Analiza sekvenci

U bioinformatici, **analiza sekvenci** je proces podvrgavanja DNK, RNK ili peptidne sekvence bilo kojoj od širokog spektra analitičkih metoda, kako bi se razumjele njene karakteristike, funkcija, struktura ili evolucija. [Može se izvesti na cijelom genomu, transkriptomu ili proteomu organizma, a može uključivati i samo odabrane segmente ili regije, poput tandemskih ponavljanja i transpozabilnih elemenata. Korištene metodologije uključuju poravnanje sekvenci, pretrage u biološkim bazama podataka i druge.

Od razvoja metoda visokopropusne proizvodnje genskih i proteinskih sekvenci, stopa dodavanja novih sekvenci u baze podataka se vrlo brzo povećala. Takva kolekcija sekvenci sama po sebi ne povećava razumijevanje biologije organizama od strane naučnika. Međutim, poređenje ovih novih sekvenci sa onima sa poznatim funkcijama je ključni način razumijevanja biologije organizma iz kojeg nova sekvenca potiče. Stoga se analiza sekvenci može koristiti za dodjeljivanje funkcije kodirajućim i nekodirajućim regijama u biološkoj sekvenci, obično poređenjem sekvenci i proučavanjem sličnosti i razlika. Danas postoji mnogo alata i tehnika koje omogućavaju poređenje sekvenci (poravnanje sekvenci) i analiziraju proizvod poravnanja kako bi se razumjela njegova biologija. Analiza sekvenci u molekularnoj biologiji uključuje vrlo širok spektar procesa:

# Poređenje sekvenci radi pronalaženja sličnosti, često radi zaključivanja da li su povezane (homologne)
# Identifikacija intrinzičnih karakteristika sekvence kao što su aktivna mjesta, mjesta posttranslacijske modifikacije, genske strukture, otvoreni okvir čitanja, distribucije introna i egzona i regulatorni elementi
# Identifikacija razlika i varijacija u sekvenci kao što su tačkasta mutacija i polimorfizam jednog nukleotida (SNP) kako bi se dobio genetički marker.
# Otkrivanje evolucije i genetičke raznolikosti sekvenci i organizama
# Identifikacija molekularne strukture samo iz sekvence.

## Historija 
Od prve sekvence proteina insulina koje je okarakterizirao Fred Sanger 1951. godine, biolozi pokušavaju iskoristiti ovo znanje kako bi razumjeli funkciju molekula. Njegovaa otkrića i njegovih kolega doprinijela su uspješnom sekvenciranju prvog genoma zasnovanog na DNK. Metod korišten u ovoj studiji, koji se naziva "Sangerov metod" ili Sangerovo sekvenciranje, bio je prekretnica u sekvenciranju dugolančanih molekula poput DNK. Ovaj metod je na kraju korištena u Projektu ljudskog genoma.  Prema Michaelu Levittu, analiza sekvenci je nastala u periodu od 1969. do 1977. U 1969. analiza sekvenci transfernih RNK korištena je za zaključivanje o interakcijama ostataka iz koreliranih promjena u  nukleotidnim sekvencama, što je dovelo do modela sekundarne strukture tRNK. u 1970, Saul B. Needleman i Christian D. Wunsch objavili su prvi kompjuterski algoritam za poravnavanje dvije sekvence. Tokom ovog vremena, napredak u dobijanju nukleotidnih sekvenci se znatno poboljšao, što je dovelo do objavljivanja prvog kompletnog genoma bakteriofaga 1977. godine. Vjeruje se da su Robert Holley i njegov tim na Univerzitetu Cornell prvi koji su sekvencirali molekulu RNK.

## Pregled analize nukleotidnih sekvenci (DNK i RNK) 
Analize nukleotidnih sekvenci identificiraju funkcionalne elemente poput mjesta vezivanja proteina, otkrivaju genetske varijacije poput SNP-ova, proučavaju obrasce ekspresije gena i razumiju genetsku osnovu osobina. Pomaže u razumijevanju mehanizama koji doprinose procesima poput replikacije i transkripcije. Neki od uključenih zadataka navedeni su u nastavku.

### Kontrola kvaliteta i predobrada 
Kontrola kvaliteta procjenjuje kvalitet očitavanja sekvenciranja dobivenih tehnologijom sekvenciranja (npr. Illumina). To je prvi korak u analizi sekvenciranja kako bi se ograničili pogrešni zaključci zbog lošeg kvaliteta podataka. Alati koji se koriste u ovoj fazi zavise od platforme za sekvenciranje. Naprimjer, FastQC provjerava kvalitet kratkih očitavanja (uključujući RNK sekvence), Nanoplot ili PycoQC se koriste za dugačke sekvence (npr. očitavanja Nanopore sekvenci), a MultiQC agregira rezultat FastQC-a u formatu web stranice.
Kontrola kvaliteta pruža informacije kao što su dužine očitavanja, GC sadržaja, prisustvo adapterskih sekvenci (za kratka očitavanja) i rezultat kvaliteta, koji se često izražava na PHRED skali. Ako su u očitanjima prisutni adapteri ili drugi artefakti iz PCR amplifikacije (posebno kratka očitavanja), oni se uklanjaju pomoću softvera kao što je Trimmomatic. ili  Cutadapt.

### Poravnanje očitanih podataka 
U ovom koraku, sekvencirani podaci čiji je kvalitet poboljšan mapiraju se na referentni genom korištenjem alata za poravnanje poput BWA  za čitanje kratkih DNK sekvenci, minimapa  za dugočitane DNK sekvence i STAR  za očitavanja RNK sekvenci. Svrha mapiranja je pronaći porijeklo bilo kojeg datog očitavanja na osnovu referentne sekvence. Također je važno za otkrivanje varijacija ili filogenetske studije.
Izlaz iz ovog koraka, odnosno poravnata očitavanja, pohranjuju se u kompatibilnim formatima datoteka poznatim kao SAM, koji sadrže informacije o referentnom genomu kao i o pojedinačnim očitavanjima. Alternativno, formati BAM datoteka su poželjniji jer koriste mnogo manje prostora na stolu ili za pohranu. se koriste za identifikaciju razlika u poređenju sa referentnom sekvencom.

Izbor alata za pozivanje varijanti uveliko zavisi od korištene tehnologije sekvenciranja, tako da se GATK često koristi pri radu sa kratkim sekvencama, dok duge sekvence zahtijevaju alate poput DeepVariant-a. i Sniffles-a. Alati se također mogu razlikovati na osnovu organizma (prokarioti ili eukarioti), izvora podataka o sekvenci (rak vs. metagenomika) i tipa varijante od interesa (SNV-ovi ili strukturne varijante). Izlaz pozivanja varijanti je obično u formatu vcf i može se filtrirati korištenjem frekvencija alela, ocjena kvalitete ili drugih faktora na osnovu datog istraživačkog pitanja. ili prilagođene skripte i cjevovod. Izlaz ovog koraka je datoteka s anotacijama u bed ili txt formatu. i identificirati različito eksprimirane gene (DEG) između eksperimentalnih uvjeta koristeći statističke metode poput DESeq2. Ovo se provodi kako bi se uporedili nivoi ekspresije gena ili izoformi između ili preko različitih uzoraka i zaključila biološka relevantnost.

### Analiza funkcionalnog obogaćivanja 
Analiza funkcionalnog obogaćivanja identificira biološke procese, puteve i funkcionalne utjecaje povezane s različito eksprimiranim genima dobivenim iz prethodnog koraka. Koristi alate poput GOSeq i Pathview. Ovo kreira tabelu sa informacijama o tome koji su putevi i molekularni procesi povezani sa različito eksprimiranim genima, koji su geni smanjeno ili pojačano regulirani i koji su termini genska ontologija ponavljajući ili previše zastupljeni.

## Genomski preglednici u analizi sekvenci 
Genomski preglednici nude korisnički interfejs bez koda za vizualizaciju genoma i genomskih segmenata, identifikaciju genomskih karakteristika i analizu odnosa između brojnih genomskih elemenata. Tri primarna genomska preglednika – Ensembl genomski preglednik, UCSC genomski preglednik i Nacionalni centar za biotehnološke informacije (NCBI) - podržavaju različite postupke analize sekvenci, uključujući sastavljanje genoma, anotaciju genoma i komparativnu genomiku poput istraživanja diferencijalnih obrazaca ekspresije i identifikacije konzerviranih regija. Svi preglednici podržavaju više formata podataka za otpremanje i preuzimanje i pružaju veze do vanjskih alata i resursa za analizu sekvenci, što doprinosi njihovoj svestranosti.

## Poravnanje sekvence 
thumb|650px|center|Primjer višestrukog poravnanja sekvenci

Poznati su milioni proteinskih i nukleotidnih sekvenci. Ove sekvence spadaju u mnoge grupe srodnih sekvenci poznatih kao porodice proteina ili genske porodice. Odnosi između ovih sekvenci obično se otkrivaju njihovim poravnavanjem i dodjeljivanjem ovog poravnanja bodova. Postoje dvije glavne vrste poravnanja sekvenci. Poravnanje sekvenci po parovima upoređuje samo dvije sekvence istovremeno, a višestruko poravnanje sekvenci upoređuje mnoge sekvence. Dva važna algoritma za poravnavanje parova sekvenci su Needleman-Wunschov algoritam i Smith-Watermanov algoritam. Popularni alati za poravnanje sekvenci uključuju:
* Poravnanje po parovima - BLAST, Tačkasti dijagrami
* Višestruko poravnanje - ClustalW, PROBCONS, MUSCLE, MAFFT i T-Coffee.
Uobičajena upotreba za poravnanje po parovima je uzimanje sekvence od interesa i njeno poređenje sa svim poznatim sekvencama u bazi podataka kako bi se identifikovale homologne sekvence. Općenito, podudaranja u bazi podataka su poređana tako da prvo prikazuju najsrodnije sekvence, a zatim sekvence sa opadajućom sličnošću. Ova podudaranja se obično prijavljuju s mjerom statističke značajnosti kao što je očekivana vrijednost.

## Poređenje profila
Godine 1987, Michael Gribskov, Andrew McLachlan i David Eisenberg uveli su metod poređenja profila za identifikaciju udaljenih sličnosti između proteina. Umjesto korištenja jedne sekvence, metode profila koriste višestruko poravnanje sekvenci za kodiranje profila koji sadrži informacije o nivou očuvanosti svakog ostatka. Ovi profili se zatim mogu koristiti za pretraživanje kolekcija sekvenci kako bi se pronašle sekvence koje su povezane. Profili su također poznati kao Matrice bodovanja specifične za poziciju (PSSM). Godine 1993., probabilističku interpretaciju profila uveli su Anders Krogh i kolege koristeći skriveni Markovljev model. Ovi modeli su postali poznati kao profilni HMM-ovi.

Posljednjih godina razvijeni su metodi koji omogućavaju direktno poređenje profila jedan s drugim. Poznati su kao metodi poređenja profil-profil.

## Sastavljanje sekvence 
Sastavljanje sekvence odnosi se na rekonstrukciju DNK sekvence putem usklađivanja i spajanja malih fragmenata DNK. To je sastavni dio modernog sekvenciranja DNK.  Budući da trenutno dostupne tehnologije sekvenciranja DNK nisu pogodne za čitanje dugih sekvenci, veliki dijelovi DNK (kao što su genomi) se često sekvenciraju (1) rezanjem DNK na male dijelove, (2) čitanjem malih fragmenata i (3) rekonstitucijom originalne DNK spajanjem informacija na različitim fragmentima.

U posljednje vrijeme, sekvenciranje više vrsta odjednom je jedan od glavnih istraživačkih ciljeva. Metagenomika je proučavanje mikrobnih zajednica direktno dobijenih iz okoline. Za razliku od kultiviranih mikroorganizama iz laboratorije, uzorak iz divljine obično sadrži desetine, ponekad čak i hiljade vrsta mikroorganizama iz njihovih prvobitnih staništa. Oporavak originalnih genoma može se pokazati vrlo izazovnim.

## Predviđanje gena 
Predviđanje gena ili pronalaženje gena odnosi se na proces identifikacije regija genomske DNK koje kodiraju gene. To uključuje gene koji kodiraju proteine, kao i RNK-gene, ali može uključivati i predviđanje drugih funkcionalnih elemenata kao što su regulatorne regije. Geri je jedan od prvih i najvažnijih koraka u razumijevanju genoma vrste nakon što je sekvenciran. Općenito, predviđanje bakterijskih gena je znatno jednostavnije i preciznije od predviđanja gena kod eukariotskih vrsta koje obično imaju složene intron/egzon obrasce. Identifikacija gena u dugim sekvencama ostaje problem, posebno kada je broj gena nepoznat. Skriveni Markovljevi modeli mogu biti dio rješenja. Mašinsko učenje je odigralo značajnu ulogu u predviđanju sekvence transkripcijskih faktora. Tradicionalna analiza sekvenciranja fokusirala se na statističke parametre same nukleotidne sekvence (Najčešće korišteni programi navedeni su u tabela 4.1). Drugi metod je identifikacija homolognih sekvenci na osnovu drugih poznatih genskih sekvenci (vidi Alate tabela 4.3).

## Predviđanje strukture proteina 
thumb|Struktura ciljnog proteina (3dsm, prikazana trakama), sa Calpha okosnicama (sivom bojom) 354 predviđena modela za nju podnesena u eksperimentu predviđanja strukture CASP8.|260px|right
3D strukture molekula su od velikog značaja za njihove funkcije u prirodi. Budući da je predviđanje strukture velikih molekula na atomskom nivou uglavnom teško rješiv problem, neki biolozi su uveli načine za predviđanje 3D strukture na nivou primarne sekvence. To uključuje biohemijsku ili statističku analizu ostataka aminokiselina u lokalnim regijama i strukturno zaključivanje iz homologa (ili drugih potencijalno srodnih proteina) sa poznatim 3D strukturama.

Postojao je veliki broj različitih pristupa rješavanju problema predviđanja strukture. Kako bi se utvrdilo koji su metodi najefikasnije, osnovano je takmičenje u predviđanju strukture pod nazivom CASP (Kritička procjena predviđanja strukture)).

## Računarski pristupi i tehnike 
Zadaci analize sekvenci često nisu trivijalni za rješavanje i zahtijevaju upotrebu relativno složenih pristupa, od kojih su mnogi osnova mnogih postojećih alata za analizu sekvenci. Od mnogih metoda koje se koriste u praksi, najpopularnije uključuju sljedeće:
* Dinamičko programiranje
* Vještačka neuronska mreža
* Skriveni Markovljev model
* Mašina vektora podrške
* Klasterovanje
* Bayesova mreža
* Regresijska analiza
* Rudarenje sekvenci
* Analiza sekvenci bez poravnanja

## Također poglegdajte
* Lista softvera za poravnanje sekvenci
* Lista softvera za vizualizaciju poravnanja
* Lista softvera za filogenetsko istraživanje
* Lista softvera za vizualizaciju filogenetskog stabla
* Lista softvera za predviđanje strukture proteina
* Lista softvera za predviđanje strukture RNK
* Odjeljak o softveru u Analizi sekvenci u društvenim naukama

## Reference
Kategorija:Bioinformatika