Prečišćavanje proteina

**Prečišćavanje proteina** je niz procesa namijenjenih za izolaciju jednog ili nekoliko proteina iz složene smjese, obično ćelije, tkiva  ili cijelih organizama. Prečišćavanje proteina je od vitalnog značaja za specifikaciju funkcije, strukture i interakcija proteina od interesa. Proces prečišćavanja može odvojiti proteinske i neproteinske dijelove mješavine i konačno odvojiti željeni protein od svih ostalih proteina. U idealnom slučaju, da bi se proučavao protein od interesa, on mora biti odvojen od ostalih komponenti ćelije, tako da kontaminanti ne ometaju ispitivanje strukture i funkcije proteina od interesa. Separacija jednog proteina od svih ostalih je obično najzahtjevniji aspekt prečišćavanja proteina. Koraci razdvajanja obično koriste razlike u veličini proteina, fizičko-hemijskim svojstvima, afinitetu vezivanja i biološkoj aktivnosti. Čisti rezultat se može nazvati **proteinski izolat**.
 
## Svrha 
Troškovi proizvodnje proteina ostaju visoki i postoji rastuća potražnja za razvojem ekonomičnih i brzih metoda prečišćavanja proteina. Razumijevanje različitih metoda pročišćavanja proteina i optimizacija daljnje obrade su od ključne važnosti za minimiziranje troškova proizvodnje uz održavanje kvaliteta prihvatljivih standarda homogenosti. Prečišćavanje proteina je ili *preparativno* ili *analitičko*. **Preparativna prečišćavanja** imaju za cilj proizvodnju relativno velike količine prečišćenih proteina za naknadnu upotrebu. Primjeri uključuju pripremu komercijalnih proizvoda kao što su enzimii (npr. laktaza), nutritivni proteini (npr. sojin proteinski izolat) i određeni biofarmaceutski (npr. [[insulin]) ]). Često se koristi nekoliko koraka pripremnog prečišćavanja, kako bi se uklonili nusproizvodi, kao što su proteini ćelije domaćina, koji predstavljaju potencijalnu prijetnju zdravlju pacijenta. **Analitičko prečišćavanje** proizvodi relativno malu količinu proteina za različite istraživačke ili analitičke svrhe, uključujući identifikaciju, kvantifikaciju i proučavanje strukture proteina, posttranslacijske modifikacije i funkcije. Svaki korak procedure prečišćavanja proteina se prati i uzima u obzir nivoe prečišćavanja i prinos. Visok nivo prečišćavanja i slab prinos ne ostavljaju gotovo nikakav protein sa kojim bi se eksperimentisalo. S druge strane, visok prinos sa niskim nivoom prečišćavanja ostavlja mnogo zagađivača (proteina koji nije onaj koji je interesantan) koji ometa istraživačke svrhe. Konačno, ćelijski ostaci se mogu ukloniti diferencijalnim centrifugiranjem, što je postupak u kojem se homogenat centrifugira malom brzinom, a zatim opet većom silom kako bi se dobio pelet koji se sastoji od jezgara i supernatanta. Ovo daje nekoliko frakcija opadajuće gustine gdje se na jednu frakciju primjenjuju diskriminatornije tehnike pročišćavanja. ili Strep-tag kako bi se olakšalo prečišćavanje, smanjujući broj potrebnih njegovih  koraka.
 
Analitičko prečišćavanje općenito koristi tri svojstva za razdvajanje proteina.
*Prvo, proteini se mogu pročistiti u skladu sa njihovim izoelektričnim tačkama, propuštanjem kroz gel s pH stepenom ili kolonu za ionsku izmjenu.
*Drugo, proteini se mogu razdvojiti prema njihovoj veličini ili molekulskoj težini putem hromatografija isključivanja veličine ili analizom SDS-PAGE (natrij-dodecil sulfat-poliakrilamidna gel elektroforeza). Proteini se često prečišćavaju upotrebom 2D-PAGE, a zatim se analiziraju pomoću peptidne mase prstiju, kako bi se utvrdio identitet proteina. Ovo je vrlo korisno u naučne svrhe, a granice detekcije proteina su danas vrlo niske i nanogramske količine proteina su dovoljne za njihovu analizu.
*Treće, proteini se mogu razdvojiti po polarnosti/hidrofobnosti putem tečne hromatografije visokih performansi ili hromatografija reverzne faze.
 
Obično protokol za prečišćavanje proteina sadrži jedan ili više hromatografskih koraka. Osnovni postupak u hromatografiji je protok rastvora koji sadrži protein kroz kolonu napunjenu različitim materijalima. Različiti proteini različito stupaju u interakciju sa materijalom kolone i stoga mogu biti razdvojeni vremenom potrebnim za prolazak kolone ili uslovima potrebnim za eluiranje proteina iz kolone. Proteini se obično detektuju dok izlaze iz kolone po njihovoj apsorpciji na 280&nbsp;nm. Postoji mnogo različitih hromatografskih metoda:
 
### Precipitacija i diferencijalna solubilizacija 
Većina proteina zahteva malo soli da bi se rastvorila u vodi, proces koji se zove soljenje. Kako se koncentracija soli povećava, proteini se mogu taložiti, proces koji se naziva isoljavanje koji uključuje promenu rastvorljivosti proteina. Ovo se izvodi dodavanjem sve veće količine amonij-sulfata i prikupljanjem različitih frakcija precipitiranih proteina. Nakon toga, amonij-sulfat se može ukloniti pomoću dijalize (odvajanje proteina od malih molekula kroz polupropusnu membranu). Tokom koraka taloženja amonij-sulfata, hidrofobne grupe na proteinima izložene su atmosferi, privlačeći druge hidrofobne grupe; rezultat je stvaranje agregata hidrofobnih komponenti. U ovom slučaju, talog proteina će obično biti vidljiv golim okom. Jedna od prednosti ove metode je što se može izvesti jeftino, čak i sa vrlo velikim obima.
 
Prvi proteini koji se prečišćavaju su proteini rastvorljivi u vodi. Prečišćavanje proteina integralne membrane zahtijeva prekid ćelijske membrane. kako bi se izolovao bilo koji određeni protein od drugih koji se nalaze u istom membranskom odjeljku. Ponekad se određena frakcija membrane može prvo izolirati, kao što je izolacija mitohondrija iz ćelija prije prečišćavanja proteina koji se nalazi u mitohondrijskoj membrani. Deterdženti, kao što je natrij-dodecil sulfat (SDS) mogu se koristiti za rastvaranje ćelijskih membrana i zadržavanje membranskih proteina u rastvoru tokom prečišćavanja; međutim, pošto SDS uzrokuje denaturaciju, blaži deterdženti kao što su Triton X-100 ili CHAPS mogu se koristiti za zadržavanje prirodne konformacije proteina tokom potpunog prečišćavanja.
 
### Isključivanje veličine (gel-filtracijska hromatografija) 
Hromatografija se može koristiti za odvajanje proteina u rastvoru ili uslovima denaturacije, korišćenjem poroznih gelova. Ova tehnika je diskriminatornije odvajanje i poznata je kao hromatografija isključenja veličine (*Size Exclusion Chromatography*). Princip je da manje molekule moraju proći kroz veći volumen u poroznoj matrici. Posljedično, proteini određenog raspona veličine će zahtijevati varijabilnu zapreminu eluenta (rastvarača) prije nego što se sakupe na drugom kraju kolone gela.
 
U kontekstu prečišćavanja proteina, eluent se obično skuplja u različite epruvete. Sve epruvete koje ne sadrže mjerljive tragove proteina za pročišćavanje se odbacuju. Preostali rastvor je tako napravljen od proteina za prečišćavanje i svih drugih proteina slične veličine.
 
### Separacija na osnovu naelektrisanja (iono-izmjenjivačka hromatografija) 
Jedna tehnika hromatografije zasnovana na molekularnim svojstvima obično nije dovoljna za dobijanje proteina visoke čistoće. Pored veličine, ionoizmenjivačka hromatografija razdvaja spojeve prema prirodi i stepenu njihovog ionskog naboja. Kolona koja će se koristiti bira se prema njenom tipu i jačini punjenja. Anionske izmjenjivačke smole imaju pozitivan naboj i služe za zadržavanje i odvajanje negativno nabijenih spojeva (aniona), dok kationske izmjenjivačke smole imaju negativan naboj i služe za odvajanje pozitivno nabijenih molekula (kationa).
 
Prije nego što odvajanje počne, kroz kolonu se pumpa pufer, kako bi se uravnotežili suprotni nabijeni ioni. Nakon ubrizgavanja uzorka, molekule rastvorene tvari će se razmjenjivati s puferskim ionima jer se svaki takmiči za mjesto vezanja na smoli. Dužina zadržavanja za svaku rastvorenu tvar ovisi o jačini njenog naboja. Najslabije naelektrisani spojevi će prvo eluirati, a zatim slijede ona sa sukcesivno jačim nabojem. Zbog prirode mehanizma za odvajanje, pH, tip pufera, koncentracija pufera i temperatura igraju važnu ulogu u kontroli odvajanja.
 
Ionoizmjenjivačka hromatografija je vrlo moćan alat za korištenje u prečišćavanju proteina i često se koristi i u analitičkim i u preparativnim separacijama.
-afinitetna kolona. Smola je plava jer je vezala nikal.]]

## Također pogledajte
*Isoljavanje
*Soljenje
*Proteinska oznaka
*Proizvodnja proteina
*Protein ćelije domaćina
 
## Reference 
## Vanjski linkovi 
*Protein purification ebook
*Protein purification facility
*Strategies for Protein Purification Handbook 
 

Kategorija:Procesi biohemijskog odvajanja
Kategorija:Biotehnologija
Kategorija:Proteinski metodi
Kategorija:Laboratorijske tehnike