Tercijarna struktura nukleinske kiseline

**Tercijarna struktura nukleinske kiseline** je trodimenzijski oblik polimera nukleinske kiseline. Molekule RNK i DNK su sposobne za različite funkcije, od molekularnog prepoznavanja do kataliza. Takve funkcije zahtijevaju preciznu trodimenzionalnu strukturu. Iako su takve strukture raznolike i naizgled složene, sastavljene su od ponavljajućih, lahko prepoznatljivih tercijarnih strukturnih motiva koji služe kao molekulski gradivni blokovi. Neki od najčešćih motiva za tercijarnu strukturu RNK i DNK opisani su u nastavku, ali ove informacije se zasnivaju na ograničenom broju riješenih struktura. Mnogo više tercijarnih strukturnih motiva bit će otkriveno kako se nove molekule RNK i DNK budu strukturno karakterizirale.

## Heliksne strukture 
thumb|left|285px|Strukture dvostruke spirale A-, B- i Z-DNK.

### Dvostruka spirala 
Dvostruka spirala je dominantna tercijarna struktura biološke DNK, a također je moguća struktura i RNK. Vjeruje se da se u prirodi nalaze tri konformacije DNK: A-DNK, B-DNK i Z-DNK. Smatra se se da "B" oblik, koji su opisali James D. Watson i Francis Crick, prevladava u ćelijama. James D. Watson i Francis Crick su opisali ovu strukturu kao dvostruku spiralu s radijusom od 10 Å i korakom od 34 Å, koja pravi jedan puni okret oko svoje ose svakih 10 bp sekvence. Dvostruka spirala napravi jedan puni okret oko svoje ose svakih 10,4–10,5 baznih parova u rastvoru. Ova frekvencija uvijanja (poznata kao "nagib" spirale) uveliko zavisi od sila slaganja koje svaka baza vrši na svoje susjede u lancu. Dvostruko-spiralna RNK usvaja konformaciju sličnu strukturi A-oblika.

Moguće su i druge konformacije; zapravo, samo slova F, Q, U, V i Y su sada dostupna za opisivanje bilo koje nove strukture DNK koja se može pojaviti u budućnosti. Međutim, većina ovih oblika je stvorena sintetski i nisu uočeni u prirodnim biološkim sistemima.

### Tripleksi glavnog i sporednog žlijeba
Tripleks sporednog žlijeba je sveprisutni RNK strukturni motivi. Budući da su interakcije sa sporednim žlijebom često posredovane 2'-OH skupinom riboznog šećera, ovaj RNK motiv izgleda vrlo različito od svog DNK ekvivalenta. Najčešći primjer trostrukog žlijeba je A-sporedni motiv  ili umetanje adenozinskih baza u sporedan žlijeb (vidi gore). Međutim, ovaj motiv nije ograničen na adenozine, jer je uočeno da i druge nukleobaze interaguju sa sporednim žlijebom RNK.

Sporedni žlijeb predstavlja gotovo savršen komplement za umetnutu bazu. To omogućava optimalne van der Waalsove kontakte, opsežno vodično vezivanje i hidrofobno površinsko ukopavanje, te stvara energetski vrlo povoljnu interakciju. intronke grupe II, i ribosome.

Iako je glavni žlijeb standardne A-oblika RNK prilično uzak i stoga manje dostupan za tripleks interakciju od malog žlijeba, tripleks interakcije glavnog žlijeba mogu se uočiti u nekoliko RNK struktura. Ove strukture se sastoje od nekoliko kombinacija baznog para i Hoogsteen interakcija. Naprimjer, GGC tripleks (GGC amino(N-2)-N-7, imino-karbonil, karbonil-amino(N-4); Watson-Crick) uočen u 50S ribosomu, sastavljen od Watson-Crickovog G-C para i dolaznog G koji formira pseudo-Hoogsteenovu mrežu vodikovih veza između obje baze uključene u kanonsko sparivanje. (iii)  SAM-II ribosklopka i (iv) element za jedarnu ekspresiju (ENE), koji djeluje kao element za stabilizaciju RNK putem formiranja trostruke spirale s poli(A) repom.

Jezgro malahitno zelene boje aptamer je također vrsta baznog kvadripleksa s drugačijim obrascem vodikovih veza (vidi sliku). Kvadripleks se može ponavljati nekoliko puta uzastopno, stvarajući izuzetno stabilnu strukturu.

Jedinstvena struktura kvadripleksnih regija u RNK može služiti različitim funkcijama u biološkom sistemu. Dvije važne funkcije su potencijal vezivanja sa ligandima ili proteinima i njena sposobnost stabilizacije cijele tercijarne strukture DNK ili RNK. Jaka struktura može inhibirati ili modulirati transkripciju i replikaciju DNK, kao što je to slučaj u telomerama hromosoma i netranslatiranoj regiji iRNK.  Identitet baze je važan za vezivanje liganda. G-kvadripleks obično veže monovalentne katione poput kalija, dok druge baze mogu vezati brojne druge ligande poput hipoksantina u U-U-C-U kvadripleksu. Moguće je da postoje još zanimljivije strukture i funkcije koje tek treba otkriti *in vivo*.

## Koaksijalno slaganje 
[300px|thumb|left| Sekundarna (umetnuta) i tercijarna struktura [tRNK koja demonstrira koaksijalno slaganje.]]

Koaksijalno slaganje, inače poznato kao spiralno slaganje, glavna je odrednica tercijarne strukture RNK višeg reda. Koaksijalno slaganje se događa kada dva RNK dupleksa formiraju susjednu spiralu, koja je stabilizirana slaganje baza na granici dvije spirale. Koaksijalno slaganje je uočeno u kristalnoj strukturi tRNK za Phe. U novije vrijeme, koaksijalno slaganje je uočeno u strukturama višeg reda mnogih ribozima, uključujući mnoge oblike samospljuskujućih grupa I i grupa II introna. Uobičajeni motivi koaksijalnog slaganja uključuju interakciju ljupljenje petlje i pseudočvora. Stabilnost ovih interakcija može se predvidjeti adaptacijom "Turnerovih pravila".

U 1994., Walter i Turner su odredili doprinose slobodne energije interakcija slaganja najbližeg susjeda unutar heliks-heliks interfejsa koristeći modelni sistem koji je kreirao heliks-heliks interfejs između kratkog oligomera i prevjesa od četiri-nukleotida na kraju ukosnice. Njihovi eksperimenti su potvrdili da termodinamički doprinos slaganja baza između dvije spiralne sekundarne strukture blisko oponaša termodinamiku standardnog formiranja dupleksa (interakcije najbližeg susjeda predviđaju termodinamičku stabilnost rezultirajuće spirale). Relativna stabilnost interakcija najbližeg susjeda može se koristiti za predviđanje povoljnog koaksijalnog slaganja na osnovu poznate sekundarne strukture. Walter i Turner su otkrili da se, u prosjeku, predviđanje strukture RNK poboljšalo sa 67% na 74% tačnosti kada su uključeni doprinosi koaksijalnog slaganja.

Većina dobro proučenih tercijarnih struktura RNK sadrži primjere koaksijalnog slaganja. Neki istaknuti primjeri su tRNK-Phe, introni grupe I, introni grupe II i ribosomske RNK. Kristalne strukture tRNK otkrile su prisustvo dvije proširene spirale koje nastaju koaksijalnim slaganjem stabla akceptora aminokiselina s T-krakom i slaganjem D- i antikodonskih krakova. Ove interakcije unutar tRNK orijentiraju stablo antikodona okomito na stablo aminokiselina, što dovodi do funkcionalne tercijarne strukture u obliku slova L. i kristalografske metode. Kristalna struktura P456 pružila je detaljan uvid u to kako koaksijalno slaganje stabilizuje pakovanje RNK heliksa u tercijarne strukture. U intronu grupe II sa samosplajsujućim djelovanjem iz *Oceanobacillus iheyensis*, stabljike IA i IB se koaksijalno slažu i doprinose relativnoj orijentaciji konstitutivnih heliksa petosmjernog spoja.

thumb|right|Formiranje pseudočvora s koaksijalnim slaganjem dvije spirale
Dva uobičajena motiva koja uključuju koaksijalno slaganje su petlje za poljubac i pseudočvorovi. U interakcijama petlji za poljubac, područja jednolančane petlje dvije ukosnice interaguju putem sparivanja baza, formirajući kompozitnu, koaksijalno složenu spiralu. Važno je napomenuti da ova struktura omogućava svim nukleotidima u svakoj petlji da učestvuju u interakcijama sparivanja baza i slaganja. Ovaj motiv su vizualizirali i proučavali pomoću NMR analize Lee i Crothers. Motiv pseudočvora nastaje kada se jednolančana regija u obliku ukosnice upari s uzvodnom ili nizvodnom sekvencom unutar istog lanca RNK. Dvije rezultirajuće dupleks regije često se slažu jedna na drugu, formirajući stabilnu koaksijalno složenu kompozitnu spiralu. Jedan primjer motiva pseudočvora je visoko stabilan ribozim virusa hepatitisa delta, u kojem osnovni lanac pokazuje ukupnu topologiju dvostrukog pseudočvora.
Efekat sličan koaksijalnom slaganju uočen je u racionalno dizajniranim DNK strukturama. DNK-origami strukture sadrže veliki broj dvostrukih spirala sa izloženim tupim krajevima. Uočeno je da se ove strukture lijepe duž rubova koji sadrže ove izložene tupe krajeve, zbog hidrofobnih interakcija slaganja. Kombinacijom ovih racionalno dizajniranih DNK-nanostruktura i DNA-PAINT snimanja superrezolucije, istraživači su uočili individualnu snagu energija slaganja između svih mogućih dinukleotida.

### Mjerenje koaksijalnog slaganja u nukleinskoj kiselini 
Rana mjerenja koaksijalnog slaganja provedena su korištenjem biokemijskih testova koji proučavaju relativnu migraciju različitih molekula nukleinskih kiselina na osnovu njihove konformacije i vrste prisutnih interakcija. Kratke molekule DNK koje sadrže zareze, a koje su se i dalje mogle koaksijalno slagati, migrirale su brže od molekula DNK koje sadrže praznine i stoga nisu imale koaksijalno slaganje. To se može objasniti polimernim svojstvima DNK, gdje će kruće molekule nalik štapiću migrirati brže duž električnog gradijenta u matrici u poređenju sa fleksibilnijim molekulama. Razvoj novijih tehnika poput optičke pincete i sposobnost savijanja DNK-nanostruktura doveo je do mjerenja količine DNK snopova i njihove sposobnosti slaganja jednih s drugima. Sila potrebna za razdvajanje ovih snopova pomoću optičke pincete mogla se zatim analizirati, kako bi se izmjerile energije slaganja baznih parova. Ova mjerenja su provedena uglavnom u neravnotežnim uslovima i napravljene su različite ekstrapolacije kako bi se dobile tačne vrijednosti koaksijalnog slaganja između baza. Nedavne studije pojedinačnih molekula korištenjem DNK-nanostruktura i DNK-PAINT superrezolucijske mikroskopije omogućile su mjerenje ovih interakcija između dinukleotida, korištenjem dubinske kinetičke analize vremena vezivanja kratkih DNK molekula za njihove komplementarne sekvence, u prisustvu ili odsustvu interakcija slaganja DNK.]]
Interakcije tetrapetlje i receptora kombiniraju interakcije sparivanja baza i slaganja između nukleotida petlje motiva tetrapetlje i motiva receptora smještenog unutar RNK dupleksa, stvarajući tercijarni kontakt koji stabilizira globalni tercijarni nabor molekule RNK. Tetrapetlje su također moguće strukture u DNK dupleksima.

Matične petlje mogu se uveliko razlikovati po veličini i sekvenci, ali tetrapetlje od četiri nukleotida su vrlo česte i obično pripadaju jednoj od tri kategorije, na osnovu sekvence. Ove tri porodice su tetrapetlje CUYG, UNCG i GNRA *(vidi sliku desno)*. U svakoj od ovih porodica tetrapetlji, drugi i treći nukleotid formiraju zavoj u lancu RNK, a bazni par između prvog i četvrtog nukleotida stabilizuje strukturu matične petlje. Općenito je utvrđeno da stabilnost tetrapetlje zavisi od sastava baza unutar petlje i od sastava ovog "zatvarajućeg para baza". GNRA porodica tetrapetlji se najčešće opaža unutar interakcija tetrapetlji i receptora. Osim toga, UMAC tetrapetlje su poznate kao alternativne verzije GNRA petlji, obje dijele slične strukture glavnog lanca; uprkos sličnostima, razlikuju se u mogućim interakcijama dugog dometa koje su sposobne za to.

[220px|thumb|right|**GAAA Tetrapetlja i receptor:** Štapićasti prikaz tetrapetlje (žute) i njenog receptora, koji prikazuje i Watson-Crickovo i Hoogsteenovo sparivanje baza. koji se sastoji od [vodikova veza|vodikove veze između baza u sekvencama tetrapetlje do matične petlje u distalnim dijelovima sekundarne strukture RNK.  Pored vodikovih veza, interakcije slaganja su važna komponenta ovih tercijarnih interakcija. Naprimjer, u GNRA-tetrapetlji interakcijama, drugi nukleotid tetrapetlje se slaže direktno na motiv A-platforme (vidi gore) unutar receptora.

Naprimjer, samosplajsirajući intron grupe I oslanja se na motive tetrapetljinog receptora za svoju strukturu i funkciju. tipovi 0 do III, na osnovu položaja insercijske baze u odnosu na dva 2’-OH Watson-Crickovog baznog para. Kod A-minor motiva tipa I i II, N3 adenina je umetnut duboko unutar malog žlijeba dupleksa (vidi sliku: A-minor interakcije - interakcija tipa II), i postoji dobra komplementarnost oblika sa baznim parom. Za razliku od tipova 0 i III, interakcije tipa I i II su specifične za adenin zbog interakcija vodikovim vezama. U interakciji tipa III, i O2' i N3 insercijske baze su manje blisko povezani sa malim žlijebom dupleksa. Motivi tipa 0 i III su slabiji i nespecifični jer su posredovani interakcijama sa jednim 2’-OH (vidi sliku: A-minor interakcije - interakcije tipa 0 i tipa III).

A-minor motiv je među najčešćim strukturnim motivima RNK u ribosomu, gdje doprinosi vezivanju tRNK za 23S podjedinicu. Najčešće stabiliziraju interakcije dupleksa RNK u petljama i heliksima, kao što je u jezgru introna grupe II.

Analiza A-minor motiva u 23S ribosomskoj RNK otkrila je hijerarhijsku mrežu strukturnih zavisnosti, za koju se pretpostavlja da je povezana s evolucijom ribosoma i redoslijedom događaja koji su doveli do razvoja moderne bakterijske velike podjedinice.

Izvještava se da A-minor motiv i njegova nova podklasa, WC/H A-minor interakcije, jačaju druge tercijarne strukture RNK, kao što su trostruke spirale glavnog žlijeba identificirane u stabilizacijskim elementima RNK.

### Ribozni zatvarač
[300px|thumb|upright|**Ribozni zatvarači:** Pogled na kanonski ribozni  zatvarač između dva lanca RNK.

Brojni oblici riboznih zatvarača su zabilježeni, ali uobičajeni tip uključuje četiri vodikove veze između 2'-OH grupa dva susjedna [šećera. Ribozni zatvarači se obično javljaju u nizovima koji stabiliziraju interakcije između odvojenih lanaca RNK.  Ribozni zatvarači se često opažaju kao interakcije petlja stabla sa vrlo niskom specifičnošću sekvence. Međutim, u malim i velikim ribosomskim podjedinicama postoji sklonost ka riboznim zatvaračima CC/AA sekvence - dva citozina na prvom lancu uparena sa dva adenina na drugom lancu.

## Uloga metalnih iona 
Funkcionalne RNK su često presavijene, stabilne molekule trodimenzijskog oblika, a ne mehki, linearni lanci. Kationi su neophodni za termodinamičku stabilizaciju tercijarnih struktura RNK. Metalni kationi koji vežu RNK mogu biti monovalentni, dvovalentni ili trovalentni. Kalij (K+) je uobičajeni monovalentni ion koji veže RNK. Uobičajeni dvovalentni ion koji veže RNK je magnezij (Mg2+). Utvrđeno je da drugi ioni, uključujući natrij (Na+), kalcij (Ca2+) i mangan (Mn2+), vežu RNK *in vivo* i *in vitro*. Multivalentni organski kationi poput spermidina ili spermina također se nalaze u ćelijama i oni daju važan doprinos savijanju RNK. Trovalentni ioni poput kobalt-heksamina ili lantanoidni ioni poput terbija (Tb3+) su korisni eksperimentalni alati za proučavanje vezivanja metala za RNK.

Metalni ion može interagovati sa RNK na više načina. Ion se može difuzno povezati sa RNK osnovom, štiteći inače nepovoljne elektrostatičke interakcije. Ovo skrining naboja često ispunjavaju monovalentni ioni. Ioni vezani za mjesto stabilizuju specifične elemente tercijarne strukture RNK. Interakcije vezane za mjesto mogu se dalje podijeliti u dvije kategorije, ovisno o tome da li voda posreduje u vezivanju metala. Interakcije "vanjske sfere" posreduju molekule vode koje okružuju metalni ion. Na primjer, magnezijum heksahidrat interaguje sa specifičnim motivima tercijarne strukture RNK i stabilizuje ih putem interakcija sa gvanozinom u glavnom žlijebu. Obrnuto, interakcije "unutrašnje sfere" direktno posreduje metalni ion. RNK se često savija u više faza, a ovi koraci mogu biti stabilizovani različitim vrstama kationa. U ranim fazama, RNK formira sekundarne strukture nukleinske kiseline stabilizovane vezivanjem monovalentnih kationa, dvovalentnih kationa i polianionskih amina kako bi neutralizirala polianionski okosnicu. Kasnije faze ovog procesa uključuju formiranje tercijarne strukture RNK, koja se stabilizuje gotovo u velikoj mjeri vezivanjem dvovalentnih iona poput magnezijuma, uz mogući doprinos vezivanja kalijuma.

Mjesta vezivanja metala često su lokalizovana u dubokom i uskom glavnom žlijebu RNK dupleksa, koordinirajući se sa Hoogsteen rubovima purina. Posebno, metalni kationi stabilizuju mjesta uvijanja glavnog lanca gdje čvrsto pakovanje fosfata rezultira područjem gustog negativnog naboja. Postoji nekoliko motiva vezivanja metalnih iona u RNK dupleksima koji su identifikovani u kristalnim strukturama. Na primjer, u P4-P6 domenu *Tetrahymena thermophila* intron grupe I, nekoliko mjesta za vezivanje iona sastoje se od tandema G-U volećavi parovi i tandema G-A neusklađenosti, u kojima dovalentni kationi interaguju sa Hoogsteen-ovim rubom gvanozina putem O6 i N7. Još jedan motiv vezivanja iona u intronu grupe I *Tetrahymena* je motiv platforme A-A, u kojem uzastopni adenozini u istom lancu RNK formiraju nekanonski pseudobazni par. Za razliku od tandemskog G-U motiva, A-A platformski motiv se preferencijalno veže za monovalentne katione. U mnogim od ovih motiva, odsustvo monovalentnih ili dvovalentnih kationa rezultira ili većom fleksibilnošću ili gubitkom tercijarne strukture.

Utvrđeno je da su dvovalentni metalni ioni, posebno magnezij, važni za strukturu spojeva DNK kao što je Hollidayev spoj međuprodukt u genetičkoj rekombinaciji. Magnezijev ion štiti negativno nabijene fosfatne grupe u spoju i omogućava im da budu bliže jedna drugoj, omogućavajući naslaganu konformaciju umjesto neslagane konformacije.  Magnezij je ključan za stabilizaciju ovakvih spojeva u vještački dizajniranim strukturama koje se koriste u DNK-nanotehnologiji, kao što je motiv dvostrukog ukrštanja.

## Historija
Najraniji radovi u strukturnoj biologiji RNK poklopili su se, manje-više, s radom na DNK početkom 1950-ih. U svom značajnom radu iz 1953. godine, Watson i Crick sugerirali su da bi van der Waalsovo gužvanje 2`OH grupom riboze spriječilo RNK da usvoji dvostruku spiralnu strukturu identičnu modelu koji su predložili - onome što danas znamo kao B-oblik DNK. Ovo je izazvalo pitanja o trodimenzionalnoj strukturi RNK: da li bi ovaj molekul mogao formirati neku vrstu spiralne strukture, i ako da, kako?

Sredinom 1960-ih, uloga tRNK u sintezi proteina intenzivno se proučavala. Godine 1965., Holley i saradnici su pročistili i sekvencirali prvu molekulu tRNK, prvobitno pretpostavivši da je usvojio strukturu lista djeteline, uglavnom zasnovanu na sposobnosti određenih regija molekule da formiraju strukture petlji matičnih stabljika. Izolacija tRNA pokazala se kao prvi veliki uspjeh u strukturnoj biologiji RNK. Godine 1971. Kim i saradnici su postigli još jedan proboj, proizvodeći kristale kvasne tRNAPHE koja je difrakcijski reagirala do rezolucije od 2-3 Ångströma koristeći spermin, prirodni poliamin, koji se vezao za [tRNK i stabilizirao je.

Tokom značajnog perioda nakon prvih struktura tRNA, oblast proučavanja strukture RNK nije dramatično napredovala. Mogućnost proučavanja strukture RNK zavisila je od potencijala za izolaciju ciljne RNK. Ovo se pokazalo ograničavajućim za ovu oblast dugi niz godina, dijelom i zato što su druge poznate ciljeve - tj. ribosom - bilo znatno teže izoliratiti i kristalizirati. Kao takve, nekih dvadeset godina nakon originalnog objavljivanja strukture tRNKPHE, riješene su strukture samo nekoliko drugih ciljeva RNK, pri čemu gotovo svi pripadaju porodici transferne RNK.

Ovaj nesretni nedostatak prostora na kraju će biti prevaziđen uglavnom zahvaljujući dva velika napretka u istraživanju nukleinskih kiselina: identifikaciji ribozima i sposobnosti njihove proizvodnje putem transkripcije *in vitro*. Nakon publikacije Toma Cecha koja implicira intron grupe I *Tetrahymena* kao autokatalitički ribozim, i izvještaj Sidneyja Altmana o katalizi ribonukleazom P RNK, nekoliko drugih katalitskih RNK identificirano je krajem 1980-ih, uključujući ribozim čekićaste glave. Godine 1994., McKay *i saradnici* objavili su strukturu 'kompleksa RNA-DNK ribozim-inhibitor čekićaste glave' u rezoluciji od 2,6 Ångströma, u kojem je autokatalitska aktivnost ribozima poremećena vezivanjem za DNK supstrat.  Pored napretka postignutog u određivanju globalne strukture putem kristalografije, početkom 1990-ih također je uvedena NMR kao moćna tehnika u strukturnoj biologiji RNK. Istraživanja poput ovog omogućila su precizniju karakterizaciju interakcija sparivanja baza i slaganja baza koje su stabilizirale globalne nabore velikih molekula RNK.

Ponovni porast strukturne biologije RNK sredinom 1990-ih izazvao je pravu eksploziju u području istraživanja strukture nukleinskih kiselina. Od objavljivanja struktura čekićaste glave i P4-6, postignuti su brojni značajni doprinosi ovom području. Neki od najznačajnijih primjera uključuju strukture Introna Grupe I i introna Grupe II, i ribosom. Prve tri strukture su proizvedene korištenjem *in vitro* transkripcije, a NMR je odigrao ulogu u istraživanju parcijalnih komponenti sve četiri strukture - što svjedoči o neophodnosti obje tehnike za istraživanje RNK. Nobelova nagrada za hemiju 2009. godine dodijeljena je [[Ada Yonath|]Adi Yonath]], Venkatramanu Ramakrishnanu i Thomasu Steitzu za njihov strukturni rad na ribosomu, demonstrirajući istaknutu ulogu koju je strukturna biologija RNK preuzela u modernoj molekulskoj biologiji.

## Također pogledajte 
* Petlja matične kiseline
* Pseudoknot
* Predviđanje sekundarne strukture
* Bazni par
* Vobling bazni par
* Hoogsteenov bazni par
* Ribosom
* Riboprekidač
* Ribozim
* Čekićar ribozim
* Katalitički intron grupe I
* Intron grupe II
* tRNA
* G-kvadrupleks
* i-motiv DNK
* Tetrapetlja
* Klizava sekvenca
* Poljubac matične petlje

## Reference 
Kategorija:RNK
Kategorija:DNK