荧光共振能量转移

荧光共振能量转移（），是描述两个生色团之间能量转移的一种机制。

激发态上的供体生色团，有可能通过偶极耦合将能量传递给受体生色团（两者距离通常在1nm附近）。

福斯特能量共振转移（FRET）类似于近场传输，即反应的作用距离远小于激发光的波长。在近场区域，激发态的供体生色团发射虚拟光子，光子旋即被受体发色团吸收。该些光子是无法探测的，因为他们的存在违反了能量和动量守恒。因此福斯特能量共振转移被认为是无辐射过程。从量子电动力学计算，我们可以确定无辐射和辐射能量转移分别是统一场下的短程和长程近似。

 术语 
这一机理被称为'福斯特共振能量转移'，以德国科学家命名Förster T., Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz, Ann. Physik 1948, 437, 55. 。当两发色团都为荧光体，则该机理也称荧光共振能量转移，尽管实际上能量并非通过荧光来完成转移。由于这一现象基于非辐射的能量传递，为了避免名称误导，我们更倾向于采用福斯特能量共振转移的命名方式，而非荧光共振能量转移，虽然大量科学文献偏爱后者。还应当注意，FRET不限于荧光。 它也可以与磷光有关。

 测量荧光共振能量转移效率的方法 
在荧光显微技术、荧光共聚焦激光扫描显微技术以及分子生物学中，荧光共振能量转移是用于量化在生物物理和生物化学中的分子动态的有效工具，如蛋白质互作、蛋白质-DNA互作、DNA-DNA互作以及蛋白质构象变化。为了监测两个分子的复合物形成，其中一个分子会被标记上荧光供体，而另一个会被标记上荧光受体。荧光共振能量转移效率被用于识别被标记复合物中的相互作用。下面展示几种由检测受体或供体荧光发射强度的变化来测量荧光共振能量转移效率的方法。

敏化发射

测量荧光共振能量转移效率的方法之一是测量受体荧光发射强度的变化。当供体与受体因分子间相互作用而处于邻近位置（1–10 nm）时，由于供体向受体的荧光共振能量转移，受体的发射会增强。当监测蛋白构象变化时，目标蛋白的两个位置会分别被标记上供体与受体。当蛋白的扭转或弯曲使供体与受体之间的距离或相对取向发生变化时，荧光共振能量转移的变化就能被观察到。如果某种分子相互作用或蛋白构象变化依赖于配体结合，那么该荧光共振能量转移技术也可用于配体检测的荧光指示剂。

寿命测量

荧光共振能量转移效率也可以由供体荧光寿命的变化测量。在受体存在的条件下，供体荧光的寿命会下降。荧光共振能量转移供体的寿命测量在荧光寿命成像显微镜（FLIM）中被使用。

 在细胞生物学中的定量应用与发展 

荧光共振能量转移（FRET）技术已从一种物理化学现象，发展成为生命科学，尤其是细胞信号转导研究中不可或缺的核心定量工具。其独特的距离依赖性和对分子相互作用的敏感性，使其能够揭示传统生化方法难以捕捉的、活细胞内动态、微弱且瞬时的生物过程。

 定量原理与关键参数 
FRET的效率公式  是其作为“分子尺”的定量基础。其中，（福斯特半径）是一个关键常数，通常为2-6纳米。当供体与受体间距  时，FRET效率为50%。该公式的“六次方反比”关系意味着效率对距离变化极端敏感。例如，当间距从增加到时，效率会从约98%急剧下降到约8%。这种敏感性使得FRET不仅能判断“有无结合”，更能定量监测构象变化的幅度或相互作用强度的细微变化。

除了光谱重叠和距离，偶极子相对取向（用取向因子κ²表示）是影响FRET效率的第三大要素。理论上，κ²的取值范围为0（垂直）到4（平行共线）。在生物体系中，荧光蛋白通常通过柔性连接子连接，其快速随机旋转使得κ²常被近似为2/3，这简化了活细胞中的定量分析。然而，在研究结构刚性或取向固定的系统时，必须考虑取向因子的影响。

 FRET生物传感器与在信号转导中的定量应用 
FRET生物传感器是将其应用于活细胞研究的桥梁。通过将信号分子敏感的感应域与FRET荧光蛋白对（如CFP/YFP、mCerulean/mVenus、或现代更优的mTurquoise2/sYFP2）进行基因编码融合，可将不可见的生化活动转化为可量化的荧光信号变化。

 第二信使动态定量：例如，基于钙调蛋白和M13肽的“Cameleon”系列传感器，其FRET效率变化与细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]）成比例，经过体外校准曲线换算，可直接报告胞内特定微域（如线粒体基质、核内）的钙浓度（单位：nM）及其瞬态动力学（毫秒级）。类似地，针对cAMP、IP3、DAG、H₂O₂等的FRET传感器，使得实时观测这些第二信使的时空波动成为可能。
 酶活性实时监测：以激酶活性传感器为例，其设计通常包含：供体荧光蛋白、可被特定激酶磷酸化的底物肽序列、以及结合磷酸化底物的受体结构域（如FHA、WW域）与受体荧光蛋白。当激酶被激活并磷酸化底物肽后，会引起受体结构域的结合，从而拉近供受体，导致FRET效率升高。通过连续记录FRET比率，可以以秒为单位定量描绘MAPK、PKA、PKC、Akt等关键信号通路在细胞迁移、分裂、凋亡等过程中的激活时空模式，甚至揭示细胞群体中的异质性响应。
 蛋白质相互作用与构象变化的直接成像：通过将供体和受体荧光蛋白分别标记在两个疑似互作的蛋白上，其FRET信号的产生直接证明了二者在活细胞内的物理接近与结合。同样，将FRET对标记在同一蛋白的不同结构域，可以监测该蛋白在信号刺激下发生的构象变化，如G蛋白偶联受体的激活、离子通道的开闭等。

 技术演进与新型检测模态 
为了克服传统强度型FRET易受激光功率、探针浓度、光漂白等因素干扰的缺点，一系列更稳健的检测与成像模态得到发展：
 荧光寿命成像FRET：FLIM-FRET通过测量供体荧光平均寿命的缩短来量化FRET效率。由于荧光寿命是分子的本征物理属性，不受探针浓度和激发光强影响，因此提供了更定量、更可靠的数据。
 受体光漂白FRET：通过选择性漂白受体，观察供体荧光强度的恢复程度来计算FRET效率，方法直接但属于终点法。
 光谱扫描与解卷积：使用光谱成像检测整个发射光谱，通过解卷积算法精确分离供体和受体的贡献，提高了定量精度。
 新型荧光蛋白与生物发光共振能量转移：开发具有更大斯托克斯位移、更高亮度和光稳定性的荧光蛋白对（如CyPet-YPet的优化变体）提高了信噪比。BRET利用生物发光蛋白（如Rluc）作为供体，无需外部激发光，彻底消除了自发荧光和光毒性的干扰，尤其适用于高通量药物筛选和体内成像。

 前沿应用拓展 
FRET的应用已远超基础研究，正向转化医学和精准医疗延伸。例如，基于FRET的HIV蛋白酶活性传感器可用于高通量筛选抗艾滋病药物；设计对特定肿瘤相关激酶异常激活敏感的FRET传感器，可用于癌症的早期诊断或预后评估；在神经科学中，多色FRET技术正在尝试同时解耦多个信号通路在同一神经元中的交叉对话。

总之，FRET已从一个描述能量转移的物理概念，演变为一套强大、多维、定量的活细胞“生理学检测工具箱”。它使我们能够以分子的视角、动态的维度、定量的语言，直观地“看见”并“解读”细胞信号转导这部复杂而精密的生命交响乐，持续推动着生命科学向更深处探索。

 参考 

延伸閱讀

 Recent advances in FRET: distance determination in protein–DNA complexes.  Current Opinion in Structural Biology 2001, 11(2), 201–207

外部連結

 Browser-based calculator to find the critical distance and FRET efficiency with known spectral overlap
 FRET description
 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy

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