Protein fosforilasyonu

Protein fosforilasyonu, bir proteine bir fosfat grubu (PO4) eklenmesidir. Protein fosforilasyonu pek çok hücresel süreçte önemli bir rol oynar.

 Tarihçe 
1906'da Rockefeller Tıp Araştırma Enstitüsü'nde Phoebus A. Levene, vitellin adlı proteininde fosfat olduğunu bulduP.A. Levene and C.L. Alsberg, The cleavage products of vitellin, J. Biol. Chem. 2 (1906), pp. 127–133. ve 1933'te, Fritz Lipmann'la ortak çalışması ile, kazeinde fosfoserin bulunduğunu keşfetti.F.A. Lipmann and P.A. Levene, Serinephosphoric acid obtained on hydrolysis of vitellinic acid, J. Biol. Chem. 98 (1932), pp. 109–114. Ancak, Eugene P. Kennedy tarafından enzimatik protein fosforilasyonunun keşfedilmesine kadar yirmi yıl geçmesi gerekti.G. Burnett and E.P. Kennedy, The enzymatic phosphorylation of proteins, J. Biol. Chem. 211 (1954), pp. 969–980.

 İşlev 
Proteinlerin tersinir fosforilasyonu prokaryot ve ökaryotlarda görülen önemli bir düzenleyici mekanizmadır.A.J. Cozzon (1988) Protein phosphorylation in prokaryotes Ann. Rev. Microbiol. 42:97-125J.B. Stock, A.J. Ninfa and A.M. Stock (1989) Protein phosphorylation and regulation of adaptive responses in bacteria. Microbiol. Rev., p. 450-490C. Chang and R.C. Stewart (1998) The Two-Component System. Plant Physiol. 117: 723-731D. Barford, A.K. Das and MP. Egloff. (1998) The Structure and mechanism of protein phosphatases: Insights into Catalysis and Regulation Annu Rev Biophys Biomol Struct. Vol. 27: 133-164 Protein kinaz ve fosfataz denen enzimler bu düzenleme sürecinin fosforilasyon ve defosforilasyon kısımlarında rol oynarlar. Fosforilasyon ve defosforilasyon sonucu çoğu enzim ve reseptörün yapısında bir biçim (konformasyon) değişimi olur, bunun sonucu bunlar ya aktifleşir veya inaktifleşir. Ökaryotik proteinlerde fosforilasyonu genelde serin, treonin ve tirozin kalıntılarında olur. Prokaryotlarda bazik amino asitler olan histidin, lizin ve arjininde de fosforilasyon olur. Apolar bir amino asit kalıntısına bir PO4 grubunun eklenmesi, proteinin hidrofobik bir kısmının çok hidrofilik bir hâl almasına neden olabilir. Proteinin bu bölgesinin diğer hidrofobik ve hidrofilik bölgeleriyle etkileşimi değişir ve böylece protein yapısında biçimsel bir değişiklik meydana gelir.

Fosforilasyonun düzenleyici rolüne bir örnek, p53 tümör baskılayıcı proteinidir. p53 proteinin etkinliği çeşitli mekanizmalarla düzenlenirM. Ashcroft, M.H.G. Kubbutat, and K.H. Vousden (1999). Regulation of p53 Function and Stability by Phosphorylation. Mol Cell Biol Mar;19(3):1751-8. ve 18 farklı fosforilasyon konumu vardır. p53'ün etkinleşmesi hücre döngüsünü durdurur. Hücre hasar gördüğü veya hücrenin normal fizyolojisi bozulduğunda bu etkinleşme olur ve bunun sonucunda apoptozis meydana gelir.S. Bates, and K. H. Vousden. (1996). p53 in signalling checkpoint arrest or apoptosis. Curr. Opin. Genet. Dev. 6:1-7. Etkinsizleşme sinyalinin ardından protein defosforile olur ve çalışması durur. Bu mekanizma çoğu sinyal transdüksiyonu yolunda görülür. Örneğin retinadaki ışığa duyarlı hücrelere gelen ışığa hücrenin tepki vermesinde de bu süreç vardır.

Fosforilasyonun düzenleyici rolleri arasında aşağıdakiler bulunmaktadır:
 Enerji gerektiren reaksiyonların biyolojik termodinamiği.
 Na+/K+-ATPaz enziminin fosforilasyonu, sodyum (Na+) ve potasyum (K+) iyonlarının hücre zarından taşınmasını düzenler. Hücrelerde osmotik düzenlemeyi sağlayan bu sistem, vücut suyunun homeostazında rol oynar.
 Enzim inhibisyonuna aracılık eder
 İnsülin sinyalizasyon yolunun bir parçası olarak, GSK-3 enziminin AKT (Protein kinaz B) tarafından fosforile olur.P.C. van Weeren, K.M. de Bruyn, A.M. de Vries-Smits, J. Van Lint, B.M. Burgering. (1998). "Essential role for protein kinase B (PKB) in insulin-induced glycogen synthase kinase 3 inactivation. Characterization of dominant-negative mutant of PKB. J Biol Chem 22;273(21):13150-6.
 Src adlı tirozin kinazının, Src C-ucu kinaz (C-terminal Src kinase ; Csk) tarafından fosforile edilmesi, enzimin yapısında biçimsel bir değişikliğe neden olur, protein katlanarak kendi kinaz bölgesini kapatır ve çalışmaz hale gelir.Cole, P.A., Shen, K., Qiao, Y., and Wang, D. (2003) Protein tyrosine kinases Src and Csk: A tail's tale, Curr. Opin. Chem., Biol. 7:580-585. 
 "Tanınma bölgeleri" (recognition domain) aracılığıyla protein-protein etkileşiminde önemlidir.
 Fagositik hücrelerde bulunan çok alt birimli büyük bir protein olan NADPH oksidaz'ın sitozolik altbirimlerinin fosforilasyonu, bu enzimin protein-protein etkileşimlerinin düzenlenmesinde önemli rol oynar.Babior, B.M., (1999). NADPH oxidase: an update. Blood 93, pp. 1464–1476
 Protein yıkımında önemlidir.
 Bazı proteinlerin fosforilasyonunun, bunların ATP-bağımlı ubikuitin/proteozom yoluyla yıkımına yol açar. Bu proteinler ancak fosforile oldukları zaman belli ubikuitin ligazlara substrat olurlar.

 Sinyalizasyon şebekeleri 
Sinyalizasyon yolu fosforilasyon olaylarını açığa kavuşturmak zor olabilir. Hücresel sinyal iletiminde, A proteini B proteini fosforile edebilir ve B de C'yi fosforile edebilir. Ama başka bir sinyalizasyon yolunda, protein D, protein A'yı veya protein C'yi fosforile eder. Fosforile olmuş proteinlerin araştırılması olan Fosfoproteomiks, proteomiks'in bir alt sahasıdır. Fosfoproteomiks gibi global yaklaşımlar ve kütle spektrometri yöntemleri kullanılarak fosforile proteinlerdeki zaman bağlı değişiklikler tespit edilip nicellenmektedir. Karmaşık fosforilasyon şebekelerinin anlaşılması için bu teknikler giderek daha fazla önem kazanmaktadır.J.V. Olsen, B.Blagoev, F. Gnad, B. Macek, C. Kumar, P. Mortensen, and M. Mann. (2006) Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell. 3;127(3):635-48.Y. Li-Rong, H.J. Issaq and T.D. Veenstra. (2007) Phosphoproteomics for the discovery of kinases as cancer biomarkers and drug targets. Proteomics Clin. Appl. 1, 1042–1057

 Protein fosforilasyon konumları 
Bir hücre içinde binlerce fosforilasyon yeri bulunmaktadır.Çünkü:
 Belli bir hücre (örneğin bir lenfosit) içinde binlerce farklı tip protein bulunmaktadır.
 Belli bir fizyolojik haldeki hücredeki proteinlerin 1/10 ila 1/2'si fosforiledir.
 Belli bir proteinde birden çok fosforilasyon yeri vardır.

Belli bir proteinin belli bir konumunun fosforilasyonu onun işlevini veya lokalizasyonu değiştirebildiği için, hücrenin "hal"inın anlaşılması hücredeki proteinlerin fosforilasyon durumunun bilinmesini gerektirir. Örneğin, AKT proteinin serin-473 ("S473") amino asidinin fosforile olmuşsa, AKT genelde bir kinaz olarak etkinleştirilmiş demektir. S473 fosforile olmamışsa AKT inaktif bir kinazdır.

 Fosforilasyon tipleri 
Farklı fosforilasyon tipleri için ayrıca kinaz maddesine bakınız.

Bir proteinde fosforilasyon birkaç farklı amino asitte meydana gelebilir. Serin fosforilasyonu en sık görülür, bunu treonin fosforilasyonu izler. Tirozin forforilasyonu nispeten daha enderdir. Ancak, tirozin fosforile proteinlerin antikorlarla saflaştırılması göreli daha kolay olduğu için, tirozin fosforilasyon konumları daha iyi bilinmektedir. Histidin ve aspartat fosforilasyonu prokaryotlarda iki bileşen sinyalizasyonunda ve ökaryotlarda bazı sinyal transdüksiyon yollarında görülür.

 Tespit ve karakterizasyon 
Antikorlar bir proteinin belli bir konumda fosforile olup olmadığını tespit etmek için kullanılan etkili gereçlerdir. Antikorlar proteinin fosforile olmaktan kaynaklanan değişik biçimlerine (konformasyonlarına) bağlanabilirler ve böylece bunların varlığını tespitte kullanılabilirler. Böylesi antikorlar fosfo-spesifik antikor olarak adlandırılır; bu tür yüzlerce antikor mevcuttur. Temel araştırmada ve klinik tanı koyma amaçlı testlerde bunlar vazgeçilmez ayıraçlardır.

küçükresim|2-boyutlu jel elektroforezinde tespit edilmiş çevrim sonrası bir değişiklik örneği (benek sınırları analiz yazılımı tarafından çizilmiştir, analiz kütle spektrometresi ile yapılmıştır; P46462, proteinin Expasy veritabanındaki kimlik numarasıdır) Çevrim sonrası değişim izoformları İki-boyutlu jel elektroforeziyle kolaylıkla tespit edilebilir. Serin, treonin ve tirozin, fosforile olunca nötür hidroksil gruplarının yerini negatif yüklü fosfat grupları alır. Bu fosfat gruplarının pK'ları 1,2 ve 6,5 dolayındadır, dolayısıyla pH 5,5 altında fosfatlar bir negatif yük ekler, ph 6,5 civarında 1,5 negatif yük, pH 7,5 üzerinde 2 negatif yük eklerler. Her bir izoformun göredeli oranı, 2 boyutlu  jeldeki protein beneklerinin göreceli boyanma miktarını ölçerek kolayca belirlenebilir.

Son yıllarda kütle spektrometrisi ile yapılan büyük çaplı analizler ile protein fosforilasyon konumları belirlenmektedir. Bu yöntemle daha evvelden bilinmeyen binlerce fosforilasyon yeri tespit edilmiştir. Kütle spektrometrisi bu tür analizler için idealdir çünkü bir fosfat grubunun eklenmesi proteinin kütlesi artırır. Ancak, bu tür çalışmalar için kütle ölçümlerindeki hata oranının çok düşük olması gerekmektedir, bu yüzden bu teknoloji ancak yüksek kaliteli kütle spektrometresine sahip laboratuvarlarda yapılabilmektedir.

Fosforilasyon konumlarının ayrıntılı bir karakterizasyonu çok zordur ve protein fosforilasyonunun nicelenmesi için dahili izotopik standartlar kullanmak gerekir. Göreceli bir niceleme için çeşitli diferansiyel izotop işaretleme yöntemleri kullanıllabilir.

 Dış bağlantılar 
 Mammalian Phosphorylation Resource, fosfo-spesifik antikorlar hakkında bilgileri bütünleştiren bir site
 deltaMasses kütle spektrometresi ile fosforilasyon tespiti ve fosforilasyon konum belirlenmesi 
 Hücrelerdeki bir hedef proteinin konuma özel fosforilasyonunun işlevsel analizi (bir deney protokolu)

 Kaynakça 

Kategori:Hücre biyolojisi
Kategori:Hücre sinyalizasyonu
Kategori:Fosfor
Kategori:Posttranslasyonel modifikasyon