Nuklease

Dalam biokimia, nuklease (juga dikenali sebagai nukleodepolimerase atau polinukleotidase) ialah enzim yang mampu membelah ikatan fosfodiester di antara nukleotida asid nukleik. Nuklease memberi kesan yang berbeza-beza kepada patah terkandas tunggal dan berganda dalam molekul sasarannya. Dalam organisma hidup, ia adalah jentera penting dalam banyak aspek pembaikan DNA. Kecacatan pada nuklease tertentu boleh menyebabkan ketidakstabilan genetik atau kekurangan imun. Nuklease juga digunakan secara meluas dalam pengeklonan molekul.

Terdapat dua pengelasan utama berdasarkan lokus aktiviti. Eksonuklease mencerna asid nukleik dari hujungnya. Endonuklease bertindak pada kawasan di tengah-tengah molekul sasaran. Ia selanjutnya dikelaskan kepada deoksiribonuklease (DNase) dan ribonuklease (RNase), dengan jenis pertama bertindak terhadap DNA, dan jenis kedua pula terhadap RNA.

 Sejarah 
Pada akhir 1960-an, saintis Stuart Linn dan Werner Arber mengasingkan contoh dua jenis enzim yang bertanggungjawab untuk sekatan pertumbuhan faj dalam bakteria Escherichia coli (E. coli). Salah satu daripada enzim ini menambah kumpulan metil pada DNA, menghasilkan DNA bermetil, manakala yang lain membelah DNA tidak metilasi pada pelbagai lokasi di sepanjang molekul. Jenis pertama enzim dipanggil "metilase" dan satu lagi ialah "nuklease pemotongan". Alat enzim ini penting kepada saintis yang sedang mengumpulkan alat yang diperlukan untuk "memotong dan menampal" molekul DNA. Apa yang diperlukan ketika itu ialah alat yang akan memotong DNA di tapak tertentu, bukannya di tapak rawak sepanjang molekul, supaya saintis boleh memotong molekul DNA dengan cara yang boleh diramal dan boleh dihasilkan semula.

Perkembangan penting berlaku apabila HO Smith, KW Wilcox, dan TJ Kelly yang bekerja di Universiti Johns Hopkins pada 1968 mengasingkan dan mencirikan nuklease pemotongan pertama yang berfungsi bergantung pada jujukan nukleotida DNA tertentu. Bekerja dengan bakteria Haemophilus influenzae, kumpulan ini mengasingkan enzim dipanggil HindII yang sentiasa memotong molekul DNA di titik tertentu dalam urutan tertentu enam pasangan asas. Mereka mendapati bahawa enzim HindII sentiasa memotong terus di tengah-tengah jujukan ini (antara pasangan bes ke-3 dan ke-4).

 Pengelasan 
Kebanyakan nuklease dikelaskan mengikut nombor Suruhanjaya Enzim dalam "Jawatankuasa Tatanama Kesatuan Biokimia dan Biologi Molekul Antarabangsa" sebagai hidrolase (nombor EC 3). Nuklease tergolong sama seperti fosfodiesterase, lipase dan fosfatase kepada esterase (EC-nombor 3.1), subkumpulan hidrolase. Esterase yang dimiliki oleh nuklease dikelaskan dengan nombor EC 3.1.11 - nombor EC 3.1.31.

 Struktur 
Struktur primer nuklease pada umumnya tidak terpelihara dengan baik dan terpelihara minima di tapak aktif, permukaannya terdiri terutamanya daripada sisa asid amino berasid dan asas. Nuklease boleh dikelaskan kepada keluarga pelipatan.

 Pengiktirafan tapak 
Nuklease mesti bersatu dengan asid nukleik sebelum ia boleh membelah molekul, dan ini memerlukan kebolehan pengiktirafan. Nuklease menggunakan pelbagai penyatuan tidak khusus serta khusus dalam cara pengiktirafan dan pengikatannya. Kedua-dua mod memainkan peranan penting dalam organisma hidup, terutamanya dalam pembaikan DNA.

Endonuklease tidak khusus yang terlibat dalam pembaikan DNA boleh mengimbas DNA bagi jujukan sasaran atau kerosakan. Nuklease sedemikian meresap sepanjang DNA sehingga ia menemui sasaran, di mana sisa tapak aktifnya berinteraksi dengan kumpulan kimia DNA. Dalam kes endonuklease seperti EcoRV, BamHI dan PvuII, pengikatan tidak khusus ini melibatkan interaksi elektrostatik antara luas permukaan minimum protein dan DNA. Pengikatan yang lemah ini menyebabkan bentuk keseluruhan DNA tidak berubah bentuk, kekal dalam bentuk B.

Nuklease khusus tapak pulu membentuk penyatuan yang jauh lebih kuat. Ia menarik DNA ke dalam alur dalam domain pengikat DNA-nya. Ini mengakibatkan ubah bentuk ketara struktur tertier DNA dan dicapai dengan permukaan yang kaya dengan sisa bes (bercas positif). Ia terlibat dalam interaksi elektrostatik yang meluas dengan DNA.

Sesetengah nuklease yang terlibat dalam pembaikan DNA mempamerkan kekhususan jujukan separa. Walau bagaimanapun, kebanyakannya tidak khusus, dan sebaliknya mengiktiraf keabnormalan struktur yang dihasilkan dalam tulang belakang DNA oleh ketidakpadanan pasangan bes.

 Nuklease khusus jujukan 
Enzim Sumber Jujukan pengiktirafan Pemotongan Hind II Haemophilus influenzae 5'–GTYRAC–3'3'–CARYTG–5' 5'–   –3'3'–   –5' R = A atau G; Y = C atau T
Terdapat lebih daripada 900 enzim pemotongan, dengan beberapa jenis adalah khusus dan beberapa pula tidak, dan telah diasingkan daripada lebih 230 strain bakteria sejak penemuan awal HindII. Enzim pemotongan ini secara amnya mempunyai nama yang mencerminkan asal usulnya — Huruf pertama nama itu berasal daripada genus dan dua huruf kedua berasal daripada spesies sel prokariotik dari mana ia diasingkan. Contohnya, EcoRI berasal daripada bakteria Escherichia coli RY13, manakala HindII berasal daripada strain Haemophilus influenzae Rd. Nombor menuruti mengikuti nama nuklease menunjukkan turutan enzim diasingkan daripada strain tunggal bakteria: EcoRI, EcoRII.

 Endonuklease 
Endonuklease sekatan berfungsi dengan "mengimbas" panjang molekul DNA. Sebaik sahaja ia menemui urutan pengecaman khususnya, ia akan mengikat molekul DNA dan membuat satu potongan di setiap dua tulang belakang gula-fosfat. Kedudukan kedua-dua potongan ini, kedua-duanya berhubung antara satu sama lain, dan dengan urutan pengecaman itu sendiri, ditentukan oleh identiti endonuklease sekatan. Endonuklease yang berbeza menghasilkan set potongan yang berbeza, tetapi satu endonuklease akan sentiasa memotong jujukan bes tertentu dengan cara yang sama, tidak kira apa molekul DNA ia bertindak. Apabila pemotongan telah dibuat, molekul DNA akan pecah menjadi serpihan.

 Pemotongan bertingkat 
Tidak semua endonuklease sekatan dipotong secara simetri dan meninggalkan hujung tumpul seperti HindII yang diterangkan di atas. Banyak endonuklease membelah tulang belakang DNA dalam kedudukan yang tidak bertentangan antara satu sama lain, mewujudkan satu lebihan. Contohnya, EcoRI nuklease mempunyai jujukan pengecaman5'—GAATTC—3'.
Enzim Sumber Jujukan pengiktirafan Pemotongan HindIII Haemophilus influenzae 5'–AAGCTT–3'3'–TTCGAA–5' 5'–   –3'3'–   –5' EcoRI Escherichia coli 5'–GAATTC-3'3'–CTTAAG–5' 5'–   –3'3'–   –5' BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5'–GGATCC–3'3'–CCTAGG–5' 5'–   –3'3'–   –5'
Apabila enzim menemui jujukan ini, ia membelah setiap tulang belakang antara G dan sisa bes A yang paling hampir. Apabila pemotongan telah dibuat, serpihan yang terhasil hanya disatukan oleh ikatan hidrogen yang agak lemah yang memegang bes pelengkap antara satu sama lain. Kelemahan ikatan ini membolehkan serpihan DNA terpisah antara satu sama lain. Setiap serpihan yang terhasil mempunyai hujung 5' yang menonjol terdiri daripada tapak yang tidak berpasangan. Enzim lain mencipta luka pada tulang belakang DNA yang mengakibatkan hujung 3' menonjol. Hujung terkeluar — kedua-duanya 3' dan 5' — kadangkala dipanggil "hujung melekit" kerana ia cenderung terikat dengan jujukan tapak pelengkap. Dalam erti kata lain, jika panjang tapak yang tidak berpasangan5'—AATT—3' menemui satu lagi panjang tidak berpasangan dengan urutan3'—TTAA—5' mereka akan terikat antara satu sama lain — ia "melekat" antara satu sama lain. Enzim ligase kemudiannya digunakan untuk bergabung dengan tulang belakang fosfat kedua-dua molekul. Asal sel ataupun asal spesies tidak menjejaskan kelekatannya. Mana-mana pasangan jujukan pelengkap akan cenderung terikat, walaupun salah satu jujukan berasal dari DNA manusia, dan satu lagi berasal dari panjang DNA bakteria. Malah, kualiti kelekitan inilah yang membolehkan penghasilan molekul DNA rekombinan, molekul yang terdiri daripada DNA daripada sumber yang berbeza, dan yang telah melahirkan teknologi kejuruteraan genetik.

 Peranan semula jadi 

 Pembaikan DNA 
Dengan semua sel bergantung kepada DNA sebagai medium maklumat genetik, kawalan kualiti genetik adalah fungsi penting bagi semua organisma. Replikasi DNA ialah proses yang terdedah kepada ralat, dan molekul DNA sendiri terdedah kepada pengubahsuaian oleh banyak tekanan metabolik dan persekitaran. Contoh lazim termasuk spesies oksigen reaktif, berhampiran sinaran ultraungu, dan sinaran pengion. Banyak nuklease mengambil bahagian dalam pembaikan DNA dengan mengenali tapak kerosakan dan memisahkannya daripada DNA sekeliling. Enzim ini berfungsi secara bebas atau dalam kompleks. Kebanyakan nuklease yang terlibat dalam pembaikan DNA bersifat tidak khusus. Ia mengenali tapak kerosakan melalui ubah bentuk struktur sekunder DNA dwiuntai (dsDNA).

 Pembacaan pruf replikasi 
Semasa replikasi DNA, DNA polimerase memanjangkan helai DNA baharu terhadap helai templat pelengkap. Kebanyakan polimerase DNA terdiri daripada dua domain enzim yang berbeza: polimerase dan eksonuklease pembacaan pruf. Polimerase membentuk untaian baru dalam arah 5' → 3'. Eksonuklease mengeluarkan nukleotida yang salah dari helai yang sama dalam arah 3' → 5'. Aktiviti eksonuklease ini penting dalam keupayaan DNA polimerase bagi membaca pruf. Pemadaman yang menyahaktifkan atau mengalih keluar nuklease ini dapat meningkatkan kadar mutasi dan kematian dalam mikrob yang terjejas, serta kanser pada tikus.

 Garpu replikasi terhenti 
Banyak bentuk kerosakan DNA menghentikan perkembangan garpu replikasi, menyebabkan DNA polimerase dan jentera yang berkaitan meninggalkan garpu. Ia kemudiannya mesti diproses oleh protein khusus garpu. Protein yang paling ketara ialah MUS81. Pemadaman yang menyebabkan sensitiviti kerosakan UV atau pemetilan dalam yis, selain kecacatan meiosis.

 Pemprosesan serpihan Okazaki 
Satu tugas selalu buat di dalam sel ialah penyingkiran primer RNA serpihan Okazaki daripada replikasi. Kebanyakan primer sedemikian dikeluarkan daripada DNA untai tertinggal yang baru disintesis oleh endonuklease keluarga RNase H. Dalam eukariot dan arkea, endonuklease kepak FEN1 juga mengambil bahagian dalam pemprosesan serpihan Okazaki.

 Pembaikan ketidakpadanan 
Pembaikan ketidakpadanan DNA dalam mana-mana organisma tertentu dilakukan oleh satu set endonuklease khusus yang tidak padan. Dalam prokariot, peranan ini terutamanya diisi oleh MutSLH dan protein berkaitan pembaikan tampalan sangat pendek (pembaikan VSP).

Sistem MutSLH (terdiri daripada MutS, MutL dan MutH) membetulkan mutasi titik dan pusingan kecil. MutS mengenali dan mengikat ketidakpadanan, di mana ia merekrut MutL dan MutH. MutL mengantara interaksi antara MutS dan MutH, dan meningkatkan aktiviti endonuklease MutH. MutH mengiktiraf tapak5'—GATC—3' berhemimetil, dan membelah di sebelahG di helai tak bermetil (untaian baharu).

Pembaikan VSP dimulakan oleh endonuklease Vsr. Ia membetulkan ketidakpadananT/G tertentu yang disebabkan oleh penyahaminaan spontan sitosina bermetil kepada timina. Vsr mengenali jujukan5'—CTWGG—3', di mana ia menjerutkan untaian DNA di sisi 5' timina yang tidak sepadan (digariskan dalam jujukan sebelumnya). Salah satu eksonucleases RecJ, ExoVII, atau ExoI kemudiannya menguraikan tapak sebelum DNA polimerase mensintesis semula jurang dalam helai.

 Pembaikan pemotongan bes 
Pembentukan tapak AP ialah kejadian biasa dalam dsDNA. Ia merupakan hasil daripada hidrolisis spontan dan aktiviti DNA glikosilase sebagai langkah perantara dalam pembaikan pemotongan bes. Tapak AP ini dialih keluar oleh AP endonuklease yang memberi kesan kepada pecahan helai tunggal di sekeliling tapak.

 Pembaikan pemotongan nukleotida 
Pembaikan pemotongan nukleotida, tidak boleh dikelirukan dengan pembaikan pemotongan bes, melibatkan penyingkiran dan penggantian nukleotida yang rosak. Kejadian penyambungan silang, penambahan dan lesi (dijana oleh cahaya ultralembayung atau spesies oksigen reaktif) boleh mencetuskan laluan pembaikan ini. Regangan pendek DNA untai tunggal dengan nukleotida rosak itu dikeluarkan daripada DNA dupleks oleh endonuklease berasingan yang memberi kesan ke atas dan hilir kerosakan. Penghapusan atau mutasi yang menjejaskan nuklease ini mencetuskan peningkatan kepekaan terhadap kerosakan ultralembayung dan karsinogenesis. Keabnormalan sedemikian boleh menjejaskan perkembangan saraf.

Dalam bakteria, kedua-dua pemotongan dilakukan oleh kompleks UvrB-UvrC. Dalam yis tunas, Rad2 dan kompleks Rad1-Rad10 masing-masing membuat potongan 5' dan 3'. Dalam mamalia, homolog XPG dan XPF-ERCC1 mempengaruhi pemotongan yang sama.

 Pembaikan pemutusan dwiuntai 
Pemotongan dwiuntai, sama ada disengajakan atau tidak, kerap berlaku dalam sel. Pemecahan yang tidak disengajakan biasanya dihasilkan oleh sinaran pengion, pelbagai agen kimia eksogen dan endogen, dan garpu replikasi yang terhenti. Pemecahan yang disengajakan dijana sebagai perantara dalam meiosis dan rekombinasi V(D)J, dan terutamanya dibaiki melalui rekombinasi homolog dan penyambungan hujung bukan homolog. Kedua-dua kes memerlukan hujung dalam pemisah helai berganda diproses oleh nuklease sebelum pembaikan boleh dilakukan. Satu nuklease sedemikian ialah Mre11 dikomplekskan dengan Rad50. Mutasi Mre11 boleh mencetuskan gangguan seperti ataksia-telangiektasia.

Penggabungan semula V(D)J melibatkan pembukaan struktur gelung batang yang dikaitkan dengan pecahan dua helai dan seterusnya bercantum kedua-dua hujungnya. Kompleks Artemis-DNAPKcs mengambil bahagian dalam tindak balas ini. Walaupun Artemis mempamerkan aktiviti eksonuklease DNA 5' → 3' ssDNA apabila bersendirian, pengkompleksannya dengan DNA-PKcs membolehkan pemprosesan endonuklease gelung batang. Kecacatan salah satu protein menyebabkan kemerosotan imun yang teruk.

Rekombinasi homolog pula melibatkan dua dupleks DNA homolog yang disambungkan oleh gelung D atau persimpangan Holliday. Dalam bakteria, endonuklease seperti RuvC menyelesaikan persimpangan Holliday menjadi dua dsDNA berasingan dengan membelah persimpangan di dua tapak simetri berhampiran pusat persimpangan. Dalam eukariot, FEN1, XPF-ERCC1 dan MUS81 membelah gelung D, dan Cce1/Ydc2 memproses persimpangan Holliday dalam mitokondria.

 Meganuklease 
Kekerapan nuklease tertentu akan memotong molekul DNA tertentu bergantung pada kerumitan DNA dan panjang jujukan pengecaman nuklease; disebabkan kemungkinan statistik untuk mencari bes dalam susunan tertentu secara kebetulan, urutan pengecaman yang lebih panjang akan mengakibatkan pemotongan yang kurang kerap. Sebagai contoh, jujukan empat bes yang diberikan (bersamaan dengan tapak pengecaman nuklease andaian) akan diramalkan wujud setiap 256 pasangan bes secara purata (di mana 44 = 256), tetapi sebarang jujukan enam bes dijangkakan wujud sekali setiap 4,096 pasangan bes secara purata (46 = 4096).

Satu keluarga unik nuklease ialah meganuklease yang dicirikan mempunyai jujukan pengecaman yang lebih besar, dan oleh itu, kurang lazim, yang terdiri daripada 12 hingga 40 pasangan bes. Nuklease ini amat berguna dalam kejuruteraan genetik dan aplikasi kejuruteraan genom dalam organisma kompleks seperti tumbuhan dan mamalia dengan genom yang lebih besar (berbilion pasangan bes), di mana penggunaan nuklease lazim akan mengakibatkan pemotongan khusus tapak yang kerap dan merosakkan.

 Rujukan 

 Pautan luar 
 Carta Contoh Enzim Pemotongan
 Tindakan Enzim Pemotongan EcoRI
 Glosari enzim
 Nucleases

Kategori:EC 3.1