হাই-পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি

**হাই-পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি** (**HPLC**), যা আগে **উচ্চ-চাপ তরল ক্রোমাটোগ্রাফি** নামে পরিচিত ছিল, এটি বিশ্লেষণীয় রসায়নের একটি কৌশল যা মিশ্রণের নির্দিষ্ট উপাদানগুলোকে পৃথক করতে, শনাক্ত করতে এবং তাদের পরিমাণ নির্ণয় করতে ব্যবহৃত হয়। এই মিশ্রণগুলো খাদ্য, রাসায়নিক পদার্থ, ফার্মাসিউটিক্যালস, জৈবিক, পরিবেশগত এবং কৃষি ইত্যাদি উৎস থেকে আসতে পারে, যা নিজে একটি তরল অথবা যাকে কোনো তরলে দ্রবীভূত করা হয়েছে।

এটি উচ্চ-চাপের পাম্পের ওপর নির্ভর করে, যা বিভিন্ন দ্রাবকের মিশ্রণ (যাকে **মোবাইল ফেজ** বলা হয়) পুরো সিস্টেমের মধ্য দিয়ে প্রবাহিত করে। এই প্রবাহ পথিমধ্যে নমুনা মিশ্রণটিকে সংগ্রহ করে একটি সিলিন্ডারের ভেতরে নিয়ে যায় যাকে বলা হয় **কলাম**। এই কলামটি কঠিন কণা বা অধিশোষক উপাদান দ্বারা পূর্ণ থাকে যাকে বলা হয় **স্টেশনারি ফেজ**। নমুনার প্রতিটি উপাদান এই অধিশোষক উপাদানের সাথে ভিন্ন ভিন্নভাবে বিক্রিয়া বা মিথস্ক্রিয়া করে যার ফলে প্রতিটি উপাদানের কলাম থেকে বেরিয়ে আসার হার ভিন্ন হয়। এই হারের পার্থক্যের কারণেই উপাদানগুলো পৃথক হয়ে যায় এবং কলাম থেকে বেরিয়ে একটি নির্দিষ্ট **ডিটেক্টরে** (যেমন: ইউভি ডিটেক্টর) প্রবেশ করে। ডিটেক্টর থেকে প্রাপ্ত ফলাফলটি একটি গ্রাফ বা ছক আকারে প্রকাশ পায় যাকে বলা হয় **ক্রোমাটোগ্রাম**।

ক্রোমাটোগ্রাম হলো সময়ের বিপরীতে সংকেতের তীব্রতার একটি গ্রাফিক্যাল উপস্থাপনা, যেখানে বিভিন্ন 'পিক' দেখা যায়। এই পিকগুলো নমুনার ভিন্ন ভিন্ন উপাদানকে নির্দেশ করে। প্রতিটি উপাদান একটি নির্দিষ্ট সময়ে আবির্ভূত হয় যাকে এর **রিটেনশন টাইম** বলা হয় এবং পিকের ক্ষেত্রফল ওই উপাদানের পরিমাণের সমানুপাতিক হয়ে থাকে। এইচপিএলসি (HPLC) বিভিন্ন ক্ষেত্রে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়; যেমন: উৎপাদন শিল্পে (উদাহরণস্বরূপ: ওষুধ ও জৈবজাত পণ্য তৈরির প্রক্রিয়ার সময়), আইনি প্রয়োজনে (যেমন: মূত্রে নিষিদ্ধ বলবর্ধক ওষুধ বা ডোপিং শনাক্তকরণে), গবেষণায় (যেমন: কোনো জটিল জৈবিক নমুনা থেকে উপাদানসমূহ পৃথক করা অথবা পরস্পর সদৃশ সংশ্লেষিত রাসায়নিক পদার্থকে আলাদা করা) এবং চিকিৎসাক্ষেত্রে (যেমন: রক্তে ভিটামিন ডি-এর মাত্রা নির্ণয় করা)।

ক্রোমাটোগ্রাফিকে একটি ভর স্থানান্তর প্রক্রিয়া হিসেবে বর্ণনা করা যেতে পারে যার মধ্যে অধিশোষণ এবং বিভাজন অন্তর্ভুক্ত থাকে। আগেই উল্লেখ করা হয়েছে, এইচপিএলসি (HPLC) পাম্পের ওপর নির্ভর করে যা উচ্চ-চাপের তরল এবং নমুনার মিশ্রণকে অধিশোষক দ্বারা পূর্ণ একটি কলামের মধ্য দিয়ে প্রবাহিত করে এবং এর ফলে নমুনার উপাদানগুলো পৃথক হয়ে যায়। কলামের সক্রিয় অংশ বা অধিশোষকটি সাধারণত দানাদার পদার্থ (যেমন: সিলিকা, পলিমার ইত্যাদি) দ্বারা তৈরি কঠিন কণা, যার আকার ১.৫–৫০ মাইক্রোমিটার (μm) হয়ে থাকে। এই কণাগুলোর সাথে বিভিন্ন রাসায়নিক বিকারক যুক্ত থাকতে পারে। 

অধিশোষক কণাগুলোর সাথে নমুনার উপাদানগুলোর পারস্পরিক মিথস্ক্রিয়ার মাত্রার পার্থক্যের কারণে উপাদানগুলো একে অপর থেকে আলাদা হয়ে যায়। উচ্চ-চাপের তরলটি সাধারণত বিভিন্ন দ্রাবকের মিশ্রণ (যেমন: পানি, বাফার দ্রবণ, অ্যাসিটোনাইট্রাইল অথবা মিথানল) ইত্যাদির এবং একে "মোবাইল ফেজ" বলা হয়। নমুনা এবং অধিশোষকের মধ্যে ঘটে যাওয়া মিথস্ক্রিয়াগুলোকে প্রভাবিত করার মাধ্যমে এর গঠন এবং তাপমাত্রা পৃথকীকরণ প্রক্রিয়ায় গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। এই মিথস্ক্রিয়াগুলো সাধারণত ভৌত প্রকৃতির হয় যেমন: হাইড্রোফোবিক, ডাইপোল-ডাইপোল এবং আয়নিক মিথস্ক্রিয়া। অনেক ক্ষেত্রে এগুলো কয়েকটির সংমিশ্রণে ঘটে থাকে।

## কার্যপ্রণালি

তরল ক্রোমাটোগ্রাফ যন্ত্রটি জটিল এবং এতে অত্যন্ত সূক্ষ্ম ও উন্নত প্রযুক্তি ব্যবহৃত হয়। সিস্টেমটি সঠিকভাবে পরিচালনা করার জন্য যন্ত্রটি কীভাবে ডেটা প্রক্রিয়াকরণ করে সে সম্পর্কে ন্যূনতম ধারণা থাকা প্রয়োজন যাতে ভুল তথ্য বা বিকৃত ফলাফল এড়ানো যায়। এইচপিএলসি (HPLC) প্রথাগত ("নিম্ন চাপ") তরল ক্রোমাটোগ্রাফি থেকে আলাদা কারণ এর কার্যকারিতা চাপ উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি (প্রায় ৫০–১৪০০ বার); সেখানে সাধারণ তরল ক্রোমাটোগ্রাফি সাধারণত কলামের মধ্য দিয়ে মোবাইল ফেজ প্রবাহিত করতে মাধ্যাকর্ষণ শক্তির ওপর নির্ভর করে। অ্যানালিটিক্যাল HPLC-তে নমুনার পরিমাণ খুব কম হওয়ায় কলামের ব্যাস সাধারণত ২.১–৪.৬ মিলিমিটার এবং দৈর্ঘ্য ৩০–২৫০ মিলিমিটার হয়। এছাড়াও HPLC কলামে অনেক ক্ষুদ্রাকৃতির অধিশোষক কণা (গড় আকার ১.৫–৫০ মাইক্রোমিটার) ব্যবহৃত হয়। এটি মিশ্রণের উপাদানগুলোকে খুব অল্প সময়ে পৃথক করার ক্ষেত্রে উচ্চতর রেজোলিউশন বা রেজলভিং পাওয়ার (যৌগগুলোর মধ্যে পার্থক্য করার ক্ষমতা) প্রদান করে, যা একে একটি অত্যন্ত জনপ্রিয় কৌশলে পরিণত করেছে।

একটি এইচপিএলসি যন্ত্রের নকশায় সাধারণত দ্রাবক আধারের এক বা একাধিক পাম্প, একটি দ্রাবক-ডিগ্যাসার, একটি স্যাম্পলার, একটি কলাম এবং একটি ডিটেক্টর থাকে। পৃথকীকরণের জন্য প্রয়োজন অনুযায়ী দ্রাবকগুলো আগে থেকেই তৈরি করা হয়। এগুলো ডিগ্যাসারের মধ্য দিয়ে যাওয়ার সময় দ্রবীভূত গ্যাস অপসারিত হয় এবং মিশ্রিত হয়ে মোবাইল ফেজে পরিণত হয়। এরপর এটি স্যাম্পলারের মধ্য দিয়ে যাওয়ার সময় নমুনার মিশ্রণটিকে সংগ্রহ করে কলামে নিয়ে যায়।

পাম্পগুলো কলামের ভেতরে থাকা স্টেশনারি ফেজের মধ্য দিয়ে মোবাইল ফেজের কাঙ্ক্ষিত প্রবাহ এবং গঠন বজায় রাখে এবং সরাসরি ডিটেক্টরের ভেতরে থাকা ফ্লো-সেলে পৌঁছে দেয়। ডিটেক্টর কলাম থেকে বেরিয়ে আসা নমুনায় উপাদানের পরিমাণের সমানুপাতিক একটি সংকেত তৈরি করে যেটি উপাদানগুলোর পরিমাণগত বিশ্লেষণের সুযোগ দেয়। ডিটেক্টরটি উপাদানটির বেরিয়ে আসার সময় বা 'রিটেনশন টাইম' চিহ্নিত করে, যা প্রাথমিক শনাক্তকরণে সাহায্য করে।

আরও উন্নত ডিটেক্টরগুলো অ্যানালাইটের বৈশিষ্ট্য অনুযায়ী অতিরিক্ত তথ্য প্রদান করে, যেমন অতিবেগুনী-দৃশ্যমান বর্ণালীবীক্ষণ স্পেকট্রাম বা মাস স্পেকট্রাম, এগুলো উপাদানের গঠনগত বৈশিষ্ট্য সম্পর্কে ধারণা দেয়। সাধারণত অতিবেগুনী-দৃশ্যমান বর্ণালীবীক্ষণ, ফটোডায়োড অ্যারে বা ডায়োড অ্যারে ডিটেক্টর এবং মাস স্পেকট্রোমেট্রি ডিটেক্টর বহুল ব্যবহৃত হয়।

একটি ডিজিটাল মাইক্রোপ্রসেসর এবং ইউজার সফটওয়্যার এইচপিএলসি যন্ত্রটিকে নিয়ন্ত্রণ করে এবং তথ্য বিশ্লেষণ করে তা প্রদান করে। এইচপিএলসি যন্ত্রের কিছু মেকানিক্যাল পাম্পের মডেলে বিভিন্ন অনুপাতে একাধিক দ্রাবক মিশ্রিত করার সুবিধা থাকে যা সময়ের সাথে পরিবর্তিত হতে পারে। ফলে এটি মোবাইল ফেজে একটি কম্পোজিশন গ্রেডিয়েন্ট তৈরি করে। আধুনিক এইচপিএলসি যন্ত্রগুলোতে কলাম ওভেন থাকে যা পৃথকীকরণ প্রক্রিয়ার তাপমাত্রা সামঞ্জস্য করতে সাহায্য করে। বিশ্লেষণ করার জন্য নমুনার মিশ্রণটিকে খুব অল্প পরিমাণে (সাধারণত মাইক্রোলিটার) কলামের মধ্য দিয়ে প্রবাহিত করে মোবাইল ফেজের স্রোতে প্রবেশ করানো হয়। 

নমুনার উপাদানগুলো কলামের ভেতর দিয়ে ভিন্ন ভিন্ন গতিতে অগ্রসর হয়, যা স্টেশনারি ফেজের (অধিশোষক) সাথে নির্দিষ্ট ভৌত মিথস্ক্রিয়ার ওপর নির্ভর করে। প্রতিটি উপাদানের গতিবেগ নির্ভর করে তার রাসায়নিক প্রকৃতি, কলামের ভেতরের স্টেশনারি ফেজের প্রকৃতি এবং মোবাইল ফেজের উপাদানের ওপর। কোনো নির্দিষ্ট অ্যানালাইট কলাম থেকে বেরিয়ে আসার সময়কে এর রিটেনশন টাইম বলা হয়। নির্দিষ্ট শর্তাধীনে পরিমাপ করা রিটেনশন টাইম একটি প্রদত্ত অ্যানালাইটের শনাক্তকারী বৈশিষ্ট্য হিসেবে কাজ করে।

বাজারে অনেক ধরনের কলাম পাওয়া যায় যা ভিন্ন ভিন্ন কণার আকার, ছিদ্রযুক্ততা এবং পৃষ্ঠতলীয় রসায়নের অধিশোষক দ্বারা পূর্ণ থাকে। ক্ষুদ্রাকার কণার প্যাকিং ম্যাটেরিয়াল ব্যবহারের জন্য উচ্চ অপারেশনাল প্রেশার (*ব্যাকপ্রেশার*) প্রয়োজন হয় এবং এটি সাধারণত ক্রোমাটোগ্রাফিক রেজোলিউশন উন্নত করে। সোরবেন্ট কণাগুলো প্রকৃতিগতভাবে আয়নিক, হাইড্রোফোবিক বা পোলার হতে পারে।

লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফির সবচেয়ে সাধারণ পদ্ধতি হলো বিপরীত পর্যায় যেখানে ব্যবহৃত মোবাইল ফেজে পানি বা বাফারের সাথে বিভিন্ন জৈব দ্রাবকের (সবচেয়ে সাধারণ হলো অ্যাসিটোনাইট্রাইল এবং মিথানল) যেকোনো মিশ্রণযোগ্য সংমিশ্রণ অন্তর্ভুক্ত থাকে। কিছু এইচপিএলসি (HPLC) কৌশলে পানিমুক্ত মোবাইল ফেজও ব্যবহৃত হয় (নিচে নরমাল-ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফি দেখুন)। মোবাইল ফেজের জলীয় উপাদানে নমুনার উপাদানগুলো পৃথকীকরণে সহায়তা করার জন্য অ্যাসিড (যেমন: ফর্মিক, ফসফরিক বা ট্রাইফ্লুরোঅ্যাসেটিক অ্যাসিড) বা লবণ থাকতে পারে। ক্রোমাটোগ্রাফিক বিশ্লেষণের সময় মোবাইল ফেজের গঠন স্থির রাখা হতে পারে (*আইসোক্র্যাটিক এলুশন মোড*) অথবা পরিবর্তন করা হতে পারে (*গ্রেডিয়েন্ট এলুশন মোড*)।

সাধারণ মিশ্রণ পৃথক করার ক্ষেত্রে আইসোক্র্যাটিক এলুশন সাধারণত কার্যকর। তবে জটিল মিশ্রণের জন্য, যেখানে স্টেশনারি এবং মোবাইল ফেজের সাথে উপাদানের মিথস্ক্রিয়া ভিন্ন ভিন্ন হয়, সেখানে গ্রেডিয়েন্ট এলুশন প্রয়োজন। এই কারণেই গ্রেডিয়েন্ট এলুশনে মোবাইল ফেজের গঠন সাধারণত নিম্ন থেকে উচ্চ 'এলুটিং স্ট্রেংথে' পরিবর্তিত হয়। মোবাইল ফেজের এলুটিং স্ট্রেংথ অ্যানালাইটের রিটেনশন টাইম দ্বারা প্রতিফলিত হয়; কারণ উচ্চ এলুটিং স্ট্রেংথ এলুশনকে ত্বরান্বিত করে (যার ফলে রিটেনশন টাইম কমে যায়)। উদাহরণস্বরূপ, রিভার্সড ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফিতে একটি সাধারণ গ্রেডিয়েন্ট প্রোফাইল ৫% অ্যাসিটোনাইট্রাইল (পানি বা জলীয় বাফারে) দিয়ে শুরু হতে পারে এবং ৫-২৫ মিনিটের মধ্যে রৈখিকভাবে ৯৫% অ্যাসিটোনাইট্রাইল পর্যন্ত পৌঁছাতে পারে।

মোবাইল ফেজের নির্বাচিত গঠন নির্ভর করে বিভিন্ন নমুনা উপাদানের (*অ্যানালাইট*) এবং স্টেশনারি ফেজের মধ্যকার মিথস্ক্রিয়ার তীব্রতার ওপর (যেমন: রিভার্সড ফেজ HPLC-তে হাইড্রোফোবিক মিথস্ক্রিয়া)। স্টেশনারি ফেজ এবং মোবাইল ফেজের প্রতি তাদের আসক্তির ওপর ভিত্তি করে অ্যানালাইটগুলো কলামে পৃথকীকরণ প্রক্রিয়ার সময় দুটির মধ্যে বিভাজিত হয়। এই বিভাজন প্রক্রিয়াটি তরল-তরল নিষ্কাশনের মতোই, তবে এটি ধাপ অনুযায়ী না হয়ে নিরবচ্ছিন্নভাবে ঘটে।পানি/অ্যাসিটোনাইট্রাইল গ্রেডিয়েন্ট ব্যবহারের উদাহরণটিতে, অধিক হাইড্রোফোবিক (জলবিদ্বেষী) উপাদানগুলো কলাম থেকে পরে নির্গত হবে। এরপর যখন মোবাইল ফেজে অ্যাসিটোনাইট্রাইলের পরিমাণ বৃদ্ধি পায় (অর্থাৎ মোবাইল ফেজ যখন উচ্চ এলুটিং ক্ষমতাসম্পন্ন দ্রবণে পরিণত হয়) তখন তাদের নির্গমনের গতি ত্বরান্বিত হয়।

## ইতিহাস এবং উন্নয়ন

এইচপিএলসি (HPLC) আবিষ্কারের আগে বিজ্ঞানীরা বেঞ্চটপ কলাম লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি কৌশল ব্যবহার করতেন। সেই সময়কার লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি সিস্টেমগুলো ছিল মূলত অদক্ষ, কারণ দ্রাবকের প্রবাহের হার সম্পূর্ণভাবে মাধ্যাকর্ষণ শক্তির ওপর নির্ভর করত। ফলে পৃথকীকরণ প্রক্রিয়া সম্পন্ন হতে কয়েক ঘণ্টা বা কখনও কখনও কয়েক দিন পর্যন্ত লেগে যেত। সেই সময় গ্যাস ক্রোমাটোগ্রাফি লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফির চেয়ে অনেক বেশি শক্তিশালী ছিল; তবে এটি স্পষ্ট ছিল যে গ্যাসীয় অবস্থায় অত্যন্ত পোলার এবং উচ্চ আণবিক ওজনের বায়োপলিমারগুলোর পৃথকীকরণ এবং বিশ্লেষণ করা অসম্ভব। জীবন বিজ্ঞান এবং স্বাস্থ্য সংক্রান্ত গবেষণায় ব্যবহৃত অনেক জৈব অণুর ক্ষেত্রে GC কার্যকর ছিল না, কারণ এগুলোর বেশিরভাগই উদ্বায়ী নয় এবং GC-তে ব্যবহৃত উচ্চ তাপমাত্রায় এগুলো তাপীয়ভাবে অস্থিতিশীল। ফলস্বরূপ, বিকল্প পদ্ধতির পরিকল্পনা করা হয় যা খুব শীঘ্রই এইচপিএলসি-র উন্নয়নে ভূমিকা রাখে।

১৯৪১ সালে মার্টিন এবং সিঞ্জের সেমিনাল কাজের ধারাবাহিকতায় ১৯৬০-এর দশকে ক্যালভিন গিডিংস, জোসেফ হুবার এবং অন্যরা ভবিষ্যদ্বাণী করেছিলেন যে, প্যাকিং কণার ব্যাস সাধারণ লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি এবং গ্যাস ক্রোমাটোগ্রাফির চেয়ে ১৫০ মাইক্রোমিটার স্তরের অনেক নিচে কমিয়ে এনে এবং উচ্চ চাপ ব্যবহার করে মোবাইল ফেজের গতিবেগ বৃদ্ধির মাধ্যমে লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফিকে অত্যন্ত দক্ষ মোডে পরিচালনা করা সম্ভব। এই ভবিষ্যদ্বাণীগুলো ষাটের দশক থেকে সত্তরের দশক এবং বর্তমান সময় পর্যন্ত ব্যাপক পরীক্ষা-নিরীক্ষা ও পরিমার্জনের মধ্য দিয়ে গিয়েছে। শুরুর দিকের গবেষণায় এলসি কণাগুলোর উন্নয়ন শুরু হয় যার একটি ঐতিহাসিক উদাহরণ হলো জিপ্যাক্স (একটি সারফিশিয়ালি পোরাস বা উপরিতলে ছিদ্রযুক্ত কণা)।

১৯৭০-এর দশকে হার্ডওয়্যার এবং যন্ত্রপাতির ক্ষেত্রে অনেক উন্নয়ন নিয়ে আসে। গবেষকরা পাম্প এবং ইনজেক্টর ব্যবহার করে একটি প্রাথমিক এইচপিএলসি সিস্টেমের নকশা তৈরি করতে শুরু করেন। যান্ত্রিক সরঞ্জামের উন্নয়ন গুরুত্বপূর্ণ হলেও এইচপিএলসি-র ইতিহাস মূলত কণা প্রযুক্তির ইতিহাস এবং বিবর্তনের সাথে জড়িত। ছিদ্রযুক্ত স্তরের কণা প্রবর্তনের পর থেকে দক্ষতা বৃদ্ধির জন্য কণার আকার ক্রমাগত কমিয়ে আনার একটি ধারাবাহিক প্রবণতা দেখা গেছে। তবে কণার আকার কমানোর ফলে নতুন কিছু সমস্যার সৃষ্টি হয়। এর ব্যবহারিক অসুবিধাগুলো হলো মূলত কলামের মধ্য দিয়ে মোবাইল ফেজের মধ্যে প্রবাহিত করার জন্য প্রয়োজনীয় অতিরিক্ত চাপ এবং অত্যন্ত সূক্ষ্ম উপাদানগুলোর সুষম প্যাকিং তৈরির জটিলতা থেকে উদ্ভূত। প্রতিবার যখন কণার আকার উল্লেখযোগ্যভাবে কমানো হয় তখন সেই উচ্চ চাপ সামাল দেওয়ার জন্য সাধারণত যন্ত্রপাতির আরও এক দফা আধুনিকায়ন বা উন্নয়নের প্রয়োজন পড়ে।

## প্রকারভেদ
### বিভাজন ক্রোমাটোগ্রাফি

বিভাজন ক্রোমাটোগ্রাফি রসায়নবিদদের দ্বারা উদ্ভাবিত প্রথম দিকের ক্রোমাটোগ্রাফিগুলোর মধ্যে অন্যতম, যদিও বর্তমানে এটি খুব একটা ব্যবহৃত হয় না। বিভাজন সহগ নীতিটি মূলত কাগজ ক্রোমাটোগ্রাফি, পাতলা স্তর ক্রোমাটোগ্রাফি, গ্যাস ফেজ এবং তরল-তরল পৃথকীকরণ প্রয়োগে ব্যবহৃত হয়। ১৯৫২ সালে রসায়নে নোবেল পুরস্কার অর্জন করেন আর্চার জন পোর্টার মার্টিন এবং রিচার্ড লরেন্স মিলিংটন সিনজ যারা অ্যামিনো অ্যাসিড পৃথকীকরণের জন্য এই কৌশলটি তৈরি করেছিলেন। বিভাজন ক্রোমাটোগ্রাফিতে একটি "নিষ্ক্রিয়" কঠিন ম্যাট্রিক্সের উপরিভাগে বা এর তন্তুগুলোর ভেতরে ধরে রাখা দ্রাবক ব্যবহার করা হয় অথবা স্টেশনারি ফেজের সাথে কুলম্বীয় অথবা হাইড্রোজেন দাতা মিথস্ক্রিয়াকে কাজে লাগানো হয়। এখানে অ্যানালাইটের অণুগুলো একটি তরল স্টেশনারি ফেজ এবং এলুয়েন্টের মধ্যে বিভাজিত হয়।

হাইড্রোফিলিক ইন্টারঅ্যাকশন ক্রোমাটোগ্রাফিের (HILIC, যা এইচপিএলসি-র একটি উপ-কৌশল) মতো এই পদ্ধতিটিও উপাদানগুলোর পোলারিটি বা মেরুত্বের পার্থক্যের ওপর ভিত্তি করে তাদের পৃথক করে। HILIC-তে সাধারণত একটি বন্ডেড পোলার স্টেশনারি ফেজ এবং অ্যাসিটোনাইট্রাইল সমৃদ্ধ মোবাইল ফেজ ব্যবহৃত হয় (যেখানে পানি একটি শক্তিশালী উপাদান হিসেবে কাজ করে)। ঐতিহাসিকভাবে আনবন্ডড সিলিকা বা অ্যালুমিনা সাপোর্টে এই পদ্ধতি ব্যবহার করা হতো। প্রতিটি পদ্ধতিই পোলারিটির পার্থক্যের ভিত্তিতে অ্যানালাইট পৃথক করতে কার্যকর। HILIC বন্ডেড ফেজের সুবিধা হলো এটি একটি একক রানের মাধ্যমেই অম্লীয়, ক্ষারীয় এবং নিরপেক্ষ দ্রবণগুলোকে পৃথক করতে পারে।

পোলার (মেরুবিশিষ্ট) অ্যানালাইটগুলো পোলার স্টেশনারি ফেজের সাথে যুক্ত স্থির পানির স্তরে বিচ্ছুরিত হয় এবং এভাবেই কলামে আটকে থাকে। পোলার অ্যানালাইট এবং পোলার স্টেশনারি ফেজের মধ্যে মিথস্ক্রিয়া যত শক্তিশালী হয় (মোবাইল ফেজের তুলনায়) এলুশন টাইম বা নির্গমন সময় তত দীর্ঘ হয়। এই মিথস্ক্রিয়ার তীব্রতা অ্যানালাইটের আণবিক কাঠামোর অংশ হিসেবে থাকা কার্যকরী মূলকগুলোর ওপর নির্ভর করে যেখানে অধিক পোলারাইজড গ্রুপ (যেমন: হাইড্রোক্সিল-) এবং হাইড্রোজেন বন্ড তৈরিতে সক্ষম গ্রুপগুলো বেশি রিটেনশন বা ধারণক্ষমতা তৈরি করে। কুলম্বীয় (স্থির বৈদ্যুতিক) মিথস্ক্রিয়াও রিটেনশন টাইম বাড়িয়ে দিতে পারে। মোবাইল ফেজে অধিক পোলার দ্রাবক ব্যবহার করলে অ্যানালাইটগুলোর রিটেনশন টাইম কমে যায় এবং সেখানে হাইড্রোফোবিক (জলবিদ্বেষী) দ্রাবকগুলো রিটেনশন টাইম বাড়িয়ে দেওয়ার প্রবণতা রাখে।

### নরমাল-ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফি

নরমাল-ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফি হলো এইচপিএলসি-র প্রথম দিকের ধরণগুলোর মধ্যে একটি তবে গত কয়েক দশকে এর ব্যবহার অনেকটা কমে গেছে। নরমাল-ফেজ এইচপিএলসি (NP-HPLC) নামে পরিচিত এই পদ্ধতিতে সিলিকার মতো একটি পোলার স্টেশনারি সারফেসের প্রতি অ্যানালাইটের আসক্তির ওপর ভিত্তি করে উপাদানগুলোকে পৃথক করা হয়। এটি মূলত সোরবেন্ট পৃষ্ঠের সাথে অ্যানালাইটের পোলার মিথস্ক্রিয়া (যেমন: হাইড্রোজেন বন্ধন বা ডাইপোল-ডাইপোল মিথস্ক্রিয়া) করার ক্ষমতার ওপর ভিত্তি করে কাজ করে। NP-HPLC-তে একটি অপোলার, পানিমুক্ত মোবাইল ফেজ (যেমন: ক্লোরোফর্ম) ব্যবহৃত হয় এবং এটি অপোলার দ্রাবকে সহজে দ্রবণীয় অ্যানালাইটগুলো পৃথক করতে কার্যকরভাবে কাজ করে। অ্যানালাইটটি পোলার স্টেশনারি ফেজের সাথে যুক্ত হয় এবং কলামে আটকে থাকে। অ্যানালাইটের মেরুত্ব যত বেশি হয় অধিশোষণ ক্ষমতাও তত বাড়ে। এই মিথস্ক্রিয়ার তীব্রতা কেবল অ্যানালাইটের আণবিক কাঠামোর কার্যকরী মূলকের ওপরই নয় বরং স্টেরিক কারণের ওপরও নির্ভর করে। মিথস্ক্রিয়ার তীব্রতার ওপর স্টেরিক বাধার এই প্রভাব পদ্ধতিটিকে গাঠনিক সমানু পৃথক করতে সাহায্য করে।

মোবাইল ফেজে অধিক পোলার দ্রাবক ব্যবহার করলে অ্যানালাইটের রিটেনশন টাইম কমে যায় আর সেখানে হাইড্রোফোবিক (জলবিদ্বেষী) দ্রাবকগুলো ধীর এলুশন বা রিটেনশন টাইম বাড়িয়ে দেয়। মোবাইল ফেজে থাকা পানির সামান্য কণার মতো অত্যন্ত পোলার দ্রাবকগুলো স্টেশনারি ফেজের কঠিন পৃষ্ঠে অধিশোষিত হয়ে একটি স্থির পানির স্তর তৈরি করে যা রিটেনশনে সক্রিয় ভূমিকা পালন করে বলে মনে করা হয়। নরমাল ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফির এই বৈশিষ্ট্যটি কিছুটা স্বতন্ত্র কারণ এটি প্রায় একচেটিয়াভাবে একটি অধিশোষণ প্রক্রিয়া দ্বারা পরিচালিত হয়। অ্যাক্টিভেটেড (শুকনো) সিলিকা বা অ্যালুমিনা সাপোর্টে কলাম এবং পাতলা স্তর ক্রোমাটোগ্রাফি উভয় পদ্ধতিতেই গাঠনিক সমানু পৃথক করার জন্য এখনও অধিশোষণ ক্রোমাটোগ্রাফি ব্যবহৃত হয়।

সিলিকা বা অ্যালুমিনা ক্রোমাটোগ্রাফিক মিডিয়ার পৃষ্ঠে পানি বা প্রোটিক জৈব দ্রাবকের স্তরের উপস্থিতির কারণে রিটেনশন টাইমের নিম্নমানের পুনরুৎপাদনযোগ্যতার ফলে ১৯৭০-এর দশকে বিভাজন এবং NP-HPLC-র জনপ্রিয়তা হ্রাস পায় এবং রিভার্সড-ফেজ HPLC-র বিকাশ ঘটে। মোবাইল ফেজের গঠনের সামান্য পরিবর্তনের (যেমন: আর্দ্রতার মাত্রা) সাথে এই স্তরটি পরিবর্তিত হয় যা রিটেনশন টাইমের বিচ্যুতি বা ড্রিফটিং ঘটায়।
সম্প্রতি বিভাজন ক্রোমাটোগ্রাফি আবার জনপ্রিয় হয়ে উঠেছে। এর কারণ হলো HILIC বন্ডেড ফেজের উদ্ভাবন যা উন্নত পুনরুৎপাদনযোগ্যতা প্রদর্শন করে এবং এই কৌশলের উপযোগিতার পরিধি সম্পর্কে আরও ভালো বোঝাপড়া তৈরি হয়েছে।

### ডিসপ্লেসমেন্ট ক্রোমাটোগ্রাফি
ডিসপ্লেসমেন্ট ক্রোমাটোগ্রাফির ব্যবহার অনেকটা সীমিত এবং এটি মূলত প্রস্তুতিমূলক ক্রোমাটোগ্রাফিতে ব্যবহৃত হয়। এর মূল নীতিটি এমন যে, একটি অণুর ওপর ভিত্তি করে কাজ করে যার ক্রোমাটোগ্রাফি ম্যাট্রিক্সের প্রতি উচ্চ আসক্তি রয়েছে (যাকে 'ডিসপ্লেসার' বলা হয়)। এই ডিসপ্লেসারটি বন্ধন স্থানের জন্য কার্যকরভাবে প্রতিযোগিতা করে এবং কম আসক্তিযুক্ত সমস্ত অণুকে সেখান থেকে সরিয়ে বা প্রতিস্থাপন করে দেয়। ডিসপ্লেসমেন্ট এবং এলুশন ক্রোমাটোগ্রাফির মধ্যে স্পষ্ট পার্থক্য রয়েছে। এলুশন মোডে সাধারণত উপাদানগুলো সরু এবং গাউসিয়ান পিক হিসেবে কলাম থেকে বেরিয়ে আসে। সর্বোচ্চ বিশুদ্ধতা অর্জনের জন্য পিকগুলোর মধ্যে পর্যাপ্ত ব্যবধান (পছন্দমতো বেসলাইন পর্যন্ত) থাকা বাঞ্ছনীয়। এলুশন মোডে মিশ্রণের কোনো উপাদানের কলাম দিয়ে ভ্রমণের গতি অনেকগুলো বিষয়ের ওপর নির্ভর করে।

তবে দুটি পদার্থকে ভিন্ন গতিতে চলার জন্য এবং আলাদা করার জন্য জৈব অণু এবং ক্রোমাটোগ্রাফি ম্যাট্রিক্সের মধ্যকার মিথস্ক্রিয়ায় যথেষ্ট পার্থক্য থাকতে হবে। এই পার্থক্যের প্রভাবকে সর্বোচ্চ করতে অপারেটিং প্যারামিটারগুলো সামঞ্জস্য করা হয়। অনেক ক্ষেত্রে পিকগুলোর বেসলাইন পৃথকীকরণ কেবল গ্রেডিয়েন্ট এলুশন এবং কলামে নমুনার কম লোডিংয়ের মাধ্যমেই অর্জন করা সম্ভব। ফলে এলুশন মোডের দুটি প্রধান অসুবিধা হলো—গ্রেডিয়েন্ট সলভেন্ট পাম্পিংয়ের কারণে অপারেশনাল জটিলতা এবং কম কলাম লোডিংয়ের কারণে স্বল্প উৎপাদন ক্ষমতা। ডিসপ্লেসমেন্ট ক্রোমাটোগ্রাফির সুবিধা হলো এতে উপাদানগুলো "পিক"-এর পরিবর্তে বিশুদ্ধ পদার্থের পর্যায়ক্রমিক জোনে বিভক্ত হয়। যেহেতু এই প্রক্রিয়াটি আইসোথার্মের অরৈখিকতার সুযোগ নেয় তাই একটি নির্দিষ্ট কলামে বড় আকারের নমুনা পৃথক করা সম্ভব এবং উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চ ঘনত্বের বিশুদ্ধ উপাদান পাওয়া যায়।

### বিপরীত-পর্যায় তরল ক্রোমাটোগ্রাফি

রিভার্সড ফেজ এইচপিএলসি  হলো ক্রোমাটোগ্রাফির সবচেয়ে বিস্তৃত পদ্ধতি। এতে একটি অপোলার স্টেশনারি ফেজ এবং একটি জলীয়, মাঝারি পোলার মোবাইল ফেজ থাকে। রিভার্সড ফেজ পদ্ধতিতে কোনো পদার্থ যত বেশি হাইড্রোফোবিক (জলবিদ্বেষী), সেটি সিস্টেমে তত বেশি সময় ধরে আটকে থাকে। জৈব পদার্থ ধরে রাখার জন্য কলামের ভেতরে প্যাক করা স্টেশনারি ফেজগুলো মূলত বিভিন্ন আকৃতির (প্রধানত গোলাকার) এবং ভিন্ন ভিন্ন ব্যাসের (১.৫, ২, ৩, ৫, ৭, ১০ মাইক্রোমিটার) ছিদ্রযুক্ত সিলিকা জেল কণা দ্বারা গঠিত।

এই কণাগুলোর ছিদ্রের ব্যাসও ভিন্ন হয় (৬০, ১০০, ১৫০, ৩০০ অ্যাংস্ট্রম) এবং এদের পৃষ্ঠতলে বিভিন্ন হাইড্রোকার্বন লিগ্যান্ড যেমন C3, C4, C8, C18 রাসায়নিকভাবে যুক্ত থাকে। যখন চরম pH মাত্রার দ্রবণের প্রয়োজন হয় তখন স্টেশনারি ফেজ হিসেবে পলিমারিক হাইড্রোফোবিক কণা বা জৈব পদার্থের সাথে পলিমারাইজড হাইব্রিড সিলিকাও ব্যবহৃত হয়। স্টেশনারি ফেজে হাইড্রোকার্বন লিগ্যান্ড যত দীর্ঘ হয়, নমুনার উপাদানগুলো তত বেশি সময় ধরে কলামে আটকে থাকতে পারে। বর্তমানে বায়োমেডিক্যাল উপকরণ পৃথকীকরণের বেশিরভাগ পদ্ধতিতে C-18 ধরনের কলাম ব্যবহৃত হয় যাকে কখনও কখনও বাণিজ্যিক নামে ODS (অক্টাডেসিলসিলেন) বা RP-18 বলা হয়।

সবচেয়ে সাধারণ রিভার্সড-ফেজ স্টেশনারি ফেজগুলো সিলিকা সাপোর্টের ওপর ভিত্তি করে তৈরি করা হয়, যার পৃষ্ঠতল RMe2SiCl দ্বারা বন্ডিংয়ের মাধ্যমে পরিবর্তিত করা হয়। এখানে 'R' হলো একটি সরল শিকল অ্যালকাইল গ্রুপ যেমন C18H37 বা C8H17। এই ধরনের স্টেশনারি ফেজে লিপোফিলিক (চর্বি-দ্রবণীয় বা তেল-প্রেমী) অণুগুলোর রিটেনশন টাইম দীর্ঘ হয় যেখানে পোলার (মেরুবিশিষ্ট) অণুগুলো আরও সহজে এবং দ্রুত এলুশন সম্পন্ন করে (বিশ্লেষণের শুরুর দিকে বেরিয়ে আসে)। একজন ক্রোমাটোগ্রাফার মোবাইল ফেজে আরও পানি যোগ করে রিটেনশন টাইম বাড়িয়ে দিতে পারেন যার ফলে হাইড্রোফোবিক স্টেশনারি ফেজের সাথে হাইড্রোফোবিক অ্যানালাইটের মিথস্ক্রিয়া তুলনামূলকভাবে শক্তিশালী হয়।

একইভাবে, মোবাইল ফেজে আরও জৈব দ্রাবক যোগ করে রিটেনশন টাইম কমানো সম্ভব। জীববিজ্ঞানী এবং লাইফ সায়েন্স ব্যবহারকারীদের মধ্যে RP-HPLC এতই জনপ্রিয় যে, এটি অনেক সময় ভুলবশত কোনো বিশদ বিবরণ ছাড়াই কেবল "HPLC" নামে অভিহিত করা হয়। ওষুধ শিল্পেও বাজারজাত করার আগে ওষুধের গুণগত মান যাচাই করতে নিয়মিত RP-HPLC ব্যবহার করা হয়। রিভার্সড ফেজ এইচপিএলসি হাইড্রোফোবিক মিথস্ক্রিয়ার মূলনীতির ওপর ভিত্তি করে কাজ করে যা পানির দ্বিপাক্ষিক কাঠামোর উচ্চ প্রতিসাম্য থেকে উদ্ভূত এবং লাইফ সায়েন্সের সমস্ত প্রক্রিয়ায় গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। RP-HPLC এই মিথস্ক্রিয়া বলগুলো পরিমাপ করার সুযোগ দেয়। স্টেশনারি ফেজের লিগ্যান্ডের সাথে অ্যানালাইটের অণুর অপোলার অংশের সংস্পর্শ তলের ক্ষেত্রফল যত বেশি হয় অ্যানালাইটের বন্ধন তত শক্তিশালী হয়। এই সলভোফোবিক প্রভাব মূলত অ্যানালাইট এবং C18-শিকলের চারপাশে পানির "গহ্বর-হ্রাস" করার প্রবণতা দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়।

এই প্রক্রিয়ায় নির্গত শক্তি এলুয়েন্টের পৃষ্ঠটানের সমানুপাতিক (পানি: ৭.৩ J/cm², মিথানল: ২.২ J/cm²) এবং যথাক্রমে অ্যানালাইট ও লিগ্যান্ডের হাইড্রোফোবিক পৃষ্ঠতলের সমানুপাতিক। মোবাইল ফেজে কম পোলার দ্রাবক (মিথানল, অ্যাসিটোনাইট্রাইল) যোগ করে পানির পৃষ্ঠটান কমিয়ে রিটেনশন কমানো যায়। গ্রেডিয়েন্ট এলুশন এই প্রভাবটিকেই কাজে লাগায়। অ্যানালাইট অণুর গাঠনিক বৈশিষ্ট্য এর রিটেনশন বৈশিষ্ট্যে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা রাখে। তাত্ত্বিকভাবে বলা যায়, বৃহত্তর হাইড্রোফোবিক পৃষ্ঠতল (C–H, C–C এবং সাধারণত অপোলার বন্ধন যেমন S-S) যুক্ত অ্যানালাইট দীর্ঘক্ষণ আটকে থাকে। অন্যদিকে উচ্চ পোলার পৃষ্ঠতল সম্পন্ন অণুগুলো (যেমন: -OH, -NH2, COO−) পানির সাথে ভালোভাবে মিশে যায় বলে কম সময় আটকে থাকে। এছাড়া স্টেরিক প্রভাব বা এক্সক্লুশন প্রভাবের কারণে খুব বড় অণুগুলো স্টেশনারি ফেজের ছিদ্রে প্রবেশ করতে পারে না, ফলে রিটেনশন কমে যায়।

আণবিক কাঠামোর শাখা-প্রশাখা থাকলে পৃষ্ঠতলের ক্ষেত্রফল কমে যায় বলে তারা রৈখিক আইসোমারের চেয়ে দ্রুত নির্গত হয়। একইভাবে, একক C–C বন্ধনযুক্ত জৈব যৌগগুলো সাধারণত দ্বিবন্ধন বা ত্রিবন্ধনযুক্ত যৌগের চেয়ে পরে নির্গত হয় কারণ দ্বিবন্ধন বা ত্রিবন্ধন অণুকে একক বন্ধনের তুলনায় বেশি সংকুচিত করে তোলে। আরেকটি গুরুত্বপূর্ণ বিষয় হলো মোবাইল ফেজের পিএইচ (pH), কারণ এটি আয়নিত অ্যানালাইটের হাইড্রোফোবিক অবস্থাকে পরিবর্তন করতে পারে। এজন্য পিএইচ নিয়ন্ত্রণে সোডিয়াম ফসফেটের মতো বাফারিং এজেন্ট ব্যবহৃত হয়। বাফার কেবল পিএইচ নিয়ন্ত্রণই করে না বরং এটি স্টেশনারি ফেজের সিলিকা পৃষ্ঠের চার্জকেও প্রভাবিত করে এবং কখনও কখনও আয়ন পেয়ারিং এজেন্ট হিসেবে কাজ করে। মাস স্পেকট্রোমেট্রিতে শনাক্তকরণ ক্ষমতা বাড়াতে প্রায়ই অ্যামোনিয়াম ফরমেট বা উদ্বায়ী জৈব অ্যাসিড (যেমন অ্যাসিটিক অ্যাসিড বা ফরমেট অ্যাসিড) যোগ করা হয়।

ট্রাইফ্লুরোঅ্যাসেটিক অ্যাসিড পেপটাইড এবং প্রোটিনের মতো জটিল বায়োমেডিক্যাল নমুনার ক্ষেত্রে বহুল ব্যবহৃত হয়। এটি কার্বক্সিলিক অ্যাসিডের মতো উপাদানের রিটেনশন বাড়াতে কার্যকর। তবে মাস স্পেকট্রোমেট্রিতে এটি ডিটেক্টরে অবশিষ্টাংশ রেখে যেতে পারে বলে কম ব্যবহৃত হয়। রিভার্সড ফেজ কলামগুলো সিলিকা কলামের চেয়ে টেকসই হলেও চরম পিএইচ অবস্থায় সিলিকা কণা হাইড্রোলাইসিস হয়ে দ্রবীভূত হতে পারে। তাই ক্ষারীয় মোবাইল ফেজ ব্যবহারের ক্ষেত্রে হাইব্রিড সিলিকা কলাম ব্যবহার করা উচিত। কলাম ব্যবহারের পর অবশিষ্ট অ্যাসিড বা বাফার সরাতে পরিষ্কার দ্রাবক দিয়ে ফ্লাশ করা এবং যথাযথভাবে সংরক্ষণ করা জরুরি। সিলিকা পৃষ্ঠে ধাতব আয়নের উপস্থিতি পরীক্ষা করার জন্য ২,২'- এবং ৪,৪'-বাইপিরিডিন-এর মিশ্রণ ইনজেক্ট করা হয়। যদি পৃষ্ঠে ধাতব আয়ন থাকে, তবে ২,২'-বাইপিরিডিন ধাতুর সাথে চিলেট গঠন করবে ফলে এর পিকের আকৃতি বিকৃত হয়ে যাবে।

### আকার-নির্বাচন ক্রোমাটোগ্রাফি

**আকার-নির্বাচন ক্রোমাটোগ্রাফি** হলো পলিমার অণু এবং বায়োমলিকিউলগুলোকে তাদের আণবিক আকারের পার্থক্য অনুযায়ী আলাদা করে (প্রকৃতপক্ষে একটি কণার স্টোকস ব্যাসার্ধের অনুযায়ী)। এই পৃথকীকরণ প্রক্রিয়াটি কলামের ভেতরে প্যাক করা জেল গোলকগুলোর ছিদ্রে নমুনা অণুগুলোর প্রবেশ করার ক্ষমতার ওপর ভিত্তি করে ঘটে। এটি মূলত অ্যানালাইট অণুর আপেক্ষিক আকার এবং অধিশোষকের ছিদ্রের আকারের ওপর নির্ভর করে। এই প্রক্রিয়াটি প্যাকিং উপাদানের পৃষ্ঠের সাথে নমুনার কোনো প্রকার রাসায়নিক মিথস্ক্রিয়া না থাকার ওপরও নির্ভরশীল।

মোবাইল ফেজে অধিক পোলার দ্রাবক ব্যবহার করলে অ্যানালাইটের রিটেনশন টাইম কমে যায় তাই সেখানে হাইড্রোফোবিক (জলবিদ্বেষী) দ্রাবকগুলো এলুশন ধীরে হয় বা রিটেনশন টাইম বাড়িয়ে দেয়। মোবাইল ফেজে থাকা পানির সামান্য কণার মতো অত্যন্ত পোলার দ্রাবকগুলো স্টেশনারি ফেজের কঠিন পৃষ্ঠে অধিশোষিত হয়ে একটি স্থির পানির স্তর তৈরি করে যা রিটেনশনে সক্রিয় ভূমিকা পালন করে বলে মনে করা হয়। নরমাল ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফির এই বৈশিষ্ট্যটি কিছুটা স্বতন্ত্র কারণ এটি প্রায় একচেটিয়াভাবে একটি অধিশোষণ প্রক্রিয়া দ্বারা পরিচালিত হয় (অর্থাৎ অ্যানালাইটগুলো সোরবেন্ট পৃষ্ঠে যুক্ত লিগ্যান্ডের সলভেশন লেয়ারের পরিবর্তে সরাসরি কঠিন পৃষ্ঠের সাথে মিথস্ক্রিয়া করে)। অ্যাক্টিভেটেড (শুকনো) সিলিকা বা অ্যালুমিনা সাপোর্টে কলাম এবং পাতলা স্তর ক্রোমাটোগ্রাফি উভয় পদ্ধতিতেই গাঠনিক সমানু পৃথক করার জন্য এখনও অধিশোষণ ক্রোমাটোগ্রাফি কিছুটা ব্যবহৃত হয়।

সিলিকা বা অ্যালুমিনা ক্রোমাটোগ্রাফিক মিডিয়ার পৃষ্ঠে পানি বা প্রোটিক জৈব দ্রাবকের স্তরের উপস্থিতির কারণে রিটেনশন টাইমের নিম্নমানের পুনরুৎপাদনযোগ্যতার ফলে ১৯৭০-এর দশকে বিভাজন এবং NP-HPLC-র জনপ্রিয়তা হ্রাস পায় এবং রিভার্সড-ফেজ HPLC-র বিকাশ ঘটে। মোবাইল ফেজের গঠনের সামান্য পরিবর্তনের (যেমন: আর্দ্রতার মাত্রা) সাথে এই স্তরটি পরিবর্তিত হয় যা রিটেনশন টাইমের বিচ্যুতি বা ড্রিফটিং ঘটায়। সম্প্রতি, বিভাজন ক্রোমাটোগ্রাফি আবার জনপ্রিয় হয়ে উঠেছে যার কারণ হলো HILIC বন্ডেড ফেজের উদ্ভাবন যা উন্নত পুনরুৎপাদনযোগ্যতা প্রদর্শন করে এবং এই কৌশলের উপযোগিতার পরিধি সম্পর্কে আরও ভালো বোঝাপড়া তৈরি হয়েছে।

### আয়ন-বিনিময় ক্রোমাটোগ্রাফি

**আয়ন-বিনিময় ক্রোমাটোগ্রাফি** (**IEC**) বা **আয়ন ক্রোমাটোগ্রাফি** (**IC**) হলো পরিবেশগত এবং শিল্প উৎস (যেমন: ধাতু শিল্প, শিল্প বর্জ্য পানি, জৈবিক সিস্টেম, ফার্মাসিউটিক্যাল নমুনা, খাদ্য ইত্যাদি) থেকে প্রাপ্ত জলীয় নমুনায় আয়নিক দ্রবণ পৃথকীকরণ এবং নির্ধারণের একটি বিশ্লেষণমূলক কৌশল। এই পদ্ধতিতে রিটেনশন বা অণু আটকে থাকা মূলত দ্রবণীয় আয়ন এবং স্টেশনারি ফেজের সাথে যুক্ত চার্জযুক্ত স্থানগুলোর মধ্যকার আকর্ষণের ওপর ভিত্তি করে ঘটে। কলামের আয়নের মতো একই চার্জযুক্ত দ্রবণীয় আয়নগুলো বিকর্ষিত হয় এবং কোনো প্রকার রিটেনশন ছাড়াই কলাম থেকে বেরিয়ে আসে। অন্যদিকে, কলামের চার্জযুক্ত স্থানের বিপরীত চার্জযুক্ত আয়নগুলো সেখানে আটকে থাকে। কলামে আটকে থাকা এই আয়নগুলোকে মোবাইল ফেজের গঠন পরিবর্তনের মাধ্যমে (যেমন: লবণের ঘনত্ব বৃদ্ধি, পিএইচ পরিবর্তন বা কলামের তাপমাত্রা বৃদ্ধি ইত্যাদি) কলাম থেকে বের বা এলুট করা যায়।

আয়ন এক্সচেঞ্জারের প্রকারভেদের মধ্যে রয়েছে পলিস্টাইরিন রেজিন, সেলুলোজ এবং ডেক্সট্রান আয়ন এক্সচেঞ্জার (জেল) এবং নিয়ন্ত্রিত-ছিদ্রযুক্ত কাঁচ বা ছিদ্রযুক্ত সিলিকা জেল। পলিস্টাইরিন রেজিনগুলো ক্রস-লিঙ্কেজ তৈরির সুযোগ দেয় যা চেইনের স্থায়িত্ব বৃদ্ধি করে। উচ্চতর ক্রস-লিঙ্কেজ রেজিনের নমনীয়তা কমিয়ে দেয় যা ইকুইলিব্রেশন সময় বৃদ্ধি করে এবং শেষ পর্যন্ত সিলেক্টিভিটি বা নির্বাচনের সক্ষমতা উন্নত করে। সেলুলোজ এবং ডেক্সট্রান আয়ন এক্সচেঞ্জারগুলোতে ছিদ্রের আকার বৃহত্তর এবং চার্জের ঘনত্ব কম থাকে যা এদের প্রোটিন পৃথকীকরণের জন্য উপযুক্ত করে তোলে।

সাধারণভাবে, আয়ন বিনিময়কারীগুলো উচ্চ চার্জ এবং ক্ষুদ্র ব্যাসার্ধের আয়নগুলোর বন্ধন বা বাইন্ডিংকে বেশি প্রাধান্য দেয়। কাউন্টার আয়নের ঘনত্ব বৃদ্ধি হলে (রেজিনের ফাংশনাল গ্রুপের সাপেক্ষে) রিটেনশন টাইম কমিয়ে দেয় কারণ এটি দ্রবণীয় আয়নের সাথে একটি তীব্র প্রতিযোগিতার সৃষ্টি করে। পিএইচ (pH) হ্রাস করা হলে ক্যাটায়ন এক্সচেঞ্জে রিটেনশন টাইম কমে যায় অন্যদিকে পিএইচ বৃদ্ধি করা হলে অ্যানায়ন এক্সচেঞ্জে রিটেনশন টাইম হ্রাস পায়। উদাহরণস্বরূপ বলা যায় যে, একটি ক্যাটায়ন এক্সচেঞ্জ কলামে দ্রাবকের পিএইচ কমিয়ে দিলে অধিক পরিমাণে হাইড্রোজেন আয়ন পাওয়া যায় যা অ্যানায়নিক স্টেশনারি ফেজে স্থান পাওয়ার জন্য প্রতিযোগিতা করে এবং এর ফলে দুর্বলভাবে আটকে থাকা ক্যাটায়নগুলোকে কলাম থেকে বের বা এলুট করে দেয়।

ক্রোমাটোগ্রাফির এই পদ্ধতিটি নিম্নোক্ত ক্ষেত্রগুলোতে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়: পানি বিশুদ্ধকরণ, অতি সামান্য পরিমাণ উপাদানের প্রাক-ঘনীভবন, লিগ্যান্ড-বিনিময় ক্রোমাটোগ্রাফি, প্রোটিনের আয়ন-বিনিময় ক্রোমাটোগ্রাফি, কার্বোহাইড্রেট এবং অলিগোস্যাকারাইডের উচ্চ-পিএইচ (অ্যানায়ন-বিনিময় ক্রোমাটোগ্রাফি) এবং আরও অনেক ক্ষেত্রে।

### বায়োঅ্যাফিনিটি ক্রোমাটোগ্রাফি

উচ্চ-দক্ষতাসম্পন্ন অ্যাফিনিটি ক্রোমাটোগ্রাফি (HPAC) একটি নমুনায় থাকা দ্রবণকে এমন একটি কলামের মধ্য দিয়ে প্রবাহিত করে যার স্টেশনারি ফেজ বা স্থির দশায় একটি গতিহীন জৈবিকভাবে সক্রিয় লিগ্যান্ড থাকে। এই লিগ্যান্ডটি মূলত এমন একটি সাবস্ট্রেট যার নমুনায় থাকা লক্ষ্যবস্তু অণুর প্রতি একটি সুনির্দিষ্ট বাইন্ডিং অ্যাফিনিটি বা বন্ধন আসক্তি রয়েছে। লক্ষ্যবস্তু অণুটি লিগ্যান্ডের সাথে আটকে যায় আর নমুনার অন্যান্য অণুগুলো কোনো প্রকার রিটেনশন ছাড়াই কলামের মধ্য দিয়ে বেরিয়ে যায়। পরবর্তীতে একটি উপযুক্ত এলুশন বাফার ব্যবহার করে লক্ষ্যবস্তু অণুকে কলাম থেকে মুক্ত বা এলুট করা হয়।

এই ক্রোমাটোগ্রাফিক প্রক্রিয়াটি মূলত কলামে যুক্ত সক্রিয় পদার্থগুলোর স্থিতিশীল, সুনির্দিষ্ট এবং উভমুখী কমপ্লেক্স গঠন করার ক্ষমতার ওপর নির্ভর করে। এটি নমুনার নির্দিষ্ট কিছু উপাদানের জৈবিক স্বীকৃতির মাধ্যমে সম্পন্ন হয়। এই কমপ্লেক্সগুলো গঠনের পেছনে সাধারণ আণবিক বলসমূহ যেমন: ভ্যান ডার ওয়ালস মিথস্ক্রিয়া, স্থির বৈদ্যুতিক মিথস্ক্রিয়া, ডাইপোল-ডাইপোল মিথস্ক্রিয়া, হাইড্রোফোবিক মিথস্ক্রিয়া এবং হাইড্রোজেন বন্ধনের অবদান থাকে। পরিপূরক বন্ধন স্থানগুলোতে এই বলগুলোর যুগপৎ এবং সমন্বিত ক্রিয়ার মাধ্যমেই একটি দক্ষ ও জৈব-সুনির্দিষ্ট বন্ধন গঠিত হয়।

### অ্যাকুয়াস নরমাল-ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফি
**অ্যাকুয়াস নরমাল-ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফি** (**ANP**)-কে **হাইড্রোফিলিক ইন্টারঅ্যাকশন লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি** (**HILIC**)-ও বলা হয়। এটি এমন একটি ক্রোমাটোগ্রাফিক কৌশল যা রিভার্সড-ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফি এবং জৈব নরমাল-ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফির মাঝামাঝি মোবাইল ফেজ অঞ্চলকে অন্তর্ভুক্ত করে। হাইড্রোফিলিক (জলপ্রিয়) যৌগগুলোর জন্য অনন্য সিলেক্টিভিটি অর্জনে HILIC ব্যবহৃত হয়। এটি মোবাইল ফেজে "রিভার্সড-ফেজ সলভেন্ট" (অর্থাৎ তুলনামূলকভাবে পোলার এবং মূলত পানিমুক্ত জৈব দ্রাবক) ব্যবহার করে নরমাল-ফেজ এলুশন ক্রম প্রদর্শন করে। অনেক জৈব অণু, বিশেষ করে যেগুলো জৈবিক তরলে পাওয়া যায় সেগুলো ক্ষুদ্র পোলার যৌগ যা রিভার্সড-ফেজ HPLC-তে ভালোভাবে আটকে থাকে না।

এটি পোলার অণু বিশ্লেষণের জন্য HILIC-কে একটি আকর্ষণীয় বিকল্প এবং দরকারী পদ্ধতিতে পরিণত করেছে। উপরন্তু, যেহেতু HILIC-এ নিয়মিতভাবে পোলার জৈব দ্রাবক (যেমন: ACN এবং মিথানল) এর সাথে জলীয় মিশ্রণ ব্যবহৃত হয়, তাই এটি খুব সহজেই মাস স্পেকট্রোমেট্রির সাথে সংযুক্ত করা যায়।

## আইসোক্র্যাটিক এবং গ্রেডিয়েন্ট এলুশন

একটি পৃথকীকরণ প্রক্রিয়া যাতে পুরো পদ্ধতি জুড়ে মোবাইল ফেজের গঠন অপরিবর্তিত থাকে তাকে *আইসোক্র্যাটিক* (যার অর্থ *স্থির গঠন*) বলা হয়। এই শব্দটি সাবো হার্ভাথ উদ্ভাবন করেছিলেন, যিনি HPLC-র অন্যতম পথিকৃৎ ছিলেন। মোবাইল ফেজের গঠন সবসময় স্থির থাকতে হয় না। একটি পৃথকীকরণ প্রক্রিয়া যাতে প্রক্রিয়া চলাকালীন মোবাইল ফেজের গঠন পরিবর্তন করা হয় তাকে *গ্রেডিয়েন্ট এলুশন* বলা হয়।

উদাহরণস্বরূপ বলা যায়, একটি গ্রেডিয়েন্ট ১০% মিথানল এবং পানির মিশ্রণ দিয়ে শুরু হয়ে ২০ মিনিট পর ৯০% মিথানলে শেষ হতে পারে। মোবাইল ফেজের দুটি উপাদানকে সাধারণত "A" এবং "B" ধরা হয়; *A* হলো "দুর্বল" দ্রাবক যা অ্যানালাইটকে খুব ধীরে নির্গত হতে দেয় আর *B* হলো "শক্তিশালী" দ্রাবক যা কলাম থেকে দ্রুত উপাদানগুলোকে বের করে আনে। রিভার্সড-ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফিতে, দ্রাবক *A* সাধারণত পানি বা একটি জলীয় বাফার এবং *B* হলো পানির সাথে মিশ্রণযোগ্য একটি জৈব দ্রাবক যেমন অ্যাসিটোনাইট্রাইল, মিথানল, টেট্রাহাইড্রোফুরান বা আইসোপ্রোপানল থাকে। আইসোক্র্যাটিক এলুশনে, তাত্ত্বিক প্লেট সংখ্যার (N) সমীকরণ অনুযায়ী পিকের প্রস্থ রিটেনশন টাইমের সাথে রৈখিকভাবে বৃদ্ধি পায়। এটি একটি বড় অসুবিধা হতে পারে যখন এমন কোনো নমুনা বিশ্লেষণ করা হয় যাতে রিটেনশন ফ্যাক্টরের বিস্তৃত পরিসর বিশিষ্ট অ্যানালাইট থাকে। একটি দুর্বল মোবাইল ফেজ ব্যবহার করলে রান-টাইম দীর্ঘ হয় এবং এর ফলে ধীরে নির্গত হওয়া পিকগুলো চওড়া হয়ে যায়, যা সংবেদনশীলতা কমিয়ে দেয়।

একটি শক্তিশালী মোবাইল ফেজ রান-টাইম এবং পরবর্তী পিকগুলোর চওড়া হওয়ার সমস্যার উন্নতি ঘটাবে কিন্তু এর ফলে পিকের পৃথকীকরণ হ্রাস পাবে—বিশেষ করে দ্রুত নির্গত হওয়া অ্যানালাইটগুলোর ক্ষেত্রে যারা সম্পূর্ণরূপে আলাদা হওয়ার জন্য পর্যাপ্ত সময় পায় না। গ্রেডিয়েন্ট এলুশনের পরিবর্তনশীল মোবাইল ফেজ গঠনের মাধ্যমে এই সমস্যার সমাধান করা হয়।

শুরুতে দুর্বল মোবাইল ফেজ দিয়ে শুরু করে রান-টাইমের মধ্যে সেটিকে শক্তিশালী করার পর গ্রেডিয়েন্ট এলুশন শেষের দিকে নির্গত হওয়া উপাদানগুলোর রিটেনশন কমিয়ে দেয় যাতে তারা দ্রুত নির্গত হয়। ফলে বেশিরভাগ উপাদানের জন্য তুলনামূলক সংকীর্ণ এবং উঁচু পিক পাওয়া যায় এবং সেই সাথে শুরুর দিকের উপাদানগুলোর পর্যাপ্ত পৃথকীকরণও নিশ্চিত হয়। এটি টেইলড পিকের আকৃতিও উন্নত করে কারণ জৈব এলুয়েন্টের ক্রমবর্ধমান ঘনত্ব পিকের পেছনের অংশকে সামনের দিকে ঠেলে দেয়।

আইসোক্র্যাটিক এলুশনে কলামের মাত্রা (দৈর্ঘ্য এবং অভ্যন্তরীণ ব্যাস) পরিবর্তিত হলেও রিটেনশন ক্রম পরিবর্তিত হয় না অর্থাৎ পিকগুলো একই ক্রমে নির্গত হয়। তবে গ্রেডিয়েন্ট এলুশনে মাত্রা বা প্রবাহের হার পরিবর্তিত হলে এলুশন ক্রম পরিবর্তিত হতে পারে, যদি পরিবর্তনের সাথে সামঞ্জস্য রেখে সেগুলোকে স্কেল ডাউন বা স্কেল আপ করা না হয়।  রিভার্সড-ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফিতে চালিকাশক্তি আসে পানির কাঠামোর উচ্চ বিন্যাস থেকে। মোবাইল ফেজের *জৈব উপাদানের* ভূমিকা হলো এই উচ্চ বিন্যাস কমিয়ে আনা এবং এর মাধ্যমে *জলীয় উপাদানের প্রতিবন্ধকতা শক্তি হ্রাস করা*।

## প্যারামিটারসমূহ
### তাত্ত্বিক
উচ্চ-দক্ষতাসম্পন্ন তরল ক্রোমাটোগ্রাফি বা HPLC-র তত্ত্ব মূলত সাধারণ ক্রোমাটোগ্রাফি তত্ত্বের মতোই। এই তত্ত্বকে ভিত্তি হিসেবে ব্যবহার করে *সিস্টেম-সুইটেবিলিটি* টেস্টগুলো তৈরি করা হয়েছে যা ইউএসপি ফার্মাকোপিয়াতে দেখা যায়।  এগুলো হলো একগুচ্ছ পরিমাণগত মানদণ্ড, যা বিশ্লেষণের যেকোনো ধাপে প্রয়োজনীয় কাজের জন্য HPLC সিস্টেমটির উপযুক্ততা যাচাই করে।

এই সম্পর্কটিকে একটি নরমালাইজড এককহীন ফ্যাক্টর হিসেবেও প্রকাশ করা হয়, যা *রিটেনশন ফ্যাক্টর* বা রিটেনশন প্যারামিটার নামে পরিচিত। এটি মূলত ক্যাপাসিটি রেশিও-র একটি পরীক্ষামূলক পরিমাপ যা পারফরম্যান্স ক্রাইটেরিয়া বা কার্যকারিতার মানদণ্ড চিত্রেও দেখানো হয়েছে। এখানে tR হলো নির্দিষ্ট উপাদানের রিটেনশন টাইম এবং t0 হলো এমন একটি সময় যা কোনো প্রকার রিটেনশন ছাড়াই একটি উপাদান সিস্টেমের মধ্য দিয়ে নির্গত হতে গ্রহণ করে তাই একে ভয়েড টাইম বলা হয়।

ক্রোমাটোগ্রামে প্রতি দুটি পাশাপাশি পিকের রিটেনশন ফ্যাক্টরের k' অনুপাত তাদের মধ্যকার পৃথকীকরণের মাত্রা মূল্যায়নে ব্যবহৃত হয়, যাকে **সিলেক্টিভিটি ফ্যাক্টর** (α) বলা হয়। এটি পারফরম্যান্স ক্রাইটেরিয়া গ্রাফেও প্রদর্শিত হয়েছে। সিস্টেমের দক্ষতার মানদণ্ড হিসেবে প্লেট সংখ্যা N-এর ধারণাটি আইসোক্র্যাটিক অবস্থার জন্য তৈরি করা হয়েছিল অর্থাৎ যেখানে পুরো রান জুড়ে মোবাইল ফেজের গঠন স্থির থাকে। গ্রেডিয়েন্ট অবস্থায় যেখানে ক্রোমাটোগ্রাফিক রান চলাকালীন সময়ের সাথে মোবাইল ফেজ পরিবর্তিত হয়, সেখানে সিস্টেমের দক্ষতার পরিমাপক হিসেবে **''পিক ক্যাপাসিটি'' (P<sub>c</sub>)** প্যারামিটারটি ব্যবহার করা অধিকতর উপযুক্ত।

ক্রোমাটোগ্রাফিতে *পিক ক্যাপাসিটির* সংজ্ঞা হলো: একটি নির্দিষ্ট পূর্বনির্ধারিত রেজোলিউশন ফ্যাক্টরের (সাধারণত ~১) জন্য একটি নির্দিষ্ট রিটেনশন উইন্ডোর মধ্যে যতগুলো পিক পৃথক করা সম্ভব তার সংখ্যা। এটিকে পিকের গড় প্রস্থের সংখ্যায় পরিমাপকৃত রান-টাইম হিসেবেও কল্পনা করা যেতে পারে। এর সমীকরণটি পারফরম্যান্স ক্রাইটেরিয়া চিত্রে দেখানো হয়েছে। এই সমীকরণে tg হলো গ্রেডিয়েন্ট টাইম এবং w(ave) হলো বেস বা পাদদেশে পিকের গড় প্রস্থ।

প্যারামিটারগুলো মূলত ক্রোমাটোগ্রাফির দুটি তত্ত্ব থেকে নেওয়া হয়েছে: প্লেট থিওরি (বা স্তর তত্ত্ব, যা বিভাজন ক্রোমাটোগ্রাফির অংশ) এবং ক্রোমাটোগ্রাফির রেট থিওরি (গতি তত্ত্ব) বা ভ্যান ডেমটার সমীকরণ। যদিও রেট থিওরিকে অধিকতর নির্ভুল তত্ত্ব হিসেবে বিবেচনা করা হয় তবে উভয় তত্ত্বই HPLC ক্রোমাটোগ্রাম বিশ্লেষণের মাধ্যমে বাস্তবে প্রয়োগ করা সম্ভব।

এগুলো কাগজ ক্রোমাটোগ্রাফিতে পৃথকীকরণের ক্ষেত্রে রিটেনশন ফ্যাক্টর গণনার অনুরূপ তবে এগুলো বর্ণনা করে যে HPLC কতটা দক্ষতার সাথে একটি মিশ্রণকে দুই বা ততোধিক উপাদানে বিভক্ত করে এবং এগুলো ক্রোমাটোগ্রামে পিক (ব্যান্ড) হিসেবে শনাক্ত করা হয়। HPLC-র প্যারামিটারগুলো হলো: দক্ষতা ফ্যাক্টর (*N*), রিটেনশন ফ্যাক্টর (kappa prime) এবং সেপারেশন বা পৃথকীকরণ ফ্যাক্টর। এই ফ্যাক্টরগুলো একত্রে একটি রেজোলিউশন সমীকরণের চলক হিসেবে কাজ করে যা বর্ণনা করে যে দুটি উপাদানের পিক একে অপরের থেকে কতটা ভালোভাবে পৃথক হয়েছে বা কতটা ওভারল্যাপ (একটির ওপর আরেকটি উঠে যাওয়া) করেছে। এই প্যারামিটারগুলো মূলত HPLC রিভার্সড-ফেজ এবং HPLC নরমাল-ফেজ পৃথকীকরণের বর্ণনায় ব্যবহৃত হয় কারণ এই পদ্ধতিগুলো অন্যান্য HPLC মোডের (যেমন: আয়ন বিনিময় এবং সাইজ এক্সক্লুশন) তুলনায় অনেক বেশি সূক্ষ্ম হয়ে থাকে।

ভয়েড ভলিউম হলো একটি কলামের অভ্যন্তরে দ্রাবক বা সলভেন্ট দ্বারা দখলকৃত স্থানের পরিমাণ। এটি কলামের ভেতরের সেই খালি জায়গা যা কলামের প্যাকিং উপাদানের বাইরে থাকে। ক্রোমাটোগ্রামে শনাক্ত হওয়া প্রথম উপাদানের পিকটি থেকে ভয়েড ভলিউম পরিমাপ করা হয় যা সাধারণত নমুনার মিশ্রণে উপস্থিত দ্রাবক হয়ে থাকে; আদর্শভাবে নমুনার দ্রাবকটি কলামের উপাদানের সাথে কোনো প্রকার মিথস্ক্রিয়া ছাড়াই কলামের মধ্য দিয়ে প্রবাহিত হয়, তবে এটি HPLC সলভেন্ট থেকে আলাদা হিসেবে শনাক্ত করা সম্ভব। ভয়েড ভলিউমকে একটি সংশোধনী ফ্যাক্টর হিসেবে ব্যবহার করা হয়।

দক্ষতা ফ্যাক্টর (*N*) ব্যবহারিকভাবে পরিমাপ করে যে ক্রোমাটোগ্রামে উপাদানের পিকগুলো কতটা তীক্ষ্ণ। এটি উপাদানের পিকের ক্ষেত্রফল বা অবস্থান ("রিটেনশন টাইম") এবং পিকের পাদদেশের সবচেয়ে প্রশস্ত বিন্দুর প্রস্থের অনুপাত হিসেবে কাজ করে। যে পিকগুলো লম্বা, তীক্ষ্ণ এবং তুলনামূলকভাবে সরু সেগুলো নির্দেশ করে যে পৃথকীকরণ পদ্ধতিটি মিশ্রণ থেকে একটি উপাদানকে অত্যন্ত দক্ষতার সাথে আলাদা করেছে; একে উচ্চ দক্ষতা বলা হয়। দক্ষতা মূলত HPLC কলাম এবং ব্যবহৃত HPLC মেথডের ওপর ব্যাপকভাবে নির্ভরশীল। দক্ষতা ফ্যাক্টর শব্দটি *প্লেট নম্বর* এবং *তাত্ত্বিক প্লেট সংখ্যার* সমার্থক।

রিটেনশন ফ্যাক্টর (*kappa prime*) পরিমাপ করে যে মিশ্রণের একটি উপাদান কলামের সাথে কতক্ষণ আটকে ছিল এবং এটি ক্রোমাটোগ্রামে পিকের বক্ররেখার নিচের ক্ষেত্রফল দ্বারা পরিমাপ করা হয় (যেহেতু HPLC ক্রোমাটোগ্রাম সময়ের একটি ফাংশন)। ক্রোমাটোগ্রামের প্রতিটি পিকের নিজস্ব রিটেনশন ফ্যাক্টর থাকে (যেমন: প্রথম পিকের রিটেনশন ফ্যাক্টরের জন্য *kappa*1)। কলামের ভয়েড ভলিউম ব্যবহার করে এই ফ্যাক্টরটিকে সংশোধন করা যেতে পারে।

সেপারেশন ফ্যাক্টর (*alpha*) হলো মিশ্রণের দুটি নিকটবর্তী উপাদান কত ভালোভাবে পৃথক হয়েছে তার একটি আপেক্ষিক তুলনা (অর্থাৎ ক্রোমাটোগ্রামের দুটি পাশাপাশি ব্যান্ড)। এই ফ্যাক্টরটি ক্রোমাটোগ্রামের এক জোড়া নিকটবর্তী পিকের রিটেনশন ফ্যাক্টরের অনুপাত দ্বারা সংজ্ঞায়িত করা হয় এবং এটি কলামের ভয়েড ভলিউম দ্বারা সংশোধন করা যেতে পারে। সেপারেশন ফ্যাক্টরের মান ১.০-এর চেয়ে যত বেশি হবে পৃথকীকরণ তত উন্নত হবে; তবে এই মান ২.০ ছাড়িয়ে গেলে সেই পৃথকীকরণের জন্য সম্ভবত HPLC পদ্ধতির আর প্রয়োজন পড়ে না। রেজোলিউশন সমীকরণগুলো এই তিনটি ফ্যাক্টরকে (N, k, alpha) এমনভাবে সম্পর্কিত করে যাতে উচ্চ দক্ষতা এবং সেপারেশন ফ্যাক্টর একটি HPLC বিশ্লেষণে উপাদানের পিকগুলোর রেজোলিউশন বা পৃথকীকরণের মান উন্নত করে।

### অভ্যন্তরীণ ব্যাস

একটি HPLC কলামের অভ্যন্তরীণ ব্যাস (ID) একটি অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ প্যারামিটার। সলিউট ব্যান্ডের পার্শ্বীয় ব্যাপন হ্রাস পাওয়ার কারণে কলামের ব্যাস কমালে তা ডিটেকশন রেসপন্স বা শনাক্তকরণ প্রতিক্রিয়ার ওপর প্রভাব ফেলতে পারে। আইসোক্র্যাটিক এবং গ্রেডিয়েন্ট উভয় মোডেই যদি প্রবাহের হার এবং ইনজেকশন ভলিউম কলামের ছোট বা বড় ব্যাসের সাথে আনুপাতিকভাবে পরিবর্তন করা না হয় তবে এটি পৃথকীকরণের সিলেক্টিভিটি বা নির্বাচকতাকেও প্রভাবিত করতে পারে। কলামে কতটা অ্যানালাইট লোড করা যাবে তা এর ব্যাস দ্বারা নির্ধারিত হয়। বড় ব্যাসের কলামগুলো সাধারণত প্রিপারেটিভ কাজে দেখা যায়, যেমন পরবর্তীতে ব্যবহারের জন্য কোনো ওষুধজাত পণ্য বিশুদ্ধকরণ।

সাম্প্রতিক আল্ট্রা-হাই পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফিতে (UHPLC) কম অভ্যন্তরীণ ব্যাসের কলামগুলো উন্নত সংবেদনশীলতা এবং কম দ্রাবক খরচ নিশ্চিত করে।

বৃহত্তর অভ্যন্তরীণ ব্যাসের (১০&nbsp;মিমি-এর বেশি) কলামগুলো তাদের উচ্চ লোডিং ক্ষমতার কারণে ব্যবহারযোগ্য পরিমাণে উপাদান বিশুদ্ধ করার কাজে ব্যবহৃত হয়। অ্যানালিটিক্যাল স্কেল কলাম (৪.৬&nbsp;মিমি) এই পর্যন্ত সবচেয়ে প্রচলিত কলাম হিসেবে ব্যবহৃত হয়ে আসছে, যদিও বর্তমানে চিকন বা সংকীর্ণ কলামগুলোর জনপ্রিয়তা দ্রুত বাড়ছে। এগুলো নমুনার প্রথাগত পরিমাণগত বিশ্লেষণে ব্যবহৃত হয় এবং প্রায়শই এতে একটি UV-Vis অ্যাবজর্বেন্স ডিটেক্টর ব্যবহার করা হয়।

ন্যারো-বোর কলাম (১–২&nbsp;মিমি) এমন ক্ষেত্রে ব্যবহৃত হয় যেখানে বিশেষ UV-Vis ডিটেক্টর, ফ্লুরোসেন্স ডিটেকশন বা অন্যান্য ডিটেকশন পদ্ধতি যেমন লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-মাস স্পেকট্রোমেট্রিের মাধ্যমে অধিকতর সংবেদনশীলতা প্রয়োজন হয়। কৈশিক কলাম বা ক্যাপিলারি কলাম (০.৩&nbsp;মিমি-এর নিচে) প্রায় একচেটিয়াভাবে ভর বর্ণালীবীক্ষণের মতো বিকল্প ডিটেকশন পদ্ধতিতে ব্যবহৃত হয়। এগুলো সাধারণত স্টেইনলেস স্টিল টিউবিংয়ের পরিবর্তে ফিউজড সিলিকা ক্যাপিলারি দিয়ে তৈরি করা হয় যা বড় কলামগুলোর ক্ষেত্রে ব্যবহৃত হয় না।

### কণার আকার
অধিকাংশ প্রথাগত HPLC সম্পন্ন করা হয় ছোট গোলাকার সিলিকা কণার (খুব ছোট বিড বা দানা) বাইরের দিকে যুক্ত থাকা স্টেশনারি ফেজের মাধ্যমে। এই কণাগুলো বিভিন্ন আকারের হয়ে থাকে যার মধ্যে ৫&nbsp;μm আকারের দানাগুলো সবচেয়ে প্রচলিত। ছোট কণাগুলো সাধারণত অধিক পৃষ্ঠতল এবং উন্নত পৃথকীকরণ নিশ্চিত করে তবে সর্বোত্তম রৈখিক গতিবেগ বজায় রাখার জন্য প্রয়োজনীয় চাপের পরিমাণ কণার ব্যাসের বর্গের ব্যস্তানুপাতিক হারে বৃদ্ধি পায়।

কলামের গতিবেগ, দক্ষতা এবং ব্যাকপ্রেসার সংক্রান্ত সমীকরণসমূহ অনুযায়ী, কলামের আকার অপরিবর্তিত রেখে যদি কণার ব্যাস অর্ধেক করা হয়, তবে কলামের গতিবেগ এবং দক্ষতা দ্বিগুণ হবে; কিন্তু ব্যাকপ্রেসার চার গুণ বৃদ্ধি পাবে। এছাড়া ক্ষুদ্র কণা বিশিষ্ট HPLC পিকের বিস্তৃতি হ্রাস করতে পারে। অপেক্ষাকৃত বড় কণাগুলো প্রিপারেটিভ HPLC (কলামের ব্যাস ৫ সেমি থেকে >৩০ সেমি পর্যন্ত) এবং যেগুলো HPLC না সেগুলো প্রয়োগে যেমন সলিড-ফেজ এক্সট্রাকশনে ব্যবহৃত হয়।

### ছিদ্রের আকার
অধিক পৃষ্ঠতল প্রদানের জন্য অনেক স্টেশনারি ফেজ ছিদ্রযুক্ত বা সচ্ছিদ্র হয়ে থাকে। ক্ষুদ্র ছিদ্রগুলো বেশি পৃষ্ঠতল নিশ্চিত করে অন্যদিকে বড় ছিদ্রের আকার উন্নত গতিবিদ্যা প্রদান করে— বিশেষ করে বড় আকারের অ্যানালাইটের ক্ষেত্রে। উদাহরণস্বরূপ বলা যায়, একটি প্রোটিন যা কোনো ছিদ্রের তুলনায় সামান্য ছোট সেটি ছিদ্রের ভেতরে প্রবেশ করতে পারে ঠিকই কিন্তু একবার ভেতরে ঢুকে গেলে সহজে বের হতে পারে না।

### পাম্পের চাপ
পাম্পগুলোর চাপের ক্ষমতা ভিন্ন ভিন্ন হতে পারে তবে তাদের কার্যকারিতা পরিমাপ করা হয় একটি সামঞ্জস্যপূর্ণ এবং পুনরুৎপাদনযোগ্য আয়তনিক প্রবাহ হার প্রদানের ক্ষমতার ওপর ভিত্তি করে। চাপ ৬০&nbsp;MPa (৬০০০&nbsp;lbf/in<sup>2</sup>) বা প্রায় ৬০০ বায়ুমণ্ডলীয় চাপ পর্যন্ত পৌঁছাতে পারে। আধুনিক HPLC সিস্টেমগুলোকে অনেক উচ্চ চাপে কাজ করার উপযোগী করে উন্নত করা হয়েছে যার ফলে কলামে অনেক ক্ষুদ্র আকারের কণা (<২&nbsp;μm) ব্যবহার করা সম্ভব হচ্ছে। এই *আল্ট্রা হাই পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি* সিস্টেম বা UHPLC-সমূহ (যা আল্ট্রা হাই প্রেসার ক্রোমাটোগ্রাফি সিস্টেম নামেও পরিচিত) প্রায় ১২০০ বায়ুমণ্ডলীয় চাপ পর্যন্ত কাজ করতে পারে।  *UPLC* 
শব্দটি ওয়াটার্স কর্পোরেশনের একটি ট্রেডমার্ক তবে এটি কখনও কখনও সাধারণ UHPLC প্রযুক্তি বোঝাতেও ব্যবহৃত হয়।

### নির্ণায়ক
HPLC নির্ণায়কগুলো মূলত দুটি প্রধান ভাগে ভাগ করা যায়: সর্বজনীন ও নির্বাচনমূলক। সর্বজনীন নির্ণায়কগুলো সাধারণত মোবাইল ফেজ এবং সলিউটসহ মোবাইল ফেজের মধ্যকার ভৌত বৈশিষ্ট্যের পার্থক্য পরিমাপের মাধ্যমে একটি বাল্ক প্রপার্টি বা সামগ্রিক বৈশিষ্ট্য (যেমন: প্রতিসরাঙ্ক) পরিমাপ করে। অন্যদিকে নির্বাচনমূলক নির্ণায়কগুলো সলিউটের ভৌত বা রাসায়নিক বৈশিষ্ট্যের ওপর ভিত্তি করে শুধুমাত্র সলিউটের বৈশিষ্ট্য (যেমন: অতিবেগুনী-দৃশ্যমান বর্ণালীবীক্ষণ) পরিমাপ করে।

HPLC-তে সবচেয়ে বেশি বর্ণালীবীক্ষণ যন্ত্র ব্যবহৃত হয়; তবে আরও বিস্তৃত পরিসরের অন্যান্য ক্রোমাটোগ্রাফি ডিটেক্টর ব্যবহার করা সম্ভব। UV-Vis অ্যাবজর্বেন্স নির্ণয়কের পরিপূরক হিসেবে একটি সর্বজনীন নির্ণায়ক হলো চার্জড অ্যারোসল ডিটেক্টর। সাধারণত ব্যবহৃত ডিটেক্টরগুলোর মধ্যে রিফ্র্যাক্টিভ ইনডেক্স  ডিটেক্টর অন্যতম যা ফ্লো সেলের মধ্য দিয়ে প্রবাহিত এলুয়েন্টের প্রতিসরাঙ্কের পরিবর্তন পরিমাপের মাধ্যমে তথ্য প্রদান করে। নির্দিষ্ট কিছু ক্ষেত্রে একাধিক ডিটেক্টর ব্যবহার করা সম্ভব; যেমন তরল ক্রোমাটোগ্রাফি-ভর বর্ণালীবীক্ষণে সাধারণত UV-Vis-এর সাথে একটি মাস স্পেকট্রোমিটার যুক্ত থাকে।

যখন ইলেকট্রোকেমিক্যাল নির্ণায়কের সাথে ব্যবহার করা হয় তখন HPLC-ECD পদ্ধতিটি স্নায়ু-রাসায়নিক বিশ্লেষণ গবেষণায় বিশেষভাবে নিউরোট্রান্সমিটার শনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়। এর মধ্যে রয়েছে: নরএপিনেফ্রিন, ডোপামিন, সেরোটোনিন, গ্লুটামেট, GABA, অ্যাসিটাইলকোলিন এবং অন্যান্য। HPLC-ECD পদ্ধতিটি ফেমটোমোলার পর্যায় পর্যন্ত অত্যন্ত সূক্ষ্মভাবে নিউরোট্রান্সমিটার শনাক্ত করতে পারে। নিউরোট্রান্সমিটার শনাক্ত করার অন্যান্য পদ্ধতির মধ্যে লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-মাস স্পেকট্রোমেট্রি, ELISA, অথবা রেডিওইমিউনোঅ্যাস অন্তর্ভুক্ত।

### অটোস্যাম্পলার
HPLC অটোস্যাম্পলার ব্যবহারের মাধ্যমে বিপুল সংখ্যক নমুনা স্বয়ংক্রিয়ভাবে একটি HPLC সিস্টেমে ইনজেক্ট বা প্রবেশ করানো যায়। এছাড়া HPLC অটোস্যাম্পলারের ইনজেকশন ভলিউম (নমুনার পরিমাণ) এবং কৌশল প্রতিটি ইনজেকশনের জন্য হুবহু একই থাকে ফলে এগুলো ইনজেকশন ভলিউমের ক্ষেত্রে অত্যন্ত উচ্চমানের নির্ভুলতা নিশ্চিত করে। স্যাম্পলিং-চেম্বারের ভেতরে নমুনা নাড়াচাড়া করার ব্যবস্থা করা সম্ভব, যা নমুনার সমজাতীয়তা বজায় রাখতে সাহায্য করে।

## প্রয়োগসমূহ

### উৎপাদন
গবেষণাগার এবং ক্লিনিক্যাল সায়েন্স—উভয় ক্ষেত্রেই HPLC-এর অনেক প্রয়োগ রয়েছে। ওষুধ তৈরির ক্ষেত্রে এটি একটি অত্যন্ত প্রচলিত পদ্ধতি কারণ এটি পণ্যের বিশুদ্ধতা নিশ্চিত করার একটি নির্ভরযোগ্য উপায়। যদিও HPLC অত্যন্ত উচ্চমানের (বিশুদ্ধ) পণ্য তৈরি করতে সক্ষম তবুও বাল্ক ড্রাগ মেটেরিয়াল বা বিপুল পরিমাণ ওষুধ উৎপাদনের ক্ষেত্রে এটি সব সময় প্রাথমিক পদ্ধতি হিসেবে ব্যবহৃত হয় না। ইউরোপীয় ফার্মাকোপিয়া অনুযায়ী, মাত্র ১৫.৫% সংশ্লেষণ বা সিন্থেসিসে HPLC ব্যবহৃত হয়।

তবে মার্কিন যুক্তরাষ্ট্রের ফার্মাকোপিয়াতে ৪৪% সংশ্লেষণে এটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। এটি সম্ভবত অর্থ এবং সময়ের সীমাবদ্ধতার কারণে হতে পারে কারণ বড় পরিসরে HPLC একটি ব্যয়বহুল প্রযুক্তি। HPLC-এর মাধ্যমে সুনির্দিষ্টতা, যথার্থতা এবং নির্ভুলতা বৃদ্ধি পাওয়ার সাথে সাথে দুর্ভাগ্যবশত এর খরচও বৃদ্ধি পায়।

### আইনি বা ফরেনসিক
বিভিন্ন নমুনায় অবৈধ মাদক শনাক্ত করার জন্যও এই পদ্ধতিটি ব্যবহৃত হয়। মাদক শনাক্তকরণের সবচেয়ে প্রচলিত পদ্ধতি হলো ইমিউনোঅ্যাস। এই পদ্ধতিটি অনেক বেশি সুবিধাজনক। তবে এই সুবিধার বিনিময়ে মাদকদ্রব্যের সুনির্দিষ্টতা এবং বিস্তৃত পরিসরের মাদক শনাক্ত করার ক্ষমতা কিছুটা কমে যায়; তাই বিকল্প পদ্ধতি হিসেবে HPLC-ও ব্যবহৃত হয়ে আসছে। যেহেতু HPLC মূলত বিশুদ্ধতা নির্ধারণের একটি পদ্ধতি তাই মাদকের ঘনত্ব মূল্যায়নে শুধুমাত্র HPLC ব্যবহার করা কিছুটা অপর্যাপ্ত ছিল। এই কারণে এই প্রেক্ষাপটে HPLC প্রায়শই ভর বর্ণালীবীক্ষণের সাথে একত্রে সম্পন্ন করা হয়।

তরল ক্রোমাটোগ্রাফি-ভর বর্ণালীবীক্ষণ ব্যবহারের ফলে গ্যাস ক্রোমাটোগ্রাফি-ভর বর্ণালীবীক্ষণের মতো অ্যাসিটাইলেটিং বা অ্যালকাইলেশন এজেন্টের মাধ্যমে ডেরিভেটাইজেশন করার প্রয়োজন পড়ে না বলে এটি অনেক সময় একটি অতিরিক্ত এবং কষ্টসাধ্য ধাপ হিসেবে বিবেচিত হয়। ডোপিং এজেন্ট, ড্রাগ মেটাবোলাইট, গ্লুকুরোনাইড কনজুগেট, অ্যাম্ফিটামিন, ওপিওড, কোকেন, BZDs, কেটামিন, LSD, ক্যানাবিস এবং কীটনাশকের মতো বিভিন্ন উপাদান শনাক্ত করতে তরল ক্রোমাটোগ্রাফি-ভর বর্ণালীবীক্ষণ ব্যবহৃত হচ্ছে। মাস স্পেকট্রোমেট্রির সাথে HPLC পরিচালনা করলে HPLC পরীক্ষামূলক রানগুলো আদর্শীকরণের পরম প্রয়োজনীয়তা কিছুটা হ্রাস পায়।

### গবেষণা
গবেষণার উদ্দেশ্যেও একই ধরনের পরীক্ষা চালানো যেতে পারে, যেমন ছত্রাকনাশক এবং হাঁপানির ওষুধের মতো সম্ভাব্য ক্লিনিক্যাল ক্যান্ডিডেটগুলোর ঘনত্ব শনাক্ত করা। সংগৃহীত নমুনায় একাধিক উপাদানের উপস্থিতি পর্যবেক্ষণের ক্ষেত্রেও এই প্রযুক্তিটি অত্যন্ত কার্যকর তবে উপাদানের সঠিক পরিচয় নিশ্চিত করার জন্য স্ট্যান্ডার্ড সলিউশন ব্যবহারের প্রয়োজন হয়। সংশ্লেষণ বিক্রিয়ার ফলাফল নিশ্চিত করার পদ্ধতি হিসেবেও এটি ব্যবহৃত হয় কারণ এই ধরনের গবেষণায় উপাদানের বিশুদ্ধতা অপরিহার্য। তবে কোনো নির্দিষ্ট উপাদান বা প্রজাতি শনাক্ত করার ক্ষেত্রে মাস স্পেকট্রোমেট্রি বা ভর বর্ণালীবীক্ষণ এখনও পর্যন্ত অধিকতর নির্ভরযোগ্য পদ্ধতি।

### চিকিৎসা এবং স্বাস্থ্যবিজ্ঞান
HPLC-এর চিকিৎসাকাজে ব্যবহারের ক্ষেত্রে সাধারণত মাস স্পেকট্রোমিটারকে নির্ণায়ক হিসেবে ব্যবহার করা হয়, ফলে এই পদ্ধতিটিকে LC-MS বা MS বলা হয়। LC-MS/MS-এর ক্ষেত্রে দুটি মাস স্পেকট্রোমিটার পর্যায়ক্রমে কাজ করে। যখন একটি HPLC যন্ত্র একাধিক নির্ণায়কের সাথে যুক্ত থাকে তখন তাকে হাইফেনেটেড LC সিস্টেম বলা হয়। ওষুধ শিল্পে প্রয়োগের ক্ষেত্রে HPLC, LC-MS এবং LC-MS/MS-এর সর্বাধিক ব্যবহার দেখা যায়। এর মধ্যে রয়েছে ওষুধের উন্নয়ন এবং ফার্মাকোলজি যা জীবদেহের ওপর ওষুধ ও রাসায়নিকের প্রভাব সংক্রান্ত বিজ্ঞান। এছাড়া পার্সোনালাইজড মেডিসিন, জনস্বাস্থ্য এবং রোগ নির্ণয়েও এটি ব্যবহৃত হয়।

যদিও ওষুধের ঘনত্ব বিশ্লেষণের জন্য মূত্র সবচেয়ে সাধারণ মাধ্যম তবে HPLC-এর মাধ্যমে অধিকাংশ চিকিৎসাগত বিশ্লেষণের জন্য রক্তের সিরাম সংগ্রহ করা হয়। ক্লিনিক্যাল ল্যাবরেটরিতে LC-MS এবং LC-MS/MS-এর অন্যতম গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা হলো বিপাকীয় ব্যাধি শনাক্তকরণের জন্য নবজাতকের স্ক্রিনিং এবং পরবর্তী রোগ নির্ণয়। শিশুদের নমুনাগুলো শুকনো রক্তবিন্দু আকারে আসে এবং এটি তৈরি করা এবং পরিবহন করা সহজ; ফলে এটি স্থানীয় ও বিশ্বজুড়ে নিরাপদ ও সহজলভ্য রোগ নির্ণয় ব্যবস্থা নিশ্চিত করে।

চিকিৎসা গবেষণার জন্য প্রয়োজনীয় অণু শনাক্তকরণের অন্যান্য পদ্ধতিগুলো (যেমন ইমিউনোঅ্যাস) HPLC-এর সাথে তুলনা করে দেখা হয়েছে। এর একটি উদাহরণ হলো: ভিটামিন ডি শনাক্তকরণে কম্পিটিটিভ প্রোটিন বাইন্ডিং অ্যাস (CPBA) এবং HPLC-এর সংবেদনশীলতা তুলনা করা হয়েছিল। শিশুদের ভিটামিন ডি-এর অভাব নির্ণয়ে দেখা গেছে যে, CPBA-এর সংবেদনশীলতা এবং সুনির্দিষ্টতা HPLC-এর ক্ষমতার তুলনায় যথাক্রমে মাত্র ৪০% এবং ৬০% পর্যন্ত পৌঁছাতে পেরেছে। ব্যয়বহুল পদ্ধতি হওয়া সত্ত্বেও HPLC-এর নির্ভুলতা প্রায় অতুলনীয়।

## আরও দেখুন
* ক্রোমাটোগ্রাফির ইতিহাস 
* কৈশিক ইলেকট্রোক্রোমাটোগ্রাফি
* কলাম ক্রোমাটোগ্রাফি 
* সাবা হোরভাথ 
* আয়ন ক্রোমাটোগ্রাফি 
* মাইসেলার লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি

## তথ্যসূত্র

## আরও পড়ুন
* এল. আর. স্নাইডার, জে.জে. কার্কল্যান্ড, এবং জে. ডব্লিউ. ডোলান, Introduction to Modern Liquid Chromatography, জন উইলি অ্যান্ড সন্স, নিউ ইয়র্ক, ২০০৯।
* এম.ডব্লিউ. ডং, Modern HPLC for practicing scientists. উইলি, ২০০৬।
* এল. আর. স্নাইডার, জে.জে. কার্কল্যান্ড, এবং জে. এল. গ্লাইচ, Practical HPLC Method Development, জন উইলি অ্যান্ড সন্স, নিউ ইয়র্ক, ১৯৯৭।
* এস. আহুজা এবং এইচ. টি. রাসমুসেন (সম্পাদক), HPLC Method Development for Pharmaceuticals, একাডেমিক প্রেস, ২০০৭।
* এস. আহুজা এবং এম.ডব্লিউ. ডং (সম্পাদক), Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC, এলসেভিয়ার/একাডেমিক প্রেস, ২০০৫।
* ওয়াই. ভি. কাজাকেভিচ এবং আর. লোব্রুটো (সম্পাদক), HPLC for Pharmaceutical Scientists, উইলি, ২০০৭।
* ইউ. ডি. নিউ, HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice, উইলি-ভিসিএইচ, নিউ ইয়র্ক, ১৯৯৭।
* এম. সি. ম্যাকমাস্টার, HPLC, a practical user's guide, উইলি, ২০০৭।

## বহিঃসংযোগ

* [HPLC ক্রোমাটোগ্রাফির মূলনীতি, প্রয়োগ মৌলিক নোট] -এ।
বিষয়শ্রেণী:ক্রোমাটোগ্রাফি
বিষয়শ্রেণী:হাঙ্গেরীয় উদ্ভাবন
বিষয়শ্রেণী:বৈজ্ঞানিক কৌশল