Zeleni fluorescentni protein

**Zeleni fluorescentni protein** (**GFP**) je protein koji pokazuje jarko zelenu fluorescenciju kada je izložen svjetlu u plavom do ultraljubičastom opsegu.  Oznaka *GFP* tradicionalno se odnosi na protein koji je prvi izolovan iz meduza *Aequorea victoria* i ponekad se naziva *avGFP*. Međutim, GFP-ovi su pronađeni u drugim organizmima uključujući korale, morske anemone, zoanitide, copepoda i lancelete.
 
GFP iz *A. victoria* ima glavni pik ekscitacije na talasnoj dužini od 395&nbsp;nm i manji na 475&nbsp;nm. Vrh njegove emisije je na 509&nbsp;nm, što je u donjem zelenom dijelu vidljivog spektra. Kvantni prinos (QY) florescencije GFP-a je 0,79. GFP iz morske maćuhice (*Renilla reniformis*) ima jedan glavni ekscitacioni vrh na 498&nbsp;nm. GFP je odličan alat u mnogim oblicima biologije zbog svoje sposobnosti da formira unutrašnji hromofor, bez potrebe za bilo kakvim dodatkom kofaktora, genskih proizvoda ili enzima / supstrata osim molekulskog kisika.
 
U citologiji i molekulskoj biologiji, GFP gen se često koristi kao izvještač ekspresije. Korišten je u modifikovanim oblicima za pravljenje biosenzora, a stvorene su mnoge životinje koje eksprimiraju GFP, što pokazuje dokaz koncepta da se gen može eksprimirati u datom organizmu, u odabranim organima , ili u ćelijama od interesa. GFP se može uvesti u životinje ili druge vrste putem transgenih tehnika, i održavati u njihovom genomu i genomu njihovog potomstva. Do danas, GFP je bio izražen u mnogim taksonima, uključujući bakterije, kvasce, gljive, ribe i sisare, uključujući i ljudske ćelije. Naučnici Roger Y. Tsien, Osamu Shimomura i Martin Chalfie su 10. oktobra 2008. dobili Nobelovu nagradu za hemiju 2008. za njihovo otkriće i razvoj zelenog fluorescentnog proteina .
 
Većina komercijalno dostupnih gena za GFP i slične fluorescentne proteine dugi su oko 730 parova baza. Prirodni protein ima 238 aminokiselina. Njegova molekulska masa je 27 kD. Stoga, spajanje GFP gena sa genom proteina od interesa može značajno povećati veličinu i molekulsku masu proteina i može narušiti prirodnu funkciju proteina ili promijeniti njegovu lokaciju ili putanju transporta unutar ćelija.
 
## Pozadina 
### GFP divljeg tipa (wtGFP) 
Prva prijavljena kristalna struktura GFP-a bila je ona mutanta S65T od strane Remingtonove grupe u *Science* 1996.
 
### Nomenklatura 
Nomenklatura modificiranih GFP-ova često je zbunjujuća zbog preklapanja mapiranja nekoliko GFP verzija na jedno ime. Naprimjer, **mGFP** se često odnosi na GFP sa N-terminalom palmitoilacijom koji uzrokuje da se GFP veže za ćelijske membrane. Međutim, isti termin se također koristi za označavanje monomernih GFP-a, koji se često postiže tako što interfejs dimera razbija mutaciju A206K.  GFP divljeg tipa ima slabu tendenciju dimeraizacije pri koncentracijama iznad 5&nbsp;mg/mL. mGFP je također skraćenica za "modificirani GFP", koji je optimiziran kroz razmjenu aminokiselina za stabilnu ekspresiju u biljnim ćelijama.
 
## U prirodi 
280px|right| Živa lanceta (*B. floridae*) pod fluorescentnim mikroskopom.|thumb
[280px|thumb|left|Zelena [fluorescencija u morskom kopepodu *Pontella mimocerami*]]

Svrha i (primarnih) bioluminiscencija (od djelovanja ekvorins na luciferin) i (sekundarne) fluorescencije GFP-a u meduzama je nepoznata. GFP se ko-eksprimira sa ekvorinom u malim granulama oko oboda zvona meduze. Sekundarni ekscitacijski vrh (480&nbsp;nm) GFP-a apsorbuje nešto od plave emisije ekvorina, dajući bioluminiscenciji zeleniju nijansu. Ostatak serina 65 GFP-a hromofora je odgovoran za spektre ekscitacije sa dvostrukim vrhom GFP-a divljeg tipa. Sačuvan je u sve tri GFP izoforme koje je prvobitno klonirao Prasher. Gotovo sve mutacije ovog ostatka konsolidiraju ekscitacijske spektre u jedan vrh na 395&nbsp;nm ili 480&nbsp;nm. Precizan mehanizam ove osjetljivosti je složen, ali, čini se, uključuje doniranje vodika iz serina 65 u glutamat 222, koji utiče na ionizaciju hromofora. Za razliku od *A. victoria*, lancete ne proizvode sopstvenu plavu svjetlost, a porijeklo njihovog endogenog GFP-a je još uvijek nepoznato. Neki nagađaju da privlači plankton prema ušću lancete, služeći kao pasivni mehanizam za lov. Takođe može poslužiti kao fotoprotektivni agens u larvama, sprečavajući oštećenja uzrokovana plavim svjetlom visokog intenziteta pretvarajući ga u zeleno svjetlo nižeg intenziteta. Međutim, ove teorije nisu testirane.
 
Proteini slični GFP-u pronađeni su u više vrsta morskih Copepoda, posebno iz porodica *Pontellidae* i *Aetideidae*. GFP izolovan iz *Pontella mimocerami* pokazao je visok nivo sjaja sa kvantnim prinosom od 0,92, što ih čini skoro dvostruko svetlijim od obično korišćenog EGFP izolovanog iz *A. victoria*.

## Struktura 
GFP ima beta-barelnu strukturu koja se sastoji od jedanaest β-lanaca sa nabranim rasporedom beta-listova, sa alfa-heliksom koji sadrži kovalentno vezan hromofor 4-(*p*-hidroksibenziliden)imidazolidin-5- jedan (HBI) koji prolazi kroz centar. Pet kraćih alfa-heliksa formiraju kape na krajevima strukture. Beta-barelna struktura je skoro savršen cilindar, 42Å dug i 24Å u prečniku (neke studije su prijavile prečnik od 30Å Bočni lanci cijevi okrenuti prema unutra indukuju specifične reakcije ciklizacije u Ser65–Tyr66–Gly67 koje indukuju ionizaciju HBI u fenolatnu formu i formiranje hromofora. Ovaj proces posttranslacijske modifikacije naziva se *sazrevanjem*.  Mreža vodikove veze i interakcije slaganja elektrona sa ovim bočnim lancima utiču na boju, intenzitet i fotostabilnost GFP-a i njegovih brojnih derivata. Čvrsto zbijena priroda barela isključuje molekule rastvarača, štiteći hromoforsku  fluorescenciju od gašenja vodom. Pored autociklizacije Ser65-Tyr66-Gly67, reakcija 1,2-dehidrogenacije se dešava na ostatku Tyr66.

 
### Autocatalitsko formiranje hromofora  u wtGFP 
Mehanički, proces uključuje ciklizaciju posredovanu bazom praćenu dehidratacijom i oksidacijom. U reakciji od 7a do 8 dolazi do stvaranja enamina iz imina, dok se u reakciji od 7b do 9 apstrahuje proton. Formirani HBI fluorofor je označen zelenom bojom.
 
Reakcije su katalizirane ostacima Glu222 i Arg96. Analogni mehanizam je također moguć sa treoninom umjesto Ser65.
 
### Transgeni kućni ljubimci 
Alba, zeleno-fluorescentni zec, stvoren je u francuskoj laboratoriji koju je naručio Eduardo Kac koristeći GFP za potrebe umjetnosti i društvenog komentara. Američka kompanija Yorktown Technologies prodaje akvarijske zelene fluorescentne zebrice (GloFish) koje su prvobitno razvijene za otkrivanje zagađenja u vodenim putevima. NeonPets, kompanija sa sjedištem u SAD-u, reklamirala je zelene fluorescentne miševe industriji kućnih ljubimaca kao NeonMice. Zelene fluorescentne svinje, poznate kao Noels, uzgajala je grupa istraživača pod vodstvom Wu Shinn-Chiha na Odsjeku za nauku o životinjama i tehnologiju na Nacionalnom univerzitetu Tajvana. Japansko-američki tim stvorio je zeleno-fluorescentne mačke kao dokaz koncepta kako bi ih potencijalno koristio kao uzorne organizme za bolesti, posebno HIV. U 2009. južnokorejski tim sa Nacionalnog univerziteta u Seulu uzgojio je prve transgene biglove sa ćelijama fibroblasta iz morskih anemona. Psi emituju crveno fluorescentno svjetlo, a trebali bi omogućiti naučnicima da proučavaju gene koji uzrokuju ljudske bolesti poput narkolepsija i sljepila.

## Također pogledajte 
* Proteinska oznaka
* pGLO
* Žuti fluorescentni protein
* Genetićki kodirani indikator napona

 
## Reference 
## Dopunska literatura
*  Popular science book describing history and discovery of GFP
* 

 
## Vanjski linkovi 
* A comprehensive article on fluorescent proteins at Scholarpedia
* Brief summary of landmark GFP papers
* Interactive Java applet demonstrating the chemistry behind the formation of the GFP chromophore
* Video of 2008 Nobel Prize lecture of Roger Tsien on fluorescent proteins
* Excitation and emission spectra for various fluorescent proteins
* Green Fluorescent Protein Chem Soc Rev themed issue dedicated to the 2008 Nobel Prize winners in Chemistry, Professors Osamu Shimomura, Martin Chalfie and Roger Y. Tsien
* [//www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=42 Molecule of the Month, June 2003]: an illustrated overview of GFP by David Goodsell.
* [//www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=174 Molecule of the Month, June 2014]: an illustrated overview of GFP-like variants by David Goodsell.
*Green Fluorescent Protein on FPbase, a fluorescent protein database
*
 

Kategorija:Proteinski metodi
Kategorija:Rekombinantni proteini
Kategorija:Snimanje ćelija
Kategorija:Snimanje proteina
*
Kategorija:Bioluminiscencija
Kategorija:Knidarijski proteini