포스터 공명 에너지 전달

포스터 공명 에너지 전달(, FRET), 형광 공명 에너지 전달(), 공명 에너지 전달(, RET) 또는 전자 에너지 전달(, EET)은 두 개의 빛에 민감한 분자(발색단) 사이의 에너지 전달을 설명하는 메커니즘이다. 처음에는 전자 들뜬 상태에 있는 주개 발색단이 비복사성 쌍극자-쌍극자 결합을 통해 받개 발색단으로 에너지를 전달할 수 있다. 이 에너지 전달의 효율은 주개와 받개 사이 거리의 6제곱에 반비례하여 FRET를 거리의 작은 변화에 극도로 민감하게 만든다.

FRET 효율 측정은 두 형광체가 서로 특정 거리 내에 있는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 측정은 생물학 및 화학을 포함한 분야에서 연구 도구로 사용된다.

FRET는 근거리장 통신과 유사하며, 상호작용 반경이 방출되는 빛의 파장보다 훨씬 작다. 근거리장 영역에서 들뜬 발색단은 즉시 수신 발색단에 흡수되는 가상 광자를 방출한다. 이 가상 광자들은 그 존재가 에너지 및 운동량 보존을 위반하므로 감지할 수 없으며, 따라서 FRET는 무방사 메커니즘으로 알려져 있다. 양자 전기역학 계산은 무방사 FRET와 복사 에너지 전달이 단일 통합 메커니즘의 단거리 및 장거리 점근선임을 결정하는 데 사용되었다.

 용어 
섬네일|300px|right|포스터 공명 에너지 전달(FRET) 개념의 만화 도표.

포스터 공명 에너지 전달은 독일 과학자 테오도르 포스터의 이름을 따서 명명되었다. 두 발색단이 모두 형광을 띠는 경우 "형광 공명 에너지 전달"이라는 용어가 종종 대신 사용되지만, 에너지가 실제로 형광에 의해 전달되는 것은 아니다. 항상 비복사성 에너지 전달인 현상에 대한 잘못된 해석을 피하기 위해 (두 형광 발색단 사이에서 발생하더라도) "형광 공명 에너지 전달"보다 "포스터 공명 에너지 전달"이라는 이름이 선호되지만, 후자는 과학 문헌에서 일반적으로 사용된다. FRET는 형광에만 국한되지 않고 인광과도 관련하여 발생한다.

 이론적 근거 
FRET 효율()은 에너지 전달 전이의 양자 효율이며, 즉 주개 여기 이벤트당 발생하는 에너지 전달 이벤트의 확률이다.



여기서 는 주개의 복사 붕괴율, 는 에너지 전달율, 는 다른 받개로의 에너지 전달을 제외한 다른 모든 탈여기 경로의 속도이다.

FRET 효율은 다음과 같이 그룹화될 수 있는 여러 물리적 매개변수에 따라 달라진다. 1) 주개와 받개 사이의 거리(일반적으로 1–10 nm 범위), 2) 주개 방출 스펙트럼과 받개 흡수 스펙트럼의 스펙트럼 중첩, 3) 주개 방출 분자 쌍극자 모멘트와 받개 흡수 쌍극자 모멘트의 상대적인 방향.

는 쌍극자-쌍극자 결합 메커니즘으로 인해 주개-받개 분리 거리 에 역 6제곱 법칙으로 의존한다.

여기서 는 이 주개 및 받개 쌍의 포스터 거리, 즉 에너지 전달 효율이 50%인 거리이다. 포스터 거리는 주개 방출 스펙트럼과 받개 흡수 스펙트럼의 중첩 적분 및 다음과 같은 식(모두 SI 단위)으로 표현되는 상호 분자 방향에 따라 달라진다.



여기서 는 받개가 없는 상태에서 주개의 양자 효율이며, 는 쌍극자 방향 인자, 은 매질의 굴절률, 는 아보가드로 상수이며, 는 다음과 같이 계산되는 스펙트럼 중첩 적분이다.

여기서 는 주개 방출 스펙트럼, 는 면적이 1로 정규화된 주개 방출 스펙트럼, 는 일반적으로 흡수 스펙트럼에서 얻어지는 받개의 몰 흡광 계수이다. 방향 인자 는 다음과 같이 주어진다.

여기서 는 각 형광체의 정규화된 전이 쌍극자 모멘트를 나타내고, 는 정규화된 형광체 간 변위를 나타낸다.  = 2/3이 종종 가정된다. 이 값은 두 염료가 자유롭게 회전하고 들뜬 상태 수명 동안 등방적으로 배향된다고 간주될 때 얻어진다. 만약 어느 한 염료가 고정되어 있거나 자유롭게 회전할 수 없다면,  = 2/3은 유효한 가정이 아니다. 그러나 대부분의 경우, 염료의 적당한 재배향만으로도 충분한 방향 평균화가 이루어지므로,  = 2/3이 가 의 6제곱 의존성 때문에 추정된 에너지 전달 거리에서 큰 오차를 발생시키지는 않는다. 가 2/3과 상당히 다르더라도 오차는 의 변화와 관련될 수 있으므로, 특정 시스템의 상대 거리 변화 결정은 여전히 유효하다. 형광 단백질은 형광 수명보다 빠른 시간 척도로 재배향되지 않는다. 이 경우 0 ≤  ≤ 4이다.

데이터의 단위는 일반적으로 SI 단위가 아니다. 포스터 거리를 계산하기 위해 원래 단위를 사용하는 것이 종종 더 편리하다. 예를 들어, 파장은 종종 nm 단위이고 소멸 계수는 종종  단위이며, 여기서 은 농도 이다. 이들 단위에서 얻은 는  단위를 갖는다. 에 Å () 단위를 사용하려면 방정식은 다음과 같이 조정된다.
     (Å)

FRET의 시간 의존적 분석을 위해서는 에너지 전달율()을 직접 사용할 수 있다.



여기서 는 받개가 없는 상태에서 주개의 형광 수명이다.

FRET 효율은 주개 분자의 양자 효율 및 형광 수명과 다음과 같이 관련된다.

여기서 와 는 각각 받개가 있는 경우와 없는 경우의 주개 형광 수명이며, 또는 다음과 같이 표현된다.

여기서 와 는 각각 받개가 있는 경우와 없는 경우의 주개 형광 강도이다.

 FRET 이론의 실험적 확인 
포스터 공명 에너지 전달의 역 6제곱 거리 의존성은 메이어 빌첵, 에델호흐, 브랜드를 포함한 학자들이 트립토필 펩타이드를 사용하여 실험적으로 확인했다. 루버트 스트라이어, 딕 하우글랜드, 이궤라비데 또한 주개로 융합 인도스테로이드를, 받개로 케톤을 사용하여 포스터 공명 에너지 전달의 중첩 적분에 대한 이론적 의존성을 실험적으로 입증했다. 일부 염료 쌍의 FRET 거리 계산은 여기서 찾을 수 있다. 그러나 분자의 방향과 양자 효율을 추정하기 어려운 복잡한 환경에서는 특수 실험과 이론 사이에 많은 모순이 관찰되었다.

 FRET 효율 측정 방법 
형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 현미경, 그리고 분자생물학에서 FRET는 단백질-단백질 상호작용, 단백질-DNA 상호작용, DNA-DNA 상호작용 및 단백질 형태 변화와 같은 생물리학 및 생화학 분야에서 분자 동역학을 정량화하는 유용한 도구이다. 두 분자 간의 복합체 형성을 모니터링하기 위해 한 분자에는 주개, 다른 분자에는 받개를 표지한다. FRET 효율을 측정하여 표지된 복합체 간의 상호작용을 식별하는 데 사용된다. 주개 또는 받개에서 방출되는 형광의 변화를 모니터링하여 FRET 효율을 측정하는 여러 가지 방법이 있다.

 감지된 방출 
FRET 효율을 측정하는 한 가지 방법은 받개 방출 강도의 변화를 측정하는 것이다. 두 분자의 상호작용으로 인해 주개와 받개가 근접한 경우(1-10 nm), 주개에서 받개로의 분자간 FRET로 인해 받개 방출이 증가한다. 단백질 형태 변화를 모니터링하기 위해 표적 단백질은 두 위치에 주개와 받개로 표지된다. 단백질의 비틀림 또는 굽힘이 주개와 받개 사이의 거리 또는 상대적 방향에 변화를 가져올 때 FRET 변화가 관찰된다. 분자 상호작용 또는 단백질 형태 변화가 리간드 결합에 의존하는 경우, 이 FRET 기술은 리간드 감지를 위한 형광 지표에 적용 가능하다.

 광표백 FRET 
FRET 효율은 받개가 있는 경우와 없는 경우의 주개 광표백 속도에서도 추론할 수 있다. 이 방법은 대부분의 형광 현미경에서 수행할 수 있다. 단순히 주개는 여기시키지만 받개는 크게 여기시키지 않는 주파수의 여기광을 받개 형광체가 있는 표본과 없는 표본에 비추고 시간에 따라 주개 형광을 모니터링한다(일반적으로 대역 통과 필터를 사용하여 받개 형광과 분리). 시간 척도는 광표백의 시간 척도로, 수 초에서 수 분이며, 각 곡선의 형광은 다음과 같이 주어진다.

여기서 는 광표백 붕괴 시간 상수이며, 받개가 있는지 여부에 따라 달라진다. 광표백은 들뜬 형광체의 영구적인 비활성화로 구성되므로, 들뜬 주개에서 받개 형광체로의 공명 에너지 전달은 해당 주개 형광체의 광표백을 방지하며, 따라서 높은 FRET 효율은 더 긴 광표백 붕괴 시간 상수로 이어진다.

여기서 와 는 각각 받개가 있는 경우와 없는 경우의 주개 광표백 붕괴 시간 상수이다. (이 비율은 수명 측정에 사용되는 것의 역수임을 주목해야 한다).

이 기술은 1989년에 조빈(Jovin)에 의해 소개되었다. 시간 상수를 추출하기 위해 전체 점 곡선을 사용하는 것은 다른 방법보다 정확도상의 이점을 제공할 수 있다. 또한, 시간 측정이 나노초가 아닌 초 단위라는 점은 형광 수명 측정보다 더 쉽게 만들고, 광표백 붕괴율은 일반적으로 주개 농도에 의존하지 않으므로(받개 포화가 문제가 되지 않는 한), 강도 측정에 필요한 정밀한 농도 제어가 필요하지 않다. 그러나 더 강한 입사광으로 광표백이 현저히 증가하므로, 받개가 있는 측정과 없는 측정 모두 동일한 조명을 유지하는 것이 중요하다.

 수명 측정 
FRET 효율은 주개의 형광 수명 변화에서도 결정할 수 있다. 받개가 있는 경우 주개의 수명은 감소한다. FRET-주개의 수명 측정은 형광 수명 이미징 현미경 (FLIM)에서 사용된다.

 단일 분자 FRET (smFRET) 

smFRET는 다양한 현미경 기술을 사용하여 단일 분자 수준에서 여기되고 감지되는 주개 및 받개 형광체의 쌍을 측정하는 방법 그룹이다. 수많은 분자의 FRET 신호를 제공하는 "앙상블 FRET" 또는 "벌크 FRET"와 달리, 단일 분자 FRET는 각 개별 분자의 FRET 신호를 해결할 수 있다. smFRET 신호의 변동은 앙상블 측정으로는 제공할 수 없는 운동학적 정보를 밝히는 데 유용하며, 특히 시스템이 평형 상태에 있을 때 더욱 그렇다. 다른 분자들 간의 이질성도 관찰할 수 있다. 이 방법은 DNA/RNA/단백질 접힘/풀림 및 기타 형태 변화와 같은 생체 분자 역학의 많은 측정과 화학 감지, 생체 분석 및 생체 감지에 특히 유용한 반응, 결합, 흡착 및 탈착과 같은 분자간 역학에 적용되었다.

 FRET에 사용되는 형광체 
섬네일|250px|연결자가 손상되지 않은 경우, CFP (414 nm)의 흡수 파장에서 여기되면 FRET로 인해 YFP (525 nm)가 방출된다. 연결자가 단백질분해효소에 의해 절단되면 FRET는 중단되고 CFP 파장 (475 nm)에서 방출된다.

 CFP-YFP 쌍 
생물학적 용도로 흔히 사용되는 한 쌍의 형광체는 청록 형광 단백질 (CFP) – 황색 형광 단백질 (YFP) 쌍이다. 둘 다 녹색 형광 단백질 (GFP)의 색상 변이체이다. 유기 형광 염료로 표지하려면 숙주 단백질의 정제, 화학적 변형 및 세포내 주입이 필요하다. GFP 변이체는 유전공학을 통해 숙주 단백질에 부착될 수 있어 더 편리하다. 또한, 단백질분해효소 절단 서열로 연결된 CFP와 YFP의 융합("탠덤 이합체")을 절단 분석법으로 사용할 수 있다.

 BRET 
형광체 주개로 수행되는 FRET의 한계는 형광 전달을 시작하기 위한 외부 조명의 필요성인데, 이는 받개의 직접 여기 또는 광표백으로 인해 결과에 배경 노이즈를 유발할 수 있다. 이러한 단점을 피하기 위해 생물발광 공명 에너지 전달 (또는 BRET)이 개발되었다. 이 기술은 CFP 대신 생물발광 루시페레이스 (일반적으로 레닐라 레니포르미스의 루시페레이스)를 사용하여 YFP와 호환되는 초기 광자 방출을 생성한다.

BRET는 또한 심해 새우 Oplophorus gracilirostris에서 공학적으로 만들어진 다른 루시페레이스 효소를 사용하여 구현되었다. 이 루시페레이스는 Renilla reniformis의 더 일반적으로 사용되는 루시페레이스보다 작고 (19 kD) 더 밝으며, NanoLuc 또는 NanoKAZ로 명명되었다. 프로메가는 나노Luc를 위한 특허 기질인 푸리마진을 개발했지만, 나노Luc에 대한 다른 유용한 코엘렌테라진 기질도 발표되었다. 프로메가에서 개발한 NanoLuc의 분할 단백질 버전 또한 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 실험에서 BRET 주개로 사용되었다.

 호모-FRET 

일반적으로 "FRET"는 주개 및 받개 단백질(또는 "형광체")이 두 가지 다른 유형인 상황을 의미한다. 그러나 많은 생물학적 상황에서 연구자들은 동일한 유형의 두 개 이상의 단백질 간의 상호 작용, 또는 실제로 동일한 단백질 자체와의 상호 작용을 조사해야 할 수 있다. 예를 들어, 단백질이 접히거나 단백질의 중합체 사슬의 일부를 형성하거나 생물학적 세포에서 정량화에 대한 다른 질문을 위해 또는 시험관내 실험에서 말이다.

명백하게, 기존의 UV-vis 스펙트럼의 차이는 균질 FRET를 감지하고 측정하는 데 사용되는 도구가 아닐 것이다. 왜냐하면 받개와 주개 모두 동일한 파장의 빛을 방출하기 때문이다. 그러나 특정 비선형 분광학이 선형 스펙트럼에서는 보이지 않을 균질 FRET의 특징을 제공할 수 있다는 증거가 있다. 그럼에도 불구하고 연구자들은 형광체를 여기시키는 빛과 방출되는 빛 사이의 편광 차이를 FRET 이방성 영상이라는 기술로 감지할 수 있다. 이때 정량화된 이방성(여기 및 방출 빔 사이의 편광 차이) 수준은 얼마나 많은 FRET 이벤트가 발생했는지에 대한 지표가 된다.

나노포토닉스 분야에서 FRET는 들뜬 에너지(excitonic energy)를 결함 부위로 유도할 경우 해로울 수 있지만, 유기 태양 전지와 양자점 감응 태양 전지에서 전하 수집에도 필수적이며, 다양한 FRET 기반 전략이 여러 광전자 장치에 제안되었다. 따라서 고밀도 층으로 쌓인 고립된 나노 이미터가 어떻게 작동하는지 이해하는 것이 중요하다. 나노판은 강한 평면 내 쌍극자 결합과 낮은 스토크스 이동으로 인해 강력한 호모-FRET 엑시톤 확산에 특히 유망한 후보이다. 이러한 단일 사슬에 대한 형광 현미경 연구는 이웃 나노판들 사이의 FRET에 의한 에너지 전달이 일반적인 500 nm 길이(약 80개의 나노 이미터)에 걸쳐 에너지를 확산시키며, 나노판들 사이의 전달 시간은 1 ps 정도임을 입증했다.

 기타 
형광 단백질 외의 다양한 화합물.

 응용 분야 
형광 공명 에너지 전달 (FRET)의 응용 분야는 지난 25년간 엄청나게 확장되었으며, 이 기술은 많은 생물학 및 생물리학 분야에서 필수적인 기술이 되었다. FRET는 분광학적 자로 사용되어 여러 시스템에서 거리를 측정하고 분자 상호작용을 감지할 수 있으며 생물학 및 생화학 분야에 응용된다.

 단백질 
FRET는 종종 단백질 간의 상호작용을 감지하고 추적하는 데 사용된다. 또한 FRET는 형광체로 단백질의 다른 영역을 표지하고 방출을 측정하여 거리를 결정함으로써 단일 단백질 내 단백질 도메인 간의 거리를 측정하는 데 사용될 수 있다. 이는 단백질 구조에 대한 정보를 제공하며, 단백질의 2차 구조와 단백질 접힘을 포함한다. 이는 미오신 활동과 관련된 형태 변화와 같은 단백질 구조의 기능적 변화를 추적하는 데 확장된다. 생체 내에서 적용된 FRET는 인테그린과 막 단백질을 포함한 세포 구조의 위치와 상호작용을 감지하는 데 사용되었다.

 막 
FRET는 막 유동성, 막 단백질의 이동 및 분산, 막 지질-단백질 및 단백질-단백질 상호작용, 다른 막의 성공적인 혼합을 관찰하는 데 사용될 수 있다. FRET는 또한 세포막에서 막 도메인과 지질뗏목의 형성 및 특성을 연구하고 막의 표면 밀도를 결정하는 데 사용된다.

 화학 센서 
섬네일|Cd2+와 상호작용 시 활성화되는 FRET 기반 탐침
FRET 기반 탐침은 다양한 분자의 존재를 감지할 수 있다. 탐침의 구조는 작은 분자 결합 또는 활동에 의해 영향을 받으며, 이는 FRET 시스템을 켜거나 끌 수 있다. 이는 종종 음이온, 양이온, 작은 비전하 분자, 그리고 일부 더 큰 생체고분자를 감지하는 데 사용된다. 마찬가지로, FRET 시스템은 pH, 저산소증, 또는 미토콘드리아 막 전위와 같은 요인으로 인한 세포 환경의 변화를 감지하도록 설계되었다.

 신호 전달 경로 
FRET의 또 다른 용도는 대사 또는 신호전달 경로 연구이다. 예를 들어, FRET 및 BRET는 G 단백질 연결 수용체 활성화 및 그에 따른 신호 메커니즘을 특성화하는 다양한 실험에서 사용되었다. 다른 예로는 세균 화학주성 및 세포자살에서의 캐스페이스 활동과 같은 다양한 과정을 분석하는 데 FRET를 사용하는 것이 포함된다.

 단백질 및 뉴클레오타이드 접힘 동역학 
단백질, DNA, RNA 및 기타 중합체 접힘 동역학은 FRET를 사용하여 측정되었다. 일반적으로 이러한 시스템은 동역학이 숨겨진 평형 상태에 있다. 그러나 분자에 받개 및 주개 염료를 적절하게 배치하여 단일 분자 FRET를 측정함으로써 측정할 수 있다. 더 자세한 내용은 단일 분자 FRET를 참조하라.

 기타 응용 분야 
이전에 언급된 일반적인 용도 외에도 FRET 및 BRET는 생화학 반응 동역학 연구에도 효과적이다. FRET는 pH 의존성 조립 및 분해 모니터링에 점점 더 많이 사용되고 있으며 핵산 캡슐화 분석에 유용하다. 이 기술은 다양한 유형의 나노입자 형성뿐만 아니라 나노의학의 메커니즘과 효과를 결정하는 데 사용될 수 있다.

 기타 방법 
다른 관련 메커니즘은 덱스터 전자 이동이다.

단백질-단백질 근접성을 감지하는 대체 방법은 생체분자 형광 보완법 (BiFC)인데, 여기서 형광 단백질의 두 부분이 각각 다른 단백질과 융합된다. 이 두 부분이 만나면 수 분 또는 수 시간 내에 형광체를 형성한다.

 같이 보기 
 덱스터 전자 이동
 포스터 결합
 표면 에너지 전달
 시간 분해 형광 에너지 전달

 각주 

 외부 링크 

 FRET 영상 (Becker & Hickl 튜토리얼, 웹사이트)

분류:세포생물학
분류:실험 기술
분류:생물물리학
분류:광학 현상
분류:세포 이미징
분류:영상
분류:형광
분류:생화학 기법
분류:분자생물학 기술
분류:단백질-단백질 상호작용 분석