Transkriptomske tehnologije

**Transkriptomske tehnologije** su tehnike koje se koriste za proučavanje transkriptoma organizma, zbira svih njegovih RNK transkripata. Informacijski sadržaj organizma zabilježen je u DNK njegovog genoma i eksprimira se putem transkripcije. Ovdje iRNK služi kao privremena posrednička molekula u informacijskoj mreži, dok nekodirajuće RNK obavljaju dodatne raznolike funkcije. Transkriptom bilježi vremenski snimak ukupnih transkripata prisutnih u ćeliji. Transkriptomske tehnologije pružaju širok uvid u to koji su ćelijski procesi aktivni, a koji uspavani.
Glavni izazov u molekularnoj biologiji je razumjeti kako jedan genom dovodi do nastanka različitih ćelija. Drugi je kako je regulirana ekspresija gena.

Prvi pokušaji proučavanja cijelih transkriptoma započeli su početkom 1990-ih. Naknadni tehnološki napredak od kasnih 1990-ih više je puta transformirao ovo polje i učinio transkriptomiku široko rasprostranjenom disciplinom u biološkim naukama. Postoje dvije ključne savremene tehnike u ovom polju: mikročipovi, koji kvantificiraju skup unaprijed određenih sekvenci, i RNK-Seq, koji koristi sekvenciranje visokog protoka za snimanje svih transkripata. Kako se tehnologija poboljšavala, količina podataka proizvedenih svakim eksperimentom s transkriptomom se povećavala. Kao rezultat toga, metodi analize podataka su se stalno prilagođavale kako bi se preciznije i efikasnije analizirale sve veće količine podataka. Baze podataka transkriptoma posljedično su postale veće i korisnije kako istraživači nastavljaju prikupljati i dijeliti transkriptome. Bilo bi gotovo nemoguće interpretirati informacije sadržane u transkriptomu bez poznavanja prethodnih eksperimenata.

Mjerenje ekspresija gena organizma u različitim tkivima ili biofizičkim uslovima, ili u različitim vremenima, daje informacije o tome kako su geni regulirani i otkriva detalje o biologiji organizma. Također se može koristiti za zaključivanje o fenotipu prethodno neanalitiranim genima. Analiza transkriptoma omogućila je proučavanje kako se ekspresija gena mijenja u različitim organizmima i bila je instrumentalna u razumijevanju ljudskih bolesti. Analiza ekspresije gena u cjelini omogućava otkrivanje širokih koordiniranih trendova koji se ne mogu uočiti ciljanijim testovima.

## Historija
[thumb|upright=1.5|*Korištenje transkriptomskog metoda tokom vremena.* Objavljeni radovi koji se odnose na RNK-Seq (crno), RNK mikročip (crveno), eksprimiranu oznaku sekvence (plavo), [diferencijalni prikaz|digitalni diferencijalni prikaz (zeleno) i serijsku/kap analizu ekspresije gena (žuto) od 1990.]]
Transkriptomiku karakterizira razvoj novih tehnika koje su redefinirale ono što je moguće svake decenije ili nešto više i učinile prethodne tehnologije zastarjelim. Prvi pokušaj snimanja djelimičnog ljudskog transkriptoma objavljen je 1991. godine i izvijestio je o 609 sekvenci iRNK iz ljudskog mozga. i do 2015. godine objavljeni su transkriptomi za stotine osoba. Transkriptomi različitih bolesnih stanja, tkiva ili čak pojedinačnih ćelija se sada rutinski generiraju. Ova eksplozija u transkriptomici uzrokovana je brzim razvojem novih tehnologija s poboljšanom osjetljivošću i ekonomičnošću.

### Prije transkriptomike 
Studije pojedinačnih transkripata su se provodile nekoliko decenija prije nego što su bili dostupni bilo kakvi transkriptomski pristupi. Biblioteke svilenog moljca iRNK transkripti su prikupljeni i pretvoreni u komplementarnu DNK (cDNK) za skladištenje korištenjem reverzne transkriptaze krajem 1970-ih. Tokom 1980-ih, sekvenciranje niskog protoka korištenjem Sangerove metode korišteno je za sekvenciranje nasumičnih transkripata, proizvodeći eksprimirane oznake sekvenci (EST). Količine pojedinačnih transkripata kvantificirane su korištenjem metoda Northern blot, najlonske membranske sekvence, a kasnije i Lančana reakcija polimeraze s reverznom transkripcijom|kvantitativna PCR s reverznom transkriptazom (RT-qPCR), ali ovi metodi su mukotrpni i mogu uhvatiti samo mali pododjeljak transkriptoma. Posljedično, način na koji se transkriptom kao cjelina eksprimira i regulira ostao je nepoznat sve dok nisu razvijene tehnike većeg protoka.

### Rani pokušaji 
Riječ "transkriptom" prvi put je upotrijebljena 1990-ih. Godine 1995. razvijen je jeda n od najranijih transkriptomskih metoda zasnovanih na sekvenciranju, serijska analiza genske ekspresije (SAGE), koja je radila na principu Sangerovog sekvenciranja spojenih nasumičnih transkriptnih fragmenata. Transkripti su kvantificirani usklađivanjem fragmenata s poznatim genima. Varijanta SAGE-a koja koristi tehnike sekvenciranja visokog protoka, nazvana digitalna analiza [ ekspresije gena, također je kratko korištena. Međutim, ove metode su uveliko nadmašene visokopropusnim sekvenciranjem cijelih transkripata, što je pružilo dodatne informacije o strukturi transkripta kao što su varijante splajsovanja.

### Razvoj suvremenih tehnika 
Dominantne savremene tehnike, DNK-mikročipovi i RNK-Seq, razvijene su sredinom 1990-ih i 2000-ih. Mikročipovi koji mjere količinu definiranog skupa transkripata putem njihove hibridizacija s nizom komplementarnih sondi prvi put su objavljeni 2004. Tehnologija mikročipova omogućila je istovremenu analizu hiljada transkripata, uz znatno smanjene troškove po genu i uštedu rada. I uočeni oligonukleotidni nizovi i Affymetrix sekvence visoke gustoće bili su metod izbora za transkripcijsko profiliranje do kasnih 2000-ih.

RNK-Seq se postiže reverznom transkripcijom RNK *in vitro* i sekvenciranjem rezultirajućih cDNK. i korišten je 2004. godine za validaciju ekspresije deset hiljada gena kod *Arabidopsis thaliana*. Najraniji rad o RNK-Seq objavljen je 2006. godine sa sto hiljada transkripata sekvenciranih korištenjem 454 tehnologije. Ovo je bila dovoljna pokrivenost za kvantifikaciju relativne zastupljenosti transkripata. RNK-Seq je počeo da dobija na popularnosti nakon 2008., kada su nove Illumina tehnologije omogućile snimanje jedne milijarde transkriptnih sekvenci. Ovaj prinos sada omogućava kvantifikaciju i poređenje ljudskih transkriptoma.

## Prikupljanje podataka
Generiranje podataka o RNK transkriptima može se postići putem dva glavna principa: sekvenciranjem pojedinačnih transkripata (EST ili RNK-Seq) ili hibridizacijom transkripata u uređeni niz nukleotidnih proba (mikročipova). razbijanje makromolekula i nukleotidnih kompleksa, odvajanje RNK od neželjenih biomolekula, uključujući DNK, i koncentriranje RNK putem precipitacije iz rastvora ili elucije iz čvrste matrice. Izolirana RNK može se dodatno tretirati  DNKazom kako bi se probavili svi tragovi DNK. Neophodno je obogatiti informacijsku RNK jer ukupni ekstrakti RNK obično sadrže 98% ribosomske RNK. Obogaćivanje transkripta može se izvršiti metodima afiniteta za poli-A ili deplecijom ribosomske RNK, korištenjem sekvencno specifičnih proba. Degradirana RNK može uticati na rezultate naknadne analize; naprimjer, obogaćivanje  iRNK iz degradiranih uzoraka rezultirat će iscrpljivanjem 5' krajeva KRNA i neujednačenim signalom po cijeloj dužini transkripta. Snap zamrzavanje tkiva prije izolacije RNK je tipično, a vodi se računa da se smanji izloženost RNaze enzimima nakon što je izolacija završena. Iako se sada koriste metodi većeg protoka, EST biblioteke su obično pružale informacije o sekvenci za rane dizajne mikročipova; naprimjer, mikročip ječma je dizajniran od 350.000 prethodno sekvenciranih EST-ova.

### Serijska i kap analiza genske ekspresije (SAGE/CAGE)
[thumb|upright=2|*Sažetak [Serijska analiza ekspresije gena|SAGE.* Unutar organizama, geni se transkribiraju i splajsuju (kod eukariota) kako bi se proizveli zreli transkripti iRNK (crveno). iRNK se ekstrahuje iz organizma, a reverzna transkriptaza se koristi za kopiranje iRNK u stabilnu dvolančanu cDNK (ds-cDNK; plavo). U SAGE-u, ds-cDNK se probavlja pomoću restrikcijskih enzima (na lokaciji 'X' i 'X'+11), kako bi se proizveli fragmenti "oznake" od 11 nukleotida. Ove oznake se spajaju i sekvenciraju korištenjem dugog čitanja Sangerovog sekvenciranja (različite nijanse plave označavaju oznake iz različitih gena). Sekvence se dekonvoluiraju kako bi se pronašla učestalost svake oznake. Učestalost oznake može se koristiti za izvještavanje o transkripciji gena od kojeg oznaka potiče.]]
Serijska analiza ekspresije gena (SAGE) bila je razvoj EST metodologije s ciljem povećanja propusnosti generiranih oznaka i omogućavanja kvantifikacije količine transkripta. Stoga se Mjesto početka transkripcije gena može identificirati kada su oznake poravnate s referentnim genomom. Identificiranje mjesta početka gena korisno je za analizu promotora i za kloniranje cDNK pune dužine.

SAGE i CAGE metodi daju informacije o više gena nego što je to bilo moguće pri sekvenciranju pojedinačnih EST-ova, ali priprema uzoraka i analiza podataka obično zahtijevaju više rada. Brojnost transkripta određuje se hibridizacijom fluorescentno obilježenih transkripata s ovim sondama.intenzitet fluorescencije na svakoj lokaciji probe na sekvenci označava količinu transkripta za tu sekvencu probe. kapi niza pročišćenih cDNK raspoređenih na površini staklene pločice. Ove sonde su duže od onih s sekvencama visoke gustoće i ne mogu identificirati događaje alternativnog spajanja. Tačkaste sekvence koriste dva različita fluorofora za označavanje testnih i kontrolnih uzoraka, a omjer fluorescencije se koristi za izračunavanje relativne mjere obilja. Nizovi visoke gustoće koriste jednu fluorescentnu oznaku, a svaki uzorak se hibridizira i detektira pojedinačno. Nizovi visoke gustoće popularizirani su nizom Affymetrix GeneChip, gdje se svaki transkript kvantificira pomoću nekoliko kratkih 25 oligomernih sondi koje zajedno test jedan gen.

NimbleGen nizovi su bili nizovi visoke gustoće proizvedeni metodom maskless-fotohemija, koja je omogućavala fleksibilnu proizvodnju nizova u malim ili velikim količinama. Ovi nizovi su imali 100.000 proba od 45 do 85 mera i hibridizirani su s uzorkom označenim jednom bojom za analizu ekspresije. Neki dizajni su uključivali do 12 nezavisnih nizova po pločici.

### RNK-Seq
[thumb|upright=2|*Sažetak [RNK-Seq.* Unutar organizama, geni se transkribiraju i splajsiraju (kod eukariota) kako bi se proizveli zreli transkripti iRNK (crveno). iRNK se ekstrahira iz organizma, fragmentira i kopira u stabilnu ds-cDNK (plavo). ds-cDNK se sekvencira korištenjem visokog protoka, metod sekvenciranja kratkog čitanja. Ove sekvence se zatim mogu poravnati s referentnom sekvencom genoma kako bi se rekonstruiralo koje su regije genoma transkribirane. Ovi podaci se mogu koristiti za označavanje gdje se nalaze eksprimirani geni, njihovi relativni nivoi ekspresije i sve alternativne varijante splajsovanja. Teorijski, ne postoji gornja granica kvantifikacije u RNK-Seq, a pozadinska buka je vrlo niska za očitavanja od 100 bp u neponavljajućim regijama. Od prvih opisa 2006. i 2008., RNK-Seq je brzo usvojen i pretekao mikročipove kao dominantnu transkriptomsku tehniku 2015. godine.

Potraga za transkriptomskim podacima na nivou pojedinačnih ćelija dovela je do napretka u metodama pripreme RNA-Seq biblioteka, što je rezultiralo dramatičnim napretkom u osjetljivosti. Transkriptomi pojedinačnih ćelija su sada dobro opisani i čak su prošireni na *In situ* RNK-Seq gdje se transkriptomi pojedinačnih ćelija direktno ispituju u fiksiranim tkivima.

#### Metodi
RNK-Seq je osnovan u skladu s brzim razvojem niza visokopropusnih tehnologija sekvenciranja DNK]]. Međutim, prije nego što se ekstrahovani RNK transkripti sekvenciraju, provodi se nekoliko ključnih koraka obrade. Metodi se razlikuju u korištenju obogaćivanja transkripta, fragmentacije, amplifikacije, sekvenciranja jednog ili parnog kraja, te u tome da li se čuvaju informacije o lancu. Male RNK, kao što su mikro RNK, mogu se pročistiti na osnovu njihove veličine gel elektroforezom i ekstrakcijom.

Budući da su iRNK duže od dužina očitavanja tipičnih metoda sekvenciranja visokog protoka, transkripti se obično fragmentiraju prije sekvenciranja. Metod fragmentacije je ključni aspekt konstrukcije biblioteke sekvenciranja. Fragmentacija se može postići hemijskom hidrolizom, nebulizacijom, sonikacijom ili reverznom transkripcijom sa nukleotidima koji terminiraju lanac.

Tokom pripreme za sekvenciranje, kopije transkripata cDNK mogu se amplificirati pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR) kako bi se obogatile fragmentima koji sadrže očekivane 5' i 3' adapterske sekvence. Amplifikacija se također koristi kako bi se omogućilo sekvenciranje vrlo malih ulaznih količina RNK, čak do 50 pikograma (pg) u ekstremnim primjenama.Spike-in kontrole poznatih RNK mogu se koristiti za procjenu kontrole kvalitetas, kako bi se provjerila priprema i sekvenciranje biblioteke, u smislu GC-sadržaja, dužine fragmenta, kao i pristranosti zbog položaja fragmenta unutar transkripta.Jedinstveni molekularni identifikatori (UMI) su kratke nasumične sekvence koje se koriste za pojedinačno označavanje fragmenata sekvenci tokom pripreme biblioteke tako da je svaki označeni fragment jedinstven. UMI-ovi pružaju apsolutnu skalu za kvantifikaciju, mogućnost korekcije naknadne pristranosti amplifikacije uvedene tokom konstrukcije biblioteke i tačnu procjenu početne veličine uzorka. UMI-ovi su posebno pogodni za transkriptomiku RNK-Seq pojedinačnih ćelija, gdje je količina ulazne RNK ograničena i potrebna je proširena amplifikacija uzorka.

Nakon što su molekule transkripta pripremljene, mogu se sekvencirati u samo jednom smjeru (jednostruki kraj) ili u oba smjera (upareni kraj). Sekvenca jednostrukog kraja se obično brže proizvodi, jeftinija je od sekvenciranja uparenih krajeva i dovoljna je za kvantifikaciju nivoa ekspresije gena. Sekvenciranje uparenih krajeva proizvodi robusnija poravnanja/sklapanja, što je korisno za anotaciju gena i otkrivanje transkripta izoforma. Bez informacija o lancu, očitavanja se mogu poravnati s lokusom gena, ali ne informiraju u kojem smjeru se gen transkribira. Stranded-RNK-Seq je koristan za dešifriranje transkripcije za gene koji se preklapaju u različitim smjerovima i za donošenje robusnijih predviđanja gena u nemodelnim organizmima. Direktno sekvenciranje RNK korištenjem sekvenciranja nanopora predstavlja trenutno najsavremeniju tehniku RNK-Seq. Sekvenciranje RNK nanoporama može detektovati modifikovane baze koje bi inače bile maskirane prilikom sekvenciranja cDNK, a takođe eliminiše korake amplifikacije DNK koji bi inače mogli uvesti pristrasnost.

Osjetljivost i tačnost RNK-Seq eksperimenta zavise od broja očitavanja dobijenih iz svakog uzorka. Trenutni kriteriji koje preporučuje projekat Enciklopedija DNK elemenata (ENCODE) su 70-struka pokrivenost egzoma za standardno RNK-Seq i do 500-struka pokrivenost egzoma za detekciju rijetkih transkripata i izoformi.

## Analiza podataka 
Transkriptomske metode su visoko paralelne i zahtijevaju značajna izračunavanja kako bi se dobili značajni podaci za eksperimente s mikročipovima i RNK-Seq. Podaci mikročipova se snimaju kao slike visoke rezolucije, što zahtijeva detekciju karakteristika (računarski vid) i spektarsku analizu. Datoteke mikročipova u sirovim slikama su veličine oko 750 MB, dok su obrađeni intenziteti veličine oko 60 MB. Višestruke kratke sonde koje odgovaraju jednom transkriptu mogu otkriti detalje o strukturi intron-egzon, što zahtijeva statističke modele za utvrđivanje autentičnosti rezultirajućeg signala. Studije RNK-Seq proizvode milijarde kratkih DNK sekvenci, koje moraju biti usklađene sa referentnim genomom sastavljenim od miliona do milijardi baznih parova. *De novo* sastavljanje očitavanja unutar skupa podataka zahtijeva konstrukciju vrlo složenih grafova sekvenci. Ovaj primjer bi zahtijevao približno 1,8 gigabajta prostora na disku po uzorku kada se pohrani u komprimiranom fastq formatu. Obrađeni podaci o brojanju za svaki gen bili bi mnogo manji, ekvivalentni obrađenim intenzitetima mikročipova. Podaci o sekvenci mogu se pohraniti u javne repozitorije, kao što je Sequence Read Archive (SRA). RNK-Seq skupovi podataka mogu se učitati putem Gene Expression Omnibusa.]]
Mikročipna obrada slike mora ispravno identificirati regularnu mrežu karakteristika unutar slike i nezavisno kvantificirati fluorescenciju intenzitet za svaku karakteristiku. artefakti slike moraju se dodatno identificirati i ukloniti iz ukupne analize. Intenziteti fluorescencije direktno ukazuju na brojnost svake sekvence, budući da je sekvenca svake probe na nizu već poznata.

Prvi koraci RNA-sekvenciranja također uključuju sličnu obradu slike; međutim, konverziju slika u podatke o sekvenciranju obično automatski obavlja softver instrumenta. Metod sekvenciranja sintezom Illumina rezultira nizom klastera raspoređenih po površini protočne ćelije. Protočna ćelija se snima do četiri puta tokom svakog ciklusa sekvenciranja, sa ukupno desetinama do stotinama ciklusa. Klasteri protočnih ćelija su analogni tačkama mikročipa i moraju se ispravno identificirati tokom ranih faza procesa sekvenciranja. U metodi pirosekvenciranja kompanije Roche, intenzitet emitirane svjetlosti određuje broj uzastopnih nukleotida u homopolimernom ponavljanju. Postoje mnoge varijante ovih metoda, svaka sa drugačijim profilom greške za rezultirajuće podatk.
### Analiza podataka RNK-Seq 
RNK-Seq eksperimenti generiraju veliku količinu sirovih sekvenci koje se moraju obraditi kako bi se dobile korisne informacije. Analiza podataka obično zahtijeva kombinaciju bioinformatičkog softverskog alata (pogledajte također Lista bioinformatičkih alata RNK-Seq) koji variraju u zavisnosti od eksperimentalnog dizajna i ciljeva. Proces se može podijeliti u četiri faze: kontrola kvaliteta, poravnanje, kvantifikacija i diferencijalna ekspresija. Većina popularnih RNK-Seq programa se pokreće iz sučelja komandne linije, bilo u Unix okruženju ili unutar statističkog okruženja programski biokonduktor.

#### Kontrola kvaliteta 
Očitavanja sekvenci nisu savršena, tako da je potrebno procijeniti tačnost svake baze u sekvenci za daljnje analize. Sirovi podaci se ispituju kako bi se osiguralo: da su rezultati kvaliteta za pozive baza visoki, da se GC sadržaj podudara s očekivanom distribucijom, da kratki motivi sekvenci (k-meri) nisu previše zastupljeni i da je stopa duplikacije očitavanja prihvatljivo niska. Abnormalnosti se mogu ukloniti (skraćivati) ili označiti za poseban tretman tokom kasnijih procesa.

#### Poravnanje 
Da bi se povezala brojnost očitavanja sekvenci sa ekspresijom određenog gena, transkriptne sekvence se poravnavaju sa referentnim genomom ili *de novo* poravnavaju jedna s drugom ako referenca nije dostupna. Ključni izazovi za softver za poravnanje uključuju dovoljnu brzinu koja omogućava poravnanje milijardi kratkih sekvenci u značajnom vremenskom okviru, fleksibilnost za prepoznavanje i rješavanje intronskog splajsovanja eukariotske iRNK i ispravno dodjeljivanje očitavanja koja se mapiraju na više lokacija. Napredak softvera je u velikoj mjeri riješio ove probleme, a povećanje dužine sekvenciranja smanjuje vjerovatnoću dvosmislenih poravnanja očitavanja. Listu trenutno dostupnih visokopropusnih poravnavača sekvenci održava EBI.

Poravnanje sekvenci primarnog transkripta iRNK izvedenih iz eukariota s referentnim genomom zahtijeva specijalizirano rukovanje sekvencama introna, koje nisu prisutne u zreloj iRNK. Poravnavači kratkog čitanja izvode dodatnu rundu poravnanja posebno dizajniranih za identifikaciju spojeva spajanja, informiranih kanonskim sekvencama mjesta spajanja i poznatim informacijama o mjestu spajanja introna. Identifikacija spojeva introna spajanja sprječava pogrešno poravnanje očitavanja preko spojeva spajanja ili pogrešno odbacivanje, omogućavajući poravnanje više očitavanja s referentnim genomom i poboljšavajući tačnost procjena ekspresija gena. Budući da se regulacija gena može dogoditi na nivou izoforme iRNK, poravnanja svjesna spajanja također omogućavaju detekciju promjena u broju izoformi koje bi se inače izgubile u skupnoj analizi.

*De novo* sklop se može koristiti za poravnavanje očitavanja jednih s drugima kako bi se konstruirale transkriptne sekvence pune dužine bez upotrebe referentnog genoma. Izazovi specifični za *de novo* sastavljanje uključuju veće računarske zahtjeve u poređenju sa transkriptomom zasnovanim na referencama, dodatnu validaciju genskih varijanti ili fragmenata i dodatne anotacije sastavljenih transkripata. Prve metrike korištene za opisivanje sklopova transkriptoma, kao što su N50, pokazale su se obmanjujućim i poboljšane metode evaluacije su sada dostupne. Metrike zasnovane na anotacijama su bolje procjene potpunosti sastavljanja, kao što je contig recipročni broj najboljih pogodaka. Nakon što se sastavi *de novo*, sklop se može koristiti kao referenca za naknadne metode poravnanja sekvenci i kvantitativnu analizu ekspresije gena.

 Legenda: RAM – memorija sa slučajnim pristupom; MPI – interfejs za prenos poruka; EST – izražena sekvencna oznaka.

#### Kvantifikacija 
[thumb|upright=1.6|*[Heatmap identifikacija obrazaca koekspresije gena u različitim uzorcima.* Svaka kolona sadrži mjerenja za promjenu ekspresije gena za jedan uzorak. Relativna ekspresija gena je označena bojom: visoka ekspresija (crvena), srednja ekspresija (bijela) i niska ekspresija (plava). Geni i uzorci sa sličnim profilima ekspresije mogu se automatski grupirati (lijevo i gornje stablo). Uzorci mogu biti različite osobe, tkiva, okruženja ili zdravstvena stanja. U ovom primjeru, ekspresija genskog seta 1 je visoka, a ekspresija genskog seta 2 je niska u uzorcima 1, 2 i 3.]]
Kvantifikacija poravnanja sekvenci može se izvršiti na nivou gena, eksona ili transkripta. Kvantifikacija na nivou transkripta je složenija i zahtijeva probabilističke metode za procjenu količine izoformi transkripta iz informacija o kratkom očitavanju; naprimjer, korištenjem softvera za manžetne.

#### Diferencijalna ekspresija 
Nakon što su dostupni kvantitativni podaci o svakom transkriptu, diferencijalna ekspresija gena se mjeri normalizacijom, modeliranjem i statističkom analizom podataka.

 Legenda: iRNK – informacijska RNK.

### Validacija 
Transkriptomske analize mogu se validirati korištenjem nezavisne tehnike, na primjer, kvantitativna PCR (qPCR), koja je prepoznatljiva i statistički procijenjiva. Ekspresija gena se mjeri u odnosu na definirane standarde i za gen od interesa i za kontrolne gene. Mjerenje pomoću qPCR-a slično je onome dobivenom RNK-Seq-om, gdje se vrijednost može izračunati za koncentraciju ciljne regije u datom uzorku. Međutim, qPCR je ograničen na amplikone manje od 300 bp, obično prema 3' kraju kodirajuće regije, izbjegavajući 3'UTR. Ako je potrebna validacija izoformi transkripta, pregled poravnanja RNK-Seq očitavanja trebao bi ukazati gdje bi se qPCR Prajmeri mogu se postaviti za maksimalnu diskriminaciju. Mjerenje više kontrolnih gena zajedno s genima od interesa daje stabilnu referencu unutar biološkog konteksta. qPCR validacija RNK-Seq podataka uglavnom je pokazala da su različiti RNK-Seq metodi visoko korelirane.

Funkcionalna validacija ključnih gena je važno razmatranje za planiranje nakon transkriptoma. Uočeni obrasci ekspresije gena mogu se funkcionalno povezati sa fenotipom nezavisnom studijom nok-daun/spašavanje u organizmu od interesa.

## Aplikacije 
### Dijagnostika i profiliranje bolesti 
Transkriptomske strategije su se široko primjenjivale u različitim područjima biomedicinskih istraživanja, uključujući dijagnozu bolesti i profiliranje bolesti. RNK-Seq pristupi su omogućili identifikaciju transkripcijskih početnih mjesta velikih razmjera, otkrivenu alternativnu upotrebu promotora i nove promjene u alternativnom splajsovanju. Ovi regulatorni elementi su važni kod ljudskih bolesti i stoga je definiranje takvih varijanti ključno za interpretaciju studija asocijacije na nivou cijelog genoma. RNK-Seq također može identificirati jednonukleotidni polimorfizam (SNP-ove) povezane s bolešću, alel-specifičnu ekspresiju i genske fuzije, što doprinosi razumijevanju uzročnih varijanti bolesti.

Retrotranspozoni su transpozabilni elementi koji se razmnožavaju unutar eukariotskih genoma, procesom koji uključuje reverznu transkripciju. [RNK-Seq može pružiti informacije o transkripciji endogenih retrotranspozona koji mogu uticati na transkripciju susjednih gena putem različitih epigenetičkih mehanizama koji dovode do bolesti. Slično tome, potencijal korištenja RNK-Seq za razumijevanje bolesti povezanih s imunskim sistemom se brzo širi zbog mogućnosti disekcije populacija imunskih ćelija i sekvenciranja T-ćelija i B ćelijskih receptora repertoara pacijenata.

### Transkriptomi ljudi i patogena 
RNK-Seq ljudskih patogena postao je utvrđeni metod za kvantificiranje promjena u ekspresiji gena, identifikaciju novih faktora virulencije, predviđanje otpornosti na antibiotike i otkrivanje interakcije domaćina i patogena. Primarni cilj ove tehnologije je razvoj optimiziranih mjera kontrola infekcije i ciljanog individualiziranog tretmana.

Transkriptomska analiza se pretežno fokusirala ili na domaćina ili na patogen. Dvostruko RNK-Seq je primijenjeno za istovremeno profiliranje ekspresije RNK i u patogenu i u domaćinu tokom cijelog procesa infekcije. Ova tehnika omogućava proučavanje dinamičkog odgovora i međuvrsnih mreža regulatornih gena kod oba partnera u interakciji od početnog kontakta do invazije i konačne perzistencije patogena ili uklanjanja od strane imunskog sistema domaćina.

### Reakcije na okolinu 
Transkriptomika omogućava identifikaciju gena i puteva koji reaguju na i suzbijaju biotički i abiotičke stresove okoline Ispitivanje ekspresija gena tokom formiranja biofilma od strane gljivičnog patogena *Candida albicans* otkrilo je koregulirani skup gena ključnih za uspostavljanje i održavanje biofilma.

Transkriptomsko profiliranje također pruža ključne informacije o mehanizmima otpornosti na lijekove. Analiza preko 1000 izolata *Plasmodium falciparum*, virulentnog parazita odgovornog za malariju kod ljudis, identificirali su da su pojačana regulacija odgovora na nesavijeni protein i sporije napredovanje kroz rane faze aseksualnog intraeritrocitnog razvojni ciklus povezani s rezistencijom na artemizinin u izolatima iz Jugoistočne Azije.

Upotreba transkriptomike je također važna za istraživanje odgovora u morskom okruženju. U morskoj ekologiji, "stres" i "adaptacija" su među najčešćim istraživačkim temama, posebno vezanim za antropogeni stres, kao što su globalne promjene i zagađenje. Integracija RNK-Seq skupova podataka u različitim tkivima korištena je za poboljšanje anotacije genskih funkcija kod komercijalno važnih organizama (npr. krastavac ili ugrožene vrste (npr. koala).

Sklapanje RNK-Seq očitavanja ne zavisi od referentnog genoma i stoga je idealan za studije ekspresije gena nemodelnih organizama s nepostojećim ili slabo razvijenim genomskim resursima. Naprimjer, baza podataka SNP-ova korištenih u programima oplemenjivanja duglasova jela kreirana je *de novo* analizom transkriptoma u odsustvu sekvenciranog genoma. Slično tome, geni koji funkcionišu u razvoju srčanog, mišićnog i nervnog tkiva kod jastoga identifikovani su poređenjem transkriptoma različitih tipova tkiva bez upotrebe genomske sekvence. RNK-Seq se također može koristiti za identifikaciju prethodno nepoznatih regija koja kodira protein u postojećim sekvenciranim genomima.

### Nekodirajuća RNK 
Transkriptomika se najčešće primjenjuje na sadržaj iRNK u ćeliji. Međutim, iste tehnike su podjednako primjenjive na nekodirajuće RNK (ncRNK) koje se ne translatiraju u protein, već imaju direktne funkcije (npr. uloge u translaciji proteina, replikaciji DNK, splajsovanju RNK i regulaciji transkripcije). Mnoge od ovih ncRNK utiču na bolesna stanja, uključujući kancer, kardiovaskularne i neurološke bolesti.

## Transkriptomske baze podataka 
Transkriptomske studije generiraju velike količine podataka koji imaju potencijalne primjene daleko izvan prvobitnih ciljeva eksperimenta. Kao takvi, sirovi ili obrađeni podaci mogu se pohraniti u javne baze podataka kako bi se osigurala njihova korisnost za širu naučnu zajednicu. Naprimjer, od 2018. godine, Gene Expression Omnibus sadržavao je milione eksperimenata.

 Legenda: NCBI – Nacionalni centar za biotehnološke informacije; EBI – Evropski bioinformatički institut; DDBJ – Banka podataka DNK Japana; ENA – Evropski arhiv nukleotida; MIAME – Minimalne informacije o eksperimentu mikročipova; MINSEQE – Minimalne informacije o eksperimentu sekvenciranja nukleotida visokog protoka.

## Također pogledajte 
* Omika
** Genomika
** Proteomika
** Metabolomika
** Interaktomika
## Reference 
### Bilješke 
## Dopunska literatura
* 
* Comparative Transcriptomics Analysis in Reference Module in Life Sciences
* Software used in transcriptomics:
** cufflinks
** kallisto
** tophat

Kategorija:Omike
Kategorija:Molekularna biologija
Kategorija:Biotehnologija