Proteinsko inženjerstvo

**Proteinsko inženjerstvo** je proces razvoja korisnih ili vrijednih proteina kroz dizajn i proizvodnju neprirodnih peptida, često mijenjanjem sekvenci aminokiselina,  koje se nalaze u prirodi. To je relativno mlada disciplina, s mnogo istraživanja u razumijevanju savijanja proteina i prepoznavanju principa dizajna proteina. Koristi se za poboljšanje funkcije mnogih enzima za industrijsku katalizu..

Postoje dvije opšte strategije za inženjerstvo  proteina: racionalni dizajn proteina i usmjerena evolucija. Ove metode se međusobno ne isključuju; istraživači će često primjenjivati obje. U budućnosti, detaljnije poznavanje struktura proteina i funkcije, te napredak u visokopropusnom skriningu, mogu značajno proširiti mogućnosti proteinskog inženjerstva. Na kraju, čak i neprirodne aminokiseline mogu biti uključene, putem novijih metoda, kao što je prošireni genetički kod, koje omogućavaju kodiranje novih aminokiselina u genetičkom kodu.
Primjene u brojnim oblastima, uključujući medicinu i industrijsku bioprocesu, su ogromne i brojne.

## Pristupi
### Racionalni dizajn 
U racionalnom dizajnu proteina, naučnik koristi detaljno znanje o strukturi i funkciji proteina kako bi napravio željene promjene. Općenito, ovo ima prednost što je jeftino i tehnički jednostavno, budući da su metode usmjerene mutageneze dobro razvijene. Međutim, njegov glavni nedostatak je što detaljno strukturno znanje proteina često nije dostupno, a čak i kada je dostupno, može biti vrlo teško predvidjeti efekte različitih mutacija,  jer strukturne informacije najčešće pružaju statičnu sliku strukture proteina. Međutim, programi poput Folding@home i Foldit koristili su tehnike sređivanja kako bi dobili uvid u motive savijanja proteina.
 
Algoritmi za računarski dizajn proteina algoritmi nastoje identificirati nove aminokiselinske sekvence koje imaju nisku energiju kada se savijaju u unaprijed određenu ciljnu strukturu. Iako je prostor konformacije sekvence koji treba pretražiti velik, najizazovniji zahtjev za računarski dizajn proteina je brza, ali tačna energetska funkcija koja može razlikovati optimalne sekvence od sličnih suboptimalnih.

### Višestruko poravnanje sekvenci
Bez strukturnih informacija o proteinu, analiza sekvenci je često korisna u razjašnjavanju informacija o proteinu. Ove tehnike uključuju poravnanje ciljnih proteinskih sekvenci s drugim srodnim proteinskim sekvencama. Ovo poravnanje može pokazati koje su aminokiseline očuvane između vrsta i važne su za funkciju proteina. Ove analize mogu pomoći u identifikaciji aminokiselinskih vrućih tačaka koje mogu poslužiti kao ciljna mjesta za mutacije. Višestruko poravnanje sekvenci koristi baze podataka kao što su PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE i BALIBASE kako bi unakrsno povezao ciljne proteinske sekvence s poznatim sekvencama. Tehnike višestrukog poravnavanja sekvenci navedene su u nastavku.
Ova metoda započinje izvođenjem parnog poravnanja sekvenci korištenjem metoda k-torka ili Needleman-Wunschovog algoritma. Ove metode izračunavaju matricu koja prikazuje parnu sličnost među parovima sekvenci. Rezultati sličnosti se zatim transformiraju u rezultate udaljenosti koji se koriste za izradu vodičkog stabla korištenjem metode spajanja susjeda. Ovo vodičko stablo se zatim koristi za postizanje višestrukog poravnanja sekvenci.

#### Multivalentni proteini 
Multivalentne proteine je relativno lako proizvesti posttranslacijskim modifikacijama ili umnožavanjem sekvence DNK koja kodira protein. Glavna prednost multivalentnih i multispecifičnih proteina je ta što mogu povećati efektivni afinitet za metu poznatog proteina. U slučaju nehomogenog cilja, korištenje kombinacije proteina, što rezultira multispecifičnim vezivanjem, može povećati specifičnost, što ima visoku primjenjivost u proteinskoj terapiji.
Najčešći primjer multivalentnog vezivanja su antitijela, a postoje opsežna istraživanja za bispecifična antitijela. Primjena bispecifičnih antitijela pokriva širok spektar koji uključuje dijagnozu, snimanje, profilaksu i terapiju.

### Usmjerena evolucija 
U usmjerenoj evoluciji, slučajna mutageneza, npr. putem PCR-a sklonog greškama ili mutageneze zasićenja sekvence, primjenjuje se na protein, a režim selekcije se koristi za odabir varijanti koje imaju željene osobine. Zatim se primjenjuju daljnji krugovi mutacije i selekcije. Ova metoda oponaša prirodnu evoluciju i, općenito, daje superiorne rezultate u odnosu na racionalni dizajn. Dodatni proces, nazvan miješanje DNK, miješa i spaja dijelove uspješnih varijanti kako bi se dobili bolji rezultati. Takvi procesi oponašaju rekombinaciju koja se prirodno javlja tokom seksualne reprodukcije. Prednosti usmjerene evolucije su u tome što ne zahtijeva prethodno strukturno znanje proteina, niti je potrebno predvidjeti kakav će učinak imati određena mutacija. Zaista, rezultati eksperimenata usmjerene evolucije često su iznenađujući po tome što su željene promjene često uzrokovane mutacijama za koje se nije očekivalo da će imati neki učinak. Nedostatak je što zahtijevaju visokopropusni skrining, što nije izvodljivo za sve proteine. Velike količine rekombinantne DNK moraju se mutirati, a produkti se moraju pregledati na željene osobine. Veliki broj varijanti često zahtijeva skupu robotsku opremu za automatizaciju procesa. Nadalje, ne mogu se sve željene aktivnosti lako pregledati.

Prirodna Darvinovska evolucija može se efikasno imitirati u laboratoriji kako bi se prilagodila svojstva proteina za različite primjene, uključujući katalizu. Postoje mnoge eksperimentalne tehnologije za proizvodnju velikih i raznolikih proteinskih biblioteka i za skrining ili odabir presavijenih, funkcionalnih varijanti. Presavijeni proteini se iznenađujuće često javljaju u prostoru slučajnih sekvenci, pojava koja se može iskoristiti u evoluciji selektivnih veziva i katalizatora. Iako je konzervativniji od direktne selekcije iz dubokog prostora sekvenci, redizajn postojećih proteina slučajnom mutagenezom i selekcijom/skriningom je posebno robusna metoda za optimizaciju ili promjenu postojećih svojstava. Također predstavlja odličnu početnu tačku za postizanje ambicioznijih inženjerstvenih ciljeva. Spajanje eksperimentalne evolucije s modernim računarskim metodama vjerovatno je najšira i najplodnija strategija za generiranje funkcionalnih makromolekula nepoznatih u prirodi.Glavni izazovi dizajniranja visokokvalitetnih biblioteka mutanata pokazali su značajan napredak u skorije vrijeme. Ovaj napredak se ogleda u boljem opisu efekata mutacijskog opterećenja na osobine proteina. Također, računarski pristupi su pokazali veliki napredak u bezbrojno velikom prostoru sekvenci ka upravljivijim veličinama za izbor, stvarajući tako pametne biblioteke mutanata. Veličina biblioteke je također smanjena na veličine koje se mogu probiriti identifikacijom ključnih korisnih ostataka korištenjem algoritama za sistematsku rekombinaciju. Konačno, značajan korak naprijed ka efikasnom reinženjerstvu enzima napravljen je razvojem preciznijih statističkih modela i algoritama koji kvantificiraju i predviđaju spregnute mutacijske efekte na funkcije proteina.

Općenito, usmjerena evolucija može se sažeti kao iterativni proces u dva koraka koji uključuje generiranje biblioteka proteinskih mutanata i procese skrininga visokog protoka kako bi se odabrale varijante s poboljšanim osobinama. Ova tehnika ne zahtijeva prethodno poznavanje odnosa strukture i funkcije proteina. Usmerena evolucija koristi slučajnu ili fokusiranu mutagenezu za generiranje biblioteka proteinskih mutanata. Slučajne mutacije mogu se uvesti korištenjem PCR-a sklonog greškama ili mutageneze zasićenja mjesta. Mutanti se također mogu generirati rekombinacijom više homolognih gena. Priroda je evoluirala ograničen broj korisnih sekvenci. Usmerena evolucija omogućava identifikaciju neotkrivenih proteinskih sekvenci koje imaju nove funkcije. Ova sposobnost zavisi od sposobnosti proteina da tolerišu supstitucije aminokiselinskih ostataka bez ugrožavanja savijanja ili stabilnosti.

Napredak u poluracionalnom enzimskom inženjerstvu i de novo dizajnu enzima pruža istraživačima moćne i efikasne nove strategije za manipulaciju biokatalizatorima. Integracija pristupa zasnovanih na sekvencama i strukturi u dizajnu biblioteka pokazala se kao odličan vodič za redizajn enzima. Generalno, trenutne računarske de novo i metode redizajna ne mogu se porediti sa evoluiranim varijantama u katalitičkim performansama. Iako se eksperimentalna optimizacija može proizvesti korištenjem usmjerene evolucije, daljnja poboljšanja u tačnosti predviđanja strukture i veća katalitička sposobnost postići će se poboljšanjima u algoritmima dizajna. Daljnja funkcionalna poboljšanja mogu se uključiti u buduće simulacije integracijom dinamike proteina. ili pretvorili određene spojeve u druge (biotransformacija). Ovi proizvodi su korisni kao hemikalije, farmaceutski proizvodi, gorivo, hrana ili poljoprivredni aditivi.
*Enzimski reaktor* sastoji se od posude koja sadrži reakcijski medij koji se koristi za izvođenje željene konverzije enzimskim putem. Enzimi korišteni u ovom procesu su slobodni u rastvoru.

## Primjeri konstruiranih proteina 
Računarske metode su korištene za dizajniranje proteina s novim naborom, kao što je Top7, and sensors for unnatural molecules. Inženjerstvo fuzijskih proteina rezultirao je rilonaceptom, farmaceutskim proizvodom koji je dobio odobrenje Uprave za hranu i lijekove (FDA) za liječenje sindroma povezanog sa periodilnim kriopirinom.
Druga računarska metoda, IPRO, uspješno je konstruirala promjenu specifičnosti kofaktora ksiloza-reduktaze *Candida boidinii*.  Iterativni redizajn i optimizacija proteina (IPRO) redizajnira proteine kako bi povećao ili dao specifičnost izvornim ili novim supstratima i kofaktorima. To se postiže ponovljenim nasumičnim perturbiranjem strukture proteina oko određenih pozicija dizajna, identificiranjem najniže energetske kombinacije rotamera i određivanjem da li novi dizajn ima nižu energiju vezivanja od prethodnih. Iterativni prirod ovog procesa omogućava IPRO-u da napravi aditivne mutacije proteinske sekvence koje kolektivno poboljšavaju specifičnost prema željenim supstratima i/ili kofaktorima. Proteinski kafez, bakterioferitin *E. coli* (EcBfr), koji prirodno pokazuje strukturnu nestabilnost i nepotpuno samoorganizacijsko ponašanje popunjavanjem dva stanja oligomerizacije, je modelni protein u ovoj studiji. Kroz računarsku analizu i poređenje sa njegovim homolozima, utvrđeno je da ovaj protein ima manji od prosjeka dimerni interfejs proteina na svojoj dvostrukoj osi simetrije, uglavnom zbog postojanja međufaznog vodenog džepa centriranog na dva vodom premošćena ostatka asparagina. Da bi se istražila mogućnost inženjerstva EcBfr-a za modificiranu strukturnu stabilnost, koristi se poluempirijska računarska metoda za virtuelno istraživanje energetskih razlika 480 mogućih mutanata na dimernom interfejsu u odnosu na EcBfr divljeg tipa. Ova računarska studija također konvergira na vodom premošćene asparagine. Zamjena ova dva asparagina sa hidrofobnim aminokiselinama rezultira proteinima koji se savijaju u alfa-heliks monomere i sklapaju u kafeze, što je dokazano cirkularnim dihroizmom i transmisijskom elektronskom mikroskopijom. I termička i hemijska denaturacija potvrđuju da svi redizajnirani proteini, u skladu s proračunima, posjeduju povećanu stabilnost. Jedna od tri mutacije pomiče populaciju u korist stanja oligomerizacije višeg reda u rastvoru, što je pokazano i hromatografijom isključivanja po veličini i nativnom gel elektroforezom. razvijena je za redizajn bakterijskog kanalnog proteina (OmpF) kako bi se smanjila veličina njegovih pora od jedan nm na bilo koju željenu dimenziju ispod nm. Eksperimenti transporta na najužim dizajniranim porama otkrili su potpuno odbacivanje soli kada su sastavljeni u biomimetičke blok-polimer matrice.

## Također pogledajte 
** Bakterije
** Fag
** iRNK
** Ribosom
** Kvasci
* Biomolekularno inženjerstvo
* Enzimologija
* Prošireni genetički kod
* Brza paralelna proteoliza (FASTpp)
* Sinteza gena
* Genetičko inženjeratvo
* In situ ciklizacija proteina
* Analozi nukleinskih kiselina
* Dizajn i odabir proteinskog inženjeringa
* Softver za predviđanje strukture proteina
* Proteomika
* Proteom
* SCOPE (proteinsko inženjeratvo)
* Strukturna biologija
* Sintetska biologija

## Reference
## Vanjski linkovi 
* serveri za proteinski inženjering  i srodne teme zasnovane na WHAT IF softveru
* Enzimi izgrađeni od nule – Istraživači konstruišu katalizatore koji nikada prije nisu viđeni koristeći novu računarsku tehniku, *Technology Review*, 10. mart 2008.


Kategorija:Biohemija
Kategorija:Enzimi
Kategorija:Biotehnologija
Kategorija:Primijenjena biologija