Mikrozóm

V bunkovej biológii sú mikrozómy heterogénne artefakty podobné vezikulám (~20 – 200 nm priemer) znovu vytvorené z častí endoplazmatického retikula (ER) pri rozpade eukaryotických buniek v laboratóriu ; mikrozómy nie sú prítomné v zdravých, živých bunkách.

Drsné (obsahujúce ribozómy) a hladké (bez ribozómov) mikrozómy vznikajú z endoplazmatického retikula rozrušením buniek. Tieto mikrozómy majú vnútro, ktoré je úplne rovnaké ako lúmen endoplazmatického retikula. Obe formy mikrozómov sa dajú purifikovať procesom známym ako centrifugácia s rovnovážnou hustotou. Drsné a hladké mikrozómy sa líšia vo svojich proteínoch a drsné mikrozómy vykazujú súčasný výskyt translácie a translokácie, s výnimkou určitých proteínov v kvasinkách.

 Hypotéza signálu 
Signálnu hypotézu postulovali Günter Blobel a David Sabatini v roku 1971, pričom tvrdili, že jedinečná peptidová sekvencia je kódovaná mRNA špecifickou pre proteíny určené na translokáciu cez membránu ER. Tento peptidový signál smeruje aktívny ribozóm na povrch membrány a vytvára podmienky pre prenos vznikajúceho polypeptidu cez membránu. Zovšeobecnenie signálnej hypotézy tak, aby zahŕňala signály pre každú organelu a miesto v bunke, malo vplyv ďaleko za hranice objasnenia zacielenia sekrečných proteínov, pretože po prvýkrát zaviedlo koncept „topogénnych“ signálov. Pred signálnou hypotézou bolo takmer nepredstaviteľné, že by informácie kódované v polypeptidovom reťazci mohli určiť lokalizáciu proteínov v bunke.

 Syntéza bielkovín bez buniek 
To sa týka syntézy bielkovín bez buniek. Syntéza bielkovín bez buniek, ktorá prebieha bez mikrozómov, nemá spôsob, ako by sa mohla do mikrozómov zabudovať. To znamená, že keď sú mikrozomálne membrány prezentované neskôr, nedochádza k odstráneniu signálnej sekvencie. S prítomnosťou mikrozómov dochádza k bezbunkovej syntéze proteínov, čo demonštruje kotranslačný transport proteínu do mikrozómu, a tým aj odstránenie signálnej sekvencie. Tento proces vytvára zrelý proteínový reťazec. Štúdie sa zaoberali procesom syntézy bielkovín bez buniek, keď sa z mikrozómov odstránia naviazané ribozómy. Toto vysvetlilo určité detaily o signálnych sekvenciách endoplazmatického retikula. Normálne sa signálna sekvencia sekrečného proteínu odstráni iba vtedy, ak sú mikrozómy prítomné na syntézu proteínov, pretože sekrečný proteín je začlenený do mikrozómov. K transportu bielkovín nedochádza, ak dôjde k neskorému pridaniu mikrozómov po dokončení procesu syntézy bielkovín.

Extrúziu proteínu do mikrozómu možno opísať viacerými faktormi. Proteín bol extrudovaný, ak je rezistentný voči proteázam, nie je rezistentný voči proteázam v prítomnosti detergentov alebo je glykozylovaný enzýmami nachádzajúcimi sa v mikrozómoch. Ďalším znakom extruzie proteínu je odštiepenie N-terminálneho signálneho peptidu vo vnútri mikrozómu signálnou peptidázou, čo môže spôsobiť zmenšenie veľkosti proteínu.

 Pulzné experimenty s prenasledovaním 
Mikrozómy tiež zohrávajú úlohu v experimentoch Pulse-Chase. Experimenty Pulse-Chase ukázali, že sekretované proteíny sa pohybujú cez membránu endoplazmatického retikula, keď sú membrány čistené. Bolo dôležité oddeliť endoplazmatické retikulum od zvyšku bunky, aby sa preskúmala translokácia, ale to nie je možné kvôli jeho jemnosti a prepojenosti. To umožnilo, aby sa do hry dostali mikrozómy, pretože majú väčšinu biochemických vlastností endoplazmatického retikula. Mikrozómy sa tvoria homogenizáciou buniek a malé uzavreté vezikuly s ribozómami zvonku sa tvoria z hrubého rozpadu endoplazmatického retikula. Keď boli mikrozómy ošetrené proteázou, zistilo sa, že polypeptid vytvorený ribozómami končí v lúmene mikrozómov. Toto sa deje aj napriek tomu, že proteíny sa tvoria na cytozolovej strane membrány endoplazmatického retikula.

Ďalšie experimenty ukázali, že mikrozómy musia byť zavedené predtým, ako sa preloží približne prvých 70 aminokyselín, aby sa sekrečný proteín dostal do lúmenu mikrozómov. V tomto bode z ribozómu vyčnieva 40 aminokyselín a ďalších 30 aminokyselín je v ribozomálnom kanáli. Kotranslačná translokácia vysvetľuje, že transport sekrečných proteínov do lúmenu endoplazmatického retikula začína, keď je proteín stále viazaný na ribozómy a nie je úplne syntetizovaný. Mikrozómy je možné koncentrovať a oddeliť od ostatných bunkových zvyškov diferenciálnou centrifugáciou. Nerozbité bunky, jadrá a mitochondrie sedimentujú pri 10 000 g (kde g je gravitačné zrýchlenie Zeme), zatiaľ čo rozpustné enzýmy a fragmentovaný ER, ktorý obsahuje cytochróm P450 (CYP), zostávajú v roztoku. Pri 100 000 g, dosiahnutom rýchlejšou rotáciou centrifugy, ER sedimentuje z roztoku ako peleta, ale rozpustné enzýmy zostávajú v supernatante. Týmto spôsobom sa cytochróm P450 v mikrozómoch koncentruje a izoluje. Mikrozómy majú červenohnedú farbu kvôli prítomnosti hému. Vzhľadom na potrebu viacdielneho proteínového systému sú na analýzu metabolickej aktivity CYP nevyhnutné mikrozómy. Tieto CYP sú vysoko zastúpené v pečeni potkanov, myší a ľudí, ale sú prítomné aj vo všetkých ostatných orgánoch a organizmoch.

Na získanie mikrozómov obsahujúcich špecifický CYP alebo na dosiahnutie vysokého množstva aktívneho enzýmu sa mikrozómy pripravujú z hmyzích buniek Sf9 alebo v kvasinkách prostredníctvom heterológnej expresie. Alternatívne je možné vykonať aj expresiu celých alebo skrátených proteínov v Escherichia coli. Preto sú mikrozómy cenným nástrojom na skúmanie metabolizmu zlúčenín (inhibícia enzýmov, klírens a identifikácia metabolitov) a na skúmanie liekových interakcií prostredníctvom výskumu in vitro. Výskumníci často vyberajú šarže mikrozómov na základe úrovne enzýmovej aktivity špecifických CYP. Niektoré šarže sú k dispozícii na štúdium špecifických populácií (napríklad pľúcne mikrozómy od fajčiarov alebo nefajčiarov) alebo sú rozdelené do klasifikácií, aby sa splnili cieľové hladiny aktivity CYP pre štúdie inhibície a metabolizmu.

Mikrozómy sa používajú na napodobnenie aktivity endoplazmatického retikula v skúmavke a na vykonávanie experimentov, ktoré vyžadujú syntézu bielkovín na membráne. Poskytujú vedcom spôsob, ako zistiť, ako sa proteíny tvoria na ER v bunke, a to rekonštitúciou procesu v skúmavke.

Keefer a kol. skúmali, ako sa ľudské pečeňové mikrozómy a ľudské hepatocyty používajú na štúdium metabolickej stability a inhibície v systémoch in vitro. Preskúmanie ich podobností a rozdielov môže objasniť mechanizmy metabolizmu, pasívnej permeability a transportérov. Bolo preukázané, že pasívna permeabilita je dôležitá pri metabolizme a inhibícii enzýmov v ľudských hepatocytoch. V tejto oblasti má menšiu úlohu aj eflux P-gp. Pečeňové mikrozómy sú tiež prediktívnejšie ako hepatocyty, pokiaľ ide o in vivo klírens, keď poskytujú vyšší vnútorný klírens ako hepatocyty.

 MTP 
Iqbal, Jahangir a Al-Qarni študovali mikrozomálny proteín prenosu triglyceridov (MTP). MTP je rezidentný proteín endoplazmatického retikula a pomáha pri prenose neutrálnych lipidov do vznikajúceho apolipoproteínu B. MTP má široké využitie u pacientov s abetalipoproteinémiou s mutáciami MTP, pretože ovplyvňuje zostavovanie a sekréciu lipoproteínov obsahujúcich apoB. Tieto mutácie MTP sú spojené s absenciou cirkulácie lipoproteínov obsahujúcich apoB. MTP sa tiež podieľa na biosyntéze cholesterolových esterov a klastrov diferenciácie 1d. Prenos sfingolipidov na lipoproteíny obsahujúce apoB tiež spadá pod schopnosť MTP. MTP pracuje s homeostázou lipidov a lipoproteínov a súvisí s určitými patofyziologickými stavmi a metabolickými ochoreniami.

Wang a kol. skúmali metabolizmus liekov in vitro s použitím ľudských pečeňových mikrozómov a frakcií S9 z ľudskej pečene. Štúdia zistila významné rozdiely medzi ľudskými pečeňovými mikrozómami a frakciami S9 ľudskej pečene v koncentráciách enzýmov metabolizujúcich liečivá a transportných proteínov. Korelácie proteín-proteín týchto enzýmov a transportérov metabolizujúcich liečivá boli stanovené vo vzťahu k dvom pečeňovým prípravkom.

 Referencie 

 Pozri aj 
 Cytochróm P450
 Zoznam porúch biologického vývoja
 Frakcia S9
 Syntéza bielkovín bez buniek
 Pulzné experimenty s prenasledovaním
 Diferenciálna centrifugácia
 Mikrozomálny proteín prenosu triglyceridov

 Zdroj 

Kategória:Stránky s neskontrolovanými prekladmi