Tsütotoksilisus

**Tsütotoksilisus** (kreeka-ladina päritolu: *κύτος* – 'anum' ja *toxicum* – 'mürk') on omadus, mille tõttu looduslik või sünteetiline keemiline aine või muu mõjur (nt ioniseeriv kiirgus või immuunsüsteemi rakk) põhjustab rakkude surma. Mõiste on oluline farmakoloogias, toksikoloogias ja meditsiinis, olles seotud ravimite ja muude ainete või materjalide ohutuse hindamise ning bioloogiliste efektide uurimisega.

## Tsütotoksiliste mõjurite tööpõhimõte

Tsütotoksiline toime võib avalduda mitmete mehhanismide kaudu, näiteks rakumembraani lagundamise, ainevahetuse häirimise (sh oksüdatiivse stressi tekitamise) või DNA vigastuste põhjustamise teel, mis kutsuvad esile programmeeritud rakusurma (apoptoosi) või muid rakusurma liike. Tsütotoksilisus erineb tsütostaasist: tsütostaatiline toime pidurdab rakkude kasvu või jagunemist ilma rakke otseselt tapmata.

Aine või muu mõjuri tsütotoksiline toime sõltub oluliselt selle kontsentratsioonist või doosist ning mõjuriga kokkupuuteajast: madalatel kontsentratsioonidel või lühiajalisel kokkupuutel võib toime puududa või olla tsütostaatiline, samas kõrgematel kontsentratsioonidel või pikemaajalisel kokkupuutel võib see põhjustada rakkude surma. Rakenduste seisukohalt on oluline ka selektiivsus, sest ained, mis on tsütotoksilised ühtedele rakkudele, ei pruugi olla sama doosi juures tsütotoksilised teistele rakkudele. Näiteks põhineb paljude antibiootikumide toime mikroorganismide spetsiifiliste struktuuride või ainevahetusprotsesside kahjustamisel, mistõttu on need bakteritele tsütotoksilised, kuid peremeesorganismi rakkudele suhteliselt ohutud.

Samuti võivad mõned ained osutuda tsütotoksiliseks just konkreetsete elundite rakkudele: vastavalt avaldub näiteks kardiotoksilisus (südame kontekstis), nefrotoksilisus (neerude kontekstis), neurotoksilisus (närvirakkude kontekstis) jms. Enamasti põhineb aine elundispetsiifiline toksilisus aine selektiivsel kuhjumisel või metaboliitide tekkel antud elundi teatud rakkudes.

## Tsütotoksiliste mõjurite näited

### Vähiravimid
Mitmed kemoteraapias kasutatavad ühendid, mis on mõeldud vähirakkude hävitamiseks, on klassikalised tsütotoksilised ühendid. Selektiivsus vähirakkude suhtes saavutatakse näiteks läbi selle, et kemoteraapilised ühendid mõjutavad just kiiresti jagunevaid rakke (oluline taksaanide korral), muundunud DNA parandusmehhanismidega rakke (oluline plaatinapõhiste ravimite korral) või teatud toitainetest sõltuvaid rakke (oluline antifolaatide korral).

### Bioloogilised mõjurid
Tsütotoksilised T-rakud (CD8⁺ T-rakud) on immuunsüsteemi rakud, mis suudavad hävitada patogeeniga nakatunud rakke või vähirakke läbi nn tsütotoksilise immuunvastuse. Nimelt tunnevad CD8⁺ T-rakud ära antigeeni-MHC klass I kompleksi sihtraku pinnal ja moodustavad selle rakuga tiheda kontakti. Antigeeniks on seejuures enamasti peptiid, mis pärineb raku sees sünteesitud või lagundatud valgust, näiteks kasvajale iseloomulikest valkudest või viirusevalkudest. Koesobivuskompleksi klass I (MHC I) molekulid esitlevad neid rakusiseseid antigeene rakkude pinnal, võimaldas immuunsüsteemil saada infot raku seisundi kohta. CD8⁺ T-raku seondumisele anomaalseks tunnustatud raku pinnale järgneb lüütiliste graanulite vabastamine, mis sisaldavad perforiini ja gransüüme: perforiini toimel tekivad sihtraku membraani sisse poorid ning gransüümid indutseerivad raku apoptoosi.

Bioloogiliste tsütotoksiliste mõjurite hulka võib liigitada ka loomade, taimede, seente või bakterite eraldatavaid valgulisi toksiine. Need võivad avaldada tsütotoksilist toimet erinevate mehhanismide alusel: näiteks tsütolüsiinid põhjustavad pooride teket rakumembraanis, difteeriatoksiin peatab valgusünteesi ribosoomidel ning mõningad toksiinid võivad lagundada ka RNA molekule. Enamasti sisenevad valgulised toksiinid rakkudesse endotsütoosi teel ning omavad efekti juba üsna madalatel kontsentratsioonidel. Seepärast on neid püütud rakendada ka meditsiinis vähirakkude hävitamiseks või vaktsiinide tõhustamiseks – selleks modifitseeritakse toksiine viisil, mis minimeeriks kõrvaltoimete tõenäosust (näiteks ühendatakse toksiin selektiivse antikehaga või kasutatakse vaid lühikest fragmenti algsest toksiinist).

### Keskkonnas levinud ja laboritingimustes kasutatavad kemikaalid
Samuti võivad tsütotoksilist toimet omada erinevad keskkonnas levinud ja laborites või tööstuses kasutatavad kemikaalid – sealhulgas orgaanilised lahustid, raskmetallid, putukamürgid, herbitsiidid ning nende laguproduktid või metaboliidid. Näiteks on *[[in vitro]]* rakumudelites näidatud, et dimetüülsulfoksiid ja teatud pindaktiivsed ained põhjustavad rakkude elujõulisuse vähenemist, demonstreerides, et isegi lahustid võivad mõjutada tsütotoksilisust sõltuvalt kontsentratsioonist ja katse kontekstist. Samuti on mitmete herbitsiidide koostisse kuuluvate aktiivainetel ja nende kaubanduslike formulatsioonide komponentidel täheldatud *in vitro* mudelites rakumembraani kahjustavaid ja oksüdatiivset stressi tekitavaid toimeid.

Kuigi mõningate eelmainitud ainete puhul on selektiivne tsütotoksilisus taotluslik, võimaldades kasutada ainet näiteks putuka- või umbrohumürgina, võib ainete soovimatu tsütotoksilisus avalduda ka teistes organismides. Kuna konkreetsete aineklasside seos tsütotoksilisusega on keeruline ja keskkonnas leiduva kontsentratsiooni mõju sõltub nii kokkupuute kestusest kui ka kuhjumisest toitumisahelas, ei saa üldistada üht kindlat doosi, mille juures kemikaalid avaldavad tsütotoksilist või muud kahjustavat toimet (näiteks käitudes endokriinseid häireid põhjustavate kemikaalidena).

### Ioniseeriv kiirgus
Ioniseeriv kiirgus on kõrgenergeetiline kiirgus (hõlmab gammakiirgust, röntgenikiirgust ja lühilainelist ultraviolettkiirgust), mis suudab elektrone aatomite elektronkatte sisekihtidest välja lüüa. Tulemusena tekivad ioniseeritud ühendid, mille anomaalselt kõrge reaktsioonivõime rikub bioloogilise süsteemi kontekstis tavapärast tasakaalu. Näiteks võib ioniseeriv kiirgus põhjustada otsest DNA ahela katkestust või kaudset kahjustust tekkivate vabade radikaalide kaudu, mis lõhuvad biomolekule ja viivad süsteemi rakusurmani või mutatsioonide tekkimiseni. Ioniseeriv kiirgus avaldab üldiselt tsütotoksilist toimet kõigile rakkudele, kuid mõningate organismide rakkude rakukest (nt mikrovetikates) ja teatud kohastumused (nt melaniini süntees) võivad mõnevõrra takistada kiirguse neeldumist või seda lokaalselt piirata ning seeläbi vähendada tsütotoksilist efekti.

Ioniseeriva kiirguse tsütotoksilisus on samas kasutusel meditsiinis: kiiritusravi (radioteraapia) kasutab fokuseeritud röntgeni- ja gammakiirgust vähirakkude hävitamiseks. Samuti on kasutusel radioaktiivsete nukliididega märgistatud antikehad ja peptiidid, mis lokaliseerivad tsütotoksilise kiirguse toimet kasvajakoesse (radioimmunoteraapia). Sellised rakendused võimaldavad ioniseeriva kiirguse tsütotoksilist toimet selektiivselt suunata, püüdes minimeerida tervete rakkude kahjustust.
## Tsütotoksilisuse uurimine
Tsütotoksilisuse hindamine annab varajase ja kvantitatiivse info selle kohta, kas ja mil määral aine või tegur võib kahjustada elusrakke. See on keskne nii ohutusriskide hindamisel, tsütotoksilisust eeldavate preparaatide efektiivsuse määramisel kui ka regulatiivsete otsuste tegemisel. Valdkondade lõikes on tsütotoksilisuse uuringud vajalikud näiteks ravimiarenduse algstaadiumis, keskkonnatoksikoloogias ja ka tehislike biomaterjalide ohutuse hindamisel.

* Ravimiarendus: tsütotoksilisuse testid võimaldavad varakult välja selgitada, kas kandidaatühend kahjustab soovimatult terveid rakke või kas see kahjustab piisaval määral patoloogilisi rakke (nt vähiravimite puhul). See aitab eristada sobiliku toimega ühendeid nendest, mille terapeutiline aken on liiga kitsas (st aine kasulikud efektid avalduvad dooside juures, kus hakkavad avalduma ka kahjulikud efektid).
* Kemikaalide ja materjalide ohutuse hindamine: tsütotoksilisuse testimine on oluline tööstuskemikaalide, kosmeetikatoodete, nanomaterjalide ja biomaterjalide (nt implantaadid) hindamisel, et vältida rakkude kahjustust kokkupuutel teguriga. Seejuures tuleb silmas pidada, et vaadeldavate teguritega kokkupuude on sageli pikaajaline või regulaarne, mis erineb näiteks ravimitega kokkupuute kestusest vähipatsientidel.
* Keskkonna- ja töötervishoid: tsütotoksilisuse testimine annab infot saasteainete, kiirguse või muude keskkonnategurite või konkreetse isiku töökeskkonnas leiduvate tegurite võimaliku bioloogilise mõju kohta ning aitab hinnata pikaajalisi riske. Samuti võib tsütotoksilisuse hinnanguid anda teatud tehnoloogiliste võtete abil saadud toodetele, aitamaks otsuste tegemist tehnoloogiate võimalikest mõjudest nii inimese kui ka teiste elusorganismide tervisele.
* Mehhanistlik arusaam: mõned tsütotoksilisuse mõõtmiseks kasutatavad meetodid aitavad mõista, kuidas aine rakke täpsemalt kahjustab (nt membraanikahjustus, mitokondriaalne stress, DNA kahjustus), mis on oluline nii fundamentaalsete kui ka rakenduslike teadusuuringute seisukohalt ja võimaldab tsütotoksiliste ainete kasutust paremini suunata, valida efektiivsemad kaitsevahendid tsütotoksilise teguriga töötamisel, piiritleda tsütotoksilisest tegurist eriti mõjutatud populatsioone või muuta kasutajaid teadlikemaks potentsiaalsetest riskidest.

### Kasutatavad mudelid
Tsütotoksilisuse hindamiseks kasutatakse erineva keerukusega bioloogilisi mudeleid. *In vitro*, *ex vivo* ja *in vivo* mudelid erinevad selle poolest, kui kaugel need on terviklikust elusorganismist:

* *[[In vitro]]* mudelid põhinevad koest värskelt eraldatud eraldatud rakkudel (nt osteoblastid) või korduvat rakujagunemist võimaldavatel rakuliinidel (nt emakakaelavähiliin HeLa, maksavähiliin HepG2), mida kasvatatakse kunstlikes tingimustes (rakukultuuris). Need mudelid võimaldavad täpselt kontrollida katsetingimusi ja testitavate ainete kontsentratsioone ning nendega tehtud katsed on hästi reprodutseeritavad (nt võimaldavad varasemate ja hilisemate katsete tulemuste omavahelist võrdlemist), kuid ei kajasta täielikult rakkude loomulikku koostoimet. Suurendamaks füsioloogilist relevantsust, tehakse tänapäeval rakkudega katseid mitte vaid tavapärases kinnituvas formaadis, vaid ka nn 3D-formaadis (sferoidid, organoidid), mis jäljendab paremini kudede struktuuri ja toitainete ning testitavate ainete difusiooni rakukogumis. Samuti teostatakse erinevate rakutüüpide kooskultiveerimist.
* *[[Ex vivo]]* mudelid kasutavad elusorganismist pärinevaid kudesid (nt nahk, luuüdi), mida uuritakse väljaspool organismi, säilitades osaliselt nende loomuliku struktuuri ja funktsiooni. Sellised mudelid peegeldavad paremini kudede keerukust kui *in vitro* süsteemid, kuid nende kasutatavuse suhteliselt lühike kestus ja kättesaadavuse piiratus seab metoodilised piirangud.
* *[[In vivo]]* mudelid hõlmavad terveid elusorganisme (peamiselt loomi – nt kalu kui vees elavaid organisme ning hiiri kui imetajaid), milles uuritakse aine või teguri mõju kogu organismi tasandil. Need mudelid võimaldavad hinnata süsteemseid mõjusid, aine metabolismi ja erinevate elundite vastastikmõju, kuid on eetiliselt ja regulatiivselt rangemalt piiratud ning ressursimahukamad. Tänapäeval püütakse neid võimaluse korral asendada või vähendada, kasutades täpsemaid *in vitro* mudeleid (3R-põhimõte inglisekeelsest *Replacement, Reduction, Refinement* ehk eesti keelde tõlgituna asendamine, vähendamine ja täiustamine).

*[[In silico]]* mudelid põhinevad arvutuslikel ja matemaatilistel meetoditel, millega ennustatakse ainete bioloogilist toimet ilma otseste katseteta elusrakkudel või -organismidel. Tsütotoksilisuse hindamisel kasutatakse *in silico* lähenemisi eelkõige keemilise struktuuri, füüsikalis-keemiliste omaduste ja varasemate eksperimentaalsete andmete põhjal võimalike toksiliste efektide prognoosimiseks. Levinud on nn QSAR-mudelid (ingl k *quantitative structure-activity relationship*) ja masinõppel põhinevad algoritmid, mis seovad keemiliste ühendite struktuuri nende tsütotoksilise potentsiaaliga. *In silico* mudelid võimaldavad kiiresti sõeluda suuri andmekogusid, vähendada loomkatsete vajadust ning suunata eksperimentaalseid uuringuid olenevalt rakenduslikust vajadusest ka tõenäoliselt aktiivsematele või hoopis ohutumatele kandidaatidele. Samas sõltub *in silico* meetodite usaldusväärsus tugevalt kasutatavate andmete kvaliteedist ja mudelite valideeritusest ning need ei asenda täielikult eksperimentaalseid uuringuid, vaid täiendavad neid osana mitmetasandilisest riskihindamisest.

### Näiteid mõõtmismeetodikatest
*In vitro* mudelites hinnatakse tsütotoksilisust peamiselt rakkude arvu, metaboolse aktiivsuse, plasmamembraani terviklikkuse või rakusurma mõõtmise kaudu. Samas saab mitmeid tsütotoksilisuse mõõtmise meetodeid, eriti LDH-, resasuriini- ja TUNEL-teste, sobiva kohandamise korral kasutada ka *ex vivo*. Lisaks ühendatakse tihti mitut testimeetodit, et saada terviklikum pilt aine mõjust rakkudele.

* Rakumembraani terviklikkust mõõtvad meetodid põhinevad eeldusel, et rakumembraani lokaalsel katkemisel (nt pooride tekkimisel) ei ole rakk enam elujõuline, sest puudub eraldav barjäär raku sisemuse ja väliskeskkonna vahel. Rakumembraani terviklikkuse kadu võib olla vahetult tingitud tsütotoksilisest tegurist või siis tekkida muu mehhanismi kaudu käivitatud rakusurma hilistes staadiumites. Trüpaansinisel põhinevate testide korral hinnatakse värvainega värvunud ja värvumata rakupopulatsioonide suurust: elusad rakud ei lase värvainet sisse, samas kui surnud või tugevalt kahjustatud membraaniga rakud värvuvad. Meetod on lihtne, kuid suhteliselt madala tundlikkusega. Laktaadi dehüdrogenaasi (LDH) testide korral hinnatakse rakukahjustuse ulatust aga LDH ensümaatilise aktiivsuse alusel – elusrakkudes paikneb LDH tsütoplasmas, kuid rakumembraani kahjustumisel lekib ensüüm rakuvälisesse keskkonda, kus selle aktiivsust saab abireagente kasutades spektrofotomeetriliselt mõõta.
* Raku ainevahetuslikul aktiivsusel põhinevad testid mõõdavad elusrakkude võimet metaboliseerida (nt redutseerida hingamisahelas tekkivate aktiivsete ühendite arvelt) kindlaid keemilisi ühendeid. MTT-test kasutab abiainet 3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüültetrasooliumbromiid, mille mitokondriaalsed ensüümid redutseerivad nn formasaaniks. Formasaani neelduvusspekter erineb MTT omast ning seega saab tekkinud saaduse hulka mõõta spektrofotomeetriliselt ja korreleerida elujõuliste rakkude populatsiooni suurusega. Analoogsel põhimõttel põhineb ka resasuriini test, kuigi resasuriini redutseerimises osalevad ka tsütoplasmas paiknevad ensüümid ning tekkiv resorufiin on ka fluorestseeruv, seega saab mõõtmisi teha ka tundlikumas fluorimeetrilises formaadis.
* Apoptoosi ja DNA kahjustust mõõtvad meetodid võimaldavad eristada rakusurma erinevaid mehhanisme ning hinnata tsütotoksilise teguri täpsemat toimemehhanismi. TUNEL-test (ingl k *Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling*) tuvastab DNA ahela katkeid (DNA fragmenteerumise), mis on iseloomulik apoptoosile. Meetodis kasutatakse ensüümi terminaalne deoksünukleotidüültransferaas (TdT), mis lisab DNA katkestuste vabadetele 3’-terminaalidele märgistatud nukleotiide (enamasti dUTP). Need nukleotiidid võivad olla fluorestseerivalt märgistatud või seotud ensüümidega (nt peroksüdaas), mis võimaldab kahjustunud rakkude visualiseerimist fluorestsentsmikroskoopia või värvusreaktsiooni abil. Kaspaaside aktiivsuse testid mõõdavad apoptoosi käigus aktiveeruvate proteaaside kaspaaside aktiivsust. Selleks kasutatakse enamasti ka geneetiliselt kodeeritud või sünteetilisi sensormolekule, mille töö põhineb kaspaaside vahendatud proteolüütilisel lõhustamisel. Kaspaaside sensorid sisaldavad tavaliselt peptiidjärjestust, mida uuritav kaspaas suudab spetsiifilist lõhustada. Sensori lõhustumine muudab omakorda sensori optilisi omadusi, näiteks fluorestsentsi intensiivsust või energiaülekande efektiivsust kahe fluorofoori vahel (FRET-põhistes sensorites).

#### Tsütotoksiline ''versus'' tsütostaatiline toime
Tsütotoksiline toime viitab rakkude surmale. Tsütostaatiline toime tähendab rakkude kasvamise või jagunemise pidurdumist, aga mitte tingimata nende hävitamist. Tsütostaatilist toimet rakendatakse sageli kasvajarakkude paljunemise peatamiseks. Seega võib aine olla tsütostaatiline ilma tugevalt tsütotoksilisena toimimata, kuigi paljud vähivastased ravimid avaldavad mõlemat toimet.

## Vaata ka
*Tsütotoksilised T-rakud
## Viited