অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণ

**অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণ** হলো সুনির্দিষ্ট রাসায়নিক গঠনবিশিষ্ট (অনুক্রম) তুলনামূলক ছোট নিউক্লিক অ্যাসিড খণ্ডের রাসায়নিক সংশ্লেষণ প্রক্রিয়া। বর্তমান গবেষণাগারের কাজে এই কৌশলটি অত্যন্ত উপযোগী, কারণ এটি কাঙ্ক্ষিত অনুক্রমের কাস্টম-মেড অলিগোনিউক্লিওটাইড দ্রুত এবং সাশ্রয়ী উপায়ে পাওয়ার সুযোগ করে দেয়। যেখানে এনজাইম কেবল ৫' থেকে ৩' অভিমুখে ডিএনএ এবং আরএনএ সংশ্লেষণ করে, রাসায়নিক অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণের ক্ষেত্রে এমন কোনো সীমাবদ্ধতা নেই; যদিও এটি সাধারণত বিপরীত অর্থাৎ ৩' থেকে ৫' অভিমুখে সম্পন্ন করা হয়। বর্তমানে, এই প্রক্রিয়াটি সুরক্ষিত ২'-ডিঅক্সিনিউক্লিওসাইড (ডিএ, ডিসি, ডিজি, এবং টি), রাইবোনিউক্লিওসাইড (এ, সি, জি, এবং ইউ), অথবা রাসায়নিকভাবে পরিবর্তিত নিউক্লিওসাইড (যেমন এলএনএ বা বিএনএ) থেকে উদ্ভূত ফসফোরামিডাইট পদ্ধতি এবং ফসফোরামিডাইট গাঠনিক একক ব্যবহার করে সলিড-ফেজ সংশ্লেষণ হিসেবে বাস্তবায়িত হয়।

কাঙ্ক্ষিত অলিগোনিউক্লিওটাইড পেতে, গাঠনিক এককগুলোকে অনুক্রমের প্রয়োজন অনুযায়ী ক্রমান্বয়ে ক্রমবর্ধমান অলিগোনিউক্লিওটাইড চেইনের সাথে যুক্ত করা হয় (নিচে সংশ্লেষণ চক্র দেখুন)। ১৯৭০-এর দশকের শেষভাগ থেকে এই প্রক্রিয়াটি সম্পূর্ণ স্বয়ংক্রিয় করা হয়েছে। চেইন অ্যাসেম্বলি শেষ হওয়ার পর, উৎপাদটিকে কঠিন দশা বা (কঠিন অবস্থা) থেকে দ্রবণে মুক্ত করা হয়, ডিপ্রোটেক্ট করা হয় এবং সংগ্রহ করা হয়। পার্শ্ব-প্রতিক্রিয়ার উপস্থিতির কারণে সংশ্লেষিত অলিগোনিউক্লিওটাইডের দৈর্ঘ্যের একটি বাস্তব সীমা (প্রায় ২০০ নিউক্লিওটাইড অবশিষ্টাংশ পর্যন্ত) তৈরি হয়, কারণ সংশ্লেষিত হতে থাকা অলিগোনিউক্লিওটাইডের দৈর্ঘ্যের সাথে ত্রুটির সংখ্যাও বাড়তে থাকে। উচ্চ বিশুদ্ধতাসম্পন্ন অলিগোনিউক্লিওটাইড পেতে প্রায়শই হাই-পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি (এইচপিএলসি) এর মাধ্যমে উৎপাদগুলোকে আলাদা করা হয়। সাধারণত, সংশ্লেষিত অলিগোনিউক্লিওটাইডগুলো হলো একক-তন্তুর ডিএনএ বা আরএনএ অণু যা দৈর্ঘ্যে প্রায় ১৫–২৫টি বেস বিশিষ্ট হয়ে থাকে।

আণবিক জীববিজ্ঞান এবং চিকিৎসাবিজ্ঞানে অলিগোনিউক্লিওটাইডের নানাবিধ প্রয়োগ রয়েছে। এগুলো সবচেয়ে বেশি ব্যবহৃত হয় অ্যান্টিসেন্স অলিগোনিউক্লিওটাইড, স্মল ইন্টারফেয়ারিং আরএনএ, ডিএনএ সিকোয়েন্সিং ও অ্যামপ্লিফিকেশনের জন্য প্রাইমার, আণবিক নিউক্লিক অ্যাসিড হাইব্রিডাইজেশনের মাধ্যমে পরিপূরক ডিএনএ বা আরএনএ শনাক্ত করার জন্য প্রোব, লক্ষ্যযুক্ত মিউটেশন এবং রেস্ট্রিকশন সাইট তৈরির সরঞ্জাম এবং কৃত্রিম জিন সংশ্লেষণের কাজে। অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণের একটি উদীয়মান প্রয়োগ হলো কেবল অনুক্রম থেকে ভাইরাস পুনর্নির্মাণ করা, তা নির্বিষ (যেমন ফাই এক্স ১৭৪) বা বিপজ্জনক (যেমন ১৯১৭ সালের ইনফ্লুয়েঞ্জা ভাইরাস বা সার্স-কোভি-২) উভয়ই হতে পারে।

## ইতিহাস
অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণের বিবর্তনে ইন্টারনিউক্লিওসিডিক লিঙ্কেজ তৈরির চারটি প্রধান পদ্ধতি দেখা গেছে এবং সাহিত্যে এ নিয়ে বিস্তারিত আলোচনা করা হয়েছে।

### প্রাথমিক কাজ এবং সমসাময়িক এইচ-ফসফোনেট সংশ্লেষণ

১৯৫০-এর দশকের শুরুর দিকে, আলেকজান্ডার টড-এর দল অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণের এইচ-ফসফোনেট এবং ফসফেট ট্রাইএস্টার পদ্ধতি উদ্ভাবন করে। যৌগ **১** এবং **২** এর বিক্রিয়ায় এইচ-ফসফোনেট ডাইএস্টার **৩** তৈরি হওয়া একটি দ্রবণে ঘটিত এইচ-ফসফোনেট কাপলিং, যেখানে যৌগ **৪** এবং **৫** থেকে **৬** উৎপন্ন হওয়া একটি ফসফোট্রাইএস্টার কাপলিং (নিচে ফসফোট্রাইএস্টার সংশ্লেষণ দেখুন)।

ত্রিশ বছর পর, এই কাজটি স্বাধীনভাবে দুটি গবেষণা দলকে অনুপ্রাণিত করে যাতে তারা নিউক্লিওসাইড এইচ-ফসফোনেট মনোএস্টার **৭**-কে গাঠনিক একক এবং পিভালোয়িল ক্লোরাইড, ২,৪,৬-ট্রাইআইসোপ্রোপাইলবেনজেনসালফোনিল ক্লোরাইড (টিপিএস-সিএল) ও অন্যান্য যৌগকে অ্যাক্টিভেটর হিসেবে ব্যবহার করে সলিড-ফেজ সংশ্লেষণে এইচ-ফসফোনেট রসায়ন গ্রহণ করতে পারে। এইচ-ফসফোনেট পদ্ধতির ব্যবহারিক প্রয়োগের ফলে একটি অত্যন্ত সংক্ষিপ্ত এবং সহজ সংশ্লেষণ চক্র তৈরি হয় যা মাত্র দুটি ধাপ- ডেট্রাইটাইলেশন এবং কাপলিং নিয়ে গঠিত (পরিকল্পনা ২)। **৮** এর ইন্টারনিউক্লিওসিডিক এইচ-ফসফোনেট ডাইএস্টার লিঙ্কেজগুলোকে জলীয় পিরিডিনে আয়োডিন দ্রবণের মাধ্যমে **৯**-এর ফসফোডাইএস্টার লিঙ্কেজে অক্সিডেশন করা হয়, যা সংশ্লেষণ চক্রের ধাপ হিসেবে না করে চেইন অ্যাসেম্বলির শেষে করা হয়। প্রয়োজন হলে, জারণ প্রক্রিয়াটি অনার্দ্র অবস্থায় সম্পন্ন করা যেতে পারে। বিকল্পভাবে, **৮**-কে ফসফোরোথিওয়েট **১০** বা ফসফোরোসেলেনোয়েট **১১** (X = Se)-এ রূপান্তরিত করা যেতে পারে, অথবা প্রাইমারি বা সেকেন্ডারি অ্যামিনের উপস্থিতিতে কার্বন টেট্রাক্লোরাইড (সিসিএল৪) দ্বারা জারিত করে ফসফোরামিডেট অ্যানালগ **১২** তৈরি করা যায়। এই পদ্ধতিটি খুবই সুবিধাজনক কারণ এর মাধ্যমে একই অলিগোনিউক্লিওটাইডের বৈশিষ্ট্য পরিবর্তনের জন্য বিভিন্ন ধরনের ফসফেট মডিফিকেশন (ফসফেট/ফসফোরোথিওয়েট/ফসফোরামিডেট) যুক্ত করা যায়।

অধিকাংশ ক্ষেত্রে, এইচ-ফসফোনেট গাঠনিক এককগুলো ৫' হাইড্রক্সি গ্রুপে এবং নিউক্লিক বেস এ, সি, ও জি এর অ্যামিনো গ্রুপে ফসফোরামিডাইট গাঠনিক এককের মতোই সুরক্ষিত থাকে (নিচে দেখুন)। তবে অ্যামিনো গ্রুপে সুরক্ষা প্রদান বাধ্যতামূলক নয়।

### ফসফোডাইএস্টার সংশ্লেষণ

১৯৫০-এর দশকে, হরগোবিন্দ খোরানা এবং তার সহকর্মীরা একটি ফসফোডাইএস্টার পদ্ধতি উদ্ভাবন করেন যেখানে ৩'-*ও*-অ্যাসিটাইলনিউক্লিওসাইড-৫'-*ও*-ফসফেট **২** (পরিকল্পনা ৩) কে ''এন'',''এন''-ডাইসাইক্লোহেক্সাইলকার্বোডাইমাইড (ডিসিসি) বা ৪-টলুইনসালফোনিল ক্লোরাইড (টিএস-সিএল) দিয়ে সক্রিয় করা হতো। এই সক্রিয় যৌগগুলোকে ৫'-*ও*-সুরক্ষিত নিউক্লিওসাইড **১**-এর সাথে বিক্রিয়া ঘটিয়ে একটি সুরক্ষিত ডাইনিউক্লিওসাইড মনোফসফেট **৩** তৈরি করা হতো। ক্ষারীয় হাইড্রোলাইসিস ব্যবহার করে ৩'-*ও*-অ্যাসিটাইল গ্রুপ অপসারণ করার পর চেইনটি আরও দীর্ঘ করা হতো। এই পদ্ধতি অনুসরণ করে ট্রাই- এবং টেট্রাডিঅক্সিরাইবোনিউক্লিওটাইডের সেট সংশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং সেগুলোকে এনজাইমের মাধ্যমে দীর্ঘতর অলিগোনিউক্লিওটাইডে রূপান্তরিত করা হয়েছিল, যা জেনেটিক কোড উন্মোচনে সাহায্য করেছিল। ফসফোডাইএস্টার পদ্ধতির প্রধান সীমাবদ্ধতা ছিল পাইরোফসফেট অলিগোমার তৈরি হওয়া এবং ইন্টারনিউক্লিওসিডিক ফসফেটে অলিগোনিউক্লিওটাইডের শাখা তৈরি হওয়া। পদ্ধতিটি আগে বর্ণিত আরও নির্বাচনী রসায়নের তুলনায় পিছিয়ে পড়া মনে হতে পারে; তবে সেই সময়ে বর্তমানে সহজলভ্য অধিকাংশ ফসফেট-প্রতিরক্ষামূলক গ্রুপ উদ্ভাবিত হয়নি। সুবিধাজনক সুরক্ষা কৌশলের অভাবে গবেষণার চূড়ান্ত লক্ষ্য অর্জনে অপেক্ষাকৃত ধীর এবং কম নির্বাচনী রসায়নের সাহায্য নিতে হয়েছিল।

### ফসফোট্রাইএস্টার সংশ্লেষণ

১৯৬০-এর দশকে, আর. লেটসিঙ্গার এবং সি. রিস-এর নেতৃত্বাধীন দলগুলো ফসফোট্রাইএস্টার পদ্ধতি উদ্ভাবন করে। ফসফোডাইএস্টার পদ্ধতির সাথে এর প্রধান পার্থক্য ছিল গাঠনিক একক **১** (পরিকল্পনা ৪) এবং উৎপাদ **৩**-এ ফসফেট অংশকে ২-সায়ানোইথাইল গ্রুপ দিয়ে সুরক্ষিত করা। এটি ইন্টারনিউক্লিওসিডিক ফসফেটে অলিগোনিউক্লিওটাইডের শাখা তৈরি হওয়া রোধ করত। এই পদ্ধতির উচ্চতর নির্বাচনি ক্ষমতার কারণে আরও দক্ষ কাপলিং এজেন্ট এবং প্রভাবক ব্যবহার করা সম্ভব হয়েছিল, যা সংশ্লেষণের সময় নাটকীয়ভাবে কমিয়ে দেয়। প্রাথমিকভাবে সলিউশন-ফেজ সংশ্লেষণের জন্য উদ্ভাবিত এই পদ্ধতিটি পরবর্তীতে লো-ক্রস-লিঙ্কড "পপকর্ন" পলিস্টাইরিনে এবং পরবর্তীতে কন্ট্রোলড পোর গ্লাস (সিপিজি, নিচে "সলিড সাপোর্ট উপাদান" দেখুন) এ প্রয়োগ করা হয়েছিল। এটি অলিগোনিউক্লিওটাইডের সলিড-ফেজ সংশ্লেষণে ব্যাপক গবেষণার সূত্রপাত ঘটায় এবং অবশেষে অলিগোনিউক্লিওটাইড চেইন অ্যাসেম্বলিকে স্বয়ংক্রিয় করে তোলে।

### ফসফাইট ট্রাইএস্টার সংশ্লেষণ
১৯৭০-এর দশকে, নিউক্লিওসাইডের উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি সক্রিয় পি(III) ডেরিভেটিভ, ৩'-*ও*-ক্লোরোফসফাইট, ইন্টারনিউক্লিওসিডিক লিঙ্কেজ তৈরির জন্য সফলভাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।এটি ফসফাইট ট্রাইএস্টার পদ্ধতির আবিষ্কারের পথ প্রশস্ত করে। এম. ক্যারুদার্স এর নেতৃত্বাধীন দলটি অপেক্ষাকৃত কম আক্রমণাত্মক এবং বেশি নির্বাচনী ১*এইচ*-টেট্রাজোলিডোফসফাইটের সুবিধা গ্রহণ করে এবং পদ্ধতিটি সলিড-ফেজে বাস্তবায়ন করে। এর কিছুকাল পরেই, একই দলের কর্মীরা গাঠনিক একক হিসেবে আরও স্থিতিশীল নিউক্লিওসাইড ফসফোরামিডাইট ব্যবহার করে পদ্ধতির আরও উন্নতি ঘটান। ব্যবহারকারী-বান্ধব নয় এমন মিথাইল গ্রুপের পরিবর্তে ২-সায়ানোইথাইল ফসফাইট-প্রতিরক্ষামূলক গ্রুপের ব্যবহার বর্তমানে অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণে ব্যবহৃত নিউক্লিওসাইড ফসফোরামিডাইটের দিকে নিয়ে যায় (নিচে ফসফোরামিডাইট গাঠনিক একক দেখুন)। গাঠনিক একক উৎপাদন, অলিগোনিউক্লিওটাইড সিনথেসাইজার এবং সংশ্লেষণ প্রোটোকলের অনেক পরবর্তী উন্নতি ফসফোরামিডাইট রসায়নকে সংশ্লেষিত অলিগোনিউক্লিওটাইড তৈরির জন্য একটি অত্যন্ত নির্ভরযোগ্য এবং দ্রুত পদ্ধতিতে পরিণত করেছে।

## ফসফোরামিডাইট পদ্ধতিতে সংশ্লেষণ

### গাঠনিক এককসমূহ

#### নিউক্লিওসাইড ফসফোরামিডাইট

উপরে উল্লিখিত হিসাবে, প্রাকৃতিকভাবে পাওয়া নিউক্লিওটাইড (নিউক্লিওসাইড-৩'- বা ৫'-ফসফেট) এবং তাদের ফসফোডাইএস্টার অ্যানালগগুলো উচ্চ ফলনসহ অলিগোনিউক্লিওটাইডের দ্রুত সংশ্লেষণের জন্য যথেষ্ট সক্রিয় নয়। নিউক্লিওসাইডের ৩'-*ও*-(*এন*,*এন*-ডাইআইসোপ্রোপাইল ফসফোরামিডাইট) ডেরিভেটিভ (নিউক্লিওসাইড ফসফোরামিডাইট) ব্যবহারের মাধ্যমে ইন্টারনিউক্লিওসিডিক লিঙ্কেজ তৈরির নির্বাচনি ক্ষমতা এবং গতি নাটকীয়ভাবে উন্নত হয়, যা ফসফাইট ট্রাইএস্টার পদ্ধতিতে গাঠনিক একক হিসেবে কাজ করে। অবাঞ্ছিত পার্শ্ব-প্রতিক্রিয়া রোধ করতে, নিউক্লিওসাইডে উপস্থিত অন্যান্য সমস্ত ফাংশনাল গ্রুপকে সুরক্ষামূলক গ্রুপ যুক্ত করার মাধ্যমে নিষ্ক্রিয় (সুরক্ষিত) করতে হয়। অলিগোনিউক্লিওটাইড চেইন অ্যাসেম্বলি সম্পন্ন হওয়ার পর, কাঙ্ক্ষিত অলিগোনিউক্লিওটাইড পেতে সমস্ত সুরক্ষামূলক গ্রুপ অপসারণ করা হয়। নিচে বর্তমানে বাণিজ্যিকভাবে সহজলভ্য এবং সবচেয়ে সাধারণ নিউক্লিওসাইড ফসফোরামিডাইট গাঠনিক এককগুলোতে ব্যবহৃত সুরক্ষামূলক গ্রুপগুলো সংক্ষেপে পর্যালোচনা করা হলো:
* ৫'-হাইড্রক্সিল গ্রুপটি একটি অ্যাসিড-ল্যাবাইল ডিএমটি (৪,৪'-ডাইমিথোক্সিট্রিটাইল) গ্রুপ দ্বারা সুরক্ষিত থাকে।
* থাইমিন এবং ইউরাসিল, যথাক্রমে থাইমিডিন এবং ইউরিডিনের নিউক্লিক বেসগুলোতে কোনো এক্সোসাইক্লিক অ্যামিনো গ্রুপ থাকে না এবং তাই এগুলোর কোনো সুরক্ষার প্রয়োজন হয় না।
* যদিও গুয়ানোসিন এবং ২'-ডিঅক্সিগুণোসিনের নিউক্লিক বেসে এক্সোসাইক্লিক অ্যামিনো গ্রুপ থাকে, তবে এর ক্ষারীয়তা এতটাই কম যে এটি কাপলিং বিক্রিয়ার শর্তাধীনে ফসফোরামিডাইটের সাথে বিক্রিয়া করে না। তবে, এন২-অসুরক্ষিত ৫'-*ও*-ডিএমটি-২'-ডিঅক্সিগুণোসিন থেকে উদ্ভূত একটি ফসফোরামিডাইট অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণে সাধারণত ব্যবহৃত দ্রাবক অ্যাসিটোনাইট্রাইলে খুব কম দ্রবণীয়। এর বিপরীতে, একই যৌগের এন২-সুরক্ষিত সংস্করণগুলো অ্যাসিটোনাইট্রাইলে ভালো দ্রবীভূত হয় এবং তাই ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়। নিউক্লিক বেস অ্যাডেনিন এবং সাইটোসিনে এক্সোসাইক্লিক অ্যামিনো গ্রুপ থাকে যা কাপলিং বিক্রিয়ার শর্তাধীনে সক্রিয় ফসফোরামিডাইটের সাথে বিক্রিয়াশীল। সংশ্লেষণ চক্রে অতিরিক্ত ধাপ ব্যবহারের মাধ্যমে অথবা বিকল্প কাপলিং এজেন্ট এবং দ্রাবক সিস্টেম ব্যবহারের মাধ্যমে, অসুরক্ষিত অ্যামিনো গ্রুপযুক্ত ডিএ এবং ডিসি ফসফোরামিডাইট ব্যবহার করে অলিগোনিউক্লিওটাইড চেইন অ্যাসেম্বলি করা যেতে পারে। তবে, এই পদ্ধতিগুলো বর্তমানে গবেষণার পর্যায়ে রয়েছে। রুটিন অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণে, সম্পূর্ণ চেইন অ্যাসেম্বলি জুড়ে নিউক্লিওসাইডের এক্সোসাইক্লিক অ্যামিনো গ্রুপগুলোকে স্থায়ীভাবে সুরক্ষিত রাখা হয়।
এক্সোসাইক্লিক অ্যামিনো গ্রুপগুলোর সুরক্ষা অবশ্যই ৫'-হাইড্রক্সি গ্রুপের সুরক্ষার সাপেক্ষে অর্থোগোনাল হতে হবে, কারণ প্রতিটি সংশ্লেষণ চক্রের শেষে ৫'-হাইড্রক্সি গ্রুপের সুরক্ষা অপসারণ করা হয়। সবচেয়ে সহজ এবং বহুল ব্যবহৃত কৌশল হলো এক্সোসাইক্লিক অ্যামিনো গ্রুপগুলোতে একটি ক্ষার-সংবেদনশীল সুরক্ষা গ্রুপ যুক্ত করা। অধিকাংশ ক্ষেত্রে, দুটি সুরক্ষা স্কিম ব্যবহৃত হয়।
* প্রথমটি হলো স্ট্যান্ডার্ড এবং বেশি শক্তিশালী স্কিম (চিত্র), যেখানে এ, ডিএ, সি, এবং ডিসি এর জন্য বিজেড (বেনজয়েল) সুরক্ষা এবং জি ও ডিজি এর জন্য আইসোবিউটাইরিল গ্রুপ ব্যবহৃত হয়। আরও সম্প্রতি, সি এবং ডিসি সুরক্ষার জন্য চিত্রে দেখানো হিসাবে এসি (অ্যাসিটাইল) গ্রুপ ব্যবহৃত হচ্ছে।
* দ্বিতীয়টি হলো মৃদু সুরক্ষা স্কিম, যেখানে এ এবং ডিএ কে আইসোবিউটাইরিল বা ফেনোক্সিট্রিটাইল গ্রুপ (পিএসি) দ্বারা সুরক্ষিত করা হয়। সি এবং ডিসিতে অ্যাসিটাইল সুরক্ষা থাকে, এবং জি ও ডিজিকে ৪-আইসোপ্রোপাইলফেনোক্সিট্রিটাইল (*i*Pr-PAC) বা ডাইমিথাইলফর্মামিডিনো (ডিএমএফ) গ্রুপ দ্বারা সুরক্ষিত করা হয়। মৃদু সুরক্ষামূলক গ্রুপগুলো স্ট্যান্ডার্ড গ্রুপগুলোর তুলনায় সহজে অপসারণ করা যায়। তবে, এই গ্রুপগুলো বহনকারী ফসফোরামিডাইটগুলো দ্রবণে সংরক্ষিত অবস্থায় কম স্থিতিশীল।
* ফসফাইট গ্রুপটি একটি ক্ষার-সংবেদনশীল ২-সায়ানোইথাইল সুরক্ষামূলক গ্রুপ দ্বারা সুরক্ষিত থাকে। একবার একটি ফসফোরামিডাইট সলিড সাপোর্ট-সংলগ্ন অলিগোনিউক্লিওটাইডের সাথে যুক্ত হলে এবং ফসফাইট অংশগুলো পি(ভি) যৌগে রূপান্তরিত হলে, পরবর্তী কাপলিং বিক্রিয়াগুলো সফলভাবে সম্পন্ন করার জন্য ফসফেট সুরক্ষা থাকা বাধ্যতামূলক নয়।

* আরএনএ সংশ্লেষণে, ২'-হাইড্রক্সি গ্রুপটি টিবিডিএমএস (*টি*-বিউটাইডাইমিথাইলসাইলিল) গ্রুপ

> অথবা টিওএম (ট্রাই-*আইসো*-প্রোপাইলসাইলিলোক্সিমিথাইল) গ্রুপ দ্বারা সুরক্ষিত থাকে, যা ফ্লোরাইড আয়ন দিয়ে ট্রিটমেন্টের মাধ্যমে অপসারণযোগ্য।
* ফসফাইট অংশে একটি ডাইআইসোপ্রোপাইলঅ্যামিনো (*i*Pr2N) গ্রুপও থাকে যা অ্যাসিডিক অবস্থায় বিক্রিয়াশীল। সক্রিয়করণের পর, ডাইআইসোপ্রোপাইলঅ্যামিনো গ্রুপটি অপসারিত হয় এবং সাপোর্ট-সংলগ্ন অলিগোনিউক্লিওটাইডের ৫'-হাইড্রক্সি গ্রুপ দ্বারা প্রতিস্থাপিত হয় (নিচে "ধাপ ২: কাপলিং" দেখুন)।

#### নন-নিউক্লিওসাইড ফসফোরামিডাইট

নন-নিউক্লিওসাইড ফসফোরামিডাইটগুলো হলো এমন ফসফোরামিডাইট রিএজেন্ট যা সংশ্লেষিত অলিগোনিউক্লিওটাইডের প্রান্তে বা অনুক্রমের মাঝখানে নিউক্লিওটাইড অবশিষ্টাংশের মধ্যে বিভিন্ন কার্যকারিতা যুক্ত করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছে। অনুক্রমের ভেতরে যুক্ত হওয়ার জন্য, একটি নন-নিউক্লিওসিডিক মডিফায়ারের কমপক্ষে দুটি হাইড্রক্সি গ্রুপ থাকতে হয়, যার একটি প্রায়শই ডিএমটি গ্রুপ দ্বারা সুরক্ষিত থাকে এবং অন্যটি সক্রিয় ফসফোরামিডাইট অংশ বহন করে।

নন-নিউক্লিওসিডিক ফসফোরামিডাইটগুলো এমন কাঙ্ক্ষিত গ্রুপ যুক্ত করতে ব্যবহৃত হয় যা প্রাকৃতিক নিউক্লিওসাইডে পাওয়া যায় না অথবা যা সহজতর রাসায়নিক ডিজাইনের মাধ্যমে আরও সহজে যুক্ত করা যায়। সহজলভ্য কাঠামোগত এবং কার্যকরী বৈচিত্র্য প্রদর্শনের জন্য পরিকল্পনায় বাণিজ্যিক ফসফোরামিডাইট রিএজেন্টের একটি সংক্ষিপ্ত তালিকা দেখানো হয়েছে। এই রিএজেন্টগুলো ৫'-প্রান্তীয় ফসফেট (**১**), এনএইচ২ (**২**), এসএইচ (**৩**), অ্যালডিহাইডো (**৪**), এবং কার্বক্সিলিক গ্রুপ (**৫**), সিসি ট্রিপল বন্ড (**৬**), নন-রেডিওঅ্যাক্টিভ লেবেল এবং কোয়েনচার (যেমন ফ্লুরোসিন যুক্ত করার জন্য ৬-এফএএম অমিডাইট **৭** এবং ডাবসিল অমিডাইট **৮**), হাইড্রোফিলিক এবং হাইড্রোফোবিক মডিফায়ার (যেমন হেক্সাইথিলিন গ্লাইকল অমিডাইট **৯** এবং কোলেস্টেরল অমিডাইট **১০**), এবং বায়োটিন অমিডাইট **১১** যুক্ত করতে কাজ করে।

### সংশ্লেষণ চক্র

অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণ করা হয় ক্রমবর্ধমান চেইনের ৫'-প্রান্তের সাথে নিউক্লিওটাইড অবশিষ্টাংশ ক্রমান্বয়ে যোগ করার মাধ্যমে যতক্ষণ না কাঙ্ক্ষিত অনুক্রমটি তৈরি হয়। প্রতিটি সংযোজনকে একটি সংশ্লেষণ চক্র বলা হয় (পরিকল্পনা ৫) এবং এটি চারটি রাসায়নিক বিক্রিয়া নিয়ে গঠিত:

#### ধাপ ১: ডি-ব্লকিং (ডেট্রাইটাইলেশন)
একটি নিষ্ক্রিয় দ্রাবকে (ডাইক্লোরোমিথেন বা টলুইন) ২% ট্রাইক্লোরোঅ্যাসেটিক অ্যাসিড (টিসিএ) বা ৩% ডাইক্লোরোঅ্যাসেটিক অ্যাসিড (ডিসিএ) এর মতো অ্যাসিডের দ্রবণের মাধ্যমে ডিএমটি গ্রুপটি অপসারণ করা হয়। উৎপন্ন কমলা রঙের ডিএমটি ক্যাটায়নটি ধুয়ে ফেলা হয়; এই ধাপের ফলে সলিড সাপোর্ট-সংলগ্ন অলিগোনিউক্লিওটাইড প্রিকারসার পাওয়া যায় যাতে একটি মুক্ত ৫'-প্রান্তীয় হাইড্রক্সিল গ্রুপ থাকে।
এটি মনে রাখা জরুরি যে দীর্ঘ সময় ধরে বা অ্যাসিডের প্রস্তাবিত দ্রবণের চেয়ে শক্তিশালী দ্রবণ দিয়ে ডেট্রাইটাইলেশন করলে সলিড সাপোর্ট-সংলগ্ন অলিগোনিউক্লিওটাইডের ডিপিউরিনেশন ঘটে এবং এর ফলে কাঙ্ক্ষিত পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের উৎপাদের ফলন কমে যায়।

#### ধাপ ২: কাপলিং
অ্যাসিটোনাইট্রাইলে নিউক্লিওসাইড ফসফোরামিডাইটের (বা একাধিক ফসফোরামিডাইটের মিশ্রণ) একটি ০.০২–০.২ এম দ্রবণকে ০.২–০.৭ এম অ্যাসিডিক অ্যাজোল প্রভাবক যেমন ১''এইচ''-টেট্রাজোল, ৫-ইথাইলথিও-১এইচ-টেট্রাজোল, ২-বেনজাইলথিওটেট্রাজোল, ৪,৫-ডাইসায়ানোইমিডাজোল, বা অনুরূপ বেশ কয়েকটি যৌগ দ্বারা সক্রিয় করা হয়। অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণে বিভিন্ন কাপলিং এজেন্টের ব্যবহার সম্পর্কে আরও বিস্তারিত তথ্য সাম্প্রতিক একটি পর্যালোচনায় পাওয়া যাবে। মিশ্রণটি সাধারণত খুব সংক্ষিপ্ত হয় এবং অলিগোনিউক্লিওটাইড সিনথেসাইজারের ফ্লুইড লাইনে ঘটে যখন উপাদানগুলো সলিড সাপোর্ট সম্বলিত রিঅ্যাক্টরে সরবরাহ করা হয়। সাপোর্ট-সংলগ্ন উপাদানের তুলনায় ১.৫ – ২০ গুণ বেশি সক্রিয় ফসফোরামিডাইট তখন প্রারম্ভিক সলিড সাপোর্টের (প্রথম কাপলিং) বা সাপোর্ট-সংলগ্ন অলিগোনিউক্লিওটাইড প্রিকারসারের (পরবর্তী কাপলিং) সংস্পর্শে আনা হয়, যার ৫'-হাইড্রক্সি গ্রুপটি আগত নিউক্লিওসাইড ফসফোরামিডাইটের সক্রিয় ফসফোরামিডাইট অংশের সাথে বিক্রিয়া করে একটি ফসফাইট ট্রাইএস্টার লিঙ্কেজ তৈরি করে। ২'-ডিঅক্সিনিউক্লিওসাইড ফসফোরামিডাইটের কাপলিং খুব দ্রুত এবং ছোট স্কেলে সম্পন্ন হতে প্রায় ২০ সেকেন্ড সময় লাগে। এর বিপরীতে, স্টেরিক্যালি হিন্ডারড ২'-*ও*-সুরক্ষিত রাইবোনিউক্লিওসাইড ফসফোরামিডাইটগুলো উচ্চ ফলনে কাপল হতে ৫-১৫ মিনিট সময় নেয়। এই বিক্রিয়াটি পানির উপস্থিতির প্রতি অত্যন্ত সংবেদনশীল, বিশেষ করে যখন ফসফোরামিডাইটের লঘু দ্রবণ ব্যবহার করা হয়, এবং এটি সাধারণত অনার্দ্র অ্যাসিটোনাইট্রাইলে সম্পন্ন করা হয়। সাধারণত, সংশ্লেষণের স্কেল যত বড় হয়, ফসফোরামিডাইটের আধিক্য তত কম এবং ঘনত্ব তত বেশি ব্যবহার করা হয়। এর বিপরীতে, অ্যাক্টিভেটরের ঘনত্ব মূলত অ্যাসিটোনাইট্রাইলে এর দ্রবণীয়তা দ্বারা নির্ধারিত হয় এবং সংশ্লেষণের স্কেলের ওপর নির্ভর করে না। কাপলিং সম্পন্ন হওয়ার পর, যেকোনো অব্যবহৃত রিএজেন্ট এবং উপজাত ধোয়ার মাধ্যমে অপসারণ করা হয়।

#### ধাপ ৩: ক্যাপিং
ক্যাপিং ধাপটি সলিড সাপোর্ট-সংলগ্ন উপাদানকে অ্যাসিটিক অ্যানহাইড্রাইড এবং প্রভাবক হিসেবে ১-মিথাইলইমিডাজোল বা (খুব কম ক্ষেত্রে) ডিএমএপি এর মিশ্রণ দিয়ে ট্রিট করার মাধ্যমে সম্পন্ন করা হয়। ফসফোরামিডাইট পদ্ধতিতে এটি দুটি উদ্দেশ্যে কাজ করে:
* কাপলিং বিক্রিয়া সম্পন্ন হওয়ার পর, সলিড সাপোর্ট-সংলগ্ন ৫'-ওএইচ গ্রুপগুলোর একটি ছোট অংশ (০.১ থেকে ১%) অবিক্রিয়াশীল থেকে যায় এবং (এন-১) শর্টমার  হিসেবে পরিচিত ইন্টারনাল বেস ডিলিশন যুক্ত অলিগোনিউক্লিওটাইড তৈরি রোধ করতে এগুলোকে স্থায়ীভাবে ব্লক করা প্রয়োজন। অবিক্রিয়াশীল ৫'-হাইড্রক্সি গ্রুপগুলো ক্যাপিং মিশ্রণ দ্বারা অনেকাংশেই অ্যাসিটাইলেটেড হয়ে যায়।
* এটিও রিপোর্ট করা হয়েছে যে ১*এইচ*-টেট্রাজোল দ্বারা সক্রিয় করা ফসফোরামিডাইটগুলো অল্প পরিমাণে গুয়ানোসিনের ও৬ পজিশনের সাথে বিক্রিয়া করে। আই২/পানির সাথে জারণের পর, এই পার্শ্ব-উৎপাদটি (সম্ভবত ও৬-এন৭ মাইগ্রেশনের মাধ্যমে) ডিপিউরিনেশন প্রক্রিয়ার মধ্য দিয়ে যায়। এভাবে তৈরি হওয়া অ্যাপিউরিনিক সাইটগুলো ক্ষারীয় অবস্থায় অলিগোনিউক্লিওটাইডের চূড়ান্ত ডিপ্রোটেকশনের সময় সহজেই ভেঙে যায় (নিচে দেখুন), যা দুটি ছোট অলিগোনিউক্লিওটাইড তৈরি করে এবং পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের উৎপাদের ফলন কমিয়ে দেয়। যতক্ষণ আই২/পানির সাথে জারণের *আগে* ক্যাপিং ধাপটি সম্পন্ন করা হয়, ততক্ষণ ক্যাপিং রিএজেন্ট দ্বারা ও৬ মডিফিকেশনগুলো দ্রুত অপসারিত হয়।
* অলিগোনিউক্লিওটাইড ফসফোরোথিওয়েট (ওপিএস, নিচে দেখুন) সংশ্লেষণে আই২/পানির সাথে জারণ জড়িত নয়, এবং তাই এটি উপরে বর্ণিত পার্শ্ব-প্রতিক্রিয়ায় ভোগে না। অন্যদিকে, যদি সালফারাইজেশনের আগে ক্যাপিং ধাপটি সম্পন্ন করা হয়, তবে সলিড সাপোর্টে ক্যাপিং ধাপের পর অবশিষ্ট অ্যাসিটিক অ্যানহাইড্রাইড এবং এন-মিথাইলইমিডাজোল থাকতে পারে। ক্যাপিং মিশ্রণটি সালফার স্থানান্তর বিক্রিয়ায় হস্তক্ষেপ করে, যার ফলে কাঙ্ক্ষিত পিএস ট্রাইএস্টারের পরিবর্তে প্রচুর পরিমাণে ফসফেট ট্রাইএস্টার ইন্টারনিউক্লিওসিডিক লিঙ্কেজ তৈরি হয়। অতএব, ওপিএস সংশ্লেষণের জন্য ক্যাপিং ধাপের *আগে* সালফারাইজেশন ধাপটি পরিচালনা করার পরামর্শ দেওয়া হয়।

#### ধাপ ৪: জারণ
নতুন তৈরি হওয়া ট্রাইকোঅর্ডিনেটেড ফসফাইট ট্রাইএস্টার লিঙ্কেজটি প্রাকৃতিক নয় এবং অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণের শর্তাধীনে এর স্থায়িত্ব সীমিত। একটি মৃদু ক্ষারের (পিরিডিন, লুটিডিন বা কলিডিন) উপস্থিতিতে আয়োডিন এবং পানি দিয়ে সাপোর্ট-সংলগ্ন উপাদানকে ট্রিট করলে ফসফাইট ট্রাইএস্টারটি টেট্রাকোঅর্ডিনেটেড ফসফেট ট্রাইএস্টারে জারিত হয়, যা প্রাকৃতিকভাবে পাওয়া ফসফোডাইএস্টার ইন্টারনিউক্লিওসিডিক লিঙ্কেজের একটি সুরক্ষিত প্রিকারসার। টার্ট-বিউটাইল হাইড্রোপেরোক্সাইড বা আরও দক্ষতার সাথে (১এস)-(+)-(১০-ক্যাম্ফোরসালফোনিল)-অক্সাজিরিডিন (সিএসও) ব্যবহার করে অনার্দ্র অবস্থায় জারণ সম্পন্ন করা যেতে পারে। অলিগোনিউক্লিওটাইড ফসফোরোথিওয়েট পাওয়ার জন্য জারণ ধাপটিকে একটি সালফারাইজেশন ধাপ দ্বারা প্রতিস্থাপন করা যেতে পারে (নিচে *অলিগোনিউক্লিওটাইড ফসফোরোথিওয়েট এবং তাদের সংশ্লেষণ* দেখুন)। শেষের ক্ষেত্রে, ক্যাপিংয়ের আগে সালফারাইজেশন ধাপটি সম্পন্ন করা সবচেয়ে ভালো।

### সলিড সাপোর্টসমূহ
সলিড-ফেজ সংশ্লেষণে, সংশ্লেষিত হতে থাকা একটি অলিগোনিউক্লিওটাইড এর ৩'-প্রান্তীয় হাইড্রক্সি গ্রুপের মাধ্যমে একটি সলিড সাপোর্ট উপাদানের সাথে সমযোজী বন্ধনে আবদ্ধ থাকে এবং সম্পূর্ণ চেইন অ্যাসেম্বলি চলাকালীন এটির সাথেই যুক্ত থাকে। সলিড সাপোর্টটি কলামের মধ্যে থাকে যার আকার সংশ্লেষণের স্কেলের ওপর নির্ভর করে এবং ০.০৫ মিলি থেকে কয়েক লিটার পর্যন্ত হতে পারে। অলিগোনিউক্লিওটাইডের সিংহভাগ ১০ এনমোল থেকে ১ μmol (মাইক্রোমোল) স্কেলে সংশ্লেষিত হয়। আরও সম্প্রতি, হাই-থ্রুপুট অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণ যেখানে সলিড সাপোর্ট মাল্টি-ওয়েল প্লেটের (বেশিরভাগ ক্ষেত্রে প্রতিটি প্লেটে ৯৬ বা ৩৮৪টি ওয়েল থাকে) ওয়েলে থাকে, তা ছোট স্কেলে সমান্তরাল অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণের জন্য একটি পছন্দের পদ্ধতিতে পরিণত হয়েছে। চেইন অ্যাসেম্বলি শেষে অলিগোনিউক্লিওটাইডটি সলিড সাপোর্ট থেকে মুক্ত করা হয় এবং কলাম বা ওয়েল থেকে বের করে আনা হয়।

#### সলিড সাপোর্ট উপাদান
জৈব সলিড-ফেজ সংশ্লেষণ এবং পেপটাইড সংশ্লেষণের বিপরীতে, অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণ নন-সোয়েলেবল বা লো-সোয়েলেবল সলিড সাপোর্টে সবচেয়ে ভালো হয়। সবচেয়ে বেশি ব্যবহৃত দুটি সলিড-ফেজ উপাদান হলো কন্ট্রোলড পোর গ্লাস (সিপিজি) এবং ম্যাক্রোপোরাস পলিস্টাইরিন (এমপিপিএস)।
* সিপিজি সাধারণত এর ছিদ্রের আকার  দ্বারা সংজ্ঞায়িত করা হয়। অলিগোনিউক্লিওটাইড রসায়নে, প্রায় ৫০, ৮০, ১০০, ১৫০ এবং ২০০-মার  অলিগোনিউক্লিওটাইড তৈরির জন্য যথাক্রমে ৫০০, ১০০০, ১৫০০, ২০০০ এবং ৩০০০ এ ছিদ্রের আকার ব্যবহৃত হয়। নেটিভ সিপিজিকে পরবর্তী প্রক্রিয়াকরণের উপযোগী করতে উপাদানটির উপরিভাগকে (৩-অ্যামিনোপ্রোপাইল)ট্রাইইথোক্সিসিলেন দিয়ে ট্রিট করে অ্যামিনোপ্রোপাইল সিপিজি তৈরি করা হয়। অ্যামিনোপ্রোপাইল বাহুটিকে আরও বাড়িয়ে লং চেইন অ্যামিনোঅ্যালকাইল (এলসিএএ) সিপিজি তৈরি করা যেতে পারে। অ্যামিনো গ্রুপটি তখন অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণের জন্য উপযোগী লিঙ্কারের অ্যাঙ্করিং পয়েন্ট হিসেবে ব্যবহৃত হয়।
* অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণের উপযোগী এমপিপিএস হলো একটি লো-সোয়েলেবল, উচ্চ ক্রস-লিঙ্কড পলিস্টাইরিন যা একটি পোরোজেনাস এজেন্টের উপস্থিতিতে ডাইভিনাইলবেনজিন (নূন্যতম ৬০%), স্টাইরিন এবং ৪-ক্লোরোমিথাইলস্টাইরিন এর পলিমারাইজেশন দ্বারা প্রাপ্ত হয়। প্রাপ্ত ম্যাক্রোপোরাস ক্লোরোমিথাইল এমপিপিএসকে অ্যামিনোমিথাইলএমপিপিএস এ রূপান্তরিত করা হয়।

#### লিঙ্কার রসায়ন

সলিড সাপোর্ট উপাদানকে অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণের উপযোগী করতে, অ্যামিনোপ্রোপাইল সিপিজি, এলসিএএ সিপিজি বা অ্যামিনোমিথাইল এমপিপিএস এর সক্রিয় অ্যামিনো গ্রুপগুলোতে নন-নিউক্লিওসিডিক লিঙ্কার বা নিউক্লিওসাইড সাক্সিনেটগুলো সমযোজী বন্ধনে যুক্ত করা হয়। অবশিষ্ট অবিক্রিয়াশীল অ্যামিনো গ্রুপগুলোকে অ্যাসিটিক অ্যানহাইড্রাইড দিয়ে ক্যাপ করা হয়। সাধারণত তিনটি ভিন্ন ধরনের সলিড সাপোর্ট ব্যবহৃত হয়:
* *ইউনিভার্সাল সাপোর্ট*: বর্তমানে বহুল ব্যবহৃত পদ্ধতিতে সংশ্লেষণ শুরু হয় ইউনিভার্সাল সাপোর্ট দিয়ে যেখানে সলিড সাপোর্ট উপাদানের সাথে একটি নন-নিউক্লিওসিডিক লিঙ্কার যুক্ত থাকে (যৌগ **১** এবং **২**)। ৩'-প্রান্তীয় নিউক্লিওটাইড অবশিষ্টাংশের অনুরূপ একটি ফসফোরামিডাইট স্ট্যান্ডার্ড প্রোটোকল ব্যবহার করে অলিগোনিউক্লিওটাইড চেইন অ্যাসেম্বলির প্রথম সংশ্লেষণ চক্রে ইউনিভার্সাল সলিড সাপোর্টের সাথে যুক্ত করা হয়। এরপর অ্যাসেম্বলি শেষ না হওয়া পর্যন্ত চলতে থাকে, যার পরে সলিড সাপোর্ট-সংলগ্ন অলিগোনিউক্লিওটাইডকে ডিপ্রোটেক্ট করা হয়। ইউনিভার্সাল সলিড সাপোর্টের বৈশিষ্ট্য হলো অলিগোনিউক্লিওটাইড মুক্ত করার প্রক্রিয়াটি ঘটে একটি পি-ও বন্ধনের হাইড্রোলাইটিক বিভাজনের মাধ্যমে যা ৩'-প্রান্তীয় নিউক্লিওটাইড অবশিষ্টাংশের ৩'-*ও*-কে ইউনিভার্সাল লিঙ্কারের সাথে যুক্ত রাখে, যেমনটি পরিকল্পনা ৬-এ দেখানো হয়েছে। এই পদ্ধতির গুরুত্বপূর্ণ সুবিধা হলো সংশ্লেষণীয় অলিগোনিউক্লিওটাইডের অনুক্রম নির্বিশেষে একই সলিড সাপোর্ট ব্যবহার করা যায়। অ্যাসেম্বল করা অলিগোনিউক্লিওটাইড থেকে লিঙ্কার এবং ৩'-প্রান্তীয় ফসফেট সম্পূর্ণ অপসারণের জন্য সলিড সাপোর্ট **১** এবং অনুরূপ বেশ কয়েকটি সলিড সাপোর্টের ক্ষেত্রে গ্যাসীয় অ্যামোনিয়া, জলীয় অ্যামোনিয়াম হাইড্রোক্সাইড, জলীয় মিথাইলঅ্যামিন অথবা তাদের মিশ্রণ প্রয়োজন হয় এবং এগুলো বাণিজ্যিকভাবে সহজলভ্য। সলিড সাপোর্ট **২**-এর ক্ষেত্রে অনার্দ্র মিথানলে অ্যামোনিয়া দ্রবণের প্রয়োজন হয় এবং এটিও বাণিজ্যিকভাবে সহজলভ্য।
* *নিউক্লিওসিডিক সলিড সাপোর্ট*: ঐতিহাসিকভাবে প্রথম এবং এখনও জনপ্রিয় পদ্ধতিতে, ৩'-প্রান্তীয় নিউক্লিওসাইড অবশিষ্টাংশের ৩'-হাইড্রক্সি গ্রুপটি সলিড সাপোর্টের সাথে সাধারণত ৩'-*ও*-সাক্সিনাইল বাহুর মাধ্যমে যুক্ত থাকে, যেমনটি যৌগ **৩**-এ দেখা যায়। অলিগোনিউক্লিওটাইড চেইন অ্যাসেম্বলি শুরু হয় ৩'-প্রান্ত থেকে দ্বিতীয় নিউক্লিওটাইড অবশিষ্টাংশের অনুরূপ একটি ফসফোরামিডাইট গাঠনিক এককের কাপলিংয়ের মাধ্যমে। নিউক্লিওসিডিক সলিড সাপোর্টে সংশ্লেষিত অলিগোনিউক্লিওটাইডের ৩'-প্রান্তীয় হাইড্রক্সি গ্রুপটি ইউনিভার্সাল সলিড সাপোর্টের তুলনায় কিছুটা মৃদু শর্তে ডিপ্রোটেক্ট করা হয়। তবে, একটি নিউক্লিওসিডিক সলিড সাপোর্টকে অনুক্রম-নির্দিষ্ট উপায়ে নির্বাচন করতে হয় বিধায় এটি সম্পূর্ণ সংশ্লেষণ প্রক্রিয়ার গতি কমিয়ে দেয় এবং মানুষের ভুল হওয়ার সম্ভাবনা বাড়িয়ে দেয়।
* *স্পেশাল সলিড সাপোর্ট*: সংশ্লেষিত অলিগোনিউক্লিওটাইডের ৩'-প্রান্তীয় অংশে কাঙ্ক্ষিত ফাংশনাল বা রিপোর্টার গ্রুপ যুক্ত করতে বিশেষ সলিড সাপোর্ট ব্যবহৃত হয়। উদাহরণস্বরূপ, বাণিজ্যিক সলিড সাপোর্ট **৪** ব্যবহার করে ৩'-প্রান্তীয় ৩-অ্যামিনোপ্রোপাইল লিঙ্কারযুক্ত অলিগোনিউক্লিওটাইড তৈরি করা যায়। নন-নিউক্লিওসিডিক ফসফোরামিডাইটের মতো বিক্রিয়াশীল ফাংশনাল গ্রুপ, নন-রেডিওঅ্যাক্টিভ রিপোর্টার গ্রুপ এবং টার্মিনাল মডিফায়ার (যেমন কোলেস্টেরল) যুক্ত করার জন্য ডিজাইন করা আরও অনেক বিশেষ সলিড সাপোর্ট বাণিজ্যিকভাবে সহজলভ্য।

### অলিগোনিউক্লিওটাইড ফসফোরোথিওয়েট সংশ্লেষণ

অলিগোনিউক্লিওটাইড ফসফোরোথিওয়েট (ওপিএস) হলো পরিবর্তিত অলিগোনিউক্লিওটাইড যেখানে ফসফেট অংশের একটি অক্সিজেন পরমাণু সালফার দ্বারা প্রতিস্থাপিত হয়। ওপিএস সংশ্লেষণ প্রাকৃতিক অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণের মতোই। পার্থক্য হলো জারণ ধাপটি সালফার স্থানান্তর বিক্রিয়া (সালফারাইজেশন) দ্বারা প্রতিস্থাপিত হয় এবং ক্যাপিং ধাপটি সালফারাইজেশনের পরে সম্পন্ন করা হয়।

### স্বয়ংক্রিয়করণ
অতীতে অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণ ম্যানুয়ালি দ্রবণে বা সলিড-ফেজে করা হতো। সলিড-ফেজ সংশ্লেষণে সলিড ফেজের ধারক হিসেবে ছোট কাঁচের কলাম বা ছিদ্রযুক্ত ফিল্টারযুক্ত সিরিঞ্জ ব্যবহৃত হতো। বর্তমানে, সলিড-ফেজ অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণ কম্পিউটার-নিয়ন্ত্রিত যন্ত্র (অলিগোনিউক্লিওটাইড সিনথেসাইজার) ব্যবহার করে স্বয়ংক্রিয়ভাবে সম্পন্ন করা হয় এবং এটি প্রযুক্তিগতভাবে কলাম, মাল্টি-ওয়েল প্লেট এবং অ্যারে ফরম্যাটে বাস্তবায়িত হয়। কলাম ফরম্যাটটি গবেষণা এবং বড় স্কেলের প্রয়োগের জন্য সবচেয়ে উপযুক্ত যেখানে উচ্চ গতির প্রয়োজন নেই। মাল্টি-ওয়েল প্লেট ফরম্যাটটি বিশেষভাবে শিল্প এবং একাডেমিয়ার ক্রমবর্ধমান চাহিদা মেটাতে ছোট স্কেলে উচ্চ গতির সংশ্লেষণের জন্য ডিজাইন করা হয়েছে।

### মাঝারি থেকে বড় স্কেলের অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণের ইতিহাস
বড় স্কেলের অলিগোনিউক্লিওটাইড সিনথেসাইজারগুলো প্রায়শই পূর্ববর্তী যন্ত্র প্ল্যাটফর্মের ক্ষমতা বৃদ্ধির মাধ্যমে তৈরি করা হয়েছে। প্রথম মাঝারি স্কেলের সিনথেসাইজারগুলোর একটি ১৯৮০-এর দশকের শেষের দিকে বায়োসার্চ কোম্পানি দ্বারা তৈরি করা হয়েছিল (৮৮০০)। এই প্ল্যাটফর্মটি মূলত পেপটাইড সিনথেসাইজার হিসেবে ডিজাইন করা হয়েছিল এবং এতে ফ্লুইডাইজড বেড রিঅ্যাক্টর ব্যবহার করা হয়েছিল যা মেরিফিল্ড পদ্ধতিতে ব্যবহৃত পলিস্টাইরিন সাপোর্টের প্রসারণ বৈশিষ্ট্যগুলোর সাথে খাপ খাইয়ে নিতে অপরিহার্য ছিল। অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণে সিপিজি (কন্ট্রোলড পোর গ্লাস) ব্যবহার জড়িত যা একটি অনমনীয় সাপোর্ট এবং এটি কলাম রিঅ্যাক্টরের জন্য বেশি উপযোগী। ৮৮০০-এর স্কেলটি সাপোর্টকে ফ্লুইডাইজ করার জন্য প্রয়োজনীয় প্রবাহ হারের মধ্যে সীমাবদ্ধ ছিল। কিছু নতুন রিঅ্যাক্টর ডিজাইনের পাশাপাশি স্বাভাবিকের চেয়ে বেশি চাপের ফলে ৮৮০০ এমন স্কেল অর্জন করতে সক্ষম হয়েছিল যাতে ১ মিমোল অলিগোনিউক্লিওটাইড প্রস্তুত করা যেত। ১৯৯০-এর দশকের মাঝামাঝি বেশ কয়েকটি কোম্পানি সেমি-প্রিপারেটিভ এবং প্রিপারেটিভ লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফের ওপর ভিত্তি করে প্ল্যাটফর্ম তৈরি করে। এই সিস্টেমগুলো কলাম রিঅ্যাক্টর পদ্ধতির জন্য বেশ উপযুক্ত ছিল। অধিকাংশ ক্ষেত্রে কেবল কলামে সরবরাহ করা তরল পদার্থের সংখ্যা বাড়ানোর প্রয়োজন ছিল। অলিগো সংশ্লেষণে নূন্যতম ১০টি তরল প্রয়োজন হয় এবং লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফে সাধারণত ৪টি থাকে। এটি একটি সহজ ডিজাইনের কাজ ছিল এবং কিছু সেমি-অটোমেটিক কৌশল বিদ্যমান এলসি যন্ত্রপাতিতে কোনো পরিবর্তন ছাড়াই কাজ করেছিল। পারসেপটিভ বায়োসিস্টেমস এবং ফার্মাসিয়া ছিল এমন কয়েকটি কোম্পানির মধ্যে যারা লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফ থেকে সিনথেসাইজার তৈরি করেছিল। জেনোমিক টেকনোলজিস ইনকর্পোরেটেড  ছিল সেই অল্প কয়েকটি কোম্পানির একটি যারা গোড়া থেকেই একটি বড় স্কেলের অলিগোনিউক্লিওটাইড সিনথেসাইজার তৈরি করেছিল। ভিএলএসএস নামক প্রাথমিক প্ল্যাটফর্মটি খুব বড় স্কেলের সিনথেসাইজারের জন্য ফার্মাসিয়া লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফ কলামগুলোকে রিঅ্যাক্টর হিসেবে ব্যবহার করত এবং ৭৫ মিমোল পর্যন্ত উপাদান সংশ্লেষণ করতে পারত। অনেক অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণ কারখানা তাদের নিজস্ব কাস্টম প্ল্যাটফর্ম ডিজাইন ও তৈরি করেছে এবং ডিজাইনগুলো স্বত্বাধিকারী হওয়ার কারণে এ সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়। ভিএলএসএস ডিজাইনটি ক্রমাগত পরিমার্জিত হতে থাকে এবং কিউমাস্টার সিনথেসাইজারে এটি অব্যাহত রয়েছে যা মিলিগ্রাম থেকে গ্রাম পরিমাণে সংশ্লেষিত অলিগোনিউক্লিওটাইড প্রদানকারী একটি স্কেল-ডাউন প্ল্যাটফর্ম।

রাসায়নিকভাবে পরিবর্তিত অলিগোনিউক্লিওটাইডের বড় স্কেলে সংশ্লেষণের বর্তমান পদ্ধতিগুলো সম্প্রতি পর্যালোচনা করা হয়েছে।

### অলিগোনিউক্লিওটাইড মাইক্রোঅ্যারে সংশ্লেষণ
অলিগোনিউক্লিওটাইড মাইক্রোঅ্যারেকে একটি ক্ষুদ্রাকৃতি মাল্টি-ওয়েল প্লেট হিসেবে কল্পনা করা যেতে পারে যেখানে ওয়েলগুলোর মধ্যে ভৌত বিভাজকগুলো (প্লাস্টিকের দেয়াল) ইচ্ছাকৃতভাবে সরিয়ে ফেলা হয়েছে। রসায়নের ক্ষেত্রে, অলিগোনিউক্লিওটাইড মাইক্রোঅ্যারে সংশ্লেষণ প্রচলিত অলিগোনিউক্লিওটাইড সংশ্লেষণের থেকে দুটি দিক থেকে ভিন্ন:

* অলিগোনিউক্লিওটাইডগুলো স্থায়ীভাবে কঠিন দশার সাথে যুক্ত থাকে, যার জন্য এমন লিঙ্কার ব্যবহারের প্রয়োজন হয় যা চূড়ান্ত ডিপ্রোটেকশন পদ্ধতির শর্তাধীনে স্থিতিশীল থাকে।
* ব্যক্তিগত অলিগোনিউক্লিওটাইডগুলোর মধ্যে ভৌত বিভাজকের অনুপস্থিতি, মাইক্রোঅ্যারের উপরিভাগের অত্যন্ত সীমিত স্থান (একটি অলিগোনিউক্লিওটাইড অনুক্রম ২৫×২৫ μm(মাইক্রোমিটার) বর্গক্ষেত্র দখল করে) এবং উচ্চ নির্ভুলতার প্রয়োজনীয়তার কারণে সাইট-সিলেক্টিভ ৫'-ডিপ্রোটেকশন কৌশল ব্যবহারের প্রয়োজন হয়। একটি পদ্ধতিতে, প্রয়োজনীয় স্থানে অ্যাসিডের ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল জেনারেশনের মাধ্যমে ৫'-*ও*-ডিএমটি গ্রুপটি অপসারণ করা হয়। অন্য একটি পদ্ধতিতে ৫'-*ও*-(এ-মিথাইল-৬-নাইট্রোপিপারোনিলোক্সিকার্বনিল) (MeNPOC) সুরক্ষামূলক গ্রুপ ব্যবহার করা হয়, যা ৩৬৫ nm তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আল্ট্রাভায়োলেট (UV) আলো দিয়ে বিকিরণের মাধ্যমে অপসারণ করা যায়।

## সংশ্লেষণ-পরবর্তী প্রক্রিয়াকরণ
চেইন অ্যাসেম্বলি সম্পন্ন হওয়ার পর, সলিড সাপোর্ট-সংলগ্ন অলিগোনিউক্লিওটাইডটি সম্পূর্ণ সুরক্ষিত থাকে:
* ৫'-প্রান্তীয় ৫'-হাইড্রক্সি গ্রুপটি ডিএমটি গ্রুপ দ্বারা সুরক্ষিত থাকে;
* ইন্টারনিউক্লিওসিডিক ফসফেট বা ফসফোরোথিওয়েট অংশগুলো ২-সায়ানোইথাইল গ্রুপ দ্বারা সুরক্ষিত থাকে;
* টি এবং ইউ বাদে সমস্ত নিউক্লিক বেসের এক্সোসাইক্লিক অ্যামিনো গ্রুপগুলো অ্যাসাইল সুরক্ষামূলক গ্রুপ দ্বারা সুরক্ষিত থাকে।
একটি কার্যকরী অলিগোনিউক্লিওটাইড পেতে সমস্ত সুরক্ষামূলক গ্রুপ অপসারণ করতে হয়। এন-অ্যাসাইল বেস সুরক্ষা এবং ২-সায়ানোইথাইল ফসফেট সুরক্ষা প্রায়শই অজৈব ক্ষার বা অ্যামিন দিয়ে ট্রিট করার মাধ্যমে একসাথে অপসারণ করা যায়। তবে, এই পদ্ধতির প্রয়োগযোগ্যতা এই সত্য দ্বারা সীমাবদ্ধ যে ২-সায়ানোইথাইল ফসফেট সুরক্ষা বিভাজনের ফলে পার্শ্ব-উৎপাদ হিসেবে অ্যাক্রাইলোনিট্রাইল উৎপন্ন হয়। এন-অ্যাসাইল সুরক্ষা অপসারণের জন্য প্রয়োজনীয় শক্তিশালী ক্ষারীয় শর্তাধীনে, অ্যাক্রাইলোনিট্রাইল নিউক্লিক বেসগুলোকে অ্যালকাইলেশন করতে সক্ষম, মূলত থাইমিন এবং ইউরাসিল অবশিষ্টাংশের এন৩-পজিশনে মাইকেল বিক্রিয়ার মাধ্যমে সংশ্লিষ্ট এন৩-(২-সায়ানোইথাইল) অ্যাডাক্ট তৈরি করে। সলিড সাপোর্ট-সংলগ্ন অলিগোনিউক্লিওটাইডকে জৈব দ্রাবকে ক্ষারের দ্রবণ দিয়ে ট্রিট করার মাধ্যমে এই পার্শ্ব-উৎপাদ তৈরি হওয়া এড়ানো যায়, যেমন অ্যাসিটোনাইট্রাইলে ৫০% ট্রাইইথাইলঅ্যামিন বা অ্যাসিটোনাইট্রাইলে ১০% ডাইইথাইলঅ্যামিন দিয়ে। মাঝারি এবং বড় স্কেলে প্রস্তুতির জন্য এই ট্রিটমেন্টের জোরালো সুপারিশ করা হয় এবং ছোট স্কেলের সংশ্লেষণের জন্য এটি ঐচ্ছিক যেখানে ডিপ্রোটেকশন মিশ্রণে উৎপন্ন অ্যাক্রাইলোনিট্রাইলের ঘনত্ব কম থাকে।

ফসফেট সুরক্ষামূলক গ্রুপগুলো আগে সরানো হোক বা না হোক, সলিড সাপোর্ট-সংলগ্ন অলিগোনিউক্লিওটাইডগুলোকে দুটি সাধারণ পদ্ধতির যেকোনো একটি ব্যবহার করে ডিপ্রোটেক্ট করা হয়।
* (১) অধিকাংশ ক্ষেত্রে, অলিগোনিউক্লিওটাইড চেইন অ্যাসেম্বলির শেষে ৫'-ডিএমটি গ্রুপটি অপসারণ করা হয়। এরপর অলিগোনিউক্লিওটাইডগুলোকে কঠিন দশা থেকে মুক্ত করা হয় এবং জলীয় অ্যামোনিয়াম হাইড্রোক্সাইড, জলীয় মিথাইলঅ্যামিন, তাদের মিশ্রণ, গ্যাসীয় অ্যামোনিয়া বা মিথাইলঅ্যামিন অথবা অন্য কোনো প্রাইমারি অ্যামিন বা অ্যালক্যালির দ্রবণ দিয়ে কক্ষ তাপমাত্রায় বা উচ্চ তাপমাত্রায় ট্রিট করে ডিপ্রোটেক্ট করা হয়। এটি ২'-ডিঅক্সিওলিগোনিউক্লিওটাইড থেকে অবশিষ্ট সমস্ত সুরক্ষা গ্রুপ অপসারণ করে কাঙ্ক্ষিত উৎপাদ প্রদান করে। যদি অলিগোনিউক্লিওটাইডে কোনো ২'-*ও*-সুরক্ষিত রাইবোনিউক্লিওটাইড অবশিষ্টাংশ থাকে, তবে ডিপ্রোটেকশন প্রোটোকলের দ্বিতীয় ধাপে ফ্লোরাইড আয়ন দিয়ে ট্রিট করে ২'-*ও*-সুরক্ষামূলক সাইলিল গ্রুপগুলো অপসারণ করা হয়। সম্পূর্ণ ডিপ্রোটেক্টেড উৎপাদটি সরাসরি ব্যবহৃত হয় অথবা বিভিন্ন পদ্ধতিতে বিশুদ্ধ করা যায়। সাধারণত, অপরিশোধিত উৎপাদকে ইথানল প্রিপিপিটেশন, সাইজ এক্সক্লুশন ক্রোমাটোগ্রাফি বা রিভার্স-ফেজ এইচপিএলসি ব্যবহার করে লবণমুক্ত (বিশুদ্ধ) করা হয়। অবাঞ্ছিত ট্রাঙ্কেশন প্রোডাক্টগুলো দূর করতে অলিগোনিউক্লিওটাইডগুলোকে পলিঅ্যাক্রাইলঅ্যামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস বা অ্যানায়ন-এক্সচেঞ্জ এইচপিএলসির মাধ্যমে বিশুদ্ধ করা যেতে পারে।
* (২) দ্বিতীয় পদ্ধতিটি কেবল তখনই ব্যবহৃত হয় যখন বিশুদ্ধকরণের জন্য রিভার্স-ফেজ এইচপিএলসি পদ্ধতি ব্যবহারের পরিকল্পনা থাকে। এক্ষেত্রে, ৫'-প্রান্তীয় ডিএমটি গ্রুপটি বিশুদ্ধকরণের জন্য হাইড্রোফোবিক হ্যান্ডেল হিসেবে সংশ্লেষণ শেষে রেখে দেওয়া হয়। অলিগোনিউক্লিওটাইডটিকে উপরে বর্ণিত ক্ষারীয় শর্তে ডিপ্রোটেক্ট করা হয় এবং বাষ্পীভবনের পর রিভার্স-ফেজ এইচপিএলসি দ্বারা বিশুদ্ধ করা হয়। সংগৃহীত উপাদানটিকে এরপর জলীয় অম্লীয় শর্তে ডেট্রাইটাইলেট করা হয়। ছোট স্কেলে (০.০১–০.০২ মিমোল-এর কম), কক্ষ তাপমাত্রায় ১৫–৩০ মিনিট ৮০% জলীয় অ্যাসিটিক অ্যাসিড দিয়ে ট্রিট করা হয় এবং এরপর বিক্রিয়া মিশ্রণটিকে শুষ্ক করার জন্য *[[:wikt:in vacuo|ইন ভ্যাকুয়ো]]* বাষ্পীভূত করা হয়। অবশেষে, উপরে বর্ণিত পদ্ধতিতে উৎপাদটিকে লবণমুক্ত করা হয়।
* কিছু প্রয়োগের জন্য, সংশ্লেষণ-পরবর্তী বিভিন্ন পদ্ধতি ব্যবহার করে একটি অলিগোনিউক্লিওটাইডে অতিরিক্ত রিপোর্টার গ্রুপ যুক্ত করা যেতে পারে।

## বৈশিষ্ট্যায়ন

যেকোনো জৈব যৌগের মতো, সংশ্লেষিত অলিগোনিউক্লিওটাইড তৈরির পর তাদের বৈশিষ্ট্য যাচাই করা বুদ্ধিমানের কাজ। আরও জটিল ক্ষেত্রে (গবেষণা এবং বড় স্কেলের সংশ্লেষণ) অলিগোনিউক্লিওটাইডগুলোর ডিপ্রোটেকশন এবং বিশুদ্ধকরণের পরে বৈশিষ্ট্য যাচাই করা হয়। যদিও বৈশিষ্ট্য যাচাইয়ের চূড়ান্ত পদ্ধতি হলো সিকোয়েন্সিং, যা তুলনামূলকভাবে সাশ্রয়ী এবং রুটিন পদ্ধতি, তবে খরচ কমানোর কথা বিবেচনা করে অলিগোনিউক্লিওটাইডের রুটিন উৎপাদনে এর ব্যবহার পরিহার করা হয়। দৈনন্দিন কাজে, একটি অলিগোনিউক্লিওটাইডের মাস স্পেকট্রাম রেকর্ড করার মাধ্যমে তার আণবিক ভর নির্ণয় করাই যথেষ্ট। অলিগোনিউক্লিওটাইডের বৈশিষ্ট্যায়নের জন্য বর্তমানে দুটি পদ্ধতি ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়: ইলেক্ট্রোস্প্রে মাস স্পেকট্রোমেট্রি (ইএসআই এমএস) এবং ম্যাট্রিক্স-অ্যাসিস্টেড লেজার ডেসরপশন/আয়নাইজেশন টাইম-অফ-ফ্লাইট মাস স্পেকট্রোমেট্রি (মালদি-টফ)। তথ্যবহুল স্পেকট্রা পেতে, যেকোনো পদ্ধতিতে বিশ্লেষণের আগে নমুনায় উপস্থিত থাকতে পারে এমন সমস্ত মেটাল আয়নকে অ্যামোনিয়াম বা ট্রাইঅ্যালকাইলঅ্যামোনিয়াম আয়ন দ্বারা প্রতিস্থাপন করা খুবই গুরুত্বপূর্ণ।
* ইএসআই এমএস স্পেকট্রায়, একটি নির্দিষ্ট অলিগোনিউক্লিওটাইড আয়নের একটি সেট তৈরি করে যা যৌগের বিভিন্ন আয়নাইজেশন অবস্থার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। এভাবে, আণবিক ভর এম বিশিষ্ট অলিগোনিউক্লিওটাইড (এম – *এন*এইচ)/*এন* ভরের আয়ন তৈরি করে যেখানে এম হলো মুক্ত অ্যাসিড আকারে অলিগোনিউক্লিওটাইডের আণবিক ভর, *এন* হলো আয়নাইজেশন অবস্থা এবং এইচ হলো হাইড্রোজেনের পারমাণবিক ভর (১ ডিএ)। বৈশিষ্ট্যায়নের জন্য ২ থেকে ৫ পর্যন্ত *এন* রেঞ্জের আয়নগুলো সবচেয়ে উপযোগী। সাম্প্রতিককালে তৈরি করা যন্ত্রগুলোর সাথে সরবরাহ করা সফটওয়্যার ডিকনভোলিউশন পদ্ধতি সম্পন্ন করতে সক্ষম যা একই সেটের আয়নের পিকগুলো খুঁজে বের করে এবং অলিগোনিউক্লিওটাইডের আণবিক ভর নির্ণয় করে।
* অলিগোনিউক্লিওটাইডের অপদ্রব্যের প্রোফাইল সম্পর্কে আরও বিস্তারিত তথ্য পেতে লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-মাস স্পেকট্রোমেট্রি (এলসি-এমএস বা এইচপিএলসি-এমএস) বা ক্যাপিলারি ইলেক্ট্রোফোরেসিস মাস স্পেকট্রোমেট্রি (সিইএমএস) ব্যবহৃত হয়।

## আরও দেখুন
* নিউক্লিক অ্যাসিড
* পেপটাইড নিউক্লিক অ্যাসিড
* ব্রিজড নিউক্লিক অ্যাসিড

## তথ্যসূত্র

## আরও পড়ুন
* Comprehensive Natural Products Chemistry, Volume 7: DNA and Aspects of Molecular Biology. Kool, Eric T., Editor. Neth. (1999), 733 pp. Publisher: (Elsevier, Amsterdam, Neth.)
* 
* 
* 
* Beaucage, S L. "Oligodeoxyribonucleotides synthesis. Phosphoramidite approach. Methods in Molecular Biology (Totowa, NJ, United States) (1993), 20 (Protocols for Oligonucleotides and Analogs), 33–61.
* 

বিষয়শ্রেণী:জেনেটিক্স কৌশল
বিষয়শ্রেণী:গবেষণাগারের কৌশল
বিষয়শ্রেণী:আণবিক জীববিজ্ঞান কৌশল