Umrežavanje DNK

U genetici, **umrežavanje DNK** označava pojave  kada različiti egzogeni ili endogeni agensi reaguju sa dva nukleotida DNK, formirajući kovalentnu vezu između njih. Ova poprečna veza može se desiti unutar istog lanca (unutarlančana) ili između suprotnih lanaca dvolančane DNK (međulančana). Ovi adukti ometaju ćelijski metabolizam, kao što su replikacija DNK i transkripcija, pokrećući ćelijsku smrt. Ove poprečne veze se, međutim, mogu popraviti putem ekscizije ili rekombinacijskih puteva.

Umrežavanje DNK također ima korisne zasluge u hemoterapijama i ciljanju kancerogenih ćelija za apoptoze, kao i u razumijevanju interakcije proteina sa DNK.

## Agensi umrežavanja
Mnogi karakterizirani agensi za umrežavanje imaju dvije neovisno reaktivne grupe unutar iste molekule, od kojih se svaka može vezati za nukleotidni ostatak DNK. Ovi agensi su odvojeni na osnovu njihovog izvora i označeni kao egzogeni ili endogeni. Egzogeni agensi za umrežavanje su hemikalije i spojevi, prirodni i sintetski, koji proizlaze iz izloženosti okolišu kao što su lijekovi i dim cigareta ili izduvni gasovi automobila. Endogeni agensi za umrežavanje su spojevi i metaboliti koji se unose iz ćelijskih ili biohemijskih puteva unutar ćelije ili organizma.

### Egzogeni agensi 
*Dušični iperit su egzogeni alkilirajući agensi koji reaguju sa *N7* položajem guanina. Ovi spojevi imaju strukturu jezgra bis-(2-etilhloro)amina, sa promenljivom *R*-grupom, sa dvije reaktivne funkcionalne grupe koje služe za alkilaciju nukleobaza i formiraju umreženu leziju. Ovi agensi najpoželjnije formiraju 1,3 5'-d(GNC) međulančanu poprečnu vezu. Uvođenje ovog agensa blago savija DNK dupleks, kako bi se prilagodio prisutnosti agensa unutar heliksa. Ovi agensi se često uvode kao farmaceutski proizvodi i koriste se u citotoksičnoj hemoterapiji.
* Cisplatin (cis-diamindikloroplatina(II)) i njegovi derivati uglavnom deluju na susedne gvanine na njihovim *N7* pozicijama. Planarno jedinjenje se povezuje s nukleobazama putem pomicanja vode jedne ili obje svoje kloridne grupe, omogućavajući cisplatinu da formira monoadukte za DNK ili RNK, unakrsne veze unutar lanaca DNK, umreženost međulančanih DNK i umrežavanje DNK-protein. Kada cisplatin generira umrežavanje DNK, on češće formira 1,2-intralančane umrežene veze (5'-GG), ali također formira i 1,3-intralančane umrežene veze (5-GNG) u nižim procentima. Kada cisplatin formira međulančano umrežavanje (5'-GC), dolazi do ozbiljnog izobličenja spirale DNK zbog skraćene udaljenosti između guanina na suprotnim nitima i citozina koji je izbačen iz heliksa kao posljedica interakcije GG. Slično dušičnim iperitima, cisplatin se često koristi u liječenju hemoterapijom – posebno za rak testisa i jajnika.
* Hloro-etil nitrozo-urea (CENU), posebno karmustin (BCNU), su agensi za umrežavanje koji se široko koriste u hemoterapiji, posebno za tumore mozga. Ovi agensi razlikuju se od drugih umreživača jer alkiliraju *O6* guanin da bi formirali *O6*-etanoguanin. Ovaj intermedijarni spoj zatim dovodi do umrežavanja između baznog para GC. Ovi agensi za umrežavanje dovode samo do malih izobličenja spirale DNK zbog manje veličine molekula.
* Psoraleni su prirodni spojevi  (furokumarini) u biljkama. Ovi spojevi  interkaliraju u DNK na mestima 5'-AT sekvence i formiraju timidinske adukte kada se aktiviraju u prisustvu ultraljubičastih-A (UV-A) zraka. Ovi kovalentni adukti nastaju povezivanjem 3, 4 (piron) ili 4', 5’ (furan) ruba psoralena sa 5, 6 dvostrukom vezom timina. Psoraleni mogu formirati dva tipa monoadukta i jedan dijadukt (međulančano umrežavanje) sa timinom. Ovi adukti rezultiraju lokalnim distorzijama DNK na mjestu interkalacije. Psoraleni se koriste u liječenju kožnih bolesti, kao što su psorijaza i vitiligo.
* Mitomicin C (MMC) je iz klase antibiotika koji se široko koriste u hemoterapiji, često kod karcinoma povezanih sa gastrointestinalnim traktom. Mitomicin C može djelovati samo kao umreživač kada je DNK nukleotid imao redukciju na svom kinonskom prstenu. Kada su dva dG-a preuređena i metilirana na ovaj način, 5'-GC međulančano umrežavanje može se formirati sa egzo aminima svake nukleobaze. Mitomicin također ima sposobnost da formira monoadukte i međulančane poprečne veze sa DNK. Međulančana umrežavanja mitomicina C formiraju se u manjem žlijebu DNK, izazivajući umjereno širenje ili istezanje do spirale DNK kako bi se prilagodio prisustvu molekula unutar dva lanca.

### Endogeni agensi
* Dušična kiselina se formira kao nusprodukt u želucu iz prehrambenih izvora nitrita i može dovesti do umreženih lezija u DNK, konverzijom amino grupa u DNK u karbonile. Ovaj tip lezije najčešće se javlja između dva gvanozina, pri čemu jedan od četiri deaminirana gvanozina dovodi do međulančanog umrežavanja. On indukuje formiranje međulančanih DNK ukrštenih veza na aminogrupi egzocikličkog N2 guanina na 5'-CG sekvencama. Ova lezija blago iskrivljuje dvostruku spiralu.
* Bifunkcionalni aldehidi su reaktivne hemikalije koje se formiraju endogeno putem peroksidacija lipida i biosinteze prostoglandina. Oni stvaraju eteno adukte formirane od aldehida koji se podvrgavaju preuređenju kako bi formirali umrežavanje na suprotnim lancima DNK. Malondialdehid je prototipski primjer koji može umrežiti DNK preko dvije egzociklične guaninske amino grupe. Otali aldehidi, kao što su formaldehid i acetilaldehidi, mogu uvesti međulančano umrežavanje  i često djeluju kao egzogeni agensi jer se nalaze u mnogim prerađenim namirnicama. Često pronađeni u pesticidima, duhanskom dimu i automobilskim izduvnim plinovima, α,β nezasićeni aldehidi, kao što su akrolein i krotonaldehid, su dodatni egzogeni agensi koji mogu izazvati umrežavanje DNK. Za razliku od drugih agenasa za umrežavanje, umrežavanje izazvano aldehidom je suštinski reverzibilan proces. NMR struktura ovih tipova agenasa kao međulančanih poprečnih veza pokazuje da 5'-GC adukt rezultira manjim izobličenjem DNK, međutim 5'-CG adukt destabilizira spiralu i izaziva savijanje i uvijanje u DNK.
* Umrežene lezije DNK mogu se formirati i u uslovima oksidativnog stresa, u kojem slobodni radikali kisika stvaraju reaktivne intermedijere u DNK, a ove lezije su uključene u starenje i rak. Tandemske lezije DNK formiraju se na značajnoj frekvenciji ionizirajućim zračenjem i reakcijama H2O2 kataliziranim metalom. U anoksijskim uslovima, dominantna lezija dvostruke baze je tip u kojoj je C8 guanin vezan za 5-metilnu grupu susjednog 3'-timina (G[8,5-Me]T), formirajući unutarlančane lezije.

#### Zbirna tabela agenasa za umrežavanje 
## Popravak umrežene  DNK
Umrežena DNK se popravlja u ćelijama kombinacijom enzima i drugih faktora iz puta nukleotidnog ekscizijskog popravka (NER), homolognom rekombinacijom i puta baznoekscijskog popravka (BER). Za popravak međulančanih umreženih veza kod eukariota, endonukleaza od 3' preklopa iz NER-a, XPF-ERCC1, regrutuje se u umreženu DNK, gdje pomaže u 'otkačivanju' DNK, cijepanjem 3' lanca na mjestu umrežavanja. 5' lanac se zatim cijepa, bilo pomoću XPF-ERCC1 ili druge endonukleaze, formirajući dvolančani prekid (DSB), koji se zatim može popraviti pomoću puta  homologne rekombinacije.

Umređena DNK općenito uzrokuju gubitak informacija o preklapanju sekvenci iz dva lanca DNK. Stoga, tačna popravka oštećenja ovisi o preuzimanju izgubljene informacije iz neoštećenog homolognog hromosoma u istoj ćeliji. Preuzimanje se može dogoditi uparivanjem sa sestrinskom hromatidom proizvedenom tokom prethodnog kruga replikacije. U diploidnoj ćeliji  umrežavanje se takođe može desiti uparivanjem sa nesestrinskim homolognim hromosomom, što se dešava posebno tokom mejoze. Kada dođe do uparivanja, umrežavanje se može ukloniti i ispravne informacije uvesti u oštećeni hromosom, homolognom rekombinacijom.

Raskid veze između šećera dezoksiriboze u šećerno-fosfatnoj kičmi DNK i povezane nukleobaza ostavlja abazno mjesto u dvolančanoj DNK. Ova abazna mjesta se često stvaraju kao međuproizvodi, a zatim se obnavljaju u baznoj ekscizijskoj popravci. Međutim, ako se ovim mjestima dopusti da opstanu, mogu inhibirati replikaciju i transkripciju DNK. Abazna mjesta mogu reagovati sa aminskim grupama na proteinima da bi formirali umrežavanje DNK-protein ili sa egzocikličkim aminima drugih nukleobaza da bi formirale međulančane umrežene veze. Kako bi spriječili međulančane ili umrežavanje DNK-protein, enzimi iz BER puta čvrsto vezuju abazno mjesto i izdvajaju ga iz obližnjih reaktivnih grupa, kao što je pokazano u ljudskoj alkiladenin DNK glikozilazi (AAG) i *E. coli* 3-metiladenin DNK glikozilazi II (AlkA). *In vitro* dokazi pokazali su da međulančano umrežavanje inducirano nebaznim mjestom (DOB-ICL) predstavljaju lezije koje blokiraju replikaciju i vrlo pogrešno kodiraju. U poređenju sa nekoliko drugih ispitanih TLS pol-a, pol η će vjerovatno doprinijeti TLS-posredovanoj popravci DOB-ICL *in vivo*. Korištenjem O6-2'-deoksigvanozin-butilen-O6-2'-deoksiguanozin (O6-dG-C4-O6-dG) lezija DNK koja je hemijski stabilna struktura, istraživana je aktivnost premošćavanja nekoliko DNK polimeraza i rezultati su pokazali da pol η ima najveću aktivnost premošćavanja; međutim, 70% bajpas proizvoda je bilo mutageno i sadrži zamjene ili delecije. Povećanje veličine nepovezanih popravnih intermedijera podiže učestalost delecijskih mutacija.

Tretiranje *E. coli* sa psoralenom-plus-UV svjetlom (PUVA) stvara međulančano umredžavanje DNK. Cole et al. i Sinden & Cole predstavili su dokaz da homolognorekombinacijski proces popravke koji zahtijeva proizvode gena *uvrA*, *uvrB* i *recA* može ukloniti ova umrežavanja u *E. coli*. Čini se da je ovaj proces prilično efikasan. Iako su jedno ili dva  nepopravljena umrećavanja dovoljna da inaktiviraju ćeliju, bakterijska ćelija divljeg tipa može se popraviti i stoga oporaviti od 53 do 71 psoralenskih umrežavanja. Eukariotske ćelije kvasca su također inaktivirane jednom preostalom umreženom vezom, ali ćelije kvasca divljeg tipa mogu se oporaviti od 120 do 200 umrežavanja.

## Aplikacije
### Umrežavanje DNK i proteina
#### Biohemijski metodi interakcije
Umrežavanje DNK-protein može biti uzrokovano raznim hemijskim i fizičkim agensima, uključujući prijelazne metale, ionizirajuće zračenje i endogene aldehide, pored hemoterapeutskih agenasa.
eDNK umrežavanju, DNK-protein umrežavanju su lezije u ćelijama koje se često oštećuju UV zračenjem. Utjecaj UV zraka može dovesti do reaktivnih interakcija i uzrokovati umrežavanje DNK i proteina koji su u kontaktu s njom. Ove umrežavajuće veze su veoma glomazne i složene lezije. One se prvenstveno javljaju u područjima hromosoma koji prolaze kroz replikaciju DNK i ometaju ćelijske procese.

Napredak u metodima identifikacije strukture je napredovao, a dodatak sposobnosti mjerenja interakcija između DNK i proteina je zahtjev za potpuno razumijevanje biohemijskih procesa. Struktura kompleksa DNK-protein može se mapirati pomoću fotoumrežavanja, što je fotoindukovano formiranje kovalentne veze između dva makromolekula ili između dva različita dijela jedne makromolekule. Metodologija uključuje kovalentno povezivanje DNK-vezujućeg motiva DNK-vezujućeg proteina specifičnog za ciljnu sekvencu sa agensom za umrežavanje koji se može fotoaktivirati i koji je sposoban da reaguje sa nukleotidima DNK kada je izložen UV zračenju. Ovaj metoda daje informacije o interakciji između DNK i proteina u unakrsnoj vezi umrežavanja.

#### Klinički tretmani
Putevi popravka DNK mogu dovesti do stvaranja tumorskih ćelija. Kancerski  tretmani su dizajnirani pomoću agenasa za umrežavanje DNK za interakciju sa dušičnim bazama DNK kako bi se blokirala replikacija DNK. Ovi agensi za umrežavanje imaju sposobnost da djeluju kao terapije sa jednim agensom ciljajući i uništavajući specifične nukleotide u ćelijama raka. Rezultat je zaustavljanje ciklusa i rasta ćelija raka; budući da inhibira specifične puteve popravka DNK, ovaj pristup ima potencijalnu prednost jer ima manje nuspojava.

Kod ljudi, vodeći uzrok smrti od raka u svijetu je rak pluća, uključujući karcinom nemalih a plućnih ćelija (NSCLC) koji čini 85% svih slučajeva raka pluća u Sjedinjenim Državama.  Pacijenti sa NSCLC liječe se često terapeutskim spojevima platine (npr. cisplatin, karboplatin ili oksaliplatin)  koji uzrokuju međulančano umrežavanje DNK. Među osobama sa NSLC-om, niska ekspresija gena raka dojke 1 (*BRCA1)* u primarnom tumoru korelirala je s poboljšanim preživljavanjem nakon hemoterapije koja sadrži platinu.  Ova korelacija implicira da nizak BRCA1 u kanceru, i posljedično nizak nivo popravka DNK, uzrokuje ranjivost raka na liječenje agensima za umrežavanje DNK. Visok BRCA1 može zaštititi ćelije raka djelujući u homolognorekombinacijskom putu popravka koji uklanja oštećenja u DNK unesena lijekovima platine. Nivo ekspresije *BRCA1* potencijalno je važan alat za prilagođavanje hemoterapije u liječenju raka pluća.

## Reference
## Vanjski linkovi
*  – *Interaktivna struktura za formiranje cisplatina i DNK adukta*
*  – *Interaktivna struktura za psoralen i umreženu DNK*
* *Psoralen Ultraviolet A Light Treatment*

Kategorija:DNK
Kategorija:Genetičke tehnike