റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പോളിമെറേയ്സ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ

ആർ.എൻ.എ എന്ന ജനിതകവസ്തുവിന്റെ സാന്നിധ്യം ഉറപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള പരിശോധനയാണ് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പോളിമെറേയ്സ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ (ആർടി-പിസിആർ , RT-PCR). ആർ.എൻ.എ എന്ന ജനിതകവസ്തുവിലെ ഘടകങ്ങളെ (ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ശ്രേണി അല്ലെങ്കിൽ ജീനുകൾ) സാധാരണഗതിയിൽ പെരുക്കിയെടുക്കാൻ സാധ്യമല്ലാത്തതിനാൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേയ്സ് എന്ന രാസാഗ്നി (എൻസൈം) ഉപയോഗിച്ച് ഈ ആർ.എൻ.എയിൽ നിന്ന് അവയുടെ കോംപ്ലിമെന്ററി ഡി.എൻ.എ തൻമാത്രകളെ ഉൽപാദിപ്പിക്കുന്നു. ഇത്തരം ഡി.എൻ.എ തൻമാത്രകളെ രാസപ്രക്രിയകളിലൂടെ അനേകകോടിയായി പെരുക്കുകയും അവയിൽ ചേർക്കുന്ന രാസമാർക്കറുകൾ സവിശേഷ ഫ്ലൂറസെൻസ് ഉത്പാദിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യും. ഈ ഫ്ളൂറസെൻസിന്റെ വിശകലനം ആർടി-പിസിആർ   മെഷീനിന്റെ സ്ക്രീനിൽ പ്രദർശിപ്പിക്കപ്പെടുന്നു. ഇതിലൂടെ ആർ.എൻ.എ ജനിതകവസ്തുവായുള്ള രോഗാണുക്കളുടെ, പ്രത്യേകിച്ചും വൈറസുകളുടെ സാന്നിധ്യം തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയുന്നു. 

കൊറോണാവൈറസ് -19 രോഗമുണ്ടാക്കുന്ന സാർസ്- കോവിഡ് വൈറസ്-19 -ന്റെ ആർ.എൻഎ. ശരീരത്തിലുണ്ടോ എന്ന് പരിശോധിച്ചറിയാൻ ലോകമെമ്പാടും ഫലപ്രദമായി പ്രയോജനപ്പെടുത്തുന്ന ഒരു പോളിമെറേയ്സ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ (പി.സി.ആർ.) സാങ്കേതിക വിദ്യയാണ് ആർടി-പിസിആർ. ഡി.എൻ.എ തൻമാത്രകളെ വിവിധഘട്ടങ്ങളിലൂടെ പെരുക്കിയെടുക്കുന്ന സാങ്കേതികവിദ്യയാണ് പി.സി.ആർ. ഇതിൽ ആർ.എൻ.എയിൽ നിന്ന് സൃഷ്ടിച്ചെടുക്കുന്ന ഡി.എൻഎ തൻമാത്രകളുടെ നിരവധി കോപ്പികൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്നതാണ് ആർടി-പിസിആർ. ഏകദേശം മൂന്നുമണിക്കൂറിനുള്ളിൽ വൈറസിന്റെ സാന്നിധ്യം തിരിച്ചറിയാൻ ഈ സാങ്കേതികവിദ്യയിലൂടെ കഴിയും..

 പ്രയോജനങ്ങൾ 
പ്രത്യേകയിനം ആർ.എൻ.എ. യുടെ സാന്നിധ്യം പരിശോധിക്കുന്ന പ്രാഥമിക പരിശോധനാരീതിയാണിത്. ആർ.എൻ.എ.യുടെ സാന്നിധ്യം പരിശോധിക്കുക, ഇവയിലെ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ശ്രേണി ഏതെന്ന് തിരിച്ചറിയുക, തൻമാത്രാ ക്ലോണിംഗ് നടത്തുക എന്നിവയാണ് ആർടി-പിസിആർ  വഴി ചെയ്യുന്നത്. എന്നാൽ ഇതിനോടൊപ്പം വൈറസിന്റെ കോംപ്ലിമെന്ററി ഡി.എൻ.എ. യുടെ അളവ് എത്ര എന്ന് തിരിച്ചറിയാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന സാങ്കേതികവിദ്യയാണ് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് പി.സി.ആർ (qPCR). ഇത് റിയൽ ടൈം പി.സി.ആർ എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു. 

 അടിസ്ഥാന സാങ്കേതികവിദ്യ 
ഹോവാർഡ് ടെമിൻ, സാതോഷി മിസുടാനി എന്നിവരാണ് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേയ്സ് എന്ന  എൻസൈമിനെ ആദ്യമായി കണ്ടെത്തുന്നത്.  1970 ൽ ഡേവിഡ് ബാൾട്ടിമോർ ഈ എൻസൈമിനെ വേർതിരിച്ചെടുത്തു.  റിട്രോവൈറസുകളിലും ആർ.എൻ.എ അടങ്ങിയ വൈറസുകളിലും കാണപ്പെടുന്ന രാസാഗ്നിയാണിത്. റിട്രോവൈറസുകളിൽ കാണപ്പെടുന്ന 'gag', 'pol', 'env' എന്നീ ജീനുകൾ (യഥാക്രമം പോളിമെറേയ്സ്, എൻവലപ്, മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകൾ എന്നിവയെ ഉൽപാദിപ്പിക്കുന്നു) അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന ആർ.എൻ.എ യിൽ നിന്ന് ഈ എൻസൈമിന്റെ പ്രവർത്തനഫലമായി ഡി.എൻ.എ കൾ രൂപപ്പെടുന്നു. ഇത് ആതിഥേയജീവികളിലെ (പൊതുവേ മനുഷ്യർ) ഡി.എൻഎ യുടെ ഭാഗമായി മാറുകയും വൈറസിന്റെ കൂടുതൽ കോപ്പികളെ ഉൽപാദിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. ഈ പ്രക്രിയയെ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ എന്നുവിളിക്കുന്നു.

 പ്രക്രിയ 
വ്യക്തിയുടെ വിവിധ ശരീരഭാഗങ്ങളിൽ നിന്നെടുക്കുന്ന സാംപിളിൽ നിരവധി രാസഘടകങ്ങൾ പ്രയോഗിക്കുന്നു. ഇതിലൂടെ സാംപിളിലെ നിരവധി പ്രോട്ടീനുകളും കൊഴുപ്പുകളും നീക്കം ചെയ്യപ്പെടും. സാംപിളിൽ വൈറസ് ആർ.എൻ.എ ഉണ്ടായിരുന്നെങ്കിൽ, ഈ രാസപ്രക്രിയയുടെ അന്ത്യത്തിൽ വ്യക്തിയുടേയും വൈറസിന്റേയും ആർ.എൻ.എ ഘടകങ്ങൾ മാത്രമായിരിക്കും അവശേഷിക്കുക. 

 റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേയ്സ് എൻസൈമിന്റെ പ്രയോഗം 
ഇത്തരത്തിൽ രൂപപ്പെടുത്തിയ വൈറസ് ആർ.എൻ.എ കളിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്റ്റേയ്സ് എന്ന രാസാഗ്നി പ്രയോഗിക്കുന്നു. ഇതിലൂടെ നിരവധി ദൈർഘ്യം കുറഞ്ഞ ഡി.എൻ.എ തൻമാത്രകൾ രൂപപ്പെടുന്നു. ഇവ കോംപ്ലിമെന്ററി ഡി.എൻ.എ കൾ (സി. ഡി.എൻ.എ) എന്നറിയപ്പെടുന്നു.

 ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ 
ശാസ്ത്രജ്ഞർ വൈറൽ ഡി.എൻ.എയുമായി അനുപൂരകമായതും ലഘുവായ ദൈർഘ്യമുള്ളതുമായ ഡി.എൻ.എ കളെക്കൂടി പ്രക്രിയയിൽ കൂട്ടിച്ചേർക്കുന്നു.  ഇത്തരത്തിൽ പുതിയ ധാരാളം സി. ഡി.എൻ.എ കൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്ന പ്രക്രിയയാണ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ. ചില കോംപ്ലിമെന്ററി ഡി.എൻ.എ കളിലേയ്ക്ക് തുടർന്ന് ചില രാസമാർക്കറുകൾ പ്രയോഗിക്കുന്നു.

 മാർക്കർ ലേബലിംഗ് 
പുതുതായി സൃഷ്ടിക്കപ്പെട്ട ദശലക്ഷക്കണക്കിന് വൈറൽ ഡി.എൻ.എ കളിലേയ്ക്ക് ചില മാർക്കർ ഘടകങ്ങളെ കൂട്ടിച്ചേർക്കുന്നു. ഡി.എൻ.എ ഇഴകളുമായി ചേരുന്ന ഈ മാർക്കറുകൾ ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് നിറം പുറപ്പെടുവിക്കുന്നു. പൂർത്തിയാക്കുന്ന ഓരോ ചാക്രികപ്രവർത്തനത്തിലും പുറപ്പെടുന്ന ഈ ഫ്ലൂറസെന്റ് വർണത്തിന്റെ അളവ് മെഷീനിലെ കമ്പ്യൂട്ടർ നിർണയിക്കുന്നു. ഒരു നിശ്ചിത വർണസാന്നിധ്യം വൈറസിന്റെ സാന്നിധ്യത്തെ നിശ്ചയിക്കുന്നു. എത്രമാത്രം ചാക്രികപ്രവർത്തനം ഈ ഫ്ലൂറസെൻസ് രൂപപ്പെടാൻ എടുത്തു എന്ന് നിർണയിക്കുന്നതിലൂടെ രോഗബാധയുടെ തീവ്രത തിരിച്ചറിയാം.

 ആർ.ടി.-പി.സി.ആർ. മെഷീന്റെ പങ്ക് 
കോംപ്ലിമെന്ററി ഡി.എൻ.എ കൾ ഉൾക്കൊണ്ടിരിക്കുന്ന മിശ്രിതത്തെ ആർടി-പിസിആർ മെഷീനിലേയ്ക്ക് വയ്ക്കുന്നു. ഊഷ്മനിലയിൽ വരുത്തുന്ന വ്യത്യാസത്തിനനുസരിച്ച് വൈറൽ ഡി.എൻ.എ യുടെ ഭാഗങ്ങളുടെ നിരവധി കോപ്പികൾ മെഷീനിൽ രൂപപ്പെടും. ഊഷ്മനിലയിലെ വ്യത്യാസമാണ് ക്രമമായി ആവർത്തിച്ച് (സൈക്കിൾ) ഡി.എൻ.എ പകർപ്പുകൾ സൃഷ്ടിക്കാൻ സഹായിക്കുന്നത്. ഓരോ ചാക്രികപ്രവർത്തനത്തിലൂടെയും തൊട്ടുമുമ്പുലഭിച്ച ഡി.എൻ.എ കൾ ഇരട്ടിയായി ലഭിക്കും. സാധാരണഗതിയിലുള്ള ഒരു റിയൽ ടൈം ആർ.ടി.-പി.സി.ആർ മെഷീൻ 35 ചാക്രികപ്രവർത്തനങ്ങൾ നിർവഹിക്കും. ഈ പ്രക്രിയ അവസാനിക്കുന്നതോടെ, പ്രക്രിയയ്ക്കുപയോഗിച്ച സാംപിളിലെ ആർ.എൻ.എ ഇഴയിൽ നിന്ന്  35 ബില്യൺ വൈറൽ ഡി.എൻ.എ കോപ്പികൾ പുതുതായി മെഷീനിൽ രൂപപ്പെടും. 

 വൺ സ്റ്റെപ് ആർടി-പിസിആർ 
ഒരൊറ്റ ട്യൂബിൽ അല്ലെങ്കിൽ രാസപ്രവർത്തനത്തിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും വൈറൽ ഡി.എൻ.എ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും നടന്നാൽ ആ പ്രവർത്തനമാണ് വൺ സ്റ്റെപ് ആർടി-പിസിആർ. ഇത് വളരെ കൃത്യമായതും വളരെ എളുപ്പത്തിൽ നിർവഹിക്കാവുന്നതുമാണ്. രണ്ട് ട്യൂബുകൾ ഉപയോഗിക്കാത്തതിനാൽ ഇതിൽ ഉൾപ്പെടുത്തേണ്ട രാസഘടകങ്ങൾ ഏതെങ്കിലും രീതിയിൽ മലിനപ്പെടാനുള്ള സാധ്യത (മറ്റ് രാസഘടകങ്ങൾ ചേരാനുള്ള) കുറവാണ്.

 ടൂ സ്റ്റെപ് ആർടി-പിസിആർ 
രാസപ്രവർത്തനത്തിൽ റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനും വൈറൽ ഡി.എൻ.എ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും രണ്ട് വ്യത്യസ്ത ട്യൂബുകളിൽ നടന്നാൽ അതിനെ ടൂ സ്റ്റെപ് ആർടി-പിസിആർ എന്നുവിളിക്കുന്നു. ആദ്യട്യൂബഹിൽ ലഭിക്കുന്ന സി.ഡി.എൻ.എയെ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനും ജീൻ പ്രവർത്തനങ്ങളെപ്പറ്റി പഠിക്കുന്നതിനും പിൽക്കാലത്തേയ്ക്ക് ശേഖരിക്കാനാകുന്നു എന്നതാണ് ഇതിന്റെ മേൻമ. 

 വിവിധതരം ആർടി-പിസിആർ 
നിരവധി ആർടി-പിസിആർ സാങ്കേതികവിദ്യകൾ നിലവിലുണ്ട്.
 സാങ്കേതികവിദ്യ  ചുരുക്കം പോളിമേറേയ്സ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ (Polymerase chain reaction)  PCR റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ പോളിമെറേയ്സ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ (Reverse transcription polymerase chain reaction)  RT-PCR റിയൽ ടൈം പോളിമെറേയ്സ് ചെയിൻ റിയാക്ഷൻ (Real-time polymerase chain reaction)  qPCR ആർ.ടി. പി.സി.ആർ / ക്യൂ പി.സി.ആർ സംയോജിത സാങ്കേതികത (RT-PCR / qPCR combined technique)  qRT-PCR

 അവലംബം