Molekulárne klonovanie

Molekulárne klonovanie, tiež nazývané expresné klonovanie je súbor metód molekulárnej biológie vyvinutých v 70. rokoch 20. storočia pre prípravu a replikáciu tzv. rekombinantnej DNA určenej na produkciu ňou kódovaného proteínu v hostiteľskom organizme. Produkcia proteínov rekombinantnými technikami je výhodná z viacerých dôvodov, predovšetkým z dôvodov väčších výťažkov produkcie rekombinantného proteínu, jeho jednoduchšej purifikácie a tiež pre možnosť produkcie vybraného alebo prakticky ľubovoľného úseku proteínu alebo sekvencie aminokyselín. 

V najbežnejšom experimente je vyžadovaná DNA izolovaná z organizmu alebo nasyntetizovaná pomocou restrikčných endonukleáz zaklonovaná do tzv. vektoru a tento vektor rozšírený o vyžadovanú DNA je vnesený do hostiteľského organizmu, v ktorom sa nechá namnožiť. Následne je vektor izolovaný a purifikovaný .

 PCR 

PCR (polymerázová reťazcová reakcia, z angl. polymerase chain reaction) je dôležitým nástrojom prvého kroku molekulárneho klonovania a to namnoženia (amplifikácie) vyžadovanej sekvencie DNA. Táto sekvencia môže byť nasyntetizovaná umelo, môže byť priamo izolovaná z organizmu alebo vytvorená reverznou transkripciou z izolovanej RNA. Pomocou PCR sú typicky na oba konce amplifikovanej DNA pridané štiepne miesta pre restrikčné endonukleázy.

 Restrikčné endonukleázy 

Restrikčné nukleázy sú enzýmy, ktoré dokážu štiepiť molekulu DNA. Využívané sú restrikčné nukleázy typu II, ktoré rozoznávajú a štiepia DNA na základe presnej sekvencie DNA, typicky ide o 4, 6 alebo 8 párov báz a daná sekvencia je palindromická. Tie restrikčné endonukleázy, ktoré neštiepia molekulu dvojreťazcovej DNA priamo, vytvárajú tzv. lepivý koniec, čiže ponechajú jeden reťazec o niekoľko párov báz dlhší ako druhý. Jednou alebo dvoma restrikčnými endonukleázami sa zvykne naštiepiť tzv. inzert, čiže produkt PCR a aj tzv. klonovací vektor, do ktorého sa daný inzert vkladá ligáciou (viz nižšie). Pri použití restrikčnej endonukleázy, ktorá nevytvára lepivé konce, je možné ich dosyntetizovať pomocou ďalšieho enzýmu, terminálnej deoxynukleotidyl transferázy, ktorá na 3' koniec DNA pridáva nukleotidy.

 Vektor 
Klonovací vektor je typicky dvojvláknová molekula DNA, ktorá sa môže v hostiteľských bunkách reprodukovať, a do ktorej je vkladaná rekombinantná DNA.

 Plazmid 

Plazmid je kruhová dvojvláknová DNA dlhá medzi tisíc a dvestotisíc párov báz. Zatiaľ čo fyziologicky si plazmidy predávajú baktérie, pretože im prinášajú vo svojom genetickom kóde nejaký benefit (typicky rezistenciu proti antibiotiku), plazmidy používané pre molekulárne klonovanie majú známu sekvenciu. Typicky obsahujú sekvencie kódujúce počiatok replikácie, rezistenciu proti antibiotiku, regulačné miesto, počiatok transkripcie, počiatok translácie, tzv. polylinker, čo je oblasť so sekvenciami rozoznávanými restrikčnými endonukleázami a ďalšie. Plazmidy po vnesení do organizmu (tzv. transformácii) umožňujú rast daných organizmov v médiu s antibiotikom, na ktoré daný plazmid nesie rezistenciu, čo umožňuje selekciu tých mikroorganizmov, ktoré v sebe plazmid aj s rekombinantnou DNA nesú. Inzert zaklonovaný do plazmidu môže byť dlhý maximálne 10 000 párov báz.

 Vírusové vektory 
Vektory odvodené od vírusov prakticky infikujú hostiteľské bunky. Typickým je baktériofág λ, ktorý umožňuje vnesenie inzertu dlhého až do 16 000 párov bází. Inzert vo fágovi nahrádza 48 500 párov báz dlhý nepotrebný úsek ich genómu a do fága sa vnáša in vitro zbaľovacím systémom. Zlepšené fágy, do ktorých možno klonovať DNA pomocou tzv. cos miest, môžu niesť až 49 000 párov báz dlhú rekombinantnú DNA; nazývajú sa kozmidy. Ďalšími použiteľnými vírusovými systémami sú baktériofág M13 (inzert do 1 000 párov báz) a baculovírus (do 15 000 párov báz), ktorým sa infikujú hmyzie bunky.

 Vektory YAC a BAC 
Väčšia rekombinantná DNA môže byť zaklonovaná do tzv. umelého kvasinkového chromozómu (YAC, z angl. yeast artificial chromosome) alebo umelého bakteriálneho chromozómu (BAC, z angl. bacterial artificial chromosome). YAC sú lineárne chromozómy obsahujúce všetko potrebné pre replikáciu v kvasinkách. BAC sú odvodené od kruhového baktériochromozómu, sú replikované v E. coli, a ich na jednu bunku pripadá v priemere jeden takýto umelý chromozóm.

 Ligácia 
Po naštiepení vektoru aj inzertu restrikčnými endonukleázami na nich vznikajú lepivé konce, ktorých bázy sú navzájom komplementárne. Tieto konce sa navzájom párujú a na ich vzájomné prepojenie sa používa ďalší enzým - ligáza. Väčšinou ide o T4 DNA ligázu izolovanú baktériofága T4 . 

 Transformácia  
Pojem transformácia znamená v molekulárnej biológii prenesenie DNA do hostiteľského organizmu. Bunky hostiteľského organizmu musia byť za účelom transformácie tzv. kompetentné, čiže schopné DNA prijať. Laboratórne sa pripravujú kompetentné bunky vystavením bivalentným iónom (typicky chloridom horečnatým) a následným tepelným šokom, čím sa zvyšuje fluidita cytoplazmatickej membrány a v prípade G- baktérií znižuje množstvo proteínov v lipopolysacharidovej vrstve.

 Selekcia 
Aby boli bunky hostiteľského organizmu, ktoré prijali vektor, rozlíšiteľné od buniek ostatných, je potrebné ich selektívne odlíšiť. Najčastejšie ide o selekciu pomocou antibiotika, pri ktorej sú hostiteľské bunky ponechané rásť v médiu obohatenom o antibiotikum, na ktoré nesie daný vektor rezistenciu. Bunky, ktorý daný vektor nemajú, na takomto médiu uhynú. Ďalšou možnosťou selekcie je využitie upraveného génu lacZ'. Tento gén kóduje enzým ß-galaktozidázu, ktorá je schopná okrem galaktózy štiepiť aj molekulu X-gal (5-brómo-4-chlóro-3-indolyl-ß-D-galaktozid). Táto molekula je bezfarebná, no produkt jej štiepenia ß-galaktozidázou (5-brómo-4-chlóro-3-hydroxyindol) je modrý. Selekcia je prevedená tak, že zaklonovaním inzertu do vektoru sa naruší gén lacZ' a preto kolónie hostiteľských buniek so správne zaklonovanými vektormi nemajú modrú farbu, na rozdiel od ostatných .

 Purifikácia a verifikácia 
Z kolónií sú dané vektory izolované a purifikované kombináciou metód centrifugácie a chromatografie. Ak nebola použitá selekcia pomocou lacZ' génu, je potrebné overiť, či bol daný vektor správne zaligovaný (mohlo dôjsť, napríklad, ku opätovnej ligácii oboch koncov pôvodného vektoru). Pre overenie sa používa PCR, restrikčná analýza, sekvenácia DNA alebo hybridizačné techniky ako napr. Southern blot.

 Referencie 

Kategória:Molekulárna biológia
Kategória:Genetika