Genski nokaut

**Genski  nokaut** (**KO**)  je  genetička tehnika u kojoj se  geni jednog organizma učine neoperativnim ("nokaut" organizam).  Ovakve jedinke također su poznate kao **nokautirani organizmi** ili jednostavno **nokauti**.  Oni se koriste u proučavanju funcije gen koji je sekvenciran, koja  je  nepoznate ili nepotpuno poznata. Istraživači izvlače  zaključke iz razlika  između nokaut organizama i normalnih jedinki.

Termin se odnosi na proces stvaranja takvog organizma, kao u "nokautiranju" gena. Tehnika je u suštini suprotna od nokautiranja gena.  Nokaut dva gena istovremeno u organizmu je poznat kao **dvostruki nokaut** (**DKO**). Slično tome, izrazi **trostruki nokaut** (**TKO**) i **četverokrevetne nokauta** (**qKo**) se koriste za opisivanje tri ili četiri nokautirana gena.

## Metod
mini|350px|Laboratorijski miš kod kojeg je inaktiviran gen za rast dlake (lijevo), upoređen sa normalnim laboratorijskim mišem
Nokaut se postiže kombinacijom  tehnika, počevši u epruveti s plazmidima,  bakterijskog vještačkog hromosoma ili drugog  DNK konstrukta i postupaka u kulturi ćelija. Individualne ćelije se genetički transfektiraju DNK konstruktom. Često je cilj je da se stvori transgenih životinja  koja  ima izmenjeni gen. Ako je tako, embrionske matične ćelije se  genetički transformiraju ubacivanjem  gena u ranim  fazama embrionskog razvoja. Tako nastaju  životinje s genetskičkim promjenama u njihovim geminativnim ćelijama, tako da  se često  nokautirani gen  prenosi u buduće generacije.

Za kreiranje nokaut mahovine,  preporučljivi način je transfekcija protoplasta. Tako  transformiran protoplast *Physcomitrella patens* direktno regenerira u plodne biljke mahovine. Osam sedmica nakon transfekcije, biljke mogu biti snimane  za detekciju  ciljanog gena putem PCR.

[thumb|Divlji tip *[Physcomitrella patens* i nokaut mahovine: Odstupajući fenotipovi su  izazvani u genskim poremećajem biblioteke transformanata. *Physcomitrella* divljeg tipa i transformirane  biljke su uzgajane na minimalnim Knopovom mediju, koji omogućava diferencijaciju i razvoj gametofora. Za svaku biljku, pregled (gornji red:  bar skala  odgovara 1 mm, donji red: 0,5 mm). A: Haploidna biljka  divljeg tipa potpuno prekriven lisnatim gametoforama i izbliza list divljeg tipa. B-D: Razni mutanti]]
Konstrukt je napravljen tako da  je genetička rekombinacija bila sa ciljnim genom, čiime se postiže uključivanje sekvence DNK iz samog gena u konstrukt. Rekombinacija se  onda javlja u regiji te sekvence unutar gena, što rezultira insercijom strane sekvence u  poremećeni  gen. Sa prekinutom sekvencom, izmenjeni gen u većini slučajeva će biti preveden u nefunkcionalni  protein, ako se uopće i  prevede.
[thumb|left|350px| [Nokout miš (lijevo)  koji je modelni organizam za gojaznost, upoređen sa normalnim  mišem]]

Uvjetni genski nokaut omogućava  deleciju  gena u tkivu ili na  vremenski specifičan način. To se radi uvođenjem kratkih sekvenci zvanih loxP mjesta širom gena. Ove sekvence će uvesti u klicine linije putem istih  mehanizama kao što je nokaut. Ova klicina linija se zatim može ukrstiti  sa  drugom  klicinom linijom (gem-linijom) koja  sadrži Cre-rekombinazu koja je virusni enzim sa  sposobnošću prepoznavanja  ove sekvence, rekombinuje ih i deletira  gen koji je okružen ovim mjestima.

Budući  da  je željeni tip DNK rekombinacije rijedak događaj u slučaju većine ćelija i većine konstrukata, odabrana strana  sekvenca  za umetanje obično uključuje reporter gen. To omogućava jednostavan izbor ćelije ili jedinke u kojoj je  nokaut bio uspješan. Ponekad DNK izgradi  insercije (umetke)  u hromosom,  bez željene homologne rekombinacije sa ciljanim genom. Da bi se  takve ćelije uklonile, DNK konstrukt često sadrži drugu regiju DNK, koja omogućava da se takve ćelije identificiraju i odbace.

Kod  diploidnih organizama,  koji sadrže dva alela za najveći broj gena, može i da sadrži nekoliko povezanih gena da sarađuju u istoj ulozi, dodatnom krugu transformacije i selekcije koja  se obavlja dok svaki ciljani gen ne bude nokautiran. Za proizvodnju homozigotnih nokaut životinja, može  biti potrebno  selektivno ukrštanje

## Upotreba
Nokauti se prvenstveno koriste da  se shvati uloga specifičnog gena ili regije  DNK, poređenjem nokaut organizama sa divljim tipom sa sličnom genetičkom pozadinom.
Također se koriste kao skrining alati u razvoju lijekova, ciljanjem specifične bioloških procesa ili nedostataka  pomoću određenog nokauta, ili da se shvati mehanizam djelovanja  lijekova pomoću  genskih biblioteka u nokaut urganizmima, u  rasponu cijelog genoma, kao  u *Saccharomyces cerevisiae*.

## Također pogledajte
*Genski nokdaun
*Uvjetni genski nokaut
*Genetička rekombinacija

## Reference
## Vanjski  linkovi
*Diagram of targeted gene replacement
*Frontiers in Bioscience Gene Knockout Database (available on archive only)
*International Knockout Mouse Consortium
*KOMP Repository 

Kategorija:Genetički modificirani organizmi
Kategorija:Genetika
Kategorija:Molekularna genetika
Kategorija:Laboratorijske tehnike
Kategorija:Ekspresija gena
Kategorija:Biotehnologija
Kategorija:Tehnike molekularne biologije