Flowcytometri

Flowcytometri brukes til å telle celler og sortere celler, for å oppdage biomarkører, bakterier og utvikle proteiner innen bioteknologi. Denne metoden anses som veldig reproduserbar og nøyaktig når man skal analysere store populasjoner av celler. Den finner raskt ut kvantitative og kvalitative egenskaper til cellene ved å måle optisk lys og fluorescens.

Flowcytometri benyttes til å måle og analysere en suspensjon av celler som føres i en væskestrøm. Denne væskestrømmen har større hastighet enn prøven og danner på denne måten et drag kjent som hydrodynamisk fokusering. Dette sørger for at veggene i tunellen som cellene flyter gjennom blir bygget opp av en væskestrøm som holder prøven av celler og væskestrømmen adskilt. I tillegg kan en strømning av enkeltceller flyte gjennom apparatet slik at resirkulasjon og gjentelling av samme celle elimineres. Cellene flyter gjennom flowcytometeret én etter én, forbi en lysstråle med en bestemt bølgelengde. Det benyttes vanligvis en argon laser, fordi lyset med en bølgelengde på 488 nm har nok energi til å eksitere de aller fleste fluorkromene (et fargestoff som avgir fluorescens etter at det er blitt belyst). Når hver celle passerer forbi lysstrålen så vil den deflektere lyset, og dermed danne frem-spredt lys (forward scatter, FSC) og side-spredt lys (side scatter, SSC). Det deflekterte lyset blir registrert av flere optiske detektorer som konverterer lyset til elektriske signaler for videre dataanalyser. Hvor mye lyset deflekteres er avhengig av størrelsen til cellen, og cellens kompleksitet eller granularitet.

Forward scatter måles som oftest 1 til 20 grader på lysstrålen, avhengig av størrelse på cellen. FSC gir informasjon om cellens morfologi og størrelse. Side scatter måles omtrent 90 grader på lysstrålen, og gjengir informasjon om cellens indre kompleksitet

I tillegg til å undersøke de lysbrytende egenskapene, blir også uttrykte antigener på cellen undersøkt ved hjelp av antistoffer konjugert til en fluorescerende komponent, kalt fluorokrom. Fluorokromer kan binde seg til cellulære komponenter som DNA eller spesifikke proteiner inni cellen eller på celleoverflaten. Når fluorkromet blir bestrålt, absorberes energien fra lysstrålen og elektronene eksiteres til en tilstand med høyere energi. Det eksiterte elektronet faller raskt ned igjen til sin grunntilstand ved å emittere den absorberte energien i form av fluorescerende lys i et bestemt spektrumBrown M, Wittwer C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 2000;46(8 Pt 2):1221-9.. Deteksjon av fluorescens i dette spekteret gir indirekte informasjon om graden av antistoffbinding til cellen, og kan fortelle hvilke antigener som cellen uttrykker.

 Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) 
Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) er en metode innenfor flowcytometri som tillater sortering av en heterogen blanding av celler i to eller flere grupper basert på spesifikke lysbrytende og fluorescerende egenskaper av hver celle. Denne metoden er meget verdifull når en trenger å fange opp cellene av interesse for videre analyser, enten mikroskopisk eller biokjemisk.
En vibrerende mekanisme fører til at væskestrømningen med celler brytes ned til enkle dråper. Systemet fører til at det er liten sannsynlighet for at det er mer enn en celle per dråpe. Like før væskestrømmen brytes til dråper, passerer den først gjennom en fluorescerende detektor som registrerer cellene som er av interesse. Deretter blir en elektrisk ladning plassert i hver dråpe, slik at dråpene som har samme ladning tiltrekkes en elektromagnet med motsatt ladning. På denne måten kan en samle cellene en ønsker å undersøke nærmere i separate beholdere.

 Flowcytometeret 
Moderne flowcytometere er i stand til å analysere flere titusen partikler per sekund, og sortere dem etter forskjellige egenskaper. Et flowcytometer består av fem hovedkomponenter:

 Væskesystem – en strømning av væske som fører cellene gjennom en laserstråle. For optimal belysning bør cellene transporteres i sentrum av væskestrømingen. En økning av væsketrykket vil øke flowraten ved å øke bredden på væskestrømningen. Dette kan føre til at noen celler krysser laserstrålen i en mindre optimal vinkel, utenfor sentrum. En høy flowrate er vanligvis brukt for kvalitative målinger som for eksempel immunfenotyping. En lavere flowrate fører til at en smalere strøm av celler passerer laserstrålen, slik at lyset som blir emittert varierer i mindre grad og er mer uniform. Dette blir ofte brukt ved prøver hvor en trenger høy nøyaktighet, som for eksempel DNA-analyser. To typer for væskestrømning blir brukt i flowcytometeret: laminær strøm og turbulent strøm
 Optisk system – en lyskilde, oftest en buelampe eller laser, benyttes for å undersøke egenskapene til cellen. Moderne flowcytometre har flere lasere, slik at man kan variere energien på lyset, og dermed merke flere antistoffer på cellen. Dette gjør at vi kan bruke flere fluorokromer samtidig, og identifisere de merkete cellene enda mer nøyaktig.
 Detektor og et analog til digital-konverteringssystem som omformer FCS, SSC og fluorescens fra lysfotoner til elektriske signaler som kan bli bearbeidet av en datamaskin.
 Forsterkningssystem som forsterker det elektriske signalet, lineært eller logaritmisk.
 Data for analyse

 Dataanalyse 
Etter at dataen er samlet fra flowcytometeret kan den lagres i dataen eller i en ekstern minnebrikke for senere analyse. Ulike programmer kan brukes til dette, for eksempel WinMDITSRI Cytometry Software Page [02.03.15]. Available from:  og Flowing SoftwareTerho P. Flowing Software: Turku Centre for Biotechnology; [2012]. Available from: http://www.flowingsoftware.com/.

 Forberedelse av prøve 
Målet med å forberede en prøve er å lage en suspensjon av enkle partikler som kan passere gjennom systemet uten å forstyrre eller blokkere væskegjennomstrømningen. Partikler som kan analyseres kan være individuelle celler, organeller eller organvev.
En suspensjon av enkle partikler laget av biologisk materiale kan variere fra å være veldig enkelt til å være frustrerende vanskelig, Kroppsvæsker, spesielt blod, inneholder allerede enkeltceller som kan bli farget med et fargestoff og prosessert direkte i flowcytometeret. I en blodprøve kan man bruke et fargestoff som heter thiazole orange for å analysere og telle retikulocytterLee LG, Chen CH, Chiu LA. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 1986;7(6):508-17..
Fast vev er mye vanskeligere å analysere ved hjelp av flowcytometri da det kreves at vevet løses helt opp i individuelle celler før metoden kan tas i bruk. Ved store vev fragmenter eller celleklumper kan en risikere å tette tubene i apparatet. En teknikk som løsner celler fra en type vev kan mislykkes helt i en annen type vev. En generell metode er å bruke kollagenase for nedbrytning av vevet til enkeltceller.

 Referanser 



Kategori:Bioteknologi