Nukleotiidide väljalõikereparatsioon

**[[Nukleotiidid]]e väljalõikereparatsioon** ehk **ekstsisioonreparatsioon** (inglise *nucleotide excision repair*; NER) on üks kolmest põhilisest DNA reparatsioonimehhanismist, kus kahjustused eemaldatakse väljalõikega.

Peale NER-i eksisteerib veel lämmastikaluste väljalõikereparatsioon ehk BER (inglise *base excision repair*) ja valepaardumise reparatsioon ehk MMR (inglise *mismatch repair*). DNA parandatakse kahjustatud lämmastikaluste kõrvaldamisega, kus esmalt teostatakse väljalõige ning seejärel väljalõigatud osa asendatakse õige osaga lokaalsel DNA sünteesil.

Väljalõikereparatsiooni mehhanismid on evolutsiooniliselt konserveerunud, olles põhimõtteliselt samased bakteritest imetajateni. Need küll jaotuvad kolme rühma (BER, NER ja MMR), kuid mehhanism on kõigil kolmel sarnane: 
* DNA reparatsiooniline endonukleaas või endonukleaasi sisaldav ensüümkompleks tunneb ära kahjustatud lämmastikalused (N-alused) või nukleotiidi(d), seondub nendega ning lõikab nad DNA-st välja.
* Moodustunud tühikusse sünteesitakse DNA polümeraasi abil normaalsed N-alused (lämmastikalused) või nukleotiidid (kasutades maatritsina komplementaarset DNA-ahelat).
* DNA ligaas ühendab uuestisünteesitud DNA-lõigu intaktseks kõrvaloleva DNA-ahela otsaga.
NER-i korral tekitatakse DNA-ahelasse kahjustatud ala lokaliseerimiseks katked nii 3’- kui ka 5’- suunas.

## DNA-kahjustused ja reparatsioon
DNA reparatsiooniks nimetatakse protsessi, kus parandatakse ära nii rakkude sisekeskkonna kui ka väliskeskkonna tegurite tõttu tekkinud kahjustusi. Arvatakse, et inimese igas rakus toimub ühe ööpäeva jooksul kuni 1 miljon DNA-kahjustust.

Peamised DNA-kahjustuste tegurid:
* oksüdatiivne stress (hapniku radikaalid);
* kiirgused (ioniseeriv ja mitteioniseeriv);
* kemikaalid ja keskkonnategurid;
* vead DNA replikatsiooniprotsessis.
Peamised DNA-kahjustuste tüübid: 
* lämmastikaluste eemaldamine DNA-st;
* nukleotiidide desamiinimine ja nukleotiidide valesti paardumine;
* DNA-ahelate katkemine;
* kovalentsete keemiliste ristsidemete teke (ahelasiseselt või -vaheliselt).
Tekkinud kahjustused võivad olla erinevad: UV-kiirgus põhjustab kõrvutiasetsevate pürimidiinide vahele ristsidemete moodustumist (nn 6-4-fotoproduktide teket) ning kemikaalidel on mutageenne ja kantserogeenne toime. DNA-le võivad mõjuda ka paljud taimede ja mikroobide moodustatud ühendid, näiteks maapähklite seenhallituse korral moodustuvad alfatoksiinid. Lisaks teevad ka kõik DNA polümeraasid töötamisel vigu, mille nad tavaliselt küll ise ära parandavad, kuid vigade parandamise efektiivsus on polümeraasidel väga varieeruv.

DNA reparatsioon jaotub kaheks alaosaks, sõltuvalt sellest, kas DNA-ahelad on katkenud või mitte: 
* kahjustatud või valede lämmastikaluste reparatsioon;
* DNA-ahelate katkemiskohtade reparatsioon.

DNA repatasioonimehhanismid jaotuvad kolmeks põhitüübiks: 
* otsesed keemilised pöördreaktsioonid (ingl. *direct chemical reversal*);
* kahjustuse kõrvaldamine väljalõikega ehk ekstsisioonireparatsiooniga (ingl. *excision repair*);
*rekombinatsioonisõltuv reparatsioon (ingl. *recombination-dependent repair*).

## NER prokarüootides
NER on võimaldanud bakteritel elada erinevates kahjulike keskkonnatingimustega niššides. Bakteriaalse elu tekkimisel (3 miljardit aastat tagasi) oli Maale jõudva ultraviolettkiirguse hulk 2–3 suurusjärgu võrra suurem kui praegu. Selline keskkond aitas bakteritel tekitada vajaliku kaitsesüsteemi – DNA reparatsioonimehhanismid. UV-valgus tekitab DNA-s peamiselt kahte fotoprodukti ehk kahjustust: tsüklobutaani pürimidiini dimeere ja 6-4 fotoprodukte. Neid kahjustusi parandatakse evolutsiooniliselt konserveerunud mehhanismidega, milleks on NER ning fotoreaktivatsioon.
#### Bakteritel ''E. coli'' näitel
''Escherichia coli'''s teostatakse NER-i UvrABC endonukleaasse ensüümkompleksi toimel. See kompleks koosneb tegelikult neljast Uvr-valgust: UvrA, UvrB, UvrC ja UvrD (DNA helikaas II). UrvA ja UrvB moodustavad kompleksi, mis skaneerib DNA-d, otsides vigu. Kui viga leitakse, siis UrvA vabaneb ning UvrB lõhub ära ahelatevahelised vesiniksidemed (H-sidemed). Seejärel ühineb UvrB-DNA kompleksiga UvrD, mis indutseerib UvrC-d (endonukleaas) tegema katked 8 nukleotiidi kaugusel kahjustuse 5’-otsast ja 4 nukleotiidi kaugusel kahjustuse 3’-otsast. Nii tekitatakse 12 nukleotiidiline üksikahelaline ala ehk 12-mer, mis kõrvaldatakse DNA-st UvrD toimel. Järgnevalt sünteesib DNA polümeraas Pol I tühimiku täis ja DNA ligaas ühendab DNA-ahelad.

#### Uvr-valgud
#UvrA: esimene Uvr valkudest NER-i kaskaadis, mis DNA-ga interakteerub. Tema afiinsus korrektse DNA-ga on ainult 2–5 korda väiksem kui kahjustatud DNA-ga. UvrA kuulub ATP-aaside ABC (*ATP-binding cassette*) superperekonda. Iga UvrA monomeer omab kahte ABC moodulit ning UvrA dimeeris esineb 4 nukleotiidi sidumise saiti (kohta). Esimene UvrA valgu struktuur leiti termofiilsest prokarüoodist *Bacillus stearothermophilus*, kus nähti selgelt ära, et kõik 4 nukleotiidi sidumise saiti on formeerunud intramolekulaarsel viisil. UvrA omab ka teisi domeene, näiteks aminoterminaalset NBD'd, ühte UvrB-sidumise saiti ning ühte insertsioonisaiti. 
#UvrB: kuulub superperekonda 2 (*Superfamily 2*) ning on DEAD-box’i perekonna helikaas, mis omab nõrka helikaasset ja ATP-aasset aktiivsust. Ta aktiveerub juhul kui ta on kontaktis UvrA ja vigase DNA-ga või kui tema autoinhibitsiooni põhjustav neljas domeen eemaldada. Tal on RecA-sarnased domeenid ja kolm lisadomeeni, mis on tema funktsioonist tulenevalt spetsiifilised. Tema funktsionaalse kompositsiooni osas vaieldakse siiani, uuringud on andnud vastuolulisi tulemusi, kus ühe puhul on vaadeldud UvrB valku monomeerina, teiste puhul dimeerina.
#Endonukleaasid UvrC ja Cho: UvrC seostub UvrB karboksüterminaalse otsaga. UvrC on Uvr-valkudest kõige väiksem ning omab kahte äratuntavat katalüütilist saiti, mis vastutavad 3’ ja 5’ lõigete eest. Neid katalüütilisi saite saab inaktiveerida üksteisest sõltumatult. Saitide domeenide vahel paikneb koht, kuhu seostub UvrB. UvrB seostumine on vajalik 3’ lõike tegemiseks, kuid mitte 5’ lõike tegemise jaoks. 
#UvrD: helikaas, mis kuulub superperekonda I (ingl. *superfamily I* ehk SFI). Ta omab nelja domeeni: 1A, 1B, 2A ja 2B. UvrD interakteerub UvrA ja UvrB valkudega eraldi, kuid mitte UvrAB kompleksiga.

## NER eukarüootides

Eukarüootidel on NER seotud 15 valguga ning jaguneb kahte klassi: 
# Transkriptsiooniseoseline reparatsioon ehk TCR (ingl. *transcription coupled repair*): aktiveerub siis, kui RNA polümeraas jääb transkribeeritaval DNA-ahelal seisma.
# Globaalne genoomne reparatsioon ehk GGR (ingl. *global genome repair*): toimub transkriptsioonist sõltumatult ning parandab vigu ka transkribeeritava geeni mittekodeerivas DNA-ahelas.
Nende kahe klassi peamine erinevus seisneb viisis, kuidas valgukompleksid DNA-vigastused üles leiavad. GGR korral leiab vea üles XPChHR23B kompleks, TCR korral inhibeeritakse initsiatsioon RNA polümeraas II blokeerimisega. Pärast vea avastamist toovad mõlemad reparatsioonid kohale eukarüootse transkriptsioonifaktori TRIIH. TRIIH on valgukompleks, mis koosneb 10 alaüksusest, sealhulgas ka DNA helikaas, mille toimel DNA avatakse vigastuse piirkonnas. Inimese puhul kõrvaldatakse 24–32 aluspaari pikkune lõik, tühimik täidetakse DNA polümeraasiga ning DNA ligaas ühendab DNA-ahelad. 
### NER-i defektsusest põhjustatud haigused
* Päikesevalguse suhtes ülitundlikel ehk *xeroderma pigmentosum*’iga (XP) patsientidel areneb kergesti nahavähk, sest NER-i defektsuse tõttu ei parandata UV-kiirgusest põhjustatud DNA-kahjustusi. Tegu on päriliku autosomaalse retsessiivse haigusega, millesse haigestub Euroopas umbes 1 inimene 500 000-st.Mutatsioonid esinevad geenides XPA, XPC, XPB, XPD, XPE, XPF, XPG jt. Need geenid vastutavad kahjustatud nukleotiidi, näiteks tümiini dimeeride väljalõikamise eest. 
* Cockayne’i sündroom
* Trihhotiodüstroofia
Kahe viimase haiguse korral pole tegu nahavähi tekkega, vaid neuroloogiliste nähtustega, vaimse alaarenguga.

## Eestis
Eestis uuritakse nukleotiidide väljalõikereparatsiooni prokarüootides Tartu Ülikooli molekulaar- ja rakubioloogia instituudi geneetika õppetoolis.

## Viited