Ενισχυτής (γενετική)

Στη γενετική, ένας **ενισχυτής** είναι μια μικρή περιοχή του DNA (50–1500 ζεύγη βάσεων) που μπορεί να δεσμευτεί από ενεργοποιητές πρωτεϊνών για να αυξηθεί η πιθανότητα να συμβεί μεταγραφή ενός συγκεκριμένου γονιδίου.. Αυτές οι πρωτεΐνες αναφέρονται συνήθως ως παράγοντες μεταγραφής. Οι ενισχυτές είναι cis δραστικοί. Μπορούν να βρίσκονται σε απόσταση έως και 1 Mbp (1.000.000 ζεύγη βάσεων) μακριά από το γονίδιο, ανάντη ή κατάντη από την αρχική θέση. Υπάρχουν εκατοντάδες χιλιάδες ενισχυτές στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Βρίσκονται τόσο σε προκαρυώτες όσο και σε ευκαρυώτες.
Η πρώτη ανακάλυψη ενός ευκαρυωτικού ενισχυτή ήταν στο γονίδιο βαριάς αλυσίδας ανοσοσφαιρίνης το 1983. Αυτός ο ενισχυτής, που βρίσκεται στο μεγάλο εσώνιο, παρείχε μια εξήγηση για τη μεταγραφική ενεργοποίηση των αναδιαταγμένων προαγωγέων γονιδίου Vh, ενώ οι μη αναδιαταγμένοι προαγωγείς Vh παρέμειναν ανενεργοί. Πρόσφατα, έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται ενισχυτές σε ορισμένες ιατρικές καταστάσεις, για παράδειγμα, στη μυελοκαταστολή. Από το 2022, οι επιστήμονες έχουν χρησιμοποιήσει τεχνητή νοημοσύνη για να σχεδιάσουν συνθετικούς ενισχυτές και να τους εφαρμόσουν σε ζωικά συστήματα, πρώτα σε μια κυτταρική γραμμή, και ένα χρόνο αργότερα επίσης in vivo.
## Θέσεις
Στα ευκαρυωτικά κύτταρα η δομή του συμπλέγματος χρωματίνης του DNA διπλώνεται με τρόπο που μιμείται λειτουργικά την υπερτυλιγμένη κατάσταση που χαρακτηρίζει το προκαρυωτικό DNA, οπότε αν και ο ενισχυτής DNA μπορεί να απέχει πολύ από το γονίδιο με γραμμικό τρόπο, είναι χωρικά κοντά στον προαγωγέα και στο γονίδιο. Αυτό του επιτρέπει να αλληλεπιδρά με τους γενικούς παράγοντες μεταγραφής και την RNA πολυμεράση II. Ο ίδιος μηχανισμός ισχύει για τα τους καταστολείς στο ευκαρυωτικό γονιδίωμα. Οι αποσιωπητές (Silencers) είναι ανταγωνιστές ενισχυτών (enhancers) που, όταν συνδέονται με τους κατάλληλους μεταγραφικούς παράγοντες που ονομάζονται καταστολείς (repressors), καταστέλλουν τη μεταγραφή του γονιδίου. Οι αποσιωπητές και οι ενισχυτές μπορεί να βρίσκονται σε κοντινή απόσταση μεταξύ τους, ή μπορεί ακόμη και να βρίσκονται στην ίδια περιοχή που διαφοροποιούνται μόνο από τον παράγοντα μεταγραφής με τον οποίο συνδέεται η περιοχή.
Ένας ενισχυτής μπορεί να βρίσκεται ανοδικά ή καθοδικά του γονιδίου που ρυθμίζει. Επιπλέον, ένας ενισχυτής δεν χρειάζεται να βρίσκεται κοντά στη θέση έναρξης της μεταγραφής για να επηρεάσει τη μεταγραφή, καθώς ορισμένοι έχουν βρεθεί τοποθετημένοι αρκετές εκατοντάδες χιλιάδες ζεύγη βάσεων ανοδικά ή καθοδικά της θέσης έναρξης . Οι ενισχυτές δεν δρουν στην ίδια την περιοχή του προαγωγέα, αλλά δεσμεύονται από ενεργοποιές πρωτεΐνες (activator proteins). Αυτές οι ενεργοποιές πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με το σύμπλεγμα μεσολαβητή (mediator complex), το οποίο στρατολογεί την πολυμεράση II και τους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες που στη συνέχεια αρχίζουν να μεταγράφουν τα γονίδια. Ενισχυτές μπορούν επίσης να βρεθούν μέσα στα εσώνια. Ο προσανατολισμός ενός ενισχυτή μπορεί ακόμη και να αντιστραφεί χωρίς να επηρεαστεί η λειτουργία του. Επιπλέον, ένας ενισχυτής μπορεί να αποκοπεί και να εισαχθεί αλλού στο χρωμόσωμα και να επηρεάσει ακόμα τη μεταγραφή των γονιδίων. Αυτός είναι ένας λόγος που τα πολυμορφισμοί εσωνίων μπορεί να έχουν αποτελέσματα, αν και δεν είναι μεταφρασμένα. Οι ενισχυτές μπορούν επίσης να βρεθούν στην εξονική περιοχή ενός άσχετου γονιδίου και μπορεί να δράσουν σε γονίδια σε άλλο χρωμόσωμα.
Οι ενισχυτές δεσμεύονται από την οικογένεια συνενεργοποιητών P300-CBP και η θέση τους μπορεί να προβλεφθεί από την αλληλούχιση ChIP (ChIP-seq) έναντι αυτής της οικογένειας συνενεργοποιητών.
### Ρόλος στη γονιδιακή έκφραση

Η γονιδιακή έκφραση στα θηλαστικά ρυθμίζεται από πολλά cis ρυθμιστικά στοιχεία (cis-regulatory elements), συμπεριλαμβανομένων των προαγωγέων του πυρήνα και των εγγύς στοιχείων προαγωγέα που βρίσκονται κοντά στις αρχικές θέσεις μεταγραφής των γονιδίων. Οι κεντρικοί προαγωγείς επαρκούν για να κατευθύνουν την έναρξη της μεταγραφής, αλλά γενικά έχουν χαμηλή βασική δραστηριότητα. Άλλες σημαντικές ρυθμιστικές μονάδες cis εντοπίζονται σε περιοχές DNA που είναι απομακρυσμένες από τις θέσεις έναρξης της μεταγραφής. Αυτές περιλαμβάνουν ενισχυτές, αποσιωπητές, μονωτές και στοιχεία πρόσδεσης. Μεταξύ αυτού του καταιγισμού στοιχείων, οι ενισχυτές και οι συνδεμένοι παράγοντες μεταγραφής έχουν πρωταγωνιστικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Ένας ενισχυτής εντοπισμένος σε μια περιοχή DNA μακριά από τον προαγωγέα ενός γονιδίου μπορεί να έχει πολύ μεγάλη επίδραση στη γονιδιακή έκφραση, με ορισμένα γονίδια να υφίστανται έως και 100 φορές αυξημένη έκφραση λόγω ενός ενεργοποιημένου ενισχυτή.
Οι ενισχυτές είναι περιοχές του γονιδιώματος που είναι κύρια γονιδιακά ρυθμιστικά στοιχεία. Οι ενισχυτές ελέγχουν προγράμματα γονιδιακής έκφρασης ειδικά για κυτταρικό τύπο, τις περισσότερες φορές εκτελώντας βρόχους σε μεγάλες αποστάσεις για να έρθουν σε φυσική εγγύτητα με τους προαγωγείς των γονιδίων-στόχων τους. Ενώ υπάρχουν εκατοντάδες χιλιάδες περιοχές DNA ενισχυτή,  για έναν συγκεκριμένο τύπο ιστού μόνο συγκεκριμένοι ενισχυτές έρχονται σε εγγύτητα με τους προαγωγείς που ρυθμίζουν. Σε μια μελέτη των νευρώνων του φλοιού του εγκεφάλου, βρέθηκαν 24.937 βρόχοι, που φέρνουν ενισχυτές στους προαγωγείς-στόχους τους. Πολλαπλοί ενισχυτές, ο καθένας συχνά σε δεκάδες ή εκατοντάδες χιλιάδες νουκλεοτίδια απομακρυσμένα από τα γονίδια-στόχους τους, συνδέονται με τους προαγωγείς του γονιδίου-στόχου τους και μπορούν να συντονιστούν μεταξύ τους για να ελέγξουν την έκφραση του κοινού γονιδίου-στόχου τους.
Η σχηματική απεικόνιση σε αυτό το τμήμα δείχνει έναν ενισχυτή να περιστρέφεται για να έρθει σε στενή φυσική εγγύτητα με τον προαγωγέα ενός γονιδίου-στόχου. Ο βρόχος σταθεροποιείται από ένα διμερές ενός πρωτεϊνικού συνδέσμου (π.χ. διμερές του CTCF ή YY1), με ένα μέλος του διμερούς αγκυρωμένο στο μοτίβο πρόσδεσής του στον ενισχυτή και το άλλο μέλος αγκυρωμένο στο μοτίβο σύνδεσής του στον προαγωγέα (που αντιπροσωπεύεται από τα κόκκινα ζιγκ-ζαγκ στην εικόνα). Αρκετοί ειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες λειτουργίας των κυττάρων (υπάρχουν περίπου 1.600 μεταγραφικοί παράγοντες σε ένα ανθρώπινο κύτταρο ) συνδέονται γενικά με ειδικά μοτίβα σε έναν ενισχυτή  και ένας μικρός συνδυασμός αυτών των μεταγραφικών παραγόντων που συνδέονται με τον ενισχυτή, όταν έρχονται κοντά σε έναν προαγωγέα μέσω βρόχου DNA, διέπουν το επίπεδο μεταγραφής του γονιδίου-στόχου. Ο μεσολαβητής (ένα σύμπλεγμα που συνήθως αποτελείται από περίπου 26 πρωτεΐνες σε μια δομή αλληλεπίδρασης) επικοινωνεί με ρυθμιστικά σήματα από μεταγραφικούς παράγοντες δεσμευμένους στο DNA ενισχυτή απευθείας στο ένζυμο RNA πολυμεράση II (pol II) που είναι συνδεδεμένο με τον προαγωγέα.
Οι ενισχυτές, όταν είναι ενεργοί, μεταγράφονται γενικά και από τους δύο κλώνους του DNA με τις RNA πολυμεράσες που δρουν σε δύο διαφορετικές κατευθύνσεις, παράγοντας δύο RNA ενισχυτές (Enhancers RNA, eRNAs) όπως απεικονίζεται στο Σχήμα. Όπως τα mRNAs, αυτά τα eRNAs προστατεύονται συνήθως από το κάλυμμα 5′ (5′ cap). Ένας ανενεργός ενισχυτής μπορεί να δεσμεύεται από έναν ανενεργό παράγοντα μεταγραφής. Η φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα μπορεί να τον ενεργοποιήσει και αυτός ο ενεργοποιημένος παράγοντας μεταγραφής μπορεί στη συνέχεια να ενεργοποιήσει τον ενισχυτή στον οποίο είναι συνδεδεμένος (βλ. μικρό κόκκινο αστέρι που αντιπροσωπεύει τη φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα που συνδέεται με τον ενισχυτή στην εικόνα). Ένας ενεργοποιημένος ενισχυτής ξεκινά τη μεταγραφή του RNA του πριν ενεργοποιήσει τη μεταγραφή του αγγελιαφόρου RNA από το γονίδιο-στόχο του.
## Θεωρίες
, υπάρχουν δύο διαφορετικές θεωρίες σχετικά με την επεξεργασία πληροφοριών που λαμβάνει χώρα σε ενισχυτές:
* Ενισχυοσώματα (Enhanceosomes) – βασίζονται σε εξαιρετικά συνεργάσιμη, συντονισμένη δράση και μπορούν να απενεργοποιηθούν με μεμονωμένες σημειακές μεταλλάξεις που μετακινούν ή αφαιρούν τις θέσεις δέσμευσης μεμονωμένων πρωτεϊνών.
* Ευέλικτες ανακοινώσεις (Flexible billboards) – λιγότερο ολοκληρωμένες, πολλαπλές πρωτεΐνες ρυθμίζουν ανεξάρτητα την έκφραση των γονιδίων και το άθροισμά τους διαβάζεται από τον βασικό μεταγραφικό μηχανισμό.
## Παραδείγματα στο ανθρώπινο γονιδίωμα
### HACNS1
Το HACNS1 (που είναι επίσης γνωστό ως CENTG2 και βρίσκεται στην ανθρώπινη επιταχυνόμενη περιοχή 2 (Human Accelerated Region 2) είναι ένας γονιδιακός ενισχυτής "που μπορεί να συνέβαλε στην εξέλιξη του μοναδικά αντίθετου ανθρώπινου αντίχειρα, και πιθανώς επίσης στις τροποποιήσεις στον αστραγάλο ή στο πόδι που επιτρέπουν στους ανθρώπους να περπατούν με δύο πόδια". Τα μέχρι σήμερα στοιχεία δείχνουν ότι από τις 110.000 αλληλουχίες ενισχυτών γονιδίων που εντοπίστηκαν στο ανθρώπινο γονιδίωμα, το HACNS1 έχει υποστεί τη μεγαλύτερη αλλαγή κατά τη διάρκεια της εξέλιξης των ανθρώπων μετά τη διάσπαση με τους προγόνους του χιμπατζή.
### GADD45G
Έχει περιγραφεί ένας ενισχυτής κοντά στο γονίδιο GADD45g που μπορεί να ρυθμίζει την ανάπτυξη του εγκεφάλου σε χιμπατζήδες και άλλα θηλαστικά, αλλά όχι στον άνθρωπο. Ο ρυθμιστής GADD45G σε ποντίκια και χιμπατζήδες είναι ενεργός σε περιοχές του εγκεφάλου όπου βρίσκονται τα κύτταρα που σχηματίζουν τον φλοιό, τον κοιλιακό πρόσθιο εγκέφαλο και τον θάλαμο και μπορεί να καταστέλλουν περαιτέρω νευρογένεση. Η απώλεια του ενισχυτή GADD45G στους ανθρώπους μπορεί να συμβάλει στην αύξηση ορισμένων νευρωνικών πληθυσμών και στην επέκταση του προσθίου εγκεφάλου στους ανθρώπους.
## Στην αναπτυξιακή βιολογία
Η ανάπτυξη, η διαφοροποίηση και η ανάπτυξη των κυττάρων και των ιστών απαιτούν επακριβώς ρυθμισμένα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης. Οι ενισχυτές λειτουργούν ως cis-ρυθμιστικά στοιχεία για να μεσολαβούν τόσο στον χωρικό όσο και στον χρονικό έλεγχο της ανάπτυξης ενεργοποιώντας τη μεταγραφή σε συγκεκριμένα κύτταρα ή/και καταστέλλοντάς την σε άλλα κύτταρα. Έτσι, ο συγκεκριμένος συνδυασμός παραγόντων μεταγραφής και άλλων πρωτεϊνών που δεσμεύουν το DNA σε έναν αναπτυσσόμενο ιστό ελέγχει ποια γονίδια θα εκφραστούν σε αυτόν τον ιστό. Οι ενισχυτές επιτρέπουν στο ίδιο γονίδιο να χρησιμοποιείται σε διάφορες διαδικασίες στον χώρο και στον χρόνο.
### Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός
Παραδοσιακά, οι ενισχυτές ταυτοποιούνταν με τεχνικές παγίδευσης του ενισχυτή, χρησιμοποιώντας ένα γονίδιο αναφοράς ή με συγκριτική ανάλυση αλληλουχίας και υπολογιστική γονιδιωματική. Σε γενετικά βατά πρότυπα όπως η μύγα φρούτων *Drosophila melanogaster*, για παράδειγμα, ένα κατασκεύασμα αναφοράς όπως το *lacZ* μπορεί τυχαία να ενσωματωθεί σε το γονιδίωμα χρησιμοποιώντας ένα μεταθετόνιο στοιχείο P. Εάν το γονίδιο αναφοράς ενσωματωθεί κοντά σε έναν ενισχυτή, η έκφρασή του θα αντανακλά το πρότυπο έκφρασης που καθοδηγείται από αυτόν τον ενισχυτή. Έτσι, η χρώση των μυγών για έκφραση ή δραστηριότητα του LacZ και η κλωνοποίηση της αλληλουχίας που περιβάλλει τη θέση ενσωμάτωσης επιτρέπει την αναγνώριση της αλληλουχίας του ενισχυτή.
Η ανάπτυξη γονιδιωματικών και επιγονιδιωματικών τεχνολογιών, ωστόσο, έχει αλλάξει δραματικά τις προοπτικές για την ανακάλυψη των cis ρυθμιστικών μονάδων (cis-regulatory modules, CRM). Οι μέθοδοι αλληλούχισης επόμενης γενιάς (Next-generation sequencing, NGS) επιτρέπουν πλέον λειτουργικές αναλύσεις ανακάλυψης CRM υψηλής απόδοσης και τις απέραντα αυξανόμενες ποσότητες διαθέσιμων δεδομένων, συμπεριλαμβανομένων βιβλιοθηκών μεγάλης κλίμακας των μοτίβων της θέσης σύνδεσης του μεταγραφικού παράγοντα (transcription factor-binding site , TFBS), των συλλογών σχολιασμένων, επικυρωμένων CRM και των εκτεταμένων επιγενετικών δεδομένων σε πολλούς τύπους κυττάρων, καθιστούν την ακριβή υπολογιστική ανακάλυψη CRM εφικτό στόχο. Ένα παράδειγμα προσέγγισης που βασίζεται στο NGS που ονομάζεται αλληλούχιση DNάσης (DNase-seq) επέτρεψε την αναγνώριση περιοχών που έχουν εξαντληθεί από νουκλεόσωμα ή ανοιχτών περιοχών χρωματίνης, οι οποίες μπορεί να περιέχουν CRM. Πιο πρόσφατα αναπτύχθηκαν τεχνικές όπως η αλληλούχιση ATAC (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, ATAC-seq) που απαιτούν λιγότερο υλικό εκκίνησης. Οι περιοχές με εξάντληση νουκλεοσωμάτων μπορούν να αναγνωριστούν in vivo μέσω της έκφρασης της μεθυλάσης Dam, επιτρέποντας μεγαλύτερο έλεγχο της αναγνώρισης ειδικού κυτταρικού τύπου ενισχυτή.
Οι υπολογιστικές μέθοδοι περιλαμβάνουν συγκριτική γονιδιωματική (comparative genomics), ομαδοποίηση γνωστών ή προβλεπόμενων θέσεων δέσμευσης TF και εποπτευόμενες προσεγγίσεις μηχανικής μάθησης που έχουν εκπαιδευτεί σε γνωστά CRM.
Όλες αυτές οι μέθοδοι έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικές για την ανακάλυψη CRM, αλλά η καθεμία έχει τις δικές της εκτιμήσεις και περιορισμούς και η καθεμία υπόκειται σε μεγαλύτερο ή μικρότερο αριθμό ψευδώς θετικών ταυτοποιήσεων.
Στην προσέγγιση συγκριτικής γονιδιωματικής, η διατήρηση αλληλουχίας των μη κωδικοποιητικών περιοχών μπορεί να είναι ενδεικτική των ενισχυτών. Οι αλληλουχίες από πολλά είδη ευθυγραμμίζονται και οι διατηρημένες περιοχές προσδιορίζονται υπολογιστικά. Οι αναγνωρισμένες αλληλουχίες μπορούν στη συνέχεια να συνδεθούν σε ένα γονίδιο αναφοράς όπως η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη ή lacZ για να προσδιοριστεί το μοτίβο της γονιδιακής έκφρασης "in vivo" που παράγεται από τον ενισχυτή όταν εγχέεται σε ένα έμβρυο. Η έκφραση του mRNA του ανταποκριτή μπορεί να οπτικοποιηθεί με επιτόπιο υβριδισμός, που παρέχει μια πιο άμεση μέτρηση της δραστικότητας του ενισχυτή, αφού δεν υπόκειται στην πολυπλοκότητα της μετάφρασης και της αναδίπλωση της πρωτεΐνης. Αν και πολλά στοιχεία έχουν επισημάνει τη διατήρηση της αλληλουχίας για κρίσιμους αναπτυξιακούς ενισχυτές, άλλες εργασίες έχουν δείξει ότι η λειτουργία των ενισχυτών μπορεί να διατηρηθεί με ελάχιστη ή καθόλου διατήρηση της πρωτογενούς αλληλουχίας. Για παράδειγμα, οι ενισχυτές "RET" στους ανθρώπους έχουν πολύ μικρή διατήρηση της αλληλουχίας σε σχέση με εκείνους στο ψάρι-ζέβρα, ωστόσο οι αλληλουχίες και των δύο ειδών παράγουν σχεδόν πανομοιότυπα μοτίβα έκφρασης γονιδίου αναφοράς στο ψάρι-ζέβρα. Ομοίως, σε έντομα με μεγάλη απόκλιση (χωρισμένα κατά περίπου 350 εκατομμύρια χρόνια), παρόμοια μοτίβα γονιδιακής έκφρασης πολλών βασικών γονιδίων βρέθηκε ότι ρυθμίζονται μέσω παρόμοιας σύνθεσης CRM, αν και αυτά τα CRM δεν δείχνουν καμία αξιόλογη διατήρηση αλληλουχίας ανιχνεύσιμη με τυπικές μεθόδους στοίχισης αλληλουχιών, όπως π.χ. το BLAST.
### Στην κατάτμηση των εντόμων
Οι ενισχυτές που καθορίζουν την πρώιμη κατάτμηση σε έμβρυα της *Drosophila melanogaster* είναι από τους καλύτερα χαρακτηρισμένους αναπτυξιακούς ενισχυτές. Στο πρώιμο έμβρυο της μύγας, οι παράγοντες μεταγραφής γονιδίου χάσματος (gap gene) είναι υπεύθυνοι για την ενεργοποίηση και την καταστολή ενός αριθμού γονιδίων μεταμερισμού (segmentation genes), όπως τα γονίδια κανόνα ζεύγους (pair rule genes). Τα γονίδια χάσματος εκφράζονται σε μπλοκ κατά μήκος του πρόσθιου-οπίσθιου άξονα της μύγας μαζί με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες μητρικής επίδρασης (maternal effect), δημιουργώντας έτσι ζώνες εντός των οποίων εκφράζονται διαφορετικοί συνδυασμοί παραγόντων μεταγραφής. Τα γονίδια κανόνων ζεύγους διαχωρίζονται το ένα από το άλλο από κύτταρα που δεν εκφράζονται. Επιπλέον, οι λωρίδες έκφρασης για διαφορετικά γονίδια κανόνων ζεύγους αντισταθμίζονται από μερικές διαμέτρους κυττάρων η μία από την άλλη. Έτσι, μοναδικοί συνδυασμοί έκφρασης γονιδίων κανόνα ζεύγους δημιουργούν χωρικές περιοχές κατά μήκος του πρόσθιου-οπίσθιου άξονα για τη δημιουργία καθενός από τα 14 μεμονωμένα τμήματα. Ο ενισχυτής 480 bp που είναι υπεύθυνος για την οδήγηση της αιχμηρής λωρίδας δύο από τα γονίδια των κανόνων ζεύγους * even-skipped* (*eve*) έχει χαρακτηριστεί καλά. Ο ενισχυτής περιέχει 12 διαφορετικές θέσεις δέσμευσης για τους μητρικούς παράγοντες και τους παράγοντες μεταγραφής των γονιδίων χάσματος. Οι θέσεις ενεργοποίησης και καταστολής επικαλύπτονται με τη σειρά. Η *Eve* εκφράζεται μόνο σε μια στενή λωρίδα κυττάρων που περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις των ενεργοποιητών και χαμηλή συγκέντρωση των καταστολέων για αυτήν την αλληλουχία ενισχυτή. Άλλες περιοχές ενισχυτή οδηγούν την έκφραση *eve* σε 6 άλλες λωρίδες στο έμβρυο.
### Στη διαμόρφωση σπονδυλωτών
Η δημιουργία αξόνων σώματος είναι ένα κρίσιμο βήμα στην ανάπτυξη των ζώων. Κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης ποντικού, το Nodal, ένας συνδέτης υπεροικογένειας αυξητικoύ παράγοντα μεταμόρφωσης -β, είναι ένα βασικό γονίδιο που εμπλέκεται στη μορφογένεση τόσο του πρόσθιου-οπίσθιου άξονα όσο και του άξονα αριστερά-δεξιά του πρώιμου εμβρύου. Το γονίδιο *Nodal* περιέχει δύο ενισχυτές: τον εγγύς ενισχυτή επιβλαστών (Proximal Epiblast Enhancer, PEE) και τον Ασύμμετρο Ενισχυτή (Asymmetric Enhancer, ASE). Το PEE βρίσκεται ανάντη του γονιδίου Nodal και οδηγεί την έκφραση "Nodal" στο τμήμα της πρωτογενούς αύλακας που θα διαφοροποιηθεί στον κόμβο (αναφέρεται επίσης ως ο πρωτογενής κόμβος). Το PEE ενεργοποιεί την έκφραση Nodal ως απόκριση σε συνδυασμό σηματοδότησης Wnt συν ένα δεύτερο, άγνωστο σήμα. Έτσι, ένα μέλος της οικογένειας παραγόντων μεταγραφής LEF/TCF πιθανότατα συνδέεται σε μια θέση δέσμευσης TCF στα κύτταρα στον κόμβο. Η διάχυση του Nodal μακριά από τον κόμβο σχηματίζει μια κλίση που στη συνέχεια διαμορφώνει τον εκτεινόμενο πρόσθιο-οπίσθιο άξονα του εμβρύου. Το ASE είναι ένας εσωνικός ενισχυτής που δεσμεύεται από τον μεταγραφικό παράγοντα Fox1. Πρώιμα στην ανάπτυξη, η έκφραση Nodal που βασίζεται στο Fox1 δημιουργεί το σπλαχνικό ενδόδερμα. Αργότερα στην ανάπτυξη, η δέσμευση του Fox1 στο ASE οδηγεί την έκφραση "Nodal" στην αριστερή πλευρά της πλάγιας πλάκας μεσοδέρματος, καθιερώνοντας έτσι ασυμμετρία αριστερά-δεξιά απαραίτητη για την ασύμμετρη ανάπτυξη οργάνων στο μεσόδερμα.
Η δημιουργία τριών βλαστικών στοιβάδων (germ layers) κατά τη γαστριδίωση (gastrulation) είναι ένα άλλο κρίσιμο βήμα στην ανάπτυξη των ζώων. Κάθε μία από τα τρεις βλαστικές στοιβάδες έχει μοναδικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης που προάγουν τη διαφοροποίηση και την ανάπτυξή τους. Το ενδόδερμα (endoderm) προσδιορίζεται νωρίς στην ανάπτυξη με την έκφραση *Gata4* και το Gata4 συνεχίζει να κατευθύνει τη μορφογένεση του εντέρου αργότερα. Η έκφραση "Gata4" ελέγχεται στο πρώιμο έμβρυο από έναν εσωνικό ενισχυτή που δεσμεύει έναν άλλο μεταγραφικό παράγοντα της περιοχής φουρκέτας (forkhead), το FoxA2. Αρχικά ο ενισχυτής οδηγεί σε ευρεία γονιδιακή έκφραση σε όλο το έμβρυο, αλλά η έκφραση περιορίζεται γρήγορα στο ενδόδερμα, υποδηλώνοντας ότι άλλοι καταστολείς μπορεί να εμπλέκονται στον περιορισμό του. Στα τέλη της ανάπτυξης, ο ίδιος ενισχυτής περιορίζει την έκφραση στους ιστούς που θα γίνουν το στομάχι και το πάγκρεας. Ένας επιπλέον ενισχυτής είναι υπεύθυνος για τη διατήρηση της έκφρασης *Gata4* στο ενδόδερμα κατά τα ενδιάμεσα στάδια της ανάπτυξης του εντέρου.

### Οι πολλαπλοί ενισχυτές προάγουν την αναπτυξιακή ευρωστία
Ορισμένα γονίδια που εμπλέκονται σε κρίσιμες αναπτυξιακές διεργασίες περιέχουν πολλαπλούς ενισχυτές αλληλεπικαλυπτόμενων λειτουργιών. Δευτερεύοντες ενισχυτές, ή "ενισχυτές σκιάς", μπορεί να βρεθούν πολλές χιλιάδες βάσεις μακριά από τον κύριο ενισχυτή (ο "κύριος" αναφέρεται συνήθως στον πρώτο ενισχυτή που ανακαλύφθηκε, ο οποίος είναι συχνά πιο κοντά στο γονίδιο που ρυθμίζει). Από μόνος του, κάθε ενισχυτής οδηγεί σχεδόν πανομοιότυπα μοτίβα γονιδιακής έκφρασης. Είναι πραγματικά περιττοί οι δύο ενισχυτές; Πρόσφατη εργασία έχει δείξει ότι πολλαπλοί ενισχυτές επιτρέπουν στις μύγες των φρούτων να επιβιώνουν από περιβαλλοντικές διαταραχές, όπως η αύξηση της θερμοκρασίας. Όταν αυξάνεται σε υψηλή θερμοκρασία, ένας μεμονωμένος ενισχυτής μερικές φορές αποτυγχάνει να οδηγήσει το πλήρες πρότυπο έκφρασης, ενώ η παρουσία και των δύο ενισχυτών επιτρέπει τη φυσιολογική γονιδιακή έκφραση.

## Εξέλιξη αναπτυξιακών μηχανισμών
Ένα θέμα της έρευνας στην εξελικτική αναπτυξιακή βιολογία (evolutionary developmental biology, "evo-devo") είναι η διερεύνηση του ρόλου των ενισχυτών και άλλων ρυθμιστικών στοιχείων cis στην παραγωγή μορφολογικών αλλαγών μέσω των αναπτυξιακών διαφορών μεταξύ των ειδών.
### ''Pitx1'' γαστερόστεου
Πρόσφατη εργασία διερεύνησε τον ρόλο των ενισχυτών στις μορφολογικές αλλαγές στα ψάρια τριάκανθου γαστερόστεου. Οι γαστερόστεοι υπάρχουν τόσο σε θαλάσσιο περιβάλλον όσο και σε περιβάλλον γλυκού νερού, αλλά οι γαστερόστεοι σε πολλούς πληθυσμούς γλυκού νερού έχουν χάσει εντελώς τα πυελικά τους πτερύγια (αποφύσεις ομόλογες με το οπίσθιο άκρο των τετραπόδων). *Pitx1* είναι ένα γονίδιο ομοιοπλαισίου (homeobox) που εμπλέκεται στην ανάπτυξη του οπίσθιου άκρου σε σπονδυλωτά. Προκαταρκτικές γενετικές αναλύσεις έδειξαν ότι οι αλλαγές στην έκφραση αυτού του γονιδίου ήταν υπεύθυνες για τη μείωση της πυέλου στους γαστερόστεους. Τα ψάρια που εκφράζουν μόνο το αλληλόμορφο του γλυκού νερού του *Pitx1* δεν έχουν πυελική ράχη, ενώ τα ψάρια που εκφράζουν ένα θαλάσσιο αλληλόμορφο διατηρούν τις πυελικές ράχες. Ένας πιο εμπεριστατωμένος χαρακτηρισμός έδειξε ότι μια αλληλουχία ενισχυτή 500 ζευγών βάσεων είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση της έκφρασης "Pitx1" στο οπίσθιο πτερύγιο. Αυτός ο ενισχυτής βρίσκεται κοντά σε μια χρωμοσωμική εύθραυστη θέση—μια αλληλουχία DNA που είναι πιθανό να σπάσει και επομένως πιο πιθανό να μεταλλαχθεί ως αποτέλεσμα ανακριβούς επιδιόρθωσης  του DNA. Αυτή η εύθραυστη θέση έχει προκαλέσει επαναλαμβανόμενες, ανεξάρτητες απώλειες του ενισχυτή που είναι υπεύθυνος για την καθοδήγηση της έκφρασης *Pitx1* στις ακάνθες της πυέλου σε απομονωμένο πληθυσμό γλυκού νερού και χωρίς αυτόν τον ενισχυτή, τα ψάρια του γλυκού νερού αποτυγχάνουν να αναπτύξουν ακάνθες στην πύελο.
### Στην εξέλιξη του μοτίβου των φτερών της ''Drosophila''
Τα μοτίβα μελάγχρωσης παρέχουν μία από τις πιο εντυπωσιακές και εύκολα αξιολογημένες διαφορές μεταξύ διαφορετικών ειδών ζώων. Η χρώση του φτερού της *Drosophila* έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα ιδιαίτερα επιδεκτικό σύστημα για τη μελέτη της ανάπτυξης πολύπλοκων φαινοτύπων μελάγχρωσης. Το φτερό *Drosophila guttifera* έχει 12 σκούρες κηλίδες μελάγχρωσης και 4 πιο ανοιχτόχρωμες γκρι μεμβράνες. Οι χρωστικές κηλίδες προκύπτουν από την έκφραση του *κίτρινου* γονιδίου, το προϊόν του οποίου παράγει μαύρη μελανίνη. Πρόσφατη εργασία έχει δείξει ότι δύο ενισχυτές του *κίτρινου* γονιδίου παράγουν γονιδιακή έκφραση με αυτό ακριβώς το μοτίβο – ο ενισχυτής φλεβικής κηλίδας οδηγεί την έκφραση γονιδίου αναφοράς στις 12 κηλίδες και ο ενισχυτής απόχρωσης μεσοφλεβών οδηγεί την έκφραση αναφοράς στα 4 διακριτά επιρράματα (patches). Αυτοί οι δύο ενισχυτές ανταποκρίνονται στην οδό σηματοδότησης Wnt, η οποία ενεργοποιείται από την έκφραση *χωρίς φτερά (wingless)* σε όλες τις χρωστικές θέσεις. Έτσι, στην εξέλιξη της πολύπλοκης μελάγχρωσης φαινότυπος, το γονίδιο της *κίτρινης* χρωστικής εξέλιξε ενισχυτές που ανταποκρίνονται στο σήμα χωρίς φτερά και η έκφραση *χωρίς φτερά* εξελίχθηκε σε νέες θέσεις για να παράγει νέα μοτίβα φτερών.
### Σε φλεγμονές και καρκίνο
Κάθε κύτταρο τυπικά περιέχει αρκετές εκατοντάδες μιας ειδικής κατηγορίας ενισχυτών που εκτείνονται σε αλληλουχίες DNA μήκους πολλών κιλοβάσεων, που ονομάζονται "υπερενισχυτές (super-enhancers)". Αυτοί οι ενισχυτές περιέχουν μεγάλο αριθμό θέσεων δέσμευσης επαγώγιμων μεταγραφικών παραγόντων ειδικών για την αλληλουχία, και ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση των κυττάρων. Κατά τη διάρκεια της φλεγμονής, ο παράγοντας μεταγραφής NF-κB διευκολύνει την αναδιαμόρφωση της χρωματίνης με τρόπο που ανακατανέμει επιλεκτικά συμπαράγοντες από ενισχυτές υψηλής κατάληψης, καταστέλλοντας έτσι τα γονίδια που εμπλέκονται στη διατήρηση της κυτταρικής ταυτότητας των οποίων την έκφραση ενισχύουν. Ταυτόχρονα, αυτή η αναδιαμόρφωση και ανακατανομή που βασίζεται στο F-κΒ ενεργοποιεί άλλους ενισχυτές που καθοδηγούν τις αλλαγές στην κυτταρική λειτουργία μέσω της φλεγμονής. Ως αποτέλεσμα, η φλεγμονή επαναπρογραμματίζει τα κύτταρα, αλλάζοντας τις αλληλεπιδράσεις τους με τον υπόλοιπο ιστό και με το ανοσοποιητικό σύστημα. Στον καρκίνο, οι πρωτεΐνες που ελέγχουν τη δραστηριότητα του NF-κB είναι απορυθμισμένες, επιτρέποντας στα κακοήθη κύτταρα να μειώνουν την εξάρτησή τους από τις αλληλεπιδράσεις με τον τοπικό ιστό και εμποδίζοντας την παρακολούθηση από το ανοσοποιητικό σύστημα.

## Σχεδιασμός ενισχυτών στη συνθετική βιολογία
Τα συνθετικά ρυθμιστικά στοιχεία όπως οι ενισχυτές υπόσχονται να είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την κατεύθυνση των προϊόντων γονιδίων σε συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους προκειμένου να θεραπεύσουν ασθένειες ενεργοποιώντας ωφέλιμα γονίδια ή αναστέλλοντας τις ανώμαλες κυτταρικές καταστάσεις.
Από το 2022, οι στρατηγικές τεχνητής νοημοσύνης και εκμάθησης μεταφοράς έχουν οδηγήσει σε καλύτερη κατανόηση των χαρακτηριστικών των ρυθμιστικών αλληλουχιών DNA, στην καλύτερη πρόβλεψη και το σχεδιασμό των συνθετικών ενισχυτών.
Με βάση την εργασία στην κυτταροκαλλιέργεια, οι συνθετικοί ενισχυτές εφαρμόστηκαν με επιτυχία σε ολόκληρους ζωντανούς οργανισμούς το 2023. Χρησιμοποιώντας βαθιά νευρωνικά δίκτυα, οι επιστήμονες προσομοίωσαν την εξέλιξη των αλληλουχιών DNA για να αναλύσουν την εμφάνιση χαρακτηριστικών που υποκρύπτουν τη λειτουργία του ενισχυτή. Αυτό επέτρεψε το σχεδιασμό και την παραγωγή μιας σειράς λειτουργικών συνθετικών ενισχυτών για διαφορετικούς τύπους κυττάρων του εγκεφάλου της μύγας των φρούτων. Μια δεύτερη προσέγγιση εκπαίδευσε μοντέλα τεχνητής νοημοσύνης σε δεδομένα προσβασιμότητας μονοκυττάρου DNA και μετέφερε τα μαθημένα μοντέλα προς την πρόβλεψη ενισχυτών για επιλεγμένους ιστούς στο έμβρυο της μύγας των φρούτων. Αυτά τα μοντέλα πρόβλεψης ενισχυτών χρησιμοποιήθηκαν για το σχεδιασμό συνθετικών ενισχυτών για το νευρικό σύστημα, τον εγκέφαλο, τους μύες, την επιδερμίδα και το έντερο.
## Παραπομπές

## Εξωτερικοί σύνδεσμοι
*TFSEARCH
*JASPAR
*ReMap
*ENCODE threads explorer  
Κατηγορία:Γονιδιακή έκφραση