Ube3a-ATS

.]]
**UBE3A-ATS/Ube3a-ATS** (čovjek/miš), inače poznat kao ubikvitin-ligaza E3A-ATS,  je antisens lanac DNK koji se transkribira kao dio većeg transkripta zvanog **LNCAT** (veliki nekodirajući antisense transkript) u lokusu *Ube3a*. Lokus *Ube3a* utisnut je i u centralnom nervnom sistemu,  eksprimiran samo iz majčinskog alela. Smatra se da se utišavanje * Ube3a * na očinskom alelu događa putem *Ube3a-ATS* dijela *LNCAT *, budući da se nekodirani antisense transkripti često nalaze na utisnutim lokusima.]]]  Delecija i/ili mutacija *Ube3a* na majčinskom hromosomu uzrokuju Angelmanov sindrom (AS)  pa se *Ube3a-ATS* mogu pokazati kao važan aspekt u pronalaženju terapije za ovu bolest. Dok je kod pacijenata s AS-om majčinski alel *Ube3a* neaktivan, očinski alel je netaknut, ali epigenetički utišan. Ako se ne utiša, očinski alel mogao bi biti izvor aktivnog proteina Ube3a kod pacijenata sa AS. Stoga, razumijevanje mehanizama na koji način *Ube3a-ATS* može biti uključen u utišavanje očinskog *Ube3a* može dovesti do novih terapija za AS. Ovu mogućnost pokazala je nedavna studija u kojoj je lijek topotecan, primijenjen kod miševa koji pate od AS, aktivirao ekspresiju očinskog gena *Ube3a*, snižavanjem transkripcije *Ube3a-ATS*.

Kishino i Wagstaff (1998)  mapirali su su dva obrađena pseudogena UBE3A na hromosom 2 i 21.

UBE3A funkcionira i kao E3 ligaza na putu proteasoma ubikvitina i kao transkripcijski koaktivator. Gen UBE3A podložan je genomskom utiskivanju, sa preferencijalnom majčinom specifičnom ekspresijom u mozgu i, tačnije, u neuronima, ali ne i u gliji (Dindot et al., 2008). 
  
Smith i dr. (2011) objavili su da se gen Ube3a miša nalazi na regiji hromosoma 7, koja odgovra ljudskom hromosomu 15.

## Kloniranje i ekspresija
E6AP je u početku identificiran kao ćelijski protein koji posreduje *in vitro* povezanost ljudskog papiloma virusa E6 s p53 (191170), što dovodi do razgradnje p53 ovisne o ubikvitinu (Huibregtse et al., 1991; Scheffner et al., 1990). Huibregtse i dr. (1993) klonirali su gen E6AP i proučavali povezanost izraženog proteina sa p53 i E6. E6AP protein s 865 aminokiselina ima nativnu molekularnu masu od približno 100 kD.

Yamamoto et. al. (1997) primijetili su da UBE3A pripada porodici funkcionalno povezanih proteina definisanih konzerviranim [C-terminal]]nim HECT domenom od 350 aminokiselina. Koristeći RT-PCR,  identificirali su nekoliko UBE3A iRNK koje kodiraju izoforme proteina koje su se razlikovale na njihovim N-krajevima. Svaka iRNK eksprimirana je u svim testiranim ćelijskim linijama. Kishino i Wagstaff (1998) identificirali su dodatne alternativno prerađene oblike iRNK UBE3A.

Koristeći VCY2 (BPY2; 400013) kao sonsdu na 2-hibridnom snimku kvasca u biblioteci cDNK testisa, nakon čega slijedi RT-PCR iRNK testisa, Wong et al. (2002) klonirali UBE3A. Izvedeni protein od 873 aminokiseline sadrži C-terminalni HECT domen. Northern blot analiza otkrila je snažnu ekspresiju transkripata UBE3A od 1,4 i 2 kb i slabiju ekspresiju transkripata od 4 i 5 kb u testisima i prostatama. Transkripti od 1,4 i 2 kb također su otkriveni u tankom i debelom crijevu. RT-PCR je detektirao ekspresiju UBE3A u ejakuliranoj ljudskoj spermi.
Koristeći analizu frakcionacije, Furumai et al. (2019) pokazali su da je Ube3a lokaliziran uglavnom na jedeamišjih neurona.

## Struktura gena
Yamamoto et al. (1997) otkrili su da se kodirajuće područje gena UBE3A sastoji od 10 egzona i obuhvata najmanje 60 kb. UTR sa pet prajmera sastoji se od najmanje četiri egzona.

Kishino i Wagstaff (1998) otkrili su da gen UBE3A ima najmanje 16 egzona, uključujući šest egzona koji kodiraju 5-bazni UTR. Gen se proteže na otprilike 120 kb, s transkripcijom orijentiranom od telomera do centromere. |UBE3A mapiran je unutar kritične regije za Angelmanov sindrom (AS) na hromosomu 15, sekvenca q11-q13 (Matsuura i sur., 1997)

## Funkcija gena
Scheffner et al.  (1993) otkrili su da je E6AP E3 ubikvitin-proteinska ligaza.
Koristeći analize 2-hibridnik kvasaca i  imunoprecipitacije, Wong et al. (2002) pokazali su da je VCY2 u interakciji s HECT domenom UBE3A.
Lu i wt al (2009) pokazali su da Ube3a nije bitan za održivost *Drosophila*, ali da je gubitak aktivnosti Ube3a smanjio dendritsko grananje senzornih neurona u perifernom nervnom sistemu i usporio rast terminalnih dendriskih finih procesa. Prekomjerna ekspresija Ube3a u drozofili smanjila je grananje dendrita, što sugerira da je održavanje odgovarajućeg nivoa UBE3A presudno za normalno dendritsko oblikovanje.

Greer et al. (2010) otkrili su da je neuronska aktivnost povisila ekspresiju transkripata glodarskog Ube3a u kultiviranim neuronima i mozgu miša, istovremeno s povišenom površinskom ekspresijom receptora glutamata tipa AMPA (AMPAR) (vidi GLUR1 ili GRIA1) i povećanom učestalošću minijaturne ekscitacijske postsinapsne struje. Aktivnost posebno povećava ekspresiju Ube3a transkripata koja započinje od visoko konzerviranih promotora 1 i 3, koji sadrže mjesta vezanja za faktor aktivnosti transkripcije Mef2,  vezan za aktivnost (MEF2A). Eksperimenti s prekomjernom ekspresijom, nokdaunom i mutacijama otkrili su da je Ube3a povisio postsinapsnu površinsku ekspresiju Glur1, snižavanjem regulacije Arc, posrednika endocitoze Glur1. Smanjenje regulacije luka od puitem Ube3a zahtijevalo je aktivnost ubikvitin-ligaze Ube3a i blokirano je inhibitorom proteaze. Zaključili su da UBE3A podiže površinsku ekspresiju i aktivnost AMPAR-ova, usmjeravanjem proteasomske degradacije ARC-a.

Margolis t al. (2010) otkrili su da je Ube3a imao ulogu u degradaciji Rhoa faktora razmjene guaninskog nukleotida efeksin-5 (E5, ili ARHGEF15), koji regulira stvaranje sinapsi u razvoju mišjuh neurona. Vezivanje E5 za receptor efrina Ephb2  inhibiralo je i aktivnost tirozin-kinaze Ephb2 i stvaranje ekscitacionih sinapsi. Interakcija E5-Ephb2 prekinuta je vezivanjem efrina B  za Ephb2, što je rezultiralo fosforilacijom tirozina, oslobađanjem i destabilizacijom E5 i omogućilo stvaranje pobuđujućih sinapsi. Razgradnja E5 zahtijevala je njegovo vezanje za Ube3a i bila je inhibirana neaktivnim Ube3a mutantom ili inhibicijom proteasoma. Otkrili su da je ekspresija E5 povišena u mišjem modelu Angelmanovog sindroma, sugerirajući da povećana ekspresija E5 tokom razvoja može doprinijeti abnormalnoj kognitivnoj funkciji u Angelmanovom sindromu.

Koristeći 2-hibridnu analizu kvasca i analizu koprecipitacije kotransficiranih i endogenih proteina, Kuhnle et al. (2011) otkrili su da je E3 ubikvitin-ligaza HERC2 stupila u interakciju s izoformom 852 aminokiseline E6AP. Analiza domena otkrila je da su za interakciju potrebni centralni RLD2 domen HERC2 i domen blizu N-kraja E6AP. HERC2 pune dužine ili izolirani RLD2 domen HERC2 stimulirali su E3 aktivnost E6AP u autoubikvitinaciji i ubikvitinaciji E6AP supstrata. Za stimulaciju E6AP nije bio potreban katalitski aktivan HERC2.

Fang et al. (2011) otkrili su da je Hul5, homolog kvasca UBE3A, potreban za sveprisutnost neispravnih proteina i održavanje ćelijske kondicije nakon tretmana toplotnim šokom. Fluorescentna mikroskopija pokazala je da je preraspodjela Hul5 iz jedra u citoplazmu važna za sveprisutnost neispravnih proteina u reakciji toplotnog šoka. Eksperimenti pulsiranja otkrili su da je Hul5 ciljano pogrešno sklopio citosolne proteine niske rastvorljivosti radi razgradnje ubikvitilacijom, neovisno o šaperonima iz podporodice SSA proteina Hsp70.

Koristeći *in vivo* genetiku miša, Krishnan et al. (2017) pokazali su da je povećanje UBE3A u jedru smanjilo regulaciju glutamatskog organizatora sinapse Cbln1, koji je potreban za društvenost miševa. Epilepsijski napadi također su potisnuli Cbln1 i izložili oštećenja društvenosti kod miševa s asimptomatskim porastom UBE3A. Ova sinergija napada Ube3a preslikana je na glutamatne neurone ventralnog tegmentnog područja srednjeg mozga (VTA), gdje su delecije Cbln1 oslabile društvenost prijenos glutamata. Pružili su pretkliničke dokaze da virusna hemogenetska aktivacija ili obnavljanje Cbln1 u VTA glutamatnim neuronima zasnovana na vektorima preokreće deficite društvenosti izazvane Ube3a i/ili napadima. Zaključili su da interakcije gena i napada u VTA glutamatergijskim neuronima smanjuju društvenost smanjenjem regulacije Cbln1, ključnog čvora u mreži interakcije proteina gena za autizam.

Yi i et al. (2017) otkrili su da je UBE3A komunicirao s više podjedinica proteasoma smještenih duž jedne strane regulatorne čestice 19S, uključujući osam jezgri podjedinica proteasoma (npr. PSMD2), u ćelijama HEK293T. Interakcija s UBE3A povećala je ubikvitinaciju proteasomskih podjedinica i smanjila njihovo obilje i aktivnost, što je dovelo do aktivacije Wnt signalizacije, stabilizacijom ijedarnom akumulacijom beta-katenina (CTNNB1).

Sun i et al.  (2019) koristili su ljudske neurone i moždane organoide da demonstriraju da UBE3A potiskuje hiperekscitabilnost neurona putem razgradnje kalijevih kanala (BK), zavisnih od napona, kalcijevih kanala i napona. Pružili su dokaze da se povećana aktivnost BK kanala manifestuje kao povećana unutrašnja ekscitabilnost u pojedinačnim neuronima i naknadna mrežna sinhronizacija. BK antagonisti normalizirali su neuronsku ekscitabilnost u ljudskom i mišjem neuronima i poboljšali podložnost napadaima na modelu miša sa Angelmanovim sindromom. Zaključili su da njihovi nalazi sugeriraju da BK kanalopatija leži u osnovi epilepsije kod AS-a i podržavaju upotrebu ljudskih ćelija za modeliranje ljudskih razvojnih bolesti.

## Biohemijska svojstva
Huang et al. (1999) utvrdili su da je kristalna struktura katalitskog hekt domena E6AP otkrila birfežanjsku strukturu sa širokim katalitskim rascjepom na spoju dva režnja. Rascjep se sastoji od konzerviranih ostataka čija mutacija ometa stvaranje ubikvitin-tioesterske veze i mjesto je mutacija Angelmanovog sindroma. Kristalna struktura E6AP hekt domena vezana za enzim UBCH7-konjugirajući ubikvitin (E2)  otkrila je odrednice specifičnosti E2-E3 i pružila uvid u transfer ubikvitina iz E2 u E3.

## Molekulska genetika
Kishino i et al. (1997) pronašli su inverziju koja je prouzrokovala Angelmanov sindrom (AS) kada se prenosi majčinskim putem i koja je poremetila 5-bazni kraj gena UBE3A. Naknadno su identificirali dvije mutacije kod bolesnika saneniparentalnom disomijom/neimprinting mutacijom (NDUI) kao pacijentima kojima je predviđeno da eliminišu funkciju UBE3A.

Matsuura et al. (1997) identificirali su četiri mutacije u genu UBE3A kod pacijenata sa AS, uključujući mutaciju *de novo* pomicanje okvira i mutaciju *de novo* u  nonsens mutacijama egzona 3 i 2 misens mutacije manjeg sigurnosog značaja. *De novo* skraćene mutacije ukazale su da je UBE3A AS gen i sugerirale mogućnost majčinski eksprimiranog genskog proizvoda uz bijalično izraženi transkript. Autori su komentirali da je intragenska mutacija UBE3A u Angelmanovom sindromu prvi primjer genetičkog poremećaja proteolitskog puta ovisnog o ubikvitinu kod sisara. Može predstavljati primjer ljudskogog genetičkog poremećaja povezanog s lokusom koji proizvodi funkcionalno različite utisnute i bialelno izražene genske proizvode. Kandidat za proizvodnju otisnutih i neotisnutih transkripata iz jednog lokusa postoji za insulinu-sličan faktor rasta-2 (IGF2), gdje četiri promotora, tri utisnuta i jedan bialelni eksprimiran, predstavljaju diferencijalnu ekspresiju.

Malzac et al. (1998) identificirali su mutacije u području kodiranja UBE3A otkrivene SSCP analizom kod 13 AS osoba ili porodica. U dva slučaja pronađeno je identična *de novo* umnožavanje 5-bp u egzonu 16. Među ostalih 11 jedinstvenih mutacija, osam je bilo malih delecija ili insercija za koje se predviđalo da će uzrokovati pomicanje okvira, jedna je bila mutacija stop kodona, jedna je misens mutacija, a jedna je prouzrokovala insercija izoleucina u hect domen UBE3A proteina, koji funkcioniše u vezanju E2 i prenosu ubikvitina. Osam slučajeva bilo je porodično, a pet sporadično. U dva porodična slučaja i jednom sporadičnom slučaju otkriven je mozaicizam za mutacije UBE3A: kod majke tri sina sa AS, kod dede po majci dva rođaka AS i majke kćerke AS. Učestalost otkrivanja mutacija bila je pet (14%) od 35 u sporadičnim slučajevima i osam (80%) od 10 u porodičnim slučajevima.

Fung et al. (1998) pronašli su funkcionalno beznačajnu deleciju od 14 bp u 3' neprevedenoj regiji gena UBE3A1. Alelna varijanta identificirana je u potrazi za mutacijom kod pacijenta s onim što se smatralo atipiskm Angelmanovim sindromom. Pacijentica je imala intelektualne poteškoće, nedostatak govora, ataksiju i "veselu narav". Primijećeni su i lijep ten, strabizam i poremećeni san. Smatrali su je netipskom jer je bila vrlo niskog rasta i nije imala istaknutu mandibulu. Pored toga, njena ataksija bila je manje ozbiljna nego što se obično vidi kod Angelmanovog sindroma, nije pokazivala neprimjeren smijeh i imala je normalno formiranje zatiljka kao i normalan EEG u dobi od dvije godine i šest mjeseci. Delecija od 14 bp pronađena je kod pacijentice, njezine normalne braće i majke bez uticaja.

Fang et al. (1999)  sekvencirali su glavne kodirajuće egzone gena UBE3A u 56 indeksnih pacijenata sa kliničkom dijagnozom Angelmanovog sindroma i normalnim obrascem metilacije DNK. Mutacije koje uzrokuju bolest identificirane su kod 17 od 56 pacijenata (30%), uključujući 13 tačkastih mutacija, dvije misens mutacije, jednu deleciju jedne aminokiseline i jedni mutaciju kodona mutacije koja je predviđala produženi protein. Mutacije su identificirane u šest od osam porodica (75%) s više od jedne pogođene osobe, te u 11 od 47 izoliranih slučajeva (23%); nije pronađena mutacija u jednoj porodici s dva brata, po jedan s tipskim i atipskim fenotipom. Mutacije su *de novo* u devet od 11 izolovanih slučajeva. Identificiran je polimorfizam aminokiselina, ala178 do thr, a polimorfizam dužine 3 bp pronađen je u intronu uzvodno od egzona 8. U svim informativnim slučajevima, fenotipska ekspresija bila je u skladu s utiskivanjem, s normalnim fenotipom, kada je mutacija uključivala očinski hromosom i fenotip Angelmanovog sindroma kada je mutacija bila na majčinom hromosomu. 

Rapakko et al. (2004) izveli su analizu mutacije, elektroforezom na gelu, osjetljivu na konformaciju (CSGE) u kodnom području UBE3A kod devet pacijenata s Angelmanovim sindromom koji su pokazali normalno biparentalno nasljeđivanje i obrazac metilacije 15q11-q13. Identificirali su thr koji uzrokuje bolest. Dva pacijenta su dijelila 4-nukleotidna pomicanju okvira u egzonu 16: 3093delAAGA; mutacija petog pacijenta bila je pomak okvira koji je rezultat mutacija 1930delAG u pet od njih, uključujući dvije misens mutacije: thr106 na pro i ile 130 na egzonu 9. Utvrđeno je da je CSGE osjetljiv i jednostavan metod selekcije za mutacije u UBE3A. 

Camprubi et al (2009) analizirali su gen UBE3A u ukupno 237 pacijenata sa AS s normalnim obrascima metilacije i identificirali 11 mutacija, kod pet (13,2%) od 38 strogo odabranih pacijenata i kod šest (3%) od 199 pacijenata za koje su klinički kriteriji bili labavi. Postojala je značajna povezanost između nasljeđivanja i tipa mutacije, pri čemu je pet promjena pojedinačnih nukleotida naslijeđeno od zdrave majke, dok je četiri od pet višestrukih delecija ili insercija nukleotida došlo i do *de novo* delecija  (p = 0,02). U jednom je slučaju nasljedna mutacija bila prisutna kod zdrave majke, koja je nosila mutaciju u mozaiku u krvnim ćelijama na očinski izvedenom hromosomu. Pregled prethodno objavljenih AS mutacija potvrdio je povezanost sa nasljeđivanjem, s udjelom višestrukih nukleotidnih delecija i insercija koje se *de novo* javljaju gotovo dvostruko više od udjela jednostrukih nukleotidnih supstitucija (p = 0,015). Napominjući da su prethodno prijavljene samo tri od 11 mutacija UBE3A otkrivenih u ovoj studiji, sugerirali su da će se varijabilnost mutacijskih promjena koje uzrokuju AS povećavati kako se opisuju novi slučajevi.

## Organizacija *LNCAT*-a
a, ali potisnut na očinskom. S druge strane, *LNCAT* i *UBE3A-ATS * u potpunosti su transkribovani na očinski alel, ali potisnuti na majčinski alel. Smatra se da je ova diferencijalna ekspresija posljedica metilacije PWS-IC na majčinu  (crni ispunjeni krug) i nedostatka metilacije na očinskom alelu (nepopunjeni krug). Smatra se da AS-IC kontrolira metilaciju PWS-IC. Crveni okviri predstavljaju majčinski transkribirane gene, plavi počinske. Smjer transkripcije označen je strelicama.  Transkript je dug oko 450 kbs, započinje na U-egzon-ima i proteže se do *UBE3A* na suprotnom lancu, moguće i šire. promotor za *Snurf/Snrpn * i imprinting centar nalaze se u regiji U-egzona. Regija promotora je imperativ, jer se delecijom ovog područja onemogućava transkripcija *Ube3a-ATS*. U blizini promotora nalazi se PWS-IC, a oko 35 kbs uzvodno od PWS-IC je AS-IC. Smatra se da ove dvije regije kontroliraju ekspresiju cijelog lanca *LNCAT*. Počevši od promotora, čitav transkript može se transkribirati, a nakon transkripcije dalje se prerađuje i spaja. Recenzirano u *Trends in Neurosci*.  *Snrpn* kodira protein nepoznate funkcije koji se lokalizuje u ćelijsko jedro. *Snurf*-ovi  kodiraju mali jedarni ribonukleoprotein. Iako je većina ovih proteina uključena u preradu, uloga ovog određenog proteina još nije poznata name="Gray1998"/>  Nizvodno od *Snrpn/Snurf * i unutar njegovih introna nalaze se sekvence za nekoliko C/D okvira snoRNK. Većina C/D kutija snoRNK funkcionira u ne-iRNK metilaciji.  Međutim, nedavno je utvrđeno da je jedna snoRNK na *Ube3a-ATS*, SNORD 115, promijenila alternativnu preradu 2M pre-iRNK serotoninskog receptora. Pored toga, ova snoRNK ima sposobnost promjene prerade pet različitih iRNK. Među sekvencama snoRNK je ugniježđeni IPW (utisnuti  gen za Prader-Willijev sindrom), nekodirajuće područje za čiju se deleciju smatra da uzrokuje Prader-Willijev sindrom.

## Sistemi modela 
Mišji i ljudski *Ube3a-ATS/Ube3a* su ortologni, a opće organizacije regije su slične. Naprimjer,  mišji lokus također sadrži *Snurf/Snrpn*, snoRNK i IPW. Glavne razlike su lokacije i dužna transkripata *Ube3a-ATS*. Ljudski *Ube3a/ Ube3a-ATS* nalazi se na hromosomu 15, dok je mišji *Ube3a* na njegovom hromosomu 7. Mišji *LNCAT*, uključujući *Ube3a-ATS*, dugačak je oko 1000 kb, mnogo duži od ljudskog *LNCAT* od 450 kb.

## Varijante i lokacije prerade 
Iako se cijeli transkript *LNCAT*, uključujući transkript *Ube3a-ATS* može transkribirati, često se prerađuje tako da uključuje i razne isključuje egzone. Različite varijante prerade eksprimirane su u različitim tipovima tkiva i situacijama. Uglavnom se smatra da je barem neki tip *Ube3a-AT * eksprimirana u utisnutim ćelijama CNS-a, kao što su Purkinjeove ćelije i hipokampusni neuroni. Međutim, postoji prostorno-vremenska regulacija i nizvodnog i uzvodnog dijela ovog transkripta. and *Journal of Neuroscience*.

U mišjim embrionima, egzoni *Snurf/Snrpn* su otkriveni u blastocitima oko 7. dana nakon koitusa i nastavili su se eksprimirati tokom razvoja. Egzoni *Snurf/Snrpn* ograničeni su na tkivo CNS-a tokom razvoja, a tek kasnije tokom odrasle dobi izražavaju se u drugom tkivu. Egzoni *Ube3a-ATS* nisu otkriveni do 10. dana nakon koitusa, a njihova ekspresija je tokom razvoja također bila ograničena na CNS. Općenito, *Ube3a-ATS* se detektira u početnim fazama neurogeneze, dok se *Snurf/Snrpn* eksprimira u nediferenciranim ćelijama prekursora i tokom procesa diferencijacije.

## Reference
 Kategorija:Antisens RNK
Kategorija: Geni na  hromosomu 15
Kategorija: Ljudski proteini
Kategorija:Proteomika