Maxamova-Gilbertova metóda sekvenovania DNA

Maxamova-Gilbertova metóda sekvenovania DNA je metóda sekvenovania DNA vyvinutá Allanom Maxamom a Walterom Gilbertom v rokoch 1976-1977. Táto metóda je založen na čiastočnej chemickej modifikácii DNA v závislosti na prítomnej nukleobáze a následnom štiepení DNA reťazca na miestach hneď vedľa modifikovaných nukleotidov.

Maxam-Gilbertovo sekvenovanie bola prvá rozšírená metóda sekvenovania DNA a spolu so Sangerovou dideoxy metódou reprezentuje prvú generáciu metód sekvenovania DNA. Maxam-Gilbertovo sekvenovanie sa už bežne nepoužíva a bolo nahradené metódami sekvenovania novej generácie.

 História 
náhľad|Príklad Maxam-Gilbertovho sekvenovania. Rovnako označené segmenty DNA sa štiepia na rôznych miestach, čím vznikajú fragmenty s rôznymi dĺžkami. Tieto fragmenty možno elektroforeticky separovať. Podľa dĺžky fragmentu je potom možné zistiť polohu štiepenej báze.
I keď Maxam a Gilbert publikovali ich metódu chemického sekvenovania dva roky po tom, čo Frederick Sanger a Alan Coulson publikovali svoju prácu ohľadne „plus-mínus“ sekvenovania,Sanger F. Determination of nucleotide sequences in DNA. Nobel lecture, 8 December 1980. Maxam-Gilbertovo sekvenovanie sa rýchlo stalo veľmi populárne, keďže purifikovaná DNA mohla byť použitá priamo, zatiaľ čo počiatočná Sangerova metóda vyžadovala klonovanie každého počiatku čítania na produkciu jednoreťazcovej DNA (ssDNA). S vylepšením metód, pri ktorých dochádza k ukončeniu reťazca (pozri nižšie) však použitie Maxam-Gilbertovho sekvenovania upadlo kvôli technickej náročnosti, ktorá bránila jeho použitiu v molekulárne biologických sadách (kitoch), použitiu nebezpečných chemikálií a problémom pri zmene veľkosti (pri dlhších reťazcoch).

Článok „A new method for sequencing DNA“ (Nová metóda sekvenovania DNA), ktorý vydali Allan Maxam a Walter Gilbert v roku 1977, bol ocenený Divíziou histórie chémie Americkej chemickej spoločnosti. Cena bola odovzdaná Katedre molekulárnej a bunkovej biológie Harvardovej univerzity.

 Proces 
Maxam-Gilbertovo sekvenovanie vyžaduje rádioaktívne značenie na jednom 5' konci DNA fragmentu, ktorý sa má sekvenovať (typicky sa využíva kinázová reakcia s použitím gamma-32P ATP). DNA je potom rozdelená do 4 reakčných nádob na štyri reakcie. Pôsobenie chemikálií následne vytvorí štepy u jedného alebo dvoch zo štyroch nukleotidov v každej zo štyroch reakcií (A+G, G, C+T, C). Puríny (A+G) sú depurinované pôsobením kyseliny mravčej, guaníny (a do istej miery adeníny) sú metylované dimetylsulfátom a pyrimidíny (C+T) sú hydrolyzované pôsobením hydrazínu. Pridaním soli (chloridu sodného) k hydrazínovej reakcii sa inhibuje reakcis s tymínom, reaguje teda len cytozín. Modifikovaná DNA sa potom môže štiepiť horúcim piperidínom v pozícii modifikovanej bázy. Koncentrácia chemikálií je regulovaná tak, aby vznikla v priemere jedna modifikácia na reťazec. Takto vznikne sada označených fragmentov, od rádioaktívne značeného konca po prvý štep v každej molekule.

Fragmenty vznikajúce v týchto štyroch reakciách sú potom analyzované elektroforézou na denaturujúcom akrylamidovom géli, čím sa určí ich dĺžka. Na ich vizualizáciu sa používa autorádiografia (ktorá zaznamenáva rádioaktívny 32P), čím sa získa sada tmavších pásov, ktoré ukazujú polohu identických rádioznačených DNA molekúl. Sekvenciu je možné určiť podľa prítomnosti či neprítomnosti konkrétnych fragmentov.

 Príbuzné metódy 
Táto metóda viedla k vývoju metylačného interferferenčného stanovenia (Methylation Interference Assay), pomocou ktorého sa mapujú DNA-viažuce miesta v DNA-viažucich proteínoch.

Automatizované Maxam-Gilbertovo sekvenovanie bolo vyvinutú v roku 1994.

 Referencie 

 Zdroj 

Kategória:Sekvenovanie DNA
Kategória:Molekulárna biológia