Unit fluoresensi relatif

Istilah "unit fluoresensi relatif" (Bahasa Inggris: relative fluorescence units, disingkat RFU) dan "puncak RFU" mengacu pada pengukuran dalam metode elektroforesis, seperti untuk analisis DNA. Unit fluoresensi relatif adalah unit pengukuran yang digunakan dalam analisis yang menggunakan deteksi fluoresensi. Fluoresensi dideteksi menggunakan larik peranti tergandeng–muatan (CCD), ketika fragmen berlabel, yang dipisahkan di dalam kapiler dengan menggunakan elektroforesis, diberi energi oleh cahaya laser dan bergerak melintasi jendela deteksi. Program komputer mengukur hasilnya, menentukan jumlah atau ukuran fragmen, pada setiap titik data, dari tingkat intensitas fluoresensi.   "Relative fluorescence unit (RFU)", DNA.gov: Glossary,
   April 2011, webpage:
   DNA-gov-RFU. Sampel yang mengandung DNA teramplifikasi dalam jumlah yang lebih tinggi akan memiliki nilai RFU yang lebih tinggi.   "Thresholds", NFSTC.org, 2010, webpage:
   .

"Puncak RFU" adalah titik maksimum relatif sepanjang grafik data yang dianalisis. Data dapat dinormalisasi dengan input DNA atau gen normalisasi tambahan. Tinggi RFU dapat berkisar dari 0 hingga beberapa ribu.

Analisis PCR DNA
Pengukuran RFU digunakan, untuk pembuatan profil DNA, dalam reaksi berantai polimerase (PCR) waktu nyata. Dua metode umum untuk mendeteksi produk dalam PCR waktu nyata adalah: (1) pewarna fluoresensi non-spesifik yang menyisipkan dengan DNA untai ganda apa pun, dan (2) probe DNA spesifik-urutan yang terdiri dari oligonukleotida yang diberi label dengan reporter fluoresensi yang memungkinkan deteksi hanya setelah hibridisasi probe dengan target DNA komplementernya. Seringkali, PCR waktu nyata dikombinasikan dengan transkripsi balik untuk mengukur RNA pembawa pesan dan RNA non-pengkode dalam sel atau jaringan.

Ambang batas puncak RFU
Tinggi puncak RFU bergantung pada jumlah DNA yang dianalisis. Ketika jumlah DNA sangat rendah, maka akan sulit untuk memisahkan puncak RFU tingkat rendah yang sebenarnya dari derau sinyal atau artefak teknis lainnya. Akibatnya, banyak laboratorium DNA forensik telah menetapkan tingkat tinggi puncak RFU minimum dalam "menilai" analisis alel.   "Advancing Justice Through DNA Technology",
   National Forensic Science Technology Center (NFSTC),
   2011, web:
   NFS2.

Tidak ada aturan industri yang tegas untuk menetapkan nilai ambang batas RFU minimum. Secara umum, setiap laboratorium telah menetapkan tingkat ambang batasnya sendiri sebagai salah satu aspek dari prosedur validasinya masing-masing. Banyak laboratorium telah menetapkan ambang batas bawah dan atas untuk interpretasi data, sebagai jendela pembacaan minimum dan maksimum.

Beberapa tingkat ambang batas dapat diturunkan secara eksperimental berdasarkan rasio sinyal terhadap derau peralatan yang diketahui, atau ambang batas dapat ditetapkan agar sesuai dengan data yang dipublikasikan atau spesifikasi pabrikan. Perusahaan yang menjual peralatan yang paling banyak digunakan untuk pengetikan STR yakni Applied Biosystems, Inc. (ABI); telah merekomendasikan tinggi puncak minimum 150 RFU, menyarankan bagaimana puncak di bawah level tersebut harus dinilai dengan hati-hati. Namun, banyak laboratorium forensik yang memiliki sistem ABI telah menetapkan ambang batas yang lebih rendah, seringkali hanya 50 hingga 100 RFU, sebagaimana ditentukan oleh studi mereka sendiri.

Banyak faktor berbeda yang dapat memengaruhi pilihan ambang batas laboratorium. Misalnya, mungkin ada pedoman peraturan di yurisdiksi tertentu. Selain itu, berbagai jenis instrumen bervariasi dalam sensitivitasnya (seperti instrumen gel pelat yang kurang sensitif dibandingkan instrumen elektroforesis kapiler (CE)). Instrumen individual, dari jenis model tertentu, juga diketahui berbeda dalam kinerjanya (misalnya perbedaan di antara berbagai unit ABI 310, semuanya dari model yang sama). Instrumen elektroforesis kapiler umumnya memberikan resolusi yang lebih baik dibandingkan sistem berbasis gel, serta memiliki sensitivitas yang lebih baik. Selain itu, beberapa laboratorium telah menetapkan standar ambang batas yang berbeda, tergantung pada instrumen yang digunakan dalam analisis.

Menetapkan ambang batas maksimum atas sangat penting ketika menganalisis data DNA dalam sampel dengan kuantitas tinggi. Sampel dengan DNA yang diamplifikasi dalam jumlah besar akan melaporkan tingkat RFU yang tinggi yang dapat meningkatkan sensitivitas instrumen untuk mengukur hasilnya. Dalam kasus seperti itu, pengukuran yang akurat dari tinggi puncak dan/atau luas area relatif mungkin tidak dapat dicapai. Oversaturasi dapat menjadi masalah ketika menganalisis sampel campuran.

Referensi

Kategori:Biologi molekuler
Kategori:Teknik laboratorium
Kategori:Reaksi berantai polimerase