Metilacija DNK

: Dvije bijele sfere predstavljaju metilne grupe, vezane za dvije citozinske nukleotidne molekule koje čine sekvencu DNK]]

**Metilacija DNK** je biološki proces kojim se metilna grupa dodaje molekuli DNK. Metilacija može promijeniti aktivnost segmenta DNK bez promjene sekvence. Kada se nalazi u genu promotoru, DNK metilacija tipski djeluje na potiskivanje transkripcije gena.  Kod sisara, DNK metilacija je neophodna za normalan razvoj i povezana je sa brojnim ključnim procesima uključujući genomsko utiskivanje, inaktivaciju X-hromosoma, potiskivanje transpozibilnih elementa, starenje i kancerogenezu.

Od 2016. godine pronađene su dvije nukleobaze na kojima se odvija prirodna, enzimska metilacija DNK: adenin i citozin. Modifikovane baze su N6-metiladenin, 5-methylcytosine i N4-metilcitozin.

Dvije od četiri baze DNK, citozin i adenin, mogu biti metilirane. Metilacija citozina je široko rasprostranjena i kod eukariota i kod prokariota, iako se stopa metilacije DNK citozina može uveliko razlikovati među vrstama: 14% citozina je metilirano u *Arabidopsis thaliana*, 4% do 8% u *Physarum*, 7,6% u *Mus musculus*, 2,3% u *Escherichia coli*, 0.03%  u *Drosophila*, 0.006% in *Dictyostelium* i gotovo nijedan (0,0002 do 0,0003%) u *Caenorhabditis* ili gljivama kao što su *Saccharomyces cerevisiae* i *S. pombe* (ali ne i *Neurospora crassa*). Metilacija adenina uočena je u bakterijskoj, biljnoj i nedavno u sisarskoj DNK, ali je dobila znatno manje pažnje.

Metilacija citozina da bi se formirao 5-metilcitozin dešava se na istoj poziciji 5 na pirimidinskom prstenu, gdje se nalazi metil grupa DNK baze timin; isti položaj razlikuje timin od analogne RNK baze uracil, koja nema metilnu grupu. Spontana deaminacija 5-metilcitozina pretvara ga u timin. Ovo rezultira neusklađenošću odnosa T:G. Mehanizmi za popravku zatim ga ispravljaju nazad na originalni par C:G ; alternativno, oni mogu zamijeniti A za G, pretvarajući originalni C:G par u T:A par, efektivno mijenjajući bazu i uvodeći mutaciju. Ova pogrešno inkorporirana baza neće biti ispravljena tokom DNK replikacije jer je timin DNK baza. Ako se neusklađenost ne popravi i ćelija uđe u ćelijski ciklus, lanac koji nosi T će biti dopunjen sa A u jednoj od ćelija kćeri, tako da mutacija postaje trajna. Gotovo univerzalna upotreba timina isključivo u DNK i uracila isključivo u RNK možda je evoluirala kao mehanizam kontrole grešaka, kako bi se olakšalo uklanjanje uracila nastalih spontanom deaminacijom citozina.  Smatra se da su metilacija DNK, kao i mnoge od njenih savremenih DNK metiltransferaza, evoluirale iz rane primitivne metilacijske aktivnosti RNK i podržana je s nekoliko linija dokaza.

U biljkama i drugim organizmima, metilacija DNK nalazi se u tri različita konteksta sekvence: CG (ili CpG), CHG ili CHH (gdje H odgovara A, T ili C). Međutim, kod sisara, metilacija DNK se gotovo isključivo nalazi u CpG dinukleotidima, pri čemu su citozini na oba lanca obično metilirani. Međutim, ne-CpG metilacija se može primijetiti u embrionskim matičnim ćelijama, a također je indicirano u nervnom razvoju. Nadalje, ne-CpG metilacija primijećena je također u hematopoetskim progenitorskim ćelijama, a dešavala se uglavnom u kontekstu CpApC sekvence.

## Funkcija konzervirane metilacije DNK 
Pejzaž DNK metilacije kičmenjaka je vrlo specifičan u poređenju s drugim organizmima. Kod sisara, oko 75% CpG dinukleotida je metilirano u somatskim ćelijama, a metilacija DNK pojavljuje se kao zadano stanje koje mora biti posebno isključeno iz definiranih lokacija. Nasuprot tome, genom većine biljaka, beskičmenjaka, gljiva ili protista pokazuje "mozaične" obrasce metilacije, gdje su ciljani samo specifični genomski elementi, a karakterizira ih izmjena metiliranih i nemetiliranih domena.

Visoka CpG metilacija u genomima sisara ima evolucijsku cijenu jer povećava učestalost spontanih mutacija. Gubitak amino grupa javlja se sa velikom učestalošću za citozine, s različitim posljedicama u zavisnosti od njihove metilacije. Metilirani C-ostaci se spontano deaminiraju i formiraju T-ostatke tokom vremena; stoga CpG dinukleotidi postojano deaminiraju u TpG dinukleotide, što je dokazano nedovoljnom zastupljenošću CpG dinukleotida u ljudskom genomu (javljaju se sa samo 21% očekivane učestalosti). (S druge strane, spontana deaminacija nemetiliranih C ostataka dovodi do stvaranja U ostataka, promjene koju ćelija brzo prepoznaje i popravlja.)

### CpG otoci 
Kod sisara, jedini izuzetak za ovo globalno smanjenje CpG nalazi se u specifičnoj kategoriji sekvenci bogatih GC i CpG koje se nazivaju CpG otoci koji su općenito nemetilirani i stoga su zadržala očekivani sadržaj CpG. CpG otoci se obično definišu kao regioni sa: 1) dužinom većom od 200 bp, 2) sadržajem G+C većim od 50%, 3) odnosom uočenog i očekivanog CpG većim od 0,6, iako se ponekad koriste i druge definicije. Isključujući ponovljene sekvence, u ljudskom genomu, postoji oko 25.000 CpG otoka od kojih je 75% manji od 850bp. Oni su glavne regulatorne jedinice i oko 50% CpG otoka nalaze se u regionima promotorskog gena, dok još 25% leži u genskim tijelima, često služeći kao alternativni promotori. Recipročno, oko 60-70% ljudskih gena ima CpG ostrvo u svom promotorskom regionu. Većina CpG otoka je konstitutivno nemetilirana i obogaćena za permisivnu hromatinska modifikaciju kao što je metilacija H3K4. U somatskim tkivima, samo 10% CpG otoka je metilirano, a većina ih je locirana u intergenskim i intragenskim regijama.

### Represija CpG-gustih promotora 
Metilacija DNK je vjerovatno bila prisutna u određenoj mjeri kod vrlo ranih eukariotskih predaka. U gotovo svakom analiziranom organizmu, metilacija u promotorskim regijama negativno korelira s ekspresijom gena. CpG gusti promotori aktivno transkribovanih gena nikada nisu metilirani, ali recipročno, transkripcijski tihi geni ne moraju nužno nositi metilirani promotor. Kod miševa i ljudi, oko 60-70% gena ima CpG otoke u svom promotorskom području i većina ovih CpG otoka ostaje nemetilirana, nezavisno od transkripcione aktivnosti gena, kako u diferenciranim tako i u nediferenciranim tipovima ćelija. Treba napomenuti, dok je metilacija DNK CpG ostrva nedvosmisleno povezana sa represijom transkripcije, funkcija metilacije DNK u promotorima siromašnim CG ostaje nejasna; iako postoji malo dokaza da bi mogao biti funkcionalno relevantna.

Metilacija DNK može uticati na transkripciju gena na dva načina. Prvo, sama metilacija DNK može fizički spriječiti vezivanje transkripcijskih proteina za gen, i drugo, i vjerovatno važnije, metilirana DNK može biti vezana proteinima poznatim kao metil-CpG-vezujući domen proteinima (MBD). MBD proteini zatim regrutuju dodatne proteine na lokus, kao što su histon-deacetilaza i drugi proteini remodeliranja hromstina  koji mogu modifikovati histon đ, čime se formira kompaktan, neaktivan hromatin, zvani heterohromatin. Ova veza između metilacije DNK i strukture hromatina je vrlo važna. Konkretno, gubitak metil-CpG-vezulućeg proteina 2 (MeCP2) je impliciran u Rettov sindrom; metil-CpG-vezujući domen protein 2 (MBD2) posreduje u utišavanju transkripcije hipermetiliranih gena u "raku".

### Represija prenosivih elemenata 
DNK metilacija je moćan transkripcijski represor, barem u kontekstu gustog CpG. Čini se da je transkripcijska represija gena koji kodiraju protein u suštini ograničena na vrlo specifične klase gena koji moraju trajno biti tihi iu gotovo svim tkivima. Dok metilacija DNK nema fleksibilnost potrebnu za fino podešavanje genske regulacije, njena stabilnost je savršena da osigura trajno utišavanje transpoziblnih elementa. Kontrola transpozona jedna je od najstarijih funkcija metilacije DNK koju dijele životinje, biljke i višestruki protisti. Čak se sugerira da je metilacija DNK evoluirala upravo u tu svrhu.

### Ekspanzija genoma 
Poznato je da je metilacija DNK prenosivih elemenata povezana sa ekspanzijom genoma. Međutim, evolucijski pokretač ekspanzije genoma ostaje nepoznat. Postoji jasna pozitivna korelacija između veličine genoma i CpG, što sugerira da je metilacija DNK prijenosnih elemenata dovela do primjetnog povećanja mase DNK.

### Metilacija genskog tijela visoko transkribiranih gena 
Funkcija koja se čini još konzerviranijom od utišavanja transpozona u pozitivnoj je korelaciji s ekspresijom gena. U gotovo svim vrstama kod kojih je prisutna metilacija DNK, ona  je posebno obogaćena u tijelu visoko transkribiranih gena. i suzbijajanje aktivnosti intragenskih transkripcijskih jedinica (kriptičkih promotora ili transpozabilnih elemenata). Metilacija genskog tijela je blisko povezana s metilacijom H3K36. Kod kvasaca i sisara, metilacija H3K36 je visoko obogaćena u tijelu visoko transkribiranih gena. Barem u kvascu, H3K36me3 regrutuje enzime kao što su histon-deacilaze za kondenzaciju hromatina i sprječavanje aktivacije kriptičnih početnih mjesta. Kod sisara, DNMT3a i DNMT3b PWWP domeni vezuju se za H3K36me3 i dva enzima se regrutuju u tijelo aktivno transkribiranih gena.

## Detekcija
DNK metilacija može se otkriti pomoću sljedećih testova koji se  koriste u naučnim istraživanjima:
* Masena spektrometrija je vrlo osjetljiv i pouzdan analitički metod za otkrivanje metilacije DNK. MS, općenito, međutim, nije informativna o kontekstu sekvence metilacije, pa je stoga ograničeno u proučavanju funkcije ove modifikacije DNK.
* Metilacijski-specifični PCR (MSP), koji se zasniva na hemijskoj reakciji natrij-bisulfita sa DNK koja pretvara nemetilirane citozine CpG dinukleotida u uracil ili UpG, praćeno uobičajenim PCR. Međutim, metilirani citozini neće biti pretvoreni u ovom procesu, a prajmeri su dizajnirani da preklapaju CpG mjesto od interesa, što omogućava da se odredi status metilacije kao metilirani ili nemetilirani.
* Sekvenciranje bisulfita cijelog genoma, također poznato kao BS-Seq, što je visoko propusna analiza metilacije DNK na nivou genoma. Zasnovan je na gore spomenutoj konverziji genomske DNK natrijum bisulfitom, koja se zatim sekvencira na Next-generation sekvencion platforma. Dobijene sekvence se zatim ponovo usklađuju sa referentnim genomom kako bi se odredio status metilacije CpG dinukleotida na osnovu nepodudarnosti koje su rezultat konverzije nemetiliranih citozina u uracil.
* Sekvenciranje bisulfita sa smanjenom zastupljenošću, također poznato i kao RRBS, poznaje nekoliko radnih protokola. Prvi RRBS protokol nazvan je RRBS i ima za cilj oko 10% metiloma, potreban je referentni genom. Kasnije je došlo više protokola koji su mogli sekvencirati manji dio genoma i višestruko multipleksiranje uzoraka. EpiGBS je bio prvi protokol u kojem ste mogli multipleksirati 96 uzoraka u jednoj traci iluminskog sekvenciranja i gdje referentni genom više nije bio potreban. *De novo* referentna konstrukcija iz čitanja Watsonovog i Crickobvog lanca učinila je da je skrining populacije SNP-a i SMP-a istovremeno činjenica.
* HELP test, koji se zasniva na diferencijalnoj sposobnosti restrikcijskih enzima da prepoznaju i cijepaju metilirana i nemetilirana CpG DNK mjesta.
* GLAD-PCR test, koji se zasniva na novom tipu enzima – metil-usmjerenim DNK endonukleazama specifičnim za lokus, koje hidroliziraju samo metiliranu DNK.
* ChIP-on-chip testovi, koji se zasnivaju na sposobnosti komercijalno pripremljenih antitijela da se vežu za proteine povezane sa metilacijom DNK kao što je MeCP2.
* Restrikcijski orijentir genomskog skeniranja, komplikovan i sada retko korišćen test zasnovan na diferencijalnom prepoznavanju restrikcijskih enzima metiliranih i nemetiliranih CpG mjkesta; test je po konceptu sličan HELP testu.
* Imunoprecipitacija metilirane DNK (MeDIP), analogno imunoprecipitacioji hromatina, imunoprecipitacija koristi se za izolaciju metiliranih fragmenata DNK za unos u metode detekcije DNK kao što su DNK mikronizovi (MeDIP- čip) ili DNK sekvenciranje (MeDIP-seq).
* Pirosekvencija DNK tretirane bisulfitom. Ovo je sekvenciranje amplikona napravljenog od normalnog prednjeg prajmera, ali biotiniliranog reverznog prajmera za PCR gen izbora. Pirosekvencer zatim analizira uzorak denaturacijom DNK i dodavanjem jednog po jednog nukleotida u mješavinu prema sekvenci koju je dao korisnik. Ako postoji nepodudarnost, ona se bilježi i bilježi postotak DNK za koji je nepodudarnost prisutna. Ovo daje korisniku postotak metilacije po CpG otoku.
* Lagani molekularni test za aktivnost DNK adenin metiltransferaze – test koji se oslanja na specifičnost restriktivnog enzima DpnI za potpuno metilirana (metilacija adenina) GATC mjesta u oligonukleotidu označenom fluoroforom i gasiteljem. Adenin-metiltransferaza metilira oligonukleotid čineći ga supstratom za DpnI. Rezanje oligonukleotida pomoću DpnI dovodi do povećanja fluorescencije.
* Metil senzitivnu Southern blot sličan je HELP testu, iako koristi Southern bloting tehnike za ispitivanje gen-specifičnih razlika u metilaciji pomoću restrikcijskih digestija. Ova tehnika koristi se za procjenu lokalne metilacije u blizini mjesta vezivanja za sondu.
* MetilCpG-vezujući proteini (MBP) i fuzijski proteini koji sadrže samo metil-vezujući domen (MBD) koriste se za razdvajanje nativne DNK na metilirane i nemetilirane frakcije. Postotak metilacija pojedinačnih CpG ostrva može se odrediti kvantificiranjem količine mete u svakoj frakciji. Izuzetno osjetljiva detekcija se može postići u FFPE tkivima sa detekcijom zasnovanom na pripisivanju.
* Visokorezolutno topljenje:  Analiza (HRM ili HRMA), je post-PCR analitička tehnika. Ciljna DNK tretira se natrij-bisulfitom, koji hemijski pretvara nemetilirane citozine u uracile, dok se metilirani citozini čuvaju. PCR amplifikacija se zatim izvodi sa prajmerima dizajniranim da amplificiraju i metilirane i nemetilirane šablone. Nakon ove amplifikacije, visoko metilirane DNK sekvence sadrže veći broj CpG mjesta u odnosu na nemetilirane šablone, što rezultira različitom temperaturom topljenja koja se može koristiti u kvantitativnoj detekciji metilacije.
* Rekonstrukcija drevne DNK metilacije, metod za rekonstrukciju metilacije DNK visoke rezolucije iz drevnih uzoraka DNK. Metod se zasniva na prirodnim procesima degradacije koji se dešavaju u drevnoj DNK: s vremenom se metilirani citozini razgrađuju u timine, dok se nemetilirani citozini razgrađuju u uracile. Ova asimetrija u signalima degradacije korišćena je da se rekonstruišu pune mape metilacije neandertalca i denisovskih ljudi. U septembru 2019. i objavljen je novi metod za zaključivanje morfoloških osobina iz podataka o metilaciji DNK. Autori su bili u mogućnosti da pokažu da povezivanje gena naniže reguliranih s fenotipovima monogenskih bolesti, gdje su jedna ili dvije kopije gena poremećene, omogućava ~85% preciznosti u rekonstrukciji anatomskih osobina direktno iz mapa metilacije DNK.
* Test ekstenzije jednonukleotidnog prajmera osetljiv na metilaciju (msSNuPE), koji koristi unutrašnje prajmere koji fokusiraju ravno 5' kraj nukleotida koji se detektuje.
*Test metilacije Ilumina mjeri metilaciju DNK specifičnu za lokus koristeći hibridizaciju sekvence. DNK tretirana bisulfitom hibridizirana je sa sondama na "BeadChips". Produžetak baze sa jednom bazom sa obilježenim sondama koristi se za određivanje statusa metilacije ciljnih mesta. Godine 2016. objavljen je Infinium MethylationEPIC BeadChip, koji ispituje preko 850.000 metilacijskih mjesta u ljudskom genomu.
*Koristeći sekvenciranje nanopora,  direktno su identificirane modifikacije baze DNK i RNK pri rezoluciji nukleotida, uključujući 5mC, 5hmC, 6mA i BrdU u DNK i m6A u RNK, uz detekciju drugih prirodnih ili sintetskih epigenetičkih modifikacija mogućih kroz obuku algoritama za pozivanje baze.

## Također pogledajte
* 5-Hidroksimetilcitozi
* 5-metilcitozin
* 7-metilgvanozin
*Smanjenje DNK metilacije I (DDM1), biljnog gena za metilaciju
* Sredstvo za demetiliranje
* Diferencijalno metilirane regije
* DNK demetilacija
*Reprogramiranje DNK metilacije
* Epigenetika, čiji je značajan doprinos metilacija DNK
*Epigenetički sat, metod za izračunavanje starosti na osnovu metilacije DNK
* Epigenom
* Genom
* Genomski otisak, naslijeđena represija alela, koja se oslanja na metilaciju DNK
* MethBase Baza podataka o metilaciji DNK koja se nalazi na UCSC Genome Browser
* MethDB Baza podataka o metilaciji DNK
* N6-metiladenozin

## Reference 
## Dopunska literatura 
* 
* 
* 
* 

## Vanjski linkovi 
* 
* ENCODE threads explorer Non-coding RNA characterization. Nature
* PCMdb Pancreatic Cancer Methylation Database. 
* 
* SMART Specific Methylation Analysis and Report Tool
* Human Methylation Mark Atlas
* DiseaseMeth  Human disease methylation database
*EWAS Atlas A knowledgebase of epigenome-wide association studies

Kategorija:DNK
Kategorija:Epigenetika
Kategorija:Metilacija