Polimeraz zincir reaksiyonu

Polimeraz zincirleme tepkimesi (polymerase chain reaction - PCR), DNA içerisinde yer alan, dizisi bilinen iki segment arasındaki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir.

Metot basitçe tüp içerisinde nükleik asitlerin uygun koşullarda çoğaltılması esasına dayanır. Bir çeşit "in vitro klonlama" olarak da tanımlanan PCR; 94 °C-98 °C aralığında gerçekleştirilen denatürasyon, kullanılan başlatıcı diziye bağlı olarak 55 °C-72 °C aralığında gerçekleştirilen tavlama (İng. annealing) ve 72 °C'de gerçekleştirilen sıcaklığa dirençli bir DNA polimeraz olan Taq polimerazın kullanıldığı uzama aşamalarından oluşur ve bu döngülerin belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır. Dr. Kary B. Mullis 1980'li yıllarda yaptığı PCR çalışmaları ile 1993 yılında Kimya alanında Nobel Ödülü almıştır.

PCR yaygın olarak tıbbi ve biyolojik araştırma laboratuvarlarında kalıtsal hastalıkların teşhisi, genetik parmak izlerinin tanımlanması, bulaşıcı hastalıkların teşhisi, genlerin klonlanması, babalık testi ve DNA hesaplaması gibi değişik konularda yaygın bir şekilde kullanılmaktadır.

PCR yöntemine dayalı olarak birçok primer olarak adlandırılan başlatıcı DNA dizileri geliştirilmiştir. Bu başlatıcı DNA'lar belli dizilere sahip ve sentetik olarak üretilebilen moleküllerdir. Günümüzde başlatıcı diziler çoğaltılacak olan DNA dizisi için özellikle tasarlanır. PCR'a dayalı ARMS, RAPD, AFLP, SSR ve ISSR gibi çeşitli moleküler teknikler geliştirilmiştir. Bu teknikler birçok bitki ve hayvanda genetik akrabalığın teşhisinde tür içi ve türler arasında kullanılmaktadır.

 Aşamalar 
PCR yöntemi, genellikle yaklaşık 30 denatürasyon-tavlama-uzama döngüsünden oluşmakla birlikte döngülerden önce yaklaşık 5 dakikalık bir denatürasyon süreci ve sonrasında yine yaklaşık 5 dakikalık bir uzama süreci içerir. Bu süreçler PCR'dan önce DNA zincirlerinin birbirinden ayrılmış olduğundan ve sonrasında zincirlerin tamamlandığından emin olunmasını sağlar.

 Denatürasyon 
DNA dizisinin çoğaltılması için iki zincirin ayırılması gerekmektedir, bunun için de 20-30 saniye boyunca yaklaşık 95 °C sıcaklıklarına maruz bırakılması gerekmektedir. Çoğu enzim bu sıcaklıklarda denatürasyona uğrayacağı için kullanılamaz. PCR yönteminin gelişmesinde en büyük katkıyı kullanılan yüksek sıcaklıklara dayanabilen Taq polimeraz enziminin bulunması yapmıştır. Bu enzim ilk olarak Yellowstone Millî Parkı'nda bir kaplıcada yaşayan Thermus aquaticus bakterisinden izole edilmiştir.

 Tavlama 
Tavlama sıcaklığı genellikle başlatıcı dizilerin erime sıcaklığının, yani DNA zincirinden ayrıldığı sıcaklığın (Tm, İng. primer melting temperature) 5 °C altında olacak şekilde ayarlanır, böylece başlatıcı dizinin özel olarak hedef DNA zincirine bağlanıp diğerlerine bağlanmaması sağlanır. Bu sıcaklık guanin ile sitozinin üçlü hidrojen bağı kurup adenin ile timinin ikili hidrojen bağı kurması nedeniyle başlatıcı dizideki AT/GC yüzdesine bağlıdır. Kısa diziler için Tm=2(A+T)+4(G+C) olarak hesaplanabilirken 13 nükleotitten uzun başlatıcı diziler için Tm=64,9+41(G+C-16,4)/(toplam nükleotit sayısı) olarak hesaplanabilir. Tavlama aşaması yaklaşık 20-60 saniye sürer.

 Uzama 
Uzama için Taq polimeraz enziminin en iyi çalıştığı sıcaklık olan 72 °C kullanılır. Uzama süresi ise çoğaltılacak olan DNA zincirinin uzunluğuyla doğru orantılı olup bin baz çifti başına 10 saniye ile 1 dakika arasında değişir.

 Çeşitler 

 Ters transkriptaz PCR (RT-PCR) 
RT-PCR DNA yerine bir mRNA dizisinin çoğaltılmasını sağlamak için kullanılan PCR yöntemidir. Bu yöntemde ters transkriptaz (İng. reverse transcriptase, RT) enzimi mRNA dizisini cDNA (İng. complementary DNA, tamamlayıcı DNA) dizisine dönüştürmek için kullanılır ve cDNA üzerine PCR uygulanır. Bir adımlı ve iki adımlı olarak ayrılır. Ters transkriptaz enzimi için başlatıcı dizi olarak duruma bağlı olacak şekilde rastgele heksamerler, oligo-d(T) dizileri ya da özel hazırlanmış diziler kullanılabilir. Bir adımlı RT-PCR'da özel başlatıcı diziler kullanılmalıdır çünkü hem mRNA hem de cDNA dizilerine bağlanmaları gerekmektedir. Buna karşın, iki adımlı RT-PCR'da ters transkripsiyon ve PCR aşamaları ayrı başlatıcı diziler kullanılarak sırayla yapılır ve ters transkripsiyon adımı için üç çeşit başlatıcı diziden herhangi biri kullanılabilir.

 Nicel PCR (qPCR) 
Nicel (ing. quantitative) ya da gerçek zamanlı PCR yöntemi temel PCR yönteminin aksine sadece DNA'nın varlığını değil miktarını da bulmayı amaçlayan PCR yöntemidir. Çoğaltılan DNA'nın miktarını hesaplamak için DNA dizisine özel floresan boyalar kullanılabilir. RT-PCR ile beraber kullanıldığında qRT-PCR (İng. quantitative real-time PCR) olarak bilinir ve mRNA miktarını, dolayısıyla gen ifadesini ölçmek için kullanılır.

 Multipleks PCR 
Multipleks PCR yönteminde birden fazla başlatıcı dizi çifti kullanılarak birden fazla dizi çoğaltılır. Tepkimenin istenen şekilde gerçekleşmesi için her dizi için dikkatli bir şekilde optimize edilmesi gerekir.

 Ayrıca bakınız 
 Gen yalıtımı
 Gen çoğaltımı
 Gen kuvvetlendirilmesi
 Rekombinant DNA teknolojisi
 Amplifikasyon Dirençli Mutasyon Sistemi (ARMS)

 Kaynakça 


Kategori:Biyoteknoloji
Kategori:Moleküler biyoloji
Kategori:Moleküler biyoloji teknikleri