Nasumična amplifikacija polimorfne DNK

mini|RAPD eksperiment
**Nasumična amplifikacija polimorfne DNK** ( – **RAPD** /čita se "rapid"/) jest vrsta PCR reakcije u kojoj su umnožavajući segmenti DNK  slučajni. Za  RAPD proceduru stvara se nekoliko proizvoljnih, kratkih prajmera  (početnica), sa  8-12 nukleotida, a zatim se nastavlja PCR procesuiranje koristeći veliki predložak genomske DNK, očekujući amplifikaciju fragmenta. Na  završetku obrade  nastalih uzoraka  iz RAPD reakcije, mogu se  prikupiti polu-jedinstveni profili.

RAPD markeri su dekameri (dugi 10 nukleotida) DNK fragmenata iz PCR amplifikacije nasumičnih segmenata genomske  DNK sa jednostavnim prajmerima arbitrarnih nukleotidnih sekvenci koje su sposobne diferencirati genetički distinktne jedinke iako ne nužno na ponovljivi način. Koristi se za analizu genetičke raznolikosti individua  pomoću nasumičnih  prajmera. Zbog problema u eksperimentu obnovljivosti, mnogi znanstveni časopisi više  ne prihvataju rezultate  eksperimenata samo na osnovu RAPD analize.

RAPD-u je za umnožavanje potreban samo jedan prajmer.

Za RAPD analizu nije potrebno poznavanje  DNK sekvenci ciljanih genoma, jer će se prajmer negdje vezati u njihovom  nizu, ali nije pouzdano tačno gdje. To čini ovu metoda popularnom za poređenje DNK onih bioloških sistema koji prethodno nisu bili dovoljno istraženi ili sistema u kojima je relativno malo DNK sekvenci. Nije pogodan za formiranje DNK baze podataka zato što se oslanja na velike , neoštećene početne   DNK nizove, pa ima neka ograničenja u korištenju degradiranih DNK uzoraka. Njegova moć detekcije  je znatno niža od ciljane, po  vrstama  specičnih  metoda usporedbe DNK, kao što su kratka tandemska ponavljanja.
U posljednjih nekoliko godina, RAPD se koristi za karakterizaciju i traganje u filogeniji raznih biljnih i životinjskih vrsta.

## Djelovanje
Za razliku od tradicionalnih PCR analiza, RAPD ne zahtijeva nikakva posebna znanja o DNK sekvencama ciljnog organizma: identični 10-merni prajmer će ili neće amplificirati neki segment DNK, ovisno o pozicijama prajmeru  komplementarnih sekvenci. Na primjer, nijedan fragment se neće proizvesti ako je prajmer priključenog segmenta suviše daleko ili ako on i  3 'kraj prajmera nisu okrenuti jedan prema drugom. Stoga, ako je došlo do mutacije u DNK predloška na lokaciji koja je prethodno bila komplementarna prajmer, neće biti proizveden PCR proizvod, što  rezultira različitim obilježjima umnoženog DNK segmenata na gelu.
## Primjer
RAPD je jeftin, ali moćan metod tipizacije za mnoge vrste bakterija. Slika vidljiva na linku http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/IMG/zjm0010661110001.jpg je srebrno-obojen poliakrilamid gel koji pokazuje tri različita RAPD profila generirana prajmerom *OPE15* za *Haemophilus ducreyi* izolate  iz Tanzanije, Senegala, Tajlanda, Evrope  i Sjeverne Amerike.
Izbor prave sekvence za prajmer je veoma važno jer različite sekvence će proizvesti različite ishode i eventualno omogućiti konkretnije prepoznavanje individualnih sojeva pojedina http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/IMG/zjm0010661110001.jpg
;Prajmer: '''5'-A-C-C-G-T-3'**
;Amplificirana DNK: **5'-A-C-C-G-T-G-G-G-T-C-A-A-C-T-G-G-C-G-C-****A-C-C-G-T-A-A-T-T-G-G-C-A-3'3'-****T-G-G-C-A-C-C-C-A-G-T-T-G-A-C-C-G-C-G-T-G-G-C-A-T-T-A-****A-C-C-G-T-5'**
**Prajmerska sekvenca**, **Komplementarna sekvenca**

## Ograničenja RAPD analize
* Gotovo svi RAPD markeri su dominantni, odnosno nije moguće razlikovati da li je DNK segment je umnožen sa lokusa koji je heterozigot i ima jednu kopiju ili homozigot, sa dvije kopije produktivnog alela). Kodominantni RAPD markeri, posmatrani  kao različite veličine DNK segmenata koji su  umnoženi iz istog lokusa, otkriveni su samo rijetko.
* PCR je enzimska reakcija pa  kvalitet i koncentracija kalupa DNK, koncentracije PCR komponenti, u PCR  bicikličnim uvjetima može uveliko uticati na ishod. Dakle, RAPD tehnika zavisi notorno od uvjeta laboratorija i potrebe pažljivog razvijanja ponovljivih  laboratorijskih  protokola.
* Promašaji između prajmer i uzoraka mogu dovesti do potpunog odsustvo PCR proizvoda ili samo do   smanjene količine proizvoda. Dakle, može se desiti da je  rezultate RAPD-a  teško interpretirati.
## Lokus-specifični, kodominantni RAPD markeri
* Polimorfni  RAPD marker bend je izolovan iz  gela.
* To je pojačalo PCR reakciju.
* PCR proizvod je kloniran i sekvenciran.
* Dizajnirani su novi,  duži i specifični prajmer za DNK sekvencu, zvani sekvencirani karakterizirani amplificirani regionlni marker (**S**equenced **C**haracterized **A**mplified **R**egion marker: (**SCAR''').

## Također pogledajte
*Genetički marker
*Restrikcijski enzim
*DNK
*Dominantnost
*Kodominantnost

## Reference
Kategorija:Molekularna biologija
Kategorija:DNK