Dihidrofolat-reduktaza

**Dihdrofolat-reduktaza** (**DHFR**) je enzim koji redukuje dihidrofolnu kiselinu na tetrahidrofolnu kiselinu, koristeći NADPH kao donor elektrona, koji se može pretvoriti u vrste tetrahidrofolata kofaktor koji se koristi u hemiji prenosa sa ugljikom1. Kod ljudi, enzim DHFR kodira gen **DHFR**.
Nalazi se ns poziciji regiona q11→q22  hromosoma 5. Bakterijske vrste imaju različite DHFR enzime (zasnovane na njihovom obrascu vezanja diaminoheterocikličnih molekula), ali sisarski DHFR-i su vrlo slični.

## Struktura 
Centralni osmolančani beta-nabrani list čini glavnu karakteristiku polipeptidnog savijanja DHFR-a. Sedam od ovih lanaca je paralelno, a osmi protiče antiparalelno. Četiri alfa-heliksa povezuju uzastopne beta-lance. Aminokiselinski ostaci  9 - 24 nazivaju se "Met20" ili "petlja 1" i, zajedno s ostalim petljama, dio su glavneog poddomena koji okružuje aktivno mjesto. Aktivno mjesto nalazi se u polovini sekvence N-kraja, koja uključuje konzervirani Pro –x Trp dipeptid ; pokazalo se da je triptofan uključen u vezanje supstrata pomoću enzima.

## Funkcija 
Dihidrofolat-reduktaza pretvara dihidrofolat u tetrahidrofolat, protonski šatl potreban za *de novo* sintezu purina, timidilnske kiseline i određenih aminokiselina . Dok je funkcionalni gen dihidrofolat reduktaze mapiran na hromosomu 5, na odvojenim hromosomima identificirani su višestruko obrađeni pseudogeni ili geni nalik onim za dihidrofolat-reduktazu, bez introna.

Pronađen u svim organizmima, DHFR ima presudnu ulogu u regulaciji količine tetrahidrofolata u ćeliji. Tetrahidrofolat i njegovi derivati su neophodni za sintezu purina i timidilata, koji su važni za proliferaciju i rast ćelija. DHFR ima središnju ulogu u sintezi prekursora nukleinskih kiselina, a pokazano je da je mutantnim ćelijama kojima potpuno nedostaje DHFR potrebna aminokiselina glicin i timidin za rast. DHFR se također ispoljava kao enzim koji učestvuje u spašavanju tetrahidrobiopterina iz dihidrobiopterina.

## Mehanizam 
### Opći mehanizam 
DHFR katalizira transfer hidrida iz NADPH u dihidrofolat sa pratećom protonacijom, da bi se dobio tetrahidrofolat.  Na kraju se dihidrofolat redukuje u tetrahidrofolat, a NADPH se oksidira u NADP+. Visoka fleksibilnost Met20 i drugih petlji u blizini aktivnog mjesta ima ulogu u promociji oslobađanja proizvoda, tetrahidrofolata. U studiji koja koristi računarski i eksperimentalni pristup, Liu i suradnici zaključuju da prijenosu hidrida prethodi korak protonacije.
thumb|310x310px| U katalitskoj shemi, zatvorena struktura prikazana je crvenom bojom, a okludirana zelenom. U strukturi su DHF i THF obojeni crveno, NADPH žuto, a ostatak Met20 plavo
Pokazalo se da enzimski mehanizam DHFR ovisi o pH, posebno o koraku prijenosa hidrida, jer  promjene pH imaju izuzetan uticaj na elektrostatiku aktivnog mjesta i stanje ionizacije njegovih ostataka. Kiselost ciljanog dušika na supstratu važna je za vezanje supstrata za mjesto vezanja enzima za koje se pokazalo da je hidrofobno, iako ima direktan kontakt s vodom. Asp27 je jedini nabijeni hidrofilni ostatak na mjestu vezanja, a neutralizacija punjenja na Asp27 može promijeniti pKa enzima. Asp27 ima kritičnu ulogu u katalitskom mehanizmu, pomažući protoniranje supstrata i ograničavajući supstrat u konformaciji povoljnoj za prijenos hidrida. Pokazalo se da je korak protonacije povezan s tautomerizacijom enola, iako se ova konverzija ne smatra povoljnom za doniranje protona. Dokazano je da je molekula vode uključena u korak protoniranja.  Ulazak molekula vode u aktivno mjesto enzima olakšan je pomoću petlje Met20.

### Konformacijske promjene DHFR-a 
Katalitski ciklus reakcije pomoću DHFR uključuje pet važnih međuprodukata: holoenzim (E: NADPH), Michaelisov kompleks (E: NADPH: DHF), trostruki kompleks proizvoda ((E:NADP+:THF)), tetrahidrofolatni binarni kompleks (E:THF) i THF‚NADPH kompleks (E:NADPH:THF). Korak disocijacije proizvoda (THF) od E: NADPH: THF do E: NADPH je korak koji određuje stopu tokom stabilnog stanja prometa.

U katalitskom mehanizmu DHFR-a, ključne su konformacijske promjene. Petlja Met20 DHFR-a može otvoriti, zatvoriti ili začepiti aktivno mjesto. U skladu s tim, tri različite konformacije klasificirane kao otvorena, zatvorena i začepljena stanja, dodjeljuju se Met20. Pored toga, definirana je i dodatna iskrivljena konformacija Met20 zbog njegovih nejasnih rezultata karakterizacije. Petlja Met20 uočena je u svojoj začepljenoj konformaciji u tri međuprodukta koji ligirauju proizvod, pri čemu je nikotinamidni prsten zatvoren iz aktivnog mjesta. Ova konformacijska značajka objašnjava činjenicu da se zamjena NADP+NADPH dešava prije disocijacije proizvoda. Dakle, sljedeći krug reakcije može se dogoditi nakon vezanja supstrata.
thumb|414x414px| Poređenje reakcijske kinetike između EcDHFR i R67 DHFR
[thumb| Razlika u strukturi vezanja supstrata u *[E. coli* i R67 DHFR]]

### R67 DHFR 
Zbog svoje jedinstvene strukture i katalitskih karakteristika, R67 DHFR je široko proučavan. R67 DHFR je DHFR kodiran R-plazmidom tipa II, bez genetičke i strukturne veze sa hromosomskim DHFR *E. coli*. To je homotetramer koji ima 222 simetrije sa jednom aktivnom porom, koja je izložena rastvaraču [nul]. Ova simetrija aktivnog mjesta rezultira različitim načinom vezanja enzima: može se vezati s dvije molekule dihidrofolata (DHF), s pozitivnom kooperativnošću ili dvije molekule NADPH s negativnom kooperativnošću  ili jednim supstratom plus jedan, ali samo ovaj drugi ima katalitsku aktivnost. U usporedbi s hromosomskim DHFR *E. coli*, on ima veći Km u vezanju dihidrofolata (DHF) i NADPH. Mnogo niža katalitska kinetika pokazuje da je prijenos hidrida korak određivanja brzine, a ne oslobađanje proizvoda (THF).

U strukturi R67 DHFR, homotetramer stvara pore aktivnog mjesta. U katalitskom procesu DHF i NADPH ulaze u pore iz suprotnog položaja. Interakcija slaganja π-π između NADPH-ovog nikotinamidnog prstena i DHF-ovog pteridinskog prstena čvrsto povezuje dva reaktanta na aktivnom mjestu. Međutim, nakon vezanja, uočena je fleksibilnost repa p-aminobenzoilglutamata DHF, što može pospješiti stvaranje prijelaznog stanja.

## Klinički značaj 
Nedostatak dihidrofolat reduktaze povezan je sa megaloblastnom anemijom.  Liječenje se vrši  reduciranim oblicima folne kiseline. Budući da je tetrahidrofolat, proizvod ove reakcije, aktivni oblik folata kod ljudi, inhibicija DHFR-a može prouzrokovati funkcionalni nedostatak folata. DHFR je atraktivna farmaceutska meta za inhibiciju, zbog svoje ključne uloge u sintezi prekursora DNK. Trimetoprim, antibiotik, inhibira bakterijski DHFR, dok metotreksat, hemoterapijsko sredstvo, inhibira DHFR sisara. Međutim, rezistencija razvila se protiv nekih lijekova, kao rezultat mutacijskih promjena u samom DHFR-u.

DHFR mutacije uzrokuju rijetku autosomno recesivnu urođenu grešku metabolizma folata, koja rezultira megaloblastičnom anemijom, pancitopenijom i ozbiljnom nedostatkom cerebralnog folata, što se može ispraviti dodatkom folinske kiseline.

## Terapijska primjena 
Budući da je folat potreban za brzo dijeljenje ćelija da bi se stvorio timin, ovaj efekt može se koristiti kao terapeutsku prednost.

DHFR može biti usmjeren u liječenju karcinoma i kao potencijalna meta protiv bakterijskih infekcija. DHFR je odgovoran za nivoe tetrahidrofolata u ćeliji, a inhibicija DHFR može ograničiti rast i proliferaciju ćelija karakterističnih za rak i bakterijske infekcije. Metotreksat, kompetitivni inhibitor DHFR-a, jedan je takav lijek protiv raka koji inhibira DHFR. Ostali lijekovi uključuju trimetoprim i pirimetamin. Ova tri se široko koriste kao antitumorska i antimikrobna sredstva. Ostale klase spojeva koje ciljaju DHFR općenito, a posebno bakterijske DHFR, pripadaju klasama kao što su diaminopteridini, diaminotriazini, diaminopirolokinazolini, stilbeni, halkoni, deoksibenzoini, između ostalih.

Trimetoprim je pokazao aktivnost protiv različitih Gram-pozitivnih bakterijskih patogena. Međutim, rezistencija na trimetoprim i druge lijekove usmjerene na DHFR može nastati zbog različitih mehanizama koji ograničavaju uspjeh njihove terapijske upotrebe. Otpor može nastati pojačavanjem DHFR gena, mutacijama u DHFR, smanjenje uzimanja lijekova, između ostalog. Bez obzira na to, trimetoprim i sulfametoksazol u kombinaciji se već desetljećima koriste kao antibakterijsko sredstvo.

Folat je neophodan za rast
, a put metabolizma folata je meta u razvoju tretmana za rak. DHFR je jedna od takvih meta. Pokazano je da režim fluorouracila, doksorubicin i metotreksata produžava preživljavanje kod pacijenata sa uznapredovalim karcinomom želuca. Daljnje studije inhibitora DHFR mogu dovesti do više načina liječenja raka.

Bakterijama je također potreban DHFR za rast i razmnožavanje, pa su stoga inhibitori selektivni za bakterijski DHFR našli primjenu kao antibakterijska sredstva.

Klase malih molekula koje se koriste kao inhibitori dihidrofolat-reduktaze uključuju diaminokinazolin i diaminopirolokvinazolin, diaminopirimidin,
diaminopteridin i diaminotriazin.

### Potencijalno liječenje antraksa 
[thumb|400px| Strukturno poravnanje dihidrofolat reduktaze iz *Bacillus anthracis* (BaDHFR), *Staphylococcus aureus* (SaDHFR), *[Escherichia coli*) (EcDHFR) i *Streptococcus pneumoniae* (SpDHFR).]]

Dihidrofolat-reduktaza iz *Bacillus anthracis* (BaDHFR) potvrđena je meta u liječenju zarazne bolesti, antraksa. BaDHFR je manje osjetljiv na analoge trimetoprima nego dihidrofolat-reduktaza drugih vrsta kao što su *Escherichia coli*, *Staphylococcus aureus* i *Streptococcus pneumoniae*. Strukturno poravnanje dihidrofolat-reduktaze iz sve četiri vrste pokazuje da samo BaDHFR ima kombinaciju fenilalanina i tirozina na pozicijama 96, odnosno 102.

Otpornost BaDHFR na analoge trimetoprima,  posljedica je ova dva ostatka (F96 i Y102), koji također daju poboljšanu kinetiku i katalitsku efikasnost. Sadašnja istraživanja koriste aktivne mutante u BaDHFR za usmjeravanje optimizacije olova za nove inhibitore antifolata.

## Alat za istraživanje 
DHFR se koristi kao alat za otkrivanje interakcija protein-protein u testu komplementacije protein-fragmenta (PCA).

### CHO ćelije 
DHFR kojima nedostaju CHO ćelije najčešće su korištene ćelijske linije za proizvodnju rekombinantnih proteina. Te ćelije se transfektiraju plazmidom koji nosi gen *dhfr* i gen za rekombinantni protein u jednom ekspresijskom sistemu, a zatim se podvrgavaju selektivnim uslovima u nedostajanju timidinske podloge. Opstaju samo ćelije s egzogenim genom DHFR, zajedno sa genom od interesa.

## Interakcije 
Pokazalo se da je dihidrofolat-reduktaza  u interakcijama sa GroEL i Mdm2.

## Mapa interaktivnog puta 
## Reference 
## Dopunska literatura 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 
* 

## Vanjski linkovi 
* 1988 Nobel lecture in Medicine
* Proteopedia: *Dihydrofolate reductase* 
* 

Kategorija:Proteinski domeni
Kategorija:EC 1.5.1
Kategorija:Enzimi poznate strukture