Polimeraza zanjiri reaktsiyasi

Eng oddiy holatda PCR uchun quyidagi komponentlar talab qilinadi:

DNKni kuchaytirishga qo'shimcha ravishda, PCR nuklein kislotalar bilan boshqa ko'plab manipulyatsiyalarni amalga oshirishga imkon beradi ( mutatsiyalarni kiritish, DNK bo'laklarini birlashtirish) va biologik va tibbiy amaliyotda keng qoʻllanadi, masalan, kasalliklarni tashxislash (irsiy, yuqumli), otalikni aniqlash, genlarni klonlash, yangi genlarni ajratish.

 PCRni qo'llash 
1970-yillarning boshlarida Norvegiyalik olim   Nobel mukofoti laureati Hara Gobinda Korana laboratoriyasidan qisqa bir zanjirli DNK molekulalari - sintetik primerlar yordamida DNKni kuchaytirish usulini taklif qildi Kleppe, K. et al. (1971): Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases. In: J. Mol. Biol. Bd. 56, S. 341—361. PMID 4927950 . Biroq, o'sha paytda bu g'oya amalga oshmay qoldi. Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) 1983 yilda amerikalik biokimyogari Kari Mullis   tomonidan ixtiro qilingan. Uning maqsadi DNK polimeraza fermenti yordamida asl DNK molekulasining bir necha marta ketma-ket takrorlanishi paytida DNKni kuchaytirishga imkon beradigan usulni yaratish edi. PCR usuli bo'yicha birinchi nashr 1985 yil noyabr oyida Science Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Science 1985 Dec 20; 230 (4732): 1350-4; Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. jurnalida paydo bo'ldi. Usul molekulyar biologiya va tibbiyotda inqilob qildi. 1993 yilda Kari Mullis buning uchun kimyo bo'yicha Nobel mukofotini oldi [ Нобелевские лауреаты по химии, 1993 г.] .

Usulni qo'llashning boshida, har bir isitish-sovutish siklidan keyin reaktsiya aralashmasiga DNK polimeraza qo'shilishi kerak edi, chunki u DNK spiralining iplarini ajratish uchun zarur bo'lgan yuqori haroratda inaktivatsiya qilingan. Reaktsiya jarayoni nisbatan samarasiz bo'lib, ko'p vaqt va fermentni talab qiladi. 1986 yilda polimeraza zanjiri reaktsiyasi usuli sezilarli darajada yaxshilandi. Termofil bakteriyalardan DNK polimerazalaridan foydalanish taklif qilingan  . Bu fermentlar termostabil ekanligini isbotladi va ko'plab reaktsiya davrlariga bardosh bera oldi. Ulardan foydalanish PCRni soddalashtirish va avtomatlashtirish imkonini berdi. Birinchi termostabil DNK polimerazalaridan biri Thermus aquaticus bakteriyalaridan ajratilgan va <i id="mwMg">Taq</i> polimeraza deb nomlangan. Ushbu polimerazaning kamchiliklari noto'g'ri nukleotidni kiritish ehtimoli nisbatan yuqori, chunki bu fermentda xatolarni tuzatish mexanizmlari mavjud emas (3'→5'- ekzonukleaza faolligi). Arxeyadan ajratilgan polimerazlar   va Pwo, bunday mexanizmga ega; ulardan foydalanish DNKdagi mutatsiyalar sonini sezilarli darajada kamaytiradi, ammo ularning ish tezligi (protsessivlik) Taq dan past. Taq va Pfu aralashmalari endi polimerizatsiyaning yuqori tezligi va yuqori nusxa aniqligiga erishish uchun ishlatiladi.

Usul ixtiro qilingan vaqtda Keri Mullis PCR usulini patentlagan   da sintetik kimyogar (u oligonükleotidlarni sintez qilgan, keyinchalik genomik DNK bilan gibridlanish yo'li bilan nuqta mutatsiyalarini aniqlash uchun ishlatilgan) sifatida ishlagan. 1992 yilda Cetus Taq polimerazadan foydalanish uchun usul va patentga bo'lgan huquqlarni Hofmann-La Rochega 300 million dollarga sotdi. Biroq, Taq -polimeraza 1980 yilda sovet biokimyogarlari А. Калединым, А. Слюсаренко va С. Городецким tomonidan Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. // Биохимия. — 1980. — T. 45. — C. 644—651., shuningdek, ushbu sovet nashridan 4 yil oldin, ya'ni 1976 yilda amerikalik biokimyogarlar Elis tomonidan tavsiflanganligi ma'lum bo'ldi. Chien, Devid B. Edgar va Jon M. Trela Alice Chien, David B. Edgar и John M. Trela. Deoxyribonucleic Acid Polymerase from Extreme Thermophilic Thermus aquaticus. Jourmal of Bacteriology, Sept. 1976, pp. 1550—1557. . Natijada,   sudda Rocheni ushbu fermentga bo'lgan eksklyuziv huquqlaridan  voz kechishga majbur qilishga harakat qildi. PCR usuli uchun Amerika patentining amal qilish muddati 2005 yil mart oyida tugadi.

Usul DNK nuklein kislotasining ma'lum bir qismini fermentlar yordamida sun'iy sharoitda ( in vitro ) ko'p tanlab nusxalashga asoslangan. Bunda faqat ko'rsatilgan shartlarni qanoatlantiradigan maydon ko'chiriladi va faqat u o'rganilayotgan namunada mavjud bo'lsa. Tirik organizmlarda DNKni kuchaytirishdan ( replikatsiyadan ) farqli o'laroq, DNKning nisbatan qisqa qismlari PCR orqali kuchaytiriladi. An'anaviy PCR jarayonida replikatsiya qilingan DNK mintaqalarining uzunligi 3000 ta asosiy juftlikdan oshmaydi (3 kbp 1 kbp (англ. kilo base pair) — 1 тысяча пар оснований, единица измерения длины ДНК ). Har xil polimerazalar aralashmasi yordamida, qo'shimchalardan foydalangan holda va ma'lum sharoitlarda PCR fragmentining uzunligi 20-40 ming tayanch juftiga yetishi mumkin. Bu hali eukaryotik hujayraning xromosoma DNK uzunligidan ancha kichikdir. Masalan, odamlardagi eng qisqa yadro xromosomasining uzunligi (21-xromosoma) 46,71 million tayanch juft Venter J, et al. (2001). The sequence of the human genome. Science 291 (5507): 1304-51. PMID 11181995 .

 Reaktsiya komponentlari 
Reaksiya aralashmasi bug'lanishiga yo'l qo'ymaslik uchun probirkaga yuqori qaynaydigan yog', masalan, vazelin qo'shiladi. Agar isitiladigan qopqoq tsikli ishlatilsa, bu talab qilinmaydi.

 DNKning kuchaytirilishi kerak bo'lgan qismini o'z ichiga olgan DNK shabloni .
 Istalgan DNK fragmentining turli zanjirlarining qarama-qarshi uchlarini to'ldiruvchi ikkita primer .
 Termostabil DNK polimeraza DNK polimerizatsiyasini katalizlovchi fermentdir . PCRda foydalanish uchun polimeraza uzoq vaqt davomida yuqori haroratda faol qolishi kerak, shuning uchun termofillardan ajratilgan fermentlar qoʻllanadi - Thermus aquaticus ( <i id="mwbA">Taq</i> -polimeraza ),   ( Pfu -polimeraza), Pyrococcus woesei ( Pwo - polimeraza), Thermus thermophilus ( Tth -polimeraza) va boshqalar.
   nukleozid trifosfatlar (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
 Polimeraza ishlashi uchun zarur bo'lgan Mg 2+ ionlari.
 Bufer eritmasi zarur reaksiya sharoitlarini ta'minlaydi - pH, eritmaning ion kuchi . Tuzlarni o'z ichiga oladi, sigir sarum albumini .

PCR kuchaytirgichda - sinov naychalarini davriy sovutish va isitishni ta'minlaydigan qurilma, odatda kamida 0,1 ° S aniqlikda amalga oshiriladi. Zamonaviy sikllar murakkab dasturlarni o'rnatishga imkon beradi, shu jumladan "issiq start", Touchdown PCR (pastga qarang) va kuchaytirilgan molekulalarni 4 °C da keyinchalik saqlash. Haqiqiy vaqtda PCR uchun floresan detektor bilan jihozlangan qurilmalar ishlab chiqariladi. Asboblar avtomatik qopqoq va mikroplastinka bo'linmasi bilan ham mavjud bo'lib, ularni avtomatlashtirilgan tizimlarga birlashtirishga imkon beradi.

Pirofosfataza qo'shilishi PCR hosildorligini oshirishi mumkin. Bu ferment nukleozid trifosfatlarning ortofosfatga o'sib borayotgan DNK zanjiriga qo'shilishi natijasida hosil bo'lgan pirofosfat gidrolizini katalizlaydi. Pirofosfat PCRni inhibe qilishi mumkin  .

 Astarlar 
PCR ning o'ziga xosligi shablon va primerlar o'rtasida bir-birini to'ldiruvchi komplekslarning shakllanishiga asoslanadi, qisqa sintetik oligonükleotidlar uzunligi 18-30 asos. Primerlarning har biri ikki ipli shablonning zanjirlaridan biriga qo'shimcha bo'lib, kuchaytirilgan hududning boshi va oxirini cheklaydi.

Shablonni astar bilan gibridlashtirgandan so'ng (tavlanish Отжиг () — гибридизация фрагментов ДНК ), ikkinchisi shablonning to'ldiruvchi ipini sintez qilishda DNK polimeraza uchun primer bo'lib xizmat qiladi (1-rasmga qarang). quyida ).

Primerlarning eng muhim xarakteristikasi - primer-matritsa kompleksining erish harorati (T m ).

Tm - DNK shablonlarining yarmi oligonukleotid primeri bilan kompleks hosil qiladigan harorat. K + ionlari va DMSO kontsentratsiyasini hisobga olgan holda qisqa oligonükleotid (va uzoq DNK bo'laklari uchun) uchun T m ni hisoblashning o'rtacha formulasi:

  , qayerda  primerdagi nukleotidlar soni,  kaliy ionlarining molyar kontsentratsiyasi,  barcha guaninlar va sitozinlarning yig'indisidir.

Agar primerning uzunligi va nukleotid tarkibi yoki tavlanish harorati noto'g'ri tanlangan bo'lsa, shablon DNKning boshqa hududlari bilan qisman to'ldiruvchi komplekslarning shakllanishi mumkin, bu esa o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlarning paydo bo'lishiga olib kelishi mumkin. Erish nuqtasining yuqori chegarasi polimeraza ta'sirining optimal harorati bilan chegaralanadi, uning faolligi 80 °C dan yuqori haroratlarda tushadi.

Ikki zanjirli DNK shablonini 0,5-2 daqiqa davomida 94-96 °C (yoki ayniqsa termostabil polimeraza ishlatilsa 98 °C) gacha qizdiriladi. DNK zanjirlarini ajratish uchun. Bu bosqich eritish (   ) deb ataladi, chunki ikkita DNK zanjiri orasidagi vodorod aloqalari buziladi. Odatda, birinchi tsikldan oldin, shablon va primerlarning to'liq denatürasyonu uchun 2-5 daqiqa davomida reaktsiya aralashmasining uzoq isishi amalga oshiriladi.

 GC tarkibi ~ 40-60%;
 T m primerlarni yoping (farqlar 5 °C dan oshmaydi);
 o'ziga xos bo'lmagan ikkinchi darajali tuzilmalarning yo'qligi - soch iplari Шпилька — внутримолекулярная самокомплементарная структура va dimerlar Димер — межмолекулярные структуры, образуемые праймерами друг с другом или сами с собой ;
 guanin yoki sitozin 3' uchida maqsadga muvofiqdir, chunki ular shablon molekulasi bilan uchta vodorod aloqasini hosil qiladi, bu esa gibridlanishni yanada barqaror qiladi.


 Yuvish 
Kerakli mahsulotning o'sishi reagentlar miqdori, ingibitorlarning mavjudligi va qo'shimcha mahsulotlarning shakllanishi bilan eksponent ravishda cheklangan. Reaksiyaning so'nggi davrlarida o'sish sekinlashadi, bu "plato effekti" deb ataladi.

 Denaturatsiya 
Ikki zanjirli DNK shabloni 0,5-2 daqiqa davomida 94-96 °C (yoki ayniqsa termostabil polimeraza ishlatilsa 98 °C) ga qadar isitiladi. DNK zanjirlarini ajratish uchun. Bu bosqich eritish (   ) deb ataladi, chunki ikkita DNK zanjiri orasidagi vodorod aloqalari buziladi. Odatda, birinchi tsikldan oldin, shablon va primerlarning to'liq denatürasyonu uchun 2-5 daqiqa davomida reaktsiya aralashmasining uzoq isishi amalga oshiriladi.

 Yuvish 
Iplar ajratilganda, astarlarni bitta ipli shablonga bog'lash uchun harorat tushiriladi. Ushbu bosqich tavlanish deb ataladi. Yuvish harorati primerlarning tarkibiga bog'liq va odatda primerlarning erish haroratidan 5 daraja pastroq tanlanadi. Yuvish haroratining noto'g'ri tanlanishi yoki astarlarning shablonga yomon bog'lanishiga (yuqori haroratda) yoki noto'g'ri joyda bog'lanishiga va o'ziga xos bo'lmagan mahsulotlarning paydo bo'lishiga (past haroratda) olib keladi. Yuvish bosqichining vaqti - 30 soniya , shu bilan birga, bu vaqt ichida polimeraza allaqachon bir necha yuz nukleotidlarni sintez qilish uchun vaqtga ega. Shuning uchun, 60 °C dan yuqori erish nuqtasiga ega bo'lgan primerlarni tanlash va bir vaqtning o'zida 60-72 ° S da tavlanish va cho'zilishni amalga oshirish tavsiya etiladi.

 Cho'zilish 
DNK polimeraza primer sifatida primer yordamida shablon ipini takrorlaydi . Bu cho'zilish bosqichidir. Polimeraza qolipga bog‘langan primerning 3' uchidan ikkinchi ipning sintezini boshlaydi va shablon bo‘ylab harakatlanib, 5' uchidan 3' uchigacha bo‘lgan yo‘nalishda yangi ipni sintez qiladi. Cho'zilish harorati polimeraza bog'liq. Ko'p ishlatiladigan Taq va Pfu polimerazalari 72 °C da eng faoldir. Cho'zilish vaqti ham DNK polimeraza turiga, ham kuchaytirilayotgan fragment uzunligiga bog'liq. Odatda, cho'zilish vaqti har ming tayanch jufti uchun bir daqiqaga teng olinadi. Barcha tsikllar tugagandan so'ng, barcha bir ipli bo'laklarni bajarish uchun ko'pincha yakuniy cho'zilishning qo'shimcha bosqichi amalga oshiriladi. Ushbu bosqich 7-10 daqiqa davom etadi.

Muayyan reaksiya mahsulotining miqdori (primerlar bilan cheklangan) nazariy jihatdan 2 n - 2n ga mutanosib ravishda ortadi, bu yerda n - reaktsiya davrlarining soni  . Aslida, har bir tsiklning samaradorligi 100% dan kam bo'lishi mumkin, shuning uchun haqiqatda P ~ (1 + E) n, bu yerda P - mahsulot miqdori, E - tsiklning o'rtacha samaradorligi.

Agar shablonning nukleotidlar ketma-ketligi qisman ma'lum bo'lsa yoki umuman noma'lum bo'lsa, degeneratsiyalangan primerlardan foydalanish mumkin, ularning ketma-ketligi har qanday asoslar joylashishi mumkin bo'lgan degenerativ pozitsiyalarni o'z ichiga oladi. Masalan, primer ketma-ketligi quyidagicha bo'lishi mumkin: ...ATH... bu yerda H - A, T yoki C.

Kerakli mahsulotning o'sishi reagentlar miqdori, ingibitorlarning mavjudligi va qo'shimcha mahsulotlarning shakllanishi bilan eksponent ravishda cheklangan. Reaksiyaning so'nggi davrlarida o'sish sekinlashadi, bu "plato effekti" deb ataladi.

PCR "genetik barmoq izlari" deb ataladigan narsalarni solishtirish uchun ishlatiladi. Jinoyat joyidan genetik material namunasi zarur - qon, tupurik, sperma, soch va boshqalar. U gumon qilinuvchining genetik materiali bilan taqqoslanadi. Juda oz miqdordagi DNK etarli, nazariy jihatdan - bitta nusxa. DNK bo'laklarga bo'linadi, so'ngra PCR bilan kuchaytiriladi. Fragmanlar DNK elektroforezi yordamida ajratiladi. Natijada paydo bo'lgan DNK bantlarining joylashuvi  deb ataladi .

 Kriminalistika 

 Otalikni belgilash 
Genlarni klonlash (organizmlarni klonlash bilan adashtirmaslik kerak) - bu genlarni ajratib olish va genetik muhandislik manipulyatsiyasi natijasida ma'lum bir gen mahsulotining katta miqdorini olish jarayoni. PCR genni kuchaytirish uchun ishlatiladi, keyin u vektorga, DNKning bir qismiga, begona genni bir xil organizmga yoki o'sishi oson bo'lgan boshqa organizmga kiritadi. Vektor sifatida, masalan, plazmidlar yoki virusli DNK ishlatiladi. Genlarni begona organizmga kiritish odatda ushbu genning mahsulotini - RNKni yoki ko'pincha oqsilni olish uchun ishlatiladi. Shunday qilib, qishloq xo'jaligida, tibbiyotda va hokazolarda foydalanish uchun ko'plab oqsillar sanoat miqdorida olinadi.

 Tibbiy diagnostika 
PCR irsiy va virusli kasalliklar tashxisini sezilarli darajada tezlashtirish va osonlashtirish imkonini beradi. Kerakli gen, tegishli primerlar yordamida PCR bilan kuchaytiriladi va keyin mutatsiyalarni aniqlash uchun sekanslanadi. Virusli infektsiyalar infektsiyadan keyin, haftalar yoki oylar ( inkubatsiya davrining davomiyligiga qarab) kasallik belgilari paydo bo'lishidan oldin darhol aniqlanishi mumkin.

 Shaxsiylashtirilgan tibbiyot 
Ba'zida dorilar ba'zi bemorlar uchun toksik yoki allergiyaga olib keladi. Buning sabablari qisman dorilar va ularning hosilalarining sezuvchanligi va metabolizmidagi individual farqlarda. Bu farqlar genetik darajada aniqlanadi. Misol uchun, bir bemorda ma'lum bir sitoxrom (begona moddalar almashinuvi uchun javob beradigan jigar oqsili) faolroq bo'lishi mumkin, boshqasida - kamroq faol.

Hozirgi vaqtda PCR mutagenezni amalga oshirishning asosiy usuliga aylandi (DNKning nukleotidlar ketma-ketligiga o'zgarishlar kiritish). PCR dan foydalanish mutagenez jarayonini soddalashtirish va tezlashtirish, shuningdek, uni yanada ishonchli va takrorlanuvchan qilish imkonini berdi.

 DNK ketma-ketligi 
Floresan yorlig'i yoki radioaktiv izotop bilan belgilangan dideoksinukleotidlardan foydalangan holda sekvensiyalash usulida PCR ajralmas qismdir, chunki polimerizatsiya jarayonida floresan yoki radioaktiv yorliq bilan belgilangan nukleotidlarning hosilalari DNK zanjiriga kiritiladi. Sintezlangan ipga dideoksinukleotid qo'shilishi sintezni tugatib, jelda ajratilgandan so'ng o'ziga xos nukleotidlarning holatini aniqlashga imkon beradi.

 Molekulyar jinsiy aloqa 
PCR ning amaliy qo'llanilishining yana bir sohasi molekulyar   - erkaklar va ayollar o'rtasidagi DNK darajasidagi jinsiy farqlarga asoslangan jinsni aniqlash  .

 Sm. Shuningdek 

 Eslatmalar