Uji difusi cakram

Uji difusi cakram (juga dikenal sebagai uji difusi agar, uji Kirby–Bauer, uji kerentanan antibiotik difusi cakram, uji sensitivitas antibiotik difusi cakram, dan uji KB) adalah uji mikrobiologi berbasis kultur yang digunakan dalam laboratorium diagnostik dan penemuan obat. Dalam laboratorium diagnostik, uji ini digunakan untuk menentukan kerentanan bakteri yang diisolasi dari infeksi pasien terhadap antibiotik yang disetujui secara klinis. Hal ini memungkinkan dokter untuk meresepkan pengobatan antibiotik yang paling tepat. Dalam laboratorium penemuan obat (terutama laboratorium bioprospeksi) uji ini digunakan untuk menyaring bahan biologis (misalnya ekstrak tumbuhan, kaldu fermentasi bakteri) dan kandidat obat untuk aktivitas antibakteri. Dalam bioprospeksi, pengujian dapat dilakukan dengan galur bakteri berpasangan untuk mencapai dereplikasi dan mengidentifikasi sementara mekanisme kerja antibakteri.

Di laboratorium diagnostik, uji ini dilakukan dengan menginokulasi permukaan pelat agar dengan bakteri yang diisolasi dari infeksi pasien.  Cakram kertas yang mengandung antibiotik kemudian dioleskan ke agar dan pelat diinkubasi. Jika antibiotik menghentikan pertumbuhan bakteri atau membunuh bakteri, akan ada area di sekitar cakram tempat bakteri belum cukup tumbuh untuk terlihat. Ini disebut "zona penghambatan". Kerentanan isolat bakteri terhadap setiap antibiotik kemudian dapat dikuantifikasi secara semi-kuantifikasi dengan membandingkan ukuran zona penghambatan ini dengan pangkalan data informasi tentang bakteri yang diketahui rentan terhadap antibiotik, cukup rentan, dan resisten. Dengan cara ini, dimungkinkan untuk mengidentifikasi antibiotik yang paling tepat untuk mengobati infeksi pasien. Meskipun uji difusi cakram tidak dapat digunakan untuk membedakan aktivitas bakteriostatik dan bakterisida, uji ini lebih praktis daripada metode uji kerentanan lainnya seperti pengenceran kaldu.

Di laboratorium penemuan obat, uji difusi cakram dilakukan sedikit berbeda dibandingkan di laboratorium diagnostik. Dalam pengaturan ini, bukan galur bakteri yang harus dikarakterisasi, tetapi ekstrak uji (misalnya ekstrak tumbuhan atau mikroba). Oleh karena itu, pelat agar diinokulasi dengan galur bakteri dengan fenotipe yang diketahui (seringkali galur ATCC atau NCTC), dan cakram yang berisi ekstrak uji diaplikasikan ke permukaan (lihat di bawah). Ukuran zona hambatan tidak dapat digunakan sebagai ukuran semi-kuantitatif potensi antibakteri karena ekstrak yang berbeda mengandung molekul dengan karakteristik difusi yang berbeda (ukuran molekul, hidrofilisitas, dll. yang berbeda). Ukuran zona hambatan dapat digunakan untuk tujuan dereplikasi. Ini dicapai dengan menguji setiap ekstrak terhadap galur bakteri yang berpasangan (misalnya galur yang rentan dan resisten terhadap streptomisin untuk mengidentifikasi ekstrak yang mengandung streptomisin). Galur berpasangan (misalnya tipe liar dan galur target yang mengekspresikan secara berlebihan) juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi mekanisme aksi antibakteri.

Sejarah
Difusi agar pertama kali digunakan oleh Martinus Beijerinck pada tahun 1889 untuk mempelajari efek auksin pada pertumbuhan bakteri. Namun, metode ini telah dikembangkan, disempurnakan, dan distandarisasi oleh banyak ilmuwan dan organisasi ilmiah selama bertahun-tahun termasuk George F. Reddish, Norman Heatley, James G. Vincent, Alfred W. Bauer, William M.M. Kirby, John C. Sherris, Hans Martin Ericsson, Organisasi Kesehatan Dunia, Institut Standar Klinis dan Laboratorium, Kelompok Referensi Swedia untuk Antibiotik, Deutsches Institut für Normung, Masyarakat Britania Raya untuk Kemoterapi Antimikroba, dan lainnya.

Prinsip
Kultur bakteri murni disuspensikan dalam larutan garam, kekeruhannya distandarisasi, dan dioleskan secara merata pada pelat agar. Cakram kertas saring yang telah diresapi antibiotik atau ekstrak kemudian diletakkan pada permukaan agar. Konstituen cakram berdifusi dari kertas saring ke dalam agar. Konsentrasi konstituen ini akan paling tinggi di dekat cakram dan akan menurun seiring bertambahnya jarak dari cakram. Jika antibiotik atau ekstrak efektif melawan bakteri pada konsentrasi tertentu, tidak akan ada koloni yang tumbuh di tempat yang konsentrasinya dalam agar lebih besar atau sama dengan konsentrasi efektif. Ini adalah zona penghambatan. Secara umum, zona penghambatan yang lebih besar berkorelasi dengan konsentrasi hambat minimum (MIC) antibiotik atau ekstrak yang lebih rendah untuk galur bakteri tersebut. Pengecualian untuk hal ini adalah ketika molekul antibiotik atau ekstrak berukuran besar atau hidrofobik karena molekul-molekul ini berdifusi melalui agar secara perlahan.

Metode standar

Cakram agar dan persiapan inokulum
Semua aspek prosedur Kirby–Bauer distandarisasi untuk memastikan hasil yang konsisten dan akurat. Oleh karena itu, laboratorium harus mematuhi standar ini. Media yang digunakan dalam uji Kirby–Bauer harus berupa agar Mueller–Hinton dengan kedalaman hanya 4 mm, dituangkan ke dalam cawan Petri berukuran 100 mm atau 150 mm. Tingkat pH agar harus antara 7,2 dan 7,4. Inokulum bakteri disiapkan dengan mengencerkan kultur kaldu agar sesuai dengan standar kekeruhan McFarland 0,5; yang setara dengan sekitar 150 juta sel per mL.

Inokulasi dan Inkubasi
Menggunakan teknik aseptik, kultur kaldu organisme tertentu dikumpulkan dengan kapas usap steril. Untuk bakteri Gram-negatif, cairan berlebih dikeluarkan dari kapas usap dengan menekan atau memutarnya secara perlahan ke bagian dalam tabung. Kapas usap kemudian digoreskan pada cawan agar Mueller–Hinton untuk membentuk lapisan bakteri. Untuk mendapatkan pertumbuhan yang seragam, cawan agar digoreskan dengan kapas usap ke satu arah, diputar 120° dan digoreskan lagi, diputar 120° lagi dan digoreskan lagi. Menggunakan dispenser cakram antibiotik, cakram yang berisi antibiotik spesifik kemudian ditempelkan pada cawan. Ini harus dilakukan dalam waktu 15 menit setelah inokulasi. Pinset yang disterilkan dengan api digunakan untuk menekan setiap cakram secara perlahan ke agar dan memastikannya melekat. Cawan kemudian diinkubasi semalaman, biasanya pada suhu 35 °C.  Cawan harus diinkubasi dalam waktu 15 menit setelah penggunaan cakram antibiotik.

Modifikasi media uji
Bakteri tertentu memerlukan penambahan larutan 5% darah kuda yang didefibrinasi secara mekanis dan β-NAD (MH-F agar). Tabel berikut menunjukkan kebutuhan media mikroorganisme yang umum diuji:
+Persyaratan media difusi cakramAgar MH standarAgar MH-F  Enterobacteriales
 Pseudomonas spp.
 Stenotrophomonas maltophilia
 Acinetobacter spp.
 Staphylococcus spp.
 Enterococcus spp.
 Aeromonas spp.
 Achromobacter xylosoxidans
 Vibrio spp.
 Bacillus spp.
 Burkholderia pseudomallei grup Streptococcus A, B, C, G
 Streptococcus pneumoniae
 grup Streptococcus viridans 
 Haemophilus influenzae
 Moraxella catarrhalis
 Listeria monocytogenes
 Pasteurella multocida
 Campylobacter jejuni dan C. coli
 Corynebacterium
 Aerococcus sanguinicola dan A. urinae
 Kingella kingae
 Brucella melitensis

Kontrol Kualitas
Untuk memastikan keakuratan hasil uji, metode kontrol kualitas harus digunakan. Untuk memantau kinerja uji, galur bakteri khusus digunakan sebagai kontrol positif atau negatif. Ketika efikasi β-laktamase diuji, galur khusus yang menunjukkan resistensi terhadap β-laktam digunakan. Selain itu, media spesifik digunakan untuk menguji antibiotik tertentu. Misalnya, ketika menguji kerentanan kotrimoksazol, media dengan timina dan timidina berlebih direkomendasikan. Tabel berikut mencantumkan galur kontrol kualitas yang umum digunakan dalam metode difusi cakram:
+Galur kontrol kualitas (per Januari 2025))BakteriGalurDeskripsiAntibiotik yang diujiATCCNCTCCIPDSMCCUGCECTE. coli259221224176,24110317620434rentan (tipe liar)neomisin, kolistin, kanamisin, sefaleksin, gentamisin, sefamandol, sefalotin, tetrasiklin, sefaloglisin, sefaloridin, asam nalidiksat, kloramfenikol3521811954102181592330600943menghasilkan β-laktamase TEM-1, yang resisten terhadap ampisilin (digunakan untuk memeriksa komponen β-laktamase dari cakram kombinasi β-laktam) -13353 - - - -menghasilkan CTX-M-15 dan OXA-1 (digunakan untuk memeriksa komponen β-laktamase dari cakram kombinasi β-laktam)sefotaksimKlebsiella pneumoniae70060313368 - -454217787menghasilkan SHV-18 (β-laktamase spektrum luas, digunakan untuk memeriksa komponen β-laktamase dari cakram kombinasi β-laktam)BAA-2814 - - - - -menghasilkan KPC-3, SHV-11, TEM-1 (digunakan untuk memeriksa komponen β-laktamase dari cakram kombinasi β-laktam)kombinasi penghambat β-laktam/β-laktamase baru (misalnya meropenem/vaborbaktam)Pseudomonas aeruginosa278531290376,110111717619108rentan (tipe liar)Staphylococcus aureus2921312973103429256915915794menghasilkan β-laktamase (lemah) -12493 - -67181MRSA (plasmid mecA positif)metisilin dan antibiotik lain yang dipengaruhi oleh galur MRSAEnterococcus faecalis292121269710321425709997795rentan (tipe liar)51299133791046761295634289 -HLAR (enzim pengubah aminoglikosida), resisten terhadap vankomisin (plasmid vanB positif)gentamisin, streptomisinStreptococcus pneumoniae49619129771043401196733638 -resisten terhadap benzilpenisilinHaemophilus influenzae49766129751035701197029539 -rentan (tipe liar)4924712699104604999926214 -penurunan kerentanan terhadap β-laktam (menunjukkan modifikasi protein pengikat penisilin)Campylobacter jejuni335601135170,2T468811284 -rentan (tipe liar), membutuhkan lingkungan mikroaerobik dan suhu inkubasi yang lebih tinggi (41±1°C)

Metode alternatif
Beberapa variasi metode difusi cakram telah dikembangkan, termasuk metode cawan penisilin Oxford dan Etest yang digunakan di laboratorium diagnostik rumah sakit, serta metode difusi sumur, difusi silinder, dan bioautografi yang digunakan di laboratorium penemuan dan pengembangan obat.

Metode cawan penisilin Oxford
Cakram berisi konsentrasi antibiotik yang meningkat ditempatkan pada media bakteri yang telah disemai pada permukaan agar dan lempeng diinkubasi. Ukuran zona diukur dari tepi cakram hingga ujung zona bening. Interpretasi lebih rumit pada populasi kerentanan campuran. Ukuran zona di-plot sebagai dimensi linier atau kuadrat jarak sebagai fungsi logaritma natural konsentrasi antibiotik dalam cakram. MIC ditentukan dari titik nol intersep regresi linier yang sesuai dengan data. Titik intersep itu sendiri merupakan logaritma dari MIC. Kemiringan garis regresi berkaitan dengan koefisien difusi antibiotik tertentu dalam agar.

Uji Kerentanan Antibiotik Cepat EUCAST (RAST)
Metode RAST berfungsi sebagai cara cepat untuk memastikan kerentanan antibiotik dan diciptakan sebagai modifikasi dari uji difusi cakram klasik. Metode ini memungkinkan untuk mempersingkat waktu inkubasi menjadi 16-20 jam. Skor uji dibaca setelah 4, 6, 8, dan 16-20 jam. Dibandingkan dengan metode standar, RAST tidak menghasilkan zona hambat yang jelas dalam rentang waktu sesingkat itu (semua bakteri kecuali S. pneumoniae memiliki peluang lebih tinggi dari 90% untuk dapat dibaca setelah 6 jam). Untuk galur kontrol kualitas, galur tersebut diencerkan 1:1.000.000 dan darah kuda atau domba yang telah didefibrinasi ditambahkan. Tabel titik henti RAST khusus harus digunakan saat menginterpretasikan hasil karena perbedaan kalibrasi metode.

Galur kendali mutu yang tervalidasi meliputi: E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, S. pneumoniae ATCC 49619.

Skrining mekanisme resistensi antibiotik dalam RAST
RAST memungkinkan penentuan cepat kemungkinan resistensi antibiotik dalam kultur yang diuji. RAST memungkinkan pemeriksaan E. coli dan K. pneumoniae penghasil ESBL dan/atau karbapenemase, masing-masing menggunakan sefotaksim/seftazidim (setelah 4 jam) dan meropenem (setelah 6 jam). Namun, hasil ini tidak kuantitatif dan hanya boleh digunakan untuk skrining dalam tes medis rutin. Dalam uji klinis, metode RAST menghasilkan peningkatan signifikan dalam memprediksi efikasi terapi antibiotik.

Metode pra-difusi cakram
Cakram berisi antibiotik ditempatkan pada cawan agar Mueller-Hinton yang belum diinokulasi dan diinkubasi selama 2 jam. Kemudian, cakram tersebut dikeluarkan dan suspensi bakteri yang sebelumnya disiapkan menggunakan mikrodilusi kaldu diaplikasikan dan cakram lain dengan antibiotik yang berbeda ditempatkan tepat di tempat yang sama dengan cakram sebelumnya. Setelah inkubasi selama 16-20 jam, hasilnya dikorelasikan dengan nilai MIC antibiotik pertama. Contoh metode pra-difusi adalah pengujian efikasi seftazidim/avibaktam (cakram primer) secara in vitro dalam kaitannya dengan aztreonam (cakram sekunder).

Pengujian obat antijamur
Metode difusi cakram dapat digunakan untuk menguji kerentanan terhadap antijamur.

Bioautografi
Dibandingkan dengan metode berbasis cakram klasik, bioautografi menggunakan kromatografi lapis tipis untuk memisahkan komponen-komponen dari campuran yang diuji. Kemudian, pelat KLT dapat diletakkan di atas agar yang telah diinokulasi dan dibiarkan berdifusi ke dalamnya (bioautografi kontak) atau ditutup dengan kaldu yang mengandung mikroba (bioautografi langsung). Kemudian, sampel diinkubasi dan zona penghambatan diukur. Sebagai alternatif, pelat KLT dapat ditutup dengan agar cair dalam bioautografi lapisan agar.

Untuk memvisualisasikan zona penghambatan dalam bioautografi langsung, reagen yang mendeteksi aktivitas dehidrogenase digunakan (misalnya garam tetrazolium, yang diubah oleh dehidrogenase mikroba menjadi formazan kromogenik).

Gambar lainnya

 Catatan 

Referensi

Kategori:Teknik mikrobiologi
Kategori:Resistensi antimikroba