Палеогеномика

Палеогеномика ― научно поле засновано на реконструкција и анализа на геномските информации кај изумрените видови. Подобрените методи за екстракција на стара ДНК од музејски артефакти, ледени јадра, археолошки или палеонтолошки наоѓалишта и технологии за  секвенционирање преку т.н. „следна генерација“ го поттикнале ова поле. Сега е можно да бидат забележани генетски поместувања, стари преселби на населението и меѓусебни односи, еволутивна историја на изумрени растенија, животински видови и видови од родот човек и идентификација на фенотипски одлики низ географските региони. Научниците исто така можат да користат палеогеномика за да ги споредат старите предци со современите луѓе.Lan T. and Lindqvist C. 2018. Paleogenomics: Genome-Scale Analysis of Ancient DNA and Population and Evolutionary Genomic Inferences. In: Population Genomics, Springer, Cham. pp 1-38. Зголемената важност на палеогеномиката е видлива од фактот дека Нобеловата награда за физиологија или медицина во 2022 година му била доделена на шведскиот генетичар Сванте Пебо [1955-], кој работел на палеогеномиката.

 Заднина 
Првично, секвенционирањето на стара ДНК вклучувало клонирање на мали фрагменти во бактерии, што продолжило со ниска ефикасност поради оксидативното оштетување што старата ДНК го претрпела во текот на милениумите. Старата ДНК е тешко да биде анализирана поради лесно разградување од нуклеазите; специфичните средини и послесмртните услови ја подобриле изолацијата и анализата. За веродостојни анализи биле неопходни протоколи за екстракција и контаминација. Со развојот на полимеразната верижна реакција во 1983 година, научниците можеле да проучуваат примероци на ДНК стари до приближно 100.000 години, ограничување на релативно кратките изолирани фрагменти. Преку напредокот во изолацијата, засилувањето, секвенционирањето и реконструкцијата на податоците, постарите и постарите примероци станале анализирани. Во текот на изминатите 30 години, митохондриската ДНК со голем број копии можела да одговори на многу прашања. Доаѓањето на техниките со масивно напоредно секвенционирање поттикнало многу повеќе. Покрај тоа, оваа технолошка револуција овозможила премин од палеогенетика во палеогеномика.

 Методи на секвенционирање 

 Предизвици и техники 
Полимеразната верижна реакција, масивното напоредно секвенционирање како втора генерација и различни библиотечни методи се достапни за секвенционирање на старата ДНК, покрај многуте биоинформатички алатки. Кога се работи со секој од овие методи, важно е да се земе предвид дека старата ДНК може да биде променета послесмртно. Специфичните измени произлегуваат од:

 Податоци за секвенца на основни мутациски обрасци (C->T мутација)
 Вкрстени врски
 Деаминација на цитозин (зголемена кон крајот на читањето)
 Депуринација
 Фрагментација на геномот

Специфичните обрасци и почетокот на овие измени им помагаат на научниците да ја проценат возраста на примерокот.

Порано, научниците дијагностицирале послесмртни штети користејќи ензимски реакции или гасна хроматографија поврзана со масовна спектроскопија; во последниве години, научниците почнале да ги забележуваат со искористување на податоците од мутациската секвенца. Оваа стратегија овозможува да биде идентификуван вишокот на C->T мутации по третман со урацилна  гликозилаза на ДНК. Во денешно време, е користено секвенционирање со висок пропусен опсег за да биде идентификувана депуринација (постапка што ја поттикнува послесмртната фрагментација на ДНК, помладите примероци содржат повеќе аденин отколку гванин), прекини на една врска во двојната спирала на ДНК и абазичната местоположба (создадена од C- >Т мутација).Еден фрагмент од старата ДНК може да биде секвенциониран во целосна должина со секвенционирањето со висок пропусен опсег. Со овие податоци можеме да биде создадено распространување што претставува крива на распаѓање на големината што овозможува директна квантитативна споредба на фрагментацијата низ примероците низ просторот и условите на животната средина. Низ целата крива на распаѓање е можно да се добие средната должина на дадениот фрагмент од стара ДНК. Оваа должина ги одразува нивоата на фрагментација по смртта, што претежно се зголемува со температурата на таложење.Orlando L., Gilbert MT., Willerslev E. 2015. Reconstructing ancient genomes and epigenomes. Nat. Rev. Genet. 16(7):395-408.

 Библиотеки 
Може да се изведат две различни библиотеки за секвенционирање на стара ДНК со помош на полимеразната верижна реакција за засилување на геномот:

 Библиотека на двоверижна стара ДНК
 Библиотека на едноверижна стара ДНК

Првиот е создаден со помош на пристапот со тапи краеви. Оваа техника користи два различни прилагодувачи: овие прилагодувачи случајно го врзуваат фрагментот и тој потоа може да се засили. Фрагментот што не ги содржи двата прилагодувачи не може да се засили предизвикувајќи извор на грешка. За да биде намалена оваа грешка, била воведена Illumina T/A лигатурата: овој метод се состои во вметнување на опашката A во примерокот на ДНК за да биде олеснето врзувањето на прилагодувачите со T опашка. Во овие методи го оптимизираме засилувањето на стара ДНК.

За да бидат добиени библиотеки на едноверижна ДНК, ДНК прво е денатурирана со топлина. Добиената едноверижна ДНК потоа е врзувана на два прилагодувачи со цел да биде создадена комплементарната низа и на крајот е применувана полимеразна верижна реакција.

 Збогатување на стара ДНК 
Бидејќи старата ДНК може да содржи бактериска ДНК или други микроорганизми, постапката бара збогатување. За да бидат одделени ендогени и егзогени фракции, користени се различни методи:

 Збогатување на оштетен шаблон: користено е при конструирање на библиотека на едноверижна ДНК бидејќи овој метод цели на оштетување на ДНК. Кога Bst полимеразата го исполнува пределот, примерокот е третиран со урацилна ДНК гликозилаза и ендонуклеаза VIII. Овие соединенија го напаѓаат абазичното место. Неоштетената ДНК останува прикачена на парамагнетни зрнца обложени со стрептавидин и може да биде одвоена од примерокот. Овој метод е специфичен за примероци од неандерталците од доцниот плеистоцен.
 Збогатување на целта во раствор без екстензии: овој метод е заснован на хибридизација со цел-сонда. Овој метод бара денатурација на ДНК и потоа вметнува преклопувачки плочки сонди долж целните региони. Потоа, користена е полимеразна верижна реакција за амплификација на ДНК и на крајот ДНК е поврзувана со биотинилиран прилагодувач. Тоа е корисно за примероци од архаичното потекло на хомининот.
 Збогатување на целта во цврста фаза: во овој метод напоредно со надледување за секвенционирање со „сачмарка“ се користени микросреди и методот на полимеразна верижна реакција во вистинско време.
 Збогатување на целиот геном: користено е за секвенционирање на целиот геном на поединечни поединки. Користено е за заробување во раствор со цел геном. Овој метод започнува со подготовка на библиотека со сонда на РНК ширум геномот од вид со геном кој е тесно поврзан со целниот геном во примерокот на ДНК.

 Диверзификација на денешното неафриканско население и анатомско современите луѓе 
Досега многу студии во различни области довеле до заклучок дека денешното неафриканско население е резултат на диверзификацијата во неколку различни лози на предците, добро структурирани, метанаселенија кои биле во главна улога во проширувањето надвор од Африка, кои носеле африканско генетско наследство. Во овој контекст, анализата на старата ДНК била фундаментална за тестирање на веќе формулираната хипотеза и за давање нови сознанија. Прво, тоа овозможи да биде стеснето времето и структурата на овој феномен на диверзификација преку обезбедување на калибрација на стапката на автосомна и митохондриска мутација.Skoglund P. and Mathieson I. 2018. Ancient genomics of modern humans: the first decade. Annu. Rev. Genom. Hum. Genet. 19:1, 381-404. Анализата на мешавини покажала дека се случиле најмалку два независни настани на проток на гени помеѓу предците на современите луѓе и архаичните луѓе, како што се групите на население на неандерталците и денисовците, што сведочат за моделот на „протечена замена“ на историјата на евроазиското човечко население. Според сите овие податоци, човечката дивергенција на неафриканските лози се случила околу 45.000 – 55.000 пред сегашноста. Освен тоа, во многу случаи, старата ДНК дозволила да бидат следени историските постапки кои со текот на времето довеле до вистинската генетска структура на населението, што би било тешко да биде направено сметајќи само на анализата на денешните геноми. Меѓу овие сè уште нерешени прашања, некои од најпроучените се идентитетот на првите жители на Америка, населувањето во Европа и потеклото на земјоделството во Европа.

 Фенотипски варијации кај луѓето 
Анализата на старата ДНК овозможува да бидат проучувани мутациите на фенотипските особини по промените во околината и човековото однесување. Преселувањето кон нови живеалишта, новите промени во исхраната (по преодот кон земјоделството) и изградбата на големи заедници довело до изложување на луѓето на нови услови што на крајот резултирало со биолошко приспособување.

 Боја на кожата 
Преселбата на луѓето надвор од Африка на повисоки географски широчини вклучува помала изложеност на сончева светлина. Бидејќи ултравиолетовите зраци А и Б се клучни за синтезата на витаминот Д, кој го регулира примањето на калциум и затоа е суштински за здравјето на коските, живеењето на повисоки географски широчини би значело значително намалување на синтезата на витаминот Д. Ова извршило нов селективен притисок врз одликата на бојата на кожата, претпочитајќи посветла боја на кожата на повисоки географски широчини. Двата најважни гени вклучени во пигментацијата на кожата се SLC24A5 и SLC45A2. Денес, алелите на „светлата кожа“ на овие гени се фиксирани во Европа, но тие достигнале релативно висока честота дури неодамна (пред околу 5000 години). Ваквата бавна постапка на депигментација наведува дека старита Европејци можеле да се соочат со негативните страни на ниското производство на витамин Д, како што се мускулно-скелетни и кардиоваскуларни состојби. Друга хипотеза е дека Европејците пред земјоделството можеле да ги задоволат своите потреби за витамин Д преку нивната исхрана (бидејќи месото и рибата содржат малку витамин Д)Marciniak S., Perry G. H. Harnessing ancient genomes to study the history of human adaptation. Nature Reviews Genetics volume 18, pages 659–674 (2017)

 Прилагодување на земјоделската исхрана 
Еден од главните примери на приспособување по преминувањето кон земјоделска исхрана е упорноста на производството на ензимот лактаза во зрелоста. Овој ензим е од суштинско значење за варење на лактозата присутна во млекото и диететските производи и неговото отсуство доведува до пролив по консумирањето на овие производи. Упорноста на лактазата е определувана претежно со мутација со една база во генот MCM6 и податоците од старата ДНК покажуваат дека оваа мутација станала вообичаена само во последните 5000 години, илјадници години по почетокот на практиките на млечни производи. Така, дури и во случај на отпорност на лактаза, постои огромно временско доцнење помеѓу почетокот на новата навика и ширењето на прилагодениот алел и затоа потрошувачката на млеко можеби била ограничена на деца или на производи со намалена лактоза.

Друг пример на мутација позитивно избрана со преминот кон земјоделството е бројот на копии на генот AMY1. AMY1 шифрира за ензимот амилаза за варење на скроб присутен во плунката и современите луѓе имаат поголем број на копии на гени во споредба со шимпанзата.

 Имунолошки систем 
Човечкиот имунолошки систем претрпе интензивна селекција низ милениумите, прилагодувајќи се на различни патогенски предели. Неколку промени во животната средина и културата наметнале селективен притисок врз различни гени поврзани со имунитетот. Преселбите, на пример, ги изложиле луѓето на нови живеалишта кои носат нови патогени или патогени вектори (на пр. комарци). Исто така, преминот кон земјоделството вклучувало изложување на различни патогени и здравствени состојби, како поради зголемената густина на населението, така и поради живеењето блиску до добитокот. Сепак, тешко е директно да се поврзат одредени стари промени на геномот со подобрена отпорност на одредени патогени, давајќи ја пространоста и сложеноста на човечкиот имунолошки систем. Покрај проучувањето на директните промени во човечкиот имунолошки систем, можно е да бидат проучени и старите патогенски геноми, како што се оние што предизвикуваат туберкулоза, лепра, чума, сипаници или маларија. На пример, истражувачите откриле дека на сите соеви на Yersinia pestis пред 3600 години им недостасувал генот ymt, кој е суштински за патогенот да преживее во цревата на болвите. Ова наведува дека во старото минато чумата можеби била помалку вирулентна во споредба со поновите епидемии на Y. pestis.

Студијата на стара ДНК го поддржала или потврдила дека неодамнешната човечка еволуција за да се спротивстави на инфекцијата на патогени, исто така, го зголеми ризикот од инфламаторни болести кај Европејците од посленеолитот во последните 10.000 години, проценувајќи ја природата, силата и времето на почетокот на селекции поради патогени.

 Растенија и животни 
Многу 'рбетници кои не се хоминини - стари мамут, поларна мечка, куче и коњ - се реконструирани преку обновување на ДНК од фосили и примероци зачувани на ниска температура или голема надморска височина. Студиите за мамути се најчести поради големото присуство на меко ткиво и влакна од вечниот мраз и се користени за да биде идентификувана врската и демографските промени со поновите слонови. Студиите за поларна мечка се вршени за да биде идентификувано влијанието на климатските промени врз еволуцијата и биоразновидноста. Студиите за кучиња и коњи даваат увид во припитомувањето. Кај растенијата, старата ДНК е изолирана од семиња, полен и дрво. Идентификувана е корелација помеѓу стариот и постоечкиот јачмен. Друга примена било откривањето на постапката на припитомување и адаптација на пченката што вклучува гени за толеранција на суша и содржина на шеќер.

 Предизвици и идни гледишта 
Анализата на старите геноми на анатомски современите луѓе во последниве години целосно го револуционизирало нашиот начин на проучување на преселбите на населението, преобразбата и еволуцијата. Сепак, многу сè уште останува непознато. Првиот и очигледен проблем поврзан со овој вид пристап, кој делумно ќе биде надминато со постојано подобрување на старите техники за екстракција на ДНК, е тешкотијата да бидат повратени добро сочуваните стари геноми, предизвик кој е особено забележан во Африка и во Азија, каде температурите се повисоки отколку во другите постудени региони во светот. Понатаму, Африка е, меѓу сите континенти, онаа која има најмногу генетска разновидност. Покрај разградувањето на ДНК, егзогената контаминација ги ограничува и постапките на палеогеномско секвенционирање и склопување. Бидејќи нема во посед автентично сочувана стара ДНК и регионот населен од првобитните предци на денешното неафриканско население, сè уште знаеме малку за нивната структура и местоположба. Вториот и поважен предизвик со кој треба да се соочи ова прашање е обновувањето на ДНК од раните современи луѓе (100.000 – 200.000 пред сегашноста). Овие податоци, заедно со голем број архаични геноми што треба да бидат анализирани и со знаење за времето и распространетоста на архаичните генетски мешавини, ќе им овозможат на научниците полесно да ја реконструираат историјата на човечкиот вид. Всушност, собирањето повеќе податоци за или генетската историја ќе ни овозможи да ја следиме човечката еволуција не само во однос на преселбите и природната селекција, туку и во однос на културата. Во следната деценија, полето за истражување на палеогеномиката ќе го насочи своето внимание главно на три теми: дефиниција, со ситни подробности, на минатите човечки меѓудејствија со погусто земање примероци, разбирање за тоа како овие меѓудејствија придонеле за земјоделски преод преку анализа на ДНК на недоволно проучени региони и, конечно, квантификација на придонесот на природната селекција во денешните фенотипови. За да ги толкуваат сите овие податоци, генетичарите ќе треба да соработуваат, како што веќе направиле со антрополозите и археолозите, со историчарите.

 Биоетика 
Биоетиката во палеогеномиката се однесува на етичките прашања што се јавуваат при проучувањето на древните човечки остатоци, поради сложените односи меѓу научниците, владите и домородното население . Покрај тоа, палеогеномските студии имаат потенцијал да им наштетат на историите и идентитетите на заедницата или на поединецот, како и да откријат осудувачки информации за нивните потомци. Поради овие причини, ваквите студии се сè уште трогателна тема. Студиите за палеогеномика може да имаат негативни последици главно поради несогласувањата помеѓу артикулациите на етичките начека и практики. Всушност, посмртните останки на предците обично се сметани правно и научно како „артефакти“, наместо „човечки субјекти“, што ги оправдува сомнителните однесувања и недостатокот на ангажман од заедниците. Затоа, тестирањето на посмртните останки на предците е користено во спорови, барања во договор, репатријација или други правни случаи. Признавањето на важноста и чувствителноста на оваа тема се движи кон етичка посветеност и насоки применливи во различни контексти, со цел да биде зачувано достоинството на посмртните останки на предците и да бидат избегнати етичките прашања.Advancing the ethics of paleogenomics: Ancestral remains should not be regarded as "artifacts" but as human relatives who eserve respect - Jessica Bardill, Alyssa C. Bader, Nanibaa' A. Garrison, Deborah A. Bolnick, Jennifer A. Raff, Alexa Walker, Ripan S. Malhi, and the Summer Internship for INdigenous peoples in Genomics (SING) Consortium Конечно, уште една пионерска област на интерес е таканаречениот проект „одистребување“, кој има за цел воскреснување на изумрени видови, како што е мамутот. Овој проект, кој се чини дека е возможен благодарение на технологијата CRISPR/Cas9, сепак е силно поврзан со многу етички прашања.

 Поврзано 

 Палеогенетика
 Археогенетика

 Наводи 

Категорија:Археолошки методи
Категорија:Генетска генеалогија
Категорија:ДНК
Категорија:Палеогенетика
Категорија:Геномика
Категорија:Стара ДНК (човек)