalek RNA gehigarri txiki bat kodetzen dute, RNA transaktibatzaile (tracrRNA) deritzona eta errepikapenen sekuentziaren osagarri dena.

RNAcr-ak Cas proteinekin lotzen dira, azido nukleiko arrotzak ezagutzen dituzten erribonukleotidoen konplexuak eratzeko. Fagoekin eta plasmidoekin egindako esperimentuek agerian utzi dute RNAcr-ek ez dutela ez kate kodetzailea ez eta kate ez-kodetzailea lehenesten, eta horrek RNAk gidatutako DNArako berariazko sistema bat dagoela uzten du agerian. I-E motako konplexuak (multzo modura Cascade deritzenak) bost Cas proteina behar ditu, itsasoko zaldi bat gogorarazten duen konfigurazio batean moldatuak, "bizkarrean" zehar lotuta dagoen kate bakuneko RNAcr-ari lotuak. I. motako sistemen interferentzia-etapan, PAM sekuentzia RNAcr-ren kate osagarrian ezagutzen da, eta RNAcr-aren parekaketarekin batera behar da. I. motako sistemetan, RNAcr-a eta protoespaziadoreak behar bezala parekatzeak konformazio-aldaketa bat seinaleztatzen du Cascaden, DNA degradatzeko Cas3 proteina biltzen duena.

II. motako sistemek funtzio anitzeko proteina bat erabiltzen dute, Cas9-a, interferentzia-etaparako. Mota bakoitzaren heltze-prozesu bereizgarrian zehar ere, RNAcr guztiek sekuentzia espaziatzailea eta errepikapenaren zati bat dituzte mutur batean edo bietan. Errepikapenen sekuentzia partzialak eragozten du CRISPR-Cas sistemak kromosomari eraso egitea; izan ere, espaziatzailearen sekuentziatik haragoko baseak parekatzeak propioa dela erakusten du, eta kromosoman DNA ebakitzea eragozten du. V motako murrizketa-entzima gisa sailkatzen dira RNAk gidatutako CRISPR entzimak.

## Eboluzioa 
*Streptococcus thermophilus*en egindako azterketek erakutsi dute nola bultzatzen dituzten CRISPR sistemek fagoak eta bakterioak eboluziorantz. CRISPR espaziatzaileak guztiz bat etorri behar dira fagoaren itu-genearen sekuentziarekin. Fagoek ostalariak infektatzen jarrai dezakete espaziatzailean mutazio puntualak daudenean.

CRISPRen aniztasuna hainbat ingurumen-komunitatetan aztertu da metagenomika erabiliz. Bi meatzeren drainatze azidoen biofilmen azterketak erakutsi du aztertutako CRISPRetako batek delezio eta espaziatzaile estentsiboak dituela beste biofilmarekin alderatuta, eta horrek erakusten du komunitate batean fago-jarduera handiagoa dagoela beste batean baino. CRISPR gehienak leku jakin batean espezifikoak dira, eta CRISPR batzuk oso erraz aurkitzen dira pertsonen artean. CRISPR *locus* horietako bat Streptococcus generoko espezieei buruzko ikerketetan sortu da, eta 15,000 espaziatzaile inguru izan dituzte, horietatik % 50 bakarrak. Aho-barrunbean egindako azterketetan bezala, CRISPRetako batzuek bilakaera txikia izan dute denboran zehar. Denbora-tarte berean, fagoak zenbait SNP garatu ditu, populazioan finko geratu direnak. Horrek iradokitzen du CRISPRek mutazio horiek ez dituzten beste fago guztien erreplikazioa eragotzi duela. Kimiostato bidezko azterketek eta CRISPRen behaketek ondorio asko ekartzen dituzte CRISPR eta fagoen eboluzioaren emaitzara.

## Funtzioak 
### Edizioa 
CRISPR mekanismoak base-pareak gehitu eta ezaba ditzake oso espezifikoak diren DNA-*locus*etan. CRISPR mekanismoa erabiliz posible izan da bost gene baino gehiago moztea aldi berean.

### *Knockout* itzulgarria 
iCRISPRak iRNAen analogoak dira eta geneak modu itzulgarrian desaktibatzeko gaitasuna dute, mozketarik egiten ez dutenez sekuentziekiko espezifikoak izan arren. Bakterioetan, iCRISPRak lotzea nahikoa da geneak isilarazteko, baina ugaztunetan, proteina-sail bat gehitu behar zaio iCRISPRari transkripzioa geldiarazi nahi bada. PICI sistema aktibatzen duten mekanismoak eta fagoaren erreplikazioa inhibitzen duten mekanismoak ez dira orain arte ulertu. Ikerketa baten arabera, ICP1 fago litikoak *Vibrio cholerae*ren PICI motako elementu bat itu duen CRISPR/Cas sistema bat garatu du. ICP1 fago litikoak espezifikoki *V. cholerae*ren 01 serotipoa erasotzen du. Sistemak bi CRISPR *locus* eta 9 Cas gene ditu. Badirudi *Yersinis pestis*en aurkituriko 1-F sistemaren homologoa dela. Gainera, bakterioetan gertatzen den bezala, ICP1 CRISPR/Cas sistemak sekuentzia berriak eskuratzeko ahalmena du, eta horrek aukera ematen dio fagoari ostalariarekin batera eboluzionatzeko.

## Aplikazioak 
2012an CRISPR/Cas sistemaren berbideratze espezifikoaren printzipioa frogatu zen eta, ordutik aurrera, CRISPR eratorriak bioteknologian aplikatzeko proposamenak hasi ziren:

* Garrantzi industriala duten bakterioetan CRISPR *locus*a txertatuz lorturiko fagoen aurkako immunizazio artifiziala, elikagaien ekoizpenean eta hartziduran erabilitako bakterio-espezie anitzetan.

* Zelula edo organismo mailako ingeniaritza genetikoa: CRISPR/Cas sistema baten programazioaren bidez RNAk zuzendutako genomaren edizioa. Metodoaren arrakasta frogatu da *in vitro* ikerketetan.

* Bakterio-anduien bereziketa sekuentzia espaziatzaileen alderaketaren bidez.

### Terapiak 
Editas Medicine izeneko 43 milioi dolarreko *start up* estatu batuarrak CRISPR/Cas sistema erabiltzen duten tratamenduak garatu nahi ditu, base-pare espezifikoetatik hasita DNA-segmentu handiagoetan ere edizioak egiteko. Zenbait gaixotasun, hala nola fibrosi kistikoa eta anemia, base-pare bakar baten mutazioak eragiten ditu. CRISPR/Cas teknologiak mutazio horiek zuzentzeko gaitasuna du. Zuzendutako geneak kromosoman izan ohi duen lekua hartzen du, eta baldintza normaletan zelulak eragingo liokeen aktibazio edo inhibizio maila mantentzen du.

Pazienteen hezur-muineko hemozitoblastoak kultibatu ostean, CRISPR bidezko kirurgia genetikoak gene akastuna zuzendu lezake printzipioz. Zuzenduz gero, zelulak pazientearen muinera birsartuko lirateke eta, hortik aurrera, zelula osasuntsuak ekoitziko lituzke organismoak. Zelula akastunen % 70 ordezkatzearekin sendagaia lortuko litzateke. Erabilera klinikoaren aurretik, edizioak helburu den eskualdeari bakarrik eragingo diola bermatu behar du konpainiak, eta pazienteei emango zaien terapiaren nondik norakoak argitu behar ditu. 2014.urtean, UCSFko ikertzaile talde batek CRISPRak erabili zituen beta-talasemia duten pazienteen ama-zelula osasuntsuak sortzeko. 2020ko ekainean, CRISPR Therapeutics enpresak beta-talasemia zuten bost gaixo eta anemia faltziformea zuten bi gaixo CTX001ekin arrakastaz tratatu zirela jakinarazi zuen. CTX001 Vertex Pharmaceuticals eta CRISPR Therapeutics enpresek aztertzen duten garapen-terapia bat da. Bigarren konpainiak emandako berrian honakoak aipatu ziren: alde batetik, beta-talasemia pairatzen zuten bi pazienteak transfusioekiko independente bihurtu zirela hemoglobina fetalaren genearen (HbF) adierazpena inhibitzen zuen genearen ediziotik 5 eta 15 hilabete ostean; eta bestetik, anemia faltziformea pairatzen zuen paziente bat gaixotasunaren krisi baskooklusibotik libre geratu zela CTX001-en ediziotik 9 hilabetera.

CRISPRarekin trata daitezkeen beste patologia batzuk ere badira: Huntington gaixotasuna, zahartzaroaren ondorioak, eskizofrenia, autismoa eta enbrioi bizietako DNA-aldaketa.

CRISPR teknika medikuntzan erabili aurretik beharrezkoa da zuzentze-sistema hobetzea. Gaur existitzen diren RNA gidariek lan egin dezakete helmugako sekuentziatik base batzuetan ezberdinak diren sekuentzietan.

### Entomologia 
Zelula diploide eukariotikoetan egiten diren funtzio-galeraren analisi gehienak siRNA bidez egiten dira. Azken urteotan, ordea, garrantzi handia hartu du Cas9 proteinari lotutako CRISPR teknologiak. CRISPR sistemak eraginkortasun handiz identifikatzen ditu farmakoen erresitentziari, tumorigenesiari, erantzun immuneari, patogenoekiko interakzioari eta minbiziaren immunoterapiari dagozkien geneak. Horren adibide da *Bombyx mori*n egindako ikerketa, zeinetan zelula-bideragarritasunari, hazkundeari, ostalari-patogeno interakzioei eta tenperaturarekiko erresistentziari loturiko geneak identifikatu zituzten, eta 6000 gene ezberdin karakterizatu.

### Eskualde genomiko ez-kodetzaileetako elementu funtzionalen identifikazioa 
Markatzaile molekularrak, hala nola egoera epigenetikoa, kromatinarako eskuragarritasuna, transkripzio-faktoreen arteko lotura eta kontserbazio ebolutiboa, korrelazioan daude genoma ez-kodetzaileko elementu funtzional putatiboekin, eta haien funtzio erregulatzailea aurresan dezakete. Dena den, iragarpen horiek ezaugarririk ez duen eskualde kopurua gainditzen dute neurri handi batean, eta zaila da fenotipoan edo funtzioan duten eragina benetakoa edo ausazkoa den jakitea.

Kausalitatea egiaztatzeko ahaleginak aurrehautatutako DNA zatiak erabiltzean oinarritu dira, eta euren adierazpenean funtzioan baino. Dena den, metodo horiei lekuko kromatinaren eta interakzio erregulatzaile zabalagoen testuingurua falta zaie. Hortaz, ikuspegi sistematikoak behar dira aldagai ez-kodetzaileak bahetzeko eta jatorrizko testuinguru biologiko batean fenotipoei eragiten dieten egiaztatzeko. Horretarako, CRISPR-Cas9-an RNA gidarien liburutegi bat erabiltzen zuen etekin altuko metodo bat diseinatu zen, fenotipoarekin eta geneen erregulaziorekin loturiko eskualde funtzionalak indentifikatzeko locus ez-kodifikatzaileen artean. Genoma osoko beste saiakuntza batzuekin konbinatuta, kromatinaren eta transkripzio-faktoreen testuinguru-aldaketak gene-adierazpenari eta gaixotasunaren fenotipo nabarmen bati kausalki lotuta daudela egiaztatzeko teknikak duen etekin altua frogatu da.

Teknika horren adibide gisa lokalizazio genomiko ez-kodetzaileak hautematea dugu, medikamentuekiko erresistentzia modulatzen baitute:

Vemurafenibek mutazioaren eramaile diren B-Raf proteinak inhibitzen ditu (balinaren ordez glutamatoa erabiltzen da 600.posizioan), melanomen % 50-70etan agertzen baitira. Vemurafenibaren aurkako erresistentzia hilabete gutxiren buruan sortzen da melanoma duten ia paziente guztietan, eta bizirauten duten tumore-zelulak are gehiago gaiztotzen dira. Horren ondorioz, minbizia hilgarria izatera iristen da. Genoma-eskalako CRISPR-baheketa batean ikusi zenez, NF1, NF2 eta CUL3 geneen funtzio-galera eragiten duten mutazioek vemurafenibekiko erresistentzia sortzen dute. Gene horien inguruko eskualde ez-kodifikatzaileetako mutazioek modu berean farmakoarekiko erresistentzia eragin ote zezaketen ikusteko hiru sgRNA liburutegi erabili ziren. Liburutegi horiek gene bakoitzaren isoformetako 5’ eta 3’ eskualdeetako 100 kb inguru mapeatuak zituzten. CLU3 geneko 5’ inguruko eskualde ez-kodetzaileko mutazioek lekuko ingurune epigenetikoak eta transkripzio-faktore ezberdinen interakzioak aldatzen dituztela ondorioztatu zen. Transkripzio-faktore horiek *ying yang 1* (YY1), *zinc finger protein 263* (ZNF263), *CCCTC-binding factor* (CTCF) eta Jun:Fos-ek eratutako *activation-protein 1* (AP-1) dira, besteak beste. Eskualde ez-kodetzaile horiek garrantzi handia dute geneen erregulazioan eta erresistentzia kimioterapeutiko eta farmakologikoan.

### Giza ugalketa 
CRISPR teknikak eta gene-edizioak potentzial handia izan lezakete giza ugalketaren teknologiaren arloan. Adibidez, indibiduoaren bizitza arriskuan jar dezaketen mutazio genetikoak alda litezke. Dena den, gaur egun, CRISPRen erabilera eta arlo bereko edizio genetikoa aplikatu ahal izateko, legezkotasun- eta bioetika-auziak gainditu behar dira oraindik. Hala ere, arlo honetako berri garrantzitsu bat aipatu beharra dago: bi biki txinatar genetikoki eraldatu ziren CRISPR bidez, GIBaren aurkako erresistentzia izan zezaten. Izan ere, GIBa hiesa eragiten duen birusa da. Salbuespen hori alde batera utzita, ugalketa prozesuan CRISPRa erabiltzea hipotesi hutsean gelditzen da.

## Arriskuak 
Ingalaterrako Wellcome Sanger Institutuko ikertzaileen arabera, edizio genetikoak genoma editatu den tokiarekin zuzenean lotuta ez dauden mutazioak eragin ditzake. Editatutako eta editatu gabeko geneen arteko konplexutasunak eta erlazioak gene editatuak dituzten pertsonen osasunean eragin lezake. Bere *Fenotipo iraultzailea* (ingelesez, *The revolutionary phenotype*) monografian, Jean-François Gariépy neurologo kanadarrak RNAren munduaren hipotesian oinarritutako teoria bat garatzen du, zeinetan giza genomaren edizioak ugalketa biologikoa ordezka lezakeen. Ugalketa biologikoaren ordez, zientzialariek kontrolatutako ugalketa sor liteke, programa informatikoen bidez gurasoen nahiak betetzeko seme-alabentzako edizio genetikoa aukeratuz.

## Erreferentziak 
## Kanpo estekak 
* Ignacio López-Goñi: Bakterioen defentsa-sistema da genoma-editore onena
* CRISPR, genoma editatzeko teknika: onurak eta kezkak