Analozi nukleinske kiseline

**Analozi nukleinske kiseline** su spojevi koji su strukturno analogni prirodno prisutnim RNK i DNK, putem supstitucije bilo koje od njihovih komponenti šećera, fosfata i nukleobaze. Koriste se u medicini i u istraživanjima molekularne biologije.

## Pregled 
[thumb|300px|[RNK sa svojim nukleobazama lijevo i DNK desno.]]
Nukleinske kiseline su lanci nukleotida, koji se sastoje od tri dijela: okosnice koja se sastoji od pentoznog šećera ili riboze ili dezoksiriboze, povezanih fosfatnim grupama; i jedne od četiri nukleobaze. Analog može imati bilo koju od ovih izmijenjenih. Tipski, analogne nukleobaze, između ostalog, daju različita svojstva sparivanja i slaganja baza. Primjeri uključuju univerzalne baze, koje se mogu spariti sa sve četiri kanonske baze, i analoge fosfatno-šećernog lanca kao što je PNA, koji utiču na svojstva lanca (PNA može čak formirati trostruku spiralu).

## Analozi glavnog lanca
Analozi nukleinskih kiselina mogu imati zamjene glavnog lanca na šećernim ili fosfatnim komponentama, ili na objema.

Polielektrolitna teorija gena predlaže da genetska molekula zahtijeva nabijeni glavni lanac za funkcioniranje.

### Analozi šećera 
Riboza-ova 2' hidroksilna grupa reaguje sa fosfatno vezanom 3' hidroksilnom grupom, čineći RNK previše nestabilnom za pouzdanu upotrebu ili sintezu. Da bi se ovo prevazišlo, može se koristiti analog riboze. Najčešći RNK analozi su 2'-O-metil-supstituirana RNK, zaključana nukleinska kiselina (LNA) ili premoštena nukleinska kiselina (BNA), i peptidna nukleinska kiselina (PNA), kao i glikolne nukleinske kiseline (GNA), treozne nukleinske kiseline (TNA) i heksitol nukleinske kiseline (HNA).

Iako ovi oligonukleotidi imaju drugačiji osnovni šećer - ili, u slučaju PNA, ostatak aminokiseline umjesto riboza fosfata - oni se i dalje vežu za RNK ili DNK prema Watsonovom i Crickovom sparivanju, dok su imuni na aktivnost nukleaze. Ne mogu se enzimski sintetizirati i mogu se dobiti samo sintetički korištenjem strategije fosforamidita ili, za PNA, drugih metoda sinteze peptida.

Dideoksinukleotidi se koriste u sekvenciranju. Ovi nukleozidni trifosfati posjeduju nekanonski šećer, dideoksiribozu, kojoj nedostaje 3' hidroksilna grupa koja je normalno prisutna u DNK i stoga se ne može vezati sa sljedećom bazom. Nedostatak 3' hidroksilne grupe prekida lančanu reakciju jer je DNK polimeraze pogrešno zamjenjuju za regularni deoksiribonukleotid.

Drugi analog koji prekida lanac, a kojem nedostaje 3' hidroksilna grupa i koji oponaša adenozin, naziva se kordicepin. Kordicepin je lijek protiv raka koji cilja replikaciju RNA. Drugi analog u sekvenciranju je nukleobazni analog, 7-deaza-GTP, koji se koristi za sekvenciranje CG bogatih regija. Umjesto toga, 7-deaza-ATP se naziva tubercidin, antibiotik.

Kseno nukleinske kiseline predstavljaju jedan od glavnih stubova ksenobiologije, dizajna novih prirodnih oblika života zasnovanih na alternativnim biohemijama.

### Analozi fosfata 
Analozi fosfata uključuju fosforotioatne nukleinske kiseline i fosforodiamidat nukleinske kiseline.

### Obje 
thumb|130px| Hemijska struktura morfolina
Morfolino nukleinske kiseline zamjenjuju šećer morfolinskom komponentom, a fosfat fosforodiamidatnom komponentom.

Miravirzen je antisensni kandidat za lijek koji uključuje i zaključane nukleinske kiseline šećerne komponente i fosforotioatne grupe.

## Bazni analozi 
Za strukture analoga koji se mogu spomenuti u literaturi je jednostavni aromatskii prsten.
Prema svojoj strukturi,  prirodne baze mogu se podijeliti u dvije klase:
* Pirimidini su šestočlane heterocikličke molekule s atomima dušika na pozicijama 1 i 3.
* Purini su bicikličke, sastoje se od pirimidina spojenog s imidazolnim prstenom.

Vještački nukleotidi (*Neprirodni parovi baza* (UBP) nazvani *d5SICS UBP* i *dNaM UBP*) su umetnuti u bakterijsku DNK, ali ovi geni nisu formirali iRNK niti inducirali sintezu proteina. Vještački nukleotidi su sadržavali dva spojena aromatska prstena koji su formirali (d5SICS–dNaM) kompleks oponašajući prirodni (dG–dC) bazni par.

### Mutageni
Jedan od najčešćih analoga baza je 5-bromouracil (5BU), abnormalna baza koja se nalazi u mutagenom nukleotidnom analogu BrdU. Kada se nukleotid koji sadrži 5-bromouracil ugradi u DNK, najvjerovatnije će se spariti s adeninom; međutim, može spontano preći u drugi izomer koji se sparuje s drugom nukleobazom, guaninom. Ako se to dogodi tokom replikacije DNK, gvanin će biti umetnut kao suprotni analog baze, a u sljedećoj replikaciji DNK, taj guanin će se spariti s citozinom. To rezultira promjenom u jednom baznom paru DNK, tačnije tranzicija mutacija.

Osim toga, dušična kiselina (HNO2) je snažan mutagen koji djeluje na replicirajuću i nereplicirajuću DNK. Može uzrokovati deaminaciju amino grupa adenina, guanina i citozina. Adenin se deaminira u hipoksantin, čija se baza sparuje s citozinom umjesto s timinom. Citozin se deaminira u uracil, koji se baza sparuje s adeninom umjesto s guaninom. Deaminacija guanina nije mutagena. Mutacije izazvane dušičnom kiselinom također se induciraju da mutiraju natrag u divlji tip.

### Fluorofori
thumb|200px|Struktura aminoalil-uridina
Uobičajeno su fluorofori (kao što su rodamin ili fluorescein) povezani s prstenom povezanim sa šećerom (u para) putem fleksibilnog kraka, vjerovatno istiskujućeg iz glavnog žlijeba spirale. Zbog niske procesivnosti nukleotida povezanih s glomaznim aduktima poput fluorofora pomoću Taq -polimeraza, sekvenca se obično kopira pomoću nukleotida s krakom, a kasnije se spaja s reaktivnim fluoroforom (indirektno označavanje):
* Reaktivni na amino: aminoalil-nukleotidi sadrže primarnu amino grupu na linkeru koja reagira s amino-reaktivnom bojom kao što su boje cijanin ili Alexa Fluor, koje sadrže reaktivnu izlaznu grupu poput sukcinimidil-estera (NHS). Amino grupe koje sparuju baze nisu pogođene.
* Reaktivni na tiol: nukleotidi koji sadrže tiol reagiraju s fluoroforom povezanim s reaktivnom izlaznom grupom poput maleimida.
* Biotinom-vezani nukleotidi oslanjaju se na isti princip indirektnog označavanja (i fluorescentni streptavidin) i koriste se u Affymetrix DNK-čipovima.

Fluorofori nalaze različite upotrebe u medicini i biohemiji.

Najčešće korišteni i komercijalno dostupni fluorescentni bazni analog, 2-aminopurin (2-AP), ima visok kvantni prinos fluorescencije u slobodnom stanju u rastvoru (0,68) koji je znatno smanjen (otprilike 100 puta, ali u velikoj mjeri zavisi od sekvence baza) kada se ugradi u nukleinske kiseline. Osjetljivost 2-AP na emisiju u neposrednoj okolini dijele i drugi obećavajući i korisni fluorescentni bazni analozi poput 3-MI, 6-MI, 6-MAP, pirolo-dC (također komercijalno dostupan), modificirani i poboljšani derivati pirolo-dC, furan-modificirane baze  i mnogi drugi (pogledajte nedavne recenzije). Ova osjetljivost na mikrookruženje korištena je u studijama npr. strukture i dinamike unutar DNK i RNK, dinamike i kinetike interakcije DNK-protein i prijenosa elektrona unutar DNK.

Novo razvijena i vrlo zanimljiva grupa fluorescentnih baznih analoga koja ima kvantni prinos fluorescencije koji je gotovo neosjetljiv na njihovu neposrednu okolinu je porodica tricikličkih citozina. 1,3-Diaza-2-oksofenotiazin, tC, ima kvantni prinos fluorescencije od približno 0,2 i u jednostrukim i u dvostrukim lancima, bez obzira na okolne baze. Također, okso-homolog tC nazvan tCO (oba komercijalno dostupna), 1,3-diaza-2-oksofenoksazin, ima kvantni prinos od 0,2 u dvolančanim sistemima. Međutim, donekle je osjetljiv na okolne baze u jednolančanim lancima (kvantni prinosi od 0,14–0,41). Visoki i stabilni kvantni prinosi ovih baznih analoga čine ih vrlo svijetlim, a u kombinaciji s njihovim dobrim svojstvima baznih analoga (ostavlja strukturu i stabilnost DNK gotovo neporemećenima), posebno su korisni u fluorescentnoj anizotropiji i FRET mjerenjima, područjima gdje su drugi fluorescentni bazni analozi manje precizni. Također, u istoj porodici citozinskih analoga, razvijen je FRET-akceptorski bazni analog, tCnitro. Zajedno sa tCO kao FRET-donorom, ovo predstavlja prvi FRET-par analognih nukleinsko-kiselinskih baza ikada razvijen. tC-familija je, na primjer, korištena u studijama vezanim za mehanizme vezivanja DNK polimerazom i polimerizacije DNK.

### Prirodne nekanonske baze
U ćeliji je prisutno nekoliko nekanonskih baza: CpG ostrva u DNK (često metilirana), sve eukariotske iRNK (prekrivene metil-7-gvanozinom) i nekoliko baza rRNK (metilirane). Često su tRNK posttranskripcijski znatno modificirane kako bi se poboljšala njihova konformacija ili sparivanje baza, posebno u ili blizu antikodona: inozin se može spariti sa C, U, pa čak i sa A, dok je tiouridin (sa A) specifičniji od uracila (sa purinom). Druge uobičajene modifikacije tRNK baza su pseudouridin (koji je dao ime TΨC petlji), dihidrouridin (koji se ne slaže jer nije aromatičan), kvenozin, viozin i tako dalje. Ipak, sve su to modifikacije normalnih baza i ne postavlja ih polimeraza. Diaminopurin se savršeno sparuje s timinom jer je identičan adeninu, ali ima amino grupu na poziciji 2, formirajući tri intramolekulske vodikove veze, eliminirajući glavnu razliku između dva tipa baznih parova (slabi A-T naspram jakih C-G). Ova poboljšana stabilnost utiče na interakcije vezivanja proteina koje se oslanjaju na te razlike.
Druge kombinacije uključuju:
* Izoguanin i izocitozin, koji imaju invertovani amin i keton u poređenju sa standardnim guaninom i citozinom. Ne koriste se vjerovatno jer su tautomeri problematični za sparivanje baza, ali izoC i izoG se mogu ispravno amplificirati PCR-om čak i u prisustvu četiri kanonske baze.
* Diaminopirimidin i ksantin, koji se vežu kao 2-aminoadenin i timin, ali s invertovanim strukturama. Ovaj par se ne koristi jer je ksantin produkt deaminacije.

Međutim, ispravna struktura DNK može se formirati čak i kada baze nisu sparene putem vodoničnih veza; to jest, baze se sparuju zahvaljujući hidrofobnosti, kao što su studije pokazale sa DNK izosterima (analozima sa istim brojem atoma) kao što su analog timina 2,4-difluorotoluen (F) ili analog adenina 4-metilbenzimidazol (Z). Alternativni hidrofobni par mogao bi biti izohinolin i pirolo[2,3-b]piridin.

Ostali značajni bazni parovi:
* Napravljeno je i nekoliko fluorescentnih baza, kao što je bazni par 2-amino-6-(2-tienil)purin i pirol-2-karbaldehid.
* Metalno koordinirane baze, kao što je sparivanje između piridin-2,6-dikarboksilata (tridentatni ligand) i piridina (monodentatni ligand) putem kvadratne planarne koordinacije do centralnog bakarnog iona.
* Univerzalne baze se mogu neselektivno spariti s bilo kojom drugom bazom, ali, općenito, znatno snižavaju temperaturu topljenja sekvence; primjeri uključuju derivate 2'-dezoksiinozina (hipoksantin-dezoksinukleotida), analoge nitrozola i hidrofobne aromatske baze koje se ne vežu vodikom (jaki efekti slaganja). One se koriste kao dokaz koncepta i, općenito, ne koriste se u degeneriranim prajmerima (koji su mješavina prajmera).
* Broj mogućih baznih parova se udvostručuje kada se uzme u obzir xDNK. Ona sadrži proširene baze, kojima je dodan benzenski prsten, koji se može spariti s kanonskim bazama, što rezultira s četiri dodatna moguća bazna para (xA-T, xT-A, xC-G, xG-C) s osam baza (ili 16 baza ako se koriste neiskorišteni aranžmani). Drugi oblik benzenskih dodanih baza je yDNK, u kojoj je baza proširena benzenom.

#### Metalni bazni parovi 
U sparivanju metalnih baza, Watson-Crickove vodikove veze zamjenjuju se interakcijom između metalnog iona s nukleozidima koji djeluju kao ligandi. Moguće geometrije metala koje bi omogućile formiranje dupleksa s dva bidentatna nukleozida oko centralnog atoma metala su tetraedarski, dodekaedarski i kvadratno-planarni. Kompleksiranje metala s DNK može se dogoditi formiranjem nekanonskih baznih parova iz prirodnih nukleobaza uz sudjelovanje metalnih iona, a također i zamjenom atoma vodika koji su dio Watson-Crickovog sparivanja baza metalnim ionima. Uvođenje metalnih iona u DNK dupleks pokazalo je da ima potencijalni magnetna  ili provodna svojstva, kao i povećana stabilnost.

Pokazano je da se kompleksiranje metala događa između prirodnih nukleobaza. Dobro dokumentiran primjer je formiranje T-Hg-T, koje uključuje dvije deprotonirane nukleobaze timina koje se spajaju pomoću Hg2+ i formiraju povezani metal-bazni par. Ovaj motiv ne može da prilagodi složeni Hg2+ u dupleksu zbog procesa formiranja ukosnica unutar lanca koji je favorizovan u odnosu na formiranje dupleksa. Dva timina jedan nasuprot drugom ne formiraju Watson-Crickov bazni par u dupleksu; ovo je primjer gdje se Watson-Crickova neusklađenost baznih parova stabilizuje formiranjem para metal-baza. Drugi primjer kompleksiranja metala s prirodnim nukleobazama je formiranje A-Zn-T i G-Zn-C pri visokom pH; Co2+ i Ni2+ također formiraju ove komplekse. Ovo su Watson-Crickovi bazni parovi gdje je dvovalentni kation koordiniran s nukleobazama. Tačno vezivanje je predmet debate.

Razvijen je veliki broj umjetnih nukleobaza za upotrebu kao metalni bazni parovi. Ove modificirane nukleobaze pokazuju podesiva elektronska svojstva, veličine i afinitet vezivanja koji se mogu optimizirati za određeni metal. Naprimjer, pokazalo se da se nukleozid modificiran piridin-2,6-dikarboksilatom čvrsto veže za Cu2+, dok su drugi dvovalentni ioni samo labavo vezani. Tridentatni karakter doprinosi ovoj selektivnosti. Četvrto koordinacijsko mjesto na bakru zasićeno je suprotno raspoređenom piridinskom nukleobazom. Asimetrični sistem sparivanja metalnih baza je ortogonalan na Watson-Crickove bazne parove. Drugi primjer vještačke nukleobaze je onaj sa hidroksipiridonskim nukleobazama, koje su sposobne da vežu Cu2+ unutar DNK dupleksa. Pet uzastopnih bakar-hidroksipiridonskih baznih parova ugrađeno je u dvostruki lanac, koji je na oba kraja okružen samo jednom prirodnom nukleobazom. EPR podaci su pokazali da je udaljenost između centara bakra procijenjena na 3,7 ± 0,1 Å, dok je prirodni DNK dupleks B-tipa samo neznatno veći (3,4 Å). Privlačnost slaganja metalnih iona unutar DNK dupleksa je nada da će se dobiti nanoskopske samoorganizujuće metalne žice, iako to još nije realizovano.

#### Neprirodni bazni par (UBP) 
Neprirodni bazni par (UBP) je dizajnirana podjedinica (ili nukleobaza) DNK koja se stvara u laboratoriji i ne javlja se u prirodi. U 2012. godini, grupa američkih naučnika predvođena Floydom Romesbergom, hemijskim biologom u Scripps Research Institute u San Diegu, Kalifornija, objavila je da je njegov tim dizajnirao dva neprirodna bazna para nazvana d5SICS i dNaM. Tehnički gledano, ovi vještački nukleotidi koji nose hidrofobne nukleobaze imaju dva spojena aromatska ugljikovodika koja formiraju d5SICS-dNaM kompleks ili bazni par u DNK. U 2014., Isti tim je izvijestio da su sintetizirali plazmid koji sadrži prirodne T-A i C-G bazne parove, zajedno s najboljim UBP-om koji je Romesbergova laboratorija dizajnirala i umetnula u ćelije uobičajene bakterije *E. coli*, koja je uspješno replicirala neprirodne bazne parove kroz više generacija. Ovo je prvi poznati primjer živog organizma koji prenosi prošireni genetički kod na sljedeće generacije. Ovo je dijelom postignuto dodavanjem potpornog alginog gena koji eksprimira transporter nukleotid trifosfat koji efikasno unosi trifosfate i d5SICSTP i dNaMTP u bakterije *E. coli*. Transkripcija DNK koja sadrži neprirodne bazne parove i translacija odgovarajuće iRNK su zapravo nedavno postignute. U novembru 2017., isti tim u *Scripps Research Institute* koji je prvi uveo dvije dodatne nukleobaze u bakterijsku DNK izvijestio je da je konstruirao polusintetsku bakteriju *E. coli* sposobnu za proizvodnju proteina koristeći takvu DNK. Njena DNK je sadržavala šest različitih nukleobaza: četiri kanonske i dvije vještački dodane, dNaM i dTPT3 (ove dvije formiraju par). Bakterije su imale dvije odgovarajuće RNK baze uključene u dva nova kodona, dodatne tRNK koje su prepoznavale ove nove kodone (ove tRNK su također sadržavale dvije nove RNK baze unutar svojih antikodona) i dodatne aminokiseline, što je omogućilo bakterijama da sintetiziraju "neprirodne" proteine.

Još jednu demonstraciju UBP-ova postigla je grupa Ichira Hiraoa na institutu RIKEN u Japanu. 2002. godine razvili su neprirodni bazni par između 2-amino-8-(2-tienil)purina (s) i piridin-2-ona (y) koji funkcioniše *in vitro* u transkripciji i translaciji, za specifično ugrađivanje nestandardnih aminokiselina u proteine. U 2006., stvorili su 7-(2-tienil)imidazo[4,5-b]piridin (Ds) i pirol-2-karbaldehid (Pa) kao treći bazni par za replikaciju i transkripciju. Nakon toga, Ds i 4-[3-(6-aminoheksanamido)-1-propinil]-2-nitropirol (Px) su otkriveni kao visoko pouzdani par u PCR amplifikaciji. U 2013., primijenili su Ds-Px par na generiranje DNK aptamera putem *in vitro* selekcije (SELEX) i pokazali da ekspanzija genetičkog alfabeta značajno povećava afinitet DNK aptamera prema ciljnim proteinima.

## Aplikacije 
### Medicina 
Nekoliko nukleozidnih analoga se koristi kao antivirusni ili antikancerogeni agensi. Virusna polimeraza integrira ove spojeve s nekanonskim bazama. Ovi spojevi se aktiviraju u ćelijama pretvaranjem u nukleotide, primjenjuju se kao nukleozidi jer nabijeni nukleotidi ne mogu lako proći kroz ćelijske membrane.

### Molekularna biologija 
thumb|220px|right| Uobičajene promjene u analozima nukleotida
Analozi nukleinskih kiselina koriste se u molekularnoj biologiji u nekoliko svrha:
* Istraživanje mogućih scenarija porijekla života: Testiranjem različitih analoga, istraživači pokušavaju odgovoriti na pitanje da li je upotreba DNK i RNK u životu odabrana tokom vremena zbog svojih prednosti ili su odabrani proizvoljno;
* Kao alat za detekciju određenih sekvenci: XNA se može koristiti za označavanje i identifikaciju širokog spektra DNK i RNK komponenti sa visokom specifičnošću i tačnošću;
* Kao enzim koji djeluje na DNK, RNK i XNK supstrate - pokazalo se da XNK ima sposobnost cijepanja i ligacije DNK, RNK i drugih XNK molekula slično djelovanju RNK ribozima;

### Ortogonalni sistem 
Predložena je i proučavana mogućnost, i teorijski i eksperimentalno, implementacije ortogonalnog sistema unutar ćelija nezavisno od ćelijskog genetičkog materijala kako bi se napravio potpuno siguran sistem, sa mogućim povećanjem potencijala kodiranja.
Nekoliko grupa se fokusiralo na različite aspekte:
* Novi osnovni lanci i bazni parovi kao što je gore objašnjeno;
* XNA umjetne replikacijske i transkripcijske polimeraze koje uglavnom počinju od T7 RNK- polimeraza;
* (16S ribosomske sekvence sa izmijenjenim anti-Shine-Dalgarnovom sekvencom, što omogućava translaciju samo ortogonalne iRNK sa odgovarajućom izmijenjenom Shine-Dalgarnovom sekvencom; i
* Nova tRNK koja kodira neprirodne aminokiseline za prošireni genetički kod.

U maju 2014. godine, istraživači su objavili da su uspješno uveli dva nova vještačka nukleotida u bakterijsku DNK i, uključivanjem pojedinačnih vještačkih nukleotida u medij za kulturu, uspjeli su pasažirati bakterije 24 puta; nisu stvorili iRNK ili proteine sposobne za korištenje vještačkih nukleotida. Vještački nukleotidi su sadržavali dva spojena aromatska prstena.

## Također pogledajte
* Biotin
* Tamni gasitelj
* Dezoksiribozim
* Prošireni genetski kod
* Fluorofor
* Genetika
* Molekularna biologija
* Nukleinska kiselina
* Nukleobaza
* Nukleozid
* Nukleotid
* Sinteza oligonukleotida
* Ribozim
* Sintetička biologija
* Ksenobiologija
* xDNK
* Hahimoji DNK
* Vještački prošireni genetički informacijski sistem (AEGIS)
* Ksenonukleinska kiselina

## Reference 
## Vanjski linkovi
Kategorija:Molekularna genetika
Kategorija:Nukleinske kiseline
Kategorija:RNK
Kategorija:Ekspresija gena