Mikroplaadilugeja

**Mikroplaadiluger**, ka mikrotiiterplaadi lugeja, on bioanalüütilistes ja meditsiinilaborites kasutatav mõõteseade, mille abil on võimalik teostada optilisi mõõtmisi formaadis, kus mõõtmine toimub sama katseplaadi järjest mitmes süvendis ehk kaevus. 

Võrreldes klassikalise spektrofotomeetriga, kus mõõtmisi teostatakse küvetis, on mikroplaadilugeri kasutamisel kaks põhieelist: kiirem läbilaskevõime ja vähendatud mõõteruumala. Mõlemad eelised on väga olulised nii kliinilistes rakendustes kui ka fundamentaalteaduslikes uuringutes, kuivõrd lubavad säästa bioloogilist proovi, abireagente ja mõõtmisaega.

Mikroplaadilugereid toodavad näiteks Agilent, BioTek, BMG Labtech, Molecular Devices, PerkinElmer, Promega, Tecan ja veel paljud ettevõtted. Eri aparaatide puhul pööratakse tähelepanu erinevatele aspektidele, mis võivad olla eri kasutajarühmade seisukohalt enim soovitud – näiteks võimalus teostada võimalikult mitmekesiseid mõõtmisi, detektori tundlikkus, mikroplaadilugeri portatiivsus, töökindlus, madal hind vms.

## Olulised ehituselemendid

Mikroplaadiluger töötab enamasti elektromagnetkiirgusega, mis jääb nähtava valguse (ligi 400–740 nm) piirkonda, kui võib hõlmata ka lähiultraviolettkiirgust (lähi-UV) ja lähiinfrapunakiirgust (lähi-IP). Nähtav valgus ei ole ioniseeriv (ehk ei kahjusta bioloogilisi objekte, v.a pikaaegse valgustatuse tingimustes) ning samas sobib paljude fluorofooride ergastamiseks. Lähi-UV lainepikkuste vahemik 320–340 nm sobib samas sobib lantanoidide kelaatide ergastamiseks (vt allpool) ning seega oluliselt mitmekesistab mõõtmismetoodikate arvu. Lähi-IP lainepikkuste vahemikus 650–1350 nm asub aga bioloogiliste kudede nn optiline aken – ehk selline kiirgus läbi bioloogilisi objekte kõige paremini. Valgusallikatena kasutatakse eri aparaatides kas erinevate spektritega valgusdioode (LED; ühtlasi odavaim variant), laia kiirguse profiiliga ksenoonkaarlampi või ka monokromaatset lämmastiklaserit (uuemates mikroplaadilugerites UV-ala rakenduste jaoks).

Valimaks kitsamaid lainepikkuse vahemikke proovi ergastava ja/või proovist emiteeruva valguse jaoks, kasutatakse eri mikroplaadilugerites kas optilistest filtritest ja poolläbilaskvatest peeglitest (ingl k *dichroic mirror*) koosnevaid süsteeme, monokromaatorit või mõlemat lähenemist. Monokromaator võimaldab küll suuremat paindlikkust ergastuseks kasutatava või emiteeritava valgu lainepikkuste valikul, kuid vähendab mõõtmise tundlikkust; samuti ei ole monokromaatorit soovitatav kasutada fluorestsentsi polarisatsiooni/anisotroopia mõõtmistes (vt allpool). 

Valguse detekteerimiseks kasutatakse madalama hinnaklassiga mikroplaadilugejates ränist fotorakke, suure tundlikkusega kallimates aparaatides aga fotoelektronkordistit (ingl k *photomultiplier tube* ehk PMT). 

## Mõõdetavad optilised karakteristikud

Olenevalt konkreetse mikroplaadilugeja tüübist ja mõnikord ka moodulitest, mida on mõõteseadme soetamisel valitud, saab mikroplaadilugejat põhimõtteliselt kasutada mitmesuguse väljundsuuruse (ingl k *readout*) mõõtmiseks:

* Valguse neeldumine ja/või lahuse optiline tihedus: mõõdetakse teatud lainepikkusega valguse intensiivsuse vähenemist, kui valgus läbib lahuse kihti. Kui lahus sisaldab ainet, mis neelab vastava lainepikkusega valgust, saab Lamberti-Beeri seaduse alusel kindlaks teha aine kontsentratsiooni lahuses. Kui lahuse asemel on tegemist kolloidsüsteemi või jämedispersse süsteemiga, kus esineb valguse hajumine, saab hinnata hajutavate osakeste sisaldust süsteemis (nt bakterite kasvutiheduse mõõtmine) või muutusi hajumises, olenevalt teatud ainete juuresolekust (nt vereliistakute ehk trombotsüütide agregatsiooni mõõtmine agregeerimist käivitavate ainete juuresolekul).
* Fluorestsentsi intensiivsus: mõõdetav proov ergastatakse madalama lainepikkusega valgusega ning emiteeritud suurema lainepikkusega valguse intensiivsuse alusel hinnatakse fluorestseeruva aine sisaldust lahuses/süvendi pinnal. Samuti saab uurida fluorofoori kvantsaagise muutumist (näiteks juhul, kui fluorofoori vahetult ümbritsev keskkond muutub lahuses sisalduvate molekulide omavahelise seondumise tulemusena). 
* Försteri-tüüpi resonantne energiaülekanne ehk FRET: sisuliselt mõõdetakse samuti fluorestsentsi intensiivsust, kuid seejuures sisaldub süsteemis kaks erinevat fluorofoori, millest ühe (nn doonori) emissioonispekter kattub teise (nn aktseptori) ergastusspektriga. Juhul, kui fluorofoorid asuvad ruumiliselt lähestikku ning on teineteise suhtes sobivalt orienteerunud, esineb nende vahel mittekiirguslik energiaülekanne (FRET). Seega saab doonori ergastamisel mõõta nii doonori enda emissiooni (juhul, kui energiaülekannet ei toime) kui ka aktseptori emissiooni (juhul, kui FRET esineb). FRETi mõõtmisi kasutatakse väga laialdaselt, uurimaks molekulidevaheliste interaktsioonide esinemist (nt kui toimub kompleksi moodustumine doonorfluorofooriga ühendatud molekuli ja aktseptorfluorofooriga molekuli vahel, tekib FRET – kui aga kummagi molekuliga seostub mõni konkureeriv ühend, mis takistab FRET-partneri seostumist, siis FRET väheneb).
* Fluorestsentsi polarisatsioon või anisotroopia: ka siin mõõdetakse fluorestsentsi intensiivsust, kuid seejuures toimub proovi ergastamine lineaarselt polariseeritud kiirgusega. Sel juhul ergastatakse vaid see molekulide populatsioon, milles fluorofoori dipoolmoment on ergastava polariseeritud kiirguse suhtes sobivalt orienteeritud. Kui ergastatud molekuli pöörlemine lahuses toimub samal või lühemal ajaskaalal, kui kiirguse emissioon (fluorestsentsi puhul mõni nanosekund), siis on molekulist emiteeruv kiirgus depolariseerunud. Kui aga molekuli vaba pöörlemine lahuses on takistatud (nt moodustab molekul kompleksi mõne oluliselt suurema molekuliga), siis on emiteeritav kiirgus polariseeritud samasuunaliselt, võrreldes ergastava kiirgusega. Anisotroopia (laiemas mõistes süsteemi omaduste ebaühtlus) tähendab antud juhul seda, et fluorofoori sisaldava lahuse emiteeritud kiirgus võib omada eelistatud polarisatsiooni (kui ergastamine toimub samuti polariseeritud kiirgusega).
*Fotoluminestsentsi eluiga: mõõdetakse molekulide populatsioonis fotoluminestsentsi signaali kustumist ajas, kui ergastav valgus on välja lülitatud. Nendes mõõtmistes kasutatakse enamasti pikema elueaga (mõnesaja mikrosekundi kuni millisekundi skaalal) luminofoore – näiteks haruldaste muldmetallide ühendeid, mille optiliste omaduste puhul ei saa enam rääkida „klassikalisest“ kiirest fluorestsentsist. Molekuli fotoluminestsentsi eluiga võib muutuda, olenevalt eri teguritest – üheks on näiteks sobiva aktseptormolekuli olemasolu, kuhu saab ergastatud oleku energiat üle kanda (vt eespool FRET põhimõte). Eluea mõõtmiste eeliseks on asjaolu, et erinevalt emiteeritava valguse intensiivsusest, ei olene eluiga kuigi palju molekulide kontsentratsioonist. Samas võib mõõtmistulemuste tõlgendamine olla komplitseeritud juhul, kui esineb näiteks nn mitmeeksponendine signaali kustumine (mis viitab mitme erineva elueaga molekulide populatsiooni olemasolule) või proovi pleekumine (nähtus, kus molekuli ei ole võimalik korduvalt ergastada, kuna selle struktuur muundub suure energiaga kiirgusega kiiritamise tulemusena).
* Aeglahutatud fotoluminestsentsi intensiivsus: siinkohas kasutatakse taas pikema elueaga luminofoore ning signaali intensiivsus mõõdetakse pärast mõningast ajalist viivitust ergastava impulsi järel (enamasti mõnekümne mikrosekundi järel). Võrreldes tavalise fluorestsentsi intensiivsusega, on aeglahutatud formaadi eeliseks asjaolu, et mikrosekundite ajaskaalal protsessi mõõtmisel ei ole keerulisemates bioloogilistes süsteemides esinev taustkiirgus enam segav. Kui proovile lisatakse nn fotoluminestsentsi kustutavaid aineid (ingl k *photoluminescence quenchers*), saab mõõta ka kustutava aine efekti või selliste lisakomponentide efekte, mis kaitsevad luminofoori kustutaja toime eest.
* Bio- ja kemoluminestsentsi intensiivsus: selliste mõõtmiste puhul ei kasutata emiteeriva molekuli ergastamiseks valgust, vaid molekul saavutab ergastatud olekut tänu ensümaatiliselt katalüüsitud keemilisele reaktsioonile. Mõõdetavas proovis peavad esinema nii sobiv ensüüm (nt mädarõika peroksidaas või lutsiferaas) kui ka selle substraat. Bioluminestsentsi käsitletakse sageli ka kemoluminestsentsi alaliigina, kuna mõlema protsessi toimepõhimõte on sarnane – eesliidet „bio“ kasutatakse pigem juhul, kui ensümaatiliselt katalüüsitav protsess toimub elusrakkudes, ning eesliidet „kemo“ juhul, kui reaktsioon kulgeb lihtsamas süsteemis. Bioluminestsents on kombineeritav ka FRET-formaadiga (st toimub energiaülekanne aktseptorfluorofoorile). Kuna nii kemo- kui ka bioluminestsentsi detekteerimisel ei vajata ergastavat valgust, on süsteemis taustkiirgus minimaalne, mis võimaldab saavutada suurt tundlikkust. Mõningates rakendustes käivitatakse lutsiferaasi ekspressioon elusrakkudes, olenevalt soovitud analüüdi juuresolekust (st kasutades rakusiseseid signaaliülekande mehhanisme); inglise keeles kasutatakse selliste meetodite kohta mõistet "*reporter assay*" (nt *luciferase reporter assay*).

Olenevalt mõõdetavast suurusest, täpsematest mõõtmisparameetritest (näiteks signaali kogumise aeg), mikrotiiterplaadi süvendite arvust ja mikroplaadilugeja karakteristikutest, võib ühe mikrotiiterplaadi tüüpiline mõõtmisaeg ulatuda paarikümnest sekundist paarikümne minutini.

### Mõõtmise erirežiimid
Mikroplaadilugeja mõõdab signaali vaikimisi süvendi keskosas (vältimaks süvendi seinte läheduses esinevaid võimalikke optilisi artefakte ning temperatuurikõikumisi) ning väljundiks on seega üle süvendi keskmistatud signaal. Mõned mikroplaadilugejad lubavad valida mõõdetava välja täpsemaid koordinaate süvendis, nii *xy*- kui ka *z*-dimensioonis (viimast nimetatakse ka fokaaltasandi valikuks). Fokaaltasandi valikul tuleks ka arvestada, kas signaali on valitud metoodika puhul mõttekam tuvastada lahuse ruumalas või pigem süvendi põhjas.

Ajaliselt pikemate katsete korral võimaldavad mõningad plaadilugejad plaadi kiiret segamist („väristamist“, ingl k *shaking*) lugemite võtmise vahel. Kuigi süvendite sees tekkivad kontsentratsioonigradiendid ühtlustuvad pigem tavalise difusiooni teel, võib selline segamine olla vajalik teatud bioloogiliste süsteemide normaalseks toimimiseks – näiteks trombotsüütide agregatsiooni uuringutes.

Kuna nii reaktsiooni kiirus kui ka tasakaalulise reaktsiooni tasakaalukonstandi väärtus sõltuvad temperatuurist ning ka paljud bioloogilised molekulid on temperatuuritundlikud (nt võivad denatureeruda), võimaldavad paljud mikroplaadilugejad plaadi termostateerimist mõõtmise käigus. Siiski tuleb arvestada, et süvendi kiiritamisel võib suure energiaga valgus tekitada süvendis temperatuuri olulist tõusu, mida tuleb vajadusel nn molekulaarsete temperatuurisondide abil eraldi kvantifitseerida. Lisaks on mõned plaadilugejad varustatud süsihappegaasi- ja hapnikusensoritega, võimaldades hoida mõõtmiskambri atmosfääris stabiilset CO<sub>2</sub> ja O<sub>2</sub> sisaldust. Need on olulised katsetes pH- ja hüpoksiatundlike süsteemidega nagu elusrakud, kuid hapniku sisaldus keskkonnas võib mõjutada ka fluorofooride ja luminofooride optilisi omadusi (nt kvantsaagist ja pleekumise kiirust).

Teatud tootjate pakutavad mikroplaadilugejad on kombineeritud ka mikroskoobiga, mis võimaldab mitmekesistada aparaadiga teostatavaid uuringuid. See võib olla eriti oluline tundlike katseobjektidega töötamisel: näiteks on ühe protokolli piires võimalik teostada iga keskmistatud lugemi võtmise järel ka süvendites rakkude pildistamine fluorestsentsmikroskoobiga, jälgides rakkude fenotüübi võimalikke muutusi katse käigus.

## Mikrotiiterplaatide iseärasused

Mikrotiiterplaat on enamasti plastikust valmistatud ristkülikukujuline plaat (tüüpilised mõõtmed suurusjärgus 120–130 mm pikkus × 85–86 mm laius × 10–25 mm kõrgus), milles on korrapärase paigutuse ja mõõtmetega süvendid. Näiteks: 

* 96 süvendiga plaadil on 12×8 süvendit, kusjuures süvendi läbimõõt pealtvaates on suurusjärgus 6,5 mm ja maksimaalne tööruumala on suurusjärgus 200–400 μl;
* 384 süvendiga plaadil on 24×16 süvendit, kusjuures süvendi läbimõõt pealtvaates on suurusjärgus 3 mm ja maksimaalne tööruumala on suurusjärgus 100–150 μl sügavamate plaatide puhul või 30–40 μl nn vähendatud ruumalaga plaatide puhul.

On olemas ka 1536 ja 3456 süvendiga mikrotiiterplaate – nende puhul on süvendi maksimaalne ruumala vastavalt 3+, Eu3+) kelaatidega. Sageli kombineeritakse sellistes mõõtmistes aeglahutatud fotoluminestsentsi ja FRET-formaati (nn TR-FRET), kasutades sel viisil ära lantanoidide fotoluminestsentsi pikka eluiga ja FRETi efektiivsuse sõltuvust molekulidevahelisest kaugusest.
* Ensüümide ja retseptoriga seonduvate ühendite sidumisomaduste (sh afiinsuse, assotsiatsiooni ja dissotsiatsiooni kiiruskonstantide) kvantifitseerimine, kasutades fluorestsentsanisotroopia mõõtmisi. Katse läbiviimiseks on vajalik sobiva fluorofooriga ühendatud, suhteliselt kõrge afiinsusega sond (uuritava bioloogilise sihtmärgiga hästi seonduv molekul), millega konkureerivad uuritavad mittefluorestseeruvad molekulid. Meetod toimib hästi vaid suhteliselt lihtsates süsteemides, mis on rikastatud bioloogilise sihtmärkmolekuli sisalduse poolest (nt puhta ensüümi lahus või retseptorit ekspresseerivad viiruselaadsed osakesed).
* G-valguga seotud retseptorite aktivatsiooni uurimine elusrakkudes, kasutades geneetiliselt kodeeritud FRET-sensoreid, milles FRET efektiivsus muutub teatud sekundaarsete virgatsainete (nt cAMP või Ca2+) juuresolekul.
* Rakkude elulevuse määramine, kasutades värvainet resasuriini. Resasuriini fluorestsents- ja neeldumisomadused muutuvad, kui see redutseeritakse metaboolselt aktiivsetes rakkudes resorufiiniks.

## Viited