Tinción

Una **tinción** o **coloración** ye una téunica auxiliar utilizada en microscopía p'ameyorar el contraste na imaxe vista al microscopiu. Los colorantes y tinturas son sustancies que usualmente utilizar en bioloxía y medicina pa resaltar estructures en texíos biolóxicos que van ser reparaos cola ayuda de distintos tipos de microscopios. Los distintos colorantes pueden ser utilizaos p'aumentar la definición y esaminar grandes cortes de texíu (resaltando por casu fibres musculares o texíu conectivo), poblaciones celulares (por casu clasificando distintes célules sanguínees) o inclusive pa resaltar organeles dientro de célules individuales.

En bioquímica, esto implica amestar un colorante específicu (esto significa que s'una de manera selectiva yá sía a ADN, proteínes, lípidos, carbohidratos, etc.) a un sustratu pa cualificar o cuantificar la presencia d'un determináu compuestu. Tanto la tinción como'l marcáu fluorescente pueden sirvir pa los mesmos propósitos.

Distintos tipos de tinciones biolóxiques son utilizaes tamién pa marcar célules en citometría de fluxu y pa marcar proteínes ó acedos nucleicos en electroforesis en xel.

Les tinciones nun tán llindaes al so usu en materiales biolóxicos, tamién pueden ser utilizaes pa estudiar la morfoloxía d'otros materiales (por casu, les estructures lamelares de polímeros semicristalinos de les estructures de dominiu de bloques de copolímeros).

## Tinción ''in vivo'' y ''in vitro''
Una tinción *[[in vivo]]* (tinción vital) ye'l procesu de tiñir texíos vivos. Al provocar que determinaes célules o estructures adquieran los colores de contraste, puede estudiase el so allugamientu y morfoloxía mientres tán desempeñando la so función. El propósitu más común ye revelar detalles de la citoestructura que d'otra manera nun resultaríen evidentes, sicasí, la tinción vital puede revelar amás onde apaez un determináu productu químicu o onde se lleva a cabu una determinada reacción química dientro de les célules o texíos. 

De cutiu estes tinciones son llamaes *tinciones vitales*. Introducir nel organismu mientres les célules entá s'atopen vives. Pa consiguir l'efectu deseyáu, el colorante usualmente utilizar en soluciones bien esleíes que van ente 1:5.000 a 1:50.000. A pesar d'esto les tinciones son eventualmente tóxiques pa los organismos, delles más qu'otres. 

Una tinción *[[in vitro]]* o "supravital" arreya'l coloreo de célules o estructures que fueron removíes del so contestu biolóxicu. Utilízase de cutiu una combinación de dellos colorantes pa revelar más detalles y carauterístiques de les que se llograríen col usu d'unu solu. Combinaos con protocolos específicos de fixación y de preparación de muestres, los científicos y profesionales de la salú pueden utilizar estes téuniques estandarizadas como una ferramienta diagnóstica repetible y consistente. Una contratinción ye una tinción que consigue que les célules o estructures sían más visibles, cuando nun se consigue que sían totalmente visibles cola tinción principal.

Por casu, el cristal violeta tiñe namái a les bacteries Gram positives na tinción de Gram. Utilízase una contratinción de safranina (que colorea toles célules), pa dexar tamién la identificación de bacteries Gram negatives.

Ye de notar que munches tinciones pueden ser utilizaes tantu en célules vives como en célules fites.

### Métodos de tinción in vitro
#### Preparación
Les etapes preparatorias arreyaes nuna tinción van depender del tipu d'analís entamáu; so estes premises puede considerase que dalgunos o toos de los siguientes pasos podríen riquir.

* **[[Fixación (histoloxía)|Fixación]]**: de por si, esta etapa puede consistir en dellos pasos. La fixación ye un cambéu de les propiedaes fisicoquímiques de les proteínes que formen una célula o texíu y que tien por finalidá caltener les formes de les célules o texíos tanto como sía posible. Dacuando puede utilizase una fixación por calor pa matar, xuntar y alteriar un espécime de cuenta qu'acepte la tinción. La mayor parte de les vegaes utiliza un fijador químicu. Los fijadores químicos polo xeneral causen la formación d'enllaces cruciaos ente proteínes, o ente proteínes y otres sustancies presentes na muestra, amontando la so resistencia mecánica. Ente los fijadores químicos más comunes atópense'l formaldehídu, etanol, metanol, y/o'l acedu pícricu. Pequeños bloques de texíu pueden ser enfiñíos en parafina o dalgún polímeru, procesu conocíu como inclusión, p'amontar la so resistencia y estabilidá, y pa faer más fácil cortalos en rodajas desaxeradamente delgaes, yá que cuanto más delgáu ye un tayu histolóxicu, más definición llograr nes imáxenes microscópiques.

* **Permeabilización** esti pasu implica'l tratamientu de les célules con un surfactante nidiu. Esti tipu de tratamientu tien como finalidá eslleir la membrana celular pa dexar que les grandes molécules de colorante puedan aportar a les estructures del interior de les célules.

* **Montaxe** frecuentemente implica xuntar los tayos histolóxicos a un portaoxetos de vidriu pa la so observación al microscopiu o analís. En dellos casos, puede cultivase a les célules direutamente sobre -y portaoxetos. En muestres de célules sueltes, como les que se presenten nun estendíu de sangre o de fluyíos biolóxicos, la muestra puede ser aplicada direutamente sobre'l portaoxetos. Pa pieces de texíu de mayor tamañu, utilízase un micrótomu que corta la muestra en rodajas por demás delgaes. Estes rodajas son depués xuntaes al portaoxetos per mediu d'una sustancia que funciona como pegamento, yá sía una resina tresparente, gelatina o clara de güevu. El montaxe tien por finalidá aumentar la resistencia mecánica d'una muestra que d'otra manera sería desaxeradamente fráxil, por que soporte el procesu de tiñíu calteniendo lo más posible la so estructura orixinal.

#### Tinción afecha
Na so forma más simple, el verdaderu procesu de tinción puede implicar la inmersión de la muestra (antes o dempués de la fixación y el montaxe) na solución colorante, siguíu del esclariáu que ye una llavadura pa esaniciar l'escesu de colorante y la observación.
Munchos tintes, sicasí, riquen del usu d'un mordiente, esto ye, un compuestu químicu que reacciona col colorante pa formar un precipitáu coloriáu insoluble. Cuando la solución de colorante por demás esaníciase mientres l'esclariáu, la tinción mordentada permanez.

La mayoría de los colorantes utilizaos en microscopía atópense disponibles como **colorantes certificaos**. Esto significa que los colorantes ufiertaos pol fabricante fueron evaluaos por un organismu independiente, la Biological Stain Commission, y que esti organismu determinó que'l productu ufiertáu cumple o entepasa ciertos estándares de pureza, concentración de sustancia colorante y desempeñu nes téuniques de tinción emplegaes. Estos estándares son publicaos refechamente na revista *[[Biotechnic & Histochemistry]]*. Munchos colorantes presenten una composición distinta ente distintes fabricantes. L'usu de colorantes certificaos esanicia una fonte de resultancies inesperaes.

### Tinción direuta
Falamos de tinción direuta cuando'l colorante interacciona direutamente col sustratu, ensin otru tratamientu previu.

### Tinción indireuta
Denominar d'esta miente a les tinciones que faen usu d'un mordiente. Un mordiente habitual ye'l acedu tánico.

## Afinidá de distintos texíos por distintos colorantes
Cuando un texíu o estructura subcelular presenta una afinidá por un determináu colorante suelse designar polos sufixos *-filu* o *-fílico*. Por casu, los texíos que se tiñen con azure suelen ser nomaos como azurófilos o azurofílicos. Tamién puede ser utilizáu pa designar propiedaes tintoriales más xeneralizaes, por casu los texíos que se tiñen con colorantes de naturaleza aceda (por casu la eosina) suelen ser denominaos como acidofílicos, basofílicos cuando se tiñen con colorantes de naturaleza básica (tales como por casu l'azul de metileno o la hematoxilina), y anfifílicos cuando acepten dambos colorantes. Otra manera, los texíos cromófobos nun tomen colorante con facilidá.

### Tinción negativa
Un métodu senciellu de tinción pa bacteries, qu'amás ye un claru casu de cromofobia y que polo tanto funciona inda cuando los métodos de tinción positiva fallen, ye la tinción negativa. Esto pue ser consiguíu a cencielles estendiendo la muestra nun portaoxetos y aplicando direutamente sobre ella una gota de nigrosina o tinta china y cubriendo depués la muestra amugada con un cubreobjetos. Depués d'esto, los microorganismos pueden ser reparaos fácilmente per mediu de microscopía en campu claro como inclusiones clares perbién oldeaes contra'l mediu escuru que les arrodia. Adicionalmente, la tinción negativa ye una téunica nidia que nun destrúi a los microorganismos, dexando polo tanto un recultivo posterior pal estudiu de patóxenos.

## Colorantes
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen dalguna afinidá específica polos materiales celulares. Munchos colorantes utilizaos con frecuencia son molécules cargaes positivamente (cationes) y combínense con intensidá colos constituyentes celulares cargaos negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos acedos. Exemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molécules cargaes negativamente (aniones) y combínense colos constituyentes celulares cargaos positivamente, tales como munches proteínes. Esos colorantes inclúin la eosina, la fucsina aceda y el rojo Congo. Otru grupu de colorantes son sustancies liposolubles; los colorantes d'esti grupu combinar colos materiales lipídicos de la célula, usándose de cutiu pa revelar la llocalización de les gotículas o depósitos de grasa. Un exemplu de colorante liposoluble ye'l negro Sudán.
Si deseyar a cencielles amontar el contraste de les célules pa la microscopía, son abondes los procedimientos simples de tinción. L'azul de metileno ye un bon colorante simple qu'actúa sobre toles célules bacterianes rápido y que nun produz un color tan intensu qu'escureza los detalles celulares. Ye especialmente útil pa detectar la presencia de bacteries en muestres naturales, yá que la mayor parte del material non celular nun se tiñe.

## Colorantes histolóxicos más comunes
Los distintos colorantes reaccionen o se concentren en distintos partes de les célules o texíos, y estes propiedaes son utilizaes como una ventaya pa revelar partes o árees específiques. Dalgunos de los colorantes biolóxicos más comunes se listan más embaxo. Nun siendo que s'indique lo contrario la mayoría d'estos colorantes utilizar con célules y texíos fitos. Les tinciones vitales (que pueden ser utilizaes con organismos vivos) atópense destacaes.

### Azul brilloso de Coomassie
Azul de Coomassie (tamién conocíu como Coomassie blue) ye un colorante que tiñe en forma non específica a toles proteínes con un fuerte color azul. Utilízase frecuentemente pa tiñir les corríes de proteínes nes electroforesis en xel.

### Azul de metileno
El azul de metileno utilizar pa tiñir célules d'animales, pa faer más visibles los sos nucleos. Ye tamién utilizáu pa tiñir los estendíos de sangre pa ser utilizaos en citoloxía y como colorante vital nel recuentu de reticulocitos.

### Azul Nilo
El Nile Blue o Nile blue A, esto ye, *azul Nilo*, tiñe los nucleos de color azul. Tamién puede ser utilizáu pa tiñir célules vives.

### Bismarck brown
Bismarck brown (*Marrón Bismarck*, tamién conocíu como *Bismarck brown Y* o *Manchester brown*) imparte un color mariellu a les mucines acedes. Puede utilizase con célules vives.

### Bromuru de etidio
El bromuru de etidio (BE) s'entrepola nel ADN y otorgar un color coloráu naranxa fluorescente. A pesar de que nun ye capaz de tiñir célules vives yá que nun traviesa les membranes intactes, pue ser utilizáu pa identificar célules que s'atopen nes etapes finales de l'apoptosis, yá que tales célules tienen unes membranes muncho más permeables. Pol mesmu motivu, el bromuru de etidio ye utilizáu como un marcador de apoptosis en poblaciones celulares y p'alcontrar les bandes d'ADN nuna corrida en electroforesis en xel. Esti colorante puede ser utilizáu en combinación con naranxa de acridina (NA) nel conteo de célules vidables. Esta tinción combinada BE/NA otorgar a les célules vives un color verde fluorescente ente que les célules apoptóticas apaecen cola distintiva fluorescencia coloráu-naranxa.

### Carmín

El carmín ye un colorante d'un intensu color coloráu que puede ser utilizáu como sal de litiu pa tiñir glicógeno, ente que los sales d'allume-carmín son colorantes que se xunten al nucleu. Les tinciones con carmín riquen del usu d'un mordiente, que usualmente ye aluminiu o allume.

### Cristal violeta
El cristal violeta, al ser combináu con un mordiente fayadizu, tiñe les parés celulares de color púrpura. El cristal violeta ye un componente importante na coloración de Gram.

### DAPI
El DAPI ye un colorante nuclear (tiñe'l nucleu) fosforescente, escitar con lluz ultravioleta pa producir una fuerte fluorescencia azul cuando s'atopa xuníu al ADN. El DAPI xunir a les rexones d'alta repetición A=T nos cromosomes. Amás nun ye visible cuando s'utiliza con un microscopiu de tresmisión corriente. Puede ser utilizáu en célules vives o fites. La téunica de tinción con DAPI ye especialmente afecha pal recuentu celular.

### Eosina
La eosina utilízase más frecuentemente como contracoloración de la hematoxilina, impartiendo un color que va del rosado en candia al material citoplasmático, membrana celular, y delles estructures estracelulares. Amás imparte un fuerte color coloráu a los eritrocitos. La eosina puede ser utilizada tamién en delles variantes de la coloración de Gram, y en munchos otros protocolos de tinción. De fechu esisten dos compuestos bien estrechamente rellacionaos (anque non iguales) conocíos como eosina. El más frecuentemente utilizáu ye la eosina Y (tamién conocida como eosina amarellentada) yá que tien una tonalidá amarellentada bien nidia. L'otru compuestu conocíu como eosina ye la eosina B, tamién conocida como eosina azulada o colloráu imperial, que tien una nidia tonalidá azul. Los dos colorantes son intercambiables, y el l'usu d'unu o otru ye más una cuestión de preferencia y tradición.

### Fucsina aceda
La fucsina aceda pue ser utilizada pa colorear coláxenu, músculu llisu o mitocondries. Forma parte de la coloración tricrómica de Mallory onde s'utiliza pa colorear nucleu y citoplasma. Na tinción de Van Gieson (picrofucsina), la fucsina ye la responsable de dar el color coloráu a les fibres de coláxenu. Tamién ye una coloración tradicional pa colorear mitocondrias (métodu de Altmann).

### Hematoxilina
La hematoxilina ye un colorante nuclear. Utilizáu con un mordiente, la hematoxilina tiñe los nucleos celulares de color azul violeta a negru. Con gran frecuencia utilizar en combinación con eosina na coloración H&Y (hematoxilina y eosina), una de les más comunes utilizaes en histoloxía.

### Hoechst
Hoechst ye un compuestu deriváu *bis*-benzimidazol que se xune al riegu menor del ADN. Utilizar con frecuencia en microscopía de fluorescencia pa colorear l'ADN. Hoechst tien color mariellu cuando s'atopa disueltu n'agua, y emite lluz azul cuando recibe lluz ultravioleta. Hai dos tipos principales de colorantes Hoechst. *Hoechst 33258* y *Hoechst 33342*. Dambos compuestos son funcionalmente similares, anque tienen pequeñes diferencies na so estructura. El Hoechst 33258 contién un hidroxilo terminal, y polo tanto ye más soluble en solventes aguacientos, anque esta carauterística mengua la so habilidá pa enfusar la membrana plasmática. El Hoechst 33342 contién un grupu etilo en sustitución del grupu hidroxilo terminal (un grupu etileter), lo que lo fai más hidrofóbicu, y con meyor penetración na membrana plasmática.

### Lugol
El yodu utilizar en química analítica como indicador pal almidón. Cuando s'entemez almidón con una solución de yodu, desenvuélvese un color intensamente azul, representando la formación del complexu d'inclusión yodo/almidón. L'almidón ye una sustancia bien común na mayor parte de les célules vexetales, de cuenta que una solución esleida de yodu puede colorear l'almidón presente nes célules. El yodu tamién ye componente de la coloración de Gram utilizada en microbioloxía. La solución de Lugol o Lugol yoduro (IKI) ye una solución de color marrón que se torna negra en presencia d'almidones y puede ser utilizada pa colorear célules, faciendo más visible'l nucleu. Na coloración de gram el yoduro utilízase como mordiente, aumentando la capacidá del colorante pa entrar nes célules al traviés de los poros presentes na membrana o paré celular.

### Naranxa de acridina
El naranxa de acridina ye un colorante fluorescente, catiónico y selectivu pa ácidos nucleicos preséu pa demostraciones sobre'l ciclu celular. Ye capaz de travesar la membrana celular y interactúa col ADN y el ARN por intercalación o interacciones electrostáticas. Cuando se xune al ADN presenta un espectru bien similar al de la fluoresceína. Al igual que la fluoresceína, puede utilizase tamién como una tinción inespecífica pa dar una fonderada fluorescente (contraste) a tinciones convencionales na superficie de muestres sólides de texíos (coloración de contraste fluorescente).

### Plata
Uno tinción argéntica ye l'usu de plata pa colorear preparaos histolóxicos. Esti tipu de coloración ye especialmente importante pa demostrar proteínes (por casu el coláxenu tipu III) y ADN. Utilizar pa facilitar la visualización de dambes sustancies tanto dientro como fora de les célules. Tamién s'utiliza la tinción argéntica na electroforesis en xel en gradiente de temperatura.

Delles célules *argentafines* amenorguen les soluciones de plata a plata metálico, depués de la fixación con formalina. Esti métodu foi afayáu pol fisiólogu italianu Camillo Golgi, utilizando una reacción ente'l nitratu de plata y el dicromato de potasiu, pa bastiar cromato de plata en delles célules (métodu de Golgi). 
Otres célules son *argirofílicas*: namái amenorguen la plata a la so forma metálica, depués de ser espuestes a una tinción que contién un axente reductor como la hidroxiquinona o formalina.

### Rodamina
La rodamina ye una tinción fluorescente específica pa proteínes utilizada comúnmente en microscopía fluorescente.

### Colloráu neutru
El colloráu neutru (*toluylene rede*) colorea de colloráu a la sustancia de Nissl. Con frecuencia utilízase como contracoloración n'otres téuniques de tinción.

### Colloráu Nilo
El Coloráu Nilo (tamién conocíu como *oxazona del azul nilo*) produzse ferviendo l'Azul Nilo con ácidu sulfúrico. Esti tratamientu produz un amiestu de Colloráu y Azul Nilo. El Colloráu Nilo ye una coloración lipofílica, y atrópase nos glóbulos lipídicos nel interior de les célules, y los colorea de colloráu. El Colloráu Nilo puede utilizase con célules vives. Fluoresce fuertemente cuando s'atopa particionado en lípidos, pero práuticamente nun presenta fluorescencia en soluciones aguacientes.

### Safranina
La safranina (o safranina O) ye un colorante nuclear. Colorea los nucleos celulares de colloráu, y utilízase principalmente como contracoloración. Tamién puede ser utilizada pa da-y una coloración mariella al coláxenu.

### Sudan
La coloración de Sudán utilizar pa destacar sustancies "sudanofílicas", polo común, lípidos. Tamién s'utiliza pa determinar los niveles de grasa en materia fecal pa diagnosticar esteatorrea. Hai dellos colorantes de la familia suden, por casu: Sudan III, Sudan IV, Oil Rede O, y Sudan Black B.

### Tetróxido d'osmiu
El tetróxido d'osmiu utilizar en microscopía óptica pa colorear lípidos. Eslleir con facilidá nes grases y amenórgase a osmiu metálicu al interactuar con material orgánico, dexando un color marrón o negru carauterísticu.

### Verde de metilu
El verde de metilu utilízase frecuentemente en microscopia de campu claro, pa tiñir la cromatina de les célules y facilitar asina la so visualización.

### Verde malaquita
El verde malaquita (conocíu tamién como *diamond green B* o *victoria green B*) pue ser utilizáu como contracoloración azul-verdosa en combinación cola safranina un exemplu ye la coloración de Giménez pa bacteries. Tamién puede utilizase direutamente pa colorear endospores.

## En microscopía electrónica
Al igual que na microscopía óptica, puede faese usu de sustancies qu'aumenten el contraste na microscopía de tresmisión electrónica. Polo xeneral utilícense sustancies electrondensas, o metales pesaos.

### Ácidu fosfotúngstico
El acedu fosfotúngstico ye un colorante negativu común utilizáu pa resaltar virus, nervios, polisacáridos, y otros texíos y materiales biolóxicos.

### Tetróxido d'osmiu
El tetróxido d'osmiu utilizar en microscopía óptica pa tiñir lípidos. Eslleir en grases y amenórgase pola presencia de materiales orgánicos a osmiu metálicu, dexando una residuu negra fácilmente visible. Por cuenta de que ye un metal pesao, qu'absuerbe los electrones, ye quiciabes la coloración más común pa resaltar morfoloxíes na microscopía electrónica. Tamién s'utiliza pa la tinción de dellos polímeros pal estudiu de los mesmos por TEM. L'OSU4 ye bien volátil y desaxeradamente tóxicu. Ye un axente oxidante fuerte, yá que nél l'osmiu tien un estáu d'oxidación +8. Aferruña agresivamente munchos materiales, dexando un depósitu d'osmiu non volátil nun estáu d'oxidación baxu.

### Tetróxido de ruteniu
El tetróxido de ruteniu ye igualmente volátil ya inclusive más agresivu que'l tetróxido d'osmiu, lo que dexa colorear materiales que s'aguanten a la coloración con osmiu. Por casu el polietileno.

### Otros
Otros compuestos químicos utilizaos en microscopía electrónica: molibdato de amonio, yoduro de cadmiu, carbohidrázida, cloruru férrico, hexamina tricloruro d'indiu, nitratu de lantano, acetato de plomu (II), citrato de plomu, nitratu de plomu (II), acedu peryódico, acedu fosfomolíbdico, ferricianuro de potasiu, ferrocianuro de potasiu, colloráu de ruteniu, nitratu de plata, proteinato de plata, cloroaurato de sodiu, nitratu de taliu, tiosemicarbázida, acetato de uranilo, nitratu de uranilo y sulfatu de vanadilo.

## Dalgunes de les tinciones más comunes
Nota: Esta llista inclúi solo dalgunes de les tinciones más comunes, y nun ye nin con muncho completa.

## Referencies

## Bibliografía
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## Enllaces esternos

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*Falando sobre fixación: Parte 1 y Parte 2 - by M. Halit Umar (n'inglés)
*Photomicrographs of Histology Stains (n'inglés)
*Frequently asked questions in staining exercises at Sridhar Rayo P.N's home page (n'inglés)
* Téuniques de tinción. Fundamentos 
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