CRISPR

bawd|306x306px|CRISPR/Cas9
de|bawd|450x450px|Diagram o fecaniaeth amddiffyn gwrth-firws CRISPR mewn organebau procaryotig.
Teulu o ddilyniannau DNA mewn bacteria yw **CRISPR** (). Mae'r dilyniannau yn cynnwys darnau DNA o firwsau sydd wedi ymosod ar y bacteria. Mae'r bacteria wedyn yn defnyddio'r darnau DNA yma i ddarganfod a dinistrio DNA mewn ymosodiadau eraill gan firwsau tebyg. Mae dilyniannau CRISPR yn rhan bwysig o system amddiffyn bacteria. Maen nhw hefyd yn cael eu defnyddio fel rhan o dechnoleg o'r enw **CRISPR/Cas9** sy'n gallu newid genynnau mewn organebau mewn ffordd effeithiol a manwl.

System imiwnedd mewn organebau procaryotig yw CRISPR/Cas. Mae'n system sy'n rhoi ymwrthedd rhag elfennau genetig dieithr, megis y rheiny sy'n bresennol mewn plasmidau o facteria eraill ac mewn firwsau bacterioffag. Maen nhw'n darparu math o imiwnedd caffaeledig i'r bacteria. Mae RNA sy'n dal y dilyniant o'r ymosodwyr blaenorol yn helpu proteinau Cas i ddarganfod a thorri DNA dieithr. Call proteinau Cas eraill, hefyd wedi eu harwain gan RNA, dorri RNA dieithr fel a geir yn lle DNA mewn rhai firwsau.  Fe welir dilyniannau CRISPR mewn tua 40% o'r genomau bacteriaidd sydd wedi eu dilyniannu, ac mewn 90% o archaea sydd wedi eu dilyniannu.

Daw'r talfyriad CRISPR o'r enw Saesneg - ***C**lustered **R**egularly **I**nterspaced **S**hort **P**alindromic **R**epeats*. Bathwyd yr enw pan nad oedd gwyddonwyr yn gwybod am darddiad a defnydd is-ddilyniannau ysbeidiol. Ar y pryd, disgrifwyd CRISPR fel darnau o DNA procaryotig yn cynnwys dilyniannau byr, ailadroddol. Mewn dilyniannau ailadroddol palindromig, mae dilyniant y niwcleotidau yr un fath yn y ddau gyfeiriad. Dilynnir pob adran ailadroddol gan ddarnau byr o ddarnau DNA ysbeidiol o ymosodiadau blaenorol i DNA dieithr (ee firws neu blasmid). Ceir clystyrau bychain o enynnau *cas* (system yn gysylltiedig â CRISPR) o gwmpas dilyniannau CRISPR.

Mae fersiwn syml o system CRISPR/Cas, o'r enw CRISPR/Cas9, wedi ei addasu i olygu genomau. Wrth ddanfon yr ensym niwcleas Cas9 wedi ei gyfuno ag RNA arwain (gRNA) synthetig i mewn i gell, gellir torri genom y gell mewn man dewisiol, gan ganiatau dileu genynnau a/neu ychwaneug genynnau newydd. Mae'r cymhlygyn Cas9-gRNA yn cyfateb â'r cymhlygyn CAS III-crRNA yn y diagram uchod mewn bacteria.

Mae gan dechnegau golygu genom CRISPR/CAS lawer o ddefnyddiau posibl, yn cynnwys mewn meddygaeth ac mewn gwella cnydau. Cyhoeddwyd yn 2015 mai system olygu genom CRISPR/Cas9-gRNA oedd dewis cymdeithas y AAAS fel darganfyddiad gwyddonol y flwyddyn. Mae rhai pryderon ethegol wedi eu crybwyll ynglŷn â defnyddio CRISPR ar gyfer golygu'r llinach genhedlu.

## Hanes 
Dechreuodd daranfyddiad darnau ailadroddol o DNA mewn tri rhan o'r byd.

### Dilyniannau ailadroddol 
Daeth y disgrifiad cyntaf o beth sydd erbyn hyn yn cael ei alw'n CRISPR o ymchwilydd ym Mhrifysgol Osaka, Yoshizumi Ishino, yn 1987. Ar gamgymeriad, fe gloniodd ran o ddilyniant CRISPR ynghyd â genyn *iap*, y terged oedd Ishino â diddordeb ynddo. Roedd trefniant y dilyniannau ailadroddol yn anarferol - fel arfer, mae dilyniannau ailadroddol wedi eu trefnu yn olynol ar hyd dilyniannau DNA, heb ymyriadau rhyngddynt. Doedd gwyddonwyr ar y pryd ddim yn gwybod beth oedd swyddogaeth dilyniannau ailadroddol ysbeidiol mewn clystyrau.

Yn 1993, cyhoeddodd ymchwilwyr yn yr Iseldiroedd oedd yn gweithio ar *Mycobacterium tuberculosis* (y bacteria sy'n achosi twbercwlosis neu'r diciâu) ddwy erthygl am glwstwr o ddilyniannau ailadroddol uniongyrchol â darnau eraill o DNA rhyngddynt yn y bacteriwm. Fe welodd yr ymchwilwyr fod y darnau DNA ysbeidiol yma yn amrywio yn arw rhwng straenau gwahanol o *M. tuberculosis*. Fe ddefnyddion nhw'r nodwedd yma i ddatblygu dull o ddosbarthu'r straenau, ac mae'r dull yma - *spoligotyping* - yn cael ei ddefnyddio hyd heddiw.

Ar yr un pryd, gwelwyd dilyniannau ailadroddol yn y rhywogaethau archaea *Haloferax* a *Haloarcula.* Dechreuodd Francisco Mojica astudio swyddogaeth y dilyniannau ailadroddol yma ym Mhrifysgol Alicante yn Sbaen. Er fod ei ragdybiaeth wreiddiol yn anghywir, dyfalodd Mojica ar y pryd fod y clystyrau yma o ddilyniannau ailadroddol yn bwysig ar gyfer didoli DNA datblygedig i mewn i epigelloedd yn ystod cellraniad oherwydd nad all blasmidau a chromosomau â dilyniannau o'r un fath gydfodoli yn *Haloferax volcanii*. Gwelodd Mojica hefyd drawsgrifiad y dilyniannau ailadroddol bylchog am y tro cyntaf. Erbyn 2000, roedd grŵp ymchwil Mojica wedi dynodi dilyniannau ailadroddom bylchog mewn 20 rhywogaeth o ficrobau. Yn 2001, cynnigwyd y term CRISPR am y tro cyntaf gan Mojica a Ruud Jansen (roedd Jansen hefyd yn chwilio am ddilyniannau tebyg) er mwyn lleihau'r dryswch ynglŷn â'r talfyriadau gwahanol oedd yn cael eu defnyddio mewn erthyglau gwyddonol.

### Systemau Cas (*CRISPR-associated systems*) 
Daeth gwelliant mawr yn nealltwriaeth gwyddonwyr o CRISPR pan sylweddolodd Jansen fod genynnau arbenning bob amser i'w gweld ynghyd â'r clystyrau a welodd o ddilyniannau ailadroddol. Rhoddwyd yr enw *CRISPR-associated systems*, neu *cas*, ar y genynnau yma. Gwelodd Jansen bedwar genyn *cas* yn gyntaf (*cas 1* i *4*. Roedd gan y proteinau Cas fotiffau helicas a niwcleas, gan awgrymu eu bod yn bwysig ar gyfer strwythur dynamig y locws CRISPR. Hwn oedd y cyhoeddiad lle bathwyd yr enw CRISPR fel enw cyffredinol y patrwm. Ond parhaodd swyddogaeth CRISPR i fod yn ddirgelwch.
bawd|Diagram syml o locws CRISPR. Dangosir y tair cydran a geir mewn locws CRISPR: genynnau *cas*, dilyniant arweiniol (leader), a rheng o ddilyniannau ailadroddol (blychau llwyd) a dilyniannau ysbeidiol (llinellau lliwgar). Dydy trefn y tair cydran ddim bob amser yr un fath. Hefyd, gellir cael nifer o locysau CRISPR tebyg mewn un genom, ond dim ond un all fod yn gysylltiedig â genynnau *cas*.
Yn 2005, dangosodd tri grwp ymchwil annibynnol fod rhai dilyniannau ysbeidiol CRISPR wedi dod o DNA bacterioffag a DNA o du allan i'r cromosom, megis plasmidau. I bob pwrpas, tameidiau o DNA sydd wedi ceisio ymosod ar y gell yn flaenorol yw'r dilyniannau ysbeidiol yma. Roedd y darganfyddiad hwn yn arwydd y gallai system CRISPR/*cas* chwarae rhan yn imiwnedd ymaddasol bacteria. Yn gyntaf, fe wrthododd y cylchgronau gwyddonol mwyaf enwog bob un o'r tri gwaith ymchwil, ond fe'u cyhoeddwyd yn ddiweddarach mewn cylchgronau eraill.

Cyhoeddwyd yr erthygl gyntaf i gynnig y gall CRISPR-Cas chwarae rhan mewn imiwnedd mewn microbau gan grŵp Mojica yn 2005. Rhagdybiodd Mojica y gallai trawsgrifiad RNA y dilyniannau ysbeidiol chwarae rhan gan alluogi'r system i adnabod targed y protein Cas. Byddai mecanwaith o'r fath yn cyfateb i system ymyriant RNA mewn celloedd ewcaryotig. Felly, yr un pryd ag y daeth Ian Wilmut yn enwog am glônio Dolly'r ddafad, estynodd Koonin a'i gydweithwyr (2005) y rhagdybiaeth ymyriad RNA gan gynnig dulliau gweithio ar gyfer yr is-fathau gwahanol o CRISPR-Cas yn ôl swyddogaeth rhagweliedig eu proteinau. Cynnigiodd eraill fod y dilyniannau CRISPR yn arwain ensymau Cas i ddiraddio DNA firysau.

Dangosodd gwaith ymchwil o lawer o grwpiau gwahanol y mecanweithiau sylfaenol wrth wraidd imiwnedd CRISPR-Cas. Yn 2007, cyhoeddwyd y dystiolaeth arbrofol gyntaf mai system imiwnedd ymaddasol oedd CRISPR. Caffaelodd locws CRISPR yn *Streptococcus thermophilus* ddilyniannau ysbeidiol o DNA firws oedd yn ymosod arno. Llwyddodd yr ymchwilwyr i newid ymwrthedd *S. thermophilus* i firws bacterioffag gan ychwanegu a dileu dilyniannau ysbeidiol wedi eu canfod mewn firysau gwahanol. Yn 2008, dynododd Brouns a chydweithwyr gymhlygyn protein Cas mewn *E. coli* oedd yn gallu torri'r RNA CRISPR o fewn i'r dilyniannau ailadroddol i mewn i foleciwlau RNA yn cynnwys dilyniannau ysbeidiol; fe welodd yr ymchwilwyr fod o moleciwlau yma yn aros ynghlwm i'r cymhlygyn protein. Yr un flwyddyn, dangosodd Marraffini a Sontheimer ddilyniant CRISPR yn *S. epidermidis* oedd yn targedu DNA yn hytrach nag RNA er mwyn atal cyfunedd. Doedd y darganfyddiad hwn ddim yn cydfynd â'r syniad fod mecanwaith imiwnedd CRISPR-Cas yn debyg i system ymyriad RNA, er y darganfyddwyd system CRISPR-Cas oedd yn targedu RNA dieithr yn ddiweddarach mewn *Pyrococcus furiosus*. Dangosodd gwaith yn 2010 fod CRISPR-Cas yn torri'r ddau edafedd o DNA firysau bacterioffag a phlasmidau yn *S. thermophilus*.

### Cas9 
Dechreuodd ymchwilwyr astudio system CRISPR mwy syml o *Streptococcus pyogenes* sy'n defnyddio'r protein Cas9. Mae pedwar rhan i system endoniwcleas Cas9, sy'n cynnwys dau foleciwl RNA bychan o'r enw RNA CRISPR (crRNA) ac RNA CRISPR traws-ysgogi (tracrRNA). Llwyddodd Jennifer Doudna ac Emmanuelle Charpentier i ailadeiladu a symleiddio'r endoniwcleas Cas9 gan gyduno'r ddau foleciwl RNA i ffurfio un RNA arwain. Gall Cas9 wedyn, pan wedi ei gyfuno â'r RNA arwain, ddarganfod a thorri targed penodol mewn DNA wedi ei ddynodi gan yr RNA arwain. Gan newid dilyniant niwcleotid yr RNA arwain, gellid rhaglennu'r system Cas9 i dargedu unrhyw ddilyniant DNA er mwyn ei dorri. Dangosodd grŵp arall o gydweithwyr, yn cynnwys Šikšnys, Gasiūnas, Barrangou a Horvath y gallant hefyd ail-ragnlennu'r Cas9 o system CRISPR *S. thermophilus* er mwyn targedu man o'u dewis gan newid ei ddilyniant crRNA. Rhoddodd y datblygiadau hyn hwb i ymdrechion gwyddonwyr i olygu genomau gen ddefnyddio'r system CRISPR-Cas9.

Dangosodd dau  grŵp ymchwil ar yr un pryd a'i gilydd y gellid defnyddio CRISPR/Cas9 er mwyn golygu'r genom dynol mewn celloedd meithrin. Ers hynny, mae'r system wedi ei defnyddio mewn ystod eang o organebau, gan gynnwys burum pobi (*Saccharomyces cerevisiae*), pysgod rhesog (*D. rerio*), pryfed ffrwythau (*Drosophila melanogaster*), nematodau (*C. elegans*), planhigion, llygod, mwncïod ac ebryonau dynol.

Mae CRISPR hefyd wedi ei addasu ar gyfer creu ffactorau trawsgrifiad y gellir eu rhaglennu. Gan ddefnyddio'r rhain, gall wyddonwyr dargedu a throi genynnau penodol ymlaen neu i ffwrdd.

## Defnyddiau 
Erbyn diwedd 2014, roedd oddeutu 1000 o erthyglau ymchwil yn crybwyll CRISPR wedi eu cyhoeddi. Mae'r dechnoleg wedi ei defnyddio er mwyn diffodd genynnnau mewn celloedd a llinachau o gelloedd dynol, i astudio *Candida albicans*, i addasu'r burum sy'n cael ei ddefnyddio i greu biodanwydd, ac ar gyfer addasu genetig mewn cnydau. Gellir defnyddio CRISPR hefyd i newid mosgitos fel nad allant drosglwyddo afiechydon megis malaria.

### Peiriannu'r genom 
Mae systemau golygu genom CRISPR/Cas9 yn defnyddio system CRISPR Math II. Pan gaiff ei defnyddio ar gyfer golygu genom, mae'r system yn cynnwys Cas9, crRNA, tracrRNA ac adran opsiynol o dempled atgyweirio DNA.

bawd|dim|514x514px|Trawsolwg o wneuthuriad plasmid a ddefnyddir ar gyfer golygu'r genom gyda CRISPR/Cas9.

#### Prif gydrannau 
## Cyfeiriadau 
Categori:Nodion
Categori:Biotechnoleg
Categori:Bioleg foleciwlaidd
Categori:Bioleg