Mikrosatelit

Mikrosatelitler (mikro uydu), Basit dizi tekrarları veya Kısa Bitişik Tekrarlar, DNA'da bulunan, 1-6 baz çifti uzunluğundaki tekrar eden dizilerdir.

Mikrosatelitler genetik anlamda nötral ve eş-baskındır (codominant). Genetikte bunlar akrabalık ve topluluk araştırmaları için moleküler belirteç (marker) olarak kullanılır. Ayrıca gen duplikasyonu (ikilemesi) ve delesyonlarının (eksilmelerinin) araştırılmasında kullanılırlar.

Mikrosatelitlerin yaygın bir örneği (CA)n tekrarıdır, burada n, aleller arasında farklılık gösterir. Bu belirteçler genelde hem bir canlı türündeki farklı bireyler arasında, hem de farklı türler arasında yüksek derecede polimorfizm (çok biçimlilik) gösterir, özellikle bitişik tekrarların sayısı 10'un üstünde olursa. Tekrar eden dizi genelde basittir, iki, üç veya dört nükleotitten oluşur (bunlara, sırasıyla, di-, tri-, ve tetranükleotit tekrarları denir) ve bunlar 10 - 100 kere terar edilebilirler. CA nükleotit tekrarları insan ve diğer canlıların genomlarında oldukça sık görülür ve birkaç bin baz çiftinde bir bulunurlar. Belli bir mikrosatelit lokusunda (genetik konumunda) pek çok alel olduğu için, pedigrelerin genotipleri genelde tamamen ayırt edilebilir, yani belli bir alelin hangi ebeveynden geldiğini tespit etmek mümkündür. Bu yüzden, babalık tespiti, popülasyon genetiği araştırmaları ve rekombinasyon haritalaması için mikrosatelitler idealdir. Ayrıca, bunlar hangi alellerin evrimsel olarak birbiriyle yakın ilişkili olduğu hakkında ipucu verebilen bir moleküler belirteçtir.

Mikrosatelitlerin çeşitliliğinin nedeni, DNA'nın diğer nötür bölgelerine kıyasla daha yüksek bir mutasyon oranına sahip olmalarıdır. Bu yüksek mutasyon oranının başlıca açıklaması, DNA ikileşmesi sırasında bir DNA ipliğinin kayıp öbürüyle yanlış baz eşleşmesi yapmasıdır (kaymış iplikle eşleşme hatası, İng. slipped strand mispairing). Mayoz sırasında rekombinasyon yoluyla da bu mutasyonlar meydana gelebilir. Kaymaktan kaynaklanan hatalar biyoloji prova okuma ile düzeltilebilir ama bazı hatalar tamir sürecini atlatabilirler. Tekrarlayan birimin büyüklüğü, tekrarların sayısı ve varyant tekrarların varlığı, ayrıca DNA tekrarlarının olduğu bölgedeki transkripsiyonun sıklığı, hata oluşma oranını etkiler. Mikrosatelitlerin bir insersiyon sonucu aralanması polimorfizmin azalmasına yol açabilir.

Mikrosatelitlerin amplifikasyonu
Mikrosatelitler polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile çoğaltılarak teşhis edilebilir, bunun için iki yanındaki eşsiz (unique) diziler primer olarak olarak kullanılır. Bu yöntemle çok ufak miktarda DNA üssel şekilde çoğaltılarak sonunda jel elektroforezi ile görülebilecek kadar çok miktarda elde edilebilir. PCR teknolojisinin yaygınlaşması sayesinde bu yöntemi uygulamak kolaydır ama belli bir mikrosatelit bölgesini çoğaltmak için gerekli primerler bilinmiyorsa bunların tasarlanması zahmetli ve masraflı bir işlemdir.

Mikrosatelit primerlerinin tasarımı 
Genomun belli bir bölgesine (örneğin bir genin eksonuna) ait mikrosatelit belirteçleri (markerleri) için kullanılacak primerler elle tasarlanabilir. Bunun için önce genomik DNA'da mikrosatelitler aranır, bu işlem gözle veya otomatik araçlar ile (repeat masker  gibi) yapılabilir. Tekrarlı bölge içinde rastgele insersiyonlar içerenler faydalı değildir. Faydalı olabilecek mikrosatelitler belirlendikten sonra bunların böğüründeki (iki yanındaki) diziler, PCR yoluyla bu mikrosatelitin çoğaltılması için kullanılabilecek oligonükleotit primerlerin tasarlanmasında kullanılır.

Bir diğer yol, rastgele mikrosatelit primerleri bulmaktır. Bunun için söz konusu türe ait rastgele DNA parçaları uygun bir plazmid veya bakteriyofaj vektör içine klonlanır ve Escherichia coli bakterisi içine yerleştirilir. Koloniler büyütülür ve mikrosatelit tekrar dizisine spesifik şekilde hibridize olacak, fluoresan işaretli oligonükleotitler kullanılarak taranır. Eğer klonlanmış DNA parçasından bu mikrosatelit varsa onu taşıyan koloniler fluoresan görünürler. Bu yolla pozitif klonlar elde edilebilirse klonlanmış DNA dizilenir ve mikrosatelit bölgesinin böğüründeki dizilerden PCR primerleri seçilir. Bu yöntem epeyce deneme yanılma gerektirir çünkü, birincisi, mikrosatelit tipinin doğru tahmini gerekir ve ikincisi, bulunan mikrosatelit bölge işe yarar derecede polimorfizm göstermiyebilir. Mikrosatelit lokusları genomda yaygın şekilde bulunurlar ve PCR ile çoğaltılabilecek uygun bir substratın varlığı onların tespiti için yeterlidir. Bu yüzden, eski numunelerde bulunan yarı bozunmuş DNA'daki mikrosatelit alelleri dahi PCR sayesinde teşhis edilebilirler.

Daha yeni tekniklerde, mikrosatelit tekrarlarına komplemanter oligonükleotitler kullanılarak özütlenen DNA "zenginleştirilir". Oligonükleotit prob, mikrosatelitin tekrar dizisi ile hibridize olur ve sonra bu prob/mikrosatelit kompleksi çözeltiden çıkarılır. Zenginleştirilmiş DNA sonra normal yolla klonlanır ama başarı oranı çok daha yüksektir ve kullanılacak bölge için PCR primer tasarımı için gereken zaman önemli derecede azaltılabilir. Ancak, kullanılacak probun seçimi gene de deneme yanılmaya dayanır.

ISSR-PCR
ISSR (İngilizce inter-simple sequence repeat, "kısa dizi tekrarları arası") mikrosatelit lokusları arasındaki genom bölgeleri için kullanılan bir genel terimdir. İki komşu mikrosatelitin komplementer dizileri PCR primerleri olarak kullanılır ve aralarındaki değişken bölge çoğaltılır. PCR programında uzatma bölümünün kısa süreli tutulması nedeniyle çok uzun DNA dizileri çoğalmaz, elde edilen ürün genelde kısa ama çeşitli uzunluklarda olan DNA parçalarından oluşur.Gupta, M., Y.-S. Chyi, J. Romero-Severson, and J. L. Owen. 1994. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats. Theor Appl Genet 89:998-1006. no PMID

ISSR-PCR ile çoğaltılan diziler DNA parmakizlemesinde kullanılabilir. ISSR bölgesindeki dizinin evrimsel olarak korunmuş olma olasılığı vardır, bu yüzden kişileri ayırt etmekte kullanılmaz, onun yerine filo-coğrafî analizlerdeNagy, Z. T., U. Joger, D. Guicking and M. Wink. 2003. Phylogeography of the European whip snake Coluber (Hierophis) viridiflavus as inferred from nucleotide sequences of the mitochondrial cytochrome b gene and ISSR genomic fingerprinting. Biota 3:109-118. veya biyolojik türleri ayırt etmedeFritz, Uwe; Kiroký, Pavel; Kami, Hajigholi & Wink, Michael (2005): Environmentally caused dwarfism or a valid species - Is Testudo weissingeri Bour, 1996 a distinct evolutionary lineage? New evidence from mitochondrial and nuclear genomic markers. Molecular Phylogenetics and Evolution 37: 389–401.  kullanılır. Bu bölgelerdeki dizi çeşitliliği mikrosatelitlerdekinden daha düşüktür ama belli bir genin dizisindekinden daha fazladır. Mikrosatelit dizilemesi ve ISSR dizilemesi birbirini destekler çünkü birinin sağladığı bilgi ile öbürünün gerek duyduğu primerler üretilebilir.

Mikrosatelitlerin yetersizlikleri
Mikrosatelitler, özellikle popülasyon analizlerinde, moleküler belirteç olarak fayda göstermiş olmalarına rağmen belli yetersizlikleri de bulunmaktadır. Belli canlı türleri için geliştirilmiş olan mikrosatelitler genelde yakın ilişkili türlerde de kullanılabilir ama genetik uzaklık arttıkça başarılı şekilde çoğaltılabilen lokusların oranı azalabilir. Primerin hibridize olduğu yerdeki noktasal mutasyonlar sonucu mikrosatelit PCR ile çoğaltılamayabilir ve bir eksik alelden (İng. null allele) ayırdedilemeyebilir. Eksik aleller çeşitli olguların sonu olabilir. Böğür (iki yandaki) dizilerdeki evrimsel ıraksama yetersiz primer bağlanmasına neden olabilir, özellikle genin 3' bölgesinde, çünkü PCR reaksiyonun uzatma kısmı buradan başlar. PCR reaskiyonunun yarışmacı özelliğinden dolayı, belli uzunlukta alellerin tercihli çoğaltılması, heterozigot kişilerin homozigot (kısmi eksik) olarak kaydedilmesine 
neden olabilir. Belli aleller çoğalmayabilir, diğer alleler ise daha hızlı çoğalırsa reaksiyon ürünleri bir jelde homozigot gibi görünebilir, genomda gerçekten heterozigot olmalarına rağmen. Eksik aleller mikrosatelit alel sıklıklarının yorumlanmasını zorlaştırır ve akrabalık çıkarımlarının hatalı olmasına yol açabilir. Ayrıca, üreme sırasında meydana gelen rassal (stokastik) örneklem etkilerinin neden olduğu alel sıklıkları, yani Hardy-Weinberg denge beklentisinden sapmaya yol açan aşırı bir homozigot sıklığı, eksik alellerin etkisine çok benzer şekilde kendini gösterebilir. Eksik aleller teknik bir sorun iken, üreme sırasındaki örneklem etkileri bir topluluğun gerçek bir biyolojik özelliği olduğu için, aşırı sayıda homozigot bulununca bu iki olasılığın ayırt edilmesi çok önemlidir.

Mikrosatelitler kullanarak türler karşılıştırılınca, homozigot lokuslar ilişkili türlerde kolayca çoğaltılabilir ama söz konusu türler arasındaki genetik uzaklık arttıkça başarılı olarak çoğaltılabilen lokusların sayısı azalabilir. Mikrosatelitlerdeki mutasyonlar tarafgirdir (biased) çünkü büyük allelerde daha çok nükleotit vardır ve bunların DNA ikileşmesi sırasında hatalı kopyalanması daha olasıdır. Küçük aleller büyüme eğilimi gösterir, büyük alellere ise bir üst sınır etkisine maruz olap için kısalabilirler. Aleller arasında büyüklük farkı çoksa, mayoz sırasındaki rekombinasyonda instabilite olasılığı artabilir. Hücre bölünme kontrollerinin bozulmuş olduğu tümör hücrelerinde, mikrosatelitler her mitozda normal hücrelere kıyasla daha sık olarak uzayabilir veya kısalabilirler. Dolayısıyla bir tümör hücresi konak dokununkiden farklı bir genetik parmakizi gösterebilir.

Değişiklik mekanizması
Kısa tekrar dizileri genomun her tarafına dağılmışlardır.Kashi Y, King D, Soller M. 1997. Simple sequence repeats as a source of quantitative genetic variation. Trends Genet. 1997 Feb;13(2):74-8. PMID 9055609 Kısa dizi tekrarlarında uzunluk değişimlerinin en yaygın iki nedeni, 1) ikileşme kayması, yani mayoz sırasında DNA ikileşirken DNA iplikleri arasında hatalı eşleşmeler ve 2) rekombinasyondur.Li Y-C., et al. 2002. Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review. Mol. Ecol. 11:2453-2465 PMID 12453231Tautz, D. and Schlötterer, C. 1994. Simple sequences. Curr. Opin. Genet. Dev. 4:832-837. PMID 7888752 Tipik olarak, her bir mikrosatelitte yeni bir kayma olayı, yaklaşık 1000 nesilde bir meydana gelir.Weber, J. L. and Wong, C. 1993. Mutation of human short tandem repeats. Hum. Mol. Gen. 2:1123-1128. PMID 8401493 Genomun diğer bölgelerindeki noktasal mutasyonlara kıyasla kayma olayları bir mertebe (10 kat) daha sık olur.Pumpernik, D. et al., Replication slippage versus point mutation rates in short tandem repeats of the human genome. 2008. Mol. Genet. Genomics, 279 (1): 53-61. PMID 17926066 Çoğu kayma olayı tek bir tekrar biriminde bir değişikliğe yol açar, farklı tekrar birimi uzunlukları için kayma hızları farklıdır ve farklı biyolojik türlerde bu oranlar farklıdır.Kruglyak, S., et al. 1998. Equilibrium distributions of microstellite repeat length resulting from a balance between slippage events and point mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:10774-10778. PMID 9724780

 Proteinlerde
Memelilerde proteinlerin %20-40'ı, kısa dizi tekrarlarından kaynaklanan amino asit dizi tekrarları içerir.Marcotte, E. M., et al. 1998. A census of protein repeats. J. Mol. Biol. 293:151-160. PMID 10512723 Genomun protein kodlayıcı bölgelerindeki kısa dizi tekrarlarının tekrar edici birimlerinin çoğu üç nükleotitten oluşur, çünkü bu uzunluk çerçeve kayması mutasyonlarına neden olmaz.Sutherland, G. R., and Richards, R. I. 1995. Simple tandem DNA repeats and human genetic disease. Proc. Natl. Acad. Sci 92:3636-3641. PMID 7731957 Her bir trinükleotit tekrarlı dizi, aynı amino asitten oluşan bir tekrarlı dizi olarak çevrilir. Mayada en yaygın tekrar eden amino asitler glutamin, glutamik asit, asparajin, aspartik asit ve serindir. Bu tekrar eden bölgeler proteinlerin fiziksel ve kimyasal özelliklerine etki edebilir, bazı durumlarda protein etkinliğinde dereceli ve öngörülebilir etkilere neden olabilirler.Hancock, J. M., and Simon, M. 2005. Simple sequence repeats in proteins and their significance for network evolution. Gene 345:113-118 PMID 15716087

Örneğin, Runx2 geninin bitişik tekrarlı bölgelerindeki uzunluk değişimleri, evcil köpeklerin (Canis familiaris) yüz uzunluğunda değişikliklere yol açar, daha uzun dizilerin daha uzun yüzlerle ilişkili olduğu bulunmuştur.Fondon, J. W. III, and Garner, H. R. 2004. Molecular origins of rapid and continuous morphological evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 1010:18058-18063. Bu ilişki başka Carnivora türlerinde de geçerlidir.Sears, K. E. et al. 2007. The correlated evolution of Runx2 tandem repeats, transcriptional activity, and facial length in Carnivora. Evol. & Dev. 9(6):555-565. PMID 17976052 HoxA13 genindeki polialanin dizilerindek uzunluk farklılıkları ise, insanlarda bir gelişimsel bozukluk olan el-ayak-genital sendromu ile bağlantılıdır.Utsch, B., et al. 2002. A novel stable stable polyalanine [poly(A)] expansion in the HoxA13 gene associated with hand-foot-genital syndrome: proper function of poly(A)-harbouring transcription factors depends on a critical repeat length? Hum. Gen. 110:488-494. PMID 12073020 X25 geninin ilk intronundaki GAA üçlü genişlemesi, genin transkripsiyonuna etki etmekte ve Friedreich Ataksisi bozukluğuna neden olmaktadır.Bidichandani, S. I., et al. 1998. The GAA triplet-repeat expansion in Friedreich ataxia interferes with transcription and may be associated with an unusual DNA structure. Am. J. Hum. Genet. 62:111-121 PMID 9443873 Asparajin sentetaz geninin ilk intronundaki bitişik tekrarlar akut limfoblastik lösemi ile ilişkilendirilmiştir (Akagi 2008). NOS3 geninin dördüncü intronundaki bir tekrar polimorfizmi bir Tunus toluluuğunda hipertansyon ile ilişkili bulunmuştur.Jemaa, R., et al. 2008. Association of a 27-bp repeat polymorphism in intron 4 of endothelial constitutive nitric oxide synthase gene with hypertension in a Tunisian population. Clin. Biochem. 42:852-856. PMID 19111531 EGFR geninde azalan tekrar uzunlukları osteosarkoma ile ilişkili olduğu bulunmuştur.Kersting, C., et al. 2008. Biological importance of a polymorphic CA sequence within intron I of the epidermal growth factor receptor gene (EGFR) in high grade central osteosarcomas. Gene Chrom. & Cancer 47:657-664. PMID 18464244 Başka amino asit üçlü uzunluk değişkliklerinin insanlarda 40'tan fazla nörolojik bozuklukla bağlantılıdır.Pearson, C. E., et al. 2005. Repeat instability: mechanisms of dynamic mutations. Nat. Rev. Gen. 6:729-742. PMID 16205713

İkileşme kaymasından kaynaklanan evrimsel değişiklikler daha basit organizmalarda da meydana gelir. Örneğin, mikrosatelit uzunluk değişimleri mayanın membran proteinlerinde yaygındır, bunlar hücre özelliklerinde hızlı evrimleşmeye olanak verir.Bowen, S. and Wheals, A. E. 2006. Ser//Thr-rich domains are associated with genetic variation and morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 23:633-640. PMID 16823884 Örneğin, FLO1 genindeki uzunluk değişiklikleri, hücrenin bir yüzeye yapışma derecesini etkiler.Verstrepen, K. J., et al. 2005. Intragenic tandem repeats generate functional variability. Nat. Gen. 37:986-990. PMID 16086015 Kısa dizi tekrarları patojenik bakterilerin yüzey proteinlerinde hızlı evrimsel değişikliklere yol açar, bir olasılıkla bunun nedeni konaktaki bağışıklık değişikliklerine ayak uydurmalarını sağlamasıdır.Moxon, E. R., et al. 1994. Adaptive evolution of highly mutable loci in pathogenic bacteria. Curr. Bio. 4:24-32. PMID 7922307 Bir mantar türünde (Neurospora crassa) görülen kısa dizi tekrarlarının uzunluk değişimleri onun sirkadyen saat döngüsünün süresini kontrol etmektedir.Michael, T. P., et al. 2008. Simple sequence repeats provide a substrate for phenotypic variation in the Neurospora crassa circadian clock. PLoS One 2:e795. PMID 17726525

Gen düzenlemesi
Promotör ve diğer gen düzenleyici bölgelerdeki mikrosatelitlerde uzunluk değişimleri gen ifadesini değiştirebilir. İnsan genomu düzenleyici bölgelerde pek çok (>16,000) kısa dizi tekrarlarına sahiptir, bunlar gen ifadesine evrimsel düzeyde etki eden "ayar düğmelerine" benzetilmiştir.Rockman, M. V. and Wray, G. A. 2002. Abundant raw material for cis-regulatory evolution in humans. Mol. Biol. Evol. 19:1991-2004. PMID 12411608 Ökaryotların promotör bölgeleri genomun diğer bölgelerine kıyasla mikrosatelit zenginidir ve bu genlerdeki mikrosatelit sayısındaki farklılıklar gen ifade hızını ve oradaki nükleozom dağılımını etkilemektedir.Vinces, M. D., et al. 2009. Unstable tandem repeats in promoters confer transcriptional evolvability. Science 324:1213-1216 PMID 19478187 Bunun sonucunda meydana gelen gen ifadesindeki çeşitlilikler, organizmanın evrimine etki edecek fenotipik değişikliklere yol açmaktadır. Örneğin, Haemophilus influenza bakterisindeki mikrosatelit değişimleri, promotör uzaklığını değiştirerek fimbria oluşumunu etkilemektedir.van Ham SM, van Alphen L, Mooi FR, van Putten JP. 1993. Phase variation of H. influenzae fimbriae: transcriptional control of two divergent genes through a variable combined promoter region. Cell. 73:1187-96. PMID 8513502 Kır sıçanlarında (Microtus ochrogaster) Vasopressin 1a reseptör geninin kontrol bölgesindeki mikrosatelitler onların sosyal davranışlarını ve tek eşlilik derecesini etkilediği gösterilmiştir.Hammock, E. A. D. and Young, L. J. 2005. Microsatellite instability generates diversity in brain and sociobehavioral traits. Science 308:1630-1634. PMID 15947188

Kaynakça

Ayrıca bakınız
Minisatelit
Satelit DNA
Genetik belirteç (marker)
Mobil eleman
Transposon
SINE (short interspersed repetitive elements)
LINE (long interspersed repetitive element)
Junk DNA
Değişken sayılı bitişik tekrarlar
Trinükleotit tekrar bozuklukları
Mikrosatelit instabilitesi
SSLP

 Konuyla ilgili yayınlar 
 Caporale, L. H. 2003. Natural selection and the emergence of a mutation phenotype: an update of the evolutionary synthesis considering mechanisms that affect genome variation. Ann. Rev. Micro. 57:467-485.  
 Kashi, Y., et al. 1997. Simple sequence repeats as a source of quantitative genetic variation. Trends Gen. 13:74-78.  
 Li Y-C., et al. 2003. Microsatellites within genes: structure, function and evolution. Mol. Bio. Evol. 21:991-1007.  
 Richard, G-F., et al. 2008. Comparative genomics and molecular dynamics of DNA repeats in Eukaryotes. Micr. Mol. Bio. Rev. 72:686-727. 

Dış bağlantılar
Mikrosatelitler hakkında:
 Microsatellite DNA Methodology 
Arama araçları : 
SSR Finder
 JSTRING - Java Search for Tandem Repeats in genomes
 Microsatellite repeats finder 
 MISA - MIcroSAtellite identification tool  
 MREPATT
 Mreps
 Phobos 
 Poly 
 Tandem Repeats Finder  
 STAR
 TandemSWAN 
 TRED 
 TROLL 
 SciRoKo 

Kategori:Genetik
Kategori:Tekrarlayan DNA dizileri