SDS-PAGE

SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat–poliakrilamid jel Elektroforez) bir poliakrilamid jel elektroforez varyantı olan ve biyokimyada karışımlardaki yüklü molekülleri elektrik alan varlığında moleküler kütlelerine göre ayıran analitik bir metottur. Sodyum dodesil sülfat (SDS) molekülleri proteinlerin izolasyon ve tanımlanmasına yardım ederler.

Bu süreksiz elektroforetik sistemi Ulrich K. Laemmli  tarafından geliştirilmiştir. Bu teknik molekül kütlesi 5 ve 250 kDa arasında arasında olan proteinleri iyi ayırır. Bu metodu açıklayan makale, tek kişi tarafından yazılmış en çok atıf almış makale iken totalde ise ikinci en çok atıf almış makaledir.Neue Zürcher Zeitung: Interview with Ulrich Lämmli in German .

 Özellikleri 
SDS-PAGE proteinlerin moleküler kütlelerine göre ayrımına izin veren bir yöntemdir. Aynı zamanda matrix olarak bilinen medyum poliakrilamid temelli devamsız bir jeldir. Buna ek olarak, SDS kullanılır. Yaklaşık 1.4 gram SDS 1 gram proteine bağlanır,Smith, B. J. (1984). SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. 1. ss. 41–56. DOI:10.1385/0-89603-062-8:41.  yani her bir aminoasite 2 SDS molekülü bağlanmış olur. SDS yüzey aktif madde olarak davranır, proteinlerin kendi taşıdıkları yüklerin üzerini kaplar ve böylece proteinlerin kendi yükleri kaybolmuş ve ayrım yük temelinde gerçekleşmemiş olur. Ayrıca pozitif yükler de ayırma jelinin bazik pH'ı ile yüksek oranda indirgenir.Belli bir elektrik alanın varlığında proteinler anottan katoda doğru ilerler bu ilerlemenin hızı moleküler kütlenin büyüklüğü ile değişir. Bu basit prosedür proteinlerin moleküler kütle temelinde hassas ayrımına olanak sağlar.
küçükresim|sol|upright=1.25küçükresim|Bir proteinin SDS ile denaturasyonu|orta|upright=2.17

 Prosedür 
SDS-PAGE metodu jelin hazırlanması, numunenin hazırlanması, elektroforez, protein boyama veya western blot ve oluşan bantların incelenmesinden ibarettir.

 Jel üretimi 
küçükresim|Farklı sayıda cep içeren numune tarakları, Çekildiğinde her çatal jelde bir cep bırakır.|upright=0.81|sol

Jel, readikal polimerizasyonu ile birbirine mühürlü iki cam parçasından oluşan kalıbın içinde oluşur. Bu iki cam parçası maşalar yardımı ile geçici olarak mühürlenir. Jel solusyonu monomer olan acrilamid, çapraz bağlardan sorumlu metilenbisacrilamid, yarılma ve sıkışma tamponları, su ve SDS' ten ibarettir. TEMED katalizörü ve başlatıcı amonyum persülfat (APS) ortama eklemek polimerizasyonu başlatır.

küçükresim|Tarağı (beyaz renk) kaldırmadan önceki polimerize olmuş sıkışma ve ayırma jeli. Sıkışma jelinde küçük bir miktar bromofenol mavisi vardır. Bu boya gözlem yapmayı kolaylaştırır. Ayırma jeli ise boyanmamıştır.|sol

 Numune hazırlama 
küçükresim|DDT tarafından disulfidin indirgenmesi 

Numune hazırlamada, numune tamponu ve SDS çok miktarda numuneye uygulandıktan sonra numune 95 °C' de 5 dakika ısıtılır. Bu işlemler hidrojen bağlarını yıkarak 2. ve 3. yapıları bozar. Posiyonel olarak disülfid bağları indirginme ile kırılabilir. Bu amaçla, β-merkaptoetanol (β-ME 5% (v/v)), ditiotireitol (DTT, 10 milimolar) veya ditioeritiritol (DTE, 10 millimolar) gibi indirgen tioller numune tamponuna eklenir. Oda sıcaklığında soğutma sonrasında numune daha önceden elektroforez tamponuna batırılmış jeldeki ceplere yüklenir. Numunelere ek markır yüklenir. Bu metot ±10% yanılma payına sahiptir.

 Elektroforez 
küçükresim|Elektroforezin birkaç dakika ardından çekilmiş eletroforez makinesinin fotoğrafı. İlk cebe markır olan bromofenol konulurken diğerlerine numuneler brom krezol yeşiline eklenir.|sol

 Jel boyama 
küçükresim|
Coomassie-boyalı 10% Tris/Tricine Jel. Sol şeritte moleküler kütleyi belirleyen marker mevcuttur. Kalan şeritlerde saflaştırılmış maya proteinlerinde ayrılma gerçekleşmektedir.|sol

 Moleküler kütle hesabı 
küçükresim|Log M/Rf standard eğrisi. Bu eğri yardımı ile moleküler kütlesi bilinmeyen proteinin kütlesine ulaşılır.|sol

 Dış bağlantılar 

 OpenWetWare: protocol for BisTris SDS-PAGE 

 Kaynakça 

Kategori:Kısaltmalar
Kategori:Elektroforez