친화 크로마토그래피

친화 크로마토그래피(affinity chromatography)는 생체분자와 다른 물질 간의 매우 특이적인 거대분자 결합 상호작용을 기반으로 혼합물에서 생체분자를 분리하는 방법이다. 결합 상호작용의 특정 유형은 관심 생체분자에 따라 달라진다. 항원과 항체, 효소와 기질, 수용체와 리간드, 또는 단백질과 핵산 결합 상호작용은 다양한 생체분자의 분리를 위해 자주 활용된다. 친화 크로마토그래피는 다른 크로마토그래피 방법과 비교하여 높은 선택성과 분리의 분해능에 유용하다.

원리
친화 크로마토그래피는 관심 분석물(일반적으로 이동상에 용해됨)과 결합 파트너 또는 리간드(고정상에 고정됨) 간의 특이적 결합 상호작용이라는 장점을 가진다. 일반적인 친화 크로마토그래피 실험에서 리간드는 고체 불용성 매트릭스(일반적으로 아가로스 또는 폴리아크릴아미드와 같은 중합체)에 부착되며, 이 매트릭스는 리간드가 반응하여 안정적인 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 작용기를 도입하도록 화학적으로 변형된다. 고정상은 먼저 컬럼에 로드된 다음 이동상이 도입된다. 리간드에 결합하는 분자는 고정상과 결합된 상태로 유지된다. 그런 다음 약한 상호작용을 방해하여 비표적 생체분자를 제거하기 위해 세척 버퍼를 적용하고, 관심 생체분자는 결합된 상태로 유지된다. 표적 생체분자는 결합된 표적 생체분자와 리간드 간의 상호작용을 방해하는 용출 버퍼를 적용하여 제거할 수 있다. 따라서 표적 분자는 용출액에서 회수된다.

친화 크로마토그래피는 분리 프로토콜 설계에 결합 특성 지식이 유용하지만, 관심 분석물의 분자량, 전하, 소수성 또는 기타 물리적 특성을 알 필요가 없다. 친화 크로마토그래피 절차에서 일반적으로 활용되는 결합 상호작용 유형은 아래 표에 요약되어 있다.

+ 친화 크로마토그래피에 사용되는 일반적인 생물학적 상호작용 일련번호 리간드 유형 표적 분자1기질 유사체효소2항체항원3렉틴다당류4핵산상보적 염기 서열5호르몬수용체6아비딘바이오틴/바이오틴 접합 분자7칼모듈린칼모듈린 결합 파트너8글루타티온GST 융합 단백질9단백질 A 또는 단백질 G면역글로불린10니켈-NTA폴리히스티딘 융합 단백질

회분식 및 컬럼식 구성
섬네일|친화 컬럼 크로마토그래피의 원리
170px|right|섬네일|회분 크로마토그래피
고정상에 대한 결합은 고체 매질이 컬럼에 충전되고, 초기 혼합물이 컬럼을 통과하여 침전되도록 한 다음, 세척 버퍼가 컬럼을 통과하고 이어서 용출 버퍼가 컬럼에 적용되어 수집되는 컬럼 크로마토그래피를 통해 이루어질 수 있다. 이러한 단계는 일반적으로 주변 압력에서 수행된다. 대안으로, 결합은 회분식 처리를 사용하여 이루어질 수 있으며, 예를 들어 초기 혼합물을 용기 내 고정상에 추가하고, 혼합하고, 고정상을 분리하고, 액체상을 제거하고, 세척하고, 재원심분리하고, 용출 버퍼를 추가하고, 재원심분리하고 용출액을 제거한다.

때로는 하이브리드 방법이 사용되어 결합은 회분식 방법으로 수행되지만, 표적 분자가 결합된 고정상은 컬럼에 충전되고 세척 및 용출은 컬럼에서 수행된다.

친화 크로마토그래피에 사용되는 리간드는 유기 및 무기 공급원에서 얻어진다. 생물학적 공급원의 예로는 혈청 단백질, 렉틴 및 항체가 있다. 무기 공급원은 모로닉산, 금속 킬레이트 및 트리아진 염료이다.

위에서 언급한 두 가지 방법의 장점을 결합한 세 번째 방법인 팽창층 흡착도 개발되었다. 고정상 입자는 컬럼에 배치되며, 액체상은 바닥에서 펌핑되어 위쪽으로 배출된다. 입자의 중력은 고정상이 액체상과 함께 컬럼을 벗어나지 않도록 보장한다.

친화 컬럼은 염 농도, pH, pI, 전하 및 이온 강도를 직접 변경하거나 기울기를 통해 변경하여 관심 입자를 분리할 수 있다.

최근에는 두 개 이상의 컬럼을 직렬로 사용하는 구성이 개발되었다. 단일 컬럼 구성과 비교하여 이점은 비결합 제품이 신선한 컬럼 재료가 있는 연속 컬럼으로 직접 전달되므로 수지 재료를 완전히 로드할 수 있다는 것이다. 이러한 크로마토그래피 공정은 주기적 역류 크로마토그래피 (PCC)로 알려져 있다. 따라서 생산된 제품 양당 수지 비용을 대폭 줄일 수 있다. 한 컬럼이 항상 용출되고 재생되는 동안 다른 컬럼이 로드되므로, 두 개의 컬럼만으로도 장점을 최대한 활용하기에 충분하다. 추가 컬럼은 추가 장비 및 수지 비용이 들지만 용출 및 재생 시간에 추가적인 유연성을 제공할 수 있다.

특정 용도
친화 크로마토그래피는 핵산 정제, 세포가 없는 추출물에서 단백질 정제 및 혈액에서 정제를 포함한 여러 응용 분야에서 사용될 수 있다.

친화 크로마토그래피를 사용하면 특정 단편에 결합하는 단백질을 특정 단편에 결합하지 않는 단백질과 분리할 수 있다. 이 정제 기술은 필요한 단백질의 생물학적 특성에 의존하기 때문에 유용한 기술이며, 한 단계에서 단백질을 여러 배로 정제할 수 있다.

다양한 친화성 매체
다양한 용도에 맞는 여러 종류의 친화성 매체가 존재한다.
간단히 말해, 이는 기능성 스페이서, 지지체 매트릭스로 작동하며 독성 시약의 취급을 제거하는 (일반화된) 활성화/기능화된 매체이다.

아미노산 매체는 다양한 혈청 단백질, 단백질, 펩타이드, 효소뿐만 아니라 rRNA 및 dsDNA와 함께 사용된다. 아비딘 바이오틴 매체는 바이오틴/아비딘 및 그 유도체의 정제 과정에서 사용된다.

탄수화물 결합은 주로 당단백질 또는 다른 탄수화물 함유 물질과 함께 사용되며; 탄수화물은 렉틴, 당단백질 또는 다른 탄수화물 대사 단백질과 함께 사용된다. 염료 리간드 매체는 비특이적이지만 생물학적 기질 및 단백질을 모방한다. 글루타티온은 GST 태그 재조합 단백질의 분리에 유용하다. 헤파린은 일반화된 친화성 리간드이며, 핵산 효소 및 리파아제와 함께 혈장 응고 단백질 분리에 가장 유용하다.

소수성 상호작용 매체는 주로 자유 카르복실기 및 단백질을 표적으로 하는 데 사용된다.

면역친화성 매체(아래에 자세히 설명)는 항원 및 항체의 높은 특이성을 활용하여 분리하며; 고정화 금속 친화성 크로마토그래피는 아래에 더 자세히 설명되어 있으며 금속 이온과 단백질(일반적으로 특별히 태그된) 간의 상호작용을 사용하여 분리한다; 뉴클레오타이드/보조효소는 탈수소효소, 키나아제 및 트랜스아미나아제를 분리하는 데 사용된다.

핵산은 mRNA, DNA, rRNA 및 기타 핵산/올리고뉴클레오타이드를 포획하는 기능을 한다. 단백질 A/G 방법은 면역글로불린을 정제하는 데 사용된다.

특수 매체는 특정 클래스 또는 유형의 단백질/보조효소를 위해 설계되었다. 이러한 유형의 매체는 특정 단백질 또는 보조효소만 분리하는 데 작동한다.

면역친화성
이 절차의 또 다른 용도는 혈청에서 항체를 친화성 정제하는 것이다. 혈청에 특정 항원에 대한 항체가 포함되어 있는 것으로 알려진 경우(예: 혈청이 해당 항원에 면역된 유기체에서 유래한 경우) 해당 항원의 친화성 정제에 사용할 수 있다. 이를 면역친화성 크로마토그래피라고도 한다. 예를 들어, 유기체가 GST-융합 단백질에 면역되면 융합 단백질에 대한 항체와 GST 태그에 대한 항체도 생성할 수 있다. 그런 다음 단백질을 아가로스와 같은 고체 지지체에 공유 결합시키고 면역 혈청에서 항체를 정제하는 데 친화성 리간드로 사용할 수 있다.

철저함을 위해 GST 단백질과 GST-융합 단백질을 각각 별도로 결합시킬 수 있다. 혈청은 처음에 GST 친화성 매트릭스에 결합하도록 허용된다. 이것은 융합 단백질의 GST 부분에 대한 항체를 제거한다. 그런 다음 혈청은 고체 지지체에서 분리되어 GST-융합 단백질 매트릭스에 결합하도록 허용된다. 이것은 항원을 인식하는 항체가 고체 지지체에 포획되도록 한다. 관심 항체의 용출은 글리신 pH 2.8과 같은 낮은 pH 버퍼를 사용하여 가장 자주 달성된다. 용출액은 낮은 pH 용출 버퍼를 중화하고 항체 활성의 저하를 막기 위해 중성 트리스(히드록시메틸)아미노메테인 또는 인산 버퍼에 수집된다. 이는 초기 GST-융합 단백질을 정제하고, 혈청에서 바람직하지 않은 항GST 항체를 제거하고, 표적 항체를 정제하는 데 친화성 정제가 사용되는 좋은 예이다.

단클론 항체는 단백질을 매우 특이적으로 결합하도록 선택될 수 있으며, 단백질은 상당히 부드러운 조건에서 방출된다. 이는 미래의 추가 연구에 유용할 수 있다.

펩타이드 항원에 대해 생성된 항체를 정제하기 위해 종종 단순화된 전략이 사용된다. 펩타이드 항원이 합성적으로 생산될 때, 펩타이드의 N- 또는 C-말단 중 하나에 말단 시스테인 잔기가 추가된다. 이 시스테인 잔기에는 펩타이드가 운반 단백질(예: 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH))에 쉽게 접합될 수 있도록 하는 설프히드릴 작용기가 포함되어 있다. 동일한 시스테인 함유 펩타이드는 시스테인 잔기를 통해 아가로스 수지에 고정화되며, 그런 다음 항체를 정제하는 데 사용된다.

대부분의 단클론 항체는 박테리아에서 유래한 면역글로불린 특이적 단백질 A 또는 단백질 G를 기반으로 하는 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다.

모놀리식 컬럼에 고정화된 단클론 항체를 이용한 면역친화성 크로마토그래피는 EV 표면에 있는 테트라스파닌과 인테그린을 표적으로 하여 인간 혈장에서 세포외 소포체(예: 엑소좀 및 엑소메어)를 포획하는 데 성공적으로 사용되었다.

면역친화성 크로마토그래피는 또한 환자 치료에서 신속한 진단 수단을 제공하는 면역크로마토그래피 테스트(ICT) 스트립의 기초가 된다. ICT를 사용하면 기술자는 실험실이 필요 없이 환자의 침대 옆에서 진단을 내릴 수 있다. ICT 검출은 감염을 일으키는 미생물에 대해 매우 특이적이다.

고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피
고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)는 아미노산, 특히 히스티딘과 금속의 특이적 배위 공유 결합을 기반으로 한다. 이 기술은 금속 이온에 대한 친화성을 가진 단백질이 고정화된 금속 이온을 포함하는 컬럼에 유지되도록 하여 작동한다. 예를 들어, 히스티딘 함유 단백질이나 펩타이드 정제에는 코발트, 니켈 또는 구리가 사용되며, 인산화 단백질이나 펩타이드 정제에는 철, 아연 또는 갈륨이 사용된다. 많은 자연 발생 단백질은 금속 이온에 대한 친화성이 없으므로, 재조합 DNA 기술을 사용하여 해당 유전자에 이러한 단백질 태그를 도입할 수 있다. 관심 단백질을 용출하는 데 사용되는 방법에는 pH 변경 또는 이미다졸과 같은 경쟁 분자 추가가 포함된다.
섬네일|150px|히스티딘 태그 단백질 정제에 사용되는 니켈-아가로스 비드를 포함하는 크로마토그래피 컬럼

재조합 단백질
아마도 친화 크로마토그래피의 가장 일반적인 용도는 재조합 단백질의 정제이다. 알려진 친화성을 가진 단백질은 정제를 돕기 위해 태그된다. 단백질은 친화성 결합을 위해 선택될 수 있도록 유전적으로 변형되었을 수 있으며, 이를 융합 단백질이라고 한다. 표지단백질에는 헥사히스티딘(His), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP) 및 콜리신 E7 변형 CL7 태그가 포함된다. 히스티딘 태그는 고정상에 통합된 킬레이트제와 배위 공유 결합을 형성하여 고정화된 니켈, 코발트, 아연, 구리 및 철 이온에 대한 친화성을 가진다. 용출을 위해 이미다졸과 같이 금속 이온 리간드로 작용할 수 있는 과량의 화합물이 사용된다. GST는 글루타티온에 대한 친화성을 가지며, 이는 글루타티온 아가로스로 고정화된 형태로 상업적으로 이용 가능하다. 용출 중에 과량의 글루타티온이 태그된 단백질을 대체하는 데 사용된다. CL7은 면역 단백질 7(Im7)에 대한 친화성 및 특이성을 가지며, 이는 Im7 아가로스 수지로 고정화된 형태로 상업적으로 이용 가능하다. 용출을 위해 활성 및 부위 특이적 단백질분해효소가 Im7 수지에 적용되어 태그가 없는 단백질을 방출한다.

렉틴
렉틴 친화성 크로마토그래피는 렉틴을 사용하여 샘플 내의 구성 요소를 분리하는 친화성 크로마토그래피의 한 형태이다. 콘카나발린 A와 같은 렉틴은 특정 알파-D-만노스 및 알파-D-포도당 탄수화물 분자를 결합할 수 있는 단백질이다. 렉틴 친화성 크로마토그래피에 사용되는 몇 가지 일반적인 탄수화물 분자는 Con A-Sepharose 및 WGA-아가로스이다. 렉틴의 또 다른 예는 D-N-아세틸글루코사민을 결합하는 밀 배아 응집소이다. 가장 일반적인 응용은 당단백질을 비당화 단백질과 분리하거나, 한 당형을 다른 당형과 분리하는 것이다. 렉틴 친화성 크로마토그래피를 수행하는 다양한 방법이 있지만, 목표는 원하는 단백질의 당 리간드를 추출하는 것이다.

특수 용도
친화 크로마토그래피의 또 다른 용도는 특정 단백질에 고유한 겔 매트릭스를 사용하여 특정 단백질을 정제하는 것이다. 예를 들어, 대장균 β-갈락토시다아제는 p-아미노벤질-1-티오-β-D-갈락토피라노실 아가로스를 친화성 매트릭스로 사용하여 친화성 크로마토그래피로 정제된다. p-아미노벤질-1-티오-β-D-갈락토피라노실 아가로스는 대장균 β-갈락토시다아제에 대한 좋은 기질 유사체 역할을 하는 갈락토피라노실 그룹을 포함하고 있기 때문에 친화성 매트릭스로 사용된다. 이 특성은 효소가 친화성 매트릭스의 고정상에 결합하도록 허용하며, β-갈락토시다아제는 컬럼에 염 농도를 증가시켜 용출된다.

알칼리성 인산가수분해효소
대장균의 알칼리성 인산가수분해효소는 DEAE-셀룰로스 매트릭스를 사용하여 정제할 수 있다. 알칼리성 인산가수분해효소는 약간의 음전하를 띠고 있어 매트릭스의 양전하 아민 그룹에 약하게 결합할 수 있다. 이 효소는 더 높은 염 농도의 버퍼를 추가하여 용출될 수 있다.

보론산 친화성 크로마토그래피
보론산 친화성 크로마토그래피는 보론산 또는 보론산염을 사용하여 당단백질의 양을 용출하고 정량하는 것으로 구성된다. 임상적 적용은 이 유형의 크로마토그래피를 사용하여 당화 헤모글로빈 분석을 통해 당뇨병 환자의 장기 평가를 결정하는 데 적용되었다.

혈청 알부민 정제
혈청 알부민 및 마크로글로불린 오염의 친화성 정제는 질량 분석을 수행할 때 과도한 알부민 및 α2-마크로글로불린 오염을 제거하는 데 도움이 된다. 혈청 알부민의 친화성 정제에서 혈청 단백질을 수집하거나 유인하는 데 사용되는 고정상은 Cibacron Blue-Sepharose일 수 있다. 그런 다음 혈청 단백질은 티오시안산염 (SCN−)을 포함하는 버퍼로 흡착제에서 용출될 수 있다.

약한 친화성 크로마토그래피
약한 친화성 크로마토그래피 (WAC)는 신약 개발에서 친화성 스크리닝을 위한 친화성 크로마토그래피 기술이다. WAC는 고정화된 표적에 대한 서로 다른 약한 친화성을 기반으로 화합물을 분리하는 친화성 기반 액체 크로마토그래피 기술이다. 화합물이 표적에 대해 더 높은 친화성을 가질수록 분리 장치에 더 오래 머무르며, 이는 더 긴 유지 시간으로 표현된다. 친화성 측정 및 친화성 순위는 분석된 화합물의 얻어진 유지 시간을 처리하여 달성할 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 화학 단백질체학 기반 약물 표적 식별에 사용되는 더 큰 기술 스위트의 일부이다.

WAC 기술은 단백질분해효소, 키나아제, 샤페론 및 단백질-단백질 상호작용 (PPI) 표적과 같은 여러 다른 단백질 표적에 대해 시연되었다. WAC는 단편 기반 스크리닝을 위한 기존 방법보다 더 효과적인 것으로 나타났다.

역사
친화 크로마토그래피는 페드로 쿠아트레카사스와 메이어 빌체크가 고안하고 처음 개발했다.

 각주 

 외부 링크 

 "친화 크로마토그래피 원리, 절차 및 고급 상세 노트 – 2020".
 "친화 크로마토그래피란 무엇인가"

분류:크로마토그래피
분류:생화학적 분리 과정