RNK interferencija

no isporuka dizajniranih shRNK i mehanizam interferencije RNK u ćelijama sisara.]]
** Interferencija RNK** (**RNKi**) je biološki proces u kojem su RNK molekule uključene u supresiju ekspresije gena specifičnu za sekvencu dvolančane RNK, putem translacijske ili transkripcijske represije . Historijski gledano, RNKi je bila poznata pod drugim nazivima, uključujući "kosupresiju", "utišavanje gena nakon transkripcije" (PTGS) i "gušenje". Detaljno proučavanje svakog od ovih naizgled različitih procesa razjasnilo je da su svi identiteti ovih fenomena zapravo RNKi. Andrew Fire i Craig C. Mello podijelili su 2006. Nobelovu nagradu za fiziologiju ili medicinu za svoj rad na RNKi u obloj glisti *Caenorhabditis elegans*, koji su objavili 1998. Od otkrića RNKi i njegovih regulatornih potencijala, postalo je očigledno da RNKi ima ogroman potencijal u supresiji željenih gena. RNKi je sada poznata kao precizan, efikasan, stabilan i supresor, bolji od antisens terapija za supresiju gena.  Antisens RNK proizvedena unutar ćelija, ekspresijskim vektorom može se razviti i naći upotrebnu kao novi terapeutski agens.

Dva tipa malih molekula RNK (RNK)&nbsp;– mikroRNK (miRNK) i mala interferirajuća RNK (siRNK)&nbsp;– centralne su za interferenciju RNK. RNK su direktni proizvodi gena, a ove male RNK mogu usmjeravati enzimske komplekse da razgrađuju molekule informacijske RNK (iRNK) i na taj način smanjuju njihovu aktivnost sprečavanjem translacije, putem utišavanja gena nakon transkripcije. Štaviše, transkripcija se može inhibirati putem mehanizma za utišavanje prije transkripcije interferencije RNK, kroz koji enzimski kompleks katalizira metilaciju DNK na genomskim pozicijama komplementarnim kompleksiranoj siRNK ili miRNK. Interferencija RNK ima važnu ulogu u odbrani ćelija od parazitskih nukleotid nihsekvenci&nbsp;– virusa i transpozona. Također utiče na razvoj.

RNKi put nalazi se kod mnogih eukariota, uključujući životinje, a pokreće ga enzim Dicer, koji cijepa molekule duge dvolančane RNK (dsRNK) na kratke dvolančane fragmente od ~21 nukleotida siRNK. Svaka siRNA odmotava se u dvije jednolančane RNK (ssRNK), putnički lanac i lanac vodiča. Putnički lanac je degradiran, a lanac-vodič ugrađen je u RNK-inducirani kompleks za utišavanje (RISC). Najbolje proučavani ishod je utišavanje gena nakon transkripcije, koje se događa kada se lanac vodič upari s komplementarnom sekvencom u molekuli iRNK i inducira cijepanje pomoću argonaut 2 (Ago2), katalitske komponente RISC-a. U nekim organizmima, ovaj proces se sistemski širi, uprkos početno ograničenim molarnim koncentracijama siRNK.

RNKi je vrijedan istraživački alat, kako u kulturi ćelija tako iu živim organizmima, jer sintetska dsRNK uvedena u ćelije može selektivno i snažno inducirati supresiju specifičnih gena od interesa. RNKi može se koristiti za velike skrininge koji sistematski isključuju svaki gen u ćeliji, što može pomoći da se identifikuju komponente neophodne za određeni ćelijski proces ili događaj kao što je ćelijska dioba. Put se također koristi kao praktičan alat u biotehnologijama, medicini i proizvodnji insekticida.

## Ćelijski mehanizam 
ski protein iz *Giardia intestinalis*, koji katalizira cijepanje dsRNK na siRNK. RNazni domeni obojeni su zeleno, PAZ domen žuto, domen platforme crveno, a spirala konektora je plava.]]

RNKi je proces RNK-ovisnog utišavanja gena koji je kontroliran RNK-induciranim kompleksom utišavanja (RISC) i iniciran je kratkim molekulama dvolančane RNK u citoplazmi ćelije, gdje stupaju u interakciju sa katalitskom RISC komponentom argonauta. Kada je dsRNK egzogena (dolazi od infekcije virusom sa RNA genomom ili laboratorijskim manipulacijama), RNK se uvozi direktno u citoplazmu i Dicer cijepa na kratke fragmente. Početna dsRNK također može biti endogena (porijeklom iz ćelije), kao u premikroRNK eksprimiranim iz RNK-nkodirajućih gena u genomu.  Primarni transkripti iz takvih gena se prvo obrađuju da formiraju karakterističnu strukturu matične petlje pre-miRNK u nukleus, a zatim se eksportuju u citoplazmu. Dakle, dva puta dsRNK, egzogena i endogena, konvergiraju na RISC.

Egzogena dsRNK inicira RNAi aktiviranjem ribonukleaznog proteina Dicer, koji veže se i cijepa dvolančane RNK (dsRNK) u biljkama ili kratke RNK ukosnice (shRNK) kod ljudi, kako bi se proizveli dvolančani fragmenti od 20–25 baznih parova s prekoračenjem od dva nukleotida na 3′ kraju. Bioinformatičke studije o genomima više organizama sugeriraju da ova dužina maksimizira specifičnost ciljanog gena i minimizira nespecifične efekte. Ovi kratki dvolančani fragmenti nazivaju se male interferirajuće RNK (siRNK). Ove siRNK razdvajaju se zatim u pojedinačne lančiće i integriraju u aktivni RISC, pomoću RISC-učitavajućeg kompleksa (RLC). RLC uključuje Dicer-2 i R2D2, a ključan je za ujedinjavanje Ago2 i RISC-a. TATA-vezujući proteinski vezani faktor 11 (TAF11) sastavlja RLC, olakšavajući tetramerizaciju Dcr-2-R2D2, što povećava afinitet vezivanja za siRNA za 10 puta. Povezivanje sa TAF11 bi pretvorilo kompleks R2-D2-inicijatora (RDI) u RLC. R2D2 nosi tandem dvolančane RNK-vezujućeg domena za prepoznavanje termodinamički stabilnog kraja dupleksa siRNK, dok je Dicer-2 drugi manje stabilan ekstremitet. Učitavanje je asimetrično: MID domen Ago2 prepoznaje termodinamički stabilan kraj siRNK. Zbog toga se se izbacuje "putnički" (sens) lanac čiji 5′ kraj odbacuje MID, dok sačuvani "vodič" (antisens) lanac sarađuje sa AGO da bi formirao RISC. Za razliku od siRNK, miRNK napunjen RISC kompleks skenira citoplazmatsku iRNK za potencijalnu komplementarnost. Umjesto destruktivnog cijepanja (putem Ago2), miRNK radije ciljaju na 3' UTR regione iRNK, gdje se obično vezuju nesavršenom komplementarnošću, blokirajući tako pristup ribosomima za translaciju.

Egzogenu dsRNK detektuje i vezuje efektorski protein, poznat kao RDE-4 u *C. elegans* i R2D2 u *Drosophila*, koji stimulira aktivnost dicera. Mehanizam koji proizvodi ovu specifičnost dužine je nepoznat i ovaj protein vezuje samo dugačke dsRNK. Ove 'sekundarne' siRNK razlikuju se od strukturno siRNK i  proizvodi ih RNK-ovisna RNK-polimeraza (RdRP).

### MikroRNK 
 matične petlje pre-mikroRNK iz *Brassica oleracea*.]]

MikroRNK (miRNA) su genomski kodirane nekodirajuće RNK koje pomažu u regulaciji ekspresije gena, posebno tokom razvoja. Fenomen RNKi, široko definisan, uključuje endogeno indukovane efekte utišavanja gena miRNK, kao i utišavanje izazvano stranim dsRNK. Zrele miRNK su strukturno slične siRNK proizvedene od egzogene dsRNK, ali prije nego što dostignu zrelost, miRNK moraju prvo proći opsežnu posttranskripcijsku modifikaciju. MiRNK eksprimira se iz mnogo dužeg gena koji kodira RNK kao primarni transkript, poznat kao "pri-miRNK" koji se prerađuje u ćelijskom jedru, u 70-nukleotidnoj strukturi matične petlje koja se naziva "pre-miRNK". Ovaj kompleks sastoji se od enzima RNaza III zvanog Drosha i proteina koji vezuje dsRNK DGCR8. Dicer dsRNA ove pre-miRNK vezuje i cijepa Dicer da bi proizveo zrelu miRNK molekulu koja se može integrirati u kompleks RISC-a; tako, miRNK i siRNK dijele isti ćelijski nizvodni mehanizam. Prve, virusno [kodirane miRNK opisane su kod [Epstein–Barrov virus|Epstein-Barrovog virusa (EBV). Nakon toga, u virusima opisivan je sve veći broj mikroRNK. VIRmiRNK je sveobuhvatan katalog koji pokriva virusne mikroRNK, njihove mete i antivirusne miRNK.
siRNK izvedene iz dugih prekursora dsRNK razlikuju se od miRNK po tome što miRNK, posebno one kod životinja, obično imaju nepotpuno uparivanje baza sa metom i inhibiraju translaciju mnogih različitih iRNK sa sličnim sekvencama. Nasuprot tome, siRNK obično se savršeno uparuju bazama i induciraju cijepanje iRNK samo u jednoj, specifičnoj meti. U *Drosophila melanogaster* i *C. elegans*, miRNK i siRNK obrađuju se različitim proteinima argonauta i dicer enzimima.

### Tri primarne neprevedene regije i mikroRNK 
Tri primarne neprevedene regije (3′UTR)  iRNK često sadrže regulatorne sekvence koje nakon transkripcije uzrokuju RNKi. Takvi 3′-UTR često sadrže i mjesta vezanja za mikroRNK (miRNK) kao i za regulatorne proteine. Vezivanjem za specifična mjesta unutar 3′-UTR, miRNK mogu smanjiti ekspresiju gena različitih iRNK, tako što inhibiraju translaciju ili direktno uzrokuju degradaciju transkripta. 3' UTR također može imati prigušivače regija koje vezuju represorske proteine koji inhibiraju ekspresiju iRNK.

3'-UTR često sadrži mikroRNK elemente odgovora (MRE). MRE su sekvence za koje se vežu miRNK. Ovo su preovlađujući motivi unutar 3′-UTR-a. Među svim regulatornim motivima unutar 3′-UTR (npr. uključujući regije prigušivača), MRE čine otprilike polovinu motiva.

Od 2014. godine, miRBase web stranica, arhiva miRNK [sekvenci i napomena, navela je 28.645 unosa u 233 biološke vrste. Od toga, 1.881 miRNK bila je u označenim ljudskim lokusima miRNK. Predviđeno je da miRNK imaju u prosjeku oko četiri stotine ciljnih iRNK (što utiče na ekspresiju nekoliko stotina gena). Friedman et al. Drugi eksperimenti pokazuju da jedna miRNK može potisnuti proizvodnju stotina proteina, ali da je ta represija često relativno blaža (manje od dva puta).

Efekti disregulacije ekspresije gena miRNK važni kod kancera. Naprimjer, kod karcinoma gastrointestinalnog trakta, devet miRNK je identificirano kao epigenetički izmijenjenih i efikasnih u smanjenju regulacije enzima za popravak DNK.

Efekti disregulacije ekspresije gena miRNK važni su i kod neuropsihijatrijskih poremećaja, kao što su shizofrenija, bipolarni poremećaj, velika depresija, Parkinsonova bolest, Alzheimerova bolest i poremećaji iz autističnog spektra.

### RISC aktivacija i kataliza 
Egzogenu dsRNK detektuje i vezuje efektorski protein, poznat kao RDE-4 u *Caenorhabditis elegans* i R2D2 u *Drosophila*, koji stimuliše aktivnost dicera.

U *C. elegans* ovaj inicijacijski odgovor se pojačava kroz sintezu populacije 'sekundarne' siRNK tokom koje se inicirajuće ili 'primarne' siRNK koriste kao predlošci. Iako se prvo vjerovalo da ATP zavisna helikaza razdvaja ova dva lanca, proces se pokazao kao nezavisan od ATP-a i izveden direktno od proteinskih komponenti RISC-a. Međutim, "in vitro" kinetička analiza RNKi u prisustvu i odsustvu ATP-a pokazala je da ATP može biti potreban za odmotavanje i uklanjanje cijepanog lanca mRNK iz RISC kompleksa nakon katalize. Vodički lanac teži da bude onaj čiji je 5' kraj manje stabilno uparen sa svojim komplementom, ali selekcija lanca nije pod utjecajem smjera u kojem dicer cijepa dsRNK prije inkorporacije RISC-a. Umjesto toga, protein R2D2 može poslužiti kao faktor diferencijacije vezivanjem stabilnijeg 5′ kraja putničkog lanca.

Strukturna osnova za vezivanje RNK za protein argonauta ispitana je rendgenskom kristalografijom vezivanja domena proteina argonauta vezanog za RNK. Ovdje fosforilirani 5′ kraj RNK lanca ulazi u konzervirana osnovne površinske džepove i uspostavlja kontakte kroz dvovalentni kation (atom sa dva pozitivna naboja) kao što je magnezij i aromatičnost slaganje (proces koji omogućava više od jednog atom da dijeli elektron prenoseći ga naprijed-nazad) između 5' nukleotida u siRNK i konzerviranog tirozinskog ostatka. Smatra se da ovo mjesto formira mjesto nukleacije za vezivanje siRNK za njenu ciljni iRNK. Indeed, RNAi may be more effective against mRNA targets that are not translated. Argonautski proteini lokalizirani su na specifične regije u citoplazmi koje se nazivaju P-tijela (takođe citoplazmatska tijela ili GW tijela), a to su regije s visokim stopama raspada iRNK; Aktivnost miRNK je takođe grupisana u P-tijelima. Poremećaj P-tijela smanjuje efikasnost RNAi, sugerirajući da su ona kritično mjesto u preradi RNKi.

### Transkripcijsko utišavanje 
 skraćuje dvolančanu RNK da bi formirao malu interferirajuću RNK ili mikroRNK. Ove obrađene RNK ugrađene su u RNK-inducirani kompleks za utišavanje (RISC), koji cilja iRNK da spriječi translaciju.]]
Komponente RNKi puta koriste se kod mnogih eukariota u održavanju organizacije i strukture njihovih genoma. Modifikacija histona i povezana indukcija formiranja heterohromatina služe za pretranskripcijsko utišavanje gena; ovaj proces se naziva RNK-inducirano utišavanje transkripcije (RITS), a provodi ga kompleks proteina koji se naziva RITS kompleks. U fisijskom kvascu ovaj kompleks sadrži argonaut, hromodomenski protein Chp1 i protein zvanu Tas3 nepoznate funkcije. Kao posljedica toga, indukcija i širenje heterokromatskih regija zahtijeva argonautske i RdRP proteine. Zaista, delecija ovih gena u fisijskom kvascu *S. pombe* ometa metilaciju histona i formiranje centromera, uzrokujući usporenu ili zaustavljenu anafazu tokom ćelijskih dioba. U nekim slučajevima, uočeni su slični procesi povezani sa modifikacijom histona za transkripcijsku regulaciju gena.

Mehanizam kojim RITS kompleks indukuje formiranje i organizaciju heterohromatina nije dobro shvaćen. Većina studija fokusirala se na regiju tipa parenja u fisijskom kvascu, koji možda nije reprezentativan za aktivnosti u drugim genomskim regijama/organizmima. U održavanju postojećih heterokromatinskih regija, RITS formira kompleks sa siRNK komplementaran za lokalne gene i stabilno vezuje lokalne metilirane histone, djelujući kotranskripcijski, kako bi razgradili sve novonastale pre-iRNK transkripte koji su inicirani RNK-polimerazama. Formiranje takvog heterohromatinskog regiona, iako ne njegovo održavanje, zavisi od dicer-a, vjerovatno zato što je dicer potreban da generira početni komplement siRNK koji cilja naknadne transkripte. Sugerirano je da održavanje heterohromatina funkcionira kao povratna petlja koja se samopojačava, jer se nove siRNK formiraju iz povremenih transkripata u nastajanju putem RdRP-a za ugradnju u lokalne RITS komplekse. Relevantnost zapažanja iz regija fisijskog kvasca koji se pare i sisarskih centromera nije jasna, jer održavanje heterohromatina u ćelijama sisara može biti nezavisno od komponenti RNKi puta.

## Također pogledajte
*RNK-polimeraza

## References
## Vanjski linkovi
* Overview of the RNAi process, from ''The Naked Scientists - Cambridge University's The Naked Scientists*
* Animation of the RNAi process, from *Nature*
* NOVA scienceNOW explains RNAi&nbsp;– A 15-minute video of the *Nova* broadcast that aired on Public Broadcasting Service, 26 July 2005
* Silencing Genomes  RNA interference (RNAi) experiments and bioinformatics in C. elegans for education. From the Dolan DNA Learning Center of Cold Spring Harbor Laboratory.
* RNAi screens in C. elegans in a 96-well liquid format and their application to the systematic identification of genetic interactions (a protocol)
* 2 American ‘Worm People’ Win Nobel for RNA Work, from *NY Times*
* *Molecular Therapy'' web focus: "The development of RNAi as a therapeutic strategy", a collection of free articles about RNAi as a therapeutic strategy.
* GenomeRNAi: a database of phenotypes from RNA interference screening experiments in Drosophila melanogaster and Homo sapians
* RNAi tools  Pre-designed and custom RNA Interference tools


Kategorija:RNK
Kategorija:Ekspresija gena
Kategorija:Molekularna genetika