키메라 항원 수용체 T 세포

키메라 항원 수용체 T 세포(, CAR T cell)는 면역요법에 사용하기 위해 가공의 T 세포 수용체를 만들기 위해 유전학적으로 조작된 T 세포이다.
키메라 항원 수용체(, CAR, chimeric immunoreceptor, chimeric T cell receptor, artificial T cell receptor)는 T 세포에 특정 단백질을 대상으로 하는 새로운 기능을 부여하도록 조작된 수용체 단백질이다. 이 수용체들은 키메라의 성질을 띄는데 그 이유는 종양이 발현하고있는 항원을 인식할 수 있는 항체의 ScFv부위와 T 세포 활성 signal cascade를 담당하는 부위인 CD3z부위를 하나로 합쳐놓기 때문이다.

 키메라 항원 수용체의 역사 
chimeric antigen receptor라는 개념은 1989년 이스라엘의 Eshahar박사가 최초로 고안 하였으며 T-body로 명명되었다. 당시에는 현재와 같이 단일사슬구조가 아닌 면역글로불린 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 항원결합 부위를 각각 T세포 수용체의 alpha 사슬(Cα) 및 beta 사슬(Cβ)의 불변 부위(constant domain)와 결합한 형태로 고안하였으며 따라서 네 가지 벡터(2 × 2)를 제작하여 VHCα 및 VLCβ 또는 VHCβ 및 VLCα 조합으로 두 개의 벡터를 동시에 형질전환하여 발현시켰다.이후 VH와 VL을 링커로 연결하여 현재와 같은 단일사슬 키메릭수용체가 개발되어 구조가 단순화되고 효율을 증대할 수 있게 되었다.

 키메라 항원 수용체의 구조 
키메라 항원 수용체는 세가지 부위로 외부도메인(Ecto domain)과 막 도메인(transmembrane domain) 그리고 내부 도메인(endo domain)으로 구성되어 있다.Zhang, C., Liu, J., Zhong, J. F., & Zhang, X. (2017). Engineering CAR-T cells. Biomarker research, 5, 22. https://doi.org/10.1186/s40364-017-0102-y

1. 외부도메인(E 마지막으로 간격부위로 이루어져 있다. 신호 펩타이드의 역할은 번역이후 초기 단백질이 수송과 가공처리를 담당하는 소포체(Endoplasmic reticulum)로 향하게 하는 지시 역할을 하며 항원인지 부위인 ScFv는 면역글로불린의 중쇄와 경쇄의 가변영역을 linker를 통해 만든 형태이며 간격부위(spacer)는 ScFv와 막관통영역(transmembrane)부위를 이어주는 역할을 하며 길이나 sequence에 따라 움직일 수 있는 결합영역이 달라지기 때문에 antigen binding이나 T 세포 증식등에 관여한다는 결과들이 존재 한다.https://www.creative-biolabs.com/blog/car-t/the-transmembrane-spacer-domain-car-design/

2. 막 도메인(Transmembrane domain)
막 도메인은 소수성 알파나선 구조로 이루어져 있으며 receptor의 안정화에 기여를 하는 것으로 알려져 있다. 현재 CD28 막도메인이 가장 안정한 리셉터로 알려져있다.

3. 내부도메인(Endo domain)
내부도메인은 리셉터의 기능적인 역할을 수행하며 기본적인 요소로는 하위 신호전달 역할을 수행하는 면역세포의 활성화를 담당하는 ITAM(Immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)의 일 부분인 CD3ζ이다.

 CAR-T 세포의 작용 원리 

 CAR-T 세포의 원리 
암세포가 T세포의 인지를 회피하는 한계를 극복하기 위해 환자의 혈액에서 추출한 T세포에 CAR 유전자를 결합해 암세포를 특정적으로 인식하는 수용체를 발현시키는 방식이 CAR-T 세포 치료이다. 이렇게 유전자 재조합된 T세포를 체외에서 수백만 개로 증폭한 뒤 다시 환자에게 주입하면 이 세포들이 암세포 표면 항원을 인지해 달라붙어 암세포를 선택적으로 파괴하는 과정을 수행한다.

이러한 CAR-T 세포의 치료 방식은 우리의 몸의 면역체계와 비슷하다. 면역체계는 생물체가 모든 위협에서 자신을 지키는 방어막 구실을 한다. 사람의 면역체계에는 1차 방어벽과 2차 방어체계가 있다. 먼저 피부, 점막 등이 병원균을 차단하는 1차 방어벽인데, 여기가 뚫리면 백혈구가 2차로 방어한다. 2차 방어체계는 선천면역과 후천면역으로 나뉘며, 선천면역을 담당하는 식세포와 자연살해 세포는 우리 몸으로 들어온 병원균을 즉시 공격한다. 림프구는 후천면역을 담당하는데 림프구는 병원균을 공격하면서 그 특징을 기억했다가 다시 만나면 더 효과적으로 공격하는 특징이 있다. 림프구는 T 세포, B 세포, NK 세포로 나눠진다. T 세포는 암을 공격하는 정상세포다. 선천면역 세포가 인체에 침입한 병원균과 바이러스를 1차로 공격한 뒤 획득한 정보는 대식세포(세포 찌꺼기, 이물질, 미생물, 암세포, 비정상적인 단백질 등을 삼켜 분해하는 세포)를 통해 림프구에 전해지고, 이 정보를 받은 T 세포는 2차로 암세포를 공격한다. 하지만 암세포에는 일정 시간이 지나면 T 세포를 속이거나 공격을 회피할 수 있는 면역 회피 능력이 있는데, 이를 통해 인체의 다른 곳으로 퍼져나가게 된다. B 세포는 항체를 분비해 항원을 제거하며 T 세포와 함께 면역을 담당한다. B 세포는 세포 표면에 B 세포 수용체(B Cell Receptor: BCR)가 있다. 이 B 세포 수용체는 B 세포가 특정 항원에 결합할 수 있도록 하며, 항체 면역 반응을 시작하게 한다.

즉, CAR-T 세포 치료제는 암세포를 사멸하기 위해 외부 물질이 아닌 체내의 면역세포를 이용한다는 점에서 기존 항암제와 차이가 있다. 이러한 사실들을 통해 CAR-T 세포 치료제가 체내의 면역체계를 이용한다는 점을 CAR-T 세포 치료제의 원리라고 볼 수 있다.

 CAR-T 세포 치료제의 작용 방식 
CAR-T 세포 치료 과정은 크게 세 단계로 나눌 수 있다.

첫 번째 단계는 환자의 혈액에서 T 세포를 채취하는 단계이다. 환자의 혈액에서 면역 반응을 담당하는 T 세포를 분리한다.

두 번째 단계는 T 세포에 유전적 조작을 가하는 단계이다. 분리된 T 세포에 CAR를 삽입하여 암세포 표면의 특정 항원을 인식하도록 설계한다. 항원 결합 도메인(B 세포 수용체 유래)은 암세포를 정확히 찾아내는 역할을 하며, 신호 전달 도메인(T 세포 수용체 유래)은 T 세포 활성화와 증식을 유도한다. 이 단계에서 CAR 구조가 완성되며, 환자의 T 세포는 암세포를 인식하고 면역 반응을 수행할 수 있는 능력을 갖추게 된다.

세 번째 단계는 유전자 조작을 마친 CAR-T 세포를 체내에 주입하여 암세포를 공격하는 단계이다. 조작된 CAR-T 세포는 항원을 인식하고 활성화되어 암세포를 파괴하며, 장기간 체내에서 암세포를 감시하여 재발 방지에도 기여한다.

요약하자면, CAR-T 세포는 면역 세포를 재프로그래밍하여 체내에서 암세포를 직접 찾아 공격하도록 하는 혁신적 치료법이다.

 CAR-T 세포의 진화 과정 

 CAR-T 세포의 탄생과 진화의 서사 
CAR-T 세포 치료제는 환자의 T 세포를 뽑아 특별한 유전자를 넣어 다시 몸에 돌려보내는 기술로, 세포 치료와 유전자 공학이 합쳐져 만들어진 방식이다. 이 치료법은 여러 단계의 발전을 거치며 지금의 형태에 도달했다.

가장 초기 형태인 1세대 CAR-T 세포는 항체 조각과 CD3ζ라는 신호 전달 부위를 붙여 암세포를 직접 인식하고 공격할 수 있게 했지만, 증식과 생존력이 부족해 임상적 한계가 뚜렷했다.

이러한 약점을 극복하기 위해 등장한 2세대 CAR-T 세포는 CD28 또는 4-1BB 공동자극 도메인을 추가함으로써 활성과 지속성을 크게 향상시켰고, 현재 승인된 대부분의 CAR-T 치료제의 기반이 되었다.

이후 개발된 3세대 CAR-T 세포는 두 가지 종류의 신호 장치를 결합해 항암 능력을 강화했으나, 임상에서 일관된 효능 우위가 확인되지는 않았고 CRS나 T 세포 소진과 같은 부담도 존재했다.

4세대 CAR-T 세포, 즉 TRUCK은 IL-12 같은 사이토카인을 분비하여 억제적인 종양 미세환경을 재편하려는 보다 능동적인 전략을 취하며 고형암고형암이란 암의 한 종류이다.에서의 저항성을 극복하는 방향으로 진화했다.

더 나아가 5세대 CAR-T 세포는 합성 생물학 기술을 통해 세포 안의 신호 조절 장치를 정교하게 설계하여, T 세포의 활성도, 증식, 속도, 사이토카인 분비를 세밀하게 조절할 수 있는 차세대 플랫폼으로 발전했다. 이러한 모든 진화는 T 세포 수용체 구조 연구, 항체 생성 기술, 공동자극 도메인 발견, 바이러스 벡터 기반 유전자 전달 기술 등의 과학적 축적이 토대가 되었다.

CAR-T 세포 치료제는 현재 CD19, BCMA 등 혈액암 항원을 표적으로 높은 완전 반응률과 장기 생존율을 보이고 있으나, 고형암에서는 종양 침윤 제한과 면역 억제적 종양 미세환경으로 인해 효능이 제한적이다.

 질병의 경계를 넘는 CAR-T 세포의 미래 전망 
향후 CAR-T 세포 연구는 고형암 적용 확대, 부작용 최소화, 면역 반응 조절 등 다방면에서 발전할 것으로 기대되며 이는 차세대 면역세포 치료의 핵심 기술로 자리 잡을 전망이다.

먼저, 현재 혈액암에서 주로 활용되는 CAR-T 세포는 앞으로 고형암의 복잡한 미세환경을 극복할 수 있는 기술과 함께 더 넓은 암종으로 적용 범위를 넓혀갈 전망이다. 또한 사이토카인 폭풍과 같은 부작용을 줄이기 위해 세포 활성도를 정밀하게 조절하는 안전 장치가 도입되며, 필요할 때만 작동하는 스위치형 CAR-T 세포 기술이 개발되고 있다. 더불어 환자에게서 직접 세포를 채취하지 않아도 되는 범용(allogeneic) CAR-T 세포가 등장함에 따라 치료의 속도와 비용 효율성이 크게 향상될 것으로 예상된다.

미래의 CAR-T 세포는 단일 표적이 아닌 여러 항원을 동시에 인식하고 다양한 기능을 수행하는 다기능 세포로 진화할 것이며, 유전자 편집 기술과의 결합을 통해 개인 맞춤형 치료도 더욱 정교하게 구현될 것으로 보인다.

 CAR 진화 =
키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor)의 진화는 세포에 활성화 신호를 전달하는 내부도메인의 구성에 따라 진화되고 있다.
1989년대 키메라 항원 수용체의 초기 단계 이래로 키메라 항원 수용체는 내부 도메인 구조에 따라 4세대까지 발전되어 왔다.
 1. 1세대 키메라 항원 수용체
1세대의 경우 보조 자극도메인 없이 CD3ζ만 존재하는 형태이며 T세포를 충분히 활성화 시킬수 없다는 단점을 가지고 있다.T Brocker, K Karjalainen; Signals through T cell receptor-zeta chain alone are insufficient to prime resting T lymphocytes.. J Exp Med 1 May 1995; 181 (5): 1653–1659. doi: 또한 자체적으로 인터류킨-2(IL-2)를 생성하지 못하기 때문에 인위적으로 IL-2를 주입시켜야 효과가 나타난다고 보고가 되고 있다.Brocker T. Chimeric Fv-zeta or Fv-epsilon receptors are not sufficient to induce activation or cytokine production in peripheral T cells. Blood. 2000;96(5):1999‐2001.
이러한 단점을 보완하고자 T세포 리셉터의 보조자극분자를 추가 시킴으로써 T세포의 증식과 지속성을 증가시키는 2세대가 발전하게 된다.
 2. 2세대 키메라 항원 수용체
2세대 키메라 항원 수용체는 보조자극 분자들을 추가적으로 도입시킨 형태로 이는 증식과 세포독성 그리고 지속되는 반응성 그리고 T세포의 생존력에 영향을 미치게 된다. 보조자극 분자로는 CD28 또는 CD137(4-1BB and CD134(OX40))이 존재한다. CD28 매게 된 보조자극분자는 림포구의 증식과 생존 있어서의 조절을 담당하며 메모리기능 또한 관련 되어있다고 알려져 있다. CD134 또한 증식에 관여를 하는 유전자로 면역세포돌을 활성화시킬 수 있는 사이토카인인 인터류킨-2(IL-2)의 생산을 강화하는 역할을 하는 것으로 알려져있다.CD137 분자는 T 세포의 신호반응을 유지하는데 기여를 하고 이는 세포독성 T림프구의 생존능과 메모리기능에 있어서 중요한 역할을 담당한다.
CD3z를 기반으로 보조자극분자 CD28 또는 CD134(4-1BB) CD137(OX40)이 하나씩 추가된 형태라면
 3. 3세대 키메라 항원 수용체
3세대 키메라 항원 수용체는 보조자극도메인 2개를 동시에 발현시킨 형태로 더욱 더 사이토카인 생성과 암세포 살상능력을 높이기 위해 동시에 발현시킨 형태로 CD3ζ - CD28 - OX40 또는 CD3ζ - CD28 - 4-1BB를 구성하고 있는 형태이다.Marin V, Pizzitola I, Agostoni V, Attianese GM, Finney H, Lawson A, et al.Cytokine-induced killer cells for cell therapy of acute myeloid leukemia:improvement of their immune activity by expression of CD33-specificchimeric receptors. Haematologica. 2010;95(12):2144–52.
 4. 4세대 키메라 항원 수용체
4세대 키메라 항원 수용체는 2세대를 기반으로 하여 인터류킨-12를 추가시킴으로써 생성되며 이는 T cell redirected for universal cytokine-mediated killing(TRUCKs)이라고 명명된다. TRUCKs은 T세포의 활성을 증가 시키며 동시에 선천 면역세포들을 끌어들이며 활성화시킬 수 있는
형태의 리셉터이며 바이러스 감염 물질대사와 관련되어 있는 질병과 자가면역질환에서도 이용될 수 있다.Chmielewski M, Abken H. TRUCKs: the fourth generation o어려운ㅇㅇf CARs. ExpertOpin Biol Ther. 2015;15(8):1145–54.

 CAR 생산 및 Adoptive transfer방식 
키메릭항원수용체를 만드는 방법은 환자의 혈액 PBMC(Periheral blood mononuclear cell)로부터 백혈구성분채집술(leukapheresis)과정을 거치게 된다. 이때 분리된 PMBC는 냉장 또는 냉동되어 의약품제조관리기준(Good Manufacturing Practice)GMP을 만족하는 CAR-T 생산 시설로 이송된다.
분리된 T세포는 형질도입 효율을 증대시키기 위하여 selection and activation과정을 거치고 Retro 혹은 Lentivirus vector를 이용하여 암세포 특이적 키메릭항원수용체를 형질전환 시킨다. 형질전환시킨 T세포는 증식을 시켜 다시 환자 몸 속으로 주입하게 되는데 이때 Lymphodepletion 거치게된다. T세포의 활성을억제하는 regulatory T세포와 기존의 가지고있던 사이토카인인 IL-7과 15을 제거하여 강화된 T세포의 효능을 높이기위해 수행하는 단계로 알려져있다.
Lymphodepletion 단계를 거친 환자는 CAR T세포를 재주입하게 된다.
 CAR 한계점 및 극복 해야할 점 
CD19을 표적으로 하는 2세대 CAR의경우 B lymphoma 및 림프종 환자들에게서 높은 효능을 보이며 이외에도 CAR-T를 이용한 항암치료는 다발골수종 환자들을 대상으로한 임상시험에서 매우 성공적으로 진행되고 있으며, 급성 골수성 백혈병을 대상으로 확장이 시도되고 있다.
그러나 이는 혈액암에서만 국한되어 있고 환자90%인 고형암에서는 효과적인 임상결과를 보여주지 못하는 실정이다.이는 앞으로 CAR-T 치료제의 효능과 안전성을 향상시키기 위해 더욱 많은 연구와 임상에서의 평가가 필요함을 의미한다
CAR를 도입함에 있어서 어려운점은
첫째로 종양의 이질성(heterogeneity)이다. 종양내의 각기다른 genome instability가 불안정하면서 이와 관련하여 tumor associated antigen(TAA)을 발현하게 되는데 이는 CAR의 TARGET선정에 있어서 어려운점을 보여주고있다.
두번째로는 종양이 발현하는 케모카인이다. 주화성으로인하여 면역세포의 이동을 조절하게 되는데 종양은 면역세포들의 적절하지 않은 케모카인을 발현 시킴으로써 종양주변으로 접근 하지못하게 막는 기능을 하고있다.
세번째로는 면역세포들을 억제시키는 환경인데 CANCER ASSOCIATED FIBROBLAST(CAF)의 의해 면역세포들의 물리적인 접근을 차단 시킬 뿐만 아니라 저산소증 상태를 유지 시킴으로써 면역세포들의 활성과 증식을 줄이는 효과를 나타내고 있으며 젖당생성과 포도당결핍으로 인한 면역세포의 증식과 사이토카인 생성을 억제시키는 환경을 조성하며
마지막으로 tumor에서 유래된 soluble factor 또는 사이토카인 그리고 MDSC, TAM, TAN에 의해 분비되는 prostaglandin, TGF-β, IL-10같은 Pro-inflammatory cytokine에 의해 면역을 억제시키는 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

 같이 보기 
 세포 치료
 면역관문억제제
 유전자 치료
 면역 체크포인트
 각주 
 Zhang, C., Liu, J., Zhong, J. F., & Zhang, X. (2017). Engineering CAR-T cells. Biomarker research, 5, 22. https://doi.org/10.1186/s40364-017-0102-y

 외부 링크 
 CAR T Cells: Engineering Patients' Immune Cells to Treat Their Cancers

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