Sekvenciranje egzoma

thumb|Tok rada na sekvenciranji egzoma: 1. dio.
**Sekvenciranje egzoma**, također poznato kao **sekvenciranje cijelog egzoma** (**WES**), je genomska tehnika za sekvenciranje svih proteinskih kodirajućih regija gena u genomu (poznatom kao egzom).

Cilj ovog pristupa je identificIranje genetičkih varijanti koje mijenjaju proteinske sekvence, i to po mnogo nižoj cijeni od sekvenciranje cijelog genoma. Budući da ove varijante mogu biti odgovorne i za Mendelovske i za uobičajene poligenske bolesti, poput Alzheimerove bolesti, sekvenciranje cijelog egzoma primjenjuje se i u akademskim istraživanjima i kao klinička dijagnostika
thumb|Tok rada na sekvenciranju egzoma: 2. dio.

## Motivacija i poređenje s drugim pristupima
Sekvenciranje egzoma je posebno efikasno u proučavanju rijetkih Mendelovskih bolesti, jer je efikasan način za identifikaciju genetičkih varijanti u svim genima  jedinke. Ove bolesti najčešće uzrokuju vrlo rijetke genetičke varijante koje su prisutne samo kod malog broja individua; nasuprot tome, tehnike poput SNP nizova mogu otkriti samo zajedničke genetičke varijante koje su zajedničke mnogim jedinkama u široj populaciji. Nadalje, budući da su varijante koje uzrokuju teške bolesti mnogo vjerovatnije (ali nipošto isključivo) da se nalaze u sekvenci koja kodira proteine, a sekvenciranje na ovaj način košta daleko manje od 1%, sekvenciranja cijelog genoma, ali i dalje detektira visok prinos relevantnih varijanti.

U prošlosti su klinički genetički testovi birani na osnovu kliničke slike pacijenta (tj. fokusirani na jedan gen ili mali broj za koji se zna da je povezan s određenim sindromom) ili su ispitivali samo određene tipove  varijacija (npr. komparativna genomska hibridizacija), ali su pružali konačne genetičke dijagnoze kod manje od polovine svih pacijenata. Sekvenciranje egzoma se sada sve više koristi kao dopuna ovim drugim testovima: kako za pronalaženje mutacija u genima za koje se već zna da uzrokuju bolesti, tako i za identifikaciju novih gena poređenjem egzoma pacijenata sa sličnim karakteristikama.

## Tehnička metodologija
### Korak 1: Strategije obogaćivanja cilja
Metodi obogaćivanja cilja omogućavaju selektivno hvatanje genomskih regija od interesa iz uzorka DNK prije sekvenciranja. Nekoliko strategija obogaćivanja cilja razvijeno je od originalnog opisa metode direktne genomske selekcije (DGS) u 2005.

Iako je opisano mnogo tehnika za ciljano hvatanje, samo je nekoliko njih prošireno na hvatanje cijelih egzoma. Prva strategija obogaćivanja cilja koja je primijenjena na sekvenciranje cijelog egzoma bila je hibridna metoda snimanja zasnovana na nizovima 2007., ali snimanje u rastvoru je steklo popularnost posljednjih godina.

#### Hvatanje zasnovano na nizovima
[thumb|In-Solution Capture|Hvatanje u [rastvoru.]]
Mikročipovi sadrže jednolančane oligonukleotide sa sekvencama iz ljudskog genoma kako bi se popločalo područje interesa fiksirano za površinu. Genomska DNK se reže kako bi se formirali dvolančani fragmenti. Fragmenti se popravljaju na krajevima, kako bi se dobili tupi krajevi i dodaju se adapteri sa univerzalnim sekvencama za pripremu. Ovi fragmenti se hibridizuju sa oligonukleotidima na mikročipu.
Nehibridizovani fragmenti se ispiru i željeni fragmenti se eluiraju. Fragmenti se zatim amplificiraju korištenjem PCR-n-rastvor za hvatanje.

Mikročipovi sadrže jednolančane oligonukleotide sa sekvencama iz ljudskog genoma, kako bi se popločala regija od interesa fiksirana na površinu. Genomska DNK se reže kako bi se formirali dvolančani fragmenti. Fragmenti se popravljaju na krajevima kako bi se dobili tupi krajevi i dodaju se adapteri sa univerzalnim sekvencama za pripremu. Ovi fragmenti se hibridizuju sa oligonukleotidima na mikročipu.
Nehibridizovani fragmenti se ispiru i željeni fragmenti se eluiraju. Fragmenti se zatim amplificiraju korištenjem PCR-a.

Roche NimbleGen was first Roche NimbleGen je prvi uzeo originalnu DGS tehnologiju Ovaj metod štedi vrijeme i isplativija je u poređenju sa metodima zasnovanim na PCR-u. Agilent Capture Array i komparativna genomska hibridizacijska mreža su drugi metodi koji se mogu koristiti za hibridno hvatanje ciljnih sekvenci. Ograničenja ove tehnike uključuju potrebu za skupim hardverom, kao i relativno veliku količinu DNK.

#### Hvatanje u rastvoru
Da bi se uhvatile genomske regije od interesa korištenjem hvatanja u rastvoru, sintetizira se skup prilagođenih oligonukleotidnih sondi i hibridizira u rastvoru s fragmentiranim uzorkom genomske DNK. Sonde (obilježene kuglicama) selektivno hibridiziraju s genomskim regijama od interesa, nakon čega se kuglice (sada uključujući fragmente DNK od interesa) mogu izvući i isprati kako bi se uklonio višak materijala. Kuglice se zatim uklanjaju, a genomski fragmenti se mogu sekvencirati, što omogućava selektivno sekvenciranje DNK genomskih regija (npr. egzona) od interesa.

Ovaj metod je razvijen kako bi se poboljšao nači obogaćivanja cilja hibridizacijskog hvatanja. Kod hvatanja u rastvoru (za razliku od hibridnog hvatanja) postoji višak sondi za ciljanje regija od interesa u odnosu na količinu potrebnog predloška.

### Korak 2: Sekvenciranje
Postoji mnogo platformi za sekvenciranje sljedeće generacije sekvenciranja, koje su nastale nakon klasičnih metodologija Sangerovskog sekvenciranja. Ostale platforme uključuju sekvencer Roche 454 i SOLiD sisteme Life Technologies, Ion Torrent i Illuminin Illumina Genome Analyzer II (ukinut) i kasnije instrumente serije Illumina MiSeq, HiSeq i NovaSeq, koji se svi mogu koristiti za masovno paralelno sekvenciranje egzoma. Ovi NGS sistemi sa 'kratkim čitanjem' su posebno pogodni za analizu mnogih relativno kratkih dijelova DNK sekvenci, kao što su pronađeni u ljudskim egzonima.

## Poređenje sa drugim tehnologijama
Postoje višestruke tehnologije koje identifikuju genetičke varijante. Svaka tehnologija ima prednosti i nedostatke u smislu tehničkih i finansijskih faktora. Dvije takve tehnologije su mikročipovi i sekvenciranje cijelog genoma.

### Genotipizacija zasnovana na mikročipovima
Mikročipovi koriste hibridizacijske sonde za testiranje prevalencije poznatih DNK sekvenci, stoga se ne mogu koristiti za identifikaciju neočekivanih genetičkih promjena. Stoga, WES se bavi nekim od trenutnih ograničenja hibridizacijskih genotipizacijskih nizova.

Iako je sekvenciranje egzoma skuplje od tehnologija zasnovanih na hibridizaciji na osnovu uzorka, njegova cijena se smanjuje zbog pada troškova i povećanog protoka sekvenciranja cijelog genoma.

### Sekvenciranje cijelog genoma
Sekvenciranje egzoma može identificirati samo one varijante pronađene u kodirajućoj regiji gena koje utiču na funkciju proteina. Nije u stanju identificirati strukturne i nekodirajuće varijante povezane s bolešću, koje se mogu pronaći korištenjem drugih metoda kao što je sekvenciranje cijelog genoma.

## Analiza podataka
Statistička analiza velike količine podataka generiranih iz pristupa sekvenciranja predstavlja izazov. Čak i samo sekvenciranjem egzoma pojedinaca, generira se velika količina podataka i informacija o sekvencama, što zahtijeva značajnu količinu analize podataka. Izazovi povezani s analizom ovih podataka uključuju promjene u programima koji se koriste za poravnavanje i sastavljanje očitavanja sekvenci.Funkcionalno označavanje predviđaju učinak ili funkciju rijetkih varijanti i pomažu u određivanju prioriteta rijetkih funkcionalnih varijanti. Uključivanje ovih anotacija može efikasno povećati snagu genetičke asocijacije analize rijetkih varijanti studija sekvenciranja cijelog genoma. Razvijeni su neki metodi i alati za provođenje funkcionalno informirane analize asocijacije rijetkih varijanti, uključivanjem funkcionalnih anotacija kako bi se osnažila analiza u studijama sekvenciranja cijelog egzoma.

## Etičke implikacije
Nove tehnologije u genomici promijenile su način na koji istraživači pristupaju i osnovnim i translacijskim istraživanjima. S pristupima kao što je sekvenciranje egzoma, moguće je značajno poboljšati podatke generirane iz pojedinačnih genoma, što je postavilo niz pitanja o tome kako se nositi s ogromnom količinom informacija. Treba li pojedincima u ovim studijama dozvoliti pristup informacijama o njihovom sekvenciranju? Treba li ove informacije dijeliti s osiguravajućim društvima? Ovi podaci mogu dovesti do neočekivanih nalaza i zakomplicirati kliničku korisnost i korist za pacijenta. Ovo područje genomike i dalje predstavlja izazov i istraživači traže kako odgovoriti na ova pitanja. Ova heterogenost osnovnog rizika znači da su za otkrivanje gena potrebni vrlo veliki uzorci, te stoga sekvenciranje cijelog genoma nije posebno isplativo. Ovaj problem veličine uzoraka ublažen je razvojem novih naprednih analitičkih metoda, koje efikasno mapiraju gene bolesti uprkos tome što su genetičke mutacije rijetke na nivou varijante.

### Otkriće Mendeloviskih poremećaja
Kod Mendelovskih poremećaja velikog efekta, dosadašnji nalazi ukazuju na to da jedna ili vrlo mali broj varijanti unutar kodirajućih gena leži u osnovi cijelog stanja. Zbog težine ovih poremećaja, pretpostavlja se da su nekoliko uzročnih varijanti izuzetno rijetke ili nove u populaciji i da bi ih propustio bilo koji standardni test genotipizacije. Sekvenciranje egzoma pruža visoku pokrivenost poziva varijanti u kodirajućim regijama, što je potrebno za odvajanje pravih varijanti od šuma. Uspješan model otkrivanja Mendelovskih gena uključuje otkrivanje de novo varijanti, korištenjem trio sekvenciranja, gdje se genotipiziraju roditelji i proband.

#### Studije slučaja
Studija objavljena u septembru 2009.  razmatrala je eksperiment koncept dokaza, kako bi se utvrdilo da li je moguće identificirati uzročne genetićke varijante, korištenjem sekvenciranja egzoma. Sekvencirali su četiri osobe sa Freeman-Sheldonovim sindromom (FSS) (OMIM 193700), rijetkim autosomo dominantnim poremećajem za koji se zna da ga uzrokuje mutacija u genu MYH3. Postoje mnogi faktori koji sekvenciranje egzoma čine superiornijim u odnosu na analizu pojedinačnih gena, uključujući sposobnost identifikacije mutacija u genima koji nisu testirani zbog atipične kliničke slike ili sposobnost identifikacije kliničkih slučajeva gdje mutacije iz različitih gena doprinose različitim fenotipovima kod istog pacijenta.

Nakon što je dijagnosticiran genetički uzrok bolesti, ove informacije mogu voditi u o izboru odgovarajućeg tretmana. Prvi put kada je ova strategija uspješno provedena u klinici bilo je u liječenju dojenčeta sa upalom bolešću crijeva. Postoje mnogi faktori koji sekvenciranje egzoma čine superiornijim u odnosu na analizu pojedinačnih gena, uključujući sposobnost identifikacije mutacija u genima koji nisu testirani zbog atipične kliničke slike ili sposobnost identifikacije kliničkih slučajeva gdje mutacije iz različitih gena doprinose različitim fenotipovima kod istog pacijenta.

Nakon što je dijagnosticiran genetički uzrok bolesti, ove informacije mogu voditi u odabiru odgovarajućeg tretmana. Prvi put kada je ova strategija uspješno provedena u klinici bilo je u liječenju djenčeta sa upalnom bolešću crijeva. Kasnije je 23andMe pokrenuo pilot WES program koji je najavljen u septembru 2011. godine, a obustavljen je 2012. godine. Potrošači su mogli dobiti egzomske podatke po cijeni od 999 dolara. Kompanija je pružila sirove podatke i nije ponudila analizu.

U novembru 2012., DNADTC, odjeljenje kompanije Gene by Gene, počelo je nuditi egzome sa 80X pokrićem i početnom cijenom od 695 dolara. Ova cijena po DNADTC web stranici trenutno iznosi 895 dolara. U oktobru 2013. godine, BGI je najavio promociju za lično sekvenciranje cijelog egzoma sa 50X pokrićem za 499 dolara. 
U junu 2016. godine, Genos je uspio postići još nižu cijenu od 399 dolara sa CLIA-certificiranim 75X potrošačkim egzomom sekvenciranim iz pljuvačke.

Pregled 36 studija iz 2018. godine pokazao je da se cijena sekvenciranja egzoma kreće od 555 USD do 5.169 USD, s dijagnostičkim prinosom od 3% do 79%, ovisno o grupama pacijenata.

## Također pogledajte
* Profiliranje DNK
* Genetičko savjetovanje
* Personalizirana medicina
* Transkriptomika
* Sekvenciranje cijelog genoma

## Reference
## Vanjski  linkovi
*News on Exome Sequencing
*Guide for Patients and Families

Kategorija:Molekularna biologija
Kategorija:Sekvenciranje DNK
Kategorija:Tehnike molekularne biologije