Tuumori sfäärid

**Tuumori sfäärid** on ruumilised rakkude kogumikud, mis kuuluvad kolmedimensiooniliste (3D) kultuuride hulka. Sfäärid on ilmselt klassikaliseim ruumiline kultuur, mida on ka kõige enam kirjeldatud. Neil esineb olulisi sarnasusi väikeste mittevaskulariseerunud tuumoritega ja metastaasidega.

## Kasutuselevõtt
Algselt kasutati sfääre selliste bioloogiliste mehhanismide uurimiseks nagu rakutsükkel ja selle reguleerimine, diferentseerumine, rakkude surma protsessid ja sisenemine rakkudesse. Tehnilised uuendused on tõestanud, et sfääride geeni ekspressioon jäljendab täpsemalt kliinilist ekspressiooni, kui seda teevad ühekihilised kultuurid. Tänu sfääride sarnasusele tuumori kudedega on võimalik kasutada neid ravimiarenduses vaheetapina.

## Sarnasus tuumoritega
Võrreldes ühekihilise kultuuri ja tuumoritega on 3D-sfäärid keskmise keerukusega ja sarnanevad oluliselt tuumoritega.
Kuna sfäärid jäljendavad kasvajakoe füsioloogilisi omadusi täpsemalt kui kahedimensioonilised (2D-) kultuurid, peetakse neid bioloogilistel uuringutel efektiivseks tööriistaks. Sarnasused patofüsioloogilises keskkonnas tulenevad sellest, et sfäärid jäljendavad kolmedimensioonilist võrgustikku omades analoogseid rakkude omavahelisi ning rakkude ja maatriksi vahelisi interaktsioone.
Rakkude arvu suurenemine mõjutab histomorfoloogilisi omadusi. Sarnaselt kasvajatega toimub kataboliitide akumuleerumine.
2D-kultuuridel puudub võime omandada füsioloogilisi omadusi, mis muudaks nad originaalkoe sarnaseks. Sfääridel ja kasvajatel esinevad füsioloogilised sarnasused, nagu glükolüüs, adenosiintrifosfaadi, kolestorooli ja uurea süntees, lisaks on sarnane ravimite metabolism. Samuti omavad kolmedimensioonilised tuumori sfäärid stabiilset geeni ekspressiooni.

## Suurus ja külvamine
Sfääride moodustumine sõltub rakuliinist, mida külvamiseks kasutatakse. Sfääri füsioloogiline seisund sõltub tema suurusest. Standardseks loetakse 300–400 mikromeetrise diameetriga rakkude kogumikke. Selliste mõõtmete saavutamiseks on optimaalne 96 tundi inkubeerimist.
Tuumori rakkude kasvatamiseks kunstlikes tingimustes on mitmeid võimalusi. Näiteks on neid võimalik kasvatada Nuclon Sphera plaatidel. Kasutusel on ka nn rippuva tilga (*hanging drop*) meetod, mille on välja töötanud Šveitsi firma InSphero. Nende kasvuplaatide unikaalsus seisneb radiaalse ülesehituse muutmises. Plaatidel on ümara põhja asemel lameda põhjaga koonusekujulised kaevukesed. Samuti on kaevukese kuju disainitud nii, et tekiks õhukindel ühendus kaevu seina ja pipetiotsiku vahele. Tihe kontakt kahe pinna vahel võimaldab kanda kaevukestesse võrdseid koguseid rakususpensiooni.

### Külvamine
On rakke, mis moodustavad sfääre kinnituspinna puudumisel iseeneslikult. Selliseid rakke on lihtne kultiveerida näiteks vedelalt katmise tehnikaga (*liquid overlay method*). Külvamise protseduur võtab aega 1–2 tundi ja optimaalne inkubatsioon normaalmõõdus sfääride saamiseks on 96 tundi. Pärast sulatamist on esmalt vaja kasvatada valituid rakke koekultuuri kapis standardsetel tingimustel (5% CO2 ja 37 °C) niisutatud õhukeskkonnas, kuni rakud omandavad tavapärase kasvukiiruse. Kui rakkude kogus on piisav, tuleb valmistada üherakuline suspensioon, kasutades õrna ensümaatilist dissotsiatsiooni (EDTA ja trüpsiin). Sobiva suurusega sfääride loomiseks on vaja suspensiooni sobiva kontsentratsioonini lahjendada sobivas söötmes (sõltub rakuliinist). Eelnevate testide abil tuleb kindlaks määrata, kui palju rakke on vaja optimaalse suuruse saavutamiseks külvata. Soovitatav on kasutada 8 kanaliga pipetti ja asetada 200 mikroliitrit sobiva kontsentratsiooniga rakkude suspensiooni igasse kasvuplaadi kaevukesse, mille adhesiooni omadused on eelnevalt miinimumini viidud. Tähtis on sfääre inkubeerimise ajal võimalikult vähe häirida.

## Rakendused
Esmalt kasutati sfääre ainult bioloogiliste mehhanismide uurimiseks, nagu rakkude jagunemise reguleerimine, diferentseerumine, rakkude surmaga seotud protsessid ja rakkudesse sisenemine. Füsioloogiliselt sarnaste omaduste omandamine on seotud võimega paremini välja töötada rakuvälise maatriksi ja rakkudevahelist kommunikatsiooni.
Sfääre saab kasutada negatiivseks selektsiooniks ja nende rakendamine võib oluliselt vähendada loomkatsete hulka.
Tuumori sfäärid on ilmselt parim viis vähiravimi arendamiseks. Küllaltki palju rakendatakse ka 2D-kultuure, kuna nad on kergemini jälgitavad ja säilitatavad. Päriselus organismid aga kahedimensioonilises ruumis ei eksisteeri.
Maatriksis olevad kolmedimensioonilised kultuurid on kasutusel, et uurida diferentseerumist, migratsiooni ja tuumori invasiooni protsesse, mis on esile kutsutud tuumori poolt ja avaldavad mõju ekstratsellulaarse maatriksi komponentidele.

### Ravimi testid
Ravimi testide rakendamiseks on vaja eksperimentaalselt disaini, mis tagaks iga kord samast rakuliinist pärinevate sfääride külvamisel samades tingimustes identse struktuuri ja morfoloogia, mikrokeskkonna ja rakkude füsioloogia. Sfääride mudel ei ole ühtemoodi kasutatav kõikide pahaloomuliste haiguste puhul. Näiteks leukeemia puhul, mis on mittekinnituv kasvaja, ei ole see relevantne. Sfääre on palju kasutatud aga ajukasvajate mudelina (glioomid ja glioblastoomid). Kuni 200-mikromeetrise diameetriga sfääre kasutatakse sageli ravimite testimiseks. Neil esineb puudusi, mis muudavad nad mõningate rakuliinide jaoks ebasobivaks. Esindatud ei ole kõik rakk-rakk ja rakk-maatriks interaktsioonid, mis on olemas optimaalse suurusega või pigem suurematel sfääridel. Vastavate interaktsioonide puudumine vähendab sarnasusi patofüsioloogiliste tingimustes sfääri ja tuumori koe vahel. Hapnikuvaegus on üks ravimiresistentsuse olulisi tegureid. Suuredimensioonilised sfäärid (500–600 mikromeetrit) arendavad sekundaarseid nekroose. Analoogsed nekroosid esinevad ka *in vivo* ja on sageli apoptoosi põhjuseks.

### Tüvirakud
Tüvirakkude puhul avastatud kolmedimensioonilised koesarnased rakukobarad aitavad rakke hoida omavahelises pidevas suhtluses. Neid nimetatakse embrüonaalseteks kehadeks, mis on osa diferentseerumise protsessist. Selle saavutamiseks ei tohi lasta rakkudel kinnituda, sest muidu valguks rakukobar ühekihiliseks kultuuriks. Üks võimalus on katta kasvuplaatide pinnad polüstüreeniga, mis takistab kinnitumist. Samuti on võimalik kasutada vaheseinade süsteemi, kuid selle eemaldamisel võivad struktuurid kokku vajuda, lisaks segab see ka vaatevälja mikroskoobis.

### Oligonukleotiidid
Kuigi oligonukleotiidid on kahedimensioonilises rakukultuuris andnud geeni ekspressiooni mõjutamisel paljulubavaid tulemusi, ei ole neid kliinilises praktikas veel rakendatud. Selle põhjuseks on rakkude erinev käitumine ühekihilises rakukultuuris ja kolmedimensioonilises keskkonnas. Sfäärid on sarnased väikeste mittevaskulariseerunud kasvajatega ja mikrometastaasidega. Viimasest lähtudes on 3D-sfääre võimalik kasutada vaheetapina ühekihilise rakukultuuri ja *in vivo* vahel. Kandjamolekuli suurus mõjutab oluliselt sfääri sisemusse pääsemist ja seega ka oligonukleotiidide bioloogilist efekti. Sfääride laialdasemal kasutusele võtmisel on põhiliseks probleemiks nende kirjeldamine. Kuvamise raskused muudavad lünklikuks ka standardiseeritud iseloomustusmeetodite olemasolu.

## Uurimine
### HeLa rakuliini näitel
Uurides HeLa rakke õnnestus ruumilise kujutise rekonstrueerimise abil nii iseloomustada täpne pinna topograafia ja sisemised struktuurid. Sarnasused *in vivo* vaskulariseerimata tuumori mügarikega viitasid sellele, et nad suudavad ka funktsionaalselt tuumori omadusi jäljendada. Kolmedimensiooniliste struktuuride kuvamise puhul on võimalik saada infot ka tuumorisse penetreerumise kohta ja kasutada seda infot teraapiate väljatöötamiseks. Kvantitatiivsete andmete saamiseks saab elusaid ja surnuid rakke kuvada läbivoolu tsütomeetriaga. Viimase läbiviimiseks on vaja piisavalt üherakulist suspensiooni, mis on saadud sfääride ensümaatilisel töötlusel. Mikroskoopiline tuumori sfääride uurimine võimaldab näha järjest sügavamatesse sfääri kihtidesse.

### Värvimine ja rekonstrueerimine
Paremaks HeLa sfääride sisemiste struktuuride iseloomustamiseks värviti lõigud hematotsükliini ja eosiiniga, mis võimaldas tuumade ja tsütoplasma visualiseerimise. Pärast värvimist pildistati sfääri lõike iga 5 mikromeetri tagant ja need pildid rekonstrueeriti, kasutades tomograafiat. Vastavalt tekkinud värvide mustrile sai sfäärides olevad rakud jagada kolme rühma: 
# Paljunev rõngas, kus jagunemisfaasis olevatel rakkudel olid terviklikud tuumad. See viitas optimaalsetele tingimustele. 
# Vaikne/liikumatu piirkond, kus esinesid muutused tuumade ja rakumembraanide morfoloogias.
# Nekrootilise tuuma piirkonnas esinesid integreeritud tuumad ja kahjustatud membraanid. 

Saadud struktuuri kujutised näitasid võimalust, et kasutada 3D-kuvamist, et saada infot ka penetreerumise ja kemoteraapiliste omaduste kohta.

### Penetreerumise uurimine
Penetreerumise uurimiseks on kasutatud doksorubitsiini (DOX-analüüs). Ühekihilises kultuuris toimus kiire rakumembraanide läbimine suhteliselt lühikese aja jooksul. Sfääridesse sisenemine oli palju aeglasem (kasutati samasugust rakkude hulka eri dimensioonides). Kontrollimaks transpordi efektiivsust, on vaja võrrelda endosomaalset neelamist nii kahe- kui ka kolmedimensioonilises süsteemis. Sfääride puhul vähenes suuremate oligonukleotiidi komplekside transport võrreldes kahedimensioonilises kultuuris toimuva transpordiga. Morfoloogiliste erinevuste hindamiseks eri dimensioonilistes kultuurides kasutati skaneerivat elektronmikroskoopiat. Vigastamata sfääride ümber muutusid nähtavaks filopoodid. Ühekihiline kultuur säilitas oma lameda morfoloogia. Järeldusena saab öelda, et kolmedimensioonilised kultuurid sarnanesid kasvajatega rohkem.

## Viited