Deoksiribonuklease

Deoksiribonuklease atau singkatannya DNase merujuk kepada kumpulan endonuklease glikoprotein yang merupakan enzim yang memangkinkan pembelahan hidrolisis ikatan fosfodiester dalam tulang belakang DNA, sekali gus menguraikan DNA. Peranan enzim DNase dalam sel termasuk memecahkan DNA ekstrasel (ecDNA) yang dikumuhkan oleh apoptosis, nekrosis dan perangkap ekstrasel neutrofil (NET) dalam sel untuk membantu mengurangkan tindak balas keradangan yang sebaliknya ditimbulkan. Pelbagai jenis deoksiribonuklease diketahui dan termasuk dalam satu daripada dua keluarga (DNase I atau DNase II), yang berbeza dalam kekhususan substrat, mekanisme kimia dan fungsi biologinya. Aplikasi makmal DNase termasuk penulenan protein apabila diekstrak daripada organisma prokariot. Selain itu, DNase telah digunakan sebagai rawatan untuk penyakit yang disebabkan oleh ecDNA dalam plasma darah. Ujian DNase juga muncul dalam bidang penyelidikan.

 Jenis 
Dua jenis DNase utama yang terdapat pada haiwan dikenali sebagai deoksiribonuklease I (DNase I) dan deoksiribonuklease II (DNase II). Kedua-dua keluarga ini mempunyai subkategori di dalamnya.

 Keluarga DNase I 
Set pertama DNase ialah DNase I. Keluarga ini terdiri daripada DNase I, DNase1L1, DNase 1L2 dan DNase1L3. DNase I membelah DNA untuk membentuk dua produk akhir oligonukleotida dengan hujung 5'-fosfo dan 3'-hidroksi, dan dihasilkan terutamanya oleh organ sistem pencernaan. Keluarga DNase I memerlukan kation Ca2+ dan Mg2+ sebagai pengaktif, dan diekspresikan secara selektif. Dari segi pH, keluarga DNAses I aktif dalam pH normal sekitar 6.5 hingga 8.

 Keluarga DNase II 
Set kedua DNAase ialah DNase II. Keluarga ini terdiri daripada DNase II ɑ dan DNase II ꞵ. Seperti DNAase I, DNAase II membelah DNA untuk membentuk dua produk akhir oligonukleotida dengan hujung 5'-hidroksi dan 3'-fosfo. Jenis DNAase ini lebih banyak dinyatakan dalam tisu kerana ekspresi tinggi dalam makrofaj, tetapi ekspresi jenis sel terhad. Tidak seperti DNAase I, mereka tidak memerlukan kation Ca2+ dan Mg2+ sebagai pengaktif. Dari segi pH, keluarga DNAase II diekspresikan dalam pH berasid. Corak belahan DNase II diubah dengan kehadiran dimetil sulfoksida (DMSO) yang memberi kesan ketara kepada struktur DNA.

 Struktur 
Walaupun kedua-dua DNase I dan II ialah endonuklease glikoprotein, DNase I mempunyai struktur jenis sandwic monomer dengan rantai sisi karbohidrat, manakala DNase II mempunyai struktur kuaterner dimer.
DNase I ialah glikoprotein dengan berat molekul 30,000 Da dan rantai karbohidrat 8-10 sisa yang melekat di Asn18 (oren). Ia merupakan 𝛼,𝛽-protein dengan dua helaian 𝛽 berlipat 6 untaian yang membentuk teras struktur. Kedua-dua helaian teras ini berjalan selari, dan semua yang lain berjalan antiselari. Helaian berlipat 𝛽 terletak di tengah-tengah struktur manakala heliks 𝛼 dilambangkan dengan gegelung di pinggir. DNase I mengandungi empat poket pengikat ion, dan memerlukan Ca2+ dan Mg2+ untuk menghidrolisis DNA dwiuntai. Dua tapak mengikat kuat Ca2+ manakala dua lagi menyelaras Mg2+. Tidak banyak terbitan mengenai bilangan dan lokasi tapak pengikat Mg2+, walaupun telah dicadangkan bahawa Mg2+ terletak berhampiran poket pemangkin dan menyumbang kepada hidrolisis. Dua ion Ca2+ ditunjukkan dalam warna merah dalam imej. Ia terikat terhadap DNase I di bawah keadaan penghabluran, dan penting dalam keutuhan struktur molekul dengan menstabilkan gelung permukaan Asp198 hingga Thr204 (sian), dan dengan mengehadkan kawasan mobiliti terma yang tinggi dalam gelung fleksibel kepada sisa Gly97 hingga Gly102 (kuning).
DNase II mengandungi struktur kuaterner homodimer yang mampu mengikat DNA dwiuntai dalam seni bina pengapit berbentuk U. Bahagian dalam pengapit berbentuk U sebahagian besarnya bersifat elektropositif, dan mampu mengikat DNA bercas negatif. Sama seperti DNase I, struktur DNase II terdiri daripada struktur sekunder 𝛼/𝛽 bercampur dengan 9 𝛼-heliks dan 20 𝛽-lembaran berlipat. Walaupun tidak seperti DNase I, DNase II tidak memerlukan ion logam dwivalen dalam pemangkinan. Strukturnya terdiri daripada protomer A (sian) dan protomer B (hijau). Setiap struktur terdiri daripada dua motif pemangkin yang dilabelkan pada protomer B sebagai langkah peringkasan: His100 dan Lys102 mengarang motif pertama (biru) dan His279 dan Lys281 mengarang motif pemangkin kedua (merah).

 Mekanisme 
Sesetengah DNase memotong atau "membelah" hanya sisa di hujung molekul DNA. Jenis eksonuklease ini dikenali sebagai eksodeoksiribonuklease. Jenis lain membelah di mana-mana tempat di sepanjang rantai, dikenali sebagai endodeoksiribonuklease (subset endonukleases). Sesetengah DNase agak sembarangan tentang jujukan DNA di mana ia memotong, manakala yang  termasuk enzim pemotongan, sangat berkhusus terhadap jujukan tertentu. DNase lain hanya membelah DNA dwidua, dan jenis lain khusus untuk molekul untai tunggal, dan ada juga yang aktif terhadap kedua-duanya.

Tindakan DNase berlaku dalam tiga fasa. Fasa awal memperkenalkan berbilang samaran dalam tulang belakang fosfodiester. Fasa kedua menghasilkan nukleotida larut asid. Fasa ketiga, iaitu fasa terminal, terdiri daripada penurunan oligonukleotida, menyebabkan anjakan hiperkrom dalam data UV.

 Mekanisme DNase I 
DNase I kebanyakannya menyasarkan DNA dwiuntai, dan dalam tahap yang lebih rendah, beberapa DNA untai tunggal bagi pembelahan. DNase I memangkinkan belahan DNA yang tidak khusus dengan menjepit hubungan fosfodiester salah satu helai. Tapak belahannya terletak di antara atom oksigen 3' dan atom fosforus bersebelahan, menghasilkan oligonukleotida 3'-hidroksil dan 5'-fosforil dengan penyongsangan konfigurasi pada fosforus. Enzim DNase bergantung kepada kehadiran kation dwivalen, biasanya Ca2+, agar berfungsi yang betul. Tapak aktif DNase I termasuk dua sisa histidina (His134 dan His252) dan dua sisa berasid (Glu78 dan Asp212), semuanya penting dalam pemangkinan asid-bes am ikatan fosfodiester.

 Mekanisme DNase II 
Deoxyribonuclease II (DNase II) juga dikenali sebagai deoxyribonuclease asid kerana ia mempunyai aktiviti optimum dalam persekitaran pH rendah dalam lisosom, di mana ia biasanya ditemui dalam eukariot darjat tinggi. Sesetengah bentuk DNase II rekombinan memaparkan tahap aktiviti yang tinggi dalam pH rendah tanpa ion logam dwivalen, serupa dengan DNase II eukariot. Tidak seperti DNase I, DNase II memutuskan ikatan fosfodiester antara atom oksigen 5' dan atom fosforus bersebelahan, menghasilkan nukleotida terfosforil 3΄ dan terhidroksil 5΄.

 Aplikasi 

 Aplikasi makmal 
DNase biasanya digunakan apabila menulenkan protein yang diekstrak daripada organisma prokariot. Pengekstrakan protein selalunya melibatkan penguraian membran sel. Ia merupakan perkara biasa untuk membran sel yang terurai dan rapuh untuk dilisiskan, membebaskan DNA yang tidak diingini dan protein yang dikehendaki. Ekstrak DNA-protein yang terhasil adalah sangat likat dan sukar untuk ditulenkan, di mana DNase ditambah untuk memecahkannya. DNA dihidrolisiskan tetapi protein tidak terjejas, dan ekstrak boleh menjalani penulenan selanjutnya.

 Rawatan 
DNA ekstrasel (ecDNA) ialah DNA yang terdapat dalam peredaran darah. Ia muncul akibat apoptosis, nekrosis atau penguraian perangkap ekstrasel neutrofil (NET) darah dan sel tisu, tetapi juga boleh timbul daripada rembesan aktif daripada sel hidup. EcDNA dan protein pengikat DNA yang ditetapkan mampu mengaktifkan reseptor pengesan DNA, reseptor pengecaman corak (PRR). PRR mampu merangsang laluan yang menyebabkan tindak balas imun keradangan. Akibatnya, beberapa kajian penyakit radang telah mendapati terdapat kepekatan tinggi ecDNA dalam plasma darah. Atas sebab ini, DNase telah terbukti sebagai rawatan yang mungkin dalam pengurangan ecDNA dalam plasma darah. DNase boleh dikumuhkan secara intrasel dan ekstrasel, dan boleh memecahkan ikatan fosfodiester DNA. Fungsi ini boleh digunakan untuk mengekalkan kepekatan ecDNA yang rendah, oleh itu merawat keradangan. Penyakit disebabkan oleh sisa DNA dalam darah telah disasarkan menggunakan "sifat pemecahan" DNase. Kajian telah menunjukkan DNase mampu bertindak sebagai rawatan dengan mengurangkan kelikatan lendir.J.B. Armstrong, J.C. White Liquefaction of viscous purulent exudates by deoxyribonuclease Lancet, 259 (1950), pp. 739-742 Pemberian DNase adalah berbeza-beza bergantung kepada penyakit. Ia boleh dan telah diberikan secara mulut, intrapleural, intravena, intraperitoneal dan penyedutan. Beberapa kajian terus mengkaji penggunaan DNase sebagai rawatan serta cara untuk memantau kesihatan. Sebagai contoh, baru-baru ini, DNase asal bakteria patogen telah digunakan sebagai penunjuk untuk pemantauan jangkitan luka.

 Penyakit pernafasan 
Fibrosis sista ialah sejenis gangguan genetik yang menjejaskan pengeluaran lendir, peluh, dan cecair penghadaman, menyebabkannya menjadi lebih likat daripada pelincir. Enzim DNase boleh disedut dengan penebula oleh para penghidap. Enzim DNase membantu kerana sel darah putih terkumpul di dalam lendir, dan apabila ia terurai, ia mengeluarkan DNA, yang menambah "kelekitan" lendir. Enzim DNase memecah DNA, dan lendir lebih mudah dibersihkan dari paru-paru. Khususnya, DNase I juga dikenali sebagai ubat yang diluluskan oleh FDA sebagai Pulmozyme (juga dikenali sebagai dornase alfa), digunakan sebagai rawatan untuk meningkatkan fungsi paru-paru.

Penyakit pernafasan lain seperti asma, empiema pleura dan penyakit pulmonari obstruktif kronik juga didapati terjejas secara positif oleh sifat DNase.

Tambahan pula, kajian terbaru menunjukkan bahawa pengaktif plasminogen tisu intrapleural (tPA), protein yang bertanggungjawab dalam pecahan bekuan darah, bergabung dengan deoxyribonuclease lalu meningkatkan saliran pleura, mengurangkan tempoh penginapan hospital, dan mengurangkan keperluan untuk pembedahan dalam efusi parapneumonik dan empiema.

 Penyakit lain 
Sepsis ialah penyakit radang mengancam nyawa yang berlaku disebabkan oleh tindak balas melampau badan terhadap jangkitan. Tubuh mula menyerang dirinya sendiri sebagai tindak balas keradangan merangkumi tubuh manusia. Akibatnya, tahap ecDNA yang tinggi telah dikaitkan dengan aliran darah, dan oleh itu, penyelidik telah melihat kepada DNase sebagai rawatan yang sesuai. Kajian telah menunjukkan bahawa DNase berjaya mengganggu NET dan mengurangkan tindak balas keradangan. Lebih banyak penyelidikan mengenai jenis dan masa pentadbiran diperlukan untuk terus menetapkan DNase sebagai rawatan rasmi. 

Lupus eritematosus sistemik (SLE) ialah satu penyakit autoimun yang membawa kepada penghasilan autoantibodi yang menyebabkan keradangan lalu membawa kepada kerosakan organ, sendi dan buah pinggang. SLE telah dikaitkan dengan tahap DNase I yang rendak ketika sel apoptosis menjadi antigen sendiri dalam penyakit ini. DNase I telah disiasat sebagai rawatan mungkin untuk mengurangkan jumlah serpihan apoptosis dalam sistem manusia. Ada cadangan bahawa kesukaran mereka mungkin disebabkan oleh ketidakupayaan enzim untuk memecahkan membran sel kromatin. Namun, kajian telah menunjukkan keputusan yang bercanggah dalam rawatan ini, dan kajian lanjut sedang dijalankan untuk mengkaji faedah terapeutik DNase I.

DNase diketahui mempunyai kesan antitumor oleh kerana keupayaannya untuk memecahkan DNA. Tahap DNA yang tinggi didapati berada dalam darah pesakit kanser, menunjukkan bahawa DNase I mungkin merupakan rawatan yang mungkin. Masih kurang pemahaman tentang punca terdapat tahap ecDNA yang begitu tinggi, dan sama ada DNase akan bertindak sebagai rawatan yang berkesan atau tidak. Beberapa kajian tikus telah menunjukkan hasil positif dalam perkembangan antitumor dengan DNase I intravena. Walau bagaimanapun, lebih banyak siasatan perlu dijalankan sebelum ia diperkenalkan kepada orang ramai.

 Ujian 
DNA menyerap cahaya ultraungu (UV) dengan panjang gelombang penyerapan maksimum hampir 260 nm. Penyerapan ini disebabkan oleh elektron pi dalam bes aromatik DNA. Dalam dsDNA atau bahkan kawasan RNA di mana struktur dwiuntai berlaku, bes disusun selari antara satu sama lain, dan pertindihan orbital molekul bes membawa kepada penurunan dalam penyerapan cahaya UV. Fenomena ini dipanggil kesan hipokrom. Apabila DNase membebaskan nukleotida daripada dsDNA, bes tidak lagi disusun kerana ia berada dalam dsDNA agar pertindihan orbit dikecilkan, dan penyerapan UV meningkat. Peningkatan dalam penyerapan ini mendasari asas unit Kunitz bagi aktiviti DNase. Satu unit Kunitz ditakrifkan sebagai jumlah enzim yang ditambah kepada 1 mg/ml DNA sperma salmon yang menyebabkan peningkatan penyerapan 0.001 seminit pada panjang gelombang 260 nm apabila bertindak ke atas DNA terpolimer tinggi pada 25 °C dalam penimbal NaOAc (pH 5.0) 0.1 M. Nama unit ini mengiktiraf ahli biokimia Rusia-Amerika Moses Kunitz yang mencadangkan ujian standard pada tahun 1946.

Penyediaan enzim piawai harus dijalankan selari dengan yang tidak diketahui kerana penyeragaman sediaan DNA dan tahap pempolimeran dalam larutan adalah tidak mungkin.

 Rujukan 

 Pautan luar 

 Deoxyribonucleases di Tajuk Subjek Perubatan Perpustakaan Negara AS (MeSH)
 Deoxyribonucleases (DNases) daripada Laman Web Thermo Fisher Scientific Inc
 Deoxyribonuclease I dari laman web Sigma-Aldrich Solutions
 Deoxyribonuclease I, tapak aktif dari Laman Web InterPro

Kategori:EC 3.1.21