வெசுட்டர்ன் படிவு

]]

வெசுட்டர்ன் படிவு (western blot) என்னும் செய்நுட்பம் மூலக்கூற்று உயிரியலில், குறிப்பிட்ட ஒரு புரத வெளிப்படும் அளவை அல்லது நாம் வெளிபடுத்த விரும்பும் புரதம் சரியான புரதமா? இல்லையா? என கண்டுபிடிக்க வழக்கமாகப் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு முறையாகும். பொதுவாக இம்முறையைப் பாவித்து நோய்களைக் கண்டறியலாம் (எ.கா.HIV). இவ்விடத்தில் "பிளாட்" என்பது புரதங்களை சவ்வுப்படலத்தில் பெயர்த்து இடுதலைக் குறிக்கின்றது. புரதங்களைச் சவ்வினுள் இடம் பெயர்வு நிகழ்வுக்கு நைட்ரோ செல்லுலோசுTowbin H, Staehelin T, Gordon J. (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.". Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9): 4350–4354 அல்லது பி.வி.டி.எப். (nitrocellulose or PVDF) என்னும் சவ்வுகள் பயன்படுகின்றன.

புரதப் படிவுக்கு பின்வரும் நிலைகள் இன்றியமையாதவை.

௧. புரதப் பிரித்தெடுத்தல்.

௨. சவ்விற்குள் இடம்பெயர்த்தல்

௩. தடுத்தல்

௪. முதனிலை எதிருடல்

௫.இரண்டாம் நிலை எதிருடல்

௬. அறிதல் அல்லது காணுதல்.

 தேவையான நுட்பம் மற்றும் பொருட்கள்: 

புரதம் பகுத்தெடுத்தல்

புரதக் கூழ்ம மின்புல புரைநகர்ச்சி

புரத குறியீட்டு சாயம் (Sample buffer)

திரிசு- எச்.சி. இல்.( Tris-HCL)- 62.5mM

எசு.டி.எசு (SDS)- 2%

கிளிசரால் (Glycerol)- 10%

டி.ரி.ரி (DTT)- 50mM

புரோமொபினால் புளு (Bromophenol blue) அல்லது பினால் ரெட் (Phenol Red)= 0.01%

பெயர்வு இடைமம் (Transfer Buffer)

pH-8.5

திரிசு பேசு (Tris base)- 25mM

கிலைசின் (Glycine) 0.2M

மெத்தனால்- 20%

 10X திரிசு இடைம உப்பு (10X-Tris Buffered Saline) (TBS)

திரிசு பேசு- 24.2g

உப்பு - 80g

1 litter (pH: 7.6) பாவிக்கும் போது 1X ஆக மாற்றப்பட வேண்டும்

கொழுப்பற்ற உலர்ந்த பால்(Nonfat Dry Milk) அல்லது போவைன் சீரம் அல்புமின் (Bovine Serum Albumin)

தடுக்கும் இடைமம் (Blocking Buffer)

1X TBS.

0.1% Tween மற்றும்

5%- கொழுப்பற்ற உலர்ந்த பால் or போவைன் சீரம் அல்புமின்

அலசும் இடைமம் (Washing Buffer)

1X TBS.

0.1% Tween

வெசுட்டர்ன் படிவு காணும்பொருட்கள் (Western Blot Detection System)

இரண்டாவது எதிர்- எதிருடல் மற்றும் இதனுடன் இணைக்கப்பட்ட Horesradish peroxidase (HRP)(secondary anti-rabbit antibody conjugated with HRP)(முதனிலை எதிருடல் எவ்வகை உயிரினத்தில் பெறப்பட்டதை பொருத்து இரண்டாம் நிலை எதிருடல் அமையும். சில வேளைகளில் முயல், கழுதை, குதிரை அல்லது எலி போன்றவற்றில் இருந்து உண்டாக்க்கப்பட்ட இரண்டாம் நிலை எதிருடல் பாவிக்கப்படும்).

எதிர்-பயாட்டின் எதிருடல் மற்றும் இதனுடன் இணைக்கப்பட்ட Horesradish peroxidase (HRP)- (anti-biotin antibody conjugated to HRP)

மிளிரும் வேதிபொருள்கள் மற்றும் பெரோசிடு - LumiGLO chemiluminescent reagent and peroxide

முன் சாயமிட்ட புரத அளவிகள் (prestained protein marker)

சவ்வு: நைட்ரோ செல்லுலோசு அல்லது பி.வி.டி.எப். (Nitrocellulose or PVDF)

 புரதம் பிரித்தெடுத்தல்: 

1. 5 mM Tris-HCl, pH 7.4 - pH பராமரிக்க

2. 2mM EDTA - மின்மமேறிகளை இழுக்கும் முகவராக (chelating agent) . ஏனெனின் அனைந்து நொதிகளும் மின்மமேறிகளை (எ.கா. MgCl2 ) ஒரு உதவி பொருளாக தனது செயலுக்கு பயன்படுத்துகிறது. அவைகளை EDTA தனது கட்டுபாட்டில் இழுப்பதால் நொதிகளின் செயல்கள் கட்டுப்படுத்தபடுகிறது.

3. 10 µl Protease Inhibitor Cocktail (1000 x stock) - புரத அழிவை தடுக்க

4. 10 mg/ml benzamidine

5. 5 mg/ml leupeptin

6. 5 mg/ml trypsin inhibitor - புரத அழிவை தடுக்க

புரத பகுத்தலுக்கு உட்படுத்தப்படும் திசுவை இவ் இடைமத்தை கொண்டு நன்றாக அரைக்க வேண்டும்.

நன்றாக அரைத்து உயிரணுக்களாக பிரிக்கப்பட்ட திசுவை 30-45 நிமிடம் பனிக்கட்டியில் நிலை நிறுத்தவேண்டும்.

பின் இவைகள் உயர் நிலையில் சுழற்றப்பட்டு, நீர்ம பகுதியில் உள்ள புரதங்கள்புதிய குழாய்களுக்கு மாற்றப்பட வேண்டும். புரத அடர்வை (protein concentration) கண்டுபிடித்து மிகச் சரியான அளவில் புரதக் கூழ்ம மின்புல புரைநகர்ச்சி என்னும் நுட்பம் மூலம் நகர்த்தப்படும். புரத அடர்வை அறிய இலவ்ரி முறை (Lowry method) அல்லது பிராட்போர்ட் முறையின் (Bradford method) மூலம் தெரிந்து கொள்ளலாம். இன்றைய நாட்களில் முன் சாயமிடப்பட்ட புரத அளவிகள் (Prestaind protein Marker) இருப்பதால் , புரத அளவுகளை எளிதாக அறிந்து கொள்ளலாம்.

 சவ்விற்குள் இடம்பெயர்த்தல் - Protein Blotting 

பெயர்வு இடைமம் (Transfer Buffer)

pH-8.5

திரிசு பேசு (Tris base)- 25mM

கிலைசின் (Glycine) 0.2M

மெத்தனால்- 20%

பெயர்வு இடைமத்தை கொண்டு கூழ்மத்தில் உள்ள புரதங்கள் சவ்விற்கு இடம் பெயர்த்தப்படும். இடம் பெயர்வு நிகழ்வுக்கு நைட்ரோ செல்லுலோசு அல்லது பி.வி.டி.எப். (Nitrocellulose or PVDF) என்னும் சவ்வுகள் பயன்படுகின்றன. இவ்விடத்தில் பி.வி.டி.எப். சவ்வு சிறந்ததாக கருதப்படுகிறது. இவ் இடைமத்தில் உள்ள மெத்தனால், புரதங்களில் உள்ள SDS எய் நீக்குவதற்கும், அதே வேளையில் புரதங்களை சவ்விற்கு விரைவாக மாற்றுவதற்கு உதவுகிறது Colin J. Pettegrew, Renuka Jayini, and M. Rafiq Islam.Transfer Buffer Containing Methanol Can Be Reused Multiple Times in Protein Electrotransfer J Biomol Tech. 2009 April; 20(2): 93–95.

பெயர்வு நிகழ்வு இரு முறைகளில் மாற்றப்படலாம்.

௧. ஈரம் முறை (Wet transfer)- இம்முறையில் பெயர்வு நிகழ்வுக்கு பயன்படும் பொருள்கள் அனைத்தும் இடைமத்தில் முழ்கிய நிலையில் இருக்கும்.

௨. அரை- உலர்ந்த முறை (Semi-dry method)- மிகு சிறிய அளவில் இடைமத்தைக்கொண்டு பெயர்வு நிகழ்வு நடைபெறும்.

இவ்விரு முறைக்கென தனியான சிறப்பான பொருட்கள் கொண்டு பெயர்வு நிகழ்வு நடைபெற வேண்டும்.

பெயர்வு நிகழ்வு 100 V மின் ஓட்டத்தில் 1- 1.30 மணி நேரத்தில் முடிந்து விடும். பெயர்வு நிகழ்வு சரியான முறையில் நடைபெற்று உள்ளதா என அறிய பொன்சு (Ponceu) என்னும் சிகப்பு நிற சாயத்தை பயன்படுத்தி தெரிந்துகொள்ளலாம். இச்சாயம் சவ்வினுள் உள்ள புரதங்களோடு இணைந்து சிகப்பு நிறத்தில் தெரியும். பின் இச்சவ்வு கடினநீர் கொண்டோ அல்லது அலசும் இடைமத்தை (Wash buffer) கொண்டு கழுவப்படும் போது, சாயங்கள் நீக்கப்படும். மேலும் இச்சயத்தை பல முறை மீண்டும் மீண்டும் பாவிக்கலாம்

 தடுத்தல்- Blocking 


தடுக்கும் இடைமம்

1X TBS.

0.1% Tween மற்றும்

5%- கொழுப்பற்ற உலர்ந்த பால் or போவைன் சீரம் அல்புமின்

தடுக்கும் இடைமத்தை பயன்படுத்தி சவ்வினுள் பெயர்த்தப்பட்ட புரதங்களின் பின்புலத்தை தடுக்க அல்லது பூசுதல் வேண்டும். இதற்கு 5%- கொழுப்பற்ற உலர்ந்த பால் அல்லது போவைன் சீரம் அல்புமின் பாவிக்க வேண்டும். வேசுட்டர்ன் படிவில் இந்நிலை மிக இன்றியமையாதது ஆகும். தடுத்தல் அல்லது பூசுதல் என்னும் முறையால் சவ்வினுள் உள்ள பின்புலங்கள் (Background of the membrane) தடுக்கப்படுவதால், நாம் விரும்பாத புரதங்களை (Non-specific Binding) அறிதல் அல்லது காணுதல் நிலையில் தவிர்கலாம்.

இந்நிலை அறைவெப்பநிலையில் 1-3 மணி நேரமும், அல்லது 4C0 வெப்பநிலையில் இரவு முழுவதும் நிலைநிறுத்தப்பட வேண்டும். பின் சவ்வை அலசும் இடைமத்தை (1X TBS, 0.1% Tween) கொண்டு 5-10 நிமிடம் மூன்று முறை கழுவப்படவேண்டும்.

 முதனிலை எதிருடல் - Primary Antibody 

எதிருடல் (Antibody) என்பது நமது அல்லது விலங்கு உடல்களில் பாதுகாப்பு அரண்களாகும். இவைகள் உடலில் உள் வரும் நோயூட்டிகளை (pathogen) எதிர்த்து உடலை பாதுகாக்கும் தன்மை கொண்டவை.

முதனிலை எதிருடல் என்பது நாம் காண விரும்பும் புரதத்தினை எலி அல்லது முயல் உடலில் செலுத்தி, அவற்றிக்கு எதிராக பெரும் எதிருடல் ஆகும். இவைகளில் ஒரு வடிவாக்க எதிருடல் (Mono-clonal antibody) அல்லது பல வடிவாக்க எதிருடல் (Poly-clonal antibody) என இரு வகைப்படும்.

இரண்டாம் எதிருடல் என்பது முதனிலை எதிருடல் இணைவதற்காக பயன்படுத்தப்படும் எதிருடல் ஆகும்.

முதனிலை எதிருடலை அலசும் இடைமத்தை கொண்டு நாம் விரும்பிய அளவில் நீர்த்து, அதனை தடுக்கும் இடைமத்தை கொண்டு தடுக்கப்பட்டுள்ள சவ்வினுள் சேர்க்க வேண்டும். பொதுவாக 1/500, 1/1000, 1/1500, அல்லது 1/2000 கொண்ட அளவில் நீர்க்கலாம்.

முதனிலை எதிருடல் சேர்க்கப்பட்ட சவ்வினை ஒரு மணி நேரம் அறை வெப்பநிலையிலோ அல்லது 4Co இரவு முழுவதும் நிலைநிறுத்தப்படவேண்டும். பின் சவ்வை, அலசும் இடைமத்தை கொண்டு 5-10 நிமிடம் என மூன்று முறை கழுவப்படவேண்டும்.

 இரண்டாம் நிலை எதிருடல் - Secondary Antibody 

இரண்டாம் நிலை எதிருடலை அலசும் இடைமத்தை கொண்டு நாம் விரும்பிய அளவில் நீர்த்து, அதனை முதனிலை எதிருடல் சேர்க்கப்பட்ட சவ்வினுள் சேர்க்க வேண்டும். பொதுவாக 1/1000 அல்லது 1/2000 கொண்ட அளவில் நீர்க்கலாம்.

இரண்டாம் நிலை எதிருடல் சேர்க்கப்பட்ட சவ்வினை ஒரு மணி நேரம் அறை வெப்பநிலையிலோ அல்லது 4Co இரவு முழுவதும் நிலைநிறுத்தப்படவேண்டும். பின் சவ்வை, அலசும் இடைமத்தை கொண்டு 5-10 நிமிடம் என மூன்று முறை கழுவப்படவேண்டும்.

 அறிதல் அல்லது காணுதல்- Protein Detection 


காணும் நிலையில் இடப்படும் மிளிரும் வேதிபொருள்கள் மற்றும் பெரோசிடு (LumiGLO chemiluminescent reagent and peroxide) இடப்படுவதால், இவைகள் இரண்டாம் நிலை எதிருடலில் இணைக்கப்பட்டுள்ள Horesradish peroxidase (HRP) பிரிக்கப்படுகின்றன. இதனால் வெளியிடப்படும் மிளிரும் தன்மையெய் படசுருள் கொண்டு காணலாம். நாம் விரும்பும் புரதம் மிகையாக இருந்தால், மிகையான குறியீடுகளும் (Signal) இல்லையெனில் குறைவாக இருக்கும்.

 வெளி இணைப்பு 

http://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot

 மேற்கோள்கள் 

பகுப்பு:மூலக்கூற்று உயிரியல்