การจำลองดีเอ็นเอ

การจำลองดีเอ็นเอ (DNA replication) คือกระบวนการที่เซลล์คัดลอกสารพันธุกรรมในรูปดีเอ็นเอเพื่อให้ได้โมเลกุลดีเอ็นเอชุดใหม่สำหรับการถ่ายทอดไปยังเซลล์ลูก ซึ่งเป็นขั้นตอนพื้นฐานก่อนการแบ่งเซลล์และมีความสำคัญต่อการคงอยู่ของข้อมูลพันธุกรรมในสิ่งมีชีวิตทุกโดเมน รวมถึงแบคทีเรีย อาร์เคีย และยูคาริโอต

โดยทั่วไปการจำลองดีเอ็นเอเกิดขึ้นในลักษณะ การจำลองกึ่งอนุรักษ์ (semiconservative replication) คือดีเอ็นเอที่ได้ใหม่แต่ละโมเลกุลประกอบด้วยสายเดิมหนึ่งสายและสายที่สังเคราะห์ใหม่หนึ่งสาย อาศัยหลักการเข้าคู่ของเบส (base pairing) เพื่อกำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์ของสายใหม่จากสายแม่แบบ

การจำลองเริ่มจากตำแหน่งเฉพาะบนจีโนมที่เรียกว่า ตำแหน่งกำเนิดการจำลอง (origin of replication) ซึ่งในยูคาริโอตมักมีหลายตำแหน่งต่อโครโมโซมเพื่อรองรับขนาดจีโนมที่ใหญ่และการจัดระเบียบของโครมาติน ขณะที่องค์ประกอบหลักของเครื่องจักรการจำลอง (replisome) และหลักการทำงานโดยรวมมีการอนุรักษ์ไว้ในสิ่งมีชีวิตหลายกลุ่มแม้รายละเอียดจะแตกต่างกัน กระบวนการสิ้นสุดเมื่อรอยแยกการจำลอง (replication forks) ที่เคลื่อนเข้าหากันมาบรรจบกัน ขั้นตอนดังกล่าวประกอบด้วยการสังเคราะห์สายดีเอ็นเอเสร็จสมบูรณ์ การถอดประกอบเครื่องจักรการจำลอง และการแยกโมเลกุลดีเอ็นเอลูกออกจากกัน

 หลักการพื้นฐานและคำศัพท์สำคัญ 
การจำลองดีเอ็นเออาศัยพื้นฐานโครงสร้างของดีเอ็นเอที่เป็นสายคู่ ซึ่งมีลำดับเบสเป็นคู่สมกัน (complementary) และวางตัวในทิศทางสวนทางกัน (antiparallel) นิวคลีโอไทด์ในแต่ละสายเชื่อมต่อกันด้วยพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ (phosphodiester bond) ส่วนเบสระหว่างสองสายยึดกันด้วยพันธะไฮโดรเจน (hydrogen bond) โครงสร้างนี้ทำให้เมื่อแยกสายดีเอ็นเอออกจากกัน แต่ละสายจะสามารถทำหน้าที่เป็น สายแม่แบบ (template strand) เพื่อกำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์ของ สายคู่สม (complementary strand) ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่ได้

หัวใจสำคัญของกระบวนการนี้คือ การจำลองกึ่งอนุรักษ์ (semiconservative replication) กล่าวคือ โมเลกุลดีเอ็นเอใหม่แต่ละโมเลกุลจะประกอบด้วยสายเดิมหนึ่งสายและสายที่สังเคราะห์ใหม่หนึ่งสาย ซึ่งเกิดจากการที่สายดีเอ็นเอเดิมแยกออกจากกันและต่างทำหน้าที่เป็นแม่แบบสำหรับการสร้างสายใหม่

ในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ เอนไซม์ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส (DNA polymerase) จะเติมนิวคลีโอไทด์ได้ในทิศทาง 5′ ไป 3′ เท่านั้น โดยต่อเพิ่มที่ปลาย 3′ ของสายที่กำลังสร้างใหม่ ส่งผลให้การอ่านสายแม่แบบต้องเกิดขึ้นในทิศทาง 3′ ไป 5′ นอกจากนี้ การเริ่มสังเคราะห์โดยทั่วไปจำเป็นต้องอาศัย ไพรเมอร์ (primer) ซึ่งเป็นสายโมเลกุลสั้น ๆ ที่มีปลาย 3′ เตรียมไว้ให้โพลีเมอเรสสามารถเริ่มต้นต่อสายได้

การจำลองมักเริ่มที่ ตำแหน่งกำเนิดการจำลอง (origin of replication) โดยโปรตีนเริ่มต้นจะเข้ามาจับและทำให้เกลียวดีเอ็นเอเปิดออก เมื่อดีเอ็นเอถูกคลายเกลียวและแยกสายจะเกิดโครงสร้างเรียกว่า รอยแยกการจำลอง (replication fork) ซึ่งเป็นบริเวณที่มีการสังเคราะห์สายใหม่เกิดขึ้น โปรตีนหลายชนิดจะเข้ามารวมตัวกันเป็นเครื่องจักรการจำลองเรียกว่า รีพลิโซม (replisome) ทำหน้าที่ประสานการคลายเกลียว การสังเคราะห์ และการจัดการโครงสร้างดีเอ็นเอระหว่างกระบวนการ

 ขั้นตอนของการจำลองดีเอ็นเอ 
 ภาพรวม 
กระบวนการจำลองดีเอ็นเอแบ่งออกเป็นขั้นตอนหลัก ได้แก่ การเริ่มต้น (initiation) การยืดสาย (elongation) และการสิ้นสุด (termination) กระบวนการเหล่านี้เกิดขึ้นที่รอยแยกการจำลอง (replication fork) โดยอาศัยการทำงานร่วมกันของโปรตีนและเอนไซม์ในกลุ่มรีพลิโซม (replisome) เพื่อประสานการคลายเกลียว การเริ่มสังเคราะห์จากไพรเมอร์ และการสร้างสายดีเอ็นเอใหม่ที่มีความต่อเนื่องและแม่นยำ

 การเริ่มต้น (initiation) 

 การจดจำตำแหน่งกำเนิดและการเปิดสายดีเอ็นเอ 
การจำลองเริ่มต้นที่ตำแหน่งกำเนิดการจำลอง (origin of replication) ซึ่งเป็นบริเวณที่โปรตีนเริ่มต้นจะเข้ามาจดจำและทำให้เกิดการเปิดสาย (strand opening) เพื่อสร้างจุดเริ่มต้นของรอยแยกการจำลอง ในแบคทีเรีย โปรตีนเริ่มต้นจำเพาะจะจับกับลำดับที่ตำแหน่ง origin และกระตุ้นให้เกิดการคลายเกลียวในบริเวณใกล้เคียง เพื่อให้เอนไซม์ฮีลิเคส (helicase) เข้าเกาะและเริ่มคลายเกลียวต่อไป เมื่อดีเอ็นเอถูกคลายเกลียว แรงบิดและความเค้นเชิงทอพอโลยี (topological stress) ที่สะสมอยู่ด้านหน้ารอยแยกจะถูกบรรเทาโดยเอนไซม์โทโพไอโซเมอเรส (topoisomerase) ช่วยให้รอยแยกเคลื่อนที่ต่อไปได้อย่างราบรื่น

 การประกอบคอมเพล็กซ์เริ่มต้นในยูคาริโอต 
ในยูคาริโอต การเริ่มต้นเริ่มจากการประกอบคอมเพล็กซ์โปรตีนที่ตำแหน่ง origin โดยมีกลไกควบคุมให้เกิด “การเริ่มต้นเพียงครั้งเดียวต่อรอบวัฏจักรเซลล์” (replication once per cell cycle) ผ่านกระบวนการเตรียมความพร้อม (licensing) ในช่วงเวลาที่เหมาะสม และการกระตุ้นให้ origin เริ่มทำงาน (origin firing) ในระยะ S ของวัฏจักรเซลล์ เพื่อป้องกันการจำลองซ้ำซ้อน เนื่องจากยูคาริโอตมี origin จำนวนมาก การเริ่มต้นจึงขึ้นอยู่กับการควบคุมตำแหน่งและเวลา (spatiotemporal regulation) ภายในจีโนม รวมถึงได้รับอิทธิพลจากสภาพของโครมาติน (chromatin) และโปรตีนควบคุมต่าง ๆ

 การยืดสาย (elongation) 
 การสังเคราะห์ในทิศทาง 5′→3′ และบทบาทของไพรเมอร์ 
เมื่อรอยแยกการจำลองเกิดขึ้น ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส (DNA polymerase) จะสังเคราะห์สายใหม่โดยการเติมนิวคลีโอไทด์ในทิศทาง 5′ ไป 3′ (ต่อเพิ่มที่ปลาย 3′) เท่านั้น ส่งผลให้การอ่านสายแม่แบบต้องเป็นไปในทิศทาง 3′ ไป 5′ นอกจากนี้ยังต้องอาศัยไพรเมอร์ (primer) เพื่อให้ปลาย 3′ สำหรับเริ่มการต่อสาย โดยทั่วไปไพรเมอร์จะถูกสร้างขึ้นโดยเอนไซม์ไพรเมส (primase) สำหรับในยูคาริโอตจะมีคอมเพล็กซ์ที่ทำหน้าที่สร้างไพรเมอร์และเริ่มยืดสายด้วยโพลีเมอเรสชนิดหนึ่ง ก่อนจะส่งต่อหน้าที่ให้โพลีเมอเรสอีกชนิดทำการยืดสายในระยะยาว

 สายอาศัยนำ (leading strand) 
สายอาศัยนำ (leading strand) คือสายที่มีทิศทางการสังเคราะห์เดียวกับการเคลื่อนที่ของรอยแยกการจำลอง จึงสามารถสังเคราะห์ได้อย่างต่อเนื่องเมื่อมีไพรเมอร์เริ่มต้นเพียงจุดเดียว โพลีเมอเรสจะยืดสายตามหลังการเปิดสายของฮีลิเคส โดยอาศัยโปรตีนช่วยเพิ่มความสามารถในการเกาะและสังเคราะห์ต่อเนื่อง (processivity) เช่น สไลดิงแคลมป์ (sliding clamp) และแคลมป์โหลดเดอร์ (clamp loader) ช่วยให้โพลีเมอเรสทำงานบนสายแม่แบบได้ยาวนานขึ้น

 สายอาศัยตาม (lagging strand) และชิ้นส่วนโอกาซากิ 
สายอาศัยตาม (lagging strand) มีทิศทางของสายแม่แบบสวนทางกับการเคลื่อนที่ของรอยแยก จึงไม่สามารถสังเคราะห์ต่อเนื่องได้เนื่องจากข้อจำกัดทิศทาง 5′→3′ ของโพลีเมอเรส ทำให้ต้องสังเคราะห์เป็นชิ้นส่วนสั้น ๆ ไม่ต่อเนื่อง เรียกว่า ชิ้นส่วนโอกาซากิ (Okazaki fragments) โดยแต่ละชิ้นส่วนต้องเริ่มจากไพรเมอร์ใหม่ ต้องอาศัยการประสานงานระหว่างการคลายเกลียว การวางไพรเมอร์ และการยืดสายซ้ำ ๆ เพื่อให้ทันกับการเปิดสายที่รอยแยก ในระหว่างนี้ โปรตีนจับดีเอ็นเอสายเดี่ยวจะช่วยคงสภาพสายแม่แบบ ป้องกันไม่ให้สายดีเอ็นเอกลับมาจับคู่กันเองหรือเกิดโครงสร้างทุติยภูมิที่รบกวนการทำงานของโพลีเมอเรส

 การกำจัดไพรเมอร์ การเติมช่องว่าง และการเชื่อมสาย 
เมื่อสังเคราะห์ชิ้นส่วนโอกาซากิเสร็จสิ้น จำเป็นต้องกำจัดส่วนที่เป็นไพรเมอร์ (มักเป็นอาร์เอ็นเอ) ออก และสังเคราะห์ดีเอ็นเอเติมลงในช่องว่างให้สมบูรณ์ จากนั้นเอนไซม์ดีเอ็นเอไลเกส (DNA ligase) จะเชื่อมรอยต่อระหว่างชิ้นส่วนให้เป็นสายเดียวกัน แม้รายละเอียดขั้นตอนจะแตกต่างกันในแบคทีเรียและยูคาริโอต แต่มีหลักการร่วมกันคือการปรับแต่งปลายสายและเชื่อมพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ให้ต่อเนื่องตลอดทั้งโมเลกุล

 การควบคุมความถูกต้องระหว่างการสังเคราะห์ 
ความถูกต้องของการจำลองขึ้นอยู่กับการเลือกนิวคลีโอไทด์ที่เข้าคู่กับเบสอย่างถูกต้อง ร่วมกับกลไกการพิสูจน์แก้ (proofreading) ของโพลีเมอเรสที่สามารถตัดนิวคลีโอไทด์ที่ผิดพลาดออกจากปลายสายที่กำลังสร้าง นอกจากนี้ยังมีระบบซ่อมแซมความไม่เข้าคู่ (mismatch repair) ภายหลังการสังเคราะห์ ซึ่งช่วยลดอัตราความผิดพลาดโดยรวมลงอีกระดับหนึ่ง

 การสิ้นสุด (termination) 
 การบรรจบของรอยแยกและการจัดการโครงสร้างหลังการจำลอง 
การสิ้นสุดมักเกิดขึ้นเมื่อรอยแยกการจำลองที่เคลื่อนที่เข้าหากันมาบรรจบกัน ทำให้การสังเคราะห์สายใหม่เสร็จสมบูรณ์ ขั้นตอนต่อมาคือการแยกชิ้นส่วนรีพลิโซมและการแยกโมเลกุลดีเอ็นเอลูกทั้งสองออกจากกัน ซึ่งต้องอาศัยการจัดการปัญหาทางโครงสร้างเกลียว (topological issues) เช่น การคลายปมหรือการเกี่ยวกันของสายดีเอ็นเอ เพื่อให้โมเลกุลแยกตัวและเข้าสู่กระบวนการแบ่งเซลล์ได้อย่างถูกต้อง

 การสิ้นสุดในแบคทีเรีย 
แบคทีเรียบางชนิดมีระบบกำหนดบริเวณสิ้นสุด (termination region) เพื่อจำกัดทิศทางการเคลื่อนที่ของรอยแยกให้มาบรรจบกันในจุดที่เหมาะสม รายละเอียดของโปรตีนและลำดับดีเอ็นเอที่เกี่ยวข้องจะแตกต่างกันไปตามชนิดของแบคทีเรีย โดยมักเกี่ยวข้องกับการประสานรอยแยกและการหยุดการทำงานของฮีลิเคสเมื่อกระบวนการจำลองสิ้นสุดลง

 โปรตีนและเอนไซม์ที่เกี่ยวข้อง 
 ภาพรวมของรีพลิโซม (replisome) 
รีพลิโซม (replisome) คือกลุ่มของโปรตีนและเอนไซม์ที่ทำงานร่วมกัน ณ รอยแยกการจำลอง (replication fork) เพื่อทำหน้าที่ประสานการคลายเกลียว การเริ่มสังเคราะห์จากไพรเมอร์ การยืดสายทั้งบนสายอาศัยนำและสายอาศัยตาม รวมถึงการประมวลผลชิ้นส่วนดีเอ็นเอให้ต่อเนื่อง แม้รายละเอียดจะแตกต่างกันในแบคทีเรีย อาร์เคีย และยูคาริโอต แต่องค์ประกอบหลักและหน้าที่โดยรวมมีความคล้ายคลึงกัน

 ดีเอ็นเอพอลีเมอเรส (DNA polymerase) 
ดีเอ็นเอโพลีเมอเรสเป็นเอนไซม์หลักในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ ทำหน้าที่เติมนิวคลีโอไทด์ที่ปลาย 3′ ของสายที่กำลังสร้างใหม่ ทำให้การสังเคราะห์เกิดขึ้นในทิศทาง 5′ ไป 3′ โดยเอนไซม์ส่วนใหญ่ไม่สามารถเริ่มสร้างสายใหม่ได้เอง จึงจำเป็นต้องอาศัยไพรเมอร์ (primer) เป็นจุดเริ่มต้น ในแบคทีเรียจะมีโพลีเมอเรสหลัก (replicative polymerase) ที่มีความสามารถในการเกาะและสังเคราะห์ต่อเนื่องสูง ส่วนในยูคาริโอตจะมีการแบ่งหน้าที่ให้โพลีเมอเรสหลายชนิดทำงานร่วมกัน ทั้งในการสังเคราะห์และการประมวลผลสายใหม่ เพื่อให้เหมาะสมกับบริบทของสายอาศัยนำ สายอาศัยตาม และโครงสร้างของโครมาติน

 ฮีลิเคส (helicase) และโปรตีนจับดีเอ็นเอสายเดี่ยว 
ฮีลิเคส (helicase) ทำหน้าที่คลายเกลียวและแยกสายดีเอ็นเอคู่ ณ รอยแยกการจำลอง โดยใช้พลังงานจากการไฮโดรไลซิส ATP เพื่อขับเคลื่อนการแยกสายอย่างต่อเนื่อง สร้างดีเอ็นเอสายเดี่ยวเพื่อเป็นแม่แบบสำหรับการสังเคราะห์ เนื่องจากดีเอ็นเอสายเดี่ยวมีแนวโน้มจะกลับมาจับคู่กันเองหรือเกิดโครงสร้างทุติยภูมิ จึงต้องมีโปรตีนจับดีเอ็นเอสายเดี่ยว (single-strand DNA-binding proteins หรือ RPA ในยูคาริโอต) เข้ามาเกาะเพื่อคงสภาพสายเดี่ยวไว้และเอื้อต่อการทำงานของเอนไซม์อื่น ๆ

 ไพรเมส (primase) และการสร้างไพรเมอร์ 
การเริ่มสังเคราะห์ดีเอ็นเอต้องอาศัยไพรเมอร์ (primer) เพื่อให้ปลาย 3′ แก่โพลีเมอเรส โดยเอนไซม์ไพรเมสจะทำหน้าที่สังเคราะห์ไพรเมอร์ (มักเป็นอาร์เอ็นเอสายสั้น ๆ) บนแม่แบบดีเอ็นเอ จากนั้นโพลีเมอเรสจึงจะเริ่มต่อสายดีเอ็นเอได้ สำหรับสายอาศัยตาม จำเป็นต้องมีการสร้างไพรเมอร์ซ้ำ ๆ เพื่อเริ่มต้นการสร้างชิ้นส่วนโอกาซากิแต่ละชิ้นตามจังหวะการเปิดสายที่รอยแยก

 สไลดิงแคลมป์ (sliding clamp) และแคลมป์โหลดเดอร์ (clamp loader) 
สไลดิงแคลมป์เป็นโปรตีนรูปวงแหวนที่โอบล้อมสายดีเอ็นเอ ช่วยยึดดีเอ็นเอโพลีเมอเรสให้เกาะกับแม่แบบได้อย่างมั่นคง เพิ่มประสิทธิภาพในการสังเคราะห์ต่อเนื่อง (processivity) โดยการนำแคลมป์ไปติดตั้งบนดีเอ็นเอต้องอาศัยแคลมป์โหลดเดอร์ ซึ่งใช้พลังงานจาก ATP ในการเปิดวงแหวนและสวมลงตรงรอยต่อระหว่างไพรเมอร์และแม่แบบ ขั้นตอนนี้มีความสำคัญมากโดยเฉพาะในสายอาศัยตามที่ต้องมีการติดตั้งแคลมป์ซ้ำ ๆ สำหรับทุกชิ้นส่วนโอกาซากิ

 โทโพไอโซเมอเรส (topoisomerase) 
การคลายเกลียวของฮีลิเคสทำให้เกิดการบิดเกลียวแน่น (supercoiling) และความเค้นเชิงโครงสร้างในดีเอ็นเอส่วนที่อยู่หน้ารอยแยก ซึ่งหากสะสมมากเกินไปจะขัดขวางการเคลื่อนที่ของรอยแยก โทโพไอโซเมอเรสทำหน้าที่ตัดและต่อสายดีเอ็นเอชั่วคราวเพื่อคลายปมและความเค้นดังกล่าว ช่วยให้กระบวนการจำลองดำเนินต่อไปได้

 ดีเอ็นเอไลเกส (DNA ligase) และเอนไซม์ประมวลผลไพรเมอร์ 
หลังจากสร้างชิ้นส่วนโอกาซากิเสร็จสิ้น จะต้องมีการกำจัดไพรเมอร์ เติมช่องว่างด้วยดีเอ็นเอ และเชื่อมต่อชิ้นส่วนให้เป็นสายเดียวกัน ดีเอ็นเอไลเกสทำหน้าที่เชื่อมรอยขาด (nick) บนกระดูกสันหลังของดีเอ็นเอด้วยพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์ ส่วนการกำจัดไพรเมอร์และการปรับแต่งปลายสายอาศัยการทำงานของเอนไซม์หลายชนิด ซึ่งแม้จะมีรายละเอียดต่างกันในแต่ละกลุ่มสิ่งมีชีวิต แต่มีเป้าหมายเดียวกันคือการสร้างโมเลกุลดีเอ็นเอที่สมบูรณ์ต่อเนื่อง พร้อมสำหรับการจัดระเบียบโครมาตินและการแบ่งเซลล์ต่อไป

 ความแม่นยำและการควบคุมการจำลอง 
 ความเที่ยงตรงของการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ 
การจำลองดีเอ็นเอจำเป็นต้องมีความเที่ยงตรง (fidelity) สูงเพื่อรักษาเสถียรภาพของจีโนม โดยทั่วไปอัตราความผิดพลาดสุทธิหลังจากผ่านกระบวนการคัดเลือกนิวคลีโอไทด์ การพิสูจน์แก้ (proofreading) และการซ่อมแซมความไม่เข้าคู่ จะต่ำมากเพียงประมาณ 1 ตำแหน่งต่อทุก ๆ 108–1010 นิวคลีโอไทด์ ทั้งในโพรแคริโอตและยูคาริโอต กลไกพื้นฐานที่กำหนดความเที่ยงตรงเริ่มจากการที่ดีเอ็นเอโพลีเมอเรสเลือกนิวคลีโอไทด์ให้เข้าคู่กับเบสบนสายแม่แบบได้อย่างจำเพาะ และหากเกิดการจับคู่ผิดจะส่งผลให้การต่อสายชะลอตัวลง ซึ่งเปิดโอกาสให้เกิดการแก้ไขก่อนที่จะมีการสังเคราะห์ต่อไป

การพิสูจน์แก้ (proofreading) คือกลไกตรวจสอบและแก้ไขความผิดพลาดระหว่างการสังเคราะห์ โดยอาศัยคุณสมบัติเอกโซนิวคลีเอสทิศทาง 3′→5′ (3′-to-5′ exonuclease activity) ของโพลีเมอเรส ซึ่งสามารถตัดนิวคลีโอไทด์ที่จับคู่ผิดออกจากปลายสายที่กำลังสร้างใหม่ได้ ช่วยเพิ่มความเที่ยงตรงได้อีกหลายเท่าทวีคูณ (orders of magnitude) เมื่อเทียบกับการคัดเลือกเบสเพียงอย่างเดียว ทั้งนี้ ความสามารถในการพิสูจน์แก้จะขึ้นอยู่กับชนิดของโพลีเมอเรสและบริบทของระบบการจำลองในสิ่งมีชีวิตแต่ละกลุ่ม

 การซ่อมแซมความไม่เข้าคู่หลังการจำลอง 
แม้จะผ่านการพิสูจน์แก้แล้ว ความผิดพลาดจากการจับคู่เบสบางส่วนอาจยังคงหลงเหลืออยู่ เซลล์จึงมีระบบการซ่อมแซมความไม่เข้าคู่ (DNA mismatch repair; MMR) ซึ่งเป็นกระบวนการที่มีความสำคัญทางวิวัฒนาการ ทำหน้าที่ตรวจจับความผิดปกติและตัดดีเอ็นเอส่วนที่ผิดพลาดในสายที่สังเคราะห์ใหม่ออก แล้วสังเคราะห์ทดแทนให้ถูกต้อง กระบวนการนี้ช่วยลดความถี่การกลายพันธุ์โดยรวมลงได้อย่างมีนัยสำคัญ

ขั้นตอนสำคัญของ MMR ประกอบด้วยการจดจำตำแหน่งที่ไม่เข้าคู่ การระบุว่าสายใดเป็นสายที่สังเคราะห์ใหม่ (strand discrimination) และการตัดทอนส่วนที่ผิดพลาดก่อนสังเคราะห์ซ่อมแซม กลไกการระบุสายใหม่อาศัยสัญญาณทางชีวเคมีที่สัมพันธ์กับกระบวนการจำลองและความต่อเนื่องของสายดีเอ็นเอ ซึ่งมีรายละเอียดแตกต่างกันไปตามชนิดของเซลล์และโปรตีนที่เกี่ยวข้อง

 การให้สิทธิ์การจำลองและการป้องกันการจำลองซ้ำ 
ในยูคาริโอต มีการควบคุมกระบวนการจำลองให้เกิดขึ้น “เพียงครั้งเดียวต่อวัฏจักรเซลล์” ซึ่งอธิบายได้ด้วยแนวคิดการให้สิทธิ์การจำลอง (replication licensing) กล่าวคือ ตำแหน่งกำเนิดการจำลองจะถูก “เตรียมความพร้อม” (licensed) โดยการนำคอมเพล็กซ์ฮีลิเคสแบบ MCM ไปติดตั้งบนโครมาตินในช่วงท้ายของระยะไมโทซิสและระยะ G1 จากนั้นเมื่อเข้าสู่ระยะ S การทำงานของไคเนสจะกระตุ้นให้ตำแหน่งกำเนิดเริ่มทำงาน (origin firing) และเมื่อเริ่มการจำลองแล้ว ตำแหน่งดังกล่าวจะถูกยับยั้งไม่ให้ได้รับสิทธิ์ซ้ำอีก เพื่อป้องกันไม่ให้เกิดการจำลองดีเอ็นเอซ้ำซ้อนในวัฏจักรเดิม

ในสัตว์มีกระดูกสันหลัง พบกลไกควบคุมเพิ่มเติมที่เกี่ยวข้องกับโปรตีนเจมินิน (geminin) ซึ่งทำหน้าที่ยับยั้งปัจจัยที่ช่วยติดตั้งคอมเพล็กซ์ฮีลิเคส การสลายตัวของเจมินินในช่วงท้ายของระยะไมโทซิสจะเอื้อให้เกิดรอบการให้สิทธิ์ใหม่สำหรับวัฏจักรถัดไป กลไกเหล่านี้ช่วยให้การเริ่มต้นจำลองสอดคล้องกับการเปลี่ยนแปลงกิจกรรมของไคเนสและการดำเนินไปของวัฏจักรเซลล์

 ความแตกต่างโดยสังเขประหว่างแบคทีเรีย อาร์เคีย และยูคาริโอต 
แม้หลักการพื้นฐานของการจำลองจะมีความคล้ายคลึงกัน แต่ก็พบความแตกต่างสำคัญระหว่างกลุ่มสิ่งมีชีวิต ตัวอย่างเช่น แบคทีเรียส่วนใหญ่มีโครโมโซมรูปวงกลมและมักเริ่มจำลองจากตำแหน่งกำเนิดเพียงไม่กี่ตำแหน่ง ในขณะที่ยูคาริโอตมีโครโมโซมเป็นเส้นตรงและจำเป็นต้องใช้ตำแหน่งกำเนิดจำนวนมากกระจายทั่วจีโนมเพื่อให้สามารถจำลองดีเอ็นเอได้ทันภายในช่วงระยะ S สำหรับอาร์เคีย พบว่ามีลักษณะผสมผสานระหว่างแบคทีเรียและยูคาริโอต ทั้งในด้านชนิดโปรตีนและโครงสร้างของจีโนม โดยรายละเอียดจะแตกต่างกันไปในแต่ละสปีชีส์

ในระดับโมเลกุล แบคทีเรีย อาร์เคีย และยูคาริโอต ใช้ชุดเอนไซม์ฮีลิเคส สไลดิงแคลมป์ และดีเอ็นเอโพลีเมอเรสที่มาจากตระกูลโปรตีนต่างกันหรือมีหน่วยย่อยที่ไม่เหมือนกัน แม้ว่าจะทำหน้าที่หลักคล้ายกันก็ตาม นอกจากนี้ ยูคาริโอตยังต้องมีการประสานงานระหว่างการจำลองกับโครงสร้างโครมาตินและการควบคุมวัฏจักรเซลล์ที่ซับซ้อนเป็นพิเศษ ซึ่งส่งผลต่อกระบวนการประกอบรีพลิโซมและการควบคุมความเที่ยงตรงโดยรวม

 ประเด็นเฉพาะและการประยุกต์ใช้ 
 ปัญหาการจำลองที่ปลายโครโมโซมและเทโลเมียร์ 
ในยูคาริโอตที่มีโครโมโซมเป็นเส้นตรง (linear chromosome) กระบวนการจำลองดีเอ็นเอที่บริเวณปลายโครโมโซมมีข้อจำกัดทางกลไกที่เรียกว่า “ปัญหาการจำลองที่ปลายโครโมโซม” (end-replication problem) กล่าวคือ การสังเคราะห์สายอาศัยตาม (lagging strand) จำเป็นต้องใช้ไพรเมอร์ (primer) เมื่อมีการกำจัดไพรเมอร์ที่ปลายสุดออก จะเกิดช่องว่างที่ไม่สามารถเติมดีเอ็นเอให้เต็มได้ ส่งผลให้ปลายโครโมโซมหดสั้นลงทุกครั้งที่มีการแบ่งเซลล์ เพื่อป้องกันปัญหานี้ ปลายโครโมโซมจึงมีโครงสร้างเรียกว่า เทโลเมียร์ (telomere) ซึ่งประกอบด้วยลำดับดีเอ็นเอซ้ำ (repetitive DNA) ทำหน้าที่ปกป้องยีนสำคัญและรักษาสภาพปลายโครโมโซม โดยความยาวของเทโลเมียร์จะเปลี่ยนแปลงไปตามชนิดของเซลล์ อัตราการแบ่งตัว และประสิทธิภาพของระบบการคงรักษาเทโลเมียร์ในสิ่งมีชีวิตนั้น ๆ

 เทโลเมอเรส (telomerase) 
เทโลเมอเรส (telomerase) เป็นเอนไซม์ที่มีคุณสมบัติเป็นรีเวิร์สทรานสคริปเตส (reverse transcriptase) โดยใช้อาร์เอ็นเอที่เป็นองค์ประกอบในตัวเอนไซม์เป็นแม่แบบเพื่อเติมลำดับซ้ำที่ปลายโครโมโซม ช่วยชดเชยการหดสั้นลงของเทโลเมียร์ กลไกนี้ช่วยให้เซลล์บางชนิด เช่น เซลล์สืบพันธุ์และสเต็มเซลล์ สามารถแบ่งตัวได้ยาวนานกว่าเซลล์ร่างกาย (somatic cells) ทั่วไป นอกจากนี้ การทำงานของเทโลเมอเรสและการควบคุมความยาวเทโลเมียร์ยังมีความสัมพันธ์กับกระบวนการชรา (aging) และการเกิดมะเร็ง โดยพบว่าเซลล์มะเร็งจำนวนมากมีการกระตุ้นการทำงานของเทโลเมอเรสหรือใช้กลไกอื่นเพื่อคงสภาพเทโลเมียร์ ทำให้เซลล์เหล่านี้สามารถแบ่งตัวได้อย่างไม่มีที่สิ้นสุด

 ความเครียดจากการจำลอง (replication stress) 
ความเครียดจากการจำลอง (replication stress) คือสภาวะที่รอยแยกการจำลองเคลื่อนที่ช้าลงหรือหยุดชะงัก ซึ่งสัมพันธ์กับการเกิดความไม่เสถียรของจีโนม (genome instability) สาเหตุของภาวะนี้มีหลากหลาย เช่น การขาดแคลนนิวคลีโอไทด์ ความขัดแย้งระหว่างกระบวนการจำลองกับการถอดรหัส (replication–transcription conflicts) โครงสร้างดีเอ็นเอที่ผิดปกติ หรือความเสียหายของดีเอ็นเอที่ขวางทางเดินของรีพลิโซม เซลล์มีกลไกตอบสนองผ่านระบบจุดตรวจ (checkpoint) และการซ่อมแซมเพื่อรักษาความต่อเนื่องของการจำลองและป้องกันการแตกหักของดีเอ็นเอ อย่างไรก็ตาม หากความเครียดเกิดขึ้นเรื้อรังหรือการตอบสนองของเซลล์บกพร่อง อาจนำไปสู่การกลายพันธุ์และความผิดปกติของโครโมโซมได้

 การจำลองนอกเซลล์และปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) 
หลักการสังเคราะห์ดีเอ็นเอด้วยโพลีเมอเรสและไพรเมอร์สามารถนำมาประยุกต์ใช้ในระบบภายนอกเซลล์ (in vitro) เพื่อเพิ่มจำนวนชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ต้องการ หนึ่งในเทคนิคที่ใช้กันอย่างแพร่หลายคือ ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (polymerase chain reaction; PCR) ซึ่งใช้ไพรเมอร์สองเส้นเพื่อกำหนดขอบเขตของดีเอ็นเอเป้าหมาย กระบวนการประกอบด้วยการแยกสายคู่ด้วยความร้อน (denaturation) การลดอุณหภูมิเพื่อให้ไพรเมอร์จับกับแม่แบบ (annealing) และการปรับอุณหภูมิให้เหมาะสมเพื่อให้ดีเอ็นเอโพลีเมอเรสทำการยืดสาย (extension) เมื่อทำกระบวนการนี้ซ้ำเป็นวัฏจักร จะทำให้ปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายเพิ่มขึ้นแบบทวีคูณ (exponential amplification) PCR จึงเป็นตัวอย่างสำคัญของการนำหลักการพื้นฐานของการจำลองดีเอ็นเอมาใช้ในงานชีววิทยาโมเลกุล เช่น การตรวจวินิจฉัยทางพันธุกรรม การโคลนยีน และการศึกษานิติวิทยาศาสตร์

 อ้างอิง