Fluorestseeruvad valgud

**Fluorestseeruvad valgud** on valgud, mis helendavad, kui neid valgustada ultraviolettvalgusega või valgusega suuremal lainepikkusel. Esimesena eraldati roheline fluorestseeruv valk (GFP – *green fluorescent protein*). Sellel on kaks ergastuspiiki: 395&nbsp;nm ja 475&nbsp;nm. Emissioonimaksimum on 509&nbsp;nm, mis paikneb rohelise valgusspektri alumises osas. 
 
Roger Y. Tsien, Osamu Shimomura ja Martin Chalfie said 2008. aastal Nobeli keemiaauhinna rohelise fluorestseeruva valgu avastamise ja arendamise eest.

## Ajalugu
Washingtoni Ülikooli teadlased Osamu Shimomura ja Frank Johnson eraldasid 1961. aastal esimestena biohelendava valgu. Valk eraldati *[[Aequrea victoria]]* meduusist ning see sai nimeks *aequorin*. *Aequorin* kiirgab UV-valguses sinist värvust. *Aequrin* isoleerimise ajal avastati veel teine valk, GFP, millel on nõrk sinine kiirgus, kuid mis on võimeline helendama roheliselt, kui seda valgustada UV-valgusega.

## Kasutamine
30 aastat hiljem, 1992. aastal, kui Douglas Prasher teatas GFP kloonimisest ja nukleotiidsest järjestusest, hakkasid molekulaarbioloogid nägema GFPs kasulikku tööriista. Teadlased mõistsid, et see on hea marker geeniekspressioonil ja valgu asukoha kindlaksmääramisel. GFP-d on modifitseeritud, et saada veel teisigi helendavaid valke.

## GFP derivaadid ja teised fluorestseeruvad valgud
Rohelisest fluorestseeruvast valgust on tehtud palju derivaate, sest sel on lai kasutusala ja arenev teadus vajab uusi töövahendeid. Derivaatide fluorestsentsspekter katab peaaegu terve nähtava spektri ulatuse. Lisaks *Aequrea victoria*le kasutatakse ka teisi organisme, mille geenijärjestust kasutades on võimalik eraldada fluorestseeruvaid valke. Fluorestseeruvad valgud, mis emiteerivad oranži ja punast, on eraldatud õisloomade (*Anthozoa*) klassist, ainuõõssete (*Cnidaria*) hõimkonnast pärit isenditelt.

### Rohelised fluorestseerivad valgud
GFP toodab küll väga tugevat helendust ja on väga stabiilne valk, aga selle ergastusmaksimum on lähedal ultravioletsele valgusele ja seetõttu võib GFP-ga visualiseerimine kahjustada elavaid rakke. Ühe punktmutatsiooniga seriini 65. positsioonis, mis muudab selle treoniiniks, on ergastusmaksimum viidud 488&nbsp;nm juurde ja emissioonimaksimum on 507&nbsp;nm. EGFP (*enhanced green fluorescent protein*) on kõige enam kasutatav roheline fluorestseeruv valk, mida on laialdaselt saadaval mitmesugustes vektorites. Lisaks on EGFP vaadeldav filtritega, mis on juba laialdaselt kasutatavad.

Emerald on fotostabiilne ja erk roheline fluorestseeruv valk, aga kaubandusliku allika puudumine on selle kasutamist piiranud. Ergastusmaksimum 487&nbsp;nm, emissioonimaksimum 509&nbsp;nm.

GFP2 on roheline fluorestseeruv valk, milles fenüülalaniinijääk on 64. positsioonis leutsiini vastu vahetatud. Ergastuspiik on 400&nbsp;nm juures.

ZsGreen1 on korallrahust pärit valk. Seda on tutvustatud ka kui asendust EGFP-le. Kui ZsGreen1 ekspresseerida imetaja rakus, siis sarnaneb see väga EGFP-ga. Ergastuspiik on 493&nbsp;nm ja emissioonipiik 505&nbsp;nm juures.

### Kollased fluorestseerivad valgud
YFP (*yellow fluorescent protein*) on GFP geneetiline mutant, mis on saadud *Aequorea victoria* valgust. Sarnaselt GFP-ga on YFP kasulik tööriist raku- ja molekulaarboloogias. Ergastusmaksimum 514&nbsp;nm ja emissioonimaksimum 527&nbsp;nm.

Perekonnale pandi alus pärast rohelise fluorestseeruva valgu kristallstruktuuri avastamist, kui leiti, et rohelise fluorestseeruva valgu treoniini 203. jääk on kromofoori lähedal. Mutatsioonid selles jäägis tagavad stabiilse oleku ergastatud dipoolil.
 
EYFP (*enhanced yellow fluorescent protein*) on üks eredamaid ja laialdaselt kasutatav fluorestseeruv valk. On tundlik happelisele pH-le ja kaotab umbes 50% fluorestsentsist pH 6,5 juures. Ergastuspiik on 514&nbsp;nm ja emissioonipiik 527&nbsp;nm juures.
 
Citrine on väga erk ja võrreldes EYFP-ga on palju vastupanuvõimelisem fotopleegitamisele, happelisele pH-le ja teistele keskkonnamõjudele. Ergastusmaksimum 516&nbsp;nm juures ja emissioonimaksimum 529&nbsp;nm juures.
 
Venus on kiiremini formeeruv ja väga erk kollaselt fluorestseeruv valk võrreldes eelmistega. Ergastusmaksimum on 515&nbsp;nm juures ja emissioonimaksimum 528&nbsp;nm juures.

ZsYellow1 on kollaselt fluorestseeruv valk, mis on kloonitud *Zoanthus*e liigist, õisloomade (*Anthozoa*) klassist, ainuõõssete (*Cnidaria*) hõimkonnast. Ergastusmaksimum 529&nbsp;nm ja emissioonimaksimum 539&nbsp;nm.

### Sinised ja tsüaansinised fluorestseeruvad valgud

Selleks, et saada GFP-st siniseid (BFP – *blue fluorescent protein*) ja tsüaansiniseid (CFP – *cyan fluorescent protein*) fluorestseeruvaid valke, on vaja rohelise fluorestseeruva valgu türosiini 66. jääk modifitseerida histidiiniks või trüptamiiniks. Mõlemad variandid fluorestseeruvad nõrgalt ja vajavad veel teist mutatsiooni, et voltumine oleks efektiivsem ja helendus seetõttu tugevam. EBFP (*enhanced blue fluorescent protein*) ja ECFP (*enhanced cyan fluorescent protein*) on ainult 25–40% sellest helendusest, mida suudab EGFP toota. EBFP ja ECFP vaatlemiseks on vaja erilisi filtreid. Ergastuspiigid on vastavalt 383 ja 439&nbsp;nm juures ning emissioonipiigid 445 ja 476&nbsp;nm juures.
 
AmCyan1 on tsüaansiniselt fluorestseeruv valk, mis eraldati korallrahust *Anemonia majano*. Imetajas ekspresseerimiseks optimeeriti AmCyan1 inimese koodonitega, et saada suurem helendus ja resistentsus fotopleegitamisele. Ergastuspiik on 458&nbsp;nm juures ja emissioonipiik 489&nbsp;nm.
 
Cerulean on tõhustatud vorm ECFP-st, et saada kõrgem ekstinktsioonitegur ja paranenud kvantitatiivne saagis. Ergastusmaksimum 433&nbsp;nm ja emissioonimaksimum 475&nbsp;nm.

### Oranžid ja punased fluorestseeruvad valgud
Fluorestseeruvate valkude konstrueerimise suurim eesmärk on punaste valkude tootmine, mis oleksid võrdväärsed või paremad kui on EGFP. Punased fluorestseeruvad valgud on vaadeldavad juba olemasolevate mikroskoopide ja nende lisadega. Punaste fluorestseeruvate valkudega on võimalik vaadelda tervet looma, sest need on punasele valgusele paremini läbistatavad kui teistele valgustele. Meduusist *Aequorea victoria* eraldatud rohelise fluorestseeruva valgu mutant punane fluorestseeruv valk pole olnud nii edukas.

DsRed on oranž fluorestseeruv valk, mis eraldati *Discosoma striata*st õisloomade (*Anthozoa*) klassist. Valgul esineb mitmeid probleeme: liiga aeglane formeerumine, tetrameer, võib formeerida suuri agregaate elusrakkudega, tihti ka toksiline. Ergastusmaksimum 558&nbsp;nm ja emissioonimaksimum 583&nbsp;nm.

DsRed2 on DsRed-ist mutatsioonide abil saadud oranž fluorestseeruv valk. Sellel vähendati toksilisust, see formeerub kiiremini ja ei moodusta agregaate. Ergastusmaksimum 563&nbsp;nm ja emissioonimaksimum 582&nbsp;nm.

DsRed-Express on edasiarendus eelmistest. Sellel on tugevam helendus ja kiirem formeerumine. Ergastusmaksimum 555&nbsp;nm ja emissioonimaksimum 584&nbsp;nm.

RedStar on pärmi jaoks loodud punane fluorestseeruv valk. Sellel on veelgi kiirem formeerumine ja tugevam helendus.

HcRed1 on punane fluorestseeruv valk, mis isoleeriti *Heteractis crispa*st, meriroosiliste (*Actiniaria*) seltsis, õisloomade (Anhozoa) klassist. Laialt kättesaadav ja kasutatav just imetajate uurimisel. Ergastuspiik on 588&nbsp;nm juures ja emissioonipiik 618&nbsp;nm juures.

## Viited