Rekombinantna DNK

[340px|thumb|Dijagram ligirajuće DNK. Ovaj niz nukleotida pripada genu za ljudski [hemoglobin.]]
**Rekombinantna  DNK** (**rDNK**) ima molekule  koje su nastale primjenom laboratorijskih metoda genetičke rekombinacije  (kao što je  molekulsko kloniranje)  koje omogućavaju da se prikupi genetički  materijal iz više izvora, stvarajući sekvence koje se inače ne bi mogle naći u biološkim organizmima. Rekombinantna  DNK je je moguća zato što molekule DNK svih organizama imaju  istu hemijsku strukturu. Oni se razlikuju samo u sekvencama  nukleotida]]  u  identičnoj  ukupnoj strukturi gradivnih elemenata (nukleotida).

## Polazišta 
Rekombinantna DNK je generalni naziv za uzimanje komada jedne molekule  DNK i njegovo  kombiniranje s nekim  drugom lancem DNK. Rekombinantne molekule DNK se ponekad nazivaju i  **himerna DNK**,  jer su obično izrgađene od materijala iz dvije različita vrste, poput mitskih  himera.  Tehnologija r-DNK koristi palindromne  sekvence i dovodi do proizvodnje njihovih ljepljivih  i tupih krajeva.
Aekvence DNK koje se koristi u izgradnji rekombinantnih  molekula DNK može poticati  iz bilo koje vrste. Na primjer,  DNK biljaka se  može ugraditi u  bakterijsku DNK ili  ljudska DNK može biti spojena sa gljivičnom  DNK. Osim toga, DNK sekvence koje se ne pojavljuju nigdje u prirodi mogu  biti kreirane  putem  hemijske sinteze DNK  i inkorporirane u rekombinantne molekule. Koristeći tehnologije rekombinantne DNK i sintetičke DNK, doslovno se može kreirati bilo koja   sekvenca  DNK i uvesti  u vrlo širok spektar živih organizama.

Proteini koji mogu rezultirati iz ispoljavanja  rekombinantne DNK u okviru žive ćelije, nazivaju se rekombinantnim  proteinima.  Međutim,  kada  je rekombinantna DNK koja  kodira protein unesena u organizam domaćina, to ne znači da će se  nužno  ne proizvoditi rekombinantni protein. Tada  ispoljavanje  stranih proteina zahtijeva korištenje specijaliziranih modifikacija za  ispoljavanje vektora, a često i značajne restrukcije stranih kodirajućih  sekvenci.
 
Rekombinantna  DNK se  razlikuje od genetičke rekombinacije po tome što je rezultat  vještačkih metoda u epruveti, a druga je normalan biološki proces koji rezultira u remiksu  postojećih DNK sekvenci u suštini  u svim organizmima.
## Kreiranje rekombinantne DNK 
U kreiranju rekombinantne DNK primjenjuju se posebne metode odgovarajućeg laboratorijskog procesa.
Formiranje rekombinantne DNA zahtijeva vektor za kloniranje – DNK molekula koja se  replicira unutar žive ćelije. Vektori su uglavnom izvedeni  iz plazmid[a ili virusa, a predstavljaju relativno male segmente DNK koji sadrže potrebne genetičke signale za replikaciju, kao i dodatne elemente radi lakšeg umetanja u stranu DNK, identifikaciju ćelije koje sadrže rekombinantne DNK, i, gdje je to moguće, ispoljavanje  strane  DNK. Izbor vektora za kloniranja molekula ovisi o izboru organizma domaćina, veličine DNK koji se klonira o tome  i da li i na koji način se  ispoljava strana DNK. Segmenti DNK se mogu kombinirati koristeći razne metode, kao što su kloniranje pomoću  restrikcijskih enzimia/ ligaza ili Gibsonovim sklopom.

U standardnom protokolu kloniranja, kloniranje DNK  fragmenata u osnovi uključuje sedam koraka:
* (1) Izbor domaćina organizma i vektora za kloniranje;
*(2) Priprema vektora DNK;
* (3) Priprema DNK za kloniranje;
*(4) Kreiranje  rekombinantne DNK;
*(5) Uvođenje rekombinantne DNK u organizam domaćina;
*(6) Izbor organizama koji sadrže rekombinantnu DNK, i 
*(7) Pregled i izbor (skrining) klonova sa željenim DNK umecima i biološkim svojstvom.
## Ekspresija rekombinantne DNK
Nakon transplantacije u organizam domaćina, sadržana strana DNK u rekombinantnom DNK konstruktu može ali ne mora biti ispoljena. To je zato što DNK može jednostavno biti replicirana  bez ekspresije ili može biti transkribirana  i prevedena, tako da se proizvodi rekombinantni protein]].  Općenito govoreći, izraz stranog gena zahtijeva restrukturiranje gena uključene  sekvence, što je  potrebno za proizvodnju jedne iRNK molekule koja se može koristiti u ćeliji  domaćinskom  translacijskom  aparatu (npr.  promotoru,  pokretanju translacijskog signala i transkripcijskog  terminatora). Specifični promjene u organizmu domaćina mogu poboljšati ekspresiju unesenog  gena. Osim toga, prilagodbe mogu biti potrebne i za kodirajuće  sekvence kao i za optimizaciju translacije , čineći protein rastvorljivim. Usmjeravanjem  rekombinantnog  proteina pravilno  u ćeliji ili  vanćelijskoj lokaciji, stabiliziraju protein da se spriječi  degradacija.

## Osobenosti organizama sa rekombinantnom DNK
U većini slučajeva, organizmi koji sadrže rekombinantnu DNK imaju normalne fenotipove. To se odnosi na njihov izgled, ponašanje] i metabolizam, koji  su obično nepromijenjeni, a jedini način da se pokaže prisustvo rekombinantne sekvence je da  se ispita sama  DNK, obično koristeći polimeraznu lančanu reakciju (PCR test.

Ako je  u rDNK sekvenci kodirajući  gen koji se izražava, onda se prisustvo RNK i / ili proteinskog  proizvoda  rekombinantnog  gena mogu otkriti, obično pomoću RTPCR ili Western blot metodom hibridizacijezapadne hibridizacije.  Ukupne fenotipske promjene nisu norma, osim ako izabrana i modificirani rekombinantni  gen unesen da se  generira biološka  aktivnost u organizmu domaćina. Dodatni  fenotipovi koji se pojeve,  uključuju toksičnost na organizam domaćina uzrokovanu proizvodom  rekombinantnog gena, posebno ako je  proteinska ekspresija prekomjerno izražena u neodgovarajućjm  ćelijama  ili tkivima.

U nekim slučajevima, rekombinantna DNK može imati pogubne efekte čak i ako nije izražena. Jedan mehanizam koji dovodi do te pojave  se to dogodi je insercijska inaktivacija, u kojoj je rDNK umetnuta u gen ćelije domaćina. U nekim slučajevima, istraživači koristite ovaj fenomen za  "nokaut" gena da odrede njihovu  biološku funkciju i značaj.  Drugi mehanizam kojim umetnuta rDNA hromosomsku DNK može uticati na ekspresije gena je za neprikladna  aktivacija prethodno neispoljenih  gena ćelije domaćina. To se može dogoditi, na primjer, kada  se fragment  rekombinantne DNK koji sadrži aktivni promotor nalazi pored prethodno "tihog" gena   ćelije domaćina ili kada gen ćelije domaćina  svojom funkcijom obuzda ekspresiju gena outem insercijske inaktivacije rekombinantne DNK.

## Primjena tehnologije  rekombinantne DNK 
Rekombinantna  DNK se naširoko koristi u biotehnologiji, medicini i istraživanjima. Danas, rekombinantni proteina i drugi proizvodi  koji su rezultat upotrebe tehnologije rDNA  se nalaze  u suštini, u  svakoj zapadnoj apoteci, ljekarskom  ili veterinarskom  uredu, medicinskim laboratorijama za ispitivanje i biološka istraživanja. Osim toga, organizmi koji su izmanipulisani korištenjem tehnologije rekombinantne DNK, kao i proizvodi dobijeni iz tih organizama, pronašli u svoj put u mnogim farmama, supermarketima, medicinskim ormarima pa čak i prodavnicama životinja, kao što su one koje se bave prodajom GloFish i drugim genetički modificiranih sorti i varijeteta.

Najčešća  primjena rekombinantne DNK je  u osnovnim istraživanjima, u kojimam je ta tehnologija važna za većinu dosadašnjih aktivnosti u biološkim i biomedicinskim naukama. Rekombinantna DNK se koristi  i za identifikaciju, mapiranje  i sekvenciranje gena, kao utvrđivanje  njihova funkcija.  Sonde rDNK se upotrebljavaju  u analizi ekspresije gena unutar pojedinih ćelija i širom tkiva cijelog organizma. Rekombinantni proteini su široko koriste kao reagensi u laboratorijskim eksperimentima i za generiranje sonde antitijela za ispitivanje sinteze proteina u ćeliji i organizamu.
 
Mnoge dodatne praktične primjene rekombinantne DNK mogu se naći u industriji, proizvodnji hrane, humanoj i veterinarskoj medicini, poljoprivredi, i bioinžinjerstvu. U nastavku su identificirani neki specifični primjeri.

; Rekombinantni himozin: Pronađen  u sirilu, himozin je enzim potreban za proizvodnju sira. To je bio prvi genetički modificirani prehrambeni aditiv koji se koristi u komercijalne svrhe. Tradicionalno, hymozin je dobijan iz sirila, koje je vađeno  iz četvrtog želuca mlijekom  hranjenih teladi. Naučnici su  kreirali  nepatogeni soj (K-12) za bakterije *Escherichia coli*, za laboratorijsku proizvodnju velikih količina  enzima. Ovaj mikrobiološki proizvod  rekombinantnog enzima, strukturno je identičan sa telećim,  troškovi su neuporedivo manji,  pa se  proizvodi u ogromnim količinama. Danas je oko 60% od tvrdog sira  u USA napravljeno upotrebom rekombinantnog himozina. Od 1990. godine, nadležna agencija za hranu i lijekove (FDA) je odobrila ovakav himozin deklaracijom "općenito priznato kao sigurno" (GRAS),  na osnovu podataka koji pokazuju da je enzim bio siguran.
; Rekombinantni ljudski insulin: gotovo u potpunosti je  zamijenio  inzulin dobijen iz životinjskih izvora (npr svinja i goveda),  za liječenje insulinske zavisni dijabetes. Rekombinantne insulin je sintetiziran umetanjem ljudskog inzulinskog gena ljudskog u *Escherichia coli* ili kvasac (*Saccharomyces cerevisiae* koji onda proizvode inzulin za ljudsku upotrebu.
; Rekombinantni ljudski hormon rasta (*HGH*, somatotropin): potreban je  pacijentima čija žlijezda hipofiza stvara nedovoljne količine hormona  za podršku normalnog rasta i razvoja. Prije nego što je  postao dostupan rekombinantni HGH, za terapeutsku upotrebu je dobijan iz hipofize žlijezda leševa. Ova nesigurna  praksa je, kod pacijenata u razvoju,  dovela do pojave  Creutzfeldt-Jakobove bolesti. Rekombinantni HGH eliminira ovaj problem, a danas se masovno koristi u terapeutske  svrhe. Također je zloupotrebljen i  kao stimulirajuća droga za  poboljšanje spremnosti sportista i drugih osoba.
; Rekombinantni faktor  zgrušavanja krvi,  faktor VIII: A protrin zgrušavanja krvi koji se daje pacijentima s oblicima poremećaja krvarenja, kao što je  hemofilija. Oni nisu u stanju da proizvedu faktor VIII u količinama koje omogućavaju normalno zgrušavanje krvi.  Prije razvoj rekombinantnog faktora VIII, protein je dobijen obradom velikih količina ljudske krvi iz više donatora, koja je imala vrlo visok rizik od prijenosa krvno prenosivih zaraznih bolesti, na primjer HIV-a i hepatitisa B.
; Rekombinantne vakcine protiv hepatitisa B: infekcija hepatitisa B]]  je pod kontrolom, zahvaljujući upotrebi rekombinantne vakcine, koji sadrži oblik virusa hepatitisa B sa površinskim antigenom  koji se proizvodi u ćelijama kvasca. Razvoj rekombinantne podjedinice vakcina je važan i neophodan za razvoj, jer virus hepatitisa B, za razliku od drugih zajedničkih virusa, kao što su polio virus, ne mpže da se uzgaja *in vitro*.
; Dijagnoza infekcije  HIV-om: svaka od tri naširoko korištene metode za dijagnosticiranje infekcije HIV-om je razvijena pomoću rekombinantne DNK. Test antitijela (ELISA ili Western blot) koriste se rekombinantnim HIV-proteinom  za testiranje na prisustvo antitijela koje  tijelo proizvodi kao odgovor na infekciju HIV-om. Test DNK traži prisustvo HIV genetičkog materijala pomoću obrnute reakcije polimerazne transkripcije lanca (RT-PCR). Razvoj RT-PCR testa  je omogućio kloniranje i molekulski redoslijed u analizi  genoma HIV.
; Zlatna riža:. Razne rekombinantne riže  su  konstruirana tako da imaju ekspresiju  enzima, odgovornih za  biosintezu β-karotena. Obećavaju značajno smanjenje učestalosti nedostatka vitamina A u svjetskoj populaciji. Zlatna riža riže trenutno nije u upotrebi, dok se ne riješe regulatorna pitanja njenih svojstava.
; Usjevi otporni na herbicide: oficijelne sorte važnih poljoprivrednih kultura (uključujući i soju, kukuruza sirak, uljanu repicu, lucerku i pamuk) su razvijene u pravcima koji podrazumijevaju  rekombinantni gen koji rezultira otpornošću na  herbicid[ glifosat (trgovački naziv *Overview *), a pojednostavljuje suzbijanje korova. Ovi usjevi se zajednički komercijalno koriste u nekoliko zemalja.
; Usjevi otporni na insekte: *Bacillus thuringeiensis* je bakterija  koja prirodno proizvodi protein (Bt toksin) sa insekticidnim svojstvima, Bakterija je primijenjena na usjevima za suzbijanje i kontrolu širenja  insekata,  dugi niz godina, a ova praksa je široko prihvaćen u poljoprivredi i povrtlarstvu. Nedavno su razvijene biljke sa ekspresijom rekombinantnog oblika bakterijskog proteina, što može efikasno upravljati nekim od predatora insekata. Ekološka pitanja vezana uz korištenje ovih transgenih usjeva nisu u potpunosti riješena.

## Historija rekombinantne DNK
Ideju o mogućnosti kreiranja  rekombinantne DNA je prvi put predložio Peter Lobban, diplomirani student profesora Dalea Kaisera u Biohemijskom  odjelu na *Stanford University Medical School*. Prve publikacije koje opisuju uspješnu proizvodnju i unutarćelijsku  replikaciju rekombinantne DNK pojavile su se  1972. i 1973. *Stanford University*, za  USA prijavljuje patent za rekombinantnu DNK,  1974. godine, navodeći da su  pronalazači Stanley N. Cohen i Herbert W. Boyer; ovaj patent je nagrađen u 1980. Prvi odobreni  lijek  koji je generiran korištenjem tehnologije rekombinantne DNK  je ljudski inzulin, koji je razvio Genentech, s licencirala ga je Eli Lilly and Company.

## Reference
## Također pogledajte
*Genetičko inženjerstvo
*Biotehnologija
## Vanjski linkovi
*Recombinant DNA fact sheet  (from University of New Hampshire)
*Plasmids in Yeasts (Fact sheet from San Diego State University)
*Animation illustrating construction of recombinant DNA and foreign protein production by recombinant bacteria
*Recombinant DNA research at UCSF and commercial application at Genentech Edited transcript of 1994 interview with Herbert W. Boyer, Living history project. Oral history.
*Recombinant Protein Purification Principles and Methods Handbook 

Kategorija:Biotehnologija
Kategorija:Hrana
Kategorija:Medicina
Kategorija:Farmacija
Kategorija:Genetičke tehnike