Koopiaarvu variatsioonid

**Koopiaarvu variatsioonid** (ingl *copy number variation*, lühend **CNV**) on kindla geeni eksemplaride arvu ehk koopiaarvu varieerumine eri indiviidide vahel.

Nii nagu inimestel, on kõikidel diploidsetel organismidel kaks koopiat kindlast kromosomaalsest piirkonnast – iga kromosoomi kohta üks. Vähem on teada koopiaarvu variatsioonide kohta. "Inimese genoomi projekt" oli esimene projekt, kus need avastati. "Inimese genoomi projekti" eesmärk oli kaardistada kõikide inimeste geenid, kokku panna inimese genoomi füüsikaline kaart ning sekveneerida inimese kõik kromosoomid. Koopiaarvu variatsioonid (inglise keeles *copy number variation*, lühendatult CNV) koosnevad kindlas regioonis koopiate arvu erinevustest.

Koopiaarvu variatsioonid on vähemalt 1000 aluspaari pikkused vahemikud. Osadel inimestel on need kahe- või kolmekordistunud. Arvatakse, et genoomist moodustavad CNV-d umbes 15%. Ühel indiviidil on keskmiselt 12 koopiaarvu varieeruvust. Üle 41% kõikidest teadaolevatest koopiaarvu varieeruvustest kattuvad teiste geenidega. See näitab, et neil on oluline roll geeniekspressioonis. Esimestel avastatud varieeruvustel, milleks olid 21. trisoomia (Downi sündroom), X monosoomia (Turneri sündroom) ja XXY (Klinefelteri sündroom), oli kindel kliiniline tagajärg, kuid paljudel seda pole.

SNP-d on üksiku nukleotiidi polümorfismid – kindlas DNA punktis oleva aluspaari vahetusvarieeruvus populatsioonis, üks nukleotiid asendub teisega. Polümorfism viitab sellele, et varieeruva alleeli esinemissagedus on vähemalt 1%. CNV-d on SNP-dest eriti mõõtmete poolest komplekssemad, SNP-de keskmine sagedus on üks 200–300 aluspaari kohta. Mõlemad võivad sisaldada kodeerivaid ning mittekodeerivaid järjestusi, kuid kui SNP mõjutab vaid ühte saiti, siis koopiaarvu varieeruvus võib mõjutada mitmeid järjestikuseid geene.

## Koopiaarvu varieeruvuste avastuste ajalugu

* 1959 – avastati Downi, Turneri ja Klinefelteri sündroom.
* 1963 – leiti esimene sündroom deletsiooni tõttu: Cri-du-chat, mille põhjustas kindla kromosoomi osa kadu 5. kromosoomist. Imikutest patsientidele on iseloomulik kõrgehääleline nutt.
* 1980 – FISH-tehnikat kasutati valgusmikroskoobis mittenähtavate kõrvalekallete uurimiseks.
* 1982 – FISH-tehnikat kasutati inimeste kromosoomide uurimiseks.
* 1991 – avastati Charcot-Marie-Tooth tüüp 1A haiguse 1,4 Mb pikkune duplikatsioon ning arvati, et see tekkis mittealleelse homoloogse rekombinatsiooni tagajärjel.
* 1992 – võrdlev genoomse hübridisatsiooni meetod (inglise keeles *comparative genomic hybridisation*, lühendatult CGH) võimaldas leida duplikatsioone ja deletsioone kasvajates.
* 2001 – sekveneeriti "Inimese genoomi projekti" esimene referentsjärjestus.
* 2004 – "Inimese genoomi projekt" lõpetati ning saavutati genoomsetele variatsioonidele avalikkuse laiem tähelepanu.
* 2006 – valmis inimese genoomi koopiaarvu variatsiooni kaart.

## Koopiaarvu variatsioonide tekkemehhanismid

CNV-d moodustuvad genoomsete ümberkorralduste tagajärjel, mille tõttu kas tekib juurde või kaotatakse DNA segmente. Kohtadel, kus toimub sagedasem replikatsioon, tekib ka variatsioone rohkem. Replikatsioon on DNA *de novo* süntees. Osad koopiaarvu variatsioonid on tekkinud ka keerulisemate ümberkorralduste tõttu. Need võivad hõlmata tervet geeni, selle osasid, mitmeid geene, regulaatorelemente või siis mitte ühtegi neist.

Mehhanismid võib jaotada kolmeks:  
# Mitte-alleelne homoloogiline rekombinatsioon. Homoloogne replikatsioon on DNA homoloogsete ehk sarnaste piirkondade vaheline ristsiire ehk krossingover. Need sündmused toimuvad ühes põlvkonnas 10−4 korda. See on palju suurem tõenäosus kui SNP tekkevõimalus (10−8 korda). 
# Mittehomoloogne otsade liitmine ja mikrohomoloogiast põhjustatud otsade liitmine. Mittehomoloogne DNA otsade ühendamine toimub ligaasi abil, mis ühendab katkenud DNA ahelad. Mutatsioonidena tekivad väikesed deletsioonid (kaotatakse geneetilist materjali).
# FoSTeS mudel. DNA replikatsiooni ajal võib replikatsioonikahvel peatuda ning raam vahetuda. Kuna FoSTeS põhineb replikatsioonil, toimub see mitoosi käigus. Ümberkorraldused toimuvad nii genoomi, geeni kui eksoni tasemel. Ekson on lõik, mis splaissimise käigus ühendatakse mRNA järjestusse.

Koopiaarvu varieeruvuse tekke kohta annab vihjeid regiooni ümbritsev genoomne järjestus. Tihti on CNV-d seotud identsete järjestusosadega – segmentaalsed duplikatsioonid, madala sagedusega kordused, Alu või LINE elemendid. Struktuurne variatsioon hõlmab valgusmikroskoobiga mittenähtavaid genoomimuutusi DNA segmentides. See mõiste ei anna teavet esinemissageduse ega seotuse/mitteseotuse kohta mõne haiguse või fenotüübiga. Struktuurne variatsioon võib olla koguseline (deletsioonid, insertsioonid (geeni lisandub geneetilist materjali), duplikatsioonid (üleliigse materjali lisadumine)), positsiooniline või orientatsiooniline (inversioonid – järjestus pöördub ümber enda telje). Segmentaalne duplikatsioon on üle 1 kb pikk DNA. See esineb kahe või enama koopiana haploidses genoomis, järjestus on samane vähemalt 90% ulatuses. Alu elemendid on lühikesed insertsioonilised elemendid, LINE elemendid on pikad korduvad transposoonsed elemendid.

Koopiaarvu varieeruvusi tekib rohkem: 1) geenidesse, mis on seotud immuunsuse või rakk-rakk signaliseerumisega; 2) geenidesse, mis kodeerivad keskkonna poolt mõjutatavaid valke (näiteks immuunvastuse, lõhnatundlikkusega tegelevad valgud); 3) valku kodeerivatesse geenidesse, mis on seotud retroviiruste ja transpositsioonidega.

## Mõju inimestele

Suurimad, mikroskoobiga vaadeldavad CNV-d (1 Mb või suuremad) omavad pea alati fenotüübilist tagajärge ning nende kandjad vajavad meditsiinilist abi. Osadel koopiaarvu varieeruvustel pole mingisugust tagajärge, osad aga annavad parema ellujäämispotentsiaali muutuvate elukeskkonna tingimuste korral. CNV-d põhjustavad sellised haigused nagu Alzheimeri tõbi, autism, skisofreenia, rinnavähk, ülekaalulisus ja alaareng.

Duplikatsioonide tagajärjel võib tekkida olukord, kus toodetakse produkti liiga palju. Kui on aga tegemist geenisisese duplikatsiooniga, võib produkti struktuur muutuda ja seeläbi ka selle funktsioon. Mõned haigused pole seotud kindla koopiaarvuga, vaid lihtsalt ehituslik muutus inimgenoomis häirib kindlaid radu. Näiteks Li-Fraumeni sündroomi korral on täheldatud duplikatsiooni. Li-Fraumeni sündroom on haruldane häire, mille korral on patsiendil suurem risk haigestuda kasvajatesse.

Koopiaarvu varieeruvus, mis on päritud terve fenotüübiga pereliikmetelt ning mis kattub variantidega DGV-s või ei sisalda kliinilise tähtsusega geene, on suure tõenäosusega healoomuline. CNV, mis asub geenirikkas piirkonnas, on saadud haigelt pereliikmelt või mis on dokumenteeritud seoses mõne kliinilist abi vajava fenotüübiga, on suure tõenäosusega haigust tekitav. DGV (inglise keeles *Database of Genomic Variation*) on andmebaas, mis võtab kokku kõik teadaolevad ehituslikud variatsioonid inimgenoomis.

CNV-de fenotüübilist mõju ei tunta veel kuigi hästi. Uuringute käigus võib leida kindla patogeensete CNV-de kombinatsiooni, mis võivad üksikult olla healoomulised või siis vastupidi, patogeensed, välja arvatud juhul, kui kusagil genoomis, epigenoomis või keskkonnas leidub kompensatoorne element. Patoloogilise tagajärjega CNV-d on suurema tõenäosusega suured (hõlmates mitmeid geene või regulaatorelemente) ja kromosoomid sisaldavad rohkem/vähem genoomset materjali kui tavaliselt.

## Uurimismeetodid

Deletsioone ja duplikatsioone saab leida, kui võrrelda referents- ja uuritavat materjali. 1970. aastate keskel kasutati molekulaargeneetikas sellist kaudset meetodit nagu *Southern blotting*, mis mõõtis väiksemaid DNA koguse erinevusi. Hiljem hübridiseeriti molekulaarseid kromosoomiproove, eriti kasutati fluorestseeruvat *in situ* hübridisatsiooni (lühend FISH), millega sai määrata segmentaalseid deletsioone, duplikatsioone ja ümberkorraldusi.

2009. aasta seisuga olid üle-genoomsed CNV kataloogid tehtud inimesele, hiirele, rotile, šimpansile, reesusmakaagile ning *Drosophila melanogaster*'ile. Selleks kasutati aCGH meetodit (inglise keeles *array comparative genome hybridisation*), kas siis kasutades BACi (inglise keeles *bacterial artificial chromosome*) või oligonukleotiide. Leitavate koopiaarvu varieeruvuste arv sõltub uurimisel kasutatud meetodist. Primaatidest šimpansil ja makaagil kattuvad CNV-d inimeste omadega vastavalt 22% ja 25%.

On koostatud mõned CNV andmebaasid, näiteks DGV, ning välja töötatud mitu meetodit, et kinnitada või replitseerida ennustatud CNV-d. Nendeks meetoditeks on näiteks kvantitatiivne PCR (inglise keeles *quantitative polymerase chain reaction*, lühend qPCR), PRT (inglise keeles *paralog-ratio testing*) ja MCC (inglise keeles *molecular copy number counting*). qPCRi kasutatakse suuremahulistes CNV analüüsides, et määrata kindla CNV seotus mingi haigusega, tihti ka kinnitusmeetodina arvutuslikult ennustatud lookusele. PRT kasutab ühte paari praimereid, et leida, kui sarnased on järjestuselemendid sihtmärklookuse, mis sisaldab CNV-d, ja referentslookuse vahel, mis ei sisalda CNV-d. MCC on lihtne test, mis kasutab ära PCRi võimekust detekteerida DNA üksikuid molekule märklaudjärjestuses, milles on toimunud deletsioon. Vähenenud molekulide arv loendatakse ning seda võrreldakse teiste sihtmärk järjestustega. Kas kindel koopiaarvu varieeruvus on pärilik, selgitavad välja perekonnauuringud.

## CNV-de uurimine Eestis

Geenivaramus uuriti CNV-analüüsidega uusi geene, mis oleksid seotud haruldaste epilepsia sündroomidega. Tartu Ülikooli molekulaar- ja rakubioloogia instituudi inimese molekulaargeneetika uurimisgrupis kasutatakse koopiaarvu varieeruvuste analüüsi leidmaks uusi platsentas ekspresseeritavaid geene, mis on tähtsad raseduse õnnestumiseks.

## Viited