Молекуларна дијагностика

Молекуларна дијагностика ― збирка на техники кои се користени за анализа на биолошките маркери во геномот и протеомот и како нивните клетки ги изразуваат своите гени како белковини, применувајќи ја молекуларната биологија преку медицинските тестирања. Во медицината техниката е користена за дијагностицирање и следење на болеста, откривање на ризик и одлучување кои терапии најдобро ќе функционираат за поединечни пациенти,: предговор и во земјоделската биосигурност на сличен начин да се следат болестите на културите и добитокот, да биде проценет ризикот и да бидат одлучени какви карантински мерки треба да бидат преземени.

Со анализа на спецификите на пациентот и неговата болест, молекуларната дијагностика нуди гледиште за личната медицина. Овие тестови се корисни во низа медицински специјалности, вклучително и заразни болести, онкологија, типизација на човечки леукоцитен антиген (која ја истражува и предвидува функцијата на имунолошкиот систем), згрутчување и фармакогеномијата  генетско предвидување за тоа кои лекови ќе делуваат најдобро.: v-vii  Тие се преклопуваат со клиничката хемија (медицински тестови на телесни течности).

 Историја 
мини|400x400пкс| Молекуларната дијагностика користи техники како што се масена спектрометрија и генски чипови за да бидат доловат моделите на изразување на гените и белковините.
Областа на молекуларната биологија пораснала кон крајот на дваесеттиот век, како и нејзината клиничка примена. Во 1980 година, Јует Вај Кан и колегите предложиле пренатален генетски тест за таласемија кој не се потпирал на секвенционирање на ДНК  тогаш во неговиот повој  туку на рестриктивни ензими кои ја пресекле ДНК каде што препознавала специфични кратки секвенци, создавајќи различни должини на нишка на ДНК во зависност од тоа кој алел (генетска варијација) на фетусот кој е опседнат. Во 1980-тите, фразата била користена во имињата на претпријатија како што се Molecular Diagnostics Incorporated и Bethseda Research Laboratories Molecular Diagnostics.

Во текот на 1990-тите, идентификацијата на новооткриените гени и новите техники за секвенционирање на ДНК довеле до појава на посебно поле на молекуларна и геномска лабораториска медицина; во 1995 година било создадено Здружението за молекуларна патологија за да и даде структура. Во 1999 година, Здружението го соосновало The Journal of Medical Diagnostics. Informa Healthcare го пуштиле Expert Reviews in Medical Diagnostics во 2001 година. Од 2002 година наваму, проектот HapMap собира информации за генетските разлики во една буква што се повторуваат кај човечкото население  полиморфизмите на еден нуклеотид  и нивната врска со болеста.: гл 37 Во 2012 година, молекуларните дијагностички техники за таласемија користат тестови за генетска хибридизација за да го идентификуваат специфичниот единечниот нуклеотиден полиморфизам што предизвикува болест на поединецот.

Како што комерцијалната примена на молекуларната дијагностика станувала сè поважна, така и дебатата за патентирањето на генетските откритија е во неговото срце. Во 1998 година, Директивата 98/44/ЕЗ на Европската Унија појаснила дека патентите за ДНК секвенците се дозволени. Во 2010 година во Соединетите Држави, Здружението за молекуларна патологија ја тужеле Myriad Genetics за да ги оспори патентите на последната во врска со два гени, BRCA1, BRCA2, кои се поврзани со рак на дојка. Во 2013 година, Врховниот суд на Соединетите Држави делумно се согласил, пресудувајќи дека природно настанатата генска секвенца не може да биде патентирана.

 Техники 
мини|300x300пкс| Affymetrix 5.0, чип со микронизи.

 Развој од истражувачки алатки 
Индустријализацијата на алатките за анализа на молекуларната биологија го направило практично нивното користење во клиниките.: предговор Минијатуризацијата во еден рачен уред може да донесе медицинска дијагностика во клиниката и во канцеларијата или домот.: предговор Клиничката лабораторија барала високи стандарди на доверливост; дијагностиката може да бара акредитација или да потпадне под прописите за медицински уреди. Согласно 2011 година, некои клинички лаборатории од Соединетите Држави, сепак користеле анализи продадени само за „истражувачка употреба“.

Лабораториските постапки треба да бидат придржувани до прописите, како што се Амандманите за подобрување на клиничката лабораторија, Законот за преносливост и одговорност на здравственото осигурување, добрата лабораториска пракса и спецификациите на Администрацијата за храна и лекови во Соединетите Држави. Системите за управување со лабораториски информации помагаат со следење на овие постапки. Регулативата е применувана и за работниот кадар и за набавките. Согласно 2012 година, дванаесет сојузни држави од Соединетите Држави, бараат молекуларните патолози да бидат лиценцирани; неколку одбори како што се Американскиот одбор за медицинска генетика и Американскиот одбор за патологија ги потврдуваат технолозите, надзорниците и директорите на лабораториите.

Автоматизацијата и баркодирањето на примероците ја максимизираат пропусната моќ и ја намалуваат можноста за грешка или контаминација при рачно ракување и известување за резултати. Сега се достапни единечни уреди за правење на анализата од почеток до крај.

 Анализи 

Молекуларната дијагностика користи ин витро биолошки анализи како што се полимеразна верижна реакција- ензимски имуносорбентна анализа или флуоресцентна „на лице место“ хибридизација. Анализата открива молекула, често во ниски концентрации, која е маркер на болест или ризик во примерокот земен од пациент. Зачувувањето на примерокот пред анализата е критично. Рачното ракување треба да биде минимизирано. Кревката молекула на РНК поставува одредени предизвици. Како дел од клеточната постапка на изразување на гените како белковини, таа нуди мерка за генско изразување, но е ранлив на хидролиза и разградување од секогаш присутните ензими на рибонуклеаза. Примероците може брзо да бидат замрзнати во течен азот или да бидат инкубирани во средства за конзервација.: гл 39 

Бидејќи молекуларните дијагностички методи можат да забележуваат чувствителни маркери, овие тестови се помалку нападни од традиционалната биопсија. На пример, бидејќи во човечката плазма постојат нуклеински киселини без клетки, едноставен примерок од крв може да биде доволен за да биде земена генетска информација од тумори, пресадувања или нероден фетус.: гл 45  Многу, но не сите, молекуларни дијагностички методи засновани на детекција на нуклеински киселини користат полимеразна верижна реакција за огромно зголемување на бројот на молекули на нуклеинска киселина, со што е засилена целната низа(и) во примерокот на пациентот.: предговор Полимеразната верижна реакција е метод со кој шаблонската ДНК е засилена со користење на синтетички прајмери, ДНК полимераза и деоксинуклеотидни трифосфати. Смесата е циклирана помеѓу најмалку 2 температури: висока температура за денатурирање на двоверижна ДНК во едноверижни молекули и ниска температура за прајмерот да биде хибридизиран со шаблонот и за полимеразата да го прошири прајмерот. Секој температурен циклус теоретски ја удвојува количината на целната низа. Откривањето на варијации во секвенцата со користење на полимеразната верижна реакција обично вклучува дизајнирање и употреба на олигонуклеотидни реагенси кои поефикасно ја засилуваат варијантата од интерес отколку секвенцата од диви типови. Полимеразната верижна реакција во моментов е најшироко користен метод за забележување на секвенци на ДНК. Откривањето на маркерот може да користи полимеразна верижна реакција во вистинско време, директно секвенционирање,: гл 17 чипови со микронизи  префабрикувани чипови кои тестираат многу маркери одеднаш,: гл 24 или ласерска десорпција/јонизација-време на летот со помош на матрица Истото начело се однесува на протеомот и геномот. Белковинските низи со висока моќност можат да користат комплементарна ДНК или антитела за да бидат врзани и оттука да забележуваат многу различни белковини напоредно. Молекуларните дијагностички тестови се разликуваат во голема мера по чувствителност, време на пресврт, цена, покриеност и регулаторно одобрение. Тие, исто така, се разликуваат во нивото на валидација што е применувано во лабораториите што ги користат. Оттука, потребна е силна месна валидација во согласност со регулаторните барања и употреба на соодветни контроли, особено кога резултатот може да биде користен за информирање на одлуката за третман на пациентот.

Придобивки
мини|400x400пкс| Чипот со микронизи содржи комплементарна ДНК на многу интересни секвенци. Комплементарната ДНК флуоресцира кога е хибридирана со соодветен ДНК фрагмент во примерокот.

 Пренатална 
Конвенционалните пренатални тестови за хромозомски абнормалности како што е Даунов синдром се потпираат на анализа на бројот и изгледот на хромозомите  кариотипот. Молекуларните дијагностички тестови, како што е споредбената геномска хибридизација со микронизи, наместо тоа, тестираат примерок од ДНК, и поради ДНК без клетки во плазмата, би можеле да бидат помалку инвазивни, но од 2013 година сè уште е додаток на конвенционалните тестови.

 Третман 
Некои од единечните нуклеотидни полиморфизми на пациентот  мали разлики во нивната ДНК  можат да помогнат да биде предвидено колку брзо тие ќе метаболизираат одредени лекови; ова се нарекува фармакогеномика. На пример, ензимот CYP2C19 метаболизира неколку лекови, како што е средството против згрутчување Клопидогрел, во нивните активни облици. Некои пациенти поседуваат полиморфизми на специфични места на генот 2C19 кои прават слаби метаболизатори на тие лекови; лекарите можат да ги тестираат овие полиморфизми и да откријат дали лековите ќе бидат целосно ефикасни за тој пациент. Напредокот во молекуларната биологија помогна да биде покажано дека некои синдроми кои претходно биле класифицирани како една болест се всушност повеќе подврсти со сосема различни причини и третмани. Молекуларната дијагностика може да помогне во дијагностицирањето на подврстата  на пример инфекции и ракови  или генетска анализа на болест со наследна компонента, како што е Силвер-Раселовиот синдромот.

 Заразна болест 
Молекуларната дијагностика е користена за да бидат идентификувани заразни болести како што се кламидија, вирус на грип и туберкулоза; или специфични соеви како вирусот H1N1 или SARS-CoV-2. Генетската идентификација може да биде брза; на пример, тест за изотермално засилување со посредство на јамка го дијагностицира паразитот на маларија и е доволно груб за земјите во развој. Но, и покрај овие достигнувања во анализата на геномот, во 2013 година инфекциите сè уште почесто биле идентификувани со други средства  нивниот протеом, бактериофаг или хроматографски профил. Молекуларната дијагностика исто така е користена за да биде разбран специфичниот вид на патогенот  на пример со откривање кои гени отпорни на лекови ги поседува  и оттука кои терапии да бидат избегнувани. Дополнително, може да бидат спроведени анализи засновани на метагеномско секвенционирање со т.н. „следна генерација“ за да бидат идентификувани патогени организми без пристрасност.

 Управување со ризикот од болести 
Геномот на пациентот може да вклучува наследна или случајна мутација која влијае на веројатноста за развој на болест во иднина. На пример, Линчовиот синдром е генетско заболување кое ги предиспонира пациентите за дебелоцревен и други видови рак; раното откривање може да доведе до внимателно следење што ги подобрува шансите на пациентот за добар исход. Срцевиот ризик е означен со биолошки маркери и прегледот може да го измери ризикот дека детето ќе биде родено со генетско заболување како што е цистичната фиброза. Генетското тестирање е етички сложено: пациентите можеби не сакаат стрес од познавање на нивниот ризик. Во земјите без универзална здравствена заштита, познат ризик може да ги зголеми премиите за осигурување.Harmon, Amy (24 февруари 2008) Insurance Fears Lead Many to Shun DNA Tests. New York Times

 Рак 
Ракот е промена во клеточните постапки кои предизвикуваат туморот да расте надвор од контрола. Ракородните клетки понекогаш имаат мутации во онкогените, како што се KRAS и CTNNB1 (β-катенин). Анализирањето на молекуларниот потпис на ракородните клетки  ДНК и нејзините нивоа на изразување преку информациска РНК  им овозможува на лекарите да го карактеризираат ракот и да ја изберат најдобрата терапија за нивните пациенти. Почнувајќи од 2010 година, анализите кои вклучуваат низа антитела против специфичните молекули на белковинските маркери се нова технологија; постојат надежи за овие повеќесложни анализи кои би можеле да измерат многу маркери одеднаш. Други потенцијални идни биомаркери вклучуваат молекули на микро РНК, кои канцерогените клетки ги изразуваат повеќе од здравите.

Ракот е болест со прекумерни молекуларни причини и постојана еволуција. Исто така, постои хетерогеност на болеста дури и кај поединец. Молекуларните студии за ракот го докажале значењето на мутациите на двигателот во растот и метастазирањето на туморите. Многу технологии за откривање на варијации во низата се развиени за истражување на ракот. Овие технологии претежно може да бидат групирани во три пристапи: полимеразна верижна реакција, хибридизација и секвенционирање со „следна генерација“. Во моментов, многу полимеразната верижна реакција и хибридизациски анализи се одобрени од Службата за храна и лекови на Соединетите Држави, како ин витро дијагностика. Анализите со секвенционирање со „следна генерација“ , сепак, сè уште се во рана фаза во клиничката дијагностика.FDA-approved next-generation sequencing system could expand clinical genomic testing: experts predict MiSeqDx platform will make genetic testing more affordable for smaller labs. AM. J. Med. Genet. A 164, X-XI.

За да биде направен молекуларниот дијагностички тест за рак, едно од значајните прашања е откривањето на варијации во секвенцата на ДНК. Примероците од туморска биопсија што се користени за дијагностика секогаш содржат само 5% од целната варијанта во споредба со секвенцата од диви врсти. Исто така, за неинвазивни примени од периферна крв или урина, ДНК тестот мора да биде доволно специфичен за да открие мутации на варијантни алелни честоти помали од 0,1%.

Во моментов, со оптимизирање на традиционалната полимеразна верижна реакција, постои нов изум, амплификациски-рефрактерниот систем за мутација е метод за откривање варијанти на секвенци на ДНК кај ракот. Начелото зад амплификациски-рефрактерниот систем за мутација е дека ензимската екстензивна активност на полимеразите на ДНК е многу чувствителна на несовпаѓања во близина на 3' крајот на прајмерот. Многу различни претпријатија развиле дијагностички тестови засновани на прајмери на полимеразна верижна реакција со амплификациски-рефрактерниот систем за мутација. На пример, Qiagen therascreen, Roche cobas и Biomerieux THxID развиле тестови со полимеразна верижна реакција одобрени од Службата за храна и лекови за откривање на рак на белите дробови, дебелото црево и метастатски мутации на меланом во гените KRAS, EGFR и BRAF. Нивните IVD комплети биле во основа потврдени на геномска ДНК извлечена од формалинско фиксиран парафинско вградено ткиво.

Исто така, постојат микрочипови кои користат механизам за хибридизација за дијагностицирање на рак. Повеќе од милион различни сонди може да бидат синтетизирани на низа со технологијата Genechip на Affymetrix со ограничување на детекција од една до десет копии на информациска РНК. Обично е сметано дека оптимизираните микрочипови произведуваат повторлива релативна квантитација на различни цели. Во моментов, Службата за храна и лекови веќе одобрила голем број дијагностички анализи кои користат микрочипови: анализите на Agendia's MammaPrint можат да го информираат ризикот од повторување на рак на дојка преку профилирање на изразот на 70 гени поврзани со ракот на дојката; Autogenomics INFNITI CYP2C19 анализата може да ги профилира генетските полиморфизми, чии влијанија врз терапевтскиот одговор на антидепресивите се големи; и CytoScan Dx на Affymetrix може да ги проценат интелектуалните попречености и вродените нарушувања преку анализа на хромозомската мутација.

Во иднина, дијагностичките алатки за рак најверојатно ќе се фокусираат на секвенционирањето со „следна генерација“. Со користење на секвенционирање на ДНК и РНК за дијагностика на рак, технологијата во областа на алатките за молекуларна дијагностика ќе биде развиена подобро. Иако пропусната моќ и цената на секвенционирањето со „следна генерација“ се драматично намалени во текот на изминатите 10 години за приближно 100 пати, остануваме на најмалку 6 реда на големина подалеку од извршувањето на длабоко секвенционирање на ниво на цел геном. Во моментов, Ion Torrent развиле некои панели со секвенционирање со „следна генерација“ засновани на преведувачки AmpliSeq, на пример, Oncomine Comprehensive Assay. Тие се насочени на користење на длабоко секвенционирање на гени поврзани со ракот за откривање на ретките варијанти на секвенца.

Алатката за молекуларна дијагностика може да биде користена за проценка на ризикот од рак. На пример, тестот BRCA1/2 од Myriad Genetics ги проценува жените за животен ризик од рак на дојка. Исто така, некои видови рак не секогаш се користени со јасни симптоми. Корисно е да бидат анализирани луѓето кога тие не покажуваат очигледни симптоми и на тој начин може да биде откриен рак во раните фази. На пример, тестот ColoGuard може да биде користен за преглед на луѓе постари од 55 години за рак на дебелото црево. Ракот е долгогодишна болест со различни чекори на напредок, а алатките за молекуларна дијагностика може да бидат користени за прогноза на напредокот на ракот. На пример, тестот OncoType Dx од Genomic Health може да го процени ризикот од рак на дојка. Нивната технологија може да ги информира пациентите да бараат хемотерапија кога е потребно со испитување на нивоата на изразување на РНК во ткивото на биопсијата од рак на дојка.

Со зголемената владина поддршка во молекуларната дијагностика на ДНК, очекувано е дека наскоро ќе станат достапни зголемен број на клинички анализи за откривање на ДНК за рак. Во моментов, истражувањата во дијагностиката на ракот се развивани брзо со цели за пониски трошоци, помала потрошувачка на време и поедноставни методи за лекарите и пациентите.

 Поврзано 

 Молекуларна медицина (поширока област на молекуларното разбирање на болеста)
 Молекуларна патологија
 Лабораториски развиен тест
 Патогенеза
 Патогеномика
 Патологија
 Прецизна медицина
 Медицина за едно лице

 Наводи 

Категорија:Медицинска генетика
Категорија:Медицински испитувања
Категорија:Биотехнологија
Категорија:Патогенска геномика