Ribonuklease H

Ribonuklease H (disingkat RNase H atau RNH) ialah keluarga enzim endonuklease bukan jujukan khusus yang memangkinkan pembelahan RNA dalam substrat RNA/ DNA melalui mekanisme hidrolisis. Ahli keluarga RNase H boleh ditemui dalam hampir semua organisma, daripada bakteria ke akrea serta eukariot.

Keluarga ini dibahagikan kepada kumpulan berkaitan evolusi dengan keutamaan substrat yang sedikit berbeza, ribonuklease H1 dan H2 yang ditetapkan secara umum. Genom manusia mengekod kedua-dua H1 dan H2. Ribonuklease H2 manusia ialah kompleks heterotrimer yang terdiri daripada tiga subunit, dengan mutasi dalam mana-mana daripadanya adalah antara punca genetik penyakit jarang jumpa dikenali sebagai sindrom Aicardi-Goutières.  Jenis ketiga, berkait rapat dengan H2, hanya terdapat dalam beberapa prokariot, manakala H1 dan H2 wujud dalam semua domain kehidupan. Selain itu, domain ribonuklease H retrovirus seperti RNase H1 wujud dalam protein transkripase terbalik multidomain, dikodkan oleh retrovirus seperti HIV, dan diperlukan dalam replikasi virus.

Dalam eukariota, ribonuklease H1 terlibat dalam replikasi DNA genom mitokondria. Kedua-dua H1 dan H2 terlibat dalam tugas penyelenggaraan genom seperti pemprosesan struktur gelung R.

 Pengelassan dan tatanama 
Ribonuklease H ialah keluarga enzim endonuklease dengan kekhususan substrat yang dikongsi untuk untaian RNA dupleks RNA-DNA. Secara definisi, RNase H membelah ikatan fosfodiester tulang belakang RNA untuk meninggalkan kumpulan 3' hidroksil dan 5' fosfat. RNase H telah dicadangkan sebagai ahli superkeluarga berkaitan evolusi yang merangkumi nuklease lain dan enzim pemprosesan asid nukleik seperti integrase retrovirus, transposase DNA, resolvase simpang Holliday, protein Piwi dan Argonaute, pelbagai eksonuklease, dan protein spliseosom, Prp8.

RNase H boleh dibahagikan secara meluas kepada dua subjenis, H1 dan H2, dengan atas sebab sejarah, diberi sebutan angka Arab dalam eukariot dan sebutan angka Rom dalam prokariot. Oleh itu, Escherichia coli RNase HI ialah homolog Homo sapiens RNase H1. Dalam E. coli dan banyak prokariot lain, gen rnhA mengekod HI dan gen rnhB mengekod HII. Kelas ketiga berkaitan, dipanggil HIII, wujud dalam beberapa bakteria dan arkea; ia berkait rapat dengan enzim HII prokariot.

 Struktur 
kiri|thumb| Perbandingan struktur protein ribonuklease H perwakilan daripada setiap subjenis. Dalam protein E. coli (kuning, kiri atas), empat sisa tapak aktif yang dipelihara ditunjukkan sebagai sfera. Dalam protein H. sapiens, teras struktur biasa antara subjenis H1 dan H2 ditunjukkan dalam warna merah. Struktur diberikan daripada: E. coli,   T. maritima,   B. stearothermophilus,   H. sapiens H1,   H. sapiens, 
Struktur RNase H biasanya terdiri daripada β-helaian 5 untai yang dikelilingi oleh taburan α-heliks. Semua RNase H mempunyai tapak aktif yang berpusatkan motif jujukan terpelihara yang terdiri daripada sisa aspartat dan glutamat, sering dirujuk sebagai motif DEDD. Sisa-sisa ini berinteraksi dengan ion magnesium yang diperlukan dalam pemangkinan.

RNase H2 lebih besar daripada H1, dan biasanya mempunyai heliks tambahan. Organisasi domain enzim berbeza-beza; sesetengah ahli kumpulan H1 prokariot dan eukariot kebanyakan mempunyai domain kecil tambahan di terminal N yang dikenali sebagai "domain pengikatan hibrid" yang memudahkan pengikatan kepada dupleks hibrid RNA:DNA dan kadangkala memberikan peningkatan proses. Walaupun semua ahli kumpulan H1 dan ahli prokariot kumpulan H2 berfungsi sebagai monomer, enzim H2 eukariot ialah heterotrimer wajib. Enzim HIII prokariot ialah ahli kumpulan H2 yang lebih luas, dan berkongsi kebanyakan ciri struktur dengan H2, dengan penambahan domain pengikat kotak TATA terminal N. Domain RNase H retrovirus yang wujud dalam protein transkripase terbalik multidomain mempunyai struktur yang hampir menyerupai kumpulan H1.

RNase H1 telah dikaji secara meluas untuk meneroka hubungan antara struktur dan aktiviti enzim. Ia juga digunakan, terutamanya homolog E. coli, sebagai sistem model untuk mengkaji lipatan protein. Dalam kumpulan H1, satu hubungan telah dikenal pasti antara pertalian pengikat substrat yang lebih tinggi dengan kehadiran elemen struktur yang terdiri daripada gelung heliks dan fleksibel yang menyediakan permukaan pengikat substrat yang lebih besar dan berbes. Heliks C mempunyai taburan taksonomi bertaburan; ia terdapat dalam homolog E. coli dan RNase H1 manusia, manakala tiada dalam domain HIV RNase H, tetapi contoh domain retrovirus dengan heliks C memang wujud.

 Fungsi 
Enzim ribonuklease H membelah ikatan fosfodiester RNA dalam dwiuntai hirbid RNA:DNA, meninggalkan kumpulan 3' hidroksil dan 5' fosfat di kedua-dua hujung tapak potong dengan mekanisme pemangkinan dua ion logam, di mana dua kation dwivalen seperti Mg2+ dan Mn2+, mengambil bahagian secara langsung dalam fungsi pemangkinan. Bergantung kepada perbezaan dalam jujukan asid amino mereka, RNase H ini dikelaskan kepada jenis 1 dan jenis 2. Jenis 1 terdiri daripada jenis RNase H1 prokariot dan eukariot, dan RNase H retrovirus. Jenis 2 pula diwakili RNase H2 prokariot dan eukariot, dan RNase H3 bakteria. RNase H ini wujud dalam bentuk monomer, kecuali RNase H2 eukariot yang wujud dalam bentuk heterotrimer. RNase H1 dan H2 mempunyai keutamaan substrat, dengan fungsi yang berbeza tetapi bertindih dalam sel. Dalam prokariot dan eukariot darjat rendah, kedua-dua enzim tidak penting, manakala kedua-duanya dipercayai penting dalam eukariot darjat lebih tinggi. Aktiviti gabungan kedua-dua enzim H1 dan H2 dikaitkan dengan pengekalan kestabilan genom disebabkan penguraian enzim komponen RNA bagi gelung R.

 Ribonuklease H1 

Enzim Ribonuklease H1 memerlukan sekurang-kurangnya empat pasangan bes yang mengandungi ribonukleotida dalam substrat dan tidak boleh mengeluarkan satu ribonukleotida daripada helai yang sebaliknya terdiri daripada deoksiribonukleotida. Atas sebab ini, dianggap tidak mungkin enzim RNase H1 terlibat dalam pemprosesan primer RNA daripada serpihan Okazaki semasa replikasi DNA. RNase H1 tidak penting dalam organisma unisel di mana ia telah disiasat; dalam E. coli, organisma kalah mati RNase H1 memberikan fenotip sensitif suhu, dan dalam S. cerevisiae, ia menghasilkan kecacatan dalam tindak balas tekanan.

Dalam kebanyakan eukariot termasuk mamalia, gen RNase H1 termasuk jujukan penyasaran mitokondria yang membawa kepada ekspresi isoform dengan dan tanpa kehadiran MTS. Akibatnya, RNase H1 disetempatkan di kedua-dua mitokondria dan nukleus. Dalam model tikus kalah mati, mutan sifar RNase H1 maut semasa embriogenesis disebabkan oleh kecacatan dalam mereplikasi DNA mitokondrion. Kecacatan dalam replikasi DNA mitokondrion oleh kehilangan RNase H1 mungkin disebabkan oleh kecacatan dalam pemprosesan gelung R.

 Ribonuklease H2 

Dalam prokariot, RNase H2 ialah enzim aktif sebagai protein monomer. Dalam eukariot, ia merupakan heterotrimer wajib yang terdiri daripada subunit pemangkin A dan subunit struktur B dan C. Walaupun subunit A hampir homolog dengan RNase H2 prokariot, subunit B dan C tidak mempunyai homolog yang jelas dalam prokariot, dan kurang terpelihara dalam jujukan walaupun dalam kalangan eukariot. Subunit B mengantara interaksi protein-protein antara kompleks H2 dan PCNA yang menyetempatkan H2 kepada fokus replikasi.

Kedua-dua enzim H2 prokariot dan eukariot boleh membelah ribonukleotida tunggal dalam untaian. Bagaimanapun, ia mempunyai corak belahan dan keutamaan substrat yang sedikit berbeza: enzim prokariot mempunyai keprosesan yang lebih rendah, dan menghidrolisis ribonukleotida berturutan dengan lebih cekap daripada ribonukleotida dengan deoksiribonukleotida 5', manakala enzim eukariot memiliki keprosesan lebih tinggi, dan menghidrolisis kedua-dua jenis substrat dengan kecekapan yang sama. Kekhususan substrat RNase H2 memberikannya peranan dalam pembaikan pemotongan ribonukleotida, mengeluarkan ribonukleotida tersalah letak daripada DNA, sebagai tambahan kepada pemprosesan gelung R. Walaupun kedua-dua H1 dan H2 terdapat dalam nukleus sel mamalia, H2 ialah sumber dominan aktiviti RNase H di sana, dan penting untuk mengekalkan kestabilan genom.

Sesetengah prokariot mempunyai gen jenis H2 tambahan yang ditetapkan sebagai RNase HIII dalam tatanama angka Rom yang digunakan bagi gen prokariot. Protein HIII lebih berkait rapat dengan kumpulan H2 mengikut identiti jujukan dan persamaan struktur, tetapi mempunyai keutamaan substrat yang lebih hampir menyerupai H1. Tidak seperti HI dan HII yang kedua-duanya wujud meluas dalam kalangan prokariot, HIII hanya terdapat dalam beberapa organisma dengan taburan taksonomi yang tersebar; ia agak lebih biasa dalam arkea, dan jarang atau tidak pernah ditemui dalam genom prokariot yang sama seperti HI.

 Mekanisme 
alt=RNase H reaction mechanism|thumb| Mekanisme tindak balas pemangkinan RNase H menggunakan dua ion logam dalam domain RNase H HIV-1
Tapak aktif hampir semua RNase H mengandungi empat sisa asid amino bercas negatif, yang dikenali sebagai motif DEDD; selalunya histidina, cth., dalam HIV-1, manusia serta E. coli.

Sisa bercas mengikat dua ion logam yang diperlukan dalam pemangkinan; dalam keadaan fisiologi, ini adalah ion magnesium, tetapi mangan juga biasanya menyokong aktiviti enzim, manakala kalsium atau kepekatan tinggi Mg2+ menghalang aktiviti.

Berdasarkan bukti eksperimen dan simulasi komputer, enzim mengaktifkan molekul air yang terikat pada salah satu ion logam dengan histidina terpelihara. Keadaan peralihan adalah bersifat bersekutu, dan membentuk perantaraan dengan fosfat terproton dan alkoksida ternyahproton sebagai kumpulan keluar. Kumpulan keluar diprotonkan melalui glutamat yang mempunyai pKa tinggi, dan berkemungkinan terproton. Mekanisme ini serupa dengan RNase T dan subunit RuvC dalam enzim Cas9 yang kedua-duanya juga menggunakan histidina dan mekanisme dua ion logam.

Mekanisme pelepasan produk terbelah masih belum diselesaikan. Bukti eksperimen daripada kristalografi diselesaikan masa dan nuklease serupa menunjukkan peranan ion ketiga dalam tindak balas yang diambil ke tapak aktif.

 Dalam biologi manusia 
Genom manusia mengandungi empat gen pengekodan RNase H:

 RNASEH1, contoh subjenis H1 (monomer).
 RNASEH2A, subunit pemangkin kompleks H2 trimer
 RNASEH2B, subunit struktur kompleks H2 trimer
 RNASEH2C, subunit struktur kompleks H2 trimer

Di samping itu, bahan genetik asal retrovirus sering muncul dalam genom, mencerminkan integrasi genom retrovirus endogen manusia. Peristiwa pemasukan sedemikian mengakibatkan kehadiran gen pengekodan transkriptase terbalik retrovirus yang merangkumi domain RNase H seperti ERVK6. Retrotransposon ulangan terminal panjang (LTR) dan ulangan terminal tidak panjang (bukan LTR) juga biasa dalam genom, dan selalunya termasuk domain RNase H mereka sendiri, dengan sejarah evolusi yang kompleks.

 Peranan dalam penyakit 
kiri|thumb| Struktur kompleks H2 manusia trimer dengan subunit pemangkin A berwarna biru, subunit struktur B berwarna coklat, dan subunit struktur C berwarna merah jambu. Walaupun subunit B dan C tidak berinteraksi dengan tapak aktif, ia diperlukan dalam aktiviti. Sisa pemangkin dalam tapak aktif ditunjukkan dalam warna magenta. Kedudukan yang ditunjukkan dalam warna kuning memiliki mutasi AGS yang diketahui. Mutasi AGS yang paling biasa - alanina kepada treoninea pada kedudukan 177 subunit B - ditunjukkan sebagai sfera hijau. Kebanyakan mutasi ini tidak mengganggu aktiviti pemangkin in vitro, tetapi menjejaskan kestabilan kompleks atau mengganggu interaksi protein-protein dengan protein lain dalam sel.
Dalam kajian kecil, mutasi dalam RNase H1 manusia telah dikaitkan dengan oftalmoplegia luaran progresif kronik, ciri umum penyakit mitokondrion.

Mutasi dalam mana-mana daripada tiga subunit RNase H2 sudah mantap sebagai punca gangguan genetik jarang jumpa yang dikenali sebagai sindrom Aicardi-Goutières (AGS) yang menjelma sebagai gejala neurologi dan dermatologi pada usia awal. Gejala AGS hampir sama dengan jangkitan virus kongenital, dan dikaitkan dengan kawal atur interferon jenis I yang tidak sesuai. AGS juga boleh disebabkan oleh mutasi dalam gen lain: TREX1, SAMHD1, ADAR dan MDA5/IFIH1, yang kesemuanya terlibat dalam pemprosesan asid nukleik. Pencirian taburan mutasi dalam populasi pesakit AGS mendapati 5% daripada semua mutasi AGS dalam RNASEH2A, 36% dalam 2B, dan 12% dalam 2C.  Mutasi dalam 2B telah dikaitkan dengan kemerosotan neurologi yang agak ringan, dan ketiadaan kawal atur peningkatan gen cetusan interferon yang boleh dikesan pada pesakit dengan genotip berkaitan AGS lain.

 Dalam virus 
kiri|thumb| Struktur kristal heterodimer transkripase terbalik HIV (kuning dan hijau), dengan domain RNase H ditunjukkan dalam warna biru (tapak aktif dalam sfera magenta). Untaian asid nukleik oren ialah RNA, dan untaian merah ialah DNA.
Dua kumpulan virus menggunakan transkripsi terbalik sebagai sebahagian daripada kitaran hayatnya: retrovirus yang mengekod genomnya dalam RNA untai tunggal dan mereplikasi melalui perantaraan DNA untai dua; dan virus dsDNA-RT, yang mereplikasi genom DNA rantai dua melalui perantaraan "pragenom" RNA. Contoh patogenik termasuk HIV dan virus hepatitis B, masing-masing. Kedua-dua mengekod protein transkripase terbalik (RT) pelbagai fungsi besar yang mengandungi domain RNase H.

Protein RT retrovirus daripada HIV-1 dan virus leukemia murin ialah ahli keluarga yang paling lazim dikaji. RT retrovirus bertanggungjawab dalam menukar genom RNA untai tunggal virus kepada DNA dwiuntai. Proses ini memerlukan tiga langkah: pertama, aktiviti polimerase DNA bergantungan RNA menghasilkan DNA untai tolak daripada templat RNA untai tambah, menghasilkan perantara hibrid RNA:DNA; kedua, helai RNA dimusnahkan; dan ketiga, aktiviti polimerase DNA bergantungan DNA mensintesis DNA untai tambah, menghasilkan DNA dwiuntai sebagai produk akhir. Langkah kedua proses ini dijalankan oleh domain RNase H yang terletak di terminal C protein RT.</ref>

RNase H melakukan tiga jenis tindakan pembelahan: penguraian tak khusus genom RNA untai tambah, penyingkiran khusus primer tRNA untai tolak, dan penyingkiran primer saluran polipurina (PPT) yang kaya purina tambah. RNase H memainkan peranan dalam pemprimeran untaian tambah, tetapi bukan dalam kaedah konvensional untuk mensintesis jujukan primer baharu. Sebaliknya, RNase H mencipta "primer" daripada PPT yang tahan belahan RNase H. Dengan mengalih keluar semua tapak kecuali PPT, PPT digunakan sebagai penanda penghujung kawasan U3 ulangan terminal panjangnya.

Oleh kerana aktiviti RNase H diperlukan dalam percambahan virus, domain ini telah dianggap sebagai sasaran ubat bagi pembangunan ubat antiretrovirus yang digunakan dalam rawatan HIV/AIDS dan keadaan lain yang disebabkan oleh retrovirus. Perencat RNase H retrovirus dalam beberapa kemotip berbeza telah dikenal pasti, kebanyakannya mempunyai mekanisme tindakan berdasarkan pengkelatan kation tapak aktif. Perencat transkriptase terbalik yang secara khusus menghalang fungsi polimerase RT adalah dalam penggunaan klinikal yang meluas, tetapi bukan perencat fungsi RNase H; ia adalah satu-satunya fungsi enzim dikodkan HIV yang belum disasarkan oleh ubat-ubatan dalam penggunaan klinikal.

 Evolusi 
RNase H wujud secara meluas, dan wujud dalam semua domain kehidupan. Keluarga ini tergolong dalam superkeluarga enzim nuklease yang lebih besar dan dianggap kuno dalam evolusi. Dalam genom prokariot, pelbagai gen RNase H sering wujud, tetapi terdapat sedikit korelasi antara kejadian gen HI, HII dan HIII kepada hubungan filogenetik keseluruhan, menunjukkan bahawa pemindahan gen mendatar mungkin memainkan peranan dalam mewujudkan taburan enzim ini. RNase HI dan HIII jarang atau tidak pernah muncul dalam genom prokariot yang sama. Apabila genom organisma mengandungi lebih daripada satu gen RNase H, ia kadangkala mempunyai perbezaan yang ketara dalam tahap aktiviti. Pemerhatian ini telah dicadangkan untuk mencerminkan corak evolusi yang mengurangkan pelewahan berfungsi di kalangan gen RNase H. RNase HIII yang unik kepada prokariot mempunyai taburan taksonomi yang berselerak, dan terdapat dalam kedua-dua bakteria dan arkea; ia dipercayai telah menyimpang dari HII agak awal.

Trajektori evolusi RNase H2 dalam eukariot, terutamanya mekanisme di mana homolog eukariot menjadi heterotrimer wajib, masih tidak jelas; subunit B dan C tidak mempunyai homolog yang jelas dalam prokariot.

 Aplikasi 
Oleh kerana RNase H secara khusus merendahkan hanya RNA dalam hibrid RNA:DNA dwiuntai, ia biasanya digunakan sebagai reagen makmal dalam biologi molekul. Persediaan tulen E. coli RNase HI dan HII tersedia secara komersial. RNase HI sering digunakan untuk memusnahkan templat RNA selepas sintesis DNA pelengkap (cDNA) untaian pertama melalui transkripsi terbalik. Ia juga boleh digunakan untuk membelah urutan RNA tertentu dengan kehadiran segmen pendek pelengkap DNA. Teknik yang sangat sensitif seperti resonans plasmon permukaan boleh digunakan untuk pengesanan. RNase HII boleh digunakan untuk merendahkan komponen primer RNA bagi serpihan Okazaki atau memperkenalkan samaran beruntai tunggal di kedudukan yang mengandungi ribonukleotida. Satu varian PCR permulaan panas, dikenali sebagai PCR bergantungan RNase H atau rhPCR, telah diterangkan menggunakan RNase HII stabil haba daripada arkea hipertermofil Pyrococcus abyssi. Nota, protein perencat ribonuklease yang biasa digunakan sebagai reagen tidak berkesan untuk menghalang aktiviti sama ada HI atau HII.

 Sejarah 
Ribonukleases H pertama kali ditemui di makmal Peter Hausen apabila penyelidik menemui aktiviti endonuklease hibrid RNA:DNA dalam timus anak lembu pada tahun 1969 dan memberikannya nama "ribonuklease H " untuk menetapkan kekhususan hibridnya. Aktiviti RNase H kemudiannya ditemui dalam E. coli dan dalam sampel onkovirus dengan genom RNA semasa kajian awal transkripsi songsang virus. Ia kemudiannya menjadi jelas bahawa ekstrak timus anak lembu mengandungi lebih daripada satu protein dengan aktiviti RNase H, dan E. coli mengandungi dua gen RNase H. Pada asalnya, enzim yang kini dikenali sebagai RNase H2 eukariot telah ditetapkan sebagai H1 dan sebaliknya, tetapi nama enzim eukariot telah ditukar untuk memadankan mereka dalam E. coli bagi memudahkan analisis perbandingan, menghasilkan tatanama moden di mana enzim prokariot ditetapkan dengan angka Rom dan enzim eukariot pula dengan angka Arab. RNase HIII prokariot yang dilaporkan pada tahun 1999 ialah subjenis RNase H terkini yang dikenal pasti.

Pencirian RNase H2 eukariot ialah satu cabaran sejarah, sebahagiannya disebabkan oleh kelimpahannya yang rendah. Usaha berhati-hati dalam penulenan enzim mencadangkan bahawa tidak seperti E. coli RNase H2, enzim eukariotik mempunyai beberapa subunit. Homolog S. cerevisiae protein E. coli (iaitu subunit H2A) mudah dikenal pasti oleh bioinformatik apabila genom yis dijujukkan, tetapi protein yang sepadan didapati tidak mempunyai aktiviti enzim secara berasingan. Akhirnya, subunit yis B dan C telah diasingkan dengan penulenan bersama, dan didapati diperlukan dalam aktiviti enzim. Walau bagaimanapun, subunit yis B dan C mempunyai identiti jujukan yang sangat rendah kepada homolog mereka dalam organisma lain, dan protein manusia yang sepadan telah dikenal pasti secara muktamad hanya selepas mutasi dalam ketiga-tiga didapati menyebabkan sindrom Aicardi-Goutières. 

 Rujukan 

 Pautan luar 

 Entri GeneReviews/NCBI/NIH/UW mengenai Sindrom Aicardi-Goutières
  di   

Kategori:Biologi molekul
Kategori:EC 3.1.26
Kategori:Ribonuklease