Hepatitt C, mikrobiologisk diagnostikk

Mikrobiologisk diagnostikk av hepatitt C byggjer både på påvising av antikroppar mot hepatitt C-virus (anti-HCV) og på direkte påvising av sjølve virus (HCV) ved å amplifisera sekvensar i den virale ribonukleinsyra.

 Historikk 
I 1970-åra kom serologiske testar for aktiv diagnostikk av både akutt og gjennomgått hepatitt A og akutt, kronisk og gjenomgått hepatitt B. Duermeyer W, Wielaard F, van der Veen J (1979) «A new principle for the detection of specific IgM antibodies applied in an ELISA for hepatitis A» - J Med Virol., vol. 4, nr. 1, s. 25-32. PMID: 231096 (samandrag).  Hess G, Arnold W (1980) «The clinical relevance of the antibody to hepatitis B core antigen (anti-HBc): a review» - J Virol Methods., vol. 2, nr. 1-2, s. 107-117. PMID: 7014579 (samandrag).
Tilfelle med anamnestisk, klinisk og/eller laboratoriekjemisk viral hepatitt som var negative i dei kjende serologiske testane for hepatittformene A og B, fekk diagnosen hepatitt non A non B (HNANB). På epidemiologisk grunnlag vart anti-HBc nytta som surrogatmarkør når det galdt blodgjevarar, Stevens CE, Aach RD, Hollinger FB, Mosley JW, Szmuness W, Kahn R, Werch J, Edwards V (1984) «Hepatitis B virus antibody in blood donors and the occurrence of non-A, non-B hepatitis in transfusion recipients. An analysis of the transfusion-transmitted viruses study» - Ann Intern Med., vol. 101, nr. 6, s. 733-738. PMID: 6437308 (samandrag) men utan diagnostiske testar heldt HNANB fram med å vera ein eksklusjonsdiagnose fram til 1989. Då kunne fyrste generasjonens serologiske testar for hepatitt C takast fram med hjelp av antigen som var framtekne med ny, molekylærbiologisk, rekombinant teknikk. Choo Q-L, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradly DW, Houghton M (1989) «Isolation of a cDNA clone derived from blood-borne non-A, non B viral hepatitis genome» - Science, vol. 244, nr. 4902, s. 359-362. PMID: 2523562 (samandrag) Kuo G, Choo Q-L, Alter HJ, Gitnik GL, Redeker AG, Purcell RH, Miyamura T, Dienstag JL, Alter MJ, Stevens CE, Tegtmeier GE, Bonino F, Colombo M, Lee W-S, Kuo C, Berger K, Shuster JR,  Overby LR, Bradley DW, Houghton M (1989) «An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human non-A, non-B hepatitis» - Science, vol. 244, nr. 4902, s. 362-364. PMID: 2496467 (samandrag)  

Jamført med dei serologiske testane for infeksjonar som vart årsaka av hepatitt A- og hepatitt B-virus var dei fyrste serologiske testane med immunenzymatiske metodar som ELISA-/EIA (enzyme-linked immunosorbent assay-/enzyme immunoassay)-testar for hepatitt C ikkje særskilt bra. Alter HJ, Purcell RH, Shih JW, Melpolder JC, Houghton M, Choo Q-L, Kuo G (1989) «Detection of antibody to hepatitis C virus in prospectively followed transfusion recipients with acute and chronic non-A, non-B hepatitis» - N. Engl. J. Med., vol. 321, nr. 22, s. 1494-1500. PMID: 2509915 (samandrag) Dei reagerte på antikroppar som mest kunne tilskrivast preprotein frå NS4-regionen på genomet. Reaksjonane kom ofte seint og testane gav både falskt positive (særskilt hjå pasientar med autoimmune sjukdomar) og falskt negative resultat. Ikeda Y, Toda G, Hashimoto N, Kurokawa K (1990) «Antibody to superoxide dismutase, autoimmune hepatitis, and antibody tests for hepatitis C» - Lancet, vol. 335, nr. 8701, s. 1345-1346. PMID: 1971405 (samandrag) Theilmann L, Blazek M, Goeser T, Gmelin K, Kommerell B, Fiehn W (1990) «False positive anti-HCV tests in rheumatoid arthritis 335 Specificity of hepatitis C antibody ELISA in patients with haemophilia» - Lancet, vol. 335, nr. 8701, s. 1346. PMID: 1971406 (samandrag) Brown J, Dourakis S, Karayiannis P, Goldin R, Chiba J, Ohba H, Miyumara T, Thomas HC (1992) «Seroprevalence of hepatitis C virus nucleocapsid antibodies in patients with cryptogenic chronic liver disease» - Hepatology, vol. 15, nr. 2, s. 175-179. PMID: 1370945 (samandrag) Til dømes var berre bortimot 80 % av pasientane med påvist HCV og kliniske haldepunkt for hepatitt positive i fyrste generasjonens testar for for anti-HCV (ELISA/EIA-1). Hjå blodgjevarar var derimot så mykje som70 % utav dei positive testane for anti-HCV falsk positive. Gretch DR (1997) «Diagnostic tests for hepatitis C» - Hepatology, vol. 26, nr. 3, suppl 1, s. 43S-47S. PMID: 9305663. 

Til saman med strenge sosioanamnestiske krav som fyrst og fremst hadde komi til for å hindra HIV-smitte frå blodgjevarar, gav fyrste generasjonens immunserologiske testar for hepatitt C ei dramatisk minking av nytilkomen HNANB. Levertransaminasar og surrogatmarkøren anti-HBc skulle til saman berre ha oppdaga om lag halvparten av dei HCV-positive blodgjevarane som var involverte i posttransfusjonshepatitt. Alter HJ, Purcell RH, Shih JW, Melpolder JC, Houghton M, Choo Q-L, Kuo G (1989) «Detection of antibody to hepatitis C virus in prospectively followed transfusion recipients with acute and chronic non-A, non-B hepatitis» - N. Engl. J. Med., vol. 321, nr. 22, s. 1494-1500. PMID: 2509915 (samandrag)
mini|Posttransfusjonshepttt C

Sidan har tillegg av ytterlegare antigene epitopar gjort testane betre.  1992 kom 2dre (med antigene epitopar frå den strukturelle og rett konservative core-regionen, frå dei ikkje strukturelle NS3- og NS4-regionane på genomet) og nokre år seinare 3dje (med epitopar frå core-regionen, NS3, NS4 og den ikkje strukturelle NS5-regionen) generasjonens ELISA/EIA-testar (ELISA/EIA-2 og  ELISA/EIA-3) for anti-HCV. Med desse testane kan antikroppar mot HCV påvisast tidlegare. 

Med molekylærbiologisk teknikk vart det 1989 òg mogleg å påvisa ei særskild virusnukleinsyre
hjå sjimpansar som var infisert med HNANB. Denne nukleinsyra (HCV-RNA) koda for antigen som særskilt kunne knytast til HNANB og såleis til hepatitt C-infeksjonar.  Kubo Y, Takeuchi K, Boonmar S, Katayama T, Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Bradley DW, Houghton M, Saito I, et al. (1989)  «A cDNA fragment of hepatitis C virus isolated from an implicated donor of post-transfusion non-A, non-B hepatitis in Japan» - Nucleic Acids Res., vol. 17, nr. 24, s. 10367-10372. PMID: 2513560. (pdf) Seinare studiar kunne med hjelp av amplifiseringsteknikk slå fast at påvising av HCV-RNA er ein særs kjensleg og spesifikk metode for diagnostikk av hepatitt C. Alberti A, Morsica G, Chemello L, Cavalletto D, Noventa F, Pontisso P, Ruol A (1992) «Hepatitis C viraemia and liver disease in symptom-free individuals with anti-HCV» - Lancet, vol. 340, nr. 8821, s. 697-698. PMID: 1355801 (samandrag).

Til amplifisering av HCV-RNA nytta ein fyrst PCR (polymerase chain reaction/polymerase kjedereaksjon)]-teknikk i form av det som vert kalla nested PCR (på norsk òg kalla for «fletta PCR») – ein kjensleg teknikk som berre er kvalitativ, rett så krunglut og har stor risiko for forureiningar. Seinare har både kommersielle PCR-testar med annan deteksjonsteknikk og andre amplifiseringstestar for målsekvensane som TMA (transcription mediated amplification), NASBA (nucleic acid sequence based amplification) og ligase chain reaction kome til. Dessutan finst testar som bygger på amplifisering av deteksjonssignalet (bDNA/branchen DNA). Kommersielle testar for både kvalitativ og kvantitativ HCV-diagnostikk er no tilgjengelege.Kalland K-H, Myrmel H, Nordbø SA (2005) «Nukleinsyrediagnostikk i medisinsk mikrobiologi» - Tidsskr Nor Laegeforen, vol. 125, nr. 22, s. 3110-3114. PMID: 16299567. 

 Immunserologiske testar for anti-HCV 
 A. Screening-/sældingtestar 
Ved testing av blodgjevarar er det ingen avgjerande skilnad mellom ELISA/EIA-2 og  ELISA/EIA-3 når det gjeld sensitivitet, men ved akutt hepatitt kan tredje generasjonens testar påvisa anti-HCV tidlegare. I gjennomsnitt vert ELISA/EIA-3 positiv 14 veker etter eksposisjon og 6 veker etter sjukdomsdebut. Vrielink H, Reesink HW, van den Burg PJM, Zaaijer HL, Cuypers HTM, Lelie PN, van der Poel CL (1997) «Performance of three generations of anti-hepatitis C virus enzyme-linked immunosorbent assays in donors and patients» - Transfusion, vol. 37, nr. 8, s. 845-849. PMID: 9280331 (samandrag).

ELISA/EIA-testar for anti-HCV - sensitivitet og positivt prediktivt verde 

 Positivt predikitivt verdea) (%) Positivt prediktivt verdeb) (%) Test Sensitivitet * (%) Grupper med låg prevalens Grupper med høg prevalens EIA-1 70 - 80 30 - 50 70 - 85 EIA-2 92 - 95
 50 - 61 88 - 95 EIA-3 97 25 inga utrekning

a) Basert på kliniske funn og påvising av HCV-RNA med PCR.

b) Jamført med RIBA

Likevel har framleis bortimot 1/3 av pasientane med akutt hepatitt C inga påviselege antikroppar mot HCV når dei får symptom, og hjå sume (fyrst og fremst ved svikt i immunsystemet) kan det taka opp til 12 veker innan immunserologiske testar er positive. Såleis kan det framleis vera fare for falskt negative resultat av immunologiske testar for anti-HCV i den akutte sjukdomsfasen.Maheshwari A, Ray S, Thuluvath PJ (2008) «Acute hepatitis C» -  Lancet, vol. 372, nr. 9635, s. 321-332. PMID: 18657711 (samandrag). Ved kronisk hepatitt C, framfor alt hjå immundefekte pasientar, kan resultatet av testar for anti-HCV vera falskt negative i over 10 % enda om sirkulerande virus kan påvisast i serum. Trepo C, Alonso C, Li JS, Quo D, Laurent F, Vitvitski L (1994) «Limits of immunoserologic and molecular diagnosis of hepatitis C» - Nucl Med Biol., vol. 21, nr. 3, s. 419-431. PMID: 9296765 (samandrag) Spesifisiteten ser derimot ut til å vera betre. Ved metaanalyse av serumpanel frå pasientar med kronisk hepatitt C ligg resultatet på litt under 99 % hjå pasientar med kronisk leversjukdom og på over 97 % i serumpanel. Colin C, Lanoir D, Touzet S, Meyaud-Kraemer L, Bailly F,. Trepo C; Hepatitis Group (2001) «Sensitivity and specificity of third-generation hepatitis C virus antibody detection assays: an analysis of the literature» - J Viral Hepat., vol. 8, nr. 2, s. 87-95. PMID: 11264728 (samandrag).

 B. Konfirmasjonstestar 
Framfor alt ved autoimmunsjukdomar kan det vera fare for falskt positive resultat av immunologiske testar for anti-HCV. Ramos-Casals M, Font J, García-Carrasco M, Cervera R, Jiménez S, Trejo O, de la Red G, Sánchez-Tapias JM, Ingelmo M (2000) «Hepatitis C virus infection mimicking systemic lupus erythematosus: study of hepatitis C virus infection in a series of 134 Spanish patients with systemic lupus erythematosus» - Arthritis Rheum., vol. 43, nr. 12, s. 2801-2806. PMID: 11145039.  (pdf) Difor bør ELISA/EIA-testar for hepatitt C berre nyttast til sælding (screening). Positive utfall bør verifiserast, anten med ein spesifikk antikroppstest som RIBA-(recombinant immunoblot assay) eller WB (Western blot)
-test eller ved påvising av HCV-RNA med ein molekylærbiologisk amplifiseringsmetode. Spesifikke testar for anti-HCV (konfirmasjonstestar) som RIBA eller WB har betre spesifisitet enn ELISA-/EIA-testar, men sensitiviteten er heller dårlegare. Colin C, Lanoir D, Touzet S, Meyaud-Kraemer L, Bailly F,. Trepo C; Hepatitis Group (2001) «Sensitivity and specificity of third-generation hepatitis C virus antibody detection assays: an analysis of the literature» - J Viral Hepat., vol. 8, nr. 2, s. 87-95. PMID: 11264728 (samandrag).

Både ELISA-/EIA-testar og konfirmasjonstestar påviser berre anti-HCV. Både ved aktiv sjukdom med viremi (akutt og kronisk) og ved gjennomgått, lækt infeksjon kan ein få positivt testresultatet. 

 Testar for viruspåvising 
 A. Påvising av HCV-RNA 
Aktiv HCV-infeksjon kan berre diagnostiserast med viruspåvising. Dei mest kjenslege metodane er grunna på amplifisering og påvising av virusnukleinsyre (HCV-RNA). Rekna frå eksposisjonsdagen kan virus ved akutt infeksjon påvisast i blodet etter 1 – 2 veker med såvoren teknikk. Ozaras R, Tahan V (2009) «Acute hepatitis C: prevention and treatment» - Expert Rev Anti Infect Ther., vol. 7, nr. 3, s. 351-361. PMID: 19344247 (samandrag). mplifiseringstestar kan dessutan vera positive hjå immundefekte HCV-infeksjoninfiserte som er falskt negative i testar for anti-HCV. 

Nokre utav amplifiseringstestane kan til og med måla virusmengda i serum kvantitativt (viral load). Dei eldre kvantitative testane hadde høgare deteksjonsgrenser enn tilsvarande kvalitative testar. I dei mest moderne testutgåvene er denne skilnaden stort sett borte samstundes som deteksjonsgrensene har vorti pressa ytterligare ned.

Enda om kvantitative virusundersøkingar ikkje kan seia noko om prognosen, er dei verdefulle når behandling av kronisk hepatitt C skal styrast (monitorerast). Variasjonen mellom ulike amplifiseringsmetodar (inter assay) er så stor at berre resultat frå identiske undersøkingsmetodar kan jamførast.
(HCV-RNA vert målt i genkopiar eller IU/mL, no helst i IU/mL. Det finst ingen standardformel for omrekning av genkopiar til IU. Omrekningsfaktoren er ulik for ulike amplifiseringsmetodar og kan vera frå om lag 1 til 5 HCV-RNA-genkopiar per IU.)Highleyman L (2012) «HCV diagnostic tools: HCV viral load tests» - i: Hcsp FACTsheet (Hepatitis C Support Project), version 4, (red. Franciscus A).   

 B. Immunserologiske antigentestar 
HCV kan påvisast med immunologisk metodikk òg. Såvorne testar inneheld antikroppar mot antigen frå core-regionen på HCV (HCVcAg). Testar av denne typen er mindre kjenslege for kontaminasjon, er billegare og lettare å utføra enn amplifiseringsestar for HCV-RNA og kan nyttast til å måla virusmengda i blodet. Dei har derimot dårlegare sensitivitet enn HCV-RNA-testar. Det er difor som regel ikkje tilrådeleg å bruka HCVcAg-testar til verifisering av resultat i ELISA-/EIA-reaktive sera. Dei kan likevel vera eit mogeleg alternativ om turvande laboratorieutstyr og kunnig personale saknast. Daniel HDJ, Vivekanandan P, Raghuraman S, Sridharan G, Chandy GM, Abraham P (2007) «Significance of the hepatitis C virus (HCV) core antigen as an alternative plasma marker of active HCV infection» - Indian J Med Microbiol.,vol. 25, nr. 1, s. 37-42. PMID: 17377351.   Krajden M, Shivji R, Gunadasa K, Mak A, McNabb G, Friesenhahn M, Hendricks D, Comanor L (2004) «Evaluation of the core antigen assay as a second-line supplemental test for diagnosis of active hepatitis C virus infection» - J Clin Microbiol., vol. 42, nr. 9, s. 4054-4059. PMID: 15364989.  (pdf) Testar for HCVcAg har klart betre sensitivitet enn testar for anti-HCV. Dei vert positive på eit tidlegare stadium ved akutt infeksjonAoyagi K, Iida K, Ohue C, Matsunaga Y, Tanaka E, Kiyosawa K, Yagi S (2001) «Performance of a conventional enzyme immunoassay for hepatitis C virus core antigen in the early phases of hepatitis C infection» - Clin Lab., vol. 47, nr. 3-4, s. 119-127. PMID: 11294574 (samandrag). og syner færre falskt negative resultat på immundefekte pasientar. Dei kunne såleis vera eit billegare og tenkjeleg alternativ til testar for HCV-RNA ved HCV-sælding av blodgjevarar, Medhi S, Potukuchi SK, Polipalli SK, Swargiary SS, Deka P, Chaudhary A, Begum N, Hussain Z, Ahlawat RS, Kar P (2008) «Diagnostic utility of hepatitis C virus core antigen in hemodialysis patients» - Clin Biochem., vol. 41, nr. 7-8, s. 447-452. PMID: 18267117 (samandrag). men når antikropparantikroppsproduksjonen kjem i gang, finst det viss risiko for falskt negative testresultat. Widell A, Molnegren V, Pieksma F, Calmann M, Peterson J, Lee SR (2002) «Detection of hepatitis C core antigen in serum or plasma as a marker of hepatitis C viraemia in the serological window-phase» - Transfus Med., vol. 12, nr. 2, s. 107-113. PMID:11982963 (samandrag).

 Kombinasjonstestar for påvising av anti-HCV og HCVcAg 
På marknaden har det og komi antikropps-antigentestar som på immunologisk veg kan fanga opp både anti-HCV og HCV-antigen (HCVcAg). Etter infisering kan såvorne testar reagera tidlegare enn reine antikroppstestar, men dei kan ikkje tevla med d molekylærbiologiske amplifiseringsmetodar. Som andre testar for anti-HCV kan uspesifikke antikroppar vera årsak til falskt positiv reaksjon. Lambert N (2007) «Value of HCV antigen-antibody combined HCV assay in hepatitis C diagnosis» - Dev Biol. (Basel), vol. 127, s. 113-121. PMID: 17486884 (samandrag). Vermeersch P, Van Ranst M, Lagrou K (2010) «Evaluation of the use of a combined HCV antigen/antibody assay in routine laboratory practice » - Acta Clin Belg., vol. 65, nr. 4, s. 245-247. PMID: 20954463 (samandrag).

Tyding av testsvar
Carey W (2003) «Tests and screening strategies for the diagnosis of hepatitis C» - Cleve Clin J Med., vol. 70, suppl 4, s. 7-13. PMID: 14558640. 
 ELISA/EIA RIBA/WB HCV-RNA ALAT Infeksjonsstatus Positiv Positiv Positiv ↑ Kronisk eller akutt hepatitt C Positiv Positiv Positiv Normal Hepatitt C-virusberar Positiv Negativ Negativ Normal Anti-HCV falsk positivt Positiv Positiv Negativ Normal Kan vera lækt HCV-infeksjon*
* Pasientar med kronisk HCV-infeksjon kan ha intermittent viremi. I tillegg til normale 
transaminaseverde bør av den grunn minst 2 testar for HCV-RNA med fleire vekers/månaders mellomrom vera negative om smitterisiko skal uteslutast. 

Det finst i dag ingen testar som kan skilja akutt frå kronisk hepatitt C. I både akutt og kronisk stadium kan vi få positive resultat av serologiske antikroppstestar, antigentestar og HCV-RNA. IgM kan påvisast ved både akutt og kronisk HCV-infeksjon og er ikkje til diagnostisk hjelp.  Sato S, Fujiyama S, Tanaka M, Goto M, Taura Y, Kawano S-I, Sato T, Yasuo H (1994) «IgM and IgA antibodies generated against hepatitis C virus core antigen in patients with acute and chronic HCV infection» - Dig Dis Sci., vol. 39, nr. 9, s. 2022-2031. PMID: 7521823 (samandrag)

 Kjelder

Kategori:Infeksjonssjukdommar