Gramov metod bojenja

[thumb|[Mikrografija Gram-pozitivnog kokusa i Gram-negativnog štapića.]] [thumb| Gramov metod bojenja miješanih bakterija *[Staphylococcus aureus* (*S. aureus* ATCC 25923, Gram-pozitivna bakterija|Gram-poizivne koke, ljubičaste boje) i *Escherichia coli* (*E. coli* ATCC 11775, Gram-negativnih bacila, crvene boje), najčešće referentne bakterije za Gramovo bojenje]]

**Gramova metoda** (**Gramovo bojenje** ili **Gramov metod**) je naćin bojenja koji se koristi za klasifikaciju vrsta bakterija u dvije velike grupe: Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije. Može se koristiti i za dijagnosticiranje gljivične infekcije. Naziv potiče od danskog bakteriologa Hansa Christiana Grama, koji je razvio tehniku ​​1884.

Gramovo bojenje razlikuje bakterije prema hemijskim i fizičkim svojstvima njihovih ćelijskih zidova. Gram-pozitivne ćelije imaju debeli sloj peptidoglikana u ćelijskom zidu koji zadržava primarnu boju, kristal ljubičastu. Gram-negativne ćelije imaju tanji sloj peptidoglikana koji omogućava ispiranje kristal ljubičaste nakon dodavanja etanola. Boje se ružičasto ili crveno kontrabojom,

Bojenje po Gramu je gotovo uvijek prvi korak u identifikaciji bakterijske grupe. Iako je bojenje po Gramu vrijedan dijagnostički alat i u kliničkim i u istraživačkim okruženjima, ne mogu se sve bakterije definitivno klasificirati ovom tehnikom. To dovodi do *gram-varijabilnih* i *gram-neodređenih* grupa.

## Historija 
Metoda je dobila ime po svom izumitelju, danskom naučniku Hansu Christianu Gramu (1853–1938), koji je razvio tehniku radeći sa Carlom Friedländerom u mrtvačnici gradske bolnice u Berlinu 1884. Gram je osmislio svoju tehniku ne s ciljem razlikovanja jedne vrste bakterija od druge, već da bi bakterije bile vidljivije u obojenim presjecima plućnog tkiva. Gram je primijetio da neke bakterijske ćelije posjeduju značajnu otpornost na promjenu boje. Na osnovu ovih zapažanja, Gram je razvio početni postupak bojenja po Gramu, u početku koristeći Ehrlichovu anilin-encijan ljubičastu, Lugolov jod, apsolutni alkohol za promjenu boje i Bismarck smeđu za kontrastno bojenje. Svoju metodu je objavio 1884. godine i u svoj kratki izvještaj uključio zapažanje da tifusni bacil nije zadržao boju. Gram did not initially make the distinction between Gram-negative and Gram-positive bacteria using his procedure. koristi se za razlikovanje bakterijskih vrsta u dvije velike grupe (Gram-pozitivne i Gram-negativne) na osnovu fizičkih svojstava njihovih ćelijskih zidova. Bojenje po Gramu se također može koristiti za dijagnosticiranje gljivične infekcije.

Gram bojenje se izvodi na tjelesnoj tekućini ili biopsijsma, kada se sumnja na infekciju. Gram bojenje daje rezultate mnogo brže od mikrobiološke kulture i posebno je važno kada infekcija može značajno uticati na liječenje i prognozu pacijenta; primjeri su cerebrospinalna tekućina za meningitis i sinovijalna tekućina za sepsni artritis.

## Mehanizam bojenja 
thumb| Ljubičasto obojene Gram-pozitivne (lijevo) i ružičasto obojene Gram-negativne (desno)
Gram-pozitivne bakterije imaju debeli mrežasti ćelijski zid napravljen od peptidoglikana (50–90% ćelijske ovojnice), te se kao rezultat toga boje ljubičasto kristal ljubičastom bojom, dok gram-negativne bakterije imaju tanji sloj (10% ćelijske ovojnice), pa ne zadržavaju ljubičastu boju i kontrastno se boje ružičasto safraninom. Postoje četiri osnovna koraka bojenja po Gramu:
# Nanošenje primarne boje (kristal ljubičasta) na razmaz bakterijske kulture fiksiran toplotom. Fiksacija toplotom ubija neke bakterije, ali se uglavnom koristi za pričvršćivanje bakterija na pločicu kako se ne bi isprale tokom postupka bojenja.
# Dodavanje joda, koji se veže za kristal ljubičastu boju i zadržava je u ćeliji
# Brza dekolorizacija sa etanolom ili acetonom
# Kontrastno bojenje sa safraninom. Karbol fuksin se ponekad koristi kao zamjena za safranin jer intenzivnije boji anaerobne bakterije, ali se rjeđe koristi kao kontrastna boja.

Kristalno ljubičasta (CV) disocira u vodenim rastvorima na  i hloridne () ione. Ovi ioni prodiru u ćelijski zid i Gram-pozitivnih i Gram-negativnih ćelija.  ion interreaguje sa negativno naelektrisanim komponentama bakterijskih ćelija i boji ćelije u ljubičasto..

Jodid ( ili ) međureaguje sa  i formira velike komplekse kristal ljubičaste boje i joda (CV–I) unutar unutrašnjih i vanjskih slojeva ćelije. Jod se često naziva mordant, ali je sredstvo za hvatanje koje sprječava uklanjanje CV–I  kompleksa i stoga boji ćeliju.

Kada se doda sredstvo za uklanjanje boje poput alkohola ili acetona, ono stupa u interakciju s lipidima ćelijske membrane. Gram-negativna ćelija gubi svoju vanjsku lipopolisaharidnu membranu, a unutrašnji sloj peptidoglikana ostaje izložen. CV–I kompleksi se ispiru iz gram-negativne ćelije zajedno s vanjskom membranom. Nasuprot tome, Gram-pozitivna ćelija dehidrira tretmanom etanolom. Veliki CV–I kompleksi ostaju zarobljeni unutar Gram-pozitivne ćelije zbog višeslojne prirode njenog peptidoglikana.

Nakon obezbojenja, Gram-pozitivna ćelija ostaje ljubičasta, a 
Gram-negativna  gubi svoju ljubičastu boju. == Examples ==

### Gram-pozitivne bakterije 
[thumb| Gram-bojenje Gram-pozitivnih [streptokoka okruženih gnojnim ćelijama]]

Gram-pozitivne bakterije uglavnom imaju jednu membranu (*monoderma*) okruženu debelim peptidoglikanom.
Ovo pravilo slijede dva koljena: Bacillota (osim klasa Mollicutes i Negativicutes) i Actinomycetota. Nasuprot tome, članovi Chloroflexota (zelene nesumporne bakterije) su monodermne, ali posjeduju tanak ili odsutan (klasa Dehalococcoidetes) peptidoglikan i mogu se obojiti negativno, pozitivno ili neodređeno; članovi Deinococcota se boje pozitivno, ali su diderme s debelim peptidoglikanom.

Historijski gledano, Gram-pozitivni oblici su činili koljeno Firmicutes, naziv koji se sada koristi za najveću grupu. Uključuje mnoge poznate rodove kao što su *Lactobacillus, Bacillus*, *Listeria*, *Staphylococcus*, *Streptococcus*, *Enterococcus* i *Clostridium*. Također je proširen i na Mollicutes, bakterije poput *Mycoplasma i Thermoplasma* koje nemaju ćelijske zidove i stoga se ne mogu bojeti po Gramu, ali su izvedene iz takvih oblika.

Neke bakterije imaju ćelijske zidove koji su posebno sposobni u zadržavanju boja. One će izgledati pozitivne Gramovom metodom bojenja iako nisu blisko povezane s drugim Gram-pozitivnim bakterijama. One se nazivaju kiselootporne bakterije i mogu se razlikovati od drugih Gram-pozitivnih bakterija samo posebnim postupcima bojenja.

### Gram-negativne bakterije 
[right|thumb| Gram negativne [Neisseria gonorrhoeae i gnojne ćelije]]
Gram-negativne bakterije uglavnom posjeduju tanki sloj peptidoglikana između dvije membrane (*diderma*). Lipopolisaharid (LPS) je najzastupljeniji antigen na površini ćelija većine Gram-negativnih bakterija, čineći do 80% vanjske membrane *E. coli* i  roda *Salmonella*. Ove LPS molekule, koja se sastoje od O-antigena ili O-polisaharida, središnjeg polisaharida i lipida A, imaju višestruke funkcije, uključujući doprinos negativnom naboju ćelije i zaštitu od određenih hemikalija. Uloga LPS-a je ključna u interakcijama domaćina i patogena, pri čemu O-antigen izaziva imunski odgovor, a lipid A djeluje kao endotoksin. U kulturama *Bacillus, Butyrivibrio* i *Clostridium*, smanjenje debljine peptidoglikana tokom rasta podudara se s povećanjem broja ćelija koje boje Gram-negativne bakterije. Bakterije roda *Mycoplasma* nemaju ćelijski zid oko svojih ćelijskih membrana, što znači da se ne boje Gramovom metodom i otporne su na antibiotike koji ciljaju sintezu ćelijskog zida.
## Ortografska napomena 
Termin *Gramovo bojenje* potiče od prezimena Hans Christian Gram; eponim (Gram) se stoga piše velikim slovom, ali ne i zajednička imenica (boja) kao što je uobičajeno za naučne termine. Početna slova riječi *gram-pozitivni* i *gram-negativni*, koja su eponimni pridjevi, mogu biti veliko *G* ili malo *g*, ovisno o tome koji stilski vodič (ako postoji) reguliše dokument koji se piše. Stil s malim slovima koriste američki Centri za kontrolu i prevenciju bolesti i drugi stilski režimi kao što je AMA stil. 
## Također pogledajte
* Struktura bakterijske ćelije
* Ziehl-Neelsenova boja

## Reference 
## Vanjski  linkovi 
* Gram staining technique video

Kategorija:Bakteriologija
Kategorija:Mikrobiologija
Kategorija:Mikroskopija
Kategorija:Boje
Kategorija:1884. u biologiji