Genska terapija

[mini|300px|**Genska terapija** *[in vivo* i *ex vivo*]]
[300px|thumb|desno|**Jedan od modela genske terapije ex vivo** a – biopsija stem ćelija b – aplikacija retrovirusnog vektora za transfer normalnog genac – rekombinantna DNK sa transferiranim normalnim genom d – inkorporiranje genetički transformiranih ćelija (Prema: Mader, [2000.)]]
**Genska terapija** obuhvata niz *in vivo*, *ex vivo* i *in vitro* metoda i postupaka za prekomponiranje postojećih i unošenje funkcionalnih kopija gena, koji zamjenjuju ili nadopunjuju (ne)aktivnost alelnih varijanti koje su odgovorne za mnoge bolesti.

Već općepoznati nazivi kao što su: genetičko inženjerstvo, genska manipulacija, gensko kloniranje, tehnologija rekombinantne DNK, DNK kloniranje, genetička modifikacija, molekulsko kloniranje, gensko inženjerstvo, pa i “nova genetika”, opisuju istoznačne pojmove u oblasti biotehnologije na bazi genetičkog inženjerstva. Svi se odnose na istovjetan proces: svrsishodni prijenos ciljanih djelića i molekula DNK iz jednog organizma u samoreplicirajuće genetičke strukture drugog, tj. transgenezu. Takvi transgeni dijelovi DNK se kasnije mogu u potrebnoj količini kopija propagirati u “stranoj ćeliji domaćinu”.  Pored genetičkog inženjerstva na molekulskoj razini, već su odavno u primjeni i  manipulacije većim kompleksima genetičkog materijala – hromosomima i kompletnim genomima (označene kao hromosomsko i genomsko inženjerstvo).
## Molekulsko-genetički osnovi genske terapije 
Osnovne komponente strategije molekulsko–genetičkog inženjerstva su:
*isijecanje, mijenjanje i ugradnja DNK molekula *in vitro*,
*prijenos i predstavljanje isječenih segmenata donorske DNK (gena) u recipijenta – putem odgovarajućih vektora, 
*razvoj rekombinovanih DNK molekula u domaćinu putem vektor sistema (koji omogućuje kloniranje rekombinantnih DNK molekula) i
*izbor odgovarajućih DNK sekvenci.
     
Razvoj tehnologije rekombinatne DNK omogućuje neslućene oblike primjene novih terapijskih metoda, naročito u oblasti genske terapije i transplantacije. Tako se u istraživačke svrhe već se primjenjuje terapeutsko embrionalno kloniranje, koje predstavlja proces izgradnje genetički izmijenjenih ljudskih ćelija i tkiva. Polazni cilj razvoja ovog procesa nije kloniranje integralnih ljudskih organizama, nego “uzgajanje” stem (matičnih, neizdiferenciranih) ćelija koje se mogu koristiti za razvoj terapeutskih programa u novim pristupima kod liječenja oboljenja. Stem ćelije su veoma bitne za biomedicinska istraživanja, jer mogu proizvesti gotovo sve naknadno specijalizirane ćelije u ljudskom organizmu. Izdvajaju se nakon pet dana od iniciranja diobe – u fazi blastocita. Prilikom izdvajanja dolazi do razaranja embriona, što sve češće postaje tema pravnih, etičkih i drugih rasprava. 
     
Ovakva genska terapija je moguća prilikom liječenja određenih genetičkih kontroliranih poremećaja uvođenjem vektora koji “unose” izmijenjene kopije “pogrešnih” gena u ćelije domaćina. Tehnologija terapeutskog kloniranja se u budućnosti može koristiti i kao izvor cijelih organa iz ćelija ili za proizvodnju zdravih ćelija. One mogu zamijeniti defektne ćelije u nekim degerativnim poremećajima, liječenju srčanih oboljenja, kancera, Alzheimerove i drugih bolesti.

## Vektori unosa gena u genskoj terapiji 
Vektori u genskoj terapiji mogu biti virusnog i nevirusnog porijekla. Najčešći i najprikladniji virusni vektori su retrovirusi, adenovirusi, adeno–asocirani i herpes virusi, a od neviralnih – liposomi, lipopleksi i "gola" DNK. Liposomi su mikroskopski sitni mjehurići koji nastaju spontano kada se lipoproteini rasprše u tečnosti. U lipidne micele se mogu inkapsulirati molekule DNK (gen), a lipopleksi su mnogo razvijenije – virusolike stukture. Direktna upotreba "gole" DNK primjenjuje se samo u nekim slučajevima, jer je nedovoljno učinkovita.]]

Posebne nade u mogućnost transplantacije probudile su uspješne genetičko–inženjerske manipulacije organima nekoliko životinjskih vrsta.
 
Ksenotransplantacija, prema općoj definiciji, u medicinskoj primjeni podrazumijeva presađivanje životinjskih (umjesto ljudskih) tkiva i organa u organizam ugroženih pacijenata. Tako je moguće transplantirati srce, pluća, jetru, bubrege, pankreas i druge organe, iz dva osnovna razloga.
*	Prva varijanta je razvijena za potrebe zaštite donorskih organa tokom nekoliko sati.
*	Druga varijanta je u funkciji sprčavanja odbacivanja transplantata primjenom imunodepresivnih lijekova.
     
Sve su češći prijedlozi naučnika za razvoj protokola transplantacije organa životinjskog porijekla. Obično se mislilo da bi ne–hominidni primati, a osobito šimpanze ili babuni, mogli biti imunološki najprikladniji kao izvor organa za ovakve zahvate. Međutim, majmuni se sporo razmnožavaju i teško mogu podmiriti potencijalne potrebe za traženim organima. Pored toga, postoje i izvjesne poteškoće u procesuiranju njihovog kloniranja. Nasuprot tome, kultivirano stočarstvo već tradicionalno uključuje svinje i ostale domaće životinje kao izvor mesne hrane, a neke od njih su veoma plodonosne. Tako, ženka svinje može godišnje imati po dva okota sa po (prosječno) desetak mladunaca. 
     
Jedan od mogućih oblika primjene ove tehnologije je i terapeutsko kloniranje organa i tkiva za transplantaciju. Taj proces se zasniva na izdvajanju DNK individue kojoj je potrebna transplatacija. Izoliriana DNK se zatim ubacuje u denukleiranu jajnu ćeliju. Nakon što se dokaže da takva jajna ćelija sadrži pacijentovu DNK, inaktivira se mitoza, da bi se embrionalne stem ćelije mogle upotrijebiti za stvaranje odgovarajućih tkiva i organa. Takve tranplantate je moguće prenijeti u pacijenta bez rizika od odbacivanja. Podrazumijeva se da je primjena ovakvog postupka moguća tek nakon savladavanja mnogih imunoloških, metodološko–aplikacijskih, tehničkih  i drugih prepreka. 
     
Transgene životinje se proizvode tako što se: 
*	direktno u jajnu ćeliju ubaci manipulirani gen 
ili se
*	jajna ćelija primaoca denukleira *in vitro*, a zatim se u nju ugrađuje genetički izmijenjeno donor–jedro (sa objedinjenim genom za kodiranje poželjnog proteina). 
     
Tako izmijenjena jajna ćelija (zigot) se unosi u uterus majke – primaoca (ili surogat – majke). Nakon normalnog razvoja izmijenjenog zigota rađaju se genetički izmijenjene jedinke. Primjenom opisane procedure oni se zatim mogu klonirati u praktično beskonačno mnogo kopija.
      
Razumljivo je da ljudski organizam odbacuje ugrađene svinjske organe. Genetičko inženjerstvo, međutim, može omogućiti da takvi transplantati izgube izvornu antigenost. Tako su već proizvedeni sojevi genetički izmijenjenih svinja čiji organi u ljudskom organizmu mogu opstati i po nekoliko mjeseci. Oni se mogu upotrijebiti za premoštavanje vremenske distance između odluke za transplantaciju i pribavljanja odgovarajućeg ljudskog izvora organa – transplantata. Od svih uspješno kloniranih životinja, svinje imaju najveću “sličnost” sa tkivima i organima čovjeka. Da bi uopće postojala mogućnost tranplantacije svinjskih organa i tkiva u organizam čovjeka potrebno je izvršiti inaktivaciju gena (*knock–out*) koji kodiraju proizvodnju proteina koji izazivaju imunološku reakciju čovjeka. Proces inaktivacije se vrši u jednoj individualnoj ćeliji koja se koristi za proizvodnju odgovarajućih organa. Dvostruka inaktivacija (double knock–out) gena svinje podrazumijeva genetičku manipulaciju u cilju ukidanja djelovanja obje homologne kopije gena odgovornih za odbacivanje transplatata. Tako je, između ostalog, i proizvodnja transgenih svinjskih organa koji su široko prihvatljivi pacijentima krvne grupe 0 (univerzalnim davaocima – bez glavnih antigena ABO sistema) jedan od hitnih ciljeva u ovoj oblasti.

"Genske farme", "gensko farmerstvo", "uzgoj gena" (i tome slično) su među novijim nazivima u rijčniku biotehnologije zasnovanih na genetičkom inženjerstvu. Ovakve farme su već zasnovane u mnogim biotehnološkim kompanijama razvijenog svijeta. Geni koji kodiraju biosintezu dijagnostički i terapeutski zanimljivih proteina su uključeni u molekule životinjske DNK, a poželjne – namjenske supstance se luče u životinjskom mlijeku. Proizvedene su i transgene biljke, koje sintetiziraju lijekove za tretman cistične fibroze, kancera, krvnih bolesti i drugih teških poremećaja. Antitrombin III (za sprečavanje zgrušavanja krvi tokom hirurških operacija) se već dobija iz mlijeka genetički izmijenjenih koza, a klinička ispitivanja proizvoda te biotehnologije su u toku.     
Savremena istraživanja mogućnosti genetičke konstrukcije i kloniranja genetički izmijenjenih sisara uglavnogm su usmjerena ka ugradnji onih gena čiji se proizvodi ne luče u mlijeku, nego u urinu (kod visokoreproducibilnih miševa, npr.). Motivi takvih ambicija su, prije svega, praktične naravi: ekskrecija urina je stalna fiziološka funkcija svih životinja, a mlijeko luče samo ženke – periodično, u toku laktacije.
     
Počeci kloniranja životinja nisu novijeg datuma, jer su prvi takvi pokušaji zabilježeni još 1952. godine. Razvoj genskog farmerstva bio je snažno stimuliran pojavom prve (sada već bivše!) transgene ovce (poznate pod imenom *Dolly*, 1997.) i kloniranih miševa (1998.). Ubrzo nakon toga, klonirana je i ovca (*Polly*) sa ugrađenim ljudskim genom za kodiranje sinteze terapeutskog proteina, koji se luči u mlijeku. Do danas je kloniran veliki broj individua različitih vrsta životinja uključujuć ovce, goveda, koze, miševe, svinje, mačke, zečeve itd. Prvi transgeni nehominidni primat bio je rezus majmun (2001.), zvani ANDi (po inverziji skraćenice DNA), u kojeg je unešen marker–gen meduze za fluorescentni protein (GFP). Taj uspjeh se smatra jednim od najuvjerljivijih dokaza mogućnosti široke primjene genske terapije u medicini.

## Genska terapija nasljednih oboljenja 
Genska terapija je jedno od najprivlačnijih područja razvoja, kako novih biotehnologija, tako i načina liječenja pacijenata od mnogih opakih bolesti. Njen razvoj je potaknut liječenjem bolesti koje slabo ili nikako ne reagiraju na klasične lijekove i tretmane.

Uočeno je preko 4.000 nasljednih oboljenja, a genskom terapijom su liječeni: SCID, cistična fibroza, Gausher oboljenje, familijarna hiperholesterolemija, hemofilija, nedostatak alfa 1 antitripsina, Fanconi anemija, Hunter sindrom, hronično granulomatozno oboljenje, reumatoidni artritis i periferno vaskularno oboljenje. Najveći broj njih je izazvan nedostatkom jednog genskog proizvoda ili se javlja usljed nastanka mutiranog gena koji nije u stanju da obavlja svoju originalnu funkciju. Pristup genske terapije u ovom slučaju je vrlo jednostavan. Pacijentu se može pomoći samo ubrizgavanjem zdrave kopije gena. Međutim, taj jednostavni koncept ne navodi na mogućnost da se ovakvi protokoli mogu uspješno primijeniti i na pacijenta.      

Problemi u napretku takvih tehnologija se vežu za činjenicu da je broj genetičkih oboljenja za koja je identificiran odgovarajući gen odgovoran za bolest, u suštini mali. Problem je i pojava da se niti jedan od vektorskih sistema za isporuku gena nije pokazao kompletno uspješnim. Neka nasljedna oboljenja se odlikuju kompleksnošću jer se efekti nedostatka gena manifestiraju u više organa, tj. tkiva. Zato je ciljani gen teško ubaciti u aficirane ćelije. Regulacija nivoa ekspresije se također pokazala problematičnom. I konačno, pitanje atraktivnosti obrade pacijenata na ovaj način je također diskutabilno, zato što se farmaceutske kuće više bave tretmanom oboljenja poput kancera koja su moderna oboljenja današnjice, a broj pacijenata koji imaju genetička oboljenja, u poređenju sa ovim prvim, relativno je mali.
     
U početnoj fazi ispitivanja ovih oboljenja, naučnici su se usredsredili na hemoglobinopatije. One su davno bile okarakterizirane na molekulskoj razini, kada je uočeno da se njihovo otkrivanje svodi na analizu α– i β–lanaca hemoglobina. Ovom u prilog je išla i činjenica da se ciljane ćelije koštane srži mogu (relativno lahko) ukloniti i zamijeniti. Kod hemoglobinopatija, međutim, sinteza odgovarajućih grupa funkcionalnog hemoglobina je ovisna o prisustvu α– i β–gena sa ispravnom sekvencom aminokiselina, ali također i sa detaljnom regulacijom genske ekspresije. Tako čvrsta regulacija ekspresije unešenih gena je iznad kapaciteta tehnologije genske terapije. 
     
Drugo oboljenje koje se pokušalo tretirati genskom terapijom je bila SCID (ozbiljni kombiniranai nedostatak imuniteta). Praćena je nedostatkom adenozin–dezaminaze (*ADA*'). To je rijetka genopatiju koja se ispoljava kao vrlo ozbiljni nedostatak imuniteta kod djece. Enzim ima važnu ulogu u razgradnji purinskih nukleotida i katalizira izdvajanje amonijaka iz adenozina, pri čemu se stvara inozin koji se obično prevodi u mokraćnu kiselinu. Ovo vodi ka disfunkciji *T* i *B* limfocita. Nedostatak efektivnog imunološkog sistema znači da oboljeli od *SCID*a moraju uslovno biti u sterilnom ambijentu. Kada se ovaj tretman uporedi sa onim kod talasemija, regulacija ekspresije *ADA* je izgleda manje važna za terapeutski ishod. Kod najvećeg broja metaboličkih oboljenja izazvanih enzimskim nedostatkom, čak je ekspresija i male frakcije enzima dovoljna za poboljšanje simptoma bolesti. Tako je 1990. godine funkcionalni *ADA*–gen bio ubačen u nukleusni materijal. Genski korigirani autologni *T*–limfociti su bili ubrizgani dvjema djevojkama koje pate od ovog oboljenja. Jedna pacijentica je primila 11 infuzija i od tada ta djevojčica živi, u biti, normalnim životom. I ona, kao i druga djevojčica, nastavile su primati polietilen glikola. U svojoj cirkulaciji obje imaju *T*–limfocite dobijene genetičkim injženjerstvom. Terapija se u oba ova slučaja pokazala uspješnom, jer su se imunološke funkcije kod pacijenata poboljšale, ali je terapija tekla sa *PEG* (polietilen-glikol) i *ADA* lijekom koji je također uspješan u terapiji.      

Gen za cističnu fibrozu je identificiran 1989. godine. On kodira 170–*kD*–protein, tzv. transmembranski regulator provodljivosti cistične fibroze, koji u epitelnim ćelijama djeluje kao hloridni kanal. Nasljeđivanje mutantnog *cftr* gena od oba roditelja se ispoljava kao *CF* fenotip, pri čemu 5%–10% ciljane populacije mora ima ekspresiju *CFTR* gena. Za isporuku *CF* gena u epitel pacijenata koristi se nekoliko vektora. Najčešći sistemi su adenovirusi i kationski liposomi. Prijenos vektora u ciljane ćelije se može ostvariti i tehnologijom aerosola. Isporuka *CFTR*–a je demonstrirana sa oba vektorska tipa.

***Prve bolesti koje su liječene genskom terapijom** 

- * Melanom, neuroblastom, malignomi mozga, glave i vrata, pluća, jetre, bubrega, rak jajnika, rak dojke, kolona, prostate, mezoteliom, leukemija, limfom, višestruki mijelom.
- ** SCID = **S**evere **C**ombined **I**mmuno**d**eficiency – kombinirani imunološki nedostatak.

## Rizici kloniranja i genske terapije 
Uz sve navedene prednosti kloniranja i genske terapije, postoje i brojni (stvarni ili hipotetski) rizici primjene navedenih biotehnologija. Reproduktivno kloniranje je skupo i relativno neefikasno. Tako se kod više od 90% pokušaja kloniranja ne proizvoda promjenljivi potomci, a za nastanak jednog klona potrebno je više od 100 transnuklearnih operacija. Također je uočeno da su kod kloniranih životinja česte pojave potiskivanja imunološke funkcije, uz visoku stopu infekcija, kancera i drugih bolesti. Zabilježeno je da takve životinje umiru ranije nego što je prosječni vijek vrste kojoj pripadaju. Budući da se u procesu kloniranja umnožavaju obilježja samo jedne individue, takav genetički *otisak* može dovesti i do razvoja abnormalnosti kloniranih embriona.
     
Mnogi stručnjaci upozoravaju i na mogućnost uključivanja ebola ili MSC virusa ("kravljeg ludila") u ljudski genom i pojave drugih pandemija. Istovremeno, u jednoj od prihvatljivijih hipoteza, naučnici vjeruju da je HIV u genom ljudske vrste unesen konzumacijom majmunskog mesa. Argumentacija da je takva opasnost izbjegnuta u slučaju prehrane svinjskim mesom i njegovim prerađevinama, traži se u činjenici da je ono u ljudski jelovnik uvršteno još prije 10–12 milenija (u bliskoistočnom i kineskom području domestikacije), a bez registriranih masovnih i ozbiljnijih infekcija takve prirode.

## Također pogledajte 
*Genetičko testiranje
*Genetička konsultacija
*Genetička identifikacija
*Genetička analiza

## Reference 
## Vanjski linkovi 
*Gene Therapy: Molecular Bandage? University of Utah's Genetic Science Learning Center
*The American Society of Gene & Cell Therapy 
*The European Society of Gene & Cell Therapy
*Research Group at Cambridge, UK working on overcoming current hurdles to successful gene therapy
*Council for Responsible Genetics
*Molecular Medicine and Gene Therapy at Lund University 
*Gene Therapy Frees β-Thalassemia Patient From Transfusions
*Clinical Trial at Sloan Kettering
*Stem Cell Therapy Trial Offers Hope 

Kategorija:Primijenjena genetika
Kategorija:Genetičko mapiranje
Kategorija:Biotehnologija
Kategorija:Medicinska genetika
Kategorija:Medicinsko istraživanje
Kategorija:Medicinska etika