Üleepigenoomne assotsiatsiooniuuring

**Üleepigenoomne assotsiatsiooniuuring** (inglise **EWAS** – *Epigenome-Wide Association Study*) on meetod, millega tuvastatakse huvipakkuvate fenotüüpidega seotud epigeneetilisi muutusi.

## Epigeneetilised markerid

Epigeneetilised muutused tekivad elu jooksul vananemise käigus, soost ja keskkonnamõjudest sõltuvalt ning võivad olla pärilikud. Epigeneetilistest modifikatsioonidest eristatakse DNA metülatsiooni (DNAm), histoonide modifikatsioone ning mittekodeerivaid RNA-sid. Peamiselt uuritakse epigeneetika valdkonnas haigustega seotud muutuseid inimeste DNAm profiilis.

DNAm on kõige põhjalikumalt uuritud ja laialt levinuim EWAS-ides kasutatav epigeneetiline modifikatsioon, mis on seni ühtlasi ainus marker, mida on võimalik mõõta suure katvuse, täpsuse ning usaldusväärsusega korraga kuni tuhandetel proovidel. DNAm all mõeldakse DNA CpG saartes paiknevate tsütosiinide metüleerimist ehk CG dinukleotiidies paiknevatele tsütosiinidele kovalentset metüülrühma (-CH3) lisamist . DNAm on biokeemiliselt stabiilne modifikatsioon, mille töötlemine ja mõõtmine on võrdlemisi kerge. Samuti on DNAm bioloogiliselt oluline marker, kuna metüleerimise kaudu reguleeritakse organismi arenguks oluliste geenide aktiivsust. Ühte CpG piirkonnas asuvat DNAm nimetatakse varieeruvalt metüleeritud positsiooniks (inglise MVP – *methylation variable position*) ning mitut lähestikku paiknevat CpG piirkonnas asuvat DNAm kutsutakse varieeruvalt metüleeritud alaks (inglise DMR – *differently methylated region*). EWAS analüüsi käigus üritatakse enamasti tuvastada positsioone, mis on eri määral metüleeritud (inglise DMP – *differentially methylated positions*). Üksikus rakus on ühel DNA ahelal MVP täielikult metüleeritud või metüleerimata, kuid analüüsi käigus mõõdetakse keskmist DNAm mõlemal DNA ahelal ning kõigis proovis sisalduvates rakkudes korraga, mistõttu jääb metüleerituse tase 0–100% vahemikku. Levinud praktikas peetakse huvipakkuvaks DNAm erinevusi, mis ületavad 10%.

## EWAS-i kavandamine

### Fenotüübi defineerimine
Esimene samm EWAS analüüsi kavandamisel on uurimisküsimuse püstitamine. Täpsustatakse, millise fenotüübiga seonduvaid epigeneetilisi erinevusi soovitakse uuringu käigus tuvastada. Fenotüüpi mõjutavad geneetilised, demograafilised, kliinilised ja igasugused keskkondlikud tegurid, mistõttu on oluliste MVP-de tuvastamiseks oluline uuritava fenotüübi võimalikult spetsiifiline määratlemine. Organismi epigeneetiline profiil erineb äratuntavalt vanuse ja soo lõikes. Lisaks on kindlad keskkonnategurid, näiteks suitsetamis- ja söömisharjumised või ravimite tarvitamine, millel on teadaolev mõju epigeneetilistele mustritele. Uuringu disainimisel ning tulemuste analüüsimisel on oluline arvestada epigenoomi mõjutavate kaasuvate teguritega. Valida tuleb võimalikult homogeenne populatsioon. Piisavalt suure valimi korral on võimalik lubada mõningast stratifikatsiooni ning hiljem tulemuste analüüsimisel kasutada mitmese testimise korrektsioone. Lisaks uuritavale fenotüübile lähtutakse valimi koostamisel uuringutüübist. 

### Uuringutüübi valimine

* **Juhtkontroll uuringus** moodustatakse juhuslikest inimestest juhtgrupp, kellel esineb huvipakkuv fenotüüp ning kontrollgrupp, kellel vastav fenotüüp puudub. MVP-de leidmiseks võrreldakse juhtgrupi epigeneetilist profiili kontrollgrupiga. EWAS analüüsides on juhtkontrolluuring kõige laialt levinum uuringutüüp, kuna vajalikud andmeid on olemasolevatest suurtest andmebaasides kättesaadavad või vajadusel lihtsasti kogutavad. Juhtkontrolluuring ei selgita, kui suur osa gruppide vahelistest epigeneetilistest erinevustest tulenevad kaasuvatest keskkonnateguritest. Samuti ei ole võimalik öelda, kas fenotüüp on tekkinud epigeneetiliste muutuste tagajärjel või vastupidi.

* **Perekonnauuringus** koostatakse valim vanematest ja nende järglastest. Selliselt on võimalik kirjeldada epigeneetiliste mustrite pärilikkust ning iseloomustada lapsevanemate epigenoomi mõjutanud keskkonnategurite avaldumist järglaste fenotüübis. Perekonnauuringute piiranguks on piisava suurusega sobiva valimi moodustamine.

* **Kaksikute uuringus** otsitakse epigeneetilisi erinevusi monosügootsete kaksikute vahel, kellel on vaatamata identsele genoomile erisusi uuritava fenotüübi suhtes. Geneetilise variatiivsuse puudumine viitab, et epigeneetilised tegurid osalevad fenotüübiliste erinevuste tekkes. Sarnaselt perekonnauuringutega on kaksikute uuringuteks piisava suurusega valimi koostamine keeruline, kuid kaksikute uuring tuvastab, võrreldes juhtkontrolluuringuga, nõrgemaid seoseid väikesema valimi põhjal. 

* **[[Longituuduuring]]us** kirjeldatakse epigeneetilisi ja fenotüübilisi muutusi samal valimil läbi mitme aasta. Longituudselt on võimalik selgitada, kas epigeneetiline muutus eelneb või järgneb fenotüübilisele muutusele. Samuti saab välistada inimeste vaheliste erinevustest tulenevaid kaasnevaid mõjusid. Longituuduuringute disainimine on teiste uuringutüüpidega võrreldes kallis ja aeganõudev.

### Sobiva bioproovi määramine
Epigeneetilistes analüüsides kasutatakse bioproovina koekultuuri, mille epigeneetiline profiil on uuritava fenotüübi suhtes kõige informatiivsem. Sobivate koeproovide hankimine on komplitseeritud, kuna tihti on proovide kogumise protseduur invasiivne ning inimkatsete puhul seega enamasti võimalik vaid surmajärgselt. Üldjuhul kasutatakse seetõttu uuringutes surrogaatkoena verd. Samuti on mugav koguda sülje-, juuste- ja väljaheiteproove. Veri sobib vereringega seotud haiguste ning muude süsteemsete DNA metülatsiooni muutuste uurimiseks. Fenotüübiga otseselt seotud koe asemel surrogaatkude kasutades, peab esmalt põhjendama, et surrogaatkude on uuritava fenotüübiga seotud. Samuti peaks surrogaatkude reageerima originaalse koega sarnaselt olulistele keskkonnateguritele. Praktikas pole seni selle mõõtmiseks head meetodit ning surrogaatkoe kasutamisel on keeruline selgitada uuringutulemuste bioloogilist tähtsust.

Lisaks kudedevahelistele epigeneetilistele erinevustele, esinevad olulised lahknevused eri tüüpi rakkudes sama koe siseselt. Võimalusel tuleb katses eraldada ja kasutada ühte tüüpi rakke või vähemasti erinevat tüüpi rakke andmeanalüüsi jaoks loendada. Rakuline koostis võib koetüübi siseselt muutuda ka mõne haiguse tagajärjel, mistõttu ei pruugi tervete ja haigete inimeste vahelised epigeneetilised erinevused tuleneda haigusest endast vaid rakulise koostise erinevustest. Lisaks peab arvestama, et eritüüpi kudedes sisalduvad epigeneetilised mustrid võivad keskkonnamõjutuste tagajärjel ning vanuse kasvades erinevalt käituda.

## Katsetingimused
DNAm mõõtmine on tundlik igasuguste laboratoorsete katsete tehniliste tingimuste suhtes. Seetõttu eelneb katsetele optimaalse töövoo planeerimine, mis võimaldab uuringu jooksul tagada konstantsed katsetingimused. DNAm mõõtmine peab toimuma identse protokolli alusel muutumatutes laboritingimustes. Võimalusel viiakse katseid läbi iga päev samadel kellaaegadel samade inimeste poolt ning proove töödeldakse juhuslikus järjekorras. Kvaliteedi kontrollimiseks kasutatakse duplikaate ning teadaoleva metülatsioonitasemega standartproove. EWAS-i käigus mõõdetakse ülegenoomsed DNAm tasemed peamiselt sekveneerides või kiibipõhisel platvormil. 

## Mõõtmisplatvormid

### Metülatsioonikiibid
Kiibil põhinev EWAS analüüs on odavam ning metoodika ja tulemuse tõlgendamise poolest lihtsam kui sekveneerimine, kuna analüüsis kasutatakse piiratud hulgal väljavalitud CpG piirkondi . Lisaks EWAS analüüsidele kasutatakse kiipe kliinilises diagnostikas haiguste kulu mõõtmiseks ja iseloomustamiseks.

Enamasti kasutatakse DNAm EWAS-ide tegemiseks Illumina Methylation Array kiipe. 

* Kiipidest esimesena avalikustatud **Infinitum HumanMethylation27** mõõdab korraga üle 385 000 markerpiirkonna. 
* Järgmise põlvkonna **Infinitum HumanMethylation450K BeadChip** kannab üle 450 000 CpG markeri, mis katab umbes 2% inimese täisgenoomi CpG piirkondadest . HumanMethylation450 BeadChip markerid asuvad peamiselt geenide promootorite ja enhanserite ning 3′ UTR alades, kus paiknevad ühtlasi peamised funktsionaalsed DNAm piirkonnad. 
* **Infinitum MethylationEPIC BeadChip** avalikustati 2015. aasta detsembris. Viimane kiip sisaldab rohkem kui 850 000 markerpiirkonda.

Sarnaselt sekveneerimisanalüüsiga tehakse DNA-le esmalt bisulfiittöötlus, millele järgneb genoomse DNA paljundamine ning fragmenteerunud DNA kandmine Illumina kiipidele. Kiibi pinnal paiknevad oligonukleotiidide järjestustega kaetud silikaadi kuulid, millega hübridiseeruvad huvipakkuvad genoomsed lookused. DNA seondumise järgselt pikendatakse järjestusi ühe nukleotiidi kaupa. Iga nukleotiidi lisamisel vabaneb valgussignaal, mille tugevuse põhjal tuvastatakse erinevad nukleotiidid ning mõõdetakse kokkuvõttes huvipakkuva piirkonna keskmine metüleerituse tase. Illumina kiipidelt saab metüleerituse suhteliste beetaväärtustena, samas kui sekveneerimisega saadakse absoluutsed metülatsiooni tasemed. Beetaväärtus 0,8 vastab ligikaudu 30% absoluutsele metüleeritusele.
### Sekveneerimine
Kõige täpsemad andmed genoomi metüleerituse kohta annab sekveneerimisanalüüs. Sekveneerimise käigus on võimalik kontrollida kõigi 28 miljoni CpG piirkonna metüleerituse taset inimese genoomis. Sekveneerimisel jääb tihti limiteerivaks protseduuri hind, mistõttu analüüsitakse praktikas enamasti umbes suurusjärgu vähem genoomseid piirkondi ehk ligi 2–3 miljonit CpG piirkonda. Metüleeritavate piirkondade hulk genoomis on piiratud, mistõttu polegi kogu genoomi sekveneerimine vajalik. Lisaks tõstab ebavajalike piirkondade välistamine sekveneerimisanalüüsi täpsust. Sekveneerimiseks sobivad kõik järgmise põlvkonna sekveneerimisplatvormid (inglise *next generation sequencing* ehk NGS). Epigeneetilistes analüüsides on laialt levinud väiksema esindatusega bisulfiidsekveneerimine (inglise *reduced representation bisulfite sequencing* ehk RRBS), kus sekveneeritakse väljavalitud piirkondades ainult need genoomi osad, milles asub palju CpG piirkondi. Sekveneerimisprotseduurile eelneb DNA bisulfiit töötlus.

Sekveneerimisel põhinevad tehnikad muutuvad aastatega odavamaks ja leiavad ka tänu sellele suuremat kasutust. Kuna sekveneerimine pole nii laialdaselt kasutatav kui kiibipõhine tehnoloogia, pole sekveneerimisel põhinevate uuringute disainimine ja tulemuste tõlgendamine sama põhjalikult reguleeritud. Kuna kiibile on valitud piiratud hulk CpG piirkondi, pole kiibid sobivad kõigi huvipakkuvate fenotüüpide uurimiseks. Näiteks ei ole kiibil väga hea katvus psühholoogiliste häirete uurimiseks. Võimalusel soovitatakse kiibi meetodil kogutud metülatsioonitasemete tulemusi kontrollida otsese kvantitatiivse meetodiga, näiteks pürosekveneerimisega.

## Tulemuste analüüs
### Andmeanalüüs
EWAS analüüsi tulemusena akumuleerub suures koguses andmeid nii uuritava fenotüübi kui ka DNAm tasemete kohta üle kogu genoomi. Saadud andmete statistilises analüüsis otsitakse seoseid fenotüübi ja epigenoomi vahel, mida on võimalik selgitada bioloogilises ja kliinilises tähenduses. DNAm mõõtetulemusi analüüsitakse positsioonide, kuid ka suuremate piirkondade ja klastrite kaupa.  

* **Üksikute positsioonide analüüsis** vaadeldakse genoomis üksikutes positsioonides leiduvaid DNAm erinevusi. Iga positsiooni puhul hinnatakse, kas variatsiooni ja uuritava fenotüübi vahel esineb seos. Sageli kasutatakse üksikute positsioonide analüüsis lineaarset regressiooni, mis võimaldab kaasuvate teguritega arvestamist. Kuna igat positsiooni vaadeldakse eraldi, rakendatakse seoste puhul mitmese testimise korrektsiooni.
* **Piirkondade analüüsis** otsitakse tervete CpG saarte, saartelähedaste alade või muude ligi 1000 bp pikkuste genoomsete blokkide ja regioonide DNAm variatsioonide seoseid uuritava fenotüübiga. Võrreldes positsioonide analüüsiga, on piirkondade analüüs väiksema spetsiifilisusega, kuid suudab seoseid tuvastada suurema arvutusliku võimsusega. 
* **Klasteranalüüsis** grupeeritakse CpG positsioonid DNAm variatsiooni põhjal gruppideks, millele leitakse seejärel keskmised DNAm väärtused. Samuti on võimalik CpG positsioone grupeerida *a priori*, genoomsete annotatsioonide põhjal, geenide, signaaliradade ja CpG saarte järgi. Klasteranalüüsis on kasutusel vähem tunnuseid, tänu millele tulevad seosed fenotüübi ja DNAm variatsiooni vahel selgemalt esile. Samas võivad kaduma minna spetsiifiliste CpG positsioonide seosed uuritava fenotüübiga. 
Statistilise andmeanalüüsi seisukohast on metülatsioonianalüüsi tulemused tihti ebasobiva jaotusega, mis võib tekitada palju valenegatiivseid tulemusi. Seetõttu kasutatakse analüüsides enamasti robustset regressiooni, milles määratakse regressiooni koefitsientideks standartvea väärtused. Rakkudevahelise heterogeensusega arvestamiseks luuakse lineaarsete mudelite abil igale rakutüübile eraldi metülatsiooniprofiilid. Alternatiivina kasutatakse EWAS tulemuste analüüsimiseks mitteparameetrilisi meetodeid või Bayesian statistika arvutusi. Illumina metülatsioonikiipide analüüside tulemusena väljastatakse DNAm väärtused beetaväärtustena ja M-väärtustena. Täpsemate tulemuste saavutamiseks soovitatakse arvutustes kasutada M-väärtusi, ning hiljem tulemused esitatakse taas beetaväärtustena. 

### Põhjuslikkuse määramine
EWAS tulemuste tõlgendamisel on väärtuslikud igasugused uuringu kavandamisel püstitatud bioloogiliselt sisukad hüpoteesid. Epigeneetilise markeri ja fenotüübi vaheline seos saab tähendada, et variatsioon metüleerituses põhjustab fenotüüpi; fenotüüp põhjustas muutused metüleerituses või mõni kaasuv tegur põhjustas nii variatsiooni metüleerituses kui ka uuritava fenotüübi tekke. Enamasti on EWAS analüüsi tulemused eksploratiivsed ning tulemuste bioloogilise sisu väljaselgitamine keeruline. Põhjusliku suhte kinnitamiseks on võimalik analüüsida koos erineva disainiga uuringuid. Näiteks kombineeritakse uuringuid, milles on tuvastatud samasuguseid epigeneetilisi muutusi, kuid millel on erinevad uuritavad fenotüübid. Samuti on võimalik kontrollida, kas metülatsioonimustrite erinevused eelnevad uuritava fenotüübi väljakujunemisele või vastupidi, longituudse uuringu disainimisega. 

EWAS analüüsi tulemuste valideerimiseks tehakse analüüsile sõltumatu replikatsioon. Replikatsiooniks sobib valim ja bioproovid peavad olema sõltumatud, kuid võrreldavad esimese katsega. Replikatsiooniuuringus kasutatakse alternatiivset ülegenoomset metoodikat või jätkatakse lookuse-spetsiifilise DNAm analüüsiga. Tulemuste bioloogilise tähtsuse selgitamisel on heaks tavaks täiendavate analüüside teostamine, mille abil selgitatakse DNAm mõju geeniekspressioonile. 
## Tulemused
EWAS-i tulemustel on mitmeid rakendusi inimeste tervisliku seisundi uurimises. Uuringute abil on võimalik tuvastada epigeneetilisi mustreid, mis esinevad haigetel inimestel võrreldes tervete inimestega. Leitud biomarkerite abil kirjeldatakse uuritavate haiguste etioloogiat, tuvastatakse haigusi kliinilises praktikas ning arendatakse spetsiifilisi ravimeid . **EWAS Atlas** (http://bigd.big.ac.cn/ewas) on kontrollitud kogumik seni läbi viidud EWAS-ide tulemustest. EWAS Atlas sisaldab tulemusi rohkem kui tuhandest uuringust, milles kirjeldatakse DNAm seoseid sadade erinevate fenotüüpidega. EWAS Atlas on seotud **EWAS Data Hub**-iga (https://bigd.big.ac.cn/ewas/datahub), mis lisab EWAS Atlase andmetele informatsiooni uuringus kasutatud bioproovide, sugude, vanuste ning pärilikkuse kohta ning visualiseerib tulemusi interaktiivsetel graafikutel. EWAS Atlase statistika kohaselt on kõige rohkem avaldatud publikatsioone suitsetamiskäitumise ning vananemise teemadel. Inimeste tervislike seisunditega seoses on kõige rohkem kirjeldatud DNAm erinevuste seotust kehamassiindeksi ning II tüüpi diabeediga. Seni põhineb valdav enamus avaldatud publikatsioonidest Illumina 450K kiibi tehnoloogial ning on teostatud Euroopa populatsioonil. Bioproovidest on enamasti kasutatud täisverd, kuid lisaks ka nabaväädiverd, leukotsüüte ning perifeerse vere mononukleaarseid rakke. Esimese artikli avaldamisest aastal 2009 kuni aastani 2020 on ilmunud üle 700 EWAS tulemustega artikli.

## Vaata ka
*Ülegenoomne assotsiatsiooniuuring (GWAS)

## Viited