Trolančana DNK

[thumb|right|Trostruka struktura DNK. Strelice idu od kraja 5' do kraja 3' d. ([PDB|1BWG)]]
**Trolančana DNK** (također poznata kao **H-DNK** ili **tripleksna-DNK**) je struktura DNK u kojoj se tri oligonukleotida vijugaju jedan oko drugog i formiraju trostruku spiralu. U trolančanoj DNK, treći lanac se vezuje za DNK oblika B-DNK (preko Watson-Crickovog uparivanje baza) u dvostruku spiralu
formiranjem Hoogsteenovih baznih parova ili obrnutih Hoogsteenovih vodikovih veza.

## Struktura 
300px|thumb|right|Prostorna strukturta trolančane DNK
Primjeri trolančane DNK pronađeni su u prirodnim izvorima sa potrebnim strukturnim elementima, naprimjer u satelitskoj DNK.

### Uparivanje Hoogsteenovih baza 
Timinska (T) nukleobaza može se vezati za Watson–Crickovo uparivanje baza T-A formiranjem Hoogsteenove vodikove veze. Timinski vodik se veže sa adenozinom (A) originalne dvolančane DNK, kako bi stvorio T-A*T bazni triplet.

### Međumolekulske i unutarmolekulske interakcije 
thumb|Osnovne trijade H-DNK tripleksa: CG*G, TA*A, TA*T, na CG*A+.|260x260px
Postoje dvije klase tripleksne DNK: međumolekulske i unutarmolekulske formacije. Međumolekulski tripleks se odnosi na formiranje tripleksa između dupleksa i drugačijeg (trećeg) lanca DNK. Treći lanac može biti ili iz susjednog hromosoma ili oligonukleotida koji formira tripleks (TFO). Unutarmolekulski tripleks DNK formira se od dupleksa sa homopurinom i homopirimidinskim lancima sa simetrijom ponavljanja kao slika u ogledalu. Stepen uvijanja superspirala u DNK utiče na količinu formiranja unutarmolekulskog tripleksa koja se javlja.  Postoje dva različita tipa unutarmolekulske tripleksne DNK: H-DNK i H*-DNK. Formiranje H-DNK se stabilizuje u kiselim uslovima i u prisustvu divalentnih kationa, kao što je Mg2+. U ovoj konformaciji, homopirimidinski lanac u dupleksu se savija unazad, kako bi se vezao za purinski lanac na paralelan način. Osnovni trolanci koji se koriste za stabilizaciju ove konformacije su T-A*T i C-G*A+. Citozin ove bazne trijade treba biti protoniran da bi se formirao ovaj unutarmolekulski trostruki heliks, zbog čega se ova konformacija stabilizuje u kiselim uslovima. H*-DNK ima povoljne uslove za formiranje pri neutralnom pH i u prisustvu dvovalentnih kationa.

TFO se specifično vezuju za homopurin-homopirimidinske regije koje su često uobičajene u promotorskim i intronskim sekvencama gena, utičući na ćelijsku signalizaciju. TFO mogu inhibirati transkripciju, vezujući se sa visokom specifičnošću za spiralu DNK, čime blokiraju vezivanje i funkciju faktora transkripcije za određene sekvence. Uvođenjem TFO-a u ćeliju (transfekcijom ili drugim sredstvima), može se kontrolisati ekspresija određenih gena. Ova aplikacija ima nove implikacije u mutagenezi specifičnoj za mjesto i genskoj terapiji. U ljudskim ćelijama raka prostate, transkripcijski faktor Ets2 je pretjerano izražen i smatra se da pokreće rast i preživljavanje ćelija u takvom višku. Carbone et al. dizajnirali su TFO specifičan za sekvencu za Ets2 promotorsku sekvencu koja je smanjila ekspresiju gena i dovela do usporavanja ćelijski rast i smrti ćelije. Changxian et al. su također predstavili TFO koji cilja na promotorsku sekvencu bcl-2, gena koji inhibira apoptozu.

Uočena inhibicija transkripcije također može imati negativne zdravstvene efekte kao što je njena uloga u recesivnom, autosomnom genu za Friedreichovu ataksiju. Kod Fredrickove ataksije, formiranje tripleksa DNK narušava ekspresiju intron 1 gena FXN. To dovodi do degeneracije nervnog sistema i kičmene moždine, ometajući kretanje udova.] Za borbu protiv ove tripleksne nestabilnosti, pokazalo se da proteini za popravku ekscizijom nukleotida (NER) prepoznaju i popravljaju trolančane DNK strukture, vraćajući potpunu dostupnost prethodno inhibiranog i nestabilnog gena.
[thumb|Struktura PNA. [PDB ID: 1PNN *Proteopedia*]]

### Peptidne nukleinske kiseline (PNA) 
Peptidne nukleinske kiseline su sintetski oligonukleotidi koji se odupiru degradaciji proteazama i koriste se za induciranje popravke u regijama formiranja tripleksa specifičnih za mjesto na genomskim mjestima DNK. PNA su u stanju da se vežu sa visokim afinitetom i specifičnošću sekvence za komplementarnu sekvencu DNK putem Watson-Crickovog uparivanje baza i mogu da formiraju trostruke spirale kroz paralelne orijentacije Hoogsteenove veze sa PNA okrenutim ka 5' -kraju DNK lanca. PNA-DNK tripleks je stabilan jer se PNA sastoje od neutralno nabijene pseudopeptidne kičme koja se veže za sekvencu dvolančane DNK (dsDNA).. Slično kao homopirimidin u TFO, homopirimidin u PNA je u stanju da formira vezu sa komplementarnim homopurinom u ciljnoj sekvenci dsDNK. Ovi analozi DNK su u stanju da se vežu za dsDNK, iskorišćavanjem ambijentnih uslova DNK i različitih načina predviđanja prepoznavanja. Ovo se razlikuje od TFO-a koji se vezuju kroz glavni žlijeb prepoznavanjem dsDNK. Ovaj oblik dupleksne invazije postiže se komplementarnom sekvencom homopurinskih PNA oligomera. Ovaj tripleks je formiran od hibrida PNA-DNK koji se vezuje antiparalelno s komplementarnom sekvencom DNK i rezultira pomjerenim nekomplementarnim lancem DNK. Bis-PNA struktura formira PNA-DNK-PNA tripleks na ciljnom mjestu, gdje jedan lanac formira Watson-Crickove bazne parove sa DNK u antiparalelnoj orijentaciji, a drugi lanac formira Hoogsteenove bazne parove sa homopurinskim lancem DNK u DNK-PNA dupleks.

#### Ekspresija gena 
Prema nekoliko objavljenih članaka, H-DNK ima sposobnost da reguliše ekspresiju gena u zavisnosti od faktora kao što su lokacija i sekvence u blizini. Iako su intergenski regioni prokariotskog genoma pokazali niske tragove H-DNK ili tripleks motiva koji se javljaju u prirodi, pokazalo se da su strukture H-DNK zastupljenije u eukariotskom genomu. Pokazalo se da je H-DNK posebno zastupljena u ćelijama sisara, uključujući ljude (1 na svakih 50.000 bp).

Studije *in vitro* i *in vivo* ekspresije eukariotskog genoma rezultirale su jednim od tri rezultata: nadregulacija, podregulacija, ili bez promjene u prisustvu motiva H-DNK. S druge strane, slična studija (Brachmachari *et al.*) prijavila je da nema statistički značajne inhibicije reporterskog gena *lacZ* kada je H-DNK umetnuta u genom COS sisarskih ćelija. Ostali mehanizmi povezani sa genomskom ekspresijom genetičke sekvence u prisustvu H-DNK uključuju TFO. Studije *in vitro* istakle su smanjenje ekspresija gena u prisustvu TFO u sisarskim ćelijama. Drugi mogući mehanizam predstavili su Valentin et al., sugerirajući da 13-merni A–G motiv oligonukleotidni tripleksni kompleks (TFO kompleks) smanjuje transkripciju iRNK putem kompetitivne inhibicije. Direktna inhibicija ekspresija gena iz H-DNK ključna je za mutagenezu, inhibiciju replikacije, pa čak i rekombinaciju DNK u genomu.  Homologna rekombinacija koja uključuje motive H-DNK također je pronađena kod eukariota. RadA, homologni protein RecA, pokazalo se da ima istu enzimsku aktivnost u rekombinaciji kao i RecA. Protein ima sposobnost promoviranja i izmjene homolognih lanaca putem paralelnog trolančanog heliksa. Jednolančana DNK (ssDNK) i komplementarna dvolančana DNK (dsDNK) će formirati strukturu D-petlje. Ostali mogući mehanizami za RecA uključuji ssDNK iz dvije odvojene H-DNK strukture za formiranje Watson-Crickovih baznih parova. Nova struktura poznata je kao Hollidayeva spona, intermedijer u homolognoj rekombinaciji.

Sekvence koje formiraju H-DNK koje se ponavljaju u polipurinu su pronađene u blizini P1 promotora gena *c-MYC* i povezane su sa glavnim žarišnim tačkama ovog regiona. Slučajevi genetičke nestabilnosti su također primijećeni kod F1 potomaka transgenih miševa nakon ugradnje sekvenci koje formiraju ljudsku H-DNK uparene sa sekvencama Z-DNK u njihove genome, gdje nije ranije prijavljena nikakva nestabilnost. Osim toga, formiranje *R.*R.Y. Konformacije H-DNK su uočene na Mbr gena *bcl-2*. Pretpostavlja se da formiranje ovih struktura uzrokuje translokaciju t(14;18) uočenu kod mnogih karcinoma i većine folikulskih limfoma. Ovo zapažanje je dovelo do istraživanja koje je pokazalo da se značajno smanjenje translokacijskih događaja može primijetiti nakon blokiranja formiranja H-DNK, blagim promjenom sekvence ove regije. Također je primijećeno da dugi delovi GAA·TTC formiraju veoma stabilne strukture H-DNK. Pokazalo se da interakcije između ove dvije strukture H-DNK, koje se nazivaju ljepljiva DNK, prekidaju transkripciju "X25" ili frataksinskog gena. Kako je smanjen nivo proteina frataksina povezan sa Friedreichovom ataksijom, pretpostavlja se da je formiranje ove nestabilnosti osnova za ovu genetičku bolest.  Trolančana DNK je primijećena u supernamotanoj satelitskoj DNK, u regijama gdje je broj kopija mikrosatelita vrlo varijabilan, zajedno sa strukturama Z-DNK invertiranih ponavljanja unutar veće jedinice za ponavljanje satelitske DNK od 2,1 kb. 

Osim toga, pokazalo se da H-DNK uzrokuje mutacije povezane s kritičnim ćelijskim procesima kao što su replikacija DNK i transkripcija. Pokazalo se da različite nukleaze stupaju u interakciju s H-DNK na način ovisan o replikaciji ili replikaciji. Ovi enzimi cijepaju H-DNK na petlji koju formiraju dva Hoogsteenova lanca vezana vodikom i 5' kraj drugog Watson-Crickovog lanca vodikovim vezama. H-DNK može se shvatiti kao jedna od ovih lezija.

Studija koja je posmatra-a transkripciju pomoću T7 RNK polimeraza na stabilnom analogu sekvence koja formira H-DNK otkrila je blokadu transkripcije na spoju dupleks-tripleks. Ovdje je šablonski lanac bio središnji lanac H-DNK, a poteškoće da se prekinu njegove Watson-Crickove i Hoogsteenove vodikove veze zaustavile su transkripciju.

Kada je uočena transkripcija pomoću T7 na P0 promotoru gena *c-MYC*, pronađeni skraćeni produkti transkripcije ukazali su na to da je transkripcija zaustavljena u neposrednoj blizini sekvence koja formira H-DNK, nizvodno od promotora. Formiranje H-DNK u ovoj regiji sprečava T7 da putuje niz lanac šablona zbog sterne smetnje koju uzrokuje. Ovo zaustavlja transkripciju i signalizira da TCR faktori razriješe H-DNK, što rezultira ekscizijom DNK koja može uzrokovati genetičku nestabilnost. Ovo, zajedno sa aktivnošću TCR faktora tokom transkripcije, čini ga veoma mutagenim, pri čemu ima ulogu u razvoju Burkittovog limfoma i leukemija. Pokazalo se da TFO-ovi vezani za mutagene podstiču oštećenje DNK i induciraju mutagenezu. Jedna studija o *in vivo* ciljanju hematopoetskih matičnih ćelija predložila je novu tehniku konjugacije PNA molekula sa peptidom koji prodire u ćelije (CPP) uz poli(mliječnu-ko-glikolnu kiselinu) (PLGA) nanočestica koje omogućavaju modifikacije od 6 bp u genu CCR5. Editiranje gena CCR5 povezano je sa otpornošću na HIV-1. CPP su proteini koji su u stanju da uspješno prenesu "teret", kao što su mali proteini ili molekule u ćelije. PGLA su biorazgradivi materijal koji inkapsulira PNA molekule kao nanočestice za specifične modifikacije genoma. Mutacija F508 del je mutacija koja se najčešće javlja zbog koje osoba ima cistastu fibrozu. Mutacija F508 dovodi do gubitka funkcije CFTR, koji je hloridni kanal plazmamembrane koji je reguliran cikličkim adenozin-monofosfatom (cAMP). U ovoj studiji, uspjeli su stvoriti novi pristup liječenju CF, korištenjem nanočestica za ispravljanje mutacije F508 del *CFTR*, kako *in vitro* u ljudskim epitelnim ćelijama bronhija (HBE), tako i *in vivo* u modelu CF miša, što je rezultiralo pojavom CFTR-ovisnog transporta hlorida.

## Historija 
thumb|Sada opovrgnuta, rana spekulativna trostruka spiralna struktura koju su predložili Pauling i Corey 1953.

Trolančane strukture DNK bile su uobičajene hipoteze 1950-ih, kada su se naučnici borili da otkriju pravi strukturni oblik DNK. Watson i Crick (koji su kasnije dobili Nobelovu nagradu za svoj model sa dvostrukom spiralom) su prvobitno smatrali modelom trostrukog heliksa, kao i Pauling i Corey, koji su objavili prijedlog za njihov model trostruke spirale 1953., kao i kolega naučnik Frejzer. Međutim, Watson i Crick su ubrzo identificirali nekoliko problema s ovim modelima:
* Negativno nabijeni fosfati u blizini ose se odbijaju, ostavljajući pitanje kako trolančana struktura ostaje zajedno.
* U modelu trostruke spirale (posebno Paulingov i Coreyjev model), čini se da su neke od van der Waalsovih udaljenosti premale.
Frejzerov model se razlikovao od Paulingovog i Korijevog po tome što su u njegovom modelu fosfati spolja, a baze iznutra, međusobno povezane vodikovim vezama. Međutim, Watson i Crick su otkrili da je Fraserov model previše loše definiran da bi konkretno komentirali njegove neadekvatnosti.

Alternativna trolančana struktura DNK opisana je 1957. Felsenfeld, Davies i Rich su predvidjeli da ako jedan lanac sadrži samo purine, a drugi lanac samo purine, lanac će doživjeti konformacijsku promjenu kako bi se formirala trolančana spirala DNK. Predviđeno je da se trolančana DNK (H-DNK) sastoji od jednog polipurinskska i dva polipirimidinska lanca. Dodatno, ubrzo je otkriveno da homopirimidin i neki oligonukleotidi bogati purinom mogu formirati stabilnu H-DNK strukturu sa strukturama specifičnim za sekvencu vezivanja homopurin-homopirimidina na dupleksima DNK.

## Reference 
## Dopunska literatura 
* 
* 
* 
* 

Kategorija:DNK